CN104195137A - 抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法。抑制Six2基因表达的shRNA，序列为SEQ ID NO.2。一种Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体，将所述的shRNA插入载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro的BamH I及EcoR I酶切位点所得。将所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。本发明筛选得到对Six2基因表达具有明显抑制作用的shRNA，并在此基础上成功构建了敲减Six2的慢病毒表达载体及慢病毒，获得了稳定敲除Six2基因的MES23.5细胞株，为进一步研究Six2的功能打下了良好的基础。

Description

抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法。

背景技术

帕金森病是常见的中老年神经系统变性疾病，50岁以上人群的发病率约为1％-2％。该病的病因及发病机制仍未完全阐明，其病理变化主要表现为中脑黑质部位DA能神经元的慢性进行性丢失。GDNF对DA能神经细胞具有很好的保护作用，然而外源性给予GDNF受到难以通过血脑屏障的限制，所以，积极探索有效促进内源性GDNF的表达调控机制将对保护受损的DA能神经细胞具有很好的应用前景。

转录因子Six2是Six同源盒家族中的一员，此家族成员有三个结构域：氨基端的结构域主要参与核定位；羧基端结构域是家族成员之间差异比较大的结构域，主要介导与启动子区的结合；位于中间的同源结构域是序列比较保守的区域。研究者最初在眼的视网膜中发现Six家族成员的存在，后来发现其在肾脏等器官的发育中均起着重要的作用。Six2基因缺失或突变会导致肾脏等器官的发育不全。同时另有研究发现，GDNF也是维持肾脏正常发育所必需的因子。GDNF缺失的小鼠，出生几小时后会因肾脏发育不全而死亡。我们前期实验也发现GDNF能够很好的保护受损的多巴胺能神经细胞。GDNF维持肾脏的正常发育与保护受损DA能神经细胞一样，均需要RET受体通过PI3K-Akt信号通路来介导。在肾脏发育过程中，Six2可直接结合于GDNF启动子区促进GDNF的表达，在6-OHDA损伤早期的DA能神经细胞，Six2是否也能促进GDNF的表达至今尚未见报道。鉴于此，本发明利用分子生物学的手段构建了Six2敲减的慢病毒，并筛选出敲减Six2基因的稳定细胞株，为后续研究Six2调控GDNF的功能奠定了很好的实验基础。

发明内容

本发明的目的是提供抑制Six2基因表达的shRNA。

本发明的另一目的是提供一种Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体及慢病毒。

本发明的又一目的是提供一种Six2基因敲除慢病毒的构建方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

抑制Six2基因表达的shRNA，选自序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2、序列如SEQ ID NO.4所示的shSix2-4或序列如SEQ ID NO.5所示的shSix2-5中的任意一条；优选序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2。

一种Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体，将本发明所述的抑制Six2基因表达的shRNA插入载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro的BamH I及EcoR I酶切位点所得。

所述的Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体的构建方法，包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的抑制Six2基因表达的shRNA；

(2)将步骤(1)合成的shRNA进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoRI酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamHⅠ酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证。

一种Six2基因敲除慢病毒，由本发明所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。

一种Six2基因敲除慢病毒的构建方法，包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的shRNA；

(2)将合成的干扰序列shSix2-2进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoR I酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamH I及EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证

(3)将上述成功连接干扰序列的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。

步骤(3)优选采用含10％FBS的DMEM培养基培养293T细胞，细胞密度生长至55～65％时进行病毒的转染：将权利要求3所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG，利用Lipofectamine^TM2000转染进293T细胞内；转染后的第3天收集细胞培养基，并换上新鲜的培养基；第4天再次收集细胞培养基，将两次收集的上清混匀，将上述培养基1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液利用孔径为0.45μm的PVDF滤器过滤至50ml离心管中，再次进行离心，弃去上清液得病毒沉淀。

一种稳定敲除Six2基因的MES23.5细胞株，采用MOI值为10的本发明所述的Six2基因敲除慢病毒pLV-shSix2感染MES23.5细胞，用含有终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选得到。

有益效果：

本发明针对Six2基因的不同靶点设计并筛选得到对Six2基因表达具有明显抑制作用的shRNA，并在此基础上成功构建了敲减Six2的慢病毒表达载体及慢病毒，获得了稳定敲除Six2基因的MES23.5细胞株，为进一步研究Six2的功能打下了良好的基础。

附图说明

图1、PCR产物及双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图

M:Marker；1，2，3，4，5：质粒经BamH I及EcoR I酶切产物

图2、病毒上清滴度稀释后转染293T细胞的荧光图片

A：病毒上清稀释10⁰倍；B：病毒上清稀释10²倍；C：病毒上清稀释10³倍；

D：病毒上清稀释10⁴倍；E：病毒上清稀释10⁴倍；F：病毒上清稀释10⁵倍

图3、病毒上清感染MES23.5细胞72h的图片

A：MES23.5细胞感染72h后的明场图片；B:MES23.5细胞感染72h后的荧光图片

图4、Western Blotting结果显示Six2蛋白表达的图片

1:对照组；2：shSix2-1组；3：shSix2-2组；4：shSix2-3组；5：shSix2-4组；6：shSix2-5组

图5、嘌呤霉素筛选稳定细胞株的图片

A：培养的正常的对照细胞；B:嘌呤霉素筛选第一代后的细胞；C:嘌呤霉素筛选第三代后的细胞；D:嘌呤霉素筛选第五代后的细胞。

具体实施方式

实施例1

设计并委托上海生工生物工程有限责任公司合成针对Six2的干扰序列分别如下：

shSix2-1:Forward:5’-GATCCGCCAAGGAAAGGGAGAACAATTCAAGAGATTGAACTCCCTTTCCTTGGTTTTTCG-3’(SEQ ID NO.1)；

shSix2-2:Forward:5’-GATCCGGCTACTGCTTCAAGGAAAATTCAAGAGATTTTCCTTGAAGCAGTAGCTTTTTCG-3’(SEQ ID NO.2)；

shSix2-3:Forward:5’-GATCCGGAATGAAAGCGTGCTCAATTCAAGAGATTGAGCACGCTTTCATTCTTTTTTCG-3’(SEQ ID NO.3)；

shSix2-4:Forward:5’-GATCCGCAGCCAACCTCGTGGACCTTTCAAGAGAAGGTCCACGAGGTTGGCTGTTTTTCG-3’(SEQ ID NO.4)；

shSix2-5:Forward:5’-GATCCGGCAACTTCCGCGAGCTCTATTCAAGAGATAGAGCTCGCGGAAGTTGCTTTTTCG-3’(SEQ ID NO.5)。

对照组Forward:：5’GATCCGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTCAAGAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTTTTTCG-3’(SEQ ID NO.6).

将合成的序列进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoR I酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌。次日挑取单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并用BamH I及EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆交由公司进行测序验证。

琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，显示在约60bp和9000bp处分别有两条明显的条带。将上述酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证，测序结果经Blast验证，发现基因克隆序列与合成的敲减序列完全一致(图1)。

实施例2 慢病毒pLV-shSix2的包装

采用含10％FBS的DMEM培养基培养293T细胞，细胞密度生长至约60％时进行病毒的转染。将上述成功连接敲减序列的载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG(购自Clontech公司)，利用Lipofectamine^TM2000转染进293T细胞内；转染后的第3天收集细胞培养基，并换上新鲜的培养基；第4天再次收集细胞培养基，将两次收集的上清混匀。将上述培养基1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液利用孔径为0.45μm的PVDF滤器过滤至50ml离心管中。再次进行离心(4℃、50 000rpm高速离心)，小心弃去上清液并晾干，按100ul/10cm培养皿的量加入DMEM(不含血清、双抗)重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。

实施例3 慢病毒pLV-shSix2生物学滴度测定

因为在包装的病毒中不含有发光蛋白，所以在做实验的过程中，在同样的实验条件下，我们同时包装了携带GFP基因的的慢病毒pLV-GFP，以此病毒来测定病毒的滴度，以及验证病毒感染成功与否。在滴度测定的前1天取一块96孔板，按照每孔1×10⁵cells的密度接种293T细胞。加polybrene到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为8μg/ml。用含有polybrene的完全培养基10倍梯度稀释病毒；各吸取10μl病毒稀释液到相对应的96孔板中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养过夜，8h后用新鲜的完全培养基换液，继续于培养箱培养96h后，用荧光显微镜计数荧光细胞数量。一般情况下，在最高稀梯度10^m的孔数出现N(N＜10)个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10^m×100TU/ml(10^m为稀释倍数)。

荧光显微镜下观察荧光对照组的GFP表达。转染24h后细胞内可见绿色荧光表达，48h时细胞绿色荧光表达明显，这一结果表明在293T细胞内，载体质粒和包装质粒进行了整合，形成了完整的病毒。慢病毒pLV-shSix2的生物学滴度检测为5.0×10⁷TU/ml(图2)。

实施例4 干扰效果的鉴定及敲减Six2基因稳定细胞株的筛选

采用含10％FBS的DMEM培养基培养MES23.5细胞(购自中国科学院上海细胞所)，待细胞密度生长至约60％时进行靶细胞感染。采用MOI值为10的慢病毒感染MES23.5细胞，96h后收集细胞。Western blotting方法检测Six2蛋白的表达，以确定不同的干扰序列敲除Six2基因的效果。

蛋白免疫印迹法：培养的正常的和敲除Six2的稳定细胞株，分别用PBS洗一遍，然后利用碧云天公司生产的蛋白裂解液裂解收集的细胞，并BCA法测定蛋白浓度，最后样品置于100℃变性10min，离心备用。处理好的样品经SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳、转膜、封闭和抗体孵育，最后置于Odyssey仪器扫描观察结果。扫描照片用软件Image·Quant5.0进行分析，以光密度值表示各组的蛋白相对表达量。

挑选干扰效果最好的细胞，用含有终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选能够稳定敲除Six2基因的细胞株，-80℃冰箱冻存备用。

将上述对照和实验组病毒分别感染MES23.5细胞，含有荧光的对照组感染48h后可见GFP荧光表达，72h后荧光强度显著增强，说明包装的病毒是具有感染能力的病毒，能够很好的感染MES23.5细胞。pLV-shSix2慢病毒按感染复数(MOI)10的感染效率较高，且细胞形态正常，死亡率较低，感染率为50％-60％(图3)。72h后用含有嘌呤霉素的培养基进行传代培养，传代最初发现细胞死亡较多，待传代5代后细胞几乎无死亡现象，表明剩余的细胞均是含有嘌呤抗性的细胞，稳定表达敲减序列的MES23.5细胞株已经被成功筛选(图4)。收集培养的MES23.5细胞，Western blotting结果显示，设计的干扰序列中shSix2-2、shSix2-4和shSix2-5序列中对应的Six2蛋白的表达量明显低于对照组细胞中的表达，敲除效果明显，说明我们成功筛选出了稳定敲减Six2的细胞株。shSix2-1和shSix2-3序列中对应的Six2蛋白的表达量变化较少(图5)。

Claims (8)

1.抑制Six2基因表达的shRNA，其特征在于选自序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2、序列如SEQ ID NO.4所示的shSix2-4或序列如SEQ ID NO.5所示的shSix2-5中的任意一条。

2.根据权利要求1所述的抑制Six2基因表达的shRNA，其特征在于选自序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2。

3.一种Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体，其特征在于将权利要求1或2所述的抑制Six2基因表达的shRNA插入载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro的BamH I及EcoR I酶切位点所得。

4.权利要求3所述的Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的抑制Six2基因表达的shRNA；

(2)将步骤(1)合成的shRNA进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoR I酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamH I及EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证。

5.一种Six2基因敲除慢病毒，其特征在于由权利要求3所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。

6.一种Six2基因敲除慢病毒的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的shRNA；

(2)将合成的干扰序列shSix2-2进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoR I酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamH I及EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证

(3)将上述成功连接干扰序列的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。

7.根据权利要求6所述的Six2基因敲除慢病毒的构建方法，其特征在于步骤(3)采用含10％FBS的DMEM培养基培养293T细胞，细胞密度生长至55～65％时进行病毒的转染：将权利要求3所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG，利用Lipofectamine^TM2000转染进293T细胞内；转染后的第3天收集细胞培养基，并换上新鲜的培养基；第4天再次收集细胞培养基，将两次收集的上清混匀，将上述培养基1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液利用孔径为0.45μm的PVDF滤器过滤至50ml离心管中，再次进行离心，弃去上清液得病毒沉淀。

8.一种稳定敲除Six2基因的MES23.5细胞株，其特征在于采用MOI值为10的权利要求5所述的Six2基因敲除慢病毒pLV-shSix2感染MES23.5细胞，用含有终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选得到。