CN112795578A

CN112795578A - 稻瘟菌MoPTEN基因及其应用

Info

Publication number: CN112795578A
Application number: CN202110176760.8A
Authority: CN
Inventors: 张世宏; 王少伟; 魏毅; 张鹏辉; 梁昊; 李桂华
Original assignee: Jilin University; Shenyang Agricultural University
Current assignee: Jilin University; Shenyang Agricultural University
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2021-02-07
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2041-02-07
Also published as: CN112795578B

Abstract

本发明公开了稻瘟菌MoPTEN基因及其应用，属于基因工程领域。本发明提供了来自稻瘟菌的控制分生孢子生成、应对逆境胁迫和参与致病性的基因MoPTEN，该基因由2114个核苷酸所组成的DNA序列如SEQ ID No.1所示；MoPTEN基因所编码的蛋白质由658个氨基酸构成，其序列如SEQ ID No.2所示。MoPTEN基因的敲除能够导致突变体的产孢能力下降，对多种逆境条件的敏感性增强，致病能力减弱且在水稻细胞内形成侵染菌丝的能力下降。本发明验证了稻瘟菌MoPTEN基因的功能，为进一步利用该基因调控稻瘟菌生理功能及防治稻瘟病提供了新的方向。

Description

稻瘟菌MoPTEN基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及稻瘟菌MoPTEN基因及其应用。

背景技术

由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)所引起的稻瘟病是一种世界性的影响水稻产量的重要病害，严重威胁着水稻生产和全球粮食安全。稻瘟菌在水稻的整个生育期及其各组织部位皆可进行侵染，根据其发病时期部位的不同又可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等不同的类型。稻瘟菌对水稻的侵染过程主要包括：(1)分生孢子随风雨传播，并粘附在水稻叶片表面；(2)分生孢子萌发，形成芽管；(3)芽管分化形成附着胞；(4)附着胞分化形成侵染钉；(5)侵染钉穿透寄主细胞，并在寄主细胞内形成侵染菌丝，在细胞间进行扩展。而随着病原分子生物学的发展，大量的研究表明，许多的致病相关基因与植物病原菌的病理过程有着密切的关系。因此通过对致病基因的研究对致病菌的防治具有重要的价值和意义。现有技术中尚未有稻瘟菌MoPTEN基因对稻瘟菌致病能力影响的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供稻瘟菌MoPTEN基因，以解决上述现有技术存在的问题，提供一种与稻瘟菌致病能力密切相关的稻瘟菌基因，为进一步研究防治稻瘟病的药物奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种稻瘟菌MoPTEN基因，所述稻瘟菌MoPTEN基因核苷酸序列为以下序列之一：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1所示的序列同一性在90％以上且编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供所述的稻瘟菌MoPTEN基因所编码的蛋白质。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体中包含所述的稻瘟菌MoPTEN基因。

本发明还提供所述的表达载体的构建方法，包括以野生型稻瘟菌cDNA为模板，用引物MBD-F和MBD-R扩增出MoPTEN的开放阅读框，之后将酶切处理的开放阅读框片段连于骨架载体pET28a上，构建出原核表达载体。

本发明还提供一种敲除所述的稻瘟菌MoPTEN基因的敲除载体。

本发明还提供一种所述的敲除载体的构建方法，包括以野生型稻瘟菌基因组DNA为模板，用引物MGG-qc-LF和MGG-qc-LR扩增出的片段作为左臂，用引物MGG-qc-RF和MGG-qc-RR扩增出的片段作为右臂，将左右臂片段进行酶切后分别连接于敲除载体pXEH 2.0潮霉素磷酸转移酶基因的两侧，构建出敲除载体。

本发明还提供所述的稻瘟菌MoPTEN基因或所述的蛋白质或所述的表达载体或所述的敲除载体在调控稻瘟菌致病力中的应用。

本发明还提供所述的稻瘟菌MoPTEN基因或所述的蛋白质或所述的表达载体或所述的敲除载体在调控稻瘟菌氧化应激能力中的应用。

本发明还提供所述的稻瘟菌MoPTEN基因或所述的蛋白质或所述的表达载体或所述的敲除载体在降低稻瘟菌分生孢子产量中的应用。

本发明还提供所述的稻瘟菌MoPTEN基因或所述的蛋白质作为用于稻瘟病防治的药物的靶标的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过构建稻瘟菌MoPTEN基因的敲除载体，对野生型稻瘟菌的MoPTEN基因进行了敲除，并对其生理功能进行验证，证明了MoPTEN基因的敲除或缺失会导致稻瘟菌分生孢子形成的减少、对某些逆境环境的敏感性增强以及致病能力下降，从而说明MoPTEN基因是稻瘟菌生理和致病过程中的一个重要基因。本发明验证了稻瘟菌MoPTEN基因的功能，证明了敲除或抑制该基因能够影响稻瘟菌的生理功能和致病能力，为进一步利用该基因调控稻瘟菌生理功能及防治稻瘟病奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为MoPTEN的基因结构示意图；

图2为稻瘟菌MoPTEN基因敲除过程示意图；

图3为稻瘟菌MoPTEN基因敲除过程中转化子PCR验证结果图；其中A为目的基因验证结果，B为潮霉素磷酸转移酶基因验证结果，C为左臂和潮霉素磷酸转移酶融合基因验证结果。M代表DNAMarker，1-14代表所验证的转化子；

图4为野生型菌株JL0910与突变体ΔMoPTEN在PDA和CM培养基上营养生长情况比较图；

图5为野生型菌株JL0910与突变体ΔMoPTEN产分生孢子比较图；其中A为产孢情况统计分析，三颗星号(***)代表P<0.001，比较结果之间存在极显著差异；B为显微镜下直接观察产孢情况，Bar＝50μm；

图6为野生型菌株JL0910与突变体ΔMoPTEN对不同浓度的SDS和刚果红敏感性的比较图；

图7为野生型菌株JL0910与突变体ΔMoPTEN对不同浓度的H₂O₂敏感性对比图；

图8为野生型菌株JL0910与突变体ΔMoPTEN对水稻的致病情况比较图；其中A为用分生孢子悬液喷接水稻叶片7d后的致病情况；B为水稻叶鞘接种后48h致病情况的显微观察，其中IH为侵染性菌丝，AP为附着胞，CO为分生孢子，GT为芽管，Bar＝20μm；

图9为MoPTEN蛋白表达、纯化后SDS-PAGE电泳图，其中M代表蛋白质Marker，1代表MoPTEN表达纯化后的蛋白。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

本发明所使用的材料与试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。

实施例中所使用的部分试剂及培养基配方如下：

LB液体培养基：称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入蒸馏水用磁力搅拌器混匀后定容至1L，调整pH值到7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

PDA培养基：土豆去皮洗净后称重200g，切成小块后在沸水中煮20min左右，用纱布过滤后于滤液中加入20g葡萄糖，用自来水定容至1L，加入1.5％-1.8％的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。

CM培养基：称取酸水解干酪素0.5g，酶水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，酵母提取物1g，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，NaCl 0.15g，加入蒸馏水用磁力搅拌器混匀后定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

燕麦培养基：称取50g燕麦片，用沸水煮20min左右，过滤后用蒸馏水定容至1L。固体燕麦培养基中加入1.8％的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。

IM液体诱导培养基：在8.695mL无菌水中依次加入MES溶液0.8mL，M-N buffer0.4mL，Tracelement buffer 200μL，50％甘油200μL，20％葡萄糖200μL，0.01％FeSO₄·7H₂O溶液200μL，20％NH₄NO₃溶液50μL，1％CaCl₂·2H₂O溶液20μL，K-buffer溶液16μL，100mM乙酰丁香酮(AS)溶液20μL，混匀后备用。

MES溶液：称取19.524g MES用适量蒸馏水溶解后定容至100mL，调整pH值为5.5，过滤灭菌。

M-N buffer：称取3.0g MgSO₄·7H₂O，1.5g NaCl，用适量蒸馏水溶解后定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。

Tracelement buffer：称取10mg ZnSO₄·7H₂O，10mg CuSO₄·5H₂O，10mg H₃BO₄，10mg MnSO₄·H₂O，10mg Na₂MoO₄·2H₂O，用适量蒸馏水溶解后定容至200mL后过滤灭菌。

50％甘油：用量筒量取20mL丙三醇(甘油)，加入20mL蒸馏水，混匀后121℃高压蒸汽灭菌20min。

20％葡萄糖溶液：称取20g葡萄糖，用适量蒸馏水溶解后定容至100mL，之后过滤灭菌。

0.01％FeSO₄：称取0.01g FeSO₄用适量蒸馏水溶解后定容至100mL后过滤灭菌。

20％NH₄NO₃溶液：称取20g NH₄NO₃，用适量蒸馏水溶解后定容至100mL，之后121℃高压蒸汽灭菌20min。

1％CaCl₂·2H₂O溶液配方：称取1g CaCl₂·2H₂O，用适量蒸馏水溶解后定容至100mL，之后121℃高压蒸汽灭菌20min。

K-buffer配方：称取7.25g KH₂PO₄，10g K₂HPO₄，用适量蒸馏水溶解后定容至50mL，之后121℃高压蒸汽灭菌20min。

100mM乙酰丁香酮(AS)溶液，称取0.192g固体AS，用二甲基亚砜(DMSO)溶解后过滤灭菌。

本发明所使用的野生型菌株JL0910在吉林大学植物科学学院购买，并且已在非专利文献“线粒体ATP-Lon蛋白酶(MAP1)参与稻瘟病致病和自身防护的分子依据，李健”中公开。

实施例1

MoPTEN基因的相关内容分析

MoPTEN基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。MoPTEN基因位于稻瘟菌的Ⅱ号染色体上，全长2114bp，具有一个内含子，两个外显子(见图1)。

实施例2

对MoPTEN基因的敲除分析

(1)敲除载体的构建

对该基因的敲除采用同源染色体重组的方法，利用构建的载体将潮霉素磷酸转移酶基因片段替换野生型菌株JL0910中的MoPTEN基因的编码序列，具体敲除策略见图2。以野生型菌株JL0910基因组DNA为模板，用引物MGG-qc-LF(SEQ ID NO.3，5’-CGGAATTCTAGGCCACGGAATGAAGGAG-3’，5’端带有EcoRⅠ酶切位点)和MGG-qc-LR(SEQ IDNO.4，5’-GGGGTACCCGGCAACCCAAAAAAAGAAG-3’，5’端带有KpnⅠ酶切位点)扩增出的片段作为左臂，用引物MGG-qc-RF(SEQ ID NO.5，5’-GCTCTAGATTTCTCCAGGCTCCTTTTCC-3’，5’端带有XbaⅠ酶切位点)和MGG-qc-RR(SEQ ID NO.6，5’-GCGTCGACTGGCTGCTTTGGTCTGTTCT-3’，5’端带有SalⅠ酶切位点)扩增出的片段作为右臂。将左右臂片段进行酶切后分别连接于敲除载体pXEH 2.0潮霉素磷酸转移酶基因的两侧，从而构建得到重组质粒pMoPTEN用于基因敲除。

(2)稻瘟菌的转化与敲除突变体的获得

a.稻瘟菌的遗传转化

1.转化采用土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens AGL-1)介导法。

首先将构建好的敲除载体通过热激转化导入农杆菌感受态中，具体步骤如下：

①从-80℃超低温冰箱中取出AGL-1感受态细胞，冰上放置5min使其自然解冻。

②待感受态细胞完全解冻后向其中加入10μL的构建好的敲除载体质粒，轻轻混匀后冰上静置30min，然后置于液氮中处理5min。

③37℃金属浴中保温处理5min。

④在无菌条件下，加入无抗性的LB液体培养基700μL，之后放置于28℃摇床中180rpm震荡培养2h。

⑤培养结束后在4℃离心机中5000rpm离心5min。保留200μL左右上清液，于超净台内将菌体重悬浮，并用无菌涂布器将全部液体均匀涂布在含有50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基上，28℃倒置培养2d，待单菌落长出。

⑥挑取单菌落置于含有50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的LB液体配培养基中，28℃震荡培养1-2d，之后将培养的菌液通过PCR进行鉴定，以确保所构建敲除载体转入其中。其中左臂验证引物为MGG-qc-LF(SEQ ID NO.3，5’-CGGAATTCTAGGCCACGGAATGAAGGAG-3’)和MGG-qc-LR(SEQ ID NO.4，5’-GGGGTACCCGGCAACCCAAAAAAAGAAG-3’)，可扩增出982bp片段；右臂验证引物为MGG-qc-RF(SEQ ID NO.5，5’-GCTCTAGATTTCTCCAGGCTCCTTTTCC-3’)和MGG-qc-RR(SEQ ID NO.6，5’-GCGTCGACTGGCTGCTTTGGTCTGTTCT-3’)，可扩增出1068bp片段；潮霉素基因验证引物为HYG-YZ-F(SEQ ID NO.7，5’-GCCCTTCCTCCCTTTATTTC-3’)和HYG-YZ-R(SEQ ID NO.8，5’-ACTCTATTCCTTTGCCCTCG-3’)，可扩增出1088bp片段。经鉴定的菌落为阳性克隆后，可用于下一步实验。

2.土壤农杆菌AGL-1的活化与诱导培养

①将带有所构建敲除载体的土壤农杆菌AGL-1在含有50μg/mL的利福平和50μg/mL卡那霉素的LB平板上划线，28℃倒置培养2d。

②挑取划线长出的单菌落接种于5mL含有50μg/mL的利福平和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃摇床中180rpm震荡培养2d。

③取800μL震荡培养的AGL-1菌液接种于10mL IM液体培养基的三角瓶中，使菌体悬匀后于28℃摇床中180rpm，黑暗诱导5h。

3.稻瘟菌分生孢子与诱导的土壤农杆菌AGL-1的共培养

①用液体IM培养基将燕麦培养基上的稻瘟菌分生孢子洗下，之后用已灭菌的三层擦镜纸对孢子进行过滤收集，镜检并调整其浓度为5×10⁴个/mL。

②将稻瘟菌分生孢子悬液与用IM液体培养基培养后的AGL-1按照1:1的比例进行混合并用移液器吸打悬匀。

③在IM固体培养基表面贴上一层无菌的孔径为0.45μm的玻璃纸，之后吸取上述混合液100μL加于玻璃纸上，用无菌涂布器进行涂布。

④将涂布好的平板置于28℃培养箱中，倒置培养48h。

4.稻瘟菌转化子的筛选与纯化

①将稻瘟菌分生孢子与AGL-1共培养平板上的玻璃纸用镊子揭下，并将该玻璃纸反向贴于用于筛选的PDA固体培养基表面，PDA中含有潮霉素200μg/mL，头孢霉素200μg/mL，羧苄青霉素200μg/mL。将PDA平板倒置于28℃培养箱中培养2d。

②2d后将玻璃纸从PDA培养基上取下，于同样条件继续培养2d。

③将扩展菌丝挑至新的PDA培养基上，含有200μg/mL潮霉素，连续筛选2-3代，然后于燕麦培养基上进行单孢纯化，并通过滤纸片进行保存。

b.敲除突变体的检测

①将通过潮霉素筛选得到的转化子接于铺有玻璃纸的PDA平板上，培养3-4d后收集菌丝，之后通过CTAB法提取稻瘟菌基因组DNA。

②以提取的基因组DNA为模板，用设计好的引物分别进行3次扩增，对转化子进行验证。

1)以引物MoPTEN-F(SEQ ID NO.9，5’-TGGGGTGTCGGAGGTGGTAC-3’)和MoPTEN-R(SEQ ID NO.10，5’-GGCTTTGCTTGCTCTGGTTT-3’)扩增验证，扩增序列位于目的基因内部；

2)以引物HYG-YZ-F(SEQ ID NO.7，5’-GCCCTTCCTCCCTTTATTTC-3’)和HYG-YZ-R(SEQ ID NO.8，5’-ACTCTATTCCTTTGCCCTCG-3’)扩增验证，扩增序列位于潮霉素磷酸转移酶基因内部；

3)以引物M-L-F(SEQ ID NO.11，5’-AAATCGGGACAACAGCAAC-3’)和M-L-R(SEQ IDNO.12，5’-CAAACGCACCAAGTTATCG-3’)扩增验证，引物M-L-F位于MoPTEN基因左臂上游约170bp处，引物M-L-R位于潮霉素基因内，扩增序列为左臂和潮霉素磷酸转移酶基因融合后的一部分。经过3次PCR验证(图3)，筛选出所需要的敲除突变体，将其命名为ΔMoPTEN。

实施例3

营养生长情况分析

采用固体PDA和CM平板培养法观察。将保存有野生型和突变体菌株的滤纸片接于PDA培养基上进行活化，待生长4d后用打孔器在菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，之后将菌饼重新接于固体CM和PDA培养基的平板中，于28℃培养箱中连续培养7d，之后观察菌体生长情况。结果显示，突变体与野生型菌株相比在生长上没有太大的差异(见图4)。

实施例4

分生孢子产量分析

采用血球计数板统计法和显微镜观察法比较野生型和突变体的产孢情况。分别将野生型稻瘟菌JL0910和突变体ΔMoPTEN已活化的菌株打菌饼接种在燕麦培养基上，待菌丝长满平板后，用无菌水洗下平板表面气生菌丝，盖上无菌双层纱布，于28℃持续培养3-5d。之后用10mL蒸馏水洗脱其分生孢子，取孢子悬液用血球计数板显微计数。该实验独立重复3次，每次野生型菌株与突变体各3个重复样品。结果显示，与野生型菌株相比，突变体产生的分生孢子量有明显下降(见图5A)。

此外，将野生型和突变体产孢3d后的燕麦培养基取20mm×5mm的菌块于显微镜下直接观察分生孢子的产生情况。该实验独立重复3次，每次野生型菌株与突变体各3个重复样品。结果显示，与野生型相比，突变体产生的分生孢子量比野生型的明显减少(见图5B)。

实施例5

MoPTEN基因在稻瘟菌应对不同逆境胁迫中的作用

1.MoPTEN基因在稻瘟菌细胞壁完整性作用中的研究

将已活化的野生型菌株与突变体取5mm菌饼接种于含有100μg/mL、200μg/mL刚果红(CR)和0.005％、0.01％(w/v)SDS的CM平板上，同时以不含刚果红和SDS的CM平板做对照，28℃黑暗培养7d，观察并记录菌落生长情况。结果显示，突变体对于刚果红和SDS的敏感性要高于野生型(见图6)，证明MoPTEN基因参与了稻瘟菌维持细胞壁完整性的过程。

2.MoPTEN基因在应对氧化胁迫中的作用研究

将已活化的野生型菌株与突变体取5mm菌饼接种于含有0mM、2.5mM和5mM H₂O₂的CM平板上，28℃黑暗条件下连续培养7d，观察并记录菌落生长情况。结果显示，与野生型相比，突变体在同等条件下形成的菌落较小，对H₂O₂的敏感性增强(见图7)，证明MoPTEN基因在稻瘟菌承受氧化胁迫方面起着一定的作用。

实施例6

MoPTEN基因在稻瘟菌致病过程中的作用

1.孢子悬液喷接水稻叶片

将5mL野生型菌株JL0910和5mL突变体ΔMoPTEN的分生孢子悬液(浓度为1×10⁵个/mL)分别喷接于生长15d的JJ88水稻叶片上。25℃保湿黑暗培养24h，之后12h光照12h黑暗条件持续培养6d，观察并记录发病情况。结果显示，7d后野生型菌株可在水稻叶片表面产生典型的致病病斑，而突变体不能对水稻叶片造成典型的致病情况，致病力与野生型相比明显下降(见图8A)。

2.侵染性菌丝扩展情况分析

采用水稻叶鞘细胞接菌观察法。将300μL野生型菌株JL0910和300μL突变体ΔMoPTEN的分生孢子悬液(浓度为5×10⁴个/mL)用注射器分别注入生长4周的JJ88水稻叶鞘中。于25℃保湿黑暗培养24h，之后12h光照12h黑暗条件培养1d，将叶鞘切片后显微观察发病情况。结果显示，野生型菌株的侵染菌丝可以在水稻叶鞘细胞内正常扩展，而与之相比多数突变体不能形成侵染菌丝(见图8B，AP代表附着胞，IH代表侵染菌丝，CO代表分生孢子，GT代表芽管)。

实施例7

MoPTEN蛋白的表达与纯化

以野生型稻瘟菌JL0910的cDNA为模板，用引物MBD-F(SEQ ID NO.13，5’-CGGAATTCATGGCATCACTCCTGCGC-3’，5’端带有EcoRⅠ酶切位点)和MBD-R(SEQ ID NO.14，5’-CCAAGCTTTCAATCAACAATAAACCC-3’，5’端带有HindⅢ酶切位点)扩增出MoPTEN的开放阅读框，之后将双酶切处理的片段连于骨架载体pET28a上，构建出原核表达载体。对该蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE分析(见图9)，显示表达载体构建成功。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 吉林大学

沈阳农业大学

<120> 稻瘟菌MoPTEN基因及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcatcac tcctgcgcca gatcgtcgcg ggaccaagag ccagacatga agaaacaggc 60

ctcgatctgt gctacgtgac gtccaacatc atagcaacgt aaggcgcccc ccgcgctaga 120

tttgaaagct cttgaacttg tgttttttcc ttctcgcaac aaacttgatg ggctatgcag 180

agtctaagaa aaccgcatgc taacccatag gctctctgtt tatcgggaaa tacagctccg 240

gcccctcaca gacgtacccc caacgagcat accgcaaccc gctcgaccga ctcgtcgcgt 300

tcctcgacaa gcagcatggc gacaattggg ccatctggga gttccgcggc gagggaaccg 360

ggtacccaga cgaggccgtg tacggccgca tccggcacta cccgtggccc gaccaccacc 420

cgccgccctt tcgcctcgtg cccatgatca tggcgtcgat gcgctcctgg ctggccggcg 480

aggacctgca tggcaccggg gtagcggctg gtaaaaacga taaggctgtt gccaagaacg 540

ggaacgacgg gccggttgat gccgatgccg acgctgggaa cggcagggtg gcggtcgtgc 600

actgcaaggc cggcaagggc aggtccggat ccatggcctg cagcttcctc atctcggagc 660

gcgggtggac gcccgaggcg gcgctcgcgc gtttcacgga gcggcggatg aggcccaagt 720

tcggcgccgg cgtgtccatc ccctcgcagc tccgctggat cagctacgtc gaccggtgga 780

ccaagacggg gaagaagtac gtcgaccgcc ggttcgagat tgtggaaatc cacgcctggg 840

gtctgaggtc cggggtcaag atgtcggtcg agatcttcgc cgaagaaggg cgcaggatcg 900

aggtgctgca taccttcacc agggatgaga gggtcattgt cgagggggag actcccaggt 960

cgggtggggt gtcggaggtg gtaccggatc tgacaaagat ggcagcggca gaggctattt 1020

ctaccactgg cgacaagacg gactatgaag aagttgtggg ggattcttca gtgcccaaga 1080

tcaagaatgc cgctaccgat tctgacattg tcgatggtgc gaagagcaaa tcgaaaagcc 1140

caaaggattc tttgatgcga aggctatcga aacggcctga taaaagcccg gcacggtcag 1200

agacggccac gacgattggg gcagagaacg gagcatcgtc ttcggccgca tccctgccag 1260

ccgaagtctc gggaggttcc aagctagcac ctgccgcgaa gccgccatcg tcgctgacgg 1320

cgagcaacac gccgtctcag ctgtcgctca accaggggtc tacatcatcc cccgctgaga 1380

aggagcccgg cggcatggcg gtcatcttca agccgcgcga gccgatcgtg gtgtccaacg 1440

gcgacgtaaa catctcgctc gagcgacgta accgggcccc ggcgtcaatg ggcctgacca 1500

tggtgacggc ggtcgcacac gtctggttca acgtgttctt tgagggcaac gggcccgagc 1560

aggatggaaa gtcggacgac agcggcgtgt tcgagattga gtgggacaag atggacggca 1620

tcaagggcag cagcagaaag ggggtccgcg ggctggacag gatcgccgtg gtgtggcggt 1680

gcgtggacga cgcggccgag aaggcgcagg gcaagggcgt ggagattgtc gagccggggg 1740

tgggcgagga ggtgccgcag atgcctgccg ccgactggaa gggccacaac atggaagatc 1800

ccagcgcctc gaagaacctg ggcctgaggg cgacggaccc ggacagcgag aacgtcagca 1860

aggccagcag catcaagagc atgacggtag ggggcgagga caaggacgac aaggaggact 1920

cggacctgtt cagcggcgtc aaggcgagcg ggccgggagg ggaggatctc gacaaggaca 1980

aggtggccgc ggcggacgat gcggccaaga cggaggcgga gaagaacgac gtgaccggga 2040

ggaaaccaga gcaagcaaag ccggacgacg gactggctga cgcgacggcc cagaaggggt 2100

ttattgttga ttga 2114

<210> 2

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Leu Arg Gln Ile Val Ala Gly Pro Arg Ala Arg His

1 5 10 15

Glu Glu Thr Gly Leu Asp Leu Cys Tyr Val Thr Ser Asn Ile Ile Ala

20 25 30

Thr Ser Gly Pro Ser Gln Thr Tyr Pro Gln Arg Ala Tyr Arg Asn Pro

35 40 45

Leu Asp Arg Leu Val Ala Phe Leu Asp Lys Gln His Gly Asp Asn Trp

50 55 60

Ala Ile Trp Glu Phe Arg Gly Glu Gly Thr Gly Tyr Pro Asp Glu Ala

65 70 75 80

Val Tyr Gly Arg Ile Arg His Tyr Pro Trp Pro Asp His His Pro Pro

85 90 95

Pro Phe Arg Leu Val Pro Met Ile Met Ala Ser Met Arg Ser Trp Leu

100 105 110

Ala Gly Glu Asp Leu His Gly Thr Gly Val Ala Ala Gly Lys Asn Asp

115 120 125

Lys Ala Val Ala Lys Asn Gly Asn Asp Gly Pro Val Asp Ala Asp Ala

130 135 140

Asp Ala Gly Asn Gly Arg Val Ala Val Val His Cys Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Gly Arg Ser Gly Ser Met Ala Cys Ser Phe Leu Ile Ser Glu Arg Gly

165 170 175

Trp Thr Pro Glu Ala Ala Leu Ala Arg Phe Thr Glu Arg Arg Met Arg

180 185 190

Pro Lys Phe Gly Ala Gly Val Ser Ile Pro Ser Gln Leu Arg Trp Ile

195 200 205

Ser Tyr Val Asp Arg Trp Thr Lys Thr Gly Lys Lys Tyr Val Asp Arg

210 215 220

Arg Phe Glu Ile Val Glu Ile His Ala Trp Gly Leu Arg Ser Gly Val

225 230 235 240

Lys Met Ser Val Glu Ile Phe Ala Glu Glu Gly Arg Arg Ile Glu Val

245 250 255

Leu His Thr Phe Thr Arg Asp Glu Arg Val Ile Val Glu Gly Glu Thr

260 265 270

Pro Arg Ser Gly Gly Val Ser Glu Val Val Pro Asp Leu Thr Lys Met

275 280 285

Ala Ala Ala Glu Ala Ile Ser Thr Thr Gly Asp Lys Thr Asp Tyr Glu

290 295 300

Glu Val Val Gly Asp Ser Ser Val Pro Lys Ile Lys Asn Ala Ala Thr

305 310 315 320

Asp Ser Asp Ile Val Asp Gly Ala Lys Ser Lys Ser Lys Ser Pro Lys

325 330 335

Asp Ser Leu Met Arg Arg Leu Ser Lys Arg Pro Asp Lys Ser Pro Ala

340 345 350

Arg Ser Glu Thr Ala Thr Thr Ile Gly Ala Glu Asn Gly Ala Ser Ser

355 360 365

Ser Ala Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Ser Gly Gly Ser Lys Leu Ala

370 375 380

Pro Ala Ala Lys Pro Pro Ser Ser Leu Thr Ala Ser Asn Thr Pro Ser

385 390 395 400

Gln Leu Ser Leu Asn Gln Gly Ser Thr Ser Ser Pro Ala Glu Lys Glu

405 410 415

Pro Gly Gly Met Ala Val Ile Phe Lys Pro Arg Glu Pro Ile Val Val

420 425 430

Ser Asn Gly Asp Val Asn Ile Ser Leu Glu Arg Arg Asn Arg Ala Pro

435 440 445

Ala Ser Met Gly Leu Thr Met Val Thr Ala Val Ala His Val Trp Phe

450 455 460

Asn Val Phe Phe Glu Gly Asn Gly Pro Glu Gln Asp Gly Lys Ser Asp

465 470 475 480

Asp Ser Gly Val Phe Glu Ile Glu Trp Asp Lys Met Asp Gly Ile Lys

485 490 495

Gly Ser Ser Arg Lys Gly Val Arg Gly Leu Asp Arg Ile Ala Val Val

500 505 510

Trp Arg Cys Val Asp Asp Ala Ala Glu Lys Ala Gln Gly Lys Gly Val

515 520 525

Glu Ile Val Glu Pro Gly Val Gly Glu Glu Val Pro Gln Met Pro Ala

530 535 540

Ala Asp Trp Lys Gly His Asn Met Glu Asp Pro Ser Ala Ser Lys Asn

545 550 555 560

Leu Gly Leu Arg Ala Thr Asp Pro Asp Ser Glu Asn Val Ser Lys Ala

565 570 575

Ser Ser Ile Lys Ser Met Thr Val Gly Gly Glu Asp Lys Asp Asp Lys

580 585 590

Glu Asp Ser Asp Leu Phe Ser Gly Val Lys Ala Ser Gly Pro Gly Gly

595 600 605

Glu Asp Leu Asp Lys Asp Lys Val Ala Ala Ala Asp Asp Ala Ala Lys

610 615 620

Thr Glu Ala Glu Lys Asn Asp Val Thr Gly Arg Lys Pro Glu Gln Ala

625 630 635 640

Lys Pro Asp Asp Gly Leu Ala Asp Ala Thr Ala Gln Lys Gly Phe Ile

645 650 655

Val Asp

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaattcta ggccacggaa tgaaggag 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggtacccg gcaacccaaa aaaagaag 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagatt tctccaggct ccttttcc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgtcgactg gctgctttgg tctgttct 28

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcccttcctc cctttatttc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actctattcc tttgccctcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggggtgtcg gaggtggtac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctttgctt gctctggttt 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaatcgggac aacagcaac 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caaacgcacc aagttatcg 19

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggaattcat ggcatcactc ctgcgc 26

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccaagctttc aatcaacaat aaaccc 26

Claims

1.一种稻瘟菌MoPTEN基因，其特征在于，所述稻瘟菌MoPTEN基因核苷酸序列为以下序列之一：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.一种权利要求1所述的稻瘟菌MoPTEN基因所编码的蛋白质。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中包含权利要求1所述的稻瘟菌MoPTEN基因。

4.一种权利要求3所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以野生型稻瘟菌cDNA为模板，用引物MBD-F和MBD-R扩增出MoPTEN的开放阅读框，之后将酶切处理的开放阅读框片段连于骨架载体pET28a上，构建出原核表达载体。

5.一种敲除权利要求1所述的稻瘟菌MoPTEN基因的敲除载体。

6.一种权利要求5所述的敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以野生型稻瘟菌基因组DNA为模板，用引物MGG-qc-LF和MGG-qc-LR扩增出的片段作为左臂，用引物MGG-qc-RF和MGG-qc-RR扩增出的片段作为右臂，将左右臂片段进行酶切后分别连接于敲除载体pXEH2.0潮霉素磷酸转移酶基因的两侧，构建出敲除载体。

7.一种权利要求1所述的稻瘟菌MoPTEN基因或权利要求2所述的蛋白质或权利要求3所述的表达载体或权利要求5所述的敲除载体在调控稻瘟菌致病力中的应用。

8.一种权利要求1所述的稻瘟菌MoPTEN基因或权利要求2所述的蛋白质或权利要求3所述的表达载体或权利要求5所述的敲除载体在调控稻瘟菌氧化应激能力中的应用。

9.一种权利要求1所述的稻瘟菌MoPTEN基因或权利要求2所述的蛋白质或权利要求3所述的表达载体或权利要求5所述的敲除载体在降低稻瘟菌分生孢子产量中的应用。

10.一种权利要求1所述的稻瘟菌MoPTEN基因或权利要求2所述的蛋白质作为用于稻瘟病防治的药物的靶标的应用。