RU2418071C2 - Способ получения бактериального лактоферрина - Google Patents
Способ получения бактериального лактоферрина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2418071C2 RU2418071C2 RU2008144032/10A RU2008144032A RU2418071C2 RU 2418071 C2 RU2418071 C2 RU 2418071C2 RU 2008144032/10 A RU2008144032/10 A RU 2008144032/10A RU 2008144032 A RU2008144032 A RU 2008144032A RU 2418071 C2 RU2418071 C2 RU 2418071C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lactoferrin
- iron
- solution
- concentration
- klebsiella pneumoniae
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения и очищения лактоферрина из бульонной культуры микроорганизмов. Способ предусматривает инкубацию Klebsiella pneumoniae на питательном бульоне при температуре 37°С с получением бульонной культуры и с последующей постановкой реакции ИФА. Отделение балластных белков в 2 М сульфате аммония с получением раствора. В полученный раствор добавляют железоаммонийные квасцы для насыщения лактоферрина железом. Насыщенный железом раствор обессоливают и забуферивают фосфатным буфером с последующим нанесением на колонку с катионообменным сефадексом G-50 /8,5×9 см/ и проведением элюции ступенчатым градиентом концентрации хлористого натрия с получением лактоферрина, содержащегося во фракциях с концентрацией соли 0,25 М и 0,3 М. Изобретение позволяет увеличить выход целевого продукта. 1 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно биохимии и микробиологии, и может быть использовано, в частности, для получения и очищения лактоферрина из бульонной культуры микроорганизмов.
Лактоферрин (ЛФ) представляет собой гликопротеид, ассоциированный с двумя атомами железа, молекулярная масса по данным различных авторов колеблется от 79 до 95 кД. Углеводный компонент составляет 6,6% и представлен тремя цепями, каждая из которых оканчивается остатком сиаловой кислоты и содержит 1 или 2 остатка фукозы, шесть остатков гексозы и четыре остатка N-ацетилглюкозамина.
В настоящее время основным субстратом, из которого выделяют лактоферрин, являются продукты жизнедеятельности человеческого организма: грудное молоко или кровь (Николаев А.А., Аншакова Н.И. Лактоферрин человека: физико-химические свойства и способ очистки // Изобрет. и рационал в медицине. - М., 1987. - С.70-72).
Целью представленного изобретения является получение лактоферрина из бульонной культуры микроорганизмов Klebsiella pneumoniae.
Известно, что необходимость доступного для бактерий железа в тканях выражается в том, что при острых и хронических воспалительных процессах, вызываемых в том числе и инфекционными агентами, развивается гипоферримия. Понижение доставки железа в ткани сопровождается торможением развития железозависимых бактерий. Так, ставшие классическими эксперименты на ящерицах показывают, что при содержании их при повышенной температуре концентрация железа в крови уменьшается, одновременно с этим повышается резистентность этих животных к дифтероидным бактериям. При коррекции уровня железа снижается противоинфекционный иммунитет.
В других опытах, на Vibrio parahaemolyticus, отмечалось, что обеспечение этих бактерий легко доступными соединениями железа повышало их вирулентность для экспериментальных животных.
Аналогичные данные были получены и в отношении Yersinia pestis, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio vulnificus, V. anguilarus, E.coli и др.
В наших исследованиях установлена способность бактерий к синтезу собственного бактериального лактоферрина (БЛФ). Синтез БЛФ подтверждался иммуноферментным анализом, проведенным с набором реагентов для выявления человеческого лактоферрина, обладающего, как известно, 100% специфичностью анализа (Бойко А.В., Бойко О.В. Синтез лактоферрина бактериями // Депонировано в ВНИИТИ, г.Москва. - 20.04.01. - №1039В2001).
Авторами было выяснено, что бактерии, способные к выживанию и размножению в условиях окружающей среды, активно вырабатывают собственные сидерофоры, в том числе и бактериального лактоферрина.
Синтез сидерофоров бактериями является лимитирующим фактором их выживания вне макроорганизма, то есть микробы, не способные синтезировать собственные сидерофоры, активно используют молекулы, имеющиеся в организме хозяина; они полностью зависят от него и не могут успешно развиваться и выживать в условиях окружающей среды.
Предложенный способ был успешно апробирован на 50 образцах в практической работе лаборатории микробиологии Астраханской областной ветеринарной лаборатории в течение 2006 года.
Ниже приводятся результаты апробации.
Пример 1
Проводили выделение бактериального лактоферрина следующим образом.
1. Посев в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона (приготовленного в соответствии со «Справочником по микробиологическим и вирусологическим методам исследования»/ под ред. М.О.Биргера. - 3-е изд. М.: Медицина, 1982. - С.48) 0,1 мл суточной агаровой культуры Klebsiella pneumoniae в концентрации 1020 КОЕ, приготовленной с использованием стандарта мутности с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч.
2. Постановка реакции ИФА способом, указанным в «Наборе реагентов для количественного иммуноферментного определения лактоферрина в сыворотке крови человека Лактоферрин-стрип» для определения наличия лактоферрина в среде.
3. Чтение результатов на фотометре для ИФА при длине волны 492 нм.
4. Начинали выделение лактоферрина с отделения балластных белков в 2 М (116 г/л) сульфате аммония. При этой концентрации лактоферрин не преципитирует, и после отделения осадка в раствор добавляются железоаммоннийные квасцы в концентрации 0,75 г/л для насыщения лактоферрина железом (появление красной окраски свидетельствует о завершении перехода всего лактоферрина из апоформы в форму Fe2+).
5. Затем проба тщательно обессоливается и забуферивается фосфатным буфером рН 7,0 (добавляется фосфатный буфер рН 7,0) путем диализа и наносится на колонку с катионообменным сефадексом G-50 /8,5×9 см/. Элюция ведется ступенчатым градиентом концентрации хлористого натрия с шагом 0,05 М. Лактоферрин содержится во фракциях с концентрацией соли 0,25 М и 0,3 М.
Полученный препарат хромотографически и электрофоретически гомогенен.
Определение концентрации собственно лактоферрина без балластных солей в выделенном препарате проводили по методу Лоури - Фолина (Таблица 1).
Пример 2.
Выделение бактериального лактоферрина включало следующие этапы.
1. Посев в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона 0,2 мл суточной агаровой культуры Klebsiella pneumoniae в концентрации 1020 КОЕ, приготовленной с использованием стандарта мутности с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч.
2. Далее методика повторяется аналогично описанной в примере 1 (Таблица 1).
Пример 3.
Проводили выделение бактериального лактоферрина следующим образом:
1. Посев в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона 0,3 мл суточной агаровой культуры Klebsiella pneumoniae в концентрации 1020 КОЕ, приготовленной с использованием стандарта мутности с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч.
2. Далее методика повторяется аналогично описанной в примере 1 (Таблица 1).
Применение предлагаемого способа получения и очистки бактериального лактоферрина приводит к выделению ценного биологического материала, применяемого в медицине для лечения и профилактики инфекционных процессов различной локализации, а также в производстве диагностических тест-систем и работе научно-исследовательских лабораторий.
Использование этого способа позволит существенно снизить стоимость получения лактоферрина с одновременным увеличением выхода готовой продукции.
Изобретение может быть рекомендовано к применению в практической деятельности предприятий, занимающихся производством биопрепаратов, а также работе профильных научно-исследовательских лабораторий.
| Таблица 1 | ||
| Воспроизводимость результатов получения бактериального лактоферрина предлагаемым способом | ||
| Пример | Объем внесенной в пробирки бактериальной взвеси, мл | Продукция бактериального лактоферрина, нг/мл |
| 1 | 0,1 | 31,0 |
| 2 | 0,2 | 40,4 |
| 3 | 0,3 | 60,1 |
Claims (1)
- Способ получения бактериального лактоферрина, заключающийся в обработке суточной бактериальной культуры Klebsiella pneumoniae отделением балластных белков в 2 М сульфате аммония, добавлении раствора железо-аммонийных квасцов для насыщения лактоферрина железом, обессоливании пробы и забуферивании фосфатным буфером рН-7,0 с последующим нанесением на колонку с катионообменным сефадексом G-50 (8,5×9 см), проведением элюции ступенчатым градиентом концентрации хлористого натрия, при этом лактоферрин содержится во фракциях с концентрацией соли 0,25 М и 0,3 М.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008144032/10A RU2418071C2 (ru) | 2008-11-05 | 2008-11-05 | Способ получения бактериального лактоферрина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008144032/10A RU2418071C2 (ru) | 2008-11-05 | 2008-11-05 | Способ получения бактериального лактоферрина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008144032A RU2008144032A (ru) | 2010-05-10 |
| RU2418071C2 true RU2418071C2 (ru) | 2011-05-10 |
Family
ID=42673580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008144032/10A RU2418071C2 (ru) | 2008-11-05 | 2008-11-05 | Способ получения бактериального лактоферрина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2418071C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2689987C2 (ru) * | 2013-09-25 | 2019-05-30 | Джеллепи С.П.А. | Лактоферрин для лечения ibd, вызванного бактериальной инвазией |
-
2008
- 2008-11-05 RU RU2008144032/10A patent/RU2418071C2/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2689987C2 (ru) * | 2013-09-25 | 2019-05-30 | Джеллепи С.П.А. | Лактоферрин для лечения ibd, вызванного бактериальной инвазией |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008144032A (ru) | 2010-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Söderling | Practical aspects of salivary analyses | |
| EP0523805B1 (en) | Device and method for enchanced recovery and detection of microbial growth in the presence of antimicrobial substances | |
| US11360085B2 (en) | Bacterial endotoxin test for the determination of endotoxins | |
| CN101971032A (zh) | 在液体培养基中通过凝集实时检测微生物的方法 | |
| Van Heyningen | Fluorescent derivatives of 3-hydroxy-L-kynurenine in the lens of man, the baboon and the grey squirrel. | |
| LELWALA‐GURUGE et al. | Haemagglutination patterns of Helicobacter pylori: Frequency of sialic acid‐specific and non‐sialic acid‐specific haemagglutinins | |
| de Vries et al. | Single-use membrane adsorbers for endotoxin removal and purification of endogenous polysialic acid from Escherichia coli K1 | |
| JP5449834B2 (ja) | リポ多糖、イネ発酵エキス及びイネ発酵エキス配合物 | |
| RU2418071C2 (ru) | Способ получения бактериального лактоферрина | |
| Jarumilinta et al. | The Patterns of Some Proteolytic Enzymes of Entamoeba Histolytica and Acanthamoeba SP. I.—The Action of E. Histolytica and Acanthamoeba SP. on Protein Substrates | |
| CN116640186A (zh) | 一种人鼻液补体因子抗菌肽c4-aⅱ及其应用 | |
| DE102009021681B4 (de) | Verwendung von Staphylococcus aureus bindenden Peptiden, Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierung und zum Nachweis von Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus bindendes Peptid und dafür kodierende Nukleinsäure | |
| CN105699667B (zh) | 细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒及其临床应用 | |
| US3990946A (en) | Substrate for the determination of desoxy-ribonuclease | |
| JP2001169799A (ja) | 菌の分離・検出方法 | |
| Sharma et al. | Marine proteins in clinical chemistry | |
| CN106770243A (zh) | 一种聚唾液酸的测定方法 | |
| US4229530A (en) | Methods and media for rapid detection of pathogenic neisseria | |
| RU2553224C2 (ru) | Питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая (бульон мосселя), варианты | |
| Hamzah et al. | EXTRACTION AND PURIFICATION OF UROPATHOGENIC E. COLI OUTER MEMBRANE VESICLES (OMVS) ISOLATED FROM URINE SPECIMEN PATIENT SUFFERING URINARY TRACT INFECTION (UTI) | |
| Natsir et al. | Hydrolisis enzymatic protein from microsimbiont red algae Eucheuma cottonii as an antibacterial | |
| Hsu et al. | Purification of epidermidins, new antibiotics from staphylococci | |
| EP3502697B1 (de) | Nachweis von cholesterol-bindenden toxinen | |
| JPH03279396A (ja) | 紅藻類レクチン及びその製造方法 | |
| Jebor et al. | Interaction of some pathogenic bacteria with Phaseolus vulgaris L. seeds lectin (as biosensor) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111106 |