KR101090683B1

KR101090683B1 - ＭｏＬＨＳ1 유전자가 결실된 마그나포르테 오리자 결실변이체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101090683B1
Application number: KR1020090014402A
Authority: KR
Inventors: 이용환; 이미화; 지명환; 박숙영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-02-20
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2011-12-08
Also published as: KR20100095224A

Abstract

본 발명은 MoLHS1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체, MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물, MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스 및 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 및 마그나포르테 오리자의 MoLHS1 발현을 측정하여 벼 도열병 방제 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

소포체 샤페론, MoLHS1, 마그나포르테 오리자, 도열병, 병원성

Description

ＭｏＬＨＳ1 유전자가 결실된 마그나포르테 오리자 결실변이체 및 이의 용도{Magnaporthe oryzae mutant in which MoLHS1 gene is deleted and use thereof}

본 발명은 MoLHS1 유전자가 결실된 마그나포르테 오리자 결실변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 MoLHS1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체, MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물, MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스 및 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 균주 및 마그나포르테 오리자의 MoLHS1 발현을 측정하여 벼 도열병 방제 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

도열병은 전세계적으로 벼 생산성에 가장 심각한 생물적 위협이며, 식물-병원균 간 상호작용의 연구를 위한 우수한 모델이다. 벼 및 진균성 병원균 마그나포르테 오리자( Magnaporthe oryzae) 양자의 전 게놈 서열이 밝혀진 이후 (Yu 등, 2002, Science 296: 79-92; Dean 등, 2005, Nature 434: 980-986) 도열병균의 병 발생 기작에 관한 연구가 가속화되었다. 현재까지, 대부분의 연구는 도열병균 분생 포자의 식물체 표면에서의 발아 및 식물체 안으로 침입하기 위한 특수 구조체인 부착기(appressorium) 형성 단계에 집중되어 있다. 부착기는 돔(dorm) 형태의 구조물로서 8 MPa의 높은 팽압을 생성 (de Jong 등, 1997, Nature 389: 244-245) 하여 물리적으로 식물 표피에 구멍을 뚫고 침투관(penetration peg)을 형성하여 (Ebbole, 2007, Annu. Rev. Phytopathol. 45:18) 식물 세포 내로 침입하는 데 중요한 역할을 한다. 벼 세포 내로 침입한 도열병균은 감염 초기 단계에서 부푼 형태의 일차 감염균사(infectious hyphae)를 형성하는데, 일차 감염균사는 식물 세포를 파괴하지 않는 활물기생의 형태로 발달되며 일차 침입균사의 주변에는 식물 유래의 감염균사 외막(extra-invasive-hyphal membrane: EIHM)이 형성된다 (Kankanala 등, 2007, Plant Cell 19: 706-724). 감염균사는 초기 감염된 식물 세포를 가득 채운 뒤 다음 세포로 이동하는 특성을 지닌다. 감염 초기 단계에서 감염균사로부터 다양한 이펙터(effector) 단백질이 분비되어 식물과 상호작용하며, 병 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다. 현재까지, 식물 내로 분비되는 도열병균의 이펙터(effector) 단백질은 식물의 저항성(resistance: R) 유전자와 상호작용하여 과민성 반응을 (hypersensitive resistance: HR)을 유도하는 소수의 비병원성 단백질들만이 동정되었다 (Ballini 등, 2008, Mol. Plant Microbe Interact. 21: 859-868). 도열병 비병원성(AVR) 이펙터(effector) 단백질, AVR-Pita 및 PWL 단백질의 식물체 내 분비에 관한 최근의 연구는 EIHM 내에서 발달하는 병원균 유래의 구조물인 활물기생 계면 복합체 (Biotrophic Interfacial Complex: BIC)를 동정했다 (Berruyer 등, 심사 중). BIC은 침투관 정단에 있는 EIHM 내에서 처음 발달하여, 처음 분화된 IH 세포 외부로 이동한다. IH가 숙주 세포내에서 증식하는 동안 분비된 이펙터(effector) 단백질은 BICs 내에 축적된다.

앞으로 해결해야 할 중요한 과제는 부가적인 도열병 이펙터(effector) 단백질의 동정, 이펙터(effector) 단백질에 의한 병원성 기작 혹은 저항성 유도 기작의 이해, 및 이들 이펙터(effector) 단백질이 식물체 내로 분비되는 과정의 이해이다.

소포체는 효모를 비롯한 모든 진핵생물에만 있는 막성 세포내 구조물로서, 세포 외로 분비되는 단백질들이나 세포막 단백질들은 이 기관을 통해서 이동한다. 즉, 세포질이 아닌 세포 외부로 나가는 단백질들은 라이보좀(ribosome)에서 해독되어 나오면서 곧바로 소포체로 전좌(translocation)되는데, 이러한 분비 과정 중에 접힘(folding)이 불완전한 단백질들이 소포체 내에 축적되면 소포체 스트레스(ER stress)가 발생한다. 이렇게 소포체에서 소포체 스트레스가 발생하면 이를 해소하기 위한 UPR(Unfolded Protein Response)이라고 불리는 대응 기작이 작동하게 된다. 이러한 UPR 기작은 진핵생물인 효모에서부터 인간과 같은 고등 생물에 이르는 모든 진핵 세포들에서 발견된다.

소포체 내로의 수송은 단백질 분비의 초기 단계이며, 분비 단백질 및 막 단백질 생합성의 결정적인 단계이다 (Zimmermann 등, 2006, Trends Mol. Med. 12: 567-573). 새로 합성된 단백질의 아미노 말단의 신호 펩티드가 소포체 내로의 수송을 지시하며, 소포체막을 가로지르는 단백질의 전좌는 합성되는 단백질의 성질에 따라 해독 시 또는 해독 후에 일어난다. 도열병균과 같은 자낭균문에 속하는 효모균인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 있어, 열충격 단백 질 70 (heat shock protein 70: Hsp70) 패밀리의 두 구성원인 Kar2p 및 Lhs1p는 co-chaperone Sec63p 및 뉴클레오티드 교환 인자 Sil1p와 함께 소포체 내로의 단백질 수송 및 소포체 내강에서 적절한 단백질 접힘에 분자 샤페론으로서 핵심 역할을 한다 (Tyson 및 Stirling, 2000, EMBO J. 19: 6440-6452). 효모에 있어서 Lhs1p은 Kar2p의 ATPase 활성을 돕는 역할을 하는데, Sil1p과 함께 Kar2p에 대한 뉴클레오티드 교환 인자로 작용한다 (Steel 등, 2004, Science 303: 98-101). 이들 유전자는 효모의 UPR(unfolded protein response) 기구의 구성 인자들을 암호화하며, 이들 유전자의 전사는 디티오스레이톨 (DTT: 이황화 결합 형성의 저해제) 및 투니카마이신 (tunicamycin: N-glycosylation의 저해제) 같은 소포체 스트레스 인자에 의해 또는 이종(heterologous) 단백질의 발현에 의해 활성화된다. 비록 SIL1 또는 LHS1 어느 것도 필수적이지는 않지만, 효모에서 양 유전자의 결실은 치사를 초래한다 (Tyson 및 Stirling, 2000, EMBO J. 19: 6440-6452). 결실변이체 Δ lhs1 및 조건적 결실변이체 Δl h s1Δ sil1, Δ sec63, 및 Δ kar2의 세포질 내에는 소포체 내로 수송의 결함으로 인하여 많은 세포외 분비성 단백질이 축적된다 (Steel 등, 2004, Science 303: 98-101).

이펙터(effector) 단백질뿐만 아니라, 식물 병원성 진균에 의해 분비되는 많은 단백질이 병원성에 관련된다 (Kamoun, 2006, Plant Biol. 10: 358-365). 진균이 숙주의 표면을 파괴하여 식물 세포에 감염되게 돕는 가수분해 효소와 같은 단백질들이 여기에 포함된다. 하이드로포빈 (MPG1 및 MHP1) 및 snodprot1 (MSP1) 같은 분비 단백질이 마그나포르테 오리자의 발병에 중요하며 (Jeong 등, 2007, FEMS Microbiol. Lett. 273: 157-165), 이들의 적절한 분비가 질병 발달에 결정적이다 (Kershaw 등, 2005, Mol. Microbiol. 56: 117-125). 식물 감염에 관여되는 분비 단백질의 중요성에도 불구하고, 마그나포르테 오리자의 분비 체계는 잘 알려져 있지 않다. 최근에, P-형 ATPase(APT2)가 감염에 관여되는 몇몇 분비 단백질의 방출에 필수적임 (Gilbert 등, 2006, Nature 440: 535-539)이 밝혀졌으나, 단백질 분비와 연관된 어떠한 다른 유전자도 동정된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 마그나포르테 오리자 유래 MoLHS1이 소포체에서 단백질 전좌 및 성숙을 위한 샤페론으로서 작용하는지 및 상기 단백질이 숙주에서 병원성 발생에 참여하는지를 관찰하며, 상기 유전자의 세포 내 위치를 알아보고, 결실변이체를 제조하여, 숙주에 접종하여 숙주에서의 상기 결실변이체의 반응을 분석하여, 상기 유전자의 역할을 알아보고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 MoLHS1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스 및 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)를 제공한다.

또한, 본 발명은 마그나포르테 오리자 내의 MoLHS1 발현을 측정하여 벼 도열병 방제 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는, 도열병 원인균인 마그나포르테 오리자 유래 MoLHS1이 소포체에서 단백질 전좌 및 성숙을 위한 샤페론으로서의 역할 및 숙주에 감염 시 상기 단백질의 병원성 발병의 기작을 연구함으로써, 도열병을 통제하는 새로운 전략을 개발할 수 있다. 또한, MoLHS1을 타겟으로 하거나 MoLHS1을 통한 분비를 타겟으로 하여 도열병을 감소시킬 수 있는 새로운 농약을 개발할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MoLHS1 유전자가 결실된, 벼 도열병에 대한 병원성이 감소된 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 결실변이체를 제공한다. 본 발명의 결실변이체에서, 상기 MoLHS1 유전자는 게놈 DNA 및 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는, 벼 도열병에 대한 병원성을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 MoLHS1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 상기 MoLHS1 유전자 돌연변이체는 MoLHS1 단백질의 기능이 상실된 유전자를 의미하며, MoLHS1 유전자 서열에서 특정 염기서열의 삽입, 치환, 결실된 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, MoLHS1 유전자 돌연변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 MoLHS1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적 인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)이다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 곰팡이, 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는, 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen 등, 1973, Proc. Natl. Acac. Sci. USA 9: 2110-2114), 하 나한 방법 (Hanahan, 1983, Mol. Biol. 166: 557-580) 및 전기천공 방법 (Dower 등, 1988, Nucleic. Acids Res. 16: 6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개 형질전환법, 미세주입법 (Capecchi, 1980, Cell 22: 479), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham 등, 1973, Virology 52: 456), 전기천공법 (Neumann 등, 1982, EMBO J. 1: 841), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong 등, 1980, Gene 10: 87), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, 1985, Mol. Cell Biol. 5: 1188-1190), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang 등, 1990, Proc.Natl. Acad. Sci. 87: 9568-9572) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한,

마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)에 시험 물질을 처리하는 단계; 및

마그나포르테 오리자 내의 MoLHS1 발현을 측정하는 단계를 포함하는 벼 도열병 방제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 벼 도열병 방제 물질의 스크리닝 방법은 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)에 시험하고자 하는 물질을 처리한 후, 마그나포르테 오리자 내의 MoLHS1 발현을 측정하는데, 상기 물질 처리 후에 MoLHS1 발현이 감소하면 상기 처리된 물질은 벼 도열병 방제 후보 물질이 될 수 있다. 따라서, MoLHS1을 타겟으로 하여 벼 도열병을 방제할 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 진균 균주 및 배양 조건

마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 균주 KJ201이 본 발명에서 야생형 균주로 사용되었다. 상기 균주 및 이의 형질전환체는 오트밀 아가 배지 (OMA: 5% 오트밀 (w/v), 2.5% 아가 분말) 상에서 25℃, continuous 형광등 하에서 배양되어, 게놈 DNA 추출을 위해 액체 완전 배지 (0.6% 효모 추출물, 0.6% 카사미노산, 및 1% 서당)에서 25℃, 3일 간 진탕배양 (150 rpm)되었다. RNA 추출을 위해서는 개별 균주의 분생포자 현탁액이 Talbot 등 (1993, Plant Cell 5: 1575-1590)에 의해 기재된 액체 완전 배지에서 2-3일간 배양되어, 연이어 열충격, 냉충격 또는 DTT (10 mM) 및 투니카마이신 (10 ㎍/㎖) 같은 소포체 스트레스 처리가 가해졌다. 스트레스 하의 영양균사 생장을 관찰하기 위해, 4 mM CuSO₄ 또는 10 mM MnCl₂를 개별적으로 CM 아가 배지에 첨가하였다 (Talbot 등, 1993, Plant Cell 5: 1575-1590). 각 균주의 균사 디스크 (직경 7 mm)를 이들 스트레스 배지에 뒤집어 접종하여 12일까지 매 4일 마다 직경을 측정하여 생장율을 평가하였다. 벼 병원균 O-135가 재배품종 야시로모찌 (Valent 등, 1991, Genetics 127: 87-101) 상에 정상적인 질병 발달에 관한 대조구로서 사용되었다.

2. 핵산 준비 및 정량적 역전사효소 RT - PCR

플라스미드 DNA 준비, 제한효소 절단, 클로닝, 및 서던 탁본법 분석을 포함한 대부분의 분자 생물학 관련 기법은 Sambrook 및 Russell (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York)의 기재에 따랐다. 게놈 DNA 및 총 RNA 추출은 Kim 등 (2005, Mol. Microbiol. 57: 1224-1237)의 기재에 따랐다. 전사물의 수준을 정량화하기 위한 정량적 역전사효소 PCR (RT-PCR)은 Yi 및 Lee (2008, Plant Pathol. J. 24: 131-142)에 따랐다. 간략하게 설명하면, 제조사의 설명서에 따라 SuperScript^TM First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 RNA 5 ㎍이 cDNA로 역전사 되었다. 반응은 7500 Real-Time PCR System을 사용하여 제조사의 디폴트 조건 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 각 프라이머 150 nM, cDNA 25 ng 및 SYBR

Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) 5 ㎕가 포함된 10 ㎕ 반응액에서 수행되었다. 2^-ΔΔ ^Ct 방법 (Livak 및 Schmittgen, 2001, Methods 25: 402-408)으로 전사물의 상대적 정량 분석을 위하여, 평균 threshold cycle(Ct)은 2^-Δ ^Ct로서 각 조건에 대해 베타-튜블린 또는 사이클로피린에 의해 표준화되었다. Fold 변화는 2^-ΔΔ ^Ct로서 계산되었다. PCR 반응은 적어도 3 회 반복으로 독립적으로 2 회 반복되었으며, 대표적인 자료만 제시하였다.

정량적 역전사효소 PCR 분석을 위해 각 유전자별로 프라이머를 제작하여 사용하였다. MoLHS1 유전자에 대응하는 프라이머로서 nDK5_RTf (서열번호 2) 및 nDK5_RTr (서열번호 3), MoKAR2 유전자에 대응하는 프라이머로서 DK1_RTf (서열번호 4) 및 DK1_RTr (서열번호 5), MoSIL1 유전자에 대응하는 프라이머로서 SIL1qF (서열번호 6) 및 SIL1qR (서열번호 7), MoSCJ1 유전자에 대응하는 프라이머로서 SCJ1qF (서열번호 8) 및 SCJ1qR (서열번호 9), MoPDI1 유전자에 대응하는 프라이머로서 PDI1qF (서열번호 10) 및 PDI1qR (서열번호 11), MHP1 유전자에 대응하는 프라이머로서 MHP1F_qRT (서열번호 12) 및 MHP1R_qRT (서열번호 13), LAC1 유전자에 대응하는 프라이머로서 LAC1_qF (서열번호 14) 및 LAC1_qR (서열번호 15), 사이클로피린 (CYP1) 유전자에 대응하는 프라이머로서 CYPF_qRT (서열번호 16) 및 CYPR_qRT (서열번호 17), 베타-튜블린 (TUB) 유전자에 대응하는 프라이머로서 TUBF_qRT (서열번호 18) 및 TUBR_qRT (서열번호 19), 벼의 PBZ1 유전자에 대응하는 프라이머로서 PBZ1_QF (서열번호 20) 및 PBZ1_QR (서열번호 21), 벼의 PR1a 유전자에 대응하는 프라이머로서 PR1a_QF (서열번호 22) 및 PR1a_QR (서열번호 23), 벼의 액틴 (ACT) 유전자에 대응하는 프라이머로서 Ri_actin_QF (서열번호 24) 및 Ri_actin_QR (서열번호 25)을 각각 사용하여 전사 수준을 측정하였다.

3. 마그나포르테 오리자 LHS1 및 KAR2 의 세포내 위치 규명

프로모터 추정 구간 및 LHS1 유전자의 신호 펩티드 예측 구간이 포함된 1.2 kb 게놈 단편이 프라이머, DK5fu1F (서열번호 28) 및 DK5fuSigR (서열번호 46)로 증폭되었다. eGFP ORF (0.7 kb)는 주형으로서 pSK2707를 사용하여 프라이머 eGFP_M (서열번호 26) 및 ^*HEELgfpR (서열번호 27) 로 증폭되었다. 생성된 PCR 단편은 프라이머 DK5fu1F (서열번호 28) 및 ^*HEELgfpR (서열번호 27)를 사용하여 double-joint PCR (Yu 등, 2004, Fungal Genet. Biol. 41: 973-981)에 의해 융합되어, 생성된 1.9 kb 단편은 XL-TOPO 벡터 (Invitrogen Carlsbad, CA, USA)에 클로닝 되었다. A. nidulans TrpC 프로모터는 pBCATPH (Yun, 1998, Molecular genetics and manipulation of pathogenicity and mating determinants in Mycoshpaerella zeae-maydis and Cochliobolus heterostrophus. Ph.D. thesis. Cornell University, Ithaca, NY)로부터 프라이머 pTrpC_F (서열번호 29) 및 pTrpC_R (서열번호 30) (0.3 kb)로, 종결 코돈 없는 KAR2 ORF는 KJ201 게놈 DNA로부터 프라이머 trpDK1fuF (서열번호 31) 및 DK1fuR (서열번호 32)로, 및 eGFP ORF는 pSK2707로부터 프라이머 eGFP_M (서열번호 26) 및 eGFP_P1 (서열번호 44)로 증폭되었다. TrpC 프로모터 및 프라이머 pTrpC_F (서열번호 29) 및 DK1fu_sigR (서열번호 33)로 증폭된 KAR2의 신호 펩티드 구간을 포함하는 0.4 kb 단편 및 pSK2707로부터 프라이머 eGFP_M (서열번호 26) 및 ^*HDELgfpR (서열번호 34)로 증폭된 eGFP ORF는 프라이머 pTrpC_F (서열번호 29) 및 ^*HDELgfpR (서열번호 34)로 double-joint PCR에 의해 융합되어, 생성된 1.1 kb 단편은 XL-TOPO 벡터로 클로닝 되었다.

융합 단백질 Pro _LHS1 -LHS1SP-GFP-HEEL 및 Pro _TrpC -KAR2SP-GFP-HDEL을 코딩하는 구축물은 제네티신(geneticin)에 저항성이 있는 유전자를 지닌 pII99 벡터 (Lee 등, 2003, Mol. Microbiol. 50: 145-152)와 동시 형질전환에 의해 야생형에 도입되었다. 형질전환체의 분생포자에서 형광 신호가 ER-Tracker Blue-White DPX (Molecular Probes)로 염색 후 GFP 및 DAPI 필터의 형광현미경 (Zeiss Axio Imager A1, Cal Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관찰되었다.

4. LHS1 의 붕괴 및 유전적 보완

마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 게놈 (http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/)의 MGG_06648.5 유전자좌 상의 서열에 근거하여, 유전자의 양 옆 5' 방향 1.5 kb 및 3' 방향 1.3 kb 구간은 게놈 DNA KJ201로부터 각각 프라이머 nH_kdk5F (서열번호 35) 및 f_kdk5_5r (서열번호 36), 및 프라이머 nXb_kdk5R (서열번호 45) 및 f_kdk5_3f (서열번호 37)를 사용하여 증폭되었다. 프라이머 f_kdk5_5r (서열번호 36) 및 f_kdk5_3f (서열번호 37)는 HPH 마커 카세트의 말단에 상동인 여분의 서열을 함유한다. 2.1 kb HPH 마커 카세트는 프라이머 HygB_F (서열번호 38) 및 HygB_R (서열번호 39)를 사용하여 pBCATPH (Seo 등, 2007, Plant Pathol. J. 23: 51-56)로부터 증폭되었다. 이들 3 개의 증폭물은 double-joint PCR에 의해 융합되어, 생성된 유전자 결손 구축물은 프라이머 H3_kdk5_Fw (서열번호 40) 및 Xb_kdk5_Rv (서열번호 41)를 사용하여 이전에 기재된 방법에 따라 (Yu 등, 2004, Fungal Genet. Biol. 41: 973-981) 희석된 융합 PCR 산물로부터 증폭되었다. 유전자 결손 구축물은 pCR

RTOPO2.1 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 클로닝 되고, HindIII~XbaI 단편은 pSK1834 ATMT 바이너리 벡터 (Khang 등, 2005, Fungal Genet. Biol. 42: 483-492)로 클로닝 되었다. 생성된 클론은 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 AGL-1로 도입되어 KJ201의 ATMT가 이전의 기재 (Rho 등, 2001, Mol. Cells 12: 407-411)에 따라 수행되었다. 형질전환체는 200 ppm 하이그로마이신이 첨가된 배지에서 2 단계에 걸쳐 선발되었으며, PCR에 의해 스크리닝되었다. 기대된 결실변이를 지닌 형질전환체 및 전위 형질전환체는 단일 분생포자 분리를 거쳐 유전적으로 정제되었다. LHS1 유전자의 결실은 서던 탁본법 분석에 의해 확인되었으며, LHS1 전사물의 결실도 프라이머 nDK5_RTf (서열번호 2) 및 nDK5_RTr (서열번호 3)을 사용한 RT-PCR에 의해 확인되었다.

유전적 보완을 위하여, LHS1 유전자를 지니는 KJ201의 포스미드 클론 FOSKJ_A_11_L10이 분리되었으며, 상기 포스미드 내의 11 kb SmaI 단편은 pBluescript SK(+)로 서브클로닝되었다. 클로닝 결과물인 11_L10pBlu_20 및 제네티신 저항성 유전자를 포함하는 pII99 벡터 (Lee 등, 2003, Mol. Microbiol. 50: 145-152)가 Δl h s1 원형질체의 동시 형질전환 (Sweigard 등, 1992, Mol. Gen. Genet. 232: 183-190)에 사용되었다. 생성된 형질전환체는 제네티신(geneticin)을 함유하는 TB3 아가 배지 상에서 선발되었다. 단일 분생포자 분리에 의한 유전적 정제 후에, LHS1의 단일 copy 삽입은 서던 탁본법 분석에 의해 확인되었고, 완전 배지에서 키운 배양물로부터 추출된 균사 RNA를 사용한 RT-PCR을 이용하여 형질전환체에 LHS1 전사물이 회복되어 있음을 확인하였다.

표 1. 프라이머 목록

유전자 명	프라이머 명	서열 (5' to 3')	서열번호
MoLHS1	nH_kdk5F	cccaagcttACAGGTTCCTTGGGTTCAG	35
	f_kdk5_5r	gcacaggtacacttgtttagagaATCTGGCTTTGGTCACTCC	36
	f_kdk5_3f	ccttcaatatcatcttctgtcgaCGCCTCTGGTATGTTCTGA	37
	nXb_kdk5R	gctctagaGGTGACGGATGGATGAAAC	45
	H3_kdk5_Fw	cccaagcttTCTCTCCAAGGATCCCACTA	40
	Xb_kdk5_Rv	gctctagaGATGAAACCACACGATTTGA	41
	nDK5_RTf	ACCCAGTCCTTACCATCAAG	2
	nDK5_RTr	CTATCTTAACCGGCTTGTCC	3
	DK5fu1F	aaaaagcaggctCAATAGGCTGCCAACTACCT	28
	DK5fuSigR	tcctcgcccttgctcaccatGGCGAGGACATTAGAGGAGA	46
MoKAR2	DK1_RTf	AACGGTCTCGAGAACTATGC	4
	DK1_RTr	TCCTTCTGCTCCTCAAAATC	5
	trpDK1fuF	tctaccgaagcatcgatATGAAGTCAGGCTCAAGGAG	31
	DK1fuR	cgcccttgctcaccattttgaaTAGCTCATCGTGGGAACG	32
	DK1fu_sigR	tcctcgcccttgctcaccatCGCGTTGGCGGTCTTGACAA	33
MoSIL1	SIL1qF	GACTTAGAGGGTCTGCCTGT	6
	SIL1qR	GAAGTACATGTCGTGGGAAA	7
	PrcSILovF	ctattctaccgaagcatcgatCATACCATTTTCACGTTGCT	42
	SILovR	GTTTTTCCTGTATGCGTTGA	43
MoSCJ1	SCJ1qF	GGTCACGTAGAGATGGTCAA	8
MoSCJ1	SCJ1qR	CCTGTATTTCTCCCACACTG	9
MoPDI1	PDI1qF	GTTGTCGCTTACTTGTCCAG	10
MoPDI1	PDI1qR	CGTCAAATTTCTTGTCGAAG	11
MHP1	MHP1F_qRT	TCCTGCCCATCCTTGACC	12
MHP1	MHP1R_qRT	GAGGAAGAGAAAGGACCCCAAAAC	13
LAC1	LAC1_qF	TACAAGCGCTACTGCCAGAC	14
LAC1	LAC1_qR	CACCAGGAACACCATCATACTC	15
CYP1	CYPF_qRT	GCCTAACGTTTTCTTCGACATTTC	16
CYP1	CYPR_qRT	GTTCTCGTCGGCAAACTTCTC	17
TUB	TUBF_qRT	TCGACAGCAATGGAGTTTACAA	18
TUB	TUBR_qRT	AGCACCAGACTGACCGAAGAC	19
HPH marker	HygB_F	cgacagaagatgatattgaagg	38
HPH marker	HygB_R	ctctaaacaagtgtacctgtgc	39
TrpC promoter	pTrpC_F	gtcgacagaagatgatattgaag	29
TrpC promoter	pTrpC_R	catatcgatgcttcggtaga	30
eGFP	eGFP_M	atggtgagcaagggcgaggagctgt	26
	eGFP_P1	cttgtacagctcgtccatgccg	44
	*HEELgfpR	ttataactcctcatgCTTGTACAGCTCGTCCATGC	27
	*HDELgfpR	tcatagctcatcgtgCTTGTACAGCTCGTCCATGC	34
PBZ1	PBZ1_QF	CTACTATGGCATGCTCAAGAT	20
PBZ1	PBZ1_QR	ATAGAAAGGCACATAAACACAA	21
PR1a	PR1a_QF	CTTCAACACCCCTGCTATG	22
PR1a	PR1a_QR	CCGTTGTGGTGAATGAGTAA	23
ACT	Ri_actin_QF	CTTCAACACCCCTGCTATG	24
ACT	Ri_actin_QR	CCGTTGTGGTGAATGAGTAA	25

5. 분생포자 발아, 부착기 형성, 분생포자 형성, 및 병원성 분석

각 도열병균 균주의 균총은 OMA 배지에서 12일 동안 4-5 회 반복으로 배양하 였다. 이들 배양물로부터 분생포자를 수집하여, 5 ㎖ 멸균 증류수에 재현탁하였고 분생포자 현탁액의 농도는 혈구계(hemacytometer)를 사용하여 측정하였다. 분생포자 형성 과정은 이전 보고 (Lau 및 Hamer, 1998, Fungal Genet. Biol. 24: 228-239)에 따라 관찰하였다. 분생포자 현탁액 (2 x 10⁴ 분생포자/㎖)이 분생포자 발아 및 부착기 형성의 분석에 사용되었다. 각 현탁액 30 ㎕를 현미경 커버슬립 (ref. no. 01 010 30; Marienfeld, Lauda-Konigshofen, Germany)에 3 회 반복하여 떨어뜨렸다. 25℃, 고습도 조건에서 12 시간 배양 후, 분생포자 발아 및 부착기 형성을 광학현미경으로 관찰하였다.

멸균 증류수를 사용하여 13일 된 OMA 배양물로부터 수확한 분생포자는 식물체에 접종 전에 250 ppm Tween

20으로 1 x 10⁵ 분생포자/㎖로 맞췄다. 분생포자 현탁액 5 ㎖를 3-4 엽기의 벼에 분무접종하였다. 접종된 식물체는 암소의 고습도 생장상(dew chamber)에 밤새 두었다가 생장실로 옮겼다. 병원성 결과는 접종 7일 후에 관찰하였다. 상처 주입 분석을 위하여, 2 x 10⁴ 분생포자/㎖ 분생포자 현탁액 100-200 ㎕를 바늘 없는 주사기로 벼 잎에 주입하였다. 재배품종 낙동벼, 야시로모찌 또는 YT-16의 한 달 된 벼 엽초로 13일 된 OMA 배양물의 분생포자 (1-2 x 10⁴ 분생포자/㎖ 농도)가 엽초 접종에 사용되었다. 접종 후 48 시간이 지나 엽초를 주맥 상부로부터 3-4 세포층 두께의 표피층을 만들기 위해 절단하고, 잘린 엽초 조직 절편을 유리슬라이드에 올렸다. 표본은 40X 대물렌즈를 끼운 Zeiss Axio Imager A1 형광현미경 또는 C-Apochromat 63X (N.A.1.2) 물잠김(water immersion) 대물렌즈를 끼운 Zeiss Axioplan 2 IE MOT 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 형광 발현은 X-Cite

120 (EXFO Life Sciences, Mississauga, Ontario) 수은등 광원 및 GFP 특이 필터 (excitation 480±20 nm, emission 510±20 nm, filter set 41020, Chroma Tech. Corp., Rockingham, VT)를 이용하여 관찰하였다. 비친화적 상호작용을 평가하기 위해, 벼 재배품종 야시로모찌가 친화적 상호작용 대조구로서 낙동벼 또는 YT16와 함께 사용되었으며, 분무접종 및 엽초 분석을 위해 상기 분석법들이 적용되었다. 모든 병원성 분석은 적어도 4 회 반복되었으며 비슷한 결과를 나타내었다. 세포 사멸을 관찰하기 위해, 엽초 샘플을 트리판블루로 1 시간 동안 염색하고, 락토페놀로 1 시간 동안 탈염하였다. 감염 생장 및 자동형광을 관찰하기 위한 양파 접종 실험은 염색 없이 Kim 등 (2005, Mol. Microbiol. 57: 1224-1237)에 따라 수행되었다.

6. SIL1 의 과발현

SIL1 (MGG_10843.5)의 ORF 및 3' 비해독 구간 1.1 kb를 프라이머 PrcSILovF (서열번호 42) 및 SILovR (서열번호 43)을 사용하여 PCR 증폭한 뒤, 상기 PCR 산물에 강력한 프로모터인, A. nidulans TrpC 프로모터를 융합 PCR을 이용하여 연결하였다. pCR

R-XL-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 증폭물의 클로닝 후, 농생명과학공동기기원 (서울대학교, 서울, 한국)에서 ABI 3700 DNA sequencer (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용한 서열분석으로 삽입물의 서열을 확인하였다. Δlhs1 결실변이체는 서열 확인된 SIL1 클론 및 pII99 벡터 (Lee 등, 2003, Mol. Microbiol. 50: 145-152)로 동시 형질전환되었으며, 생성된 형질전환체는 제네티신(geneticin) 함유 배지에서 선발되어, 상기 기재된 서던 탁본법 분석 및 정량적 RT-PCR에 의해 확인되었다.

7. 단백질 전좌 분석

진균 균주를 액체 완전 배지 (Talbot 등, 1993, Plant Cell 5: 1575-1590)에서 2일 동안 키운 후 균사의 분쇄를 위해 새 배지로 옮겼다. 24 시간 계대배양 후 각 균주의 균사를 수집하였다. 단백질은 Bruno 등 (2004, Cell 3: 1525-1532)의 방법에 따라 개개 배양물로부터 추출하였다. 총 단백질 (약 20 ㎍)은 황산도데실나트륨-12% 폴리아크릴아마이드겔(sodium dodecyl sulfate-12% polyacrylamide gel) 상에서 분리하여 니트로셀룰로즈 막 (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 옮겼다. 단백질이 전개된 니트로셀룰로즈 막은 2 반복으로 제작되었으며, 일차 항체 (1:500)로서 단일클론 안티-녹색 형광 단백질, N-말단 (SIGMA, Saint Louis, Missouri, USA; product code, G6795)항체를 사용하였고, 이차 항체 (1:20,000)로서 염소의 안티-마우스 IgA+IgG+IgM, (H+L) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA; product number, 31171) 항체를 탐침으로 사용하였다. 대조구로서, 쥐의 안티-액틴 단일클론 항체 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA; catalog number, MAB1501) (1:1,000), 및 염소 안티-마우스 IgA+IgG+IgM, (H+L) (1:100,000) 항체가 사용되었다.

8. 분비된 효소의 활성 분석

야생형 및 Δ lhs1 돌연변이체의 균사는 HMT 배지 (van Hoof 등, 1991, Physiol. Mol. Plant Pathol. 39: 259-267)에서 16일 동안 주 탄소원으로서 벼 세포벽을 대체 공급하여 정체배양 하였다. 자일라나아제(xylanase), 폴리갈락투로나아제(polygalacturonases), 및 글루카나아제(glucanase)의 활성은 기질로서 0.1% 자일란(xylan) 및 0.1% 폴리갈락투론산(polygalacturonic acid)을 사용하여 DNS 방법 (Miller, 1959, Anal. Chem. 31: 426-428)으로 분석되었다. 베타-자일로시다아제(β-xylosidase) 및 알파-아라비노시다아제(α-arabinosidase) (Chaplin 및 Kennedy, 1986, Carbohydrate Analysis: A Practical Approach, IRL Press, Washington D.C.), 및 라카아제(laccase)의 활성은 각각 기질로서 1 mM 4-니트로페닐 베타-디-자일로피라노사이드(4-Nitrophenyl β-D-xylopyranoside), 4-니트로페닐 알파-엘-아라비노푸라노사이드(4-Nitrophenyl α-L-arabinofuranoside) 및 2,2'-아지노-비스-3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)을 사용하여 분석되었다.

9. BIC 으로 AVR - Pita 융합 단백질 분비의 분석

AVR - Pita 프로모터 및 신호 펩티드와 연결된 eGFP 발현 벡터 (Berruyer 등, 심사 중) 및 pII99 벡터를 원형질체 도입 방법으로 KJ201 및 Δ lhs1 결실변이체에 각각 동시 형질전환하였다. 형질전환체는 PCR 및 서던 탁본법 분석으로 스크리닝 되었다. 몇 독립적으로 분리된 형질전환체는 YT16의 엽초에 접종되었으며, 접종 36±2 시간 후 형광현미경 하에서 관찰되었다.

Accession 번호

본 발명에 기재된 마그나포르테 오리자 서열에 대한 GenBank accession 번호는 하기와 같다: LHS1 (MGG06648, ABS87374), KAR2 (MGG02503, ABS87375), SIL1 (MGG10843, EU156060), SCJ1 (MGG07502, EU156061), MHP1 (MGG01173, AF126872), MSP1(MGG05344, XP359969.1), CYP1 (MGG10447, AF293848). PDI1 (MGG05753, XM360379), TUB(MGG00604, XM368640)에 대한 서열은 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea) 70-15 게놈 데이터베이스로부터 얻었다.

PBZ1 (D38170), PR1a (AJ278436), 및 ACT (Os03g50890)는 오리자 사티바(Oryza sativa)의 유전자이다.

< 실시예 >

실시예 1. 마그나포르테 오리자의 두 Hsp70 추정 단백질은 소포체에 있다.

Hsp70의 상동단백질로 추정되는 단백질을 마그나포르테 오리자 게놈에서 생물정보학 portal system인 Comparative Fungal Genomics Platform (CFGP)에 포함된 InterProScan 프로그램 (Park 등, 2008, Nucleic Acids Res. 36: D562-571)을 사용하여 찾았다. 13 개의 단백질이 Hsp70 관련 도메인 (IPR001023, Hsp70; IPR013126, Hsp70; IPR012725, Chaperone DnaK)을 함유하는 것으로 동정되었다. 이들 중, 2 개 의 단백질, MGG02503.5 (DK1) 및 MGG06648.5 (DK5)가 SIGNALP (Bendtsen 등, 2004, J. Mol. Biol. 340: 783-795)프로그램에 의해 아미노 말단에 신호 펩티드 (0.998 및 1.000; 각각 신호 펩티드 가능)를 가지는 것으로 예측되었으며, 카르복실 말단에 특성이 잘 알려진 소포체 체류 신호 (IPR000886; ER-targeting sequence) (HDEL DK1 및 HEEL DK5) (Derkx 및 Madrid, 2001, Mol. Genet. Genomics 266: 537-545)를 가지는 것으로 나타났다. 신경망 (neural network: NN) 및 은닉 마르코프모델 (hidden Markov model: HMM) 분석에 따라, DK1 펩티드 사슬의 절단 부위는 잔기 26 및 27 (A-Q) 사이에서, DK5 펩티드 사슬의 절단 부위는 잔기 20 및 21 (A-I) 사이에 예측되었다. DK1 및 DK5 단백질은 효모의 소포체 Hsp70 단백질 Kar2p (e-값=0, 71.2% 일치) 및 Lhs1p (e-값=9.00e-51, 23.4% 일치) 각각에 대해 서열 유사성을 나타냈으므로, 마그나포르테 오리자에서는 각각 KAR2 및 LHS1로 표시되었다. 효모 Lhs1p 및 LHS1 간의 유사성은 효모 Kar2p 및 KAR2 간의 유사성에 비해 상대적으로 낮은데, 이는 LHS1에 특이한 아포리포포린 III-유사 도메인 (IPR011000) 및 Hsp70 도메인 뒤쪽으로 연장된 C-말단이 있기 때문이다. 그러나, 다른 진균에 있어 아포리포포린 III-유사 도메인을 함유하는 LHS1의 상동단백질은 없으며, 진균에 있어 상기 도메인의 기능에 대한 보고 또한 아직 없다.

2 개의 융합 녹색 형광 발현 벡터 (Pro _TrpC -KAR2SP-GFP-HDEL 및 Pro _LHS1 -LHS1SP-GFP-HEEL)가 소포체 체류 신호를 가지는 녹색 형광 단백질의 세포 내 위치를 관찰하기 위하여 야생형 균주 KJ201로 도입되었다. 형광 신호는 소포체 추적 염 료 (Derkx 및 Madrid, 2001, Mol. Genet. Genomics 266: 537-545)로 염색된 형질전환체와 비교되었다. 융합 단백질을 발현하는 형질전환체의 분생포자는 형광 신호를 핵 주변 및 실 같은 형상으로 세포질의 일부에 나타내었으며, 상기 신호는 소포체 추적 염료에 의한 염색과 같은 위치였다 (도 1).

실시예 2. LHS1 의 붕괴로 병원성이 심하게 감소되었다

균주 70-15 (http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe)에 있어 마그나포르테 오리자 LHS1 유전자 (좌위 MGG06648.5)는 인트론 없이 3-kb ORF로 구성되며, 999 아미노산의 단백질을 코딩한다. 균주 KJ201의 LHS1은 균주 70-15에서와 서열이 동일하다. LHS1 유전자가 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 형질전환 (ATMT) (도 2의 A)을 통하여 목적 유전자 치환에 의해 제거되었다. 3 개의 형질전환체, k5 _44, k5 _35, 및 k5 _ 36는 PCR에 의하여 목적한 유전자 변이를 포함하였음이 확인되었으며, 단일 분생포자 분리를 통하여 유전적으로 정제되었다. LHS1의 결실은 서던 탁본법 분석으로 확인되었으며, LHS1 전사물의 결실은 역전사효소 PCR(RT-PCR)로 확인되었다 (도 2의 B 및 C). 3 개의 결실변이체 모두가 생장율, 분생포자 형성, 및 병원성에 있어 동일하였으므로, 하나의 변이체, k5 _44 (이후 Δ lhs1라 함)가 본 발명의 실험에 사용되었다. 결실변이체(null mutant)에 의해 나타나는 표현형이 LHS1의 결실에 의한 것임을 확인하기 위해, 원형질체 형질전환법 (도 2의 B)을 이용하여 LHS1이 포함된 11-kb SmaI 단편을 도입하여 결실변이를 확인하였다. LHS1의 단일 copy를 포함하는 한 형질전환체 k5cp _19 (cp19)가 차기 분석을 위하여 선발되었다. 완전 액체 배지에서 키운 배양물로부터 균사 RNA를 사용한 RT-PCR은 cp19에서의 LHS1 전사량은 야생형 균주 KJ201에 맞먹는 수준으로 복구되었음을 확인하였다 (도 2의 C).

야생형, Δ lhs1, ect32 (전위 형질전환체) 및 cp19로부터 동일 농도의 분생포자 현탁액이 야생형 KJ201에 대해 감수성인 벼 재배품종 낙동벼의 3 주 된 식물체에 분무접종되었다. Δl h s1 결실변이체는 다른 균주에 비하여 상당히 감소된 병원성을 나타냈다. 접종 후 7일 째(dpi), 야생형, ect32, 및 cp19로 감염된 벼 식물체는 전형적인 도열병 증상을 보여, 가장자리가 황색인 포자가 발아하는 확장성 (중심부위 회색) 병반으로 덮였다. 대조적으로, Δ lhs1 결실변이체로 감염된 식물체는 중심부가 흰색이며, 암갈색 환으로 가장자리가 황색인 소수의 작은 병반을 보였다 (도 3의 A). 포자 현탁액을 벼 잎에 상처 접종 시 병원성이 감소된 증상이 또한 관찰되었다. 결실변이체로 감염된 식물체는 7 dpi 때 중심부가 흰색인 제한된 병반을 발달시킨 반면, 야생형, ect32 및 cp19 균주로 접종된 식물체는 풍부한 분생포자 형성으로 인하여 회색으로 보이는 확장성 병반을 생성하였다 (도 3의 B).

감염의 어느 단계가 LHS1의 결실로 인한 결함이었는지 결정하기 위해 부착, 발아, 부착기 형성, 침입, 및 식물체 내(in planta)에서 감염 생장하는 능력이 4 개의 균주 간에 비교되었다. 소수성 플라스틱 커버슬립 상에서 관찰 시, Δ lhs1 결실변이체 분생포자의 부착, 발아, 및 부착기 형성은 야생형 ect32 및 cp19 균주에서 관찰된 것에 필적하였으나, 양파 표피세포에서 침투율을 비교하였을 때 결실변이체에 의한 침투는 다른 균주들에 의한 것의 34%이었다. 접종 후 ~36 시간(hpi) 때에 엽초 분석에서, 야생형 부착기의 43%가 첫 번째 침입세포에서 IH를 형성한 반면, 결실변이체 부착기의 19%가 IH를 형성하였다 (표 2). 48 hpi까지 야생형 ect32 및 cp19의 대부분의 IH는 첫 번째 침입 세포를 채웠으며, 기대된 바대로 두 번째 또는 세 번째 세포로 자라 나갔다 (도 3의 C). 대조적으로, 결실변이체의 IH는 48 hpi 때에 첫 번째 침입세포 외부로 좀처럼 분지되지 않았다. 이들 결과는 벼 감염 분석으로부터의 결과와 일치한다 (도 3의 A 및 B). 더욱이, Δ lhs1 감염에 반응하여 벼 방어 관련 유전자 PR1a 및 PBZ1의 발현은 정량적 RT-PCR에 의한 분석 (도 3의 D) 시 야생형 KJ201의 감염으로 야기된 것에 비해 적었다. 상기에서와 같이, Δ lhs1 결실변이체의 감소된 병원성은 식물체 내(in planta)로 침투 및 감염생장을 하는 능력이 결함된 결과였다.

실시예 3. 마그나포르테 오리자 Δ lhs1 결실변이체는 무성적 발달에 있어 결함을 보인다.

마그나포르테 오리자의 분생포자는 주요 전염원으로서, 분생포자의 발달은 도열병과 같이 식물의 생육기 중에 여러 번 생활사를 완성하는 병원균에 있어서 중요한 병 진전 요소이다. Δ lhs1 결실변이체는 야생형에 비해 상당히 소수의 분생포자를 생성한다 (야생형의 0.3-4%) (도 4의 A). cp19의 분생포자 형성이 야생형에 필적한다는 것은 LHS1의 결실이 분생포자 형성의 결함을 야기했음을 증명한다. 분생포자 형성 및 식물체 내(in planta) 생장 중에 특이적으로 유도되는 class II 하이드로포빈 유전자 MHP1 (Kim 등, 2005, Mol. Microbiol. 57: 1224-1237)의 전사 또한 Δ lhs1 결실변이체에서 현저하게 감소되었다 (도 4의 B).

분생포자 발달의 어느 단계가 결실변이체에 있어 결함인지 결정하기 위하여, OMA 배지상에서 새로이 발달하는 분생포자 및 분생포자경을 관찰하였다. 16 시간 후, 야생형 및 cp19의 분생포자경에 1 또는 2 개의 분생포자가 생성되었으며, 반면 결실변이체는 상당히 감소된 수의 분생포자경을 발달시켰으며, 말단 분생포자 형성이 거의 개시되지 않았다. 24 시간 후에 야생형 및 cp19의 분생포자경에 3 개 이상의 분생포자가 가축분지로 형성되었으며, 한편 결실변이체에는 1 또는 2 개의 분생포자가 형성되었다 (도 4의 C). 따라서, 결실변이체에 있어 현저하게 감소된 분생포자 형성은 분생포자경 형성의 감소된 빈도 및 분생포자의 감소된 발생의 조합된 결과이다.

실시예 4. Δ lhs1 결실변이체는 MnCl ₂ 첨가 배지에서 색소를 덜 축적하며, CuSO ₄ 에 민감하다

Δ lhs1 결실변이체에 있어 부가적인 변화를 분석하기 위해, 결실변이체의 생장율을 스트레스 유도 조건 하에서 야생형과 비교하였다. 결실변이체의 생장율은 완전 배지 (CMA) 상의 야생형과 비교하여 약간 감소되었다 (90%). 콩고 레드(Congo Red), 메틸 비올로겐(methyl viologen), 과산화수소, 3-아미노-1,2,4 트리아졸(3-amino-1,2,4 triazole), 염화칼슘, 염화나트륨, p-쿠마르산(p-coumaric acid), 및 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate)이 첨가된 CMA 상에서 결실변이체 및 야 생형의 생장율은 CMA 상에서와 크게 다르지 않았다. 대조적으로, CMA에 10 mM MnCl₂를 첨가하였을 때 야생형은 콜로니 중심부로부터 적갈색 삼출물을 생성하였으나, 결실변이체는 약간 갈색 또는 무색의 삼출물만 생성하였다. 그러나, 10 mM MnCl₂가 있을 때 결실변이체 및 야생형의 생장율은 CMA에서와 유사하였다. 한편, 비록 4 mM CuSO₄가 첨가된 CMA 상에서 결실변이체 및 야생형 양자의 생장율은 CMA 상에서에 비해 감소되었으나, 감소된 정도는 결실변이체가 더 심하였다. (결실변이체에 대해 73%, 야생형에 대해 37%). 이는 결실변이체가 CuSO₄에 대해 보다 더 민감하다는 것을 나타낸다. 양 균주는 감소된 기중균사를 보였다.

실시예 5. LHS1 발현은 소포체 스트레스에 의해 유도되며, UPR 표적 유전자는 Δ lhs1 결실변이체에서 상향조절된다.

LHS1 및 관련 유전자의 발현이 Δ lhs1 결실변이에 의한 영향을 받는지 밝히기 위해, 다양한 발달 단계 및 스트레스 조건 하에서 야생형 및 결실변이체의 배양물에서 추출된 RNA를 사용하여 정량적 RT-PCR이 수행되었다. 열 (42℃에서 5, 10, 20, 및 40 분) 및 냉 (4℃에서 40 분) 충격에 대한 반응으로, KAR2 및 LHS1 전사물의 수준은 대조구에 비해 현저하게 변화하지 않았다. 그러나, KAR2 전사는 냉 또는 열충격 80 분 후에 감소되었다. LHS1 및 KAR2 전사가 열충격으로부터 회복 중에 변화되었는지 조사하였다. 37℃에서 1 시간 배양하여 열 내성의 유도 후, 배양물을 50℃에서 20 분간 배양하고, 25℃ 배양기에 15, 30, 60, 120, 또는 240 분간 옮겨 두었다. KAR2 및 LHS1의 전사는 각 시점에서 측정되었다. 어떠한 유전자의 현저한 유도도 관찰되지 않았으며, LHS1 전사물의 수준은 120 분 후 절반으로 감소되었다.

열 및 냉충격 조건에서 이들의 발현이 변화하지 않는 것과는 대조적으로, 소포체 스트레스가 10 mM DTT 또는 10 ㎍/㎖ 투니카마이신(tunicamycin) 처리로 유도 시 양 유전자의 발현은 매우 상승하였다 (도 5의 A). 상기 두 약품은 효모 및 몇 섬유상 진균에 있어 해독 후 변형에 관련된 유전자의 전사를 유도하는 것으로 알려져 왔다 (Arvas 등, 2006, BMC Genomics 7: 32). 효모(S. cerevisiae)의 소포체에서 발견되는 Scj1p (Hsp40 패밀리 단백질), Sil1p (뉴클레오티드 교환 인자), 및 Pdi1p (protein disulfide isomerase1)의 상동체가 BLASTP를 이용하여 Magnaporthe 게놈 데이터베이스에서 동정되었다. 이들 상동 유전자의 전사 조절이 동일한 조건 하에서 조사되었다. 대조구로서, 베타투블린(β-tubulin)을 코딩하는 TUB가 사용되었다. DTT 또는 투니카마이신 처리 시, SIL1, PDI1 및 SCJ1의 전사는 SIL1이 최고치였을 때에 비해 2 배 이상 유도되었다 (DTT에 의해 32 배 및 투니카마이신에 의해 20 배) (도 5의 A). 또한 무성 생장 및 분생포자 형성 중에 KAR2, SIL1, PDI1, 및 SCJ1의 전사는 야생형에 비해 Δ lhs1 결실변이체에서 상당히 증가 (2배 이상)하였다 (도 5의 B).

실시예 6. SIL1 의 과발현은 Δ lhs1 결실변이체의 모든 결함을 보완한다.

효모(S. cerevisiae)의 Lhs1p 및 Sil1p 양자가 Kar2p에 대한 뉴클레오티드 교환 인자 (Steel 등, 2004, Science 303: 98-101) 이고, SIL1의 과발현이 Δ lhs1 결실변이체 표현형을 억제하므로 (Tyson 및 Stirling, 2000, EMBO J. 19: 6440-6452) SIL1이 Δ lhs1 결실변이체에 있어 LHS1을 대체할 수 있는지 조사하였다. 아스퍼질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) TrpC 프로모터를 사용한 효모 Sil1p의 상동체 SIL1의 과발현은, 야생형 및 결실변이체에 비하여 각각 약 44 배 및 16 배 증가하였다 (도 6의 A). 상기 구축물 (SILOV)을 함유하는 Δ lhs1 결실변이체에서 SIL1의 과발현은 병원성, 분생포자 형성, 및 CuSO₄ 배지 상의 생장에 있어 모든 결함을 보완하였으며 (도 6의 B에서 D), KAR2 발현 또한 야생형 수준으로 복구되었다 (도 6의 A).

실시예 7. LHS1 는 소포체로의 단백질 전좌에 필요하다.

Δ lhs1 결실변이체에 있어 단백질 전좌를 평가하기 위해 Pro _TrpC _- KAR2SP-GFP-HDEL 구축물 (도 1)이 결실변이체에 도입되었다. 전구체 단백질이 ProT _rpC -KAR2SP-GFP-HDEL을 지니는 KJ201의 형질전환체 및 상기의 동일한 구축물을 지니는 Δ lhs1 결실변이체에 있어 적절하게 가공되는지를 연구하기 위해 항-GFP 항체로의 웨스턴 탁본법 분석이 사용되었다. 세포질 전구체가 단백질 전좌에 의해 소포체로 적절히 가공되면, 신호 펩티드의 절단으로 그 분자량이 감소될 것이다. Δ lhs1 결실변이체에 있어, 비가공 전구체 형 (30 KDa)이 축적되었으며, 한편 27 KDa의 완성형 단백질은 KJ201에서 검출되었다 (도 7).

실시예 8. Δ lhs1 결실변이는 액체 배양에서 세포외 분비효소의 활성을 줄인다.

Δ lhs1 결실변이체 및 야생형으로부터의 배양 여과물의 세포외 효소의 활성을 비교하였다. 자일라나아제(xylanase), 자일로시다아제(xylosidase), 아라비노시다아제(arabinosidase), 글루카나아제(glucanase), 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 및 라카아제(laccase)를 포함하는 6 개의 효소를 분석하였다. 자일로시다아제, 아라비노시다아제, 글루카나아제 및 라카아제의 효소 활성은 Δ lhs1 결실변이체에서 상당히 감소 (야생형 활성의 41-67%)되었으며, 자일라나아제 및 폴리갈락투로나아제의 활성은 결실변이체에서 약간 감소 (야생형 활성의 85-90%)되었다 (도 8).

실시예 9. Δ lhs1 결실변이체는 AVR - Pita 의 기능 및 분비가 저해된다.

LHS1의 결실이 이펙터(effector) 단백질의 분비에 양향을 미치는지 결정하기 위하여 AVR-Pita 및 Pi-ta 매개된 유전자 대 유전자 상호작용 (Orbach 등, 2000, Plant Cell 12: 2019-2032)에 상기 결실변이의 효과를 조사하였다. 잘 알려진 저항성 단백질 Pi-ta를 포함하는 벼 재배품종 야시로모찌는 AVR - Pita-함유 야생형 KJ201에 확장형 과민성 반응을 나타내며 (도 9의 A), 이는 흔히 현미경으로 보이는, 균일한 암갈색의 Type 1 저항성 반점으로 보였다 (Valent 등, 1991, Genetics 127: 87-101). 대조적으로, Δ lhs1 결실변이체는 야시로모찌 상에 더 이상 확장형의 Type 1 과민성 반응 반점을 유도하지 않았다. 낙동벼 및 YT16 (도 3의 A, 6의 B, 및 9의 A) 상에 친화적 상호작용에 있어서처럼, 결실변이체는 완전 친화적 병원균 O-135에 의해 형성된 것에 비해 야시로모찌 상에 작은 병반을 드물게 형성한다. 세포 수준에서, 병균이 침입한 야시로모찌 엽초 표피세포의 과민성 사멸이 트리판블루 염색으로 평가되었다. HR은 야생형에 의해 침범된 벼 세포의 95.5%에서, Δ lhs1 결실변이체에 의해 침범된 세포에서는 8.9% 만 발생하였다 (표 2). 따라서, 육안 및 현미경 수준에서 관찰 시, LHS1 소포체 샤페론의 결실변이는 AVR-Pita 단백질 분비의 결함으로 인하여 Pi-ta 매개된 저항성을 크게 감하였다.

Δ lhs1 결실변이체에 의한 AVR-Pita의 분비를 직접적으로 조사하기 위해, 기존 AVR-Pita 프로모터의 통제 하에서 발현하는, AVR-Pita 신호 펩티드 (APitaSP:GFP)에 융합된 녹색 형광 단백질을 KJ201 및 Δ lhs1 형질전환체에 도입하여, 이들이 BICs을 통하여 식물체 내로 분비되는 과정을 비교, 관찰하였다. 야생형 균주에 있어서, 형광 이펙터(effector) 단백질 리포터는 섬유상 균사 정단에서 BICs으로 분비되며, 형광은 첫 번째 IH 세포 외에 최종 위치인 곳에 BICs 내에 남아있게 된다 (Berruyer 등, 심사 중). BICs으로 분비된 APitaSP:GFP를 정량화하기 위해, 첫 번째 감염 세포 내에 처음 발생한 BIC를 집중적으로 관찰하였다 (도 9의 C). 야생형 IH에서는, 97.4%가 BICs 내에 형광을 지녔으나, 결실변이체 IH는 5.6%만 BICs 내에 형광을 지녔다 (표 2). BIC 형광의 강도 또한 결실변이체는 야생형보다 훨씬 약하게 발현하였다. 결론적으로, LHS1 소포체 샤페론은 식물체 내에서(in planta) AVR-Pita 이펙터(effector) 단백질의 적절한 분비에 필요하다.

표 2. Δ lhs1 결실변이체의 친화적 및 비친화적 상호작용의 정량적 분석

	친화적 상호작용^a		비친화적 상호작용^b
	야생형	Δ lhs1	야생형	Δ lhs1
감염 부위-App.	175	368	ND	ND
IH 지닌 App. 부위	76 (43.4%)	72 (19.5%)	310	101
HR 지닌 IH 부위	ND	ND	296 (95.5%)	9 (8.9%)
Flu. BIC 지닌 IH 부위	74 (97.4%)	4 (5.6%)	ND	ND
^a진균 균주는 감수성 벼 재배품종 YT16의 엽초에 접종되었으며, 36±2 hpi에 관찰되었다. ^b진균 균주는 벼 재배품종 야시로모찌의 엽초에 접종되었으며, 트리판블루로 염색 후 48 hpi에 관찰되었다. App.: 부착기, IH: 침입 균사, HR: 과민 반응, Flu. BIC: 형광 활물기생 계면 복합체(Fluorescent Biotrophic Interfacial Complex), ND: 결정되지 않음

도 1은 마그나포르테 오리자에 있어 KAR2 및 LHS1의 세포내 위치를 보여준다. Pro _LHS1 -LHS1SP-GFP-HEEL 및 Pro _TrpC -KAR2SP-GFP-HDEL를 발현하는 KJ201의 형질전환체의 분생포자가 형광현미경 하에서 관찰되었다. 세포는 소포체 추적 염료로 염색되었으며, DAPI 필터를 이용하여 관찰되었다. 소포체 추적 염료의 푸른색은 GFP 신호와의 공동 위치를 더 잘 보이게 하기 위해 적색으로 변환하였다. DIC: differential contrast image. 막대 = 10 ㎛.

도 2는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 형질전환에 의한 Δ lhs1 결실변이체 및 이의 보완체를 보여준다. (A)는 유전자 붕괴 전략을 보여준다. 수직 막대: XhoI 절단 부위, HPH : 하이그로마이신 B 인산전이효소 마커 유전자 카세트. (B)에서 야생형 (1), Δ lhs1 (2), ect32 (3), 및 cp19 (4)으로부터의 게놈 DNA 샘플은 XhoI으로 제한효소 처리되고, XhoI-제한효소 처리된 LHS1 (5'-플랭킹 477 bp)이 탐침으로 사용되었다. (C)는 LHS1 전사물의 결실 및 복구를 확인하기 위한 RT-PCR을 보여준다. 1: 야생형, 2: Δ lhs1 , 3: cp19.

도 3은 Δ lhs1 결실변이체의 병원성을 보여준다. (A) 및 (B)는 3주 된 벼 (친화적 재배품종 낙동벼) 식물체가 분생포자 현탁액 (1x10⁵ 분생포자/㎖)으로 분무접종 (A) 및 상처접종 (2x10⁴분생포자/㎖) (B)된 7일 후 관찰된 것이다. 양 분석은 병반의 포자형성 (회색화) 유도를 위해 고습도 하에 유지되었다. (C)는 낙동벼의 엽초 분석으로, 엽초는 2 x 10⁴ 분생포자/㎖로 접종한 48 시간 후에 관찰되었다. 막대 = 50 ㎛. (D)는 야생형 및 Δ lhs1 결실변이체에 의한 감염에 반응하여 식물 방어 관련 유전자의 발현을 낙동벼의 잎에 분무접종 후 정량적 RT-PCR로 분석한 것이다. 그래프는 3 회 반복 실험으로 만들어졌으며, 또 다른 독립적인 반복 실험에서도 결과는 동일하였다.

도 4는 Δ lhs1 결실변이체의 분생포자 형성 및 MHP1 발현을 보여준다. (A)는 오트밀아가배지(OMA)에서 13일간 배양 후 야생형, Δ lhs1 결실변이체, 및 cp19 (전위 형질전환체) 간에 분생포자 형성을 비교한 것이다. 별표는 0.4±0.1을 나타낸다. 값은 3 회 반복의 평균±표준편차이다. (B)는 Δ lhs1 결실변이체에 있어 분생포자 형성 중에 MHP1의 전사를 정량적 RT-PCR에 의해 야생형 균주와 비교한 것이다. 프로필은 CYP1 (내재성 대조구, 사이클로피린을 코딩하는 유전자) 전사물을 사용하여 표준화되었으며, 영양 생장 조건을 기준으로 초기화되었다. 양 균주는 10일 (OMA 상의 분생포자 형성 균사) 및 3일 (완전 액체 배지 상의 균사)에 시료를 취했다. 정량적 RT-PCR 반응은 3 회 반복으로, 독립적으로 2 회 반복되었으며, 대표적인 자료를 제시하였다. (C)는 분생포자 발달을 커버슬립 상에 분생포자 형성 유도 16 (상부) 및 24 시간 (하부) 후에 광학현미경으로 관찰한 것이다. 유도 24 시간 후에 각 분생포자경 및 분생포자의 도해는 현미경 관찰에 근거하여 작성되었다. 막대 = 100 ㎛.

도 5는 소포체 스트레스 하에서 및 Δ lhs1 결실변이체 백그라운드에서 UPR 경로 유전자의 발현 프로필이다. (A)는 분생포자 현탁액 (1 x 10⁶ 분생포자/플라스크)으로 시작된 배양이 2일간 완전 배지 상에서 이루어졌으며, 10 mM DTT 및 10 ㎍/㎖ 투니카마이신이 개별적으로 배양물에 첨가된 것이다. DTT30은 30 분간 DTT로 처리된 야생형으로부터의 샘플, 및 투니카마이신60은 60 분간 투니카마이신으로 처리된 야생형으로부터의 샘플이다. 발현 자료는 베타투블린(β-tubulin) 유전자(TUB)를 사용하여 표준화되었으며, 무처리로 배양한 균사의 발현량을 기준으로 초기화하였다. 그래프는 3 회 반복 실험으로 만들었으며, 적어도 2 회의 독립적인 반복 실험에서도 결과는 동일하였다. (B)는 분생포자 형성 중에 Δ lhs1 결실변이체 및 야생형에 있어 UPR 유전자 발현이 정량적 RT-PCR을 사용하여 정량화된 것이다. 양 배양물은 RNA 추출 전 10일간 오트밀아가배지 상에서 분생포자 형성이 되었다. CYP1이 표준화에 사용되었으며, 값은 정량적 RT-PCR 자료로 2^- ^ddCT 방법으로 계산되었다. 3 회 반복으로 2 회의 생물학적 반복이 수행되었으며, 대표적인 자료를 제시하였다.

도 6은 SIL1 과발현에 의한 Δ lhs1 결실변이체의 표현형 복구를 보여준다. (A)는 KAR2- 및 SIL1 - 특이 프라이머로부터의 전사물을 정량화하기 위해 수행된 정량적 RT-PCR이며, CYP1 전사물이 표준화에 사용되었다. RNA 샘플은 액체 완전 배지에서 키운 야생형, Δ lhs1 결실변이체, 및 SILOV의 배양물로부터 추출되었다. Δ lhs1 결실변이체 및 SILOV로부터의 발현 자료는 야생형의 발현량을 기준으로 사용하여 초기화되었다. 값은 대표적인 자료 세트로 3 회 반복하여 계산되었으며, 또 다른 독립적인 생물학적인 반복 실험에서도 결과는 동일하였다. (B)는 오트밀아가배지(OMA) 상에서 개별 균주에 의해 생성된 분생포자의 수를 접종 후 12일째 센 것이다. (C) 및 (D)는 개별 균주의 분생포자 현탁액 (분무접종을 위해 5 x 10⁴ 분생포자/㎖, 침윤 분석을 위해 2 x 10⁴ 분생포자/㎖)이 벼 재배품종 낙동벼에 접종된 7일째 촬영된 사진이다.

도 7은 Δ lhs1 결실변이에 의해 야기된 단백질 전좌의 결함을 보여준다. 단백질 전좌, 잇따른 신호 펩티드의 제거를 직접적으로 평가하기 위해 웨스턴 탁본법 분석이 수행되었다. 야생형 KJ201 (레인 1), Pro _TrpC -KAR2SP-GFP-HDEL을 함유하는 KJ201 (레인 2), Pro _TrpC -KAR2SP-GFP-HDEL을 함유하는 Δ lhs1 결실변이체 (레인 3), 및 Δ lhs1 결실변이체 (레인 4)로부터 추출된 단백질은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되었다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨졌으며, 단일클론 안티-GFP N-말단 항체 (상부 panel), 및 일차 항체로서 쥐 안티-액틴 단일클론 항체, 및 이어 이차 항체로서 염소 안티-마우스 IgA+IgG+IgM, (H+L)항체 (하부 panel)가 탐침으로 사용되었다. 해당 분자량의 기대된 단백질 산물 및 신호 펩티드의 위치가 표시되어 있다.

도 8은 Δ lhs1 결실변이체의 세포외 효소 분비의 결함을 보여준다. 자일라나아제(xylanase), 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 글루카나아제(glucanase), 자일로시다아제(xylosidase), 아라비노시다아제(arabinosidase), 및 라카아제(laccase)의 효소 활성이 1% 벼 세포벽이 첨가된 변형된 HMT 배지에서 키운 야생형 및 Δ lhs1 결실변이체로부터의 배양 여과액을 사용하여 분석되었다. 야생형과 비교된 Δ lhs1 결실변이체의 상대적 효소 활성(%)은 각 추출물에서 단백질의 양으로 표준화 후 계산되었다. 값은 대표 자료 세트에서 2 회 반복의 혼합물의 결과로부터 계산되었으며, 별도의 생물학적 반복에서도 비슷한 결과가 보였다. Ara: 아라비노시다아제, Xylo: 자일로시다아제, Lac: 라카아제, Xyl: 자일라나아제, PGa: 폴리갈락투로나아제, Glu: 글루카나아제.

도 9는 LHS1의 결실변이가 AVR-Pita 기능 및 분비에 충격을 주는 것을 보여준다. (A)는 야생형 KJ201 (AVR - Pita), 결실변이체 Δ lhs1 (AVR - Pita) 및 감염에 대한 양성 대조구 균주 O-135 (avr - pita ^- )로 접종된 재배품종 야시로모찌 (Pi - ta) 및 YT-16 (pi - ta ^- )로 수행된 전 식물 분석을 보여준다. 비친화적 KJ201은 일반적으로 야시로모찌 상에 연장된 HR로 인한 드물고, 암갈색, 비포자형성 반점을 제외한 두드러진 증상을 형성하는데 실패하였다. 친화적 재배품종 YT16 상에는 전형적인 확장성 병반이 생성되었다. Δ lhs1 결실변이체는 감수성 재배품종 YT16에 생성된 것과 유사한 드물고, 작은, 흰색의 병반을 야시로모찌 상에 형성하였다. 7 dpi에 촬영되었다. (B)는 48 hpi에 야시로모찌 벼 엽초에서, 야생형 균주는 IH를 함유하는 첫 번째 침입된 세포 (좌측)의 96%의 과민성 사멸을 유도했으나, 결실변이체는 IH를 함유하는 드문 벼 세포 (우측)의 9%에서만 HR을 유도하였음을 보여준다. 조직은 진균 및 벼 HR을 보이게 하기 위해 트리판블루로 염색되었다. 막대 = 20㎛. (C) 는 감수성 YT16 엽초 세포에 있어, 야생형 KJ201에 의해 AVR - Pita 프로모터 및 신호 펩티드 (APitaSP:GFP)를 사용하여 발현된 GFP는 BIC (화살표) (좌측)에 분비되어 축적되었음을 보여준다. 표 2에 제시된 바와 같이, Δ lhs1 결실변이체 (APitaSP:GFP)에 의한 GFP 발현은 일반적으로 BICs (우측)에서 관찰되지 않는다. 사진은 36±2 hpi에 촬영되었다 (상부: differential interference contrast (DIC) image, 하부: 4 초 노출의 GFP 필터). 양 그림은 동일한 배율로 촬영되었다. 막대 = 10 ㎛. 첫 번째 세포에서 BIC 발달의 도해는 현미경 관찰에 근거하여 준비되었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Magnaporthe oryzae mutant in which MoLHS1 gene is deleted and use thereof <130> PN09021 <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3000 <212> DNA <213> MoLHS1 ORF <400> 1 atgtcgcctc ttataaagct actttgttct ttgtttctat tctcctctaa tgtcctcgcc 60 atctcggccg ttataggcat cgacctgggt actgagtatc tcaaggcttc acttgtaaag 120 ccgggaatcc ccctcgacat tgtcttgacc aaggattcgc ggcgcaaaga aatatcggcg 180 gtcgtcttca agccaccacg aaatggacca aagactggag aataccccga gcgtgcctat 240 ggctccgacg ccatggccct cgccccgcgc ttccctggcg acgtctaccc gaacctgaaa 300 gccctcctgg gcctaccaac cgacacctcg attgttctcg agtacgctgc ccgccacccc 360 gcactgcagc tcggctcgca caagcttcgg aagacggcca ctttcaagag tgcgggtgct 420 ttcagccccg aagaggaggc ttggatggtt gaggagcttc tggccatgga actccagagt 480 gtacaaaaga gcgcagagga gatggccggt tcgacagttc gctccgccgt cattacggtt 540 ccgcccttct acaccctcga ggagaggcgc gccaccgaga ccgccgccga gctcgcaggc 600 cttcgagtcc tgtcgctcat cagcgacggt cttgccgttg ggcttcacta cgccactagc 660 agaaccttcc ccaacatcaa 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Claims

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마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)에 시험 물질을 처리하는 단계; 및

마그나포르테 오리자 내의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 MoLHS1 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 벼 도열병 방제 물질의 스크리닝 방법.