JP2022550599A - 操作されたデュアルガイド核酸を有するｃｒｉｓｐｒシステム - Google Patents

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Abstract

本発明は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat、CRISPR）関連（Cas）ヌクレアーゼ、例えばV-A型Casヌクレアーゼを活性化させることができる操作されたデュアルガイド核酸（例えば、RNA）を含む操作されたCRISPRシステムに関する。また、操作されたCRISPRシステムを用いて核酸をターゲティング、編集および/または修飾する方法、ならびに操作されたCRISPRシステムを含む組成物および細胞を提供する。TIFF2022550599000035.tif97163

Description

関連出願
本出願は、2019年10月3日に出願された米国特許仮出願第62/910,055号の恩典および優先権を主張するものであり、その開示内容は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat、CRISPR）関連（Cas）ヌクレアーゼを活性化させることができる操作されたデュアルガイド核酸（例えば、RNA）を含む操作されたCRISPRシステム、操作されたCRISPRシステムを用いて核酸をターゲティング、編集および/または修飾する方法、ならびに操作されたCRISPRシステムを含む組成物および細胞に関する。
発明の背景
最近、精密なゲノムターゲティング技術が進歩してきている。例えば、ゲノムDNA内の特定の座位を、デザイナーメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクター（TALE）によってターゲティング、編集または別の様式で修飾することができる。さらに、細菌および古細菌の適応免疫のCRISPR-Casシステムが、真核細胞におけるゲノムDNAの精密なターゲティングのために適合されている。前の世代のゲノム編集ツールと比べて、CRISPR-Casシステムはセットアップが容易であり、拡張可能であり、真核生物のゲノム内の複数の位置をターゲティングするのに適しており、それによりゲノム操作における新たな用途のための主要な手段をもたらす。
2つの相違するクラスのCRISPR-Casシステムが同定されている。クラス1のCRISPR-Casシステムでは複数タンパク質のエフェクター複合体が使用され、一方、クラス2のCRISPR-Casシステムでは単一タンパク質のエフェクターが使用される（Makarova et al.（2017）CELL, 168:328（非特許文献1）参照）。3つの型のクラス2のCRISPR-Casシステムのうち、II型とV型のシステムは典型的にはDNAをターゲティングし、VI型システムは典型的にはRNAをターゲティングする（同書）。天然に存在するII型エフェクター複合体は、Cas9、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化型CRISPR RNA（tracrRNA）からなるが、操作されたシステムでは簡単にするためにcrRNAとtracrRNAがシングルガイドRNAとして融合され得る（Wang et al.（2016）ANNU. REV. BIOCHEM., 85:227（非特許文献2）参照）。一部の特定の天然に存在するV型システム、例えばV-A型、V-C型およびV-D型のシステムはtracrRNAを必要とせず、crRNAが単独で標的DNAの切断のためのガイドとして使用される（Zetsche et al.（2015）CELL, 163:759（非特許文献3）;Makarova et al.（2017）CELL, 168:328（非特許文献1）参照）。
CRISPR-Casシステムは種々の目的のために、例えばゲノムDNAの切断、塩基編集、エピゲノム編集およびゲノムイメージングのために操作されている（例えば、Wang et al.（2016）ANNU. REV. BIOCHEM., 85:227（非特許文献2）およびRees et al.（2018）NAT. REV. GENET., 19:770（非特許文献4）参照）。相当な開発が行なわれてきているが、依然として、強力な精密ゲノムターゲティングツールとしての新しい有用なCRISPR-Casシステムの必要性が存在している。
Makarova et al.（2017）CELL, 168:328 Wang et al.（2016）ANNU. REV. BIOCHEM., 85:227 Zetsche et al.（2015）CELL, 163:759 Rees et al.（2018）NAT. REV. GENET., 19:770
本発明は、一部において、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が、ハイブリダイズして複合体を形成したとき、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化されるCasヌクレアーゼを活性化し得る、デュアルガイドCRISPR-Casシステムの設計に基づいている。本明細書に記載の操作されたデュアルガイドCRISPR-Casシステムは、ゲノムDNAなどの標的核酸をターゲティング、編集または修飾するために使用され得る。
V-A型、V-C型およびV-D型のCRISPR-Casシステムは天然状態では、CasヌクレアーゼとシングルガイドRNA（すなわち、crRNA）を含む。このシングルガイドRNAを2つの異なる核酸に分割することにより、本明細書に記載の操作されたシステムによってより良好な柔軟性と調整可能性がもたらされる。例えば、核酸切断の効率は、ハイブリダイゼーション長さおよび/またはターゲッター核酸とモジュレーター核酸の親和性を調整することにより上げたり下げたりすることができる。さらに、高い収率と精度で合成できる核酸長さの制限を考慮すると、デュアルガイド核酸の使用により、編集の有効性および/または特異性を改善し得るポリヌクレオチドエレメントをより多く組み込むことが可能となる。
特に、このデュアルガイドシステムは、オフターゲット編集を低減させるための調整可能なシステムとして操作され得、したがって、高い特異性を有する核酸を編集するために使用され得る。システムは、いくつかの用途、例えば治療における使用のための細胞、例えば哺乳動物細胞の編集において使用され得る。オフターゲット編集の低減は、治療を必要とする対象に投与される遺伝子操作された増殖性細胞、例えば幹細胞、前駆細胞および免疫記憶細胞を作出する場合に特に望ましい。本明細書に記載のデュアルガイドシステムを使用すると高い特異性がもたらされ得、デュアルガイドシステムは任意で、例えば、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸、編集エンハンサー配列および/またはドナーテンプレートリクルート配列に1つまたは複数の化学修飾をさらに含む。
したがって、一局面において、本発明により、
（a）（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列;および
（ii）ターゲッターステム配列
を含むターゲッター核酸;ならびに
（b）ターゲッターステム配列に相補的なモジュレーターステム配列を含むモジュレーター核酸
を含む、操作された、天然に存在しないシステムであって、
ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は別個の核酸であり、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体が、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化されるCRISPR関連（Cas）ヌクレアーゼを活性化させることができる、
操作された、天然に存在しないシステムを提供する。
一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型Casヌクレアーゼである。
一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、4～10ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、5ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列がワトソン・クリック塩基対合によりハイブリダイズされる。
一部の特定の態様では、スペーサー配列が約20ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、スペーサー配列が18ヌクレオチド長であるか、またはそれより短い。一部の特定の態様では、スペーサー配列が17ヌクレオチド長であるか、またはそれより短い。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が、5’から3’に向かってターゲッターステム配列、スペーサー配列、および任意のさらなるヌクレオチド配列を含む。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸がリボ核酸（RNA）を含む。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が修飾RNAを含む。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸がRNAとDNAの組合せを含む。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が化学修飾を含む。一部の特定の態様では、化学修飾がターゲッター核酸の3’末端の1個または複数のヌクレオチドに存在している。一部の特定の態様では、化学修飾が、2'-O-メチル、2'-フルオロ、2'-O-メトキシエチル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、プソイドウリジン、およびその任意の組合せからなる群より選択される。
一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、さらなるヌクレオチド配列をさらに含む。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列がモジュレーターステム配列の5’側に位置している。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が4～50ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が、ドナーテンプレートとハイブリダイズすることができるドナーテンプレートリクルート配列を含む。一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムがドナーテンプレートをさらに含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、モジュレーターステム配列の3’側に1個または複数のヌクレオチドを含む。
一部の特定の態様では、モジュレーター核酸がRNAを含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が修飾RNAを含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸がRNAとDNAの組合せを含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が化学修飾を含む。一部の特定の態様では、化学修飾が、モジュレーター核酸の5’末端の1個または複数のヌクレオチドに存在している。一部の特定の態様では、化学修飾が、2'-O-メチル、2'-フルオロ、2'-O-メトキシエチル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、プソイドウリジン、およびその任意の組合せからなる群より選択される。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が共有結合により連結されていない。
一部の特定の態様では、Casヌクレアーゼが、SEQ ID NO:1と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがCpf1である。一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムがCasヌクレアーゼをさらに含む。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸、およびCasヌクレアーゼがリボ核タンパク質（RNP）複合体内に存在している。
別の局面において、本発明により、本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムを含む真核細胞を提供する。
別の局面において、本発明により、本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムまたは真核細胞を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。
別の局面において、本発明により、以下の工程を含む、標的ヌクレオチド配列を有する標的DNAを切断する方法を提供する：標的DNAを本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムと接触させる工程であって、それにより標的DNAの切断をもたらす工程。
一部の特定の態様では、接触がインビトロで行なわれる。
一部の特定の態様では、接触が細胞においてエクスビボで行なわれる。一部の特定の態様では、標的DNAが細胞のゲノムDNAである。一部の特定の態様では、システムが、事前に形成させたRNP複合体として細胞内に送達される。一部の特定の態様では、事前に形成させたRNP複合体が、エレクトロポレーションによって細胞内に送達される。
別の局面において、本発明により、以下の工程を含む、真核細胞のゲノムを編集する方法を提供する：本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムを真核細胞内に送達する工程であって、それにより真核細胞のゲノムの編集をもたらす工程。
一部の特定の態様では、システムが、事前に形成させたRNP複合体として細胞内に送達される。一部の特定の態様では、システムが、エレクトロポレーションによって細胞内に送達される。
真核細胞を伴う方法の一部の特定の態様では、細胞が免疫細胞である。一部の特定の態様では、免疫細胞がTリンパ球である。
例示的なデュアルガイドV-A型CRISPR-Casシステムの構造を示す略図である。 図1B～1Dは、デュアルガイドV-A型CRISPR-Casシステム内への保護基（例えば、保護ヌクレオチド配列または化学修飾部）（図1B）、ドナーテンプレートリクルート配列（図1C）および編集エンハンサー（図1D）の組込みを示す一連の略図である。 図1Bの説明を参照のこと。 図1Bの説明を参照のこと。 図2Aは、インビトロ切断実験で試験した2つのcrRNAの推定される二次構造を示す一連の略図である。図2Bは、化学的に転写した「crRNA1」および「crRNA2」と称する2つの異なるcrRNAならびにその対応するターゲッターRNAとモジュレーターRNAの組と複合体形成させたMAD7を用いたインビトロ切断実験のゲル電気泳動の結果を示す写真である。 図2-1の説明を参照のこと。 化学合成またはインビトロ転写による作製のいずれかの「crRNA1」、「crRNA3」および「crRNA4」と称する3つの異なるcrRNAならびにその対応するターゲッターRNAとモジュレーターRNAの組と複合体形成させたMAD7を用いたインビトロ切断実験のゲル電気泳動の結果を示す写真である。 図4A～4Hは、ハイブリダイズしているターゲッターRNAとモジュレーターRNAの推定される二次構造を示す一連の略図である。×印（ループ領域内）は、RNAがターゲッターRNAとモジュレーターRNAに分割された部位を示す。図4A～4Fにおいて、RNA#1はシングルガイドRNAである。RNA#2、#4、#6、#8および#10はモジュレーターRNAであり、RNA#3、#5、#7、#9および#11はターゲッターRNAである。図4G～4Hにおいて、RNA#12と#14は、ヘアピン配列を含むシングルガイドRNAである。RNA#13は、RNA#12に対応するモジュレーターRNAであり、RNA#15は、RNA#14に対応するターゲッターRNAである。図4Iは、ターゲッターRNAとモジュレーターRNAの組合せと複合体形成させたMAD7を用いたインビトロ切断実験のゲル電気泳動の結果を示す一組の写真である。 図4-1の説明を参照のこと。 図4-1の説明を参照のこと。 図4-1の説明を参照のこと。 図4-1の説明を参照のこと。 図5A～5Iは、crRNAの推定される二次構造を示す一連の略図である。crRNAをモジュレーターRNAとターゲッターRNAの組合せに分割している場合、太い×印（ループ領域内,組合せ3、5、7、9、11、13および15に対応する）ならびに細い×印（ステム領域内,組合せ4、6、8、10、12、14および16に対応する）は、crRNAが分割された部位を示す。RNAfoldプログラムによって推定される、対応するcrRNAの二次構造の形成の際のギブスの自由エネルギー変化（ΔG）を各構築物または組合せについて注記している。図5J～5Kは、crRNA構築物またはターゲッターRNAとモジュレーターRNAの組合せと複合体形成させたMAD7を用いたインビトロ切断実験のゲル電気泳動の結果を示す写真である。図5Jにおける切断生成物の比率は、バンドの相対強度を測定することによって求めた。 図5-1の説明を参照のこと。 図5-1の説明を参照のこと。 図5-1の説明を参照のこと。 図5-1の説明を参照のこと。 図5-1の説明を参照のこと。 試験したcrRNAまたは対応するターゲッターRNAとモジュレーターRNAの組の各々による標的DNAの編集コピーおよび未編集コピーのリード数割合を示す棒グラフである。「rep1」および「rep2」は、同じ実験の第1および第2のレプリケートをそれぞれ意味する。 各条件で得られたシーケンシングリードの数を示す棒グラフである。色はリードの質を示す。 Jurkat細胞のゲノム内の標的遺伝子座（x軸上に示す）の編集コピーのパーセンテージを示す棒グラフである。 異なる部位（ループの5’末端を基準にして1、2、3、4または5個目のヌクレオチド）で分割されたcrRNAを有するデュアルガイドCRISPRシステムの送達後のJurkat細胞のCD52、PDCD1またはTIGIT遺伝子において編集されたゲノムコピーのパーセンテージを示す棒グラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、一部において、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が、ハイブリダイズして複合体を形成したとき、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化されるCasヌクレアーゼを活性化し得る、デュアルガイドCRISPR-Casシステムの設計に基づいている。本明細書に記載の操作されたデュアルガイドCRISPR-Casシステムは、ゲノムDNAなどの標的核酸をターゲティング、編集または修飾するために使用され得る。
V-A型、V-C型およびV-D型のCRISPR-Casシステムは天然状態では、CasヌクレアーゼとシングルガイドRNA（すなわち、crRNA）を含む。このシングルガイドRNAを2つの異なる核酸に分割することにより、本明細書に記載の操作されたシステムによってより良好な柔軟性と調整可能性がもたらされる。例えば、核酸切断の効率は、ハイブリダイゼーション長さおよび/またはターゲッター核酸とモジュレーター核酸の親和性を調整することによって上げたり下げたりすることができる。さらに、高い収率と精度で合成できる核酸長さの制限を考慮すると、デュアルガイド核酸の使用により、編集の有効性および/または特異性を改善し得るポリヌクレオチドエレメントをより多く組み込むことが可能になる。
特に、このデュアルガイドシステムは、オフターゲット編集を低減させるための調整可能なシステムとして操作され得、したがって、高い特異性を有する核酸を編集するために使用され得る。システムは、いくつかの用途、例えば治療における使用のための細胞、例えば哺乳動物細胞の編集において使用され得る。オフターゲット編集の低減は、治療を必要とする対象に投与される遺伝子操作された増殖性細胞、例えば幹細胞、前駆細胞および免疫記憶細胞を作出する場合に特に望ましい。本明細書に記載のデュアルガイドシステムを使用すると高い特異性がもたらされ得、デュアルガイドシステムは任意で、例えば、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸、編集エンハンサー配列および/またはドナーテンプレートリクルート配列に1つまたは複数の化学修飾をさらに含む。
デュアルガイドCRISPR-Casシステムの特徴および使用を以下のセクションに論考する。
I. 操作された、天然に存在しないデュアルガイドCRISPR-Casシステム
本発明の操作された天然に存在しないシステムは、
（a）（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列;および
（ii）ターゲッターステム配列
を含むターゲッター核酸;ならびに
（b）ターゲッターステム配列に相補的なモジュレーターステム配列を含むモジュレーター核酸
を含み、
ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は別個の核酸であり、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体は、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化されるCasヌクレアーゼを活性化させることができる。
V-A型、V-C型およびV-D型のCRISPR-Casシステムは、Makarova et al.（2017）CELL, 168:328に記載の分類に基づくCRISPR-Casシステムの相違する亜型である。これらの亜型の天然に存在するCRISPR-CasシステムにはtracrRNAがなく、CRISPR-Cas複合体を標的DNAにガイドすることを単独のcrRNAに依存する。天然に存在するV-A型Casタンパク質はRuvC様ヌクレアーゼドメインを含むがHNHエンドヌクレアーゼドメインがなく、非標的鎖（すなわち、スペーサー配列とハイブリダイズしない鎖）をコーディネート鎖（coordinate）として用いて決定される5’配向部である5’Tリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を認識する。天然に存在するV-A型CRISPR-Casシステムは二本鎖DNAを切断し、平滑末端ではなく段違いに切断された二本鎖を生成させる。切断部位はPAM部位から遠位である（例えば、非標的鎖上のPAMから少なくとも10、11、12、13、14もしくは15ヌクレオチド離れている、および/または標的鎖上のPAMに相補的な配列から少なくとも15、16、17、18もしくは19ヌクレオチド離れている）。
したがって、別の局面において、本開示により、
（a）（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列;および
（ii）ターゲッターステム配列
を含むターゲッター核酸;ならびに
（b）ターゲッターステム配列に相補的なモジュレーターステム配列を含むモジュレーター核酸
を含む、操作された、天然に存在しないシステムであって、
ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は別個の核酸であり、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体が、V-A型、V-C型またはV-D型のCasヌクレアーゼを活性化させることができる、
操作された、天然に存在しないシステムを提供する。一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型Casヌクレアーゼである。
Casタンパク質
本明細書において互換的に用いている用語「CRISPR関連タンパク質」、「Casタンパク質」および「Cas」は、天然に存在するCasタンパク質または操作されたCasタンパク質を指す。Casタンパク質操作の非限定的な例としては、非限定的に、対応する非修飾Casと比べてCasの活性を改変する、PAM特異性を改変する、認識されるPAMの範囲を広くする、および/または1つまたは複数のオフターゲット座位を修飾する能力を低下させるCasタンパク質変異およびCasタンパク質修飾が挙げられる。一部の特定の態様では、操作されたCasの活性の改変が、天然に存在するcrRNAもしくは操作されたデュアルガイド核酸に結合する能力（例えば、特異性もしくは動態）の改変、標的ヌクレオチド配列に結合する能力（例えば、特異性もしくは動態）の改変、核酸スキャニングのプロセッシビティの改変および/またはエフェクター（例えば、ヌクレアーゼ）活性の改変を含む。ヌクレアーゼ活性を有するCasタンパク質は「CRISPR関連ヌクレアーゼ」または「Casヌクレアーゼ」と称され、これらは本明細書において互換的に用いている。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体が活性化させることができるCasヌクレアーゼがV-A型、V-C型またはV-D型のCasヌクレアーゼである。一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型ヌクレアーゼである。
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがCpf1を含む。Cpf1タンパク質は当技術分野において公知であり、米国特許第9,790,490号および同第10,113,179号に記載されている。Cpf1オーソログは種々の細菌および古細菌のゲノムに見い出され得る。例えば、一部の特定の態様では、Cpf1タンパク質が、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）U112（Fn）、アシダミノコッカス属の種BV3L6（As）、ラクノスピラ科の細菌ND2006（Lb）、ラクノスピラ科の細菌MA2020（Lb2）、カンジダタス・メタノプラズマ・テルミタム（Candidatus Methanoplasma termitum）（CMt）、モラクセラ・ボーボクリ（Moraxella bovoculi）237（Mb）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Porphyromonas crevioricanis）（Pc）、プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）（Pd）、野兎病菌（Francisella tularensis）1、野兎病菌の亜種名ノビシダ（novicida）、プレボテラ・アルベンシス（Prevotella albensis）、ラクノスピラ科の細菌MC2017 1、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Butyrivibrio proteoclasticus）、ペレグリニバクテリア（Peregrinibacteria）細菌GW2011_GWA2_33_10、パルクバクテリア（Parcubacteria）細菌GW2011_GWC2_44_17、スミセラ属（Smithella）の種SCADC、ユウバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、ポルフィロモナス・マカカエ（Porphyromonas macacae）、プレボテラ・ブリアンティー（Prevotella bryantii）、プロテオカテラ・スフェニスシ（Proteocatella sphenisci）、アネロビブリオ属（Anaerovibrio）の種RM50、モラクセラ・カプラエ（Moraxella caprae）、ラクノスピラ科の細菌COE1またはユウバクテリウム・コプロスタノリゲネス（Eubacterium coprostanoligenes）に由来する。
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがAsCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000002
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがLbCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000003
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがFnCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000004
一部の特定の態様では、V-A型Casヌクレアーゼがプレボテラ・ブリアンティーのCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000005
一部の特定の態様では、V-A型Casヌクレアーゼがプロテオカテラ・スフェニスシのCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000006
一部の特定の態様では、V-A型Casヌクレアーゼがアネロビブリオ属の種RM50のCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000007
一部の特定の態様では、V-A型Casヌクレアーゼがモラクセラ・カプラエのCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000008
一部の特定の態様では、V-A型Casヌクレアーゼがラクノスピラ科の細菌COE1のCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000009
一部の特定の態様では、V-A型Casヌクレアーゼがユウバクテリウム・コプロスタノリゲネスのCpf1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000010
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがCpf1ではない。一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがAsCpf1ではない。
一部の特定の態様では、V-A型Casヌクレアーゼが、MAD1、MAD2、MAD3、MAD4、MAD5、MAD6、MAD7、MAD8、MAD9、MAD10、MAD11、MAD12、MAD13、MAD14、MAD15、MAD16、MAD17、MAD18、MAD19もしくはMAD20またはそのバリアントを含む。MAD1-MAD20は当技術分野において公知であり、米国特許第9,982,279号に記載されている。
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがMAD7またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000011
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがMAD2またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000012
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがCsm1を含む。Csm1タンパク質は当技術分野において公知であり、米国特許第9,896,696号に記載されている。Csm1オーソログは種々の細菌および古細菌のゲノムに見い出され得る。例えば、一部の特定の態様では、Csm1タンパク質が、スミセラ属の種SCADC（Sm）、スルフリクルバム属（Sulfuricurvum）の種（Ss）またはマイクロゲノメート（Microgenomate）（ロイズマンバクテリア（Roizmanbacteria））細菌（Mb）に由来する。
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがSmCsm1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000013
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがSsCsm1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000014
一部の特定の態様では、V-A型CasヌクレアーゼがMbCsm1またはそのバリアントを含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質が、SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、V-A型Casタンパク質がSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を含む。
Figure 2022550599000015
さらに多くのV-A型Casヌクレアーゼおよびその対応する天然に存在するCRISPR-Casシステムが、当技術分野において公知の、例えば米国特許第9,790,490号およびShmakov et al.（2015）MOL. CELL, 60:385に記載のようなコンピュータ使用による方法および実験による方法によって同定され得る。例示的なコンピュータ使用による方法としては、ホモロジーモデリング、構造（structural）BLAST、PSI-BLASTまたはHHPredによる推定Casタンパク質の解析、およびCRISPRアレイの同定による推定CRISPR座位の解析が挙げられる。例示的な実験による方法としては、インビトロ切断アッセイおよびZetsche et al.（2015）CELL, 163:759に記載のような細胞内ヌクレアーゼアッセイ（例えば、サーベイヤーアッセイ）が挙げられる。
一部の特定の態様では、Casヌクレアーゼが、標的遺伝子座の一方または両方の鎖、例えば標的鎖（すなわち、シングルガイド核酸またはデュアルガイド核酸とハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列を有する鎖）および/または非標的鎖の切断に指向される。一部の特定の態様では、Casヌクレアーゼが、標的ヌクレオチド配列またはその相補配列の最初または最後のヌクレオチドから約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約50、約100、約200、約500個またはそれより多くのヌクレオチドの範囲内での一方または両方の鎖の切断に指向される。一部の特定の態様では、切断が段違いである、すなわち付着端を生じる。一部の特定の態様では、切断により5'突出端を有する段違いの切断部が生じる。一部の特定の態様では、切断により1～5個のヌクレオチド、例えば4個または5個のヌクレオチドの5'突出端を有する段違いの切断部が生じる。一部の特定の態様では、切断部位がPAMから遠位である、例えば切断は非標的鎖の18番目のヌクレオチドの後ろおよび標的鎖の23番目のヌクレオチドの後ろで起こる。
一部の特定の態様では、本発明の操作された天然に存在しないシステムが、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体が活性化させることができるCasヌクレアーゼをさらに含む。他の態様では、本発明の操作された天然に存在しないシステムが、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体が活性化させることができるCasヌクレアーゼに関連しているCasタンパク質をさらに含む。例えば、一部の特定の態様では、Casタンパク質が、Casヌクレアーゼと少なくとも80％（例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％）同一のアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様では、Casタンパク質が、Casヌクレアーゼのヌクレアーゼ不活性変異型を含む。一部の特定の態様では、Casタンパク質がエフェクタードメインをさらに含む。
一部の特定の態様では、Casタンパク質は実質的にすべてのDNA切断活性がない。かかるCasタンパク質は、1つまたは複数の変異を活性なCasヌクレアーゼ（例えば、天然に存在するCasヌクレアーゼ）に導入することにより作製され得る。変異型Casタンパク質は、タンパク質が有するDNA切断活性が対応する非変異型形態のDNA切断活性の約25％以下、約10％以下、約5％以下、約1％以下、約0.1％以下、約0.01％以下、またはそれより低い、例えば非変異型形態と比べてゼロであるか、または無視できる場合、実質的にすべてのDNA切断活性がないとみなされる。したがって、Casタンパク質は、1つまたは複数の変異（例えば、V-A型Casタンパク質のRuvCドメイン内の変異）を含み得、エフェクタードメインとの融合あり、またはなしの一般DNA結合タンパク質として使用され得る。例示的な変異としては、AsCpf1内のアミノ酸位置に関するD908A、E993AおよびD1263A;LbCpf1内のアミノ酸位置に関するD832A、E925AおよびD1180A;ならびにFnCpf1のアミノ酸位置ナンバリングに関するD917A、E1006AおよびD1255Aが挙げられる。より多くの変異が、Yamano et al.（2016）Cell, 165:949に記載の結晶構造に従って設計され、作製され得る。
Casタンパク質は、あらゆるDNAを切断するヌクレアーゼ活性を失っているのではなく、二本鎖DNAの標的鎖を切断する能力のみ、または非標的鎖を切断する能力のみを失っており、それによりニッカーゼとして機能性であってもよいことは理解されよう（Gao et al.（2016）CELL RES., 26:901参照）。したがって、一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがCasニッカーゼである。一部の特定の態様では、Casヌクレアーゼは非標的鎖を切断する活性を有するが、例えばNucドメイン内の変異により標的鎖を切断する活性は実質的にない。一部の特定の態様では、Casヌクレアーゼは標的鎖を切断する切断活性を有するが非標的鎖を切断する活性は実質的にない。
他の態様では、Casヌクレアーゼが二本鎖DNAを切断する活性を有し、二本鎖切断をもたらす。
実質的にすべてのDNA切断活性がないか、あるいは一方の鎖を切断する能力しかないCasタンパク質は、天然に存在するシステムから同定される場合もあり得る。例えば、一部の特定の天然に存在するCRISPR-Casシステムは真核生物の（例えば、哺乳動物またはヒトの）細胞において標的ヌクレオチド配列に結合する能力を保持しているが全DNA切断活性または一部のDNA切断活性を失っている場合があり得る。かかるV-A型タンパク質は、例えばKim et al.（2017）ACS SYNTH. BIOL. 6（7）:1273-82およびZhang et al.（2017）CELL DISCOV. 3:17018に開示されている。
Casタンパク質（例えば、Casヌクレアーゼ）の活性は改変され、それにより操作されたCasタンパク質が作出され得る。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質の活性の改変がターゲティング効率の増大および/またはオフターゲット結合の低減を含む。理論に拘束されることを望まないが、オフターゲット結合はCasタンパク質により、例えばCRISPR-Cas複合体の安定性および/またはコンホメーションに影響し得るスペーサー配列と標的ヌクレオチド配列間の1つまたは複数のミスマッチの存在によって認識され得るという仮説が立てられる。一部の特定の態様では、活性の改変が、結合の修飾、例えば標的遺伝子座（例えば、標的鎖もしくは非標的鎖）に対する結合の増大および/またはオフターゲット座位に対する結合の低減を含む。一部の特定の態様では、活性の改変が、タンパク質のシングルガイド核酸またはデュアルガイド核酸と結合する領域の電荷の改変を含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質の活性の改変が、タンパク質の標的鎖および/または非標的鎖と結合する領域の電荷の改変を含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質の活性の改変が、タンパク質のオフターゲット座位と結合する領域の電荷の改変を含む。電荷の改変としては、正電荷の減少、負電荷の減少、正電荷の増加および負電荷の増加が挙げられ得る。例えば、負電荷の減少および正電荷の増加は一般的には核酸（1つまたは複数）への結合を強化し得るが、正電荷の減少および負電荷の増加は核酸（1つまたは複数）への結合を弱め得る。一部の特定の態様では、活性の改変が、タンパク質とシングルガイド核酸またはデュアルガイド核酸間の立体障害の増大または低減を含む。一部の特定の態様では、活性の改変が、タンパク質と標的鎖および/または非標的鎖間の立体障害の増大または低減を含む。一部の特定の態様では、活性の改変が、タンパク質とオフターゲット座位間の立体障害の増大または低減を含む。一部の特定の態様では、修飾または変異が、Lys、His、Arg、Glu、Asp、Ser、GlyまたはThrの置換を含む。一部の特定の態様では、修飾または変異が、Gly、Ala、Ile、GluまたはAspとの置換を含む。一部の特定の態様では、修飾または変異が、Casタンパク質（例えば、V-A型Casタンパク質）のWEDとRuvCドメイン間の溝内におけるアミノ酸置換を含む。
一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質の活性の改変が、標的遺伝子座を切断するヌクレアーゼ活性の増大を含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質の活性の改変が、オフターゲット座位を切断するヌクレアーゼ活性の低下を含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質の活性の改変がヘリカーゼ動態の改変を含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が、CRISPR複合体の形成を改変する修飾を含む。
一部の特定の態様では、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはPAM様モチーフによりCasタンパク質複合体の標的遺伝子座への結合が指向される。多くのCasタンパク質はPAM特異性を有する。PAMの精密な配列および長さの要件は、使用されるCasタンパク質に応じて異なる。PAM配列は典型的には2～5塩基対の長さであり、標的ヌクレオチド配列に隣接している（が、標的ヌクレオチド配列と異なる標的DNA鎖上にある）。PAM配列は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、標的ヌクレオチド配列といろいろなPAM配列を有するオリゴヌクレオチドの切断、ターゲティングまたは修飾を試験して同定され得る。
例示的なPAM配列を表1に示す。一態様では、Casタンパク質がMAD7であり、PAMがTTTNであり、ここで、NはA、C、GまたはTである。一態様では、Casタンパク質がMAD7であり、PAMがCTTNであり、ここで、NはA、C、GまたはTである。別の態様では、Casタンパク質がAsCpf1であり、PAMがTTTNであり、ここで、NはA、C、GまたはTである。別の態様では、Casタンパク質がFnCpf1であり、PAMが5' TTNであり、ここで、NはA、C、GまたはTである。一部の特定の他のV-A型Casタンパク質のPAM配列がZetsche et al.（2015） CELL, 163:759および米国特許第9,982,279号に開示されている。さらに、Casタンパク質のPAM相互作用（PI）ドメインの操作によってPAM特異性のプログラミングが可能となり得、標的部位認識の忠実度が改善され得、操作された天然に存在しないシステムの多用途性が増大し得る。Cpf1のPAM特異性を改変するための例示的なアプローチはGao et al.（2017）NAT. BIOTECHNOL., 35:789に記載されている。
一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が、Casタンパク質の特異性をターゲティング範囲に対する修飾と協調する状態に改変する修飾を含む。Cas変異型は、例えば、PAM特異性を改変する変異（例えば、PIドメイン内）を選び出し、変異を、オフターゲット座位と対比してオンターゲット座位の特異性を増大させる（または所望される場合は低減させる）溝内変異と合わせることにより、標的特異性の増大ならびにPAM認識の修飾における適応を有するように設計され得る。本明細書に記載のCas修飾は、PAM認識の改変に起因する特異性の喪失を無効にするため、PAM認識の改変に起因する特異性の獲得を増強するため、PAM認識の改変に起因する特異性の獲得を無効にするため、またはPAM認識の改変に起因する特異性の喪失を増強するために使用され得る。
一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が1つまたは複数の核局在化シグナル（NLS）モチーフを含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が、少なくとも2つ（例えば少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10）のNLSモチーフを含む。NLSモチーフの非限定的な例としては、PKKKRKV（SEQ ID NO:23）のアミノ酸配列を有する、SV40ラージT抗原のNLS;ヌクレオプラスミン由来のNLS、例えば、KRPAATKKAGQAKKKK（SEQ ID NO:24）のアミノ酸配列を有するヌクレオプラスミン双節型NLS;PAAKRVKLD（SEQ ID NO:25）またはRQRRNELKRSP（SEQ ID NO:26）のアミノ酸配列を有するc-myc NLS;
Figure 2022550599000016
のアミノ酸配列を有するhRNPA1 M9 NLS;
Figure 2022550599000017
のアミノ酸配列を有するインポーチン-α IBBドメインNLS;VSRKRPRP（SEQ ID NO:29）またはPPKKARED（SEQ ID NO:30）のアミノ酸配列を有する筋腫Tタンパク質NLS;PQPKKKPL（SEQ ID NO:31）のアミノ酸配列を有するヒトp53 NLS;SALIKKKKKMAP（SEQ ID NO:32）のアミノ酸配列を有するマウスc-abl IV NLS;DRLRR（SEQ ID NO:33）またはPKQKKRK（SEQ ID NO:34）のアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルスNS1 NLS;RKLKKKIKKL（SEQ ID NO:35）のアミノ酸配列を有する肝炎ウイルスδ抗原NLS;REKKKFLKRR（SEQ ID NO:36）のアミノ酸配列を有するマウスMx1タンパク質NLS;
Figure 2022550599000018
のアミノ酸配列を有するヒトポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼNLS;RKCLQAGMNLEARKTKK（SEQ ID NO:38）のアミノ酸配列を有するヒトグルココルチコイド受容体NLS、および合成NLSモチーフ、例えばPAAKKKKLD（SEQ ID NO:39）が挙げられる。
一般に、1つまたは複数のNLSモチーフは、真核細胞の核内において検出可能な量でのCasタンパク質の蓄積を推進するのに充分な強さのものである。核局在化活性の強さは、Casタンパク質内のNLSモチーフ（1つもしくは複数）の数、使用される具体的なNLSモチーフ（1つもしくは複数）、NLSモチーフ（1つもしくは複数）の位置（1つもしくは複数）、またはこれらの要素の組合せに由来し得る。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が、少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10）のNLSモチーフをN末端に、またはN末端付近（例えば、ポリペプチド鎖に沿ってN末端から約1、約2、約3、約4、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約40、約50個またはそれより多くのアミノ酸の範囲内）に含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が、少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10）のNLSモチーフをC末端に、またはC末端付近（例えば、ポリペプチド鎖に沿ってC末端から約1、約2、約3、約4、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約40、約50個またはそれより多くのアミノ酸の範囲内）に含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が、少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10）のNLSモチーフをC末端またはC末端付近に、および少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、または少なくとも10）のNLSモチーフをN末端またはN末端付近に含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が、1つ、2つまたは3つのNLSモチーフをC末端またはC末端付近に含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質が1つのNLSモチーフをN末端またはN末端付近に、および1つ、2つまたは3つのNLSモチーフをC末端またはC末端付近に含む。一部の特定の態様では、操作されたCasタンパク質がヌクレオプラスミンNLSをC末端またはC末端付近に含む。
核内における蓄積の検出は任意の適切な手法によって行なわれ得る。例えば、検出可能なマーカーを核酸ターゲティングタンパク質に、細胞内における場所が可視化され得るように融合させてもよい。また、細胞核を細胞から単離してもよく、次いで、その内容物を、タンパク質を検出するための任意の適切な方法、例えば免疫組織化学検査、ウエスタンブロットまたは酵素活性アッセイによって解析してもよい。また、核内における蓄積の検出は間接的に、例えば、Casタンパク質複合体の核輸入の効果を、Casタンパク質に曝露されていない対照またはNLSモチーフのうちの1つもしくは複数がないCasタンパク質に曝露された対照と比較して検出するアッセイ（例えば、標的遺伝子座におけるDNAの切断もしくは変異のアッセイまたは遺伝子発現活性の改変のアッセイ）によって測定され得る。
本発明におけるCasタンパク質は、キメラCasタンパク質、例えばキメラであることによって機能が向上したCasタンパク質を含み得る。キメラCasタンパク質は、1種より多くの天然に存在するCasタンパク質またはそのバリアント由来の断片を含む新しいCasタンパク質であり得る。例えば、複数のV-A型Casホモログ（例えば、オーソログ）の断片を融合してキメラCasタンパク質が形成され得る。一部の特定の態様では、キメラCasタンパク質が、複数の種および/または系統由来のCpf1オーソログの断片を含む。
一部の特定の態様では、Casタンパク質が1つまたは複数のエフェクタードメインを含む。1つまたは複数のエフェクタードメインは、Casタンパク質のN末端もしくはN末端付近および/またはCasタンパク質のC末端もしくはC末端付近に位置し得る。一部の特定の態様では、Casタンパク質に含まれるエフェクタードメインが転写活性化ドメイン（例えば、VP64）、転写抑制ドメイン（例えば、KRABドメインもしくはSIDドメイン）、外来性ヌクレアーゼドメイン（例えば、FokI）、デアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼもしくはアデニンデアミナーゼ）または逆転写酵素ドメイン（例えば、高忠実度逆転写酵素ドメイン）である。エフェクタードメインの他の活性としては、非限定的に、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写終結因子活性、翻訳開始活性、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性、ヒストン修飾（例えば、アセチル化または脱メチル化）活性、一本鎖RNA切断活性、二本鎖RNA切断活性、一本鎖DNA切断活性、二本鎖DNA切断活性および核酸結合活性が挙げられる。
一部の特定の態様では、Casタンパク質が、相同配列依存的修復（HDR）を向上させる、および/または非相同性末端結合（NHEJ）を阻害する1つまたは複数のタンパク質ドメインを含む。かかる機能を有する例示的なタンパク質ドメインは、Jayavaradhan et al.（2019）NAT. COMMUN. 10（1）:2866およびJanssen et al.（2019）MOL. THER. NUCLEIC ACIDS 16:141-54に記載されている。一部の特定の態様では、Casタンパク質が、p53結合タンパク質1（53BP1）のドミナントネガティブ変形型、例えば最小フォーカス形成（minimum focus forming）領域（例えば、ヒト53BP1のアミノ酸1231～1644）を含む53BP1の断片を含む。一部の特定の態様では、Casタンパク質が、APC-Cdh1によってターゲティングされるモチーフ、例えばヒトジェミニンのアミノ酸1～110を含み、それにより細胞周期のHDR非許容G1期に融合タンパク質の分解をもたらす。
一部の特定の態様では、Casタンパク質が誘導性ドメインまたは制御性ドメインを含む。誘導物質または制御体の非限定的な例としては、光、ホルモンおよび小分子薬が挙げられる。一部の特定の態様では、Casタンパク質が光誘導性ドメインまたは光制御性ドメインを含む。一部の特定の態様では、Casタンパク質が化学薬品誘導性ドメインまたは化学薬品制御性ドメインを含む。
一部の特定の態様では、Casタンパク質が、追跡または精製を容易にするためのタグタンパク質またはタグペプチドを含む。タグタンパク質およびタグペプチドの非限定的な例としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、YFP、RFP、CFP、mCherry、tdTomato）、HISタグ（例えば、6×Hisタグ）、ヘマグルチニン（HA）タグ、FLAGタグおよびMycタグが挙げられる。
一部の特定の態様では、Casタンパク質が非タンパク質部分に、例えばゲノムのイメージングに有用なフルオロフォアにコンジュゲートされる。一部の特定の態様では、Casタンパク質が非タンパク質部分に共有結合によりコンジュゲートされる。用語「CRISPR関連タンパク質」、「Casタンパク質」、「Cas」、「CRISPR関連ヌクレアーゼ」および「Casヌクレアーゼ」の使用は、本明細書において、1つまたは複数の非タンパク質部分が存在しているにもかかわらずかかるコンジュゲートを包含している。
ターゲッター核酸およびモジュレーター核酸
本発明の操作された天然に存在しないシステムは、ハイブリダイズして複合体を形成したとき本明細書に開示のCasヌクレアーゼを活性化させることができるターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む。一部の特定の態様では、Casヌクレアーゼが、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化される。一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型、V-C型またはV-D型のヌクレアーゼである。
用語「ターゲッター核酸」は、本明細書で用いる場合、（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列;および（ii）さらなる核酸とハイブリダイズして複合体を形成することができるターゲッターステム配列を含む核酸を指し、複合体は適切な条件下でCasヌクレアーゼ（例えば、V-A型Casヌクレアーゼ）を活性化させることができ、ターゲッター核酸は、さらなる核酸なしの単独では、同じ条件下でCasヌクレアーゼを活性化させることができない。
用語「モジュレーター核酸」は、所与のターゲッター核酸およびその対応するCasヌクレアーゼとの関連において本明細書で用いる場合、ターゲッター核酸とハイブリダイズして複合体を形成することができる核酸を指し、複合体は適切な条件下でCasヌクレアーゼ型を活性化させることができるが、モジュレーター核酸単独では活性化させることができない。
用語「適切な条件」は、「ターゲッター核酸」および「モジュレーター核酸」の定義で用いる場合、天然に存在するCRISPR-Casシステムが例えば原核生物細胞内、真核生物（例えば、哺乳動物もしくはヒトの）細胞内またはインビトロアッセイにおいて機能性である条件を指す。
ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸は化学合成され得るか、または生物学的方法（例えば、インビトロ反応でRNAポリメラーゼによって触媒されるもの）にて作製され得る。かかる反応または方法ではターゲッター核酸およびモジュレーター核酸の長さが限定され得る。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下または25以下のヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が少なくとも20、25、30、40、50、60、70、80または90ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が20～100、20～90、20～80、20～70、20～60、20～50、20～40、20～30、20～25、25～100、25～90、25～80、25～70、25～60、25～50、25～40、25～30、30～100、30～90、30～80、30～70、30～60、30～50、30～40、40～100、40～90、40～80、40～70、40～60、40～50、50～100、50～90、50～80、50～70、50～60、60～100、60～90、60～80、60～70、70～100、70～90、70～80、80～100、80～90または90～100ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下または20以下のヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が少なくとも10、15、20、25、30、40、50、60、70、80または90ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が10～100、10～90、10～80、10～70、10～60、10～50、10～40、10～30、10～20、15～100、15～90、15～80、15～70、15～60、15～50、15～40、15～30、15～20、20～100、20～90、20～80、20～70、20～60、20～50、20～40、20～30、25～100、25～90、25～80、25～70、25～60、25～50、25～40、25～30、30～100、30～90、30～80、30～70、30～60、30～50、30～40、40～100、40～90、40～80、40～70、40～60、40～50、50～100、50～90、50～80、50～70、50～60、60～100、60～90、60～80、60～70、70～100、70～90、70～80、80～100、80～90または90～100ヌクレオチド長である。
天然に存在するV-A型CRISPR-Casシステムでは、crRNAが骨格配列（直接反復配列とも称する）と、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするスペーサー配列とを含む。一部の特定の天然に存在するV-A型CRISPR-Casシステムでは、骨格配列がステム-ループ構造を形成しており、構造内のステムは連続する5つの塩基対からなる。デュアルガイドV-A型CRISPR-Casシステムは、天然に存在するV-A型CRISPR-CasシステムまたはcrRNA単独によってCasタンパク質が標的ヌクレオチド配列にガイドされるそのバリアントに由来し得、かかるシステムを本明細書において「シングルガイドV-A型CRISPR-Casシステム」と称する。本明細書に開示のデュアルガイドV-A型CRISPR-Casシステムでは、ターゲッター核酸が、スペーサーとループ間のステム配列（「ターゲッターステム配列」）とスペーサー配列の鎖を含み、モジュレーター核酸が、ステム配列（「モジュレーターステム配列」）とモジュレーターステム配列の5’側に位置している5’テールの他方の鎖を含む。ターゲッターステム配列はモジュレーターステム配列に100％相補的である。そのため、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸の二本鎖複合体は、シングルガイドV-A型CRISPR-Casシステムの5’テール、モジュレーターステム配列、ターゲッターステム配列およびスペーサー配列の配向を保持しているが、モジュレーターステム配列とターゲッターステム配列の間にループ構造がない。例示的な二本鎖複合体の略図を図1に示す。
一般構造の類似性にもかかわらず、天然に存在するV-A型CRISPR複合体のcrRNAのステム-ループ構造はCRISPRシステムの機能性に不可欠でないことが見いだされた。この知見は、先行技術ではステム-ループ構造が極めて重要であること（Zetsche et al.（2015）CELL, 163:759参照）およびcrRNAを「分割すること」によってループ構造を除去するとAsCpf1 CRISPRシステムの活性が消失したこと（Li et al.（2017）NAT. BIOMED. ENG., 1:0066参照）が示唆されているため、驚くべきことである。
この二本鎖の長さは機能性のデュアルガイドCRISPRシステムの提供における一要素であり得ることが想定される。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、互いに塩基対合する4～10個のヌクレオチドからなる。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、互いに塩基対合する4～9、4～8、4～7、4～6、4～5、5～10、5～9、5～8、5～7または5～6個のヌクレオチドからなる。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチドからなる。各配列内のヌクレオチドの組成が二本鎖の安定性に影響することは理解され、C-G塩基対の方がA-U塩基対より大きな安定性を付与する。一部の特定の態様では、塩基対のうち20％～80％、20％～70％、20％～60％、20％～50％、20％～40％、20％～30％、30％～80％、30％～70％、30％～60％、30％～50％、30％～40％、40％～80％、40％～70％、40％～60％、40％～50％、50％～80％、50％～70％、50％～60％、60％～80％、60％～70％または70％～80％がC-G塩基対である。
一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、5個のヌクレオチドからなる。そのため、ターゲッターステム配列とモジュレーターステム配列は5塩基対の二本鎖を形成する。一部の特定の態様では、5塩基対のうち0～4、0～3、0～2、0～1、1～5、1～4、1～3、1～2、2～5、2～4、2～3、3～5、3～4または4～5つがC-G塩基対である。一部の特定の態様では、5塩基対のうち0、1、2、3、4または5つがC-G塩基対である。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列が5’-GUAGA-3’（SEQ ID NO:21）からなり、モジュレーターステム配列が5’-UCUAC-3’からなる。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列が5’-GUGGG-3’（SEQ ID NO:22）からなり、モジュレーターステム配列が5’-CCCAC-3’からなる。
また、所与のCasヌクレアーゼに対する二本鎖の適合性も機能性のデュアルガイドCRISPRシステムの提供における一要素であり得ることが想定される。例えば、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列は、CasヌクレアーゼをtracrRNAなしで活性化させることができる天然に存在するcrRNAに由来し得る。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列のヌクレオチド配列が、かかる天然に存在するcrRNAのステム-ループ構造の対応するステム配列と同一である。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が、5’から3’に向かってターゲッターステム配列およびスペーサー配列を含む。スペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計される。標的ヌクレオチド配列に対する充分なターゲティングを提供するためには、スペーサー配列は一般的に16またはそれより多くのヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、スペーサー配列が少なくとも16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50または75ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、スペーサー配列が、75、50、45、40、35、30、25、もしくは20ヌクレオチド長より短いか、または75、50、45、40、35、30、25、もしくは20ヌクレオチド長に等しい。短いスペーサー配列の方がオフターゲット事象の低減のために望ましいかもしれない。したがって、一部の特定の態様では、スペーサー配列が、19、18、もしくは17個のヌクレオチドより短いか、または19、18、もしくは17個のヌクレオチドに等しい。一部の特定の態様では、スペーサー配列が17～30ヌクレオチド長、例えば20～30ヌクレオチド長、20～25ヌクレオチド長、20～24ヌクレオチド長、20～23ヌクレオチド長、23～25ヌクレオチド長、20～22ヌクレオチド長または約20ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、スペーサー配列が20ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、スペーサー配列が標的ヌクレオチド配列に少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％または少なくとも約99％相補的である。一部の特定の態様では、スペーサー配列がシード領域（PAMに近位の約5塩基対）において標的ヌクレオチド配列に100％相補的である。一部の特定の態様では、スペーサー配列が標的ヌクレオチド配列に100％相補的である。DNA結合と比べると、DNA切断はスペーサー配列と標的ヌクレオチド配列間のミスマッチに対してあまり寛容でないことが報告されている（Klein et al.（2018）CELL REPORTS, 22:1413参照）。したがって、特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムがCasヌクレアーゼを含む場合、スペーサー配列が標的ヌクレオチド配列に100％相補的である。
スペーサー配列の適正な設計は標的ヌクレオチド配列の選択に依存する。例えば、所与のゲノム内の特定の遺伝子内の標的ヌクレオチド配列を選択するため、スペーサー配列とゲノム内の任意の他の座位とのハイブリダイゼーションの可能性を最小限にするために配列解析が実施され得る。また、Casタンパク質によって認識されるPAMを有する標的ヌクレオチド配列の結合も多くの設計方法で考慮される。V-A型CRISPR-Casシステムでは、非標的鎖（すなわち、スペーサー配列とハイブリダイズしない鎖）をコーディネート鎖として用いた場合、PAMは標的配列のすぐ上流に存在する。標的ヌクレオチド配列のターゲティング可能性ならびに任意の潜在的オフターゲット効果を評価するための、例えばDoench et al.（2016）NAT. BIOTECHNOL., 34:184;Chuai et al.（2018）GENOME BIOLOGY, 19:80;およびKlein et al.（2018）CELL REPORTS, 22:1413に開示されているようなコンピュータ使用によるモデルが開発されている。コンピュータ使用による方法はスペーサー配列の選択に有用であるが、複数のスペーサー配列を設計し、高い効率および特異性を有する1つまたは複数をインビトロおよび/またはインビボ実験の結果に基づいて選択することが一般的に賢明である。
一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列の3’末端が、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下、6個以下、7個以下、8個以下、9個以下または10個以下のヌクレオチドによってスペーサー配列の5’末端に連結される。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列とスペーサー配列が互いに隣接しており、ヌクレオチド間結合によって直接連結されている。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列とスペーサー配列が、1個のヌクレオチド、例えばウリジンによって連結されている。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列とスペーサー配列が2個以上のヌクレオチドによって連結されている。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列とスペーサー配列が、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチドによって連結されている。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が、ターゲッターステム配列の5’側にさらなるヌクレオチド配列をさらに含む。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が、少なくとも1個（例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個または少なくとも50個）のヌクレオチドを含む。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45または50個のヌクレオチドからなる。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が2個のヌクレオチドからなる。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が、対応するシングルガイドCRISPR-CasシステムのcrRNAのループまたはその断片（例えば、ループの3’末端の1、2、3または4個のヌクレオチド）とよく似ている。ターゲッターステム配列の5’側のさらなるヌクレオチド配列は不可欠でないことは理解されよう。したがって、一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が、ターゲッターステム配列の5’側に1個もさらなるヌクレオチドを含まない。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸が、1個または複数のヌクレオチドを含むさらなるヌクレオチド配列を、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない3’末端にさらに含む。さらなるヌクレオチド配列はターゲッター核酸を3’-5’エキソヌクレアーゼによる分解から保護し得る。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が、100以下のヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下または10以下のヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45または少なくとも50ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が5～100、5～50、5～40、5～30、5～25、5～20、5～15、5～10、10～100、10～50、10～40、10～30、10～25、10～20、10～15、15～100、15～50、15～40、15～30、15～25、15～20、20～100、20～50、20～40、20～30、20～25、25～100、25～50、25～40、25～30、30～100、30～50、30～40、40～100、40～50または50～100ヌクレオチド長である。
一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列がスペーサー配列とヘアピン部を形成する。かかる二次構造により、操作された天然に存在しないシステムの特異性が増大し得る（Kocak et al.（2019）NAT. BIOTECH. 37:657-66参照）。一部の特定の態様では、ヘアピン部形成の際の自由エネルギー変化が、-20kcal/molより大きい、-15kcal/molより大きい、-14kcal/molより大きい、-13kcal/molより大きい、-12kcal/molより大きい、-11kcal/molより大きい、もしくは-10kcal/molより大きいか、または-20kcal/mol、-15kcal/mol、-14kcal/mol、-13kcal/mol、-12kcal/mol、-11kcal/mol、もしくは-10kcal/molに等しい。一部の特定の態様では、ヘアピン部形成の際の自由エネルギー変化が、-5kcal/molより大きい、-6kcal/molより大きい、-7kcal/molより大きい、-8kcal/molより大きい、-9kcal/molより大きい、-10kcal/molより大きい、-11kcal/molより大きい、-12kcal/molより大きい、-13kcal/molより大きい、-14kcal/molより大きい、もしくは-15kcal/molより大きいか、または-5kcal/mol、-6kcal/mol、-7kcal/mol、-8kcal/mol、-9kcal/mol、-10kcal/mol、-11kcal/mol、-12kcal/mol、-13kcal/mol、-14kcal/mol、もしくは-15kcal/molに等しい。一部の特定の態様では、ヘアピン部形成の際の自由エネルギー変化が、-20～-10kcal/mol、-20～-11kcal/mol、-20～-12kcal/mol、-20～-13kcal/mol、-20～-14kcal/mol、-20～-15kcal/mol、-15～-10kcal/mol、-15～-11kcal/mol、-15～-12kcal/mol、-15～-13kcal/mol、-15～-14kcal/mol、-14～-10kcal/mol、-14～-11kcal/mol、-14～-12kcal/mol、-14～-13kcal/mol、-13～-10kcal/mol、-13～-11kcal/mol、-13～-12kcal/mol、-12～-10kcal/mol、-12～-11kcal/molまたは-11～-10kcal/molの範囲である。他の態様では、ターゲッター核酸がスペーサー配列の3’側に1個もヌクレオチドを含まない。
一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、モジュレーターステム配列の3’側にさらなるヌクレオチド配列をさらに含む。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が、少なくとも1個（例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個または少なくとも50個）のヌクレオチドを含む。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45または50個のヌクレオチドからなる。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が1個のヌクレオチド（例えば、ウリジン）からなる。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が2個のヌクレオチドからなる。一部の特定の態様では、さらなるヌクレオチド配列が、対応するシングルガイドCRISPR-CasシステムのcrRNAのループまたはその断片（例えば、ループの5’末端の1、2、3または4個のヌクレオチド）とよく似ている。モジュレーターステム配列の3’側のさらなるヌクレオチド配列は不可欠でないことは理解されよう。したがって、一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、モジュレーターステム配列の3’側に1個もさらなるヌクレオチドを含まない。
ターゲッターステム配列の5’側のさらなるヌクレオチド配列とモジュレーターステム配列の3’側のさらなるヌクレオチド配列は、存在するならば、互いと相互作用し得ることは理解されよう。例えば、ターゲッターステム配列のすぐ5’側のヌクレオチドとモジュレーターステム配列のすぐ3’側のヌクレオチドはワトソン・クリック塩基対を形成しない（普通なら、これらは、それぞれターゲッターステム配列の一部およびモジュレーターステム配列の一部を構成し得る）が、ターゲッターステム配列の5’側のさらなるヌクレオチド配列およびモジュレーターステム配列の3’側のさらなるヌクレオチド配列内の他のヌクレオチドは、1つ、2つ、3つ、またはそれより多くの塩基対（例えば、ワトソン・クリック塩基対）を形成し得る。かかる相互作用は、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体の安定性に影響し得る。
ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体の安定性は、計算または実測のいずれかの、複合体の形成の際のギブスの自由エネルギー変化（ΔG）によって評価され得る。複合体の推定されるすべての塩基対合がターゲッター核酸内の塩基とモジュレーター核酸内の塩基との間で起こる場合、すなわち鎖内二次構造が存在しない場合、複合体の形成の際のΔGは一般的に、対応するシングルガイド核酸内の二次構造の形成の際のΔGと相関する。ΔGの計算方法または測定方法は当技術分野において公知である。例示的な方法はGruber et al.（2008）NUCLEIC ACIDS RES., 36（Web Server issue）:W70-W74に開示されているようなRNAfold（rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）である。特に記載のない限り、本開示におけるΔG値は、対応するシングルガイド核酸内の二次構造の形成についてRNAfoldによって計算したものである。一部の特定の態様では、ΔGが-1kcal/molより小さいかまたは-1kcal/molに等しい、例えば-2kcal/molより小さいかもしくは-2kcal/molに等しい、-3kcal/molより小さいかもしくは-3kcal/molに等しい、-4kcal/molより小さいかもしくは-4kcal/molに等しい、-5kcal/molより小さいかもしくは-5kcal/molに等しい、-6kcal/molより小さいかもしくは-6kcal/molに等しい、-7kcal/molより小さいかもしくは-7kcal/molに等しい、-7.5kcal/molより小さいかもしくは-7.5kcal/molに等しい、または-8kcal/molより小さいかもしくは-8kcal/molに等しい。一部の特定の態様では、ΔGが-10kcal/molより大きいかまたは-10kcal/molに等しい、例えば-9kcal/molより大きいかもしくは-9kcal/molに等しい、-8.5kcal/molより大きいかもしくは-8.5kcal/molに等しい、または-8kcal/molより大きいかもしくは-8kcal/molに等しい。一部の特定の態様では、ΔGが-10～-4kcal/molの範囲である。一部の特定の態様では、ΔGが、-8～-4kcal/mol、-7～-4kcal/mol、-6～-4kcal/mol、-5～-4kcal/mol、-8～-4.5kcal/mol、-7～-4.5kcal/mol、-6～-4.5kcal/molまたは-5～-4.5kcal/molの範囲である。一部の特定の態様では、ΔGが約-8kcal/mol、-7kcal/mol、-6kcal/mol、-5kcal/mol、-4.9kcal/mol、-4.8kcal/mol、-4.7kcal/mol、-4.6kcal/mol、-4.5kcal/mol、-4.4kcal/mol、-4.3kcal/mol、-4.2kcal/mol、-4.1kcal/molまたは-4kcal/molである。
ΔGは、ターゲッターステム配列内のものでないターゲッター核酸内の配列および/またはモジュレーターステム配列内のものでないモジュレーター核酸内の配列によって影響され得ることは理解されよう。例えば、ターゲッターステム配列の5’側のさらなる配列とモジュレーターステム配列の3’側のさらなる配列間の1つまたは複数の塩基対（例えば、ワトソン・クリック塩基対）はΔGを低減し得る、すなわち核酸複合体を安定化させ得る。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列のすぐ5’側のヌクレオチドがウラシルを含むか、またはウリジンであり、モジュレーターステム配列のすぐ3’側のヌクレオチドがウラシルを含むか、またはウリジンであり、それにより非従来型U-U塩基対が形成される。
一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、モジュレーターステム配列の5’側に位置している本明細書において「5’テール」と称するヌクレオチド配列を含む。CRISPRシステムがV-A型CRISPRシステムである場合、デュアルガイドシステムの5’テールは、crRNA（シングルガイド）内の骨格配列のステム-ループ構造の5’側に位置しているヌクレオチド配列とよく似ている。したがって、5’テールは、デュアルガイドシステムをシングルガイドシステムから操作するときの対応するヌクレオチド配列を含み得る。
理論に拘束されないが、5’テールがCRISPR-Cas複合体の形成に関与し得ることが想定される。例えば、一部の特定の態様では、5’テールがモジュレーターステム配列とシュードノット構造を形成し、これがCasタンパク質によって認識される（Yamano et al.（2016）CELL, 165:949参照）。一部の特定の態様では、5’テールが、少なくとも3（例えば少なくとも4または少なくとも5）ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、5’テールが3、4または5ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、5’テールの3’末端のヌクレオチドがウラシルを含むか、またはウリジンである。一部の特定の態様では、5’テール内の3’末端から数えて2番目の位置のヌクレオチドがウラシルを含むか、またはウリジンである。一部の特定の態様では、5’テール内の3’末端から数えて3番目の位置のヌクレオチドがアデニンを含むか、またはアデノシンである。この3番目のヌクレオチドは、モジュレーターステム配列の5’側のヌクレオチドと塩基対（例えば、ワトソン・クリック塩基対）を形成し得る。したがって、一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、モジュレーターステム配列の5’側にウリジンまたはウラシル含有ヌクレオチドを含む。一部の特定の態様では、5’テールが5’-AUU-3’のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の態様では、5’テールが5’-AAUU-3’のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の態様では、5’テールが5’-UAAUU-3’のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の態様では、5’テールがモジュレーターステム配列のすぐ5’側に位置している。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸が、ターゲッターステム配列とモジュレーターステム配列間のハイブリダイゼーション以外の二次構造の度合いが低減されるように設計される。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸のヌクレオチドのうち約75％以下、約50％以下、約40％以下、約30％以下、約25％以下、約20％以下、約15％以下、約10％以下、約5％以下、約1％以下またはそれより少ないヌクレオチドが、最適にフォールディングされている場合、自己相補的塩基対合に関与する。最適なフォールディングは任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。一部のプログラムはギブスの自由エネルギーの最小値の計算に基づいている。かかるアルゴリズムの1つの例は、Zuker and Stiegler（Nucleic Acids Res. 9（1981）,133-148）に記載のようなmFoldである。別のフォールディングアルゴリズムの一例は、ウィーン大学の理論化学学会（Institute for Theoretical Chemistry）で開発され、セントロイド構造推定アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーRNAfoldである（例えば、A.R. Gruber et al.,2008,Cell 106（1）:23-24;およびPA Carr and GM Church,2009,Nature Biotechnology 27（12）:1151-62参照）。
ターゲッター核酸は特定の標的ヌクレオチド配列に指向され、ドナーテンプレートは、標的ヌクレオチド配列またはその近傍の配列を修飾するように設計される。したがって、ターゲッター核酸またはモジュレーター核酸とドナーテンプレートとの結合により編集効率が高まり得、オフターゲット作用が低減され得ることは理解されよう。マルチプレックス方法（例えば、以下のセクションIIのサブセクション「マルチプレックス法」に開示しているような）では、ドナーテンプレートとモジュレーター核酸との結合により、ターゲッター核酸ライブラリーをドナーテンプレートライブラリーと組み合わせ、スクリーニングまたは選択アッセイの設計を、より効率的で柔軟性にすることが可能になる。したがって、一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、ドナーテンプレートとハイブリダイズすることができるドナーテンプレートリクルート配列をさらに含む（図1C参照）。ドナーテンプレートは、以下のセクションIIのサブセクション「ドナーテンプレート」に記載している。ドナーテンプレートおよびドナーテンプレートリクルート配列は、これらが配列相補性を有するように設計され得る。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートリクルート配列が、ドナーテンプレートの少なくとも一部分に少なくとも90％（例えば少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％）相補的である。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートリクルート配列がドナーテンプレートの少なくとも一部分に100％相補的である。一部の特定の態様において、ドナーテンプレートが修復対象の配列に相同でない操作された配列を含む場合、ドナーテンプレートリクルート配列は、ドナーテンプレート内の操作された配列とハイブリダイズすることができる。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートリクルート配列が少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートリクルート配列がモジュレーター核酸の5’末端に位置している。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートリクルート配列が、モジュレーター核酸の、存在するならば5’テールまたはモジュレーターステム配列にヌクレオチド間結合によって、またはヌクレオチドリンカーを介して連結される。
一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、遺伝子の編集および/または相同配列依存的修復（HDR）の効率を高める編集エンハンサー配列をさらに含む（図1D参照）。例示的な編集エンハンサー配列はPark et al.（2018） NAT. COMMUN. 9:3313に記載されている。一部の特定の態様では、編集エンハンサー配列が、存在するならば5’テールの5’側またはモジュレーターステム配列の5’側に位置している。一部の特定の態様では、編集エンハンサー配列が1～50、4～50、9～50、15～50、25～50、1～25、4～25、9～25、15～25、1～15、4～15、9～15、1～9、4～9または1～4ヌクレオチド長である。一部の特定の態様では、編集エンハンサー配列が約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50または約55ヌクレオチド長である。編集エンハンサー配列は、標的ヌクレオチド配列との相同性が最小限となるように、または操作された天然に存在しないシステムが接触し得る任意の他の配列、例えば、操作された天然に存在しないシステムが送達される細胞のゲノム配列との相同性が最小限となるように設計される。一部の特定の態様では、編集エンハンサーが、ヘアピン構造部の存在が最小限となるように設計される。編集エンハンサーは1つまたは複数の本明細書に開示の化学修飾を含み得る。
モジュレーター核酸および/またはターゲッター核酸は、核酸の分解を抑制または低減する保護ヌクレオチド配列をさらに含み得る。一部の特定の態様では、保護ヌクレオチド配列が、少なくとも5（例えば少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45または少なくとも50）ヌクレオチド長である。保護ヌクレオチド配列の長さによって、エキソヌクレアーゼが5’テール、モジュレーターステム配列、ターゲッターステム配列および/またはスペーサー配列に達する時間が長くなり、それにより、モジュレーター核酸および/またはターゲッター核酸のこれらの部分がエキソヌクレアーゼによる分解から保護される。一部の特定の態様では、保護ヌクレオチド配列が二次構造、例えばヘアピン部またはtRNA構造を形成しており、エキソヌクレアーゼによる分解の速度が低下する（例えば、Wu et al.（2018）CELL. MOL. LIFE SCI., 75（19）:3593-3607参照）。二次構造は、当技術分野において公知の方法、例えばウィーン大学で開発され、セントロイド構造推定アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーRNAfold（Gruber et al.（2008）NUCLEIC ACIDS RES., 36:W70参照）によって推定され得る。また、以下のサブセクション「RNAの修飾」に開示されているような、保護ヌクレオチド配列に存在していてもよい一部の特定の化学修飾によっても核酸の分解が抑制または低減され得る。
保護ヌクレオチド配列は、典型的にはモジュレーター核酸またはターゲッター核酸の5’末端、3’末端または両端にある。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が保護ヌクレオチド配列を5’末端に、任意でヌクレオチドリンカーを介して含む（図1B参照）。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が保護ヌクレオチド配列を3’末端に含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が保護ヌクレオチド配列を5’末端に含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が保護ヌクレオチド配列を3’末端に含む。
上記のように、種々のヌクレオチド配列、例えば非限定的に、ドナーテンプレートリクルート配列、編集エンハンサー配列、保護ヌクレオチド配列、およびかかる配列を、存在するならば5’テールに、またはモジュレーターステム配列に連結するリンカーがモジュレーター核酸の5’部分に存在し得る。ドナーテンプレートリクルート、編集向上、分解に対する保護および結合の機能は互いに排他的でなく、1つのヌクレオチド配列がかかる機能のうちの1つまたは複数を有し得ることは理解されよう。例えば、一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、ドナーテンプレートリクルート配列と編集エンハンサー配列の両方であるヌクレオチド配列を含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、ドナーテンプレートリクルート配列と保護配列の両方であるヌクレオチド配列を含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、編集エンハンサー配列と保護配列の両方であるヌクレオチド配列を含む。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸が、ドナーテンプレートリクルート配列、編集エンハンサー配列および保護配列であるヌクレオチド配列を含む。一部の特定の態様では、存在するならば5’テールの5’側またはモジュレーターステム配列の5’側のヌクレオチド配列が1～90、1～80、1～70、1～60、1～50、1～40、1～30、1～20、1～10、10～90、10～80、10～70、10～60、10～50、10～40、10～30、10～20、20～90、20～80、20～70、20～60、20～50、20～40、20～30、30～90、30～80、30～70、30～60、30～50、30～40、40～90、40～80、40～70、40～60、40～50、50～90、50～80、50～70、50～60、60～90、60～80、60～70、70～90、70～80または80～90ヌクレオチド長である。
一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムが、HDRを向上させる、および/またはNHEJを阻害する1種または複数種の化合物（例えば、小分子化合物）をさらに含む。かかる機能を有する例示的な化合物は、Maruyama et al.（2015）NAT BIOTECHNOL. 33（5）:538-42;Chu et al.（2015）NAT BIOTECHNOL. 33（5）:543-48;Yu et al.（2015）CELL STEM CELL 16（2）:142-47;Pinder et al.（2015）NUCLEIC ACIDS RES. 43（19）:9379-92;およびYagiz et al.（2019）COMMUN. BIOL. 2:198に記載されている。一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムが、DNAリガーゼIVアンタゴニスト（例えば、SCR7化合物、Ad4 E1B55Kタンパク質およびAd4 E4orf6タンパク質）、RAD51アゴニスト（例えば、RS-1）、DNA依存性プロテインキナーゼ（DNA-PK）アンタゴニスト（例えば、NU7441およびKU0060648）、β3アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、L755507）、ERからゴルジ装置への細胞内タンパク質輸送のインヒビター（例えば、ブレフェルジンA）ならびにその任意の組合せからなる群より選択される1種または複数種の化合物をさらに含む。
モジュレーター核酸およびターゲッター核酸の配列はCasタンパク質と適合性であるのがよい。一部の特定のV-A型Casタンパク質とともに機能性の例示的な配列を表1に示す。これらの配列は一例にすぎず、他のガイド核酸配列もまた、これらのCasタンパク質とともに使用され得ることは理解されよう。
（表１）V-A型Casタンパク質および対応するガイド核酸配列
Figure 2022550599000019
1 Casタンパク質のアミノ酸配列は本明細書の最後に示している。
2 ここに列記した「モジュレーター配列」がモジュレーター核酸のヌクレオチド配列を構成し得ることは理解されよう。あるいは、さらなるヌクレオチド配列がモジュレーター核酸内のここに列記した「モジュレーター配列」の5’および/または3’側に含まれていてもよい。
3 コンセンサスPAM配列において、NはA、C、GまたはTを表す。PAM配列の前に「5’」が示されている場合、これは、非標的鎖（すなわち、スペーサー配列とハイブリダイズしない鎖）をコーディネート鎖として用いた場合、PAMが標的配列のすぐ上流に存在することを意味する。
一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムのターゲッター核酸が、表1に列記したターゲッターステム配列を含む。一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムのターゲッター核酸およびモジュレーター核酸がそれぞれ、表1の同じ並びに列記したターゲッターステム配列およびモジュレーター配列を含む。一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムが、表1の同じ並びに列記したSEQ ID NOに示すアミノ酸配列を含むCasヌクレアーゼをさらに含む。一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムが、非標的鎖（すなわち、スペーサー配列とハイブリダイズしない鎖）をコーディネート鎖として用いた場合、表1の同じ並びに列記したPAMに近接または隣接した（例えば、そのすぐ下流の）標的ヌクレオチド配列を含む核酸のターゲティング、編集または修飾に有用である。
一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムが調整可能または誘導性である。例えば、一部の特定の態様では、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸および/またはCasタンパク質が標的ヌクレオチド配列に異なる時点で導入され得、システムは、すべての構成要素が存在している場合にのみ活性となり得る。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸および/またはCasタンパク質の量が、望ましい効率および特異性が得られるように調整され得る。一部の特定の態様では、ターゲッターステム配列またはモジュレーターステム配列を含む核酸が過剰量でシステムに付加され得、それによりターゲッター核酸とモジュレーター核酸の複合体が解離し、システムがオフ状態になり得る。
RNAの修飾
ターゲッター核酸は、DNA（例えば、修飾DNA）、RNA（例えば、修飾RNA）またはその組合せで構成され得る。モジュレーター核酸は、DNA（例えば、修飾DNA）、RNA（例えば、修飾RNA）またはその組合せで構成され得る。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸がRNAであり、モジュレーター核酸がRNAである。RNAの形態のターゲッター核酸はターゲッターRNAとも称し、RNAの形態のモジュレーター核酸はモジュレーターRNAとも称する。本明細書に開示のヌクレオチド配列はチミジン（T）を含めることによってDNA配列として、および/またはウリジン（U）を含むRNA配列として示される。対応するDNA配列、RNA配列およびDNA/RNAキメラ配列もまた想定されることは理解されよう。例えば、スペーサー配列をDNA配列として示している場合、このスペーサー配列を含むRNAとしての核酸は、各TをUと置き換えることにより本明細書に開示のDNA配列から誘導され得る。その結果として、ヌクレオチド配列の記載の解釈上、TとUは本明細書において互換的に用いている。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸が、リボース基内に1つもしくは複数の修飾、リン酸基内に1つもしくは複数の修飾、核酸塩基内に1つもしくは複数の修飾、1つもしくは複数の末端修飾またはその組合せを有するRNAである。例示的な修飾が、米国特許出願公開第2016/0289675号、同第2017/0355985号、同第2018/0119140号、Watts et al.（2008）Drug Discov. Today 13:842-55、およびHendel et al.（2015）NAT. BIOTECHNOL. 33:985に開示されている。
リボース基における修飾としては、非限定的に、2'位の修飾または4'位の修飾が挙げられる。例えば、一部の特定の態様では、リボースが、2'-O-C1～4アルキル、例えば2'-O-メチル（2'-OMe）を含む。一部の特定の態様では、リボースが、2'-O-C1～3アルキル-O-C1～3アルキル、例えば2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても公知の2'-メトキシエトキシ(2'-O-CH2CH2OCH3)を含む。一部の特定の態様では、リボースが2'-O-アリルを含む。一部の特定の態様では、リボースが2'-O-2,4-ジニトロフェノール（DNP）を含む。一部の特定の態様では、リボースが、2'-ハロ、例えば2'-F、2'-Br、2'-Clまたは2'-Iを含む。一部の特定の態様では、リボースが2'-NH2を含む。一部の特定の態様では、リボースが2'-H（例えば、デオキシヌクレオチド）を含む。一部の特定の態様では、リボースが2'-アラビノまたは2'-F-アラビノを含む。一部の特定の態様では、リボースが2'-LNAまたは2'-ULNAを含む。一部の特定の態様では、リボースが4'-チオリボシルを含む。
リン酸基における修飾としては、非限定的に、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、キラルホスホロチオエートヌクレオチド間結合、ホスホロジチオエートヌクレオチド間結合、ボラノホスホネートヌクレオチド間結合、C1～4アルキルホスホネートヌクレオチド間結合、例えばメチルホスホネートヌクレオチド間結合、ボラノホスホネートヌクレオチド間結合、ホスホノカルボキシレートヌクレオチド間結合、例えばホスホノアセテートヌクレオチド間結合、ホスホノカルボキシレートエステルヌクレオチド間結合、例えばホスホノアセテートエステルヌクレオチド間結合、アミド結合、チオホスホノカルボキシレートヌクレオチド間結合、例えばチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合、チオホスホノカルボキシレートエステルヌクレオチド間結合、例えばチオホスホノアセテートエステルヌクレオチド間結合、およびホスホジエステルリンカーまたは上記の任意のリンカーを有する2',5'-結合が挙げられる。また、種々の塩、混合塩および遊離酸形態も包含される。
核酸塩基における修飾としては、非限定的に、2-チオウラシル、2-チオシトシン、4-チオウラシル、6-チオグアニン、2-アミノアデニン、2-アミノプリン、プソイドウラシル、ヒポキサンチン、7-デアザグアニン、7-デアザ-8-アザグアニン、7-デアザアデニン、7-デアザ-8-アザアデニン、5-メチルシトシン、5-メチルウラシル、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ヒドロキシメチルウラシル、5,6-デヒドロウラシル、5-プロピニルシトシン、5-プロピニルウラシル、5-エチニルシトシン、5-エチニルウラシル、5-アリルウラシル、5-アリルシトシン、5-アミノアリルウラシル、5-アミノアリル-シトシン、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、ジアミノプリン、ジフルオロトルエン、ジヒドロウラシル、脱塩基ヌクレオチド、Z塩基、P塩基、アンストラクチャード・ニュークレイック・アシッド（Unstructured Nucleic Acid）、イソグアニン、イソシトシン（Piccirilli et al.（1990）NATURE, 343:33参照）、5-メチル-2-ピリミジン（Rappaport（1993）BIOCHEMISTRY, 32:3047参照）、x（A、G、C、T）およびy（A、G、C、T）が挙げられる。
末端修飾としては、非限定的に、ポリエチレングリコール（PEG）、炭化水素リンカー（例えば、ヘテロ原子（O、S、N）置換型炭化水素スペーサー;ハロ置換型炭化水素スペーサー;ケト-、カルボキシル-、アミド-、チオニル-、カルバモイル-、チオノカルバマオイル（thionocarbamaoyl）-含有炭化水素スペーサー）、スペルミンリンカー、色素、例えば蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）、クエンチャー（例えば、ダブシル、BHQ）、ならびに他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチドおよび/またはタンパク質）が挙げられる。一部の特定の態様では、末端修飾が、RNAと、オリゴヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/またはリボヌクレオチド）、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンおよび/または他の分子を含む別の分子とのコンジュゲーション（またはライゲーション）を含む。一部の特定の態様では、RNA内に組み込まれている末端修飾が、RNA配列の内部に、2-(4-ブチルアミドフルオレセイン)プロパン-1,3-ジオールビス(ホスホジエステル)リンカーなどの、ホスホジエステル結合として組み込まれ、RNA内の2つのヌクレオチド間のどこに組み込まれてもよいリンカーを介して位置している。
上記に開示した修飾は、RNAの形態であるターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸内に結合され得る。一部の特定の態様では、RNAにおける修飾が、2'-O-メチル-3'ホスホロチオエート、2'-O-メチル-3'-ホスホノアセテート、2'-O-メチル-3'-チオホスホノアセテート、2'-ハロ-3'-ホスホロチオエート（例えば、2'-フルオロ-3'-ホスホロチオエート）、2'-ハロ-3'-ホスホノアセテート（例えば、2'-フルオロ-3'-ホスホノアセテート）および2'-ハロ-3'-チオホスホノアセテート（例えば、2'-フルオロ-3'-チオホスホノアセテート）の組込みからなる群より選択される。
一部の特定の態様では、修飾によりRNAの安定性が改変される。一部の特定の態様では、修飾により、例えば、RNAのヌクレアーゼ抵抗性が修飾なしの対応するRNAと比べて高まることによってRNAの安定性が向上する。安定性向上修飾としては、非限定的に、2'-O-メチル、2'-O-C1～4アルキル、2'-ハロ（例えば、2'-F、2'-Br、2'-Clまたは2'-I）、2'MOE、2'-O-C1～3アルキル-O-C1～3アルキル、2'-NH2、2'-H（または2'-デオキシ）、2'-アラビノ、2'-F-アラビノ、4'-チオリボシル糖鎖部分、3'-ホスホロチオエート、3'-ホスホノアセテート、3'-チオホスホノアセテート、3'-メチルホスホネート、3'-ボラノホスフェート、3'-ホスホロジチオエート、リボース環の2'炭素と4'炭素間にメチレン架橋基を含むロックド核酸（「LNA」）ヌクレオチド、およびアンロックド核酸（「ULNA」）ヌクレオチドの組込みが挙げられる。かかる修飾は、5’テール、モジュレーターステム配列、ターゲッターステム配列および/またはスペーサー配列の分解を抑制または低減するための保護基としての使用に適している（上記のサブセクション「ターゲッター核酸およびモジュレーター核酸」参照）。
一部の特定の態様では、修飾により、操作された天然に存在しないシステムの特異性が改変される。一部の特定の態様では、修飾により、操作された天然に存在しないシステムの仕様が、例えば、オンターゲット結合および/または切断の向上あるいはオフターゲット結合および/または切断の低減あるいはその組合せによって向上する。特異性向上修飾としては、非限定的に、2-チオウラシル、2-チオシトシン、4-チオウラシル、6-チオグアニン、2-アミノアデニンおよびプソイドウラシルが挙げられる。
一部の特定の態様では、修飾によりRNAの免疫賦活効果が修飾なしの対応するRNAと比べて改変される。例えば、一部の特定の態様では、修飾により、RNAがTLR7、TLR8、TLR9、TLR3、RIG-I、および/またはMDA5を活性化させる能力が低下する。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸が、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、少なくとも31個、少なくとも32個、少なくとも33個、少なくとも34個、少なくとも35個、少なくとも36個、少なくとも37個、少なくとも38個、少なくとも39個または少なくとも40個の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸が機能性を保持するように、これらの核酸内の1つまたは複数の位置に行なってもよい。例えば、修飾された核酸は依然としてCasタンパク質を標的ヌクレオチド配列に指向し、Casタンパク質がそのエフェクター機能を発揮するのを可能にすることができる。ある位置における具体的な修飾（1つまたは複数）は、その位置のヌクレオチドの機能性に基づいて選択され得ることは理解されよう。例えば、特異性向上修飾は、スペーサー配列、ターゲッターステム配列またはモジュレーターステム配列内のヌクレオチドに好適であり得る。安定性向上修飾は、ターゲッター核酸および/またはモジュレーター核酸内の1個または複数の末端ヌクレオチドに好適であり得る。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸の5’末端の少なくとも1個（例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個もしくは少なくとも5個）の末端ヌクレオチドおよび/または3’末端の少なくとも1個（例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個もしくは少なくとも5個）の末端ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸の5’末端の5個もしくはそれより少ない（例えば、1個もしくはそれより少ない、2個もしくはそれより少ない、3個もしくはそれより少ない、あるいは4個もしくはそれより少ない）末端ヌクレオチドおよび/または3’末端の5個もしくはそれより少ない（例えば、1個もしくはそれより少ない、2個もしくはそれより少ない、3個もしくはそれより少ない、あるいは4個もしくはそれより少ない）末端ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸の5’末端の少なくとも1個（例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個もしくは少なくとも5個）の末端ヌクレオチドおよび/または3’末端の少なくとも1個（例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個もしくは少なくとも5個）の末端ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。一部の特定の態様では、モジュレーター核酸の5’末端の5個もしくはそれより少ない（例えば、1個もしくはそれより少ない、2個もしくはそれより少ない、3個もしくはそれより少ない、あるいは4個もしくはそれより少ない）末端ヌクレオチドおよび/または3’末端の5個もしくはそれより少ない（例えば、1個もしくはそれより少ない、2個もしくはそれより少ない、3個もしくはそれより少ない、あるいは4個もしくはそれより少ない）末端ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。修飾の位置の選択は米国特許出願公開第2016/0289675号および同第2017/0355985号に記載されている。このパラグラフで用いる場合、ターゲッター核酸またはモジュレーター核酸がDNAとRNAの組合せである場合は、全体として核酸をRNAであるとみなし、DNAのヌクレオチド（1個または複数）は、RNAの修飾（1つまたは複数）、例えばリボースの2'-H修飾および任意で核酸塩基の修飾であるとみなす。
ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は、同じ核酸内に存在していない、すなわち末端同士が従来のヌクレオチド間結合によって連結されていないが、これらの核酸内に導入した1つまたは複数の化学修飾によって互いを共有結合によりコンジュゲートしてもよく、それにより二本鎖複合体の安定性が高まり得る、および/またはシステムの他の特徴が改善され得ることは理解されよう。
II. ゲノムDNAのターゲティング、編集および/または修飾の方法
本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムは、細胞内または生物体の標的核酸、例えばDNA（例えば、ゲノムDNA）のターゲティング、編集および/または修飾に有用である。したがって、一局面において、本発明により、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸（例えば、DNA）の修飾方法であって、標的核酸を本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムと接触させ、それにより標的核酸の修飾をもたらすことを含む方法を提供する。
操作された天然に存在しないシステムを標的核酸と複合体として接触させてもよい。したがって、一部の特定の態様では、方法が、標的核酸を、（a）（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列および（ii）ターゲッターステム配列を含むターゲッター核酸;（b）ターゲッターステム配列に相補的なモジュレーターステム配列を含むモジュレーター核酸;ならびに（c）Casタンパク質を含むデュアルガイドCRISPR-Cas複合体と接触させることを含み、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は別個の核酸であり、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化されるCasヌクレアーゼを活性化させることができる複合体を形成し、それにより標的核酸の修飾をもたらす。一部の特定の態様では、Casタンパク質が、Casヌクレアーゼと少なくとも80％（例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％）同一のアミノ酸配列を含む。
Casタンパク質とCasヌクレアーゼは同一であってもよい。したがって、一部の特定の態様では、本発明により、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸（例えば、DNA）の切断方法であって、標的核酸を本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムと接触させ、それにより標的DNAの切断をもたらすことを含む方法を提供する。一部の特定の態様では、方法が、標的核酸を、（a）（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列および（ii）ターゲッターステム配列を含むターゲッター核酸;（b）ターゲッターステム配列に相補的なモジュレーターステム配列を含むモジュレーター核酸;ならびに（c）Casヌクレアーゼを含むデュアルガイドCRISPR-Cas複合体と接触させることを含み、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は別個の核酸であり、天然に存在するシステムではCasヌクレアーゼはtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化され、それによりCasヌクレアーゼによる標的核酸の切断をもたらす。
一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型、V-C型またはV-D型のCasヌクレアーゼである。一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型Casヌクレアーゼである。一部の特定の態様では、標的核酸が、標的ヌクレオチド配列に対して（a）デュアルガイドCRISPR-Cas複合体が標的核酸に結合するように;または（b）デュアルガイドCRISPR-Cas複合体が標的核酸に結合したときにCasヌクレアーゼが活性化されるように位置しているコグネートPAMをさらに含む。
デュアルガイドCRISPR-Cas複合体は細胞に、事前に形成させたリボ核タンパク質（RNP）複合体を細胞内に導入することによって送達され得る。あるいは、デュアルガイドCRISPR-Cas複合体の1つまたは複数の構成要素を細胞内で発現させてもよい。例示的な送達方法は当技術分野において公知であり、例えば米国特許第10,113,167号および同第8,697,359号ならびに米国特許出願公開第2015/0344912号、同第2018/0044700号、同第2018/0003696号、同第2018/0119140号、同第2017/0107539号、同第2018/0282763号および同第2018/0363009号に記載されている。
細胞内のDNA（例えば、ゲノムDNA）をデュアルガイドCRISPR-Cas複合体と接触させることは、細胞内への複合体のすべての構成要素の送達を必要としないことは理解されよう。例えば、構成要素のうちの1つまたは複数が細胞内に既に存在していてもよい。一部の特定の態様では、細胞（またはその親細胞/祖先細胞）がCasタンパク質を発現するように操作されており、ターゲッター核酸（またはターゲッター核酸をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される調節エレメントを含む核酸）とモジュレーター核酸（またはモジュレーター核酸をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される調節エレメントを含む核酸）が細胞内に送達される。一部の特定の態様では、細胞（またはその親細胞/祖先細胞）がモジュレーター核酸を発現するように操作されており、Casタンパク質（またはCasタンパク質をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される調節エレメントを含む核酸）とターゲッター核酸（またはターゲッター核酸をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される調節エレメントを含む核酸）が細胞内に送達される。一部の特定の態様では、細胞（またはその親細胞/祖先細胞）がCasタンパク質を発現するように操作されており、モジュレーター核酸とターゲッター核酸（またはターゲッター核酸をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される調節エレメントを含む核酸）が細胞内に送達される。
一部の特定の態様では、標的DNAが標的細胞のゲノム内に存在している。したがって、別の局面において、本発明により、天然に存在しないシステムまたは本明細書に記載のCRISPR発現システムを含む細胞を提供する。また、本発明により、ゲノムが本明細書に開示のデュアルガイドCRISPR-Casシステムまたは複合体によって修飾されている細胞を提供する。
標的細胞は、任意の生物体由来の有糸分裂細胞または分裂終了細胞、例えば細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物体の細胞、植物細胞、藻細胞、例えばボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、ヤツマタモク（Sargassum patens C. Agardh）など、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、エニダリアン（enidarian）、棘皮動物、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、齧歯類由来の細胞またはヒト由来の細胞であり得る。標的細胞の型としては、非限定的に、幹細胞（例えば、胚性幹（ES）細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、生殖細胞）、体細胞（例えば、線維芽細胞、造血細胞、Tリンパ球（例えば、CD8+ Tリンパ球）、NK細胞、神経細胞、筋肉細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞）、任意のステージの胚のインビトロまたはインビボ胚細胞（例えば、1細胞期、2細胞期、4細胞期、8細胞期;のステージのゼブラフィッシュ胚）が挙げられる。細胞は樹立細胞株由来であってもよく、初代細胞（すなわち、対象に由来しており、インビトロで限られた回数の継代培養で増殖されている細胞および細胞培養物）であってもよい。例えば、初代培養物は、0回以内、1回以内、2回以内、4回以内、5回以内、10回以内または15回以内だがクライシス期になるには充分でない回数継代されたものであり得る培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、インビトロで10回より少ない継代で維持されたものである。細胞が初代細胞である場合、これは個体から任意の適切な方法によって採取され得る。例えば、白血球はアフェレーシス、白血球アフェレーシスまたは密度勾配分離によって採取され得るが、組織、例えば皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸または胃由来の細胞は生検によって採取され得る。採取された細胞はすぐに使用してもよく、凍結条件下で凍結保護剤とともに保存し、後の時点で当技術分野において一般的に知られた様式で解凍してもよい。
リボ核タンパク質（RNP）の送達および「Cas RNA」の送達
本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムは、当技術分野において公知の適切な方法、例えば非限定的に、後述するリボ核タンパク質（RNP）の送達および「Cas RNA」の送達によって、細胞内に送達され得る。
一部の特定の態様では、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸およびCasタンパク質を含むデュアルガイドCRISPR-CasシステムがRNP複合体に一体化され、次いで、事前に形成させた複合体として細胞内に送達され得る。この方法は、限られた期間での細胞の遺伝情報またはエピジェネティック情報の能動的修飾に適している。例えば、Casタンパク質が細胞のゲノムDNAを修飾するためのヌクレアーゼ活性を有する場合、このヌクレアーゼ活性は、DNA切断を可能にするための期間、保持される必要があるだけであり、長期のヌクレアーゼ活性はオフターゲット作用を高め得る。同様に、一部の特定のエピジェネティック修飾は、いったん樹立されたら細胞に維持され得、娘細胞に継承され得る。
「リボ核タンパク質」または「RNP」は、本明細書で用いる場合、核タンパク質とリボ核酸を含む複合体を指す。「核タンパク質」は、本明細書において示す場合、核酸（例えば、RNA、DNA）に結合することができるタンパク質を指す。核タンパク質がリボ核酸に結合する場合、これは「リボ核タンパク質」と称される。リボ核タンパク質とリボ核酸間の相互作用は、例えば共有結合により直接的であってもよく、例えば非共有結合（例えば、静電的相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子-双極子、双極子誘起双極子、ロンドン分散力）、環スタッキング（π効果）、疎水性相互作用など）により間接的であってもよい。一部の特定の態様では、リボ核タンパク質が、リボ核酸に非共有結合により結合しているRNA結合モチーフを含む。例えば、RNA結合モチーフ内の正電荷を有する芳香族アミノ酸残基（例えば、リジン残基）は、RNAの負の核酸リン酸骨格と静電的相互作用を形成し得る。
Casタンパク質の効率的な負荷を確実にするため、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は、Casタンパク質に対してモル過剰量（例えば、約2倍、約3倍、約4倍または約5倍）で供給され得る。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は、Casタンパク質と複合体形成する前に適切な条件下でアニーリングされる。他の態様では、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸およびCasタンパク質を一緒に直接混合してRNPを形成する。
さまざまな送達方法を用いて本明細書に開示のRNPが細胞内に導入され得る。例示的な送達方法または送達媒体としては、非限定的に、マイクロインジェクション、リポソーム（例えば、米国特許出願公開第2017/0107539号参照）、例えば血液脳関門を通過して分子を送達する分子トロイの木馬（molecular trojan horse）リポソーム（Pardridge et al.（2010）COLD SPRING HARB. PROTOC., doi:10.1101/pdb.prot5407参照）、イムノリポソーム、ビロソーム、マイクロベシクル（例えば、エキソソームおよびARMM）、ポリカチオン、脂質:核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、細胞透過性ペプチド（米国特許出願公開第2018/0363009号参照）、ナノ粒子、ナノワイヤ（Shalek et al.（2012）NANO LETTERS, 12:6498参照）、エキソソーム、ならびに細胞膜の摂動（例えば、細胞がマイクロ流路系内の狭窄部を通過することによる、米国特許出願公開第2018/0003696号参照）が挙げられる。標的細胞が増殖性細胞である場合、RNP送達の効率は細胞周期の同期化によって向上し得る（米国特許出願公開第2018/0044700号参照）。
他の態様では、デュアルガイドCRISPR-Casシステムが「Cas RNA」アプローチで、すなわち、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸、およびCasタンパク質をコードしているRNA（例えば、メッセンジャーRNA（mRNA））を送達することで細胞内に送達される。Casタンパク質をコードしているRNAは細胞内で翻訳され、細胞内でターゲッター核酸およびモジュレーター核酸と複合体を形成し得る。RNPアプローチと同様、RNAは、RNAの1つまたは複数に安定性増大修飾（1つまたは複数）を行なったとしても細胞内で有する半減期は限定的である。したがって、「Cas RNA」アプローチは、限られた期間での細胞の遺伝情報またはエピジェネティック情報の能動的修飾、例えばDNA切断に適しており、オフターゲット作用の低減という利点を有する。
mRNAは、Casコード配列に機能的に連結される調節エレメントを含むDNAの転写によって生成し得る。1つのmRNAから複数コピーのCasタンパク質が生じ得ることを考慮すると、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は一般的に、mRNAに対してモル過剰量（例えば、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍）で供給され得る。一部の特定の態様では、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は、細胞内への送達前に適切な条件下でアニーリングされる。他の態様では、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が、インビトロでのアニーリングなしで細胞内に送達される。
さまざまな送達系を用いて「Cas RNA」システムが細胞内に導入され得る。送達方法または送達媒体の非限定的な例としては、マイクロインジェクション、パーティクルガン法（biolistic particles）、リポソーム（例えば、米国特許出願公開第2017/0107539号参照）、例えば血液脳関門を通過して分子を送達する分子トロイの木馬リポソーム（Pardridge et al.（2010）Cold Spring Harb. Protoc.,doi:10.1101/pdb.prot5407参照）、イムノリポソーム、ビロソーム、ポリカチオン、脂質:核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ナノ粒子、ナノワイヤ（Shalek et al.（2012）NANO LETTERS, 12:6498参照）、エキソソームおよび細胞膜の摂動（例えば、細胞がマイクロ流路系内の狭窄部を通過することによる、米国特許出願公開第2018/0003696号参照）が挙げられる。エレクトロポレーションによる「核酸のみ」でのアプローチの具体例は国際（PCT）公開公報第2016/164356号に記載されている。
他の態様では、デュアルガイドCRISPR-Casシステムが、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸、およびCasコード配列に機能的に連結される調節エレメントを含むDNAの形態で細胞内に送達される。DNAは、プラスミド、ウイルスベクター、またはサブセクション「CRISPR発現系」に記載の任意の他の形態にて供給され得る。かかる送達方法では、標的細胞内でCasタンパク質の構成的発現がもたらされる場合があり得（例えば、DNAが細胞内にエピソームベクターで維持されるか、またはゲノム内に組み込まれる場合）、Casタンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合は望ましくないオフターゲット作用のリスクが高くなり得る。それでもなお、このアプローチは、Casタンパク質が非ヌクレアーゼエフェクター（例えば、転写活性化因子または転写抑制因子）を含む場合では有用である。また、これは研究目的および植物のゲノム編集にも有用である。
CRISPR発現系
別の局面において、本発明により、（a）（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列および（ii）ターゲッターステム配列を含む本明細書に開示のターゲッター核酸をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される第1の調節エレメントを含む核酸;（b）ターゲッターステム配列に相補的なモジュレーターステム配列を含む本明細書に開示のモジュレーター核酸をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される第2の調節エレメントを含む核酸を含むCRISPR発現システムであって、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸は別個の核酸として発現され、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸を含む複合体は、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化されるCasヌクレアーゼを活性化させることができるCRISPR発現システムを提供する。
一部の特定の態様では、CRISPR発現システムが、（c）本明細書に開示のCasタンパク質をコードしているヌクレオチド配列に機能的に連結される第3の調節エレメントを含む核酸をさらに含む。一部の特定の態様では、Casタンパク質が、Casヌクレアーゼと少なくとも80％（例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％）同一のアミノ酸配列を含み、それにより標的核酸（例えば、DNA）の修飾をもたらす。一部の特定の態様では、Casタンパク質とCasヌクレアーゼが同一であり、方法により標的核酸の切断がもたらされる。一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型、V-C型またはV-D型のCasヌクレアーゼである。一部の特定の態様では、CasヌクレアーゼがV-A型Casヌクレアーゼである。
本文中において用いる場合、用語「機能的に連結される」は、関心対象のヌクレオチド配列が調節エレメントに、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写/翻訳系内または宿主細胞にベクターを導入した場合は宿主細胞内で）を可能にする様式で連結されることを意味することを意図する。
上記のCRISPR発現システムのエレメント（a）、（b）および（c）の形態は、種々の核酸、例えばDNA（例えば、修飾DNA）およびRNA（例えば、修飾RNA）から独立して選択され得る。一部の特定の態様では、エレメント（a）および（b）が各々、DNAの形態である。一部の特定の態様では、CRISPR発現システムがDNAの形態のエレメント（c）をさらに含む。第3の調節エレメントは、Casタンパク質の発現を推進する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。他の態様では、CRISPR発現システムが、RNA（例えば、mRNA）の形態のエレメント（c）をさらに含む。
エレメント（a）、（b）および/または（c）は1つまたは複数のベクターにて供給してもよい。用語「ベクター」は、本明細書で用いる場合、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。慣用的なウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を用いて核酸を細胞、例えば原核生物細胞、真核細胞、哺乳動物細胞または標的組織内に導入することができる。非ウイルスベクター送達系としては、DNAプラスミド、RNA（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達媒体、例えばリポソームと複合体形成された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性となるか、またはゲノムに組み込まれるかのいずれかとなるDNAウイルスおよびRNAウイルスが挙げられる。遺伝子治療の手順は当技術分野において公知であり、Van Brunt（1988） BIOTECHNOLOGY, 6:1149; Anderson （1992） SCIENCE, 256:808; Nabel & Feigner（1993）TIBTECH, 11:211; Mitani & Caskey（1993） TIBTECH, 11:162; Dillon（1993）TIBTECH, 11:167; Miller（1992）NATURE, 357:455; Vigne,（1995）RESTORATIVE NEUROLOGY AND NEUROSCIENCE, 8:35; Kremer & Perricaudet（1995）BRITISH MEDICAL BULLETIN, 51:31; Haddada et al.（1995）CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, 199:297; Yu et al.（1994）GENE THERAPY, 1:13;およびDoerfler and Bohm（Eds.）（2012）The Molecular Repertoire of Adenoviruses II:Molecular Biology of Virus-Cell Interactionsに開示されている。一部の特定の態様では、ベクターのうち少なくとも1つがDNAプラスミドである。一部の特定の態様では、ベクターのうち少なくとも1つがウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）である。
一部の特定のベクターは、自身が導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌系の複製起点を有する細菌系ベクターおよびエピソーム性哺乳動物系ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物系ベクターおよび複製欠損性ウイルスベクター）は宿主細胞内で自律的に複製しない。しかしながら、一部の特定のベクターは宿主細胞のゲノム内に組み込まれる場合があり得、それにより宿主ゲノムとともに複製される。当業者には、いろいろなベクターがいろいろな送達方法に好適であり得、いろいろな宿主トロピズムを有し、使用に適したベクターを1つまたは複数、選択できることが認識されよう。
用語「調節エレメント」は、本明細書で用いる場合、非コード配列（例えば、ターゲッター核酸もしくはモジュレーター核酸）またはコード配列（例えば、Casタンパク質）の転写をもたらす、および/または転写を調節する、および/またはコードされているポリペプチドの翻訳を調節する、転写制御配列および/または翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル（例えば、ポリアデニル化シグナル）、内部リボソーム進入部位（IRES）、タンパク質分解シグナルなどを指す。かかる調節エレメントは、例えばGoeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY,185, Academic Press, San Diego, Calif.（1990）に記載されている。調節エレメントとしては、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、および一部の特定の宿主細胞内のみでのヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主として関心対象の所望の組織、例えば筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）または特定の細胞型（例えば、リンパ球）での発現を指令し得る。また、調節エレメントは、時間依存的様式、例えば細胞周期依存的または発生段階依存的様式で発現を指令するものであってもよく、様式はまた、組織型特異的または細胞型特異的であってもよく、そうでなくてもよい。一部の特定の態様では、ベクターが、1つまたは複数のpol IIIプロモーター（例えば、1、2、3、4、5種もしくはそれより多くのpol IIIプロモーター）、1つまたは複数のpol IIプロモーター（例えば、1、2、3、4、5種もしくはそれより多くのpol IIプロモーター）、1つまたは複数のpol Iプロモーター（例えば、1、2、3、4、5種もしくはそれより多くのpol Iプロモーター）あるいはその組合せを含む。pol IIIプロモーターの例としては、非限定的に、U6プロモーターおよびH1プロモーターが挙げられる。pol IIプロモーターの例としては、非限定的に、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター（任意でRSVエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（任意でCMVエンハンサーを伴う）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモーターおよびEF1αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、エンハンサーエレメント、例えばWPRE;CMVエンハンサー;HTLV-IのLTR内のR-U5'セグメント（Takebe et al.（1988）MOL. CELL. BIOL., 8:466参照）;SV40エンハンサー;およびウサギβ-グロビンのエキソン2とエキソン3の間のイントロン配列（O’Hare et al.（1981）PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., 78:1527参照）も包含される。当業者には、発現ベクターの設計が、例えば、形質転換させる宿主細胞の選択、所望される発現レベルなどの要素に依存し得ることは認識されよう。ベクターが宿主細胞内に導入されると、本明細書に記載のような核酸にコードされている転写物、タンパク質またはペプチド、例えば融合タンパク質または融合ペプチド（例えば、CRISPR転写物、タンパク質、酵素、その変異型形態またはその融合タンパク質）が産生され得る。
一部の特定の態様では、Casタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が真核生物宿主細胞、例えば酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞もしくはヒト細胞）または植物細胞内での発現のためにコドン最適化されている。種々の種が、特定のアミノ酸の一部の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物体間でのコドン使用頻度の違い）は、多くの場合、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率と相関しており、さらにはこの翻訳効率が、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーRNA（tRNA）分子の利用能に依存性であると考えられている。細胞内において選択されるtRNAの優勢さは一般的に、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、所与の生物体における最適な遺伝子発現のためにコドン最適化に基づいて個別調整され得る。コドン使用頻度の表は、例えばkazusa.or.jp/codon/において入手可能な「Codon Usage Database」で容易に入手可能であり、この表は、いくつかの様式で適合され得る（Nakamura et al.（2000）NUCL. ACIDS RES., 28:292参照）。また、特定の宿主細胞内での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズム、例えばGene Forge（Aptagen; Jacobus, Pa.）も利用可能である。一部の特定の態様では、コドン最適化により宿主細胞内でのCasタンパク質の発現が助長または改善される。
ドナーテンプレート
本明細書に開示のデュアルガイドCRISPR-Casシステムまたは複合体による細胞のゲノム内での標的ヌクレオチド配列の切断によってDNA損傷経路が活性化され得、これにより、切断されたDNA断片がNHEJまたはHDRによって再接合され得る。HDRは、配列情報を修復テンプレートから標的に伝達するための、内在性または外来性のいずれかの修復テンプレートを必要とする。
一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムまたはCRISPR発現システムがドナーテンプレートをさらに含む。本明細書で用いる場合、用語「ドナーテンプレート」は、細胞内または生物体に導入されたら標的ヌクレオチド配列またはその付近で修復テンプレートとしての機能を果たすように設計された核酸を指す。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが、標的ヌクレオチド配列またはその一部分を含むポリヌクレオチドに相補的である。最適にアラインメントした場合、ドナーテンプレートは、標的ヌクレオチド配列の1個または複数のヌクレオチド（例えば、約1個、約5個、約10個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個もしくはそれより多く、または約1個より多く、約5個より多く、約10個より多く、約15個より多く、約20個より多く、約25個より多く、約30個より多く、約35個より多く、約40個より多く、もしくはそれより多くのヌクレオチド）とオーバーラップし得る。ドナーテンプレートのヌクレオチド配列は典型的には、置き換わるゲノム配列と同一でない。そうではなく、ドナーテンプレートは、相同配列依存的修復が支援されるのに充分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に対して1つまたは複数の置換、挿入、欠失、逆位または再編成を含み得る。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが相同性の2つの領域（すなわち、ホモロジーアーム）にフランキングされた非相同配列を含み、そのため、標的DNA領域と2つのフランキング配列間の相同配列依存的修復によって標的領域に非相同配列の挿入がもたらされる。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが、2つのホモロジーアーム間に位置している10～100ヌクレオチド長、50～500ヌクレオチド長、100～1,000ヌクレオチド長、200～2,000ヌクレオチド長または500～5,000ヌクレオチド長の非相同配列を含む。
一般的に、ドナーテンプレートの相同領域（1つまたは複数）は、組換えが所望されるゲノム配列と少なくとも50％の配列同一性を有する。ホモロジーアームは、標的ヌクレオチド配列にフランキングしているヌクレオチド配列との組換えを細胞内条件下で行なうことができるように設計または選択される。一部の特定の態様では、非標的鎖のHDRが所望される場合、ドナーテンプレートが、標的ヌクレオチド配列の5’側の配列に相同な第1のホモロジーアームおよび標的ヌクレオチド配列の3’側の配列に相同な第2のホモロジーアームを含む。一部の特定の態様では、第1のホモロジーアームが、標的ヌクレオチド配列の5’側の配列と少なくとも50％（例えば少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％）同一である。一部の特定の態様では、第2のホモロジーアームが、標的ヌクレオチド配列の3’側の配列と少なくとも50％（例えば少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％）同一である。一部の特定の態様では、ドナーテンプレート配列と標的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを最適にアラインメントした場合、ドナーテンプレートの最も近いヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列から約1ヌクレオチド以内、約5ヌクレオチド以内、約10ヌクレオチド以内、約15ヌクレオチド以内、約20ヌクレオチド以内、約25ヌクレオチド以内、約50ヌクレオチド以内、約75ヌクレオチド以内、約100ヌクレオチド以内、約200ヌクレオチド以内、約300ヌクレオチド以内、約400ヌクレオチド以内、約500ヌクレオチド以内、約1000ヌクレオチド以内、約2000ヌクレオチド以内、約3000ヌクレオチド以内、約4000ヌクレオチド以内またはそれより多くの個数以内に存在する。
一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが、修復対象の配列に相同でない操作された配列をさらに含む。かかる操作された配列は、本明細書に開示のドナーテンプレートリクルート配列とハイブリダイズすることができるバーコードおよび/または配列を有し得る。
一部の特定の態様では、ドナーテンプレートがゲノム配列に対して1つまたは複数の変異をさらに含み、1つまたは複数の変異により、同じCRISPR-Casシステムによるドナーテンプレートの切断またはドナーテンプレート配列の少なくとも一部分が組み込まれた修飾されたゲノム配列の切断が低減または抑制される。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートにおいて、標的ヌクレオチド配列に隣接しており、Casヌクレアーゼによって認識されるPAMが、同じCasヌクレアーゼによって認識されない配列に変異している。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートにおいて、標的ヌクレオチド配列（例えば、シード領域）が変異している。一部の特定の態様では、1つまたは複数の変異が、変異部位を含むタンパク質コード配列のリーディングフレームに関してサイレントである。
ドナーテンプレートは細胞に、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖DNAまたは二本鎖RNAとして供給され得る。本明細書に開示のデュアルガイドCRISPR-Casシステムは、標的鎖、非標的鎖または両方を切断するヌクレアーゼ活性を有し得ることは理解されよう。標的鎖のHDRが所望される場合、標的鎖に相補的な核酸配列を有するドナーテンプレートもまた想定される。
ドナーテンプレートは細胞内に線状または環状の形態で導入され得る。線状形態で導入される場合、ドナーテンプレートの末端は、当業者に公知の方法によって保護され得る（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）。例えば、1個または複数のジデオキシヌクレオチド残基が線状分子の3'末端に付加される、および/または自己相補的オリゴヌクレオチドが一端もしくは両端にライゲートされる（例えば、Chang et al.（1987）PROC. NATL. ACAD SCI USA, 84:4959;Nehls et al.（1996） SCIENCE, 272:886参照;また、上記に開示したRNAの安定性および/または特異性を高めるための化学修飾も参照のこと）。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、非限定的に、末端アミノ基（1つまたは複数）の付加ならびに修飾ヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびO-メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの使用が挙げられる。線状ドナーテンプレートの末端の保護の代わりに、組換えに影響を及ぼすことなく分解され得るさらなる長さの配列を相同性の領域の外側に含めてもよい。
ドナーテンプレートは本明細書に記載のベクターの構成要素にしてもよく、別個のベクターに含めてもよく、別個のポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチド、線状ポリヌクレオチドまたは合成ポリヌクレオチドとして供給してもよい。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートがDNAである。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが、適用可能な場合、ターゲッター核酸をコードしている配列、モジュレーター核酸をコードしている配列および/またはCasタンパク質をコードしている配列と同じ核酸内に存在する。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが別個の核酸で供給される。ドナーテンプレートポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば約50、約75、約100、約150、約200、約500、約1000、約2000、約3000、約4000もしくはそれより多く、または少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約100、少なくとも約150、少なくとも約200、少なくとも約500、少なくとも約1000、少なくとも約2000、少なくとも約3000、少なくとも約4000もしくはそれより多くのヌクレオチド長であり得る。
ドナーテンプレートは、単離された核酸として細胞内に導入され得る。あるいは、ドナーテンプレートは、関心対象のDNA領域内への挿入を意図するものでないさらなる配列、例えば複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードしている遺伝子などを有するベクター（例えば、プラスミド）の一部として細胞内に導入され得る。あるいは、ドナーテンプレートは、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV））によって送達され得る。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートがAAV、例えばシュードタイプAAVとして導入される。AAVのカプシドタンパク質は、当業者によりAAVのトロピズムおよび標的の細胞型に基づいて選択され得る。例えば、一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが肝細胞内にAAV8またはAAV9として導入される。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが造血幹細胞、造血前駆細胞またはTリンパ球（例えば、CD8+ Tリンパ球）内にAAV6またはAAVHSCとして導入される（米国特許第9,890,396号参照）。カプシドタンパク質（VP1、VP2またはVP3）の配列は野生型AAVカプシドタンパク質から修飾されていてもよく、例えば、野生型AAVカプシド配列と少なくとも50％（例えば少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％）の配列同一性を有し得ることは理解されよう。
ドナーテンプレートは細胞（例えば、初代細胞）に、種々の送達方法、例えば本明細書に開示のウイルス系または非ウイルス系の方法によって送達され得る。一部の特定の態様では、非ウイルス系ドナーテンプレートが標的細胞内にネイキッド核酸として、またはリポソームもしくはポロキサマーとの複合体で導入される。一部の特定の態様では、非ウイルス系ドナーテンプレートが標的細胞内にエレクトロポレーションによって導入される。他の態様では、ウイルス系ドナーテンプレートが標的細胞内に感染によって導入される。操作された天然に存在しないシステムはドナーテンプレートの前、ドナーテンプレートの後またはドナーテンプレートと同時に送達され得る（国際（PCT）出願国際公開公報第2017/053729号参照）。当業者は、送達の形態（例えば、RNA成分およびタンパク質成分の転写および翻訳に必要とされる時間が考慮される）ならびに細胞内での分子（1種または複数種）の半減期に基づいて適正なタイミングを選ぶことができよう。具体的な態様において、Casタンパク質を含むデュアルガイドCRISPR-Casシステムがエレクトロポレーションによって（例えば、RNPとして）送達される場合、ドナーテンプレート（例えば、AAVとして）は細胞内に、操作された天然に存在しないシステムの導入後4時間以内（例えば、1分以内、2分以内、3分以内、4分以内、5分以内、6分以内、7分以内、8分以内、9分以内、10分以内、11分以内、12分以内、13分以内、14分以内、15分以内、16分以内、17分以内、18分以内、19分以内、20分以内、25分以内、30分以内、35分以内、40分以内、45分以内、50分以内、55分以内、60分以内、90分以内、120分以内、150分以内、180分以内、210分以内または240分以内）に導入される。
一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが、共有結合によりモジュレーター核酸にコンジュゲートされる。このコンジュゲーションに適した共有結合による連結は当技術分野において公知であり、例えば米国特許第9,982,278号およびSavic et al.（2018）ELIFE 7:e33761に記載されている。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが共有結合によりモジュレーター核酸（例えば、モジュレーター核酸の5’末端）にヌクレオチド間結合を介して連結されている。一部の特定の態様では、ドナーテンプレートが共有結合によりモジュレーター核酸（例えば、モジュレーター核酸の5’末端）にリンカーを介して連結されている。
効率および特異性
本発明の操作された天然に存在しないシステムは、核酸のターゲティング、切断または修飾の効率を、例えばデュアルガイド核酸のハイブリダイゼーションおよびスペーサー配列の長さを調整することによって上げたり下げたりできるという利点を有する。
一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムが高効率を有する。例えば、一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムと接触させると、標的ヌクレオチド配列とコグネートPAMを有する核酸集団の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％がターゲティング、切断または修飾される。一部の特定の態様では、操作された天然に存在しないシステムと接触させると、細胞集団の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％のゲノムがターゲティング、切断または修飾される。
オンターゲット事象の発生とオフターゲット事象の発生は一般的に相関していることが観察されている。一部の特定の治療目的では、低オンターゲット効率が許容され得、低オフターゲット頻度がより望ましい。例えば、対象に送達されるとインビボで増殖する増殖性細胞を編集または修飾する場合、オフターゲット事象に対する許容性は低い。しかしながら、送達前に、オンターゲット事象とオフターゲット事象を評価し、それにより、所望の編集または修飾を有し、所望されない編集または修飾は全くない1つまたは複数のコロニーを選択することが可能である。
本明細書に開示の方法はかかる使用に適している。一部の特定の態様では、標的ヌクレオチド配列とコグネートPAMを有する核酸集団を本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムと接触させた場合、オフターゲット事象（例えば、CRISPR-Casシステムの機能に応じてターゲティング、切断または修飾）の頻度が、同じ条件下でシングルガイド核酸（例えば、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸の配列からなる単独のcrRNA）を含む対応するCRISPRシステムを用いた場合のオフターゲット事象の頻度と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％低下する。一部の特定の態様では、標的ヌクレオチド配列とコグネートPAMを有するゲノムDNAを本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムと細胞集団において接触させた場合、オフターゲット事象（例えば、CRISPR-Casシステムの機能に応じてターゲティング、切断または修飾）の頻度が、同じ条件下でシングルガイド核酸（例えば、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸の配列からなる単独のcrRNA）を含む対応するCRISPRシステムを用いた場合のオフターゲット事象の頻度と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％低下する。一部の特定の態様では、標的ヌクレオチド配列とコグネートPAMを有するゲノムDNAを含む細胞の集団に送達した場合、本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムを受容した細胞におけるオフターゲット事象（例えば、CRISPR-Casシステムの機能に応じてターゲティング、切断または修飾）の頻度は、同じ条件下でシングルガイド核酸（例えば、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸の配列からなる単独のcrRNA）を含む対応するCRISPRシステムを受容した細胞におけるオフターゲット事象の頻度と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％低下する。オフターゲット事象を評価する方法は、Lazzarotto et al.（2018）NAT PROTOC. 13（11）:2615-42に要約されており、Wienert et al.（2019）SCIENCE 364（6437）:286-89に開示されているような、インサイチューCasオフターゲットの発見およびシーケンシング（DISCOVER-seq）による検証;Kleinstiver et al.（2016）NAT. BIOTECH. 34:869-74に開示されているような、シーケンシング（GUIDE-seq）によって可能になる二本鎖切断部（DSB）のゲノムワイド不偏同定;Kocak et al.（2019）NAT. BIOTECH. 37:657-66に記載のような、シーケンシング（CIRCLE-seq）による切断効果のインビトロ報告のための環化が含まれる。一部の特定の態様では、オフターゲット事象としては、所与のオフターゲット座位（例えば、最も多くオフターゲット事象の発生が検出された座位）におけるターゲティング、切断または修飾が挙げられる。一部の特定の態様では、オフターゲット事象としては、検出可能なオフターゲット事象を有するすべての座位における集合的なターゲティング、切断または修飾が挙げられる。
マルチプレックス法
本明細書に開示のゲノムDNAをターゲティング、編集および/または修飾する方法は多重式で実施され得る。例えば、ターゲッター核酸のライブラリーがゲノム遺伝子座をターゲティングするために使用され得;また、複数の挿入、欠失および/または置換を生成させるためにドナーテンプレートのライブラリーも使用され得る。マルチプレックスアッセイはスクリーニング方法において実施され得、この場合、個々の各細胞培養物（例えば、96ウェルプレートまたは384ウェルプレートのウェル内）を、異なるターゲッター核酸または異なる組合せのターゲッター核酸とドナーテンプレートに曝露する。また、マルチプレックスアッセイを選択方法において実施してもよく、この場合、細胞培養物を、異なるターゲッター核酸および/またはドナーテンプレートの混合集団に曝露し、所望の特徴（例えば、機能性）を有する細胞を、有利な生存または増殖、ある特定の薬剤に対する耐性、検出可能なタンパク質（例えば、フローサイトメトリーによって検出可能な蛍光タンパク質）の発現などによって濃縮または選択する。
一部の特定の態様では、マルチプレックス方法において、異なる標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる複数のターゲッター核酸が使用される。一部の特定の態様では、複数のターゲッター核酸が共通のターゲッターステム配列を含む。一部の特定の態様では、マルチプレックス方法において、複数のターゲッター核酸とハイブリダイズすることができる単一のモジュレーター核酸が使用される。一部の特定の態様では、マルチプレックス方法において、本明細書に開示の単一のCasタンパク質（例えば、Casヌクレアーゼ）が使用される。
一部の特定の態様では、マルチプレックス方法において、異なるPAMに近接または隣接した異なる標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる複数のターゲッター核酸が使用される。一部の特定の態様では、複数のターゲッター核酸が異なるターゲッターステム配列を含む。一部の特定の態様では、マルチプレックス方法において、各々が異なるターゲッター核酸とハイブリダイズすることができる複数のモジュレーター核酸が使用される。一部の特定の態様では、マルチプレックス方法において、異なるPAM特異性を有する複数の本明細書に開示のCasタンパク質（例えば、Casヌクレアーゼ）が使用される。
一部の特定の態様では、マルチプレックス方法が、1つまたは複数のドナーテンプレートを細胞集団に導入することをさらに含む。一部の特定の態様では、マルチプレックス方法において、各々が異なるドナーテンプレートリクルート配列を含む複数のモジュレーター核酸が使用され、この場合、各ドナーテンプレートリクルート配列は異なるドナーテンプレートとハイブリダイズすることができる。
一部の特定の態様では、複数のターゲッター核酸および/または複数のドナーテンプレートが飽和編集用に設計される。例えば、一部の特定の態様では、関心対象の配列内の各ヌクレオチド位置が、従来の4種類すべての塩基A、T、GおよびCの各々で体系的に修飾される。他の態様では、関心対象の遺伝子のプールの各遺伝子内の少なくとも1つの配列が、例えばCRISPR設計アルゴリズムに従って修飾される。一部の特定の態様では、関心対象の外来性エレメント（例えば、タンパク質コード配列、非タンパク質コード遺伝子、調節エレメント）のプールの各配列が、ゲノムの1つまたは複数の所与の遺伝子座に挿入される。
典型的には研究目的のために実施されるスクリーニング方法または選択方法を行なう目的に適したマルチプレックス方法は、治療目的に適した方法とは異なり得ることは理解されよう。例えば、ある特定のエレメント（例えば、Casヌクレアーゼおよび/またはモジュレーター核酸）の構成的発現は、オフターゲット作用が増大する可能性のため治療目的には望ましくないことであり得る。逆に、研究目的には、Casヌクレアーゼおよび/またはモジュレーター核酸の構成的発現は望ましいことであり得る。例えば、構成的発現により、他のエレメントが導入され得る広い時間枠がもたらされる。構成的発現について安定な細胞株が樹立されると、単一の細胞内に共送達される必要がある外来性エレメントの数も少なくなる。したがって、ある特定のエレメントの構成的発現によってスクリーニングプロセスまたは選択プロセスの効率が高まり得、複雑性が低減され得る。また、本明細書に開示のシステムのある特定のエレメントの誘導性発現も、同様の利点が得られる研究目的に使用され得る。発現は外来性因子（例えば、小分子）によって、または特定の細胞型（例えば、特定の分化段階の）に存在している内在性の分子もしくは複合体によって誘導され得る。当技術分野において公知の方法、例えば上記のサブセクション「CRISPR発現系」に記載のものが、1つまたは複数のエレメントを構成的または誘導的に発現させるために使用され得る。
少なくとも3つのエレメント-ターゲッター核酸、モジュレーター核酸およびCasタンパク質-を導入することが必要ではあるが、これらの3つのエレメントを、事前に形成させたRNPの単一の複合体として細胞内に送達してもよいことがさらに理解されよう。したがって、スクリーニングプロセスまたは選択プロセスの効率はマルチプレックス様式において、複数のRNP複合体を事前に組織化させることによっても達成され得る。
一部の特定の態様では、本明細書に開示の方法が、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸、Casタンパク質、ドナーテンプレートまたはこれらのエレメントのうちの2つ以上の組合せを、スクリーニングプロセスまたは選択プロセスにより同定する工程をさらに含む。例えば、2つのホモロジーアーム間のドナーテンプレート内に一組のバーコードを使用すると同定が容易になり得る。特定の態様では、方法が、細胞集団を採取すること;標的ヌクレオチド配列（1つもしくは複数）を含むゲノムDNAもしくはRNA試料および/またはバーコードを選択的に増幅させること;および/または選択的に増幅されたゲノムDNAもしくはRNA試料および/またはバーコードをシーケンシングすることをさらに含む。
別の局面において、本発明により、複数の本明細書に開示のターゲッター核酸を含み、任意で1つまたは複数の本明細書に開示のモジュレーター核酸をさらに含むライブラリーを提供する。別の局面において、本発明により、各々が異なる本明細書に開示のターゲッター核酸に機能的に連結される調節エレメントを含む複数の核酸を含み、任意で本明細書に開示のモジュレーター核酸に機能的に連結される調節エレメントをさらに含むライブラリーを提供する。このようなライブラリーは、1種もしくは複数種の本明細書に開示のCasタンパク質もしくはCasコード核酸および/または1つもしくは複数の本明細書に開示のようなドナーテンプレートとの組合せで、スクリーニング方法または選択方法に使用され得る。
III. 薬学的組成物
本発明により、本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムまたは真核細胞を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。一部の特定の態様では、組成物がターゲッター核酸とモジュレーター核酸の複合体を含む。一部の特定の態様では、組成物が、ターゲッター核酸と、モジュレーター核酸と、Casタンパク質（例えば、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が活性化させることができるCasヌクレアーゼまたは関連Casタンパク質）とを含むRNPを含む。
また、本発明により、本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムのターゲッター核酸とモジュレーター核酸を適切な条件下でインキュベートし、それにより、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸の複合体を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を作製することを含む、組成物の作製方法を提供する。一部の特定の態様では、方法が、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸をCasタンパク質（例えば、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が活性化させることができるCasヌクレアーゼまたは関連Casタンパク質）とともにインキュベートし、それにより、ターゲッター核酸、モジュレーター核酸およびCasタンパク質の複合体（例えば、RNP）を作製することをさらに含む。一部の特定の態様では、方法が複合体（例えば、RNP）を精製することをさらに含む。
治療的使用では、本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステム、CRISPR発現システム、またはかかるシステムを含むか、あるいはかかるシステムによって修飾された細胞が薬学的に許容される担体と合わされる。用語「薬学的に許容される」は、本明細書で用いる場合、化合物、材料、組成物および/または投薬形態が、正しい医学的判断の範囲内で、過度な毒性、過敏、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく人間および動物の組織との接触における使用に適しており、妥当な便益/リスク比に見合っていることを指す。
用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で用いる場合、過度な毒性、過敏、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく人間および動物の組織との接触における使用に適しており、妥当な便益/リスク比に見合ったバッファー、担体および賦形剤を指す。薬学的に許容される担体としては、任意の標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水液、水、乳剤（例えば、油/水型または水/油型の乳剤など）および種々の型の湿潤剤が挙げられる。また、組成物に安定剤および保存料を含めてもよい。担体、安定剤および佐剤の例については、例えばMartin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton,PA（1975）を参照のこと。薬学的に許容される担体としては、医薬品の投与と適合性であるバッファー、溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は当技術分野において公知である。
一部の特定の態様では、本明細書に開示の薬学的組成物に塩、例えばNaCl、MgCl2、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えばTrisバッファー、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)（HEPES）、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）、MESナトリウム塩、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）など;可溶化剤;デタージェント、例えば非イオンデタージェント、例えばTween-20など;ヌクレアーゼ阻害剤;などが含まれる。例えば、一部の特定の態様では、主題の組成物が、主題のDNAターゲティングRNAおよび核酸を安定化させるためのバッファーを含む。
一部の特定の態様では、薬学的組成物が、例えば組成物のpH、容積オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、におい、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を修飾、維持または保存するための製剤化材料を含み得る。かかる態様では、適切な製剤化材料としては、非限定的に、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン）;抗菌薬;抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）;バッファー（例えば、ボレート、ビカーボネート、Tris-HCl、シトレート、ホスフェートもしくは他の有機酸）;増量剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）;キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））;錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン）;フィラー;単糖類;二糖類;および他の糖質（例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン）;タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）;着色剤、着香剤および希釈剤;乳化剤;親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）;低分子量ポリペプチド;塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）;保存料（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素）;溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）;糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）;懸濁化剤;界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック系、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート20、ポリソルベート、triton、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（tyloxapal））;安定性向上剤（例えば、スクロースもしくはソルビトール）;張度向上剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトール ソルビトール）;送達媒体;希釈剤;賦形剤および/または医薬用佐剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.（Mack Publishing Company,1990参照）が挙げられる。
一部の特定の態様では、薬学的組成物が、ナノ粒子、例えばポリマーナノ粒子、リポソームまたはミセルを含み得る（Anselmo et al.（2016）BIOENG. TRANSL. MED. 1:10-29参照）。一部の特定の態様では、薬学的組成物が無機ナノ粒子を含む。例示的な無機ナノ粒子としては、例えば磁性ナノ粒子（例えば、Fe3MnO2）またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外側表面を、ペイロードの結合（例えば、コンジュゲーションまたは封入）を可能にする正電荷を有するポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートさせてもよい。一部の特定の態様では、薬学的組成物が有機ナノ粒子を含む（例えば、ナノ粒子内部にペイロードが封入）。例示的な有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされおり、中性ヘルパー脂質を一緒に含むカチオン性脂質を含むSNALPリポソームならびに脂質コーティングでコーティングされたプロタミンと核酸との複合体が挙げられる。一部の特定の態様では、薬学的組成物がリポソーム、例えば国際出願国際公開公報第2015/148863号に開示されているリポソームを含む。
一部の特定の態様では、薬学的組成物が、標的細胞の結合またはナノ粒子およびリポソームのアップデートを高めるターゲティング部分を含む。例示的なターゲティング部分としては、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖鎖および細胞膜透過ペプチドが挙げられる。一部の特定の態様では、薬学的組成物が、膜融合性またはエンドソーム不安定化性のペプチドまたはポリマーを含む。
一部の特定の態様では、薬学的組成物が持続性送達製剤または制御送達製剤を含み得る。持続性送達手段または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生物浸食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射剤を製剤化するための手法もまた当業者に公知である。徐放性調製物は、例えば多孔性ポリマー微粒子または、成形物品、例えばフィルムもしくはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートのコポリマー、ポリ（2-ヒドロキシエチル-イネタクリレート（inethacrylate））、エチレン酢酸ビニルまたはポリ-D（-）-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられ得る。また、徐放性組成物としては、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得るリポソームも挙げられ得る。
本発明の薬学的組成物は当技術分野において公知のさまざまな方法によって投与され得る。投与の経路および/または様式は所望の結果に応じてさまざまである。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは皮下であり得るか、あるいは標的部位の近位に施行され得る。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮への投与（例えば、注射または輸注による）に適したものであるのがよい。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明の多重特異性抗体を、化合物を酸の作用および化合物を不活性化し得る他の自然条件から保護するための物質でコーティングしてもよい。
非経口投与に適した製剤成分としては、滅菌された希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒;抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム;キレート剤、例えばEDTA;バッファー、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート;および張度の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースが挙げられる。
静脈内投与では、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が挙げられる。担体は、製造および保存の条件下で安定であるのがよく、微生物に対して保存されているのがよい。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール）ならびにその適切な混合物を含有している溶媒または分散媒であり得る。
薬学的製剤は好ましくは滅菌されている。滅菌は、任意の適切な方法、例えば滅菌濾過膜に通す濾過によって行なわれ得る。組成物が凍結乾燥されている場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に実施しても後に実施してもよい。一部の特定の態様では、多重特異性抗体は凍結乾燥され、次いで、投与時に緩衝生理食塩水で再構成される。
本発明の薬学的組成物は、当技術分野において周知であり常套的に行なわれている方法に従って調製され得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000;およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。薬学的組成物は好ましくはGMP条件下で製造される。典型的には、治療上有効な用量または有効な用量の本発明の多重特異性抗体が本発明の薬学的組成物中に使用される。本発明の多重特異性抗体は、当業者に公知の慣用的な方法によって薬学的に許容される投薬形態に製剤化される。投薬量レジメンは、至適な所望の応答（例えば、治療応答）がもたらされるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、用量を、治療状況の緊急性に指示されるとおりに比例的に低減または増加してもよい。非経口組成物を、投与の容易性および投薬量の均一性のための単位投薬量形態に製剤化することは特に好都合である。単位投薬量形態は、本明細書で用いる場合、処置を受ける対象のための投薬量ユニットとして適した物理的に独立した単位を指し;各単位は、所望の治療効果がもたらされるように計算された所定量の活性化合物を、必要とされる薬学的担体とともに含む。
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、具体的な患者、組成物および投与様式で所望の治療応答を得るのに有効であり、患者に対して毒性でない活性成分量が得られるように変えてもよい。選択される投薬量レベルは、さまざまな薬物動態学的要素、例えば使用される具体的な本発明の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される具体的な化合物の排出速度、処置期間、使用される具体的な組成物と併用して使用される他の薬物、化合物および/または物質、処置対象の患者の年齢、性別、体重、体調、一般健康状態および既往歴などの要素に依存する。
IV. 治療的使用
本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムおよびCRISPR発現システムは細胞内または生物体のゲノムDNAのターゲティング、編集および/または修飾に有用である。このようなシステム、ならびにシステムのうちの1つを含む細胞または操作された天然に存在しないシステムによってゲノムが修飾されている細胞が、遺伝情報またはエピジェネティック情報の修飾が望ましい疾患または障害を処置するために使用され得る。したがって、別の局面において、本発明により、処置を必要とする対象に本明細書に開示の天然に存在しないシステム、CRISPR発現システムまたは細胞を投与することを含む、疾患または障害の処置方法を提供する。
用語「対象」はヒトおよび非ヒト動物を包含している。非ヒト動物としては、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類が挙げられる。注記している場合を除き、用語「患者」または「対象」は本明細書において互換的に用いている。
用語「処置」、「処置すること」、「処置する」、「処置される」などは、本明細書で用いる場合、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患および/または疾患に起因する有害効果の部分的または完全な治癒あるいは疾患の進行の遅延という点においては治療性であり得る。「処置」は、本明細書で用いる場合、哺乳動物、例えばヒトの疾患の任意の処置を包含しており、（a）疾患を抑止すること、すなわちその進展を停止させること;および（b）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすことを含む。疾患または障害を遺伝学的方法によって認定し、なんらかの医学的症状が発現する前に処置してもよいことは理解されよう。
治療目的では、本明細書に開示の方法は、増殖性細胞、例えば幹細胞（例えば、造血幹細胞）、前駆細胞（例えば、造血前駆細胞もしくはリンパ系前駆細胞）または記憶細胞（例えば、メモリーT細胞）を編集または修飾するのに特に適している。かかる細胞は対象に送達されるとインビボで増殖することを考慮すると、オフターゲット事象に対する許容性は低い。しかしながら、送達前に、オンターゲット事象とオフターゲット事象を評価し、それにより、所望の編集または修飾を有するが所望されない編集または修飾は全くない1つまたは複数のコロニーを選択することが可能である。したがって、下がった編集効率または修飾効率がかかる細胞によって許容され得る。本発明の操作された天然に存在しないシステムは、例えばデュアルガイド核酸のハイブリダイゼーションを調整することによって核酸切断の効率が上がったり下がったりするという利点を有する。その結果、これは、遺伝子操作された増殖性細胞を作出する場合のオフターゲット事象を最小限にするために使用され得る。
毒性およびオフターゲット効果の最小限化のためには、送達されるデュアルガイドCRISPR-Casシステムの濃度を制御することが重要である。最適な濃度は、いろいろな濃度を細胞モデル、組織モデルまたは非ヒト真核生物動物モデルにおいて試験し、ディープシーケンシングを用いて潜在的オフターゲットゲノム遺伝子座における修飾の程度を解析することにより決定され得る。最も高いオンターゲット修飾レベルが得られるがオフターゲット修飾レベルは最小限である濃度がエクスビボまたはインビボ送達のために選択されるべきである。
遺伝子治療
本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムおよびCRISPR発現システムは、遺伝性の疾患または障害、すなわち、対象のゲノム内の望ましくない変異と関連しているか、あるいは変異によって媒介される疾患または障害を処置するために使用され得ることは理解されよう。
例示的な遺伝性の疾患または障害としては、加齢性黄斑変性、副腎脳白質ジストロフィー（ALD）、アラジール症候群、アルファ-1-抗トリプシン欠乏症、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、運動失調症（例えば、フリードライヒ失調症、脊髄小脳失調症、毛細血管拡張性運動失調症、本態性振戦、痙性対麻痺）、自閉症、胆道閉鎖症、ビオチニダーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素I欠損症、糖タンパク質糖鎖不全症候群（CDGS）、中枢神経系（CNS）関連障害（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、カナバン病（CD）、虚血、多発性硬化症（MS）、神経障害性疼痛、パーキンソン病）、ブルーム症候群、がん、シャルコー・マリー・トゥース病（例えば、腓骨筋萎縮、遺伝性運動感覚ニューロパチー）、先天性肝性ポルフィリン症、シトルリン血症、クリーグラー・ナジャー症候群、嚢胞性線維症（CF）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、尿崩症、ファブリ病、家族性高コレステロール血症（LDL受容体欠損）、ファンコーニ貧血、脆弱X症候群、脂肪酸代謝異常症、ガラクトース血症、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）、糖原病（例えば、I型（グルコース-6-ホスファターゼ欠損症、フォン・ギールケII型（アルファグルコシダーゼ欠損症,ポンペ病）、III型（脱分枝酵素欠損症,コーリー病）、IV型（分枝酵素欠損症,アンダーソン病）、V型（筋グリコーゲンホスホリラーゼ欠損症,マッカードル病）、VII型（筋ホスホフルクトキナーゼ欠損症,タウリ（Tauri）病）、VI型（肝ホスホリラーゼ欠損症,エール病）、IX型（肝グリコーゲンホスホリラーゼキナーゼ欠損症））、血友病A（第VIII因子の不足と関連している）、血友病B（第IX因子の不足と関連している）、ハンチントン病、グルタル酸尿症、低リン血症、クラッベ病、乳酸アシドーシス、ラフォラ病、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リソソーム蓄積症、異染性白質ジストロフィー疾患（MLD）、ムコ多糖症（MPS）（例えば、ハンター症候群、ハーラー症候群、マロトー・ラミー症候群、サンフィリポ症候群、シャイエ症候群、モルキオ症候群、その他、MPSI、MPSII、MPSIII、MSIV、MPS 7）、筋肉/骨格の障害（例えば、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、筋強直性ジストロフィー（DM）、新生組織形成、N-アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、フェニールケトン尿症、原発性開放隅角緑内障、網膜色素変性症、統合失調症、重症複合免疫不全症（SCID）、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、鎌状赤血球貧血、アッシャー症候群、テイ・サックス病、サラセミア（例えば、βサラセミア）、トリヌクレオチドリピート病、チロシン血症、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、X連鎖性慢性肉芽腫症（CGD）、X連鎖性重症複合免疫不全症および色素性乾皮症が挙げられる。
さらなる例示的な遺伝性の疾患または障害および関連する情報は、kumc.edu/gec/support、genome.gov/10001200およびncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22183/のワールドワイドウェブにおいて入手可能である。さらなる例示的な遺伝性の疾患または障害、関連する遺伝子変異、および遺伝性の疾患または障害を処置するための遺伝子治療アプローチは、国際（PCT）公開公報第2013/126794号、同第2013/163628号、同第2015/048577号、同第2015/070083号、同第2015/089354号、同第2015/134812号、同第2015/138510号、同第2015/148670号、同第2015/148860号、同第2015/148863号、同第2015/153780号、同第2015/153789および同第2015/153791号ならびに米国特許出願公開第2009/0222937号、同第2009/0271881号、同第2009/0271881号、同第2010/0229252号、同第2010/0311124号、同第2011/0016540号、同第2011/0023139号、同第2011/0023144号、同第2011/0023145号、同第2011/0023145号、同第2011/0023146号、同第2011/0023153号、同第2011/0091441号、同第2011/0158957号、同第2011/0182867号、同第2011/0225664号、同第2012/0159653号、同第2012/0328580号、同第 2013/0145487号および同第2013/0202678号に記載されている。
免疫細胞の操作
本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステムおよびCRISPR発現システムは免疫細胞を操作するために使用され得ることは理解されよう。免疫細胞としては、非限定的に、リンパ球（例えば、Bリンパ球またはB細胞、Tリンパ球またはT細胞およびナチュラルキラー細胞）、骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球）、ならびにこれらの細胞型に分化し得る幹細胞および前駆細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞およびリンパ系前駆細胞）が挙げられる。細胞には、処置される対象に由来する自己細胞あるいはまたドナーに由来する同種異系細胞が包含され得る。
一部の特定の態様では、免疫細胞がT細胞であり、これは、例えば培養T細胞、初代T細胞、培養T細胞株由来のT細胞（例えば、Jurkat、SupTi）、または哺乳動物、例えば処置される対象から採取されたT細胞であり得る。哺乳動物から採取される場合、T細胞は数多くの供給源、例えば非限定的に、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液から採取され得る。また、T細胞を濃縮または精製してもよい。T細胞は任意の型のT細胞であり得、任意の発生段階のもの、例えば非限定的に、CD4+/CD8+ダブルポジティブT細胞、CD4+ヘルパーT細胞（例えば、Th1およびTh2細胞）、CD8+ T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、メモリーT細胞（例えば、セントラルメモリーT細胞およびエフェクターメモリーT細胞）、制御性T細胞、ナイーブT細胞などであり得る。
一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞は外来遺伝子を発現するように操作される。例えば、一部の特定の態様では、本明細書に開示の操作されたCRISPRシステムが、免疫細胞を、外来遺伝子を発現するように操作するために使用され得る。例えば、一部の特定の態様では、本明細書に開示の操作されたCRISPRシステムが遺伝子座におけるDNA切断を触媒し、遺伝子座におけるHDRによる外来性遺伝子の部位特異的組込みを可能にし得る。
一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞がキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように操作される、すなわち、T細胞に、CARをコードしている外来性ヌクレオチド配列を含める。本明細書で用いる場合、用語「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、抗原特異的結合部分と免疫受容体に由来する1つまたは複数のシグナル伝達鎖とを含む任意の人工受容体を指す。CARは、ヒンジおよび膜貫通領域を介してT細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメインに、例えば、T細胞トリガードメイン（例えば、CD3ζ由来）とタンデム状態のT細胞共刺激ドメイン（例えば、CD28、CD137、OX40、ICOSまたはCD27由来）に連結された抗原に特異的な抗体の単鎖可変領域断片（scFv）を含み得る。キメラ抗原受容体を発現しているT細胞はCAR T細胞と称される。例示的なCAR T細胞としては、CD19標的指向性CTL019細胞（Grupp et al.（2015）BLOOD,126:4983参照）、19-28z細胞（Park et al.（2015）J. CLIN. ONCOL., 33:7010参照）およびKTE-C19細胞（Locke et al.（2015）BLOOD, 126:3991参照）が挙げられる。さらなる例示的なCAR T細胞は、米国特許第8,399,645号、同第8,906,682号、同第7,446,190号、同第9,181,527号、同第9,272,002号および同第9,266,960号、米国特許出願公開第2016/0362472号、同第2016/0200824号および同第2016/0311917号、ならびに国際（PCT）公開公報第2013/142034号、同第2015/120180号、同第2015/188141号、同第2016/120220号および同第2017/040945号に記載されている。CRISPRシステムを用いてCARを発現させるための例示的なアプローチは、Hale et al.（2017）MOL THER METHODS CLIN DEV., 4:192、MacLeod et al.（2017）MOL THER, 25:949およびEyquem et al.（2017）NATURE, 543:113に記載されている。
一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が抗原、例えばがん抗原に内在性のT細胞受容体（TCR）を介して結合する。一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、外来性TCR、例えば外来性の天然に存在するTCRまたは外来性の操作されたTCRを発現するように操作される。T細胞受容体はα鎖およびβ鎖と称される 2つの鎖を含み、これらの鎖はT細胞表面で一体となっており、MHC拘束性抗原を認識することができるヘテロ二量体型受容体を形成している。α鎖およびβ鎖の各々は、定常領域および可変領域を含む。α鎖およびβ鎖の各可変領域は、T細胞受容体に抗原結合活性および結合特異性を付与するCDR1、CDR2およびCDR3として公知の相補性決定領域（CDR）と称される3つのループを画定している。
一部の特定の態様では、CARまたはTCRが、B細胞成熟抗原（BCMA）、メソテリン、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、前立腺幹細胞抗原（PCSA）、炭酸脱水酵素IX（CAIX）、癌胎児性抗原（CEA）、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD123、CD133、CD138、上皮糖タンパク質2（EGP 2）、上皮糖タンパク質-40（EGP-40）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、受容体型チロシンプロテインキナーゼ（FLT3）、葉酸結合タンパク質（FBP）、胎児型アセチルコリン受容体（AChR）、葉酸受容体-aおよびβ（FRaおよびβ）、ガングリオシドG2（GD2）、ガングリオシドG3（GD3）、上皮成長因子受容体2（HER-2/ERB2）、上皮成長因子受容体vIII（EGFRvIII）、ERB3、ERB4、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2（IL-13Ra2）、K-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（KDR）、ルイスA（CA19.9）、ルイスY（LeY）、LI細胞接着分子（LICAM）、メラノーマ関連抗原1（メラノーマ抗原ファミリーAl、MAGE-A1）、ムチン16（MUC-16）、ムチン1（MUC-1;例えば、切断型MUC-1）、KG2Dリガンド、がん-精巣抗原NY-ESO-1、腫瘍胎児抗原（h5T4）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG-72）、血管内皮細胞増殖因子R2（VEGF-R2）、ウィルムス腫瘍タンパク質（WT-1）、1型チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体（ROR1）、B7-H3（CD276）、B7-H6（Nkp30）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン-4（CSPG4）、DNAXアクセサリー分子（DNAM-1）、エフリンA型受容体2（EpHA2）、線維芽細胞関連タンパク質（FAP）、Gpl00/HLA-A2、グリピカン3（GPC3）、HA-IH、HERK-V、IL-1 IRa、潜伏感染膜タンパク質1（LMP1）、神経細胞接着分子（N-CAM/CD56）ならびにトレイル受容体（TRAIL-R）から選択されるがん抗原に結合する。
CARコード配列または外来性TCRコード配列の挿入に適した遺伝子座としては、非限定的に、セーフハーバー遺伝子座（例えば、AAVS1遺伝子座）、TCRサブユニット遺伝子座（例えば、TCRα定常領域（TRAC）座位）、およびある特定の利点と関連している他の遺伝子座（例えば、CCR5遺伝子座、その不活性化によってHIV感染が抑制または低減され得る）が挙げられる。TRAC遺伝子座内への挿入によって、トニックCARシグナル伝達が低減され、T細胞の有効能が向上することは理解されよう（Eyquem et al.（2017）NATURE, 543:113参照）。さらに、内在性TRAC遺伝子の不活性化によって移植片対宿主病（GVHD）の反応が低減され得、それにより同種異系T細胞をCAR-T細胞の調製のための出発材料として使用することが可能になり得る。したがって、一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、内在性のTCRまたはTCRサブユニット、例えばTCRαサブユニット定常領域（TRAC）の発現の低減を有するように操作される。細胞を、内在性のTCRもしくはTCRサブユニットの発現の部分低減を有するように、または内在性のTCRもしくはTCRサブユニットの発現を有しないように操作してもよい。例えば、一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が有する内在性のTCRまたはTCRサブユニットの発現が、対応する未修飾細胞または親細胞と比べて80％未満（例えば、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満または5％未満）となるように操作される。一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が内在性のTCRまたはTCRサブユニットの検出可能な発現を有しないように操作される。CRISPRシステムを用いてTCRの発現を低減させるための例示的なアプローチは、米国特許第9,181,527号、Liu et al.（2017）CELL RES, 27:154、Ren et al.（2017）CLIN CANCER RES, 23:2255、Cooper et al.（2018）LEUKEMIA, 32:1970およびRen et al.（2017）ONCOTARGET, 8:17002に記載されている。
また、一部の特定の免疫細胞、例えばT細胞は主要組織適合性複合体（MHC）遺伝子またはヒト白血球抗原（HLA）遺伝子もまた発現し、これらの内在性遺伝子の不活性化によってGVHD反応が低減され得、それにより同種異系T細胞をCAR-T細胞の調製のための出発材料として使用することが可能になり得ることは理解されよう。したがって、一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、1種または複数種の内在性のクラスIまたはクラスIIのMHCまたはHLA（例えば、ベータ2-マイクログロブリン（B2M）、クラスII主要組織適合性複合体トランス活性化因子（CIITA）、HLA-Eおよび/またはHLA-G）の発現の低減を有するように操作される。細胞を、内在性のMHCもしくはHLAの発現の部分低減を有するように、または内在性のMHCもしくはHLAの発現を有しないように操作してもよい。例えば、一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が有する内在性MHC（例えば、B2M、CIITA、HLA-EまたはHLA-G）の発現が、対応する未修飾細胞または親細胞と比べて80％未満（例えば、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満または5％未満）となるように操作される。一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、内在性MHC（例えば、B2M、CIITA、HLA-EまたはHLA-G）の検出可能な発現を有しないように操作される。CRISPRシステムを用いてMHCの発現を低減させるための例示的なアプローチは、Liu et al.（2017）CELL RES, 27:154、Ren et al.（2017）CLIN CANCER RES, 23:2255およびRen et al.（2017）ONCOTARGET, 8:17002に記載されている。
GVHD反応を低減させるために不活性化され得る他の遺伝子としては、非限定的に、CD3、CD52およびデオキシシチジンキナーゼ（DCK）が挙げられる。例えば、CKの不活性化により、免疫細胞（例えば、T細胞）は、免疫細胞療法の際のGVHD反応を低減させるために宿主免疫システムを抑制状態にするために多くの場合で使用され得るプリンヌクレオチドアナログ（PNA）化合物に対して抵抗性となり得る。
一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が内在遺伝子の発現の低減を有するように操作される。例えば、一部の特定の態様では、本明細書に開示の操作されたCRISPRシステムを用いて免疫細胞が内在遺伝子の発現の低減を有するように操作され得る。例えば、一部の特定の態様では、本明細書に開示の操作されたCRISPRシステムによって遺伝子座におけるDNA切断がもたらされ、それによりターゲティング対象の遺伝子が不活性化され得る。他の態様では、本明細書に開示の操作されたCRISPRシステムが、標的遺伝子の発現を低減させるためのエフェクタードメイン（例えば、転写抑制因子またはヒストンメチラーゼ）と融合され得る。
免疫細胞（例えば、T細胞）の活性は、免疫抑制因子、例えば免疫チェックポイントタンパク質の発現を不活性化または低減させることによって向上し得ることは理解されよう。したがって、一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、免疫チェックポイントタンパク質の発現の低減を有するように操作される。野生型T細胞によって発現される例示的な免疫チェックポイントタンパク質としては、非限定的に、PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、PTPN6（SHP-1）およびFASが挙げられる。細胞は、免疫チェックポイントタンパク質の発現の部分低減を有するように、または免疫チェックポイントタンパク質の発現を有しないように修飾され得る。例えば、一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が有する免疫チェックポイントタンパク質の発現が、対応する未修飾細胞または親細胞と比べて80％未満（例えば、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満または5％未満）となるように操作される。一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、免疫チェックポイントタンパク質の検出可能な発現を有しないように操作される。CRISPRシステムを用いて免疫チェックポイントタンパク質の発現を低減させるための例示的なアプローチは、国際（PCT）公開公報第2017/017184号、Cooper et al.（2018）LEUKEMIA, 32:1970、Su et al.（2016）ONCOIMMUNOLOGY, 6:e1249558およびZhang et al.（2017）FRONT MED, 11:554に記載されている。
一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、ドミナントネガティブ形態の免疫チェックポイントタンパク質を発現するように修飾される。一部の特定の態様では、ドミナントネガティブ形態のチェックポイントインヒビターが、本来なら野生型免疫チェックポイントタンパク質に結合してこれを活性化させ得る天然リガンドに結合するか、あるいは天然リガンドを隔離するデコイ受容体としての機能を果たし得る。ドミナントネガティブ形態の免疫抑制因子を含む操作された免疫細胞、例えばT細胞の例は、例えば国際（PCT）公開公報第2017/040945号に記載されている。
一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、免疫細胞の生存、増殖、活性または分化（例えば記憶細胞への）を調節する遺伝子（例えば、転写因子、サイトカインまたは酵素）を発現するように修飾される。一部の特定の態様では、免疫細胞が、TET2、FOXO1、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-7、GLUT1、GLUT3、HK1、HK2、GAPDH、LDHA、PDK1、PKM2、PFKFB3、PGK1、ENO1、GYS1および/またはALDOAを発現するように修飾される。一部の特定の態様では、修飾が、調節エレメントに機能的に連結されるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の挿入である。一部の特定の態様では、修飾が、内在遺伝子内の一塩基多型（SNP）部位の置換である。
一部の特定の態様では、免疫細胞、例えばT細胞が、免疫細胞が遊走するように設計される微小環境（例えば、腫瘍微小環境）を調節するタンパク質（例えば、サイトカインまたは酵素）を発現するように修飾される。一部の特定の態様では、免疫細胞が、CA9、CA12、V-ATPaseサブユニット、NHE1および/またはMCT-1を発現するように修飾される。
V. キット
本明細書に開示の操作された天然に存在しないシステム、CRISPR発現システムおよびライブラリーを、医療提供者による使用に適したキットにパッケージングしてもよいことは理解されよう。したがって、別の局面において、本発明により、上記のシステム、ライブラリー、方法および組成物に開示した要素のうちのいずれか1つまたは複数を含むキットを提供する。一部の特定の態様では、キットが、本明細書に開示のような操作された天然に存在しないシステムとキットを使用するための使用説明書とを備えている。使用説明書は、本明細書に記載の用途および方法に特定されていてもよい。一部の特定の態様では、システムの要素のうちの1つまたは複数が溶液で提供される。一部の特定の態様では、システムの要素のうちの1つまたは複数が凍結乾燥形態で提供され、キットが希釈剤をさらに含む。諸要素は個々に提供されても組合せで提供されてもよく、任意の適切な容器、例えばバイアル、ボトル、チューブ内に提供してもよく、固相基材（例えば、チップまたはマイクロアレイ）の表面上に固定化してもよい。一部の特定の態様では、キットが、本明細書に記載の核酸および/またはタンパク質のうちの1つまたは複数を備えている。一部の特定の態様では、キットが本発明のシステムのすべての要素を備えている。
操作された天然に存在しないシステムを備えているキットの一部の特定の態様では、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が別々の容器内に提供される。他の態様では、ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が事前に複合体形成され、複合体が単一の容器内に提供される。一部の特定の態様では、キットが、別々の容器内に提供されたCasタンパク質またはCasタンパク質をコードしている核酸に機能的に連結される調節エレメントを含む核酸を備えている。他の態様では、キットが、ターゲッター核酸およびモジュレーター核酸と事前に複合体形成されたCasタンパク質を備えており、複合体は単一の容器内に提供される。
例えばスクリーニングプロセスまたは選択プロセスにおける使用のために複数の標的ヌクレオチド配列をターゲティングするため、複数のターゲッター核酸を備えたキットが提供され得る。したがって、一部の特定の態様では、キットが、複数の本明細書に開示のようなターゲッター核酸（例えば、別々のチューブ内または固相基材、例えばチップもしくはマイクロアレイの表面上に固定化）、任意で1つまたは複数の本明細書に開示のようなモジュレーター核酸、および任意で本明細書に開示のようなCasタンパク質またはCasタンパク質をコードしている核酸に機能的に連結される調節エレメントを備えている。かかるキットは、所与の遺伝子をターゲティングするための最も高い効率および/または特異性を有するターゲッター核酸を同定するため、生理学的経路または病理学的経路に関与している遺伝子を同定するため、あるいはマルチプレックスアッセイにおいて所望の機能性が得られるように細胞を操作するために有用である。一部の特定の態様では、キットが、1つまたは複数の別々の容器に提供された1つまたは複数のドナーテンプレートをさらに備えている。一部の特定の態様では、キットが、複数の本明細書に開示のようなドナーテンプレート（例えば、別々のチューブ内または固相基材、例えばチップもしくはマイクロアレイの表面上に固定化）、1つまたは複数の本明細書に開示のターゲッター核酸、および1つまたは複数の本明細書に開示のようなモジュレーター核酸、ならびに任意で本明細書に開示のようなCasタンパク質またはCasタンパク質をコードしている核酸に機能的に連結される調節エレメントを備えている。かかるキットは、マルチプレックスアッセイにおいて最適な遺伝子修飾を導入するドナーテンプレートを同定するために有用である。また、本明細書に開示のようなCRISPR発現システムもキットにおける使用に適している。
一部の特定の態様では、キットが、本明細書に記載の要素のうちの1つまたは複数を利用する方法における使用のための1種または複数種の試薬および/またはバッファーをさらに備えている。試薬は任意の適切な容器内に提供され得、特定のアッセイで使用可能な形態、または使用前に1種もしくは複数種の他の成分の添加を必要とする形態で（例えば、濃縮形態あるいは凍結乾燥形態で）提供され得る。バッファーは、反応バッファーまたは保存バッファー、例えば非限定的に、炭酸ナトリウムバッファー、重炭酸ナトリウムバッファー、ホウ酸バッファー、Trisバッファー、MOPSバッファー、HEPESバッファーおよびその組合せであり得る。一部の態様では、バッファーがアルカリ性である。一部の特定の態様では、バッファーが約7～約10のpHを有する。一部の特定の態様では、キットが薬学的に許容される担体をさらに備えている。一部の特定の態様では、キットが、対象への投与のための1つまたは複数のデバイスまたは他の材料をさらに備えている。
本記載全体を通して、組成物が具体的な成分を有する、含む（including）または含む（comprising）と記載されている場合、あるいはプロセスおよび方法が具体的な工程を有する、含む（including）または含む（comprising）と記載されている場合、さらに、記載の成分から本質的になるか、または記載の成分からなる本発明の組成物が存在すること、ならびに記載のプロセス工程から本質的になるか、または記載のプロセス工程からなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが想定される。
本出願書類において、要素もしくは成分が記載の要素もしくは成分のリストに含まれている、および/または記載の要素もしくは成分のリストから選択されるという場合、要素もしくは成分は、記載の要素または成分のうちのいずれか1つであり得る、または要素もしくは成分は、記載の要素または成分のうちの2つ以上からなる群より選択され得ると理解されたい。
さらに、本明細書に記載の組成物または方法の要素および/または特徴は、本明細書において明示的であれ黙示的であれ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくさまざまな様式で組み合わされ得ると理解されたい。例えば、特定の化合物に言及している場合、文脈からそうでないことが理解されない限り、化合物は本発明の組成物の種々の態様において、および/または本発明の方法において使用され得る。換言すると、この出願書類では、諸態様を、明瞭で簡潔な適用が記載および図示されることを可能にする様式で説明し、図示しているが、態様は、本教示および本発明（1つまたは複数）から逸脱することなく種々に組み合わせてもよく、独立していてもよいことを意図しており、それが認識されよう。例えば、本明細書において記載および図示した特徴はすべて、本明細書において記載および図示した発明（1つまたは複数）のあらゆる局面に適用可能であり得ることが認識されよう。
本発明を説明する文中における（特に、以下の特許請求の範囲の文中における）用語「1つの（a）」および「1つの（an）」および「その（the）」ならびに同様の言及は、本明細書において特に記載のない限り、または文脈と明らかに矛盾していない限り、単数と複数の両方を包含していると解釈されたい。例えば、用語「1つの細胞（a cell）」は、その混合物を含む複数の細胞を包含している。また、化合物、塩などについて複数形が使用されている場合、これは単数の化合物、塩なども意味すると解釈されたい。
「少なくとも1つの」という表現は、文脈および使用状況からそうでないと理解されない限り、この表現に続く記載の対象物の個々の各々および記載の対象物の2つ以上の種々の組合せを包含していると理解されたい。3つ以上の記載の対象物との関連における「および/または」という表現は、文脈からそうでないことが理解されない限り、同じ意味を有すると理解されたい。
「を含む（include）」、「を含む（includes）」、「を含む（including）」、「を有する（have）」、「を有する（has）」、「を有する（having）」、「を含む（contain）」、「を含む（contains）」または「を含む（containing）」という用語の使用は、その文法的に対応する語句も含めて、そうでないことが具体的に記載されていない限り、またはそうでないことが文脈から理解されない限り、一般的にオープンエンドで非限定的である、例えば記載されていないさらなる要素または工程を排除しないと理解されたい。
数量値の前に用語「約」の使用がある場合、そうでないことが具体的に記載されていない限り、本発明は具体的な数量値自体も包含している。本明細書で用いる場合、用語「約」は、特に記載がない限り、またはそうでないことが推察されない限り、公称値から±10％の変動を指す。
工程の順序またはある特定の行為を行なうための順序は、本発明の機能性が維持される限り重要でないと理解されたい。さらに、2つ以上の工程または行為を同時に実施してもよい。
本明細書におけるありとあらゆる例または例示的な文言、例えば「など（such as）」または「を含む（including）」の使用は、よりよく本発明の実例を示すことを意図しているにすぎず、特許請求の範囲の記載を除いて本発明の範囲を限定するものではない。本明細書における文言は、特許請求の範囲に記載されていない何らかの要素が本発明の実施に必須であることを示していると解釈されるべきではない。
以下の実施例は一例にすぎず、本発明の範囲または内容をなんら限定することを意図するものではない。
実施例1. デュアルガイドMAD7 CRISPR-Casシステムによる標的DNAのインビトロ切断
MAD7は、V-A型システムにおけるcrRNAとしても公知のシングルガイドRNAと複合体形成するとエンドヌクレアーゼ活性を有するV-A型Casタンパク質である（米国特許第9,982,279号参照）。この実施例では、インビトロ切断アッセイにおいてデュアルガイド核酸との複合体の状態のMAD7を用いた標的DNAの切断を記載する。
簡単には、crRNA1およびcrRNA2と命名した2つの異なるcrRNAを設計し、DNMT1遺伝子をターゲティングした。特に、crRNA2の方がゼブラフィッシュのLbCas12aおよびFnoCas12aを活性化させるのに良好な能力を有すると報告されている（Liu et al.（2019）NUC. ACIDS RES. 47（8）:4169-80参照）。crRNA1およびcrRNA2の予測される二次構造を図2Aに示す。また、それぞれcrRNA1_ターゲッター1およびcrRNA1_モジュレーター1と命名した、crRNA1に対応するターゲッターRNAおよびモジュレーターRNAの組ならびにそれぞれcrRNA2_ターゲッター1およびcrRNA2_モジュレーター1と命名した、crRNA2に対応するターゲッターRNAおよびモジュレーターRNAの組も設計した。各組のデュアルガイドRNAは、対応するシングルガイドRNAのループ領域の中央の位置での分割を示す。これらのガイドRNAのヌクレオチド配列を表2に示す。
（表２）試験したシングルガイドRNAおよびデュアルガイドRNAのヌクレオチド配列
Figure 2022550599000020
これらのガイドRNAは化学合成した。ヒトDNMT1標的DNAはPCRによって調製し、
Figure 2022550599000021
のヌクレオチド配列を含めた。MAD7タンパク質は、ヌクレオプラスミンNLSをC末端に含み、大腸菌（E. Coli）内で発現させ、タンパク質の高速液体クロマトグラフィー（FPLC）によって精製した。
シングルガイドCRISPR-CasシステムおよびデュアルガイドCRISPR-Casシステムをインビトロ切断アッセイにおいて試験した。簡単には、1μMのMAD7タンパク質を室温で10分間、1μMのcrRNA1、1μMのcrRNA1_モジュレーター1、1μMのcrRNA1_ターゲッター1、1μMのcrRNA1_モジュレーター1と1μMのcrRNA1_ターゲッター1の組合せ、1μMのcrRNA2、1μMのcrRNA2_モジュレーター1、1μMのcrRNA2_ターゲッター1、または1μMのcrRNA2_モジュレーター1と1μMのcrRNA2_ターゲッター1の組合せとともにインキュベートし、RNP複合体を形成した。次いでDNMT1標的DNAを溶液中に、MAD7と標的DNAの10:1または1:1のモル比で添加した。37℃で10分間のインキュベーション後、試料をアガロースゲルでの電気泳動によって解析した。
図2Bに示されるように、crRNA1、crRNA2およびその対応する組のデュアルガイドRNAではMAD7のヌクレアーゼ活性が活性化され、DNMT1標的DNAが切断された。対照的に、crRNA1_モジュレーター1、crRNA1_ターゲッター1、crRNA2_モジュレーター1またはcrRNA2_ターゲッター1単独はかかる活性を示さなかった。この条件下でMAD7ヌクレアーゼを活性化するcrRNA1の能力はcrRNA2のものより大きかった。crRNA1およびcrRNA2の各々について、MAD7ヌクレアーゼを活性化させるシングルガイドRNAの能力は、対応するデュアルガイドシステムのものより大きかった。
5’末端におけるモジュレーターRNAの伸長
次に、CRISPR-CasシステムがcrRNAまたはモジュレーターRNAの5’末端にヌクレオチド配列の付加を許容し得るかどうかを評価した。crRNA3およびcrRNA4と命名した2つのcrRNA配列を、crRNA1の5’末端にさらなるヌクレオチド配列を含むように設計した。対応するデュアルガイドシステムには、ターゲッターRNAとしてcrRNA1_ターゲッター1とペアにしたcrRNA3_モジュレーター1およびcrRNA4_モジュレーター1と命名したモジュレーターRNAを含めた。これらの新たに設計したガイドRNAの配列を表3に示す。RNAの5’末端のさらなるヌクレオチド配列に下線を付している。
（表３）試験したcrRNAおよびモジュレーターRNAのヌクレオチド配列
Figure 2022550599000022
これらのガイドRNAは化学合成した。インビトロ切断アッセイは上記の方法を用いて実施した。各ガイドRNAは、MAD7とともにインキュベートしてRNPを形成させるとき1μMの濃度で使用した。MAD7と標的DNAのモル比は10:1にした。
図3に示されるように、crRNA1、crRNA3およびcrRNA4ではすべて、MAD7のヌクレアーゼ活性が活性化され、DNMT1標的DNAが切断された。さらに、crRNA1_モジュレーター1、crRNA3_モジュレーター1およびcrRNA4_モジュレーター1の各々で、crRNA1_ターゲッター1との組合せで、MAD7ヌクレアーゼが活性化された。対照的に、ターゲッターRNA単独またはモジュレーターRNA単独ではいずれも、かかる活性は示されなかった。したがって、この条件下では、crRNAまたはモジュレーターRNAの5’末端のさらなるヌクレオチド配列は、MAD7ヌクレアーゼを活性化させるガイドRNAの能力になんらマイナスの影響を有しないようであった。
インビトロ転写モジュレーターRNA
次に、シングルガイドCRISPR-CasシステムまたはデュアルガイドCRISPR-Casシステムにおけるインビトロ転写RNAの活性を評価した。簡単には、crRNA1およびcrRNA3を、化学合成した二本鎖テンプレートDNAからMegaScriptキット（Ambion）を用いてインビトロで転写した。テンプレートDNAはT7プロモーターを関心対象のRNAをコードしている配列のすぐ上流に含み、これは
Figure 2022550599000023
のヌクレオチド配列を有した。その結果、crRNA1_T7およびcrRNA3_T7と命名したインビトロ転写RNAには、転写されたRNAの5’末端にGGのヌクレオチド配列が含まれた。このRNAを、Oligo Clean and Concentrationキット（Zymogen）を用いて精製し、Nanodropで定量した。インビトロ転写RNAの品質をアガロースゲルにおいて評価した。
対応するデュアルガイドシステムを作製するため、crRNA1_モジュレーター1またはcrRNA3_モジュレーター1をコードしている配列のすぐ上流にT7プロモーターを含むテンプレートDNAをインビトロ転写した。得られたRNAをcrRNA1_モジュレーター1_T7およびcrRNA3_モジュレーター1_T7と命名し、各々には、転写されたRNAの5’末端にGGのヌクレオチド配列が含まれた。これらRNA試料を精製し、その量および品質を上記のようにして評価した。これらのインビトロ転写モジュレーターRNAを、化学合成したcrRNA1_ターゲッター1と組合せて使用した。
インビトロ転写RNAを、インビトロ切断アッセイにおいて上記の方法を用いて試験した。各ガイドRNAは、MAD7とともにインキュベートしてRNPを形成させるとき1μMの濃度で使用した。MAD7と標的DNAのモル比は10:1にした。
図3に示されるように、crRNA1_T7およびcrRNA3_T7は、MAD7ヌクレアーゼを活性化させる能力を保持していた。同様に、（1）crRNA1_モジュレーター1_T7とcrRNA1_ターゲッター1および（2）crRNA3_モジュレーター1_T7とcrRNA1_ターゲッター1の組合せもMAD7ヌクレアーゼを活性化させる能力を保持していた。したがって、この条件下では、インビトロ転写crRNAおよびモジュレーターRNAは、さらなるヌクレオチド配列を5’末端に含んでいるにもかかわらず、シングルガイドCRISPR-CasシステムおよびデュアルガイドCRISPR-Casシステムのそれぞれにおける使用に適していた。
モジュレーターRNAおよびターゲッターRNAの「ループ」末端
上記のデュアルガイドRNAは、シングルガイドRNAをcrRNAループの中央の位置で分割することによって設計した。次に、シングルガイドRNAをループ内の異なる位置で分割されたデュアルガイドRNAシステムのバリアントを評価した。図4A～4Fに示されるように、crRNA1（本明細書においてRNA#1とも称する）をループ内の異なる位置で分割し、RNA#2、#4、#6、#8および#10と命名したモジュレーターRNAならびにRNA#3、#5、#7、#9および#11と命名したターゲッターRNAを作製した。これらのガイドRNAのヌクレオチド配列を表4に示す。
（表４）試験したシングルガイドRNAおよびデュアルガイドRNAのヌクレオチド配列
Figure 2022550599000024
これらのガイドRNAは化学合成した。インビトロ切断アッセイは上記の方法を用いて実施した。各ガイドRNAは、MAD7とともにインキュベートしてRNPを形成させるとき1μMの濃度で使用した。MAD7と標的DNAのモル比は10:1にした。
図4Iに示されるように、ガイドRNA#2と#3、#4と#5、#6と#7および#8と#9および#10と#11のペアではMAD7のヌクレアーゼ活性が活性化され、DNMT1標的DNAが切断された。これらのターゲッターRNA単独またはモジュレーターRNA単独では、いずれもかかる活性は示されなかった。したがって、この条件下では、crRNA1を分割したループ内の位置はデュアルガイドRNAシステムの活性に影響しないようであった。
驚くべきことに、RNA#2、#4、#6、#8および#10から選択される任意のモジュレーターRNAとRNA#3、#5、#7、#9および#11から選択される任意のターゲッターRNAとの組合せでMAD7ヌクレアーゼが活性化されることが示された（図4I）。特に、RNA#4と#11の組合せにはcrRNA1のループ由来の配列が含まれておらず、RNA#10と#5の組合せにはモジュレーターRNAとターゲッターRNAの両方にcrRNA1のループ配列が含まれていた。したがって、この条件下では、対応するシングルガイドRNAのループまたはループの断片がデュアルガイドシステムに不可欠でなかった。ループまたはループ断片が存在していた場合、その長さは、ターゲッターRNAまたはモジュレーターRNAのいずれにおいてもデュアルガイドRNAシステムの活性に影響しないようであった。
さらなるヘアピン配列の含有
次に、モジュレーターRNAの5’末端またはターゲッターRNAの3’末端にヘアピン配列を含むデュアルガイドRNAシステムを評価した。図4G～4Hに示されるように、ヘアピン配列をcrRNA1の5’末端または3’末端に付加し、それぞれRNA#12および14と命名したシングルガイドRNAを作製した。crRNA1_モジュレーター1の5’末端に付加されたヘアピン配列を含むRNA#12に対応するモジュレーターRNAを設計し、RNA#13と命名した。crRNA1_ターゲッター1の3’末端に付加されたヘアピン配列を含むRNA#14に対応するターゲッターRNAを設計し、RNA#15と命名した。これらのガイドRNAのヌクレオチド配列を表5に示す。ガイドRNAのヘアピン配列に下線を付している。
（表５）試験したシングルガイドRNAおよびデュアルガイドRNAのヌクレオチド配列
Figure 2022550599000025
これらのガイドRNAは化学合成した。インビトロ切断アッセイは上記の方法を用いて実施した。各ガイドRNAは、MAD7とともにインキュベートしてRNPを形成させるとき1μMの濃度で使用した。MAD7と標的DNAのモル比は10:1にした。
図4Iに示されるように、ヘアピンを含むシングルガイドRNA#12および14ではMAD7のヌクレアーゼ活性が活性化され、DNMT1標的DNAが切断された。それぞれ5’末端および3’末端にヘアピン配列を含む対応するモジュレーターRNA#13およびターゲッターRNA#15では、単独でかかる活性は示されなかった。しかしながら、モジュレーターRNA#13をターゲッターRNA#3（サブセクション「モジュレーターRNAおよびターゲッターRNAの「ループ」末端」に記載の）と合わせてデュアルガイドシステムを形成した場合、このRNAペアではMAD7ヌクレアーゼが活性化された。同様に、ターゲッターRNA#15をモジュレーターRNA#2（サブセクション「モジュレーターRNAおよびターゲッターRNAの「ループ」末端」に記載の）と合わせてデュアルガイドシステムを形成した場合、このRNAペアではMAD7ヌクレアーゼが活性化された。注目すべきことに、各々がペアピン（pairpin）配列を含むモジュレーターRNA#13とターゲッターRNA#15の組合せでもMAD7ヌクレアーゼが活性化された。したがって、この条件下では、モジュレーターRNAの5’末端またはターゲッターRNAの3’末端に付加されたヘアピン配列は、デュアルガイドシステムの活性にマイナスに影響しないようであった。
モジュレーターRNAとターゲッターRNA間の塩基対合
デュアルガイドシステムの活性に対するモジュレーターRNA-ターゲッターRNA間の塩基対合の影響を評価するため、さらに多くのシングルガイドシステムとデュアルガイドシステムを設計し、試験した。具体的には、crRNA構築物を、モジュレーターRNAとターゲッターRNA間にさらなる塩基対合が導入されるように設計した。このような塩基対を形成するモジュレーターRNA内のヌクレオチドはモジュレーターステム配列の3’側に配置し、このような塩基対を形成するターゲッターRNA内のヌクレオチドはターゲッターステム配列の5’側に配置した。図5A～5Iに示されるように、構築物1および2は上記のcrRNA1およびcrRNA2と同一にした。その他の構築物は、ループ領域内のいずれかで分割して組合せ3、5、7、9、11、13および15を作製するか、またはステム領域内のいずれかで分割して組合せ4、6、8、10、12、14および16を作製した。これらのガイドRNAのヌクレオチド配列を表6に示す。対応するcrRNAのギブスの自由エネルギー変化（ΔG）をRNAfoldプログラムによって計算し、図5A～5Iに記載している。
（表６）試験したシングルガイドRNAおよびデュアルガイドRNAのヌクレオチド配列
Figure 2022550599000026
ガイドRNAは化学合成した。インビトロ切断アッセイは、MAD7タンパク質を等モル量のRNA（1つまたは複数）とともに25℃で20分間インキュベートしてRNPを形成させ、このRNPを標的DNAとともに30分間インキュベートしたこと以外は上記の方法を用いて実施した。各ガイドRNAは、MAD7とともにインキュベートしてRNPを形成させるとき1μMの濃度で使用した。MAD7と標的DNAのモル比は10:1にした。
図5J～5Kに示されるように、crRNAをステム領域内で分割してデュアルガイドにするとCRISPR-Casシステムの活性が消失した。しかしながら、crRNAをループ領域内で分割した場合、MAD7ヌクレアーゼを活性化させるデュアルガイドシステムの能力は、モジュレーターRNAとターゲッターRNA間にさらなる塩基対合を含むシステムで低下した。
実施例2. デュアルガイドMAD7 CRISPR-CasシステムによるゲノムDNAの切断
この実施例では、シングルガイド核酸またはデュアルガイド核酸との複合体の状態のMAD7を用いたJurkat細胞のゲノムDNAの切断を記載する。
簡単には、Jurkat細胞を、10％ウシ胎児血清を補給したRPMI 1640培地（Thermo Fisher Scientific,A1049101）中で5％CO2の環境下37℃にて培養し、2～3日毎に100,000細胞/mLの密度に分割した。MAD7タンパク質は、ヌクレオプラスミンNLSをC末端に含み、大腸菌内で発現させ、FPLCによって精製した。RNP複合体は、150pmolのMAD7タンパク質を、実施例1に記載のような150pmolのcrRNA1または150pmolのcrRNA1_モジュレーター1と150pmolのcrRNA1_ターゲッター1の組合せとともに室温で10分間インキュベートすることによって調製した。このRNPを200,000個のJurkat細胞と25μLの最終体積で混合した。エレクトロポレーションを4D-Nucleofector（Lonza）においてプログラムCA-137を用いて行なった。エレクトロポレーション後、細胞を3日間培養した。
細胞のゲノムDNAを、Quick Extract DNA抽出溶液1.0（Epicentre）を用いて抽出した。DNMT1遺伝子をゲノムDNA試料からPCR反応にて、
Figure 2022550599000027
のヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと
Figure 2022550599000028
のヌクレオチド配列を有するリバースプライマーを用いて増幅させた。増幅したDNAを精製し、Nextera用インデックス付きプライマーIndex 1とIndex 2を用いた第2のPCR反応でのテンプレートとして使用した。Index 1の配列は
Figure 2022550599000029
であり、Index 2の配列は
Figure 2022550599000030
であり、ここで、i7およびi5はマルチプレックスのためのバーコードとした。PCR産物を次世代シーケンシングによって解析し、データを、AmpliCanパッケージを用いて解析した（Labun et al.（2019）, Accurate analysis of genuine CRISPR editing events with ampliCan, GENOME RES.参照、早期電子公開）。シーケンシング結果の質を図6Bにおいて検証した。編集効率は、各条件下で得られたリードの総数に対する編集されたリードの数によって決定した。実験は二連で実施した。
図6Aに示されるように、MAD7との複合体の状態のcrRNA1_モジュレーター1とcrRNA1_ターゲッター1の組合せでは、Jurkat細胞の集団においてDNMT1ゲノム遺伝子座の25～40％が編集された。観察されたこの効率はcrRNA1とMAD7を用いることによって得られる効率と同様であった。
実施例3. デュアルガイドMAD7 CRISPR-Casシステムによる他の標的部位の切断
実施例1および2には、ヒトDNMT1遺伝子の配列を有する標的DNAの切断を記載している。この実施例では、デュアルガイド核酸との複合体の状態のMAD7を用いた他の標的DNAの切断を記載する。
簡単には、crRNAおよび対応するターゲッターRNAを、他のヒト遺伝子をターゲティングするように設計した。このようなターゲッターRNAをcrRNA1_モジュレーター1と合わせるとデュアルガイドシステムが作製され得る。この実験で使用したガイドRNAの配列を表7に示す。また、他のヒト遺伝子をターゲティングするガイドRNAも設計される。
（表７）例示的なシングルガイドRNAおよびデュアルガイドRNAのヌクレオチド配列
Figure 2022550599000031
Figure 2022550599000032
ガイドRNAは化学合成した。細胞内切断アッセイは、実施例2に記載の方法を用いて実施した。
図7に示されるように、試験した各標的遺伝子座において、デュアルガイドRNAではヒトゲノムが、それぞれのシングルガイドRNAと同様の効率で編集された。
実施例4. crRNAループ内の異なる分割部を用いたデュアルガイドMAD7 CRISPR-Casシステムによる他の標的部位の切断
この実施例では、cRNAループ内の異なる位置で分割されたデュアルガイド核酸との複合体の状態のMAD7を用いたDNAの切断を記載する。
簡単には、CD52、PDCD1およびTIGITをターゲティングするcrRNAならびにデュアルガイドCRISPRシステムのモジュレーターRNAとターゲッターRNAを化学合成した。これらのRNAヌクレオチド配列を以下の表8に示す。
（表８）例示的なシングルガイドRNAおよびデュアルガイドRNAのヌクレオチド配列
Figure 2022550599000033
Figure 2022550599000034
表8において、crRNA_CD52、crRNA_PDCD1およびcrRNA_TIGITは、それぞれCD52、PDCD1およびTIGITをターゲティングするシングルガイドRNAとして使用した。crRNA_モジュレーター1は、crRNA_CD52_ターゲッター1、crRNA_PDCD1_ターゲッター1またはcrRNA_TIGIT_ターゲッター1との組合せで、それぞれのシングルガイドRNAに対応するデュアルガイドRNAとして使用し、この場合、シングルガイドRNAはループの5’末端から1番目のヌクレオチド間結合で分割されている。crRNA_モジュレーター2は、crRNA_CD52_ターゲッター2、crRNA_PDCD1_ターゲッター2またはcrRNA_TIGIT_ターゲッター2との組合せで、それぞれのシングルガイドRNAに対応するデュアルガイドRNAとして使用し、この場合、シングルガイドRNAはループの5’末端から2番目のヌクレオチド間結合で分割されている。crRNA_モジュレーター3は、crRNA_CD52_ターゲッター3、crRNA_PDCD1_ターゲッター3またはcrRNA_TIGIT_ターゲッター3との組合せで、それぞれのシングルガイドRNAに対応するデュアルガイドRNAとして使用し、この場合、シングルガイドRNAはループの5’末端から3番目のヌクレオチド間結合で分割されている。crRNA_モジュレーター4は、crRNA_CD52_ターゲッター4、crRNA_PDCD1_ターゲッター4またはcrRNA_TIGIT_ターゲッター4との組合せで、それぞれのシングルガイドRNAに対応するデュアルガイドRNAとして使用し、この場合、シングルガイドRNAはループの5’末端から4番目のヌクレオチド間結合で分割されている。crRNA_モジュレーター5は、crRNA_CD52_ターゲッター5、crRNA_PDCD1_ターゲッター5またはcrRNA_TIGIT_ターゲッター5との組合せで、それぞれのシングルガイドRNAに対応するデュアルガイドRNAとして使用し、この場合、シングルガイドRNAはループの5’末端から5番目のヌクレオチド間結合で分割されている。細胞内切断アッセイは、上記の実施例1に記載の方法を用いて実施した。
図8に示されるように、試験した各標的遺伝子について、デュアルガイドCRISPRシステムでは細胞のゲノムが細胞内切断アッセイにおいて、分割位置が2、3、4または5である場合は同様の効率で、分割位置が1である（すなわち、ループの5’末端から1番目のヌクレオチド間結合で分割した）場合は有意に低い効率で、編集された。この結果により、モジュレーターRNAは、細胞内での最適な活性のために少なくとも1個のヌクレオチド（例えば、ウリジン）をモジュレーターステム配列の3’側に含んでいるのがよいことが示唆された。
参照による組み入れ
本明細書において言及した特許および科学文献の各々の全開示内容は、参照によりあらゆる目的のために組み入れられる。
均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態に具現化され得る。したがって、前述の態様は、あらゆる点において本明細書に記載の発明に対する限定ではなく例示であるとみなされたい。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等の意味および範囲の範囲内に含まれるあらゆる変更が特許請求の範囲に包含されることを意図する。

Claims (45)

  1. （a）（i）標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計されたスペーサー配列;および
    （ii）ターゲッターステム配列
    を含むターゲッター核酸;ならびに
    （b）該ターゲッターステム配列に相補的なモジュレーターステム配列を含むモジュレーター核酸
    を含む、操作された、天然に存在しないシステムであって、
    該ターゲッター核酸と該モジュレーター核酸が、別個の核酸であり、該ターゲッター核酸と該モジュレーター核酸を含む複合体が、天然に存在するシステムではtracrRNAなしの単独のcrRNAによって活性化されるCRISPR関連（Cas）ヌクレアーゼを活性化させることができる、
    操作された、天然に存在しないシステム。
  2. CasヌクレアーゼがV-A型Casヌクレアーゼである、請求項1記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  3. ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、4～10ヌクレオチド長である、請求項1または2記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  4. ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列が各々、5ヌクレオチド長である、請求項1～3のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  5. ターゲッターステム配列およびモジュレーターステム配列がワトソン・クリック塩基対合によりハイブリダイズされる、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  6. スペーサー配列が約20ヌクレオチド長である、請求項1～5のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  7. スペーサー配列が18ヌクレオチド長であるかまたはそれより短い、請求項1～5のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  8. スペーサー配列が17ヌクレオチド長であるかまたはそれより短い、請求項7記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  9. ターゲッター核酸が、5’から3’に向かってターゲッターステム配列、スペーサー配列、および任意のさらなるヌクレオチド配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  10. ターゲッター核酸がリボ核酸（RNA）を含む、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  11. ターゲッター核酸が修飾RNAを含む、請求項10記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  12. ターゲッター核酸がRNAとDNAの組合せを含む、請求項10または11記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  13. ターゲッター核酸が化学修飾を含む、請求項10～12のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  14. 化学修飾がターゲッター核酸の3’末端の1個または複数のヌクレオチドに存在している、請求項13記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  15. 化学修飾が、2'-O-メチル、2'-フルオロ、2'-O-メトキシエチル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、プソイドウリジン、およびその任意の組合せからなる群より選択される、請求項13または14記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  16. モジュレーター核酸が、さらなるヌクレオチド配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  17. さらなるヌクレオチド配列がモジュレーターステム配列の5’側に位置している、請求項16記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  18. さらなるヌクレオチド配列が4～50ヌクレオチド長である、請求項16または17記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  19. さらなるヌクレオチド配列が、ドナーテンプレートとハイブリダイズすることができるドナーテンプレートリクルート配列を含む、請求項16～18のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  20. ドナーテンプレートをさらに含む、請求項19記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  21. モジュレーター核酸が、モジュレーターステム配列の3’側に1個または複数のヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  22. モジュレーター核酸がRNAを含む、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  23. モジュレーター核酸が修飾RNAを含む、請求項22記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  24. モジュレーター核酸がRNAとDNAの組合せを含む、請求項22または23記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  25. モジュレーター核酸が化学修飾を含む、請求項22～24のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  26. 化学修飾が、モジュレーター核酸の5’末端の1個または複数のヌクレオチドに存在している、請求項25記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  27. 化学修飾が、2'-O-メチル、2'-フルオロ、2'-O-メトキシエチル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、プソイドウリジン、およびその任意の組合せからなる群より選択される、請求項25または26記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  28. ターゲッター核酸とモジュレーター核酸が共有結合により連結されていない、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  29. Casヌクレアーゼが、SEQ ID NO:1と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、請求項1～28のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  30. CasヌクレアーゼがCpf1である、請求項1～28のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  31. Casヌクレアーゼをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  32. ターゲッター核酸、モジュレーター核酸、およびCasヌクレアーゼが、リボ核タンパク質（RNP）複合体内に存在している、請求項31記載の操作された、天然に存在しないシステム。
  33. 請求項1～32のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム
    を含む、真核細胞。
  34. 請求項1～32のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステム、または
    請求項33記載の真核細胞
    を含む、組成物。
  35. 以下の工程を含む、標的ヌクレオチド配列を有する標的DNAを切断する方法：
    標的DNAを、請求項1～32のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステムと接触させる工程であって、それにより標的DNAの切断をもたらす工程。
  36. 接触がインビトロで行なわれる、請求項35記載の方法。
  37. 接触が細胞においてエクスビボで行なわれる、請求項35記載の方法。
  38. 標的DNAが前記細胞のゲノムDNAである、請求項37記載の方法。
  39. 前記システムが、事前に形成させたRNP複合体として前記細胞内に送達される、請求項37または38記載の方法。
  40. 事前に形成させたRNP複合体が、エレクトロポレーションによって前記細胞内に送達される、請求項39記載の方法。
  41. 以下の工程を含む、真核細胞のゲノムを編集する方法：
    請求項1～32のいずれか一項記載の操作された、天然に存在しないシステムを、真核細胞内に送達する工程であって、それにより真核細胞のゲノムの編集をもたらす工程。
  42. 前記システムが、事前に形成させたRNP複合体として前記細胞内に送達される、請求項41記載の方法。
  43. 前記システムが、エレクトロポレーションによって前記細胞内に送達される、請求項41または42記載の方法。
  44. 前記細胞が免疫細胞である、請求項37～43のいずれか一項記載の方法。
  45. 免疫細胞がTリンパ球である、請求項44記載の方法。
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