KR101424101B1 - 벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용한 벼 도열병균의 정량적 검출방법 - Google Patents

벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용한 벼 도열병균의 정량적 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특이도 및 민감도가 우수한 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용해 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 벼 도열병균 검출용 조성물은 벼 도열병의 분자생물학적 예찰 시스템을 정착시킬 수 있고 벼 도열병균 감염의 객관적인 수치화가 가능하도록 한다.

Description

벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용한 벼 도열병균의 정량적 검출방법{Composition for detecting Magnaporthe oryzae and method for Quantitative analysis of Magnaporthe oryzae using the same}
본 발명은 도열병균을 정량적으로 검출하기 위한 벼 도열병균 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자와 혼성화할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브가 포함된 벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용하여 도열병균을 정량적으로 검출할 수 있는 검출방법에 관한 것이다.
벼 도열병은 벼 재배시 발생되는 병해 중에서 가장 큰 피해를 주는 것으로 우리나라를 포함한 여러 나라의 벼 경작지에서 발생되고 있다. 현재 도열병으로 인한 추정 알곡 피해량은 전세계적으로 천만톤에 이르는 것으로 추산된다.
벼 도열병의 진단은 현재 육안 관찰에 의한 방법이 주로 사용되고 있으나, 육안으로 관찰이 가능할 정도로 병이 진행되었다면, 도열병이 확산되기 충분한 정도의 초기전염원이 존재하고 있다고 볼 수 있으므로 병의 확산을 예방하기에는 시기적으로 어려움이 있는 상태이다. 그러나 이러한 어려움에도 불구하고, 분자생물학적 수단을 이용한 예찰 방법은 현재까지 개발되지 못한 상태이다.
이에 본 발명자들은 도열병을 진단 및 예찰하기 위한 연구를 거듭한 결과, 도열병 발생에 필수적인 병원성 관련 유전자로서 모든 도열병균에 한 개씩 존재하는 하이드로포빈 유전자를 이용하여 벼 도열병을 특이적으로 진단할 수 있는 높은 민감성의 프라이머 및 프로브를 발명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 벼의 도열병균, 특히 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 다른 병원균을 배제하고 특이적으로 도열병균을 높은 민감도로 검출하고자 하였다. 그리고 이러한 정량적 검출방법을 통해서 도열병의 효과적인 방제 대책을 계획할 수 있도록 한다.
본 발명은 위와 같은 과제를 달성하기 위해 다음과 같은 과제 해결 수단을 제공한다:
1. 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 벼 도열병균 검출용 조성물.
2. 위1에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 하이드로포빈 유전자에 특이적으로 혼성화되는 것을 특징으로 하는 벼 도열병균 검출용 조성물.
3. 위1에 있어서, 상기 조성물에 서열번호 4로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 벼 도열병균 검출용 조성물.
4. (a) 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4로 표시되는 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계,
(b) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트 및 상기 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계, 및
(c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물에서의 형광신호를 측정하여, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
5. 위4에 있어서, 상기 시료는 벼의 잎, 줄기 및 알곡 중 어느 하나에서 선택된 것을 특징으로 하는, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
6. 위4에 있어서, 상기 벼 도열병균은 Magnaporthe oryzae KI197인 것을 특징으로 하는, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
7. 위4에 있어서, 상기 형광물질은 5-카복시플루오레세인 (5-carboxyfluorescein: 5-FAM), 6-카복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein: 6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (tetrachlorofluorescein: TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (hexachlorofluorescein: HEX) 및 2',7'-디메톡시(dimethoxy)-4',5'-디클로로(dichloro)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: JOE) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
8. 위4에 있어서, 상기 프라이머 세트 및 상기 프로브는 서열번호 1의 하이드로포빈 유전자에 특이적으로 혼성화되는 것을 특징으로 하는, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
본 발명은 벼 도열병균을 정량적으로 측정할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용하여 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자와 혼성화할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이를 이용하여 벼 도열병균을 정량적으로 검출할 수 있는 검출방법에 관한 것이다.
상기 검출방법은 우수한 특이성 및 민감성을 제공한다.
벼 도열병의 정확한 진단 및 예찰을 통해서 도열병의 방제를 위해서 사용되는 많은 인력과 농약의 사용을 방지하여 농작물의 잔류독성, 인축에 대한 중독, 생태계 파괴등의 부작용을 예방할 수 있다. 또한 하이드로포빈 유전자를 특이적으로 정량적 검출하여 방제 대책을 효과적으로 계획할 수 있다.
도 1은 Magnaporthe oryzae 유전체당 하나의 하이드로포빈 유전자가 존재하고 있음을 나타낸다.
도 2는 MHP1_84F 및 MHP1_351R 프라이머를 이용하여 도열병균의 종류별로 하이드로포빈 유전자를 검출한 것을 나타낸다. (1, KI197; 2, KJ101; 3, KJ201; 4, KI305; 5, KJ401)
도 3은 MHP1_84F 및 MHP1_351R 프라이머를 이용하여 도열병균을 포함한 진균의 DNA를 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다. (1, Magnaporthe oryzae race KI197; 2, Cochliobolus miyabeanus; 3, Gibberella zeae; 4, Gibberella fujikuroi; 5, Rhizoctonia solani)
도 4는 pGEM-T 벡터의 모식도이다.
도 5는 클로닝된 증폭산물을 이용하여 측정된 형광의 세기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Magnaporthe oryzae race KI197의 본체 DNA를 대상으로 한 증폭산물에서 측정된 형광의 세기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 저항성 및 감수성 이병 조직으로부터의 도열병균 본체 DNA를 계측한 것이다.
본 발명은 벼 도열병균을 정량적으로 검출할 수 있는 벼 도열병균 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자와 혼성화할 수 있는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 벼 도열병균 검출용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브는 벼 도열병균을 검출을 위해 벼 도열병균에 한 카피(copy)씩만 존재하는 하이드로포빈 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있도록 제작하였다. 따라서, 본 발명에 따른 하이드로포빈 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 형광성 프로브를 포함하는 DNA 증폭 반응 혼합물을 이용하여 벼 도열병을 정량적으로 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
도열병균(Magnaporthe oryzae 또는 Magnaporthe grisea)은 하이드로포빈(hydrophobin) 유전자를 가지고 있으며, 하이드로포빈 유전자는 도열병 발생에 필수적인 병원성 관련 유전자로서 모든 도열병균에 한 개씩만 존재한다.
본 발명은 이러한 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자와 혼성화할 수 있는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 벼 도열병균 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트는 벼 도열병 하이드로포빈 유전자(Magnaporthe oryzae HYDROPHOBIN gene; magnaporin)를 검출할 수 있는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 센스 프라이머 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머를 포함한다.
본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(intersimple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 변형하여 디자인될 수 있다.
본 발명에 따른 벼 도열병균 검출용 조성물 또는 이를 이용하는 방법은 서열번호 4로 표시되는 프로브를 이용할 수 있다. 본 발명자들은 프로브를 이용하여 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자를 정량적으로 분석하는 방법에 적용시켰다.
본 발명에 따른 프로브는 TagMan assay에 이용될 수 있는바, TagMan 프로브는 형광 리포터 분자 및 형광 소멸자를 포함하는 올리고 뉴클레오티드 프로브이며, PCR 어닐링(annealing) 단계에서 DNA 주형에 특이적으로 혼성화되지만, 프로브의 3'-말단에 형광 소멸자가 부착되어 있어서 빛을 주어도 형광을 발하지 못한다. 이후 PCR의 다음 단계인 익스텐션(extension)단계에서 DNA 중합효소가 가지고 있는 5’→3’ 뉴클레아제(nuclease) 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되면 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광 소멸자에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 된다. 따라서, 형광의 세기를 측정하게 되면 DNA의 양을 정량적으로 분석할 수 있게 된다.
상기 올리고 뉴클레오티드 프로브의 말단의 인접한 부위에 결합하는 형광성 리포터 분자는 5-카복시플루오레세인 (5-carboxyfluorescein: 5-FAM), 6-카복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein: 6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (tetrachlorofluorescein: TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (hexachlorofluorescein: HEX) 및 2',7'-디메톡시(dimethoxy)-4',5'-디클로로 (dichloro)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: JOE)등이 바람직하다.
상기 형광 소멸자 분자는 블랙홀 켄처 다이 (black hole quencher dye; BHQ1), 테트라메틸(tetramethyl)-6-카복시로다민 (carboxyrhodamine: TAMRA), 테트라프로파노(tetrapropano)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: ROX), 시아닌 (cyanine), 안트로퀴논 (anthraquinone), 니트로티아졸 (nitrothiazole) 및 니트로이미다졸 (nitroimidazole) 등이 바람직하다.
가장 바람직하게는 상기 형광성 리포터 분자는 5-카복시플루오레세인이고, 상기 형광 소멸자는 3' BHQ1이다.
본 발명에 있어서, 상기 리포터 형광 분자가 방출하는 형광의 상대적 증가가 PCR 증폭 도중에 실시간으로 모니터될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자와 혼성화된다.
본 발명에 있어서 “혼성화”는 DNA 주형과 비공유적으로 결합하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 프라이머가 DNA 증폭반응에서 본래의 기능을 할 수 있을 정도로 DNA 주형과 비공유적으로 결합되어 있는 상태를 의미하는 것이다. 즉, DNA 주형에 대하여 완전하게 왓슨/크릭 염기쌍을 이루는 것뿐만 아니라, 부분적으로 왓슨/크릭 염기쌍을 이루지 못한 부분이 있다 하더라도, 프라이머로 기능을 할 수 있을 정도로 DNA 주형에 대해 결합한 것을 의미한다.
본 발명에 따른 조성물은 전사, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 전사효소, 데옥시뉴클레오티드, DNA 증폭 반응에 적합한 열안정성 폴리머라제 및 핵산의 표지화 및 검출용 시약을 포함할 수 있다.
본 발명은 (a) 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4로 표시되는 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계, (b) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트 및 상기 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계, 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물에서의 형광신호를 측정하여, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 DNA 증폭하는 단계는 실시간(real time) PCR을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 실시간 PCR은 PCR 증폭산물을 실시간으로 모니터링하여 증폭산물의 정확한 정량이 가능하도록 하며, 형광의 세기를 측정하여 PCR 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.
상기 DNA 주형을 증폭하는 단계는 통상적인 DNA 증폭반응과 동일하게 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension) 과정을 포함한다.
본 발명의 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법은 도열병균의 감염정도를 이미 알고 있는 벼로부터 얻은 DNA 주형을 이용하여 표준곡선을 작성하는 단계 및 미지의 DNA 시료를 이용하여 측정된 형광 세기의 값을 상기 표준곡선에 대입하여 벼 도열병균의 하이드로포빈 유전자의 함량을 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 시료는 벼의 어느 부위에서든 채취할 수 있으며,　바람직하게는 벼의 잎, 줄기 및 알곡 중 어느 하나에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 벼의 잎이다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 벼 도열병균은 Magnaporthe oryzae KI197, Magnaporthe oryzae KJ101, Magnaporthe oryzae KJ201, Magnaporthe oryzae KI305 및 Magnaporthe oryzae KJ401 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 벼 도열병균 검출방법은 Magnaporthe oryzae KI197을 검출하는데 적합하다. 본 발명의 벼 도열병균 검출 방법은 Magnaporthe oryzae 검출시 우수한 민감도를 가질 수 있다. 실시간 PCR을 통해 40cycle 증폭시킨 증폭산물에서 약 200 copy의 하이드로포빈 유전자를 검출할 수 있었으며(도 5 참고), 약 30 femtogram의 본체 DNA까지 검출할 수 있었다(도 6 참고).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다.
[실시예]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 벼 도열병균 하이드로포빈 유전자 추출
벼 도열병균의 감염여부를 확인하기 위하여 Magnaporthe oryzae race KI197로부터 genomic DNA를 분리하여 본 발명의 실시간 PCR 주형으로 사용하였다.
실시예 2. 도열병균 특이적 프라이머의 제작
1) 프라이머의 제작
벼 도열병균 하이드로포빈 유전자를 검출하기 위한 PCR에 이용될 프라이머를 디자인하여 센스 프라이머(MHP1_84F: 서열번호 2: 5'-GGTCCCTACACTCCCTGCT-3')와 안티센스 프라이머(MHP1_351R: 서열번호 3: 5'-ACCCTGGTCAAGCTGTTCGATTGT-3')를 합성하였다.
2) 증폭산물의 검출
도열병균을 포함한 모든 균주는 PDbroth, 25℃, 150 rpm, 암조건에서 3일간 증식시켰으며 수거한 균사체는 균사체로 마쇄한 후 이로부터 본체 DNA를 얻었다.
2-1) 벼 도열병균 검출 여부
도 2를 참조하면, 모든 도열병균주로부터 동일한 크기의 증폭산물을 검출할 수 있음을 알 수 있다.
2-2) 벼 도열병균 외 진균 검출 여부
도 3에 나타난 바와 같이, M. oryzae race KI197를 포함해 Cochliobolus miyabeanus, Gibberella zeae, Gibberella fujikuroi, 및 Rhizoctonia solani를 대상으로 상기 프라이머를 혼성화하여 증폭시킨 결과 도열병균을 제외한 다른 병원균들의 경우에는 증폭산물이 나타나지 않았다. 이를 통해, 상기 프라이머는 벼 도열병균에만 특이적으로 혼성화함을 알 수 있었다.
실시예 3. 하이드로포빈 유전자 클로닝
상기 프라이머를 이용하여 얻은 268bp크기의 증폭산물을 pGEM-T easy vector에 제작사의 실험방법에 의거하여 클로닝하였다. M13 프라이머(서열번호 5: 5’-gttgggtaacgccaggg-3')를 이용한 염기서열 분석 결과 모든 염기서열이 오차 없이 증폭되어 pGEM-T 벡터에 클로닝되었음을 확인하였다.
실시예 4. 프로브의 제작
본 발명의 실시간 하이드로포빈 유전자 증폭의 정량적 신뢰도를 증가시키기 위하여 Taqman probe를 두 프라이머 사이의 염기서열을 기반으로 제작하였다.
Taqman probe는 Expedite 8909 DNA/PNA 합성기 (PerSeptive Biosystems 사)를 이용하여 1 μmole 스케일로 트리틸-온 (trityl-on) 상태로 상기 합성기의 사용 매뉴얼에 따라 합성하였다. 3'-말단에 인접하여 도입되는 BHQ1 형광 소멸자는 BHQ가 CPG (controlled pore glass)에 부착되어 있는 3'-BHQ1-CPG (Glen Research사; 1-Dimethoxytrityloxy-3-[O-(N-carboxy-(tetramethyl-rhodamine)-3-aminopropyl)]-propyl-2-O-succinoyl-long chain alkylamino-CPG)를 사용하고, 5' -말단에 인접하여 도입되는 FAM은 5-플루오레세인 포스포라미디트 (Glen Research사; [(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-6-carboxyamidohexyl]-1-O-(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropyl)-phospharamidite)를 사용하였다.
또한, 각각의 염기는 dA bz, dC bz, dG dmf 및 T 포스포라미디트 (ABI 사)를 사용하였다. 5' 위치의 FAM의 축합의 경우에는 3분 동안의 축합 시간을 설정하였다 (일반적인 축합 시간은 1분). 프로브의 합성이 완료된 다음, 고체 지지물과 보호기는 티부틸아민:메탄올:증류수 (1:1:2)의 혼합물을 사용하여 65℃에서 3 시간 동안 가열하여 분리하였고, 반응이 완료된 최종 용액을 동결 건조하였다. 이어, 잔사를 1 ㎖의 100 mM 트라이에틸암모니움 아세테이트 (triethyl ammonium acetate, pH 7, 이하 'TEAA'라 한다) 용액에 용해하고, 이를 역상 고질 크로마토그래피 (Hamilton PRP1, 300 mm x 7 mm, 18-38 % 아세토나이트릴/100 mM TEAA, pH 7, 260 nm 및 560 nm에서 UV로 모니터)로 정제하였다. 원하는 분획을 동결 건조하고 1 ㎖의 증류수를 두 번 첨가하여 용해하고, 이를 다시 동결 건조하여 잔류하는 TEAA 염을 완전히 제거하였다. 그런 다음, 잔사에 1 ㎖의 증류수를 가한 후 이 용액을 70℃에서의 UV 흡광도 값으로 정량하였다. 농도 계산을 위한 자연 뉴클레오티드의 흡광 계수는 다음과 같다: dAMP, 15200; dCMP, 7700; TMP, 8830: dGMP, 11500; FAM, 20958; 및 BHQ, 31980. 올리고머의 구성은 효소분해 (알칼린 포스파타제 및 스낵 베놈 포스포디에스터라아제) 후 HPLC (Hewlett Packard, ODS hypersil, C-18; 20 mM K 2 HPO 4 , pH 5.6(A), MeOH(B), 100% A:40% B, 20 분) 및 레이져 탈착 질량 분석으로 확인하였다. 최종적으로 합성된 올리고 뉴클레오티드는 5'-FAM- aaggaaaggccatcgttgaagatg-BHQ1-3'이다.
상기 서열번호 2 및 서열번호 3으로 나타나는 프라이머와 Taqman 프로브, 그리고 증폭산물을 농도별로 첨가한 후 Roche사의 Taqman real time master와 Light Cycler 480 Ⅱ 시스템을 이용하여 copy number 별 유전자 증폭양상을 비교하였다. 사용한 프로그램은 95℃ 10초, 60℃ 30초였고 총 40 cycle의 증폭을 거치며 매회 증폭산물 생산으로 인한 형광물질 농도 증가를 측정하였다. 실험결과 이 시스템은 약 200 copy 내외의 하이드로포빈 유전자를 검출할 수 있을 정도로 우수한 민감도를 보였다 (도 5).
실시예 5. TaqMan probe / primer 를 이용한 도열병균의 정량적 측정
TaqMan probe 및 하이드로포빈 유전자 특이적 프라이머를 이용한 시스템의 감도를 본체 DNA 수준에서 검정하였다. 본체 DNA의 PCR 혼합액 내 농도를 12.5 ng에서 0.125 femtogram까지 희석시킨 후 상기 TaqMan probe/primer를 이용한 실시간 PCR을 동일한 조건에서 수행하였다. 실험 결과 이 시스템은 약 30 femtogram의 본체 DNA까지 측정할 수 있었다 (도 6).
실시예 6. 프라이머 작동성 확인
제작된 프라이머가 하이드로포빈 유전자를 정상적으로 증폭시키는지 검사하기 위하여 친화적 관계인 동진과 벼 도열병균 KI197, 비친화적 관계인 동진과 벼 도열병균 KJ401, 그리고 물만을 처리한 동진과 벼로부터 접종/처리 7일 후 얻은 이병 조직에서 병원균/벼 DNA 혼합체를 얻었다.
각 균주는 oatmeal 배지에 접종한 후 22℃, 광조건에서 2주간 배양하여 분생포자생성을 유도하였다. 멸균수를 배지에 붓고 loop로 긁은 다음 miracloth로 걸러 균사체가 제거된 분생포자 현탁액을 제조한 후 포자농도를 2 × 105 개/ml로 적정한 후 Tween20을 250 ppm이 되도록 가하였다. 6주간 기른 낙동과벼에 들의 표면이 포자현탁액에 고루 덮이도록 분무접종한 후 25℃, 100% 상대습도에서 20시간 동안 방치하였다. 그 후 자연광 상태의 온실에 옮기고 병 진전을 7일간 관찰한 후, 프라이머를 이용해 증폭시킨 결과 1.25 ng의 KI197/동진 DNA 혼합체 중 46 pg이 도열병 진균 DNA임을 확인하였다.(도 7)
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 하이드로포빈 유전자에 특이적으로 혼성화되며, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae) 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물에 서열번호 4로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 벼 도열병균 검출용 조성물.
  4. (a) 서열번호 1의 하이드로포빈 유전자에 특이적으로 혼성화되며, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 4로 표시되는 형광물질로 표지된 프로브를 제작하는 단계,
    (b) 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트 및 상기 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계, 및
    (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭산물에서의 형광신호를 측정하여, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 시료는 벼의 잎, 줄기, 및 알곡으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 벼 도열병균은 Magnaporthe oryzae KI197인 것을 특징으로 하는, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 형광물질은 5-카복시플루오레세인 (5-carboxyfluorescein: 5-FAM), 6-카복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein: 6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (tetrachlorofluorescein: TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (hexachlorofluorescein: HEX) 및 2',7'-디메톡시(dimethoxy)-4',5'-디클로로 (dichloro)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: JOE)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 벼 도열병균을 정량적으로 검출하는 방법.
  8. 삭제
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