CN101494970A - 用于肠道病症和/或补水的口服制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括一种或多种重组产生的人乳蛋白质的口服制剂。本发明的制剂可用于预防已暴露于或将暴露于一种或多种已知引起肠道病症的媒介物中的患者腹泻的发作，和预防从该病中恢复的患者腹泻的复发。所述制剂也可用于治疗炎性肠疾病，包括克隆氏病和溃疡性结肠炎。所述制剂也可按照用于促进人类患者中健康肠内菌群发育的方法有益地施用于人类患者。

Description

用于肠道病症和/或补水的口服制剂

技术领域

本发明涉及作为口服制剂组分的抗微生物剂的产生和用途，所述口服制剂用于预防和治疗由微生物生物体或经其他来源引起的肠道病症。所述口服制剂可用于治疗和/或预防多种肠疾病和病症、用于控制肠病原体和用于给患有腹泻的个体补水。

背景技术

五岁以下的儿童由于腹泻病(diarrheal disease)引起的发病率和死亡率仍是发展中国家以及发达世界的较低社会经济群体的主要健康挑战，直到20世纪50年代，才确定腹泻病是五岁以下儿童发病和死亡的主要原因。世界卫生组织(WHO)报道在2000年约150,0000名5岁以下的儿童死于腹泻病。

在20世纪70年代初的研究中，WHO/UNICEF推荐使用葡萄糖基口服补水溶液(oral rehydration solution，ORS)(盐/钠、糖/碳水化物和水)的单一制剂来预防或治疗各种原因或各个感染年龄组的腹泻脱水。ORS的应用拯救了全世界数百万儿童的生命。今天，ORS被认为是20世纪最重要的医学进展之一。其已经成为用于治疗患有腹泻和并发脱水的儿童的基石。其在治疗腹泻相关的脱水中的使用已从1984年的少于病例的15％增加至1993年的40％。

最初的ORS制剂是基于霍乱患者中大便钠的水平，并且目的是用于治疗脱水，而不是腹泻。因此，尽管补水状态得以保持，但腹泻的持续时间没有缩短。因此，对于ORS的理想组合物及其对各种形式的腹泻的适合性的争论很激烈，所述各种形式的腹泻为：霍乱性和非霍性，营养不良性和营养良好性，儿童和成年人的，及儿童和婴儿的。

科学研究继续研发了具有如下主要特征的ORS的新制剂，其应当便宜、安全、有效、长期储存稳定，并且其具有抗腹泻作用(量和持续时间降低)和补水作用。改良第一个方面之一是碳水化物(葡萄糖)的来源和形式。在许多培养物中，已经使用米(rice)和米汤(rice water)作为腹泻的家用药物(homeremedy)。在80年代初，首先试验了用米饭(boiled rice)、米粉末(rice power)、米粉(rice flour)或糖浆(syrup)替代葡萄糖，结果引起霍乱患者的大便排出量和腹泻持续时间减少。许多临床和现场研究紧接着比较了米基ORS(rice-basedORS)与WHO推荐的葡萄糖基ORS，在所有的研究中，米基ORS显示出大便排出量减少、腹泻的持续时间缩短和对静脉内液体不定期的干扰(unscheduled interventions)较少。在ORS中，对使用米及其它复合碳水化物作为葡萄糖替代品的临床试验的荟萃分析(meta-analysis)表明，解释复合碳水化物优于葡萄糖的七种可能的因素：1)底物利用率增加，2)葡萄糖聚合物对葡萄糖吸收的动力学优点，3)小肠对葡萄糖单体和聚合物的不同处理，4)低渗透性，5)肽和氨基酸对溶质结合的钠吸收的单独作用，6)米中的抗分泌部分，以及7)内腔营养对粘膜修复和再生的增强。在1994年，WHO/lnternationalCentre联合的Diarrhea Disease Research，Bangladesh(ICDDR1B)ConsultativeMeeting在Dhaka举行，评论了使用米基ORS的22个临床试验结果。尽管米基ORS对患有霍乱的成年人和儿童较好，但其对患有急性非霍乱性腹泻的儿童不好。而且，该组织得出结论：米基物质的花费增加不足以证明改变WHO推荐的制剂是正当的。基于腹泻持续时间的减少需要较短的治疗和使用更少的ORS，已经对此花费结论进行了努力，因而使得花费相同等。还指出某些发展中国家没有备用的葡萄糖供应品。

米基ORS的改善作用及其降低的渗透性引起对具有渗透性降低的新的葡萄糖基制剂的研究。使用钠和葡萄糖浓度的几种变化来试验渗透性降低的ORS。在对2,397名患者参与的15次随机试验的观察中，与标准WHO制剂相比，渗透性降低的补水溶液与需要不定期的静脉内输注降低、大便量减少和呕吐减少有关。在2001年，口服补水溶液制剂的专家研讨会在纽约举行，该研讨会评论了比较WHO/UNICEF推荐的单一葡萄糖基制剂与含有更少钠和葡萄糖的渗透性降低的制剂的数据。在该会议后，WHO/UNICEF由推荐单一制剂改变为推荐低渗透性的制剂。

腹泻可以由暂时性问题如感染或慢性问题如肠疾病引起。腹泻病可以分为渗透性(由于在肠腔存在的渗透负载量的增加，或者过量摄入或吸收减少)、炎性或粘膜性(当肠的粘膜内壁发炎时)、分泌性(当分泌活动出现增加时)和运动性(由肠道运动性病症引起)。腹泻的一些更常见的原因为：

(1)细菌感染。通过污染的食物或水消耗的几种类型的细菌可以引起腹泻。常见的细菌包括梭菌属(Clostridium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)和大肠杆菌(Escherichia coli)。

(2)病毒感染，许多病毒引起腹泻，包括轮状病毒、诺瓦克病毒(Norwalkvirus)、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)和病毒性肝炎病毒。

(3)食物过敏反应(intolerances)。某些人不能消化某些食物成分，比如乳糖，在奶中发现的糖。

(4)寄生虫，寄生虫可以通过食品或水进入身体，并定居在消化系统中。引起腹泻的寄生虫包括蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)和隐孢子虫(Cryptosporidium)。

(5)药物反应，所述药物比如抗生素、血压药和含有镁的抗酸剂。

(6)肠疾病，如炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)或乳糜泻(celiac disease)。

(7)功能性肠病，比如肠易激综合征(irritable bowel syndrome)，其中肠不能正常工作。

艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种格兰氏阳性的、产芽胞的厌氧生物体，其是引起医院性(即，医院获得性)腹泻的主要原因之一。最初在健康新生儿的粪便菌群中鉴定了该生物体。该生物体建群在至多50％的健康婴儿中，但很少在正常非住院成年人中发现。直到20世纪70年代，在使用广谱抗生素后，才“再发现”艰难梭菌是与腹泻和结肠炎有关的媒介物。今天，认为艰难梭菌是在发达国家的住院成年人中腹泻的主要原因。

社区获得性(community-acqured)艰难梭菌的危险非常低，但是建群和明显的疾病(colonization and overt disease)(腹泻至假膜性结肠炎)的危险与长期的住院和使用抗生素治疗直接相关。使用广谱抗微生物的治疗剂干扰了消化道的正常菌群，使得艰难梭菌建群其中。然而，以前，估计该危险对于住院超过一周使用毒素A和B的新单克隆抗体基于快速ELISA的患者为大于20％；该比率有可能加倍。

当可能和以甲硝唑或万古霉素给药时，对于艰难梭菌的选择治疗是广谱抗微生物剂中止的原因。尽管大多数患者响应特定的治疗，但是存在药物不耐受和抗性发展的问题。而且，5％至30％的患者将经受复发和多次感染.

在1998年，确定了三个与艰难梭菌有关的未解决的问题。第一个是缺少灵敏的和特定的试验。该问题已经随着对毒素A和B的更灵敏的和特定的ELISA试验的发展而得到解决。第二个是需要改善医院控制隔离方法。一种建议是控制医院中抗微生物剂的使用模式。而且，坚决坚持手工洗涤及其它标准感染控制方案是有效的。第三个是疾病的复发。用另一种抗生素治疗由于使用抗生素引发的病症的事实可导致持续住院的患者中疾病复发。

IBD是一种发病率显著且影响生活质量的终生病症。诊断的百分之二十至三十是儿童。并不完全了解IBD的病因学，但是遗传、微生物和免疫因素起重要作用。常规的免疫调节治疗剂，包括类固醇，对生长发育可具有显著的副作用。

哺乳的孩子具有较低的腹泻及其他感染的发病率。母乳含有许多固有的抗微生物蛋白质，其可能在减少腹泻和促进健康的或共生的微生物系统(microflora)建群于胃肠道中起作用，所述微生物系统起抑制现患有的腹泻和未来腹泻发作的作用。体外数据表明乳蛋白质乳铁蛋白(lactoferrin，LF)和溶菌酶(lysozyme，LZ)在母乳的抗微生物作用中起重要作用。已证实独立LF和LZ的和其组合具有抗广谱细菌、病毒、寄生虫和真菌的抗微生物活性。LF还具有免疫调节性质，上调肠道中的抗炎细胞因子和下调其中的促炎症反应细胞因子。

目前的市场上没有安全和经济有效的显示出该效果的生理活性乳蛋白质的来源。这样的蛋白质的必要条件包括下述的：

a.蛋白质必须是生物活性的。

b.蛋白质必须在经济有效的系统中生产和分离。

c.大量补给这些生物活性乳蛋白质是必需的。

d.在基本上缺少人类病原体和/或毒素的宿主中产生。捐赠的人类母乳包括病原体，其与在转基因细菌、酵母菌、真菌、动物和细胞培养物中产生的病原体相同。

e.能够在多种制剂中保持生物活性。

f.当配置时贮存稳定。

本发明满足了这些必要条件。

仍需要使用更有效的制剂，例如复合碳水化物和抗微生物蛋白质来预防和治疗肠疾病。进一步地，如果复合碳水化物或抗微生物蛋白质的制剂是以类似于在先天免疫系统中发现的浓度，这样的治疗可能具有协同的有益效果，比如在控制肠内生物体比如艰难梭菌方面。这样的治疗可以单独进行或与用抗生素的标准治疗协同进行。

发明概述

本发明的一个方面是用于预防或治疗肠道病症、肠疾病和相关病症的口服制剂。实例包括腹泻(diarrhea)、霍乱(cholera)、隐孢子虫病(cryptosporidiosis)、食源性疾病(foodborne disease)、胃肠炎(gastroenteritis)、溃疡(ulcers)、炎症性肠病(其包括，但不限于克隆氏病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis))、沙门氏菌病(saalmonellosis)、伤寒(typhoid)和AIDS。

本发明的另一个方面是有助于控制肠病原体的口服制剂。实例包括梭菌属、弯曲杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和大肠杆菌。

本发明的另一个方面是有助于促进肠内有益菌群生长的口服制剂。

本发明的进一步的方面是一种口服制剂，其含有rhLF，含量为约0.5至约5.0g/l；和rhLZ，含量为约0.1至约1.0g/l。优选，所述口服制剂具有的约200至约310mOsm/L的渗透性。所述口服制剂优选递送抗微生物活性和补水，并给药以在降低肠疾病或病症的持续时间和/或严重性降低和提高痊愈率方面提供主要改善，因而提高康复的速度。

本发明的另一个方面包括用于产生口服制剂的方法，该方法包括将抗微生物剂加入所述制剂中，其中所述制剂赋予至少一种下述益处：改善补水、预防腹泻的发作或复发、减少腹泻持续时间和/或量、控制肠病原体如艰难梭菌和促进有益肠内菌群的生长。

当通过实施本发明下述试验或上述知识时，本发明的其它新特征和优点将对本领域技术人员变得显而易见。

发明详述

有关植物细胞的术语“稳定地转化的”指该植物细胞具有整合到其基因组中的非天然(异源)核酸序列，其保持两代或多代。

“宿主细胞”指含有载体且支持异源核酸序列复制和/或转录和/或表达的细胞。优选，根据本发明，所述宿主细胞为植物细胞，最优选单子叶植物细胞，比如水稻(rice)或大麦(barley)。可使用其它的宿主细胞作为第二寄主，包括细菌、酵母菌、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，以将DNA转移至期望的植物宿主细胞。

“植物细胞”指来源于植物的任何细胞，包括未分化的组织(例如胼胝体)以及植物种子、花粉、繁殖体、胚胎、悬浮液培养物、分生组织区域、叶子、根、茎干、配子体、孢子体和小孢子。

术语“成熟的植物”指完全分化的植物。

术语“种子产品”包括，但不限于种子成分(seed fractions)，比如脱壳(de-hulled)的整个种子、磨粉(flour)(通过将已经脱壳的种子研磨和碾磨成粉末)、种子提取物，优选蛋白质提取物(其中所述米粉的蛋白质成分已经与碳水化物成分分离)、麦芽(包括麦芽浸膏或麦芽糖浆)和/或来源于转基因谷粒的纯化的蛋白质成分。

术语“生物活性”指由本领域技术人员通常归因于所述蛋白质的任何生物活性。

“单子叶植物种子组分”指从单子叶植物种子、通常成熟的单子叶植物种子中提取的碳水化物、蛋白质和脂质组分。

“种子成熟”指以受精开始和以谷物干燥结束的时期，在受精中，可代谢的储备物，例如糖、低聚糖、淀粉、酚类化合物、氨基酸和蛋白质在有或没有靶向液胞(vacuole targeting)下储存至种子(谷物)中各种组织，例如胚乳、种皮、糊粉层和盾片状上皮(scutellar epithelium)，引起谷物增大、谷粒填充(grain filling)。

“成熟-特殊蛋白质启动子”指在种子成熟期间基本上显示出上调活性(大于25％)的启动子。

“异源DNA”指从另一个来源引入植物细胞的或来自植物来源的DNA，所述植物来源包括相同的植物来源，但其在没有正常地调节异源DNA表达的启动子的调控下。

“异质蛋白”为由异源PNA编码的蛋白质。所述蛋白质包括，但不限于抗微生物蛋白质和肽、乳铁蛋白(其可由乳铁蛋白多肽取代的)、溶菌酶、咕啉结合蛋白(haptocorin)、乳凝集素(lactahedrin)、防卫素(defensin)、组织蛋白酶抑制素(cathelicidins)和乳过氧化物酶(lactoperoxidase)。

如本文所用的，术语“天然型的”或“野生型”，相对于给定的细胞、多肽、核酸、特性或表型，指其中通常在自然中发现的形式。

如本文所用的，术语“纯化”可以与术语“分离”交互使用，通常指将特定的组分从环境的一种或多种其它组分中的任何分离，在所述环境中产生或发现有该特定组分。例如，从产生重组体蛋白质的植物细胞中纯化重组体蛋白质通常指使含有转基因蛋白质的植物材料经历分离技术，比如沉淀、离心、过滤和层析。任何这样的纯化或分离步骤的结果可仍然含有其它的组分，只要该结果具有比在这样的纯化或分离步骤之前更少的其它组分(“杂质组分”)。

如本文所用的，关于宿主细胞的术语“转化的”或“转基因的”指宿主细胞含有天然宿主细胞缺乏的、非天然的或异源的或引入的核酸序列的宿主细胞。而且，在本发明的上下文中，“稳定地转化的”指引入的核酸序列保持宿主的两代或多代，优选(但不是必要地)，这是归因于将引入的序列整合到宿主基因组的缘故。“ORS”指常用于预防或改正脱水的溶液。ORS通常但非必须含有盐、糖、钾及其它有助于代替疾病或病症的体液损失的矿物质的混合物。

“口服制剂成分”包括一种或多种蛋白质、肽、激素、碳水化物、氨基酸、脂质、维生素、有机盐和无机盐。

“口服制剂活性成分”或“口服制剂组分”指加入到或补充到口服制剂的任何抗微生物剂、蛋白质和非蛋白质、重组体和非重组体。

“口服制剂补充剂”指一种或多种口服制剂组分与或不与加入到口服制剂的其它成分的组合。

“抗微生物剂”指具有抗菌药、抗真菌药、抗原虫药和/或抗病毒药功能的一组化学品。

“重组体蛋白质”指使用DNA重组技术产生的异源蛋白。

“肠疾病或病症”包括腹泻(来自任何原因，例如任何之前列出的独立原因)、克隆氏病、憩室病(diverticulosis)和憩室炎(diverticulitis)、胃癌(gastriccancer)、胃炎(gastritis)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、消化性溃疡(pepticulcer)、肠溃疡(intestinal ulcer)、胃溃疡(gastric ulcer)、十二指肠溃疡(duodenalulcer)、应激性肠病(irritable bowel disease)、肠易激综合征、便秘(constipation)、肠病原体感染、与慢性人类免疫缺陷性病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染相关的胃肠功能失调(gastrointestinal dysfunction)、获得性免疫缺乏综合症(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)和/或其治疗及痔疮(hemorrhoids)。

向口服溶液中加入乳铁蛋白和溶菌酶引起腹泻病的持续时间减少和肠粘膜的回收率增加。

已经表明乳铁蛋白具有抗HT-29细胞的轮状病毒感染的体外抗病毒作用，HT-29细胞为肠细胞样细胞系。该抗病毒作用机理似乎是双重的。乳铁蛋白直接结合病毒颗粒，并防止其结合到靶细胞。当在结合步骤后，将细胞暴露于乳铁蛋白中时，乳铁蛋白也对病毒抗原的合成和病毒产生具有抑制作用。该第二种机理需要由特定的细胞受体摄取乳铁蛋白。另一种重要的观察为牛乳铁蛋白抗轮状病毒的活性在脱液酸化(desialylation)后增加。注意到在水稻中产生的重组体人乳铁蛋白没有唾液酸。尽管没有如常规检测到，腺病毒也可能与腹泻相关。乳铁蛋白能通过结合糖胺聚糖受体和阻断病毒结合细胞膜而抑制细胞的腺病毒感染。

乳铁蛋白也已显示出有效地消弱志贺氏菌毒力(virulence)。在孟加拉的流行病学研究证实哺乳婴儿患有志贺氏菌感染的发病率和严重性降低。体外试验表明乳铁蛋白在细菌表面起作用，引起侵入的抗原释放并使该细菌变得对蛋白酶更敏感。这些相同的研究证实侵入抗原的损失与乳铁蛋白的铁饱和或N-末端阳离子肽无关。乳铁蛋白的抗炎和免疫调节作用使该“食品”物质成为向患有肠疾病或病症如轻度至中度IBD的孩子和/或成年人供应营养的优良候选者。使用先天免疫系统的蛋白质与标准抗微生物剂治疗，将辅助物(adjuncts)加入IBD治疗和/或肠病原体如艰难梭菌的控制的时机可通过使用乳铁蛋白获得。该蛋白质在上皮分泌物中发现，并推测其有助于屏障保护功能。乳铁蛋白是一种转铁蛋白家族的铁结合糖蛋白，并且其与抗微生物性质和以粘膜水平提高免疫性有关。乳铁蛋白和来自乳铁蛋白的特定胃蛋白酶产生的肽刺激双歧杆菌(bifidobacterial)的生长。在大鼠结肠炎模型系统中证实乳铁蛋白具有调节肠中炎症细胞因子应答的能力。其也降低了了健康志愿者中吲哚美辛(indomethacin)的损害。在本发明的一个实施方案中，乳铁蛋白为通过在米颗粒基系统(rice grain based system)中的蛋白质表达和纯化产生，且优选重组体人乳铁蛋白。如此产生的乳铁蛋白已经历了大量测试以确定其与从母乳中纯化的天然蛋白质基本等效。在其他的实施方案中，乳铁蛋白可以重组产生或从一种或多种人类、牛类、猪和山羊来源获得的乳汁中分离。

本发明的另一个实施方案包括使用乳铁蛋白来治疗、控制或预防肠病原体的感染。例如，在住院患者中可使用乳铁蛋白来治疗治疗、控制或预防艰难梭菌感染。天然的蛋白质，以平均母乳水平(至少1mg/ml乳铁蛋白)或高于该水平使用，可控制或预防受试者中的病原体建群，特别是需要广谱抗菌治疗剂的住院或长期护理的患者。来自体外试验的初始数据证实了临床分离物对重组体人乳铁蛋白的敏感性。在用于治疗或预防病原性优选艰难梭菌感染的方法中，剂量方案(dosing regimen)可以是每24小时约0.5至10g，优选约2至8g，最优选约3g的乳铁蛋白，持续至足够治疗或预防感染时，可伴有或不伴有抗生素治疗。

在相关的实施方案中，使用乳铁蛋白，无论是单独或与溶菌酶一起，可促进健康肠道菌群的发育和保持。此类益生菌(probiotic basteria)的实例可包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、酵母菌属(Saccharomyces)和嗜酸菌属(Acidophilus)的成员，但不限于这些。

溶菌酶是1，4-β-N-乙酰基溶菌酶。它酶促解性降解革兰氏阳性细菌的细胞膜中肽聚糖的糖苷键。溶菌酶单独的起作用，其溶胞和杀死一些革兰氏阳性微生物。通常，革兰氏阴性细菌的外膜保护它们免受溶菌酶的作用。相反，乳铁蛋白结合并改变革兰氏阴性细菌的膜。在母乳及其它粘膜分泌物中发现的这两种蛋白质证实了单独的抑菌活性，但能当两者都存在时，其能以协同的杀菌方式起作用。乳铁蛋白单独具有抑菌性质。乳铁蛋白的一种作用机理是通过分离铁，剥夺(depriving)微生物的必需营养素。然而，乳铁蛋白也具有N-末端区域，其有杀菌性且具有脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)结合活性。在对霍乱弧菌(V.cholerae)的研究中，单独的溶菌酶为非活性的，单独的乳铁蛋白为抑菌性的，并且混合的蛋白质为杀菌性的。在S.typhimurium和大肠杆菌中发现了类似的结果。乳铁蛋白和溶菌酶分别和组合都对大肠杆菌有效。

也已经研究了人乳和乳铁蛋白的抗寄生活性。两者都显示出抗蓝氏贾第虫滋养体的杀死活性(cidal activity)。在隐孢子虫病的情况下，母乳喂养已成为有效的抑制(deterrent)。这可以通过细胞因子调节而具有抗微生物作用和抗炎作用两者。

乳铁蛋白可具有保护腹泻期间肠粘膜的阳性作用。口服施用乳铁蛋白的动物研究证实了其经由调节免疫系统抗结肠炎发展的保护作用。这可通过乳铁蛋白诱导抗炎细胞因子IL-4和IL-10的增加和抑制促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的释放来实现。这种保护性机理可产生更少的损害和更快地修复肠道粘膜组织，引起其正常通透性和生长。在小鼠中，乳铁蛋白也保护肠道粘膜抗细菌脂多糖的作用。通过对作为抗炎和免疫调节蛋白质的乳铁蛋白的研究证实，使用本发明的口服制剂中人乳铁蛋白是有益的，无论单独施用或与已知的治疗炎症性肠病如克隆氏病或溃疡性结肠炎的方法协同施用。

从人母乳中纯化乳铁蛋白和溶菌酶不是经济可行的选择。这些蛋白质也可从一种或多种牛、猪和/或山羊来源的乳汁中分离。人乳铁蛋白和溶菌酶在植物，优选单子叶植物比如水稻中的表达也是有吸引力的方法，因为米属于用于引入婴儿的第一类推荐食品。其具有营养价值和低的变应原性。纯化后，来自米的任何剩余蛋白或碳水化物无危险引入，且可以看作营养的试探(nutritionally sound)。因为人乳铁蛋白和溶菌酶是母乳喂养婴儿饮食的主要部分，向饮食中加入重组体人乳铁蛋白和溶菌酶将扩充它们的正常摄入。

口服制剂或ORS可以有利地含有0.0001％至10％重量的抗微生物蛋白质，优选，选自下组：乳铁蛋白、溶菌酶、防卫素、组织蛋白酶抑制素和乳过氧化物酶。优选，这些蛋白质以占所述口服制剂或ORS重量的约0.001％至1％的量提供。更优选，如果使用乳铁蛋白和/或溶菌酶，它们至少以在人母乳中发现的量存在。在其他的实施方案中，抗微生物蛋白质可以重组产生或从一种或多种人、牛、猪和山羊来源获得中的乳汁中分离。

根据本发明，抗微生物剂蛋白质和肽，如乳铁蛋白和溶菌酶的产生可以使用美国专利申请号10/077,381、10/411,395、PCT/US2004/041083和/或PCT/US2003/39107的教导获得，在此将其中的每篇全部引入作为参考。如此产生的抗微生物剂蛋白质和肽可在进一步纯化或不进一步纯化的情况下使用，和加入到口服制剂中。

在单子叶植物种子中产生抗微生物蛋白质和肽的优选方法包括下述步骤：

(a)用嵌合体基因转化单子叶植物细胞，所述嵌合体基因包括：

(i)来自成熟特异的单子叶植物贮藏蛋白的基因的启动子，

(ii)第一DNA序列，可操作地连接至所述启动子，编码单子叶植物种子特异性信号序列，所述序列能将与其连接的多肽靶向单子叶植物种子胚乳细胞，和

(iii)第二DNA序列，连接具有第一DNA序列的翻译框，编码抗微生物蛋白质和/或肽，其中第一DNA序列和第二DNA序列一起编码融合蛋白，该融合蛋白含有N-末端信号序列的抗微生物蛋白质和/或肽；

(b)从转化的单子叶植物细胞培养单子叶植物，至足够产生含有抗微生物蛋白质和/或肽的种子的时间；以及

(c)从植物中收获该种子。

优选，述抗微生物蛋白质和/或肽构成种子产品中全部可溶性蛋白质的至少3.0％，或全部种子重量的至少0.1％。

重组体人乳铁蛋白在谷物比如米和大麦中的表达，为产生和分离乳铁蛋白提供了成本有效的方法。已表明，在水稻中产生的人乳铁蛋白基本上与来自母乳的人乳铁蛋白等效。而且，研究证实聚糖模式中的差异非常不可能出现变应原性危险。通过对作为抗微生物、抗炎和免疫调节蛋白质的乳铁蛋白的研究证实，人乳铁蛋白在胃肠疾病中的使用提供了理想的应用。它们除了在治疗、预防和减少患者中腹泻影响的应用之外，可以施用根据本发明的营养供给产品以促进患这种健康的肠道菌群的发展。

对于患有急性水样腹泻的儿童，可以使用一种含有人乳铁蛋白与另一种母乳蛋白质、溶菌酶组合的口服补水溶液。人乳铁蛋白和/或溶菌酶也在预防长期护理的老年患者的腹泻中是有益的。在本发明的另一个实施方案中，人乳铁蛋白和/或溶菌酶可用作营养供应品并用于预防旅客和军队腹泻。在其他的实施方案中，本发明的口服补水溶液也可使用从一种或多种人、牛、猪和山羊来源的乳汁中分离的蛋白质来制备。本发明的制剂可以以适于产生预期效果的任何方式施用——使用其补水、治疗肠疾病或病症、预防肠疾病的发作或复发、抑制肠道病原体比如艰难梭菌和促进肠道中共生的微生物系统的生长。所述制剂可以作为溶液、用于重构的无水形式(粉末)、液态浓缩物(可以向其中加入水)、汁状物、酸奶酪等的形式提供，配制成营养棒(nutritionbar)、胶囊、片剂、糯米纸囊剂(wafer)等。

附图说明

将参照附图进一步详细地描述本发明。

图1显示了在根据本发明制备的口服溶液和标准ORS之间腹泻持续时间的差异；

图2显示了在根据本发明制备的口服溶液和标准ORS之间腹泻量的差异；

图3显示了与标准ORS相比，使用根据本发明制备的口服溶液后不到达48小时就具有固体粪便的患者的百分数；

图4显示了与标准ORS相比，使用根据本发明制备的口服溶液后复发患者的百分数；

图5显示了消耗的溶液量(根据本发明制备的口服溶液与ORS相比)；

图6显示了在有和没有1mg/ml rhLF的介质中大肠杆菌菌落形成比较，显示出在用rhLF处理的培养基中菌落减少；

图7显示了如通过在波长A630的光密度测定的乳铁蛋白抑制细菌细胞生长的线形图。所述三种处理为对照(仅仅培养基)、天然(含有天然人乳铁蛋白)和重组体(含有重组人乳铁蛋白)；

图8显示了在有和没有20μg/ml rhLZ的介质中大肠杆菌菌落形成的比较，显示出在用rhLZ处理的培养基中菌落减少；和

图9显示了来自三种处理：仅仅缓冲液(用白色正方形方框)、缓冲液加天然人溶菌酶(红线)和缓冲液加重组体人溶菌酶(绿线)的大肠杆菌菌落形成单元的线形图。

实施例

实施例1：重组体人乳铁蛋白的表达

A.人乳铁蛋白在转基因水稻中表达的表达载体

人乳腺乳铁蛋白的完整核苷酸序列为优化的密码子，其通过OperonTechnologies(CA，USA)合成。为了获得最佳的表达水平，用在水稻种子蛋白的翻译中最常使用的密码子再合成人乳乳铁蛋白基因(Genbank登记号码：HSU07642)。尽管密码子改变的数量占全部序列的22.46％，但氨基酸组成与非重组体人乳铁蛋白保持相同。含有密码子优化的基因的质粒称为Lac-ger。用Smal/Xhol消化Lac-ger，将含有乳铁蛋白基因的片段克隆至pAPI141，其被部分Nael消化，且完全被Xho消化。对于在水稻种子中hLF的表达，将密码子优化的基因可操作地连接于水稻胚乳特异性谷蛋白(Gt1)的启动子和NOS终止子。得到的质粒称为pAPI164。

B.产生系统

选择水稻品种Taipei 309(Oryza sativa，Japonica)作为重组体人乳铁蛋白(recombinant human lactorerrin，rhLF)的产生系统，通过用具有质粒pAPI164和作为可选的标记物的、含有潮霉素磷酸转移酶基因的相伴标记物质粒(companion marker plasmid)的粒子轰击胚胎发生的水稻胼胝体，最终得到转基因水稻植物。通过该步骤获得充分发育的、能繁殖的水稻植物。

C.重组体人乳铁蛋白在米颗粒中的高水平蛋白质表达

重组体人乳铁蛋白的表达在种子成熟特异性启动子Gt1的调控下。重组体人乳铁蛋白的高水平表示是显而易见的。在Laemli凝胶上试验来自成熟水稻种子提取物的全部可溶性蛋白质，用考马斯蓝染色以显影所述蛋白质。如用染色凝胶所显示的，在所有的转基因系中获得～80kD重组体乳铁蛋白蛋白质。重组体人乳铁蛋白的表达水平相当于种子重量的0.5％。监测10代重组体重组体人乳铁蛋白的稳定表达。表达水平维持在糙米(brown rice)的约5g/kg。

实施例2：重组体人乳铁蛋白的纯化

为了制备补充了重组体人乳铁蛋白的口服补水溶液，从米粉中纯化重组体人乳铁蛋白。选择表达高水平rhLF的转基因水稻系(164-12)。将这个系，现在称为LF164，每年种植两代，交替在夏季田间种植和在冬季温室种植。对于蛋白质纯化，通过使用脱壳机(Rice Mill，PS-160，Rimac，FL)对表达rhLF的稻米(paddy rice)脱壳，然后使用锤磨机(hammer mill，8WA，Schutte-Buffalo，NY)碾磨成面粉(平均粒子大小100目)。

通过在50L槽(tank)中将2kg的米粉和20L的提取缓冲液(0.02M磷酸钠，pH6.5和0.3M氯化钠)混合1小时，从转基因米粉中进行蛋白质的提取。在混合期结束时，使该悬浮液沉降过夜，或以3750rpm离心。在两种情况下，分别利用M-05和M-70纤维素/珠光体-基过滤器(Ertel Alsop，NY)，通过板框式过滤器(plate and frame filter，Ertel Alsop，8S，NY)过滤上清液。

将含有rhLF及其它米粉可溶性蛋白质的滤液装载在离子交换柱上进一步纯化。使用以SP-Sepharose速流(fast flow)(Amersham Pharmacia Biotech，NJ)填充的INDEX 200/500加工柱(Amersham pharmacia Biotech，NJ)。使用具有150-200cm/h的线性流速的柱。按制造商的说明进行填充柱性能的填充、净化和试验。将滤液装载在线速度为175cm/h的柱上，并用含有0.3M NaCl的0.02M磷酸钠缓冲液(pH6.5)洗涤，直至A₂₈₀回到基线。使用20mM含有0.8M NaCl的磷酸钠缓冲液(pH6.5)洗脱重组体hLF。洗涤和洗脱分别以200cm/h和150cm/h进行。

使用具有1ft² 50kDa的聚醚砜(Pall Biopharmaceutical，MA)膜的Centramate模(Pall Biopharmaceutical，MA)进行洗脱的hLF的浓缩和脱盐(浸润)。过滤在错流速率为约1.5L/分钟平均Tran膜压力为10psig下进行。浓缩洗脱的rhLF并脱盐至0.25L终体积，然后冻干。通常，从一千克转基因米粉中回收约3克纯化的重组体人乳铁蛋白。

从米粉纯化的重组体人乳铁蛋白为约50％被铁饱和(部分乳铁蛋白)。然后，将50％饱和的重组体人乳铁蛋白用铁进行处理使饱和＞90％，得到乳铁蛋白，并将饱和＜10％的铁用酸处理以除去结合铁，得到apo-乳铁蛋白。

实施例3：重组体人溶菌酶的生产和纯化

在来源于Oryza sativa，Japonica，Taipei 309的水稻品种LZ159中生产重组体人溶菌酶。使用标准的食品工业过程对该米去壳，并研磨至平均100目的米粉。使用具有0.3M NaCI pH4.5的0.02乙酸盐缓冲液从碾磨的米粉中提取重组体人溶菌酶。提取1.0至2.0小时后，通过离心从液相中分离固体米粉。过滤含有可溶性蛋白质的液相并浓缩。此时，产物为蛋白质浓缩物，其为＞10％溶菌酶蛋白质。使用离子交换层析进一步纯化该浓缩物。将该浓缩物装在SP Sepharose Big Bead Media的柱上，洗涤该柱，并用0.8M的氯化钠洗脱结合的溶菌酶。在冷冻干燥前，超滤分离物以除去过量的盐并浓缩。如通过HPLC分析测定，分离形式的溶菌酶为＞80％纯溶菌酶蛋白质。

实施例4：含有重组体蛋白质的ORS与标准ORS的比较

表1

成分	示例性的米-ORS-LF/LZ	可接受的范围
			钠(mmol/L)	75	80-90
钾(mmol/L)	20	15-25
			氯(mmol/L)	65	50-80
柠檬酸盐(mmol/L)	10	8-12
			葡萄糖(mmol/L)		≤111
碳水化物(g/L)	41.0	25-50
			rhLF(g/L)	1.0	0.5-50
rhLZ(g/L)	0.2	0.1-1.0
			渗透性(mOsm/L)	220-240	200-310

在患有急性水样腹泻的儿童的预期双盲研究中，将含有重组体人乳铁蛋白(rhLF)和重组体人溶菌酶(recombinant human lysozyme，rhLZ)及其它组分(如表1所示)的ORS与标准ORS进行了比较，所述重组体人乳铁蛋白(rhLF)和重组体人溶菌酶(rhLZ)的浓度与人母乳(1mg/ml的乳铁蛋白和0.2mg/ml的急性溶菌酶)中的类似的。将ORS的小药囊溶于1升已煮沸并冷却的水中。每日制备新鲜的ORS。

给予患有水样急性腹泻的一百四十个孩子根据本发明的ORS或根据WHO规定制备的标准ORS 14天。参与后，治疗继续直至腹泻停止两天或14天。研究表明含有乳铁蛋白和溶菌酶的ORS优于标准ORS，如通过测得腹泻持续时间和量减少所测量的(图1至图5)。

实施例5：重组体人乳铁蛋白的抗微生物作用

用大肠杆菌作为底物，测定重组体人乳铁蛋白的抗微生物活性。从培养平板制备大肠杆菌K12的培养细胞。将1mL中约10⁵CFU的大肠杆菌与1mg的rhLF混合；对照不含乳铁蛋白。将混合物在37℃培养120分钟，以250rpm振摇。然后，将5μl的混合物涂布平板(plated)。如可图6中所看到的，在加入rhLF的培养物中菌落形成单位显著地减少。

为了比较rhLF和天然hLF对大肠杆菌生长的作用，用三组进行另外的试验：阴性对照组(仅仅生长培养基)、阳性对照组(含有天然hLF的生长培养基)和治疗组(含有rhLF的生长培养基)。如图7所示，在生长培养基中大肠杆菌显著地增加，而在含有天然和重组体人乳铁蛋白的治疗组中大肠杆菌生长慢得多，表明在生长培养基中重组体人乳铁蛋白与天然乳铁蛋白在控制大肠杆菌生长方面具有相同的作用。

实施例6：重组体人溶菌酶的抗微生物作用

用大肠杆菌作为底物，测定重组体人溶菌酶的抗菌活性。从培养平板制备大肠杆菌K12的培养细胞。将1mL中约10⁵CFU的大肠杆菌与20μg的rhLZ混合；对照不含溶菌酶。将该混合物在37℃培养120分钟，以250rpm振摇。然后，将5μl的混合物涂布平板。如图8中所看到的，在加入rhLZ的培养物中菌落形成单位显著地减少。

为了比较rhLZ和天然hLZ的抗菌作用，用三组重复相同的试验：阴性对照组(仅仅缓冲液)、阳性对照组(含有天然hLZ的缓冲液)和治疗组(含有rhLZ的缓冲液)(图9)。在阴性对照组中，菌落形成单位没有减少，而在阳性对照组中，大肠杆菌显著地减少。在60分钟的培养时间时，菌落形成单位减少为100，并在120分钟接近零。具有rhLZ的治疗组与阳性对照组具有相同的作用，表明rhLZ和hLZ都具有杀菌活性。

实施例7：乳铁蛋白对艰难梭菌的体外抑制

为了测定乳铁蛋白抗艰难梭状芽胞杆菌的活性，进行本实施例。该研究包括在50个不同系的艰难梭菌上进行乳铁蛋白的体外敏感性试验。

50个系中的46个受4mg/ml乳铁蛋白的抑制。证实以16mg/ml抗一种分离物没有活性，且三种分离物不生长，并且认为是不确定的。

实施例8：乳铁蛋白对艰难梭菌的体内抑制

进行本实施例是为了测定来源于米的人乳铁蛋白在肠道进食的长期护理患者中处理肠道内艰难梭菌抗生素后建群(post-antibiotic colonization)和产生的炎症反应中的用途。

在经由肠道进食系统接受营养物的特定患者群体中，试验重组体人乳铁蛋白。已经报道该人群对艰难梭菌具有较高的易感性。当指示广谱抗生素治疗时，开始治疗，并持续8周。通过毒素A/B的阳性快速ELISA的存在，监测患者的艰难梭菌。所有的患者都通过胃造口术或空肠造口术管肠道进食。患者将接受肠道进食液形式的50mM NaCl中的来自米的重组体人乳铁蛋白(在8周研究期间的每24小时施用600ml 0.3％的生理盐水中的5mg/ml乳铁蛋白)或者接受600mL作为对照的0.3％生理盐水。

预期接受乳铁蛋白处理的患者群体将比对照群体的艰难梭菌的量低。

实施例9：乳铁蛋白治疗克隆氏病的用途

进行该研究是为了评价用作患有活性克隆氏病的儿科患者的营养供应品的重组体人乳铁蛋白对儿科克隆氏病活性指数(Pediatric Crohn’s DiseaseActivity Index，PCDAI)和医师整体评估的作用。

PCDAI为多项目测定，其包括线性生长以及强调主观报告症状较少但强调肠炎的实验室参数更多。该指数已被批准用于儿童和青少年，其已显示可区别疾病活性水平的变化。将在初始、4周、8周和12周时评价PCDAI。

来源于米的重组体人乳铁蛋白是粉末形式。治疗剂和安慰剂都以用于在汁或水中重构的1克的独立包装提供。建议的重构为250mL，但这可根据受试者的喜好改变，只要一次消耗了全部的1克剂量。最少的重构体积为150mL。剂量给药为每天两次。

预期该研究表明，与相比，除标准治疗剂外，还向患有轻度至中度克隆氏病(新发病或最近发病)的儿童施用重组体人乳铁蛋白，将比单独的标准治疗剂产生更快的疾病稳定和疾病改善，如同通过PCDAI和医师整体评估所评价的。

当然，应当认识到仅以实施例的方式给出了上述描述，可以在本发明的范围内进行详细的修改。

在本申请中，引用了各种专利和出版物。在此，将这些专利和出版物的公开内容以其全部引入本申请作为参考，以便更充分地描述本发明所属领域的技术现状。本发明能够在形式和功能方面进行相当大的改进、改变和等效替换，如具有本发明公开内容益处的相关领域中的普通技术人员所想到的。

虽然本发明已经对被目前认为是优选的实施方案进行了描述，但本发明并不限于此。相反，本发明意欲涵盖包括在上述提供的详细说明的精神和范围内的各种改进和等效方案。例如，尽管重组产生的人乳蛋白质代表本发明优选的实施方案，本发明也可使用重组产生的或从乳汁分离的蛋白质进行，其中所述乳汁来源于一种或多种人、牛、猪和山羊来源。

Claims (45)

1、预防或治疗患者肠道病症发作或复发的方法，所述患者已暴露于引起肠道病症的媒介物中，该方法包括向所述患者施用含有乳蛋白质的口服制剂的步骤。

2、权利要求1的方法，其中所述肠道病症选自下组：霍乱、腹泻、隐孢子虫病、食源性疾病、胃肠炎、溃疡、炎症性肠病、沙门氏菌病、伤寒和AIDS。

3、权利要求1的方法，其中所述乳蛋白质为从乳汁中分离出或重组产生。

4、权利要求3的方法，其中所述乳蛋白质为从一种或多种人类、牛、猪和山羊来源的乳汁中所分离。

5、权利要求3的方法，其中所述乳蛋白质为在植物细胞中重组产生。

6、权利要求4的方法，其中所述乳蛋白质为选自下组的重组产生的人乳蛋白质：乳铁蛋白、溶菌酶及其组合。

7、权利要求1的方法，其中所述口服制剂进一步包含一种或多种独立地选自下组的附加蛋白质：防卫素、组织蛋白酶抑制素、乳铁蛋白和乳过氧化物酶。

8、权利要求1的方法，其中所述口服制剂为溶液的形式。

9、权利要求1的方法，其中所述口服制剂为营养棒的形式。

10、权利要求1的方法，其中所述口服制剂为适于在水中重构的粉末形式。

11、权利要求1的方法，其中所述口服制剂为丸剂、片剂或胶囊的形式。

12、权利要求1的方法，其中所述引起肠道病症的媒介物选自下组：细菌、病毒、真菌和寄生虫。

13、权利要求12的方法，其中所述细菌选自下组：梭菌属、弯曲杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和埃希氏菌属。

14、权利要求12的方法，其中所述病毒选自下组：轮状病毒、诺瓦克病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷性病毒和病毒性肝炎病毒。

15、权利要求12的方法，其中所述寄生虫选自下组：蓝氏贾第虫、溶组织内阿米巴和隐孢子虫。

16、预防和治疗患者腹泻发作和复发的方法，所述患者已暴露于引起腹泻的媒介物中，该方法包括向所述患者施用含有从单子叶植物种子获得的重组产生的人乳蛋白质的口服制剂的步骤。

17、权利要求16的方法，其中所述重组产生的人乳蛋白质选自下组：乳铁蛋白、溶菌酶及其组合。

18、权利要求16的方法，其中所述口服制剂进一步包含一种或多种独立地选自下组的附加蛋白质：防卫素、组织蛋白酶抑制素和乳过氧化物酶。

19、权利要求16的方法，其中所述口服制剂为溶液的形式。

20、权利要求16的方法，其中所述口服制剂为营养棒的形式。

21、权利要求16的方法，其中所述口服制剂为适于在水中重构的粉末形式。

22、权利要求16的方法，其中所述引起腹泻的媒介物为选自下组的肠病原体：细菌、病毒、真菌和寄生虫。

23、权利要求22的方法，其中所述细菌选自梭菌属、弯曲杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和埃希氏菌属。

24、权利要求22的方法，其中所述病毒选自下组：轮状病毒、诺瓦克病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和病毒性肝炎病毒。

25、权利要求22的方法，其中所述寄生虫选自下组：蓝氏贾第虫、溶组织内阿米巴和隐孢子虫。

26、预防和治疗炎症性肠病的方法，其包括向患有所述疾病的患者施用含有从单子叶植物种子获得的重组产生的人乳蛋白质的口服制剂。

27、权利要求26的方法，其中所述炎症性肠病选自下组：克隆氏病和溃疡性结肠炎。

28、权利要求26的方法，其中所述重组产生的人乳蛋白质选自下组：乳铁蛋白、溶菌酶及其组合。

29、权利要求28的方法，其中所述口服制剂进一步包含一种或多种独立地选自下组的附加蛋白质：防卫素、组织蛋白酶抑制素和乳过氧化物酶。

30、权利要求26的方法，其中所述口服制剂为溶液的形式。

31、权利要求26的方法，其中所述口服制剂为营养棒的形式。

32、权利要求26的方法，其中所述口服制剂为适于在水中重构的粉末形式。

33、促进患者的消化道中肠内益生菌群生长的方法，其包括向所述患者施用含有从单子叶植物种子获得的重组产生的人乳蛋白质的口服制剂。

34、权利要求33的方法，其中所述重组产生的人乳蛋白质选自下组：乳铁蛋白、溶菌酶及其组合。

35、权利要求34的方法，其中所述口服制剂进一步包含一种或多种独立地选自下组的附加蛋白质：防卫素、组织蛋白酶抑制素和乳过氧化物酶。

36、权利要求33的方法，其中所述口服制剂为溶液的形式。

37、权利要求33的方法，其中所述口服制剂为营养棒的形式。

38、权利要求33的方法，其中所述口服制剂为适于在水中重构的粉末形式。

39、口服补水溶液，其包括：

重组体人乳铁蛋白，含量为约0.5至约5.0g/L；和

重组体人溶菌酶，含量为约0.1至约1.0g/L，

其中所述口服补水溶液具有约200至约310mOsm/L的渗透性。

40、权利要求39的口服补水溶液，其中所述重组体人乳铁蛋白和重组体人溶菌酶为从单子叶植物种子中获得的。

41、粉末形式的口服补水制剂，其包含重组体人乳铁蛋白和重组体人溶菌酶，其中，当与水重构以提供口服补水溶液时，该口服补水溶液提供：

重组体人乳铁蛋白，含量为约0.5至约5.0g/L；和

重组体人溶菌酶，含量为约0.1至约1.0g/L，

其中所述口服补水溶液具有约200至约310mOsm/L的渗透性。

42、权利要求41的口服补水制剂，其中所述重组体人乳铁蛋白和重组体人溶菌酶为从单子叶植物种子中获得的。

43、液态浓缩物形式的口服补水制剂，其包含重组体人乳铁蛋白和重组体人溶菌酶，其中，当与水重构以提供口服补水溶液时，该口服补水溶液提供：

重组体人乳铁蛋白，含量为约0.5至约5.0g/L；和

重组体人溶菌酶，含量为约0.1至约1.0g/L，其中所述口服补水溶液具有约200至约310mOsm/L的渗透性。

44、权利要求43的口服补水制剂，其中所述重组体人乳铁蛋白和重组体人溶菌酶为从单子叶植物种子中获得的。

45、治疗腹泻的方法，其包括向腹泻患者施用权利要求39、41或43的口服补水溶液。

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