CN105112382A - 一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法 - Google Patents

一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法，涉及基因工程和生物技术领域。将完整的人髓过氧化物酶MPO的cDNA克隆到自身含6个组氨酸的供体质粒上，获得含人MPO基因的重组供体质粒；在大肠杆菌BmDH10Bac中和家蚕杆状病毒基因组杆粒于转座子上发生转座，通过蓝、白斑筛选出带有目的基因的克隆，随后在家蚕细胞中制备含人MPO基因的重组病毒；用获得的含目的基因的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，同时给家蚕添加一定量的血红素前体；收集家蚕幼虫的体液，经超声波裂解，下进行高速离心，收集的上清进行分离纯化，最终获得目的产物。本发明利用家蚕作为生物反应器，大规模、低成本、高效率地制备重组人MPO的方法。

Description

一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法
技术领域
本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体而言，特指一种基于家蚕-杆状病毒表达系统、应用家蚕作为生物反应器来廉价、高效地制备具催化活性的人髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)的方法。
背景技术
人MPO是一种存在于正常人多形核中性白细胞(Polymorphonuclearneutrophils,PMN)嗜苯胺蓝颗粒(Azurophilicgranules)中被糖基化的血红素包含形可溶酶，它通过催化形成强氧化物和次氯酸在自身免疫有氧杀灭微生物系统中扮演着重要角色。
针对自身免疫系统性血管炎和炎症性等疾病，利用抗中性粒细胞胞浆抗体(p-ANCA)进行诊断已成为既定工具。临床上常见的自身抗原是人MPO及蛋白酶3(PR3)，通过抗原特异性诊断设备检测与这些抗原相对应的来自于中性粒细胞嗜天青颗粒的自身抗体，能够很容易的诊断出与抗中性粒细胞胞浆抗体相关的疾病。作为p-ANCA免疫荧光图谱的主要标靶，人MPO自身抗体指出了某些疾病的程度，如：特发性新月体性肾小球肾炎，Churg-Strauss综合征以及经典型结节性多动脉炎等相关疾病。
人MPO的基因编码全长为11千碱基（kilobase,kb），最初的翻译产物是一个80千道尔顿(kilodalton,kDa)的蛋白，该蛋白N-端由41个氨基酸组成的信号肽段被酶解切除后，继而糖基化加入富含甘露糖的侧链后重新生成一个约90kDa酶性不活跃的apoproMPO，当结合一个血红素基团后，apoproMPO变成了酶性活跃的前体蛋白MPO。N-端125个氨基酸前区通过酶解产生了一个约75kDa的蛋白，经过第二次酶解生成由约57kDa重链和约12kDa轻链组成的重轻原体人MPO，最终包装成的一个成熟的人MPO，其分子量大约为150kDa，由一对重链和一对轻链组成，两个重链沿着长轴由一个二硫键相连，富含甘露糖的糖基和两个铁素基团通过共价键与重链相连。
早期的研究表明，用人MPO的cDNA转染BHK细胞，观察到一个被糖基化了的85kDa的precursorMPO，它从内质网被缓慢释放，但没有进行进一步的蛋白水解过程(Cully,J.,etal,1989,Exp.CellRes.,180:440-450)。Moguilevsky等也观察到了一个从CHO细胞释放的具有酶活性的84kDa的precursorMPO，尽管这个84kDa的MPO与从HL-60细胞释放的89kDa的MPO非常相似(Hur,S.-J.,etal,1989,J.Biol.Chem.,264:8542-8548)，但也没有发现其具有蛋白水解过程(Moguilevsky,N.,etal,1991,Eur.J.Biochem.,197:605-614)。应用杆状病毒表达系统在Sf-9昆虫细胞中表达重组人MPO的实验表明，有两种形式的MPO被观察到，一种是84kDa的释放形MPO(释放到培养基上清中)，另一种是在细胞内表达的74kDa的MPO，这两种形式的MPO均显示被糖基化修饰，而只有胞内表达的74kDa的MPO进行了翻译后的蛋白水解过程(Taylor,K.L.etal,1992,Biochem.Biophys.Res.Commun.,187:1572-1578)，但这两种形式的MPO均不具过氧化酶的活性。也有研究表明，在感染了含人MPO重组病毒的T.ni细胞培养基中添加血红素前体，其表达的释放形MPO具有相应的酶催化活性(Shin,K.etal,2000,Biochem.Biophys.Res.Commun.,271:831-836)。
临床上用于自身免疫系统相关疾病体外诊断的MPO以人天然蛋白为最佳，但天然蛋白的资源有限，来源各异，导致纯化的天然抗原纯度低、批次之间不一致，且成本昂贵，以德国Diarect公司产品为例，每毫克天然（非重组）人MPO高达一万元人民币以上(http://www.ebiotrade.com/custom/biosun/100224/DIARECT.htm)。由于表达和蛋白折叠技术的瓶颈限制，利用体外表达系统所获得的重组人MPO成本高昂，如以色列ProSpec-Tany公司从大肠杆菌表达系统中制备的重组人MPO每毫克更高达八万元人民币以上(http://www.amyjet.com/products/ENZ-334.shtml)。严重制约了自身免疫系统相关疾病体外诊断技术的发展。
家蚕-杆状病毒表达系统凭借其高表达水平及强大的翻译后修饰功能而被普遍应用于大规模表达外源蛋白，通过家蚕-杆状病毒系统表达的人重组蛋白具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性与人的天然蛋白相似，且家蚕饲养简单方便，成本低，目前已经成为世界上最具商业开发价值的真核表达系统之一。
发明内容
针对制约在体外表达系统中制备重组人MPO的技术瓶颈，本发明首次提出一种高效、廉价、大规模制备重组人MPO的方法。本发明提出一种基于家蚕-杆状病毒表达系统，利用家蚕作为生物反应器，大规模、低成本、高效率地制备重组人MPO的方法。
本发明所采用的技术方案是：将完整的人MPO的cDNA(在C-端设计带有6个组氨酸)克隆到自身含6个组氨酸的供体质粒(pFastBacHTb)上，获得含人MPO基因的重组供体质粒；在大肠杆菌(菌株为BmDH10Bac)中和家蚕杆状病毒基因组杆粒(Bacmid)于转座子(Tn7)上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有目的基因的克隆，随后在家蚕细胞中(细胞株为BmN)制备含人MPO基因的重组病毒；感染宿主昆虫家蚕，同时给家蚕添加一定量的血红素前体；收集含表达了人MPO的家蚕幼虫的体液，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，40C下进行高速离心，收集的上清应用镍-柱亲和层析结合离子交换层析的方法进行分离纯化，最终获得目的产物。
本技术方案所述的人MPO的cDNA来源于已公开的DNA序列(GenBank:BC130476.1)；所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒(BmNPV)；所述的宿主昆虫为家蚕(Bombyxmori)，品种为“306”；所述的宿主昆虫感染时间是五龄期幼虫；所述的感染方法是经昆虫皮下注射接种感染；所述的血红素前体的添加是经口喂食；所述的杆状病毒供体质粒是是商品化的质粒(型号为pFastBacHTb)。
本技术方案所述的分离纯化具体操作是：收集的经超声波裂解、高速离心后含表达了人MPO的上清，经过镍-亲和层析柱和离子交换层析柱分离纯化出高纯度的目的产物。所述的镍-亲和层析柱为带组氨酸标签蛋白纯化试剂盒，离子交换层析柱是指FPLCMonoS。
本发明的突出优点表现为：
表达量高：通过制备含人MPO家蚕重组杆状病毒感染五龄起蚕第二天的家蚕幼虫，在感染4-5天后收集高表达了人MPO的蚕血淋巴，经分离纯化后，每条蚕可制备高达1.7微克左右目的蛋白。
成本低：家蚕是目前唯一可以大规模商业化无菌饲养的昆虫物种，由于避免了苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)-昆虫细胞表达系统中昆虫细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清，使得用家蚕作为生物反应器制备人MPO的成本低。
附图说明
图1为重组供体质粒的构建；
其中A:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)产物(～2277bp)。B:供体质粒pFastBacHTb(Lane1-2)和PCR产物(Lane3-4)被XhoI和HindIII双酶切。C:连接反应前酶切产物胶回收效率的鉴定，Lane1:供体质粒pFastBacHTb，Lane2:PCR产物。D:挑选的克隆双酶切鉴定，Lane1:空供体质粒作为对照，Lane2-4：连接产物涂平板过夜后所挑选克隆经双酶切反应后的琼脂糖胶。图中酶切后的供体质粒和MPO片段分别用箭头表示，LaneM表示标准DNA标记(marker)，左边的数字表示标准DNA标记的位置，以碱基对bp(basepair)表示。
图2为发生同源重组家蚕BacmidDNA的PCR鉴定；
其中以MPO中间引物C1669TGAATCGTCAGAACCAAATTG1690作为正引物和特异性反向引物(pUC/M13:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')对挑选的白斑BacmidDNA进行的PCR鉴定，图中M表示DNAmarker，以左边的数字表示(bp)，“1”表示以未发生转座的蓝斑BacmidDNA作为对照，“2”和“3”表示发生了转座的白斑BacmidDNA，预期的PCR产物位置(发生了同源重组)和未发生转座的PCR产物位置分别用箭头表示。
图3为含人MPO重组病毒在五龄家蚕中的表达时相；
五龄起蚕后第二天的家蚕接种含人MPO的重组病毒，并喂食一定量的血红素前体，每隔24小时收集一次蚕血淋巴，以未接种病毒的家蚕血淋巴作为阴性对照(0时)，测定酶活性(每5头蚕血淋巴的混合样)。纵坐标表示MPO活性检测试剂盒测定的活性，以毫单位/毫升(mU/mL)表示，横坐标表示感染病毒后收集蚕血淋巴的时间，以小时表示。
图4为在五龄家蚕中大量表达的人重组MPO的分离纯化；
其中经镍-柱纯化、再经MonoS离子交换层析柱分离纯化后获得的目的蛋白在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)上的分析结果。图左边的数字表示标准蛋白标记(Marker)位置(kDa)，大约90kDa的目的蛋白以箭头表示，图下方M表示标准蛋白Marker，Bc表示经镍-亲和层析柱纯化后的目的蛋白洗脱馏分合并后再经透析到MonoS柱的上样缓冲液中，数字表示经MonoS柱的各洗脱馏分。
图5为MonoS离子交换层析柱分离纯化后目的蛋白的蛋白质印迹杂交(WesternBlot)鉴定；
其中A:以抗His-标签的鼠单克隆抗体作为一抗的免疫反应(以α-His表示)；B:以抗人源MPO兔多克隆抗体作为第一抗的免疫反应[以α-MPO(Human)表示]。图中M表示标准蛋白质Marker以图中左右两边的数字表示(kDa)，图下方“1”表示免疫反应的加样量为1微克，“2”表示加样量为2微克，MPO的位置以箭头表示。
图6为分离纯化后目的蛋白的质谱鉴定；
经MonoS离子交换层析柱纯化后，将其SDS-PAGE凝胶上相对应的大约90kDa位置的目的条带用医用手术刀割下(图4中第21号洗脱馏分)进行质谱分析，得分为1140(ProteinScore)。图中相匹配的氨基酸肽段以加深的字体表示，覆盖率为61.48%。
图7为分离纯化后的人MPO酶活性分析；
其中按照比色法MPO活性检测试剂盒使用说明书，A:绘制发色载色体(TNB)标准曲线，横坐标表示不同TNB量(纳摩尔)，纵坐标表示所对应的不同量TNB在412纳米处的吸光度，标准曲线的公式和R2平方值均在图中标注。B:在250C下反应60分钟，测定各样品在412纳米处的吸光度，以“样品A412”表示；不加MPO基质的反应作为空白对照，以“空白对照A412”表示，计算出两者差值?A412=(空白对照A412)－(样品A412)作为纵坐标，参与反应的不同量样品作为横坐标，以微克(μg)表示，以来源于人嗜中性粒细胞表达的MPO作为阳性对照，对比TNB标准曲线A，确定各反应所消耗的TNB量，以纳摩尔(nmole)表示，从而计算出MPO的比活性。一个单位(Unit)MPO的活性定义为：在250C下每分钟水解基质产生的氨基乙磺酸氯胺所消耗1个微摩尔(μmole)TNB所需要MPO的量。
具体实施方式
本发明通过以下附图和实施例作进一步详细阐述。
实验材料：
分子克隆等实验所用常规试剂如：限制性内切酶、连接酶、丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺等为Promega公司产品；聚合酶链式反应(PCR)试剂盒、大肠杆菌培养基(型号为LB)、昆虫细胞培养基（型号为TC-100）、胎牛血清、昆虫细胞转染实验所用的阳离子脂质体(型号：Cellfectin?IIReagent)等化学试剂购自GIBCOBRL公司；人源MPO的cDNA购自PROTEINTECHGROUP公司(GenBank:BC130476.1)；杆状病毒供体质粒（型号：pFastBacHTb）购自GIBCOBRL公司；大肠杆菌(E.ColiDH5α)购自Takara公司；大肠杆菌(E.ColiBmDH10Bac)以及家蚕细胞BmN和家蚕品种“306”均已经公开发表，详见已发表文献(Zhou,Y.,etal,PLoSOne,2011,6(7):e22224,doi:10.1371/journal.pone.0022224)
带His-(组氨酸)标签蛋白纯化试剂盒购自Pierce公司；离子交换层析柱FPLCMonoS5/50GL购自GEHealthcare公司；抗His-标签的鼠单克隆抗体、抗人MPO兔多克隆抗体购自CellSignalingTechnology公司；比色法MPO活性检测试剂盒购自SIGMA-ALDRICH公司(CatalogNumber:MAK068)。
说明：以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》（Sambrook等编著，科学出版社，1992年版）、试剂盒说明书、及产品说明书进行。
实施例1：重组供体质粒的构建
化学合成用于PCR扩增人MPO的引物，在引物序列N-端引入XhoI酶切位点，在C-端引入HindIII酶切位点，均用双下划线表示，C-端引入编码6个组氨酸的碱基以单下划线表示，引物序列设计如下：
MPO前引物：5’-AGGAGACTCGAGATGGGGGTTCCCTTCTTCTCT-3’；(SEQIDNO.1)
MPO反向引物：5’-TACAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGGGAGGCTTCCCTCCAGGA-3’；(SEQIDNO.2)
应用以上引物，以人MPO的cDNA为模板进行PCR反应，扩增出的MPO片段进行1%琼脂糖凝胶电泳(图1A)；切割下含目的片段的凝胶，用QIAGENGelExtraction试剂盒回收扩增出的DNA片段，用XhoI和HindIII对扩增出的DNA片段进行双酶切，同时，对供体质粒pFastBacHTb也进行XhoI和HindIII的双酶切反应(图1B)；酶切反应产物分别用试剂盒再纯化一次，以1%琼脂糖凝胶电泳进行试剂盒回收效率的鉴定(图1C)；将酶切后纯化的PCR产物和供体质粒用连接试剂盒进行连接反应，140C下过夜；将连接产物于大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化反应，反应混合物涂于含100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基平板上，370C倒置培养过夜；挑选LB平板上的单个菌落，经LB液体培养基培养，抽提质粒DNA；经对质粒DNA用XhoI和HindIII进行双酶切鉴定，筛选出已插入正确基因片段的重组供体质粒(图1D)；经DNA序列检测，结果正确。至此，成功地获得了分别含人MPO正确序列的重组供体质粒。
实施例2：重组家蚕杆状病毒的制备
将实施例1中所构建的重组供体质粒转染含家蚕杆状病毒基因组杆粒（Bacmid）的大肠杆菌感受态细胞BmDH10Bac，在助手(Helper)作用下在转座子(Tn7)上发生转座，通过蓝、白斑筛选进行重组穿梭载体的鉴定。分别提取所挑选白斑的重组BacmidDNA，以蓝斑BacmidDNA作为对照，以人MPO中间引物(5’-C1669TGAATCGTCAGAACCAAATTG1690-3’)(SEQIDNO.3)
作为正向引物，以特异性反向引物(pUC/M13:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')(SEQIDNO.4)
进行PCR反应验证，其结果如图2所示，与对照组的蓝斑比较(未发生Tn7转座子转座的在～300bp出现条带)，所挑选的2个白斑均在预期的位置(~1173bp)出现条带，表明所挑选的2个白斑均在Tn7上发生了转座，人MPO基因片段已成功地通过同源重组整合到家蚕BacmidDNA上。用阳离子脂质体CELLFECTINReagent介导重组的BacmidDNA转染家蚕BmN细胞，经两轮病毒的扩增，获得含人MPO的重组家蚕杆状病毒。
实施例3：含人MPO重组病毒在五龄家蚕中的表达时相
将实施例2所制备的含人MPO的重组家蚕杆状病毒接种五龄起蚕后第二天的家蚕(306品种)，每条蚕通过皮下注射接种1.0×105个空斑形成单位(PFU)，即：每条蚕接种5微升病毒母液(2×107PFU/毫升)。在接种病毒前经口喂食一定量的血红素前体，以后每天经口喂食一次血红素前体。从接种病毒开始，每隔24小时收集一次蚕血淋巴，以未接种病毒的家蚕血淋巴作为阴性对照(0时)，测定MPO酶活性(每5头蚕血淋巴的混合样)，结果如图3所示，病毒接种后48小时开始检测到MPO的活性，至72小时MPO活性明显升高，到96和120小时时达最高值。
实施例4：在五龄家蚕中大量表达的人重组MPO的分离纯化
根据实施例3人重组MPO在五龄家蚕中的表达时相，其酶活性在接种病毒后第4和第5天时达最高值。因此，按照实施例3接种病毒的条件，接种大约300头蚕，收集4－5天发病后的蚕血淋巴，用His-(组氨酸)标签蛋白纯化专用裂解缓冲液稀释，经超声波裂解、高速离心后取上清，经过镍-亲和层析柱和离子交换层析柱MonoS分离纯化，共获得大约0.5毫克左右高纯度的目的产物，其分子量大约为90kDa，与人早幼粒白血病细胞HL-60所释放的89kDa的MPO相近(Hur,S.-J.,etal,1989,J.Biol.Chem.,264:8542-8548)。
经MonoS离子交换层析柱纯化后的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析结果如图4所示，蛋白纯度在95%以上，平均每条蚕可获得约1.7微克纯化后的人MPO蛋白。
实施例5：经分离纯化后目的蛋白的蛋白质印迹杂交(WesternBlot)鉴定
以实施例4经MonoS柱后的第21号馏分经过10%的SDS-PAGE凝胶电泳，转硝酸纤维素膜，分别以抗组氨酸His-标签的鼠单克隆抗体和抗人源MPO兔多克隆抗体作为一抗进行免疫反应，以标记了碱性磷酸酶的抗鼠源和抗兔源的免疫球蛋白IgG(ImmunoglobulinG)作为二抗，以碱性磷酸酶试剂盒进行显色反应，结果表明，所制备的分子量大约为90kDa的目的蛋白不但被抗His-标签的抗体所识别(图5A)，同时也能够被商品化抗人MPO的抗体识别(图5B)，初步验证了所表达的目的蛋白为人MPO。
实施例6：经分离纯化后目的蛋白的质谱鉴定
将实施例4中经MonoS离子交换层析柱纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳上相对应的大约90kDa位置的目的条带用医用手术刀割下(图4中第21号馏分)，进行质谱分析，质谱分析条件：仪器型号：5800MALDI-TOF/TOF(ABSCIEX公司)；检测方式：正离子，反射模式。分析结果：蛋白质得分(ProteinScore)：1140；总离子(TotalIon)：835；有41条肽段相匹配，如图6所示，其氨基酸的覆盖率为61.48%，这进一步验证了所制备的目的蛋白为人MPO。
实施例7：分离纯化后的人MPO酶活性分析
根据比色法MPO活性检测试剂盒使用说明书，首先绘制发色载色体(TNB)标准曲线如图7A所示；同时，测定各样品经反应60分钟后在412nm处的吸光度(样品A412)，以不加MPO基质的反应作为空白对照(空白对照A412)，计算出两者差值?A412=(空白对照A412)－(样品A412)，对照标准曲线，根据?A412确定反应所消耗TNB的量B(纳摩尔)，由公式:(B╳样品稀释倍数)/(反应时间╳样品量)，计算出MPO的比活性。一个单位(Unit)MPO的活性定义为：在250C下每分钟水解基质产生的氨基乙磺酸氯胺所消耗1个微摩尔(μmole)TNB所需要MPO的量。如图7B所示，在250C下反应60分钟，经计算，我们所制备的重组人MPO(实施例四经MonoS柱纯化后第21号馏分)的比活性为396.7±41.7毫单位/毫克，与阳性对照(来源于人嗜中性粒细胞表达的MPO,SIGMA-ALDRICH公司产品，CatalogNumber:MAK068F)的比活性(366.7毫单位/毫克)相近。
本发明利用家蚕-杆状病毒表达系统在五龄家蚕中制备的人重组MPO具与来源于人嗜中性粒细胞表达的MPO相当的比活性；且表达量高：平均每条蚕可制备高达1.7微克左右目的蛋白；成本低：由于避免了AcMNPV-昆虫细胞表达系统中昆虫细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清，且家蚕饲养简单方便，使得利用家蚕作为生物反应器制备人MPO的成本低。
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<110>江苏大学、中山瑞福医疗器械科技有限公司
<120>一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>3
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
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<120>一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>4
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
1AGCGGATAACAATTTCACACAGG13

Claims (2)

1.一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
将完整的人髓过氧化物酶MPO的cDNA(在C-端设计带有6个组氨酸)克隆到自身含6个组氨酸的供体质粒(pFastBacHTb)上，获得含人MPO基因的重组供体质粒；在大肠杆菌(菌株为BmDH10Bac)中和家蚕杆状病毒基因组杆粒(Bacmid)于转座子(Tn7)上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有目的基因的克隆，随后在家蚕细胞中(细胞株为BmN)制备含人MPO基因的重组病毒；以制备的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，同时给家蚕添加一定量的血红素前体；收集含表达了人MPO的家蚕幼虫的体液，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，40C下进行高速离心，收集的上清应用镍-柱亲和层析结合离子交换层析的方法进行分离纯化，最终获得目的产物人髓过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法，其特征在于：所述的人MPO的cDNA来源于已公开的DNA序列(GenBank:BC130476.1)；所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒(BmNPV)；所述的宿主昆虫为家蚕(Bombyxmori)，品种为“306”；所述的宿主昆虫感染时间是五龄期幼虫；所述的感染方法是经昆虫皮下注射接种感染；所述的血红素前体的添加是经口喂食；所述的杆状病毒供体质粒是是商品化的质粒。
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