JP2024505672A - 免疫療法のためのナチュラルキラー細胞受容体2b4組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
2B4遺伝子内で編集するための、例えば、DNA配列を改変するための組成物及び方法が提供される。免疫療法のための組成物及び方法が提供される。【選択図】図1A
Description
本出願は、2021年2月8日に出願された米国仮出願第63/147,226号の米国特許法第119条(e)に基づく利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、2022年1月31日に作成された「01155-0042-00PCT_Seq_List_ST25.txt」と題するファイルとして提供され、サイズは133,099バイトである。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
緒言及び概要
T細胞疲弊は、慢性抗原刺激に対するT細胞の応答を説明するために使用されてきた広義の用語である。これは、慢性ウイルス感染の設定において最初に観察されたが、腫瘍に対する免疫応答においても研究されてきた。T細胞疲弊機序の特性及び特徴は、チェックポイント遮断及び養子T細胞移植療法の成功に決定的な意味を有し得る。
T細胞疲弊は、慢性抗原刺激に対するT細胞の応答を説明するために使用されてきた広義の用語である。これは、慢性ウイルス感染の設定において最初に観察されたが、腫瘍に対する免疫応答においても研究されてきた。T細胞疲弊機序の特性及び特徴は、チェックポイント遮断及び養子T細胞移植療法の成功に決定的な意味を有し得る。
T細胞疲弊は、慢性感染症及びがんの特徴である、長期の抗原刺激によるエフェクター機能の進行性の喪失である。連続的な抗原刺激に加えて、微小環境に存在する抗原提示細胞及びサイトカインもまた、この疲弊した表現型に寄与し得る。したがって、T細胞疲弊は、T細胞のエフェクター機能が低下し、阻害性受容体の発現が持続するT細胞機能不全の状態である。これにより、感染症または腫瘍の最適な制御が妨げられる。さらに、疲弊したT細胞は、機能性エフェクターまたはメモリーT細胞の転写状態とは異なる転写状態を有する。治療的処置は、疲弊したT細胞を救出する可能性を有する(Goldberg,M.V.&Drake,C.G.,2011,Wherry,E.J.&Kurachi M.,2015)。
疲弊したT細胞は、典型的には、プログラム細胞死1(PDCD1またはPD-1)などの共阻害性受容体を発現する。遺伝子産物は、免疫チェックポイント系の構成要素として作用する。T細胞疲弊は、これらの受容体を遮断することによって逆転され得る。
ナチュラルキラー細胞受容体2B4(CD244としても知られる)は、シグナルリンパ球活性化分子(SLAM)ファミリーにおける免疫調節性膜貫通受容体である。2B4発現は、例えば、ナチュラルキラー細胞、T細胞、樹状細胞、好塩基球、単球、及び骨髄由来のサプレッサー細胞を含む、様々な細胞において示されている。以前の研究は、特定の免疫細胞上の2B4発現が特定の病理学的条件下で変化することを実証した。続いて、2B4阻害は、例えば、慢性感染及びがんにおけるT細胞における疲弊した表現型の維持に関連付けられている。Agresta et al.,Front.Immunol.9:2809,2018。
例えば、例えば、CRISPR/Cas系を使用して生成された2B4配列、例えば、ゲノム遺伝子座における遺伝子修飾(例えば、挿入、欠失、置換)を有する細胞の調製方法において、使用するための化合物及び組成物、ならびに2B4配列における遺伝子修飾を有する細胞、及び例えば、免疫腫瘍学及び感染症における、例えば、免疫応答を促進するための様々な方法におけるそれらの使用を本明細書に提供する。2B4発現を低減し得る2B4遺伝子修飾を有する細胞は、TCR発現を低減するT細胞受容体(TCR)遺伝子座、例えば、TRACまたはTRBC遺伝子座;MHCクラスI分子の発現を低減するゲノム遺伝子座、例えば、B2M及びHLA-A遺伝子座;MHCクラスII分子の発現を低減するゲノム遺伝子座、例えば、CIITA遺伝子座;ならびにチェックポイント阻害剤遺伝子座、例えば、LAG3遺伝子座、TIM3遺伝子座、及びPD-1遺伝子座を含む、追加のゲノム配列における遺伝子修飾を含み得る。本開示は、2B4配列の遺伝子修飾を有する細胞、及び任意選択で本明細書に提供される他のゲノム遺伝子座を含む細胞集団に関する。細胞は、養子T細胞移植療法において使用されてもよい。本開示は、治療、例えば、がん治療及び免疫療法で使用するための2B4配列の遺伝子修飾を伴う細胞の組成物及び使用に関する。本開示は、gRNA分子、CRISPR系、細胞、及び細胞のゲノム編集に有用な方法に関する。
chr1:160830160-160862887のゲノム座標内に、ヒト2B4配列における遺伝子修飾を含む、操作された細胞が本明細書に提供される。さらなる実施形態が、特許請求の範囲及び図面全体を通して提供され、記載される。
対象を治療するための医薬の調製のための、上記実施形態のいずれかに記載の組成物または製剤の使用も開示される。対象は、ヒトまたは動物(例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、カニクイザル)であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
2B4遺伝子配列に遺伝子修飾(例えば、挿入、置換、または欠失)をもたらす際に使用するための、上記組成物または製剤のうちのいずれかも開示される。特定の実施形態では、配列内の遺伝子修飾は、ゲノム遺伝子座の遺伝子修飾の前に、例えば、フレームシフトまたはナンセンス変異を形成することによって、全長タンパク質の翻訳を防止する核酸配列の変化をもたらし、その結果、翻訳は早期に終結する。遺伝子修飾は、スプライス部位、すなわち、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位における挿入、置換、または欠失を含むことができ、その結果、異常なスプライシングは、フレームシフト変異、ナンセンス変異、または切断されたmRNAをもたらし、その結果、翻訳は早期に終結する。遺伝子修飾はまた、コードされたタンパク質の翻訳または折り畳みを妨害し、早期の翻訳終結をもたらす可能性がある。
配列内の遺伝子修飾の生成に使用するために本明細書で提供される組成物は、好ましくは、配列からのタンパク質の発現、例えば、タンパク質の細胞表面発現の低減をもたらす。
別の態様では、本発明は、対象に免疫療法を提供する方法であって、本明細書に記載される有効量の細胞、例えば、前述の細胞態様及び実施形態のうちのいずれかの細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。
方法の実施形態では、方法は、本明細書に記載される細胞または細胞集団を投与する前のリンパ枯渇を含む。方法の実施形態では、方法は、本明細書に記載される有効量の細胞、例えば、前述の細胞態様及び実施形態のうちのいずれかの細胞を対象に投与する前に、リンパ消耗剤または免疫抑制剤を投与することを含む。別の態様では、本発明は、細胞(例えば、細胞集団)を調製する方法を提供する。
免疫療法は、免疫系を活性化または抑制することによる疾患の治療である。免疫応答を誘発または増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法として分類される。細胞ベースの免疫療法は、いくつかのがんの治療に有効であることが実証されている。リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)などの免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞の表面に発現する異常な抗原に応答して作用するようにプログラムすることができる。したがって、がん免疫療法は、免疫系の成分が腫瘍または他のがん細胞を破壊するのを可能にする。
免疫療法はまた、慢性感染症、例えば、B型肝炎及びC型肝炎ウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症、結核感染症、ならびにマラリア感染症の治療に有用であり得る。トランスジェニックTCRまたはCARなどの標的化受容体を含む免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載されるものなどの免疫療法において有用である。
別の態様では、本発明は、免疫療法のための細胞(例えば、細胞集団)を調製する方法であって、(a)例えば、本明細書に開示されるgRNA分子(本明細書に記載される)、または2つ以上のgRNA分子を当該細胞に導入することによって、T細胞受容体(TCR)の1つ以上または全ての構成要素の発現を低減または排除することによって細胞を修飾することと、(b)当該細胞を増殖することと、を含む、方法を提供する。本発明の細胞は、例えば、標的化受容体、例えば、TCR/CD3ゼータ鎖シグナル伝達を媒介するポリペプチドをコードする異種配列の導入によるさらなる操作に好適である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非内因性TCRまたはCAR配列から選択される標的化受容体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型またはバリアントTCRである。本発明の細胞はまた、代替の抗原結合部分をコードする異種配列の導入、例えば、代替の(非内因性)T細胞受容体、例えば、特定のタンパク質を標的とするように操作されたキメラ抗原受容体(CAR)をコードする異種配列の導入による、さらなる操作にも好適であり得る。CARは、キメラ免疫受容体、キメラT細胞受容体または人工T細胞受容体としても知られている。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞を調製する方法、例えば、細胞を調製する方法の前述の態様及び実施形態のうちのいずれかの方法によって調製された細胞(例えば、細胞集団)を投与することを含む、対象を治療する方法を提供する。
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本教示を様々な実施形態と併せて記載するが、本教示をそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替、改変物、及び均等物を包含する。
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「コンジュゲート(a conjugate)」への言及は、複数のコンジュゲートを含み、「細胞(a cell)」への言及は、複数の細胞(例えば、細胞集団)を含む等である。
数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値及び測定可能な値は、有意な桁及び測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも103、104、105、または106個の細胞、好ましくは107、2×107、5×107、または108個の細胞の集団を指す。
「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含有する(contain)」、「含有する(contains)」、「含有する(containing)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、及び「含む(including)」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と、以下の詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む(comprising)」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む(comprising)」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む(comprising)」ものであると想定される(この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない)。
「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、明細書において包括的な意味で、すなわち、「及び/または」に等しい意味で使用される。
「約」という用語は、リストの前に使用されると、リストの各メンバーを修飾する。「約」という用語は、当該技術分野内の許容される変動または誤差、例えば、平均からの2標準偏差、または測定を行うために使用される方法の感度を包含すると理解される。「約」が数列の第1の値の前に存在するとき、数列の各値を修飾することが理解され得る。
範囲は、その範囲の最後の数値及びその間の全ての論理値を含むと理解される。例えば、5~10個のヌクレオチドは、5、6、7、8、9、または10個のヌクレオチドとして理解され、5~10%は、5%及び10%までの全ての可能な値を含有すると理解される。
20ヌクレオチド配列の少なくとも17個のヌクレオチドは、提供される配列の17、18、19、または20個ヌクレオチドを含むと理解され、したがって明確に理解されるため、1つが特異的に提供されなくても上限を提供する。同様に、最大3個のヌクレオチドは、0、1、2、または3個のヌクレオチドを包含すると理解され、1つが特異的に提供されなくても下限を提供する。「少なくとも」、「最大」、または他の同様の言語が数字を修飾するとき、数列の各数字を修飾することが理解され得る。
本明細書で使用される場合、「それ以下」または「それ未満」は、語句に隣接する値、及び文脈から論理的であるように、ゼロまでの論理的により低い値または整数として理解される。例えば、「2個以下のヌクレオチド塩基対」の二重鎖領域は、2、1、または0個のヌクレオチド塩基対を有する。一連の数字または範囲の前に「以下」または「未満」が存在する場合、一連または範囲内の数字の各々が修飾されることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、範囲は、上限及び下限の両方を含む。
本出願における配列と、指示された受入番号または受入番号における位置との間に矛盾が生じた場合、本出願における配列が優勢である。
化学名と構造との間に矛盾がある場合、構造が優勢である。
本明細書で使用される場合、「分析物を検出する」等は、存在する場合、分析物を検出することができるアッセイを実施することとして理解され、分析物は、アッセイの検出レベルを上回る量で存在する。
本明細書で使用される場合、値の最大量が100%(例えば、100%阻害または100%カプセル化)で表される場合、値は検出方法によって制限されることが理解される。例えば、100%阻害は、アッセイの検出レベルを下回るレベルへの阻害として理解され、100%カプセル化は、カプセル化のために意図された材料を小胞の外側で検出することができないとして理解される。
本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のものに過ぎず、決して所望の主題を限定すると解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の材料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。
I.定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体(従来のRNA、DNA、混合RNA-DNA、及びそれらの類似体であるポリマーを含む)を含む、多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド-核酸結合(「ペプチド核酸」またはPNA、PCT第95/32305号)、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、2’メトキシまたは2’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。RNAは、例えば、修飾として、1つ以上のデオキシリボースヌクレオチドを含み得、同様に、DNAは、1つ以上のリボヌクレオチドを含み得る。窒素系塩基は、従来の塩基(A、G、C、T、U)、その類似体(例えば、5-メトキシウリジン、シュードウリジン、もしくはN1-メチルシュードウリジンなどの修飾ウリジン);イノシン;プリンもしくはピリミジンの誘導体(例えば、N4-メチルデオキシグアノシン、デアザ-もしくはアザ-プリン、デアザ-もしくはアザ-ピリミジン、5位もしくは6位に置換基を有するピリミジン塩基(例えば、5-メチルシトシン)、2、6、もしくは8位に置換基を有するプリン塩基、2-アミノ-6-メチルアミノプリン、O6-メチルグアニン、4-チオ-ピリミジン、4-アミノ-ピリミジン、4-ジメチルヒドラジン-ピリミジン、及びO4-アルキル-ピリミジン;米国特許第5,378,825号及びPCT第WO93/13121号)であってもよい。一般的な考察については、The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36、Adams et al.編集、第11版、1992を参照)。核酸は、骨格がポリマーの位置(複数可)に窒素系塩基を含まない1つ以上の「脱塩基」残基を含み得る(米国特許第5,585,481号)。核酸は、従来のRNAもしくはDNA糖、塩基及び連結のみを含むことができるか、または従来の構成要素及び置換の両方(例えば、2’メトキシ置換基を有する従来のヌクレオシド、または従来のヌクレオシド及び1つ以上のヌクレオシド類似体の両方を含有するポリマー)を含むことができる。核酸は、RNA模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なRNA及びDNA配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、1つ以上のLNAヌクレオチドモノマーを含有する類似体である「ロックド核酸」(LNA)を含む(Vester and Wengel,2004,Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA及びDNAは異なる糖部分を有し、RNA内のウラシルもしくはその類似体及びDNA内のチミンもしくはその類似体の存在によって異なり得る。
「ガイドRNA」、「gRNA」、及び単に「ガイド」は、例えば、単一ガイドRNA、またはcrRNA及びtrRNAの組み合わせ(tracrRNAとしても知られる)のいずれかを指すために、本明細書で互換的に使用される。crRNA及びtrRNAは、単一RNA分子(単一ガイドRNA、sgRNA)として会合し得るか、または例えば、2つの別々のRNA鎖(デュアルガイドRNA、dgRNA)において会合し得る。「ガイドRNA」または「gRNA」は、各々のタイプを指す。trRNAは、天然に存在する配列、または修飾もしくは変化を伴うtrRNA配列であり得る。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、RNAガイドDNA結合剤による結合または修飾(例えば、切断)のための標的配列に対してガイドRNAを指向させるように機能する、ガイドRNA内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Streptococcus pyogenes(すなわち、Spy Cas9)及び関連するCas9ホモログ/オルソログの場合、20塩基対の長さであり得る。例えば、15、16、17、18、19、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号1~86から選択される配列の少なくとも17、18、19、もしくは20個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、例えば、ガイド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも75%、80%、85%、90%、もしくは95%であるか、または100%である。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号1~86から選択される配列の少なくとも17、18、19、もしくは20個の連続ヌクレオチドに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%、または100%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、100%相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列及び標的領域とは、参照配列に応じて、少なくとも1個のミスマッチ、すなわち、同一ではないか、または相補的ではない1個のヌクレオチドを含有していてもよい。例えば、ガイド配列及び標的配列は、1、2、3、または4個のミスマッチを含有していてもよく、標的配列の全長は、17、18、19、20個、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、1~4個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、少なくとも17、18、19、20個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、1、2、3、または4個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、20個のヌクレオチドを含む。すなわち、ガイド配列及び標的領域は、17、18、19、20個、またはそれ以上の塩基対を有する二重鎖領域を形成してもよい。特定の実施形態では、二重鎖領域は、1、2、3、または4個のミスマッチを含んでもよく、その結果、ガイド鎖及び標的配列は完全に相補的ではない。例えば、ガイド鎖及び標的配列は、2個のミスマッチを含む、20を超えるヌクレオチド領域にわたって相補的であってもよく、その結果、ガイド配列及び標的配列は、90%相補的であり、20個のうち18個の塩基対の二重鎖領域を提供する。
RNAガイドDNA結合剤の核酸基質は二本鎖核酸であるため、RNAガイドDNA結合剤の標的配列は、ゲノムDNAのプラス鎖とマイナス鎖(すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体)の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖に結合するようにガイドRNAを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるUのTへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド(例えば、PAMを含まない標的配列)と同一である。
本明細書で使用される場合、「RNAガイドDNA結合剤」は、RNA及びDNA結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のDNA結合サブユニットを意味し、DNA結合活性は、配列特異的であり、RNAの配列に依存する。例示的なRNAガイドDNA結合剤には、Casクリベース(cleavase)/ニッカーゼ及びその不活性化形態(dCas DNA結合剤」)が含まれる。本明細書で使用されるとき、「Casヌクレアーゼ」は、Casクリベース、Casニッカーゼ、及びdCas DNA結合剤を包含する。dCas DNA結合剤は、非機能性ヌクレアーゼドメイン(RuvCまたはHNHドメイン)を含む不活性型ヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、CasクリベースまたはCasニッカーゼは、例えば、FokIドメインとの融合を介して、DNA切断を可能にするように修飾されたdCas DNA結合剤を包含する。Casクリベース/ニッカーゼ及びdCas DNA結合剤には、III型CRISPRシステムのCsmまたはCmr複合体、そのCas10、Csm1、またはCmr2サブユニット、I型CRISPR系のカスケード複合体、そのCas3サブユニット、及びクラス2 Casヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス2 Casヌクレアーゼ」は、RNAガイドDNA結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス2 Casヌクレアーゼには、さらにRNAガイドDNAクリベースまたはニッカーゼ活性を有するクラス2 Casクリベース/ニッカーゼ(例えば、H840A、D10A、またはN863Aバリアント)、及びクリベース/ニッカーゼ活性が不活性化されている、クラス2 dCas DNA結合剤が含まれる。クラス2 Casヌクレアーゼには、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例えば、N497A、R661A、Q695A、Q926Aバリアント)、HypaCas9(例えば、N692A、M694A、Q695A、H698Aバリアント)、eSPCas9(1.0)(例えば、K810A、K1003A、R1060Aバリアント)、及びeSPCas9(1.1)(例えば、K848A、K1003A、R1060Aバリアント)タンパク質、ならびにそれらの修飾物が含まれる。Cpf1タンパク質、Zetsche et al.,Cell,163:1-13(2015)は、Cas9と相同であり、RuvC様ヌクレアーゼドメインを含む。ZetscheのCpf1配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Zetscheの表S1及びS3を参照のこと。例えば、Makarova et al.,Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)、Shmakov et al.,Molecular Cell,60:385-397(2015)を参照のこと。
Cas9分子の例示的なヌクレオチド及びポリペプチド配列を以下に提供する。代替の天然に存在するバリアントを含む、Cas9ポリペプチド配列をコードする代替のヌクレオチド配列を同定するための方法は、当該技術分野において既知である。本明細書に提供されるアミノ酸配列をコードするCas9核酸配列、アミノ酸配列、または核酸配列のうちのいずれかに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列も企図される。
Cas9の例示的なオープンリーディングフレーム(配列番号120)
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Cas9の例示的なアミノ酸配列(配列番号121)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
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Cas9の例示的なオープンリーディングフレーム(配列番号122)
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本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」(RNP)または「RNP複合体」は、RNAガイドDNA結合剤、例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Casクリベース、Casニッカーゼ、またはdCas DNA結合剤(例えば、Cas9)とともに含むガイドRNAを指す。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、Cas9などのRNAガイドDNA結合剤を標的配列へとガイドし、ガイドRNAは、標的配列とハイブリダイズし、薬剤が標的配列に結合し、その場合、この薬剤はクリベースまたはニッカーゼであり、結合の後に切断またはニッキングを行うことができる。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、gRNAのガイド配列に対して相補性を有する、すなわち、ガイド配列に対してガイド配列の特異的結合を可能にするのに十分に相補的である、標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、RNAガイドDNA結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に(薬剤の活性に応じて)ニックを形成するか、または切断するように指向される。
本明細書で使用される場合、第2の配列に対する第1の配列のアラインメントにより、第2の配列の位置の全体での全てが第1の配列によって一致することが示される場合、第1の配列は、第2の配列と「同一」であるか、または「100%の同一性を有する」とみなされる。例えば、配列AAGAは、配列AAGに対して100%の同一性を有するが、その理由は、アラインメントが、第1の配列の3つの全ての位置においてギャップなしで一致があるという点で100%の同一性を与えるからである。100%未満の同一性は、通常の方法を使用して計算することができる。例えば、第1の配列の3つの位置のうちの2つが第2の配列と一致するため、ACGは、AAGAと67%の同一性を有するであろう(2/3=67%)。RNAとDNAとの間の差(一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆)、及び修飾ウリジンなどのヌクレオシド類似体の存在は、関連するヌクレオチド(チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど)が同じ相補体(例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン;別の例は、シトシン及び5-メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する)を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Xがいずれかの修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、または5-メトキシウリジンである配列5’-AXGは、両方とも同じ配列(5’-CAU)に完全に相補的である点において、AUGと100%同一であるとみなされる。例示的なアラインメントアルゴリズムは、当該技術分野において周知である、Smith-Waterman及びNeedleman-Wunschアルゴリズムである。当業者は、アラインメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズム及びパラメータ設定の選択が適切であるかを理解するであろう。一般的に類似する長さ及び予想される同一性がアミノ酸については50%超の配列、またはヌクレオチドについては75%超の配列に関して、www.ebi.ac.ukウェブサーバでEBIによって提供されるNeedleman-Wunschアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いたNeedleman-Wunschアルゴリズムが一般的に適切である。
同様に、本明細書で使用される場合、第1の配列のヌクレオチドの全てが、ギャップなしで第2の配列に対して相補的であるとき、第1の配列は、第2の配列に対して「完全に相補的」または100%相補的」であるとみなされる。例えば、配列UCUは、ギャップなしで、第1の配列からの核酸塩基の各々が第2の配列のヌクレオチドと塩基対合しているため、配列AAGAに対して完全に相補的であるとみなされるであろう。配列UGUは、第1の配列の3つの核酸塩基のうちの2つが第2の配列の核酸塩基と塩基対合しているため、配列AAGAに対して67%相補的であるとみなされる。当業者は、例えば、NCBI BLASTインターフェース(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)またはNeedleman-Wunschアルゴリズムを使用して、任意の配列の対について相補性パーセントを決定するために、様々なパラメータ設定でアルゴリズムが利用可能であることを理解するであろう。
「mRNA」は、ポリペプチドへと翻訳することができる(すなわち、リボソーム及びアミノアシル化tRNAによる翻訳のための基質として機能し得る)オープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。mRNAは、リボース残基またはその類似体を含むリン酸糖骨格(例えば、2’-メトキシリボース残基)を含むことができる。いくつかの実施形態では、mRNAリン酸糖骨格の糖は、リボース残基、2’-メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。
本明細書に記載のガイドRNA組成物及び方法に有用な例示的なガイド配列を、表1及び本出願全体に示す。例えば、表1がガイド配列を示す場合、このガイド配列をガイドRNAで使用して、RNAガイドDNA結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9を標的配列に指向することができる。標的配列は、ゲノム座標として表1に提供され、ゲノムDNAのプラス鎖とマイナス鎖(すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体)の両方を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるUのTへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド(例えば、PAMを含まない標的配列)と同一である。
本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の二本鎖切断(DSB)の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかである多数のヌクレオチドからなる挿入/欠失変異を指す。
本明細書で使用される場合、「発現を阻害する」は、特定の遺伝子産物(例えば、タンパク質、mRNA、またはその両方)の発現の減少を指す。タンパク質(すなわち、遺伝子産物)の発現は、目的の組織または細胞集団からのタンパク質の総細胞量を、細胞集団の個々のメンバーとしてのタンパク質の発現を、例えば、タンパク質を発現する細胞のパーセントを定義するための細胞選別によって、または集団中の細胞におけるタンパク質の発現を、例えば、ELISAもしくはウェスタンブロットによって、検出することによって測定することができる。発現の阻害は、全長遺伝子産物または任意の遺伝子産物が、もはや発現されなくなるような、遺伝子配列、例えば、ゲノム配列の遺伝子修飾、例えば、遺伝子のノックダウンから生じ得る。特定の遺伝子修飾は、全長遺伝子産物の翻訳を妨げるフレームシフトまたはナンセンス変異の導入をもたらし得る。スプライス部位、例えば、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位に十分に近い位置での遺伝子修飾は、スプライシングを破壊するために、全長タンパク質の翻訳を妨げることができる。発現の阻害は、遺伝子産物、例えば、プロモーター配列、3’UTR配列、例えば、キャッピング配列、5’UTR配列、例えば、ポリA配列の発現に必要なゲノム配列内の調節配列における遺伝子修飾に起因し得る。また、発現の阻害は、遺伝子産物の翻訳に必要な調節因子の発現または活性、例えば、遺伝子産物の産生を妨げることに起因し得る。例えば、全長転写因子の発現を阻害する転写因子配列の遺伝子修飾は、下流効果を有し、転写因子によって制御される1つ以上の遺伝子産物の発現の発現を阻害することができる。したがって、発現の阻害は、ゲノムまたはmRNA配列の変化によって予測することができる。したがって、発現の阻害をもたらすと予想される変異は、目的の組織または細胞集団から単離されたmRNAのシークエンシングを含む既知の方法によって検出することができる。発現の阻害は、タンパク質の所定の発現レベル、すなわち、少なくとも特定のレベルで目的のタンパク質を発現する集団内の細胞のパーセントまたは数の減少を有する集団内の細胞のパーセントとして決定することができる。発現の阻害はまた、例えば、細胞または組織試料、例えば、生検試料における全体的なタンパク質レベルの減少を決定することによって評価することができる。特定の実施形態では、分泌タンパク質の発現の阻害は、流体試料、例えば、細胞培地または体液中で評価することができる。タンパク質は、タンパク質レベルの分析を可能にするために、体液、例えば、血液または尿中に存在し得る。特定の実施形態では、タンパク質レベルは、タンパク質活性または代謝産物のレベル、例えば、尿または血液中のタンパク質活性または代謝産物のレベルによって決定され得る。いくつかの実施形態では、「発現の阻害」は、特定の遺伝子産物の発現のいくつかの喪失、例えば、転写されるmRNAの量の減少、または細胞集団によって発現されるタンパク質の量の減少を指し得る。いくつかの実施形態では、「阻害」は、特定の遺伝子産物、例えば、細胞表面における2B4遺伝子産物の発現のある程度の喪失を指し得る。ノックダウンのレベルは、同じタイプの対象試料における開始レベルに対して相対的であることが理解される。例えば、タンパク質レベルのルーチンモニタリングは、組織試料(例えば、生検試料)よりも、対象(例えば、血液または尿)からの流体試料においてより容易に実施される。ノックダウンのレベルは、アッセイされている試料についてであることが理解される。同様に、連続した組織試料、例えば、肝臓組織が得られ得る動物研究において、ノックダウン標的は、他の組織において発現され得る。したがって、ノックダウンのレベルは、必ずしも全身的なノックダウンのレベルではなく、試料採取される組織、細胞型、または流体内のノックダウンのレベルである。
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」は、例えば、CRISPR/Cas9 gRNA及びCas9系によって誘導される、DNAレベルでの変化である。遺伝子修飾は、典型的には、定義された配列またはゲノム遺伝子座内で、挿入、欠失、または置換(すなわち、塩基配列置換、すなわち、変異)を含み得る。遺伝子修飾は、DNAの核酸配列を変化させる。遺伝子修飾は、単一のヌクレオチド位置にあり得る。遺伝子修飾は、複数のヌクレオチド、例えば、2、3、4、5個以上のヌクレオチド、典型的には、互いに近接している、例えば、連続ヌクレオチドであってよい。遺伝子修飾は、コード配列、例えば、エクソン配列内にあり得る。遺伝子修飾は、スプライス部位、すなわち、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位に十分に近い位置にあり、スプライシングを破壊することができる。遺伝子修飾は、ゲノム遺伝子座に内因性ではないヌクレオチド配列の挿入、例えば、異種のオープンリーディングフレームまたは遺伝子のコード配列の挿入を含むことができる。本明細書で使用される場合、好ましくは、遺伝子修飾は、ゲノム遺伝子座の遺伝子修飾の前に、全長タンパク質のアミノ酸配列を有する全長タンパク質の翻訳を防止する。全長タンパク質または遺伝子産物の翻訳の防止は、任意の長さのタンパク質または遺伝子産物の翻訳の防止を含む。例えば、早期終止コドンの生成をもたらすフレームシフト変異によって、またはナンセンス変異の生成によって、全長タンパク質の翻訳を防止することができる。全長タンパク質の翻訳は、スプライシングの破壊によって防止することができる。
本明細書で使用される場合、「異種コード配列」は、細胞内の外因性ソースとして導入された(例えば、TCR遺伝子座を含むセーフハーバー遺伝子座などのゲノム遺伝子座に挿入された)コード配列を指す。すなわち、導入されたコード配列は、少なくともその挿入部位に関して異種である。そのような異種コード配列遺伝子から発現されるポリペプチドは、「異種ポリペプチド」と称される。異種コード配列は、天然に存在するか、または操作することができ、野生型またはバリアントであり得る。異種コード配列は、異種ポリペプチドをコードする配列(例えば、内部リボソーム侵入部位)以外のヌクレオチド配列を含み得る。異種コード配列は、野生型またはバリアント(例えば、変異体)として、ゲノム内で天然に存在するコード配列であり得る。例えば、細胞は(野生型またはバリアントとして)目的のコード配列を含有するが、同じコード配列またはそのバリアントを、例えば、高発現の遺伝子座での発現のための外因性ソースとして導入することができる。異種gコード配列はまた、ゲノム中に天然に存在しないか、またはゲノム中に天然に存在しない異種ポリペプチドを発現するコード配列であり得る。「異種コード配列」、「外因性コード配列」、及び「導入遺伝子」は、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、異種コード配列または導入遺伝子は、外因性核酸配列を含み、例えば、核酸配列は、レシピエント細胞に内因性ではない。いくつかの実施形態では、異種コード配列または導入遺伝子は、外因性核酸配列、例えば、レシピエント細胞内に天然に存在しない核酸配列を含む。例えば、異種コード配列は、その挿入部位に関して、及びそのレシピエント細胞に関して異種であり得る。
「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が細胞に著しい有害な影響を及ぼすことなく挿入され得るゲノム内の遺伝子座である。本明細書で使用するためにヌクレアーゼ(複数可)によって標的とされるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、AAVS1(PPP1 R12C)、TCR、B2Mが挙げられる。いくつかの実施形態では、TRC遺伝子、例えば、TRAC遺伝子などのノックダウンを標的とする遺伝子座または遺伝子座(複数)における挿入は、細胞にとって有利である。他の好適なセーフハーバー遺伝子座は、当該技術分野において既知である。
本明細書で使用される場合、「標的化受容体」は、細胞、例えば、T細胞の表面上に存在して、標的部位、例えば、生物内の特定の細胞または組織への細胞の結合を可能にする受容体を指す。標的化受容体としては、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受容体(TCR)、及びタンパク質の細胞外受容体部分の結合時にT細胞を活性化することができる内部シグナル伝達ドメイン内の少なくとも膜貫通ドメインを通して作動可能に連結された細胞表面分子の受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体は、細胞外抗原認識ドメイン、例えば、抗原が結合されるときにT細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に連結される、scFv、VHH、ナノボディを指す。CARは、抗原認識ドメイン、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内T細胞シグナル伝達ドメインの4つの領域で構成される。そのような受容体は、当該技術分野において周知である(例えば、各々の内容の対応する部分が参照により本明細書に組み込まれる、WO2020092057、WO2019191114、WO2019147805、WO2018208837を参照のこと)。アダプター分子を介した標的細胞への免疫細胞の結合を促進する逆ユニバーサルCAR(例えば、その内容全体が本明細書に組み込まれる、WO2019238722を参照のこと)も企図される。CARは、抗体が開発され得る任意の抗原を標的とすることができ、典型的には、標的とされる細胞または組織の表面上に表示される分子を対象とする。
本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患または障害のための投与または治療の任意の適用を指し、その疾患を阻害すること、その進行を止めること、その疾患の1つ以上の症状を緩和すること、その疾患を治癒させること、その疾患の1つ以上の症状を防止すること、またはその疾患の1つ以上の症状の再発を防止することを含む。自己免疫応答または炎症応答または障害を治療することは、疾患特異的症状の緩和をもたらす特定の障害に関連する炎症を緩和することを含み得る。本明細書に記載される操作されたT細胞による治療は、追加の治療薬、例えば、治療される適応症の標準的なケアの前、後、またはそれと組み合わせて使用され得る。
ヒト野生型2B4配列は、NCBI Gene ID:51744(www.www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/51744、本出願の出願日に入手可能なバージョン)で入手可能である。Ensembl:ENSG00000122223、chr1:160830160-160862887。2B4遺伝子は、9つのエクソンを含有する。CD244、NAIL、NKR2B4、Nmrk、SLAMF4は、2B4の遺伝子同義語である。2B4遺伝子は、タンパク質UniProtKB識別子Q9BZW8に対応する。2B4遺伝子は、ナチュラルキラー(NK)細胞及び非主要組織適合性複合体(MHC)制限殺傷を媒介するT細胞上に発現する細胞表面受容体をコードする。
本明細書で使用される場合、「T細胞受容体」または「TCR」は、T細胞における受容体を指す。一般に、TCRは、2つのTCRポリペプチド鎖、α及びβを含有するヘテロ二量体受容体分子である。α及びβ鎖TCRポリペプチドは、様々なCD3分子と複合体化し、抗原結合後に炎症及び自己免疫を含む免疫応答(複数可)を誘発することができる。本明細書で使用される場合、TCRのノックダウンは、任意のTCR遺伝子の部分的または全体的なノックダウン、例えば、単独で、または他のTCR遺伝子(複数可)の部分的または全体のノックダウンとの組み合わせで、TRBC1遺伝子の一部の欠失を指す。
「TRAC」は、T細胞受容体α鎖を指すために使用される。ヒト野生型TRAC配列は、NCBI Gene ID:28755;Ensembl:ENSG00000277734で利用可能である。T細胞受容体アルファ定数、TCRA、IMD7、TRCA及びTRAは、TRACの遺伝子同義語である。
「TRBC」は、T細胞受容体β鎖、例えば、TRBC1及びTRBC2を指すために使用される。「TRBC1」及び「TRBC2」は、T細胞受容体β鎖をコードする2つの相同遺伝子を指し、これらは、TRBC1またはTRBC2遺伝子の遺伝子産物である。
ヒト野生型TRBC1配列は、NCBI Gene ID:28639;Ensembl:ENSG00000211751で利用可能である。T細胞受容体ベータ定数、V_セグメント翻訳産物、BV05S1J2.2、TCRBC1、及びTCRBは、TRBC1の遺伝子同義語である。
ヒト野生型TRBC2配列は、NCBI Gene ID:28638;Ensembl:ENSG00000211772で利用可能である。T細胞受容体ベータ定数、V_セグメント翻訳産物、及びTCRBC2は、TRBC2の遺伝子同義語である。
「T細胞」は、抗原への曝露後の免疫応答において中心的な役割を果たす。例えば、T細胞が、エンジニアリングによって、例えば、幹細胞から、または分化転換によって、例えば、体細胞をリプログラミングすることによって形成されるとき、T細胞は、天然に存在し得るか、または非天然であり得る。T細胞は、細胞表面上のT細胞受容体の存在によって他のリンパ球と区別することができる。この定義には、ヘルパーCD4+T細胞、細胞傷害性CD8+T細胞、メモリーT細胞、及び調節CD4+T細胞を含む、従来の適応性T細胞、ならびにナチュラルキラーT細胞、粘膜関連不変T細胞、及びガンマデルタT細胞を含む自然様T細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD4+である。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD3+/CD4+である。
本明細書で使用される場合、「MHC」または「MHCタンパク質」は、主要な組織適合性複合体分子(または複数)を指し、例えば、MHCクラスI分子(例えば、ヒトにおけるHLA-A、HLA-B、及びHLA-C)ならびにMHCクラスII分子(例えば、ヒトにおけるHLA-DP、HLA-DQ、及びHLA-DR)を含む。
「CIITA」または「CIITA」または「C2TA」は、本明細書で使用される場合、「クラスII主要組織適合性複合体トランスアクチベーター」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、ヒト遺伝子は、受託番号NC_000016.10(範囲10866208..10941562)、参照GRCh38.p13を有する。核内のCIITAタンパク質は、MHCクラスII遺伝子転写の陽性調節因子として作用し、MHCクラスIIタンパク質発現に必要である。
「β2M」または「B2M」は、本明細書で使用される場合、「β-2ミクログロブリン」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、ヒト遺伝子は、受託番号NC_000015(範囲44711492..44718877)、参照GRCh38.p13を有する。B2Mタンパク質は、核化細胞の表面上のヘテロ二量体としてMHCクラスI分子と関連しており、MHCクラスIタンパク質発現に必要である。
「HLA-A」という用語は、HLA-Aタンパク質の文脈で本明細書で使用される場合、重鎖(HLA-A遺伝子によってコードされる)及び軽鎖(すなわち、ベータ-2ミクログロブリン)からなるヘテロ二量体である、MHCクラスIタンパク質分子を指す。「HLA-A」または「HLA-A遺伝子」という用語は、核酸の文脈で本明細書で使用される場合、HLA-Aタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。HLA-A遺伝子は、「HLAクラスI組織適合性、Aアルファ鎖」とも称され、ヒト遺伝子は、受託番号NC_000006.12(29942532..29945870)を有する。HLA-A遺伝子は、集団全体にわたって何千もの異なるバージョン(「対立遺伝子とも称される)を有することが知られている(また個体は、HLA-A遺伝子の2つの異なる対立遺伝子を受け取ることができる)。配列情報を含むHLA-A対立遺伝子の公開データベースは、IPD-IMGT/HLA:www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/でアクセスすることができる。HLA-Aの全ての対立遺伝子は、「HLA-A」及び「HLA-A遺伝子」という用語によって包含される。
本明細書で使用される場合、「ゲノム座標内」という用語は、与えられたゲノム座標範囲の境界を含む。例えば、chr6:29942854-chr6:29942913が与えられた場合、座標chr6:29942854-chr6:29942913が包含される。本出願を通して、参照されるゲノム座標は、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能なゲノム参照コンソーシアムからのヒトゲノムのGRCh38(hg38とも称される)アセンブリにおけるゲノム注釈に基づいている。1つのアセンブリと別のアセンブリとの間でゲノム座標を変換するためのツール及び方法は、当該技術分野において既知であり、同じ機関によって、または同じアルゴリズムを使用して生成された以前のアセンブリへの変換(例えば、GRCh38からGRCh37への)、及び異なる機関またはアルゴリズムによって生成されたアセンブリの変換(例えば、GRCh38から国際ヒトゲノムシークエンシングコンソーシアムによって生成されたNCBI33への)を含む、本明細書に提供されるゲノム座標をヒトゲノムの別のアセンブリの対応する座標に変換するために使用され得る。当該技術分野において既知の利用可能な方法及びツールとしては、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能なNCBIゲノム再マッピングサービス、UCSC Genome Browerのウェブサイトで入手可能なUCSC LiftOver、及びEnsembl.orgのウェブサイトで入手可能なAssembly Converterが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「スプライス部位」は、アクセプタースプライス部位もしくはドナースプライス部位(以下に定義する)を構成する3個のヌクレオチド、またはスプライス部位の一部である当該技術分野で既知の任意の他のヌクレオチドを指す。例えば、Burset et al.,Nucleic Acids Research 28(21):4364-4375(2000)(乳類ゲノムにおけるカノニカル及び非標準的なスプライス部位を記載する)を参照のこと。「アクセプタースプライス部位」を構成する3個のヌクレオチドは、イントロンの3’における2つの保存された残基(例えば、ヒトにおけるAG)及び境界ヌクレオチド(すなわち、AGのエクソン3’の第1のヌクレオチド)である。アクセプタースプライス部位の「スプライス部位境界ヌクレオチド」は、以下の図では「Y」と表記され、本明細書では「アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチド」または「スプライスアクセプター部位境界ヌクレオチド」とも称され得る。「アクセプタースプライス部位」、「スプライスアクセプター部位」、「アクセプタースプライス配列」、または「スプライスアクセプター配列」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
「ドナースプライス部位」を構成する3個のヌクレオチドは、イントロン及び境界ヌクレオチド(すなわち、GTのエクソン5’の第1のヌクレオチド)の5’末端における2つの保存された残基(例えば、ヒトにおけるGT(遺伝子)またはGU(pre-mRNAなどのRNAにおける)である。ドナースプライス部位の「スプライス部位境界ヌクレオチド」は、以下の図では「X」と表記され、本明細書では「ドナースプライス部位境界ヌクレオチド」または「スプライスドナー部位境界ヌクレオチド」とも称され得る。「ドナースプライス部位」、「スプライスドナー部位」、「ドナースプライス配列」、または「スプライスドナー配列」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
II.組成物
A.ガイドRNA(gRNA)を含む組成物
DNA配列を改変する、例えば、ガイドRNAをRNAガイドDNA結合剤(例えば、CRISPR/Cas系)とともに使用して、2B4遺伝子内で一本鎖切断(SSB)または二本鎖切断(DSB)を誘導するのに有用な組成物が本明細書に提供される。2B4遺伝子を標的とするガイド配列は、表1に配列番号1~86で示され、そのようなガイドRNAが標的とするゲノム座標も同様である。
A.ガイドRNA(gRNA)を含む組成物
DNA配列を改変する、例えば、ガイドRNAをRNAガイドDNA結合剤(例えば、CRISPR/Cas系)とともに使用して、2B4遺伝子内で一本鎖切断(SSB)または二本鎖切断(DSB)を誘導するのに有用な組成物が本明細書に提供される。2B4遺伝子を標的とするガイド配列は、表1に配列番号1~86で示され、そのようなガイドRNAが標的とするゲノム座標も同様である。
表1に配列番号1~86で示される各々のガイド配列は、crRNAを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、その3’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。5’から3’への配向で、GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号200)。
sgRNAの場合、上述のガイド配列は、sgRNAを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、ガイド配列の3’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。5’から3’への配向で、GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号201)。
sgRNAの場合、上述のガイド配列は、sgRNAを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、ガイド配列の3’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。5’から3’への配向で、GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号202)。
sgRNAの場合、ガイド配列は、以下の修飾モチーフmN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*Mu(配列番号300)に組み込まれてもよく、ここで、「N」は、任意の天然または非天然ヌクレオチド、好ましくはRNAヌクレオチドであり得、ヌクレオチドの糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換を有する同様の化合物であり得、mは、2’-O-メチル修飾ヌクレオチドであり、*は、ヌクレオチド残基間のホスホロチオエート連結であり、Nは、集合的にガイド配列のヌクレオチド配列である。
sgRNAの場合、ガイド配列は、SpyCas9 sgRNA配列をさらに含んでいてもよい。SpyCas9 sgRNA配列の例は、ガイド配列の3’末端に含まれる以下の表(配列番号201(GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-「例示的なSpyCas9 sgRNA-1」)に示され、以下の表に示されるようなドメインを備えている。LSは、下部ステムである。Bは、バルジである。USは、上部ステムである。H1及びH2は、それぞれ、ヘアピン1及びヘアピン2である。H1及びH2は、総称して、ヘアピン領域と称される。構造のモデルは、参照により本明細書に組み込まれる、WO2019237069の図10Aに提供される。
例示的なSpyCas9 sgRNA-1のヌクレオチド配列は、特定の化学修飾、配列置換及び切断のためのテンプレート配列として機能し得る。
特定の実施形態では、gRNAは、例えば、sgRNAまたはdgRNAであり、任意選択で、化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾sgRNAは、ガイド配列及びSpyCas9 sgRNA配列、例えば、例示的なSpyCas9 sg-RNA-1を含む。sgRNAなどのgRNAは、ガイド配列の5’末端またはガイド配列の3’末端、例えば、例示的なSpyCas9 sgRNA-1、末端ヌクレオチドのうちの1つ以上、例えば、3’末端または5’末端におけるヌクレオチドのうちの1、2、3、または4つにおける修飾を含み得る。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-O-メチル(2’-OMe)修飾ヌクレオチド、2’-O-(2-メトキシエチル)(2’-O-moe)修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート(PS)連結、及び反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-OMe修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、PS連結を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-OMe修飾ヌクレオチド及びPS連結を含む。
特定の実施形態では、(配列番号201「例示的なSpyCas9 sgRNA-1」)を例として使用して、例示的なSpyCas9 sgRNA-1は、以下のうちの1つ以上をさらに含む。
A.短縮されたヘアピン1領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン1領域であって、
1.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、またはH1-4及びH1-9のうちの少なくとも1つが、ヘアピン1においてワトソン-クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、ヘアピン1領域が、任意選択で、
a.H1-5~H1-8のうちのいずれか1つもしくは2つ、
b.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、ならびにH1-4及びH1-9のうちの1つ、2つ、もしくは3つ、または
c.ヘアピン1領域の1~8個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
2.短縮されたヘアピン1領域が、4~8個のヌクレオチド、好ましくは4~6個のヌクレオチドを欠いており、
a.位置H1-1、H1-2、もしくはH1-3のうちの1つ以上が、例示的なSpyCas9 sgRNA-1に対して欠失もしくは置換されているか、または
b.位置H1-6~H1-10のうちの1つ以上が、例示的なSpyCas9 sgRNA-1に対して置換されているか、あるいは
3.短縮されたヘアピン1領域が、5~10個のヌクレオチド、好ましくは5~6個のヌクレオチドを欠いており、位置N18、H1-12、もしくはnのうちの1つ以上が、例示的なSpyCas9 sgRNA-1に対して置換されている、短縮されたヘアピン1領域、あるいは
1.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、またはH1-4及びH1-9のうちの少なくとも1つが、ヘアピン1においてワトソン-クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、ヘアピン1領域が、任意選択で、
a.H1-5~H1-8のうちのいずれか1つもしくは2つ、
b.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、ならびにH1-4及びH1-9のうちの1つ、2つ、もしくは3つ、または
c.ヘアピン1領域の1~8個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
2.短縮されたヘアピン1領域が、4~8個のヌクレオチド、好ましくは4~6個のヌクレオチドを欠いており、
a.位置H1-1、H1-2、もしくはH1-3のうちの1つ以上が、例示的なSpyCas9 sgRNA-1に対して欠失もしくは置換されているか、または
b.位置H1-6~H1-10のうちの1つ以上が、例示的なSpyCas9 sgRNA-1に対して置換されているか、あるいは
3.短縮されたヘアピン1領域が、5~10個のヌクレオチド、好ましくは5~6個のヌクレオチドを欠いており、位置N18、H1-12、もしくはnのうちの1つ以上が、例示的なSpyCas9 sgRNA-1に対して置換されている、短縮されたヘアピン1領域、あるいは
B.短縮された上部ステム領域であって、短縮された上部ステム領域が、1~6個のヌクレオチドを欠いており、短縮された上部ステム領域の6、7、8、9、10、または11個のヌクレオチドが、例示的なSpyCas9 sgRNA-1に対して4個以下の置換を含む、短縮された上部ステム領域、あるいは
C.LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及びH2-14のうちのいずれか1つ以上における例示的なSpyCas9 sgRNA-1と比較した置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、置換、あるいは
D.上部ステム領域を有する例示的なSpyCas9 sgRNA-1であって、上部ステム修飾が、上部ステム領域におけるUS1~US12のうちのいずれか1つ以上の修飾を含み、
1.修飾ヌクレオチドが、任意選択で、2’-O-メチル(2’-OMe)修飾ヌクレオチド、2’-O-(2-メトキシエチル)(2’-O-moe)修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート(PS)連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、もしくはそれらの組み合わせから選択されるか、または
2.修飾ヌクレオチドが、任意選択で、2’-OMe修飾ヌクレオチドを含む、例示的なSpyCas9 sgRNA-1。
1.修飾ヌクレオチドが、任意選択で、2’-O-メチル(2’-OMe)修飾ヌクレオチド、2’-O-(2-メトキシエチル)(2’-O-moe)修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート(PS)連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、もしくはそれらの組み合わせから選択されるか、または
2.修飾ヌクレオチドが、任意選択で、2’-OMe修飾ヌクレオチドを含む、例示的なSpyCas9 sgRNA-1。
特定の実施形態では、例示的なSpyCas9 sgRNA-1(配列番号201)、または例示的なSpyCas9 sgRNA-1を含むsgRNAなどのsgRNAは、3’テール、例えば、1、2、3、4個、またはそれ以上のヌクレオチドの3’テールをさらに含む。特定の実施形態では、テールは、1個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-O-メチル(2’-OMe)修飾ヌクレオチド、2’-O-(2-メトキシエチル)(2’-O-moe)修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート(PS)連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-OMe修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド間にPS連結を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-OMe修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間にPS連結を含む。
特定の実施形態では、ヘアピン領域は、1個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-O-メチル(2’-OMe)修飾ヌクレオチド、2’-O-(2-メトキシエチル)(2’-O-moe)修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート(PS)連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-OMe修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、上部ステム領域は、1個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-O-メチル(2’-OMe)修飾ヌクレオチド、2’-O-(2-メトキシエチル)(2’-O-moe)修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート(PS)連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-OMe修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、例示的なSpyCas9 sgRNA-1は、1つ以上のYAジヌクレオチドを含み、Yは、ピリミジンであり、YAジヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-O-メチル(2’-OMe)修飾ヌクレオチド、2’-O-(2-メトキシエチル)(2’-O-moe)修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート(PS)連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-OMe修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、例示的なSpyCas9 sgRNA-1は、1つ以上のYAジヌクレオチドを含み、Yは、ピリミジンであり、YAジヌクレオチドは、置換ヌクレオチド、すなわち、配列置換ヌクレオチドを含み、ピリミジンは、プリンで置換される。特定の実施形態において、ピリミジンが単一ガイド内にワトソン-クリック塩基対を形成するとき、置換されたピリミジンヌクレオチドのワトソン-クリックベースのヌクレオチドは、ワトソン-クリック塩基対を維持するために置換される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼ(例えば、Cas9等のCasヌクレアーゼ)であってもよいRNAガイドDNA結合剤を、2B4中の標的DNA配列に指向させるガイド配列を含む1つ以上のガイドRNA(gRNA)を含む組成物を提供する。gRNAを含むいくつかの実施形態では、gRNAは、例えばsgRNAとして、表1に示されるガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、gRNAは、配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17から選択されるガイド配列を含み得る。gRNAは、表1に示されるガイド配列の17、18、19、または20個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、gRNAは、表1、任意選択で配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17に示されるガイド配列の少なくとも17、18、19、もしくは20個の連続ヌクレオチドに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、もしくは95%、または100%の同一性を有する配列を含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、gRNAは、表1、任意選択で配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17に示されるガイド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、もしくは95%、または100%の同一性を有する配列を含むガイド配列を含む。gRNAは、trRNAをさらに含み得る。本明細書に記載される各実施形態では、gRNAは、単一RNA(sgRNA)として、または別個のRNA(dgRNA)上で会合したcrRNA及びtrRNAを含んでいてもよい。sgRNAの文脈において、crRNA及びtrRNAの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。
本明細書に記載される各々の実施形態では、ガイドRNAは、「デュアルガイドRNA」または「dgRNA」として2つのRNA分子を含み得る。dgRNAは、例えば、表1に示されるガイド配列を含むcrRNAを含む第1のRNA分子と、trRNAを含む第2のRNA分子と、を含む。第1のRNA分子及び第2のRNA分子は共有結合していなくてもよいが、crRNA及びtrRNAの部分の間の塩基対形成によってRNA二本鎖を形成してもよい。
本明細書に記載される各々の実施形態では、ガイドRNAは、「単一ガイドRNA」または「sgRNA」として単一のRNA分子を含み得る。sgRNAは、trRNAに共有結合した表1に示されるガイド配列、または配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、もしくは配列番号3、4、10、及び17から選択されるガイド配列を含むcrRNA(またはその一部)を含み得る。sgRNAは、表1に示されるガイド配列、または配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、もしくは配列番号3、4、10、及び17から選択されるガイド配列の17、18、19、もしくは20個の連続ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、crRNA及びtrRNAは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態では、sgRNAは、crRNAとtrRNAの部分の間の塩基対形成によって、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態では、crRNA及びtrRNAは、ホスホジエステル結合ではない1つ以上の結合を介して共有結合される。
いくつかの実施形態では、trRNAは、天然に存在するCRISPR/Cas系由来のtrRNA配列の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、trRNAは、先端切断または修飾された野生型trRNAを含む。trRNAの長さは、使用されるCRISPR/Cas系に依存する。いくつかの実施形態では、trRNAは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、または100個より多いヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、trRNAは、例えば1つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または1つ以上のバルジ構造などの特定の二次構造を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号1~86、好ましくは配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17のうちのいずれか1つのガイド配列を含む、1つ以上のガイドRNAを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号87~119のうちのいずれか1つを含む1つ以上のsgRNAを含む組成物を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号1~86、好ましくは配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17の核酸のうちのいずれかに対して100%、または少なくとも95%もしくは90%同一であるガイド配列を含むgRNAを含む組成物を提供する。
他の実施形態では、組成物は、配列番号1~86、好ましくは配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17のガイド配列のうちのいずれか2つ以上から選択されるガイド配列を含む少なくとも1つ、例えば、少なくとも2つのgRNAを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、各々が配列番号1~86、好ましくは配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17の核酸のうちのいずれかと100%、または少なくとも95%もしくは90%同一であるガイド配列を含む少なくとも2つのgRNAを含む。
本発明のガイドRNA組成物は、2B4遺伝子内の標的配列を認識する(例えば、それに対してハイブリダイズする)ように設計される。例えば、2B4標的配列は、ガイドRNAを含む提供されるCas開裂によって認識され、切断され得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤、例えば、Casクリベースは、ガイドRNAを2B4遺伝子の標的配列に対して指向させてもよく、ガイドRNAのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、RNAガイドDNA結合剤、例えば、Casクリベースは、標的配列を切断する。
いくつかの実施形態では、1つ以上のガイドRNAの選択は、2B4遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、遺伝子の特定の領域における変異(例えば、ヌクレアーゼ媒介性DSBの結果として生じるインデル、すなわち挿入または欠失に起因するフレームシフト変異)は、遺伝子の他の領域における変異よりも許容性が低くてもよく、したがって、DSBの位置は、もたらされ得るタンパク質ノックダウンの量または種類における重要な因子である。いくつかの実施形態では、2B4内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するgRNAは、RNAガイドDNA結合剤を2B4遺伝子内の特定の位置に指向させるために使用される。いくつかの実施形態では、gRNAは、2B4のエクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、またはエクソン8内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するガイド配列を有するように設計されている。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ヒト2B4遺伝子内に存在する標的配列または標的配列の逆相補体と100%、または少なくとも95%もしくは90%同一である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドRNAのガイド配列に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドRNAのガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも80%、85%、90%、もしくは95%、または100%であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列とgRNAのガイド配列とは、100%相補的であるか、または同一であり得る。他の実施形態では、標的配列とgRNAのガイド配列は、少なくとも1個のミスマッチを含んでいてもよい。例えば、標的配列とgRNAのガイド配列は、1、2、3、または4個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列の全長は、約20である。いくつかの実施形態では、標的配列とgRNAのガイド配列は、1~4個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列は、20個のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、RNAガイドDNA結合剤、例えば、本明細書に記載のCasヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むmRNAを含む。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤、例えば、CasヌクレアーゼをコードするORFを含むmRNAが提供されるか、使用されるか、または投与される。
B.修飾gRNA及びmRNA
いくつかの実施形態では、gRNAは、化学修飾されている。1つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むgRNAは、標準的なA、G、C、及びU残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される1つ以上の非天然または天然に存在する成分または構造の存在を記載するために、「修飾」gRNAまたは「化学修飾」gRNAと呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾gRNAは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、(i)ホスホジエステル骨格連結における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の1つもしくは両方、または、架橋リン酸酸素の1つ以上の置き換え(例示的な骨格修飾)、(ii)リボース糖の成分、例えば、リボース糖の2’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え(例示的な糖修飾)、(iii)リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え(例示的な骨格修飾)、(iv)非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え(例示的な塩基修飾)、(v)リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾(例示的な骨格修飾)、(vi)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換え、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュゲーション(そのような3’または5’のキャップ修飾は、糖及び/または骨格の修飾を含み得る)、ならびに(vii)糖の修飾または置き換え(例示的な糖修飾)の1つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、gRNAは、化学修飾されている。1つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むgRNAは、標準的なA、G、C、及びU残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される1つ以上の非天然または天然に存在する成分または構造の存在を記載するために、「修飾」gRNAまたは「化学修飾」gRNAと呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾gRNAは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、(i)ホスホジエステル骨格連結における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の1つもしくは両方、または、架橋リン酸酸素の1つ以上の置き換え(例示的な骨格修飾)、(ii)リボース糖の成分、例えば、リボース糖の2’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え(例示的な糖修飾)、(iii)リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え(例示的な骨格修飾)、(iv)非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え(例示的な塩基修飾)、(v)リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾(例示的な骨格修飾)、(vi)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換え、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュゲーション(そのような3’または5’のキャップ修飾は、糖及び/または骨格の修飾を含み得る)、ならびに(vii)糖の修飾または置き換え(例示的な糖修飾)の1つ以上を含み得る。
上に列挙されるものなどの化学修飾を組み合わせて、2、3、4、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド(まとめて「残基」)を含む修飾gRNAまたはmRNAを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、gRNAの各々の塩基は修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエートなどの修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、gRNA分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾gRNAは、RNAの5’末端において、またはその近傍において少なくとも1つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾gRNAは、RNAの3’末端において、またはその近傍において少なくとも1つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態では、gRNAは、1、2、3、またはそれ以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾gRNA内の位置の少なくとも5%(例えば、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%)が、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるものによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様において、本明細書に記載されるgRNAは、例えば、細胞内または血清に由来するヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、1つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾gRNA分子は、インビボとエクスビボの両方において細胞集団に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン(特にインターフェロン)発現及び放出の誘導及び細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞応答を含む。
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾された残基のリン酸基は、1つ以上の酸素を異なる置換基によって代置することによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾は、帯電していないリンカーまたは非対称な電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
修飾されたリン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの1つの、上述の原子または原子群のうちの1つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「R」配置(本明細書においてRp)または「S」配置(本明細書においてSp)のいずれかを有し得る。骨格は、架橋酸素(すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素)の、窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)、及び炭素(架橋メチレンホスホネート)による置き換えによってもまた修飾できる。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。
リン酸基は、特定の主鎖修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、帯電したリン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例は、非限定的に、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スフホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ(methylenehydrazo)、メチレンジメチルヒドラゾ(methylenedimethylhydrazo)、メチレンオキシメチルイミノ(methyleneoxymethylimino)を含み得る。
リン酸リンカー及びリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられている、核酸を模倣することができる足場もまた構築できる。そのような修飾は、骨格及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例は、非限定的に、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸(PNA)ヌクレオシド代替物を含み得る。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基に対する1つ以上の修飾、すなわち糖修飾を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、修飾されていてもよく、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、2’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが2’-アルコキシドイオンを形成するように脱プロトン化されることがもはや起こり得ないため、核酸の安定性を増強し得る。
2’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ(OR、式中「R」がアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る)、ポリエチレングリコール(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2ORであって式中Rが、例えば、Hまたは任意選択で置換されたアルキルであり、nが0~20の整数であり得るもの(例えば、0~4、0~8、0~10、0~16、1~4、1~8、1~10、1~16、1~20、2~4、2~8、2~10、2~16、2~20、4~8、4~10、4~16、及び4~20)を含み得る。いくつかの実施形態では、2’ヒドロキシル基修飾は、2’-O-Meであり得る。いくつかの実施形態では、2’ヒドロキシル基修飾は、2’-ヒドロキシル基をフッ素で置き換える2’-フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態では、2’ヒドロキシル基修飾は、2’ヒドロキシルが、例えばC1-6アルキレンまたはC1-6ヘテロアルキレン架橋を介して同一のリボース糖の4’炭素へと接続し得る「ロックド」核酸(LNA)を含んでいてもよく、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、O-アミノ(ここで、アミノは、例えば、NH2、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る)、及びアミノアルコキシ、O(CH2)n-アミノ(ここで、アミノは、例えば、NH2、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る)を含み得る。いくつかの実施形態では、2’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がC2’-C3’結合を欠失している「アンロックド(unlocked)」核酸(UNA)を含み得る。いくつかの実施形態では、2’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基(MOE)、(OCH2CH2OCH3、例えば、PEG誘導体)を含み得る。
「デオキシ」2’修飾は、水素(すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なdsRNAの突出部分);ハロ(例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード);アミノ(ここでアミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る);NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-アミノ(ここでアミノは、例えば、本明細書に記載されるようなものであり得る)、-NHC(O)R(ここでRは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る)、シアノ;メルカプト;アルキル-チオ-アルキル;チオアルコキシ;ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含み得、任意選択で、例えば本明細書に記載されるようなアミノによって置換されていてもよい。
糖修飾は、1つ以上の炭素を含み、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の1つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、L型である1つ以上の糖、例えばL-ヌクレオシドを含み得る。
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書に記載される修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことのできる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、またはピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、及び塩基の合成誘導体を含み得る。
デュアルガイドRNAを用いる実施形態において、crRNAとtracrRNAの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、crRNAまたはtracrRNAの一方または両方の末端に存在してもよい。sgRNAを含む実施形態では、sgRNAの一方または両方の末端における1つ以上の残基が化学修飾され得るか、または内部ヌクレオシドが修飾され得るか、またはsgRNA全体が化学修飾され得る。特定の実施形態は、5’末端修飾を含む。特定の実施形態は、3’末端修飾を含む。特定の実施形態は、5’末端修飾及び3’末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドRNAは、2017年12月8日に出願された「Chemically Modified Guide RNAs」という発明の名称のWO2018/107028(A1)に開示された修飾パターンの1つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドRNAは、US20170114334号に開示された構造/修飾パターンの1つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドRNAは、WO2017/136794に開示された構造/修飾パターンの1つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、sgRNAは、本明細書に示される修飾パターンのうちのいずれかを含み、ここでNは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Nの全体は、例えば、表1で本明細書に記載される2B4ガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾sgRNAは、以下の配列:mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号300)を含み、ここで「N」は、任意の天然または非天然ヌクレオチドであってもよく、Nの全体は、表1に記載される2B4ガイド配列を含む。例えば、ここでNは、表1において本明細書に開示されるガイド配列のうちのいずれかに置き換えられ、任意選択で、Nは、配列番号1~86に置き換えられるか、または好ましくは、配列番号1~28、配列番号1~5、配列番号1及び2、または配列番号3、4、10、及び17に置き換えられる。
以下に記載される修飾のいずれも、本明細書に記載されるgRNA及びmRNA内に存在し得る。
「mA」、「mC」、「mU」、または「mG」という用語は、2’-O-Meで修飾されたヌクレオチドを表すために使用され得る。
ヌクレオチド糖環に影響を及ぼすことが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の2’-フルオロ(2’-F)置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。
本出願では、「fA」、「fC」、「fU」、または「fG」という用語を使用して、2’-Fで置換されたヌクレオチドを表すことができる。
ホスホロチオエート(PS)連結または結合とは、ホスホジエステル連結、例えばヌクレオチド塩基間の結合での1個の非架橋リン酸酸素を硫黄が置換する結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはS-オリゴとも称され得る。
PS修飾を示すために、「*」を使用し得る。本出願では、用語A*、C*、U*、またはG*を使用して、PS結合で隣りの(例えば3’)ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すことができる。
本出願では、「mA*」、「mC*」、「mU*」、または「mG*」という用語を使用して、2’-O-Meで置換され、PS結合で次の(例えば、3’)ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すことができる。
脱塩基ヌクレオチドは、反転した連結と結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、5’から5’連結を介して末端5’ヌクレオチドに結合してもよいし、または脱塩基ヌクレオチドは、3’から3’連結を介して末端3’ヌクレオチドに結合してもよい。末端5’または3’ヌクレオチドのいずれかにおける反転した脱塩基ヌクレオチドはまた、反転した脱塩基末端キャップと称され得る。
いくつかの実施形態では、5’末端部における最初の3、4、または5個のヌクレオチドのうちの1つ以上、及び3’末端部における最後の3、4、または5個のヌクレオチドのうちの1つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾は、2’-O-Me、2’-F、反転した脱塩基ヌクレオチド、PS結合、または安定性もしくは性能を増加させることが当該技術分野において周知の他のヌクレオチド修飾である。
いくつかの実施形態では、5’末端部における最初の4個のヌクレオチド、及び3’末端部における最後の4個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート(PS)結合を用いて連結される。
いくつかの実施形態では、5’末端部における最初の3個のヌクレオチド、及び3’末端部における最後の3個のヌクレオチドは、2’-O-メチル(2’-O-Me)修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、5’末端部における最初の3個のヌクレオチド、及び3’末端部における最後の3個のヌクレオチドは、2’-フルオロ(2’-F)修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、5’末端部における最初の3個のヌクレオチド、及び3’末端部における最後の3個のヌクレオチドは、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、修飾sgRNAを含む。いくつかの実施形態では、sgRNAは、mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号300)に示される修飾パターンを含み、ここでNは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Nの全体は、2B4内の標的配列に対してヌクレアーゼを指向させるガイド配列(例えば、表1に示されるゲノム座標)を含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、修飾sgRNAを含む。いくつかの実施形態では、sgRNAは、mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号300)に示される修飾パターンを含み、ここでNは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Nの全体は、2B4内の標的配列に対してヌクレアーゼを指向させるガイド配列(例えば、表1に示されるゲノム座標)を含む。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、配列番号1~86のガイド配列のうちのいずれか1つを含むsgRNA及びsgRNAの保存された部分、例えば、例示的なSpyCas9 sgRNA-1として示されるsgRNAの保存された部分、または表2及び本明細書全体で示されるgRNAの保存された部分を含む。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、配列番号1~86のガイド配列及びGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号202)のヌクレオチドのうちのいずれか1つを含むsgRNAを含み、ここでヌクレオチドは、ガイド配列の3’末端にあり、sgRNAは、本明細書または配列mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号300)に示されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、sgRNAは、本明細書で提供される例示的なSpyCas9 sgRNA-1及びその修飾バージョン、またはNの全体が、標的配列にヌクレアーゼを指向させるガイド配列を含む、以下の表3に提供されるバージョンを含む。各Nは、独立して、修飾されているか、または非修飾である。特定の実施形態では、修飾の表示がない場合、ヌクレオチドは、非修飾RNAヌクレオチド残基、すなわち、リボース糖及びホスホジエステル骨格である。
上述のように、いくつかの実施形態では、本明細書において開示される組成物または製剤は、RNAガイドDNA結合剤、例えば、本明細書に記載のCasヌクレアーゼ、例えば、Cas9ヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むmRNAを含む。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤、例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9ヌクレアーゼをコードするORFを含むmRNAが提供されるか、使用されるか、または投与される。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNAヌクレアーゼをコードするORFは、「修飾RNAガイドDNA結合剤ORF」または単に「修飾ORF」であり、ORFが修飾されていることを示すための略語として使用される。
いくつかの実施形態では、mRNAまたは修飾ORFは、少なくとも1つ、複数、または全てのウリジン位置に、修飾ウリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、5位で修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、1位で修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、N1-メチル-プソイドウリジン、5-メトキシウリジン、5-ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、5-メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、5-ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、N1-メチル-プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンとN1-メチル-プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、N1-メチルプソイドウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、5-ヨードウリジンとN1-メチル-プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと5-ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、5-ヨードウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、5’キャップ、例えば、Cap0、Cap1、またはCap2を含む。5’キャップは、一般に、mRNAの5’-3’鎖の第1のヌクレオチド(すなわち、第1のキャップ近位のヌクレオチド)の5’位に対して5’-トリホスフェートを介して連結した7-メチルグアニンリボヌクレオチド(例えば、ARCAに関して、以下に考察されるようにさらに修飾されてもよい)である。Cap0において、mRNAの第1及び第2のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、2’-ヒドロキシルを含む。Cap1において、mRNAの第1及び第2の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、2’-メトキシ及び2’-ヒドロキシを含む。Cap2において、mRNAの第1及び第2のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、2’-メトキシを含む。例えば、Katibah et al.(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30、Abbas et al.(2017)Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115を参照のこと。ヒトmRNA等の哺乳動物mRNAを含む、ほとんどの内因性の高級真核生物mRNAは、Cap1またはCap2を含む。Cap0、及びCap1及びCap2とは異なる他のキャップ構造は、IFIT-1及びIFIT-5等の自然免疫系の構成要素によって「非自己」として認識されるため、ヒト等の哺乳動物において免疫原性である場合があり、I型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こし得る。IFIT-1及びIFIT-5等の自然免疫系の構成要素はまた、Cap1またはCap2以外のキャップとのmRNAの結合についてeIF4Eと競合する場合があり、mRNAの翻訳を潜在的に阻害する。
キャップは、共転写的に含めることができる。例えば、ARCA(抗逆キャップ類似体、Thermo Fisher Scientificカタログ番号AM8045)は、グアニンリボヌクレオチドの5’位に連結する7-メチルグアニン3’-メトキシ-5’-トリホスフェートを含むキャップ類似体であり、開始時にインビトロで転写産物に組み込むことができる。ARCAは、第1のキャップ近位のヌクレオチドの2’位がヒドロキシルであるCap0キャップをもたらす。例えば、Stepinski et al.,(2001)“Synthesis and properties of mRNAs containing the novel ‘anti-reverse’ cap analogs 7-methyl(3’-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3’deoxy)GpppG,”RNA 7:1486-1495を参照のこと。ARCAの構造を以下に示す。
CleanCap(商標)AG(m7G(5’)ppp(5’)(2’OmeA)pG、TriLink Biotechnologiesカタログ番号N-7113)またはCleanCap(商標)GG(m7G(5’)ppp(5’)(2’OmeG)pG、TriLink Biotechnologiesカタログ番号N-7133)を使用して、Cap1構造を共転写的に提供することができる。CleanCap(商標)AG及びCleanCap(商標)GGの3’-O-メチル化態様も、それぞれ、カタログ番号N-7413及びN-7433としてTriLink Biotechnologiesから入手可能である。CleanCap(商標)AGの構造を以下に示す。
あるいは、転写後に、キャップをRNAに付加することができる。例えば、Vacciniaキャッピング酵素は市販されており(New England Biolabs カタログ番号M2080S)、そのD1サブユニットによって与えられるRNAトリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ活性、ならびにそのD12サブユニットによって与えられるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、S-アデノシルメチオニン及びGTPの存在下で、Cap0を与えるように、7-メチルグアニンをRNAに付加することができる。例えば、Guo,P.and Moss,B.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4023-4027、Mao,X.and Shuman,S.(1994)J.Biol.Chem.269,24472-24479を参照のこと。
いくつかの実施形態では、mRNAは、ポリアデニル化(ポリ-A)テールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリ-Aテールは、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、または100個のアデニンを含み、任意選択で、300個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ-Aテールは、95、96、97、98、99、または100個のアデニンヌクレオチドを含む。
C.リボ核タンパク質複合体
いくつかの実施形態では、表1からの1つ以上のガイド配列を含む1つ以上のgRNA、または表2からの1つ以上のsgRNA、及びRNAガイドDNA結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9を含む組成物を包含する。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、Casヌクレアーゼを含む。Cas9ヌクレアーゼの例としては、S.pyogenes、S.aureus、及び他の原核生物のII型CRISPR系のもの(例えば、次の段落のリストを参照のこと)、ならびにそれらの修飾(例えば、操作型または変異体)態様が挙げられる。例えば、US20160312198、US20160312199を参照のこと。Casヌクレアーゼの他の例としては、III型CRISPR系のCsmもしくはCmr複合体、またはそのCas10、Csm1、もしくはCmr2サブユニット、及びI型CRISPR系のカスケード複合体、またはそのCas3サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、IIA型、IIB型、またはIIC型の系に由来していてもよい。様々なCRISPR系及びCasヌクレアーゼの考察については、例えば、Makarova et al.,NAT.REV.MICROBIOL.9:467-477(2011)、Makarova et al.,NAT.REV.MICROBIOL,13:722-36(2015)、Shmakov et al.,MOLECULAR CELL,60:385-397(2015)を参照のこと。
いくつかの実施形態では、表1からの1つ以上のガイド配列を含む1つ以上のgRNA、または表2からの1つ以上のsgRNA、及びRNAガイドDNA結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9を含む組成物を包含する。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、Casヌクレアーゼを含む。Cas9ヌクレアーゼの例としては、S.pyogenes、S.aureus、及び他の原核生物のII型CRISPR系のもの(例えば、次の段落のリストを参照のこと)、ならびにそれらの修飾(例えば、操作型または変異体)態様が挙げられる。例えば、US20160312198、US20160312199を参照のこと。Casヌクレアーゼの他の例としては、III型CRISPR系のCsmもしくはCmr複合体、またはそのCas10、Csm1、もしくはCmr2サブユニット、及びI型CRISPR系のカスケード複合体、またはそのCas3サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、IIA型、IIB型、またはIIC型の系に由来していてもよい。様々なCRISPR系及びCasヌクレアーゼの考察については、例えば、Makarova et al.,NAT.REV.MICROBIOL.9:467-477(2011)、Makarova et al.,NAT.REV.MICROBIOL,13:722-36(2015)、Shmakov et al.,MOLECULAR CELL,60:385-397(2015)を参照のこと。
Casヌクレアーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Streptococcus pyogenes、Streptococcus thermophilus、Streptococcus sp.、Staphylococcus aureus、Listeria innocua、Lactobacillus gasseri、Francisella novicida、Wolinella succinogenes、Sutterella wadsworthensis、Gammaproteobacterium、Neisseria meningitidis、Campylobacter jejuni、Pasteurella multocida、Fibrobacter succinogene、Rhodospirillum rubrum、Nocardiopsis dassonvillei、Streptomyces pristinaespiralis、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces viridochromogenes、Streptosporangium roseum、Streptosporangium roseum、Alicyclobacillus acidocaldarius、Bacillus pseudomycoides、Bacillus selenitireducens、Exiguobacterium sibiricum、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus buchneri、Treponema denticola、Microscilla marina、Burkholderiales bacterium、Polaromonas naphthalenivorans、Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、Cyanothece sp.、Microcystis aeruginosa、Synechococcus sp.、Acetohalobium arabaticum、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Finegoldia magna、Natranaerobius thermophilus、Pelotomaculum thermopropionicum、Acidithiobacillus caldus、Acidithiobacillus ferrooxidans、Allochromatium vinosum、Marinobacter sp.、Nitrosococcus halophilus、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、Anabaena variabilis、Nodularia spumigena、Nostoc sp.、Arthrospira maxima、Arthrospira platensis、Arthrospira sp.、Lyngbya asp.、Microcoleus chthonoplastes、Oscillatoria sp.、Petrotoga mobilis、Thermosipho africanus、Streptococcus pasteurianus、Neisseria cinerea、Campylobacter lari、Parvibaculum lavamentivorans、Corynebacterium diphtheria、Acidaminococcus sp.、Lachnospiraceae bacterium ND2006、及びAcaryochloris marinaが挙げられる。
いくつかの実施形態において、Casヌクレアーゼは、Streptococcus pyogenes由来のCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、Streptococcus thermophilus由来のCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、Neisseria meningitidis由来のCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、Staphylococcus aureus由来のCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、Francisella novicida由来のCpf1ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、Acidaminococcus sp.由来のCpf1ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、Lachnospiraceae bacterium ND2006由来のCpf1ヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、Casヌクレアーゼは、Francisella tularensis、Lachnospiraceae bacterium、Butyrivibrio proteoclasticus、Peregrinibacteria bacterium、Parcubacteria bacterium、Smithella、Acidaminococcus、Candidatus Methanoplasma termitum、Eubacterium eligens、Moraxella bovoculi、Leptospira inadai、Porphyromonas crevioricanis、Prevotella disiens、またはPorphyromonas macacae由来のCpf1ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、Casヌクレアーゼは、AcidaminococcusまたはLachnospiraceae由来のCpf1ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤とともに含むgRNAは、リボ核タンパク質複合体(RNP)と呼ばれる。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、Casヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼとともに含むgRNAは、Cas RNPと呼ばれる。いくつかの実施形態では、RNPは、I型、II型、またはIII型の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、II型CRISPR/Cas系由来のCas9タンパク質である。いくつかの実施形態では、Cas9とともに含むgRNAは、Cas9 RNPと呼ばれる。
野生型Cas9は、2つのヌクレアーゼドメイン、RuvC及びHNHを有する。RuvCドメインは、非標的DNA鎖を切断し、HNHドメインは、DNAの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、2つ以上のRuvCドメインまたは2つ以上のHNHドメインを含む。いくつかの実施形態では、Cas9タンパク質は、野生型Cas9である。組成物、使用及び方法の実施形態の各々において、Casは、標的DNAにおける二本鎖切断を誘導する。
いくつかの実施形態において、キメラCasヌクレアーゼが使用され、タンパク質の1つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼドメインは、Fok1等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
他の実施形態では、Casヌクレアーゼは、I型CRISPR/Cas系由来であり得る。いくつかの実施形態において、Casヌクレアーゼは、I型CRISPR/Cas系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態において、Casヌクレアーゼは、Cas3タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Casヌクレアーゼは、III型CRISPR/Cas系由来であり得る。いくつかの実施形態において、Casヌクレアーゼは、RNA切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、1つのDNA鎖を切断して一本鎖切断(「ニック」としても知られる)を生成することができる。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、Casニッカーゼを含む。ニッカーゼは、dsDNA内でニックを作製する酵素であり、すなわち、DNA二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態では、Casニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の1つ以上の改変(例えば、点変異)によって、エンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたCasヌクレアーゼ(例えば、上で考察されるCasヌクレアーゼ)の一態様である。例えば、Casニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変の考察については、米国特許第8,889,356号を参照のこと。いくつかの実施形態では、Cas9ニッカーゼなどのCasニッカーゼは、不活性化されたRuvCまたはHNHドメインを有する。
いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、1つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含有するように修飾される。例えば、薬剤タンパク質は、その核酸切断活性を低減させるために、ヌクレアーゼドメインの1つが変異されるか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低減したRuvCドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なRuvCドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低減したHNHドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なHNHドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または改変させるように置換される。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、RuvCまたはRuvC様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。RuvCまたはRuvC様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、D10A(S.pyogenes Cas9タンパク質に基づく)が挙げられる。例えば、Zetsche et al.(2015)Cell Oct 22:163(3):759-771を参照のこと。いくつかの実施形態では、Casヌクレアーゼは、HNHまたはHNH様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。HNHまたはHNH様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、E762A、H840A、N863A、H983A、及びD986A(S.pyogenesのCas9タンパク質に基づく)が挙げられる。例えば、Zetsche et al.(2015)を参照のこと。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、D917A、E1006A、及びD1255A(Francisella novicida U112 Cpf1(FnCpf1)配列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN)に基づく)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼをコードするmRNAは、それぞれ、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して相補的な一対のガイドRNAと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドRNAは、標的配列の反対側の鎖にニックを生成することによって(すなわち、ダブルニッキング)、ニッカーゼを標的配列に指向させ、DSBを導入する。いくつかの実施形態では、ダブルニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減し得る。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、DNAの反対側の鎖を標的とする2つの別個のガイドRNAとともに使用され、標的DNA内にダブルニックを産生する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ごく接近した位置にあるように選択された2つの別個のガイドRNAとともに使用され、標的DNA内にダブルニックを産生する。
いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、クリベース及びニッカーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、dCas DNA結合ポリペプチドを含む。dCasポリペプチドは、触媒(クリベース/ニッカーゼ)活性を本質的に欠く一方で、DNA結合活性を有する。いくつかの実施形態において、dCasポリペプチドは、dCas9ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クリベース活性及びニッカーゼ活性を欠くRNAガイドDNA結合剤、またはdCas DNA結合ポリペプチドは、例えば、その触媒ドメイン内の1つ以上の改変(例えば、点変異)によって、そのエンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたCasヌクレアーゼ(例えば、上述のCasヌクレアーゼ)の一態様である。例えば、US20140186958、US20150166980を参照のこと。
いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、1つ以上の異種機能ドメインを含む(例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む)。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、RNAガイドDNA結合剤の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル(NLS)であり得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、1~10個のNLSと融合され得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、1~5個のNLSと融合され得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、1個のNLSと融合され得る。1個のNLSが使用される場合、NLSは、RNAガイドDNA結合剤の配列のN末端部またはC末端部で連結され得る。これをRNAガイドDNA結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、1個より多いNLSと融合され得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、2、3、4、または5個のNLSと融合され得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、2個のNLSと融合され得る。特定の状況では、2個のNLSは、同じ(例えば、2個のSV40 NLS)であってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、カルボキシ末端部に連結された2個のSV40 NLSの配列に融合される。いくつかの実施形態において、RNAガイドDNA結合剤は、2個のNLSと融合していてもよく、1つはN末端部に連結しており、1つはC末端部に連結している。いくつかの実施形態において、RNAガイドDNA結合剤は、3個のNLSと融合され得る。いくつかの実施形態において、RNAガイドDNA結合剤は、NLSなしで融合され得る。いくつかの実施形態において、NLSは、単節型配列、例えば、SV40 NLS、PKKKRKV(配列番号123)またはPKKKRRV(配列番号124)であってもよい。いくつかの実施形態において、NLSは、双節型配列、例えば、ヌクレオプラスミンのNLSであるKRPAATKKAGQAKKKK(配列番号125)であってもよい。特定の実施形態では、単一のPKKKRKV(配列番号123)NLSは、RNAガイドDNA結合剤のC末端部で連結され得る。1つ以上のリンカーは、任意選択で、融合部位に含まれる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、RNAガイドDNA結合剤の細胞内半減期を修正することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤の半減期が増加し得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤の半減期が低減し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、RNAガイドDNA結合剤の安定性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、RNAガイドDNA結合剤の安定性を低減させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして機能し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素によって媒介され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、PEST配列を含み得る。いくつかの実施形態では、RNAガイドDNA結合剤は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質(UBL)であってもよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、小さなユビキチン様修飾因子(SUMO)、ユビキチン交差反応性タンパク質(UCRP、インターフェロン刺激遺伝子-15(ISG15)としても知られる)、ユビキチン関連修飾因子-1(URM1)、神経前駆細胞が発現する発達的に下方制御されたタンパク質-8(NEDD8、S.cerevisiaeにおいてRub1とも呼ばれる)、ヒト白血球抗原F関連(FAT10)、オートファジー-8(ATG8)及び-12(ATG12)、Fauユビキチン様タンパク質(FUB1)、膜固定UBL(MUB)、ユビキチン折りたたみ修飾因子-1(UFM1)、及びユビキチン様タンパク質-5(UBL5)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、マーカードメインであってもよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であってもよい。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質(例えば、GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色蛍光タンパク質(例えば、YFP、EYFP、Citrine、Venus、Ypet、PhiYFP、ZsYellow1)、青色蛍光タンパク質(例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、シアン蛍光タンパク質(例えば、ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、赤色蛍光タンパク質(例えば、mKate、mKate2、mPlum、DsRed単量体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)、及び橙色蛍光タンパク質(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)、または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグまたはエピトープタグであってもよい。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(TRX)、ポリ(NANP)、タンデムアフィニティ精製(TAP)タグ、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、ビオチンカルボキシル担体タンパク質(BCCP)、ポリ-His、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態では、異種機能ドメインは、RNAガイドDNA結合剤を特異的なオルガネラ、細胞型、組織、または臓器に標的化し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、RNAガイドDNA結合剤をミトコンドリアに標的化し得る。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、エフェクタードメインであってもよい。RNAガイドDNA結合剤がその標的配列に指向されるとき、例えば、Casヌクレアーゼが、gRNAによって標的配列に指向されるとき、エフェクタードメインは、標的配列を修飾するか、または影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン(例えば、非Casヌクレアーゼドメイン)、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインから選択され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ヌクレアーゼ、例えばFokIヌクレアーゼである。例えば、米国特許第9,023,649号を参照のこと。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Qi et al.,“Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression”,Cell 152:1173-83(2013)、Perez-Pinera et al.,“RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors”,Nat.Methods 10:973-6(2013)、Mali et al.,“CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering”,Nat.Biotechnol.31:833-8(2013)、Gilbert et al.,“CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes”,Cell 154:442-51(2013)を参照のこと。したがって、RNAガイドDNA結合剤は、本質的に、ガイドRNAを使用して所望の標的配列に結合するように指向され得る転写因子になる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、デアミナーゼ、例えばシチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼである。特定の実施形態では、異種機能ドメインは、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素(APOBEC)デアミナーゼなどのC-T塩基変換子(シチジンデアミナーゼ)である。
D.gRNAの有効性の決定
いくつかの実施形態では、gRNAの有効性は、送達されたとき、またはRNPを形成する他の構成要素とともに発現されたときに決定される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNAガイドDNA結合剤、例えば、Casタンパク質、例えば、Cas9とともに発現される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNAガイドDNAヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼを既に安定に発現する細胞株に送達されるか、またはその細胞株において発現される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNPの一部として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNAガイドDNAヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼをコードするmRNAとともに細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、gRNAの有効性は、送達されたとき、またはRNPを形成する他の構成要素とともに発現されたときに決定される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNAガイドDNA結合剤、例えば、Casタンパク質、例えば、Cas9とともに発現される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNAガイドDNAヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼを既に安定に発現する細胞株に送達されるか、またはその細胞株において発現される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNPの一部として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNAガイドDNAヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼをコードするmRNAとともに細胞に送達される。
本明細書に記載される場合、本明細書に開示されるRNAガイドDNAヌクレアーゼ及びガイドRNAの使用は、DNAにおいて二本鎖切断を生じる場合があり、細胞機構による修復時に挿入/欠失(インデル)変異の形態でエラーを生じ得る。インデルに起因する多くの変異は、リーディングフレームを改変するか、または未成熟終止コドンを導入し、したがって、非機能性タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、特定のgRNAの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、Cas9を安定して発現するHEK293細胞である(HEK293_Cas9)。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、末梢血単核細胞(「PBMC」)である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、一次ヒトT細胞などのT細胞である。一次細胞を使用することに関して、市販の一次ヒト肝細胞を使用して、実験間のより高い一貫性を提供することができる。いくつかの実施形態では、インビトロモデルにおいて(例えば、T細胞において)欠失または挿入が起こるオフターゲット部位の数は、例えば、インビトロでCas9 mRNA及びガイドRNAでトランスフェクトされた細胞からゲノムDNAを分析することによって決定される。いくつかの実施形態では、そのような決定は、インビトロでCas9 mRNA、ガイドRNA、及びドナーオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞由来のゲノムDNAを分析することを含む。そのような決定のための例示的な手順を、HEK293細胞、PBMC、及びヒトCD3+T細胞を使用する作業実施例に提供する。
いくつかの実施形態では、特定のgRNAの有効性は、gRNA選択プロセスのための複数のインビトロ細胞モデルにわたって決定される。いくつかの実施形態では、選択されたgRNAとのデータの細胞株比較が行われる。いくつかの実施形態において、複数の細胞モデルで交差スクリーニングを実施する。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAの有効性は、2B4のインデルパーセントまたは遺伝子修飾パーセントによって測定される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの有効性は、2B4遺伝子座におけるインデルパーセントまたは遺伝子修飾パーセントによって測定される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの有効性は、表1または表2のゲノム座標における2B4のインデルパーセントまたは遺伝子修飾パーセントによって測定される。いくつかの実施形態では、2B4の編集パーセントを、2B4タンパク質産物のノックダウンを達成するために必要なインデルまたは遺伝子修飾のパーセントと比較する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの有効性は、2B4タンパク質の発現の低減または排除によって測定される。実施形態では、当該2B4タンパク質の発現の低減または排除は、例えば、本明細書に記載されるようなフローサイトメトリーによって測定されるようなものである。
いくつかの実施形態では、2B4タンパク質発現は、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、細胞集団において低減または排除される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団に対してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも55%、60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の2B4陰性である。
「非修飾細胞」(または「非修飾細胞(複数)」)は、実験または試験における同じタイプの細胞の対照細胞(または細胞(複数))を指し、「非修飾」対照細胞は、2B4ガイドと接触していない。したがって、非修飾細胞(または細胞(複数))は、ガイドRNAと接触していない細胞、または2B4を標的としないガイドRNAと接触している細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAの有効性は、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におけるインデルまたは遺伝子修飾の数または頻度によって測定される。いくつかの実施形態では、細胞集団において、または標的部位におけるインデル生成の頻度に対して、非常に低い頻度(例えば、5%未満)で、オフターゲット部位でインデルを生成する有効なガイドRNAが提供される。したがって、本開示は、標的細胞型(例えば、T細胞)においてオフターゲットインデル形成を示さないか、または細胞集団において、または標的部位でのインデル生成の頻度に対して、オフターゲットインデル形成の頻度が5%未満であるガイドRNAを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞型(例えば、T細胞)において任意のオフターゲットインデル形成を示さないガイドRNAを提供する。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される1つ以上の方法によって評価される場合、5個未満のオフターゲット部位においてインデルを生成するガイドRNAが提供される。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される1つ以上の方法によって評価される場合、4、3、2、または1個未満または以下のオフターゲット部位(複数可)においてインデルを生成するガイドRNAが提供される。いくつかの実施形態では、オフターゲット部位は、標的細胞(例えば、肝細胞)ゲノム内のタンパク質コード領域内では発生しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集事象を検出すること、例えば、挿入/欠失(「インデル」)変異の形成、及び標的DNAにおける挿入または相同性誘導修復(HDR)事象は、タグ化プライマーを用いた線形増幅及びタグ化増幅産物の単離を利用する(本明細書ではこれ以降、「LAM-PCR」または「線形増幅(LA)」法と称される)。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの有効性は、遺伝子の発現されたタンパク質産物を含む機能的タンパク質複合体のレベルによって測定される。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの有効性は、編集された細胞の生体集団がTCRの喪失について分析されるTCR発現のフローサイトメトリー分析によって測定される。
E.T細胞受容体(TCR)
いくつかの実施形態では、例えば、2B4をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾を含む操作された細胞または細胞集団は、TCR遺伝子配列(複数可)をコードする内因性核酸配列(例えば、TRACまたはTRBC)の修飾、例えば、ノックダウンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、例えば、2B4をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾を含む操作された細胞または細胞集団は、TCR遺伝子配列(複数可)をコードする内因性核酸配列(例えば、TRACまたはTRBC)の修飾、例えば、ノックダウンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、2B4をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾(例えば、ノックダウン)、及び標的化受容体をコードする異種配列(複数可)の細胞への挿入を含む、操作された細胞または細胞集団は、TCR遺伝子配列(複数可)をコードする内因性核酸配列(例えば、TRACまたはTRBC)の修飾(例えば、ノックダウン)をさらに含む。
一般に、TCRは、2つのTCRポリペプチド鎖、α及びβを含有するヘテロ二量体受容体分子である。ノックダウンを標的とするための好適なα及びβゲノム配列または遺伝子座は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、TCR α鎖遺伝子配列、例えば、TRACの修飾、例えば、ノックダウンを含む。例えば、NCBI Gene ID:28755;Ensembl:ENSG00000277734(T細胞受容体アルファ定数)、US2018/0362975及びWO2020081613を参照のこと。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、2B4をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾、TCR遺伝子配列(複数可)をコードする内因性核酸配列(例えば、TRACまたはTRBC)の遺伝子修飾(例えば、ノックダウン)、及びMHCクラスI遺伝子(例えば、B2MまたはHLA-A)の修飾(例えば、ノックダウン)を含む。いくつかの実施形態では、MHCクラスI遺伝子は、HLA-B遺伝子またはHLA-C遺伝子である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、2B4をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾、及びTCR遺伝子配列(複数可)をコードする内因性核酸配列(例えば、TRACまたはTRBC)の遺伝子修飾(例えば、ノックダウン)、及びMHCクラスII遺伝子(例えば、CIITA)の遺伝子修飾(例えば、ノックダウン)を含む。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、2B4をコードする内因性核酸配列の修飾、TCR遺伝子配列(複数可)をコードする内因性核酸配列(例えば、TRACまたはTRBC)の遺伝子修飾(例えば、ノックダウン)、及びチェックポイント阻害剤遺伝子(例えば、TIM3、LAG3、またはPD-1)の遺伝子修飾(例えば、ノックダウン)を含む。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、シークエンシング、例えば、NGSによって評価される2B4遺伝子の遺伝子修飾を含み、細胞の少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%が、内因性2B4配列における挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも50%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも55%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも60%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも65%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも70%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも75%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも85%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも70%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも90%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも95%は、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、2B4は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも50%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも55%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも60%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも65%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも70%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも80%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも90%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、2B4の発現は、例えば、2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも95%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。2B4タンパク質及びmRNA発現のアッセイは、当該技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、例えば、シークエンシング、例えば、NGSによって評価される、遺伝子編集によるTCR遺伝子配列の修飾(例えば、ノックダウン)を含み、細胞の少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%が、内因性TCR遺伝子配列における挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態では、TCRは、例えば、TCR遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。特定の実施形態では、TCRは、TRACまたはTRBCである。TCRタンパク質及びmRNA発現のアッセイは、当該技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、遺伝子編集によって、例えば、シークエンシング(例えば、NGS)によって評価される、標的化受容体をコードする配列(複数可)の挿入を含む。
いくつかの実施形態では、TCR遺伝子内の部位、例えば、TRAC遺伝子を特異的に標的とするガイドRNAを使用して、TCR遺伝子の修飾(例えば、ノックダウン)を提供する。
いくつかの実施形態では、TCR遺伝子は、T細胞において、RNAガイドDNA結合剤とともにガイドRNAを使用して修飾(例えば、ノックダウン)される。いくつかの実施形態では、例えば、RNAガイドDNA結合剤(例えば、CRISPR/Cas系)とともにガイドRNAを使用して、T細胞のTCR遺伝子内で切断(例えば、二本鎖切断(DSB)または一本鎖切断(ニック))を誘導することによって操作されたT細胞が本明細書に開示される。方法は、インビトロまたはエクスビボで、例えば、免疫応答を抑制するための細胞産物の製造において使用され得る。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、TCR遺伝子内の本明細書に記載の部位において、RNAガイドDNA結合剤(例えば、Casヌクレアーゼ)による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、当該領域に結合する、または結合することができるガイド配列を含むことが理解されるであろう。
III.治療方法及び使用、ならびに操作された細胞または免疫療法試薬を調製する方法を含む方法及び使用
本明細書に開示されるgRNAならびに関連する方法及び組成物は、操作された細胞などの免疫療法試薬を作製するのに有用である。
本明細書に開示されるgRNAならびに関連する方法及び組成物は、操作された細胞などの免疫療法試薬を作製するのに有用である。
いくつかの実施形態では、表1のガイド配列を、RNAガイドDNAヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼとともに含むgRNAは、DSBを誘導し、修復中の非相同性末端結合(NHEJ)が、B24遺伝子内の修飾をもたらす。いくつかの実施形態では、NHEJは、ヌクレオチド(複数可)の欠失または挿入を引き起こし、B24遺伝子におけるフレームシフトまたはナンセンス変異を誘導する。特定の実施形態では、TCR配列、例えば、TRAC及びTRBCを標的とするガイド配列を含むgRNAもまた、RNAガイドDNAヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼとともに、または別個に、細胞に送達され、TCR配列内で遺伝子修飾を行い、全長TCR配列の発現を阻害する。特定の実施形態では、gRNAは、sgRNAである。
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。
いくつかの実施形態では、ガイドRNA、組成物、及び製剤は、エクスビボで細胞、例えば、免疫細胞、例えば、B24遺伝子における遺伝子修飾を有するT細胞を産生するために使用される。修飾T細胞は、ナチュラルキラー(NK)T細胞であってもよい。修飾T細胞は、ユニバーサルTCRまたは修飾TCRなどのT細胞受容体を発現し得る。T細胞は、ゼータ鎖シグナル伝達モチーフを有するCARまたはCAR構築物を発現し得る。
gRNA組成物の送達
脂質ナノ粒子(LNP)は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、エクスビボ及びインビトロでの本明細書に開示されるガイドRNA及び組成物の送達に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、LNPは、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質とともに送達する。
脂質ナノ粒子(LNP)は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、エクスビボ及びインビトロでの本明細書に開示されるガイドRNA及び組成物の送達に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、LNPは、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質とともに送達する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される細胞または細胞集団のうちのいずれか1つを対象に送達するための方法を含み、gRNAは、LNPを介して送達される。いくつかの実施形態では、gRNA/LNPはまた、Cas9またはCas9をコードするmRNAと会合する。
いくつかの実施形態では、本発明は、開示されるgRNA及びLNPのうちのいずれか1つを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Cas9またはCas9をコードするmRNAをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるgRNAと会合するLNPは、疾患または障害を治療するための医薬として細胞を調製する際に使用するためのものである。
エレクトロポレーションは、カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるgRNAのうちのいずれか1つの送達のために、任意のエレクトロポレーション方法論が使用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、本明細書に開示されるgRNA及びCas9またはCas9をコードするmRNAのうちのいずれか1つを送達するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるgRNAのうちのいずれか1つをエクスビボで細胞に送達する方法を含み、gRNAは、LNPと会合するか、またはLNPと会合しない。いくつかの実施形態では、gRNA/LNPまたはgRNAはまた、Cas9またはCas9をコードするmRNAと会合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドRNA組成物は、単独で、または1つ以上のベクターにコードされて、脂質ナノ粒子に製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、各々の内容が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、WO2017/173054及びWO2021/222287を参照のこと。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか1つ以上を含むガイドRNAのいずれかをコードするDNAまたはRNAベクターを含む。いくつかの実施形態では、ガイドRNA配列に加えて、ベクターは、ガイドRNAをコードしない核酸をさらに含む。ガイドRNAをコードしない核酸としては、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、及びRNAガイドDNAヌクレアーゼ(Cas9などのヌクレアーゼであってもよい)をコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、crRNA、trRNA、またはcrRNA及びtrRNAをコードする1つ以上のヌクレオチド配列(複数可)を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、sgRNAをコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、RNAガイドDNAヌクレアーゼをコードするmRNAと、を含み、RNAガイドDNAヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9またはCpf1であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、crRNA、trRNAをコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、RNAガイドDNAヌクレアーゼをコードするmRNAと、を含み、RNAガイドDNAヌクレアーゼは、Casタンパク質、例えば、Cas9であってもよい。一実施形態では、Cas9は、Streptococcus pyogenes由来である(すなわち、Spy Cas9)。いくつかの実施形態では、crRNA、trRNA、またはcrRNA及びtrRNA(sgRNAであってもよい)をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するCRISPR/Cas系由来の反復配列の全てまたは一部が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。crRNA、trRNA、またはcrRNA及びtrRNAを含むか、またはそれらからなる核酸は、さらにベクター配列を含んでいてもよく、ここで、ベクター配列は、自然状態ではcrRNA、trRNA、またはcrRNA及びtrRNAとともに見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、構成要素は、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、またはそれらは、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス)によって送達され得る。核酸の非ウイルス送達のための方法及び組成物は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、生物学的性質、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、LNP、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸の核酸(例えば、裸のDNA/RNA)、人工ビリオン、及びDNAの薬剤強化された取り込みを含む。例えば、Sonitron 2000システム(Rich-Mar)を使用するソノポレーション(Sonoporation)を、核酸の送達のために使用することもできる。
この説明及び例示的な実施形態は、限定として解釈されるべきではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、別途指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される量、パーセンテージ、または割合、及び他の数値を表す全ての数字は、どの場合においても「約」という用語によって、まだそれほど修飾されていない程度で修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、及び均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1-材料及び方法
次世代シークエンシング(「NGS」)及びオンターゲット切断効率の分析
ゲノムDNAは、QuickExtract(商標)DNA Extraction Solution(Lucigen、カタログ番号QE09050)を使用して、製造者のプロトコルに従って抽出した。
次世代シークエンシング(「NGS」)及びオンターゲット切断効率の分析
ゲノムDNAは、QuickExtract(商標)DNA Extraction Solution(Lucigen、カタログ番号QE09050)を使用して、製造者のプロトコルに従って抽出した。
ゲノム中の標的位置における編集効率を定量的に決定するために、ディープシークエンシングを使用して、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失(「インデル」)の存在を同定した。目的の遺伝子(例えば、2B4)内の標的部位周辺でPCRプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅させた。プライマー配列設計は、現場で標準として行われた。
シークエンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコル(Illumina)に従って追加のPCRを実施した。アンプリコンをIllumina MiSeq装置でシークエンシングした。低品質スコアを有する読み取りを除去した後に、読み取りをヒト参照ゲノム(例えば、hg38)とアラインメントした。読み取り値を含む得られたファイルを、参照ゲノム(BAMファイル)に対してマッピングし、目的の標的配列と重なり合った読み取り値を選択し、野生型の読み取り値の数と、挿入または欠失(「インデル」)を含む読み取り値の数を計算した。
実施例において使用される編集パーセンテージ(例えば、「編集効率」または「インデルパーセント」)は、野生型を含む配列読み取りの総数に対する、挿入または欠失(「インデル」)を含む配列読み取りの総数であると定義される。
脂質ナノ粒子の調製
別途指定されない限り、脂質構成要素を、様々なモル比で、100%エタノールに溶解した。RNAカーゴ(例えば、Cas9 mRNA及びsgRNA)を、25mMのクエン酸塩、100mMのNaCl(pH5.0)に溶解して、およそ0.45mg/mLのRNAカーゴ濃度を得た。
別途指定されない限り、脂質構成要素を、様々なモル比で、100%エタノールに溶解した。RNAカーゴ(例えば、Cas9 mRNA及びsgRNA)を、25mMのクエン酸塩、100mMのNaCl(pH5.0)に溶解して、およそ0.45mg/mLのRNAカーゴ濃度を得た。
別途指定されない限り、脂質核酸アセンブリは、3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノエート)とも呼ばれる、イオン化可能な脂質A((9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル オクタデカ-9,12-ジエノエート、コレステロール、DSPC、及びPEG2k-DMGを、それぞれ50:38:9:3のモル比で含んでいた。脂質核酸アセンブリは、別途指定されない限り、約6の脂質アミン対RNAホスフェートの(N:P)モル比、及び1:1のgRNA対mRNAの重量比で配合した。
クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を2体積のRNA溶液及び1体積の水と衝突噴流混合することによって、脂質ナノ粒子(LNP)を調製した。エタノール中の脂質を、交差混合により、2体積部のRNA溶液と混合する。第4の水の流れを、直列のティー(tee)を通る交差の出口流と混合した(WO2016010840の図2を参照)。LNPを室温(RT)で1時間保持し、さらに水で希釈した(およそ1:1 v/v)。LNPを、フラットシートカートリッジ(Sartorius、100kD MWCO)でタンジェンシャルフロー濾過を使用して濃縮し、PD-10脱塩カラム(GE)を用い、緩衝液を50mMのTris、45mMのNaCl、5%(w/v)のスクロース、pH7.5(TSS)に交換した。あるいは、LNPを、任意選択で、100kDaのアミコンスピンフィルターを使用して濃縮し、PD-10脱塩カラム(GE)を使用して緩衝液をTSSに交換した。次いで、得られた混合物を0.2μmの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終LNPを、さらなる使用まで4°Cまたは-80°Cで保存した。
mRNAのインビトロ転写(「IVT」)
N1-メチルシュード-Uを含むキャップされたポリアデニル化mRNAを、線状プラスミドDNAテンプレート及びT7 RNAポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。T7プロモーター、転写のための配列、及びポリアデニル化配列を含有するプラスミドDNAを、以下の条件下、XbaIと37°Cで2時間インキュベートすることによって線状化した。200ng/μLのプラスミド、2U/μLのXbaI(NEB)、及び1x反応緩衝液の条件で、XbaIとともに37℃で2時間インキュベートすることによって線状化する。XbaIを、反応物を65°Cで20分間加熱することによって不活性化した。線状プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。修飾mRNAを生成するためのIVT反応を、以下の条件下、37°Cで1.5~4時間インキュベートすることによって行った。50ng/μLの線状プラスミド、GTP、ATP、CTP、及びN1-メチルシュードUTP(Trilink)の各々、2~5mM、10~25mMのARCA(Trilink)、5U/μLのT7 RNAポリメラーゼ(NEB)、1U/μLのマウスRnase阻害剤(NEB)、0.004U/μLの無機E.coliピロホスファターゼ(NEB)、ならびに1×反応緩衝液。TURBO Dnase(ThermoFisher)を、最終濃度が0.01U/μLになるように添加し、反応物をさらに30分間インキュベートして、DNAテンプレートを除去した。MegaClear転写クリーンアップキット(ThermoFisher)またはRneasy Maxiキット(Qiagen)を製造者のプロトコルに従って使用し、mRNAを精製した。あるいは、mRNAを沈殿プロトコルにより精製し、いくつかの場合では、これに続いてHPLCベースの精製を行った。簡潔に述べると、Dnase消化後、LiCl沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、mRNAを精製する。HPLC精製mRNAについて、LiCl沈殿及び再構成後、mRNAをRP-IP HPLCによって精製した(例えば、Kariko,et al.Nucleic Acids Research,2011,Vol.39,No.21 e142を参照のこと)。プールのために選択された画分を合わせ、上記の酢酸ナトリウム/エタノール沈殿によって脱塩した。さらなる代替方法において、LiCl沈殿法、続いてタンジェンシャルフロー濾過によるさらなる精製によって、mRNAを精製した。RNA濃度を、260nm(Nanodrop)での光吸光度を測定することによって決定し、転写産物をBioanlayzer(Agilent)によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
N1-メチルシュード-Uを含むキャップされたポリアデニル化mRNAを、線状プラスミドDNAテンプレート及びT7 RNAポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。T7プロモーター、転写のための配列、及びポリアデニル化配列を含有するプラスミドDNAを、以下の条件下、XbaIと37°Cで2時間インキュベートすることによって線状化した。200ng/μLのプラスミド、2U/μLのXbaI(NEB)、及び1x反応緩衝液の条件で、XbaIとともに37℃で2時間インキュベートすることによって線状化する。XbaIを、反応物を65°Cで20分間加熱することによって不活性化した。線状プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。修飾mRNAを生成するためのIVT反応を、以下の条件下、37°Cで1.5~4時間インキュベートすることによって行った。50ng/μLの線状プラスミド、GTP、ATP、CTP、及びN1-メチルシュードUTP(Trilink)の各々、2~5mM、10~25mMのARCA(Trilink)、5U/μLのT7 RNAポリメラーゼ(NEB)、1U/μLのマウスRnase阻害剤(NEB)、0.004U/μLの無機E.coliピロホスファターゼ(NEB)、ならびに1×反応緩衝液。TURBO Dnase(ThermoFisher)を、最終濃度が0.01U/μLになるように添加し、反応物をさらに30分間インキュベートして、DNAテンプレートを除去した。MegaClear転写クリーンアップキット(ThermoFisher)またはRneasy Maxiキット(Qiagen)を製造者のプロトコルに従って使用し、mRNAを精製した。あるいは、mRNAを沈殿プロトコルにより精製し、いくつかの場合では、これに続いてHPLCベースの精製を行った。簡潔に述べると、Dnase消化後、LiCl沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、mRNAを精製する。HPLC精製mRNAについて、LiCl沈殿及び再構成後、mRNAをRP-IP HPLCによって精製した(例えば、Kariko,et al.Nucleic Acids Research,2011,Vol.39,No.21 e142を参照のこと)。プールのために選択された画分を合わせ、上記の酢酸ナトリウム/エタノール沈殿によって脱塩した。さらなる代替方法において、LiCl沈殿法、続いてタンジェンシャルフロー濾過によるさらなる精製によって、mRNAを精製した。RNA濃度を、260nm(Nanodrop)での光吸光度を測定することによって決定し、転写産物をBioanlayzer(Agilent)によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
配列番号801~803に従って、オープンリーディングフレームをコードするプラスミドDNAからStreptococcus pyogenes(「Spy」)Cas9 mRNAを生成した(表9の配列を参照)。配列番号801~803がRNAに関して以下で言及される場合、Tは、U(上記のようなN1-メチルシュードウリジンであった)で置き換えられるべきであることが理解される。実施例で使用されるメッセンジャーRNAは、5’キャップ及び3’ポリAテール、例えば、最大100ntを含み、表9の配列番号801~803によって同定される。
実施例2-HEK293細胞における2B4ガイドスクリーニング
HEK293細胞における2B4遺伝子座での編集有効性について、ガイドを設計及び試験した。目的の領域においてPAMを同定するために、ヒト参照ゲノム(例えば、hg38)及び目的のユーザが規定したゲノム領域(例えば、2B4)を用い、初期のガイド選択をインシリコで行った。同定された各PAMについて、分析を行い、統計を報告した。ガイドRNA分子をさらに選択し、当該技術分野において公知のいくつかの基準(例えば、GC含有量、予測されるオンターゲット活性、及び潜在的オフターゲット活性)に基づいてランク付けした。
HEK293細胞における2B4遺伝子座での編集有効性について、ガイドを設計及び試験した。目的の領域においてPAMを同定するために、ヒト参照ゲノム(例えば、hg38)及び目的のユーザが規定したゲノム領域(例えば、2B4)を用い、初期のガイド選択をインシリコで行った。同定された各PAMについて、分析を行い、統計を報告した。ガイドRNA分子をさらに選択し、当該技術分野において公知のいくつかの基準(例えば、GC含有量、予測されるオンターゲット活性、及び潜在的オフターゲット活性)に基づいてランク付けした。
2B4のタンパク質エクソンコード領域(ENSG00000122223)を標的とする合計86個のガイドRNAを試験した。ガイド配列及び対応するゲノム座標を上に提供する(表1)。
ガイドを、HEK293_Cas9細胞における編集効率について最初にスクリーニングした。Spy Cas9を構成的に発現するヒト胚性腎臓腺癌細胞株HEK293(「HEK293_Cas9」)を、10%のウシ胎仔血清を補充したDMEM培地中で培養した。トランスフェクションの約24時間前に、細胞を96ウェルプレート中で10,000細胞/ウェルの密度でプレーティングした(トランスフェクション時に約70%のコンフルエント)。細胞を、リポフェクタミンRNAiMAX(ThermoFisher,カタログ13778150)によって、製造者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。細胞を、個々のガイド(25nM)、trRNA(25nM)、Lipofectamine RNAiMAX(0.3μL/ウェル)、及びOptiMemを含むリポプレックスによってトランスフェクトした。DNA単離及びNGS分析を、実施例1に記載されるように行った。表4は、2つのプライマーセットを使用したHEK293_Cas9細胞におけるこれらのガイドによる2B4遺伝子座におけるインデル%を示す。「データなし」は、プライマーセットが計算された編集パーセンテージを生成できなかったことを示す。
実施例3-ヒトCD3+T細胞における2B4ガイドスクリーニング
28個のガイドを、CD3+T細胞における編集効率についてスクリーニングした。2人の健康なドナー由来のPan CD3+T細胞(StemCell)を解凍し、T細胞培地(RPMI 1640、10%ウシ胎仔血清、L-グルタミン、100uMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES緩衝液、22uMの2-メルカプトエタノール、及び100U/mlのヒト組換えインターロイキン-2(Peprotech、カタログ200-02))中1:100希釈のT Cell TransActヒト試薬(Miltenyi)の添加によって活性化した。リボ核タンパク質(RNP)は、20uMのsgRNA及び10uMの組換えCas9タンパク質を含む溶液を10分間インキュベートすることによって形成した。活性化の72時間後、T細胞を採取し、遠心分離し、P3エレクトロポレーション緩衝液(Lonza)中に5×10e6T細胞/mlの濃度で再懸濁した。CD3+T細胞を、P3 Primary Cell 96ウェルNucleofector(商標)キット(Lonza、カタログV4SP-3960)及びAmaxa(商標)96ウェルShuttle(商標)を製造者のパルスコードとともに使用して、RNPとトランスフェクトした。T細胞培地を、ヌクレオフェクション直後の細胞に添加し、4日間培養した。ゲノムDNAを収集し、実施例1に記載されるようにNGSを調製した。表5は、T細胞中の2B4遺伝子座における編集パーセンテージを示す。
28個のガイドを、CD3+T細胞における編集効率についてスクリーニングした。2人の健康なドナー由来のPan CD3+T細胞(StemCell)を解凍し、T細胞培地(RPMI 1640、10%ウシ胎仔血清、L-グルタミン、100uMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES緩衝液、22uMの2-メルカプトエタノール、及び100U/mlのヒト組換えインターロイキン-2(Peprotech、カタログ200-02))中1:100希釈のT Cell TransActヒト試薬(Miltenyi)の添加によって活性化した。リボ核タンパク質(RNP)は、20uMのsgRNA及び10uMの組換えCas9タンパク質を含む溶液を10分間インキュベートすることによって形成した。活性化の72時間後、T細胞を採取し、遠心分離し、P3エレクトロポレーション緩衝液(Lonza)中に5×10e6T細胞/mlの濃度で再懸濁した。CD3+T細胞を、P3 Primary Cell 96ウェルNucleofector(商標)キット(Lonza、カタログV4SP-3960)及びAmaxa(商標)96ウェルShuttle(商標)を製造者のパルスコードとともに使用して、RNPとトランスフェクトした。T細胞培地を、ヌクレオフェクション直後の細胞に添加し、4日間培養した。ゲノムDNAを収集し、実施例1に記載されるようにNGSを調製した。表5は、T細胞中の2B4遺伝子座における編集パーセンテージを示す。
実施例4-阻害剤遺伝子ノックアウトを有する操作されたT細胞
T細胞を、一連の遺伝子破壊及び挿入で操作した。健康なドナー細胞を、3つのLNPで連続的に処理し、各LNPは、Cas9及びsgRNA標的化をコードするmRNAと共製剤化した。最初に、TRBCをノックアウトするように細胞を編集した。ウィルムス腫瘍抗原(WT1 TCR)を標的とするトランスジェニックT細胞受容体(配列番号1001)を、AAVを使用して相同性指向修復テンプレートを送達することによって、TRAC切断部位に組み込んだ。最後に、2B4をノックアウトするようにT細胞を編集した。
T細胞を、一連の遺伝子破壊及び挿入で操作した。健康なドナー細胞を、3つのLNPで連続的に処理し、各LNPは、Cas9及びsgRNA標的化をコードするmRNAと共製剤化した。最初に、TRBCをノックアウトするように細胞を編集した。ウィルムス腫瘍抗原(WT1 TCR)を標的とするトランスジェニックT細胞受容体(配列番号1001)を、AAVを使用して相同性指向修復テンプレートを送達することによって、TRAC切断部位に組み込んだ。最後に、2B4をノックアウトするようにT細胞を編集した。
4.1.T細胞調製
健康なヒトドナーアフェレーシスを商業的に取得し(HemaCare)、洗浄し、CliniMACS PBS/EDTA緩衝液(Miltenyiカタログ130-070-525)中に再懸濁した。3人のドナーからのT細胞を、CD4及びCD8磁気ビーズ(Miltenyi BioTec、カタログ130-030-401、130-030-801)を使用し、CliniMACS Plus及びCliniMACS LS使い捨てキットを使用して陽性選択によって単離した。T細胞をバイアルに等分し、Cryostor CS10(StemCell Technologiesカタログ07930)及びPlasmalyte A(Baxterカタログ2B2522X)の1:1製剤中で将来の使用のために凍結保存した。T細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、T細胞活性化培地(TCAM):CTS OpTmizer(Thermofisher、カタログA3705001)(2.5%ヒトAB血清(Gemini、カタログ100-512)、1X GlutaMAX(Thermofisher、カタログ35050061)、10mM HEPES(Thermofisher、カタログ15630080)、200U/mLのIL-2(Peprotech、カタログ200-02)、IL-7(Peprotech、カタログ200-07)、IL-15(Peprotech、カタログ200-15)を含有するTCAM中で5ug/mLの濃度でインキュベートした。
健康なヒトドナーアフェレーシスを商業的に取得し(HemaCare)、洗浄し、CliniMACS PBS/EDTA緩衝液(Miltenyiカタログ130-070-525)中に再懸濁した。3人のドナーからのT細胞を、CD4及びCD8磁気ビーズ(Miltenyi BioTec、カタログ130-030-401、130-030-801)を使用し、CliniMACS Plus及びCliniMACS LS使い捨てキットを使用して陽性選択によって単離した。T細胞をバイアルに等分し、Cryostor CS10(StemCell Technologiesカタログ07930)及びPlasmalyte A(Baxterカタログ2B2522X)の1:1製剤中で将来の使用のために凍結保存した。T細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、T細胞活性化培地(TCAM):CTS OpTmizer(Thermofisher、カタログA3705001)(2.5%ヒトAB血清(Gemini、カタログ100-512)、1X GlutaMAX(Thermofisher、カタログ35050061)、10mM HEPES(Thermofisher、カタログ15630080)、200U/mLのIL-2(Peprotech、カタログ200-02)、IL-7(Peprotech、カタログ200-07)、IL-15(Peprotech、カタログ200-15)を含有するTCAM中で5ug/mLの濃度でインキュベートした。
4.2.LNP処理及びT細胞の拡張
1日目に、Cas9 mRNA及びTRBCを標的とするsgRNAを含有するLNP(G016239)を、1ug/mLのrhApoE3(Peprotech、カタログ350-02)を含有するTCAM中で5ug/mLの濃度でインキュベートした。一方、T細胞を採取し、洗浄し、ヒト試薬であるT細胞TransAct(Miltenyi、カタログ130-111-160)を1:50の希釈でTCAM中に2×106細胞/mLの密度で再懸濁した。T細胞及びLNP-ApoE培地を1:1の比で混合し、T細胞を培養フラスコ中で一晩プレーティングした。
1日目に、Cas9 mRNA及びTRBCを標的とするsgRNAを含有するLNP(G016239)を、1ug/mLのrhApoE3(Peprotech、カタログ350-02)を含有するTCAM中で5ug/mLの濃度でインキュベートした。一方、T細胞を採取し、洗浄し、ヒト試薬であるT細胞TransAct(Miltenyi、カタログ130-111-160)を1:50の希釈でTCAM中に2×106細胞/mLの密度で再懸濁した。T細胞及びLNP-ApoE培地を1:1の比で混合し、T細胞を培養フラスコ中で一晩プレーティングした。
3日目に、T細胞を採取し、洗浄し、TCAM中に1×106細胞/mLの密度で再懸濁した。Cas9 mRNA及びTRACを標的とするsgRNAを含有するLNP(G013006)を、5ug/mLのrhApoE3(Peprotech、カタログ350-02)を含有するTCAM中で5ug/mLの濃度でインキュベートした。T細胞及びLNP-ApoE培地を1:1の比で混合し、T細胞を培養フラスコ中でプレーティングした。次いで、WT1 TCRを含有するAAVを、3×105ゲノムコピー/細胞のMOIで各群に添加した。これらの編集を有する細胞は、表及び図において「WT1 T細胞」と称される。
4日目に、T細胞を採取し、洗浄し、TCAM中に1×106細胞/mLの密度で再懸濁した。Cas9 mRNA及び表7に列挙されるgRNAのうちの1つを含有するLNP。LNPを、5ug/mLのrhApoE3(Peprotech、カタログ350-02)を含有するTCAM中で5ug/mLの濃度でインキュベートした。次いで、LNP-ApoE溶液を、1:1の比で適切な培養物に添加した。
5~11日目に、T細胞を、T細胞増殖培地(TCEM):CTS OpTmizer(Thermofisher、カタログA3705001)(5% CTS免疫細胞血清置換(Thermofisher、カタログA2596101)、1X GlutaMAX(Thermofisher、カタログ35050061)、10mMのHEPES(Thermofisher、カタログ15630080)、200U/mLのIL-2(Peprotech、カタログ200-02)、IL-7(Peprotech、カタログ200-07)、及びIL-15(Peprotech、カタログ200-15))中の24ウェルGREXプレート(Wilson Wolf、カタログ80192)に移した。製造者のプロトコルに従って、細胞を拡張した。T細胞を6日間拡張し、培地を1日おきに交換した。細胞を、Vi-CELL細胞計数器(Beckman Coulter)を使用して計数し、全ての試料が類似した倍率拡張を示した。
4.3.フローサイトメトリー及びNGSによるT細胞編集の定量化
拡張後、編集されたT細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、TCR挿入及びメモリー細胞表現型を決定した。T細胞を、以下の分子を標的とする抗体カクテルとともにインキュベートした。CD4(Biolegend、カタログ300524)、CD8(Biolegend、カタログ301045)、Vb8(Biolegend、カタログ348106)、CD3(Biolegend、カタログ300327)、CD62L(Biolegend、カタログ304844)、CD45RO(Biolegend、カタログ304230)、CCR7(Biolegend、カタログ353214)、及びCD45RA(Biolegend、カタログ304106)。その後、細胞をCytoflex LX装置(Beckman Coulter)で処理し、データをFlowJoソフトウェアパッケージを使用して分析した。連続T細胞操作後に関連する細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを、表6A~6C及び図1A~1Cに示す。表6Aは、T細胞操作後のCD8+細胞の総パーセンテージ、及びVb8抗体で検出された、操作されたTCRを発現するCD8+またはCD4+細胞の割合を示す。表6B及び図1Aは、幹細胞メモリー表現型(Tscm;CD45RA+CD62L+)を有するCD8+Vb8+細胞のパーセンテージを示す。表6C及び図1Bは、中央メモリー細胞表現型(Tcm;CD45RO+CD62L+)を有するCD8+Vb8+細胞のパーセンテージを示す。表6C及び図1Cは、エフェクターメモリー表現型(Tem;CD45RO+CD62L-CCR7-)を有する全細胞のパーセンテージを示す。フローサイトメトリー分析に加えて、実施例1に記載されるようにゲノムDNAを調製し、NGS分析を実施して、各標的部位における編集速度を決定した。表7及び図2A~2Bは、第3の連続編集で操作された遺伝子座におけるインデル頻度の結果を示す。
拡張後、編集されたT細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、TCR挿入及びメモリー細胞表現型を決定した。T細胞を、以下の分子を標的とする抗体カクテルとともにインキュベートした。CD4(Biolegend、カタログ300524)、CD8(Biolegend、カタログ301045)、Vb8(Biolegend、カタログ348106)、CD3(Biolegend、カタログ300327)、CD62L(Biolegend、カタログ304844)、CD45RO(Biolegend、カタログ304230)、CCR7(Biolegend、カタログ353214)、及びCD45RA(Biolegend、カタログ304106)。その後、細胞をCytoflex LX装置(Beckman Coulter)で処理し、データをFlowJoソフトウェアパッケージを使用して分析した。連続T細胞操作後に関連する細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを、表6A~6C及び図1A~1Cに示す。表6Aは、T細胞操作後のCD8+細胞の総パーセンテージ、及びVb8抗体で検出された、操作されたTCRを発現するCD8+またはCD4+細胞の割合を示す。表6B及び図1Aは、幹細胞メモリー表現型(Tscm;CD45RA+CD62L+)を有するCD8+Vb8+細胞のパーセンテージを示す。表6C及び図1Bは、中央メモリー細胞表現型(Tcm;CD45RO+CD62L+)を有するCD8+Vb8+細胞のパーセンテージを示す。表6C及び図1Cは、エフェクターメモリー表現型(Tem;CD45RO+CD62L-CCR7-)を有する全細胞のパーセンテージを示す。フローサイトメトリー分析に加えて、実施例1に記載されるようにゲノムDNAを調製し、NGS分析を実施して、各標的部位における編集速度を決定した。表7及び図2A~2Bは、第3の連続編集で操作された遺伝子座におけるインデル頻度の結果を示す。
実施例5-操作されたT細胞による標的細胞死滅
実施例4で操作したT細胞を、Incucyte Live Imagingシステムを使用して、原発性白血病芽球を殺傷する能力について評価した。簡潔に述べると、T細胞を操作して、WT1 TCRをTRAC遺伝子座に挿入し、2つのT細胞ドナー試料(WT1 T細胞)中のTRBC遺伝子座をノックアウトした。第3の操作ステップでは、いくつかのWT1 T細胞を、G021215またはG021216を使用して2B4をノックアウトするように処理した。3人のHLA-A*02:01患者から採取したWT1を発現する原発性白血病芽球を、生細胞核標識用のNucLight Rapid Red試薬(Essen Bioscences)で標識し、カスパーゼ3/7緑色試薬の存在下で、異なる(5:1、1:1、及び1:5)のエフェクター対標的(E:T)比で操作されたリンパ球と共培養した。E:T比5:1の場合は2万芽球、E:T比1:1及び1:5の場合はで75,000芽球を使用した。共培養物を、5%のFBS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(BioWhittaker/Lonza)、2mMのグルタミン(BioWhittaker/Lonza)、1μg/mLのCD28モノクローナル抗体(BD Biosciences)、G-CSF及びIL-3(20ng/mL、Bio-techne)を補充したX-VIVO中の平底96ウェルプレートに播種した。画像を60分ごとに撮影し、赤色標的細胞中の緑色蛍光カスパーゼ3/7シグナルを、Incucyte Live-Cell Imaging and Analysisソフトウェア(Essen Biosciences)を使用して定量化した。このアッセイでは、生きたAML細胞は赤色のみで蛍光を発するが、死んだAML細胞は赤色及び緑色の両方で蛍光を発する。
実施例4で操作したT細胞を、Incucyte Live Imagingシステムを使用して、原発性白血病芽球を殺傷する能力について評価した。簡潔に述べると、T細胞を操作して、WT1 TCRをTRAC遺伝子座に挿入し、2つのT細胞ドナー試料(WT1 T細胞)中のTRBC遺伝子座をノックアウトした。第3の操作ステップでは、いくつかのWT1 T細胞を、G021215またはG021216を使用して2B4をノックアウトするように処理した。3人のHLA-A*02:01患者から採取したWT1を発現する原発性白血病芽球を、生細胞核標識用のNucLight Rapid Red試薬(Essen Bioscences)で標識し、カスパーゼ3/7緑色試薬の存在下で、異なる(5:1、1:1、及び1:5)のエフェクター対標的(E:T)比で操作されたリンパ球と共培養した。E:T比5:1の場合は2万芽球、E:T比1:1及び1:5の場合はで75,000芽球を使用した。共培養物を、5%のFBS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(BioWhittaker/Lonza)、2mMのグルタミン(BioWhittaker/Lonza)、1μg/mLのCD28モノクローナル抗体(BD Biosciences)、G-CSF及びIL-3(20ng/mL、Bio-techne)を補充したX-VIVO中の平底96ウェルプレートに播種した。画像を60分ごとに撮影し、赤色標的細胞中の緑色蛍光カスパーゼ3/7シグナルを、Incucyte Live-Cell Imaging and Analysisソフトウェア(Essen Biosciences)を使用して定量化した。このアッセイでは、生きたAML細胞は赤色のみで蛍光を発するが、死んだAML細胞は赤色及び緑色の両方で蛍光を発する。
表8及び図3A~図3Iは、緑色及び赤色の両方で蛍光を発する各画像の平均面積(um2/画像)の平均±SEMを示す。各エフェクター集団について、上記のように、2つの異なるT細胞ドナーからの操作された細胞を使用した。
実施例6-操作されたT細胞を使用したAML細胞の増殖の阻害
チェックポイント阻害剤は、がんなどの増殖性障害において生じ得る免疫消耗と関連付けられる。WT1に関連する増殖性障害としては、急性骨髄性白血病(AML)及び慢性骨髄性白血病(CML)を含む多数の血液悪性腫瘍が挙げられる。チェックポイント阻害剤の発現を低減し、WT1 TCRの発現を誘導するために実施例7の方法によって調製した細胞を、インビトロ及びインビボの両方の既知のAMLモデルを使用して試験する(例えば、Zhou et al.,Blood(2009)114:3793-3802を参照のこと)。
チェックポイント阻害剤は、がんなどの増殖性障害において生じ得る免疫消耗と関連付けられる。WT1に関連する増殖性障害としては、急性骨髄性白血病(AML)及び慢性骨髄性白血病(CML)を含む多数の血液悪性腫瘍が挙げられる。チェックポイント阻害剤の発現を低減し、WT1 TCRの発現を誘導するために実施例7の方法によって調製した細胞を、インビトロ及びインビボの両方の既知のAMLモデルを使用して試験する(例えば、Zhou et al.,Blood(2009)114:3793-3802を参照のこと)。
インビトロ細胞死滅アッセイを使用して、異常な増殖を有する細胞に対するT細胞の活性を検出することができる。実施例7の方法によって調製されたT細胞が標的細胞を排除する能力は、操作されたT細胞を、WT1抗原の高発現を伴う急性骨髄性白血病(AML)由来の原発性白血病芽球(CD33+細胞)と共培養することによって評価される。白血病芽球は、例えば、実施例5と同様であり得る。
ヒトWT1発現AML細胞株を、0日目に致死用量で静脈内経路を介してマウスに注射する。実施例7の方法によって調製した細胞を、14日目に静脈内投与する。マウスの生存をモニターする。WT1 TCRを発現するように操作されたT細胞で処置されたマウスは、WT1 TCRを発現しないT細胞で処置されたマウスよりも長く生存可能である。WT1 TCRの発現に加えて、チェックポイント阻害剤の発現を阻害するように操作されたT細胞で処置されたマウスは、WT1 TCR及び全ての内因性チェックポイント阻害剤を発現するT細胞で処置されたマウスよりも長く生存可能である。
実施例7.追加の実施形態
実施形態1 chr1:160830160-160862887のゲノム座標内に、ヒト2B4配列における遺伝子修飾を含む、操作された細胞。
実施形態1 chr1:160830160-160862887のゲノム座標内に、ヒト2B4配列における遺伝子修飾を含む、操作された細胞。
実施形態2 前記遺伝子修飾が、挿入、欠失、及び置換から選択される、実施形態1に記載の操作された細胞。
実施形態3 前記遺伝子修飾が、前記2B4遺伝子の発現を阻害する、請求項1または2に記載の操作された細胞。
実施形態4 前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
任意選択で、2B4-1~2B4-5、2B4-1及び2B4-2、または2B4-3、2B4-4、2B4-10、及び2B4-17によって標的とされるものから選択されるゲノム座標内に少なくとも1個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態1~3のいずれか1つに記載の操作された細胞。
任意選択で、2B4-1~2B4-5、2B4-1及び2B4-2、または2B4-3、2B4-4、2B4-10、及び2B4-17によって標的とされるものから選択されるゲノム座標内に少なくとも1個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態1~3のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態5 前記操作された細胞が、内因性T細胞受容体(TCR)配列の前記ゲノム座標内に遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、前記TCR遺伝子の発現を阻害する、実施形態1~4のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態6 前記TCR遺伝子が、TRACまたはTRBCである、実施形態5に記載の操作された細胞。
実施形態8 以下から選択されるゲノム座標内にTRACの遺伝子修飾を含み、
任意選択で、前記遺伝子修飾が、chr14:22547524-22547544、chr14:22547529-22547549、chr14:22547525-22547545、chr14:22547536-22547556、chr14:22547501-22547521、chr14:22547556-22547576、及びchr14:22547502-22547522から選択されるゲノム座標内にある、実施形態5~7のいずれか1つに記載の操作された細胞。
任意選択で、前記遺伝子修飾が、chr14:22547524-22547544、chr14:22547529-22547549、chr14:22547525-22547545、chr14:22547536-22547556、chr14:22547501-22547521、chr14:22547556-22547576、及びchr14:22547502-22547522から選択されるゲノム座標内にある、実施形態5~7のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態9 前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、1つ以上のMHCクラスIタンパク質の発現を阻害する、実施形態1~8のいずれか1項に記載の操作された細胞。
実施形態10 1つ以上のMHCクラスIタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、B2M配列における遺伝子修飾であり、前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標内にある、実施形態9に記載の操作された細胞。
実施形態11 1つ以上のMHCクラスIタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、HLA-A配列における遺伝子修飾であり、任意選択で、前記遺伝子修飾が、chr6:29942854-chr6:29942913及びchr6:29943518-chr6:29943619から選択されるゲノム座標、任意選択で、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883-29942903、chr6:29943126-29943146、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550、chr6:29943537-29943557、chr6:29943549-29943569、chr6:29943589-29943609、及びchr6:29944026-29944046から選択されるゲノム座標内にある、実施形態9に記載の操作された細胞。
実施形態12 前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、1つ以上のMHCクラスIIタンパク質の発現を阻害する、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態13 1つ以上のMHCクラスIIタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、CIITA配列における遺伝子修飾であり、前記遺伝子修飾が、chr:16:10902171-10923242、任意選択で、chr16:10902662-10923285、chr16:10906542-10923285、またはchr16:10906542-10908121、任意選択で、chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430、及びchr16:10908130-10908150;任意選択で、chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512、及びchr16:10906487-1090650;または任意選択で、chr16:10916432-10916452、chr16:10922444-10922464、chr16:10907924-10907944、chr16:10906985-10907005、chr16:10908073-10908093、chr16:10907433-10907453、chr16:10907979-10907999、chr16:10907139-10907159、chr16:10922435-10922455、chr16:10907384-10907404、chr16:10907434-10907454、chr16:10907119-10907139、chr16:10907539-10907559、chr16:10907810-10907830、chr16:10907315-10907335、chr16:10916426-10916446、chr16:10909138-10909158、chr16:10908101-10908121、chr16:10907790-10907810、chr16:10907787-10907807、chr16:10907454-10907474、chr16:10895702-10895722、chr16:10902729-10902749、chr16:10918492-10918512、chr16:10907932-10907952、chr16:10907623-10907643、chr16:10907461-10907481、chr16:10902723-10902743、chr16:10907622-10907642、chr16:10922441-10922461、chr16:10902662-10902682、chr16:10915626-10915646、chr16:10915592-10915612、chr16:10907385-10907405、chr16:10907030-10907050、chr16:10907935-10907955、chr16:10906853-10906873、chr16:10906757-10906777、chr16:10907730-10907750、及びchr16:10895302-10895322から選択されるゲノム座標内にある、実施形態12に記載の操作された細胞。
実施形態14 1つ以上のMHCクラスIIタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、CIITAスプライス部位の少なくとも1つのヌクレオチドの修飾、任意選択で、
a)CIITAスプライスドナー部位の少なくとも1つのヌクレオチドの修飾、及び/または
b)CIITAスプライス部位境界ヌクレオチドの修飾を含む、実施形態12または13に記載の操作された細胞。
a)CIITAスプライスドナー部位の少なくとも1つのヌクレオチドの修飾、及び/または
b)CIITAスプライス部位境界ヌクレオチドの修飾を含む、実施形態12または13に記載の操作された細胞。
実施形態15 前記細胞が、2B4タンパク質の細胞表面発現が低減されている、実施形態1~14のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態16 前記細胞が、2B4タンパク質の細胞表面発現が低減されており、かつTRACタンパク質の細胞表面発現が低減されている、実施形態1~15のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態17 TRBCタンパク質の細胞表面発現の低減をさらに含む、実施形態15または16に記載の操作された細胞。
実施形態18 2B4の細胞表面発現が、検出レベル未満である、実施形態16または17のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態19 TRAC及びTRBCのうちの少なくとも1つの細胞表面発現が、検出レベル未満である、実施形態16~18のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態20 2B4、TRAC、及びTRBCの各々の細胞表面発現が、検出レベル未満である、実施形態19に記載の操作された細胞。
実施形態21 chr12:6772483-6778455のゲノム座標内に、ヒトLAG3配列における遺伝子修飾を含む、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態22 LAG3における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
任意選択で、LAG3-1~LAG3-15、LAG3-1~LAG3-11、LAG3-1~LAG3-4、またはLAG3-1、LAG3-4、LAG3-5、及びLAG3-9によって標的とされるものから選択されるゲノム座標内にある、実施形態21に記載の操作された細胞。
実施形態23 chr5:157085832-157109044のゲノム座標内に、ヒトTIM3配列における遺伝子修飾を含む、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態24 TIM3における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
任意選択で、TIM3-1~TIM3-4、TIM3-6~TIM3-15、TIM3-18、TIM3-19、TIM3-22、TIM3-29、TIM3-42、TIM3-44、TIM3-58、TIM3-62、TIM3-69、TIM3-82、TIM3-86、及びTIM3-88;TIM3-1~TIM3-5、TIM3-7、TIM3-8、TIM3-12~TIM3-15、TIM3-23、TIM3-26、TIM3-32、TIM3-56、TIM3-59、TIM3-63、TIM3-66、TIM3-75、及びTIM3-87;TIM3-2、TIM3-4、TIM3-15、TIM3-23、TIM3-56、TIM3-59、TIM3-63、TIM3-75、及びTIM3-87;TIM3-1~TIM3-4;TIM3-2、TIM-4、及びTIM3-15;TIM3-2、TIM-4、TIM3-15、TIM3-63、及びTIM3-87;TIM3-2及びTIM3-15;TIM3-63及びTIM3-87;またはTIM3-15によって標的とされるものから選択されるゲノム座標内にある、実施形態23に記載の操作された細胞。
実施形態25 chr2:241849881-241858908のゲノム座標内に、ヒトPD-1配列における遺伝子修飾を含む、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態26 示されるゲノム座標における遺伝子修飾が、挿入、欠失、及び置換から選択される、実施形態21~25のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態27 前記遺伝子修飾が、前記遺伝子修飾が存在する遺伝子の発現を阻害する、実施形態21~26のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態28 前記遺伝子修飾が、インデルを含む、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態29 前記遺伝子修飾が、異種コード配列の挿入を含む、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態30 前記遺伝子修飾が、置換を含む、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態31 前記置換が、CからTへの置換またはAからGへの置換を含む、実施形態30に記載の操作された細胞。
実施形態32 前記遺伝子修飾が、遺伝子修飾の前に、全長タンパク質のアミノ酸配列を有する前記全長タンパク質の翻訳を妨げる、前記核酸配列の変化をもたらす、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態33 前記遺伝子修飾が、前記全長タンパク質のコード配列における未成熟終止コドンをもたらす前記核酸配列の変化をもたらす、実施形態32に記載の操作された細胞。
実施形態34 前記遺伝子修飾が、前記ゲノム遺伝子座からのpre-mRNAのスプライシングの変化をもたらす核酸配列の変化をもたらす、実施形態32に記載の操作された細胞。
実施形態35 前記阻害が、遺伝子修飾を含む遺伝子からのタンパク質の細胞表面発現の低減をもたらす、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態36 前記阻害が、遺伝子修飾を含む遺伝子によって調節されるタンパク質の細胞表面発現の低減をもたらす、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態37 前記細胞が、前記操作された細胞の表面上で発現される標的化受容体をコードする外因性核酸を含む、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態38 前記標的化受容体が、CARである、実施形態37に記載の操作された細胞。
実施形態39 前記標的化受容体が、TCRである、実施形態37に記載の操作された細胞。
実施形態40 前記標的化受容体が、WT1 TCRである、実施形態39に記載の操作された細胞。
実施形態41 前記操作された細胞が、免疫細胞である、上記実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞。
実施形態42 前記操作された細胞が、単球、マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、または顆粒球である、実施形態41に記載の操作された細胞。
実施形態43 前記操作された細胞が、リンパ球である、実施形態41に記載の操作された細胞。
実施形態44 前記操作された細胞が、T細胞である、実施形態43に記載の操作された細胞。
実施形態45 実施形態1~44のいずれか1つに記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
実施形態46 実施形態1~44のいずれか1つに記載の操作された細胞を含む、細胞集団。
実施形態47 前記細胞集団を含む薬学的組成物であって、前記細胞集団が、実施形態1~44のいずれか1つに記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
実施形態48 先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、細胞集団、薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法。
実施形態49 先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、養子細胞移植(ACT)療法として対象に投与する方法。
実施形態50 ACT療法として使用するための、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物。
実施形態51 以下から選択されるヌクレオチド配列を含む2B4配列に特異的にハイブリダイズする、2B4ガイドRNA:
a.配列番号1~28から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
b.配列番号1~28の配列から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むガイド配列、
c.配列番号1~28から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%同一または少なくとも90%同一のヌクレオチド配列を含むガイド配列、
d.配列番号1~5から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
e.配列番号1及び2から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、ならびに
f.配列番号3、4、10、及び17から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列。
a.配列番号1~28から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
b.配列番号1~28の配列から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むガイド配列、
c.配列番号1~28から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%同一または少なくとも90%同一のヌクレオチド配列を含むガイド配列、
d.配列番号1~5から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
e.配列番号1及び2から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、ならびに
f.配列番号3、4、10、及び17から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列。
実施形態52 RNAガイドDNA結合剤を、配列番号1~28によって標的とされたものから選択されるゲノム座標内の染色体位置、任意選択で配列番号1~5によって標的とされたゲノム座標から選択されるゲノム座標、任意選択で配列番号1及び2によって標的とされたゲノム座標から選択されるゲノム座標、または任意選択で配列番号3、4、10、及び17によって標的とされたゲノム座標から選択されるゲノム座標に指向するガイド配列を含む、2B4ガイドRNA。
実施形態53 前記ガイドRNAが、デュアルガイドRNA(dgRNA)である、実施形態51または52のガイドRNA。
実施形態54 前記ガイドRNAが、単一ガイドRNA(sgRNA)である、実施形態51または52のガイドRNA。
実施形態55 前記ガイド配列に対する配列番号400 3’のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ガイドRNAが、5’末端修飾または3’末端修飾を含む、実施形態54に記載のガイドRNA。
実施形態56 5’末端修飾または3’末端修飾及びgRNAの保存部分をさらに含み、前記保存部分が、
A.短縮されたヘアピン1領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン1領域であって、
1.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、またはH1-4及びH1-9のうちの少なくとも1つが、置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン1においてワトソン-クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、前記ヘアピン1領域が、任意選択で、
a.H1-5~H1-8のうちのいずれか1つもしくは2つ、
b.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、ならびにH1-4及びH1-9のうちの1つ、2つ、もしくは3つ、または
c.ヘアピン1領域の1~8個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
2.前記短縮されたヘアピン1領域が、4~8個のヌクレオチド、好ましくは4~6個のヌクレオチドを欠いており、
a.位置H1-1、H1-2、もしくはH1-3のうちの1つ以上が、配列番号400に対して欠失もしくは置換されているか、または
b.位置H1-6~H1-10のうちの1つ以上が、配列番号400に対して置換されているか、または
3.前記短縮されたヘアピン1領域が、5~10個のヌクレオチド、好ましくは5~6個のヌクレオチドを欠いており、位置N18、H1-12、もしくはnのうちの1つ以上が、配列番号400に対して置換されている、前記ヘアピン1領域、あるいは
B.短縮された上部ステム領域であって、前記短縮された上部ステム領域が、1~6個のヌクレオチドを欠いており、前記短縮された上部ステム領域の6、7、8、9、10、または11個のヌクレオチドが、配列番号400に対して4個以下の置換を含む、前記短縮された上部ステム領域、あるいは
C.LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2、及びH2-14のうちのいずれか1つ以上における配列番号400に対する置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、前記置換、あるいは
D.上部ステム領域であって、前記上部ステムの修飾が、前記上部ステム領域におけるUS1~US12のうちのいずれか1つ以上の修飾を含む、前記上部ステムの修飾のうちの1つ以上を含む、実施形態54に記載のガイドRNA。
A.短縮されたヘアピン1領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン1領域であって、
1.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、またはH1-4及びH1-9のうちの少なくとも1つが、置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン1においてワトソン-クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、前記ヘアピン1領域が、任意選択で、
a.H1-5~H1-8のうちのいずれか1つもしくは2つ、
b.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、ならびにH1-4及びH1-9のうちの1つ、2つ、もしくは3つ、または
c.ヘアピン1領域の1~8個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
2.前記短縮されたヘアピン1領域が、4~8個のヌクレオチド、好ましくは4~6個のヌクレオチドを欠いており、
a.位置H1-1、H1-2、もしくはH1-3のうちの1つ以上が、配列番号400に対して欠失もしくは置換されているか、または
b.位置H1-6~H1-10のうちの1つ以上が、配列番号400に対して置換されているか、または
3.前記短縮されたヘアピン1領域が、5~10個のヌクレオチド、好ましくは5~6個のヌクレオチドを欠いており、位置N18、H1-12、もしくはnのうちの1つ以上が、配列番号400に対して置換されている、前記ヘアピン1領域、あるいは
B.短縮された上部ステム領域であって、前記短縮された上部ステム領域が、1~6個のヌクレオチドを欠いており、前記短縮された上部ステム領域の6、7、8、9、10、または11個のヌクレオチドが、配列番号400に対して4個以下の置換を含む、前記短縮された上部ステム領域、あるいは
C.LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2、及びH2-14のうちのいずれか1つ以上における配列番号400に対する置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、前記置換、あるいは
D.上部ステム領域であって、前記上部ステムの修飾が、前記上部ステム領域におけるUS1~US12のうちのいずれか1つ以上の修飾を含む、前記上部ステムの修飾のうちの1つ以上を含む、実施形態54に記載のガイドRNA。
実施形態57 前記ガイド配列に対して配列番号200(GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG)3’のヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態54に記載のガイドRNA。
実施形態58 前記ガイド配列に対してGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号201)3’、任意選択で、前記ガイド配列に対してGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号202)3’のヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態54に記載のガイドRNA。
実施形態59 前記ガイドRNAが、mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号300)のパターンに従って修飾され、「N」が、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり得、mが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチドであり、*が、ヌクレオチド残基間のホスホロチオエート連結であり、前記Nが、集合的に、任意の先行実施形態のガイド配列のヌクレオチド配列である、実施形態57または58に記載のガイドRNAである。
実施形態60 各Nが、独立して、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、前記ガイド配列が、2B4遺伝子に対してCas9を標的とする、実施形態59に記載のガイドRNA。
実施形態61 前記ガイドRNAが、修飾を含む、実施形態53~60のいずれか1つに記載のガイドRNA。
実施形態62 前記修飾が、2’-O-メチル(2’-O-Me)修飾ヌクレオチドまたは2’-F修飾ヌクレオチドを含む、実施形態61に記載のガイドRNA。
実施形態63 前記修飾が、ヌクレオチド間にホスホロチオエート(PS)結合を含む、実施形態61または62に記載のガイドRNA。
実施形態64 前記ガイドRNAが、sgRNAであり、前記修飾が、ガイドRNAの5’末端での5個のヌクレオチドのうちの1つ以上における修飾を含む、実施形態61~63のいずれか1つに記載のガイドRNA。
実施形態65 前記ガイドRNAが、sgRNAであり、前記修飾が、ガイドRNAの3’末端での5個のヌクレオチドのうちの1つ以上における修飾を含む、実施形態61~64のいずれか1つに記載のガイドRNA。
実施形態66 前記ガイドRNAが、sgRNAであり、前記修飾が、ガイドRNAの5’末端での4個のヌクレオチドの各々の間にPS結合を含む、実施形態61~65のいずれか1つに記載のガイドRNA。
実施形態67 前記ガイドRNAが、sgRNAであり、前記修飾が、ガイドRNAの3’末端での4個のヌクレオチドの各々の間にPS結合を含む、実施形態61~66のいずれか1つに記載のガイドRNA。
実施形態68 前記ガイドRNAが、sgRNAであり、前記修飾が、ガイドRNAの5’末端での最初の3個のヌクレオチドの各々に2’-O-Me修飾ヌクレオチドを含む、実施形態61~67のいずれか1つに記載のガイドRNA。
実施形態69 前記ガイドRNAが、sgRNAであり、前記修飾が、ガイドRNAの3’末端での最後の3個のヌクレオチドの各々に2’-O-Me修飾ヌクレオチドを含む、実施形態61~68のいずれか1つに記載のガイドRNA。
実施形態70 RNAガイドDNA結合剤が、ポリペプチドRNAガイドDNA結合剤、またはRNAガイドDNA結合剤ポリペプチドをコードする核酸であり、任意選択で、前記RNAガイドDNA結合剤が、Cas9ヌクレアーゼである、実施形態53~69のいずれか1つに記載のガイドRNA、及びRNAガイドDNA結合剤を含む組成物。
実施形態71 前記RNAガイドDNA結合剤が、DNA配列内で修飾を行うことができるポリペプチドである、実施形態70に記載の組成物。
実施形態72 前記RNAガイドDNA結合剤が、S.pyogenes Cas9ヌクレアーゼである、実施形態71に記載の組成物。
実施形態73 前記ヌクレアーゼが、切断、ニッカーゼ、及び不活性型ヌクレアーゼの群から選択される、実施形態70~72のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態74 前記RNAガイドDNA結合剤をコードする核酸が、
a.DNAコード配列、
b.オープンリーディングフレーム(ORF)を有するmRNA、
c.発現ベクターにおけるコード配列、
d.ウイルスベクターにおけるコード配列から選択される、実施形態70に記載の組成物。
a.DNAコード配列、
b.オープンリーディングフレーム(ORF)を有するmRNA、
c.発現ベクターにおけるコード配列、
d.ウイルスベクターにおけるコード配列から選択される、実施形態70に記載の組成物。
実施形態75 以下から選択されるゲノム座標に特異的にハイブリダイズするガイドRNAをさらに含み、
任意選択で、前記遺伝子修飾が、chr14:22547524-22547544、chr14:22547529-22547549、chr14:22547525-22547545、chr14:22547536-22547556、chr14:22547501-22547521、chr14:22547556-22547576、及びchr14:22547502-22547522から選択されるゲノム座標内にある、実施形態70~74のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態77 chr:16:10902171-10923242、任意選択で、chr16:10902662-chr16:10923285、chr16:10906542-10923285、またはchr16:10906542-10908121、任意選択で、chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430、及びchr16:10908130-10908150、任意選択で、chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512、及びchr16:10906487-1090650、または任意選択で、chr16:10916432-10916452、chr16:10922444-10922464、chr16:10907924-10907944、chr16:10906985-10907005、chr16:10908073-10908093、chr16:10907433-10907453、chr16:10907979-10907999、chr16:10907139-10907159、chr16:10922435-10922455、chr16:10907384-10907404、chr16:10907434-10907454、chr16:10907119-10907139、chr16:10907539-10907559、chr16:10907810-10907830、chr16:10907315-10907335、chr16:10916426-10916446、chr16:10909138-10909158、chr16:10908101-10908121、chr16:10907790-10907810、chr16:10907787-10907807、chr16:10907454-10907474、chr16:10895702-10895722、chr16:10902729-10902749、chr16:10918492-10918512、chr16:10907932-10907952、chr16:10907623-10907643、chr16:10907461-10907481、chr16:10902723-10902743、chr16:10907622-10907642、chr16:10922441-10922461、chr16:10902662-10902682、chr16:10915626-10915646、chr16:10915592-10915612、chr16:10907385-10907405、chr16:10907030-10907050、chr16:10907935-10907955、chr16:10906853-10906873、chr16:10906757-10906777、chr16:10907730-10907750、及びchr16:10895302-10895322から選択されるゲノム座標に特異的にハイブリダイズするガイドRNAをさらに含む、実施形態70~76のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態78 chr6:29942854-29942913及びchr6:29943518-29943619から選択されるゲノム座標、任意選択で、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883-29942903、chr6:29943126-29943146、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550、chr6:29943537-29943557、chr6:29943549-29943569、chr6:29943589-29943609、及びchr6:29944026-29944046から選択されるゲノム座標に特異的にハイブリダイズするガイドRNAをさらに含む、実施形態70~77のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態79 前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態51~69のいずれか1つに記載のガイドRNA、または実施形態70~78のいずれか1つのいずれか1つに記載の組成物。
実施形態80 前記組成物が、非発熱性である、実施形態79に記載のガイドまたは組成物。
実施形態81 前記ガイドRNAが、脂質ナノ粒子(LNP)と会合している、実施形態51~69のいずれか1つに記載のガイドRNAまたは実施形態70~80のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態82 細胞を、実施形態51~81のいずれか1つに記載のガイドRNAまたは組成物と接触させることを含む、前記細胞内の2B4配列において遺伝子修飾を行う方法。
実施形態83 TCR配列においてTCR遺伝子の発現を阻害するための遺伝子修飾を行うことをさらに含む、実施形態82に記載の方法。
実施形態84 免疫療法のための細胞集団を調製する方法であって、
a.2B4ガイドRNAまたは実施形態51~81のいずれか1つに記載の組成物を有する集団内の細胞中の2B4配列において遺伝子修飾を行うことと、
b.前記集団の前記細胞中のTCR配列において遺伝子修飾を行い、前記集団内の前記細胞の前記表面上の前記TCRタンパク質の発現を低減することと、
c.培養物中の前記細胞集団を増殖させることと、を含む、前記方法。
a.2B4ガイドRNAまたは実施形態51~81のいずれか1つに記載の組成物を有する集団内の細胞中の2B4配列において遺伝子修飾を行うことと、
b.前記集団の前記細胞中のTCR配列において遺伝子修飾を行い、前記集団内の前記細胞の前記表面上の前記TCRタンパク質の発現を低減することと、
c.培養物中の前記細胞集団を増殖させることと、を含む、前記方法。
実施形態85 前記細胞の前記表面上の前記TCRタンパク質の発現が、前記集団内の前記細胞の少なくとも70%の検出レベル未満に低減される、実施形態84に記載の方法。
実施形態86 前記集団の前記細胞におけるTCR配列の前記遺伝子修飾が、2つ以上のTCR配列の修飾を含む、実施形態84または85に記載の方法。
実施形態87 2つ以上の前記TCR配列が、TRAC及びTRBCを含む、実施形態86に記載の方法。
実施形態88 任意選択で、TRAC遺伝子座において、前記操作された細胞、例えば、TCRまたはCARの前記表面上に発現される標的化受容体をコードする外因性核酸の挿入を含む、実施形態84~87のいずれかに記載の方法。
実施形態89 前記細胞を、前記2B4ガイドRNAを含むLNP組成物と接触させることをさらに含む、実施形態84~88のいずれか1つに記載の方法。
実施形態90 前記細胞を、ガイドRNAを含む第2のLNP組成物と接触させることを含む、実施形態89に記載の方法。
実施形態91 実施形態82~90のいずれか1つに記載の方法によって作製される細胞集団。
実施形態92 前記細胞集団が、エクスビボで改変される、実施形態91に記載の細胞集団。
実施形態93 実施形態91または92に記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
実施形態94 実施形態91もしくは92に記載の細胞集団、または実施形態93に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法。
実施形態95 実施形態91もしくは92に記載の細胞集団、または実施形態93に記載の薬学的組成物を、養子細胞移植(ACT)療法として対象に投与する方法。
実施形態96 ACT療法として使用するための、実施形態91もしくは92に記載の細胞集団、または実施形態93に記載の薬学的組成物。
実施形態97 前記集団内の細胞の少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%が、前記内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、2B4遺伝子の遺伝子修飾を含む細胞集団。
実施形態98 前記遺伝子修飾が、実施形態1~4のいずれかで定義されるとおりである、実施形態97に記載の細胞集団。
実施形態99 2B4の発現が、例えば、前記2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、もしくは95%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態97または98に記載の細胞集団。
実施形態100 細胞の少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%が、前記内因性TCR遺伝子配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、TCR遺伝子の遺伝子修飾を含む、実施形態97~99のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態101 前記遺伝子修飾が、実施形態5~8のいずれかで定義されるとおりである、実施形態100に記載の細胞集団。
実施形態102 TCRの発現が、例えば、前記TCR遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態100または101に記載の細胞集団。
実施形態103 前記集団が、少なくとも103、104、105または106個の細胞、好ましくは107、2×107、5×107、または108個の細胞を含む、実施形態97~102のいずれかに記載の細胞集団。
実施形態104 前記集団内の細胞の少なくとも70%が、前記内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態97~103のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態105 前記集団内の細胞の少なくとも80%が、前記内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態97~104のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態106 前記集団内の細胞の少なくとも90%が、前記内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態97~105のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態107 前記集団内の細胞の少なくとも95%が、前記内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態97~106のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態108 2B4の発現が、例えば、前記2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも70%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態97~107のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態109 2B4の発現が、例えば、前記2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも80%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態97~108のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態110 2B4の発現が、例えば、前記2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも90%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態97~109のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態111 2B4の発現が、例えば、前記2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも95%、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態97~110のいずれか1つに記載の細胞集団。
実施形態112 実施形態97~111のいずれかに記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
実施形態113 ACT療法として使用するための、実施形態97~111のいずれかに記載の細胞集団または実施形態112に記載の薬学的組成物。
実施形態114 前記遺伝子修飾が、chr1:160841611-160841631のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態115 前記遺伝子修飾が、chr1:160841865-160841885のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態116 前記遺伝子修飾が、chr1:160862624-160862644のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態117 前記遺伝子修飾が、chr1:160862671-160862691のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態118 前記遺伝子修飾が、chr1:160841622-160841642のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態119 前記遺伝子修飾が、chr1:160841819-160841839のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態120 前記遺伝子修飾が、chr1:160841823-160841843のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態121 前記遺伝子修飾が、chr1:160841717-160841737のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態122 前記遺伝子修飾が、chr1:160841859-160841879のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態123 前記遺伝子修飾が、chr1:160841806-160841826のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態124 前記遺伝子修飾が、chr1:160841834-160841854のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態125 前記遺伝子修飾が、chr1:160841780-160841800のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態126 前記遺伝子修飾が、chr1:160841713-160841733のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態127 前記遺伝子修飾が、chr1:160841631-160841651のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態128 前記遺伝子修飾が、chr1:160841704-160841724のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態129 前記遺伝子修飾が、chr1:160841584-160841604のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態130 前記遺伝子修飾が、chr1:160841679-160841699のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態131 前記遺伝子修飾が、chr1:160841874-160841894のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態132 前記遺伝子修飾が、chr1:160841750-160841770のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態133 前記遺伝子修飾が、chr1:160841577-160841597のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態134 前記遺伝子修飾が、chr1:160841459-160841479のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態135 前記遺伝子修飾が、chr1:160841466-160841486のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態136 前記遺伝子修飾が、chr1:160841461-160841481のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態137 前記遺伝子修飾が、chr1:160841460-160841480のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態138 前記遺伝子修飾が、chr1:160841360-160841380のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態139 前記遺伝子修飾が、chr1:160841304-160841324のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態140 前記遺伝子修飾が、chr1:160841195-160841215のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態141 前記遺伝子修飾が、chr1:160841305-160841325のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか1つに記載の操作された細胞、ガイドRNA、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態142 前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
または
それぞれ、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852750-241852770、chr2:241852264-241852284、chr2:241852265-241852285、chr2:241858807-241858827、chr2:241852201-241852221、chr2:241858789-241858809、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852755-241852775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852751-241852771、chr2:241858807-241858827、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858789-241858809、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852755-241852775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241858807-241858827から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241852751-241852771、chr2:241852703-241852723、chr2:241852188-241852208、及びchr2:241852201-241852221から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808, chr2:241852703-241852723、及びchr2:241852201-241852221から選択されるゲノム座標、または
chr2:241858807-241858827のゲノム座標内に少なくとも1個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態25に記載の操作された細胞。
それぞれ、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852750-241852770、chr2:241852264-241852284、chr2:241852265-241852285、chr2:241858807-241858827、chr2:241852201-241852221、chr2:241858789-241858809、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852755-241852775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852751-241852771、chr2:241858807-241858827、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858789-241858809、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852755-241852775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241858807-241858827から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241852751-241852771、chr2:241852703-241852723、chr2:241852188-241852208、及びchr2:241852201-241852221から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808, chr2:241852703-241852723、及びchr2:241852201-241852221から選択されるゲノム座標、または
chr2:241858807-241858827のゲノム座標内に少なくとも1個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態25に記載の操作された細胞。
Claims (52)
- chr1:160830160-160862887のゲノム座標内に、ヒト2B4配列における遺伝子修飾を含む、操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、挿入、欠失、及び置換から選択される、請求項1に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、前記2B4遺伝子の発現を阻害する、請求項1または2に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
2B4-1~2B4-5によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr1:160841611-160841631、chr1:160841865-160841885、chr1:160862624-160862644、chr1:160862671-160862691、及びchr1:160841622-160841642、または
2B4-1及び2B4-2によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr1:160841611-160841631及びchr1:160841865-160841885、または
2B4-3、2B4-4、2B4-10、及び2B4-17によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr1:160862624-160862644、chr1:160862671-160862691、chr1:160841806-160841826、及びchr1:160841679-160841699内に少なくとも1個のヌクレオチドの修飾を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の操作された細胞。 - 前記操作された細胞が、内因性T細胞受容体(TCR)配列のゲノム座標内の遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、TCR遺伝子の発現を阻害し、任意選択で、前記TCR遺伝子が、TRACまたはTRBCである、請求項1~4のいずれか1項に記載の操作された細胞。.
- 前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、1つ以上のMHCクラスIタンパク質の発現を阻害する、請求項1~7のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 1つ以上のMHCクラスIタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、HLA-A配列における遺伝子修飾であり、任意選択で、前記遺伝子修飾が、chr6:29942854-chr6:29942913及びchr6:29943518-chr6:29943619から選択されるゲノム座標、任意選択で、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883-29942903、chr6:29943126-29943146、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550、chr6:29943537-29943557、chr6:29943549-29943569、chr6:29943589-29943609、及びchr6:29944026-29944046から選択されるゲノム座標内にある、請求項8に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、1つ以上のMHCクラスIIタンパク質の発現を阻害する、請求項1~10のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 1つ以上のMHCクラスIIタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、CIITA配列における遺伝子修飾であり、前記遺伝子修飾が、chr:16:10902171-10923242、任意選択で、chr16:10902662-10923285、chr16:10906542-10923285、またはchr16:10906542-10908121、任意選択で、chr16:10908132-10908152、chr16:10908131-10908151、chr16:10916456-10916476、chr16:10918504-10918524、chr16:10909022-10909042、chr16:10918512-10918532、chr16:10918511-10918531、chr16:10895742-10895762、chr16:10916362-10916382、chr16:10916455-10916475、chr16:10909172-10909192、chr16:10906492-10906512、chr16:10909006-10909026、chr16:10922478-10922498、chr16:10895747-10895767、chr16:10916348-10916368、chr16:10910186-10910206、chr16:10906481-10906501、chr16:10909007-10909027、chr16:10895410-10895430、及びchr16:10908130-10908150、任意選択で、chr16:10918504-10918524、chr16:10923218-10923238、chr16:10923219-10923239、chr16:10923221-10923241、chr16:10906486-10906506、chr16:10906485-10906505、chr16:10903873-10903893、chr16:10909172-10909192、chr16:10918423-10918443、chr16:10916362-10916382、chr16:10916450-10916470、chr16:10922153-10922173、chr16:10923222-10923242、chr16:10910176-10910196、chr16:10895742-10895762、chr16:10916449-10916469、chr16:10923214-10923234、chr16:10906492-10906512、及びchr16:10906487-1090650、または任意選択で、chr16:10916432-10916452、chr16:10922444-10922464、chr16:10907924-10907944、chr16:10906985-10907005、chr16:10908073-10908093、chr16:10907433-10907453、chr16:10907979-10907999、chr16:10907139-10907159、chr16:10922435-10922455、chr16:10907384-10907404、chr16:10907434-10907454、chr16:10907119-10907139、chr16:10907539-10907559、chr16:10907810-10907830、chr16:10907315-10907335、chr16:10916426-10916446、chr16:10909138-10909158、chr16:10908101-10908121、chr16:10907790-10907810、chr16:10907787-10907807、chr16:10907454-10907474、chr16:10895702-10895722、chr16:10902729-10902749、chr16:10918492-10918512、chr16:10907932-10907952、chr16:10907623-10907643、chr16:10907461-10907481、chr16:10902723-10902743、chr16:10907622-10907642、chr16:10922441-10922461、chr16:10902662-10902682、chr16:10915626-10915646、chr16:10915592-10915612、chr16:10907385-10907405、chr16:10907030-10907050、chr16:10907935-10907955、chr16:10906853-10906873、chr16:10906757-10906777、chr16:10907730-10907750、及びchr16:10895302-10895322から選択されるゲノム座標内にある、請求項11に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、2B4タンパク質の細胞表面発現が低減されているか、または前記細胞が、2B4タンパク質の細胞表面発現が低減されており、かつTRACタンパク質もしくはTRBCタンパク質の細胞表面発現が低減されている、請求項1~12のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- chr12:6772483-6778455のゲノム座標内に、ヒトLAG3配列における遺伝子修飾を含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- LAG3における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
LAG3-1~LAG3-15によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr12:6773938-6773958、chr12:6774678-6774698、chr12:6772894-6772914、chr12:6774816-6774836、chr12:6774742-6774762、chr12:6775380-6775400、chr12:6774727-6774747、chr12:6774732-6774752、chr12:6777435-6777455、chr12:6774771-6774791、chr12:6772909-6772929、chr12:6774735-6774755、chr12:6773783-6773803、chr12:6775292-6775312、及びchr12:6777433-6777453、または
LAG3-1~LAG3-11によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr12:6773938-6773958、chr12:6774678-6774698、chr12:6772894-6772914、及びchr12:6774816-6774836、chr12:6774742-6774762、chr12:6775380-6775400、chr12:6774727-6774747、chr12:6774732-6774752、chr12:6777435-6777455、chr12:6774771-6774791、及びchr12:6772909-6772929、または
LAG3-1~LAG3-4によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr12:6773938-6773958、chr12:6774678-6774698、chr12:6772894-6772914、及びchr12:6774816-6774836、または
LAG3-1、LAG3-4、LAG3-5、及びLAG3-9によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr12:6773938-6773958、chr12:6774816-6774836、chr12:6774742-6774762、及びchr12:6777435-6777455内にある、請求項14に記載の操作された細胞。 - chr5:157085832-157109044のゲノム座標内に、ヒトTIM3配列における遺伝子修飾を含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- TIM3における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
TIM3-1~TIM3-5、TIM3-7、TIM3-8、TIM3-12~TIM3-15、TIM3-23、TIM3-26、TIM3-32、TIM3-56、TIM3-59、TIM3-63、TIM3-66、TIM3-75、及びTIM3-87によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr5:157106867-157106887、chr5:157106862-157106882、chr5:157106803-157106823、chr5:157106850-157106870、chr5:157106668-157106688、chr5:157104681-157104701、chr5:157104681-157104701、chr5:157095432-157095452、chr5:157095361-157095381、chr5:157095360-157095380、chr5:157108945-157108965、chr5:157106824-157106844、chr5:157087117-157087137、chr5:157106864-157106884、chr5:157106888-157106908、chr5:157087253-157087273、chr5:157106935-157106955、chr5:157106641-157106661、chr5:157104663-157104683、及びchr5:157106936-157106956;または
TIM3-2、TIM3-4、TIM3-15、TIM3-23、TIM3-56、TIM3-59、TIM3-63、TIM3-75、及びTIM3-87によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:それぞれ、chr5:157106862-157106882、chr5:157106850-157106870、chr5:157108945-157108965、chr5:157106824-157106844、chr5:157106888-157106908、chr5:157087253-157087273、chr5:157106935-157106955、chr5:157104663-157104683、及びchr5:157106936-157106956;または
TIM3-1~TIM3-4によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr5:157106867-157106887、chr5:157106862-157106882、chr5:157106803-157106823、及び
chr5:157106850-157106870;または
TIM3-2、TIM-4、及びTIM3-15によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr5:157106862-157106882、chr5:157106850-157106870、及びchr5:157108945-157108965;または
TIM3-2、TIM-4、TIM3-15、TIM3-63、及びTIM3-87によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr5:157106862-157106882、chr5:157106850-157106870、chr5:157108945-157108965、chr5:157106935-157106955、及びchr5:157106936-157106956y;または
TIM3-2及びTIM3-15によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr5:157106862-157106882及びchr5:157108945-157108965;または
TIM3-63及びTIM3-87によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr5:157106935-157106955及びchr5:157106936-157106956、;または
TIM3-15によって標的とされるものから選択されるゲノム座標:chr5:157108945-157108965内にある、請求項16に記載の操作された細胞。 - chr2:241849881-241858908のゲノム座標内に、ヒトPD-1配列における遺伝子修飾を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標:
それぞれ、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852750-241852770、chr2:241852264-241852284、chr2:241852265-241852285、chr2:241858807-241858827、chr2:241852201-241852221、chr2:241858789-241858809、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852755-241852775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852751-241852771、chr2:241858807-241858827、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858789-241858809、chr2:241852919-241852939、chr2:241852915-241852935、chr2:241852755-241852775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241858807-241858827から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241858755-241858775、chr2:241852751-241852771、及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808及びchr2:241852703-241852723から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808、chr2:241852751-241852771、chr2:241852703-241852723、chr2:241852188-241852208、及びchr2:241852201-241852221から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、chr2:241858788-241858808, chr2:241852703-241852723、及びchr2:241852201-241852221から選択されるゲノム座標、または
chr2:241858807-241858827のゲノム座標内に少なくとも1個のヌクレオチドの修飾を含む、請求項18に記載の操作された細胞。 - 前記遺伝子修飾が、インデルを含む、請求項1~19のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、異種コード配列の挿入を含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾が、置換を含み、任意選択で、前記置換が、CからTへの置換またはAからGへの置換を含む、請求項1~21のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 前記遺伝子修飾により、遺伝子修飾前に、全長タンパク質のアミノ酸配列を有する前記全長タンパク質の翻訳を妨げる、前記核酸配列の変化がもたらされ、任意選択で、前記遺伝子修飾により、前記全長タンパク質のコード配列における早期終止コドンをもたらす前記核酸配列の変化がもたらされるか、または前記ゲノム遺伝子座からのpre-mRNAのスプライシングの変化がもたらされる、請求項1~22のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 前記細胞が、前記操作された細胞の前記表面上で発現される標的化受容体をコードする外因性核酸を含み、任意選択で、前記標的化受容体が、CARまたはTCRである、請求項1~23のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 前記操作された細胞が、T細胞である、請求項1~24のいずれか1項に記載の操作された細胞。
- 請求項1~25のいずれか1項に記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
- 請求項1~25のいずれか1項に記載の操作された細胞を含む、細胞集団。
- 請求項1~27のいずれか1項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する、方法。
- 請求項1~27のいずれか1項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、養子細胞移植(ACT)療法として対象に投与する、方法。
- ACT療法として使用するための、請求項1~27のいずれか1項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物。
- 以下から選択されるヌクレオチド配列を含む2B4配列に特異的にハイブリダイズする、2B4ガイドRNA:
a.配列番号1~28から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
b.配列番号1~28の配列から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも17、18、19、または20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むガイド配列、
c.配列番号1~28から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%同一または少なくとも90%同一のヌクレオチド配列を含むガイド配列、
d.配列番号1~5から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
e.配列番号1及び2から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、ならびに
f.配列番号3、4、10、及び17から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列。 - RNAガイドDNA結合剤を、配列番号1~28によって標的とされたものから選択されるゲノム座標、または配列番号1~5によって標的とされたゲノム座標から選択されるゲノム座標、または配列番号1及び2によって標的とされたゲノム座標から選択されるゲノム座標、または配列番号3、4、10、及び17によって標的とされたゲノム座標から選択されるゲノム座標内の染色体位置に指向するガイド配列を含む、2B4ガイドRNA。
- 前記ガイドRNAが、単一ガイドRNA(sgRNA)である、請求項31または32に記載のガイドRNA。
- 前記ガイド配列に対して3’に配列番号201のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ガイドRNAが、5’末端修飾または3’末端修飾を含む、請求項33に記載のガイドRNA。
- 5’末端修飾または3’末端修飾及びgRNAの保存部分をさらに含み、前記保存部分が、
A.短縮されたヘアピン1領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン1領域であって、
1.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、またはH1-4及びH1-9のうちの少なくとも1つが、前記置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン1においてワトソン-クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、前記ヘアピン1領域が、任意選択で、
a.H1-5~H1-8のうちのいずれか1つもしくは2つ、
b.以下のヌクレオチド対:H1-1及びH1-12、H1-2及びH1-11、H1-3及びH1-10、ならびにH1-4及びH1-9のうちの1つ、2つ、もしくは3つ、または
c.ヘアピン1領域の1~8個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
2.前記短縮されたヘアピン1領域が、4~8個のヌクレオチド、好ましくは4~6個のヌクレオチドを欠いており、
a.位置H1-1、H1-2、もしくはH1-3のうちの1つ以上が、配列番号201に対して欠失もしくは置換されているか、または
b.位置H1-6~H1-10のうちの1つ以上が、配列番号201に対して置換されているか、または
3.前記短縮されたヘアピン1領域が、5~10個のヌクレオチド、好ましくは5~6個のヌクレオチドを欠いており、位置N18、H1-12、もしくはnのうちの1つ以上が、配列番号201に対して置換されている、前記ヘアピン1領域、あるいは
B.短縮された上部ステム領域であって、前記短縮された上部ステム領域が、1~6個のヌクレオチドを欠いており、前記短縮された上部ステム領域の6、7、8、9、10、または11個のヌクレオチドが、配列番号201に対して4個以下の置換を含む、前記短縮された上部ステム領域、あるいは
C.LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2、及びH2-14のうちのいずれか1つ以上における配列番号201に対する置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、前記置換、あるいは
D.上部ステム領域であって、前記上部ステムの修飾が、配列番号201に対して前記上部ステム領域におけるUS1~US12のうちのいずれか1つ以上の修飾を含む、前記上部ステム領域のうちの1つ以上を含む、請求項33に記載のガイドRNA。 - 前記ガイドRNAが、mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号300)のパターンに従って修飾され、「N」が、任意の天然または非天然のヌクレオチドであってよく、mが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチドであり、*が、ヌクレオチド残基間のホスホロチオエート連結であり、前記Nが、集合的に任意の先行請求項に記載のガイド配列のヌクレオチド配列であり、任意選択で、各Nが、独立して、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、前記ガイド配列が、前記2B4遺伝子に対してCas9を標的とする、請求項33または34に記載のガイドRNA。
- 前記ガイドRNAが、修飾を含む、請求項33~36のいずれか1項に記載のガイドRNA。
- 前記修飾が、(i)2’-O-メチル(2’-O-Me)修飾ヌクレオチド、(ii)2’-F修飾ヌクレオチド、(iii)ヌクレオチド間のホスホロチオエート(PS)結合、(iv)前記ガイドRNAの5’末端にある最初の5個のヌクレオチドのうちの1つ以上での修飾、(v)前記ガイドRNAの3’末端にある最後の5個のヌクレオチドのうちの1つ以上での修飾、(vi)前記ガイドRNAの最初の4個のヌクレオチドの各々の間のPS結合、(vii)前記ガイドRNAの最後の4個のヌクレオチドの各々の間のPS結合、(viii)前記ガイドRNAの前記5’末端にある最初の3個のヌクレオチドの各々での2’-O-Me修飾ヌクレオチド、(ix)前記ガイドRNAの前記3’末端にある最後の3個のヌクレオチドの各々での2’-O-Me修飾ヌクレオチド、または(i)~(ix)のうちの1つ以上の組み合わせを含む、請求項37に記載のガイドRNA。
- 請求項31~38のいずれか1項に記載のガイドRNA、及びRNAガイドDNA結合剤を含む組成物であって、前記RNAガイドDNA結合剤が、ポリペプチドRNAガイドDNA結合剤、またはRNAガイドDNA結合剤ポリペプチドをコードする核酸であり、任意選択で、前記RNAガイドDNA結合剤が、Cas9ヌクレアーゼである、前記組成物。
- 前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項31~38のいずれか1項に記載のガイドRNA、または請求項39に記載の組成物。
- 前記ガイドRNAが、脂質ナノ粒子(LNP)と会合している、請求項31~40のいずれか1項に記載のガイドRNAまたは組成物。
- 細胞内の2B4配列において遺伝子修飾を行う方法であって、前記細胞を、請求項31~41のいずれか1項に記載のガイドRNAまたは組成物と接触させることを含む、前記方法。
- TCR配列においてTCR遺伝子の発現を阻害するための遺伝子修飾を行うことをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 免疫療法のための細胞集団を調製する方法であって、
a.2B4ガイドRNAまたは請求項31~41のいずれか1項に記載の組成物を有する集団内の細胞中の2B4配列において遺伝子修飾を行うことと、
b.前記集団の前記細胞中のTCR配列において遺伝子修飾を行い、前記集団内の前記細胞の前記表面上の前記TCRタンパク質の発現を低減することと、
c.培養物中の前記細胞集団を増殖することと、を含む、前記方法。 - 請求項42~44のいずれか1項に記載の方法によって作製される、細胞集団。
- 前記細胞集団が、エクスビボで改変される、請求項45に記載の細胞集団。
- 請求項45または46に記載の細胞集団を、それを必要とする対象に投与する、方法。
- 請求項45または46に記載の集団を、養子細胞移植(ACT)療法として対象に投与する、方法。
- ACT療法として使用するための、請求項45もしくは46に記載の細胞集団、または請求項93に記載の薬学的組成物。
- 2B4遺伝子の遺伝子修飾を含む細胞集団であって、前記集団内の細胞の少なくとも50%、55%、60%、65%、任意選択で少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%が、内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、前記細胞集団。
- 2B4の発現が、例えば、前記2B4遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも50%、55%、60%、65%、好ましくは少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、もしくは95%、または前記アッセイの検出限界未満まで減少する、請求項50に記載の細胞集団。
- 前記集団内の細胞の少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%が、前記内因性2B4配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、請求項50または51に記載の細胞集団。
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