CN112204148A - 具有增强功能的修饰的免疫细胞及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了基因编辑的修饰的免疫细胞或其前体(例如，基因编辑的修饰的T细胞)，其包含对目标抗原具有特异性的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)以及一个或多个内源基因座中的插入和/或缺失，其中内源基因座编码T细胞功能的调节子，从而导致免疫细胞具有增强的功能。还提供了组合物和治疗方法。本发明提供了筛选具有增强的免疫功能(例如，T细胞功效、T细胞记忆和/或T细胞持久性)的TCR‑或CAR‑T细胞的方法。

Description

具有增强功能的修饰的免疫细胞及其筛选方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以其整体特此通过引用并入的2018年3月27日提交的美国临时申请号62/648,722的优先权。
关于联邦政府赞助研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)授予的赞助CA120409的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
背景技术
过继性细胞疗法领域目前包括CAR-和TCR-工程化T细胞，并且已从基础免疫原理发展成范式转移临床免疫疗法(paradigm-shifting clinical immunotherapy)。工程化以表达靶向所选细胞的人工受体的T细胞的过继性细胞疗法已为攻击癌症提供了令人兴奋的新方法，并且对慢性感染和自身免疫具有相同的前景。利用合成生物学的原理，免疫学和基因工程学的进步已使得产生表现期望特异性和增强功能性的人T细胞成为可能。例如，用CD19-特异性CAR T细胞治疗的晚期B细胞白血病和淋巴瘤患者的临床试验已在成人和儿童中诱导了持久的缓解。
T细胞衰竭是在多种慢性感染和癌症期间出现的T细胞功能障碍的状态。其被定义为不良的效应子功能、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆T细胞的转录状态。衰竭防止对感染和肿瘤的最佳控制。基于有效T细胞的疗法的另一障碍是T细胞易受目标细胞的微环境的免疫抑制。例如，前列腺癌细胞的微环境中的PD-L1抑制了TCR-或CAR-工程化T细胞的功能。
因此，本领域需要鉴定调控T细胞的功能的基因。具体地，本领域需要鉴定调控TCR-或CAR-工程化T细胞功能的基因。
发明内容
本发明基于以下发现：无偏的体内全基因组筛选(unbiased,in vivo genome-wide screen)可以鉴定调控T细胞功能(例如，T细胞功效、T细胞记忆和/或T细胞持久性)的基因。本发明提供了筛选具有增强的免疫功能(例如，目标细胞杀伤)的TCR-或CAR-T细胞的方法。本发明的筛选方法导致鉴定了若干基因，这些基因在下调时导致TCR-或CAR-T细胞具有增强的免疫功能。因此，本发明提供了修饰的免疫细胞，其包括外源TCR和/或CAR，以及内源基因座中的插入和/或缺失，其中内源基因座编码T细胞功能的调节子。
另一方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，其包括编码转录调节子的基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调内源转录调节子的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
在某些示例性实施方式中，基因座中的插入和/或缺失由CRISPR-相关系统介导。在某些示例性实施方式中，基因座中的插入和/或缺失由CRISPR/Cas9介导。在某些示例性实施方式中，转录调节子是转录因子或表观遗传调节子(epigenetic regulator)。
在某些示例性实施方式中，转录因子是SIX2或KLF4。在某些示例性实施方式中，转录因子是SIX2。在某些示例性实施方式中，编码SIX2的基因座中的插入和/或缺失能够下调SIX2的表达，和/或下调SIX2的一个或多个下游目标的基因表达。在某些示例性实施方式中，转录因子是KLF4。在某些示例性实施方式中，编码KLF4的基因座中的插入和/或缺失能够下调KLF4的表达，和/或下调KLF4的一个或多个下游目标的基因表达。
在某些示例性实施方式中，表观遗传调节子是组蛋白甲基化的调节子。在某些示例性实施方式中，组蛋白甲基化的调节子是组蛋白甲基转移酶复合物的组分。在某些示例性实施方式中，组蛋白甲基转移酶复合物的组分是组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶2D(KMT2D)。
在某些示例性实施方式中，组蛋白甲基转移酶复合物的组分是PAGR1。在某些示例性实施方式中，编码PAGR1的基因座中的插入和/或缺失能够下调PAGR1相关的组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标的基因表达。在某些示例性实施方式中，PAGR1相关的组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标选自ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3和TNFAIP3。
在某些示例性实施方式中，外源TCR选自野生型TCR、高亲和力TCR和嵌合TCR。在某些示例性实施方式中，外源TCR包含至少一个二硫键。在某些示例性实施方式中，外源TCR包含TCRα链和TCRβ链。
在某些示例性实施方式中，外源CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在某些示例性实施方式中，抗原结合结构域选自抗体、scFv和Fab。在某些示例性实施方式中，外源CAR进一步包含铰链结构域。在某些示例性实施方式中，铰链结构域选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链结构域、包含CD8的氨基酸序列的铰链或其任何组合。在某些示例性实施方式中，跨膜结构域选自人工疏水序列和I型跨膜蛋白的跨膜结构域、T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在某些示例性实施方式中，胞内结构域包含选自下列的至少一个共刺激结构域：TNFR超家族中蛋白质的共刺激结构域、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3。在某些示例性实施方式中，胞内结构域包含选自下列的胞内结构域：人CD3ζ链的胞质信号传导结构域、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、带有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
另一方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的蛋白质的一个或多个基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调一个或多个内源基因的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
另一方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的蛋白质的一个或多个基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调一个或多个内源基因的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
另一方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码选自KLF4、PAGR1、和SIX2的蛋白质的一个或多个基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调一个或多个内源基因的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
另一方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码KLF4的基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调内源KLF4的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
另一方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码SIX2的基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调内源SIX2的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
另一方面，提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码PAGR1的基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调内源PAGR1的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
在某些示例性实施方式中，目标细胞上的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞源自人。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的T细胞。
另一方面，提供了用于产生修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包含：a)将第一核酸引入免疫细胞中，该第一核酸包含编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；和b)将能够下调内源转录调节子的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
在某些示例性实施方式中，内源转录调节子是转录因子或表观遗传调节子。在某些示例性实施方式中，转录因子是SIX2或KLF4。在某些示例性实施方式中，下调转录因子的基因表达导致SIX2的基因表达下调，和/或SIX2的一个或多个下游目标的基因表达下调。在某些示例性实施方式中，下调转录因子的基因表达导致KLF4的基因表达下调，和/或KLF4的一个或多个下游目标的基因表达下调。
在某些示例性实施方式中，表观遗传调节子是组蛋白甲基化的调节子。在某些示例性实施方式中，组蛋白甲基化的调节子是组蛋白甲基转移酶复合物的组分。在某些示例性实施方式中，组蛋白甲基转移酶复合物的组分是组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶2D(KMT2D)。在某些示例性实施方式中，组蛋白甲基转移酶复合物的组分是PAGR1。在某些示例性实施方式中，下调组蛋白甲基转移酶复合物的组分的基因表达导致PAGR1的基因表达下调，和/或PAGR1相关的组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标的基因表达下调。在某些示例性实施方式中，PAGR1相关的组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标选自ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3和TNFAIP3。
另一方面，提供了用于产生修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：a)将第一核酸引入免疫细胞中，该第一核酸包含编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；和b)将能够下调选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：a)将第一核酸引入免疫细胞中，该第一核酸包含编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；和b)将能够下调选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于产生修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：a)将第一核酸引入免疫细胞中，该第一核酸包含编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；和b)将能够下调选自KLF4、PAGR1和SIX2的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于产生修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：a)将第一核酸引入免疫细胞中，该第一核酸包含编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；和b)将能够下调内源KLF4的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于产生修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括a)将第一核酸引入免疫细胞中，该第一核酸包含编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；和b)将能够下调内源SIX2的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于产生修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：a)将第一核酸引入免疫细胞中，该第一核酸包含编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列；和b)将能够下调内源PAGR1的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
在某些示例性实施方式中，通过病毒转导引入第一核酸。在某些示例性实施方式中，病毒转导包括使细胞与包含第一核酸的病毒载体接触。在某些示例性实施方式中，病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体。
在某些示例性实施方式中，能够下调基因表达的一种或多种多肽和/或核酸中的每一个包含CRISPR相关系统。在某些示例性实施方式中，CRISPR相关系统包含CRISPR核酸酶和引导RNA。在某些示例性实施方式中，引导RNA包含与内源基因的目标序列充分互补的引导序列。在某些示例性实施方式中，引导序列包含SEQ ID NO:31-66中任一项所示的核酸序列。在某些示例性实施方式中，CRISPR核酸酶和引导RNA包含核糖核蛋白(RNP)复合物。
在某些示例性实施方式中，目标序列在PAGR1基因内，并且包含SEQ ID NOs:31-36中任一项所示的核酸序列。在某些示例性实施方式中，目标序列在SIX2基因内，并且其中引导RNA包含SEQ ID NOs:43-48中任一项所示的核酸序列。在某些示例性实施方式中，目标序列在USP27X基因内，并且其中引导RNA包含SEQ ID NOs:49-54中任一项所示的核酸序列。在某些示例性实施方式中，目标序列在CEACAM19基因内，并且其中引导RNA包含SEQ ID NOs:55-60中任一项所示的核酸序列。在某些示例性实施方式中，目标序列在C1orf141基因内，并且其中引导RNA包含SEQ ID NOs:61-66中任一项所示的核酸序列。
在某些示例性实施方式中，CRISPR核酸酶和/或引导RNA由多核苷酸编码。在某些示例性实施方式中，多核苷酸包含载体和/或合成mRNA。
在某些示例性实施方式中，能够下调基因表达的一种或多种多肽和/或核酸中的每一个通过电穿孔引入。在某些示例性实施方式中，目标细胞上的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞源自人。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的T细胞。
另一方面，提供了用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源转录调节子的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调选自KLF4、PAGR1和SIX2的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源KLF4的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源SIX2的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源PAGR1的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
在某些示例性实施方式中，功能是肿瘤浸润。在某些示例性实施方式中，功能是肿瘤杀伤。在某些示例性实施方式中，功能是免疫抑制。在某些示例性实施方式中，功能是对PD-1、LAG-3、TIM-3和/或CTLA-4的免疫抑制具有抗性。
另一方面，提供了用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源转录调节子的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调选自KLF4、PAGR1和SIX2的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源KLF4的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源SIX2的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
另一方面，提供了用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，该方法包括：将能够下调内源PAGR1的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入免疫细胞中。
在某些示例性实施方式中，目标细胞上的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是自体细胞。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞源自人。在某些示例性实施方式中，修饰的细胞是修饰的T细胞。
另一方面，提供了用于鉴定基因的方法，该基因在下调时倒导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强，该方法包括下列步骤：a)向多个免疫细胞中引入编码对抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸文库，从而产生多个修饰的免疫细胞；b)向多个修饰的免疫细胞中引入多个靶向多种内源基因的试剂，从而产生多个编辑的免疫细胞；c)将多个编辑的免疫细胞与肿瘤细胞接触；d)选择一种或多种表现出免疫细胞功能增强的编辑的免疫细胞；和e)鉴定在步骤d)的一个或多个编辑的免疫细胞中下调的内源基因，从而鉴定基因，该基因在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强。
在某些示例性实施方式中，步骤a)和b)是同时进行的。在某些示例性实施方式中，步骤b)中的多种试剂各自包括编码独特引导RNA的核酸，该独特引导RNA靶向多个内源基因中的每一个。在某些示例性实施方式中，步骤b)中的多种试剂各自包括CRISPR核酸酶多肽或编码CRISPR核酸酶的核酸。在某些示例性实施方式中，步骤b)中的多种试剂各自包括CRISPR相关系统。在某些示例性实施方式中，CRISPR相关系统包括CRISPR核酸酶和引导RNA。在某些示例性实施方式中，引导RNA包含引导序列，该引导序列与调控免疫细胞的功能的基因的目标序列足够互补。在某些示例性实施方式中，CRISPR核酸酶和引导RNA包括核糖核蛋白(RNP)复合物。在某些示例性实施方式中，鉴定步骤e)包括鉴定靶向下调基因的独特引导RNA。
另一方面，提供了鉴定基因的方法，该基因在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强，该方法包括下列步骤：a)向多个免疫细胞中引入编码对抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸文库，并编码多个引导RNA，该引导RNA各自靶向多个内源基因中的每一个的独特区域，从而产生多个修饰的免疫细胞；b)向多个修饰的免疫细胞中引入CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的核酸，从而产生多个编辑的免疫细胞，其中多个内源基因的基因表达被下调；c)将多个编辑的免疫细胞与肿瘤细胞接触；d)选择一种或多种表现出免疫细胞功能增强的编辑的免疫细胞；和e)鉴定在步骤d)的一个或多个编辑的免疫细胞中下调的内源基因，从而鉴定基因，该基因在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强。
在某些示例性实施方式中，接触步骤c)包括将多个编辑的免疫细胞与包括肿瘤细胞的肿瘤细胞系接触。在某些示例性实施方式中，接触步骤包括将多个编辑的免疫细胞给予至包括肿瘤细胞的带肿瘤生物体中。
另一方面，提供了包含一种或多种核酸的核酸文库，其中一种或多种核酸中的每一个包括：第一核酸，其编码独特引导RNA；以及第二核酸，其编码对抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
在某些示例性实施方式中，第一核酸包括引导序列，该引导序列与内源基因的目标序列足够互补。在某些示例性实施方式中，一种或多种核酸中的每一个是载体。在某些示例性实施方式中，载体中的每一个包括第一表达盒(first expression cassette)，其包括可操作地连接至第一核酸的第一启动子；以及第二表达盒，其包括可操作地连接至第二核酸的第二启动子。在某些示例性实施方式中，第二表达盒进一步包括编码选择性标记物的多核苷酸序列。在某些示例性实施方式中，选择性标记物是荧光蛋白。
另一方面，提供了用于前述方面和/或实施方式中任一项的方法的前述方面和/或实施方式中任一种的修饰的免疫细胞或其前体细胞。
附图说明
从以下结合附图对示例性实施方式的详细描述，将更全面地理解本发明的前述和其它特征以及优点。
图1A-1B描绘了显示用单发CRISPR系统产生基因修饰的TCR-或CAR-T细胞文库的示意图。图1A描绘了单发CRISPR构建体的设计的示意图。图1B描绘了示例制备基因修饰的TCR-或CAR-T细胞文库的示意图。
图2描绘了根据本发明的实施方式使用TCR-或CAR-T细胞文库设计体外全基因组筛选(in vitro genome wide screen)的示意图。
图3A-3B描绘了根据本发明的实施方式使用TCR-或CAR-T细胞文库设计体内全基因组筛选的示意图。图3A描绘了显示筛选调控T细胞功能的基因的示意图。图3B描绘了显示筛选调控T细胞记忆和持久性的基因的示意图。
图4A-4B描绘了显示用照射的目标肿瘤细胞刺激的体外CAR-T细胞文库的扩增倍数的图。图4A描绘了显示CD19导向CAR-T细胞文库(CAR19)的扩增倍数的图。图4B描绘了显示用PC3-PSCA肿瘤细胞刺激的PSCA导向CAR-T细胞文库的扩增倍数的图。
图5A-5B描绘了显示肿瘤控制和分离的肿瘤浸润性淋巴细胞的功能的流式细胞仪分析。图5A显示了由CAR19文库T细胞消除Nalm6-GFP肿瘤细胞。图5B显示了在PC3-PSCA肿瘤细胞与PSCA-CAR文库T细胞共培养后T细胞活化标记物CD137的上调。
图6描绘了显示用于体内全基因组筛选的文库和选择过程的示意图，以鉴定CAR-T细胞疗法的抑制途径。
图7描绘了从单个引导RNA的深度测序和相对富集以及顶级候选物(TOPcandidates)的可能功能来鉴定的基因。
图8A-8B描绘了PC3-PSCA前列腺癌体内CRISPR筛选中的前20个候选物。图8A描绘了在PC3-PSCA模型中通过CRISPR筛选鉴定的前20个潜在治疗目标的热图。图8B描绘了前20个潜在治疗目标的富集倍数。
图9描绘了显示CaPan1胰腺癌体内CRISPR筛选中的前20个候选物的热图。
图10A-10B描绘了在不同肿瘤中重叠的顶级候选物。图10A描绘了来自不同肿瘤的前100、200和500个筛选命中的重叠基因。图10B描绘了重叠候选物的富集倍数。
图11描绘了顶级候选物的等级和倍数变化的图。
图12A-12C描绘了PC3-PSCA前列腺癌模型中候选物的验证。图12A描绘了PC3-PSCA前列腺癌模型中候选物验证的生物发光肿瘤图像。在NSG小鼠(n＝3)的侧腹中建立PC3-PSCA肿瘤。三周后，用1x106WT或KO PSCA CAR-T细胞(i.v.)处理小鼠。在(第0天)之前和用单次T细胞注射处理小鼠之后进行生物发光成像。图12B描绘了定量图像数据。图12C描绘了肿瘤体积数据。
图13A-13C描绘了CaPan1胰腺癌模型中候选物的验证。图13A描绘了CaPan1胰腺癌模型中候选物验证的生物发光肿瘤图像。在NSG小鼠(n＝3)的侧腹中建立CaPan1肿瘤。三周后，用1x106WT或KO PSCA CAR-T细胞(i.v.)处理小鼠。在(第0天)之前和用单次T细胞注射处理小鼠之后进行生物发光成像。图13B描绘了定量图像数据。图13C描绘了肿瘤体积数据。
图14A-14C描绘了A549-NY-ESO肺癌模型中候选物的验证。图14A描绘了A549-NY-ESO肺癌模型中候选物验证的生物发光肿瘤图像。在NSG小鼠(n＝3)的侧腹中建立A549-NY-ESO肿瘤。一周后，用1x107WT或KO NY-ESO TCR-T细胞(i.v.)处理小鼠。在(第0天)之前和用单次T细胞注射处理小鼠之后进行生物发光成像。图14B描绘了定量图像数据。图14C描绘了肿瘤体积数据。
图15A-15E描绘了显示PAGR1、Klf4和SIX2 KO在体外增强肿瘤控制的数据。图15A描绘了与PC3-PSCA和A375肿瘤共培养的PAGR1、Klf4和SIX2 KO CAR-T细胞的CD107a测定。图15B描绘了与CaPan1肿瘤共培养的PAGR1、Klf4和SIX2 KO CAR-T细胞的CD107A测定。图15C和15D描绘了基因敲除的CAR-T细胞的杀伤能力。图15E描绘了基因敲除的CAR-T细胞的CFSE增殖测定的结果。
图16A-16C描绘了显示PAGR1和Klf4 KO增强PC3-PSCA肿瘤控制的结果。图16A描绘了在PC3-PSCA前列腺癌模型中候选物验证的生物发光肿瘤成像。在NSG小鼠(n＝3)的侧腹中建立PC3-PSCA肿瘤。三周后，用1x106WT或KO PSCA CAR-T细胞(i.v.)处理小鼠。在(第0天)之前和用单次T细胞注射处理小鼠后进行生物发光成像。图16B描绘了定量图像数据。图16C描绘了肿瘤体积数据。
图17A-17B描绘了显示PAGR1 KO增强CaPan1肿瘤控制的结果。图17A描绘了在CaPan1胰腺癌模型中候选物验证的生物发光肿瘤图像。在NSG小鼠(n＝3)的侧腹中建立CaPan1肿瘤。三周后，用1x106WT或KO PSCA CAR-T细胞(i.v.)处理小鼠。在(第0天)之前和用单次T细胞注射处理小鼠后进行生物发光成像。图17B描绘了肿瘤体积数据。
图18A-18H描绘了显示PAGR1增强CAR-T细胞肿瘤积累和抑制抗性的结果。图18A描绘了PC3-PSCA模型中肿瘤浸润性CAR-T细胞的数量。图18B描绘了CaPan1模型中肿瘤浸润性CAR-T细胞的数量。图18C描绘了从肿瘤中分离的不同CAR-T细胞杀伤目标肿瘤细胞的百分比。图18D-18G描绘了在不同肿瘤浸润性CAR-T细胞上的所示抑制分子的表达水平。图18H描绘了显示PAGR1 KO增强肿瘤浸润性细胞的杀伤能力的结果。
图19A-19B描绘了显示PAGR1 KO减少CAR-T细胞的凋亡的结果。图19A描绘了在活化诱导的细胞死亡之后不同KO CAR-T细胞的凋亡的图。图19B描绘了显示与目标肿瘤细胞共培养之后不同KO CAR-T细胞的凋亡的图。
图20A-20D描绘了显示PAGR1 KO通过表观遗传学调控增强CAR-T细胞功能的结果。图20A描绘了在珠子刺激(bead stimulation)之前和之后基因KO T细胞中H3K4单甲基化和二甲基化的Western杂交。图20B描绘了PAGR1 KO和野生型T细胞中KMT2D下游基因的实时PCT结果。图20C描绘了在负调节子ARID1A和PRMT1上的H3K4单甲基化的ChIP测定的结果。图20D显示了通过实时PCR测量的促存活基因Bcl2和Myc的mRNA水平。
图21描绘了显示PAGR1 KO在同种模型中增强过继性T细胞疗法的结果。过继性转移野生型、PAGR1和Klf4 KO OT-I T细胞后B16-OVA肿瘤的体积。在C57/BL6小鼠(n＝4)的侧腹中建立B16-OVA肿瘤。8天后，用1x106WT或KO OT-I T细胞(i.v.)处理小鼠。在(第0天)之前和用单次T细胞注射处理小鼠后进行肿瘤测量。
图22描绘了对DNMT3A进行细胞内染色以确认所选gRNA的敲除效率的结果。
图23描绘了携带用于同源导向修复的供体模板的AAV质粒的图谱。
图24描绘了CRISPR/Cas9和AAV介导的同源重组以将GFP敲入DNMT3A基因座中的示意图。方框表示同源臂和gRNA目标基因座。
图25描绘了在慢病毒/AAV感染后CD19BBz和EGFP的表达。
图26描绘了使用本文所述的REP方案分选和扩增的T细胞中CD19BBz和EGFP的表达。
图27描绘了通过PCR扩增DNMT3A DNA与转基因之间的结合处来确认EGFP敲入DNMT3A gRNA目标区域的结果。方框表示DNMT3A的同源臂和gRNA目标基因座。箭头代表PCR引物。
图28描绘了显示CD107a在CD4和CD8 CD19BBz+KI细胞中以显著水平表达的结果。
图29描绘了显示INFγ在CD4和CD8 CD19BBz+KI细胞中以显著水平表达的结果。
图30描绘了显示TNFα在CD4和CD8 CD19BBz+KI细胞中以显著水平表达的结果。
图31描绘了显示IL-2在CD4 CD19BBz+KI细胞中以较高水平表达，但在CD8细胞中以低于CD19BBz T细胞中的水平表达的结果。
图32描绘了显示重复刺激后CD8细胞的数量的结果。
图33描绘了显示在连续杀伤测定结束时存活的癌细胞的数量的结果。
具体实施方式
本发明提供了用于修饰的免疫细胞或其前体(例如，修饰的T细胞)的组合物和方法，该修饰的免疫细胞或其前体包含外源(例如，重组、转基因或工程化)T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞被基因编辑，使得一种或多种内源基因的表达被下调。这些基因编辑的修饰的免疫细胞具有增强的免疫功能。在一些实施方式中，本发明的基因编辑的修饰的免疫细胞对免疫抑制(例如，对肿瘤微环境的免疫抑制因子)具有抗性。在某些实施方式中，免疫细胞具有编码调控免疫细胞功能的内源基因的基因的基因破坏。在某些实施方式中，内源基因负调控免疫细胞功能，使得当内源基因被下调时，免疫细胞具有增强的免疫细胞功能。
在一些实施方式中，提供的免疫细胞、组合物和方法改变或减少肿瘤微环境中T细胞抑制途径或信号的作用。本发明的修饰的免疫细胞抵消可以负控制T细胞活化和T细胞功能的抑制性受体或配体的上调和/或表达。例如，某些免疫检查点蛋白(例如，PD-1或PD-L1)在T细胞上和/或在肿瘤微环境中的表达可以降低过继性T细胞疗法的效力和功效。在过继性细胞疗法的环境下，这种抑制途径可以其它方式损害某些期望的效应子功能。肿瘤细胞和/或肿瘤微环境中的细胞通常上调某些抑制蛋白(如PD-L1和PD-L2)，从而传递抑制信号。这种蛋白质还可以在肿瘤微环境中的T细胞上(例如，在肿瘤浸润性T细胞上)上调，这可以在通过抗原受体(例如，TCR和/或CAR)信号传导或某些其它活化信号之后发生。此类事件可能有助于基因工程化免疫细胞(例如，TCR-或CAR-T细胞)，以获得衰竭的表型，如当与表达此类蛋白质的其它细胞相邻存在时，这进而可以导致功能降低。因此，本发明的修饰的免疫细胞解决了T细胞衰竭和/或缺乏T细胞持久性的问题，这是常规过继性细胞疗法的功效和治疗结果的障碍。
本发明还提供了体外和体内筛选方法，以鉴定参与肿瘤微环境中T细胞抑制途径或信号的基因。本发明还提供了体外和体内筛选方法，以鉴定调控T细胞记忆和持久性的基因。T细胞记忆由称为记忆T细胞的T细胞子集赋予。记忆T细胞是先前已经遇到目标抗原并对其响应的T细胞。在第二次遇到相同的目标抗原时，记忆T细胞可以增殖，与免疫系统第一次对目标抗原响应相比产生更快、更强的免疫响应。某些抑制途径或信号是本领域已知的，以防止T细胞记忆。因此，本发明的修饰的免疫细胞可以具有较强的持久性和功效。
应理解，本公开中描述的方法不限于本文公开的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而不意图是限制性的。
此外，除非另有说明，本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。这些技术对于技术人员是公知的，并且在文献中详细解释。参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)(包括所有补充材料)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版)，由MR Green和J.Sambrook以及Harlow等人所著，Antibodies:A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013年，第2版)。
A.定义
除非另有定义，本文所使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员普遍理解的含义。在存在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。除非上下文另有要求，单数形式应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，“或”的使用意为“和/或”。术语“包括”以及其它形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不是限制性的。
总体上，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法是本领域公知且通常使用的。除非另有说明，本文中提供的方法和技术总体上根据本领域公知的常规方法进行，并且如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般和更具体的文献中所述。根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域通常完成或如本文所述。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及医疗和药物化学结合使用的术语以及实验室程序和技术是本领域公知和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
为更容易地理解本公开，在下文定义选择的术语。
冠词“一(a)”和“一个(an)”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“要素(an element)”意为一个要素或多于一个要素。
当指代诸如量、持续时间等的可测量值时，本文所用的“约”意为涵盖距规定值±20％或±10％、更具体地±5％、甚至更具体地±1％、并且仍更具体地±0.1％的变量，因为这种变量适合于执行本公开的方法。
如本文所用，“活化”指代已充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”尤其指代正在进行细胞分裂的T细胞。
如本文所用，“减轻”疾病意为降低疾病的一种或多种症状的严重性。
如本文所用，术语“抗原”被定义为引起免疫响应的分子。这种免疫响应可能涉及抗体产生、或特定的免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解，任何大分子(包括实际上所有的蛋白质或肽)可以用作抗原。
此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫响应的蛋白质的核酸序列或部分核酸序列的任何DNA因此均编码本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而意见，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫响应。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而意见，抗原可以合成产生或者可以源自生物学样品。这种生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用，术语“自体的”意为指代源自相同个体的任何材料，其随后被重新引入个体中。
“共刺激分子”指代T细胞上的同源结合伴侣(cognate binding partner)，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激响应，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用，“共刺激信号”指代与初级信号(如TCR/CD3连接)结合的信号，其导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，则动物的健康继续恶化。相反，动物的“障碍”是健康状态，其中动物能够维持体内稳态，但是其中与没有障碍的情况相比，动物的健康状态不利。如果不治疗，障碍不一定会导致动物的健康状态进一步下降。
如本文所用，术语“下调”指代一种或多种基因的基因表达的减少或消除。
“有效量”或“治疗有效量”在本文中可以互换使用，并且指代有效实现特定生物学结果或提供治疗或预防益处的本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这种结果可以包括但不限于与不存在本发明的组合物时检测到的免疫响应相比，当给予哺乳动物时引起可检测水平的免疫抑制或耐受性的量。可以通过多种本领域公认的方法容易地评估免疫响应。技术人员将理解，本文所给予的组合物的量是变化的，并且可以基于多种因素(如待治疗的疾病或状况、待治疗的哺乳动物的年龄和身体状况、疾病的严重性、被给予的特定化合物等)来容易地确定。
“编码”指代多核苷酸中特定核苷酸序列(如基因、cDNA或mRNA)的固有性质，以在具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的生物学过程中用作合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果相应于基因的mRNA的转录或翻译在细胞或其它生物学系统中产生该蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常提供在序列表中)与非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以指代编码蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。
如本文所用，“内源性”指代来自或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何材料。
如本文所用，术语“表位”定义为抗原上的小化学分子，其可以引发免疫响应，包括B和/或T细胞响应。抗原可以具有一个或多个表位。大多数抗原具有多个表位，即，它们是多价的。总体上，表位的大小约为10个氨基酸和/或糖。优选地，表位为约4-18个氨基酸，更优选为约5-16个氨基酸，甚至最优选为6-14个氨基酸，更优选为约7-12，并且最优选为约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，总体上，整个三维结构而不是分子的特定线性序列是抗原特异性的主要标准，因此将一个表位与另一个表位区分开。基于本公开，本发明中使用的肽可以是表位。
如本文所用，术语“外源的”指代从生物体、细胞、组织或系统外引入或产生的任何材料。
如本文所用，术语“扩增”指代数量增加，如T细胞的数量增加。在一个实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于培养物中初始存在的数量增加。在另一实施方式中，离体扩增的T细胞的数量相对于培养物中的其它细胞类型增加。如本文所用，术语“离体”指代已从活生物体(例如，人)中去除并在生物体外(例如，培养皿、试管或生物反应器)繁殖的细胞。
如本文所用，术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指代包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用表达元件；其它表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，如黏粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)。
如本文所用，“同一性”指代两个聚合物分子之间(特别是两个氨基酸分子之间(如两个多肽分子之间))的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基时；例如，如果两个多肽分子中的每一个的位置被精氨酸占据，则其在此位置是相同的。两个氨基酸序列在比对中的相同位置具有相同残基的同一性或程度通常以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或相同位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，聚合物中的五个位置，长度为十个氨基酸)是相同的，则两个序列50％相同；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或相同，则两个氨基酸序列90％相同。
如本文所用，术语“免疫响应”被定义为对抗原的细胞响应，其在淋巴细胞将抗原分子识别为外源物并诱导抗体形成和/或活化淋巴细胞以去除抗原时发生。
术语“免疫抑制性”在本文用于指代降低总体免疫响应。
“插入/缺失”通常缩写为“插入缺失(indel)”，是遗传多态性的类型，其中基因组中存在(插入)或不存在(缺失)特定核苷酸序列。
“分离的”意为从天然状态改变或去除。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(如例如宿主细胞)中。
如本文所用，术语“敲低(knockdown)”指代一个或多个基因的基因表达降低。
如本文所用，术语“敲入(knockin)”指代已插入目标序列(例如，内源基因座)中的外源核酸序列。例如，敲入目标位点(例如，内源基因座)中的CAR/TCR指代编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核酸序列，该核酸序列已被插入目标基因序列内的目标位置中。在一些实施方式中，在目标序列是基因的情况下，产生敲入导致外源核酸序列与控制目标基因表达的任何上游和/或下游调控元件可操作地连接。在一些实施方式中，产生敲入导致外源核酸序列不与控制目标基因表达的任何上游和/或下游调控元件可操作地连接。
如本文所用，术语“敲除(knockout)”指代消除一个或多个基因的基因表达。
如本文所用，“慢病毒”指代逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂的细胞；其可以将大量遗传信息传递至宿主细胞的DNA中，因此其是基因传递载体中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。源自慢病毒的载体提供在体内实现显著水平的基因转移的手段。
如本文所用，术语“修饰的”意为本发明的分子或细胞的状态或结构改变。可以多种方式(包括化学上、结构上和功能上)修饰分子。可以通过引入核酸来修饰细胞。
如本文所用，术语“调节”意为与不存在治疗或化合物的情况下对象的响应水平相比，和/或与其它相同但未治疗对象的响应水平相比，介导对象的响应水平的可检测的提高或降低。该术语涵盖扰动和/或影响天然信号或响应，从而在对象(优选人)中介导有益的治疗响应。
在本发明的环境中，对于常见的核苷酸碱基使用以下缩写。“A”指代腺苷、“C”指代胞嘧啶、“G”指代鸟苷、“T”指代胸苷，并且“U”指代尿苷。
术语“寡核苷酸”通常指代短的多核苷酸。将理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、C、G)表示时，其还包括其中“U”替代“T”的RNA序列(即，A、U、C、G)。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列还可以包括内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有内含子(一个或多个)。
免疫原性组合物的“肠胃外”给药包括，例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、或胸骨内注射(intrasternal injection)或输注技术。
如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下常识：核酸是多核苷酸，其可以被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段(包括但不限于重组手段，即使用常规克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，以及通过合成手段)获得的所有核酸序列。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指代由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，其包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸。如本文所用，术语指代短链，例如，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体；以及较长的链，其在本领域中总体上称为蛋白质，其中有多种类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
与本文关于抗体使用的术语“特异性结合”意为识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中其它分子的抗体。例如，与一个物种的抗原特异性结合的抗体也可以与一个或多个物种的抗原结合。但是，这种种间反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在另一实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binding)”可以用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，以表示相互作用取决于化学物种上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白结构，而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离、未标记A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量。
术语“刺激”意为通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级响应，从而介导信号转导事件，如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子表达的改变，如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
本文使用的术语“刺激性分子”意为T细胞上与抗原呈递细胞上存在的同源刺激性配体特异性结合的分子。
如本文所用，“刺激性配体”意为当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等)上时可以与T细胞上的同源结合伴侣(在本文中称为“刺激性分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级响应(包括但不限于活化、免疫响应的引发、增殖等)的配体。刺激性配体是本领域公知的，并且尤其包括装载有肽的MHC I型分子、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体。
术语“对象”旨在包括其中可以引起免疫响应的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文所用，“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如，家畜和宠物，如绵羊、牛、猪、犬类、猫类和鼠类哺乳动物。优选地，对象是人。
“目标位点”或“目标序列”指代核酸序列，该核酸序列限定在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性结合的核酸的部分。在一些实施方式中，目标序列指代基因组核酸序列，其限定在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性结合的核酸的部分。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”指代响应于抗原呈递而参与T细胞活化的膜蛋白的复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR由α(α)和β(β)链的异二聚体组成，尽管在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。TCR可能以α/β和γ/δ形式存在，其在结构上相似，但是具有不同的解剖位置和功能。每条链由两个胞外结构域——可变结构域和恒定结构域——组成。在一些实施方式中，可以在包含TCR的任何细胞(包括例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞和γδT细胞)上修饰TCR。
如本文所用，术语“治疗性”意为治疗和/或预防。通过抑制、缓解或消除疾病状态获得治疗效果。
“移植物”指代要移植的生物相容性晶格或供体组织、器官或细胞。移植物的实例可以包括但不限于皮肤细胞或组织、骨髓和实体器官，如心脏、胰腺、肾、肺和肝。移植物还可以指代给予至宿主的任何材料。例如，移植物可以指代核酸或蛋白质。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指代将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代对象细胞及其后代。
本文使用的术语“治疗”疾病意为降低对象经历的疾病或障碍的至少一种体征或症状的频率或严重性。
“载体”是包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。多种载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括有助于将核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，如例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
范围：在整个本公开中，可以以范围格式来呈现本发明的各个方面。应理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明的范围的不灵活的限制。因此，应将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围以及此范围内的个体数值。例如，对范围(如1至6)的描述应被视为已明确公开了子范围(如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等)以及此范围内的个体数值(例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6)。无论范围的宽度如何，这都适用。
B.T细胞受体
本发明提供了包含外源T细胞受体(TCR)的修饰的免疫细胞或其前体(例如，修饰的T细胞)的组合物和方法。因此，在一些实施方式中，目标细胞已被改变为含有特异性T细胞受体(TCR)基因(例如，编码α/βTCR的核酸)。TCR或其抗原结合部分包括识别目标多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的那些。在一些实施方式中，TCR对肿瘤相关抗原(例如，人NY-ESO-1)具有结合特异性。
在一些实施方式中，包含外源T细胞受体(TCR)的修饰的T细胞可以用于本发明的筛选方法中，例如，以鉴定在调节时增强TCR-T细胞的功能的基因目标。
TCR是由六个不同的膜结合链组成的二硫键连接的异二聚体蛋白，其响应于抗原而参与T细胞的活化。存在α/βTCR和γ/δTCR。α/βTCR包含TCRα链和TCRβ链。表达包含TCRα链和TCRβ链的TCR的T细胞通常称为α/βT细胞。γ/δTCR包含TCRγ链和TCRδ链。表达包含TCRγ链和TCRδ链的TCR的T细胞通常称为γ/δT细胞。本公开的TCR是包含TCRα链和TCRβ链的TCR。
TCRα链和TCRβ链各自由两个胞外结构域——可变区和恒定区——组成。TCRα链可变区和TCRβ链可变区是TCR对目标抗原的亲和力所必需的。每个可变区包含三个高变或互补决定区(CDR)，其提供与目标抗原的结合。TCRα链的恒定区和TCRβ链的恒定区靠近细胞膜。TCR进一步包含跨膜区和短的胞质尾。CD3分子与TCR异二聚体组装在一起。CD3分子包含酪氨酸磷酸化的特征序列基序，称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。近侧信号传导事件通过CD3分子介导，因此，TCR-CD3复合物相互作用在介导细胞识别事件中起重要作用。
TCR的刺激由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合物分子(MHC)触发，该抗原呈递细胞将抗原肽呈递至T细胞并与TCR相互作用以诱导一系列胞内信号传导级联。TCR的参与引发阳性和阴性信号传导级联，其导致细胞增殖、细胞因子产生和/或活化诱导的细胞死亡。
本发明的TCR可以是野生型TCR、高亲和力TCR、和/或嵌合TCR。高亲和力TCR可以是对野生型TCR进行修饰的结果，其与野生型TCR相比赋予对目标抗原更高的亲和力。高亲和力TCR可以是亲和力成熟的TCR。用于修饰TCR和/或TCR的亲和力成熟的方法是本领域技术人员已知的。用于工程化和表达TCR的技术包括但不限于TCR异二聚体的产生，其包括连接对应子单元的天然二硫桥(Garboczi等人，(1996),Nature 384(6605):134-41；Garboczi等人，(1996),J Immunol 157(12):5403-10；Chang等人，(1994),PNAS USA 91:11408-11412；Davodeau等人，(1993),J.Biol.Chem.268(21):15455-15460；Golden等人，(1997),J.Imm.Meth.206:163-169；美国专利号6,080,840)。
在一些实施方式中，外源TCR是完整TCR或其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方式中，TCR是完整或全长TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方式中，TCR是抗原结合部分，其小于全长TCR但与MHC分子中结合的特定肽结合，如与MHC-肽复合物结合。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构域的部分，但仍能够将肽表位(如MHC-肽复合物)与完整TCR结合。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，如TCR的可变α链和可变β链，足以形成结合位点以结合特定的MHC-肽复合物。总体上，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区(CDR)。
在一些实施方式中，TCR的可变结构域含有高变环或CDR，其总体上是抗原识别和结合能力以及特异性的主要贡献者。在一些实施方式中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的所有或基本上所有的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各种CDR总体上被框架区(FR)隔开，与CDR相比，其在TCR分子之间总体上表现较小的可变性(参见，例如，Jores等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人，EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方式中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区的三个CDR中最主要进行抗原识别和/或与肽-MHC复合物的处理的肽部分相互作用的CDR。在一些环境下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N-末端部分相互作用。在一些环境下，β链的CDR1可以与肽的C-末端部分相互作用。在一些环境下，CDR2对负责MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别的初级CDR贡献最大，或者是初级CDR。在一些实施方式中，β-链的可变区可以含有进一步的高变区(CDR4或HVR4)，其总体上参与超抗原结合而不是抗原识别(Kotb(1995)Clinical MicrobiologyReviews,8:411-426)。
在一些实施方式中，TCR含有可变α结构域(Va)和/或可变β结构域(Vβ)或其抗原结合片段。在一些实施方式中，TCR的α链和/或β链还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短的胞质尾(参见，例如，Janeway等人，Immunobiology:The Immune System in Healthand Disease，第3版，Current Biology Publications,p.4:33,1997)。在一些实施方式中，链恒定结构域由TRAC基因(IMGT命名法)编码或为其变体。在一些实施方式中，β链恒定区由TRBC1或TRBC2基因(IMGT命名法)编码或为其变体。在一些实施方式中，恒定结构域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的胞外部分含有两个膜近侧恒定结构域和两个膜远侧可变结构域，该可变结构域各种含有CDR。
确定或鉴定TCR的各种结构域或区域在本领域技术人员的能力范围内。在一些方面，TCR的残基是已知的，或者可以根据国际免疫遗传学信息系统(IMGT)命名系统(International Immunogenetics Information System(IMGT)numbering system)进行鉴定(参见，例如www.imgt.org；还参见Lefranc等人(2003)Developmental and ComparativeImmunology,2&；55-77；和The T Cell Factsbook第2版，Lefranc and LeFranc AcademicPress 2001)。使用此系统，TCR Va链和/或νβ链内的CDR1序列相应于残基编号27-38(含)之间存在的氨基酸，TCR Va链和/或νβ链内的CDR2序列相应于残基编号56-65(含)之间存在的氨基酸，并且TCR Va链和/或νβ链内的CDR3序列相应于残基编号105-117(含)之间存在的氨基酸。IMGT编号系统不应被解释为以任何方式进行限制，因为本领域技术人员已知存在其它编号系统，并且使用任何可用的编号系统来鉴定TCR的各种结构域或区域在本领域技术人员的能力范围内。
在一些实施方式中，TCR可以是如通过一个二硫键或多个二硫键连接的两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体。在一些实施方式中，TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方式中，TCR可以在α和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方式中，恒定和可变结构域中的每一个含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。
在一些实施方式中，所述用于工程化细胞的TCR是由已知TCR序列(一个或多个)(如να、β链的序列)产生的TCR，其容易获得基本全长的编码序列。从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是公知的。在一些实施方式中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过在给定细胞(一个或多个)内或从给定细胞分离的TCR-编码的核酸的聚合酶链反应(PCR)扩增，或合成可公开获得的TCR DNA序列。在一些实施方式中，TCR获自生物学来源，如获自细胞，如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T-细胞杂交瘤或其它可公开获得的来源。在一些实施方式中，T-细胞可以获自体内分离的细胞。在一些实施方式中，T-细胞可以是培养的T-细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方式中，TCR或其抗原结合部分可以根据TCR序列的知识合成产生。在一些实施方式中，鉴定、分离来自患者的目标抗原(例如，癌症抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方式中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生了针对目标抗原的TCR克隆。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799-5808)。在一些实施方式中，噬菌体展示用于分离针对目标抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-354)。
在一些实施方式中，TCR或其抗原结合部分是已被修饰或工程化的。在一些实施方式中，定向演化方法用于产生具有改变性质(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方式中，定向演化通过展示方法，包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)、或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)来实现。在一些实施方式中，展示方法涉及工程化或修饰的、已知的亲代或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作产生诱变TCR的模板，其中CDR的一个或多个残基突变，并选择具有期望的改变性质(如对期望的目标抗原的亲和力较高)的突变体。
在所述的一些实施方式中，TCR可以含有引入的一个或多个二硫键。在一些实施方式中，不存在天然二硫键。在一些实施方式中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸(例如在α链和β链的恒定结构域中)被另一残基(如丝氨酸或丙氨酸)取代。在一些实施方式中，可以通过将α和β链上(如在α链和β链的恒定结构域中)的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO2006/000830和WO2006/037960中。在一些实施方式中，半胱氨酸可以在α链的残基Thr48处和β链的Ser57处、α链的残基Thr45和β链的Ser77处、α链的残基Tyr10和β链的Ser17处、α链的残基Thr45和β链的Asp59处和/或α链的残基Ser15和β链的Glu15处引入。在一些实施方式中，重组TCR中非天然半胱氨酸残基的存在(例如导致一个或多个非天然二硫键)可以有利于在引入其的细胞中产生期望的重组TCR，而不是表达含有天然TCR链的错配TCR对。
在一些实施方式中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域带正电。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些方面，TCR的每条链(例如α或β)可以具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和C-末端的短胞质尾。在一些实施方式中，TCR(例如经由胞质尾)与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白结合。在一些情况下，结构允许TCR与其它分子(如CD3及其亚单元)结合。例如，含有具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与CD3信号传导器或复合物的不变亚单元结合。CD3信号传导亚单元(例如CD3y、CD35、CD3s和CD3ζ链)的胞内尾含有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的活化基序或IT AM，其涉及TCR复合物的信号传导能力。
在一些实施方式中，TCR是全长TCR。在一些实施方式中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方式中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方式中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。TCR可以是细胞结合的或可溶形式。在一些实施方式中，出于提供的方法的目的，TCR为在细胞表面上表达的细胞结合形式。在一些实施方式中，dTCR含有第一多肽和第二多肽，在第一多肽中，相应于TCRα链可变区序列的序列与相应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端融合，在第二多肽中，相应于TCRβ链可变区序列的序列与相应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端融合，第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方式中，该键可以相应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方式中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方式中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区胞外序列中。在一些情况下，天然和非天然二硫键可以是期望的。在一些实施方式中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。在一些实施方式中，dTCR含有TCRα链和TCRβ链，该TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域的C-末端的第一二聚化基序；该TCRβ链含有可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域的C-末端的第一二聚化基序，其中第一和第二二聚基序容易相互作用，以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链和TCRβ链连接在一起。
在一些实施方式中，TCR是scTCR，其是含有能够结合MHC-肽复合物的α链和β链的单氨基酸链。通常，可以使用本领域技术人员已知的方法产生scTCR，参见例如，国际公开PCT号WO 96/13593、WO 96/18105、W099/18129、WO04/033685、WO2006/037960、WO2011/044186；美国专利号7,569,664；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方式中，scTCR含有由相应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一片段、由相应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列(与相应于TCRβ链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列的N末端融合)构成的第二片段以及将第一片段的C末端连接至第二片段的N末端的连接子序列。在一些实施方式中，scTCR含有由相应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成的第一片段、由相应于TCRα链可变区序列的氨基酸序列(与相应于TCRα链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列的N末端融合)构成的第二片段以及将第一片段的C末端连接至第二片段的N末端的连接子序列。在一些实施方式中，scTCR含有由与α链胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成的第一片段，和由与序列β链胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成的第二片段，以及任选地将第一片段的C末端连接至第二片段的N末端的连接子序列。在一些实施方式中，scTCR含有由与β链胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成的第一片段，和由与包含α链胞外恒定结构域序列和跨膜序列的序列的N末端融合的α链可变区序列构成的第二片段，以及任选地将第一片段的C末端连接至第二片段的N末端的连接子序列。在一些实施方式中，为了使scTCR结合MHC-肽复合物，α和β链必须配对，使得其可变区序列被定向用于这种结合。在scTCR中促进α和β的配对的各种方法是本领域公知的。在一些实施方式中，包括连接α和β链以形成单个多肽链的连接子序列。在一些实施方式中，连接子应具有足够的长度，以跨越α链的C末端与β链的N末端之间的距离，反之亦然，同时还确保连接子长度不那么长以至于其阻塞或减少scTCR与目标肽-MHC复合物的结合。在一些实施方式中，连接第一和第二TCR片段的scTCR的连接子可以是能够形成单个多肽链，同时保持TCR结合特异性的任何连接子。在一些实施方式中，连接子序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸，并且AA表示其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二片段是成对的，使得其可变区序列被定向用于这种结合。因此，在一些情况下，连接子的长度足以跨越第一片段的C末端与第二片段的N末端之间的距离，反之亦然，但不要太长以阻止或减少scTCR结合至目标配体。在一些实施方式中，连接子可以含有约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方式中，scTCR在单氨基酸链的残基之间含有二硫键，这在一些情况下可以促进单链分子的α与β区之间的配对稳定性(参见例如美国专利号7,569,664)。在一些实施方式中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区的残基连接至单链分子的β链的恒定结构域的免疫球蛋白区的残基。在一些实施方式中，二硫键相应于天然dTCR中存在的天然二硫键。在一些实施方式中，天然TCR中不存在二硫键。在一些实施方式中，例如通过将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二链区的恒定区胞外序列中将二硫键引入非天然二硫键中。示例性半胱氨酸突变包括上述中的任一种。在一些情况下，可以存在天然和非天然二硫键。
在一些实施方式中，TCR(包括dTCR或scTCR)中的任一种可以连接至在T细胞的表面上产生活性TCR的信号传导结构域。在一些实施方式中，TCR在细胞的表面上表达。在一些实施方式中，TCR含有相应于跨膜序列的序列。在一些实施方式中，跨膜结构域可以是Ca或CP跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域可以来自非-TCR来源，例如来自CD3z、CD28或B7.1的跨膜区。在一些实施方式中，TCR含有相应于胞质序列的序列。在一些实施方式中，TCR含有CD3z信号传导结构域。在一些实施方式中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方式中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式，其中一种或多种性质(如结合特性)已被改变。在一些实施方式中，TCR可以源自各种动物物种中的任一种，如人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
在一些实施方式中，TCR包含对目标细胞上的目标抗原的亲和力。目标抗原可以包括与目标细胞相关的任何类型的蛋白质或其表位。例如，TCR可以对目标细胞上的目标抗原具有亲和力，其指示目标细胞的特定疾病状态。在一些实施方式中，目标抗原由MHC加工并呈递。
在一个实施方式中，目标细胞抗原是纽约食道-1(New York esophageal-1)(NY-ESO-1)肽。NY-ESO-1属于癌症-睾丸(CT)抗原蛋白质组。NY-ESO-1是体外的高度免疫原性抗原，并且通过MHC呈递至T细胞。已经从骨髓瘤患者的血液和淋巴结生长了识别A2呈递表位NY-ESO157-165、SLLMWITQC(SEQ ID NO:1)的CTL。已显示对此表位具有特异性的T细胞克隆以杀死肿瘤细胞。识别NY-ESO157-165表位的高亲和力TCR可以识别HLA-A2-阳性、NY-ESO-1阳性细胞系(但不识别缺乏HLA-A2或NY-ESO的细胞)。因此，本公开的TCR可以是HLA-A2-限制的NY-ESO-1(SLLMWITQC；SEQ ID NO:1)-特异性TCR。在一个实施方式中，本公开的NY-ESO-1TCR是野生型NY-ESO-1 TCR。野生型NY-ESO-1 TCR可以包括但不限于8F NY-ESO-1 TCR(在本文也称为“8F”或“8F TCR”)和1G4 NY-ESO-1 TCR(在本文也称为“1G4”或“1G4 TCR”)。在一个实施方式中，本公开的NY-ESO-1 TCR是亲和力增强的1G4 TCR，也称为Ly95。1G4 TCR和亲和力增强的1G4 TCR描述于美国专利号8,143,376中。这不应被解释为以任何方式进行限制，因为对任何目标抗原具有亲和力的TCR适用于本发明的组合物或方法。在一些实施方式中，包含对NY-ESO-1具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)的修饰的免疫细胞可以用于本发明的筛选方法，例如，以鉴定在调节时增强NY-ESO-1 TCR-T细胞功能的基因目标。在本发明的筛选方法中鉴定的基因目标不限于在修饰时调节对特定抗原目标具有亲和力的TCR-T细胞的功能的基因目标。在本发明的筛选方法中鉴定的基因目标可以是在修饰时调节任何TCR-T细胞的功能(即，对任何抗原目标具有亲和力)的基因目标。在一些实施方式中，在包括使用TCR-T细胞的本发明的筛选方法中鉴定的基因目标可以是TCR-T细胞功能的整体调节子，其独立于其中包含的TCR的特异性。
在一些实施方式中，在本发明的筛选方法中鉴定的基因目标可以是在修饰时调节任何TCR-T细胞的功能(即，对任何目标抗原具有亲和力)的基因目标。在一些实施方式中，在本发明的筛选方法中鉴定的基因目标可以是在修饰时调节任何CAR-T细胞的功能(即，对任何目标抗原具有亲和力)的基因目标。在一些实施方式中，基因目标可以是T细胞功能的调节子。这样，基因目标在修饰时调节对任何目标抗原具有亲和力的任何TCR-或CAR-T细胞的功能。
因此，包含外源TCR和/或CAR的修饰的免疫细胞可以被编辑以修饰作为T细胞功能的调节子的基因目标。这种修饰的免疫细胞可以具有增强的免疫细胞功能(例如，目标细胞杀伤)。
C.嵌合抗原受体
本发明提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的修饰的免疫细胞或其前体(例如，修饰的T细胞)的组合物和方法。因此，在一些实施方式中，已经对免疫细胞进行基因修饰以表达CAR。本发明的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、铰链结构域和胞内信号传导结构域。
抗原结合结构域可以可操作地连接至CAR的另一结构域，如跨膜结构域或胞内结构域，均在本文其它部分所述，以在细胞中表达。在一个实施方式中，将编码抗原结合结构域的第一核酸序列可操作地连接至编码跨膜结构域的第二核酸，并且进一步可操作地连接至编码胞内结构域的第三核酸序列。
本文所述的抗原结合结构域可以与本文所述的跨膜结构域中的任一种、本文所述的胞内结构域或胞质结构域中的任一种、或本文所述的可以包括在本发明的CAR中的其它结构域中的任一种组合。本发明的主题CAR还可以包括本文所述的间隔子结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域中的每一个被连接子分开。
抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域是CAR的胞外区，用于结合包括蛋白质、碳水化合物和糖脂的特定目标抗原。在一些实施方式中，CAR对目标细胞上的目标抗原具有亲和力。目标抗原可以包括与目标细胞相关的任何类型的蛋白质或其表位。例如，CAR可以对目标细胞上的目标抗原具有亲和力，其指示目标细胞的特定疾病状态。
在一个实施方式中，目标细胞抗原是前列腺干细胞抗原(PSCA)。这样，在一个实施方式中，本公开的CAR对目标细胞上的PSCA具有亲和力。在一个实施方式中，目标细胞抗原是CD19。这样，在一个实施方式中，本公开的CAR对目标细胞上的CD19具有亲和力。这不应被解释为以任何方式进行限制，因为对任何目标抗原具有亲和力的CAR适用于本发明的组合物或方法。
如本文所述，对目标细胞上的特定目标抗原具有亲和力的本公开的CAR可以包含目标特异性结合结构域。在一些实施方式中，目标特异性结合结构域是鼠目标特异性结合结构域，例如，目标特异性结合结构域是鼠源的。在一些实施方式中，目标特异性结合结构域是人目标特异性结合结构域，例如，目标特异性结合结构域是人源的。在一个实施方式中，对目标细胞上的PSCA具有亲和力的本公开的CAR可以包含PSCA结合结构域。在一个实施方式中，对目标细胞上的CD19具有亲和力的本公开的CAR可以包含CD19结合结构域。
在一些实施方式中，本公开的CAR可以对一种或多种目标细胞上的一种或多种目标抗原具有亲和力。在一些实施方式中，CAR可以对目标细胞上的一种或多种目标抗原具有亲和力。在这种实施方式中，CAR是双特异性CAR或多特异性CAR。在一些实施方式中，CAR包含赋予一种或多种目标抗原亲和力的一种或多种目标特异性结合结构域。在一些实施方式中，CAR包含赋予相同目标抗原亲和力的一种或多种目标特异性结合结构域。例如，包含对相同目标抗原具有亲和力的一种或多种目标特异性结合结构域的CAR可以结合目标抗原的不同表位。当CAR中存在多个目标特异性结合结构域时，结合结构域可以串联排列并且可以被连接子肽分开。例如，在包含两个目标特异性结合结构域的CAR中，结合结构域通过寡-或多肽连接子、Fc铰链区或膜铰链区在单条多肽链上彼此共价连接。
在一些实施方式中，抗原结合结构域选自抗体、抗原结合片段(Fab)和单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，本发明的PSCA结合结构域选自PSCA-特异性抗体、PSCA-特异性Fab和PSCA-特异性scFv。在一个实施方式中，PSCA结合结构域是PSCA-特异性抗体。在一个实施方式中，PSCA结合结构域是PSCA-特异性Fab。在一个实施方式中，PSCA结合结构域是PSCA-特异性scFv。在一些实施方式中，本发明的PSCA结合结构域选自CD19-特异性抗体、CD19-特异性Fab和CD19-特异性scFv。在一个实施方式中，CD19结合结构域是CD19-特异性抗体。在一个实施方式中，CD19结合结构域是CD19-特异性Fab。在一个实施方式中，CD19结合结构域是CD19-特异性scFv。
抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任何结构域，并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体及其任何片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域部分包含哺乳动物抗体或其片段。抗原结合结构域的选择可以取决于目标细胞的表面上存在的抗原的类型和数量。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接以形成VH::VL异二聚体的免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过肽编码连接子连接，该肽编码连接子将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或将VH的C-末端与VL的N-末端连接。在一些实施方式中，抗原结合结构域(例如，PSCA结合结构域)包含scFv，其从N-末端至C-末端的构型为VH–连接子–VL。在一些实施方式中，抗原结合结构域包含具有从N-末端至C-末端的构型的scFv，VL–连接子–VH。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适当构型。
连接子通常富含甘氨酸以获得挠性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性。连接子可以连接胞外抗原结合结构域的轻链可变区和重链可变区。连接子的非限制性实例公开于Shen等人，Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010中，其内容以其整体特此通过引用并入。各种连接子序列是本领域已知的，包括但不限于甘氨酸丝氨酸(GS)连接子，如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:2)、(GGGS)n(SEQ ID NO:3)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:4)，其中n表示至少1的整数。示例性连接子序列可以包含氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:5)、GGSGG(SEQ ID NO:6)、GSGSG(SEQ ID NO:7)、GSGGG(SEQ ID NO:8)、GGGSG(SEQ ID NO:9)、GSSSG(SEQ ID NO:10)、GGGGS(SEQ ID NO:11)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:12)等。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适的连接子序列。在一个实施方式中，本发明的抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL被具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:12)的连接子序列分开，该连接子序列可以由核酸序列GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT(SEQ ID NO:13)编码。
尽管去除了恒定区并引入连接子，scFv蛋白仍保留原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由Huston等人所述的包含VH-和VL-编码序列的核酸表达(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。还参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754。已描述了具有抑制性活性的拮抗剂scFv(参见，例如，Zhao等人，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter等人，J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012年8月12日；Shieh等人，J Imunol 2009 183(4):2277-85；Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife等人，J Clin Invst2006 116(8):2252-61；Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10:31-40)。已描述了具有刺激活性的激动剂scFv(参见，例如，Peter等人，J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7；Xie等人，Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter等人，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55；Ho等人，BioChimBiophys Acta 2003 1638(3):257-66)。
如本文所用，“Fab”指代与抗原结合但为单价并且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，被木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个Fab片段和Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不与抗原结合的Fc区)。
如本文所用，“F(ab′)2”指代通过胃蛋白酶消化完整IgG抗体产生的抗体片段，其中此片段具有两个抗原结合(ab′)(二价)区，其中每个(ab′)区包含两个分开的氨基酸链，H链和轻(L)链的部分通过S—S键连接以结合抗原，并且其中剩余H链部分连接在一起。“F(ab′)2”片段可以被分成两个单独的Fab′片段。
在一些实施方式中，抗原结合结构域可以源自其中将最终使用CAR的相同物种。例如，为了在人中使用，CAR的抗原结合结构域可以包含人抗体或其片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域可以源自其中将最终使用CAR的不同物种。例如，为了在人中使用，CAR的抗原结合结构域可以包含鼠抗体或其片段。
跨膜结构域
本发明的CAR可以包含跨膜结构域，其将CAR的抗原结合结构域连接至CAR的胞内结构域。主题CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(例如，免疫细胞或其前体)的质膜的区域。跨膜结构域用于插入细胞膜(例如，真核细胞膜)中。在一些实施方式中，跨膜结构域插入抗原结合结构域与CAR的胞内结构域之间。
在一些实施方式中，跨膜结构域天然地与CAR中的一个或多个结构域相关。在一些实施方式中，可以通过一个或多个氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这种结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白，例如，I型跨膜蛋白。在来源是合成的情况下，跨膜结构域可以是促进CAR插入细胞膜中的任何人工序列，例如，人工疏水序列。在本发明中具体使用的跨膜结构域的实例包括但不限于下列跨膜结构域：源自(即包含至少跨膜区(一个或多个))T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、Toll-样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一些实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选在合成的跨膜结构域的每个末端处发现三联苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。
本文所述的跨膜结构域可以与本文所述的抗原结合结构域中的任一种、本文所述的胞内结构域中的任一种、或本文所述的可以包括在主题CAR中的其它结构域中的任一种组合。
在一些实施方式中，跨膜结构域进一步包含铰链区。本发明的主题CAR还可以包括铰链区。CAR的铰链区是位于抗原结合结构域与跨膜结构域之间的亲水区。在一些实施方式中，此结构域促进CAR的正确蛋白折叠。铰链区是CAR的任选组分。铰链区可以包括选自下列的结构域：抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链序列或其组合。铰链区的实例包括但不限于CD8a铰链、由多肽制成的人工铰链，其可以小至三个甘氨酸(Gly)、以及IgG(如人IgG4)的CH1和CH3结构域。
在一些实施方式中，本公开的主题CAR包括将抗原结合结构域与跨膜结构域连接的铰链区，该跨膜结构域进而连接至胞内结构域。铰链区优选地能够支持抗原结合结构域识别并结合目标细胞上的目标抗原(参见，例如，Hudecek等人，Cancer Immunol.Res.(2015)3(2):125-135)。在一些实施方式中，铰链区是挠性结构域，因此允许抗原结合结构域具有最佳识别细胞(如肿瘤细胞)上的目标抗原的具体结构和密度的结构(Hudecek等人，同上)。铰链区的挠性允许铰链区采用多种不同的构型。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方式中，铰链区是源自受体(例如，CD8-源性铰链区)的铰链区多肽。
铰链区可以具有约4个氨基酸至约50个氨基酸，例如，约4aa至约10aa、约10aa至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa、或约40aa至约50aa的长度。在一些实施方式中，铰链区可以具有大于5aa、大于10aa、大于15aa、大于20aa、大于25aa、大于30aa、大于35aa、大于40aa、大于45aa、大于50aa、大于55aa或更大的长度。
合适的铰链区可以容易地选择并且可以具有多种合适长度中的任一种，如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。合适的铰链区可以具有大于20个氨基酸(例如，30、40、50、60或更多个氨基酸)的长度。
例如，铰链区包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:2)和(GGGS)n(SEQ ID NO:3)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其它挠性连接子。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser是相对非结构化的，因此可以充当组分之间的中性纽带。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸甚至比丙氨酸占据显著更大的phi-psi空间，并且与侧链较长的残基相比受限制的程度小得多(参见，例如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2:73-142)。示例性铰链区可以包括氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:5)、GGSGG(SEQ ID NO:6)、GSGSG(SEQ ID NO:7)、GSGGG(SEQ ID NO:8)、GGGSG(SEQ ID NO:9)GSSSG(SEQ ID NO:10)等。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列是本领域已知的；参见，例如，Tan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1):162-166；和Huck等人，Nucleic Acids Res.(1986)14(4):1779-1789。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可以包括下列氨基酸序列中的一种：DKTHT(SEQ ID NO:14)；CPPC(SEQ IDNO:15)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:16)(参见，例如，Glaser等人，J.Biol.Chem.(2005)280:41494-41503)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:17)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:18)；KCCVDCP(SEQ ID NO:19)；KYGPPCP(SEQ ID NO:20)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:21)(人IgG1铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:22)(人IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:23)(人IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:24)(人IgG4铰链)等。
铰链区可以包含人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、铰链区的氨基酸序列。在一个实施方式中，与野生型(天然存在的)铰链区相比，铰链区可以包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人IgG1铰链的His229可以被Tyr取代，使得铰链区包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO:25)；参见，例如，Yan等人，J.Biol.Chem.(2012)287:5891-5897。在一个实施方式中，铰链区可以包含源自人CD8的氨基酸序列或其变体。
胞内信号传导结构域
本发明的主题CAR还包括胞内信号传导结构域。术语“胞内信号传导结构域”和“胞内结构域”在本文可互换使用。CAR的胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的细胞(例如，免疫细胞)的至少一种效应子功能。胞内信号传导结构域转导效应子功能信号并指导细胞(例如，免疫细胞)执行其特定功能，例如，损害和/或破坏目标细胞。
用于本发明的胞内结构域的实例包括但不限于表面受体的胞质部分、共刺激分子和协同作用以在T细胞中启动信号转导的任何分子、以及这些要素的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。
胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的ζ链或其任何同源物，例如，η链、FcsRIγ和β链、MB 1(Iga)链、B29(Ig)链等，人CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)、以及其它参与T细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、带有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞质受体及其组合。
在一个实施方式中，CAR的胞内信号传导结构域包括一个或多个共刺激分子的任何部分，如来自CD2、CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1的至少一个信号传导结构域、其任何衍生物或变体、其具有相同功能性能力的任何合成序列及其任何组合。
胞内结构域的其它实例包括来自一个或多个分子或受体的片段或结构域，包括但不限于TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、常见FcRγ、FcRβ(FcεRIb)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP 12、T细胞受体(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD 96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll-样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其它共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同功能性能力的共刺激分子的任何合成序列及其任何组合。
胞内结构域的另外实例包括但不限于各种其它免疫信号传导受体的若干类型的胞内信号传导结构域，包括但不限于第一代、第二代、和第三代T细胞信号传导蛋白，包括CD3、B7家族共刺激和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体(参见，例如，Park和Brentjens，J.Clin.Oncol.(2015)33(6):651-653)。另外，胞内信号传导结构域可以包括由NK和NKT细胞使用的信号传导结构域(参见，例如，Hermanson和Kaufman，Front.Immunol.(2015)6:195)，如NKp30(B7-H6)的信号传导结构域(参见，例如，Zhang等人，J.Immunol.(2012)189(5):2290-2299)、和DAP 12(参见，例如，Topfer等人，J.Immunol.(2015)194(7):3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10和CD3z。
适用于本发明的主题CAR的胞内信号传导结构域包括任何期望的信号传导结构域，其响应于CAR的活化(即，被抗原和二聚化剂活化)而提供独特和可检测信号(例如，细胞增加一种或多种细胞因子的产生；目标基因的转录改变；蛋白质的活性改变；细胞行为的改变，例如，细胞死亡、细胞增殖；细胞分化、细胞存活；细胞信号传导响应的调节等)。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)下述ITAM基序。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域不共价附接至膜结合的CAR，而是分散在胞质中。
适用于本发明的主题CAR的胞内信号传导结构域包括含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞内信号传导多肽。在一些实施方式中，ITAM基序在胞内信号传导结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二情况彼此间隔6至8个氨基酸。在一个实施方式中，主题CAR的胞内信号传导结构域包含3个ITAM基序。
在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括人免疫球蛋白受体的信号传导结构域，其含有基于免疫球蛋白酪氨酸的活化基序(ITAM)，如但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(参见，例如，Gillis等人，Front.Immunol.(2014)5:254)。
合适的胞内信号传导结构域可以是源自含有ITAM基序的多肽的含有ITAM基序的部分。例如，合适的胞内信号传导结构域可以是来自任何含有ITAM基序的蛋白质的含有ITAM基序的结构域。因此，合适的胞内信号传导结构域不需要含有其源性完整蛋白质的完整序列。合适的含有ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12、FCER1G(Fcε受体Iγ链)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3ζ)和CD79A(抗原受体复合物相关的蛋白α链)。
在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-活化蛋白12；KAR-相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤活化受体相关蛋白；杀伤活化受体相关蛋白等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRlγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚单元γ；免疫球蛋白E受体、高亲和力γ链等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原、δ亚单元；CD3δ；CD3d抗原、δ多肽(TiT3复合物)；OKT3、δ链；T-细胞受体T3δ链；T-细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T-细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T-细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T-细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自T-细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T-细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一个实施方式中，胞内信号传导结构域源自CD79A(也称为B-细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合的免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM-相关蛋白等)。在一个实施方式中，适用于本公开的FN3 CAR的胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一个实施方式中，适用于本公开的FN3 CAR的胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的胞质信号传导结构域。在一个实施方式中，CAR中的胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的胞质信号传导结构域。
尽管通常可以采用整个胞内信号传导结构域，但在多种情况下，不必要使用完整链。在使用胞内信号传导结构域的截短部分的情况下，可以使用这种截短部分来代替完整链，只要其转导效应子功能信号。胞内信号传导结构域包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
本文所述的胞内信号传导结构域可以与本文所述的抗原结合结构域中的任一种、本文所述的跨膜结构域中的任一种或本文所述的可以包括在CAR中的其它结构域中的任一种组合。
D.核酸和表达载体
本公开提供了编码外源TCR和/或CAR的核酸。在一个实施方式中，本公开的核酸包含编码外源TCR(例如，NY-ESO-1 TCR)的核酸序列。在一个实施方式中，本公开的核酸包含编码外源CAR(例如，PSCA CAR)的核酸序列。
在一些实施方式中，提供本公开的核酸用于例如在哺乳动物细胞中产生本文所述的TCR和/或CAR。在一些实施方式中，本公开的核酸提供了用于扩增编码TCR-或CAR-的核酸。
如本文所述，本公开的TCR包含TCRα链和TCRβ链。因此，本公开提供了编码TCRα链的核酸和编码TCRβ链的核酸。在一些实施方式中，编码TCRα链的核酸与编码TCRβ链的核酸分开。在示例性实施方式中，编码TCRα链的核酸和编码TCRβ链的核酸位于相同核酸内。
在一些实施方式中，本公开的核酸包括包含TCRα链编码序列和TCRβ链编码序列的核酸。在一些实施方式中，本公开的核酸包括包含通过连接子分开的TCRα链编码序列和TCRβ链编码序列的核酸。用于本公开的连接子允许多个蛋白质由相同核酸序列(例如，多顺反子或双顺反子序列)编码，其被翻译为解离成单独的蛋白质组分的多蛋白。例如，用于本公开的包含TCRα链编码序列和TCRβ链编码序列的核酸的连接子允许TCRα链和TCRβ链翻译为解离成分离的TCRα链和TCRβ链组分的多蛋白。
在一些实施方式中，连接子包含编码内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site)(IRES)的核酸序列。如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”指代促进内部核糖体直接进入蛋白质编码区的起始密码子(如ATG)的元件，从而导致基因的帽不依赖性翻译(cap-independent translation)。各种内部核糖体进入位点是本领域技术人员已知的，包括但不限于可从病毒或细胞mRNA来源获得的IRES，例如，免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)；血管内皮生长因子(VEGF)；成纤维细胞生长因子2；胰岛素样生长因子；翻译起始因子eIF4G；酵母转录因子TFIID和HAP4；和IRES，其获自例如，心脏病毒、鼻病毒、口疮病毒、HCV、弗兰德小鼠白血病毒(Friend murine leukemia virus)(FrMLV)和莫洛尼小鼠白血病毒(MoMLV)。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适的IRES。
在一些实施方式中，连接子包含编码自切割肽的核酸序列。如本文所用，“自切割肽”或“2A肽”指代寡肽，其允许将多种蛋白质翻译为多蛋白，该多蛋白在翻译时解离成组分蛋白。术语“自切割”的使用不旨在暗示蛋白水解切割反应。各种自切割或2A肽是本领域技术人员已知的，包括但不限于在小核糖核酸病毒科成员中发现的那些，例如口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻咽A病毒(ERAV0、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)(TaV)、和猪捷申病毒-1(porcine tescho virus-1)(PTV-1)；和心脏病毒，如泰勒病毒(Theilovirus)和脑炎心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文被分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适的自切割肽。
在一些实施方式中，连接子进一步包含编码弗林蛋白酶(furin)切割位点的核酸序列。弗林蛋白酶是普遍表达的蛋白酶，其存在于反式高尔基体(trans-golgi)中，并在其分泌之前加工蛋白质前体。弗林蛋白酶在其共有识别序列的COOH-末端处切割。各种弗林蛋白酶共有识别序列(或“弗林蛋白酶切割序列”)是本领域技术人员已知的，包括但不限于Arg-X1-Lys-Arg(SEQ ID NO:26)或Arg-X1-Arg-Arg(SEQ ID NO:27)、X2-Arg-X1-X3-Arg(SEQ ID NO:28)和Arg-X1-X1-Arg(SEQ ID NO:29)，如Arg-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO:30)，其中X1是任何天然存在的氨基酸，X2为Lys或Arg，并且X3为Lys或Arg。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适的弗林蛋白酶切割位点。
在一些实施方式中，连接子包含编码弗林蛋白酶切割位点和2A肽的组合的核酸序列。实例包括但不限于，包含编码弗林蛋白酶和F2A的核酸序列的连接子、包含编码弗林蛋白酶和E2A的核酸序列的连接子、包含编码弗林蛋白酶和P2A的核酸序列的连接子、包含编码弗林蛋白酶和T2A的核酸序列的连接子。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适的组合。在这种实施方式中，连接子可以进一步在弗林蛋白酶与2A肽之间包含间隔子序列。各种间隔子序列是本领域已知的，包括但不限于甘氨酸丝氨酸(GS)间隔子，如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:2)和(GGGS)n(SEQ ID NO:3)，其中n表示至少1的整数。示例性间隔子序列包含氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:5)、GGSGG(SEQ ID NO:6)、GSGSG(SEQID NO:7)、GSGGG(SEQ ID NO:8)、GGGSG(SEQ ID NO:9)、GSSSG(SEQ ID NO:10)等。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适的间隔子序列。
在一些实施方式中，本公开的核酸可以可操作地连接至转录控制元件，例如，启动子和增强子等。合适的启动子和增强子元件是本领域技术人员已知的。
为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子(cytomegalovirus immediate earlypromoter)；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子(herpes simplex virus thymidine kinasepromoter)；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。合适的可逆启动子(包括可逆诱导型启动子)是本领域已知的。这种可逆启动子可以分离和源自多种生物体，例如，真核生物和原核生物。用于第二生物体(例如，第一原核生物和第二真核生物，第一真核生物和第二原核生物等)的源自第一生物体的可逆启动子的修饰是本领域公知的。这种可逆启动子和基于这种可逆启动子但还包含另外对照蛋白的系统包括但不限于酒精调节型启动子(例如，酒精脱氢酶I(alcA)基因启动子、对酒精反式激活子蛋白(A1cR)响应的启动子等)、四环素调节的启动子(例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子系统)、类固醇调节的启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类维生素A启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节的启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、病原相关调节启动子(例如，水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节的启动子等)、温度调节的启动子(例如，热激诱导型启动子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆热激启动子等)、光调节的启动子、合成诱导型启动子等。
在一些实施方式中，启动子是CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或NK-特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见，例如，Salmon等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7739；和Marodon等人(2003)Blood101:3416。作为另一实例，可以使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可以通过使用NcrI(p46)启动子来实现；参见，例如，Eckelhart等人Blood(2011)117:1565。
为了在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子等；或可调节的启动子，如GAL1启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PHOS启动子、CUP1启动子、GALT启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1(例如，用于毕赤酵母(Pichia))。合适的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内。适用于真核宿主细胞的启动子包括但不限于噬菌体T7 RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；araBAD启动子；体内调节的启动子，如ssaG启动子或相关的启动子(参见，例如，美国专利公开号20040131637)、pagC启动子(Pulkkinen和Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1):86-93；Alpuche-Aranda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21):10079-83)、nirB启动子(Harborne等人Mol.Micro.(1992)6:2805-2813)等(参见，例如，Dunstan等人，Infect.Immun.(1999)67:5133-5141；McKelvie等人；Vaccine(2004)22:3243-3255；和Chatfield等人，Biotechnol.(1992)10:888-892)；sigma70启动子，例如，共有sigma70启动子(参见，例如，GenBank登录号AX798980、AX798961和AX798183)；固定相启动子，例如，dps启动子、spv启动子等；源自致病岛SPI-2(pathogenicity island SPI-2)的启动子(参见，例如，WO96/17951)；actA启动子(参见，例如，Shetron-Rama等人，Infect.Immun.(2002)70:1087-1096)；rpsM启动子(参见，例如，Valdivia和Falkow Mol.Microbiol.(1996).22:367)；tet启动子(参见，例如，Hillen,W.和Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.andHeinemann,U.(eds),Topics in Molecular and Structural Biology,Protein--NucleicAcid Interaction.Macmillan,London,UK,第10卷，pp.143-162)；SP6启动子(参见，例如，Melton等人，Nucl.Acids Res.(1984)12:7035)等。适用于原核生物(如大肠杆菌(Escherichia coli))的强启动子包括但不限于Trc、Tac、T5、T7和PLambda。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(当与乳糖接触时，LacI阻遏蛋白改变构象，从而防止Lad阻遏蛋白与操纵子结合)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有结合操纵子的构象；在没有色氨酸的情况下，TrpR阻遏蛋白具有不结合操纵子的构象)、和tac启动子操纵子(参见，例如，deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:21-25)。
合适的启动子的其它实例包括立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动任何与其可操作地连接的多核苷酸序列的高水平表达。也可以使用其它组成型启动子，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)或人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、EF-1α启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步，本发明不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被视为是本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够在期望这种表达时开启与其可操作连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子(metallothionine promoter)、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方式中，通过诱导型系统的诱导不可逆地切换含有合适启动子的基因座或构建体或转基因。诱导不可逆开关的合适系统是本领域公知的，例如，不可逆开关的诱导可以利用Cre-lox-介导的重组(参见，例如，Fuhrmann-Benzakein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28:e99，其公开内容通过引用并入本文)。本领域已知的重组酶、核酸内切酶、连接酶、重组位点等的任何合适的组合可以用于产生不可逆的转换的启动子。本文其它部分所述的进行位点特异性重组的方法、机制和要求可以用于产生不可逆转换的启动子，并且是本领域公知的，参见，例如，Grindley等人，Annual Review ofBiochemistry(2006)567-605；和Tropp,Molecular Biology(2012)(Jones&BartlettPublishers,Sudbury,Mass.)，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本公开的核酸进一步包含编码TCR和/或CAR诱导型表达盒(inducible expression cassette)的核酸序列。在一个实施方式中，TCR和/或CAR诱导型表达盒用于产生在TCR和/或CAR信号传导时释放的转基因多肽产物。参见，例如，Chmielewski和Abken,Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8):1145-1154；和Abken,Immunotherapy(2015)7(5):535-544。在一些实施方式中，本公开的核酸进一步包含编码与T细胞活化响应性启动子可操作地连接的细胞因子的核酸序列。在一些实施方式中，与T细胞活化响应性启动子可操作地连接的细胞因子存在于单独的核酸序列上。在一个实施方式中，细胞因子是IL-12。
本公开的核酸可以存在于表达载体和/或克隆载体中。表达载体可以包括选择性标记物、复制起点和提供载体复制和/或维持的其它特征。合适的表达载体包括例如，质粒、病毒载体等。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；多种可商购用于产生主题重组构建体。以下载体作为实例提供，并且不应解释为以任何方式进行限制：细菌：pBs、噬菌体、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,LaJolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体总体上具有位于启动子序列附近的方便性限制位点，以提供编码异源蛋白的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中有效的选择性标记物。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于牛痘病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如，Li等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35:2543-2549；Borras等人，Gene Ther.(1999)6:515-524；Li和Davidson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7700-7704；Sakamoto等人，H.Gene Ther.(1999)5:1088-1097；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺病毒相关病毒(参见，例如，Ali等人，Hum.Gene Ther.(1998)9:81-86，Flannery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:6916-6921；Bennett等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38:2857-2863；Jomary等人，GeneTher.(1997)4:683 690，Rolling等人，Hum.Gene Ther.(1999)10:641-648；Ali等人，Hum.Mol.Genet.(1996)5:591-594；WO 93/09239中的Srivastava，Samulski等人，J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:10319-23；Takahashi等人，J.Virol.(1999)73:7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，小鼠白血病病毒、脾坏死病毒和源自逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)、和乳腺肿瘤病毒)的载体)等。
适合使用的另外的表达载体是例如但不限于慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺病毒相关病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、工程化杂交病毒载体、转座子介导的载体等。病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等人，2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring HarborPress,NY)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。
总体上，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择性标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)可以用于将TCR和/或CAR引入免疫细胞或其前体(例如，T细胞)中。因此，本发明的表达载体(例如，慢病毒载体)可以包含编码TCR和/或CAR的核酸。在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)将包含将有助于在其中编码的TCR和/或CAR的功能性表达的另外元件。在一些实施方式中，包含编码TCR和/或CAR的核酸的表达载体进一步包含哺乳动物启动子。在一个实施方式中，载体进一步包含延长因子-1-α启动子(EF-1α启动子)。EF-1α启动子的使用可以增加下游转基因(例如，TCR和/或CAR编码核酸序列)的表达效率。生理启动子(例如，EF-1α启动子)可能不太可能诱导整合介导的遗传毒性，并且可能消除逆转录病毒载体转化干细胞的能力。适用于载体(例如，慢病毒载体)的其它生理性启动子是本领域技术人员已知的，并且可以掺入本发明的载体中。在一些实施方式中，载体(例如，慢病毒载体)进一步包含可以改善滴度和基因表达的非必需顺式作用序列(non-requisite cis acting sequence)。非必需顺式作用序列的一个非限制性实例是中心多嘌呤管道和中心终止序列(central polypurine tract andcentral termination sequence)(cPPT/CTS)，其对于有效的逆转录和细胞核输入是重要的。其它非必需顺式作用序列是本领域技术人员已知的，并且可以掺入本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。在一些实施方式中，载体进一步包含转录后调控元件。转录后调控元件可以改善RNA翻译、改善转基因表达并稳定RNA转录物。转录后调控元件的一个实例是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。因此，在一些实施方式中，本发明的载体进一步包含WPRE序列。各种转录后调控元件是本领域技术人员已知的，并且可以掺入本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。本发明的载体可以进一步包含另外的元件，如用于RNA转运的rev响应性元件(RRE)、包装序列(packaging sequences)以及5’和3’长末端重复序列(LTR)。术语“长末端重复序列”或“LTR”指代位于逆转录病毒DNA的末端的碱基对的结构域，其包含U3、R和U5区。LTR总体上提供表达逆转录病毒基因(例如，基因转录物的促进、起始和多腺苷酸化)和病毒复制所需的功能。在一个实施方式中，本发明的载体(例如，慢病毒载体)包括3’U3缺失的LTR。因此，本发明的载体(例如，慢病毒载体)可以包含本文所述的元件的任何组合，以增强转基因的功能性表达的效率。例如，除了编码TCR和/或CAR的核酸外，本发明的载体(例如，慢病毒载体)可以包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5’LTR、3’U3缺失的LTR’。
本发明的载体可以是自去活化载体(self-inactivating vectors)。如本文所用，术语“自去活化载体”指代其中3’LTR增强子启动子区(U3区)已被修饰(例如，通过缺失或取代)的载体。自去活化载体可能在第一轮病毒复制后防止病毒转录。因此，自去活化载体可以仅能够感染一次然后整合到宿主基因组(例如，哺乳动物基因组)中，并且不能进一步传递。因此，自去活化载体可以大大降低产生具有复制能力病毒的风险。
在一些实施方式中，本发明的核酸可以是RNA，例如，体外合成的RNA。RNA的体外合成方法是本领域技术人员已知的；可以使用任何已知的方法来合成包含编码本公开的TCR和/或CAR的序列的RNA。将RNA引入宿主细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，Zhao等人，Cancer Res.(2010)15:9053。可以在体外、离体或体内将包含编码本公开的TCR和/或CAR的核苷酸序列的RNA引入宿主细胞。例如，可以用包含编码本公开的TCR和/或CAR的核苷酸序列的RNA在体外或离体电穿孔宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)。
为了评估多肽或其部分的表达，要引入细胞中的表达载体还可以含有选择性标记物基因或报道基因、或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在一些实施方式中，选择性标记物可以携带在分开的DNA片段上并用于共转染程序中。选择性标记物和报道基因都可以带有合适的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记物包括但不限于抗生素抗性基因。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控序列的功能性。总体上，报道基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达并且编码多肽的基因，该多肽的表达通过一些易于检测的性质(例如，酶活性)来表现。在已将DNA引入受体细胞后的适当时间评估报道基因的表达。合适的报道基因可以包括但不限于下列基因：编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBSLetters 479:79-82)。
E.修饰的免疫细胞
本发明提供了修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)，其包含本文所述的外源TCR和/或CAR。因此，这种修饰的细胞具有在其中表达的TCR和/或CAR引导的特异性。例如，包含NY-ESO-1 TCR的本公开的修饰的细胞对目标细胞上的NY-ESO-1具有特异性。
基因编辑的免疫细胞
本公开提供了基因编辑的修饰的细胞。在一些实施方式中，本公开的修饰的细胞(例如，包含外源TCR和/或CAR的修饰的细胞)被基因编辑以破坏一种或多种内源表达的基因的表达。在一些实施方式中，基因编辑的免疫细胞(例如，T细胞)具有一种或多种内源表达的基因的表达的减少、缺失、消除、敲除或破坏。
在一些实施方式中，本公开的修饰的细胞被基因编辑以破坏选自下列的一种或多种内源基因的表达：载脂蛋白A2(APOA2)、5-氮胞苷诱导2(AZI2)、BTB结构域和CNC同源2(Bach2)、C10orf129(也称为酰基-CoA合成酶中链家族成员6；ACSM6)、C1orf141、C1orf64(也称为类固醇受体相关和调控蛋白；SRARP)、C-C基序趋化因子配体7(CCL7)、周期蛋白I家族成员2(Cyclin I Family Member 2)(CCNI2)、氯离子通道附件1(Chloride ChannelAccessory 1)(CLCA1)、氯离子核苷酸敏感性通道1A(CLNS1A)、生物钟昼夜节律调节子(Clock Circadian Regulator)(CLOCK)、含1的半胱氨酸富集跨膜模组(Cysteine RichTransmembrane Module Containing 1)(CYSTM1)、防御素α4(DEFA4)、具有序列相似性的家族124成员A(FAM124A)、FAM86A(也称为真核生物延长因子2赖氨酸甲基转移酶；EEF2KMT)、多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(GALNT2)、含5的乙二醛酶结构域(GLOD5)、G蛋白偶联受体35(GPR35)、低氧调节因子-1(HRF1)、组氨酸富集糖蛋白(HRG)、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、驱动蛋白家族成员27(KIF27)、Kruppel样因子4(Klf4)、肌球蛋白结合蛋白H(MYBPH)、NDC、NADH:泛醌氧化还原酶亚单元S4(NDUFS4)、PAXIP1相关谷氨酸富集蛋白1(PAGR1)、Parvinγ(PARVG)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMVK)、蛋白激酶CAMP活化的催化亚单元β(PRKACB)、前MRNA加工因子39(PRPF39)、妊娠特异性β-1-糖蛋白5(PSG5)、前列腺素I2受体(PTGIR)、骨髓灰质炎病毒受体相关3(PVRL3)、SIX同源框2(SIX2)、跨膜蛋白249(TMEM249)、跨膜蛋白48(TMEM48)、四肽重复结构域27(TTC27)、泛素特异性肽酶27、X-连接(X-Linked)(USP27X)、含WD重复的蛋白85(WDR85)、YY1相关蛋白1(YY1AP)以及锌和环指2(Zinc And Ring Finger2)(ZNRF2)。
使用CAR(嵌合抗原受体)T细胞和TCR重导向的T细胞的免疫疗法已在癌症患者的治疗中显示各种功效。限制其作用的主要问题之一是T细胞在受肿瘤细胞的持续刺激后衰竭。衰竭的T细胞的效应子功能(如细胞因子的产生和对肿瘤细胞的细胞毒性)降低，并且它们表达较高水平的检查点抑制分子，如PD-1和CTLA-4。PD-1和CTLA-4抗体已在临床上用于治疗多种类型的癌症。然而，多数患者不能从这些疗法中显著受益。已显示，衰竭的T细胞与效应子T细胞和记忆T细胞的全基因组表观遗传学格局(genome-wide epigeneticlandscape)不同，并且这些衰竭的T细胞不能通过例如PD-L1阻断来重塑/恢复活力(reinvigorated)(参见，Pauken等人，(2016)Science,354(6316):1160-1165)。不受任何理论的束缚，改变的表观遗传学格局可能限制衰竭的T细胞无法通过检查点抗体完全恢复活力。
在某些实施方式中，本公开的修饰的细胞被基因编辑以破坏转录调节子的表达。如本文其它部分所述，本公开显示了破坏转录调节子(例如，转录因子或表观遗传调节子)，以增强免疫细胞(例如，T细胞)功能。不受任何理论的束缚，破坏转录调节子(例如，转录因子或表观遗传调节子)的表达可能导致参与负调控免疫细胞功能(例如，T细胞存活)的基因表达减少和/或参与正调控免疫细胞功能(例如，存活因子)的基因表达增加，从而增强基因编辑的免疫细胞的功效。
因此，具有转录调节子的破坏性表达的本公开的修饰的细胞(例如，具有转录因子或表观遗传调节子的破坏性表达的修饰的T细胞)可以抵抗衰竭，并且在一些实施方式中，可以另外通过检查点抗体(例如，抗-PD-1、抗-CTLA-4、抗-PDL1抗体)恢复活力。
例如，本公开将PAGR1、Klf4和SIX2鉴定为当表达被破坏时增强免疫细胞(例如，T细胞)功能的基因。在示例性实施方式中，本公开的修饰的细胞被基因编辑以破坏PAGR1的表达。在示例性实施方式中，本公开的修饰的细胞被基因编辑以破坏Klf4的表达。在示例性实施方式中，本公开的修饰的细胞被基因编辑以破坏SIX2的表达。在一些实施方式中，本公开的修饰的细胞被基因编辑以破坏选自PAGR1、Klf4和SIX2的一个或多个基因的表达。
在转录调节子(例如，转录因子或表观遗传调节子)的表达的破坏导致作用于转录调节子下游的一个或多个基因的表达下调的情况下，本发明的修饰的细胞可以被基因编辑以破坏一个或多个下游作用基因的表达。例如，Klf4和SIX2是调控本领域已知的一个或多个下游基因的表达的转录因子。因此，本发明提供了被基因编辑以破坏由Klf4和/或SIX2调控的一个或多个基因的表达的修饰的细胞。在另一实例中，PAGR1是表观遗传调节子组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶2D(KMT2D)的已知组分。如本文其它部分所述，PAGR1的破坏导致AT富集的互作结构域1A(ARID1A)、AT富集的互作结构域3B(ARID3B)、另外的性梳样1(Additional Sex Combs Like 1)(ASXL1)、DNA甲基转移酶3α(DNMT3A)、双重特异性磷酸酶1(DUSP1)、促有丝分裂活化蛋白激酶激酶激酶8(Mitogen-Activated Protein KinaseKinase Kinase 8)(MAP3K8)、PAX互作蛋白1(PAXIP1)、蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)、细胞因子信号传导3的抑制子(SOCS3)、和/或TNFα诱导蛋白(TNFAIP3)中的一个或多个的表达降低。因此，本发明提供了基因编辑以破坏选自下列的一个或多个基因的表达的修饰的细胞：ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3和TNFAIP3。
在其它实施方式中，本公开的修饰的细胞被基因编辑以破坏内源PDCD1基因产物(程序性死亡1受体；PD-1)的表达。破坏内源PD-1的表达可能产生“检查点”抗性修饰的细胞，导致肿瘤控制增加。检查点抗性修饰的细胞也可以通过破坏例如但不限于腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B和T淋巴细胞衰减蛋白(BTLA/CD272)、CD96、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4/CD152)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)或T细胞活化的V结构域Ig抑制子(VISTA)来产生。
因此，本发明的修饰的细胞被基因编辑以破坏本文所述的内源基因中的任一种的表达。因此，在一些实施方式中，本发明的修饰的细胞(例如，包含外源TCR和/或CAR的修饰的细胞)被基因编辑以破坏本文所述的一种或多种内源基因的表达。
各种基因编辑技术是本领域技术人员已知的。基因编辑技术包括但不限于归巢核酸内切酶(homing endonucleases)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子(TALE)核酸酶(TALEN)和成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR-相关蛋白9(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR-associatedprotein 9)(Cas9)。归巢核酸内切酶总体上将其DNA底物切割为二聚体，并且不具有明显的结合和切割结构域。ZFN识别由两个锌指结合位点组成的目标位点，该锌指结合位点位于FokI切割结构域识别的5-至7-个碱基对(bp)间隔子序列的侧面。TALEN识别由两个TALEDNA-结合位点组成的目标位点，该TALE DNA-结合位点位于FokI切割结构域识别的12-至20-bp间隔子序列的侧面。Cas9核酸酶靶向与位于兼容的原间隔子相邻基序(PAM)上游紧邻的单个引导RNA(gRNA)中的靶向序列互补的DNA序列。因此，本领域技术人员将能够为本发明选择合适的基因编辑技术。
在一些方面，通过使用RNA引导的核酸酶系统(如，对被破坏的基因(例如，PAGR1、Klf4、SIX2)具有特异性的CRISPR-Cas系统，如CRISPR-Cas9系统)进行基因编辑来进行破坏。在一些实施方式中，将含有Cas9和含有靶向基因座的区域的靶向结构域的引导RNA(gRNA)的试剂引入细胞中。在一些实施方式中，试剂是或包含Cas9多肽和gRNA(Cas9/gRNARNP)的核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些实施方式中，引入包括使试剂或其部分与细胞体外接触，其可以包括将细胞和试剂培养或培育上至24、36或48小时或3、4、5、6、7或8天。在一些实施方式中，引入可以进一步包括将试剂递送至细胞中。在各种实施方式中，根据本公开的方法、组合物和细胞利用Cas9和gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物直接递送至细胞，例如通过电穿孔。在一些实施方式中，RNP复合物包括已被修饰为包括3'poly-A尾和5'抗-反向帽类似物(Anti-Reverse Cap Analog)(ARCA)帽的gRNA。
CRISPR/Cas9系统是用于诱导靶向基因改变的简便和高效的系统。Cas9蛋白对目标的识别需要引导RNA(gRNA)内的“种子”序列和gRNA结合区上游、含有保守二核苷酸的原间隔子相邻基序(PAM)序列。通过重新设计细胞系(如293T细胞)、原代细胞和TCR T细胞中的gRNA，从而可以对CRISPR/Cas9系统工程化以切割几乎任何DNA序列。CRISPR/Cas9系统可以通过与两个或更多个gRNA共表达单个Cas9蛋白来同时靶向多个基因组基因座，从而使此系统适合于进行多基因编辑或目标基因的或协同活化。
Cas9蛋白和引导RNA形成鉴定和切割目标序列的复合物。Cas9由六个结构域组成：REC I、REC II、Bridge螺旋、PAM互作、HNH和RuvC。REC I结构域与引导RNA结合，而Bridge螺旋与目标DNA结合。HNH和RuvC结构域是核酸酶结构域。引导RNA被工程化，以具有与目标DNA序列互补的5’端。引导RNA与Cas9蛋白结合后，发生构象变化以使蛋白质活化。活化后，Cas9通过结合与其原间隔子相邻基序(PAM)序列匹配的序列来搜索目标DNA。PAM是在与引导RNA互补的区域下游的一个核苷酸内的两个或三个核苷酸碱基序列。在一个非限制性实例中，PAM序列是5’-NGG-3’。当Cas9蛋白找到具有合适PAM的其目标序列时，其使PAM上游的碱基融化并将其与引导RNA上的互补区域配对。然后，RuvC和HNH核酸酶结构域在PAM上游的第三个核苷酸碱基之后切割目标DNA。
用于抑制基因表达的CRISPR/Cas系统的一个非限制性实例(CRISPRi)描述于美国专利申请公开号US20140068797中。CRISPRi诱导永久性基因破坏，其利用RNA引导的Cas9核酸内切酶以引入DNA双链断裂，其触发易于出错的修复途径(error-prone repairpathways)，从而导致移码突变。催化死亡的Cas9缺乏核酸内切酶活性。当与引导RNA共表达时，生成DNA识别复合物，其特异性干扰转录延伸、RNA聚合酶结合或转录因子结合。此CRISPRi系统有效地抑制目标基因的表达。
当将对目标基因和Cas核酸内切酶酶具有特异性的引导核酸序列引入细胞中并形成使得Cas核酸内切酶在目标基因处引入双链断裂的复合物时，发生CRISPR/Cas基因破坏。在某些实施方式中，CRISPR/Cas系统包含表达载体，如但不限于pAd5F35-CRISPR载体。在其它实施方式中，Cas表达载体诱导Cas9核酸内切酶的表达。也可以使用其它核酸内切酶，包括但不限于Cas12a(Cpf1)、T7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、本领域已知的其它核酸酶及其任何组合。
在某些实施方式中，诱导Cas表达载体包括将细胞暴露于活化Cas表达载体中的诱导型启动子的试剂。在这种实施方式中，Cas表达载体包括诱导型启动子，如通过暴露于抗生素(例如，通过四环素或四环素的衍生物，例如，强力霉素)诱导的启动子。也可以使用本领域技术人员已知的其它诱导型启动子。诱导剂可以是导致诱导诱导型启动子的选择性条件(例如，暴露于试剂，例如抗生素)。这导致Cas表达载体的表达。
如本文所用，术语“引导RNA”或“gRNA”指代促进RNA引导核酸酶(如Cas9)与细胞中的目标序列(例如，基因组或游离序列(episomal sequence))特异性结合(或“靶向”)的任何核酸。
如本文所用，“模块化(modular)”或“双重RNA”引导包括多于一个，并且通常两个单独的RNA分子，如CRISPR RNA(crRNA)和反式活化crRNA(tracrRNA)，其通常例如通过双工(duplexing)彼此相关。在整个文献中描述了gRNA及其组成部分(参见，例如，Briner等人，Mol.Cell,56(2),333-339(2014)，其通过引用并入)。
如本文所用，“单分子gRNA”、“嵌合gRNA”或“单引导RNA(sgRNA)”包括单个RNA分子。sgRNA可以是连接在一起的crRNA和tracrRNA。例如，crRNA的3’端可以与tracrRNA的5’端连接。crRNA和tracrRNA可以例如通过桥接crRNA(在其3'端)和tracrRNA(在其5'端)的互补区的四个核苷酸(例如，GAAA)“四环”或“连接子”序列连接到单个单分子或嵌合gRNA中。
如本文所用，“重复”序列或区域是crRNA的3’端处或附近的核苷酸序列，其与tracrRNA的抗重复序列互补。
如本文所用，“抗重复”序列或区域是在tracrRNA的5’端处或附近的核苷酸序列，其与crRNA的重复序列互补。
关于引导RNA结构和功能的另外细节，包括用于基因组编辑的gRNA/Cas9复合物，至少在Mali等人，Science,339(6121),823-826(2013)；Jiang等人，Nat.Biotechnol.31(3).233-239(2013)；和Jinek等人Science,337(6096),816-821(2012)(其通过引用并入本文)中找到。
如本文所用，“引导序列”或“靶向序列”指代gRNA的核苷酸序列，无论是单分子还是模块化的，其与期望编辑的细胞的基因组中DNA序列内的目标区域或目标多核苷酸完全或部分互补。引导序列的长度通常为10-30个核苷酸，长度优选为16-24个核苷酸(例如，长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且在Cas9 gRNA的5'末端处或附近。
如本文所用，“目标结构域”或“目标多核苷酸序列”或“目标序列”是细胞的基因组中与gRNA的引导序列互补的DNA序列。
在形成CRISPR复合物的情况下，“目标序列”指代引导序列被设计成具有一些互补性的序列，其中目标序列与引导序列之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补性，只要存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。目标序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在某些实施方式中，目标序列位于细胞的核或胞质中。在其它实施方式中，目标序列可以在真核细胞的细胞器(例如，线粒体或细胞核)内。通常，在CRISPR系统的环境中，形成CRISPR复合物(包含与目标序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)导致目标序列中或附近(例如，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对)切割一条或两条链。与目标序列一样，相信不需要完全的互补性，只要这足以起作用。
在某些实施方式中，将驱动CRISPR系统的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入宿主细胞中，使得CRISPR系统的元件的表达指导在一个或多个目标位点处形成CRISPR复合物。例如，Cas核酸酶、crRNA和tracrRNA可以各自可操作地连接至分开的载体上的分开的调控元件。可选地，可以将由相同或不同调控元件表达的两个或更多个元件组合在单个载体中，其中一个或多个另外的载体提供不包括在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。可以沿任何合适的取向排列组合在单个载体中的CRISPR系统元件，如相对于第二元件(“上游”)位于5’或相对于第二元件(“下游”)位于3’的一个元件。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的相同或相反链上，并且以相同或相反方向定向。在某些实施方式中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物和一个或多个引导序列、tracr配对序列(任选地可操作地连接至引导序列)和嵌入一个或多个内含子序列中的tracr序列(例如，每个在不同的内含子中、两个或更多个在至少一个内含子中或全部在单个内含子中)的表达。
在某些实施方式中，CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个除CRISPR酶以外的结构域)的融合蛋白的部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何另外的蛋白序列，以及任选地任何两个结构域之间的连接子序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白结构域的实例包括但不限于表位标签、报道基因序列、和具有以下活性中的一种或多种的蛋白结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的部分的另外的结构域描述于通过引用并入本文的美国专利申请公开号US20110059502中。在某些实施方式中，标记的CRISPR酶用于鉴定目标序列的位置。
常规的病毒和非病毒系基因转移方法可以用于将核酸引入哺乳动物和非哺乳动物细胞或目标组织中。这种方法可以用于向培养物或宿主生物体中的细胞给予编码CRISPR系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述的载体的转录物)、裸核酸以及与递送载体(如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有游离或整合基因组(Anderson,1992,Science 256:808-813；和Yu等人，1994,Gene Therapy 1:13-26)。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas源自II型CRISPR/Cas系统。在其它实施方式中，CRISPR/Cas系统源自Cas9核酸酶。可以用于本发明的示例性Cas9核酸酶包括但不限于酿脓链球菌Cas9(S.pyogenes Cas9)(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(S.aureus Cas9)(SaCas9)、嗜热链球菌Cas9(S.thermophilus Cas9)(StCas9)、脑膜炎奈瑟氏菌Cas9(N.meningitidis Cas9)(NmCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(C.jejuni Cas9)(CjCas9)和地芽孢杆菌Cas9(Geobacillus Cas9)(GeoCas9)。
总体上，Cas蛋白包含至少一个RNA识别和/或RNA结合结构域。RNA识别和/或RNA结合结构域与引导RNA相互作用。Cas蛋白还可以包含核酸酶结构域(即，DNA酶或RNA酶结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNA酶结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其它结构域。可以修饰Cas蛋白以增加核酸结合亲和力和/或特异性、改变酶活性、和/或改变蛋白质的另一性质。在某些实施方式中，融合蛋白的Cas样蛋白可以源自野生型Cas9蛋白或其片段。在其它实施方式中，Cas可以源自修饰的Cas9蛋白。例如，可以修饰Cas9蛋白的氨基酸序列以改变蛋白质的一种或多种性质(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。可选地，可以从蛋白质中消除不参与RNA引导的切割的Cas9蛋白的结构域，使得修饰的Cas9蛋白小于野生型Cas9蛋白。总体上，Cas9蛋白包含至少两个核酸酶(即，DNA酶)结构域。例如，Cas9蛋白可以包含RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域共同作用以切割单链，从而在DNA中产生双链断裂(Jinek等人，2012,Science,337:816-821)。在某些实施方式中，可以修饰Cas9源性蛋白质以仅含有一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶结构域)。例如，可以修饰Cas9源性蛋白，使得核酸酶结构域中的一个被缺失或突变，使得其不再起作用(即，不存在核酸酶活性)。在其中核酸酶结构域中的一个是失活的一些实施方式中，Cas9源性蛋白能够将切口(nick)引入双链核酸(这种蛋白被称为“切口酶(nickase)”)，但不切割双链DNA。在上述实施方式中的任一个中，可以使用公知的方法(如定点诱变、PCR介导的诱变和总基因合成以及本领域已知的其它方法)，通过一个或多个缺失突变、插入突变、和/或取代突变使核酸酶结构域中的任一种或全部失活。
在一个非限制性实施方式中，载体驱动CRISPR系统的表达。本领域充满可用于本发明的合适载体。使用的载体适用于复制，以及任选地整合到真核细胞中。典型的载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控期望的核酸序列的表达的启动子。本发明的载体还可以用于核酸标准基因递送方案。基因递送的方法是本领域已知的(美国专利号5,399,346、5,580,859&5,589,466，以其整体通过引用并入本文)。
进一步，载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等人(第4版，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York,2012)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒、辛德毕斯病毒、γ逆转录病毒和慢病毒。总体上，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择性标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
在一些实施方式中，引导RNA(一个或多个)和Cas9可以作为核糖核蛋白(RNP)复合物(例如，Cas9/RNA蛋白复合物)递送至细胞。RNP由与gRNA复合的纯化Cas9蛋白组成，并且在本领域公知有效地递送至多种类型的细胞，包括但不限于干细胞和免疫细胞(Addgene,Cambridge,MA,Mirus Bio LLC,Madison,WI)。在一些实施方式中，Cas9/RNA蛋白复合物通过电穿孔递送至细胞中。
在一些实施方式中，使用CRISPR/Cas9编辑本公开的基因编辑的修饰的细胞，以破坏修饰的细胞(例如，修饰的T细胞)中的一个或多个内源基因。在一些实施方式中，CRISPR/Cas9用于破坏内源TRAC、TRBC、PDCD1、A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CD96、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3、和/或VISTA基因座中的一个或多个，从而导致TRAC、TRBC、PD-1、A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CD96、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3、和/或VISTA下调。在一些实施方式中，CRISPR/Cas9用于破坏内源TRAC、TRBC、PDCD1、和/或TIM-3中的一个或多个。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas9用于破坏内源APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、和/或ZNRF2基因座中的一个或多个，从而导致APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、和/或ZNRF2下调。在某些示例性实施方式中，CRISPR/Cas9用于破坏内源PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19和/或C1orf14基因座中的一个或多个，从而导致PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19和/或C1orf14下调。用于破坏内源PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19和/或C1orf141中的一个或多个的合适的gRNA显示于表1中。
表1：
Figure BDA0002798262570000431
Figure BDA0002798262570000441
Figure BDA0002798262570000451
本领域技术人员将理解，可以用胸苷(T)或尿苷(U)核苷酸叙述引导RNA序列。
在一些实施方式中，本发明提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码转录调节子的基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调内源转录调节子的基因表达。在一些实施方式中，基因座中的插入和/或缺失是基因座中CRISPR介导的插入和/或缺失。在一些实施方式中，基因座是本文所述的内源目标基因中的任一种。因此，本发明提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码本文所述基因中的任一种的基因座中的CRISPR介导的插入和/或缺失，其中CRISPR介导的插入和/或缺失能够下调基因的基因表达。
在一些实施方式中，本发明提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码转录调节子的基因座中的插入和/或缺失，其中插入和/或缺失能够下调内源转录调节子的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，基因座中的插入和/或缺失是基因座中的CRISPR介导的插入和/或缺失。在一些实施方式中，基因座是本文所述的内源目标基因中的任一种。因此，本发明提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码本文所述的基因中的任一种的基因座中的CRISPR介导的插入和/或缺失，其中CRISPR介导的插入和/或缺失能够下调基因的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方式中，本发明提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码内源APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、和/或ZNRF2基因座的基因座中的CRISPR介导的插入和/或缺失，其中CRISPR介导的插入和/或缺失能够下调APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、和/或ZNRF2的基因表达。
在一些实施方式中，本发明提供了修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：编码内源APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、和/或ZNRF2基因座的基因座中的CRISPR介导的插入和/或缺失，其中CRISPR介导的插入和/或缺失能够下调APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、和/或ZNRF2的基因表达；和对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
因此，对本公开的修饰的细胞进行基因编辑的方法包括将能够下调选自APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、和/或ZNRF2的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。在一个实施方式中，对本公开的修饰的细胞进行基因编辑的方法包括将能够下调选自PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19和C1orf141的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。在一个实施方式中，对本公开的修饰的细胞进行基因编辑的方法包括将能够下调选自PAGR1、Klf4和SIX2的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。在一个实施方式中，对本发明的修饰的细胞仅由基因编辑的方法包括将能够下调内源PAGR1的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。在一个实施方式中，对本发明的修饰的细胞进行基因编辑的方法包括将能够下调内源Klf4的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。在一个实施方式中，对本发明的修饰的细胞进行基因编辑的方法包括将能够下调内源SIX2的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。
在一个实施方式中，用于生成本公开的修饰的细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入细胞中；和2)将能够下调选自PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19和C1orf141的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入细胞中；和2)将能够下调PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19和/或C1orf141(例如，SEQ ID NOs:31-66)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19和/或C1orf141的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:31-66中的任一种。
在一个实施方式中，用于生成本公开的修饰的细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入细胞中；和2)将能够下调选自PAGR1、Kl4和SIX2的一种或多种内源基因的基因表达的一种或多种核酸引入细胞中。
在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调PAGR1、Klf4、和/或SIX2(例如，SEQ ID NOs:31-38)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调PAGR1、Klf4、和/或SIX2的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:31-48中的任一种。
在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调PAGR1(例如，SEQ ID NOs:31-36)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调PAGR1的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:31-36中的任一种。
在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调SIX2(例如，SEQ ID NOs:37-42)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调SIX2的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:37-42中的任一种。
在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调Klf4(例如，SEQ ID NOs:43-48)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调Klf4的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:43-48中的任一种。
在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调USP27X(例如，SEQ IDNOs:49-54)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调USP27X的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:49-54中的任一种。
在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调CEACAM19(例如，SEQ IDNOs:55-60)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调CEACAM19的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:55-60中的任一种。
在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调C1orf141(例如，SEQ IDNOs:61-66)的基因表达的核酸引入细胞中。在示例性实施方式中，用于生成本公开的修饰的T细胞的方法包括：1)将包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的核酸引入T细胞中；2)将能够下调C1orf141的基因表达的核酸引入细胞中，其中能够下调基因表达的核酸包含靶向序列，即SEQ ID NOs:61-66中的任一种。
CRISPR介导的修饰的非限制性类型包括取代、插入、缺失和插入/缺失(INDEL)。修饰可以位于目标位点的任何部分(例如，本文所述的目标基因中的任一种的内源基因座)，包括但不限于外显子、剪接供体或剪接受体。
在一些方面，提供的组合物和方法包括其中在免疫细胞的组合物中，至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的免疫细胞含有期望的基因修饰的那些。例如，在引入用于敲除或基因破坏内源基因(例如，PAGR1、KLF4或SIX2)的试剂(例如gRNA/Cas9)的细胞的组合物中，约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的免疫细胞含有基因破坏；不表达目标内源多肽，不含有目标基因的连续和/或功能性拷贝。在一些实施方式中，根据本公开的方法、组合物和细胞包括其中在引入用于目标基因的敲除或基因破坏的试剂(例如gRNA/Cas9)的细胞的组合物中，至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞在如免疫细胞的表面上不表达目标多肽的那些。在一些实施方式中，在引入用于目标基因的敲除或基因破坏的试剂(例如gRNA/Cas9)的细胞的组合物中，至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞在两个等位基因中被敲除，即在这种细胞百分比中包含双等位基因缺失。
在一些实施方式中，提供了组合物和方法，在已引入用于目标基因的敲除或基因破坏的试剂(例如gRNA/Cas9)的细胞的组合物中，其中在目标基因内或附近(例如，在切割位点的上游或下游：在或大约在100个碱基对内、在或大约在50个碱基对内、或在或大约在25个碱基对内或在或大约在10个碱基对内)由Cas9介导的切割效率(％插入缺失)为至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞。
在一些实施方式中，在引入用于目标基因的敲除或基因破坏的试剂(例如gRNA/Cas9)的细胞的组合物中，提供的细胞、组合物和方法导致经由内源传递的信号的减少或破坏为至少或大于约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞。
在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与在相应或参考组合物的工程化细胞(包含受体但不包含基因的基因破坏或表达多肽)中表达的受体相比，根据提供的公开内容的组合物(包含用重组受体工程化的细胞和包含在内源受体的表达(例如PAGR1、KLF4或SIX2的基因破坏)中的减少、缺失、消除、敲除或破坏)保留受体的功能性质或活性。在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与包含工程化细胞(其中其用重组受体工程化但不包含基因破坏或表达目标多肽)的相应或参考组合物相比，提供的组合物的工程化细胞保留功能性质或活性。在一些实施方式中，与此相应或参考组合物相比，细胞保留细胞毒性、增殖、存活或细胞分泌因子分泌。
在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与相应或参考组合物中的细胞表型相比，组合物中的免疫细胞保留免疫细胞(一个或多个)的表型。在一些实施方式中，组合物中的细胞包括幼稚细胞(naive cells)、效应记忆细胞、中枢记忆细胞(central memorycells)、中枢记忆干细胞(stem central memory cells)、效应记忆细胞和长寿效应记忆细胞(long-lived effector memory cells)。在一些实施方式中，T细胞、或表达重组受体(例如TCR和/或CAR)并且包含目标基因(例如，PAGR1、KLF4或SIX2)的基因破坏的T细胞的百分比表现出非活化的、长寿记忆或中枢记忆表型，其与用重组受体工程化但不含有基因破坏的相应或参考细胞群或组合物相同或基本上相同。在一些实施方式中，可以在体外测定中测量这种性质、活性或表型，如通过在TCR和/或CAR靶向的抗原、表达抗原和/或抗原受体活化物质的细胞的存在下培育细胞。在一些实施方式中，可以在电穿孔或其它试剂的引入后的不同天数(如在或上至3、4、5、6、7天后)来评估所评估的活性、性质或表型中的任一种。在一些实施方式中，当在相同条件下评估时，与含有用重组受体工程化的细胞但不包含目标基因的基因破坏的相应组合物的活性相比，组合物中这种活性、性质或表型保留至少80％、85％、90％、95％或100％的细胞。
如本文所用，提及“相应的组合物”或“相应的免疫细胞群”(也称为“参考组合物”或“细胞的参考群”)指代在相同或基本相同的条件下获得、分离、生成、产生和/或培育的免疫细胞(例如，T细胞)，不同之处在于免疫细胞或免疫细胞群不引入试剂。在一些方面，除了不含有试剂的引入外，这种免疫细胞与已引入试剂的免疫细胞相同或基本相同地处理，使得可以影响细胞的活性或性质(包括抑制性分子的上调或表达)的任一种或多种条件除试剂的引入之外，在细胞之间没有变化或基本上没有变化。
用于评估T细胞标记物的表达和/或水平的方法和技术是本领域已知的。用于检测这种标记物的抗体和试剂是本领域公知的，并且容易获得。用于检测这种标记物的测定和方法包括但不限于流式细胞术，包括细胞内流式细胞术、ELISA、ELISPOT、细胞计数珠阵列(cytometric bead array)或其它多重方法、Western杂交和其它基于免疫亲和力的方法。在一些实施方式中，抗原受体(例如TCR和/或CAR)表达细胞可以通过流式细胞术或其它基于免疫亲和力的方法检测，以表达这种细胞特有的标记物，然后可以将这些细胞与另一T细胞表面标记物(一个或多个)共染色。
在一些实施方式中，细胞、组合物和方法用于在过继性转移的免疫细胞(如被工程化以表达外源TCR和/或CAR的细胞)(例如T细胞)中进行目标基因的表达的缺失、敲除、破坏或减少。在一些实施方式中，在原代细胞(如来自对象的原代免疫细胞(例如T细胞))上离体执行该方法。在一些方面，产生或生成这种基因工程化T细胞的方法包括向含有免疫细胞(例如T细胞)的细胞群中引入一种或多种编码重组受体(例如外源TCR和/或CAR)的核酸和一种或多种试剂，该试剂能够破坏编码被靶向的内源受体的基因。如本文所用，术语“引入”涵盖体外或体内将DNA引入细胞的多种方法，这些方法包括转化、转导、转染(例如电穿孔)和感染。载体可用于将DNA编码分子引入细胞中。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体或其它载体，如腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体。
含有T细胞的细胞群可以是已从对象获得(如从外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采血液成分术样品、白细胞分离术样品(leukapheresis product)获得)的细胞。在一些实施方式中，可以使用阳性或阴性选择和富集方法分离或选择T细胞以富集群体中的T细胞。在一些实施方式中，群体含有CD4+、CD8+或CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中，引入编码基因工程化抗原受体的核酸的步骤和引入试剂(例如Cas9/gRNA RNP)的步骤可以同时或以任何次序顺序发生。在一些实施方式中，在引入外源受体和一种或多种基因编辑试剂(例如Cas9/gRNA RNP)后，在刺激细胞扩增和/或增殖的条件下培养或培育细胞。
因此，提供了增强免疫细胞(如T细胞)在过继性细胞疗法中起作用的细胞、组合物和方法，包括提供改善的功效的那些，如通过增强给予的基因工程化细胞的活性和效力，同时随时间推移保持持久性或暴露于转移的细胞。在一些实施方式中，与某些可获得的方法相比，当体内给予对象时，基因工程化细胞表现出增强的扩增和/或持久性。在一些实施方式中，当体内给予对象时，提供的免疫细胞表现出增加的持久性。在一些实施方式中，与将通过可选方法(如涉及通过其中不引入试剂的T细胞的方法给予基因工程化的细胞的那些，该试剂减少编码内源受体的基因的表达或破坏编码内源受体的基因)实现的持久性相比，在给予后对象中基因工程化免疫细胞的持久性更大。在一些实施方式中，持久性增加至少或约至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更大。
在一些实施方式中，可以在向对象给予之后检测或定量所给予细胞的持久性的程度或范围(extent)。例如，在一些方面，定量PCR(qPCR)用于评估在对象的血液或血清或器官或组织(例如，疾病位点)中表达外源受体(例如，TCR和/或CAR)的细胞的数量。在一些方面，持久性被量化为每微克DNA的编码外源受体的DNA或质粒的拷贝，或每微升样品(例如，血液或血清)中、或每外周血单核细胞(PBMC)或白细胞的总数量或每微升样品T细胞中表达受体的细胞的数量。在一些实施方式中，还可以进行流式细胞术测定，其通常使用对受体具有特异性的抗体来检测表达受体的细胞。基于细胞的测定法也可以用于检测功能性细胞(如能够结合和/或中和和/或诱导针对疾病或状况的细胞的响应(例如，细胞毒性响应)或表达由受体识别的抗原)的数量或百分比。在这种实施方式中的任一种中，与外源受体(例如外源TCR和/或CAR)相关的另一标记物的表达程度或水平可以用于区分对象中给予的细胞与内源细胞。
F.产生基因修饰的免疫细胞的方法
本公开提供了用于产生或生成用于肿瘤免疫疗法(例如，过继性免疫疗法)的本发明的修饰的免疫细胞或其前体(例如，T细胞)的方法。通常通过引入编码外源受体(例如，TCR和/或CAR)的一种或多种基因工程化核酸来工程化细胞。在一些实施方式中，细胞还与编码外源受体的核酸、能够破坏目标基因(例如，编码PAGR1的基因)的试剂(例如，Cas9/gRNA RNP)一起同时或顺序地引入。
在一些实施方式中，使用同源引导修复(homology directed repair)将编码外源TCR和/或CAR的核酸插入目标位点(例如，本文所述的目标基因中的任一种的内源基因座)。
如本文所用，“同源引导修复”或“HDR”是修复细胞中双链DNA断裂的机制。HDR总体上依赖于同源重组过程，进而使用一段核酸序列同源性来修复双链DNA断裂。在HDR期间，核酸供体的同源序列的链侵入切割DNA的切除部分或与其杂交。使用切除的DNA作为引物的DNA聚合酶使用侵入的供体序列作为模板延伸切割DNA。延伸和断裂修复后，切割位点处的新序列具有修复过程中使用的核酸供体中存在的任何序列。HDR的过程进一步描述于通过引用并入本文的Jasin等人(Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2013年11月；5(11):a012740)中。
在一些实施方式中，核酸供体模板(例如，用于插入编码TCR和/或CAR的核酸序列)可以与基因编辑复合物(例如，CRISPR/Cas系统)一起使用，以使得能够在宿主细胞的同源目标核酸中的特定核苷酸位置(例如，在特定等位基因处是复合杂合的同源染色体)处进行基因组工程化。在一些方面，本公开提供了用于目标基因编辑的方法，该方法包括将重组基因编辑复合物的至少一种组分与核酸供体模板一起递送至细胞(例如，患病对象的细胞)，在这种条件下使得重组基因编辑复合物在染色体的目标位点中引起基因损伤(例如，切口或双链断裂)，并且本发明的供体模板介导修复机制(例如，HDR)，从而修复损伤。
在某些实施方式中，核酸供体模板(在本文中也称为外源供体DNA序列)通过同源重组促进编码TCR和/或CAR的核酸序列插入目标位点(例如，内源基因座)。因此，在某些实施方式中，使用外源供体DNA序列通过同源重组将编码TCR和/或CAR的核酸序列插入目标位点(例如，内源基因座)。在某些实施方式中，外源供体DNA序列包含5’同源臂，该5’同源臂包含SEQ ID NO:162中所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，外源供体DNA序列包含SEQ IDNO:163中所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，外源供体DNA序列包含3’同源臂，该3’同源臂包含SEQ ID NO:164中所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，外源供体DNA序列包含SEQ ID NO:165中所示的核苷酸序列。
5’同源臂(SEQ ID NO:162)：
AAGGCACCCGCTGGGTCATGTGGTTCGGAGACGGACATTGAGGCTCCCACAGGAGATGCAGATGTCTGGAAAGCAGAGGGAGGGGATGGGGTGAGAGTGCCAGAGTTCCCAGGCAACAAACTTACCCTCAATGTTCCGGCACTTCTGCCGCACCTCGTACACCAGCCGCTCTGCAAGGGGAGGAGAGCTGGCGTCAGAGGTGCCACCCTCTCCAGAAGCAGGCCAACTACCTCTTGTGCGCTCATCAATAATCTCCTTGACCTTGGGCTTCTCCGCTGTGCTCTTCCGGGGCTTTTTGGCTGGTGGAGGTGGTGCGTAGGCAGCTGCCTCAGGTTCCACCCACATGTCCGTGTACACTTCTTTGTAGGGATTCTTCTCTTCTGGAGGAGGAAAGCAGGTGCCAAGGTCAGGGTCCCAGAAAGCTGGGTGCCCTCATTTACCTTCTGGTGGCTCCAGGCCCTTAGGGCCAGAAGGCTGGAAGCCCCCCAGGGCCCATTCAATCATGGGCTTGTTCTGCACCTCCACGGCCTTGGCAGTGTCACTCTCATCGCTGTCGTGGCACACCGGGAACAGCTTCCCCGCGCGGCTGCTGGCCACCTGGAGGGTGACACGCCAGGGTTGGGGTTGCTCCTCCGAGCTCCCAGCAGGGACACTCACCTGCAGGACCTCGTAGATGGCTTTGCGGTACATGGGCTGCTTGTTGTACGTGGCCTGGTGGAACGCACTGCAAAACGAGCTCAGCGGCATCAGCTTCTCAACACACACCTGGGGGGACAAGCCAGGCCTTGTTTGCCGCCCAGGCTACTGCCAAACCCCACAACTTACCACTGAGAAT
hPGK启动子-eGFP-WPRE-BghPolyA(SEQ ID NO:163)：
GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGGGGATCATCGAATTACCTCTAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGTCGACATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG
3’同源臂(SEQ ID NO:164)：
GACCCAGCGGGTGCCTTCAGCTGCTCGGCTCCGGCCCGTCATCCACCAAGACACAATGCGGCCTGGCCACCAGGAGAAGCCCCGCAGTTTCCCCCACACCAGCTCCCCAATGCCAAAGCCCCGGCCGTCCTGGAGCCCCAAGGAGCAGAAATCATTACACTGGCCACGGCTGGTGAAGAAGCCGCTCACCTCGTACTCTGGCTCGTCATCGCCTGCTTTGGTGGCATTCTTGTCCCCAGCATCGGACCCCACGGGCTCAGGCGTGGTAGCCACAGTGGGGGATGCGGGGTCAGTGGGCTGCTGCACAGCAGGAGGGCTGGCCTCCTCCACCTTCTGAGACTCCCCGGGCCCCTGGTTTTCTTCCACAGCATTCATTCCTGCAATGACCTTGGCTTTCTTCTCAGCCTGGGGAAACAAAAAACAAAAAGTCACCTTGGCTGGGGCCCAGGCCAGAAGGCGCCTCACCTCCCTTTTCCAGCGTGCCAGCCACTCGTCCCGCTTGCGCTTGCTGATGTAGTAGGGGTCCCCCGCCTGGAAGGTGAGCCTCGGCATGGGCCGCTGACGGAGGCTGGACTCCCAGCCCAAGCCACCCCGCAGCCGGCCCCGGGAGCCCTAGGACAGAGAGACAGACATTAGGGCATTCCACAGAGCCCCTGGGGGTGGAACACTTGCCTCCATTTTCATGGATTCGATGTTGGTCTCCTTCTGTTCTTTGCCTGTGGAGAGGGAAGAACAAAGGGACCAGTAAGAGGCTGCCCCTGGTGCTGAGGACTCACCCGCTTCTGCAGGGGCTCCTCGGCCCGTCTCCGAACCACATGACCCAGCGGGTGCCTT
5’同源臂-hPGK启动子-eGFP-WPRE-BghPolyA-3’同源臂的完整序列(SEQ ID NO:165)：
AAGGCACCCGCTGGGTCATGTGGTTCGGAGACGGACATTGAGGCTCCCACAGGAGATGCAGATGTCTGGAAAGCAGAGGGAGGGGATGGGGTGAGAGTGCCAGAGTTCCCAGGCAACAAACTTACCCTCAATGTTCCGGCACTTCTGCCGCACCTCGTACACCAGCCGCTCTGCAAGGGGAGGAGAGCTGGCGTCAGAGGTGCCACCCTCTCCAGAAGCAGGCCAACTACCTCTTGTGCGCTCATCAATAATCTCCTTGACCTTGGGCTTCTCCGCTGTGCTCTTCCGGGGCTTTTTGGCTGGTGGAGGTGGTGCGTAGGCAGCTGCCTCAGGTTCCACCCACATGTCCGTGTACACTTCTTTGTAGGGATTCTTCTCTTCTGGAGGAGGAAAGCAGGTGCCAAGGTCAGGGTCCCAGAAAGCTGGGTGCCCTCATTTACCTTCTGGTGGCTCCAGGCCCTTAGGGCCAGAAGGCTGGAAGCCCCCCAGGGCCCATTCAATCATGGGCTTGTTCTGCACCTCCACGGCCTTGGCAGTGTCACTCTCATCGCTGTCGTGGCACACCGGGAACAGCTTCCCCGCGCGGCTGCTGGCCACCTGGAGGGTGACACGCCAGGGTTGGGGTTGCTCCTCCGAGCTCCCAGCAGGGACACTCACCTGCAGGACCTCGTAGATGGCTTTGCGGTACATGGGCTGCTTGTTGTACGTGGCCTGGTGGAACGCACTGCAAAACGAGCTCAGCGGCATCAGCTTCTCAACACACACCTGGGGGGACAAGCCAGGCCTTGTTTGCCGCCCAGGCTACTGCCAAACCCCACAACTTACCACTGAGAATGCGATCGCGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGGGGATCATCGAATTACCTCTAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGTCGACATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGACCCAGCGGGTGCCTTCAGCTGCTCGGCTCCGGCCCGTCATCCACCAAGACACAATGCGGCCTGGCCACCAGGAGAAGCCCCGCAGTTTCCCCCACACCAGCTCCCCAATGCCAAAGCCCCGGCCGTCCTGGAGCCCCAAGGAGCAGAAATCATTACACTGGCCACGGCTGGTGAAGAAGCCGCTCACCTCGTACTCTGGCTCGTCATCGCCTGCTTTGGTGGCATTCTTGTCCCCAGCATCGGACCCCACGGGCTCAGGCGTGGTAGCCACAGTGGGGGATGCGGGGTCAGTGGGCTGCTGCACAGCAGGAGGGCTGGCCTCCTCCACCTTCTGAGACTCCCCGGGCCCCTGGTTTTCTTCCACAGCATTCATTCCTGCAATGACCTTGGCTTTCTTCTCAGCCTGGGGAAACAAAAAACAAAAAGTCACCTTGGCTGGGGCCCAGGCCAGAAGGCGCCTCACCTCCCTTTTCCAGCGTGCCAGCCACTCGTCCCGCTTGCGCTTGCTGATGTAGTAGGGGTCCCCCGCCTGGAAGGTGAGCCTCGGCATGGGCCGCTGACGGAGGCTGGACTCCCAGCCCAAGCCACCCCGCAGCCGGCCCCGGGAGCCCTAGGACAGAGAGACAGACATTAGGGCATTCCACAGAGCCCCTGGGGGTGGAACACTTGCCTCCATTTTCATGGATTCGATGTTGGTCTCCTTCTGTTCTTTGCCTGTGGAGAGGGAAGAACAAAGGGACCAGTAAGAGGCTGCCCCTGGTGCTGAGGACTCACCCGCTTCTGCAGGGGCTCCTCGGCCCGTCTCCGAACCACATGACCCAGCGGGTGCCTT
在一些实施方式中，供体DNA序列可以包含转录控制元件，如但不限于MND启动子、CMB启动子、EF-1α启动子、PGK启动子。在一些实施方式中，供体DNA序列可以包含报道分子，如但不限于荧光标记物(例如，GFP)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经生长因子受体(NGFR)、诱导型胱天蛋白酶。在供体DNA序列包含初级插入元件(例如，编码TCR和/或CAR的核酸序列)和次级元件(例如，报道分子)的情况下，可以期望协同表达。一种或多种基因的协同表达的各种方法是本领域已知的。在一些实施方式中，初级插入元件(例如，编码TCR和/或CAR的核酸序列)和次级插入元件(例如，GFP)通过连接子分开。用于本公开的连接子允许多个蛋白质由相同核酸序列(例如，多顺反子或双顺反子序列)编码，其被翻译为解离成单独的蛋白质组分的多蛋白。例如，用于本公开的供体核酸的连接子(包含编码TCR和/或CAR的核酸序列和报道基因)允许TCR和/或CAR以及报道基因产物翻译为解离成单独的TCR和/或CAR和报道基因产物组分的多蛋白。本文其它部分公开了可以使用的各种连接子，例如，IRES或2A肽。
在一些实施方式中，外源受体(例如，TCR和/或CAR)通过表达载体引入细胞中。本文提供了包含编码本发明的TCR和/或CAR的核酸序列的表达载体。合适的表达载体包括慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺病毒相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、工程化杂交病毒载体、裸DNA，包括但不限于转座子介导的载体，如Sleeping Beauty、Piggybak和Integrases，如Phi31。一些其它合适的表达载体包括单纯疱疹病毒(HSV)和逆转录病毒表达载体。
腺病毒表达载体基于腺病毒，其整合到基因组DNA中的能力低，但转染宿主细胞的效率高。腺病毒表达载体含有足以满足下列的腺病毒序列：(a)支持表达载体的包装和(b)最终在宿主细胞中表达TCR和/或CAR。在一些实施方式中，腺病毒基因组是36kb线性双链DNA，其中为了制备本发明的表达载体，可以插入外源DNA序列(例如，编码外源TCR和/或CAR的核酸)以取代大片段的腺病毒DNA(参见，例如Danthinne and Imperiale,Gene Therapy(2000)7(20):1707-1714)。
另一表达载体基于腺病毒相关病毒，其利用腺病毒偶联系统。此AAV表达载体整合到宿主基因组中的效率高。其可以感染未分裂的细胞，因此使得其可以用于将基因递送至哺乳动物细胞中，例如在组织培养物中或体内。AAV载体具有广泛的宿主感染范围。关于AAV载体的产生和使用的细节描述于美国专利号5,139,941和4,797,368中。
逆转录病毒表达载体能够整合到宿主基因组中、递送大量的外来遗传物质、感染广泛的物种和细胞类型并包装在特殊的细胞系中。通过在某些位置处将核酸(例如，编码外源TCR和/或CAR的核酸)插入病毒基因组中以产生复制缺陷型病毒来构建逆转录病毒载体。尽管逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型，但是TCR和/或CAR的整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂。
慢病毒载体源自慢病毒，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有其它具有调控或结构功能的基因(参见，例如，美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。已通过多重减毒HIV毒力基因(例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被缺失，从而使该载体具有生物安全性)来生成慢病毒载体。慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可以用于例如编码TCR和/或CAR的核酸的体内和离体基因转移和表达(参见，例如，美国专利号5,994,136)。
可以通过本领域技术人员已知的任何手段将包括本公开的核酸的表达载体引入宿主细胞中。如果期望，表达载体可以包括用于转染的病毒序列。可选地，可以通过融合、电穿孔、生物弹药(biolistics)、转染、脂转染等引入表达载体。可以在引入表达载体之前使宿主细胞生长并在培养基中扩增，然后进行适当处理以引入和整合载体。然后扩增宿主细胞，并且可以通过载体中存在的标记物进行筛选。可以使用的各种标记物是本领域已知的，并且可以包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。在一些实施方式中，宿主细胞是免疫细胞或其前体，例如，T细胞、NK细胞或NKT细胞。
本发明还提供了基因工程化细胞，其包括和稳定表达本公开的TCR和/或CAR。在一些实施方式中，基因工程化细胞是基因工程化T淋巴细胞(T细胞)、幼稚T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、天然杀伤细胞(NK细胞)、和能够产生治疗相关后代的巨噬细胞。在一个实施方式中，基因工程化细胞是自体细胞。
可以通过用包含本公开的核酸的表达载体稳定转染宿主细胞来产生修饰的细胞(例如，包含TCR和/或CAR)。用于生成本公开的修饰的细胞的另外方法包括但不限于化学转化方法(例如，使用磷酸钙、树状聚合物、脂质体和/或阳离子聚合物)、非化学转化方法(例如，电穿孔、光转化、基因电转移(gene electrotransfer)和/或流体动力递送)和/或基于颗粒的方法(例如，使用基因枪和/或磁转染(magnetofection)的基因交付(impalefection))。表达本公开的TCR和/或CAR的转染细胞可以离体扩增。
用于将表达载体引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook等人(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York。用于将表达载体引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。
可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自Sigma,St.Louis,MO；双十六烷基磷酸酯(“DCP“)可以获自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Choi”)可以获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以获自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以存储在约-20℃下。氯仿可以用作唯一的溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以被表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，其自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排，并且在脂质双层之间夹带水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。也包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式使细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中核酸的存在，可以进行多种测定。这种测定包括例如，本领域技术人员公知的分子生物学测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如，例如通过免疫学手段(ELISA和Western杂交)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明范围内的试剂。
在一个实施方式中，引入宿主细胞中的核酸是RNA。在另一实施方式中，RNA是包含体外转录的RNA或合成RNA的mRNA。可以使用聚合酶链反应(PCR)生成的模板通过体外转录产生RNA。可以使用适当的引物和RNA聚合酶，通过PCR将任何来源的目的DNA直接转化为模版，以进行体外mRNA合成。DNA的来源可以是例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它适当的DNA来源。
PCR可以用于生成用于mRNA的体外转录的模板，然后将其引入细胞中。进行PCR的方法是本领域公知的。用于PCR的引物被设计为具有与要用作PCR的模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补“指代这样的核苷酸的序列：其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA目标退火或杂交。引物可以被设计为与DNA模版的任何部分基本上互补。例如，引物可以被设计为扩增通常在细胞中转录的基因的部分(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。引物也可以被设计为扩增编码特定目的结构域的基因的部分。在一个实施方式中，引物被设计为扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域公知的合成方法生成。“正向引物”是含有与待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文所用的“上游”指代相对于编码链要扩增的DNA序列的位置5。“反向引物”是含有与待扩增的DNA序列的下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文所用的“下游”指代相对于编码链要扩增的DNA序列的位置3'。
也可以使用具有促进RNA的稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度为0至3000个核苷酸。可以通过不同的方法(包括但不限于设计退火至UTR的不同区域的PCR的引物)改变添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度。使用这种方法，本领域普通技术人员可以在转染转录的RNA后修饰需要实现最佳翻译效率的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是目的基因的天然存在的内源5'和3'UTR。可选地，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物中或通过模板的任何其它修饰来添加对于目的基因不是内源的UTR序列。使用对于目的基因不是内源的UTR序列可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中AU富集的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域公知的UTR的性质来选择或设计3'UTR，以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。可选地，当如上所述通过PCR添加对于目的基因不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并不需要所有RNA都能够有效翻译。Kozak序列对多种mRNA的需求是本领域已知的。在其它实施方式中，5'UTR可以源自RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其它实施方式中，各种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR以阻止mRNA的核酸外切酶降解。
为了能够在无需基因克隆的情况下从DNA模板合成RNA，应将转录启动子连接到要转录的序列上游的DNA模板。当将充当RNA聚合酶的启动子的序列添加至正向引物的5'端时，RNA聚合酶启动子被整合到要转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个实施方式中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其它部分所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方式中，mRNA在5'端和3'poly(A)尾上均具有帽，其确定核糖体结合、翻译的起始和细胞中的稳定性mRNA。在环状DNA模板(例如，质粒DNA)上，RNA聚合酶产生长的连体产物(long concatameric product)，其不适合在真核细胞中表达。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，即使在转录后被聚腺苷酸化，该mRNA在真核转染中也不起作用。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'端延伸至模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
转录DNA模板的polyA/T片段可以在PCR期间通过使用含有polyT尾(如100T尾(大小可以为50-5000T)，或者在PCR之后通过任何其它方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。Poly(A)尾还为RNA提供稳定性并减少其降解。总体上，Poly(A)尾的长度与转录RNA的稳定性呈正相关。在一个实施方式中，Poly(A)尾在100与5000个腺苷之间。
在体外转录后，可以使用Poly(A)聚合酶(如大肠杆菌PolyA聚合酶(E.coli polyApolymerase)(E-PAP))进一步延伸RNA的Poly(A)尾。在一个实施方式中，将聚(A)的长度从100个核苷酸增加至300至400个核苷酸导致RNA的翻译效率提高约两倍。另外，将不同的化学基团连接至3'端可以增加mRNA稳定性。这种连接可以含有修饰的/人工核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以使用Poly(A)尾聚合酶将ATP类似物并入Poly(A)尾中。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知和本文所述的技术提供5'帽(Cougot等人，Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人，RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
在一些实施方式中，将RNA(如体外转录的RNA)电穿孔到细胞中。可以包括任何适合细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和存活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
在一些实施方式中，编码本公开的TCR和/或CAR的核酸将是RNA，例如，体外合成的RNA。RNA的体外合成的方法是本领域已知的；可以使用任何已知的方法来合成包含编码TCR和/或CAR的序列的RNA。将RNA引入宿主细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，Zhao等人，Cancer Res.(2010)15:9053。可以在体外、离体或体内将包含编码TCR和/或CAR的核苷酸序列的RNA引入宿主细胞中。例如，可以用包含编码TCR和/或CAR的核苷酸序列的RNA在体外或离体电穿孔宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)。
公开的方法可以在癌症、肝细胞、急性和慢性感染以及自身免疫疾病领域的基础研究和治疗中应用于T细胞活性的调节，包括评估基因修饰的T细胞杀死目标癌症细胞的能力。
该方法还提供通过改变例如启动子或输入RNA的量来在较大范围内控制表达水平的能力，从而可以单独调节表达水平。此外，基于PCR的mRNA生产技术极大地促进了具有不同结构及其结构域组合的mRNA的设计。
本发明的RNA转染方法的一个优点是RNA转染基本上是瞬时的和无载体的。可以在短暂的体外细胞活化后将RNA转基因作为最小表达盒(expressing cassette)递送至淋巴细胞并在其中表达，而无需任何另外的病毒序列。在这些条件下，转基因整合到宿主细胞基因组中的可能性不大。由于RNA的转染效率及其均匀修饰整个淋巴细胞群的能力，因此无需对细胞进行克隆。
用体外转录的RNA(IVT-RNA)对T细胞进行基因修饰利用了两种不同的策略，这两种策略已在各种动物模型中进行了连续测试。通过脂转染或电穿孔用体外转录的RNA转染细胞。期望使用各种修饰来稳定IVT-RNA，以实现转移的IVT-RNA的延长表达。
一些IVT载体在文献中是已知的，其以标准化方式用作体外转录的模板，并且已经以产生稳定的RNA转录物的方式进行基因修饰。本领域中使用的当前方案基于具有下列结构的质粒载体：5'RNA聚合酶启动子，其能够进行RNA转录；随后是目的基因，其由非翻译区(UTR)侧接3'和/或5'；以及含有50-70A核苷酸的3'聚腺苷酸盒。在体外转录之前，通过II型限制性酶在聚腺苷酸盒下游将环状质粒线性化(识别序列相应于切割位点)。因此，聚腺苷酸盒相应于转录物中的后一个Poly(A)序列。由于此程序，一些核苷酸在线性化后保留酶切割位点的一部分，并在3'端延伸或掩盖Poly(A)序列。尚不清楚，这种非生理性的突出是否影响从这种构建体胞内产生的蛋白质的量。
在另一方面，通过电穿孔将RNA构建体递送至细胞中。参见，例如，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教导，将核酸构建体电穿孔至哺乳动物细胞中的制剂和方法。在相关文献以及领域中的多个专利和申请中，通常已知各种参数，其包括用于任何已知细胞类型的电穿孔所需的电场强度。参见，例如，美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的设备可以商购获得，例如，MedPulserTM DNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且描述于专利，如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482中；电穿孔也可以用于体外转染细胞，如例如US20070128708A1中所述。电穿孔也可以用于将核酸体外递送至细胞中。因此，利用本领域技术人员已知的多种可用装置和电穿孔系统中的任一种，将包括表达构建体的核酸电穿孔介导给予至细胞中提供了令人兴奋的新手段，用于将目的RNA递送至目标细胞。
在一些实施方式中，免疫细胞(例如T细胞)可以在引入编码外源受体(例如，TCR和/或CAR)的核酸分子和基因编辑试剂(例如Cas9/gRNA RNP)之前、期间和/或之后培育或培养。在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)可以在引入编码外源受体的核酸分子之前、期间或之后(如在用编码外源受体的病毒载体(例如慢病毒载体)转导细胞之前、期间或之后)培育或培养。在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)可以在引入基因编辑剂(例如Cas9/gRNARNP)之前、期间或之后(如在用试剂接触细胞之前、期间或之后或在例如通过电穿孔将试剂递送至细胞之前、期间或之后)培育或培养。在一些实施方式中，培育可以在引入编码外源受体的核酸分子和引入基因编辑剂(例如Cas9/gRNA RNP)的环境下。在一些实施方式中，方法包括在引入编码外源受体的核酸分子和基因编辑剂(例如Cas9/gRNA RNP)之前，使用刺激或活化剂(例如抗CD3/抗CD28抗体)活化或刺激细胞。
在一些实施方式中，引入基因编辑试剂(例如Cas9/gRNA RNP)在引入编码外源受体的核酸分子之后完成。在一些实施方式中，在引入试剂之前，例如通过去除任何刺激或激活剂使细胞静置。在一些实施方式中，在引入试剂之前，不去除刺激或活化剂和/或细胞因子。本领域技术人员将能够确认将一个或多个核酸序列中的每一个引入宿主细胞中的顺序。
G.免疫细胞来源
在扩增之前，从对象获得免疫细胞来源，用于离体操作。用于离体操作的目标细胞来源还可以包括例如自体或异源供体血液、脐带血或骨髓。例如，免疫细胞来源可以来自待用本发明的修饰的免疫细胞治疗的对象，例如，对象的血液、对象的脐带血或对象的骨髓。对象的非限制型实性包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，对象是人。
免疫细胞可以获自多种来源，包括血液、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带、淋巴或淋巴器官。免疫细胞是免疫系统的细胞，如先天或过继性免疫的细胞，例如，髓样或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。其它示例性细胞包括干细胞，如多能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些方面，细胞是人细胞。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体的和/或自体的。细胞通常是原代细胞，如直接从对象中分离和/或从对象中分离并冷冻的细胞。
在某些实施方式中，免疫细胞是T细胞，例如，CD8+T细胞(例如，CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、天然杀伤T细胞(NKT细胞)、调节性T细胞(Treg)、干细胞记忆T细胞、淋巴样祖细胞(lymphoid progenitor cell)、造血干细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)或树突细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在实施方式中，目标细胞是诱导型多能干(iPS)细胞或源自iPS细胞的细胞，例如，从对象中生成的iPS细胞，其被操作以改变(例如，诱导突变)或操纵一个或多个目标基因的表达，并分化成例如T细胞，例如，CD8+T细胞(例如，CD8+幼稚T细胞、中枢记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4+T细胞、干细胞记忆T细胞、淋巴样祖细胞或造血干细胞。
在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其它细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌概况和/或分化程度限定的那些。T细胞和/或CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型和亚群是幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的不变T(MAIT)细胞、天然存在和过继性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。在某些实施方式中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。
在一些实施方式中，方法包括从对象分离免疫细胞，对其进行制备、加工过、培养和/或工程化。在一些实施方式中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。可以从样品(如生物学样品，例如，从对象获得或源自对象的样品)分离用于所述用于工程化的细胞。在一些实施方式中，分离细胞的对象是患有疾病或状况或需要细胞疗法或将给予其细胞疗法的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗干预(如针对其进行细胞分离、加工和/或工程化的过继性细胞疗法)的人。因此，在一些实施方式中，细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。样品包括直接取自对象的组织、液体和其它样品，以及由一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或培育)产生的样品。生物学样品可以是直接从生物来源获得的样品或被加工的样品。生物学样品包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、脑脊液(cerebrospinal fluid)、滑膜液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括源自其的加工样品。
在一些方面，细胞源自或分离的样品是血液或血液源性样品，或者是或源自单采血液成分术或白细胞分离术样品。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其它淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨骼、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官、和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继性细胞疗法)的环境下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人灵长类和猪。在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或非亲和力系细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂的存在下洗涤、分离和/或培育细胞，例如，以去除不需要的组分、富集期望的组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质，如密度、粘附性质、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性来分离细胞。
在一些实例中，例如通过单采血液成分术或白细胞分离术获得来自对象的循环血液中的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板以外的细胞。在一些实施方式中，洗涤从对象收集的血细胞，例如，以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，以用于随后的处理步骤。在一些实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些方面，根据制造商的说明，通过切向流过滤(tangential flow filtration)(TFF)来完成洗涤步骤。在一些实施方式中，在洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中。在某些实施方式中，去除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方式中，方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。
在一个实施方式中，通过单采血液成分术或白细胞分离术从个体的循环血液获得免疫细胞。单采血液成分术样品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或洗涤液缺乏钙并且可能缺乏镁或者可能缺乏多种(如果不是所有)二价阳离子，用于后续处理步骤。洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(如，例如无Ca、无Mg PBS)中。可选地，可以去除单采血液成分术样品的不期望组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方式中，分离方法包括基于一种或多种特异性分子(如表面标记物，例如，表面蛋白、胞内标记物或核酸)的表达或在细胞中的存在，分离不同细胞类型。在一些实施方式中，可以使用基于这种标记物的任何已知的分离方法。在一些实施方式中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞的表达或一种或多种标记物(通常是细胞表面标记物)的表达水平，例如通过与特异性结合这种标记物的抗体或结合伴侣一起培育，随后通常通过洗涤步骤并且从不与抗体或结合伴侣结合的那些细胞分离与抗体或结合伴侣结合的细胞来分离细胞或细胞群。
这些分离步骤可以基于阳性选择，其中与试剂结合的细胞被保留用于进一步使用，和/或阴性选择，其中不与抗体或结合伴侣结合的细胞被保留。在一些实例中，两个级分均被保留用于进一步使用。在一些方面，阴性选择可以特别有用，在没有可用于特异性鉴定异源群中的细胞类型的抗体的情况下，使得基于由细胞而不是期望群体表达的标记物来最好地进行分离。分离不需导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记物的细胞。例如，对特定类型的细胞(如表达标记物的细胞)的阳性选择或富集指代增加这些细胞的数量或百分比，但不需导致不表达标记物的细胞的完全存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记物的细胞)的阴性选择、去除或衰竭指代减少这种细胞的数量或百分比，但不需导致所有这种细胞的完全去除。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中将一个步骤的阳性或阴性选择级分进行另一分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可以同时衰竭表达多个标记物的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合伴侣一起培育，每种抗体或结合结合伴侣对靶向阴性选择的标记物具有特异性。同样，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣一起培育来同时阳性选择多种细胞类型。
在一些实施方式中，一个或多个T细胞群富集或衰竭对一种或多种特定标记物(如表面标记物)呈阳性(标记物+)或表达高水平(标记物高)，或对一种或多种标记物呈阴性(标记物-)或表达相对低水平(标记物低)的细胞。例如，在一些方面，T细胞的特定亚群(如阳性或表达高水平的一种或多种表面标记物的细胞)，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和/或CD45RO+ T细胞通过阳性或阴性选择技术分离。在一些情况下，这种标记物是在某些T细胞群(如非记忆细胞)上不存在或以相对低水平表达，但在某些其它T细胞群(如记忆细胞)上存在或以相对较高水平表达的标记物。在一个实施方式中，细胞(如CD8+细胞或T细胞，例如，CD3+细胞)富集(即，阳性选择)阳性或表达高表面水平CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD 127和/或CD62L的细胞和/或或衰竭(例如，阴性选择)阳性或表达高表面水平CD45RA的细胞。在一些实施方式中，细胞富集或衰竭阳性或表达高表面水平CD 122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD 127)的细胞。在一些实例中，CD8+T细胞富集对于CD45RO为阳性(或对于CD45RA为阴性)和对于CD62L为阳性的细胞。例如，可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0002798262570000641
M-450 CD3/CD28 T细胞扩展剂)阳性选择CD3+、CD28+ T细胞。
在一些实施方式中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其它白细胞，如CD 14)上表达的标记物将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助和CD8+细胞毒性T细胞。可以通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记物进行阳性或阴性选择将这些CD4+和CD8+群进一步分选成亚群。在一些实施方式中，例如通过基于与各个亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择使CD8+细胞进一步富集或衰竭幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞。在一些实施方式中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高功效，如改善给药后的长期存活、扩增和/或植入，在一些方面，这在这些亚群中尤其牢固。在一些实施方式中，将富含TCM的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞组合进一步增强功效。
在一些实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-子集中。PBMC可以例如使用抗-CD8和抗-CD62L抗体富集或衰竭CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分。在一些实施方式中，CD4+ T细胞群和CD8+ T细胞亚群，例如，亚群富集中枢记忆(TCM)细胞。在一些实施方式中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，其基于对表达或高表达CD45RA和/或粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过衰竭表达CD4、CD 14、CD45RA的细胞和对表达CD62L的细胞进行阳性选择或富集来进行富集TCM细胞的CD8+群的分离。在一方面，从基于CD4表达选择的细胞的负级分开始进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集，其然后进行基于CD 14和CD45RA的表达的阴性选择和基于CD62L的阳性选择。在一些方面，这种选择同时进行，而在其它方面，则以任一次序顺序进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同CD4表达系选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自CD4系分离的正和负级分保留并在方法的后续步骤(任选地在一个或多个进一步的阳性或阴性选择步骤之后)中使用。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+ T辅助细胞分选为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方式中，幼稚CD4+ T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T细胞。在一些实施方式中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物(cocktail)通常包括针对CD14、CD20、CDl lb、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方式中，抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质，如磁珠或顺磁珠，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。
在一些实施方式中，在基因工程化之前或与基因工程一起培育和/或培养细胞。培育步骤可以包括培养(culture)、培养(cultivation)、刺激、活化和/或繁殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激剂的存在下培育组合物或细胞。这种条件包括设计以诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞以进行基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的条件。条件可以包括下列中的一种或多种：特定介质、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体和设计以活化细胞的任何其它试剂。在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括能够活化TCR复合物的胞内信号传导结构域的一种或多种试剂，例如，配体。在一些方面，试剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3胞内信号传导级联。这种试剂可以包括抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体，例如，抗CD3、抗CD28，例如，其结合固体支持物(如珠子)和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可以进一步包括将抗CD3和/或抗CD28抗体添加至培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)中的步骤。在一些实施方式中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，浓度为至少约10单位/mL的IL-2。
在另一实施方式中，例如，通过PERCOLLTM梯度离心，通过裂解红细胞并衰竭单核细胞从外周血中分离T细胞。可选地，可以从脐带分离T细胞。在任何情况下，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群。
如此分离的脐带血单核细胞可以衰竭表达某些抗原(包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56)的细胞。可以使用分离的抗体、包含抗体的生物学样品(如腹水)、结合物理支持物的抗体和细胞结合的抗体来完成这些细胞的衰竭。
通过阴性选择富集T细胞群可以使用针对阴性选择细胞特有的表面标记物的抗体组合来完成。优选的方法是通过阴性磁免疫粘附(negative magnetic immunoadherence)或流式细胞术(其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物)进行细胞分选和/或选择。例如，为通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的浓度。在某些实施方式中，可以期望显著减小珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用大于100百万个细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方式中，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。
T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻，这不需要单核细胞去除步骤。尽管不希望受理论束缚，但是冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一些程度的单核细胞而提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管多种冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且将在上下文中有用，但是在非限制性实例中，一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其它合适的细胞冷冻培养基。然后将细胞以每分钟1℃的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其它控制冷冻的方法，以及立即在-20℃或在液氮中进行非控制冷冻。
在一个实施方式中，T细胞群被包含在细胞(如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系)内。在另一实施方式中，外周血单核细胞包含T细胞群。在又一实施方式中，纯化的T细胞包含T细胞群。
在某些实施方式中，可以从样品中分离T调节细胞(Treg)。样品可以包括但不限于脐带血或外周血。在某些实施方式中，通过流式细胞仪分选分离Treg。在分离之前，可以通过本领域已知的任何手段使样品富集Treg。分离的Treg可以在使用之前冷冻保存和/或扩增。分离Treg的方法描述于美国专利号：7,754,482、8,722,400和9,555,105以及美国专利申请号13/639,927中(其内容以其整体并入本文)。
H.免疫细胞扩增
无论在修饰细胞以表达TCR和/或CAR之前还是之后，可以使用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国公开号20060121005中所述的方法活化和扩增细胞。例如，本发明的T细胞可以通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体地，可以通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触、或通过与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑制素)结合钙离子载体接触来刺激T细胞群。为了共同刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)并且这些可以用于本发明，本领域已知的其它方法和试剂也可以用于本发明(参见，例如，ten Berge等人，TransplantProc.(1998)30(8):3975-3977；Haanen等人，J.Exp.Med.(1999)190(9):1319-1328；和Garland等人，J.Immunol.Methods(1999)227(1-2):53-63)。
通过本文公开的方法扩增T细胞可以乘以约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大，以及其间的任何及所有全部或部分整数。在一个实施方式中，T细胞在约20倍至约50倍之间的范围内扩增。
培养后，在将细胞传递到另一培养设备之前，可以将T细胞在培养设备中的培养基中培育一段时间，或者直至细胞达到汇合或高细胞密度以用于最佳传代。培养设备可以是通常用于体外培养细胞的任何培养设备。优选地，在将细胞传递到另一培养设备之前，汇合水平为70％或更高。更具体地，汇合水平为90％或更高。时间段可以是适合于体外细胞培养的任何时间。在T细胞的培养期间可以随时更换T细胞培养基。优选地，大约每2-3天更换一次T细胞培养基。然后从培养设备中收获T细胞，随后可以立即使用T细胞或将其冷冻保存以供后续使用。在一个实施方式中，本发明包括冷冻保存扩增的T细胞。在将核酸引入T细胞之前，将冷冻保存的T细胞解冻。
在另一实施方式中，方法包括分离T细胞并扩增T细胞。在另一实施方式中，本发明进一步包括在扩增之前冷冻保存T细胞。在又一实施方式中，将冷冻保存的T细胞解冻，用于通过编码嵌合膜蛋白的RNA进行电穿孔。
离体扩增细胞的另一程序描述于美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)中。扩增(如美国专利号5,199,942中所述)可以是本文所述的其它扩增方法的替代或补充。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括添加细胞生长因子(如描述于美国专利号5,199,942中的那些或其它因子，如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体)。在一个实施方式中，扩增T细胞包括用选自flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。
本文所述的培养步骤(与本文所述的试剂接触或电穿孔后)可以非常短，例如小于24小时，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。如本文进一步所述的培养步骤(与本文所述的试剂接触)可以较长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
各种术语用于描述培养中的细胞。细胞培养总体上指代取自活生物体并在受控条件下生长的细胞。原代细胞培养是直接取自生物体并在第一次传代培养之前的细胞、组织或器官的培养。当在促进细胞生长和/或分裂的条件下将细胞置于生长培养基中时，细胞在培养物中扩增，从而产生较大的细胞群。当细胞在培养物中扩增时，细胞增殖速率通常由细胞数量翻倍所需的时间量(也称为倍增时间)来测量。
每轮传代培养称为传代。当将细胞传代培养时，其被称为传代。特定的细胞群或细胞系有时通过已传代的次数来指代或表征。例如，已经传代10次的培养的细胞群可以称为P10培养物。原代培养物(即，从组织中分离细胞后的第一培养物)称为P0。第一次传代培养后，将细胞描述为二次培养物(P1或第1代)。第二次传代培养后，细胞变为第三代培养物(P2或第2代)，依此类推。本领域技术人员将理解，在传代期间可以有多个群体倍增；因此，培养物的群体倍增次数大于传代次数。在传代之间的时期内，细胞的扩增(即，群体倍增的数量)取决于多个因素，包括但不限于接种密度、底物、培养基和传代之间的时间。
在一个实施方式中，可以将细胞培养数小时(约3小时)至约14天或期间的任何小时整数值。适用于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，基本必需培养基(MinimalEssential Media)或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可以含有增殖和存活力所需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、血浆化物(plasmanate)和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimize，并添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素(不含血清)或补充有适当量的血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量的细胞因子(一个或多个)。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，而不包括在要注入对象的细胞培养物中。将目标细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO2)。
用于培养T细胞的培养基可以包括可以共同刺激T细胞的试剂。例如，可以刺激CD3的试剂是针对CD3的抗体，并且可以刺激CD28的试剂是针对CD28的抗体。通过本文公开的方法分离的细胞可以近似扩增10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一个实施方式中，T细胞在约20倍至约50倍或更大的范围内扩增。在一个实施方式中，人T调节细胞通过抗CD3抗体包被的KT64.86人工抗原呈递细胞(aAPC)扩增。用于扩增和活化T细胞的方法可以在美国专利号：7,754,482、8,722,400和9,555,105中找到，其内容以其整体并入本文。
在一个实施方式中，扩增T细胞的方法可以进一步包括分离扩增的T细胞用于进一步应用。在另一实施方式中，扩增方法可以进一步包括随后对扩增的T细胞进行电穿孔，然后进行培养。随后的电穿孔可以包括将编码试剂的核酸引入扩增的T细胞群中，如转导扩增的T细胞、转染扩增的T细胞、或用核酸电穿孔扩增的T细胞，其中试剂进一步刺激T细胞。试剂可以例如通过刺激进一步的扩增、效应子功能或另一T细胞功能来刺激T细胞。
I.治疗方法
本文所述的修饰的细胞(例如，T细胞)可以包含在用于免疫疗法的组合物中。组合物可以包括药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。可以给予治疗有效量的包含修饰的T细胞的药物组合物。
在一方面，本发明包括用于过继性细胞疗法的方法，包括向需要其的对象给予本发明的修饰的T细胞。在另一方面，本发明包括治疗对象的疾病或状况的方法，包括向需要其的对象给予修饰的T细胞群。
还包括在需要其的对象中治疗疾病或状况的方法，包括向对象给予基因编辑的修饰的细胞(例如，基因编辑的修饰的T细胞)。在一个实施方式中，在需要其的对象中治疗疾病或状况的方法包括向对象给予包含外源TCR和/或CAR的基因编辑的修饰的细胞。
用于过继性细胞疗法的免疫细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性T细胞疗法方法描述于例如，授予Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)NatRev Clin Oncol.8(10):577-85)中。参见，例如，Themeli等人，(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人，(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人，(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。在一些实施方式中，通过自体转移进行细胞疗法，例如，过继性T细胞疗法，其中从要接受细胞疗法的对象或从源自此对象的样品中分离和/或制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的对象(例如，患者)，并且分离和加工之后的细胞被给予相同对象。
在一些实施方式中，通过同种异体转移进行细胞疗法，例如，过继性T细胞疗法，其中从要接受或最终接受细胞疗法的对象(例如，第一对象)以外的对象分离和/或以其它方式制备细胞。在这种实施方式中，然后将细胞给予相同物种的不同对象，例如，第二对象。在一些实施方式中，第一和第二对象在基因上相同。在一些实施方式中，第一和第二对象在基因上相似。在一些实施方式中，第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超型。
在一些实施方式中，在给予细胞或含有细胞的组合物之前，已经用靶向疾病或状况(例如，肿瘤)的治疗剂治疗对象。在一些方面，对象对其它治疗剂是难治性或无反应的。在一些实施方式中，例如，在用另一治疗干预(包括化学疗法、放射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT)进行治疗后，对象患有持续或复发性疾病。在一些实施方式中，尽管对象已经变得对另一疗法有抗性，但给药仍有效地治疗了对象。
在一些实施方式中，对象对其它治疗剂有响应，并且用该治疗剂进行的治疗减小了疾病负担。在一些方面，对象最初对治疗剂有响应，但是随着时间推移表现出疾病或状况的复发。在一些实施方式中，对象尚未复发。在一些这种实施方式中，确定对象处于复发风险中，如处于高复发风险中，并且因此预防性地给予细胞，例如，以降低复发的可能性或防止复发。在一些方面，对象尚未接受用另一治疗剂的先前治疗。
在一些实施方式中，例如，在用另一种治疗性干预(包括化学疗法、放射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT)进行治疗后，对象患有持续性或复发性疾病。在一些实施方式中，尽管对象已经变得对另一疗法有抗性，但给药仍有效地治疗了对象。
可以将本发明的修饰的免疫细胞给予动物，优选地哺乳动物，甚至更优选地人，以治疗癌症。另外，本发明的细胞可以用于治疗与癌症相关的任何状况，尤其是期望治疗或减轻疾病的针对肿瘤细胞(一个或多个)的细胞介导的免疫响应。用本发明的修饰的细胞或药物组合物治疗的癌症类型包括癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤(malignant tumors)，以及恶性肿瘤(malignancies)，例如，肉瘤、癌和黑素瘤。其它示例性癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲状腺癌等。癌症可以是非实体瘤(如血液肿瘤)或实体瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。在一个实施方式中，癌症是实体瘤或血液肿瘤。在一个实施方式中，癌症是癌。在一个实施方式中，癌症是白血病。在一个实施方式中，癌症是实体瘤。
实体瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤因形成其的细胞类型而异(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、以及其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌(pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma)、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
可以通过本文公开的方法进行治疗的癌包括但不限于食道癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌的形式)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌，包括过渡性细胞癌(膀胱恶性肿瘤)、支气管癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌、肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、髓样癌、肾细胞癌、原位导管癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌(cervical carcinoma)、子宫癌、睾丸癌、成骨癌、上皮癌和鼻咽癌。
可以通过本文公开的方法进行治疗的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其它软组织肉瘤。
在某些示例性实施方式中，本发明的修饰的免疫细胞用于治疗骨髓瘤或与骨髓瘤相关的状况。骨髓瘤或与其相关的状况的实例包括但不限于轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(monoclonal gamopathy of underterminedsignificance)(MGUS)、浆细胞瘤(plasmacytoma)(例如，单发、多单发、髓外浆细胞瘤(extramedullary plasmacytoma))、淀粉样变性病和多发性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗多发性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗难治性骨髓瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗复发性骨髓瘤。
在某些示例性实施方式中，本发明的修饰的免疫细胞用于治疗黑素瘤或与黑素瘤相关的状况。黑素瘤或与其相关的状况的实例包括但不限于浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤、无黑色素性恶性黑素瘤、或皮肤黑素瘤(例如，皮肤、眼、外阴、引道、直肠黑素瘤)。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗皮肤黑素瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗难治性黑素瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗复发性黑素瘤。
在又一示例性实施方式中，本发明的修饰的免疫细胞用于治疗肉瘤或与肉瘤相关的状况。肉瘤或与其相关的状况的实例包括但不限于血管肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、恶性周围神经鞘瘤、骨肉瘤、多形肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗滑膜肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗脂肉瘤，如粘液样/圆形细胞脂肉瘤、分化/去分化脂肉瘤和多形脂肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗粘液样/圆形细胞脂肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗难治性肉瘤。在一个实施方式中，本公开的方法用于治疗复发性肉瘤。
相对于接受治疗的对象，要给予的本发明的细胞可以是自体的。
本发明的细胞的给予可以以本领域技术人员已知的任何方便的方式进行。本发明的细胞可以通过气雾吸入、注射、摄入、输注、植入或移植给予对象。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内给予患者。在其它情况下，将本发明的细胞直接注射到对象的炎症部位、对象的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等中。
在一些实施方式中，以期望的剂量给予细胞，该期望的剂量在一些方面包括期望剂量或数量的细胞或细胞类型(一种或多种)和/或期望的细胞类型的比。因此，细胞的剂量在一些实施方式中基于细胞的总数(或每千克体重的数量)和个体群体或亚型的期望比，如CD4+与CD8+的比。在一些实施方式中，细胞的剂量基于个体群体或个体细胞类型中细胞的期望总数(或每千克体重的数量)。在一些实施方式中，剂量基于这些特征的组合，如个体群体中期望的总细胞数、期望的比和期望的细胞总数。
在一些实施方式中，以总细胞的期望剂量(如T细胞的期望剂量)的容忍差异或在其容忍差异内给予细胞的群体或亚型，如CD8+和CD4+ T细胞。在一些方面，期望的剂量是期望的细胞数量或期望的细胞数量/要给予细胞的对象的单位体重，例如，细胞/kg。在一些方面，期望的剂量等于或大于最小细胞数量或最小细胞数量/单位体重。在一些方面，在以期望的剂量给予的总细胞中，个体群体或亚型以期望的输出比(如CD4+与CD8+的比)或接近期望的输出比，例如在这种比的某些容忍差异或误差内存在。
在一些实施方式中，以细胞的个体群体或亚型中的一种或多种的期望剂量(如CD4+细胞的期望剂量和/或CD8+细胞的期望剂量)的容忍差异或在其容忍差异内给予细胞。在一些方面，期望的剂量是亚型或群体的期望的细胞数量，或这种细胞的期望数量/要给予细胞的对象的单位体重，例如，细胞/kg。在一些方面，期望的剂量等于或大于群体或亚型的最小细胞数量，或群体或亚型的最小细胞数量/单位体重。因此，在一些实施方式中，剂量基于总细胞的期望的固定剂量和期望的比，和/或基于个体亚型或亚群中的一种或多种(例如，每种)的期望的固定剂量。因此，在一些实施方式中，剂量基于T细胞的期望的固定或最小剂量和CD4+与CD8+细胞的期望比，和/或基于CD4+和/或CD8+细胞的期望的固定或最小剂量。
在某些实施方式中，细胞或细胞亚型的个体群体以约1百万至约1,000亿个细胞的范围，如例如1百万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞、约2,500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞、或前述值中的任两个值限定的范围)、如约1,000万至约1,000亿个细胞(例如，约2,000万个细胞、约3,000万细胞、约4,000万个细胞、约6,000万个细胞、约7,000万个细胞、约8,000万个细胞、约9,000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞、或前述值中的任两个值限定的范围)、和在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)、或这些范围中的任意值给予对象。
在一些实施方式中，总细胞的剂量和/或细胞的个体亚群的剂量在等于或约1x105个细胞/千克至约1x1011个细胞/千克(kg)，104至等于或约1011个细胞/千克(kg)体重的范围内，如105个至106个细胞/kg体重，例如，等于或约1x105个细胞/kg体重、1.5x105个细胞/kg体重、2x105个细胞/kg体重、或1x106个细胞/kg体重。例如，在一些实施方式中，以等于或约104个至等于或约109个T细胞/千克(kg)体重(如105个至106个T细胞/kg体重，例如，等于或约1x105个T细胞/kg体重、1.5x105个T细胞/kg体重、2x105个T细胞/kg体重、或1x106个T细胞/kg体重)的某些误差范围或在该范围内给予细胞。在其它示例性实施方式中，用于本公开的方法的修饰的细胞的合适的剂量范围包括但不限于约1x105个细胞/kg至约1x106个细胞/kg、约1x106个细胞/kg至约1x107个细胞/kg、约1x107个细胞/kg至约1x108个细胞/kg、约1x108个细胞/kg至约1x109个细胞/kg、约1x109个细胞/kg至约1x1010个细胞/kg、约1x1010个细胞/kg至约1x1011个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开的方法的合适的剂量为约1x108个细胞/kg。在示例性实施方式中，用于本公开的方法的合适的剂量为约1x107个细胞/kg。在其它实施方式中，合适的剂量为约1x107个总细胞至约5x107个总细胞。在一些实施方式中，合适的剂量为约1x108个总细胞至约5x108个总细胞。在一些实施方式中，合适的剂量是约1.4x107个总细胞至约1.1x109个总细胞。在示例性实施方式中，用于本公开的方法的合适的剂量为约7x109个总细胞。
在一些实施方式中，以在或约104个至在或约109个CD4+和/或CD8+细胞/千克(kg)体重，如105至106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重，例如，在或约1x105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、1.5x105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、2x105个CD4+和/或CD8+细胞/kg或1x106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重的某些误差范围或误差范围内给予细胞。在一些实施方式中，以在大于和/或小于约1x106个、约2.5x106个、约5x106个、约7.5x106个或约9x106个CD4+细胞和/或至少约1x106个、约2.5x106个、约5x106个、约7.5x106个或约9x106个CD8+细胞、和/或至少约1x106个、约2.5x106个、约5x106个、约7.5x106个、或约9x106个T细胞的某些误差范围或误差范围内给予细胞。在一些实施方式中，以在约108个至1012个或约1010个至约1011个T细胞、约108个至1012个或约1010个至1011个CD4+细胞和/或约108个至1012个或约1010个至1011个CD8+细胞的某些误差范围或误差范围内给予细胞。
在一些实施方式中，以多细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的期望输出比率的容忍范围或在容忍范围内给予细胞。在一些方面，期望的比率可以是特定比率或者可以是比率的范围，例如，在一些实施方式中，期望的比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)为等于或约5:1至等于或约5:1(或大于约1:5至小于约5:1)、或等于或约1:3至等于或约3:1(或大于约1:3至小于约3:1)，如等于或约2:1至等于或约1:5(或大于约1:5至小于约2:1，如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，容许差异在约1％、约2％、约3％、约4％约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％的期望比率的范围内，包括这些范围之间的任何值。
在一些实施方式中，以单剂量或多剂量将一定剂量的修饰的细胞给予需要其的对象。在一些实施方式中，以多剂量(例如，每1周或每7天一次、每2周或每14天一次、每3周或每21天一次、每4周或每28天一次)给予一定剂量的修饰的细胞。在示例性实施方式中，将单剂量的修饰的细胞给予需要其的对象。在示例性实施方式中，通过快速静脉内输注将单剂量的修饰的细胞给予需要其的对象。
为了预防或治疗疾病，合适的剂量可能取决于要治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重性和病程、是否出于预防或治疗目的而给予细胞、先前治疗、对象的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的判断力。在一些实施方式中，将组合物和细胞一次或通过一系列治疗适当地给予对象。
在一些实施方式中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗干预(如抗体或工程化细胞或受体或试剂，如细胞毒性或治疗剂)同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方式中，将细胞与一种或多种另外的治疗剂共同给予，或与另一种治疗干预同时或以任何顺序共同给予。在一些情况下，将细胞与时间足够接近的另一种疗法共同给予，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，在一种或多种另外的治疗剂之前给予细胞。在一些实施方式中，在一种或多种另外的治疗剂之后给予细胞。在一些实施方式中，一种或多种另外的试剂包括细胞因子，如，例如IL-2，例如，以增强持久性。在一些实施方式中，方法包括给予化学治疗剂。
在某些实施方式中，本发明的修饰的细胞(例如，包含TCR和/或CAR的修饰的细胞)可以与免疫检查点抗体(例如，抗PD1、抗CTLA-4或抗PDL1抗体)组合给予对象。例如，修饰的细胞可以与靶向例如PD-1(程序性死亡1蛋白)的抗体或其抗体片段组合给予。抗PD-1抗体的实例包括但不限于帕博利珠单抗(pembrolizumab)(
Figure BDA0002798262570000731
以前为lambrolizumab，也称为MK-3475)和纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、
Figure BDA0002798262570000732
)或其抗原结合片段。在某些实施方式中，修饰的细胞可以与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段组合给予。抗PD-L1抗体的实例包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A(
Figure BDA0002798262570000733
阿特珠单抗(Atezolizumab))和MEDI4736(德瓦鲁单抗(Durvalumab)，Imfinzi)。在某些实施方式中，修饰的细胞可以与抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段组合给予。抗CTLA-4抗体的实例包括但不限于伊匹单抗(Ipilimumab)(商品名Yervoy)。也可以使用其它类型的免疫检查点调节子，包括但不限于小分子、siRNA、miRNA和CRISPR系统。免疫检查点调节子可以在包含CAR的修饰的细胞之前、之后或同时给予。在某些实施方式中，包含免疫检查点调节子的联合治疗可以增强包含本发明的修饰的细胞的疗法的治疗功效。
在给予细胞后，在一些实施方式中，例如通过多种已知方法中的任一种来测量工程化细胞群的生物活性。评估的参数包括在体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELISA或流式细胞术)将工程化或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原特异性结合。在某些实施方式中，工程化细胞破坏目标细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法(如，例如Kochenderfer等人，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等人，J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法)来测量。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结果(如肿瘤负载或负荷的降低)来测量生物学活性。
在某些实施方式中，向对象提供二级治疗(secondary treatment)。
在一些实施方式中，可以在CAR T细胞疗法之前向对象给予调理疗法(conditioning therapy)。在一些实施方式中，调理疗法包括向对象给予有效量的环磷酰胺。在一些实施方式中，调理疗法包括向对象给予有效量的氟达拉滨。在优选的实施方式中，调理疗法包括向对象给予有效量的环磷酰胺和氟达拉滨的组合。在CAR T细胞疗法之前给予调理疗法可以提高CAR T细胞疗法的功效。调理患者T细胞疗法的方法描述于以其整体通过引用并入本文的美国专利号9,855,298中。
在某些实施方式中，向对象提供二级治疗。二级治疗包括但不限于化疗、放疗、手术和药物治疗。
在一些实施方式中，本公开的具体剂量方案包括在给予修饰的T细胞之前的淋巴去除步骤(lymphodepletion step)。在示例性实施方式中，淋巴去除步骤包括给予环磷酰胺和/或氟达拉滨。
在一些实施方式中，淋巴去除步骤包括以约200mg/m2/天至约2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的剂量给予环磷酰胺。在示例性实施方式中，环磷酰胺的剂量为约300mg/m2/天。在一些实施方式中，淋巴清除步骤包括以约20mg/m2/天至约900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的剂量给予氟达拉滨。在示例性实施方式中，氟达拉滨的剂量为约30mg/m2/天。
在一些实施方式中，淋巴清除步骤包括以约200mg/m2/天至约2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的剂量给予环磷酰胺，和以约20mg/m2/天至约900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的剂量给予氟达拉滨。在示例性实施方式中，淋巴清除步骤包括以约300mg/m2/天的剂量给予环磷酰胺和以约30mg/m2/天的剂量给予氟达拉滨。
在示例性实施方式中，环磷酰胺的剂量在3天内为约300mg/m2/天，并且氟达拉滨的剂量在3天内为30mg/m2/天。
相对于第0天输注T细胞(例如，CAR-T、TCR-T、修饰的T细胞等)，可以在-6至-4天(有-1天的空窗期，即，在-7至-5给药)进行淋巴清除化疗的给药。在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象在给予修饰的T细胞之前3天，通过静脉输注接受包括300mg/m2的环磷酰胺的淋巴清除化疗。在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象在给予修饰的T细胞之前3天，通过静脉输注接受包括300mg/m2的环磷酰胺的淋巴清除化疗。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，对象接受包括约20mg/m2/天至约900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的剂量的氟达拉滨的淋巴清除化疗。在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象接受包括30mg/m2的剂量的氟达拉滨的淋巴清除化疗3天。
在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象接受包括约200mg/m2/天至约2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的剂量的环磷酰胺和约20mg/m2/天至约900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天或60mg/m2/天)的剂量的氟达拉滨的淋巴清除化疗。在示例性实施方式中，对于患有癌症的对象，该对象接受包括约300mg/m2/天的剂量的环磷酰胺和30mg/m2的剂量的氟达拉滨的淋巴清除化疗3天。
本发明的细胞可以以适当的临床前和临床实验和试验中确定的剂量和途径以及次数给予。细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次给予。如本领域技术人员所确定，本发明的细胞的给予可以与可用于治疗期望疾病或状况的其它方法组合。
本领域已知，输注CAR T细胞后的不良反应之一是免疫活化的开始，称为细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是导致炎症细胞因子升高的免疫活化。CRS是已知的靶向毒性，其发展可能与功效相关。临床和实验室措施从轻度CRS(体质体征(constitutional symptoms)和/或2级器官毒性)到重度CRS(sCRS；≥3级器官毒性、积极的临床干预和/或可能威胁生命)。临床特征包括：高烧、不适、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能不全、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CAR T细胞输注后已显示包括干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10和IL-6的细胞因子的急剧升高。CRS的一种特征是细胞因子的升高，包括IL-6(严重升高)、IFN-γ、TNF-α(中等)、和IL-2(轻度)。还已观察到包括铁蛋白和C反应蛋白(CRP)的临床可用炎症标记物的升高与CRS相关。CRS的存在通常与过继性转移细胞的扩增和进行性免疫活化有关。已证明，由于高肿瘤负担的患者经历更严重的CRS，因此CRS严重程度由输注时的疾病负担决定。
因此，本发明提供了在CRS诊断之后适当的CRS管理策略，以减轻不受控炎症的生理症状，而不减弱工程化细胞(例如，CAR T细胞)的抗肿瘤功效。CRS管理策略是本领域已知的。例如，可以给予全身性皮质类固醇以快速逆转sCRS(例如，3级CRS)的症状，而不损坏最初的抗肿瘤反应。
在一些实施方式中，可以给予抗IL-6R抗体。抗IL-6R抗体的一个实例是食品和药物管理局批准的单克隆抗体托珠抗体(tocilizumab)，也称为atlizumab(以Actemra或RoActemra销售)。托珠抗体是针对白细胞介素-6受体(IL-6R)的人源化单克隆抗体。托珠抗体的给药已证明CRS的近期逆转。
总体上基于所观察的综合征的严重程度来管理CRS，并据此调整(tailored)干预。CRS管理决策可能基于临床症状和体征以及对干预的反应，而不仅仅单独基于实验室值。
轻至中度的病例总体上通过液体疗法、非甾体类抗炎药(NSAID)和抗组胺药的症状管理来治疗，以充分缓解症状。更严重的病例包括患有任何程度的血液动力学不稳定；患有任何血液动力学不稳定的患者，托珠抗体的给药是推荐的。在一些实施方式中，CRS的一线管理可以是托珠单抗，在60分钟内以8mg/kg IV的标记剂量(不超过800mg/剂量)；托珠单抗可以重复Q8小时。如果对第一剂量的托珠单抗反应欠佳，可以考虑另外剂量的托珠单抗。托珠单抗可以单独或与皮质类固醇疗法组合给予。患有持续或进行性CRS症状、12-18小时内临床改善不足或对托珠单抗反应不良的患者可以用大剂量皮质类固醇疗法(总体上为100mg IV氢化可的松或1-2mg/kg甲基强的松龙)治疗。在患有更严重的血液动力学不稳定或更严重的呼吸道症状的患者中，可以在CRS的早期向患者给予大剂量皮质类固醇疗法。CRS管理指南可能基于发表的标准(Lee等人，(2019)Biol Blood Marrow Transplant,doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758；Neelapu等人，(2018)Nat Rev Clin Oncology,15:47；Teachey等人，(2016)Cancer Discov,6(6):664-679)。
在用CAR-T疗法治疗的患者中已观察到与巨噬细胞活化综合征(MAS)或嗜血细胞淋巴组织细胞增生症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis)(HLH)一致的特征(Henter，2007)，与CRS的临床表现一致。MAS似乎是对CRS发生的免疫活化的反应，并且因此应被视为CRS的表现。MAS类似于HLH(也是对免疫刺激的反应)。MAS的临床综合征的特征在于高级不发热、影响三个谱系中的至少两个的血细胞减少症和肝脾肿大。其与高血清铁蛋白、可溶性白细胞介素-2受体和甘油三酸酯以及循环天然杀伤(NK)活性降低有关。
包含本发明的外源TCR和/或CAR的修饰的免疫细胞可以用于本文所述的治疗方法中。在一些实施方式中，修饰的免疫细胞在能够下调内源基因的基因表达的基因座中包含插入和/或缺失。在一些实施方式中，内源基因是当被下调时增强包含外源TCR和/或CAR的免疫细胞的功能的基因。例如但不限于，内源基因是当被下调时增强肿瘤浸润、肿瘤杀伤和/或对包含外源TCR和/或CAR的免疫细胞的免疫抑制具有抗性的基因。
在一些实施方式中，基因座中的插入和/或缺失能够下调选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个基因的表达。在一些实施方式中，基因座中的插入和/或缺失能够下调选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个基因的表达。在一些实施方式中，基因座中的插入和/或缺失能够下调选自KLF4、PAGR1和SIX2的一个或多个基因的表达。在一些实施方式中，基因座中的插入和/或缺失能够下调PAGR1的表达。在一些实施方式中，基因座中的插入和/或缺失能够下调PAGR1相关基因(例如，ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3或TNFAIP3)的表达。
这样，当在本文所述的治疗方法中使用时，包含本发明的外源TCR和/或CAR的修饰的免疫细胞增强了修饰的免疫细胞执行其功能的能力。因此，本发明提供了用于增强在本文所述的治疗方法中使用的修饰的免疫细胞的功能的方法。
J.药物组合物和制剂
还提供了本发明的免疫细胞群、含有这种细胞和/或富集这种细胞的组合物，如其中表达重组受体的细胞占组合物中总细胞或某些类型的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在这些组合物中为药物组合物和制剂，以用于给药，如用于过继性细胞疗法。还提供了用于将细胞和组合物给予对象(例如，患者)的治疗方法。
还提供了包括用于给药的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，如包括以给定剂量或其分数给予的细胞数的单位剂型组合物。药物组合物和制剂总体上包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物包括至少一种另外的治疗剂。
术语“药物制剂”指代这样的制剂：其形式为允许所含活性成分的生物学活性有效，并且不含有对将给予制剂的对象具有不可接受的毒性的另外组分。“药学上可接受的载体”指代药物制剂中除活性成分以外对对象无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些方面，载体的选择部分地由特定细胞和/或通过给予方法来确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂的可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体例如由Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)描述。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下总体上对受体无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，如钠；金属复合物(例如Zn蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，缓冲剂包括在组合物中。合适的缓冲剂包括例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
制剂可以包括水溶液。制剂或组合物还可以含有多于一种的活性成分，所述活性成分可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或状况，优选具有与细胞互补的活性的那些活性成分，其中各自的活性不互相不利地影响。这种活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其它药学上活性剂或药物，如化疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱和/或长春新碱。在一些实施方式中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或状况的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估所治疗的对象来监测治疗或预防功效。可以通过单次推注细胞、多次推注细胞或持续输注细胞来递送期望的剂量。
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂给药的那些制剂。在一些实施方式中，肠胃外给予细胞群。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给药。在一些实施方式中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送将细胞给予对象。在一些实施方式中，组合物作为可以在一些方面缓冲至选择的pH的无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散液或粘性组合物)提供。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在一些程度上更方便给予，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物，以提供与特定组织较长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，该溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
可以通过将细胞掺入溶剂中，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物来制备无菌注射溶液。根据给药途径和期望的制剂，组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、调味剂和/或着色剂。在一些方面，可以参考标准文本以制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。
用于体内给药的制剂总体上是无菌的。无菌可以容易地实现，例如，通过无菌过滤膜过滤。
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K.核酸和免疫细胞文库
本发明提供了用于本文其它部分所述的筛选方法的核酸文库。核酸文库包括一种或多种核酸。在一些实施方式中，文库包含各自包含编码独特靶向序列的第一核酸的一种或多种核酸。独特靶向序列可以是能够靶向内源基因座的任何区域的任何序列。在一个实施方式中，独特靶向序列能够靶向内源基因座并在该内源基因座的目标序列中产生插入和/或缺失。在一个实施方式中，本发明的核酸文库包含一个或多个核酸，其中一个或多个核酸中的每一个包含编码独特靶向序列的第一核酸。在一些实施方式中，本发明的核酸文库包含一个或多个核酸，其中一个或多个核酸中的每一个包含编码独特靶向序列的第一核酸，并且该文库包含编码靶向人基因组的每个基因(例如，开放阅读框)的独特靶向序列的至少一个核酸。
人基因组中估计有19,000-20,000个基因。这样，在一些实施方式中，本发明的核酸文库包含至少19,000-20,000个核酸，每个包含编码靶向人基因组的19,000-20,000个基因中的每一个的独特靶向序列的第一核酸。例如，本发明的核酸文库包含超过100个核酸，每个包含编码靶向人基因组的至少100个独特基因(例如，开放阅读框)的独特靶向序列的第一核酸。例如，本发明的核酸文库包含超过200个，例如，超过300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000个核酸，每个包含编码靶向人基因组的至少200个，例如300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000个独特基因的独特靶向序列的第一核酸。
在又一实施方式中，本发明的核酸文库包含一个或多个核酸，该核酸包含编码靶向人基因组的19,000–20,000个基因中的每一个的一个或多个部分的独特靶向序列的第一核酸。在这种实施方式中，本发明的核酸文库被认为具有人基因组的一倍或多倍覆盖率。例如，人基因组中的每个基因可以被靶向一次或多次，例如，2次或更多次、3次或更多次、4次或更多次、5次或更多次、10次或更多次、15次或更多次、20次或更多次，并且本发明的核酸文库包含人基因组的至少2倍覆盖率，例如，至少3倍覆盖率、至少4倍覆盖率、至少5倍覆盖率、至少10倍覆盖率、至少15倍覆盖率、至少20倍覆盖率。例如，在一个实施方式中，包含人基因组的至少3倍覆盖率的本发明的核酸文库包含超过600个，例如，超过900、1200、1500、3000、4500、6000、9000、12,000、15,000、18,000、21,000、24,000、27,000、30,000、33,000、36,000、39,000、42,000、45,000、48,000、51,000、54,000、57,000、60,000个核酸，每个包含编码靶向人基因组至少3次的至少200个，例如，300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000个独特基因的独特靶向序列的第一核酸。在这种实施方式中，靶向相同基因的靶向序列靶向相同基因的独特区域。在另一实例中，在一个实施方式中，包含人基因组的至少6倍覆盖率的本发明的核酸文库包含超过1200个，例如，超过1800、2400、3000、6000、9000、12,000、18,000、24,000、30,000、36,000、42,000、48,000、54,000、60,000、66,000、72,000、78,000、84,000、90,000、96,000、102,000、108,000、114,000、120,000个核酸，每个包含编码靶向人基因组至少6次的至少200个，例如，300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000个独特基因的独特靶向序列的第一核酸。在这种实例中，至少六个独特靶向序列靶向相同基因(例如，开放阅读框)的至少六个独特区域。技术人员将能够容易地确定在目的筛选中使用的适当覆盖水平和适当的文库大小(例如，独特目标的数量)。
本主题核酸文库的第一核酸可以进一步包含与独特靶向序列可操作连接的启动子序列。例如，本主题核酸文库的第一核酸可以进一步包含与独特靶向序列可操作连接的U6启动子序列。U6启动子募集RNA聚合酶III，其除了转录小RNA外，也可用于驱动独特靶向序列的转录。适于驱动小RNA转录的任何启动子序列可以可操作地连接至主题核酸文库的第一核酸的独特靶向序列。这种启动子的另一实例是H1启动子。因此，在一个实施方式中，本发明的核酸文库包含一个或多个核酸，每个包含第一核酸，该第一核酸包含与编码独特靶向序列的核酸序列可操作地连接的U6启动子。适于驱动独特靶向序列转录的多种启动子是本领域已知的。技术人员将能够容易地确定使用哪个启动子来满足目的筛选的需要。
在一些实施方式中，本发明的主题核酸文库包含一个或多个核酸，每个包含编码独特靶向序列(例如，独特引导RNA)的第一核酸。独特引导RNA包含与内源基因的目标区域充分互补的序列。在一个实施方式中，包含人基因组的至少6倍覆盖率的本发明的核酸文库包含超过1200个，例如，超过1800、2400、3000、6000、9000、12,000、18,000、24,000、30,000、36,000、42,000、48,000、54,000、60,000、66,000、72,000、78,000、84,000、90,000、96,000、102,000、108,000、114,000、120,000个核酸，每个包含第一核酸，该第一核酸编码靶向(例如，足够互补)人基因组至少6次的至少200个，例如，300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000个独特基因的独特目标区域的独特引导RNA。
在一些实施方式中，文库包含编码外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸。在一些实施方式中，由第二核酸编码的外源TCR和/或CAR对目标抗原(例如，已知目标抗原)具有亲和力。在一些实施方式中，由第二核酸编码的外源TCR和/或CAR对例如，NY-ESO-1或PSCA具有亲和力。
在一些实施方式中，主题核酸文库的第二核酸可以进一步包含与编码外源TCR和/或CAR的核酸可操作连接的延伸因子-1-α启动子(EF-1α启动子)。使用EF-1α启动子可以增加下游转基因(例如，编码核酸序列的TCR和/或CAR)的表达效率。适于驱动下游转基因(例如，TCR和/或CAR)表达的任何启动子序列可以可操作地连接至编码外源TCR和/或CAR的核酸。在一个实施方式中，本发明的核酸文库包含第二核酸，其包含与编码外源TCR和/或CAR的核酸序列可操作地连接的EF-1α启动子。适于驱动下游转基因表达的多种启动子是本领域已知的。技术人员将能够容易地确定使用哪个启动子来满足目的筛选的需要。
在一些实施方式中，主题核酸文库的第一和第二核酸各自位于单独的核酸上。在这种实施方式中，可以将选择标记物(例如，可检测的标记或抗性基因)掺入第一和/或第二核酸中。在第一核酸和第二核酸各自位于单独的核酸上的实施方式中，当将文库引入细胞群中时，选择性标记物可以用于确定哪些细胞包含第一和第二核酸。在一些实施方式中，第一和第二核酸位于相同核酸上。可以将选择性标记物掺入包含第一和第二核酸的这种核酸中。在一个实施方式中，选择性标记物是报道基因，例如，包含编码报道蛋白(例如，荧光蛋白)的核酸序列。这种选择性标记物可用于确定哪些细胞已成功地用主题核酸文库的核酸转化或转导。
在示例性实施方式中，主题核酸文库的第一和第二核酸位于相同核酸上。例如，参见图1。在一个实施方式中，主题核酸文库包含一个或多个核酸，其中每个核酸包含编码独特靶向序列的第一核酸，和包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的第二核酸。在一个实施方式中，主题核酸文库包含一个或多个核酸，其中每个核酸包含第一核酸和EF-1α启动子序列，该第一核酸包含与编码独特靶向序列的核酸序列可操作连接的U6启动子序列，该EF-1α启动子序列与编码外源TCR和/或CAR的核酸序列可操作连接。
在本主题核酸文库中采用病毒载体的那些实施方式中，核酸文库的成员以容纳病毒基因组核酸的病毒颗粒的形式存在，其中文库的给定颗粒成员的病毒基因组核酸包括载体结构域和主题核酸(例如，包含编码独特靶向序列的第一核酸和包含编码外源TCR和/或CAR的核酸序列的第二核酸的核酸)。这种文库可以被称为包装的病毒核酸文库。在某些实施方式中特别感兴趣的是使用采用病毒载体结构域的包装的病毒核酸文库，该病毒载体结构域使核酸文库的单个成员进入给定目标细胞(例如，目标免疫细胞)中。
在本发明的包装的病毒核酸文库中，不同文库成员的病毒基因组核酸将共享相同的载体结构域。因此，核酸文库成员将共享共同的载体序列，使得文库中包封的病毒基因组核酸的序列对于主题核酸文库的不同成员将是基本上(即使不是完全)相同。载体结构域的序列可以根据载体的本质而有大的变化。在一些情况下，载体结构域包括在包装细胞中产生重组病毒构建体、在目标细胞(例如，免疫细胞)中转导和复制核酸文库的成员和表达核酸文库的成员(例如，表达引导RNA和TCR和/或CAR)、报道基因或其它效应子和基因必需的序列。可以使用任何合适的基因工程技术(包括但不限于PCR的标准技术、寡核苷酸合成、限制性核酸内切酶消化、位点特异性消化、位点特异性重组、连接、转化、质粒纯化和DNA测序)来完成载体结构域以及包括载体结构域的主题核酸文库的产生。
在一些情况下，载体结构域选自病毒的病毒基因组，所述病毒选自腺病毒、腺病毒相关病毒、牛痘、疱疹病毒、泡沫病毒等病毒，其中这种病毒通常用于基因转移应用。在一些情况下，载体结构域是逆转录病毒载体区域，使得其是源自逆转录病毒的结构域。逆转录病毒是属于逆转录病毒科的任何病毒，包括特征在于两个独特特征的单链RNA动物病毒。首先，逆转录病毒的基因组是二倍体，由两个拷贝的RNA组成。第二，此RNA被病毒体相关的酶逆转录酶转录成双链DNA。然后，此双链DNA或原病毒可能能够整合到宿主基因组(例如，目标免疫细胞的基因组)中。因此，在一些方面，主题核酸文库的每个成员被配置为整合到目标免疫细胞的基因组中。整合可以是非特异性的或对特定染色体位置特异的。在某些方面，设计病毒载体以使用位点特异性重组(例如，使用Cre-Lox或其它重组系统)、锌指核酸内切酶、CRISPR核酸内切酶在特定染色体位点整合，在该特定位点处，载体源自的病毒天然地整合等。
在某些方面，主题核酸文库的成员是非整合载体，例如，其中主题核酸文库的每个成员基于非整合慢病毒、腺病毒或腺病毒相关病毒载体。
根据某些实施方式，逆转录病毒载体区域是腺病毒相关病毒载体区域，例如，源自腺病毒相关病毒(AAV)的载体。可以使用具有任何目的血清型的任何合适的AAV系载体，包括描述于例如，McCarty(2008)Mol.Therapy 16:1648-1656；Nonnenmacher(2012)GeneTherapy 19:649-658；和Jayandharan等人(2008)Gene Therapy 15:1287-1293中的AAV系载体。
在一些实施方式中，逆转录病毒载体区域是慢病毒载体区域，例如，源自慢病毒的载体。慢病毒是逆转录病毒家族的成员。慢病毒载体可以用VSV-G假型化，并且已源自人免疫缺陷病毒(HIV)、人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；visan-maedi，其在绵羊中引起脑炎(visna)或肺炎；山羊关节炎-脑炎病毒，其在山羊中引起免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒(EIAV)，其在马中引起自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起淋巴结病和淋巴细胞增多；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其在非人灵长类动物中引起免疫缺陷和脑病。基于HIV的载体可以保留<5％的亲本基因组，而且可以将<25％的基因组掺入包装构建体中，这最小化产生回复复制能力HIV的可能性。载体区域可以包括来自慢病毒的5′和3′LTR的序列。在一些情况下，载体结构域包括来自慢病毒的5′LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的灭活或自灭活的3′LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。在期望的情况下，主题病毒核酸文库可以由自灭活的载体组成，该载体在下游长末端重复序列中含有调控元件的缺失，从而消除载体运动所需的包装信号的转录。这样，载体区域可以包括灭活或自灭活的3′LTR。3′LTR可以通过任何方便的方法使自身灭活。例如，3′LTR的U3元件可以含有其增强子序列的缺失，如TATA盒、Sp1和NF-κB位点。由于自灭活的3′LTR，整合到宿主细胞基因组中的原病毒将包含灭活的5′LTR。任选地，可以用病毒构建体中的启动子序列替换来自慢病毒5′LTR的U3序列。这可能增加从包装细胞系回收的病毒的效价。也可以包括增强子序列。
主题病毒核酸文库的病毒基因组核酸可以含有另外的元件，其中这些元件可以有大的变化。例如，可以将报道基因与内部启动子(如荧光标记蛋白的基因)建立功能性关系。另外的基因元件可以与独立的启动子/增强子可操作地连接并由其控制。
在一些实施方式中，主题病毒核酸文库的每个成员可以包括例如，在以下以及在2012年5月8日提交的共同未决美国临时专利申请号61/644,324(其公开内容通过引用并入本文)中更详细地描述的效应子盒。术语“效应子”用于指代可以影响另一分子(一种或多种)(如目标基因或目标基因的产物)的转录、翻译、表达、加工或功能的生化分子。效应子可以是全长蛋白质、蛋白质结构域、肽、单链或双链脱氧或核糖寡核苷酸、siRNA、微RNA、CRISPR RNA、核酶、反义RNA、包括小RNA和非编码RNA的调控RNA、其模拟物或类似物。目的效应子盒包括至少效应子序列，其中效应子序列可以可操作地连接至启动子，例如，用于在包括效应子构建体的细胞中表达效应子序列。任选地，效应子盒可以包括效应子特异性条形码，例如，以促进效应子序列的识别。
可以使用任何方便的方案来产生在本主题方法的实施方式中采用的文库。例如，主题核酸文库可以通过多种不同的方案合成或酶促产生，并且合适的寡核苷酸和多核苷酸载体可以使用例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)中描述的标准重组DNA技术，以及例如，HHS的United States Dept.、美国国立卫生研究院(NIH)的重组DNA研究指南中所述的法规来纯化。
在一些实施方式中，制备主题核酸文库包括在足以产生转染质粒的条件下将核酸文库的每个成员与包含载体结构域或载体序列的载体构建体组合，该转染质粒在转染包装细胞后导致产生含有主题核酸文库的病毒颗粒，其是病毒衣壳蛋白包装的基因组核酸的部分。为制备用于转染的产物转染质粒，可以将主题核酸文库的每个成员插入载体核酸中，其中可以采用任何合适的方案。合适的方案的实例包括但不限于：DNA连接酶介导的连接、重组酶介导的连接、使用
Figure BDA0002798262570000831
PCR方案(Clontech Laboratories,Mountain View,Calif.)、
Figure BDA0002798262570000832
克隆技术(Life Technologies,Carlsbad,Calif.)等。
然后可以将所得产物转染质粒用于转染合适的包装细胞系，以产生主题核酸文库病毒颗粒。包装细胞系提供反式包装病毒基因组RNA到病毒颗粒所需的病毒蛋白。包装细胞系可以是能够表达逆转录病毒蛋白的任何细胞系，包括HEK293、HeLa、D17、MDCK、BHK、NIH3T3、CHO、CrFK和Cf2Th。在一些实施方式中，主题病毒核酸文库的每个成员与病毒报道构建体一起使用，该病毒报道构建体可以在组成型或条件(可调节)启动子的控制下包含一个或多个报道基因。包装细胞系可以稳定表达必需的病毒蛋白。这种包装细胞系描述于例如，美国专利号6,218,181中。可选地，可以用包含编码必需病毒蛋白的核酸的质粒瞬时转染包装细胞系。在另一实施方式中，将不稳定表达必需病毒蛋白的包装细胞系与两个或更多个质粒共转染。质粒中的一个包含病毒构建体，其是主题核酸文库的成员。其它质粒(一种或多种)包含核酸，该核酸编码使细胞产生能够感染期望宿主细胞的功能性病毒所需的蛋白质。包装细胞系可能不表达包膜基因产物。在这种情况下，包装细胞系将病毒基因组包装成缺乏包膜蛋白的颗粒。由于包膜蛋白部分负责病毒颗粒的宿主范围，因此病毒优选是假型的。“假型”逆转录病毒是具有包膜蛋白的逆转录病毒颗粒，该包膜蛋白来自不同于RNA基因组来源的病毒的病毒。包膜蛋白可以来自不同的逆转录病毒或非逆转录病毒。一种包膜蛋白是水泡性口炎病毒G(VSV-G)蛋白。因此，包装细胞系可以用包含编码膜相关蛋白(如VSV-G)的序列的质粒转染，该膜相关蛋白将允许病毒进入目标细胞中。本领域技术人员可以为所使用的目标细胞选择特定的和/或更有效的合适的假型。除了赋予特定的宿主范围外，所选假型可以使病毒浓缩至非常高的滴度。可选地，可以使用将感染局限于特定物种的亲膜包膜蛋白(ecotropic envelope proteins)进行假型化。
本发明还提供了包含主题核酸文库的多个免疫细胞。在一个实施方式中，多个免疫细胞中的每一个包含主题核酸文库的成员，例如，包含核酸的主题核酸文库的单个成员，该核酸包含编码单个独特靶向序列的第一核酸和编码TCR和/或CAR的第二核酸。在转导条件下使多个免疫细胞与主题核酸文库接触。
用主题病毒核酸文库转导多个免疫细胞中的一个或多个目标细胞可以通过任何方便的方案来完成，并且可以至少部分取决于所采用的目标细胞类型和病毒载体。例如，转导可以包括解冻冷冻的主题病毒核酸文库、将细胞样品悬浮在可补充有血清(例如，10％FBS)和/或增强转导的试剂(例如，己二溴甲烷
Figure BDA0002798262570000841
)的细胞培养基(例如，D-MEM)中、将文库和细胞悬浮液组合在细胞培养板中、并将平板在37℃下于CO2培养箱中放置合适的时间段。在某些方面，将细胞培育1至24小时，如4至16小时，例如，8至12小时。
可以优化转导条件以实现将主题核酸文库的单个成员递送和表达到给定目标细胞中。例如，在某些方面，通过采用足够复杂的包装的病毒核酸文库并在合适的感染复数(MOI)下进行转导步骤来实现用主题病毒核酸文库的单个成员转导任何给定的目标细胞，该感染复数是感染剂(例如，病毒颗粒)与目标细胞(例如，目标免疫细胞)的比率。在一些实施方式中，以1或更小、0.9或更小、0.8或更小、0.7或更小、0.6或更小、0.5或更小、0.4或更小、0.3或更小、0.2或更小或0.1或更小的MOI来进行转导。特别令人感兴趣的是转导条件，其导致含有主题病毒核酸文库的一个单个成员的多个免疫细胞中的每一个。在这种实施方式中，每个免疫细胞包含核酸，该核酸包含编码单个独特靶向序列(例如，单个独特引导RNA)的第一核酸和编码TCR和/或CAR的第二核酸。
在一些实施方式中，使包含主题核酸文库的多个免疫细胞中的每一个与编辑剂接触。如本文所用，“编辑剂”指代基于主题核酸文库包含的独特靶向序列在内源基因座中引入插入和/或缺失的任何试剂。在一个实施方式中，编辑剂是CRISPR核酸酶多肽、或编码CRISPR核酸酶的核酸。在其中主题核酸文库的第一和第二核酸位于相同核酸上的实施方式中，编辑剂可以是CRISPR核酸酶、或编码CRISPR核酸酶的核酸。在其中主题核酸文库的第一和第二核酸位于单独核酸上的实施方式中，编辑剂可以是CRISPR相关系统。在这种实施方式中，CRISPR相关系统包含主题核酸文库的第一核酸，例如，CRISPR相关系统包含独特的靶向序列。在多个免疫细胞中的每一个包含主题核酸文库的成员并且已与编辑剂接触的情况下，多个免疫细胞中的每一个包含在内源基因座(由独特靶向序列所指示)中的插入和/或缺失以及外源TCR和/或CAR。这种多个基因编辑的修饰的免疫细胞在本文中可以称为基因修饰的TCR/CAR免疫细胞(例如，T细胞)文库。
在一些实施方式中，无论筛选方法是在体外还是在体内进行(如本文其它部分所述)，细胞均源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自宿主生物体来源，例如但不限于小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
L.筛选方法
本发明提供了用于鉴定调控免疫细胞功能的基因(例如，在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强的基因)的方法(例如，筛选基因的方法)。例如，这种基因可以是但不限于通常用于抑制免疫细胞功能的基因、或者可以是通常用于增强免疫细胞功能的抑制子的基因、或者可以是通常用于抑制免疫细胞功能的增强子的基因。本发明还提供了用于鉴定调控免疫细胞记忆和持久性(例如，T细胞记忆和T细胞持久性)的基因的方法。在一个实施方式中，本发明提供了用于鉴定在下调时增强免疫细胞记忆和/或增强免疫细胞持久性的基因的方法。在一个实施方式中，本发明提供了用于鉴定在下调时增强T细胞记忆和/或增强T细胞持久性的基因的方法。
在一些实施方式中，本发明提供了用于鉴定调控免疫细胞功能的基因(例如，在下调时导致包含外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞或其前体细胞的功能增强)的方法。本文中其它部分所述的内源基因中的任一种在下调时可能导致包含外源TCR和/或CAR的免疫细胞的功能增强。鉴定方法包括将如本文其它部分所述的主题核酸文库引入多个免疫细胞(例如，T细胞群)中。在一些实施方案中，多个免疫细胞是经修饰以表达对抗原具有亲和力的外源TCR和/或CAR的多个T细胞。在一些实施方案中，多个修饰的免疫细胞是修饰的T淋巴细胞(T细胞)、幼稚T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、天然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞。在一个实施方式中，基因工程化细胞是自体细胞。在这种实施方式中，通过引入靶向多种内源基因的多种试剂(例如，基因编辑剂)来进一步修饰多个修饰的免疫细胞，从而产生多种编辑的免疫细胞。
在示例性实施方式中，多个免疫细胞是由主题核酸文库修饰的多个T细胞，以表达对抗原具有亲和力的外源TCR和/或CAR，并表达独特的靶向序列(例如，独特引导RNA)。在这种实施方式中，通过引入多种基因编辑剂(例如，CRISPR核酸酶)进一步修饰多个修饰的免疫细胞，该基因编辑剂导致独特目标序列靶向的内源基因中的插入和/或缺失，从而产生多个编辑的免疫细胞。编辑的免疫细胞中的每一个包含在内源基因座(由独特靶向序列所指示)中的插入和/或缺失以及外源TCR和/或CAR。
可以在体外或体内进行用于鉴定调控免疫细胞功能的基因(例如，在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强的基因)的方法。在一个实施方式中，鉴定方法在体外进行。图2中示意性示例了用于鉴定调控免疫细胞功能的基因(例如，在下调时导致免疫细胞或其前体细胞(例如，T细胞)的功能增强的基因)的体外方法。如所示例的，体外筛选方法包括使基因编辑的修饰的TCR/CAR免疫细胞文库(例如，基因编辑的修饰的TCR/CAR T细胞文库)与目标肿瘤细胞接触。在这种实施方式中，由免疫细胞包含的TCR/CAR对目标肿瘤细胞具有亲和力。例如，基因编辑的修饰的TCR/CAR T细胞文库包含表达对特定抗原具有亲和力的TCR/CAR(例如，PSCA CAR)的T细胞，并且T细胞文库与表达特定抗原的目标肿瘤细胞(例如，表达PSCA的目标肿瘤细胞)接触。使T细胞文库与目标肿瘤细胞接触的步骤代表“挑战(challenge)”，例如，肿瘤细胞挑战。每次挑战产生富集的TCR/CAR T细胞文库。例如，在第一个挑战后，可以分离第一富集的TCR/CAR T细胞文库。在一个或多个挑战后，例如，在两个或更多个挑战、三个或更多个挑战、四个或更多个挑战、五个或更多个挑战后，可以分离两个或更多个，例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六或更多个富集的TCR/CAR T细胞文库。在连续的挑战后，最终富集的TCR/CAR T细胞文库可以包含其中内源基因已被编辑以赋予增强的T细胞功能(例如，T细胞持久性、T细胞功效)的T细胞。
在一个实施方式中，在体内进行鉴定方法。图3A中示意性地示例了用于鉴定调控免疫细胞功能的基因(例如，在下调时导致免疫细胞或其前体细胞(例如，T细胞)的功能增强的基因)的体内方法。如所示例的，体内筛选方法包括将基因编辑的、修饰的TCR/CAR免疫细胞文库(例如，基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库)输注到带目标肿瘤模型生物体中。例如，基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库包含表达对特定抗原具有亲和力的TCR/CAR(例如，PSCA CAR)的T细胞，并将T细胞文库注入带肿瘤生物体中，其中生物体具有表达特定抗原的肿瘤(例如，表达PSCA的肿瘤)。然后从输注的带肿瘤生物体中分离出肿瘤浸润性淋巴细胞，从而产生富集的TCR/CAR T细胞文库。输注步骤类似于本文所述的体外筛选方法的“挑战”步骤。这样，在一些实施方式中，可以连续进行多次输注(“挑战”)，以进一步富集所得的分离的TCR/CAR T细胞文库。
用于本发明的体内筛选方法的合适的模型生物体包括但不限于小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。合适的模型生物体总体上包括具有天然免疫细胞库(例如，T细胞库)的生物体。在一些实施方式中，在体内进行鉴定方法的情况下，由获自相同动物作为输注对象的免疫细胞(例如，T细胞)群产生基因编辑的、修饰的TCR/CAR免疫细胞(例如，T细胞)文库。例如，在体内筛选方法包括将主题基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库输注到带肿瘤小鼠的情况下，可以从小鼠T细胞群产生基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库。在一些实施方式中，在体内进行鉴定方法的情况下，由获自不同动物作为输注对象的免疫细胞(例如，T细胞)群产生基因编辑的、修饰的TCR/CAR免疫细胞(例如，T细胞)文库。例如，在体内筛选方法包括将主题基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库输注到带肿瘤小鼠中时，从人T细胞群产生基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库。技术人员将能够容易地确定合适来源的免疫细胞和合适的输注对象。
图3A中示意性地示例了用于鉴定调控免疫细胞记忆和/或免疫细胞持久性的基因(例如，在下调时导致T细胞记忆和/或T细胞持久性增强的基因)的体内方法。如所示例的，体内筛选方法包括将基因编辑的、修饰的TCR/CAR免疫细胞文库(例如，基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库)输注到带目标肿瘤模型生物体中。例如，基因编辑的、修饰的TCR/CART细胞文库包含表达对特定抗原具有亲和力的TCR/CAR(例如，PSCA CAR)的T细胞，并且T细胞文库融合到带肿瘤生物体中，其中生物体具有表达特定抗原的肿瘤(例如，表达PSCA的肿瘤)。在一个实施方式中，基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库将能够从带肿瘤生物体清除肿瘤的显著部分。在一个实施方式中，基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库将能够从带肿瘤生物体完全清除肿瘤。在一个实施方式中，基因编辑的、修饰的TCR/CAR T细胞文库将能够从带肿瘤生物体清除肿瘤至使用标准方法无法检测的水平。基因编辑后，修饰的TCR/CAR T细胞文库从带肿瘤器官清除肿瘤，进行肿瘤重新接种，以将肿瘤细胞重新引入已清除的带肿瘤生物体中。重新接种的肿瘤可以由记忆文库T细胞控制。然后从重新接种的生物体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞，从而产生富集的TCR/CAR T细胞文库。
分离出富集的TCR/CAR免疫细胞文库(例如，富集的TCR/CAR T细胞文库)后，可以使用标准测序方法来鉴定调控免疫细胞功能、免疫细胞记忆和/或免疫细胞持久性(例如，T细胞功能、T细胞记忆、和/或T细胞持久性)的基因。DNA提取和分析的若干方法包括在本发明的方法中。如本文所用，“深度测序”表示该过程的深度是所研究序列的长度的多倍大。深度测序包括在一下代测序方法中，该下一代测序方法包括但不限于单分子实时测序(Pacific Bio)、离子半导体(Ion torrent测序)、Pyrosequencing(454)、合成测序(Illumina)、连接测序(SOLiD测序)和链终止(Sanger测序)。技术人员将能够确定在富集的TCR/CAR免疫细胞文库中富集的目标基因。
尽管已参考其具体实施方式描述了本发明，但在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等同物。对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不背离本文公开的实施方式的范围的情况下，可以使用合适的等同物对本文所述的方法进行其它合适的修改和改编。另外，可以做出多种修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、一个或多个处理步骤适应于本发明的目的、精神和范围。所有这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。现已详细描述了某些实施方式，通过参考以下实施例，将更清楚地理解该实施方式，仅出于示例的目的包括这些实施例，并且不旨在是限制性的。
实施例
以下实验实施例不旨在是限制性的，并且涉及通过使用单发II型CRISPR系统(One-shot type II CRISPR system)产生T细胞基因消除文库的组合物和方法。一个方面包括用于产生编码T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)基因的单发sgRNA文库以及sgRNA文库的方法。另一方面包括通过转导单发sgRNA文库和随后对能够改变内源基因表达的Cas9核酸内切酶进行电穿孔来产生修饰的T细胞。还描述了通过在多个NSG肿瘤小鼠模型中用NY-ESO-1 TCR或PSCA CAR筛选两个CRISPR/Cas9 T细胞文库进行体外和体内全基因组全基因筛选的方法。从处理小鼠分离的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)进行的DNA深度测序鉴定了一组富集的gRNA，其靶向hsa-mir-4508、C1orf141、PAGR1、CEACAM19、MFSD5、SIX2、KLF4、USP27X、CCDC33和ZNF124的基因。在前列腺癌(PC3-PASC)、胰腺癌(CaPan1)或肺癌(A549-ESO)的NSG小鼠肿瘤模型中测试了内源C1orf141、PAGR1、CEACAM19、SIX2、KLF4、USP27X或CCDC33下调的CAR-T或TCR-T细胞。不受任何理论的束缚，发现在不同小鼠肿瘤模型中，PAGR1、SIX2和Klf4下调可以体外和体内改善T细胞功能。
材料和方法
原代人淋巴细胞。如(Human gene therapy 2011,22(12):1575-1586)中所述，用包被有CD3和CD28刺激性抗体(Life Technologies,Grand Island,NY,Catalog)的微珠刺激原代淋巴细胞。在第10天，以1x108细胞/小瓶将T细胞冷冻保存在90％胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)的溶液中。
原代T细胞的繁殖。将原代人T细胞培养在补充有10％FCS、100-U/ml青霉素、100-g/ml硫酸链霉素、10-mM Hepes的RPMI 1640中，并用包被有抗CD3/抗CD28的磁珠以1:3细胞与珠子的比率刺激。每2天对细胞进行计数并喂养一次，并且在T细胞出现休眠(通过降低的生长动力学和细胞大小来确定)后，将T细胞用于功能测定或冷冻保存。
用于慢病毒转导的PSCA CAR单发构建体的生成。合成了PSCA CAR，并将其亚克隆到人GeCKO慢病毒sgRNA文库v2(lentiGuide-Puro)中。扩增文库并产生用于转导T细胞的慢病毒载体。
用单发CRISPR进行CAR T细胞基因编辑。使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(Life Technologies,AM1345,Carlsbad,CA)在体外转录Cas9 mRNA。使用HiScribeTM T7高产RNA合成试剂盒转录gRNA。Cas9蛋白购自PNA Bio(CP01)。使用BTX830电穿孔器对具有单发CAR或CAR T细胞的CRISPR试剂进行电穿孔。
简而言之，将T细胞用OPTI-MEM洗涤3次，并以1-3x108细胞/ml的终浓度重新悬浮在OPTI-MEM(Invitrogen)中。随后，将0.1ml细胞与IVT RNA混合，并在2mm比色皿中电穿孔。使用BTX830(Harvard Apparatus BTX)在360V和1ms下将20微克Cas9mRNA电穿孔到细胞中。电穿孔后，立即将细胞置于2ml预热的培养基中，并在IL-2(100IU/ml)的存在下于37℃和5％CO2下培养。
流式细胞仪。以指定的特异性和适当的同型对照使用以下单克隆抗体和试剂。来自BD Biosciences(San Jose,CA)：APC偶联的抗CD3(555335)。使用CellQuest版本3.3(BDBiosciences,San Jose,CA)在FACS Accuri(BD Biosciences,San Jose,CA)上获得数据，并通过FCS Express版本3.00(De Novo Software,Los Angeles,CA)或FlowJo版本7.6.1(Tree Star,Inc.Ashland,OR)进行分析。
小鼠异种移植研究。所有动物实验方案均根据机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准并进行。如先前所述进行研究并进行某些修改。简而言之，对于Nalm6肿瘤模型，在第0天，通过尾静脉向6-至10-周龄的NSG小鼠注射1x106个Nalm6肿瘤细胞。T细胞治疗在肿瘤接种后第7天开始。以2x106个细胞/小鼠(2M)的剂量给予T细胞。
实施例1：用CRISPR文库在TCR-或CAR-T细胞中进行全基因组功能筛选
包含单发CRISPR系统的基因修饰的TCR-或CAR-T细胞文库可以用于体外或体内全基因组功能筛选。根据本发明的实施方式，基因修饰的TCR-或CAR-T细胞CRISPR文库使用图1A中描绘的构建体制备。根据图1B中描绘的方法进行文库制备。如图2所描绘，进行体外全基因组筛选，并且如图3A和3B所描绘，进行体内全基因组筛选。图4A和4B显示了用照射的目标肿瘤细胞体外刺激的针对CD19导向CAR-T细胞文库(图4A)和PSCA导向CAR-T细胞文库(图4B)的CAR-T细胞文库的扩增倍数。图5显示了CD19导向CAR-T细胞文库和PSCA导向CAR-T细胞文库的功能分析。CD19导向CAR-T细胞文库肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)能够消除Nalm6-GFP肿瘤细胞(图5A)。与PC3-PSCA肿瘤细胞共培养后，PSCA导向CAR-T细胞文库TIL能够上调T细胞活化标记物CD137(图5B)。
实施例2：使用CRISPR文库在CAR-T细胞中进行全基因组功能筛选
CAR-T细胞文库经历体内选择。简而言之，通过将CAR-T细胞注入携带PC3-PSCA肿瘤的小鼠内直接进行体内选择。在CAR-T细胞输注后14天，收集肿瘤浸润性CAR-T细胞(图6)。
实施例3：深度测序和数据分析
通过将条形码和衔接子序列整合到PCR引物中制备条形码DNA文库。进行Miseq以鉴定每个引导RNA的富集。发现超过240个引导RNA显示相对富集大于5倍，包括40个引导RNA富集大于10倍(图7)。通过体内筛选鉴定的顶级候选物(Top candidates)包括Klf4、Bach和PTGIR，发现其显示50至100倍的sgRNA富集(图8A和8B)。不受任何理论的束缚，这些结果表明，单发CRISPR系统是用于体内筛选CAR-T细胞阴性调控基因的有效且可靠的系统。
实施例4：鉴定不同肿瘤类型之间的共同CAR-T细胞调控基因
为进一步验证候选物，在带有胰腺癌-CaPan1的天然PSCA抗原中进行另一种体内筛选，与PC3-PSCA肿瘤相比，其具有相对低的抗原表达。进行了类似的筛选方法，并通过深度测序测量富集的sgRNA。前20个富集的候选物与先前的筛选没有任何重叠(图9)。
不受任何理论的束缚，这些差异可能由于不同肿瘤类型之间不同的代谢途径偏好、抑制分子谱和/或微环境。通过比较前100个候选物，发现两个候选物在两个筛选：Klf4和PAGR1中高度富集。在两个筛选的前200个中发现10个重叠的候选物。发现所有10个候选物已在PC3-PSCA模型中富集了50至100倍，并在在CaPan1模型中甚至更高(图10A和10B)。图11显示了顶级候选物的等级和倍数变化。
表2列出了两个单独实验中前10个富集的目标基因。
表2：
Figure BDA0002798262570000891
Figure BDA0002798262570000901
表3列出了在肿瘤动物模型中选择的候选目标基因。
表3：
Figure BDA0002798262570000902
实施例5：肿瘤模型中的候选物验证
为验证肿瘤模型中的功能，在CAR-T细胞中分别单独敲除了六个潜在的候选物，并在表达PSCA的PC3-PSCA和CaPan1肿瘤小鼠模型中进行测试。在PAGR1、Klf4和SIX2 KO组中观察到加速的肿瘤清除(图12A-12C)。当在低表达PSCA的肿瘤模型中进行测试时，PAGR1和SIX2 KO增强了CAR-T细胞功能(图13A-13C)。为了测试这些候选物是否增强TCR-T细胞的功能，对A549-NY-ESO肺癌中的NY-ESO-1 TCR T细胞进行了另一项验证。PAGR1 KO NY-ESO-1TCR-T细胞显示出比野生型对应物更好的肿瘤控制(图14A-14C)。
基于肿瘤模型中优异的肿瘤清除，进一步研究了PAGR1、Klf4和SIX2。为了测试这些基因如何调控CAR-T细胞功能，在体外测试了基因敲除CAR-T细胞的功能。无论所用sgRNA如何，在所有三个基因敲除的CAR-T细胞中均观察到显著的脱粒增加(图15A和15B)。与野生型对照相比，此观察结果与敲除的CAR-T细胞的升高的肿瘤细胞毒性一致(图15C和15D)。三个候选物在被敲除时也增强了CAR-T细胞增殖，这通过CSFE测定法得到证实(图15E)。在PC3-PSCA和CaPan1模型中进行了第二次验证。PAGR1 KO在两个模型中均显示出优异的肿瘤控制，而Klf4 KO在PC3-PSCA模型中显示增强的肿瘤控制(图16A-16C和图17A-17B)。
实施例6：PAGR1 KO增强CAR-T细胞肿瘤积累和抑制抗性
PAGR1和Klf4 KO显著增强了PC3-PSCA肿瘤浸润性CART细胞的数量。进一步发现，PAGR1 KO CAR-T细胞浸润显著大于野生型CAR-T细胞(图18A和18B)。发现PAGR1KO肿瘤浸润性CAR-T细胞在体外显示出优异的肿瘤清除(图18C)。不受任何理论的束缚，这些发现可能表明PAGR1 KO赋予对CAR-T细胞的抑制性抗性。确实，发现肿瘤浸润性PAGR1 KO CAR-T细胞比其它组表达更少的抑制性分子(图18D-18G)。图18H还显示PAGR1 KO增强了肿瘤浸润性细胞的杀伤能力。
实施例7：PAGR1 KO通过组蛋白甲基化的表观遗传调控降低细胞凋亡
与野生型CAR-T细胞相比，通过CD3/CD28珠刺激或通过与目标肿瘤细胞共培养的抗原暴露，PAGR1 KO显著降低CAR-T细胞凋亡(图19A和19B)。据报道，PAGR1是组蛋白甲基化复合物组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2D(KMT2D)的组分。PAGR1 KO表现出降低的H3K4单甲基化和二甲基化，与B细胞淋巴瘤中KMT2D功能丧失的表型一致(图20A)。在PAGR1 KO CAR-T细胞中观察到由KMT2D调控的下游基因的表达降低(图20B)。发现细胞存活的ARID1A和PRMT1启动子的负调节子处的H3K4单甲基化占有率大大降低(图20C)。发现促存活因子(pro-survival factors)(如Bcl2和Myc)的RNA水平被上调(图20D)。
实施例8：PAGR1 KO在同基因模型中增强过继性T细胞疗法
为测试这些候选物的下调是否增强免疫能力模型中过继性T细胞疗法的功能，将PAGR1和Klf4 KO OT-I小鼠T细胞注入B16-OVA带肿瘤小鼠中。如肿瘤大小所证实，与野生型对照相比，PAGR1 KO显著增强了OT-I小鼠T细胞的功能(图21)。
表4
Figure BDA0002798262570000911
Figure BDA0002798262570000921
Figure BDA0002798262570000931
Figure BDA0002798262570000941
Figure BDA0002798262570000951
表5
Figure BDA0002798262570000952
Figure BDA0002798262570000961
实施例9：产生用于过继性免疫疗法的DNMT3A敲除的CAR T细胞
实施例9-12描述了通过敲除DNMT3A基因来产生用于过继性免疫疗法的抗衰竭T细胞的方法。筛选靶向DNMT3A的gRNA，然后使用CRISPR/Cas9和AAV介导的同源重组将GFP敲入DNMT3A基因座中，这消除了DNMT3A基因。通过AAV感染将由EGFP和位于gRNA目标侧翼的同源臂组成的供体DNA引入T细胞中。还通过慢病毒感染将CD19BBz CAR转导至T细胞。通过FACS分选选择具有GFP敲入的CD19BBz+T细胞并在体外扩增。当与癌细胞共培养时，这些细胞表现出增强的细胞因子(IL2、INFγ和TNFα)产生和脱粒。在癌细胞重复刺激后，敲除DNMT3A也增加了CD19BBz CAR T细胞的增殖和抗肿瘤作用。
材料和方法
原代人淋巴细胞：白细胞分离术后，通过使用RosetteSep试剂盒(Stem CellTechnologies,Vancouver BC,Canada)进行阴性选择，从健康志愿者供体中分离原代人CD4和CD8 T细胞。用抗CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies,Grand Island,NY)刺激原代淋巴细胞。
CRISPR的设计和构建：如先前所述(Cong,L.等人(2013)Science 339,819-823；Slaymaker,I.M.等人(2016)Science 351,84-88)，通过PCR合成Cas9 DNA并克隆到RNA体外转录(IVT)载体、pD-A载体中(Zhao,Y.等人(2010)Cancer Research 70,9053-9061)。使用基于网络的CRISPR算法(crispr.mit.edu and chopchop.rc.fas.harvard.edu)选择gRNA。将选择的sgRNA在T7启动子的控制下克隆到MSGV载体中，然后通过体外转录合成。化学修饰的gRNA(S1、S2、S3和S4)由Synthego(Menlo Park,CA)制备。如(Ren,J.et al.(2017)Clinical cancer research,23(9),2255-2266)中所述生成并存储体外转录的Cas9mRNA和sgRNA。
慢病毒和AAV转导：第0天，通过CD3/CD28 dynabeads刺激T细胞，并在第1天通过CD19BBz慢病毒转导。在第4天，在将gRNA电穿孔后3小时，将AAV载体添加至细胞中。
DNMT3A基因编辑和敲入的分析：CRISPR/Cas9基因编辑如前所述进行(Ren,J.等人，(2017)Clinical cancer research,23(9),2255-2266)。RNA电穿孔后2或3天，从细胞中提取基因组DNA。表6列出了用于扩增基因组DNA片段和分析DNMT3A敲除效率的PCR引物。TIDE(通过分解追踪插入缺失)和ICE(CRISPR编辑推断)工具用于量化插入缺失频率。通过对DNMT3A DNA和PGK-EGFP-WPRE-BGH PolyA转基因的连接点进行测序来确认敲入。使用引物CTTCTGTCACTGTTCCGGGTTTTG(SEQ ID NO:67)和GCCACTCCCACTGTCCTTTCCTA(SEQ ID NO:68)对5’端的敲入进行PCR扩增。使用引物CACAAGGGTAGCGGCGAAGATC(SEQ ID NO:69)和ACATGCCCAGAAGCGGTGGA(SEQ ID NO:70)对3’端的敲入进行PCR扩增。
表6：用于扩增基因组DNA片段和分析DNMT3A敲除效率的PCR引物
Figure BDA0002798262570000971
Figure BDA0002798262570000981
构建体：通过MluI和PmlI消化PAAV6-MCS质粒(Cell Biolabs,Inc)，并将2907bp的片段用作骨架。通过IDT合成DNMT3A 5’臂、WPRE-BGH PolyA和DNMT3A 3’臂的DNA片段。将DNMT3A gRNAs 8-2、8-3和8-4(aaggcacccgctgggtcatgtggttcggagacgg)(SEQ ID NO:95)的目标序列添加至5’臂和3’臂的5’末端。PCR扩增PGK启动子-EGFP。片段DNMT3A 5’臂-PGK启动子-EGFP-WPRE-BGH PolyA-DNMT3A 3’臂通过重叠PCR组装，用MluI和PmlI消化，然后用PAAV6骨架连接。AAV载体由Genecopoeia(Rockville,MD)产生。
快速T细胞扩增方案：在第0天，将10万个T细胞与25百万个照射的同种异体外周血单核细胞在含有30ng/ml小鼠抗人CD3单克隆抗体(Thermo Fisher Scientific 16-0037-85)的25ml R10培养基中混合。在第2天，将300IU/ml白细胞介素-2添加至培养物中。在第5天，用含有300IU/ml IL-2的新鲜培养基替换20ml的培养基。在第8天和第11天，将细胞分离并用含有300IU/ml IL-2的新鲜培养基饲喂，并在第14天冷冻保存。
流式细胞仪：使用以下具有指定特异性和适当的同种型对照的单克隆抗体和试剂。来自BD Biosciences(San Jose,CA)：APC缀合的抗CD3(555335)、FITC-抗-CD8(555366)、PE-抗-CD8(555635)、PE-抗-CD107a(555801)、PECy7-抗-TNF(557647)和V450-抗-INFγ(560371)。来自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.(West Grove,PA)：生物素-SP AffiniPure山羊抗小鼠IgG(115-065-072)。来自Biolegend(San Diego,CA)：BV785-抗-CD45(304048)、AF700-抗-CD8a(300920)、AF647-抗-粒酶B(515406)和BV605-抗-IL-2(500332)。
对于胞内细胞因子染色，首先使用LIVE/DEADTM可固定死亡细胞染色试剂盒(LIVE/DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit)(Thermo Fisher Scientific)对细胞进行染色以排除死细胞。接下来，使用FIX&PERM细胞固定&细胞透化试剂盒(FIX&PERM CellFixation&Cell Permeabilization Kit)(Thermo Fisher Scientific)对细胞进行表面抗原染色、固定和透化，然后将细胞因子染色。在Fortessa(BD Biosciences,San Jose,CA)上获得数据，并使用FlowJo版本7.6.1(Tree Star,Inc.,Ashland,OR)对数据进行分析。
顺序杀伤测定：在第1天，将10万个T细胞与20万个K562、K562-CD19、Raji或Nalm6细胞共培养。在第4天和第7天，去除培养基并在新鲜培养基中添加20万个肿瘤细胞。细胞用LIVE/DEADTM Fixable Aqua(Invitrogen)、CD4和CD8染色，并用Countbright绝对计数珠(Countbright Absolute Counting Beads)(Invitrogen)对CD4细胞、CD8细胞和肿瘤细胞进行计数。
实施例10：筛选靶向DNMT3A的gRNA
使用TIDE和ICE工具评价靶向DNMT3A外显子7-15和19的gRNA的敲除效率(表7-10)。进行DNMT3A的胞内染色，以确认选择的gRNA的敲除效率(图22)。
表7：靶向DNMT3A外显子7的gRNA的序列和基因编辑效率。
Figure BDA0002798262570000991
表8：靶向DNMT3A外显子8和9的gRNA的序列和基因编辑效率。
Figure BDA0002798262570001001
表9：靶向DNMT3A外显子10、11和12的gRNA的序列和基因编辑效率。
Figure BDA0002798262570001002
Figure BDA0002798262570001011
表10：靶向DNMT3A外显子13、14、15和19的gRNA的序列和基因编辑效率。
Figure BDA0002798262570001012
表11：专利WO 2017/079642 Al中描述的gRNA的序列和基因编辑效率
Figure BDA0002798262570001013
Figure BDA0002798262570001021
实施例11：将GFP敲入CAR T细胞的DNMT3A基因座中
首先用CD19BBz慢病毒转导T细胞，然后使用gRNA 8.2和8.3在DNMT3A基因座处进行CRISPR/Cas9基因编辑。携带DNMT3A同源臂和EGFP的AAV载体(图23-24)用于感染T细胞，并用作同源指导性修复的模版，以敲入EGFP。在第10天，进行FACS以检查CD19BBz和EGFP的表达(图25)。未转导的细胞(NTD)不表达CD19BBz和EGFP。CD19BBz细胞仅通过CD19BBz慢病毒转导。69.2％的细胞表达CD19BBz，但其不表达EGFP。这些CAR T细胞通过FACS分选。对于由慢病毒和AAV(CD19BBz+KI)转导的T细胞，77.77％的细胞表达CD19BBz，而3.85％的细胞表达EGFP。2.87％的双阳性细胞通过FACS分选。使用快速T细胞扩增方案(Rapid T cellExpansion Protocol)(REP)扩增NTD、分选的CD19BBz T细胞和分选的CD19BBz+EGFP+细胞。用REP方案扩增后，95％的细胞在CD19BBz组中表达CD19BBz，而87.5％的细胞在CD19BBz+KI组中表达CD19BBz和EGFP(图26)。通过PCR扩增DNMT3A DNA与转基因之间的连接来确认EGFP敲入DNMT3A gRNA目标区域中(图27)。
实施例12：DNMT3A的敲除增强了CD19BBz T细胞的功能
将NTD、CD19BBz和CD19BBz+KI T细胞与不表达CD19的K562癌细胞和表达CD19:K19(K562细胞中CD19的强制表达)、Nalm6和Raji的三种癌细胞系共培养。CD107a以显著的水平表达，表明在CD19BBz+KI细胞中脱粒增加(图28)。在CD4和CD8CD19BBz+KI细胞中以较高水平诱导INFγ和TNFα(图29-30)。尽管IL-2在CD8细胞中以较低水平表达，但其在CD4CD19BBz+KI细胞中以较高水平表达(图31)。在第1天、第4天和第7天，通过肿瘤细胞重复挑战T细胞，然后在第10天对CD8 T细胞和肿瘤细胞的数量进行计数。当与CD19+肿瘤细胞共培养时，存在比CD19BBz T细胞显著更多的CD19BBz KI T细胞(图32)，表明DNMT3A的敲除增加了抗原刺激后的细胞增殖。更重要地是，CD19BBz KI T细胞几乎完全消除了Nalm6细胞，而CD19BBz T细胞在重复刺激后未能有效地控制Nalm6细胞(图33)。
与AAV载体的供体DNA递送结合的CRISPR/Cas9基因编辑技术成功地将EGFP敲入T细胞的DNMT3A基因中。EGFP+敲入细胞可以在体外分选和扩增，并且其响应于癌细胞而表现增加的细胞因子产生、增殖和细胞毒性。DNMT3A在T细胞衰竭的发展中对于重新DNA甲基化是必需的。这种方法创建了具有较强抗肿瘤功能的DNMT3A敲除的CAR T细胞。
其它实施方式
本文对变量的任何定义中的要素列表的列举包括将此变量定义为所列举要素的任何单个要素或组合(或子组合)。本文对实施方式的叙述包括作为任何单个实施方式的实施方式或与任何其它实施方式或其部分的组合。
本文引用的每个和每一个专利、专利申请和出版物的公开内容特此以其整体通过引用并入本文。尽管已经参考特定实施方式公开了本发明，但是显然，本领域的其它技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变型，而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这种实施方式和等同变型。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学董事会
<120> 具有增强功能的修饰的免疫细胞及其筛选方法
<130> 046483-7202WO1(01866)
<150> US 62/648,722
<151> 2018-03-27
<160> 165
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NY-ESO157-165
<400> 1
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复n次，其中n至少为1
<400> 2
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 重复n次，其中n至少为1
<400> 3
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复n次，其中n至少为1
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 5
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 6
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 7
Gly Ser Gly Ser Gly
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 8
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 9
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 10
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子
<400> 13
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 15
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 16
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
1 5 10 15
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 17
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 18
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 19
Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 20
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 21
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 22
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 23
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 24
Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln
1 5 10
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 25
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶（furin）切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 26
Arg Xaa Lys Arg
1
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 27
Arg Xaa Arg Arg
1
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为Arg或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为Arg或Lys
<400> 28
Xaa Arg Xaa Xaa Arg
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 29
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<400> 30
Arg Gln Lys Arg
1
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<211> 20
<212> DNA
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aatcagtatt tccgctgccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 32
ttgtacctgg ggtgcgtctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
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aggagcagat ccttcgtacc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 34
ccggtaaggc cgaggacgag 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 35
cccctcgtcc tcggccttac 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 36
attgaccgga gacgcacccc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 37
gcgggaattt gcggcgcacg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 38
accccgcgag aagcgtgagc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 39
gagtggtctg gcgtccccga 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 40
aacagccaca acccgctgaa 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 41
ttgctcctgc gtgaagccga 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 42
caaggcacac tacatcgagg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 43
gtggtggcgc cctacaacgg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 44
agcccgcgta atcacaagtg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 45
gcgcggcggc ccgccgttgt 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 46
tctttctcca cgttcgcgtc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 47
cacccacact tgtgattacg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 48
gagaagacac tgcgtcaagc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 49
cgcggcgcac gactgcgacg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 50
gtgagatgtc gtcgctgttt 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 51
ctcgatgcca gttgtagtat 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 52
gtccagtacg tccttaatac 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 53
tcttaaaccg atcgtaaagc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 54
actgcttgcg gaggtttacg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 55
ctctgaggcc gttgtatccc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 56
atacaacggc ctcagaggga 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 57
gatccctggc ccctcggagc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 58
catgtgctgg gcgtcactga 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 59
ggccgccagg atcccagcgt 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 60
atcctggcgg ccaccatcat 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 61
tcttgctaca tccgcgtcta 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 62
ctttgatatt gccttagacg 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 63
gattctgttg gtctcttaga 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 64
aataaagaaa gtgagtcaac 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 65
aagagaccaa cagaatccaa 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 66
acatttgttt gaataaagaa 20
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
cttctgtcac tgttccgggt tttg 24
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
gccactccca ctgtcctttc cta 23
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
cacaagggta gcggcgaaga tc 22
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
acatgcccag aagcggtgga 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
tttccatttt tcacggcaag 20
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
caccccaatt ccagactgc 19
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
ggagctccat ctgaatgagg 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
ttttgctctg tcttgcctca 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
acttccaggc ctcctagtgc 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
ttttgctctg tcttgcctca 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
actgtatctg gtcccctcca 20
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
ccaacagaga gcaggtcatt c 21
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
actgtatctg gtcccctcca 20
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
ccaacagaga gcaggtcatt c 21
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
ctggggtcag gacttgaatg 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
ccattgacag gagagcagaa 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
ctggggtcag gacttgaatg 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
ccattgacag gagagcagaa 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
agatgatggc gttcgagact 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
caaaagcttg aaacccaagg 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
caaaagcttg aaacccaagg 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
ctgaccctgg ctaaggtggt 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
agggtcctaa gcagtgagca 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
ctgaccctgg ctaaggtggt 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
agggtcctaa gcagtgagca 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
gacagctatt cccgatgacc 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
tgcaaagcag aagtcaccag 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
tgcaaagcag aagtcaccag 20
<210> 95
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 95
aaggcacccg ctgggtcatg tggttcggag acgg 34
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 96
ctcgtcatcg cctgctttgg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 97
tcaggcgtgg tagccacagt 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 98
tggctcgtca tcgcctgctt 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 99
ctaccacgcc tgagcccgtg 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 100
gacaagaatg ccaccaaagc 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 101
cgatgacgag ccagagtacg 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 102
aagccgctca cctcgtactc 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 103
gctaccacgc ctgagcccgt 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 104
gagcccgtgg ggtccgatgc 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 105
ggctaccacg cctgagcccg 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 106
ggggcccggg gagtctcaga 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 107
gcccgtgggg tccgatgctg 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 108
tgtcttggtg gatgacgggc 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 109
tctgagactc cccgggcccc 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 110
ctcgtcatcg cctgctttgg 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 111
caggcgtggt agccacagtg 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 112
ggaagaaaac caggggcccg 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 113
tccgaaccac atgacccagc 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 114
cggagacggc aaattctcag 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 115
gacggccggg gctttggcat 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 116
ggccaggccg cattgtgtct 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 117
tgggtcatgt ggttcggaga 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 118
tgggtcatgt ggttcggaga 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 119
cggccggggc tttggcattg 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 120
tgggtcatgt ggttcggaga 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 121
acccgctggg tcatgtggtt 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 122
tccccagcat cggaccccac 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 123
catgggctgc ttgttgtacg 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 124
gctgcttgtt gtacgtggcc 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 125
gcactgcaaa acgagctcag 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 126
gttttgcagt gcgttccacc 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 127
gcttgttgta cgtggcctgg 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 128
agaacaagcc catgattgaa 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 129
catcgctgtc gtggcacacc 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 130
ccgggaacag cttccccgcg 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 131
cccagggccc attcaatcat 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 132
aaagccccgg aagagcacag 20
<210> 133
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 133
agaagtgtac acggacatg 19
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 134
attattgatg agcgcacaag 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 135
aagaagtgta cacggacatg 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 136
ttctccgctg tgctcttccg 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 137
agcggctggt gtacgaggtg 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 138
acgaggtgcg gcagaagtgc 20
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 139
tgcagagcgg ctggtgtacg 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 140
cagaagtgcc ggaacattga 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 141
ggcacattcc tccaacgaag 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 142
gcacattcct ccaacgaaga 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 143
gcgtaccagt acgacgacga 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 144
ggtagccgtc gtcgtcgtac 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 145
gcggaaacaa caactgctgc 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 146
cttcgctaat aaccacgacc 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 147
tgcgggcaca agggtaccta 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 148
tgctacatgt gcgggcacaa 20
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 149
ccgcacatgt agcagttcca 20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 150
gcgggcacaa gggtacctac 20
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 151
cactcacaaa ttcctggtcg 20
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 152
ggttattagc gaagaacatc 20
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 153
gtacctacgg gctgctgcgg 20
<210> 154
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 154
gcatgatgcg cggccca 17
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 155
agaacaagcc catgattgaa 20
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 156
aagaagtgta cacggacatg 20
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 157
aaagccccgg aagagcacag 20
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 158
agcggctggt gtacgaggtg 20
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 159
acgaggtgcg gcagaagtgc 20
<210> 160
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 160
gcatgatgcg cggccca 17
<210> 161
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 161
agaagtgtac acggacatg 19
<210> 162
<211> 835
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 162
aaggcacccg ctgggtcatg tggttcggag acggacattg aggctcccac aggagatgca 60
gatgtctgga aagcagaggg aggggatggg gtgagagtgc cagagttccc aggcaacaaa 120
cttaccctca atgttccggc acttctgccg cacctcgtac accagccgct ctgcaagggg 180
aggagagctg gcgtcagagg tgccaccctc tccagaagca ggccaactac ctcttgtgcg 240
ctcatcaata atctccttga ccttgggctt ctccgctgtg ctcttccggg gctttttggc 300
tggtggaggt ggtgcgtagg cagctgcctc aggttccacc cacatgtccg tgtacacttc 360
tttgtaggga ttcttctctt ctggaggagg aaagcaggtg ccaaggtcag ggtcccagaa 420
agctgggtgc cctcatttac cttctggtgg ctccaggccc ttagggccag aaggctggaa 480
gccccccagg gcccattcaa tcatgggctt gttctgcacc tccacggcct tggcagtgtc 540
actctcatcg ctgtcgtggc acaccgggaa cagcttcccc gcgcggctgc tggccacctg 600
gagggtgaca cgccagggtt ggggttgctc ctccgagctc ccagcaggga cactcacctg 660
caggacctcg tagatggctt tgcggtacat gggctgcttg ttgtacgtgg cctggtggaa 720
cgcactgcaa aacgagctca gcggcatcag cttctcaaca cacacctggg gggacaagcc 780
aggccttgtt tgccgcccag gctactgcca aaccccacaa cttaccactg agaat 835
<210> 163
<211> 2082
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 163
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatcat cgaattacct ctagagccac 540
catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga 600
cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta 660
cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac 720
cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa 780
gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt 840
cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct 900
ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca 960
caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa 1020
cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc 1080
cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca 1140
ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt 1200
cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta 1260
agtcgacatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 1320
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 1380
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 1440
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 1500
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 1560
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 1620
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccttgg 1680
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 1740
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 1800
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgct 1860
gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 1920
gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 1980
agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 2040
gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tg 2082
<210> 164
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 164
gacccagcgg gtgccttcag ctgctcggct ccggcccgtc atccaccaag acacaatgcg 60
gcctggccac caggagaagc cccgcagttt cccccacacc agctccccaa tgccaaagcc 120
ccggccgtcc tggagcccca aggagcagaa atcattacac tggccacggc tggtgaagaa 180
gccgctcacc tcgtactctg gctcgtcatc gcctgctttg gtggcattct tgtccccagc 240
atcggacccc acgggctcag gcgtggtagc cacagtgggg gatgcggggt cagtgggctg 300
ctgcacagca ggagggctgg cctcctccac cttctgagac tccccgggcc cctggttttc 360
ttccacagca ttcattcctg caatgacctt ggctttcttc tcagcctggg gaaacaaaaa 420
acaaaaagtc accttggctg gggcccaggc cagaaggcgc ctcacctccc ttttccagcg 480
tgccagccac tcgtcccgct tgcgcttgct gatgtagtag gggtcccccg cctggaaggt 540
gagcctcggc atgggccgct gacggaggct ggactcccag cccaagccac cccgcagccg 600
gccccgggag ccctaggaca gagagacaga cattagggca ttccacagag cccctggggg 660
tggaacactt gcctccattt tcatggattc gatgttggtc tccttctgtt ctttgcctgt 720
ggagagggaa gaacaaaggg accagtaaga ggctgcccct ggtgctgagg actcacccgc 780
ttctgcaggg gctcctcggc ccgtctccga accacatgac ccagcgggtg cctt 834
<210> 165
<211> 3759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 165
aaggcacccg ctgggtcatg tggttcggag acggacattg aggctcccac aggagatgca 60
gatgtctgga aagcagaggg aggggatggg gtgagagtgc cagagttccc aggcaacaaa 120
cttaccctca atgttccggc acttctgccg cacctcgtac accagccgct ctgcaagggg 180
aggagagctg gcgtcagagg tgccaccctc tccagaagca ggccaactac ctcttgtgcg 240
ctcatcaata atctccttga ccttgggctt ctccgctgtg ctcttccggg gctttttggc 300
tggtggaggt ggtgcgtagg cagctgcctc aggttccacc cacatgtccg tgtacacttc 360
tttgtaggga ttcttctctt ctggaggagg aaagcaggtg ccaaggtcag ggtcccagaa 420
agctgggtgc cctcatttac cttctggtgg ctccaggccc ttagggccag aaggctggaa 480
gccccccagg gcccattcaa tcatgggctt gttctgcacc tccacggcct tggcagtgtc 540
actctcatcg ctgtcgtggc acaccgggaa cagcttcccc gcgcggctgc tggccacctg 600
gagggtgaca cgccagggtt ggggttgctc ctccgagctc ccagcaggga cactcacctg 660
caggacctcg tagatggctt tgcggtacat gggctgcttg ttgtacgtgg cctggtggaa 720
cgcactgcaa aacgagctca gcggcatcag cttctcaaca cacacctggg gggacaagcc 780
aggccttgtt tgccgcccag gctactgcca aaccccacaa cttaccactg agaatgcgat 840
cgcggggttg gggttgcgcc ttttccaagg cagccctggg tttgcgcagg gacgcggctg 900
ctctgggcgt ggttccggga aacgcagcgg cgccgaccct gggtctcgca cattcttcac 960
gtccgttcgc agcgtcaccc ggatcttcgc cgctaccctt gtgggccccc cggcgacgct 1020
tcctgctccg cccctaagtc gggaaggttc cttgcggttc gcggcgtgcc ggacgtgaca 1080
aacggaagcc gcacgtctca ctagtaccct cgcagacgga cagcgccagg gagcaatggc 1140
agcgcgccga ccgcgatggg ctgtggccaa tagcggctgc tcagcagggc gcgccgagag 1200
cagcggccgg gaaggggcgg tgcgggaggc ggggtgtggg gcggtagtgt gggccctgtt 1260
cctgcccgcg cggtgttccg cattctgcaa gcctccggag cgcacgtcgg cagtcggctc 1320
cctcgttgac cgaatcaccg acctctctcc ccagggggat catcgaatta cctctagagc 1380
caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 1440
ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 1500
ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 1560
caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 1620
gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 1680
cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 1740
cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 1800
gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 1860
gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 1920
cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 1980
ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 2040
ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 2100
gtaagtcgac atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac 2160
tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt 2220
gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat 2280
gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca 2340
acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc 2400
cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg 2460
gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcct 2520
tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct 2580
tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt 2640
ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct 2700
gctgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2760
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 2820
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 2880
tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggaccc agcgggtgcc 2940
ttcagctgct cggctccggc ccgtcatcca ccaagacaca atgcggcctg gccaccagga 3000
gaagccccgc agtttccccc acaccagctc cccaatgcca aagccccggc cgtcctggag 3060
ccccaaggag cagaaatcat tacactggcc acggctggtg aagaagccgc tcacctcgta 3120
ctctggctcg tcatcgcctg ctttggtggc attcttgtcc ccagcatcgg accccacggg 3180
ctcaggcgtg gtagccacag tgggggatgc ggggtcagtg ggctgctgca cagcaggagg 3240
gctggcctcc tccaccttct gagactcccc gggcccctgg ttttcttcca cagcattcat 3300
tcctgcaatg accttggctt tcttctcagc ctggggaaac aaaaaacaaa aagtcacctt 3360
ggctggggcc caggccagaa ggcgcctcac ctcccttttc cagcgtgcca gccactcgtc 3420
ccgcttgcgc ttgctgatgt agtaggggtc ccccgcctgg aaggtgagcc tcggcatggg 3480
ccgctgacgg aggctggact cccagcccaa gccaccccgc agccggcccc gggagcccta 3540
ggacagagag acagacatta gggcattcca cagagcccct gggggtggaa cacttgcctc 3600
cattttcatg gattcgatgt tggtctcctt ctgttctttg cctgtggaga gggaagaaca 3660
aagggaccag taagaggctg cccctggtgc tgaggactca cccgcttctg caggggctcc 3720
tcggcccgtc tccgaaccac atgacccagc gggtgcctt 3759

Claims (113)

1.修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：
编码转录调节子的基因座中的插入和/或缺失，其中所述插入和/或缺失能够下调所述内源转录调节子的基因表达；和
对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
2.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述基因座中的插入和/或缺失由CRISPR相关系统介导。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的修饰的细胞，其中所述基因座中的插入和/或缺失由CRISPR/Cas9介导。
4.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中所述转录调节子是转录因子或表观遗传调节子。
5.根据权利要求4所述的修饰的细胞，其中所述转录因子是SIX2或KLF4。
6.根据权利要求5所述的修饰的细胞，其中所述转录因子是SIX2。
7.根据权利要求6所述的修饰的细胞，其中编码SIX2的所述基因座中的插入和/或缺失能够下调SIX2的基因表达，和/或下调SIX2的一个或多个下游目标的基因表达。
8.根据权利要求5所述的修饰的细胞，其中所述转录因子是KLF4。
9.根据权利要求8所述的修饰的细胞，其中编码KLF4的所述基因座中的插入和/或缺失能够下调KLF4的基因表达，和/或下调KLF4的一个或多个下游目标的基因表达。
10.根据权利要求4所述的修饰的细胞，其中所述表观遗传调节子是组蛋白甲基化的调节子。
11.根据权利要求10所述的修饰的细胞，其中所述组蛋白甲基化的调节子是组蛋白甲基转移酶复合物的组分。
12.根据权利要求11所述的修饰的细胞，其中所述组蛋白甲基转移酶复合物的组分是组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶2D(KMT2D)。
13.根据权利要求11所述的修饰的细胞，其中所述组蛋白甲基转移酶复合物的组分是PAGR1。
14.根据权利要求13所述的修饰的细胞，其中编码PAGR1的所述基因座中的插入和/或缺失能够下调PAGR1的基因表达，和/或下调PAGR1相关组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标的基因表达。
15.根据权利要求14所述的修饰的细胞，其中所述PAGR1相关组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标选自ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3和TNFAIP3。
16.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中所述外源TCR选自野生型TCR、高亲和力TCR和嵌合TCR。
17.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中所述外源TCR包含至少一个二硫键。
18.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中所述外源TCR包含TCRα链和TCRβ链。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的修饰的细胞，其中所述外源CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
20.根据权利要求19所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域选自抗体、scFv和Fab。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的修饰的细胞，进一步包含铰链结构域。
22.根据权利要求21所述的修饰的细胞，其中所述铰链结构域选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链结构域、包含CD8的氨基酸序列的铰链或其任何组合。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的修饰的细胞，其中所述跨膜结构域选自人工疏水序列和I型跨膜蛋白的跨膜结构域、T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、和CD154。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的修饰的细胞，其中所述胞内结构域包含至少一种选自下列的共刺激结构域：TNFR超家族中蛋白质的共刺激结构域、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C和B7-H3。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的修饰的细胞，其中所述胞内结构域包含选自下列的胞内结构域：人CD3ζ链的胞质信号传导结构域、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、带有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞质受体、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
26.修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：
编码选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的蛋白质的一个或多个基因座中的插入和/或缺失，其中所述插入和/或缺失能够下调一个或多个内源基因的基因表达；和
对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
27.修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：
编码选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的蛋白质的一个或多个基因座中的插入和/或缺失，其中所述插入和/或缺失能够下调一个或多个内源基因的基因表达；和
对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
28.修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：
编码选自KLF4、PAGR1和SIX2的蛋白质的一个或多个基因座中的插入和/或缺失，其中所述插入和/或缺失能够下调一个或多个内源基因的基因表达；和
对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
29.修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：
编码KLF4的基因座中的插入和/或缺失，其中所述插入和/或缺失能够下调内源KLF4的基因表达；和
对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
30.修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：
编码SIX2的基因座中的插入和/或缺失，其中所述插入和/或缺失能够下调内源SIX2的基因表达；和
对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
31.修饰的免疫细胞或其前体细胞，包含：
编码PAGR1的基因座中的插入和/或缺失，其中所述插入和/或缺失能够下调内源PAGR1的基因表达；和
对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
32.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中目标细胞上的所述抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
33.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是自体细胞。
34.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞源自人。
35.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是修饰的T细胞。
36.用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：
a)将包含核酸序列的第一核酸引入所述免疫细胞中，所述核酸序列编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将能够下调内源转录调节子的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述内源转录调节子是转录因子或表观遗传调节子。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述转录因子是SIX2或KLF4。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中下调所述转录因子的基因表达导致SIX2的基因表达下调和/或SIX2的一个或多个下游目标的基因表达下调。
40.根据权利要求37或38所述的方法，其中下调所述转录因子的基因表达导致KLF4的基因表达下调和/或KLF4的一个或多个下游目标的基因表达下调。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述表观遗传调节子是组蛋白甲基化的调节子。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述组蛋白甲基化的调节子是组蛋白甲基转移酶复合物的组分。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶复合物的组分是组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶2D(KMT2D)。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述组蛋白甲基转移酶复合物的组分是PAGR1。
45.根据权利要求44所述的方法，其中下调所述组蛋白甲基转移酶复合物的组分的基因表达导致PAGR1的基因表达下调和/或所述PAGR1相关组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标的基因表达下调。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述PAGR1相关组蛋白甲基转移酶复合物的一个或多个下游目标选自ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3和TNFAIP3。
47.用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：
a)将包含核酸序列的第一核酸引入所述免疫细胞中，所述核酸序列编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将能够下调选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
48.用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：
a)将包含核酸序列的第一核酸引入所述免疫细胞中，所述核酸序列编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将能够下调选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
49.用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：
a)将包含核酸序列的第一核酸引入所述免疫细胞中，所述核酸序列编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将能够下调选自KLF4、PAGR1和SIX2的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
50.用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：
a)将包含核酸序列的第一核酸引入所述免疫细胞中，所述核酸序列编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将能够下调内源KLF4的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
51.用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：
a)将包含核酸序列的第一核酸引入所述免疫细胞中，所述核酸序列编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将能够下调内源SIX2的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
52.用于生成修饰的免疫细胞或其前体细胞的方法，包括：
a)将包含核酸序列的第一核酸引入所述免疫细胞中，所述核酸序列编码对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将能够下调内源PAGR1的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
53.根据权利要求36-52中任一项所述的方法，其中通过病毒转导引入所述第一核酸。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述病毒转导包括使所述细胞与包含所述第一核酸的病毒载体接触。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体。
56.根据权利要求36-53中任一项所述的方法，其中能够下调基因表达的所述一种或多种多肽和/或核酸中的每一个包含CRISPR相关系统。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述CRISPR相关系统包含CRISPR核酸酶和引导RNA。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述引导RNA包含与内源基因的目标序列充分互补的引导序列。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶和所述引导RNA包含核糖核蛋白(RNP)复合物。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述目标序列在所述PAGR1基因内并且包含SEQID NO:31-36中任一项所示的核酸序列。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述目标序列在所述SIX2基因内并且其中所述引导RNA包含SEQ ID NO:37-42中任一项所示的核酸序列。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述目标序列在所述Klf4基因内并且其中所述引导RNA包含SEQ ID NO:43-48中任一项所示的核酸序列。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述目标序列在所述USP27X基因内并且其中所述引导RNA包含SEQ ID NO:49-54中任一项所示的核酸序列。
64.根据权利要求58所述的方法，其中所述目标序列在所述CEACAM19基因内并且其中所述引导RNA包含SEQ ID NO:55-60中任一项所示的核酸序列。
65.根据权利要求58所述的方法，其中所述目标序列在所述C1orf141基因内并且其中所述引导RNA包含SEQ ID NO:61-66中任一项所示的核酸序列。
66.根据权利要求58所述的方法，其中所述引导序列包含SEQ ID NO:31-66中任一项所示的核酸序列。
67.根据权利要求57所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶和/或所述引导RNA由多核苷酸编码。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述多核苷酸包含载体和/或合成mRNA。
69.根据权利要求36-68中任一项所述的方法，其中能够下调基因表达的所述一种或多种多肽和/或核酸中的每一个通过电穿孔引入。
70.根据权利要求36-69中任一项所述的方法，其中目标细胞上的所述抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
71.根据权利要求36-70中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是自体细胞。
72.根据权利要求36-71中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞源自人。
73.根据权利要求36-72中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是修饰的T细胞。
74.用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源转录调节子的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
75.用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
76.用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
77.用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调选自KLF4、PAGR1和SIX2的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
78.用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源KLF4的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
79.用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源SIX2的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
80.用于增强修饰的免疫细胞或其前体细胞的功能的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源PAGR1的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
81.根据权利要求74-80中任一项所述的方法，其中所述功能是肿瘤浸润。
82.根据权利要求74-80中任一项所述的方法，其中所述功能是肿瘤杀伤。
83.根据权利要求74-80中任一项所述的方法，其中所述功能是对免疫抑制的抗性。
84.根据权利要求74-80中任一项所述的方法，其中所述功能是对PD-1、LAG-3、TIM-3、和/或CTLA-4的免疫抑制的抗性。
85.用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源转录调节子的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
86.用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调选自AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
87.用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调选自C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2和USP27X的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
88.用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调选自KLF4、PAGR1和SIX2的一个或多个内源基因的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
89.用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源KLF4的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
90.用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源SIX2的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
91.用于抑制修饰的免疫细胞或其前体细胞的活化诱导的细胞死亡的方法，其中所述修饰的细胞包含对目标细胞上的抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括：
将能够下调内源PAGR1的基因表达的一种或多种多肽和/或核酸引入所述免疫细胞中。
92.根据权利要求74-91中任一项所述的方法，其中目标细胞上的所述抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
93.根据权利要求74-92中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是自体细胞。
94.根据权利要求74-93中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞源自人。
95.根据权利要求74-94中任一项所述的方法，其中所述修饰的细胞是修饰的T细胞
96.用于鉴定在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强的基因的方法，包括下列步骤：
a)将编码对抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的核酸文库引入多个免疫细胞中，从而产生多个修饰的免疫细胞；
b)将靶向多个内源基因的多种试剂引入所述多个修饰的免疫细胞中，从而生成多个编辑的免疫细胞；
c)使所述多个编辑的免疫细胞与肿瘤细胞接触；
d)选择表现出免疫细胞功能增强的一个或多个编辑的免疫细胞；和
e)鉴定在步骤d)的所述一个或多个编辑的免疫细胞中被下调的所述内源基因，从而鉴定在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强的基因。
97.根据权利要求96所述的方法，其中步骤a)和b)同时进行。
98.权利要求97所述的方法，其中步骤b)中的所述多种试剂各自包含编码独特引导RNA的核酸，所述独特引导RNA靶向所述多个内源基因中的每一个。
99.根据权利要求96-98中任一项所述的方法，其中步骤b)中的所述多种试剂各自包含CRISPR核酸酶多肽或编码CRISPR核酸酶的核酸。
100.根据权利要求96-99中任一项所述的方法，步骤b)中的所述多种试剂各自包含CRISPR相关系统。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述CRISPR相关系统包含CRISPR核酸酶和引导RNA。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述引导RNA包含与调控所述免疫细胞的功能的基因的目标序列充分互补的引导序列。
103.根据权利102所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶和所述引导RNA包含核糖核蛋白(RNP)复合物。
104.根据权利要求98-103中任一项所述的方法，其中所述鉴定步骤e)包括鉴定靶向所述下调基因的所述独特引导RNA。
105.用于鉴定在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强的基因的方法，包括下列步骤：
a)将核酸文库引入多个免疫细胞中，所述核酸文库编码对抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)，并且编码各自靶向多个内源基因中的每一个的独特区域的多个引导RNA，从而生成多个修饰的免疫细胞；
b)将CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的核酸引入所述多个修饰的免疫细胞中，从而生成多个编辑的免疫细胞，其中所述多个内源基因的基因表达被下调；
c)使所述多个编辑的免疫细胞与肿瘤细胞接触；
d)选择表现出免疫细胞功能增强的一个或多个编辑的免疫细胞；和
e)鉴定在步骤d)的所述一个或多个编辑的免疫细胞中被下调的所述内源基因，从而鉴定在下调时导致免疫细胞或其前体细胞的功能增强的基因。
106.根据权利要求96-105中任一项所述的方法，其中所述接触步骤c)包括使所述多个编辑的免疫细胞与包含所述肿瘤细胞的肿瘤细胞系接触。
107.根据权利要求96-105中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括将所述多个编辑的免疫细胞给予包含所述肿瘤细胞的带肿瘤生物体中。
108.包含一个或多个核酸的核酸文库，其中所述一个或多个核酸中的每一个包含：
第一核酸，所述第一核酸编码独特引导RNA；和
第二核酸，所述第二核酸编码对抗原具有亲和力的外源T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。
109.根据权利要求108所述的核酸文库，其中所述第一核酸包含与内源基因的目标序列充分互补的引导序列。
110.根据权利要求108或109所述的核酸文库，其中所述一个或多个核酸中的每一个是载体。
111.根据权利要求110所述的核酸文库，其中所述载体中的每一个包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含与所述第一核酸可操作地连接的第一启动子，所述第二表达盒包含与所述第二核酸可操作地连接的第二启动子。
112.根据权利111所述的核酸文库，其中所述第二表达盒进一步包含编码选择性标记物的多核苷酸序列。
113.根据权利要求112所述的核酸文库，其中所述选择性标记物是荧光蛋白。
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