KR20100111512A - 기주의 1차 방어 반응을 억제하는 도열병 진균 유래의 신규 병원성 유전자 및 그 용도 - Google Patents

기주의 1차 방어 반응을 억제하는 도열병 진균 유래의 신규 병원성 유전자 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기주의 1차 방어반응에 대한 극복반응을 조절하는 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 유래의 DES1(Defense Suppression 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 균주, DES1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체, DES1 유전자 결실변이체를 포함하는 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물, 상기 유전자 결실변이체를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) 및 마그나포르테 오리자 및 마그나포르테 오리자의 DES1 발현을 측정하여 벼 도열병 방제 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
병원성, 기주, 방어 극복반응, 활성산소종, 마그나포르테 오리자, DES1, PTI

Description

기주의 1차 방어 반응을 억제하는 도열병 진균 유래의 신규 병원성 유전자 및 그 용도{Novel pathogenicity gene in blast fungus to suppress basal defenses of host and uses thereof}
본 발명은 기주의 1차 방어반응에 대한 극복반응을 조절하는 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 유래의 DES1 유전자 및 그 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 DES1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 기주세포, DES1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자 결실변이체, DES1 유전자 결실변이체를 포함하는 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물, 상기 유전자 결실변이체를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) 및 마그나포르테 오리자 및 마그나포르테 오리자의 DES1 발현을 측정하여 벼 도열병 방제 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
식물은 내재한 방어체계로 인하여 일반적으로 대부분의 병원성 미생물에 대한 면역성이 있으며, 감수성 기주와 병원균의 예외적인 조합에서만 병이 발생한다 (Heath (2000) Curr Opin Plant Biol 3: 315-319). 식물은 병원성 미생물의 공격에 대항하는 2 가지 유형의 방어 기작을 가진다: 하나는 일반적인 미생물에 대항하는 것이고, 및 다른 하나는 특정 병원균에 대항하는 것이다 (Chisholm et al. (2006) Cell 124: 803-814; Jones & Dangl (2006) Nature 444: 323-329). 일반적인 방어 기작은 PTI (PAMP (pathogen-associated molecular pattern) triggered immunity)라 알려져 있다. PTI는 세균 편모단백질(flagellin), 키토산(키틴의 탈아세틸화된 산물), 및 N-아세틸키토올리고당(N-acetylchitooligosaccharides: 진균 세포벽의 골격) 같은 미생물의 일반적인 특징을 인지하는 세포 외 표면 수용체에 의해 개시된다. 상호진화의 결과, 식물 병원균은 PTI를 극복하기 위한 다양한 전략을 발달시켜 왔다. 그 중 하나는 PTI-억제 병원균 이펙터(PTI-suppressing pathogen effectors)를 이용하는 방법 (ETS, effector-triggered susceptibility) 이다. 현재까지 밝혀진 많은 이펙터들의 기능 및 분비 기작은 대부분 그람 음성 세균에서 연구되었다 (Hauck et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 8577-8582). 그러나, 식물 병원성 진균에서는 소수의 이펙터만이 보고되었으며, PTI 억제에 관여하는 기능 및 이들의 분비 기작은 아직 알려지지 않았다 (Chisholm (2006) Cell 124: 803-814; Jones & Dangl (2006) Nature 444: 323-329). 병원균이 분비하는 이펙터에 대항하는 보다 더 특이적인 식물의 방어 기작은 병원균의 이펙터 단백질 (Avr 단백질) 중의 하나를 특이적으로 인지하는 식물 감시 단백질 (R-단백질)에 의해 유도되는 ETI(effector triggered immunity)라고 알려져 있다. ETI는 PTI에 비해 가속화 및 강화된 방어 반응으로, 이들에 의해 활성화되는 방어 유전자들의 종류는 동일하지만, ETI에 의한 활성화가 PTI에 의한 그것보다 더욱 빠르고 강력하다. (Ahn et al. (2005) Phytopathology 95: 1248-1255). ETI는 식물 궁극적인 방어 기작으로 알려진 HR(hypersensitive response)인 감염 세포의 활동적인 세포 사멸을 동반한다 (Bowles (1990) Annu Rev Biochem 59: 873-907). 그러나, 어떤 병원균은 특정 감시 단백질의 인지를 회피하기 위해 표적이 되는 이펙터를 변화시키거나 또는 직접적으로 ETI를 억제하는 추가적인 이펙터를 배치함으로써 ETI를 피한다 (Abramovitch et al. (2003) Embo J 22: 60-69).
식물 PTI의 주요한 가장 빠른 반응 중의 하나는 감염 부위에서 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 급속한 축적이다 (Apostol et al. (1989) Plant Physiol 90: 109-116). ROS는 높은 반응성을 가진 기질로서 직접적으로 병원균의 사멸을 유도하거나, 리그닌 및 항미생물 활성을 가지는 다른 산화된 페놀 복합물의 합성에 사용되며, 또한 병원균의 차기 확장을 방해하기 위한 산화적 교차 결합에 의해 식물 세포벽의 강화에 이용되는 방어 물질이다 (Chen & Schopfer (1999) Eur J Biochem 260: 726-73). ROS는 또한 감염 세포의 프로그램된 세포 사멸을 위한 신호 분자로 작용하며, 주변 세포로 확산하여 다양한 병원성 관련 (pathogenesis-related, PR) 단백질 및 파이토알렉신(phytoalexins)의 생산을 유도한다. (Torres et al. (2005) Nat Genet 37: 1130-1134). 벼에 있어, PTI 반응 유도에 반드시 필요한 OsRac1 GTPase 복합체는 NADPH 산화효소의 직접적인 조절을 통하여 ROS 생산을 통제한다 (Wong et al. (2007) Plant Cell 19: 4022-4034). 식물 병원균은 식물의 ROS에 의하여 유도되는 저항성을 극복하는 대응기작을 가지고 있을 것으로 추정되나, 어떻게 병원균이 식물에 의해 생성된 ROS를 무력화 하는지 알려진 바가 거의 없다. 최근에, 옥수수 병원균 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)에 있어 AP-1 같은 전사 인자의 연구는 퍼옥시다아제(peroxidase)가 기주에 의해 생성된 ROS를 무독화함을 제시하였다 (Molina & Kahmann (2007) Plant Cell 19: 2293-2309).
도열병을 일으키는 자낭균(Ascomycete) 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)가 전 세계적으로 벼 경작에 있어 가장 유해한 병원균이다. 벼 도열병 병원성체계는 상기 질병이 경제적으로 중요할 뿐 아니라, 진균 및 기주 양자의 분자적 및 유전적 접근이 쉽기 때문에 진균성 병원균 및 식물 간 상호작용 연구를 위한 모델이 되어왔다. 기주 및 병원균 양자에 대한 전체 게놈 서열 정보가 사용 가능하며, 다양한 분자 기능적 유전체학적 접근이 개시되었다 (Dean et al. (2005) Nature 434: 980-986). 게놈 규모에서 병원성 유전자를 연구하기 위해, 본 발명자는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 형질전환 (ATMT)을 이용하여 20,000 개 이상의 삽입 변이체를 만들었으며, 발병과정의 필수적인 단계에 있어 각 변이체의 특성을 평가하였다 (Jeon et al. (2007) Nat Genet 39: 561-565). 상기 병원균의 발병과정은 성공적인 질병 발달에 필수적인 몇 단계로 구성된다. 무성적 분생포자는 병반으로부터 나오는 분생포자경에 생성되어 대기 중에 방출된다. 분생포자가 기주 잎에 접촉하면, 분생포자 정단 점액에 의해 잎에 단단히 부착되어, 수화되면 발아한다. 식물체 표면으로부터 나오는 환경적 신호로 돔(dorm) 형태의 사전 침투 구조물인 부착기(appressoria)가 균사 정단에 발달하여 식물체의 안으로 통과하기 위한 엄청난 물리적인 힘을 생성한다 (Howard & Valent (1996) Annual Review of Microbiology 50: 491-512). 침투 후, 특수화된 구근상의 감염 균사 (IH)가 병반 형성 전에 발달한다 (Kankanala et al. (2007) Plant Cell 19: 706-724). 초기 감염 단계에서, 분자 전쟁으로 여겨지는 다양한 상호작용이 진균 및 기주 간에 일어날 것으로 생각되고 있으며, 이것이 최종적으로 질병의 수준을 결정한다. 따라서, 상기 단계에 대해 집중적으로 식물 및 병원균 인자에 관한 연구가 증가하고 있다. 현재까지, 마그나포르테 오리자 있어 이펙터 단백질에 관한 연구는 초기 감염 단계에 식물 저항성 (R) 유전자와 상호작용하는 비병원성 (AVR) 유전자를 찾기 위한 유전적 접근에 의존해 왔다. 2 개의 비병원성 단백질 AVR-Pita (Orbach et al. (2000) Plant Cell 12: 2019-2032) 및 ACE1 (Bohnert et al. (2004) Plant Cell 16: 2499-2513)의 특성이 밝혀졌으며, 이들의 기능은 각각 메탈로프로테아제(metalloprotease) 및 폴리케타이드 신타아제(polyketide synthase)로 추정되나, 발병 인자로서의 역할은 미약하다. P-형 ATPase의 구성원인 MgAPT2에 관한 연구는 비병원성 유전자 산물을 포함하여 진균 이펙터의 전달이 감염성 생장 및 HR 유도에 필수적임을 제시하였다 (Gilbert et al. (2006) Nature 440: 535-539). Mig1 및 SSD1는 초기 감염 단계에서 식물에 내재한 방어를 다루는 병원성 인자이나, 어떻게 이들이 기주의 방어계에 대항하여, 진균 발병에 기여하는지 아직 알려진 바가 없다. 따라서, 식물 및 진균 간 상호작용을 이해하기 위해서는 초기 감염 단계에 작용하는 병원성 유전자에 관한 보다 더 세부적인 연구가 필요하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) ATMT 결실변이체 라이브러리로부터 병원성이 감소된 T-DNA 삽입 결실변이체 동정 및 연구로 식물에 내재한 방어억제에 필요한 진균 특이 유전자 DES1을 동정하여, 마그나포르테 오리자 유래 DES1 유전자가 기주에서 병원성 발생에 참여하는지를 관찰하며, 상기 유전자의 세포 내 위치를 알아보고, 결실변이체를 제조하며, 결실변이체 및 T-DNA 삽입 결실변이체를 기주에 접종하여 기주에서의 상기 변이체의 반응을 분석하여, 상기 유전자의 역할을 알아보고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기주의 기저 저항성에 대한 역방어를 조절하는 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 유래의 DES1 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, DES1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 DES1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 기주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 DES1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 DES1 유전자 결실변이체를 포함하는 벼 도열병에 대한 병원 성을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 DES1 유전자 결실변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 및 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)를 제공한다.
또한, 본 발명은 마그나포르테 오리자 내의 DES1 발현을 측정하여 벼 도열병 방제 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는, 기주의 1차 방어반응에 대항하는 극복기작을 조절하는 마그나포르테 오리자 유래 DES1이 기주에 감염 시 상기 유전자의 병원성 발병의 기작을 연구함으로써, 도열병을 통제하는 새로운 전략을 개발할 수 있다. 또한, DES1을 타겟으로 하거나 DES1을 통해 조절되는 효소 및 대사산물을 타겟으로 하여 도열병을 감소시킬 수 있는 새로운 농약을 개발할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 유래의 DES1 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 DES1 단백질의 범위는 마그나포르테 오리자로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이 상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
또한, 본 발명은 상기 DES1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 DES1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DES1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 DES1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있 다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 기주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 기주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 기주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 기주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 기주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 기주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 기주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 기주세포는 당업계에 공지된 어떠한 기주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 기주세포는 바람직하게는, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)이다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 기주세포로 서, 곰팡이, 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 상기 기주세포는 바람직하게는, 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)이다.
본 발명의 벡터를 기주세포 내로 운반하는 방법은, 기주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen 등, 1973, Proc. Natl. Acac. Sci. USA 9: 2110-2114), 하나한 방법 (Hanahan, 1983, Mol. Biol. 166: 557-580) 및 전기천공 방법 (Dower 등, 1988, Nucleic. Acids Res. 16: 6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 기주세포가 진핵세포인 경우에는, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개 형질전환법, 미세주입법 (Capecchi, 1980, Cell 22: 479), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham 등, 1973, Virology 52: 456), 전기천공법 (Neumann 등, 1982, EMBO J. 1: 841), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong 등, 1980, Gene 10: 87), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, 1985, Mol. Cell Biol. 5: 1188-1190), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang 등, 1990, Proc.Natl. Acad. Sci. 87: 9568-9572) 등에 의해 벡터를 기주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 DES1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체를 제공한다. 본 발명의 결실변이체에서, 상기 DES1 유전자는 게놈 DNA 및 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, DES1 유전자 결실변이체를 포함하는, 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 DES1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 상기 DES1 유전자 결실변이체는 DES1 단백질의 기능이 상실된 유전자를 의미하며, DES1 유전자 서열에서 특정 염기서열의 삽입, 치환, 결실된 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, DES1 유전자 결실변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 DES1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 재조합 벡터에 대한 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 기주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 기주세포는 당업계에 공지된 어떠한 기주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 기주세포는 바람직하게는, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)이다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 기주세포로서, 곰팡이, 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 상기 기주세포는 바람직하게는, 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)이다.
본 발명은 또한,
마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
마그나포르테 오리자 내의 DES1 발현을 측정하는 단계를 포함하는 벼 도열병 방제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 벼 도열병 방제 물질의 스크리닝 방법은 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)에 시험하고자 하는 물질을 처리한 후, 마그나포르테 오리자 내의 DES1 발현을 측정하는데, 상기 물질 처리 후에 DES1 발현이 감소하면 상기 처리된 물질은 벼 도열병 방제 후보 물질이 될 수 있다. 따라서, DES1을 타겟으로 하여 벼 도열병을 방제할 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 진균 균주 및 배양 조건
마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 균주 70-15 (Mat1-1) 및 70-6 (Mat1-2)는 A.H. Ellingboe (University Wisconsin-Madison, USA)로부터 얻었으며, 70-15가 본 발명에서 야생형 균주로 사용되었다. 균주 4091-5-8 (Mat1 -2)은 B. Valent (Kansas State University, USA)로부터 얻었다. 모든 진균 균주는 식물병원성곰팡이유전자원은행 (서울대학교, 서울, 한국; http://genebank.snu.ac.kr)에 기탁하였다. 균주는 오트밀아가배지 (OMA, 5% 오트밀 및 2.5% 아가 분말 (w/v)) 상에 유지되고, 분생포자 형성을 촉진하기 위해 25℃, 일정한 형광등 하에서 키웠다. 균주는 생장 및 콜로니 특성 평가를 위해 완전 아가 배지 (Talbot et al. (1993) Plant Cell 5: 1575-1590) 상에서 3-12일간 배양하였다. 진균 형질전환에 의해 생성된 하이그로마이신 B 저항성 형질전환체가 200 ppm 하이그로마이신 B가 첨가된 고체 TB3 아가 배지 (0.3% 효모 추출물, 0.3% 카사미노산, 1% 포도당, 20% 서당 (w/v), 및 0.8% 아가 분말) 상에서 선발되었다. 핵산 추출에 사용된 균사는 해당 균주를 액체 CM에서 3일간 25℃에서 진탕 (150 rpm) 배양으로 키우거나, 쾌속 DNA 추출 (Chi 등, (2009) Plant Pathology Journal 25: 108-111) 용으로는 TB3 아가 배지로부터 직접적으로 얻었다. 유전적 교배 및 자손 분석 (4분포자 또는 자낭포자 분석)은 이전 기재 (Valent et al. (1991) Genetics 127: 87-101)에 따라 수행되었다. 스트레스 하의 무성 생장 관찰 또는 RNA 추출물을 위해 진균 균주는 하기와 같이 처리되었다: 고체 또는 액체 CM에 적절한 양의 H2O2 용액 (Aldrich, 323381, 3 wt. %)으로 첨가함으로써 산화적 스트레스를 가하였다. 액체 CM의 3일 된 균사는 RNA 추출을 위해 수확 전 1 mM H2O2로 30분간 처리되었다. 세포벽 발생에 대한 스트 레스 조건은 진균 세포벽의 조립을 방해하는 것으로 알려진 콩고 레드 (CR, Aldrich, 860956) 및 Calcofluor White (CW, Sigma, F3543) (Ram & Klis (2006) Nat Protoc 1: 2253-2256)를 CM 아가 배지에 최종 농도 100 ppm으로 첨가하여 만들었다. 삼투 스트레스 조건을 만들기 위해, CM 아가 배지에 최종 농도로 500 mM NaCl 및 1 M 소르비톨을 첨가하였다.
2. 발달 표현형 분석
방사 콜로니 생장률은 3 회 반복하여 관찰되었으며, 접종 후 12일에 CM 아가 배지에서 측정되었다. 콜로니 색 및 형태 또한 상기 조건에서 관찰되었다. 분생포자 형성은 OMA 상에서 키운 12일 된 콜로니로 분석되었다. 분생포자는 찢어 5 ㎖ 증류수에 수집하여 현미경 하에서 혈구계로 세었다. 분생포자 발아 및 부착기 형성은 소수성 현미경 커버슬립 (Marienfeld, Landa-Konigshofen, Germany) 상에서 측정되었다. 12 일 된 OMA 배양물로부터 수확한 분생포자는 멸균 증류수에 2x104 분생포자/㎖로 희석되었다. 분생포자 현탁액 (40 ㎕)을 커버슬립에 3 회 반복하여 떨어뜨려, 습한 상태로 25℃에서 배양하였다. 8 시간 배양 후, 분생포자 발아 및 부착기 형성 퍼센트를 적어도 3 회의 독립적인 실험으로 회당 적어도 100 개의 분생포자를 현미경 관찰로 결정하였다.
3. 형광현미경 관찰
형광 및 DIC 이미지는 Zeiss Axio Imager A1 형광현미경 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관찰되었다. 녹색 형광 단백질 (eGFP) 관찰에는 470/40 nm에서 여기 및 525/50 nm에서 방사되는 필터 세트가, 7-아미노-4-클로로메틸쿠마린(7-amino-4-chloromethylcoumarin: CellTrackerTMBlue CMAC, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 아닐린 블루 형광색소 관찰에는 365 nm에서 여기 및 445/50 nm에서 방사되는 필터 세트가 사용되었다. 분생포자 염색 및 CMAC로 균사 생육은 이전 기재 (Ohneda et al. (2002) Fungal Genet Biol 37: 29-38)에 따라 수행되었다.
4. 병원성 분석 및 감염성 생장 명시화
분무접종을 위해, Tween 20 (250 ppm) 및 OMA 상에서 (1-5 x 105 분생포자/㎖) 12일 된 배양물로부터 수확한 분생포자를 함유하는 분생포자 현탁액 (10 ㎖)을 4 주된 감수성 벼 유묘 (Oryza sativa cv. Nakdongbyeo)에 분무하였다. 접종된 식물체는 25℃, 24 시간, 암소, 고습도 생장상에 두었다가, 형광등이 있는 16 시간 광주기의 생장실로 옮겼다 (Choi et al. (1996) Kor J Plant Pathol 12: 453-454). 접종 7일 후 질병 정도를 평가하였다. DES1 변이체의 발병력의 더욱 정확한 평가를 위하여 %DLA를 기록하였다. 8 cm 길이의 엽신을 포함하여 발병된 벼 잎의 사진을 촬영하고, 발병된 잎의 병반 구역 및 건강한 구역의 픽셀 수를 Axiovision 이미지 분석기로 세었다. 벼 조직상에서의 침투 및 감염성 생장을 현미경으로 관찰하기 위 해 낙동벼의 절단된 엽초를 이전 기재 (Kankanala et al. (2007) Plant Cell 19: 706-724; Koga et al. (2004) Physiol Mol Plant P 64: 67-72)에 따라 준비하여, 잎 상면에 분생포자 현탁액 (1 x 104 분생포자/㎖)을 접종하였다. 가습 상태로 배양 24, 48 및 96 시간 후, 엽록소로 채워진 식물체 부분을 제거하기 위해 엽초를 정리하고, 나머지 표피층 (3-4 세포층 두께)을 현미경으로 관찰하였다. 양파 표피세포에의 접종은 이전 기재 (Kim et al. (2005) Mol Microbiol 57: 1224-1237)에 따라 수행하였다. 벼 엽초 및 양파 표피세포의 고정 및 아닐린 블루 염색은 이전 기재 (Kim et al. (2005) Mol Microbiol 57: 1224-1237)에 따라 수행하였다. 시료는 상온에서 1 시간 동안 락토페놀에 배양하여 70% 글리세린으로 바로 마운팅하거나, 또는 0.01% 아닐린 블루에 1 시간 동안 옮겼다가 락토페놀로 탈염하였다. DAB(3,3'-diamimobenzidine: Sigma, D-8001) 염색을 위해, 시료를 상온에서 8 시간 동안 1 mg/㎖ DAB 용액 (pH 3.8)에 배양하여, 투명화 용액 (ethanol : acetic acid = 94 : 4, v/v)으로 1 시간 동안 탈염하였다. 침투율 및 IH 발달을 관찰 및 기록하기 위해, 분생포자 현탁액을 양파 표피에 떨어뜨려 습윤 배양판에 72 시간 배양하였다. 시료는 고정되어, 상기 기재된 벼 엽초에서처럼 염색되었다. 캘로오스(callose)가 없거나 산포된 캘로오스가 있는 단일 부착기로부터 발달한 확장형의 IH는 정상적인 IH로 계수하였고, 캘로오스가 축적된 비교적 짧고 뾰족한 IH는 지체된 IH로, 매우 짧은 IH를 발달시키는 부착기 또는 강한 캘로오스를 지닌 침투관(penetration peg)은 폐색된 IH로, IH 및 캘로오스 축적이 없는 부착기는 침투가 이루어지지 않은 것 으로 계수하였다.
5. 핵산 조작 및 중합효소연쇄 반응
서던 탁본 분석을 위해, 게놈 DNA는 Rogers 및 Bendich (1985, Plant Mol Biol 5: 69-76)의 방법을 약간 변형하여 분리되었다. 제한효소 처리, 아가로즈겔 상에서의 분리, 및 클로닝은 표준 프로토콜 (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY, USA)에 따라 수행되었다. 서던 탁본 분석은 이전 기재 (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY, USA)에 따라 수행되었다. 하이그로마이신 B 인산전이효소 유전자 (hygromycin B phosphotransferase gene: HPH)를 포함하는 HpaI 단편 (1.4 kb) 및 pCB1004가 탐침으로 사용되었다. PCR 스크리닝을 위한 형질전환체의 게놈 DNA는 쾌속 추출 과정 (Chi et al. (2009) Plant Pathology Journal 25: 108-111)에 따라 분리되었다. 약 50 ng의 게놈 DNA (2 ㎕)가 100 nM의 각 프라이머 1㎕, dNTP, PCR 버퍼, Taq 중합효소 1 unit 및 로딩 염료 (EnzynomicsTM, 대전, 한국)를 포함하는 2x PCR 반응 시료 5 ㎕와 함께 PCR 반응에 사용되었다. Perkin-Elmer 9600 DNA Thermal Cycler를 사용하여 PCR을 수행하였다. 플라스미드 DNA는 표준 방법 (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY, USA)에 따라 준비되었다. RNA는 급속냉동된 진균 및 식물 조직으로부터 Easy-spinTM 총 RNA 추출키트 (iNtRON Biotechnology, 서울, 한국)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 분리되었다. 정량적 RT-PCR을 위해, 총 RNA 5 ㎍이 올리고 (dT) 프라이머로 SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 first-strand cDNA로 역전사되었다. 반응은 각 프라이머 100 nM, cDNA (RNA 25 ng) 2 ㎕ 및 2x Power SYBR Green
Figure 112009020916001-PAT00001
PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) 12.5 ㎕가 포함된 총 25 ㎕ 용량에서 수행되었다. 실시간 PCR은 Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행되었다. 반응 후, 시료를 60℃에서 95℃로 가열함으로써 얻은 해리곡선으로 증폭 특이성을 확인하였다. 표준화 및 평균 Ct 값의 비교는 기재된 (Livak & Schmittgen (2001) Methods 25: 402-408) 바에 따라 수행되었다. 목적 유전자 전사체의 상대 수도를 비교하기 위하여, 3 회 반응의 평균 역치환은 (Ct) 발달 단계에서 안정된 발현을 보이며 (미발표 자료) 이전에 사용된 바가 있는 마그나포르테 오리자 사이클로피린 유전자 (CYP1, MGG10447)의 결과 (Yi & Lee (2008) Plant Pathol J 24: 131-142; Yi et al. (2008) Fungal Genet Biol 45: 1172-1181)로, 또는 오리자 사티바 Elongation factor 1α 유전자 (Os03g08020, (Caldana et al. (2007) Plant Methods 3: 7))로 표준화되었다. Fold 변화는 처리 간에 또는 표준 조건과의 비교 조건과 비교되었다. 정량적 RT-PCR은 독립적인 생물 실험으로부터 3 회 반복으로, 적어도 2 회 수행되었다. DES1 T-DNA의 T-DNA 삽입부에 인접한 게놈 DNA는 이전의 기재 (Choi et al. (2007) Mol Microbiol 66: 371-382)에 따라 수행된 TAIL-PCR에 의해 분리되었다. 삽입물은 좌위 특이 프라이머 4163TF (서열번호 3) 및 4163 TR (서열번호 4), 및 T-DNA 특이 프라이머 RB3 (서열번호 5) 및 LB3 (서열번호 6) 및 TV1 (서열번호 7)으로 PCR 증폭에 의해 확인되었다. 증폭된 PCR 단편은 삽입물의 특성 분석을 위하여 2 회 서열분석되었다.
6. 마그나포르테 오리자 있어 DES1 의 표적 붕괴
목적 유전자 붕괴 벡터는 변형된 double-joint PCR을 이용하여 (Yu et al. (2004) Fungal Genet Biol 41: 973-981) 제작되었다. 표적 구간은 DES1 ORF 및 짧은 UTR 추정 (5' -70bp 및 3' -500bp) 서열을 포함하는 ~4.5k 단편이다. 1188 bp 길이의 5' 플랭킹 구간은 DES1KOSF (서열번호 8) 및 DES1KO5R (서열번호 9) 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되었다. 942 bp 길이의 3' 플랭킹 구간은 DES1KO3F (서열번호 10) 및 DES1KOSR 프라이머 (서열번호 11) 쌍을 사용하여 증폭되었다. 표적 서열의 5' 및 3' 양 플랭킹 구간은 DES1KO5R (서열번호 9) 및 DES1KO3F (서열번호 10)상의 23 bp 말단 서열을 지닌 특이 프라이머 쌍을 사용하여 HPH 카세트에 융합되었다. HPH 카세트와의 융합 후, 내부 프라이머(nested primer) 쌍 DES1KO5F (서열번호 12) 및 DES1KO3R (서열번호 13)이 최종 구축물 증폭에 사용되었다. 야생형 7015의 진균 원형질체는 정제 후 double-joint PCR 산물로 직접적으로 형질전환되었다. 원형질체 재생 및 연이은 형질전환은 당 업계에 공지된 과정을 약간 변형하여 수행하였다. 유전자 붕괴 결실변이체의 초기 동정은 프라이머 쌍 DES1KOSF (서열번호 8) 및 HPHF (서열번호 14)으로 PCR에 의해 수행되었다. 게놈 DNA 분리는 상기 언급된 쾌속 과정에 따라 수행되었다. 유전자 붕괴 결실변이체 후보자는 단일 분생포자 분리에 의해 유전적으로 정제되었다. 붕괴 결실변이체를 확인하기 위해, 후보 균주의 게놈 DNA는 BamHI으로 절단되어, 프로브로서 DES1KO3F (서열번호 10) 및 DES1KO3R (서열번호 13) 프라이머 쌍으로 증폭된 855 bp 길이의 3' 플랭킹 단편을 사용하여 서던 혼성화 분석이 수행되었다.
표 1. 본 발명에 사용된 프라이머
이름 서열 (5'-3') 서열번호
4163TF GAGCGAGCGAGTATGATGTAG 3
4163TR CAAGTTGCGGGTATGTATGTC 4
*RB3 CCCTTCCCAACAGTTGCGCA 5
*LB3 GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT 6
TV1 ACTAGAACCGGAGACATTACG 7
DES1KOSF TCCTGTTCGTCTTTACCTGAG 8
DES1KO5R GTTTTGGTGGCTGGCTTACGCACAGGTACACTTGTTTAGA 9
DES1KO3F CCTTCAATATCATCTTCTGTCGAAATGGGGACGAGCAGTT 10
DES1KOSR ACCTAGCTGCTGACAAATCC 11
DES1KO5F GAGTGCAGGCTTGATTTCTT 12
DES1KO3R TCCCAGCGAGTAGTCAAGTG 13
HPHF TTCCGGAAGTGCTTGACATT 14
TrpC 360R ACACTAGTATGCTTGGGTAGAATAGGTAAGTCAGATTGA 15
TrpC 360F ACATCGATAGAAGATGACATTGAAGGAGCACTTTTTGGG 16
GFP 720R ACGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG 17
GFP 720F ACTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGG 18
DES1_3864R ACTCTAGATTCTCCCATCTCGACACTCTCCAAC 19
DES1_3864F ACACTAGTATGCTCGGGAAGCTTTTCAACCTG 20
* Mullins et al., 2001 Phytopathology 91: 173-180
7. DES1- EGFP 벡터의 구축
융합 구축물을 위해, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) TrpC 프로모터 (0.3 kb ClaI-HindIII 단편), EGFP 코딩 서열 (0.7 kb HindIII-XbaI 단편) 및 DES1 ORF (4 kb SpeI 또는 BamHI 단편)는 pSK1093, pSK2702 및 70-15의 게놈 DNA로부터 표 1의 프라이머 (서열번호 15-20)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 각 프라이머에는 연이은 클로닝을 위해 5' 말단에 제한 효소 절단부위가 있다. 모두 3 개의 PCR 산물이 겔로부터 분리되어 QIAquick 스핀칼럼을 사용하여 정제되어 pGEM-T Easy 백터에 클로닝되었다. 모든 클론은 서열분석으로 확인되었다. 연이어, PTrpC:DES1:EGFP 구축물이 pGEM-3Zf (Promega, Madison, WI)의 ClaI-XbaI 절단부위 사이에 삽입되었다. 융합 구축물은 제네티신(geneticin) 저항성 유전자를 함유하는 pII99 (Lee et al. (2003) Mol Microbiol 50: 145-152)와 함께 야생형 70-15로 동시 형질전환되었다. 구축물당 3 개의 형질전환체가 선발되었다.
8. 세포벽 강도 검정
니코마이신 Z(Nikkomycin Z) 민감도 분석을 위해, 분생포자는 drug 100 μM이 있는 슬라이드글라스 상에서 배양되었으며, 2 시간 후에 균사를 관찰하였다. 원형질체 생산 분석은 CM 액체 배양물로부터 3일 된 균사 (0.5g)를 사용하여 이전 기재 (Jeon et al. (2008) Mol Plant Microbe Interact 21: 525-534)에 따라 수행되었다.
9. 효소 활성 측정 및 세포외 배양 여과액내 철 이온 검출
효소 활성은 3일 된 CM 액체 배양물로부터 배양 여과액을 사용하여 분석되었다. 균사는 여과 및 원심분리 (5,000g, 4℃)로 완전히 제거되었다. 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 라카아제(laccase) 활성을 측정하기 위해, 50 mM 아세테이트 버 퍼 (pH 5.0) 및 10 mM ABTS이 함유된 반응 혼합물 (1 ㎖)이 배양 여과액 (200 ㎕)과 혼합되어 25℃에서 5 분간 3 mM H2O2와 함께 또는 없이 배양되었다. 흡광도는 420 nm에서 평가되었다.
배양 여과액의 철 이온은 BPS(Bathophenanthroline disulfonate) 색 반응으로 측정되었다. BPS가 배양 여과액 (최종 농도 1 mM)에 첨가되어, 혼합물은 3 시간 동안 상온에서 배양되었다. 철 이온의 농도는 535 nm에서 분광광도계로 BPS-Fe(II) 복합체 형성으로 감시되었다.
10. 생물정보학
본 발명에 사용된 모든 서열 정보는 마그나포르테 오리자를 포함하여 59 가지 진균의 최신 게놈 정보를 함유하는 온라인 데이터베이스 CFGP (http://cfgp.snu.ac.kr; Park et al. (2008) Nucleic Acids Res 36: D562-571)로부터 얻었다. DES1 상동체를 동정하기 위해, 유전자은행 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 및 CFGP 데이터베이스를 BLAST 알고리즘 (McGinnis & Madden (2004) Nucleic Acids Res 32: W20-25)을 사용하여 검색하였다. DES1 상동체 검색 후 유전자 분포 분석은 CFGP 내의 BLAST matrix 프로그램에 의해 자동적으로 수행되었다. ClustalW 알고리즘을 사용한 (Thompson et al. (1994) Nucleic Acid Res 22: 4673-4680) 서열 정렬 및 계통수 제작은 CFGP 내에서 수행되었다. InterPro Scan v12.0 (Mulder et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: D201-205), 도메인 구조 명시화, SignalP v3.0 (Bendtsen et al. (2004) J Mol Biol 340: 783-795) 및 아미노산 빈도 분석의 결과 또한 CFGP로부터 자동적으로 제공되었다. 본 발명에 사용된 프라이머는 Primer SelectTM 프로그램 (DNASTAR Inc., Madison, USA)을 사용하여 고안되어, 상업적으로 합성되었다 (BIONEER Corp., 대전, 한국).
실시예 1. 병원성이 결함된 T-DNA 결실변이체의 동정
감소된 병원성을 보이는 T-DNA 삽입 결실변이체 (ATMT0144A2)가 마그나포르테 오리자 ATMT 결실변이체 라이브러리 (Jeon et al. (2007) Nat Genet 39: 561-565)로부터 동정되었다. 상기 결실변이체는 감수성 벼 재배품종 낙동벼에 제한된 저항성형 병반을 발달시켰으며, 병반의 수는 야생형 균주 70-15에 있어서보다 훨씬 적었다 (도 1의 A). 더욱이, 결실변이체는 현미경 하에서 쉽게 검출되는 더 넓은 타원체의 분생포자를 균일하게 생성하였다 (도 1의 B). 결실변이체의 분생포자는 야생형보다 평균 ~4 ㎛ 짧고 ~3 ㎛ 넓었다 (도 1의 C). T-DNA 삽입 결실변이체는 다른 여러 가지 표현형에 있어서는 크게 결함을 보이지 않았다. 비록 ATMT0144A2의 균사 생장률은 아가 배지 상에서 야생형에 비해 약간 빠르긴 했으나 (표 2), 결실변이체의 콜로니 형태는 야생형과 구별이 안 되었다. 분생포자 형태의 변형에도 불구하고, 결실변이체에 의해 생성된 분생포자는 분생포자의 표면접착, 발아, 및 부착기 형성에 있어서는 결함이 없었다 (표 2). 이들 표현형은 ATMT0144A2에 T-DNA 삽입이 병원성 및 분생포자 형태형성에는 영향을 미치나 다른 침투 전 발달 단계에는 영향을 미치지 않음을 의미한다.
표 2. 균주 간 진균 특성 비교a
균주 균사 생장b 분생포자 형성c 분생포자
표면접착d 		분생포자 발아e 부착기 형성f
(mm) (105/ml) (%) (%) (%)
70-15 63.5±1.0 B 102.3±3.8 B 90.9±5.7 A 100±0.0 A 99.1±1.5 A
DES1 T - DNA 69.0±1.7 A 108.7±7.6 B 91.1±5.4 A 100±0.0 A 99.0±1.7 A
Δ des1 61.3±1.2 B 188.0±5.3 A 94.3±4.0 A 99.7±0.5 A 99.7±0.5 A
a 각 열 내에서, 던칸의 다중범위검정(Duncan's multiple range test, P = 0.05)으로 평가된,
다른 문자로 표시된 평균은 유의하게 다르다.
b 생장은 접종 후 12일 된 균사의 직경으로 측정되었다.
c 분생포자 형성은 생장 측정에 사용된 배양판에 멸균 증류수 5 ㎖를 채워 분생포자의 수를
세어 분석되었다.
d 분생포자 표면접착은 수세 전에 센 총 분생포자에 대해, 증류수로 3 회 수세 후 센 부착 분생
포자의 비로 측정되었다.
e 발아능은 총 분생포자에 대해 발아하는 분생포자의 비로 측정되었다.
f 부착기 형성은 소수성 현미경 커버슬립 상에 발아하는 분생포자에 대해 부착기 형성 분생포자
의 비로 측정되었다.
실시예 2. ATMT0144A2 표현형은 단일 T- DNA 삽입에 의해 야기된다
서던 탁본분석은 ATMT0144A2의 게놈 상에 단일 T-DNA 삽입물이 있음을 보였다 (도 2의 A). BglII-절단된 DNA로부터 ~17 kb의 단일 밴드의 존재는 밴드 위치가 기대된 (9 kb) 바와 달랐으므로 동일한 좌위에 T-DNA 몇 카피의 비정상적인 삽입을 제시한다. 삽입 좌위는 T-DNA 경계부 프라이머를 사용하여 이전 연구에 기재 (Choi et al. (2007) Mol Microbiol 66: 371-382)된 바에 따라 TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction) (Liu & Whittier (1995) Genomics 25: 674-681)로 동정되었다. 우측 경계부 (RB) 프라이머를 사용한 PCR 반 응에서는 2 개의 별개의 밴드 (RB-A 및 RB-B)가 생성되었으나, 좌측 경계부 (LB) 프라이머를 사용한 PCR 반응에서는 밴드가 검출되지 않았다. RB-A의 서열은 마그나포르테 오리자 게놈의 supercontig 6.12에, RB-B의 서열은 RB에 인접한 pBHt2 벡터 구간에 필적하였다. T-DNA의 직렬(tandem) 및 역위(inverse) 반복체 양자는 LB 및 RB 프라이머 조합을 사용하여 증폭에 의해 검출되었다. 이들 결과로부터, ATMT0144A2 내에 T-DNA의 삽입 도해가 작성되었으며, 삽입 양상은 경계부 프라이머 및 좌위 특이 프라이머의 조합으로 PCR 증폭에 의해 확인되었으며, 3-4 개의 T-DNA 단위가 직렬(tandem)로 및 역위(inverse)되어 삽입되어 있었다 (도 2의 B). T-DNA 와 마그나포르테 오리자 게놈 사이의 연결부위 서열을 관찰한 결과, T-DNA의 한쪽 말단에는 전형적인 RB 경계부가 있으나, 다른 한쪽 말단에는 비정상적인 RB read-through 및 1 bp filler DNA가 있는 것으로 나타났다 (도 2의 C). T-DNA 삽입으로 게놈 DNA의 6 bp가 삽입 부위로부터 결실되었다.
단일 T-DNA 삽입 및 ATMT0144A2 표현형 간의 상관관계를 확인하기 위해, 2 개의 다른 교배 검정 균주 (70-6 및 4091-5-8)로 유전적 분석을 수행하였다. ATMT0144A2에 삽입된 T-DNA는 유전적 교배의 F1 자손에 안정적으로 분리되었다. ATMT0144A2 및 70-6 간의 교배로부터 102 개의 F1 자손 중, 49 개의 자손이 하이그로마이신 B (HygR)에 저항성이 있었으며, 반면 53 개의 자손은 감수성 (HygS)이었다. Chi-square 분석은 유의도 5% 수준에서 1:1 분리 (Χ 2 = 0.09)를 유효하게 지지하였다. 교배로부터 모든 HygR F1 자손은 삽입변이체 양친처럼 보다 넓은 타원체 분생포자를 생산하였으며, 반면 모든 HygS F1 자손은 야생형 양친처럼 정상적인 형태의 분생포자를 생성하였다 (도 2의 D). 4163TF 및 RB3 간의 PCR 증폭으로 모든 HygR F1 자손은 T-DNA를 가지며, 반면 모든 HygS 자손은 T-DNA를 가지지 않는 것으로 나타났다 (자료 미제시). 따라서, T-DNA 삽입물은 분생포자 형태를 결정하는 좌위에 밀접하게 연관되어 있다. ATMT0144A2 및 4091-5-8 간의 유전적 교배에 있어, 단일 4분포자로부터의 자손은 앞서와 동일한 결과를 재현하였다. T-DNA는 MGG04162.6 및 MGG04163.6 간의 비코딩 구간에 있었다. MGG04163.6가 T-DNA로부터 가장 가까운 ORF였으며 (개시 코돈의 750 bp 업스트림), 정량적 RT-PCR은 ATMT0144A2에 있어 MGG04163.6의 발현 수준이 야생형의 60%까지 감소되는 것으로 보였다 (도 2의 E). 따라서, 유전자의 프로모터 구간에 T-DNA의 삽입은 전사를 감소시키며, 결과적으로 병원성 및 분생포자 형태형성에 영향을 미친다는 것을 밝혔다. 본 발명에서 유전자 MGG04163.6 (GenBank accession number: NW_001798732)를 식물 방어 억제(defense suppression)로부터 유래된 DES1으로 명명하였다. T-DNA는 MGG01462.6 으로부터 종결 코돈 넘어 2.5 kb 거리에 의 3' 방향에 있었고, 정량적 RT-PCR을 통해 관찰한 결과 해당 유전자의 전사 수준이 T-DNA에 의해 변화하지 않았다. 따라서, 상기 좌위가 ATMT0144A2의 표현형을 결정하지 않는다고 결론지었다.
실시예 3. DES1 은 미지의 진균 특이 단백질을 코딩한다
DES1 유전자는 마그나포르테 오리자 게놈의 염색체 IV에 위치하고, 예측된 ORF는 3,864 bp 길이이고, 1,287 아미노산을 코딩하며, ORF 상에 인트론은 없다. DES1 전사체의 서열은 ORF 상의 4 쌍의 프라이머를 사용하여 균사 mRNA로부터 합성된 cDNA의 서열분석에 의해 확인되었으며, 마그나포르테 오리자 게놈 버전 6 (자료 미제시)의 예측된 ORF에 동일하였다. DES1 상동체를 찾기 위한 BLAST 검색에서는 소수의 섬유상 진균의 단백질만이 검색되었다. 게다가, DES1 상동체는 분류학적 분포 (www.cfgp.snu.ac.kr; Park et al. (2008) Nucleic Acids Res 36: D562-571)에 따라 BLAST 결과를 보여주는 BLASTMatrix tool을 사용하여 59 개의 최근에 공개된 진균 게놈 (3 개의 난균(Oomycetes) 포함하여) 상에서 통합적으로 분석되었다. DES1 상동체는 자낭균 문(Ascomycota), 페지조마이코티나 아문(subphylum Pezizomycotina)에서만 발견되었으며, 각 상동체는 각 게놈에 단일 카피로 존재하였다. 페지조마이코티나(Pezizomycotina)에 속하는 21 종의 진균 중, DES1 상동체는 20 개의 종에서만 발견되었으며, 마이코스페렐라 그라미니콜라(Mycosphaerella graminicola)에서만 예외적으로 발견되지 않았다. DES1 상동체의 서열 정렬에서 보면 길이 및 아미노산 조성이 잘 보존된 것으로 나타났으며, 상동체들은 별개의 계통적 군(clades)으로 유집되었다 (도 3).
DES1의 생화학적 기능을 예측하기 위해 DES1 및 그 상동체의 아미노산 서열은 생물정보학적 도구 InterProScan (Mulder et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: D201-205), SignalP (Bendtsen et al. (2004) J Mol Biol 340: 783-795), 및 아미노산 빈도 분석을 사용하여 분석되었다. 대부분의 DES1 상동체는 InterProScan (v12.0)으로 검색 시 알려진 기능적 도메인이 없었다. 예외적으로, 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)에서의 DES1 상동체인 Afu2g05410는 C-말단 구 간에 13 개의 잔기로 구성된 IPR002048 (calcium-binding EF-hand) 도메인을 가졌다. Signal P (v3.0)는 모든 DES1 상동체가 신호 펩티드를 가지지 않으며, 비분비 단백질일 것으로 예측하였다. 아미노산 빈도 분석으로 DES1 및 그 상동체는 세린 풍부 단백질이며, DES1 및 그 상동체의 평균 세린 빈도는 13.25%인 반면 마그나포르테 오리자의 전체 단백질에서의 세린 분포는 오직 7.97%만인 것으로 나타났다.
실시예 4. 마그나포르테 오리자 DES1 의 표적화된 유전자 결실 실험
DES1의 표적화된 유전자 결실로 상기 유전자가 마그나포르테 오리자 병반 발달 및 분생포자 형태형성에 필요한 것임이 확인되었다. 유전자 결실 벡터는 double joint PCR (Yu et al. (2004) Fungal Genet Biol 41: 973-981)에 의해 구축되었으며, 상기 벡터에서 하이그로마이신 저항성 유전자 (HPH) 카세트가 ~1 kb 길이의 플랭킹 구간과 결합되었다 (도 4의 A). 유전자 결실 벡터는 야생형 70-15 원형질체에 PEG를 이용한 진균 형질전환에 의해 도입되었다. 좌위 특이 프라이머 (DES1KOSF) 및 HPH 유전자 프라이머 (HPHF)를 사용하여 하이그로마이신-B-저항성 형질전환체의 일차 PCR 스크리닝 후, DES1 결실변이체 (Δdes1) 및 전위 형질전환체 (E41)는 서던 탁본법 (도 4의 B)에 의해 확인되었다. RT-PCR로 Δdes1 결실변이체가 DES1 전사체를 생성하지 않는 DES1의 결실변이임이 확인되었다 (자료 미제시). Δdes1 결실변이체에 의해 생성된 분생포자의 형태는 ATMT0144A2 (DES1 T-DNA로 표시)에 의해 생성된 분생포자와 유사하였다. Δdes1 결실변이체에 의해 생성된 분생 포자는 비록 DES1 T-DNA 만큼 넓어지지는 않았으나 야생형보다 상당히 짧았다 (도 4의 C). 전위 형질전환체에 의해 생성된 분생포자는 야생형의 정상적인 형태를 나타냈다 (도 4의 C). Δdes1 결실변이체는 CM 상에서의 생장률 및 콜로니 형태, 소수성 표면에 분생포자 표면 접착, 및 균사 및 부착기 형성의 발달을 포함하여 다른 진균 표현형 상의 결함은 없었다 (표 2).
실시예 5. DES1 유전자는 기주 조직의 성공적인 감염에 필요하다
분무접종 검정에서, Δdes1 결실변이체는 감수성 벼 재배품종 낙동벼에 작은 크기의 억제된 병반을 생성한 반면 야생형 및 전위 형질전환체는 감수성형의 확장성 병반을 야기했다. DES1 T-DNA의 발병 수준은 야생형 및 Δdes1의 중간이었다 (도 5의 A). 질병 정도의 차이는 병반 면적(%DLA)의 측정 시 더 극적이었다. Δdes1의 %DLA는 15±10%로, 이는 야생형 (68±20%) 및 전위 형질전환체 (61±13%)의 1/4 이하였다. DES1 T - DNA는 Δ des1에 비해 약간 높은 수준의 DLA (19±14%)를 보였다 (도 5의 B).
Δdes1 결실변이체에서 부착기 발달의 결함이 관찰되지 않았으므로, 기주 세포 내에서 감염 균사 (IH)의 발달이 절단된 엽초 접종법을 이용하여 조사되었다 (Koga et al. (2004) Mol Plant P 64: 67-72). 야생형 70-15의 IH는 활발하게 자랐으며, 접종 후 96 시간까지 최초 감염 세포에 이웃한 주변 10-20 개의 세포를 점령하였다. 그러나, Δdes1의 IH는 대개 최초 감염 세포에 제한되었으며, Δdes1의 IH 를 따라 암갈색 과립이 풍부하게 축적되어 있었다 (도 5의 C). Δdes1의 오직 소수의 IH만이 이웃 세포로 확장되었다 (도 5의 C). DES1 T-DNA는 빈약하게 생장하는 IH 및 IH를 따라 산포된 암갈색 과립을 보이는 중간적인 표현형을 나타내었다 (도 5의 C). IH의 발달은 락토페놀로 갈색 과립의 탈염 및 아닐린 블루로 IH를 염색하여 관찰하였다. 접종 48 시간 후, 야생형의 구근상 IH는 일차 감염 세포로 채워졌으며, IH는 이웃 세포로 확장되었다. 야생형에 반하여, Δdes1 및 DES1 T-DNA 결실변이체의 IH는 일차 감염 세포 내에서 붕괴되는 것으로 보이며, 매우 소수의 얇은 IH만이 이웃 세포에서 자라고 있음이 관찰되었다 (도 6의 A).
실시예 6. 식물체 방어 반응은 Δdes1 결실변이체에 의해 유도된다
미생물 유래 분자의 인지에 의해 유도된 방어 반응은 흔히 세포벽 강화, 급속한 ROS 생성 및 PR 유전자의 전사 활성화와 연관되어 있다 (Numberger et al. (2004) Immunol Rev 198: 249-266). Δdes1 결실변이체로 감염된 벼 세포는 갈색 과립의 발생 및 세포 사멸을 보이므로, 식물 방어 반응이 Δdes1의 발병 약화에 관련되어 있음이 분명하다. 따라서, 야생형 및 결실변이체를 벼에 접종하였을 때 나타나는 방어 반응이 비교되었다.
감염 부위에서의 자가형광은 페놀 복합물의 축적 및 세포벽 강화를 나타낸다 (Nicholson & Hammerschmidt (1992) Annu Rev Phytopathol 30: 369-389). 형광현미경 하에서, 야생형으로 감염된 첫 번째 벼 세포는 세포벽에서만 자가형광을 방사하 였다 (도 6의 A). 형광은 차기 감염 벼 세포 및 심지어 활발하게 생장하는 IH에 의해 점령된 세포에서는 심하게 감소하거나 없었다 (도 6의 A). 대조적으로, 강한 자가형광은 Δdes1 및 DES1 T-DNA 변이체의 IH에 의해 감염된 벼 세포에서만 뿐 아니라 진균과 접촉되지 않은 이웃 세포에서도 관찰되었다 (도 6의 A).
감염 부위에 과산화수소(H2O2)의 축적은 접종 48 시간 후에 DAB (3,3'-diaminobenzidine) 염색으로 조사되었다. 야생형 IH가 감염된 벼 세포는 DAB로 염색되지 않는 반면, Δdes1 및 DES1 T-DNA로 감염된 벼 세포는 DAB로 강하게 염색되었고, 이는 고 농도의 H2O2가 축적되어 있음을 나타낸다 (도 6의 A). 식물체 반응에 상관없이, 야생형 및 결실변이체 양자의 부착기는 DAB로 동일하게 염색되었다 (도 6의 A, DAB 염색은 화살표). 자가형광 및 H2O2 축적의 수준이 결실변이체에 의해 감염된 세포에 비해 DES1 T-DNA 결실변이체에 의해 감염된 세포에서 낮았으므로, 방어 반응의 정도는 DES1 발현 수준에 비례하는 것으로 보인다.
식물 방어 유전자가 Δdes1에 의한 감염으로 활성화 되었는지 알아보기 위해, 두 PR 유전자의 발현 양상을 정량적 RT-PCR로 분석하였다. 식물 조직에 감염되지 못하는 Map-kinase 결실변이체 (pmk1) (Xu & Hamer (1996) Genes & Development 10: 2696-2706)가 음성 대조구로 사용되었다. 야생형 분생포자로의 접종 시에 PR1a 및 PBZ1의 발현은 친화적 상호작용의 전형적인 양상을 따랐으며, 상기 유전자들의 유도는 72 hpi까지 지체되었다 (Ahn et al. (2005) Phytopathology 95: 1248- 1255). 대조적으로, PR1a 및 PBZ1의 발현은 Δdes1으로 접종에 의해 접종 후 24 및 48 시간에서 높게 발현되었다 (도 6의 B). Δdes1의 침입을 받은 벼 잎의 PR1a 및 PBZ1 발현의 유도 수준은 48 hpi에서 야생형의 침입을 받은 벼 잎에 비해 각각 104 및 19 배이었다 (도 6의 B). pmk1 결실변이체의 접종에 의해 PR1a 또는 PBZ1 유전자 발현이 약간 유도되었으나, 그 수준은 야생형의 침입을 받은 벼 잎과 비교하여 매우 낮거나 그다지 높지는 않았다 (도 6의 B). 상기 결과는 Δdes1의 침입을 받은 벼는 강한 방어 반응이 유도되어 IH 발달을 저해한다는 것을 나타낸다.
실시예 7. 식물체 ROS 발생의 억제는 Δdes1 결실변이체의 IH 발달을 복원한다
식물 NADPH 옥시다아제는 병원균 공격에 반응하여 ROS를 생성한다 (Torres et al. (2005) Nat Genet 37: 1130-1134). Δdes1 및 DES1 T-DNA 결실변이체의 병원성이 기주 식물 조직에 있어 ROS 발생에 의해 영향을 받는지 결정하기 위해, NADPH 옥시다아제의 저해제인 DPI(diphenyleneiodonium) (Morre (2002) Antioxid Redox Signal 4: 207-212)를 벼 엽초에 처리하였다. 야생형의 발병은 DPI에 의한 영향을 받지 않았으며, 부착기 매개된 침투 및 IH 발달은 성공적이었다 (도 7의 A). 그러나, Δdes1 및 DES1 T-DNA의 약화된 병원성 표현형은 DPI를 처리하여 ROS 생성이 저해된 벼 세포에서 회복됨을 관찰하였다. 0.2 M DPI의 처리는 결실변이체에 있어 IH 주변에 암갈색 과립의 감소 및 용해를 초래했다 (도 7의 A). Δdes1 결실변이체의 IH는 0.2 M DPI가 있을 때 제한되었으나, DES1 T-DNA의 IH는 일차 감염 세포를 성공적으로 점령하고, 이웃 세포로 확장되었다 (도 7의 A). 0.4 μM DPI로 처리는 갈색 과립의 생성을 완전히 저해하였으며, 양 변이체는 IH를 발달시킬 수 있었다 (도 7의 A).
식물체 방어 반응의 수준 및 IH 발달이 양파 표피조직에서 측정되었다. 정상적인 조건 (DPI 없는)에서, 야생형 부착기의 ~70%는 양파 표피조직으로 침입하였으나, 캘로오스(callose) 축적과 같은 식물 방어 반응으로 인하여 최종적으로 부착기의 ~40%가 성공적으로 IH를 발달시켰다 (도 7의 B). 대조적으로, 비록 침투율은 야생형과 유사하였으나 Δdes1 및 DES1 T-DNA의 오직 소수의 침입 부착기만이 IH를 발달시켰다 (도 7의 B). DPI (0.4 μM) 처리로 Δdes1 및 DES1 T-DNA에 의한 IH 발달의 빈도는 각각 28% 및 21%까지 회복되었다 (도 7의 B). Δdes1 및 DES1 T-DNA의 회복된 IH 모양은 야생형과 차이가 없었다. (도 7A). 벼 엽초 검정의 결과에 유사하게, 양파의 방어 반응의 수준은 DPI 농도 및 DES1 유전자의 발현 수준과 관련된 것으로 보였다. 상기 결과는 DES1 유전자가 벼 및 양파에 있어 방어 개시의 억제 (DPI의 비슷한 기작에 의해), 또는 갈색 과립 및 캘로오스(callose)의 분해에 의한 방어 반응의 극복에 관련되어 있음을 제시한다.
실시예 8. Δdes1 결실변이체는 산화적 스트레스에 과민하다
DPI가 식물의 ROS 생산을 억제하는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명에서는 DES1 유전자가 ROS 또는 진균 병원균이 식물 세포 내에서 접할 수 있는 다른 다양한 스트레스 조건을 조절하는데 필요한지 조사하였다. Δ des1 및 DES1 T - DNA 결실변이체는 1 M 소르비톨 또는 0.5 M NaCl 같은 고 농도의 osmolytes로는 균사 생장에 있어 어떠한 차이도 보이지 않았다 (자료 미제시). 그러나, Δdes1and DES1 T-DNA의 균사 생장은 산화적 스트레스 조건 하에서는 심하게 영향을 받았다 (도 8의 A). 결실변이체의 생장은 2-3 mM H2O2에서 변화하였으며, 민감도는 DES1 T-DNA에서보다 Δdes1에서 더 현저하였다. 야생형의 생장은 동일한 조건하에서 영향을 받지 않았다 (도 8의 B). 상기 결과는 DES1 유전자가 ROS 분해에 관련되어 있음을 나타낸다.
Δdes1 및 DES1 T-DNA의 분생포자 형태가 변했으므로, 산화적 스트레스 및 감소된 발병에 대한 과민감도는, 삼투 스트레스에 대한 내성에도 불구하고 세포벽 조성에 있어서의 결함으로 인한 것일 수 있다. 상기 가능성을 조사하기 위해, 본 발명에서는 발아하는 분생포자에 키틴 신세타아제(chitin synthetase) 저해제인 니코마이신 Z(Nikkomycin Z)을 처리하였다. 니코마이신 Z의 처리는 분생포자 발아를 방해하며, 세포벽 결함 균주에 원형질체 같은 융기부를 유도한다 (Odenbach et al. (2007) Mol Microbiol 64: 293-307). 그러나, Δdes1 및 DES1 T-DNA에 있어 분생포자 발아는 고 농도의 니코마이신 Z (100 μM)으로 저해되지 않았으며, 균사 상의 융기부는 야생형과 차이가 없었다. 본 발명에서는 또한 세포벽 분해효소에 대한 상기 균주의 민감도를 검정하였다. Δdes1 및 DES1 T-DNA의 효소 처리된 균사는 시간 경과에 따라 관찰 시 야생형에서보다 유사한 정도로 원형질을 방출했다. 본 발명에서는 또한 각각 키틴 및 β-1,4-글루칸을 결합함으로써 진균 세포벽 조립을 방해하는 CFW(Calcofluor white) 및 CR(Congo Red)이 포함된 배지 상에서 균사 생장을 검정하였다 (Ram et al. (1994) Yeast 10: 1019-1030; Wood & Fulcher (1983) J Histochem Cytochem 31: 823-826). CFW 배지 (100 ppm) 상에서 Δdes1의 균사 생장은 정상 CM (야생형의 96%)에 비교 시 약간 감소 (야생형의 88%)되었으며, CR 배지 (100 ppm) 상에서는 더 심하게 감소되었다 (야생형의 70% ). 그러나, 분해 훈륜(halo)이 야생형 콜로니 주변에서 관찰되었고, Δdes1 콜로니 주변에서는 분해 훈륜(halo)이 관찰되지 않았으므로 (도 9의 A), CR 배지 상에서의 생장 결함은 세포벽 조성에 있어서의 결함이라기보다는 CR-분해 활성의 부재에 기인한 것으로 여겨졌다. DES1 T-DNA 콜로니는 중간 수준의 CR 탈색을 보였다 (도 9의 A).
실시예 9. DES1 유전자는 세포 외 퍼옥시다아제 (peroxidase)의 활성에 관여한다.
탈색된 훈륜(halo)이 콜로니 가장자리 외부에까지 관찰되었으므로, 세포 외 효소가 CR 분해에 관련되어 있을 것으로 추정되었다.
CR 분해 반응은 H2O2를 기질로 사용하는 퍼옥시다아제(peroxidase)에 의해 촉매되는 것으로 알려졌으므로 (Cripps et al. (1990) Appl Environ Microbiol 56: 1114-1118; Woo et al. (2003) J Microbiol Biotechn 13: 773-777), 본 발명에서는 마그나포르테 오리자 있어 CR 탈색에 미치는 H2O2의 영향을 검정하였다. 탈색된 훈륜(halo)의 크기는 CR 배지에 1 mM H2O2의 첨가 시 야생형 주변에서 상당히 증가되었다. Δdes1 결실변이체에서는 H2O2 처리에 상관없이 색상 변화가 관찰되지 않았다 (자료 미제시). H2O2의 제거 및 및 CR의 탈색에 있어 Δdes1이 결함을 나타낸 것을 고려할 때, 본 발명자는 DES1 유전자가 관련 세포외 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성에 관여한다고 추론하였다. 기질로서 ABTS (2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate, Sigma, A1888)를 사용한 효소 활성 분석은 Δdes1 결실변이체가 세포 외 배양 여과액에서 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성을 완전히 상실한 것으로 보였다 (도 9의 B). DES1 T-DNA의 배양 여과액은 매우 낮은 수준의 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성을 보였다 (도 9의 B). 더욱이, H2O2 가 없는 ABTS 산화 검정은 Δdes1 및 DES1 T-DNA의 배양 여과물에 있어 라카아제(laccase) 활성 또한 감소된 것으로 나타났다 (도 9의 C). 본 발명에서는 Δdes1, DES1 T-DNA, 및 야생형의 배양 여과물에 있어 또 다른 세포 외 효소 자일로시다아제(xylosidase)의 활성 또한 비교하였다. 그러나, 결실변이 균주의 자일로시다아제(xylosidase) 활성은 야생형과 다르지 않았다 (자료 미제시).
실시예 10. DES1 의 결실은 몇 그룹의 퍼옥시다아제(peroxidase) 유전자의 발현에 양향을 미친다.
본 발명에서는 퍼옥시다아제(peroxidase)를 코딩하는 유전자의 전사 조절을 조사하였다. 퍼옥시다아제를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자가 마그나포르테 오리자 게놈 데이터베이스로부터 동정되었다. 여기에는 IPR010255 (haem peroxidase), IPR000889 (glutathione peroxidase), 및 IPR000028 (chloroperoxidase)를 포함하여 19 개의 퍼옥시다아제 관련 InterPro 도메인을 가지는 유전자가 있었다. 19 개의 유전자 중 3 개는 전사체가 주어진 실험 조건 하에서 검출되지 않았으므로 배제되었다. 마그나포르테 오리자의 16 개의 퍼옥시다아제로 추정되는 유전자는 계통분석에 의해 3 개의 집단(clades)으로 분류될 수 있었으며, 이의 대부분은 SignalP 프로그램으로 추정 시 신호 펩티드를 소유하였다 (도 10). 산화적 (1 mM H2O2) 또는 정상적인 (H2O2 없음) 조건 하에서 야생형 및 Δdes1 결실변이체 간에 퍼옥시다아제 유전자의 전사의 차이는 정량적 RT-PCR을 이용하여 조사되었다. 집단(clade) 1 (plant ascorbate peroxidases: MGG04545, MGG10368, MGG08200, 및 MGG09398; fungal lignin peroxidase: MGG07790)에 있어 일부 퍼옥시다아제의 유전자 발현 수준은 야생형에 있어 산화적 조건 하에서 상향 조절되었다 (도 10). MGG07790, MGG08200, 및 MGG09398의 발현은 Δdes1 결실변이체에서 억제되었으며, H2O2 처리 조건에서도 유도되지 않았다. MGG10368 및 MGG04545의 발현은 Δdes1 결실변이체에서 또한 억제되었으나, H2O2에 의해 유도되었다 (도 10). 집 단(clade) 1 (catalase peroxidase: MGG04337 및 MGG09834; haem peroxidase: MGGG00461 및 MGG10877)에 속하는 다른 퍼옥시다아제 유전자의 발현 수준은 DES1 유전자의 결실에 의해 크게 변하지 않았다. 집단(clade) 2 (chloroperoxidase:MGG07574, MGG11849, MGG07871, 및 MGG07574)의 퍼옥시다아제 유전자는 H2O2 처리에 반응하였으나, Δdes1 결실변이체에서의 발현은 하향 조절되지 않았다. 집단(clade) 3의 (cytochrome P450 peroxidase: MGG10859 및 MGG13239; glutathione peroxidase: MGG07460) 퍼옥시다아제 유전자는 실험 조건 하에서 H2O2에 반응하지 않았으나, Δdes1에서 발현은 하향 조절되었다 (도 10). 마그나포르테 오리자의 게놈 데이터베이스로부터 멀티카파 옥시다아제(Munticupper oxidase) 도메인을 가지는 열일곱 개의 라카아제가 동정되었다. 이 중 하나의 라카아제 유전자는 주어진 실험 조건에서 발현되지 않았기 때문에 본 발명에서는 더 이상 취급하지 않았다. 퍼옥시다아제의 경우와 유사하게, 대부분의 라카아제 유전자들의 발현은 Δdes1 결실변이체에서 급격히 감소하였으며, 산화조건에서 이들 유전자들의 발현은 정상조건에 비해 유사하거나 오히려 줄어드는 양상을 나타내었다.
실시예 11. DES1 유전자는 금속 이온의 조절에 필요하다.
DES1 유전자에는 DNA 결합 도메인이 없으므로, DES1이 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 라카아제(laccase)를 코딩하는 유전자의 직접적인 전사 조절자로서의 역할이 어려울 것으로 생각되었다. 따라서, 본 발명에서는 Δdes1 결실변이 체가 퍼옥시다아제 및 라카아제를 포함하여 금속 핵을 함유하는 효소의 발현 및 활성에 영향을 미칠 수 있는 금속 이온 조절에 결함을 보이는지 조사하였다. 상기 가설을 검정하기 위해, 철 이온에 특이적으로 결합하여 발색 반응을 나타내는 킬레이터 (chelator) 인 BPS (bathophenanthroline sulfonate, Sigma, B1375)가 세포 외 철 이온 검출에 사용되었다. 완전배지 (CM)는 ~25 μM 철 이온을 함유하므로, 본 발명에서는 분광광도계 측정를 위한 음성 대조구로서 미량원소가 없는 CM이 사용되었다. BPS 색 반응은 야생형 배양 여과액에서보다 Δdes1 배양 여과액에서 더 강하였으며, DES1 T-DNA 배양 여과액에서는 중간색이었다. 상기 결과는 DES1이 금속 이온의 흡수 또는 저장에 관련되어 있음을 제시한다.
실시예 12. DES1 단백질의 세포 내 위치
DES1 단백질이 표적으로 하는 세포 내 인자를 동정하기 위해, DES1 유전자의 C 말단에 형광 리포터 유전자 (eGFP)가 융합되었다. 자체 프로모터 (~1.2 kb)를 사용한 GFP 관찰이 성공적이지 못하였으므로 (자료 미제시), 본 발명에서는 지속적 발현을 하는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) TrpC 프로모터가 사용되었다. DES1-eGFP 융합 구축물 및 제네티신(geneticin) 저항성 유전자를 포함하는 플라스미드(pII99)가 동시 형질전환에 의해 야생형 원형질체에 도입되었다. DES1-eGFP 융합 단백질의 표적은 상기 형질전환체의 분생포자 및 생장 균사의 액포였다 (도 11). 액포 표시 염료 CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)를 사용한 형광 신호의 공동 위치로 DES1-eGFP 융합 단백질의 액포 내 위치가 확인되었다 (도 11). 동일한 프로모터를 사용한 단일 eGFP 녹색 형광 단백질은 세포질내로 표지되었다 (도 11).
실시예 13. DES1 유전자의 발현 프로파일
진균 발달 중에 DES1의 전사가 정량적 RT-PCR을 사용하여 분석되었다. 발달 단계 중에 안정된 발현을 보이는 사이클로피린-코딩 유전자 (CYP1, MGG10447) (Kim et al., 미발표 자료)가 표준화를 위한 내재 유전자 대조구로 사용되었다. DES1 유전자의 전사체는 식물체 내(in planta)에서 분생포자 형성 및 감염성 생장 중 2 배 이상 증가하였다. 발현 수준은 분생포자 발아 및 부착기 형성을 포함한 조건 하에서 크게 변하지 않았다. DES1의 발현은 1 mM H2O2 처리에 의해 2.8 배 상향 조절되었다.
도 1은 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) T-DNA 결실변이체 ATMT0144A2가 병반 발달 및 분생포자 형태에 있어 결함을 보임을 보여준다. (A)는 야생형 균주 70-15 (좌측) 및 ATMT0144A2 (우측)로 접종된 벼 유묘 (낙동벼). 발병된 잎은 분생포자 현탁액 (1 x 105 분생포자/㎖)으로 분무접종 후 7일째 수확되었다. (B)는 70-15 (상부) 및 ATMT0144A2 (하부)에 의해 생성된 분생포자의 광학현미경 사진. 막대 = 20 ㎛. (C)는 야생형 및 ATMT0144A2의 분생포자 크기. 값은 각 균주의 100 개 이상의 분생포자로부터 Axiovision 이미지 분석기를 사용하여 측정된 평균±표준편차이다. 길이는 분생포자의 기저부터 정단까지의 거리이다. 폭은 가장 긴 격벽의 크기이다.
도 2는 MGG04163의 프로모터 구간에 비정상적인 T-DNA가 삽입된 것을 나타낸다. (A)는 ATMT0144A2의 서던 탁본 분석 결과이다. 총 게놈 DNA는 BglII로 절단되어, HpaI-절단된 HPH 단편으로 프로빙되었다. (B)는 ATMT0144A2에 있어 T-DNA의 도해이다. T-DNA 삽입 의 확인에 특이 프라이머(작은 화살표)가 사용되었으며, 벡터 부위 (빗금친 상자) 및 미지의 구간 (점선)이 표시되었다. T-DNA 삽입 지점은 MGG04163 개시 코돈으로부터 -750이다. (C)는 T-DNA 연결 부위의 서열이다. T-DNA (대문자) 및 마그나포르테 오리자 게놈 (소문자) 간 연결 부위의 서열을 표시하였다. 전형적인 우측 절단 부위 (흰색의 화살표), micro-상동 구간 (볼드체), 및 filler DNA (회색)를 표시하였다. (D)는 F1 자손에서 분생포자의 형태와 T-DNA가 함께 유전됨을 보여준다. ATMT0144A2 x 70-6 간의 교배에서 임의로 선발된 F1 자손에 의해 생성된 7일 된 분생포자를 광학현미경 하에서 관찰하고, 200 ppm 하이그로마이신 B를 함유하는 TB3 배지 상에서 조사하였다. 막대 = 10 ㎛. (E)는 ATMT0144A2에 있어 MGG04163의 전사 발현을 보여준다. MGG04163의 전사 수준은 3일 된 액체 배양물에서 야생형 및 ATMT0144A2의 균사를 사용하여 정량적 RT-PCR에 의해 분석되었다.
도 3은 DES1 상동체의 계통분석 결과을 보여준다. DES1 상동체들은 강(Class) 수준에서 분류학적 분포에 따라 분명한 계통학적 군(clades)을 이룬다. S, Sordariomycetes; D, Dothideomycetes; E, Eurotiomycetes; L, Leotiomycetes.
도 4는 마그나포르테 오리자 있어 DES1 결실변이체의 생성 모식도이다. (A)는 이중교차에 의해 DES1 ORF가 대체된 HPH 카세트를 지닌 DES1 결실 벡터 (4.5 kb)이다. 플랭킹 게놈 구간 (흰색의 상자) 및 BglII 제한 효소 부위가 표시되었다. (B)는 서던 탁본법 분석 결과이다. 총 게놈 DNA는 BamHI로 절단되어, 블럿은 패널 A에 표시된 3' 플랭킹 구간의 DNA 단편으로 프로빙되었다. Lane 1, 70-15 (야생형); Lane 2, Δdes1; Lane 3, E41 (전위 형질전환체). (C)는 균주 별 분생포자의 크기를 보여준다. 값은 각 균주 별로 Axiovision 이미지 분석기를 사용하여 측정된 분생포자 100 개 이상의 평균±표준편차이다.
도 5는 기주 조직에 있어 병원성 감소 및 생장 결함이 DES1의 결실로 야기되었음을 보여준다. (A)는 병원성 분석 결과를 보여준다. 각 균주의 분생포자 현탁액 (1 x 105 분생포자/㎖) 5 ㎖가 벼 유묘 (낙동벼)에 분무접종 되었다. 발병된 잎은 접종 7일 후에 수확되었다. (B)는 각 균주 별 질병의 정도를 보여준다. Axiovision 이미지 분석기를 사용하여 계산된 발병된 잎 면적의 퍼센트로 평가되었다. 값은 각 균주에 의해 접종된 벼 잎 8 개의 평균±표준편차이다. (C)는 감염성 생장을 보여준다. 5 주 된 벼 유묘 (낙동벼)으로부터 절단된 벼 엽초가 분생포자 현탁액 (각 균주의 1 x 104 분생포자/㎖)으로 접종되었다. 감염성 생장이 접종 96 시간 후에 관찰되었다. 막대 = 50 ㎛.
도 6은 DES1의 결실이 강력한 식물 방어 반응을 유도하였음을 보여준다. (A)는 감염된 벼 엽초 (낙동벼)의 접종 48 시간 후의 DIC 및 형광 현미경 사진이다. DIC 이미지는 DIC 필터를 사용하여 투과광의 80-ms 노출로 촬영되었다. 형광 이미지는 GFP 필터를 사용하여 흡수광에 대해 500-ms 노출로 촬영되었다. 막대 = 30 ㎛. (B)는 접종 후 시간 경과에 따른 벼 병원성 관련(pathogenesis-related, PR) 유전자의 발현을 보여준다. 감염된 벼에 있어 PR1a 및 PBZ1의 전사는 정량적 RT-PCR을 사용하여 분석되었다.
도 7 은 ROS 발생의 저해로 Δdes1 결실변이체의 감염성 생장이 복구되었음을 보여준다. (A) 절단된 벼 (낙동벼) 엽초가 DMSO에 용해된 서로 다른 농도의 diphenyleneiodonium (DPI)를 포함하는 70-15, Δdes1, 또는 DES1 T-DNA의 분생포자 현탁액 (1 x 104 분생포자/㎖)으로 접종되었다. 시료는 접종 48 시간 후에 수확 및 관찰되었다. 막대 = 50 ㎛. (B)는 DPI 처리된 양파 표피조직에서 70-15, Δdes1, 및 DES1 T-DNA의 부착기 를 통한 침투 및 감염 균사 발달의 퍼센트를 보여준다. 부착기의 총 수는 각 막대의 상부에 표시되었다. IH 발달의 수준은 접종 72 시간 후에 세었다 (실시예 참조).
도 8은 Δdes1 결실변이체가 산화적 스트레스에 과민함을 보여준다. (A)는 접종 4일 후에 2-3 mM H2O2가 함유된 또는 함유되지 않은 완전 아가 배지 상의 균사 콜로니를 보여준다. (B)는 접종 7일 후에 H2O2 (1-5 mM)가 함유된 또는 함유되지 않은 완전 아가 배지 상의 균사 생장을 보여준다. 콜로니 직경은 4 회 반복 측정되었다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다.
도 9는 DES1이 세포외 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 라카아제(laccase)의 활성에 관련되어 있음을 보여준다. (A)는 염료 최종 농도 100 ppm을 함유하는 배지에서 콩고 레드의 탈색이 관찰된 것이다. 균주는 콩고 레드를 함유하는 CM 아가 배지에 접종되어, 4일째에 탈색이 관찰되었다. 좌측 막대: 야생형, 중간 막대: DES1 T-DNA, 우측 막대: Δdes1. (B)는 H2O2가 첨가된 조건 (실시예 참조)에서 ABTS 산화 점검에 의해 측정된 퍼옥시다아제(peroxidase)의 활성을 보여준다. 흑색 막대: 야생형, 회색 막대: DES1 T-DNA, 흰색 막대: Δdes1. (C)는 H2O2 없이 ABTS 산화 점검에 의해 측정된 라카아제(laccase) 활성을 보여준다. 흑색 막대: 야생형, 회색 막대: DES1 T-DNA, 흰색 막대: Δdes1. 에러 바는 표준편차를 나타낸다.
도 10은 Δ des1 결실변이체에서 마그나포르테 오리자 퍼옥시다아제 (peroxidase)의 발현 프로파일을 보여준다. 계통수, 발현 특성, 및 마그나포르테 오리자 게놈의 16 개의 퍼옥시다아제의 도메인 구성을 조합한 것이다. 계통수는 ClustalW를 이용하여 1000 회의 bootstrappings으로 생성되었으며, 3 개의 군(clades)으로 나뉘어졌다. 산화적 조건 및/또는 Δdes1 결실변이체에서 퍼옥시다아제의 전사체 수준이 표시되었다. 퍼옥시다아제 유전자에 해당되는 InterPro 용어가 표시되어 있다.
도 11은 DES1p-eGFP가 액포에 위치함을 보여준다. (A)는 DES1p-eGFP를 발현하는 균사 및 분생포자를 슬라이드글라스 상의 Czapek-Dox 배지에서 관찰한 것이다. 우측의 통합 이미지에서, CMAC의 색은 적색으로 바뀌었고, 동 위치의 반점들은 황색으로 표시되었다. 막대 = 10 μm. (B)는 TrpC프로모터에 의해 발현되는 단독 eGFP를 발현하는 균사 및 분생포자를 (A)와 동일한 조건 하에서 관찰한 것이다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Novel pathogenicity gene in blast fungus to suppress basal <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1287 <212> PRT <213> Magnaporthe oryzae DES1 protein <400> 1 Met Leu Gly Lys Leu Phe Asn Leu Thr Ala Gly Asn Asn Gly Asp Asp 1 5 10 15 Ala Thr Gly Ala Gln Asp Gln Ser Ser Thr Ser Pro Ser Gln Leu Ile 20 25 30 Ser Thr Leu Glu Ser Val Gln Glu Asp Ile His Thr Arg Asn Leu Leu 35 40 45 Phe Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Gln His Arg Asn Asp Gln Val Phe 50 55 60 Pro Leu Ser Ala Gly Pro Ala Leu Pro Ser Thr Ser Thr Ala Val Asn 65 70 75 80 Ser Phe Asp Tyr Asp Cys Asp Val Phe Leu Asp Ala Gln Asp Val Arg 85 90 95 Val Leu Ile Met Gln Asp Ala Leu Ser Ala Lys Pro Ala Ala Leu Ile 100 105 110 Tyr Asp Ser Arg Pro Arg Pro Pro Pro Thr Ser Pro Val Ser Asp Arg 115 120 125 Pro Asp Arg Pro Pro Ser Val Ala Gly Phe Ala Thr Gly Pro Pro Pro 130 135 140 Asp Val Arg Arg Gly Pro Val Ser Pro Arg Lys Ser Ser Met Ser Gln 145 150 155 160 Gly Ser Arg Pro Gly Asn Met Thr Gln Asp Gly Ser Gln Pro Gln Arg 165 170 175 Gln Ser Ala Phe Asp Arg Arg Ala Ser Met His Gly Arg Thr Gln Pro 180 185 190 Arg Ile Glu Ser Asp Thr Gln Arg Ala Asn Arg Glu Tyr Ala Asp Glu 195 200 205 Ile Asn Val Phe Ser Ser Cys Ile Phe Gly Asn Ser Glu Leu Met Ala 210 215 220 Tyr Lys Gly Thr Ser Thr Lys Val His Val Val Pro Thr Asp Gly Arg 225 230 235 240 Asn Glu Ser Ser Ala Ser Phe Phe Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Gly 245 250 255 Arg Ala Ser Met Arg Ser Ser Lys Leu Ser Gln Ser Phe Ser Ser Glu 260 265 270 Ala Val Gly Asp Phe Met Pro Gln Met Ser Ser Ser Ala Leu Pro Arg 275 280 285 Thr Pro Gln Arg Lys Lys Val Leu Ile Thr Arg Leu Phe Pro Val Thr 290 295 300 Leu Pro Ser Asp Glu Ala Ser Asp Leu Pro Ile Thr Thr Pro Ser Ser 305 310 315 320 Arg Phe Ser Glu Asp Ser Ala Gly Gly Phe Pro Phe Pro Gln Asp Gly 325 330 335 Glu Asp Gly Lys Ala Lys Met Lys Arg Pro Gln Pro Lys Gln Lys Arg 340 345 350 Thr Pro Met Tyr Ala Val Ala Leu Val Ile Asn Leu Pro Gln Pro Thr 355 360 365 Gly Gly Asn Gly Asn Gly Val Ser Val Ser Ala Ser Arg Gln Gly Val 370 375 380 Phe Arg Gly Ser Ser Ser Tyr Asn Glu Asn Glu Ser Phe Pro Ser Ser 385 390 395 400 Phe Ser Ser Ala Arg Arg Ser Gly Trp Thr Met Val Gly Gln Ala Ala 405 410 415 Ala Ile Asp Ser Phe Glu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Ile Glu Asp Arg 420 425 430 Ile Asp Pro Ile Thr Gln His Trp Asp Ile Ile Met Arg Thr Leu Thr 435 440 445 His Leu Gln Ser Val Val Ala Thr Lys Leu Ser Ser Met Leu Arg Gln 450 455 460 His Asp Ile Gly Ser Pro Asp Gln Ile Pro Ser Ser Leu Asn Ser Gln 465 470 475 480 Leu Ser Arg Arg Pro Ser Val Ser Arg Arg Arg Ser Asp Asp Gly Ala 485 490 495 Ser Thr Lys Ala Pro Lys Met Asn Ala Arg Tyr Leu Thr Leu His Pro 500 505 510 Asn Cys Leu Met Asp Asn His Glu Val Thr Arg Glu Ile Glu Ile Ala 515 520 525 Gln Ala Arg Ile Val Ala Gly Leu Arg Ala Thr Arg Val Val Thr Gly 530 535 540 Gln Asn Arg Trp Gly Ile Trp Arg Glu Glu Ala Arg Trp Val Ala Arg 545 550 555 560 Trp Ala Gly Val Lys Asp Gln Gly Leu Phe Phe His Ser Leu Leu Thr 565 570 575 Gly Tyr Leu Ala Thr His Thr Asp Trp Leu Gln Ala Leu Gly Pro Ser 580 585 590 Phe His Arg Lys Arg His Gln Glu Gln Ala Arg Ala Arg Gly Asp Glu 595 600 605 Asp Met Ser Leu Pro Ala Arg Thr Val Ile Val Ala Arg Asp Lys Met 610 615 620 Ala Ala Arg Arg Leu Val Phe Leu Leu Ala Ala Phe Leu Pro Ala Asn 625 630 635 640 Gln Gln Leu Pro Ile Ser Met Arg Ala His Arg Pro Ser Thr Ser Ala 645 650 655 Ser Phe Gly Gly Pro Phe Ser His Ser Pro Pro Thr Tyr Ala Val Pro 660 665 670 Ile Leu Lys Glu Glu Ser Leu Arg Arg Lys Ile Asn Arg Arg Thr Ala 675 680 685 Pro Arg Arg Leu Ser His Ser Arg Thr Val Ser Leu Gln Ala Gln Pro 690 695 700 Pro Thr Arg Ser Ser Gly Leu Pro Ser Gln Leu Ala His Leu Ser Met 705 710 715 720 Glu Arg Gly His Glu Arg Arg Pro Ser Asp Ala Thr Ser Ile Arg Thr 725 730 735 Thr Tyr Leu Pro Ile Ser Thr Ser Asp Ser Gln Asn Arg Lys Ser Ser 740 745 750 Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ile Thr Pro Glu Ala Thr Ile Pro His Phe 755 760 765 Ala Thr Leu Gln Arg Gln Glu Ser Leu Ser Ser Arg Arg Pro Gly Ser 770 775 780 Ala Ser Ser Thr Ala Ala Asp Asp Leu Lys Arg Thr Leu Gln Arg 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Pro 995 1000 1005 Gly Gly Ser Gly Leu Glu Leu Phe Glu Gln Thr Ser Arg Ile Ala Ala 1010 1015 1020 Asp Gly Asp Gln Pro Phe Asn Val Ala Gly Trp Leu Gln Gln Tyr His 1025 1030 1035 1040 Pro Asp Phe Ile Leu Gln Ala Ile Pro Pro Gln Glu Asp Leu Ile Glu 1045 1050 1055 Gln Val Lys Ala Ser Leu Arg Ala Glu Pro Ser Pro Pro Val Leu Tyr 1060 1065 1070 Ser Pro Tyr His Pro Met Ser Ala Glu Ala Gln Gln Gln Glu Arg Trp 1075 1080 1085 Leu Asp Val Ser Ser Val Ile Val Ala Asp Thr Thr Ser Phe Ser Ile 1090 1095 1100 Gln Arg Ile Arg Tyr Arg Arg Leu Val Lys Leu Lys Pro Phe Gln Asp 1105 1110 1115 1120 Leu Ser Ala Gly Ala Leu Leu Thr Thr Ser Ser Val Asn Thr His Ser 1125 1130 1135 Pro Pro Val Ala Leu Leu Thr Pro Ala Val Thr Pro Tyr Glu Thr Lys 1140 1145 1150 Leu Glu Glu Glu Phe Ile Ile Glu Pro Ile Val Thr Leu Asp Asp Val 1155 1160 1165 Leu Val Glu Ala Val Glu Arg Val Val Gly His Val Gly Leu Asp Ser 1170 1175 1180 Thr Ser Ser Ser Arg Ser Thr Ser Lys Arg Arg Glu Arg Ser Asn Ser 1185 1190 1195 1200 Asp Thr Ala Pro Ser Gly Glu Ala Thr Ser Ala Ile Arg His Val Ala 1205 1210 1215 Met Pro Val Gly Arg Ala Pro Lys Ala Leu Gln Glu Val Pro Arg Ala 1220 1225 1230 Glu Cys Lys Met Val Ile Leu Ser Ala Leu Glu Glu Val Ile Lys Glu 1235 1240 1245 Val Val Glu Arg Arg Asp Arg Glu His Arg Glu Met Asp Asn Asp Glu 1250 1255 1260 His Arg Glu Lys Glu Ser Glu Leu Thr Val Ala Val Arg Gly Trp Leu 1265 1270 1275 1280 Glu Ser Val Glu Met Gly Glu 1285 <210> 2 <211> 3864 <212> DNA <213> Magnaporthe oryzae DES1 nucleotide <400> 2 atgctcggga agcttttcaa cctgacggcc ggcaacaatg gcgacgacgc cacaggtgca 60 caggatcaaa gctcaacatc tccctcacag ctgatttcaa ccctcgagtc cgtccaggag 120 gacatacata cccgcaactt gctattcccc gacgccgagt ctctgtttca gcaccgcaac 180 gatcaggtct ttccactttc ggccggtcca gctcttccgt cgacgtcgac cgctgtcaac 240 tcttttgact atgactgcga cgtcttcctt gatgctcaag atgtccgcgt cctcatcatg 300 caggatgccc tcagtgctaa gcctgctgcg ctgatctacg acagccgccc gcgtccaccg 360 cccaccagcc cagtgtcgga tcgcccagac aggcctcctt ccgtggctgg gttcgccacg 420 ggtccaccac cggatgtacg acgcgggcct gtgtccccga ggaagtctag catgagtcag 480 ggttcccggc ctggaaacat gacgcaggat ggctcgcaac cgcaacggca gagcgccttt 540 gaccggaggg cgtccatgca cggccgcact cagccgcgca tcgagtcaga tacgcaacgt 600 gcgaaccgcg agtatgccga tgagatcaac gtcttctcga gttgcatctt tggaaactcg 660 gagctaatgg cctacaaagg cacatccacc aaggtccatg tggttccgac tgatggtcgc 720 aatgaatctt ctgcctcatt cttcggcgac gggaggggat ccctaggcag ggccagcatg 780 cgatcctcca agctgtcgca gtctttttct tcggaggcgg tgggggattt tatgccacag 840 atgtcatcga gtgcgctgcc tcgcactcca caacggaaga aggttctcat tacgcggctg 900 ttccccgtga ccttgccaag cgacgaagca agcgaccttc cgataacgac accgagcagt 960 cgattctcgg aggacagtgc cggaggattc ccattcccgc aagacggcga ggatggcaag 1020 gcgaaaatga agagaccaca gccgaagcag aagcgtacgc ccatgtatgc cgtggctctg 1080 gttataaatc ttccccaacc cactggcggg aacggaaatg gtgtctcggt ttcggcctcc 1140 aggcagggag tttttcgtgg gtcgagctca tacaacgaaa acgaatcgtt tccatcttct 1200 ttctcctctg cgcgtcgctc tggctggaca atggtcgggc aggctgcggc catcgactct 1260 ttcgagtcgg catacgtggg tgacatcgag gaccgcatcg accctataac gcagcactgg 1320 gatatcatca tgcggaccct cacacacctc caatcggtgg tagccaccaa gctctccagc 1380 atgttgagac aacatgatat tggatcccct gatcagatac cgtcgtccct gaactcgcaa 1440 ctatcacgac gaccgtcggt ctccaggcgg aggagcgatg atggggcgtc cacgaaagcc 1500 cccaaaatga acgcaaggta cctgactctc cacccaaact gcttaatgga caaccacgaa 1560 gtcactcgtg agatcgagat tgcacaagcg cgcatcgttg ctggcctacg ggccacgcga 1620 gtcgtcacgg gacaaaatcg ctggggaatc tggcgcgagg aggcaagatg ggtggcaagg 1680 tgggctgggg tcaaagatca aggacttttc ttccacagcc tcctcacagg atatcttgcc 1740 acgcacacag actggctaca ggcgcttggt ccgtctttcc accgaaagcg gcaccaagaa 1800 caggcgaggg ctcgcggcga tgaagacatg tctcttccgg ctcgcaccgt gattgttgcc 1860 cgagacaaga tggccgcaag gaggctggtc ttcctccttg ctgcgtttct acctgccaat 1920 cagcaattgc ccatcagcat gcgtgcacat cgaccgagta catctgcctc ttttggtggc 1980 cccttctcgc attctcctcc gacctatgcc gttccgatcc tgaaggaaga gtccctcaga 2040 cggaagatta atcgccgtac agcaccgagg cgattgtcac actctcgaac cgtcagccta 2100 caggcacaac ctccgacccg 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gtacatcacg tctttcgaaa ctgctattag ttcaccctca 3000 agcagtggct acctttcaac acctggaggc agcggactag aactttttga acaaaccagc 3060 cgcatcgctg ccgatggtga tcagccgttc aacgttgcgg gttggctcca acaataccat 3120 ccagacttca tactacaggc cataccacca caagaagact tgattgagca agtcaaagct 3180 tctctcaggg cggagccttc gccgccagtc ctgtactcac cataccatcc catgtcagca 3240 gaagcacagc agcaggaacg gtggctggat gtcagcagtg tcattgttgc agacactacg 3300 agcttctcca tacagagaat tcgataccga cgtcttgtca agctgaagcc atttcaagac 3360 ctctccgctg gggccctact taccacatcg tcggtcaaca cccatagccc acctgtagct 3420 ctgctcaccc cagccgttac cccgtacgag accaagttgg aagaagagtt catcatagag 3480 cctatcgtca cgctggacga cgtcctagtt gaggccgtcg agcgggtagt cggccacgtc 3540 ggcctagact cgacaagctc ctctcgctcc acgagcaaac gccgtgagcg gagtaacagc 3600 gacaccgcac cctcgggcga ggccacttcg gcgatacgcc atgtggccat gccggtcggc 3660 cgcgccccta aggccttgca ggaggtacct cgcgcagaat gcaagatggt catactttcg 3720 gcgctcgagg aggtgatcaa ggaggtagtt gagcggcgtg acagggagca tcgtgagatg 3780 gacaacgacg agcatcgcga aaaggagagc gagctcacag tcgccgtcag aggctggttg 3840 gagagtgtcg agatgggaga atga 3864 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4163TF primer <400> 3 gagcgagcga gtatgatgta g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4163TR primer <400> 4 caagttgcgg gtatgtatgt c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB3 primer <400> 5 cccttcccaa cagttgcgca 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB3 primer <400> 6 gaattaattc ggcgttaatt cagt 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV1 primer <400> 7 actagaaccg gagacattac g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1KOSF primer <400> 8 tcctgttcgt ctttacctga g 21 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1KO5R primer <400> 9 gttttggtgg ctggcttacg cacaggtaca cttgtttaga 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1KO3F primer <400> 10 ccttcaatat catcttctgt cgaaatgggg acgagcagtt 40 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1KOSR primer <400> 11 acctagctgc tgacaaatcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1KO5F primer <400> 12 gagtgcaggc ttgatttctt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1KO3R primer <400> 13 tcccagcgag tagtcaagtg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPHF primer <400> 14 ttccggaagt gcttgacatt 20 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrpC 360R primer <400> 15 acactagtat gcttgggtag aataggtaag tcagattga 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrpC 360F primer <400> 16 acatcgatag aagatgacat tgaaggagca ctttttggg 39 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP 720R primer <400> 17 acgcggccgc ttacttgtac agctcgtcca tgccg 35 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP 720F primer <400> 18 actctagaat ggtgagcaag ggcgagg 27 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1_3864R primer <400> 19 actctagatt ctcccatctc gacactctcc aac 33 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES1_3864F primer <400> 20 acactagtat gctcgggaag cttttcaacc tg 32

Claims (14)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 마그나포르테 오리자 (Magnaporthe oryzae) 유래의 DES1 단백질.
  2. 제1항의 DES1 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 기주세포.
  6. DES1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 DES1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 결실변이체.
  8. DES1 유전자 결실변이체를 포함하는, 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 DES1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 DES1 유전자 결실변이체는 T-DNA 삽입 변이체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. DES1 유전자 결실변이체를 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 DES1 유전자 결실변이체는 T-DNA 삽입 결실변이체인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  13. 제11항의 재조합 벡터로 형질전환된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae).
  14. 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    마그나포르테 오리자 내의 DES1 발현을 측정하는 단계를 포함하는 벼 도열병 방제 물질의 스크리닝 방법.
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