CN104561098A - 一种重组人乳铁蛋白蚕蛹粉及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人乳铁蛋白蚕蛹粉及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明主要利用家蚕杆状病毒表达系统构建重组病毒，以家蚕蛹作为生物反应器表达重组人乳铁蛋白，将接种重组病毒发病后的蚕蛹制成冻干粉，通过体外抑菌试验进行活性检测，以灌胃方式治疗由葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎，对小鼠的疾病活动指数(DAI)进行分析，并检测其结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的含量，结果表明家蚕蛹中成功表达了具有抑菌活性的重组人乳铁蛋白(rhLF)，且rhLF蚕蛹粉对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有一定的治疗作用，为生产新型的口服蛋白药物提供了一种简单、廉价的方法。

Description

一种重组人乳铁蛋白蚕蛹粉及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组人乳铁蛋白蚕蛹粉及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，简称LF)，是转铁蛋白属中的一员，主要存在于哺乳动物乳清中，亦称乳转铁蛋白。乳铁蛋白分布广泛，除乳汁中含有丰富的乳铁蛋白外，在一些分泌物，如：泪液、精液、胆汁中也检测到乳铁蛋白的存在。

人乳铁蛋白(Human Lactoferrin，hLF)，是一种分泌型铁结合糖蛋白，由一条多肽链折叠成两个结构相似的脑叶结构，每个结构含有一个铁结合位点。 hLF的cDNA为2136bp，所编码的前19个氨基酸为信号肽，后692个氨基酸构成分子量约80kD的成熟人乳铁蛋白。hLF具有铁结合能力、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节以及消炎等多种生物学功能。

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)，是一种慢性肠道疾病，其病因及发病机制目前尚不清楚。病变主要位于结肠的黏膜层；以溃疡为主；多累及直肠和远端结肠。典型的临床表现为腹痛、腹泻、粘液脓血便。由于其病因不明,病程漫长且易反复发作而治愈难度大，已引起医药行业人士的广泛重视。

治疗UC的常用给药制剂有液体灌肠剂、泡沫剂和栓剂，但由于剂型应用不便，制约了药效发挥。中药口服制剂以汤药居多，且大多为粗制剂，服用量大，生物利用度低，药效缓慢。柳氮磺胺嘧啶片(SASP)是目前西药治疗轻中度UC的首选口服药物，口服后在肠道被细菌分解成5-氨基水杨酸和磺胺嘧啶，前者被小肠大量吸收，导致无足量药物抵达结肠；而后者并无治疗作用，吸收后产生大量不良反应。因此，研究一种有效、安全的新型口服药显得尤为必要和紧迫。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种克服上述缺陷的重组人乳铁蛋白蚕蛹粉及其制备方法和应用，通过构建重组杆状病毒Bm-hLF，以家蚕蛹作为生物反应器大量表达重组人乳铁蛋白，并考察了rhLF(重组人乳铁蛋白)蚕蛹粉在用于制备由葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供一种家蚕重组杆状病毒Bm-hLF，该病毒含有hLF基因。

优选地，其中所述hLF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种上述家蚕重组杆状病毒Bm-hLF的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1) 通过设计引物，由PCR扩增的方法以携带有hLF基因的重组病毒DNA为模板获得hLF基因的目的片段；

2) hLF基因的5’和3’端分别引入XhoI和KpnI酶切位点后，连接到载体pFastBac1的多角体启动子下，构建成重组转移质粒pFastBac1-hLF；

3) 取步骤2)所得的重组转移质粒pFastBac1-hLF转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，培养24~48h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，进行PCR鉴定；

(4) 取步骤3)鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0~4℃保存，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bm-hLF。

本发明还提供一种上述家蚕重组杆状病毒Bm-hLF表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供含有上述蛋白的rhLF蚕蛹粉。

本发明还提供上述rhLF蚕蛹粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1) 家蚕重组杆状病毒Bm-hLF病毒液以穿刺法接种于家蚕蛹；

2) 通风透光，持续培养5~7天，培养环境为25~28℃，湿度80%；

3) 收集发病蚕蛹，4~8℃匀浆，冻干，获得所述rhLF蚕蛹粉。

本发明还提供上述rhLF蚕蛹粉的体外抑菌活性检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)取-80℃保存的E.coli TG1甘油菌，接种于LB液体培养基中，37℃，220rpm，摇床培养12~14h，以活化菌种；

2)将步骤1)活化得到的E.coliTG1菌液转接到新的LB液体培养基中，摇床培养2 h，使菌液变浑浊；

3) 将上述rhLF蚕蛹粉溶于提前在4℃中预冷的PBS中，冰上搅拌使其充分溶解，4℃，15000rpm，离心30min，上清重复离心，所得上清在超净工作台过0.22μm滤膜除菌，获得所述rhLF蚕蛹粉的上清液；

4) 在超净工作台上，取灭菌EP管加入新的LB液体培养基200μL，再加入2μL步骤2)获得的菌液和20μL步骤3)获得的所述rhLF蚕蛹粉的上清液，37℃，220rpm摇床培养，分别在2h、4h、6h、8h、10h后取出相应的菌液，1000rpm离心10min，沉淀用PBS洗2次以消除蚕蛹粉的颜色干扰，最后用220μL的PBS重悬，测OD₆₀₀ 值，每组3个重复；

5) 以接种野生病毒蚕蛹粉和正常蚕蛹粉为阴性对照，处理方法同步骤3)所述， PBS为空白对照，绘制生长曲线。

本发明还提供上述rhLF蚕蛹粉在用于制备由葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的药物中的应用。

本发明实现的技术效果如下：

本发明构建的含有人乳铁蛋白的重组杆状病毒，可以利用家蚕蛹作为生物反应器高效表达重组人乳铁蛋白，且表达产物具有很好的生物学活性，将表达重组人乳铁蛋白的蚕蛹冻干制成蚕蛹粉，可以直接用于溃疡性结肠炎的口服治疗，适用于大规模生产，可降低成本，提高产量，所生产的rhLF蚕蛹粉应用价值大。

目前，尚无利用rhLF蚕蛹粉口服治疗溃疡性结肠炎的应用，蚕蛹粉本身含有多种天然蛋白质保护剂和脂类物质可以对表达的重组人乳铁蛋白起到一定的保护作用，提高其稳定性，具有较好的药用价值。

附图说明

图1为hLF基因的PCR扩增图：M. 10kb DNA分子量标准；1. PCR产物(箭头所示为hLF条带)；

图2为重组质粒pFastBac1-hLF鉴定图：M. 10kb DNA分子量标准；1. XhoⅠ/Kpn I 酶切重组质粒；2. PCR产物；

图3为重组Bacmid-hLF的PCR鉴定图：M. 10kb DNA分子量标准；1. M13 F和hLF R为上下游引物的PCR结果；2. hLF F和M13 R为上下游引物的PCR结果；

图4为重组杆状病毒基因组PCR鉴定图；M. 10kb DNA 分子量标准；1. M13 F和hLF R为上下游引物的PCR结果；2. hLF F和M13 R为上下游引物的PCR结果；

图5为BmN细胞中rhLF蛋白的SDS-PAGE鉴定图；M.低分子量蛋白质标准；1. 正常细胞上清；2. 感染重组病毒vBm-hLF的细胞上清；3. hLF标准品；

图6为BmN细胞中rhLF蛋白的Western blotting鉴定图；M.低分子量蛋白质标准；1. 正常细胞上清；2. 感染重组病毒vBm-hLF的细胞上清；3. hLF标准品；

图7为蚕蛹中rhLF蛋白的SDS-PAGE鉴定图；M. 低分子量蛋白质标准；1. hLF标准品；2. 发病蚕蛹匀浆后上清；3. 正常蚕蛹匀浆后上清；

图8为蚕蛹中rhLF蛋白的Western blotting鉴定图；M. 低分子量蛋白质标准；1. hLF标准品；2. 发病蚕蛹匀浆后上清；3. 正常蚕蛹匀浆后上清；

图9为rhLF蚕蛹粉对大肠杆菌的生长曲线作用图；

图10为小鼠结肠组织中MPO的含量检测图。

具体实施方式

应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。

实施例1：hLF基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的获得

根据NCBI上提供的hLF(基因登录号：AY875691.1)的基因序列设计一对引物：

hLF F：5’-GCGCTCGAGATGAAACTTGTCTTCC- 3’

hLF R：5’-CGCGGTACCTTACTTCCTGAGGAATTC-3’

以携带有hLF基因的重组病毒DNA (Tao Liu, Yao-Zhou Zhang, Xiang-Fu Wu. Recombinant Functional Human Lactoferrin Expressed in Baculovirus System( J). Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2006, 38 (3): 201–206)为模板，以hLF F和hLF R为上下游引物，进行PCR扩增，具体反应体系和反应程序如下：

PCR反应体系：

10×Taq buffer             5 μL

10 mM dNTPs              1 μL

hLF F                         2.5 μL

hLF R                         2.5 μL

模板                            1 μL

Taq 酶                         1 μL

ddH₂O                          37 μL

反应程序：

                                                                                     

待反应结束后，电泳鉴定扩增片段, 目的片段大小为2136bp(参见图1)，同时切胶回收目的片段。 

实施例2：重组转移质粒pFastBac1-hLF的构建

将pFastBac 1载体(购自Invitrogen公司)用XhoI和 KpnI (购自Fermentas公司)双酶切后，回收大片段，与纯化的hLF PCR产物连接，构建重组转移质粒pFstBac1-hLF。通过酶切分析、双向测序鉴定基因序列正确，说明重组转移质粒构建成功。图2为重组转移质粒pFastBac1-hLF的双酶切和PCR鉴定电泳图。

实施例3：家蚕重组杆状病毒Bm-rhLF的获得

鉴定重组成功的重组转移质粒pFastBac1-hLF转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen公司)，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板(购自上海生工生物公司，按照说明书进行操作)上培养，通过转座进行同源重组(pFastBac 1-hLF上的hLF序列通过同源转座插入到Bacmid的多克隆位点)后进行蓝白斑筛选，避光培养48h后挑取白斑，白斑继续在含四环素、卡那霉素、庆大霉素、X-gal和IPTG的LB培养液中摇菌培养48h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组DNA，用M13通用引物、hLF-F和hLF-R通过PCR扩增鉴定重组Bacmid中目的基因插入情况，插入成功的质粒命名为Bacmid-hLF(即重组杆状病毒基因组)。图3为重组Bacmid-hLF的PCR鉴定图。

其中，M13通用引物序列：

M13F：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC- 3’

M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC- 3’

鉴定成功的质粒Bacmid-hLF通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞(购自Invitrogen公司)，转染使用Invitrogen 公司脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent，转染方法参照该转染试剂说明书，转染具体步骤为：

前一天晚上将6μL的质粒Bacmid-hLF和8μL Cellfectin Ⅱ Reagent(购自Invitrogen 公司)加到76μL的sf-900ⅡSFM(1×)无血清培养基中(购自GIBCO公司)，室温孵育20min，使脂质体充分包裹质粒Bacmid-hLF，然后将其加入到1mL生长良好的家蚕BmN细胞中，置入培养箱培养过夜，第二天早上将无血清培养基吸走，换成添加了10%(v/v)胎牛血清（FBS，购自奥地利PAA公司）的培养基培养5~7天，待细胞发病。

细胞发病后(显微镜观察)获得一代病毒悬液4℃保存，提取病毒基因组用M13上下游引物和hLF上下游引物PCR鉴定，电泳检测有明显的目的条带(参见图4)，结果表明病毒构建成功，获得重组杆状病毒，命名为Bm-hLF。

实施例4：BmN细胞中hLF蛋白的表达鉴定

将家蚕重组杆状病毒Bm-hLF感染BmN细胞进行病毒扩增，3-5天后发病，收集病毒液，取1 mL 4℃，800rpm，离心10 min，沉淀用PBS洗2次，最后用40 μL的PBS重悬，加入10 μL 5×蛋白质上样缓冲液(250mM Tris-HCl(PH6.8)，10%(W/V)SDS，0.5%(W/V)溴酚蓝，50%(W/V)甘油，5%(W/V)β-巯基乙醇)，100℃加热10 min，进行SDS-PAGE及Western blotting检测，结果显示hLF成功表达(参见图5，图6)。hLF蛋白测序结果显示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例5：hLF蛋白在家蚕蛹中的表达鉴定

重组杆状病毒Bm-hLF病毒液以穿刺法接种于家蚕蛹(购自浙江中奇生物药业股份有限公司)背部倒数第2、3节间，27℃，湿度80%，通风透光，持续培养5~7天。接种5天后，蚕蛹开始出现发病症状：蛹体颜色暗褐，体壁易破，破后流出黄色浓汁，收集发病蚕蛹-80℃冰箱保存备用。

随机称取100g发病的蚕蛹，加入200mL PBS缓冲液，用匀浆机匀浆30min，匀浆30s，冰上放置2min。4℃，15000rpm，离心30min，9层医用纱布过滤去除油脂类物质，反复3次。取40μL上清加入10μL的5×蛋白质上样缓冲液，100℃加热10min，取加热后的混合液12μL进行SDS-PAGE和Western blotting分析，以正常蚕蛹作为阴性对照，结果表明hLF蛋白在蚕蛹中成功表达(参见图7，图8)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例6：rhLF蚕蛹粉的制备

将上述蚕蛹按1：10(W/V)加入预冷的ddH₂O，用匀浆机匀浆30min, 匀浆30s，冰上放置2min，匀浆液倒入干净的瓷盘中，冻干成蚕蛹粉，-20℃保存备用。具体冻干工艺如下表1：

表1

实施例7：rhLF蚕蛹粉的体外抑菌活性检测

取-80℃保存的E.coli TG1甘油菌(购自Invitrogen公司)，接种于LB液体培养基中，37℃，220rpm，摇床培养12~14h，以活化菌种，然后转接LB液体培养基中摇菌2h，使菌液变浑浊。

称取5g实施例6获得的rhLF蚕蛹粉至于15mL提前在4℃中预冷的PBS中，冰上搅拌使其充分溶解，4℃，15000rpm离心30min，上清重复离心，所得上清在超净工作台过0.22μm滤膜除菌。取灭菌 EP 管加入LB液体培养基200μL，再加入2μL 菌液和20μL rhLF 蚕蛹粉上清液，37℃，220rpm摇床培养，分别在2h、4h、6h、8h、10h后取出相应的菌液，1000rpm离心10min，沉淀用PBS洗2次以消除蚕蛹粉的颜色干扰，最后用220μL的PBS重悬，测OD₆₀₀ 值，每组3个重复。以接种野生病毒蚕蛹粉和正常蚕蛹粉为阴性对照，处理方法同上， PBS为空白对照，绘制生长曲线，见图9。结果表明，rhLF蚕蛹粉对E.coliTG1具有抑制和杀死作用，接种野生病毒的蚕蛹粉和正常蚕蛹粉对E.coliTG1的生长几乎没有影响，说明蚕蛹中表达的hLF蛋白具有生物活性。

实施例8：动物实验

选取BALB/c小鼠(购自天津市奥易得实验用品有限公司，5周龄，20±2g)，雌雄各半，随机分为柳氮磺胺吡啶(SASP，购自上海中西三维药业有限公司，国药准字 H31020450)组、rhLF蚕蛹粉组、阴性对照组、模型组和正常组，每组10只。除正常组外，其余各组小鼠自由饮用5%(W/V) DSS(葡聚糖硫酸钠，购自东京化成工业株式会社，分子量 Mw约为25000)(即5g DSS溶于100mL蒸馏水中)溶液一周，建立急性溃疡性结肠炎模型。一周后改用1%(W/V) DSS(即1g DSS溶于100mL蒸馏水中)维持一周，同时灌胃给药，SASP 组给药剂量为每天600mg/kg，治疗组和阴性对照组灌胃等量（2.5g/kg）的rhLF蚕蛹粉和正常蚕蛹粉，0.2mL/10g，模型组不灌胃。每天称重并记录小鼠活动及生理状况，按表2进行DAI(疾病活动指数)分析。

表2：DAI评分标准

 

 大便性状评分：正常大便：成形大便；

松散大便：不粘附于肛门的糊状、半成形大便；

稀便：可粘附于肛门的稀水样便。

其中，DAI的分数按下式计算： 

5%（W/V） DSS造模第3天小鼠开始出现半稀便，活动状态减弱，第5天开始出现不同程度的稀便和肉眼血便，小鼠怠动，精神不佳，毛发稀疏无光泽。造模7天后改用1%(W/V) DSS维持一周，除模型组外其余各组分别灌胃上述各组溶液给予治疗，连续7天，表3为各组小鼠的DAI评分结果，模型组分数明显高于其他各组，柳氮磺胺吡啶(SASP)组和rhLF蚕蛹粉组较正常组稍高，但明显低于阴性对照组，柳氮磺胺吡啶组和rhLF蚕蛹粉组差异无统计学意义，说明rhLF蚕蛹粉能够改善小鼠溃疡性结肠炎的症状。

表3：DAI评分结果(，n=10)

^▲▲：与模型组比较p<0.01；^**：与SASP组比较p<0.01

两周后处死小鼠，取各组小鼠的结肠组织按照髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒(购自USCN公司)说明书检测MPO含量，结果模型组中，髓过氧化物酶的含量明显高于其余各组，柳氮磺胺吡啶(SASP)组和rhLF蚕蛹粉治疗组没有显著差异，但两者都低于阴性对照组，说明rhLF蚕蛹粉对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有治疗作用。图10为小鼠结肠组织中MPO的含量检测图。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  天津耀宇生物技术有限公司

 

<120>  一种重组人乳铁蛋白蚕蛹粉及其制备方法和应用

 

<130>  132215-I-CP-TJYU

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  2136

<212>  DNA

<213>  hLF基因

 

<400>  1

atgaaacttg tcttcctcgt cctgctgttc ctcggggccc tcggactgtg tctggctggc       60

 

cgtaggagaa ggagtgttca gtggtgcgcc gtatcccaac ccgaggccac aaaatgcttc      120

 

caatggcaaa ggaatatgag aaaagtgcgt ggccctcctg tcagctgcat aaagagagac      180

 

tcccccatcc agtgtatcca ggccattgcg gaaaacaggg ccgatgctgt gacccttgat      240

 

ggtggtttca tatacgaggc aggcctggcc ccctacaaac tgcgacctgt agcggcggaa      300

 

gtctacggga ccgaaagaca gccacgaact cactattatg ccgtggctgt ggtgaagaag      360

 

ggcggcagct ttcagctgaa cgaactgcaa ggtctgaagt cctgccacac aggccttcgc      420

 

aggaccgctg gatggaatgt ccctataggg acacttcgtc cattcttgaa ttggacgggt      480

 

ccacctgagc ccattgaggc agctgtggcc aggttcttct cagccagctg tgttcccggt      540

 

gcagataaag gacagttccc caacctgtgt cgcctgtgtg cggggacagg ggaaaacaaa      600

 

tgtgccttct cctcccagga accgtacttc agctactctg gtgccttcaa gtgtctgaga      660

 

gacggggctg gagacgtggc ttttatcaga gagagcacag tgtttgagga cctgtcagac      720

 

gaggctgaaa gggacgagta tgagttactc tgcccagaca acactcggaa gccagtggac      780

 

aagttcaaag actgccatct ggcccgggtc ccttctcatg ccgttgtggc acgaagtgtg      840

 

aatggcaagg aggatgccat ctggaatctt ctccgccagg cacaggaaaa gtttggaaag      900

 

gacaagtcac cgaaattcca gctctttggc tcccctagtg ggcagaaaga tctgctgttc      960

 

aaggactctg ccattgggtt ttcgagggtg cccccgagga tagattctgg gctgtacctt     1020

 

ggctccggct acttcactgc catccagaac ttgaggaaaa gtgaggagga agtggctgcc     1080

 

cggcgtgcgc gggtcgtgtg gtgtgcggtg ggcgagcagg agctgcgcaa gtgtaaccag     1140

 

tggagtggct tgagcgaagg cagcgtgacc tgctcctcgg cctccaccac agaggactgc     1200

 

atcgccctgg tgctgaaagg agaagctgat gccatgagtt tggatggagg atatgtgtac     1260

 

actgcaggca aatgtggttt ggtgcctgtc ctggcagaga actacaaatc ccaacaaagc     1320

 

agtgaccctg atcctaactg tgtggataga cctgtggaag gatatcttgc tgtggcggtg     1380

 

gttaggagat cagacactag ccttacctgg aactctgtga aaggcaagaa gtcctgccac     1440

 

accgccgtgg acaggactgc aggctggaat atccccatgg gcctgctctt caaccagacg     1500

 

ggctcctgca aatttgatga atatttcagt caaagctgtg cccctgggtc tgacccgaga     1560

 

tctaatctct gtgctctgtg tattggcgac gagcagggtg agaataagtg cgtgcccaac     1620

 

agcaacgaga gatactacgg ctacactggg gctttccggt gcctggctga gaatgctgga     1680

 

gacgttgcat ttgtgaaaga tgtcactgtc ttgcagaaca ctgatggaaa taacaatgag     1740

 

gcatgggcta aggatttgaa gctggcagac tttgcgctgc tgtgcctcga tggcaaacgg     1800

 

aagcctgtga ctgaggctag aagctgccat cttgccatgg ccccgaatca tgccgtggtg     1860

 

tctcggatgg ataaggtgga acgcctgaaa caggtgttgc tccaccaaca ggctaaattt     1920

 

gggagaaatg gatctgactg cccggacaag ttttgcttat tccagtctga aaccaaaaac     1980

 

cttctgttca atgacaacac tgagtgtctg gccagactcc atggcaaaac aacatatgaa     2040

 

aaatatttgg gaccacagta tgtcgcaggc attactaatc tgaaaaagtg ctcaacctcc     2100

 

cccctcctgg aagcctgtga attcctcagg aagtaa                            2136

 

 

<210>  2

<211>  711

<212>  PRT

<213>  hLF蛋白

 

<400>  2

 

Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu

1               5                   10                  15     

 

 

Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser

            20                  25                  30         

 

 

Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys

        35                  40                  45             

 

 

Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro

                85                  90                  95     

 

 

Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu

        115                 120                 125            

 

 

Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly

    130                 135                 140                

 

 

Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly

145                 150                 155                 160

 

 

Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser

                165                 170                 175    

 

 

Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu

            180                 185                 190        

 

 

Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro

        195                 200                 205            

 

 

Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly

    210                 215                 220                

 

 

Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp

225                 230                 235                 240

 

 

Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg

                245                 250                 255    

 

 

Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser

            260                 265                 270        

 

 

His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp

        275                 280                 285            

 

 

Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro

    290                 295                 300                

 

 

Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe

305                 310                 315                 320

 

 

Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser

                325                 330                 335    

 

 

Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg

            340                 345                 350        

 

 

Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys

        355                 360                 365            

 

 

Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu

    370                 375                 380                 

 

 

Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys

385                 390                 395                 400

 

 

Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly

                405                 410                 415    

 

 

Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala

            420                 425                 430        

 

 

Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val

        435                 440                 445            

 

 

Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser

    450                 455                 460                

 

 

Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His

465                 470                 475                 480

 

 

Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu

                485                 490                 495    

 

 

Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser

            500                 505                 510        

 

 

Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile

        515                 520                 525            

 

 

Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg

    530                 535                 540                

 

 

Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly

545                 550                 555                 560

 

 

Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly

                565                 570                 575    

 

 

Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala

            580                 585                 590        

 

 

Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser

        595                 600                 605            

 

 

Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp

    610                 615                 620                

 

 

Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe

625                 630                 635                 640

 

 

Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser

                645                 650                 655    

 

 

Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg

            660                 665                 670        

 

 

Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val

        675                 680                 685            

 

 

Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu

    690                 695                 700                

 

 

Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys

705                 710   

Claims (8)

1.一种家蚕重组杆状病毒Bm-hLF，其特征在于，该病毒含有hLF基因。

2.一种权利要求1所述的家蚕重组杆状病毒Bm-hLF，其特征在于，所述hLF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bm-hLF的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1) 通过设计引物，由PCR扩增的方法以携带有hLF基因的重组病毒DNA为模板获得hLF基因的目的片段；

2) hLF基因的5’ 和3’ 端分别引入XhoI和KpnI酶切位点后，连接到载体pFastBac1的多角体启动子下，构建成重组转移质粒pFastBac1-hLF；

3) 取步骤2)所得的重组转移质粒pFastBac1-hLF转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，培养24~48h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，进行PCR鉴定；

4) 取步骤3)鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0~4℃保存，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bm-hLF。

4.一种权利要求1所述的家蚕重组杆状病毒Bm-hLF表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.一种含有权利要求4所述的蛋白的rhLF蚕蛹粉。

6.一种权利要求5所述的rhLF蚕蛹粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1) 家蚕重组杆状病毒Bm-hLF病毒液以穿刺法接种于家蚕蛹；

2) 通风透光，持续培养5~7天，培养环境为25~28℃，湿度80%；

3) 收集发病蚕蛹，4~8℃匀浆，冻干，获得所述rhLF蚕蛹粉。

7.一种权利要求5所述的rhLF蚕蛹粉的体外抑菌活性检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1) 取-80℃保存的E.coliTG1甘油菌，接种于LB液体培养基中，37℃，220rpm，摇床培养12~14h，以活化菌种；

2) 将步骤1)活化得到的E.coli TG1菌液转接到新的LB液体培养基中，摇床培养2h，使菌液变浑浊；

3) 将权利要求5所述的rhLF蚕蛹粉溶于提前在4℃中预冷的PBS中，冰上搅拌使其充分溶解，4℃，15000rpm，离心30min，上清重复离心，所得上清在超净工作台过0.22μm滤膜除菌，获得所述rhLF蚕蛹粉的上清液；

4) 在超净工作台上，取灭菌EP管加入新的LB液体培养基200μL，再加入2μL步骤2)获得的菌液和20μL步骤3)获得的所述rhLF蚕蛹粉的上清液，37℃，220rpm摇床培养，分别在2h、4h、6h、8h、10h后取出相应的菌液，1000rpm离心10min，沉淀用PBS洗2次以消除蚕蛹粉的颜色干扰，最后用220μL的PBS重悬，测OD₆₀₀ 值，每组3个重复；

5) 以接种野生病毒蚕蛹粉和正常蚕蛹粉为阴性对照，处理方法同步骤3)所述， PBS为空白对照，绘制生长曲线。

8.一种权利要求5所述的rhLF蚕蛹粉在用于制备由葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的药物中的应用。