ITMI20131578A1 - Sostanza e formulazione per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche intestinali - Google Patents

Description

SOSTANZA E FORMULAZIONE PER IL TRATTAMENTO DELLE MALATTIE INFIAMMATORIE CRONICHE INTESTINALI

La presente invenzione riguarda i trattamenti delle malattie infiammatorie croniche intestinali, come ad esempio il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, e tutte le malattie intestinali di origine infettiva, ed in particolare si riferisce ad una sostanza per uso nel trattamento dell’infiammazione in pazienti affetti da malattie infiammatorie intestinali.

Il morbo di Crohn (CD), la colite ulcerosa (UC) e le malattie infiammatorie dell'intestino (IBS) di origine infettiva sono malattie multifattoriali ad eziologia spesso sconosciuta. La deregolamentazione del sistema immunitario innato e adattativo diretto contro i batteri luminali o i loro prodotti e le risposte immunitarie inadeguate verso gli organismi a livello intestinale che normalmente non suscitano una risposta sono fattori immunitari caratteristici di CD, UC ed altre malattie infiammatorie dell'intestino .

Secondo le conoscenze attuali, i microrganismi approfittano dello strato mucoso indebolito dei pazienti affetti da malattie infiammatorie croniche intestinali e dell'incapacità di eliminare i batteri dalle pareti intestinali, causando in tal modo i sintomi delle malattie .

Alcuni studi hanno dimostrato che gli Escherichia coli aderenti invasivi (AIEC) sono molto più frequenti nei pazienti affetti da morbo di Chron rispetto ai controlli Altri studi, come quello pubblicato in Curr Opin Gastroenterologia .2007; 23 (1): 16 - 20 "Adherent-Invasive Escherichia coli and Crohn’s disease" di Nicolas Barnich, Arlette Darfeuille - Michaud, ha indicato che il ciclo di infezione di E. coli aderenti invasivi potrebbe dipendere dalla capacità di AIEC di colonizzare il tratto gastrointestinale dei pazienti geneticamente predisposti al morbo di Crohn, in cui antibiotici che possano sradicare i batteri , o probiotici che li possano sostituire nel tratto gastrointestinale, potrebbero essere di valore terapeutico nella malattia di Crohn ileale .

Gli Escherichia coli Aderenti - Invasivi comprendono un sottogruppo di E. coli spp. denominato dalla loro capacità caratteristica di aderire alle cellule intestinali, di invadere le cellule eucariotiche infette e di replicarsi in cellule epiteliali e macrofagi, provocando malattie intestinali nell'uomo. LF82, un ceppo di E. coli (sierotipo O83: H1) originariamente isolato da un paziente con malattia di Crohn rappresenta il ceppo AIEC prototipo, come descritto in Darfeuille - Michaud A., Neut C., Barnich N., Lederman E., Di Martino P., Desreumaux P. et al. "Presenza di aderenti ceppi di Escherichia coli in mucosa ileale di pazienti con malattia di Crohn " Gastroenterology , 115 (1998) , pp 1405-1413.

La lattoferrina (Lf), un membro della famiglia delle tranferrine di glicoproteine ferro-leganti, costituisce uno dei principali sistemi antimicrobici nel latte e altre secrezioni esocrine. Le proprietà biologiche riportate per Lf includono un’attività antimicrobica contro una vasta gamma di batteri patogeni, funghi, protozoi e virus, nonché attività antinfiammatoria, antitumorale ed immuno-modulatoria, come descritto in Steijns, JM e Van Hooijdonk, ACM "Occurrence, structure, biochemical properties and technological characteristics of lactoferrin" Br J Nutr 2000; 84, 511-517 , and Superti, F.; Berlutti, F.; Paesano, R., Valenti, P. " Structure and activity of lactoferrin – A multi functional protective agent for human health". Iron Metabolism and Disease; Fuchs , H. , Ed.; Reasearch Signpost: . Kerala , India , 2008; pp 1-32 .

Generalmente, il trattamento delle malattie infiammatorie intestinali acute comprende l'uso di farmaci, per esempio farmaci antibiotici, per trattare qualsiasi infezione e farmaci anti - infiammatori e corticosteroidi per ridurre l’infiammazione. Tuttavia, l'uso prolungato di antibiotici, farmaci anti- infiammatori e corticosteroidi ha significativi effetti collaterali e deve essere evitato.

Pertanto, scopo della presente invenzione è fornire una sostanza per uso nel trattamento di pazienti affetti da malattia infiammatoria intestinale associata ad una infezione batterica, che non causi alcun effetto collaterale significativo.

Tale scopo è stato raggiunto per mezzo di lattoferrina per l'uso secondo la prima rivendicazione, e di formulazioni a rilascio modificato comprendenti lattoferrina per l'uso secondo la rivendicazione 4, mentre altre caratteristiche sono specificate nelle restanti rivendicazioni .

Secondo la presente invenzione, si è scoperto che la lattoferrina, in particolare la lattoferrina bovina, esercita forti effetti inibitori sull’ invasione da AIEC delle cellule epiteliali intestinali e può essere utilizzata nel trattamento di malattie intestinali infiammatorie, come per esempio sia il morbo di Crohn che la colite ulcerosa, e per il mantenimento della remissione in pazienti portatori di AIEC patogeni che colonizzano lesioni ileali precoci e croniche.

Infatti, prove effettuate dagli inventori mostrano che un idrolizzato di lattoferrina con pepsina è in grado di impedire l'adesione AIEC e internalizzazione nelle cellule intestinali mentre non è in grado di ridurre l'infiammazione. Al contrario, sorprendentemente la lattoferrina inibisce fortemente l’invasione da AIEC delle cellule intestinali e riduce l'infiammazione .

Secondo l'invenzione si è constatato inoltre che, a concentrazione non citotossica e non battericida, il trattamento con lattoferrina non ha avuto effetto sulla adesione batterica mentre era in grado di prevenire l'invasione delle cellule intestinali dal ceppo AIEC prototipo LF82 in modo dose-dipendente.

Pertanto le formulazioni a rilascio modificato comprendenti lattoferrina possono essere usate nel trattamento di condizioni infiammatorie croniche associate con una infezione batterica, in particolare una invasione da AIEC e da qualsiasi altro microrganismo collegato a malattie infiammatorie intestinali .

In particolare, l' uso di lattoferrina bovina, essendo privo di effetti collaterali negativi, potrebbe essere utilizzato nel trattamento del morbo di Crohn e di altre malattie infiammatorie intestinali e nel mantenimento dello stato remissione dei pazienti.

In conseguenza dei risultati di cui sopra, le formulazioni a rilascio modificato secondo la presente invenzione comprendenti lattoferrina o preferibilmente lattoferrina bovina sono state ottenute da una selezione attenta e intenzionale dei sistemi a rilascio modificato noti e delle sostanze in esso impiegate .

Infatti, le formulazioni a rilascio modificato di lattoferrina secondo la presente invenzione hanno un'attività localizzata nel tratto gastrointestinale o una differente attività sistemica, e un rilascio controllato dalle prime fasi di somministrazione. Inoltre, l’omogeneità di rilascio nel tempo è assicurata e contemporaneamente è consentito che, una volta che sia stata resa disponibile una parte del principio attivo, è immediatamente attiva sia a livello topico o a livello sistemico, per il suo stato di microemulsione, solubilizzazione o complessazione.

Secondo la presente invenzione, viene fornita una sostanza per uso nel trattamento delle malattie infiammatorie intestinali, detta sostanza essendo lattoferrina e preferibilmente lattoferrina bovina.

In particolare, la lattoferrina viene fornita per l'uso nel trattamento della malattia intestinale da invasione di Escherichia coli, più in particolare per l'uso nel trattamento della malattia intestinale da invasione di Escherichia coli adesivo-invasivo.

La lattoferrina per uso secondo la presente invenzione può essere somministrata in qualsiasi quantità giornaliera che abbia il risultato di una riduzione dei sintomi delle malattie infiammatorie intestinali. Preferibilmente, lattoferrina per l'uso secondo la presente invenzione può essere somministrata in quantità tra 50 mg e 250 mg al giorno; più preferibilmente detta quantità giornaliera è compresa tra 100 mg e 200 mg al giorno.

In ogni caso, gli esperti del ramo sarebbero in grado di regolare le quantità e il programma di dosaggio dall'osservazione dell’efficacia del trattamento. Di conseguenza, è previsto che l’intervallo del dosaggio di applicazione potrebbe essere parecchie volte superiore o inferiore a quello ottimale sopra indicato. Mentre la via di somministrazione preferita è la somministrazione orale, è evidente agli esperti nel ramo che secondo l' invenzione sarebbero anche adatte altre vie di somministrazione, come la somministrazione sottocutanea, intramuscolare, endovenosa e simili.

Secondo un altro aspetto della presente invenzione, viene fornita una formulazione orale di dosaggio a rilascio modificato comprendente lattoferrina per l'uso nel trattamento di malattie intestinali infiammatorie come il morbo di Crohn, colite ulcerosa, in particolare per l'uso nel trattamento di malattie intestinali dovute ad una invasione da Escherichia coli, più in particolare per l'uso nel trattamento delle malattie infiammatorie intestinali dovuti ad una invasione da Escherichia coli LF82.

In particolare, dosaggio a rilascio modificato significa un rilascio ritardato che permette di ottenere il vantaggio di una ridotta frequenza di somministrazione e un rilascio della sostanza attiva in particolari punti del tratto gastrointestinale.

La formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo la presente invenzione comprende lattoferrina disciolta e / o dispersa e / o incorporata in una matrice, e un rivestimento esterno, in cui detta matrice comprende :

- sostanze selezionate nel gruppo di: sostanze lipidiche, sostanze idrofile, sostanze anfifiliche e loro miscele, e

- opzionalmente, eccipienti farmaceuticamente accettabili destinati a facilitare la fattibilità della forma farmaceutica .

Come lattoferrina nella formulazione orale secondo l'invenzione presente può essere utilizzata lattoferrina bovina. La quantità di lattoferrina nelle formulazioni orali secondo la presente invenzione è preferibilmente atta a consentire la somministrazione di lattoferrina in un dosaggio giornaliero compreso tra 50 mg e 250 mg, preferibilmente tra 100 mg e 200 mg, in una o più somministrazioni giornaliere .

Detto rivestimento esterno è preferibilmente formato da materiali provvisti della proprietà di solubilità gastrica o della proprietà di resistenza gastrica e / o della proprietà di rilascio allo specifico pH intestinale (proprietà di rilascio dipendente dal pH), o della proprietà di rilascio ritardato indipendente dal pH.

I materiali idonei per detto rivestimento esterno delle formulazioni orali secondo la presente invenzione comprendono acetato ftalato di cellulosa, acetato metacrilico, polimeri di acido metacrilico, gommalacca, etilcellulosa, acidi alginici e loro combinazioni; possono essere menzionati agenti di rivestimento preferibilmente gastroresistenti selezionati nel gruppo costituito da gommalacca, polimetacrilati, acetoftalato di cellulosa, derivati di alginati. Preferibilmente possono essere utilizzati gommalacca acquosa (per esempio, il prodotto Aquagold® da Harke) e loro combinazioni, o una combinazione di etilcellulosa e sali di acido alginico commercializzato come Nutrateric® sistema di rivestimento enterico nutrizionale da Colorcon Inc. di Westpoint, Pa.

Le sostanze lipidiche che possono essere utilizzate nella matrice della composizione orale secondo l'invenzione comprendono alcoli grassi, acidi grassi, trigliceridi, cere. Preferibilmente, dette sostanze lipidiche sono scelte nel gruppo costituito da acido palmitico, alcool cetilico, alcool cetostearilico, cera carnauba, acido stearico.

Le sostanze idrofile che possono essere utilizzate nella matrice della composizione orale secondo l' invenzione comprendono idrogel, cioè sostanze che passando dallo stato anidro allo stato idrato presentano un fenomeno di rilassamento molecolare, caratterizzato da un notevole aumento di volume del sistema e da un aumento delle dimensioni e peso dopo il coordinamento di un gran numero di molecole d’acqua da parte dei gruppi polari presenti nella catena polimerica. Gli idrogel che possono essere usati secondo l'invenzione sono selezionati nel gruppo dei polimeri o copolimeri di acido acrilico o metacrilico, polimeri di alchil vinil eteri, idrossialchilcellulose, carbossialchilcellulose, polisaccaridi, alginati, pectine, amidi, gomme naturali e sintetiche, policarbofil e miscele. Preferibilmente, dette sostanze idrofile comprendono idrossipropilmetilcellulosa (per esempio venduto con i nomi commerciali Methocel® K4M, K15M, K100M, 100LV), carbossimetilcellulosa (per esempio venduto sotto il nome commerciale Blanose® ), idrossipropilcellulosa (per esempio venduto con i nomi commerciali Klucel® EF , LF , JF , GF , MF , HF), cellulosa microcristallina, amidi come amido di mais e lattosio.

Le sostanze anfifiliche della matrice che possono essere utilizzati nelle formulazioni secondo l' invenzione comprendono lecitina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina, alchil eteri di glicole come dietilenglicole monometiletere, macrogolgliceridi, polietilene glicole idrossistearati, cere, sodio laurilsolfato, sodio dodecilsolfato, polisorbati, acido colico, polossameri, sodio sulfosuccinato, sodio laurilsarcosinato e loro miscele. Preferibilmente, dette sostanze anfifiliche comprendono lauroil polossigliceridi (per esempio, il prodotto commercializzato con il nome commerciale Gelucire® 44/14 o Labrafil® M2130Cs ), olio di cocco idrogenato, PEG 1500 esteri, stearoil poliossigliceridi (per esempio, il prodotto commercializzato con il nome commerciale Gelucire® 50/13, olio di palma idrogenato, lecitina (per esempio, i prodotti commercializzati con il nome commerciale Epikuron®, Phosal®, Phospholipon® 100 H , Lipoid®).

Tali eccipienti farmacologicamente accettabili che hanno lo scopo di agevolare la fattibilità della forma farmaceutica possono essere scelti fra gli agenti di scorrimento, diluenti, agenti anti-aderenti, lubrificanti, disgreganti, antiagglomeranti, stabilizzanti .

Secondo una realizzazione alternativa, la formulazione orale secondo l' invenzione è nella forma di un sistema reservoir in cui lattoferrina è disciolta e/o dispersa e/o collocata in un nucleo del reservoir che è rivestito da membrane di cellulosa semipermeabili all'acqua, preferibilmente membrane di etilcellulosa.

I nuclei del reservoir possono essere considerati contenitori di lattoferrina che sono adeguatamente rivestiti con membrane semipermeabili fatte di derivati di cellulosa come etilcellulosa, metilcellulosa, metil etil cellulosa, idrossipropil metilcellulosa.

Altri componenti facoltativi delle composizioni orali secondo la presente invenzione sono eccipienti filmogeni ed eccipienti di granulazione e possono a loro volta essere scelti tra gli agenti di rivestimento gastrosolubili, agenti di rivestimento gastroresistenti, agenti di rivestimento pH dipendenti, agenti di rivestimento pH indipendenti dotati di proprietà di rilascio sito- specifiche e includono acetato ftalato di cellulosa, polimeri dell'acido metacrilico, gomma lacca, etilcellulosa, acidi alginici.

Inoltre, le formulazioni secondo la presente invenzione possono comprendere altre sostanze attive come farmaci anti-infiammatori, mesalazina, derivati di mesalazina, corticosteroidi, azatioprina, ciclosporina, anticorpi monoclonali.

Le formulazioni orali secondo la presente invenzione possono essere prodotti mediante procedimenti di fabbricazione scelti tra quelli normalmente utilizzati nelle aree di produzione farmaceutica, come processo di compressione diretta, processo di granulazione a umido, processo di compattazione / granulazione a secco e processo comprendente granulazione per fusione e carico / co-macinazione e riempimento finale di polvere.

In particolare, le formulazioni orali secondo l'invenzione possono essere ottenute con un metodo costituito dai seguenti stadi:

a) miscelare lattoferrina setacciata con sostanze di matrice selezionate tra sostanze lipidiche, sostanze idrofile, sostanze anfifiliche;

b) opzionalmente, aggiungere altri principi attivi;

c) effettuare una fase scelta nel gruppo costituito da granulazione a umido, granulazione a secco, riempimento diretto, co - macinazione, granulazione allo stato fuso;

d) opzionalmente, aggiungere altri eccipienti farmaceuticamente accettabili destinati a facilitare la fattibilità della forma farmaceutica, come ad esempio: agenti di scorrimento, diluenti, agenti anti-aderenti, lubrificanti, disgreganti, per ottenere la forma solida in polveri e / o granuli e / o microcompresse e / o microgranuli con buone proprietà di scorrevolezza e compressibilità;

e) rivestimento con film mediante eccipienti gastrosolubili o gastroresistenti o eccipienti pH dipendenti e / o pH - indipendenti in grado di ritardare il rilascio di lattoferrina, al fine di ottenere un rivestimento esterno che fornisce un rilascio sitospecifico nel tratto gastrointestinale.

Secondo l'invenzione, per la preparazione di un sistema a matrice monolitica viene preparata una matrice lipidica o idrofila o anfifila contenente la lattoferrina, poi sono aggiunti vari eccipienti funzionali per diluire e rendere attuabile il prodotto attraverso i processi farmaceutici adatti. Il rapporto tra le quantità di farmaco e sostanze della matrice rispetto agli eccipienti che vengono aggiunti in questo passaggio di norma non supera 1:4; la quantità ottimale di farmaco e sostanze della matrice è compresa tra 0,1 % e 20% in peso rispetto alla quantità di eccipienti.

A questa miscela, è possibile aggiungere diluenti in una quantità fino al 50 % in peso, lubrificanti in una quantità di 0,5-3 % in peso, agenti di scorrimento in una quantità di 0,5-3 % in peso, e disintegranti in quantità di 0,1-40 % in peso, tutte le percentuali essendo riferite al peso finale della forma di dosaggio unitario.

Una forma farmaceutica alternativa di lattoferrina consiste in sistemi reservoir. Per preparare un sistema reservoir di lattoferrina, viene preparato un nucleo contenente lattoferrina farmaceutica multiparticolata o monolitica di caricando lattoferrina su eccipienti inerti quali diluenti, agenti di scorrimento, lubrificanti. Il rapporto in peso tra lattoferrina e agenti diluenti può essere ad esempio 1:1; il rapporto in peso tra lattoferrina e agenti di scorrimento può essere per esempio 1:0,5 ; il rapporto in peso tra lattoferrina e lubrificanti può essere per esempio 1:0,5 . Il nucleo risultante viene poi rivestito con una membrana semipermeabile che regola il tempo di ritardo e il tempo di rilascio. La membrana può essere formata da polimeri di cellulosa e loro derivati, e il rivestimento fornisce un aumento del peso del sistema dal 0,5 % al 30 %.

In termini di caratteristiche di dissoluzione, il contatto di queste formulazioni con acqua o fluidi acquosi provoca il rilascio modificato e/o ritardato e/o rallentato e/o sito specifico del principio attivo che viene immediatamente disperso, solubilizzato nel sistema così formulato. Gli eccipienti ed i polimeri presenti nella struttura regolano la bagnabilità del sistema e la solubilizzazione omogenea di lattoferrina nei ristretti intervalli di rilascio, favorendo così la sua attività localizzata e/o un assorbimento continuo e graduale o il rilascio topico graduale nel tratto gastrointestinale.

Ulteriori vantaggi e caratteristiche delle formulazioni di lattoferrina per l'uso secondo la presente invenzione risulteranno evidenti agli esperti del ramo dai seguenti esempi con riferimento alle figure allegate , in cui:

- la figura 1 è un grafico che mostra l'effetto di bLf e bLfH (1 mg / ml) sulla capacità di adesione di LF82 alle cellule epiteliali;

- la figura 2 è un grafico che mostra l'effetto di bLf e bLfH (1 mg / ml) sulla capacità di invasione di LF82 sulle cellule epiteliali;

- le figure 3 A, B e C sono grafici che mostrano l'effetto di bLf ( 1 mg / ml ) sull’espressione mRNA di TNF alfa, IL-8 e IL6 in cellule epiteliali;

- le figure 4 A e B sono grafici che mostrano l'effetto di bLf sull'espressione mRNA di TNF -alfa, IL-8 e di IL- 6 in colture di espianti di mucose infettate da LF82 per 6 ore (A) e 24 ore (B) e

- la figura 5 è un grafico che mostra l'effetto dell'aggiunta di bLf sull’espressione di mRNA di citochine pro-infiammatorie, in particolare TNF-alfa, in cellule trattate con INF -gamma.

Materiali e Metodi

Il ceppo di E. coli aderenti, invasivi utilizzati in questo studio era LF82 (ceppo di Crohn ileale , gentilmente fornito da Arlette Darfeuille - Michaud, Clermont Université, Université d'Auvergne , Clermont - Ferrand , Francia ).

LF82 fu coltivato in piastre di agar MacConkey per 24 ore a 37°C e poi sottocoltivato in brodo Luria Bertani (LB, Oxoid) con incubazione in aria a 37°C per una notte. Prima dell’infezione delle cellule, i batteri furono lavati e risospesi in un mezzo di coltura cellulare alle concentrazioni idonee.

Colture di linee cellulari

Caco-2 (adenocarcinoma colorettale umano), le cellule furono ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MA). Le cellule furono coltivate a 37°C in atmosfera umidificata con il 5 % di CO2in terreno essenziale minimo di Dulbecco (DMEM, Gibco) supplementato con 10 % di siero di vitello fetale disattivato (FCS, Euroclone) e 2 mM di L- glutammina.

Coltura di organi

Lo studio è stato approvato dal comitato etico del Policlinico universitario Umberto I, dove i pazienti sono stati ricoverati. Per ogni paziente fu ottenuto il consenso informato da parte dei genitori. Dopo il consenso scritto, furono ottenute biopsie di soggetti di CD da tessuto intestinale macroscopicamente non coinvolto in processi di infiammazione cronica. Quattro campioni di colture d'organo furono immediatamente messi in terreno Trowell T8 medie e trattati come descritto di seguito.

Campioni bioptici della mucosa furono collocati su griglie di ferro con la faccia della mucosa verso l'alto nel pozzo centrale di un piatto di coltura d'organo (Falcon, Becton Dickinson , NJ , USA) contenente terreno Trowell T8 e terreno NCTC -135 (rapporto 3:1) ( BioWest , Miami , FL , USA ) supplementato con 10 % FCS (Euroclone). I piatti furono disposti in una camera di incubatrice modulare (MP Biomedicals , Aurora , Ohio , USA) ad alta saturazione di ossigeno ( 95 % ) e incubate a 37 ° C.

Chimica

Lattoferrina bovina (bLf) e il suo idrolizzato di pepsina (bLfH), prodotto da Morinaga Milk Industry Co., Ltd. furono sciolti in PBS alla concentrazione di 80 mg/ml.

Test di citotossicità

Per stabilire la dose massima non citotossica di bLf o bLf-idrolizzato, diluizioni seriali di ogni singolo preparato furono incubate a 37°C con le diverse linee cellulari coltivate in diversi mezzi di crescita a 37°C in un incubatore umidificato al 5% di CO2. Dopo 24, 48 e 72 ore, i seguenti parametri saranno valutati: enumerazione delle cellule, morfologia e vitalità dopo la dispersione in singole cellule con tripsina.

Attività antibatterica

Le concentrazioni minime inibenti (MIC) di bLf e bLfH furono determinate con metodi di microdiluizione del brodo. Le prove furono effettuate con cellule LF82 precedentemente cresciute fino alla fase di crescita esponenziale in brodo Mueller-Hinton ad una concentrazione finale di 5 x 105 CFU / ml.

Cento microlitri di batteri furono aggiunti ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di bLf o bLfH a diversa concentrazione (diluizioni doppie seriali vanno da 0,08 a 40 mg/ml). La MIC fu definita come la concentrazione minima di proteina o idrolizzato che causa una completa inibizione della crescita batterica dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C.

Per determinare la concentrazione battericida minima (MBC), un volume di 100 microlitri fu prelevato dai pozzetti in cui non fu rilevata alcuna crescita, distribuito su piastre di TSA e incubato a 37 ° C per 24 h. MBC sarà definita come la concentrazione alla quale vi è > 99,9 % ( 3 log) di diminuzione delle cellule vitali.

Inibizione di LF82 adesione a cellule Caco-2

Monostrati cellulari di Caco-2 furono preparati in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti ( Falcon).

Prima della prova di adesione, le cellule furono incubate a 37°C in DMEM supplementato con 10 % FCS in presenza o assenza di bLf o bLfH (1mg/ml). Dopo 2 ore, le cellule furono infettate con LF82 ad una molteplicità di infezione (MOI) di 1 o 10 batteri per cellula. Dopo 3h di incubazione a 37°C, le cellule furono lavate 3 volte e lisate con 0.1 % TritonX -100 e il numero di CFU fu determinato mediante placcatura. L’adesione batterica nelle diverse condizioni sperimentali fu definito come la percentuale di batteri attaccati in confronto con l'adesione di batteri non trattati presa come 100 %. Tutti i saggi furono eseguiti tre volte.

Inibizione dell’adesione LF82 in cellule Caco-2

Per determinare l'invasione batterica, monostrati di cellule Caco-2 furono infettati con 1 o 10 batteri per cellula. Dopo 3h incubazione a 37 ° C , le cellule furono lavate 3 volte e incubate per 2 ore aggiuntive in terreno supplementato con 0.1mg/ml di gentamicina per uccidere i batteri extracellulari. L' attività di inibizione della bLf o bLfH 1mg/ml fu valutata incubando le cellule per due ore prima e durante l'infezione, in presenza o assenza di proteine. Poi i monostrati furono lavati e lisati mediante aggiunta di acqua deionizzata contenente 0,1 % Triton X - 100 per 5 min per rilasciare batteri internalizzati. Tutti i saggi furono eseguiti tre volte. L’invasione batterica nelle diverse condizioni sperimentali fu definita come la percentuale dei batteri intracellulari che sono coltivabili dopo il trattamento di gentamicina e lisi cellulare in confronto con i batteri non trattati presi come 100 % .

Analisi di citochine in cellule Caco-2 infettate

Cellule Caco-2 furono incubate in assenza o presenza di bLf di bLfH per 2 ore prima e durante l'infezione (3 ore a 37°C) con LF82 ( MOI 1 o 10). Dopo l'infezione , furono raccolti i sovranatanti della coltura, puliti da qualsiasi cellula e patogeno per centrifugazione, e tenuti congelati a - 80 ° C fino all'uso. Surnatanti ed estratti cellulari furono processati per individuare citochine (IL- 6 , IL- 8 e TNF - alfa), mediante RealTime -PCR quantitativa .

Analisi di citochine in colture d'organo infetti

Colture d'organo furono incubate in assenza o presenza di bLf prima e durante l'infezione (2 ore a 37 ° C) con LF82 (108 CFU / ml). I piatti furono quindi posti in una camera incubatrice modulare (MP Biomedicals , Aurora , OH) ad alta saturazione di ossigeno (95 %) e incubate a 37 ° C. Dopo 6 e 24 ore, furono raccolte biopsie e fu estratto l’RNA totale per l’analisi PCR a trascrizione inversa (RT - PCR).

Induzione di citochine in cellule Caco-2

Induzione di citochine proinfiammatorie stata fu eseguita trattando cellule Caco-2, in assenza o in presenza di bLf, con 5ng/mL di interferone gamma per 6 ore. Surnatanti ed estratti cellulari furono trattati per citochine (IL- 6, IL- 8 e TNF - alfa), mediante RealTime -PCR quantitativa.

Real- time PCR

L’espressione di TNF - alfa , IL- 8 e IL -6 fu rilevata mediante Real - time PCR. I primer furono progettati per le sequenze non ridondanti utilizzando Primer Express V3.0 (Applied Biosystems, Foster City , California. Stati Uniti) .

I primer erano: TNF-alfa : fwd 5’-TCTGGCCCAGGCAGTCAGATC-3’; rvs 5’-CAGTGATGTTGGGGATAAAGAGC-3’; IL-8: fwd 5’-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT-3’; rvs 5’-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3’; IL-6: fwd 5’-AGGGCTCTTCGGCAAATGTA3’; rvs 5’-GAAGGAATGCCCATTAACAACAA-3’.

L'RNA totale ( 1μg ) fu retro-trascritto a cDNA da un cDNA Kit per trascrizione inversa ad alta capacità (Applied Biosystems ). L'amplificazione PCR in tempo reale fu effettuata con ABI®PRISM 7300 Sequence Detection System, utilizzando il kit SYBR®Green (Applied Biosystems). I livelli di trascrizione relativi furono determinati utilizzando GAPDH come i geni di controllo endogeni: primer utilizzati: 5’-TCATCAATGGAAATCCCATCA-3 and 5’- GCCAGCATCGCCCCACTT-3’.

Risultati

Effetto della lattoferrina e della sua idrolizzato pepsina sulla adesione di LF82 a cellule Caco-2

Una serie preliminare di esperimenti fu condotta per determinare la concentrazione massima non citotossica e non battericida della lattoferrina e del suo idrolizzato di pepsina. A questo scopo, diluizioni seriali di 2 volte di proteine da 4 mg/ml in MEM furono incubate con cellule Caco-2 per 24h a 37°C. In queste condizioni, fino a 4 mg/ml di proteina non ha influenzarono nessuno dei parametri di citotossicità (dati non mostrati). L' attività antibatterica della lattoferrina e del suo idrolizzato di pepsina fu poi studiata ed i risultati ottenuti dimostrarono che tutte le proteine, fino a 40 mg/ ml, non hanno interessato la vitalità delle cellule batteriche. L'effetto di 1 mg / ml di proteine sull’adesione di LF82 a cellule Caco-2 fu poi testato.

Come mostrato in figura 1, attaccamento di LF82 alle membrane cellulari di Caco-2 non fu significativamente influenzato da bLf mentre il trattamento con bLfH inibì l’adesione batterica di circa il 95% e il 75% con MOI 1 e MOI 10, rispettivamente. Effetto della lattoferrina e del suo idrolizzato di pepsina sulla invasione di LF82 in cellule Caco-2

L'effetto di BLF e bLfH su LF82 invasione fu poi testato. Come mostrato in Figura 2, l’internalizzazione di LF82 in cellule Caco-2 fu inibito in modo significativo sia da bLf e bLfH , essendo bLfH più attivo di bLf. Infatti trattamento con bLfH provocò una inibizione dell’ invasione batterica di circa il 90% e il 65 % con MOI 1 e MOI 10, rispettivamente, mentre, nelle stesse condizioni sperimentali, bLf inibì l’ingresso di LF82 di circa il 75 e il 60 %.

Effetto di BLF e bLfH sull’espressione di citochine proinfiammatorie

Per capire se bLf e bLfH siano in grado di influenzare la produzione di citochine pro - infiammatorie e, quind , di modulare l'infiammazione, fu analizzata l’espressione di mRNA del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF - alfa), interleuchina 8 ( IL- 8 ), e interleuchina 6 (IL- 6) in cellule Caco-2 infettate o meno con LF82. L' infezione di monostrati fu eseguita in assenza o presenza di bLf o bLfH come descritto per la prova di adesione. In queste condizioni sperimentali, l'assenza di attività antibatterica di bLf e bLfH era rilevante per escludere che la diversa espressione di mRNA di citochine potesse essere correlata ad un numero diverso di batteri aderenti vitali. I risultati ottenuti mostrarono che l'aggiunta di bLf non ha influenzato l'espressione di m -RNA di citochine pro-infiammatorie in cellule a infezione simulata mentre notevolmente diminuito il TNF - alfa , IL- 8 , IL-6 e l'espressione di mRNA in cellule infettate con LF82 (Figura 3). Questo effetto non era dovuta ad una azione diretta sulla invasione batterica poiché bLfH, sebbene in grado di prevenire internalizzazione batterica, non era in grado di regolare l’espressione m -RNA di citochine pro-infiammatorie (dati non mostrati).

Effetto di BLF sull'espressione di mRNA di TNF -alfa, IL- 8, e IL- 6 in colture di espianti mucosali infettati con LF82

Per emulare la condizioni in vivo, l'effetto di bLf sull’espressione di m-RNA di citochina pro-infiammatoria fu analizzata anche nelle biopsie effettuate da due soggetti di CD come descritto in Materiali e metodi, che furono infettate con LF82 e coltivate per 6 e 24 ore come descritto in Materiali e Metodi. Similarmente agli esperimenti in vitro, i risultati ottenuti dimostrarono che l'aggiunta di bLf diminuì l'espressione di mRNA di TNF - alfa , IL- 8 , IL-6 in colture di espianti mucosali infettati con LF82, questa inibizione essendo più evidente dopo 24 ore (Figura 4).

Effetto di bLf sull’espressione m-RNA di citochine pro-infiammatorie in cellule di Caco-2 trattate con INF–gamma

L’espressione di lattoferrina è iperregolata in risposta a stimoli infiammatori. L'attività anti - infiammatoria avviene attraverso l'inibizione del legame di endotossina lipopolisaccaride alle cellule infiammatorie, come pure attraverso l'interazione con le cellule epiteliali in siti locali di infiammazione per inibire la produzione di citochine infiammatorie (Conneely OM. Attività antinfiammatorie di lattoferrina. J Am Coll Nutr.

2001 20:389 S - 395S). Per valutare un possibile effetto diretto di bLf sulla sintesi di citochine pro - infiammatorie, le cellule Caco-2 furono trattate con INF -gamma per 6 ore in presenza o assenza di bLf. I risultati ottenuti hanno mostrato che l'aggiunta di bLf diminuì l' espressione di mRNA di citochine pro - infiammatorie, in particolare TNF -alfa, in cellule trattate con INF -gamma (Figura 5).

I seguenti esempi non limitativi sono intesi per spiegare l'invenzione in maggior dettaglio.

ESEMPIO 1

200 g di lattoferrina bovina sono caricati in un miscelatore ad alta azione di taglio dotato di camicia riscaldante e sono impastati con 50 g di alcol cetilico precedentemente riscaldato alla temperatura di rammollimento.

Poi, la miscela viene granulata con una sospensione acquosa contenente 15 g di polivinilpirrolidone finché viene ottenuto un prodotto granulare omogeneo.

5 g di polivinilpirrolidone e 80 g di matrice idrofila di idrossipropilmetilcellulosa vengono aggiunti nello stesso miscelatore ad alta azione di taglio.

I componenti sono miscelati fino dispersione omogenea delle matrici . Poi 100 g di cellulosa microcristallina, 5 g di stearato di magnesio, 5 g di talco e 10 g di silice colloidale vengono aggiunti nell'ordine di menzione.

La miscela viene compressa in modo da ottenere un peso unitario finale di 470 mg/compressa, adatto per fornire 200 mg di principio attivo per ogni compressa.

Le compresse ottenute vengono poi rivestite con film con idrossipropilmetilcellulosa e plastificanti.

Le compresse sottoposte a test di dissoluzione nel succo gastrico e in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea Europea mostrarono il seguente profilo di rilascio: dopo 60 minuti inferiore al 30 %, dopo 180 minuti inferiore al 60 %, dopo 5 ore meno del 80 %.

ESEMPIO 2

20 g di lattoferrina bovina vengono caricati in un granulatore/omogeneizzatore e sono aggiunti 10g di cera carnauba e 45 g di alcol cetilico. La miscela viene riscaldata alla temperatura di rammollimento e una miscela omogenea viene ottenuta

155 g di matrice idrofila di idrossipropil metilcellulosa e 50 mg di policarbofil vengono aggiunti nello stesso mixer.

I componenti sono miscelati fino ad ottenere una dispersione omogenea delle matrici. Poi vengono aggiunti 210 g di fosfato di calcio, 5 g di magnesio stearato e 5 g di silice colloidale nell'ordine di menzione .

La miscela viene compressa fino ad un peso unitario finale di 500 mg/compressa adatto per fornire 20 mg di principio attivo per ogni compressa.

Le compresse ottenute vengono poi rivestite con film d' idrossipropilmetilcellulosa e plastificanti.

Le compresse sottoposte a test di dissoluzione nel succo gastrico e in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea Europea mostrarono il seguente profilo di rilascio: dopo 60 minuti meno del 25 %, dopo 180 minuti in meno del 50 %, dopo 5 ore meno di 70 %.

ESEMPIO 3

300 g microgranuli fatti di cellulosa microcristallina e amido di mais, sono caricati in un sistema a letto fluido Wuster; 100 g di lattoferrina bovina con 20 g di polivinilpirrolidone sono sospesi al tempo stesso essendo caricati sui microgranuli.

Il rivestimento con film è ulteriormente eseguito mediante una soluzione acquosa contenente 50 g di polivinilpirrolidone e 50 g di etilcellulosa per ottenere microgranuli omogenei.

Poi, capsule di dimensione 0 sono riempite con la miscela fino ad un peso unitario finale di 520 mg/capsula per ottenere 100 mg di ingrediente attivo per singola capsula.

Le capsule sottoposte a test di dissoluzione nel succo gastrico e in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea europea mostrarono il seguente profilo di rilascio: dopo 120 minuti in succhi gastrici 0 %, dopo 60 minuti nel succo enterico inferiore al 25%, dopo 180 minuti inferiore al 50 %, dopo 6 ore inferiore al 80 % .

ESEMPIO 4

200 g di cellulosa microcristallina con 100 g di amido di mais vengono caricati in letto fluido con 200 g di lattoferrina bovina.

La miscela viene granulata con una soluzione acquosa contenente 50 g di polivinilpirrolidone per ottenere un prodotto granulare omogeneo.

Quindi, si aggiungono 150 g di idrossipropil metilcellulosa, 5 g di magnesio stearato e 5 g di silice colloidale.

La miscela viene poi compressa ad un peso unitario finale di 710 mg/compressa per fornire compresse singole contenenti 200 mg di principio attivo .

Le compresse ottenute vengono poi rivestite con film di polimetacrilati e plastificanti per garantire la gastroresistenza ed impedire il rilascio di principio attivo nello stomaco.

Le compresse sottoposte a test di dissoluzione nel succo gastrico e in ambiente intestinale simulato mostrato il seguente profilo di rilascio: dopo 120 minuti in succhi gastrici 0 %, dopo 60 minuti nel succo enterico inferiore al 25 %, dopo 180 minuti meno del 50 %, dopo 6 ore meno di 80%.

ESEMPIO 5.

800 g di lattoferrina bovina vengono caricati in un granulatore/omogeneizzatore, e si aggiungono 400 g di idrossipropilmetilcellulosa, 480 g di mannitolo, 252 g di cellulosa microcristallina.

La miscela venne agitata per 15 minuti.

Furono aggiunti 20 g di acido stearico, 8 g di croscarmellosio , 20 g di lecitina , 40 g di silice colloidale e 20 g di stearato di magnesio nell'ordine di menzione.

La miscela venne compressa fino ad un peso unitario finale di 510 mg/compressa per fornire compresse singole contenenti ciascuna 200 mg di principio attivo .

Le compresse ottenute vennero rivestite con 500 g di gommalacca (aquagold 25%), 50 g di idrossipropil metilcellulosa, 25 g di glicerina per ottenere una compressa rivestita con 50 mg di film enterico.

Le compresse rivestite vennero sottoposte a test di dissoluzione in succo gastrico ed in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea Europea. I test hanno mostrato il seguente profilo di rilascio: dopo 120 minuti in succhi gastrici 0 %, dopo 60 minuti nel succo enterico inferiore al 25%, dopo 180 minuti meno del 50 %, dopo 8 ore non inferiore all'80 %, dopo 12 ore > 80 % .

ESEMPIO 6

800 g di lattoferrina bovina vengono caricati in un miscelatore/omogeneizzatore, poi vengono aggiunti 400 g di idrossipropilmetilcellulosa, 480 g di mannitolo, 252 g di cellulosa microcristallina.

La miscela è stata agitata per 15 minuti per ottenere una miscela omogenea.

Sono aggiunti nell'ordine 20 g di acido stearico, 8 g di croscarmellosio, 20 g di lecitina, 40 g di silice colloidale e 20 g di magnesio stearato.

La miscela fu compressa fino ad peso unitario finale di 510 mg/compressa per fornire compresse contenenti 200 mg di principio attivo per singola compressa.

Le compresse ottenute vengono rivestite con una soluzione acquosa contenente 40 g di idrossipropilmetilcellulosa, 8 g di talco per ottenere compressa rivestita con film di 12 mg.

Le compresse sottoposti a test di dissoluzione insucco gastrico ed in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea Europea mostrarono il seguente profilo di rilascio: dopo 60 minuti meno del 25 %, dopo 180 minuti in meno del 60 %, dopo 8 ore a meno di 80%.

ESEMPIO 7

800 g di lattoferrina bovina furono caricati in un miscelatore / omogeneizzatore e sono aggiunti 416 g di cellulosa microcristallina, 496 g di mannitolo.

La miscela venne agitata per 15 minuti.

20 g di acido stearico, 160 mg di PVP reticolato , 60 g di croscarmellosio, 20 g di lecitina, 40 g di silice colloidale e 20 g di stearato di magnesio vengono aggiunti nell'ordine indicato.

La miscela venne compressa fino ad un peso unitario finale di 510 mg / compressa per fornire compresse contenenti 200 mg di principio attivo per singola compressa .

Le compresse ottenute furono rivestite con 480 g di gommalacca (aquagold 25 %), 48 g di idrossipropil metilcellulosa, 24 g di glicerina per ottenere una compressa rivestita con film enterico di 50 mg.

Le compresse rivestite sottoposte a test di dissoluzione in succo gastrico e in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea europea mostrò il seguente profilo di rilascio: dopo 120 minuti in succhi gastrici 0 %, dopo 60 minuti in succo enterico inferiore al 25%, dopo 180 minuti > 70% dopo 300 minuti > 80% .

ESEMPIO 8

200 g di lattoferrina bovina furono caricati nel miscelatore ad alta azione di taglio con camicia di riscaldamento e impastati con 50 g di Lauroil poliossigliceridi precedentemente portati alla temperatura di rammollimento.

La miscela fu ulteriormente granulata con una soluzione / sospensione acquosa contenente 15 g di polivinilpirrolidone fino ad ottenere un granulato omogeneo.

5 g di polivinilpirrolidone e 80 g di idrossipropilmetilcellulosa furono aggiunti nello stesso mixer.

I componenti furono miscelati fino ad ottenere una dispersione omogenea delle matrici. Poi, 100 g di cellulosa microcristallina, 5 g di stearato di magnesio, 5 g di talco e 10 g di silice colloidale sono stati aggiunti nell'ordine di menzione.

La miscela fu compressa fino ad un peso unitario finale di 470 mg/cpr che è adatto per la somministrazione di 200 mg di principio attivo per ogni compressa.

Le compresse ottenute sono state poi rivestite con idrossipropilmetilcellulosa e plastificanti.

Le compresse, sottoposte a test di dissoluzione succo gastrico ed in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea europea, hanno avuto il seguente profilo di rilascio: dopo 60 minuti non più del 30 %, dopo 180 minuti non è superiore al 60 % , dopo 5 ora non più del 80 % .

ESEMPIO 9

20 g di lattoferrina bovina sono stati caricati in un granulatore / omogeneizzatore e furono poi aggiunti 55 g di Stearoil gliceridi. La miscela venne granulata fino alla temperatura di rammollimento, per ottenere una miscela omogenea. 205 g di idrossipropil metilcellulosa furono poi aggiunti nello stesso miscelatore.

I componenti sono stati miscelati fino a dispersione omogenea delle matrici e poi furono aggiunti nell'ordine di menzione 210 g di fosfato di calcio , 5 g di magnesio stearato e 5 g di silice colloidale.

La miscela fu compressa fino ad un peso unitario finale di 500 mg / cpr adatto per la somministrazione di 20 mg di principio attivo per ogni compressa.

Le compresse ottenute furono poi rivestite con pellicola di idrossipropilmetilcellulosa e plastificanti .

Le compresse sottoposte a test di dissoluzione in succo gastrico ed in ambiente intestinale simulato in base alla corrente edizione della Farmacopea Europea mostrò il seguente profilo di rilascio: dopo 60 minuti non più del 25 %, dopo 180 minuti non è superiore al 50 %, dopo 5 ore nessun più del 70 % .

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Lattoferrina per uso nel trattamento di malattie infiammatorie croniche intestinali associate a invasione batterica.
2. 2. Lattoferrina per uso secondo la rivendicazione precedente, in cui detta malattia infiammatoria cronica intestinale è il Morbo di Crohn.
3. 3. Lattoferrina per uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta invasione è una invasione di Escherichia coli aderente invasiva.
4. 4. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato comprendente lattoferrina per uso secondo una delle precedenti rivendicazioni.
5. 5. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo la rivendicazione precedente, comprendente lattoferrina disciolta e/o dispersa e/o incorporata in una matrice, e un rivestimento esterno, in cui detta matrice comprende : - sostanze selezionate nel gruppo di: sostanze lipidiche, sostanze idrofile, sostanze anfifiliche e loro miscele, e - opzionalmente, eccipienti farmaceuticamente accettabili.
6. 6. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo la rivendicazione precedente, in cui dette sostanze lipidiche sono scelte nel gruppo formato da alcool grassi, acidi grassi, trigliceridi, cere.
7. 7. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo la rivendicazione 5, in cui dette sostanze idrofile sono scelte nel gruppo formato da polimeri e copolimeri dell’acido acrilico o metacrilico, polimeri di alchil vinil etere, idrossialchilcellulosa, carbossialchilcellulosa, polisaccaridi, alginati, pectine, amidi, gomme naturali e sintetiche, policarbofil e loro miscele.
8. 8. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo la rivendicazione 5, in cui dette sostanze anfifiliche sono scelte nel gruppo formato da lecitina, fosfatidilcolina, fosfatidil-etanolammina, alchil eteri di glicole come dietilenglicole monometiletere, macrogolgliceridi, polietilene glicole idrossistearati, cere, sodio laurilsolfato, sodio dodecilsolfato, polisorbati, acido colico, polossameri, sodio sulfosuccinato, sodio laurilsarcosinato e loro miscele.
9. 9. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo la rivendicazione 4, in cui la lattoferrina è disciolta e/o dispersa e/o collocata in un nucleo di reservoir che è rivestito da un film semipermeabile.
10. 10. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 9, comprendente inoltre agenti di rivestimento gastroresistenti scelti nel gruppo formato da gommalacca, polimetacrilati, acetoftalato di cellulosa, derivati di alginati.
11. 11. Formulazione orale per dosaggio a rilascio modificato per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 10, caratterizzato dal fatto che la quantità di lattoferrina è tra 50 mg e 250 mg.