JP2832517B2 - 大腸菌付着阻止剤 - Google Patents
大腸菌付着阻止剤Info
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- JP2832517B2 JP2832517B2 JP6331757A JP33175794A JP2832517B2 JP 2832517 B2 JP2832517 B2 JP 2832517B2 JP 6331757 A JP6331757 A JP 6331757A JP 33175794 A JP33175794 A JP 33175794A JP 2832517 B2 JP2832517 B2 JP 2832517B2
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- coli
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- bacteria
- escherichia coli
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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- Fodder In General (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、大腸菌により引き起こ
される感染症を予防するために利用される大腸菌付着阻
止剤に関する。
される感染症を予防するために利用される大腸菌付着阻
止剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に病原菌は体内への進入、標的細胞
への付着、増殖という過程をもって、感染症を引き起こ
す。これに対して、現在用いられている治療法は、主に
抗生物質を投与することによるものである。これは、付
着、増殖した病原菌を死滅させることにより病原を根滅
しようというもので、病原菌の感染過程の最終段階に作
用するものである。この抗生物質による感染治療は発病
後の生体に対する治療法としては非常に有効であるが、
抗生物質の性格上、様々な副作用あるいはアレルギー症
状を引き起こすなど問題点も多い。
への付着、増殖という過程をもって、感染症を引き起こ
す。これに対して、現在用いられている治療法は、主に
抗生物質を投与することによるものである。これは、付
着、増殖した病原菌を死滅させることにより病原を根滅
しようというもので、病原菌の感染過程の最終段階に作
用するものである。この抗生物質による感染治療は発病
後の生体に対する治療法としては非常に有効であるが、
抗生物質の性格上、様々な副作用あるいはアレルギー症
状を引き起こすなど問題点も多い。
【０００３】一方、生体は、これら病原菌の感染に対し
て、その感染初期の段階において、防御機構を備えてい
る。消化管内においては分泌型ＩｇＡを主とする免疫グ
ロブリンによる防御機構がそれであり、これらの免疫グ
ロブリンは病原菌の感染の初期段階、すなわち、病原菌
の標的細胞への付着を阻止することにより、生体を感染
から守る。ところで、一般に病原菌は標的細胞に付着す
る際、その標的細胞上の特定の構造を受容体として認識
することが知られている。このことは、これら受容体ま
たは受容体と類似した構造をもつもので、病原菌と結合
能をもつものは、病原菌の菌体表面の受容体結合部位に
特異的に結合し、病原菌の標的細胞上の受容体への結合
を特異的に阻害するものと考えられる。この作用は、病
原菌の感染を、その初期段階で阻止するという意味で上
述の免疫グロブリンによる生体防御機構に類似してい
る。すなわち、この様な病原菌と特異的に結合し、かつ
標的細胞への病原菌の付着を阻止し得る物質は、おだや
かな作用で副作用の少ない病原菌付着阻止剤となり得る
ことが考えられる。
て、その感染初期の段階において、防御機構を備えてい
る。消化管内においては分泌型ＩｇＡを主とする免疫グ
ロブリンによる防御機構がそれであり、これらの免疫グ
ロブリンは病原菌の感染の初期段階、すなわち、病原菌
の標的細胞への付着を阻止することにより、生体を感染
から守る。ところで、一般に病原菌は標的細胞に付着す
る際、その標的細胞上の特定の構造を受容体として認識
することが知られている。このことは、これら受容体ま
たは受容体と類似した構造をもつもので、病原菌と結合
能をもつものは、病原菌の菌体表面の受容体結合部位に
特異的に結合し、病原菌の標的細胞上の受容体への結合
を特異的に阻害するものと考えられる。この作用は、病
原菌の感染を、その初期段階で阻止するという意味で上
述の免疫グロブリンによる生体防御機構に類似してい
る。すなわち、この様な病原菌と特異的に結合し、かつ
標的細胞への病原菌の付着を阻止し得る物質は、おだや
かな作用で副作用の少ない病原菌付着阻止剤となり得る
ことが考えられる。
【０００４】この様な物質として、κ−カゼインおよび
／またはそのプロテアーゼ分解物であるκ−カゼイング
リコマクロペプチド（以下、ＧＭＰという）があり、特
開昭６３−２８４１３３号公報には、病原菌やウィルス
によって引き起こされる感染を防御するのに有効である
旨が開示されている。また、特開昭６３−２３３９１１
号公報には、ＧＭＰが抗歯垢および抗う歯剤として有効
であることが開示されている。
／またはそのプロテアーゼ分解物であるκ−カゼイング
リコマクロペプチド（以下、ＧＭＰという）があり、特
開昭６３−２８４１３３号公報には、病原菌やウィルス
によって引き起こされる感染を防御するのに有効である
旨が開示されている。また、特開昭６３−２３３９１１
号公報には、ＧＭＰが抗歯垢および抗う歯剤として有効
であることが開示されている。
【０００５】一方、乳中の感染防御機能蛋白質としてラ
クトフェリン（以下、Ｌｆという）がある。Ｌｆの作用
は、その鉄キレート力にあり、病原菌がその増殖に必要
な鉄をＬｆが奪い取るために増殖が抑制されるといわれ
ている。しかしながら、一般にＬｆによる病原菌増殖抑
制効果は、一時的なものであり数時間後には、再び菌が
増殖しはじめるため、感染の予防および治療剤としての
効力には不充分であると考えられていた。また、Ｌｆが
種々な細菌に結合することは古くから知られており、Ｌ
ｆが菌に結合することによって細菌の物質輸送サイトや
生合成をブロックし、所謂鉄の存在と密接に関係してい
る静菌効果とは全く別の機能によって細菌を死滅させる
と考えられている。しかし、Ｌｆが菌に結合したからと
いって抗菌効果を示すとは限らず、例えば、Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓはＬｆと結合し鉄を菌
体内に取り込むことによって増殖が可能になると報告さ
れている（ジャーナル オブ ジェネラル マイクロバ
イオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３
３：８９１−８９８，１９８７）。
クトフェリン（以下、Ｌｆという）がある。Ｌｆの作用
は、その鉄キレート力にあり、病原菌がその増殖に必要
な鉄をＬｆが奪い取るために増殖が抑制されるといわれ
ている。しかしながら、一般にＬｆによる病原菌増殖抑
制効果は、一時的なものであり数時間後には、再び菌が
増殖しはじめるため、感染の予防および治療剤としての
効力には不充分であると考えられていた。また、Ｌｆが
種々な細菌に結合することは古くから知られており、Ｌ
ｆが菌に結合することによって細菌の物質輸送サイトや
生合成をブロックし、所謂鉄の存在と密接に関係してい
る静菌効果とは全く別の機能によって細菌を死滅させる
と考えられている。しかし、Ｌｆが菌に結合したからと
いって抗菌効果を示すとは限らず、例えば、Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓはＬｆと結合し鉄を菌
体内に取り込むことによって増殖が可能になると報告さ
れている（ジャーナル オブ ジェネラル マイクロバ
イオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３
３：８９１−８９８，１９８７）。
【０００６】このように、Ｌｆの感染防御効果について
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験結果では静菌効果や抗菌効
果が示されてはいるものの単純ではない。一方、ｉｎ
ｖｉ ｖｏにおいては、ラクトパーオキシダーゼと共に添
加されたＬｆは動物の生存率を延長する可能性が示唆さ
れている（特開昭６１−８３１３１号公報）もののＬｆ
がｉｎ ｖｉｖｏで感染防御効果を持つかどうかは不明
である。さらに又、病原性大腸菌をマウスに投与する２
４時間前にＬｆを静脈から注射するとマウスの生存率が
著しく高まることが報告されているが（Ｊ．ＥＸＰ．Ｐ
ａｔｈ．７０：６９７−７０４）、Ｌｆがマウスの免疫
系を刺激し間接的に効果を発揮したと考えられている。
このように、Ｌｆの感染防御効果がｉｎ ｖｉｖｏの系
で確認されたことはこれまで無かった。そこで、本発明
者らはＬｆの薬理作用について研究していたところ、Ｌ
ｆは上述した鉄キレート力に由来する静菌作用あるいは
菌に結合することによって菌を死滅させる抗菌作用とは
全く別のメカニズムによって、病原菌の歯、皮膚あるい
は腸管細胞への付着を阻止することを発見した。Ｌｆが
ビフィダス菌や乳酸菌のような有用菌の腸管内への定着
を促進することはすでに開示されているが（特開平１−
２２１３１９号公報）、本発明はそれとは逆にＬｆが病
原性細菌、特に大腸菌の腸管への付着を阻止する。本発
明は、このようなＬｆの病原性細菌、特に大腸菌の腸管
への付着阻止作用を見出し、本発明をなすに至った。
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験結果では静菌効果や抗菌効
果が示されてはいるものの単純ではない。一方、ｉｎ
ｖｉ ｖｏにおいては、ラクトパーオキシダーゼと共に添
加されたＬｆは動物の生存率を延長する可能性が示唆さ
れている（特開昭６１−８３１３１号公報）もののＬｆ
がｉｎ ｖｉｖｏで感染防御効果を持つかどうかは不明
である。さらに又、病原性大腸菌をマウスに投与する２
４時間前にＬｆを静脈から注射するとマウスの生存率が
著しく高まることが報告されているが（Ｊ．ＥＸＰ．Ｐ
ａｔｈ．７０：６９７−７０４）、Ｌｆがマウスの免疫
系を刺激し間接的に効果を発揮したと考えられている。
このように、Ｌｆの感染防御効果がｉｎ ｖｉｖｏの系
で確認されたことはこれまで無かった。そこで、本発明
者らはＬｆの薬理作用について研究していたところ、Ｌ
ｆは上述した鉄キレート力に由来する静菌作用あるいは
菌に結合することによって菌を死滅させる抗菌作用とは
全く別のメカニズムによって、病原菌の歯、皮膚あるい
は腸管細胞への付着を阻止することを発見した。Ｌｆが
ビフィダス菌や乳酸菌のような有用菌の腸管内への定着
を促進することはすでに開示されているが（特開平１−
２２１３１９号公報）、本発明はそれとは逆にＬｆが病
原性細菌、特に大腸菌の腸管への付着を阻止する。本発
明は、このようなＬｆの病原性細菌、特に大腸菌の腸管
への付着阻止作用を見出し、本発明をなすに至った。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、病原菌、特
に大腸菌に起因する感染症の防御効果を有し、しかも安
全性の点でも何ら問題のない新規な大腸菌付着阻止剤を
提供することを課題とする。
に大腸菌に起因する感染症の防御効果を有し、しかも安
全性の点でも何ら問題のない新規な大腸菌付着阻止剤を
提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はＬｆ
またはそのプロテアーゼ分解物を有効成分とする大腸菌
付着阻止剤に関する。特に、大腸菌が皮膚および口から
大腸に至る消化器官において感染する場合に大腸菌の付
着を有効に阻止する大腸菌付着阻止剤に関する。
またはそのプロテアーゼ分解物を有効成分とする大腸菌
付着阻止剤に関する。特に、大腸菌が皮膚および口から
大腸に至る消化器官において感染する場合に大腸菌の付
着を有効に阻止する大腸菌付着阻止剤に関する。
【０００９】本発明で用いるＬｆは、牛、羊、山羊およ
びヒトの乳等の分泌液から単離して得られたものであ
り、また遺伝子組換技術などによって生産されたもので
あってもよい。Ｌｆの単離法としては、すでにいくつか
の技術が開示されており、例えば、特開昭６１−１４５
０００号公報、特開昭６１−２４６１９８号公報、特開
昭６２−１９５２３号公報、特開昭６３−１５２４００
号公報、特開昭６３−２５５３００号公報、特開昭６４
−８６８３９号公報などがある。工業的な実用性を考慮
すれば、硫酸エステル化した多糖類担体を利用する方法
（特開昭６３−２５５３００号公報）が最も好ましい。
なお、Ｌｆには鉄をキレートする機能があり、乳等の分
泌液より単離されたＬｆの一部は鉄と結合したものが含
まれている。しかし、本発明による大腸菌付着阻止効果
は、鉄の結合状態には依存しないので、鉄の結合した形
態であっても結合していない形態であってもそのいずれ
でもよい。Ｌｆをプロテアーゼ処理する場合、特に制限
はないが極端に低分子化しない程度の限定分解を行なう
べきである。低分子化すると効果が弱くなる。ここで用
いるプロテアーゼは特に制限はなく、トリプシン、キモ
トリプシン、パパイン、ペプシン、酸性プロテアーゼ、
パンクレアチン、微生物起源プロテアーゼ、サーモリシ
ン、アルカラーゼ、プロナーゼなどを例示することがで
きる。分解条件は酵素の種類、Ｌｆの濃度、ｐＨ、温度
などによって変わるが、例えばトリプシンではＬｆ１％
となるように水に溶解し、０．０１％のトリプシンを加
え、１０分〜数時間分解すればよい。トリプシンインヒ
ビターで酵素活性を止めてもよいが、加熱して失活させ
てもよい。Ｌｆのイオン強度さえ低ければ加熱しても沈
澱しない（特開平２−１０８６２９号公報）。そして、
本発明ではＬｆまたはそのプロテアーゼ分解物を単独で
用いてもよいし、また両者を併用してもよい。
びヒトの乳等の分泌液から単離して得られたものであ
り、また遺伝子組換技術などによって生産されたもので
あってもよい。Ｌｆの単離法としては、すでにいくつか
の技術が開示されており、例えば、特開昭６１−１４５
０００号公報、特開昭６１−２４６１９８号公報、特開
昭６２−１９５２３号公報、特開昭６３−１５２４００
号公報、特開昭６３−２５５３００号公報、特開昭６４
−８６８３９号公報などがある。工業的な実用性を考慮
すれば、硫酸エステル化した多糖類担体を利用する方法
（特開昭６３−２５５３００号公報）が最も好ましい。
なお、Ｌｆには鉄をキレートする機能があり、乳等の分
泌液より単離されたＬｆの一部は鉄と結合したものが含
まれている。しかし、本発明による大腸菌付着阻止効果
は、鉄の結合状態には依存しないので、鉄の結合した形
態であっても結合していない形態であってもそのいずれ
でもよい。Ｌｆをプロテアーゼ処理する場合、特に制限
はないが極端に低分子化しない程度の限定分解を行なう
べきである。低分子化すると効果が弱くなる。ここで用
いるプロテアーゼは特に制限はなく、トリプシン、キモ
トリプシン、パパイン、ペプシン、酸性プロテアーゼ、
パンクレアチン、微生物起源プロテアーゼ、サーモリシ
ン、アルカラーゼ、プロナーゼなどを例示することがで
きる。分解条件は酵素の種類、Ｌｆの濃度、ｐＨ、温度
などによって変わるが、例えばトリプシンではＬｆ１％
となるように水に溶解し、０．０１％のトリプシンを加
え、１０分〜数時間分解すればよい。トリプシンインヒ
ビターで酵素活性を止めてもよいが、加熱して失活させ
てもよい。Ｌｆのイオン強度さえ低ければ加熱しても沈
澱しない（特開平２−１０８６２９号公報）。そして、
本発明ではＬｆまたはそのプロテアーゼ分解物を単独で
用いてもよいし、また両者を併用してもよい。
【００１０】このようにして得られたＬｆまたはその分
解物は、経口的に投与する場合、標準的な服用量は成人
一日一人当り６〜３００ｍｇを一応の目安とすることが
できる。また外用的に投与する場合、この程度乃至その
数倍量を使用することができる。本発明は、このように
Ｌｆまたはその分解物を単独で大腸菌付着阻止剤として
用いてもよいし、実施例に示すように製剤化して用いて
もよい。さらに、これらを食品や飼料中に混合したり、
あるいは医薬品や化粧品に添加して用いることも可能で
ある。これらＬｆは、天然物であり、乳の一成分として
古来より飲用されてきたものであるだけに、安全性に何
ら問題はない。
解物は、経口的に投与する場合、標準的な服用量は成人
一日一人当り６〜３００ｍｇを一応の目安とすることが
できる。また外用的に投与する場合、この程度乃至その
数倍量を使用することができる。本発明は、このように
Ｌｆまたはその分解物を単独で大腸菌付着阻止剤として
用いてもよいし、実施例に示すように製剤化して用いて
もよい。さらに、これらを食品や飼料中に混合したり、
あるいは医薬品や化粧品に添加して用いることも可能で
ある。これらＬｆは、天然物であり、乳の一成分として
古来より飲用されてきたものであるだけに、安全性に何
ら問題はない。
【００１１】次に本発明の大腸菌付着阻止効果について
試験例をあげて説明する。 ＜試験例＞ １．病原性大腸菌のヒト小腸細胞（ＪＴＣ−１７）への
付着に対する阻止効果。ヒト小腸細胞ＪＴＣ−１７（東
京医科大学より分譲を受けた）を、５％牛胎児血清を含
むダルベッコ変法イーグル培地（５％ＦＣＳ／ＤＭＥ
Ｍ）にて２５ｃｍ２の底面積をもつ培養フラスコに３７
℃、ＣＯ２濃度５％で培養する。細胞がフラスコの底面
一面に増殖したら、培養をやめ常法どうりトリプシン
（２００Ｕ／ｍｌ）含有、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）１ｍｌにて細胞をはがし取り、１０００ｒｐｍで５
分間遠心分離することで細胞を集めた。上清を吸い出
し、新たに５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ ８ｍｌに細胞を懸濁
した。この細胞懸濁液各１ｍｌを１０ｍｌポリスチレン
チューブ（ファルコン社２０９５）に入れ３７℃３日間
培養した。
試験例をあげて説明する。 ＜試験例＞ １．病原性大腸菌のヒト小腸細胞（ＪＴＣ−１７）への
付着に対する阻止効果。ヒト小腸細胞ＪＴＣ−１７（東
京医科大学より分譲を受けた）を、５％牛胎児血清を含
むダルベッコ変法イーグル培地（５％ＦＣＳ／ＤＭＥ
Ｍ）にて２５ｃｍ２の底面積をもつ培養フラスコに３７
℃、ＣＯ２濃度５％で培養する。細胞がフラスコの底面
一面に増殖したら、培養をやめ常法どうりトリプシン
（２００Ｕ／ｍｌ）含有、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）１ｍｌにて細胞をはがし取り、１０００ｒｐｍで５
分間遠心分離することで細胞を集めた。上清を吸い出
し、新たに５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ ８ｍｌに細胞を懸濁
した。この細胞懸濁液各１ｍｌを１０ｍｌポリスチレン
チューブ（ファルコン社２０９５）に入れ３７℃３日間
培養した。
【００１２】病原性大腸菌Ｈ１０４０７株、Ｐｂ１７６
株（都立衛生研より分譲を受けた）をそれぞれ１白金耳
取り、普通ブイヨン培地４ｍｌに３７℃で一夜培養し
た。培養後、３０００ｒｐｍ１０分間遠心分離すること
により集菌し、これをｐＨ８に調整したＰＢＳで３回洗
浄した。その後、大腸菌をｐＨ８に調整したＰＢＳ １
ｍｌに懸濁し、フルオレッセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）（シグマ社）１ｍｇを加えよく溶解し４℃
で３時間ゆっくり撹拌しながら反応させ、大腸菌をＦＩ
ＴＣにてラベルした。ラベルを終えた大腸菌は、３００
０ｒｐｍ１０分間の遠心分離にて集菌し、ＰＢＳにて３
回洗浄した後、３ｍｌのＰＢＳに懸濁した。この様にし
て調製した、ＦＩＴＣでラベルした大腸菌懸濁液４００
μｌに、目的のサンプルＰＢＳ溶液２００μｌを混合
し、３７℃で１時間インキュベートした。
株（都立衛生研より分譲を受けた）をそれぞれ１白金耳
取り、普通ブイヨン培地４ｍｌに３７℃で一夜培養し
た。培養後、３０００ｒｐｍ１０分間遠心分離すること
により集菌し、これをｐＨ８に調整したＰＢＳで３回洗
浄した。その後、大腸菌をｐＨ８に調整したＰＢＳ １
ｍｌに懸濁し、フルオレッセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）（シグマ社）１ｍｇを加えよく溶解し４℃
で３時間ゆっくり撹拌しながら反応させ、大腸菌をＦＩ
ＴＣにてラベルした。ラベルを終えた大腸菌は、３００
０ｒｐｍ１０分間の遠心分離にて集菌し、ＰＢＳにて３
回洗浄した後、３ｍｌのＰＢＳに懸濁した。この様にし
て調製した、ＦＩＴＣでラベルした大腸菌懸濁液４００
μｌに、目的のサンプルＰＢＳ溶液２００μｌを混合
し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００１３】一方、３日間の培養を終えたＪＴＣ１７細
胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し上清の培地を除
き、さらにＰＢＳで３回洗浄し、これに上述の大腸菌と
サンプルとを混合し、インキュベートした溶液各６００
μｌを加え３７℃で３０分間インキュベートした。イン
キュベート終了後、７５０ｒｐｍ５分間遠心分離し、細
胞だけを沈澱させ、細胞に付着せず上清に残った大腸菌
を吸い出した。さらに、ＰＢＳにて細胞を２回洗浄し
た。ＰＢＳで洗浄した細胞に２００Ｕトリプシン／ＰＢ
Ｓ ９００μｌを加え、激しく撹拌した。これに０．１
％ＳＤＳ１００μｌ，１ｍｌの脱イオン水を加え激しく
撹拌し、３０分間静置することにより細胞を溶解した。
この溶液を蛍光分光光度計（日立フルオレッセンススペ
クトロメーターＦ−３０００）にて励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５２０ｎｍで相対蛍光強度を測定し、蛍光
ラベルした大腸菌のＪＴＣ１７細胞への付着を評価し
た。表１には、サンプルを添加しない時（ブランク）の
相対蛍光強度を付着率１００％、蛍光ラベルした大腸菌
のポリスチレンチューブへの非特異的な吸着（ポリスチ
レンチューブ内に検体と同じ濃度の蛍光ラベルした大腸
菌を入れ、検体と同じ条件で測定した相対蛍光強度）を
付着率０％とし、各サンプルを添加した際の付着率を示
している。実験は、すべて３連で行った。
胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し上清の培地を除
き、さらにＰＢＳで３回洗浄し、これに上述の大腸菌と
サンプルとを混合し、インキュベートした溶液各６００
μｌを加え３７℃で３０分間インキュベートした。イン
キュベート終了後、７５０ｒｐｍ５分間遠心分離し、細
胞だけを沈澱させ、細胞に付着せず上清に残った大腸菌
を吸い出した。さらに、ＰＢＳにて細胞を２回洗浄し
た。ＰＢＳで洗浄した細胞に２００Ｕトリプシン／ＰＢ
Ｓ ９００μｌを加え、激しく撹拌した。これに０．１
％ＳＤＳ１００μｌ，１ｍｌの脱イオン水を加え激しく
撹拌し、３０分間静置することにより細胞を溶解した。
この溶液を蛍光分光光度計（日立フルオレッセンススペ
クトロメーターＦ−３０００）にて励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５２０ｎｍで相対蛍光強度を測定し、蛍光
ラベルした大腸菌のＪＴＣ１７細胞への付着を評価し
た。表１には、サンプルを添加しない時（ブランク）の
相対蛍光強度を付着率１００％、蛍光ラベルした大腸菌
のポリスチレンチューブへの非特異的な吸着（ポリスチ
レンチューブ内に検体と同じ濃度の蛍光ラベルした大腸
菌を入れ、検体と同じ条件で測定した相対蛍光強度）を
付着率０％とし、各サンプルを添加した際の付着率を示
している。実験は、すべて３連で行った。
【００１４】
【表１】
【００１５】なお、表中の記号は次のことを示す。 ｂＬｆ：ウシラクトフェリン、ｈＬｆ：ヒトラクトフェ
リン、ｇＬｆ：ヤギラクトフェリン、ｗＬｆ：水牛ラク
トフェリン、ｂＧＭＰ：ウシグリコマクロペプチド。い
ずれの試料でも病原性大腸菌のヒト小腸細胞（ＪＴＣ−
１７）への付着は阻止されるが、特にｂＬｆはその効果
が優れており、プロテアーゼ処理したｂＬｆにおいても
付着阻止効果を示した。特にトリプシン処理したものは
未処理と殆ど変わらない効果を示した。
リン、ｇＬｆ：ヤギラクトフェリン、ｗＬｆ：水牛ラク
トフェリン、ｂＧＭＰ：ウシグリコマクロペプチド。い
ずれの試料でも病原性大腸菌のヒト小腸細胞（ＪＴＣ−
１７）への付着は阻止されるが、特にｂＬｆはその効果
が優れており、プロテアーゼ処理したｂＬｆにおいても
付着阻止効果を示した。特にトリプシン処理したものは
未処理と殆ど変わらない効果を示した。
【００１６】２．無菌マウスＩＣＲ ２０匹を５匹ずつ
４群に分け、各群に以下の試料を毎日０．２ｍｌずつ経
口投与した。 Ａ群 ＰＢＳ ０．２ｍｌ Ｂ群 ｂＬｆ １ｍｇ／０．２ｍｌ ＰＢＳ Ｃ群 ｂＧＭＰ １ｍｇ／０．２ｍｌ ＰＢＳ
４群に分け、各群に以下の試料を毎日０．２ｍｌずつ経
口投与した。 Ａ群 ＰＢＳ ０．２ｍｌ Ｂ群 ｂＬｆ １ｍｇ／０．２ｍｌ ＰＢＳ Ｃ群 ｂＧＭＰ １ｍｇ／０．２ｍｌ ＰＢＳ
【００１７】なお、各試料は、０．２２μｍのフィルタ
ーで濾過除菌してから用いた。一方、病原性大腸菌Ｐｂ
１７６株を普通ブイヨン培地で培養後、集菌し、ＰＢＳ
で３回洗浄した。各試料投与後１週間目の各マウスに１
０４ＣＦＵ／０．２ｍｌの菌液を経口投与し、さらに１
週間各試料を投与し続けた。その後マウスを無菌的に解
剖し腸管を摘出した。この腸管をホモゲナイズし、その
１ｍｌを寒天ゲル平板に接種し菌数を数えた。 Ａ群 ４．３×１０５ ＣＦＵ Ｂ群 ７．０×１０３ ＣＦＵ Ｃ群 ３．９×１０４ ＣＦＵ このように、Ｂ群では、Ａ群に比べ有意に菌数が低く、
さらに従来公知のＣ群に比べても菌数が低く、病原性大
腸菌の付着が顕著に阻止された。
ーで濾過除菌してから用いた。一方、病原性大腸菌Ｐｂ
１７６株を普通ブイヨン培地で培養後、集菌し、ＰＢＳ
で３回洗浄した。各試料投与後１週間目の各マウスに１
０４ＣＦＵ／０．２ｍｌの菌液を経口投与し、さらに１
週間各試料を投与し続けた。その後マウスを無菌的に解
剖し腸管を摘出した。この腸管をホモゲナイズし、その
１ｍｌを寒天ゲル平板に接種し菌数を数えた。 Ａ群 ４．３×１０５ ＣＦＵ Ｂ群 ７．０×１０３ ＣＦＵ Ｃ群 ３．９×１０４ ＣＦＵ このように、Ｂ群では、Ａ群に比べ有意に菌数が低く、
さらに従来公知のＣ群に比べても菌数が低く、病原性大
腸菌の付着が顕著に阻止された。
【００１８】３ ．マウスを用いた皮膚への大腸菌付着阻止 無菌マウスＩＣＲの背中の体毛を約２ｃｍそり落とし、
アルコール綿で消毒した。このマウスを４匹ずつ４群に
分けた。体毛をそった部分の中心に注射針で傷をつけ、
各群のマウスに下記の試料を塗り付けた。 Ａ群 脱イオン水 Ｂ群 １％ ｂＬｆ Ｃ群 １％ ｂＬｆトリプシン分解物 Ｄ群 １％ ｂＧＭＰ 塗り付けた直後に病原性大腸菌 Ｈ １０４０７株を１
０４ＣＦＵずつ塗り付けた。１時間後、ＰＢＳにて傷口
を洗い１週間そのまま無菌的に飼育した。
アルコール綿で消毒した。このマウスを４匹ずつ４群に
分けた。体毛をそった部分の中心に注射針で傷をつけ、
各群のマウスに下記の試料を塗り付けた。 Ａ群 脱イオン水 Ｂ群 １％ ｂＬｆ Ｃ群 １％ ｂＬｆトリプシン分解物 Ｄ群 １％ ｂＧＭＰ 塗り付けた直後に病原性大腸菌 Ｈ １０４０７株を１
０４ＣＦＵずつ塗り付けた。１時間後、ＰＢＳにて傷口
を洗い１週間そのまま無菌的に飼育した。
【００１９】その後皮膚を１ｃｍ２角に切り取り、ホモ
ゲナイズした。この液１ｍｌを寒天培地を入れたシャー
レに接種し、３７℃一夜培養後菌数を測定した。結果を
下記に示す。 Ａ群 １．８×１０８ ＣＦＵ Ｂ群 ５．２×１０４ ＣＦＵ Ｃ群 ４．４×１０５ ＣＦＵ Ｄ群 ２．５×１０５ ＣＦＵ Ｂ群及びＣ群は、従来公知のＤ群と同様に付着していた
菌数が有意に少ない結果を示した。
ゲナイズした。この液１ｍｌを寒天培地を入れたシャー
レに接種し、３７℃一夜培養後菌数を測定した。結果を
下記に示す。 Ａ群 １．８×１０８ ＣＦＵ Ｂ群 ５．２×１０４ ＣＦＵ Ｃ群 ４．４×１０５ ＣＦＵ Ｄ群 ２．５×１０５ ＣＦＵ Ｂ群及びＣ群は、従来公知のＤ群と同様に付着していた
菌数が有意に少ない結果を示した。
【００２０】次に、本発明のＬｆまたはそのプロテアー
ゼ分解物を有効成分とする大腸菌付着阻止剤を用いた飲
食品、飼料、化粧品等の応用例を記載する。
ゼ分解物を有効成分とする大腸菌付着阻止剤を用いた飲
食品、飼料、化粧品等の応用例を記載する。
【応用例１】下記配合のＬｆ配合飲料を製造した。 溶液Ａ Ｌｆ １．２ｋｇ 脱イオン水 ５０ｋｇ 溶液Ｂ ショ糖 ４８ｇ クエン酸 ８００ｇ クエン酸ナトリウム ８００ｇ ビタミンＢ２ １．１ｇ ビタミンＢ６ ２．２ｇ ビタミンＣ ５．５ｇ 葉 酸 ０．４ｇ 香 料 １００ｇ １／５濃縮果汁 １ｋｇ 水 ５０ｋｇ 溶液ＡとＢを別々にプレート殺菌機にて９３℃３分間保
持して殺菌後、冷却（５〜１０℃）し、殺菌済タンク中
に貯蔵した。次いでこの混合液を殺菌済紙容器に無菌的
に充填し、大腸菌付着阻止用飲料を製造した。
持して殺菌後、冷却（５〜１０℃）し、殺菌済タンク中
に貯蔵した。次いでこの混合液を殺菌済紙容器に無菌的
に充填し、大腸菌付着阻止用飲料を製造した。
【００２１】次に溶液Ｃとして下記の配合のものを用い
た。 溶液Ｃ Ｌｆトリプシン１時間分解物 ６００ｇ Ｌｆペプシン１時間分解物 ６００ｇ 脱イオン水 ５０ｋｇ 溶液ＣとＢを同様に別々に殺菌し無菌的に両者を混合充
填して、大腸菌付着阻止用飲料を製造した。
た。 溶液Ｃ Ｌｆトリプシン１時間分解物 ６００ｇ Ｌｆペプシン１時間分解物 ６００ｇ 脱イオン水 ５０ｋｇ 溶液ＣとＢを同様に別々に殺菌し無菌的に両者を混合充
填して、大腸菌付着阻止用飲料を製造した。
【００２２】
【応用例２】 ローション配合例（％） クエン酸 ０．１ スルホ石灰酸亜鉛 ０．２ グリセリン ０．５ ポリオキシエチレン（２０モル） １．０ オレイルアルコールエーテル エチルアルコール ２０．０ 香料・防腐剤 適量 Ｉｆ １．０ 水 残余 本ローションは皮膚面に１日１〜３回塗布して使用す
る。
る。
【００２３】
【応用例３】 動物用飼料配合例 脱粉 ５９．０ｇ ホエー蛋白濃縮物（ＷＰＣ） １４．３ｇ 脂肪 ７．２ｇ グルコース ５．０ｇ ビタミン・ミネラル ２．５ｇ Ｌｆ ２．０ｇ 計 １００ｇ
【００２４】さらに本発明の大腸菌付着阻止剤の形態を
実施例として示す。
実施例として示す。
【実施例１】 上記の配合を行ない、よく混合した後に４００ｍｇずつ
カプセルに入れた。本カプセルは１日１〜３回程度を目
安に投与される。
カプセルに入れた。本カプセルは１日１〜３回程度を目
安に投与される。
【００２５】
【実施例２】医薬用錠剤 Ｌｆ１００ｍｇ、および微結晶セルロース１００ｍｇを
含む錠剤を常法に従って調製し、シロップゼラチン沈降
性炭酸カルシウムで糖衣をほどこした。本錠剤は１日１
〜３錠を目安にして投与される。
含む錠剤を常法に従って調製し、シロップゼラチン沈降
性炭酸カルシウムで糖衣をほどこした。本錠剤は１日１
〜３錠を目安にして投与される。
【００２６】
【発明の効果】本発明のＬｆまたはＬｆ部分分解物を有
効成分とする大腸菌付着阻止剤は、従来病原菌付着阻止
効果があるとして知られているκ−カゼインまたはκ−
カゼイン分解物と同様に皮膚および腸管における大腸菌
の付着を阻止することができる。また、本発明の有効成
分はその安全性も確認されており、さらに牛乳より大量
に入手し得るのでコストの面からも実用性が高い。さら
に、本発明の大腸菌付着阻止剤を飲食品、飼料、医薬
品、化粧品等に添加することによって毒性のない大腸菌
付着阻止効果を有する飲食品、飼料、医薬品、化粧品等
を安定的かつ安価に供給することができ、食中毒を未然
に防止することが可能になる。
効成分とする大腸菌付着阻止剤は、従来病原菌付着阻止
効果があるとして知られているκ−カゼインまたはκ−
カゼイン分解物と同様に皮膚および腸管における大腸菌
の付着を阻止することができる。また、本発明の有効成
分はその安全性も確認されており、さらに牛乳より大量
に入手し得るのでコストの面からも実用性が高い。さら
に、本発明の大腸菌付着阻止剤を飲食品、飼料、医薬
品、化粧品等に添加することによって毒性のない大腸菌
付着阻止効果を有する飲食品、飼料、医薬品、化粧品等
を安定的かつ安価に供給することができ、食中毒を未然
に防止することが可能になる。
【図１】試験例２の無菌マウスに病原性大腸菌（Ｐｈ−
１７６及びＨ−１０４０７）投与後の日数と糞便中の病
原性大腸菌数との関係を示す。
１７６及びＨ−１０４０７）投与後の日数と糞便中の病
原性大腸菌数との関係を示す。
【図２】試験例２の病原性大腸菌（Ｐｂ−１７６）の腸
管付着防止に対するウシラクトフェリンの効果を示す。
管付着防止に対するウシラクトフェリンの効果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−284133（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−220130（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．197（1977) Ｐ．263−265 Ｎｅｓｔｌｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓ ｈｏｐ Ｓｅｖｉｅｓ，Ｖ ｏｌ．５（1984) Ｒｅｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｂｏｏｋｓ Ｌｔｄ．，Ｐ．133−143 Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ. 18，Ｎｏ．１（1985）Ｐ．３−12 小児科臨床，第39巻，第６号（1986) Ｐ．1287−1293 周産期医学，第19巻，第４号（1989) Ｐ．125−130 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 38/40 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】 ラクトフェリンまたはそのプロテアーゼ
分解物を有効成分とする大腸菌付着阻止剤
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6331757A JP2832517B2 (ja) | 1994-12-09 | 1994-12-09 | 大腸菌付着阻止剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6331757A JP2832517B2 (ja) | 1994-12-09 | 1994-12-09 | 大腸菌付着阻止剤 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015285A Division JP2673320B2 (ja) | 1990-01-25 | 1990-01-25 | う蝕原菌付着阻止剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07300425A JPH07300425A (ja) | 1995-11-14 |
| JP2832517B2 true JP2832517B2 (ja) | 1998-12-09 |
Family
ID=18247284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6331757A Expired - Lifetime JP2832517B2 (ja) | 1994-12-09 | 1994-12-09 | 大腸菌付着阻止剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2832517B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7642395B2 (en) | 2004-12-28 | 2010-01-05 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Composition and wipe for reducing viscosity of viscoelastic bodily fluids |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001519815A (ja) * | 1997-04-10 | 2001-10-23 | エイジェニックス・インコーポレイテッド | アレルゲン誘発性障害の治療におけるラクトフェリンの使用 |
| US6172040B1 (en) * | 1999-05-28 | 2001-01-09 | A. Satyanarayan Naidu | Immobilized lactoferrin antimicrobial agents and the use thereof |
| JP4592260B2 (ja) * | 2003-05-29 | 2010-12-01 | 雪印乳業株式会社 | ラクトフェリン組成物 |
| US7332179B2 (en) | 2003-12-12 | 2008-02-19 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Tissue products comprising a cleansing composition |
| WO2005079582A1 (en) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Campina B.V. | Antimicrobial lactoferrin compositions for surfaces, cavities, and foodstuff |
| EP1833495B1 (en) | 2005-03-15 | 2008-02-06 | Campina Nederland Holding B.V. | Dermatologic use of milk proteins |
| EP1940454A4 (en) * | 2005-09-28 | 2012-01-04 | Ventria Bioscience | ORAL PREPARATION FOR ENTERIC DISORDERS AND / OR REHYDRATION |
| JP2007332072A (ja) * | 2006-06-15 | 2007-12-27 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 歯質硬度維持剤 |
| ITRM20060434A1 (it) | 2006-08-07 | 2008-02-08 | Pietro Raimondi | Prodotto da somministrare all organismo umano per isuoi effetti protettivi e curativi a base di latte di bufala autorricchito di lattoferrina oppure di lattoferrina tal quale ottenuto attraverso processi separativi di membrana |
| JP4858699B2 (ja) * | 2006-09-27 | 2012-01-18 | ライオン株式会社 | 歯の美白用セット |
| JP5897783B2 (ja) * | 2009-12-24 | 2016-03-30 | 株式会社ロッテ | 抗アンドロゲン剤及び皮脂分泌抑制剤 |
| JP5427713B2 (ja) * | 2010-07-02 | 2014-02-26 | 森永乳業株式会社 | 統合失調症の陽性症状のための治療薬 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2631470B2 (ja) * | 1987-05-15 | 1997-07-16 | 雪印乳業株式会社 | 感染防御剤 |
| JP2673320B2 (ja) * | 1990-01-25 | 1997-11-05 | 雪印乳業株式会社 | う蝕原菌付着阻止剤 |
-
1994
- 1994-12-09 JP JP6331757A patent/JP2832517B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１（１９８５）Ｐ．３−１２ |
| Ｎｅｓｔｌｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓ ｈｏｐ Ｓｅｖｉｅｓ，Ｖｏｌ．５（１９８４） |
| Ｒｅｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｂｏｏｋｓ Ｌｔｄ．，Ｐ．１３３−１４３ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１９７（１９７７）Ｐ．２６３−２６５ |
| 周産期医学，第１９巻，第４号（１９８９）Ｐ．１２５−１３０ |
| 小児科臨床，第３９巻，第６号（１９８６）Ｐ．１２８７−１２９３ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7642395B2 (en) | 2004-12-28 | 2010-01-05 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Composition and wipe for reducing viscosity of viscoelastic bodily fluids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07300425A (ja) | 1995-11-14 |
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