JP2024506016A - 免疫療法のためのｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ｔｉｍ３）組成物及び方法 - Google Patents

免疫療法のためのｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ｔｉｍ３）組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

ＴＩＭ３遺伝子内で編集するための、例えば、ＤＮＡ配列を改変するための組成物及び方法が提供される。免疫療法のための組成物及び方法が提供される。【選択図】図４

Description

本出願は、２０２１年２月８日に出願された米国仮出願第６３／１４７，２２１号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２２年２月３日に作成された「０１１５５－００４１－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するファイルとして提供され、サイズは１３３，１２０バイトである。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
緒言及び概要
Ｔ細胞疲弊は、慢性抗原刺激に対するＴ細胞の応答を説明するために使用されてきた広義の用語である。これは、慢性ウイルス感染の設定において最初に観察されたが、腫瘍に対する免疫応答においても研究されてきた。Ｔ細胞疲弊機序の特性及び特徴は、チェックポイント遮断及び養子Ｔ細胞移植療法の成功に決定的な意味を有し得る。
Ｔ細胞疲弊は、慢性感染症及びがんの特徴である、長期の抗原刺激によるエフェクター機能の進行性の喪失である。連続的な抗原刺激に加えて、微小環境に存在する抗原提示細胞及びサイトカインもまた、この疲弊した表現型に寄与し得る。したがって、Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞のエフェクター機能が低下し、阻害性受容体の発現が持続するＴ細胞機能不全の状態である。これにより、感染症または腫瘍の最適な制御が妨げられる。さらに、疲弊したＴ細胞は、機能性エフェクターまたはメモリーＴ細胞の転写状態とは異なる転写状態を有する。治療的処置は、疲弊したＴ細胞を救出する可能性を有する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｖ．＆Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．，２０１１，Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．＆Ｋｕｒａｃｈｉ Ｍ．，２０１５）。
疲弊したＴ細胞は、典型的には、プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１またはＰＤ－１）などの共阻害性受容体を発現する。遺伝子産物は、免疫チェックポイント系の構成要素として作用する。Ｔ細胞疲弊は、これらの受容体を遮断することによって逆転され得る。
ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、Ｔ細胞における免疫チェックポイントとして作用する。慢性感染の間、Ｔ細胞は、ＴＩＭ－３ならびにＴ細胞の免疫応答を下方制御する他の免疫チェックポイント遺伝子を発現する。ＴＩＭ－３は、発がんに関与している。胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌、及び膵臓癌の患者では、ＴＩＭ－３腫瘍発現は、腫瘍浸潤、生存率の低下、及び転移と相関している。Ｔｈ１、Ｔｈ１７、ナチュラルキラー（ＮＫ）、及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ならびに調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む多くの免疫細胞型において、ＴＩＭ－３タンパク質の発現が観察されている。ＴＩＭ－３は、ＰＤ－１と共発現される抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現され得る。ＴＩＭ－３は、カルシウム－カルパン－カスパーゼ－１経路を介してＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のアポトーシスを引き起こす、ガレクチン－９に結合することが示されている。ＴＩＭ－３のガレクチン－９への結合は、Ｙ２６５細胞内ＴＩＭ－３ドメインをリン酸化する。さらに、ＴＩＭ－３を発現する細胞は、マウスの腫瘍浸潤Ｔ細胞において観察されている。ＴＩＭ－３は、Ｔｈ１媒介性自己免疫を直接阻害することができ、未知の機序を介して、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の増殖を誘導することによって間接的に免疫抑制を促進することが示されている。ＴＩＭ－３を遮断すると、リンパ球によるＩＦＮγの産生を増加させることができるが、この作用の分子的基礎は不明である。
例えば、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して生成されたＴＩＭ３配列、例えば、ゲノム遺伝子座における遺伝子修飾（例えば、挿入、欠失、置換）を有する細胞の調製方法において、使用するための化合物及び組成物、ならびにＴＩＭ３配列における遺伝子修飾を有する細胞、及び例えば、免疫腫瘍学及び感染症における、例えば、免疫応答を促進するための様々な方法におけるそれらの使用を本明細書に提供する。ＴＩＭ３発現を低減し得るＴＩＭ３遺伝子修飾を有する細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座、例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子座；ＭＨＣクラスＩ分子、例えば、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ遺伝子座の発現を低減するゲノム遺伝子座；ＭＨＣクラスＩＩ分子、例えば、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の発現を低減するゲノム遺伝子座；ならびにチェックポイント阻害剤遺伝子座、例えば、ＣＤ２４４（２Ｂ４）遺伝子座、ＬＡＧ３遺伝子座、及びＰＤ－１遺伝子座を含む追加のゲノム配列における遺伝子修飾を含み得る。本開示は、ＴＩＭ３配列の遺伝子修飾を有する細胞、及び任意選択で本明細書に提供される他のゲノム遺伝子座を含む細胞集団に関する。細胞は、養子Ｔ細胞移植療法において使用されてもよい。本開示は、治療、例えば、がん治療及び免疫療法で使用するためのＴＩＭ３配列の遺伝子修飾を伴う細胞の組成物及び使用に関する。本開示は、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系、細胞、及び細胞のゲノム編集に有用な方法に関する。
ｃｈｒ５：１５７０８５８３２－１５７１０９０４４のゲノム座標内に、ヒトＴＩＭ３配列における遺伝子修飾を含む、操作された細胞が本明細書に提供される。さらなる実施形態が、特許請求の範囲及び図面全体を通して提供され、記載される。
対象を治療するための医薬の調製のための、上記実施形態のいずれかに記載の組成物または製剤の使用も開示される。対象は、ヒトまたは動物（例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、カニクイザル）であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
ＴＩＭ３遺伝子配列に遺伝子修飾（例えば、挿入、置換、または欠失）をもたらす際に使用するための、上記組成物または製剤のうちのいずれかも開示される。特定の実施形態では、配列内の遺伝子修飾は、ゲノム遺伝子座の遺伝子修飾の前に、例えば、フレームシフトまたはナンセンス変異を形成することによって、全長タンパク質の翻訳を防止する核酸配列の変化をもたらし、その結果、翻訳は早期に終結する。遺伝子修飾は、スプライス部位、すなわち、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位における挿入、置換、または欠失を含むことができ、その結果、異常なスプライシングは、フレームシフト変異、ナンセンス変異、または切断されたｍＲＮＡをもたらし、その結果、翻訳は早期に終結する。遺伝子修飾はまた、コードされたタンパク質の翻訳または折り畳みを妨害し、早期の翻訳終結をもたらす可能性がある。
配列内の遺伝子修飾の生成に使用するために本明細書で提供される組成物は、好ましくは、配列からのタンパク質の発現、例えば、タンパク質の細胞表面発現の低減をもたらす。
別の態様では、本発明は、対象に免疫療法を提供する方法であって、本明細書に記載される有効量の細胞、例えば、前述の細胞態様及び実施形態のうちのいずれかの細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。
方法の実施形態では、方法は、本明細書に記載される細胞または細胞集団を投与する前のリンパ枯渇を含む。方法の実施形態では、方法は、本明細書に記載される有効量の細胞、例えば、前述の細胞態様及び実施形態のうちのいずれかの細胞を対象に投与する前に、リンパ消耗剤または免疫抑制剤を投与することを含む。別の態様では、本発明は、細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法を提供する。
免疫療法は、免疫系を活性化または抑制することによる疾患の治療である。免疫応答を誘発または増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法として分類される。細胞ベースの免疫療法は、いくつかのがんの治療に有効であることが実証されている。リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞の表面に発現する異常な抗原に応答して作用するようにプログラムすることができる。したがって、がん免疫療法は、免疫系の成分が腫瘍または他のがん細胞を破壊するのを可能にする。
免疫療法はまた、慢性感染症、例えば、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎ウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、結核感染症、ならびにマラリア感染症の治療に有用であり得る。トランスジェニックＴＣＲまたはＣＡＲなどの標的化受容体を含む免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載されるものなどの免疫療法において有用である。
別の態様では、本発明は、免疫療法のための細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法であって、（ａ）例えば、本明細書に開示されるｇＲＮＡ分子（本明細書に記載される）、または２つ以上のｇＲＮＡ分子を当該細胞に導入することによって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上または全ての構成要素の発現を低減または排除することによって細胞を修飾することと、（ｂ）当該細胞を増殖することと、を含む、方法を提供する。本発明の細胞は、例えば、標的化受容体、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３ゼータ鎖シグナル伝達を媒介するポリペプチドをコードする異種配列の導入によるさらなる操作に好適である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非内因性ＴＣＲまたはＣＡＲ配列から選択される標的化受容体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型またはバリアントＴＣＲである。本発明の細胞はまた、代替の抗原結合部分をコードする異種配列の導入、例えば、代替の（非内因性）Ｔ細胞受容体、例えば、特定のタンパク質を標的とするように操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする異種配列の導入による、さらなる操作にも好適であり得る。ＣＡＲは、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られている。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞を調製する方法、例えば、細胞を調製する方法の前述の態様及び実施形態のうちのいずれかの方法によって調製された細胞（例えば、細胞集団）を投与することを含む、対象を治療する方法を提供する。
次世代（ＮＧＳ）シークエンシングによって測定した、４人のドナー（「８２６」、「１１２」、「２６２」及び「３１５」）の各々からの試料の編集の程度を示す。 フローサイトメトリーによって測定した、再刺激Ｔ細胞におけるＴＩＭ３タンパク質発現の程度を示す。ｙ軸は、ＴＩＭ３陽性細胞のパーセンテージを示し、誤差バーは、この測定の標準偏差（ＳＤ）を示す。ドナー「２６２」及び「３１５」に由来する試料の結果を示す。 フローサイトメトリーによって測定した、再刺激Ｔ細胞におけるＴＩＭ３タンパク質発現の程度を示す。ｙ軸は、ＴＩＭ３陽性細胞のパーセンテージを示し、誤差バーは、この測定の標準偏差（ＳＤ）を示す。ドナー「１１２」及び「８２６」に由来する試料の結果を示す。 ＮＧＳシークエンシングによって測定した、Ｔ細胞中の編集の程度を示す。 フローサイトメトリーによって測定した、再刺激ＴＩＭ３＋細胞のパーセントを示し、誤差バーは、この測定のＳＥＭを示す。 Ｔ細胞におけるＴＩＭ３ガイドＲＮＡによる編集の用量応答曲線を示す。 ＣＤ８＋ＷＴ１ ＴＣＲ発現操作された細胞の中の幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）を示す。 ＣＤ８＋ＷＴ１ ＴＣＲ発現操作された細胞の中の中央メモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）を示す。 ＣＤ８＋ＷＴ１ ＴＣＲ発現操作された細胞の中のエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）を示す。 操作されたＴ細胞における第３の連続編集のためにＮＧＳを介して設定された第１のプライマーで決定されたインデル頻度を示す。 操作されたＴ細胞における第３の連続編集のためにＮＧＳを介して設定された第２の異なるプライマーで決定されたインデル頻度を示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で５：１のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で５：１のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で５：１のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ｄ、Ｅ、及びＦは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で１：１のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ｄ、Ｅ、及びＦは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で１：１のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ｄ、Ｅ、及びＦは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で１：１のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ｇ、Ｆ、及びＩは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で１：５のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ｇ、Ｆ、及びＩは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で１：５のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。 ＷＴ１を発現するＡＭＬ細胞を操作されたＴ細胞に曝露した後の、赤色及び緑色の両方で蛍光を発する平均画像面積を示す。Ｇ、Ｆ、及びＩは、それぞれ、ＡＭＬ細胞株ｐＡＭＬ１、ｐＡＭＬ２、またはｐＡＭＬ３で１：５のＥ：Ｔを使用したアッセイを示す。
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本教示を様々な実施形態と併せて記載するが、本教示をそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替、改変物、及び均等物を包含する。
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「コンジュゲート（ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」への言及は、複数のコンジュゲートを含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞（例えば、細胞集団）を含む等である。
数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値及び測定可能な値は、有意な桁及び測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも１０３、１０４、１０５、または１０６個の細胞、好ましくは１０７、２×１０７、５×１０７、または１０８個の細胞の集団を指す。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と、以下の詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。
「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、明細書において包括的な意味で、すなわち、「及び／または」に等しい意味で使用される。
「約」という用語は、リストの前に使用されると、リストの各メンバーを修飾する。「約」という用語は、当該技術分野内の許容される変動または誤差、例えば、平均からの２標準偏差、または測定を行うために使用される方法の感度を包含すると理解される。「約」が数列の第１の値の前に存在するとき、数列の各値を修飾することが理解され得る。
範囲は、その範囲の最後の数値及びその間の全ての論理値を含むと理解される。例えば、５～１０個のヌクレオチドは、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドとして理解され、５～１０％は、５％及び１０％までの全ての可能な値を含有すると理解される。
２０ヌクレオチド配列の少なくとも１７個のヌクレオチドは、提供される配列の１７、１８、１９、または２０個ヌクレオチドを含むと理解され、したがって明確に理解されるため、１つが特異的に提供されなくても上限を提供する。同様に、最大３個のヌクレオチドは、０、１、２、または３個のヌクレオチドを包含すると理解され、１つが特異的に提供されなくても下限を提供する。「少なくとも」、「最大」、または他の同様の言語が数字を修飾するとき、数列の各数字を修飾することが理解され得る。
本明細書で使用される場合、「それ以下」または「それ未満」は、語句に隣接する値、及び文脈から論理的であるように、ゼロまでの論理的により低い値または整数として理解される。例えば、「２個以下のヌクレオチド塩基対」の二重鎖領域は、２、１、または０個のヌクレオチド塩基対を有する。一連の数字または範囲の前に「以下」または「未満」が存在する場合、一連または範囲内の数字の各々が修飾されることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、範囲は、上限及び下限の両方を含む。
本出願における配列と、指示された受入番号または受入番号における位置との間に矛盾が生じた場合、本出願における配列が優勢である。
化学名と構造との間に矛盾がある場合、構造が優勢である。
本明細書で使用される場合、「分析物を検出する」等は、存在する場合、分析物を検出することができるアッセイを実施することとして理解され、分析物は、アッセイの検出レベルを上回る量で存在する。
本明細書で使用される場合、値の最大量が１００％（例えば、１００％阻害または１００％カプセル化）で表される場合、値は検出方法によって制限されることが理解される。例えば、１００％阻害は、アッセイの検出レベルを下回るレベルへの阻害として理解され、１００％カプセル化は、カプセル化のために意図された材料を小胞の外側で検出することができないとして理解される。
本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のものに過ぎず、決して所望の主題を限定すると解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の材料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。
Ｉ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びそれらの類似体であるポリマーを含む）を含む、多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。ＲＮＡは、例えば、修飾として、１つ以上のデオキシリボースヌクレオチドを含み得、同様に、ＤＮＡは、１つ以上のリボヌクレオチドを含み得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、もしくはＮ１－メチルシュードウリジンなどの修飾ウリジン）；イノシン；プリンもしくはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－もしくはアザ－プリン、デアザ－もしくはアザ－ピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。一般的な考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．編集、第１１版、１９９２を参照）。核酸は、骨格がポリマーの位置（複数可）に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基及び連結のみを含むことができるか、または従来の構成要素及び置換の両方（例えば、２’メトキシ置換基を有する従来のヌクレオシド、または従来のヌクレオシド及び１つ以上のヌクレオシド類似体の両方を含有するポリマー）を含むことができる。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体である「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ内のウラシルもしくはその類似体及びＤＮＡ内のチミンもしくはその類似体の存在によって異なり得る。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、例えば、単一ガイドＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれかを指すために、本明細書で互換的に使用される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合し得るか、または例えば、２つの別々のＲＮＡ鎖（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各々のタイプを指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または修飾もしくは変化を伴うｔｒＲＮＡ配列であり得る。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のための標的配列に対してガイドＲＮＡを指向させるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号１～８８から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、例えば、ガイド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるか、または１００％である。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号１～８８から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列及び標的領域とは、参照配列に応じて、少なくとも１個のミスマッチ、すなわち、同一ではないか、または相補的ではない１個のヌクレオチドを含有していてもよい。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、標的配列の全長は、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１～４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドを含む。すなわち、ガイド配列及び標的領域は、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の塩基対を有する二重鎖領域を形成してもよい。特定の実施形態では、二重鎖領域は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、その結果、ガイド鎖及び標的配列は完全に相補的ではない。例えば、ガイド鎖及び標的配列は、２個のミスマッチを含む、２０を超えるヌクレオチド領域にわたって相補的であってもよく、その結果、ガイド配列及び標的配列は、９０％相補的であり、２０個のうち１８個の塩基対の二重鎖領域を提供する。
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の核酸基質は二本鎖核酸であるため、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体）の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖に結合するようにガイドＲＮＡを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓクリベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）／ニッカーゼ及びその不活性化形態（ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が含まれる。本明細書で使用されるとき、「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤を包含する。ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤は、非機能性ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣまたはＨＮＨドメイン）を含む不活性型ヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓクリベースまたはＣａｓニッカーゼは、例えば、ＦｏｋＩドメインとの融合を介して、ＤＮＡ切断を可能にするように修飾されたｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤を包含する。Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤には、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼには、さらにＲＮＡガイドＤＮＡクリベースまたはニッカーゼ活性を有するクラス２ Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、及びクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されている、クラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が含まれる。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾物が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５）は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照のこと。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。
Ｃａｓ９分子の例示的なヌクレオチド及びポリペプチド配列を以下に提供する。代替の天然に存在するバリアントを含む、Ｃａｓ９ポリペプチド配列をコードする代替のヌクレオチド配列を同定するための方法は、当該技術分野において既知である。本明細書に提供されるアミノ酸配列をコードするＣａｓ９核酸配列、アミノ酸配列、または核酸配列のうちのいずれかに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列も企図される。
Ｃａｓ９の例示的なオープンリーディングフレーム（配列番号１１２）
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Ｃａｓ９の例示的なアミノ酸配列（配列番号１１３）
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Ｃａｓ９の例示的なオープンリーディングフレーム（配列番号１１４）
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本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）とともに含むガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的配列へとガイドし、ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズし、薬剤が標的配列に結合し、その場合、この薬剤はクリベースまたはニッカーゼであり、結合の後に切断またはニッキングを行うことができる。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する、すなわち、ガイド配列に対してガイド配列の特異的結合を可能にするのに十分に相補的である、標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に（薬剤の活性に応じて）ニックを形成するか、または切断するように指向される。
本明細書で使用される場合、第２の配列に対する第１の配列のアラインメントにより、第２の配列の位置の全体での全てが第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列と「同一」であるか、または「１００％の同一性を有する」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧに対して１００％の同一性を有するが、その理由は、アラインメントが、第１の配列の３つの全ての位置においてギャップなしで一致があるという点で１００％の同一性を与えるからである。１００％未満の同一性は、通常の方法を使用して計算することができる。例えば、第１の配列の３つの位置のうちの２つが第２の配列と一致するため、ＡＣＧは、ＡＡＧＡと６７％の同一性を有するであろう（２／３＝６７％）。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、及び修飾ウリジンなどのヌクレオシド類似体の存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン；別の例は、シトシン及び５－メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Ｘがいずれかの修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである配列５’－ＡＸＧは、両方とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアラインメントアルゴリズムは、当該技術分野において周知である、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アラインメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズム及びパラメータ設定の選択が適切であるかを理解するであろう。一般的に類似する長さ及び予想される同一性がアミノ酸については５０％超の配列、またはヌクレオチドについては７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。
同様に、本明細書で使用される場合、第１の配列のヌクレオチドの全てが、ギャップなしで第２の配列に対して相補的であるとき、第１の配列は、第２の配列に対して「完全に相補的」または１００％相補的」であるとみなされる。例えば、配列ＵＣＵは、ギャップなしで、第１の配列からの核酸塩基の各々が第２の配列のヌクレオチドと塩基対合しているため、配列ＡＡＧＡに対して完全に相補的であるとみなされるであろう。配列ＵＧＵは、第１の配列の３つの核酸塩基のうちの２つが第２の配列の核酸塩基と塩基対合しているため、配列ＡＡＧＡに対して６７％相補的であるとみなされる。当業者は、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴインターフェース（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、任意の配列の対について相補性パーセントを決定するために、様々なパラメータ設定でアルゴリズムが利用可能であることを理解するであろう。
「ｍＲＮＡ」は、ポリペプチドへと翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能し得る）オープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体を含むリン酸糖骨格（例えば、２’－メトキシリボース残基）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。
本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物及び方法に有用な例示的なガイド配列を、表１及び本出願全体に示す。例えば、表１がガイド配列を示す場合、このガイド配列をガイドＲＮＡで使用して、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を標的配列に指向することができる。標的配列は、ゲノム座標として表１に提供され、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体）の両方を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかである多数のヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。
本明細書で使用される場合、「発現を阻害する」は、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはその両方）の発現の減少を指す。タンパク質（すなわち、遺伝子産物）の発現は、目的の組織または細胞集団からのタンパク質の総細胞量を、細胞集団の個々のメンバーとしてのタンパク質の発現を、例えば、タンパク質を発現する細胞のパーセントを定義するための細胞選別によって、または集団中の細胞におけるタンパク質の発現を、例えば、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロットによって、検出することによって測定することができる。発現の阻害は、全長遺伝子産物または任意の遺伝子産物が、もはや発現されなくなるような、遺伝子配列、例えば、ゲノム配列の遺伝子修飾、例えば、遺伝子のノックダウンから生じ得る。特定の遺伝子修飾は、全長遺伝子産物の翻訳を妨げるフレームシフトまたはナンセンス変異の導入をもたらし得る。スプライス部位、例えば、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位に十分に近い位置での遺伝子修飾は、スプライシングを破壊するために、全長タンパク質の翻訳を妨げることができる。発現の阻害は、遺伝子産物、例えば、プロモーター配列、３’ＵＴＲ配列、例えば、キャッピング配列、５’ＵＴＲ配列、例えば、ポリＡ配列の発現に必要なゲノム配列内の調節配列における遺伝子修飾に起因し得る。また、発現の阻害は、遺伝子産物の翻訳に必要な調節因子の発現または活性、例えば、遺伝子産物の産生を妨げることに起因し得る。例えば、全長転写因子の発現を阻害する転写因子配列の遺伝子修飾は、下流効果を有し、転写因子によって制御される１つ以上の遺伝子産物の発現の発現を阻害することができる。したがって、発現の阻害は、ゲノムまたはｍＲＮＡ配列の変化によって予測することができる。したがって、発現の阻害をもたらすと予想される変異は、目的の組織または細胞集団から単離されたｍＲＮＡのシークエンシングを含む既知の方法によって検出することができる。発現の阻害は、タンパク質の所定の発現レベル、すなわち、少なくとも特定のレベルで目的のタンパク質を発現する集団内の細胞のパーセントまたは数の減少を有する集団内の細胞のパーセントとして決定することができる。発現の阻害はまた、例えば、細胞または組織試料、例えば、生検試料における全体的なタンパク質レベルの減少を決定することによって評価することができる。特定の実施形態では、分泌タンパク質の発現の阻害は、流体試料、例えば、細胞培地または体液中で評価することができる。タンパク質は、タンパク質レベルの分析を可能にするために、体液、例えば、血液または尿中に存在し得る。特定の実施形態では、タンパク質レベルは、タンパク質活性または代謝産物のレベル、例えば、尿または血液中のタンパク質活性または代謝産物のレベルによって決定され得る。いくつかの実施形態では、「発現の阻害」は、特定の遺伝子産物の発現のいくつかの喪失、例えば、転写されるｍＲＮＡの量の減少、または細胞集団によって発現されるタンパク質の量の減少を指し得る。いくつかの実施形態では、「阻害」は、特定の遺伝子産物、例えば、細胞表面におけるＴＩＭ３遺伝子産物の発現のある程度の喪失を指し得る。ノックダウンのレベルは、同じタイプの対象試料における開始レベルに対して相対的であることが理解される。例えば、タンパク質レベルのルーチンモニタリングは、組織試料（例えば、生検試料）よりも、対象（例えば、血液または尿）からの流体試料においてより容易に実施される。ノックダウンのレベルは、アッセイされている試料についてであることが理解される。同様に、連続した組織試料、例えば、肝臓組織が得られ得る動物研究において、ノックダウン標的は、他の組織において発現され得る。したがって、ノックダウンのレベルは、必ずしも全身的なノックダウンのレベルではなく、試料採取される組織、細胞型、または流体内のノックダウンのレベルである。
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９系によって誘導される、ＤＮＡレベルでの変化である。遺伝子修飾は、典型的には、定義された配列またはゲノム遺伝子座内で、挿入、欠失、または置換（すなわち、塩基配列置換、すなわち、変異）を含み得る。遺伝子修飾は、ＤＮＡの核酸配列を変化させる。遺伝子修飾は、単一のヌクレオチド位置にあり得る。遺伝子修飾は、複数のヌクレオチド、例えば、２、３、４、５個以上のヌクレオチド、典型的には、互いに近接している、例えば、連続ヌクレオチドであってよい。遺伝子修飾は、コード配列、例えば、エクソン配列内にあり得る。遺伝子修飾は、スプライス部位、すなわち、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位に十分に近い位置にあり、スプライシングを破壊することができる。遺伝子修飾は、ゲノム遺伝子座に内因性ではないヌクレオチド配列の挿入、例えば、異種のオープンリーディングフレームまたは遺伝子のコード配列の挿入を含むことができる。本明細書で使用される場合、好ましくは、遺伝子修飾は、ゲノム遺伝子座の遺伝子修飾の前に、全長タンパク質のアミノ酸配列を有する全長タンパク質の翻訳を防止する。全長タンパク質または遺伝子産物の翻訳の防止は、任意の長さのタンパク質または遺伝子産物の翻訳の防止を含む。例えば、早期終止コドンの生成をもたらすフレームシフト変異によって、またはナンセンス変異の生成によって、全長タンパク質の翻訳を防止することができる。全長タンパク質の翻訳は、スプライシングの破壊によって防止することができる。
本明細書で使用される場合、「異種コード配列」は、細胞内の外因性ソースとして導入された（例えば、ＴＣＲ遺伝子座を含むセーフハーバー遺伝子座などのゲノム遺伝子座に挿入された）コード配列を指す。すなわち、導入されたコード配列は、少なくともその挿入部位に関して異種である。そのような異種コード配列遺伝子から発現されるポリペプチドは、「異種ポリペプチド」と称される。異種コード配列は、天然に存在するか、または操作することができ、野生型またはバリアントであり得る。異種コード配列は、異種ポリペプチドをコードする配列（例えば、内部リボソーム侵入部位）以外のヌクレオチド配列を含み得る。異種コード配列は、野生型またはバリアント（例えば、変異体）として、ゲノム内で天然に存在するコード配列であり得る。例えば、細胞は（野生型またはバリアントとして）目的のコード配列を含有するが、同じコード配列またはそのバリアントを、例えば、高発現の遺伝子座での発現のための外因性ソースとして導入することができる。異種ｇコード配列はまた、ゲノム中に天然に存在しないか、またはゲノム中に天然に存在しない異種ポリペプチドを発現するコード配列であり得る。「異種コード配列」、「外因性コード配列」、及び「導入遺伝子」は、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、異種コード配列または導入遺伝子は、外因性核酸配列を含み、例えば、核酸配列は、レシピエント細胞に内因性ではない。いくつかの実施形態では、異種コード配列または導入遺伝子は、外因性核酸配列、例えば、レシピエント細胞内に天然に存在しない核酸配列を含む。例えば、異種コード配列は、その挿入部位に関して、及びそのレシピエント細胞に関して異種であり得る。
「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が細胞に著しい有害な影響を及ぼすことなく挿入され得るゲノム内の遺伝子座である。本明細書で使用するためにヌクレアーゼ（複数可）によって標的とされるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１ Ｒ１２Ｃ）、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＲＣ遺伝子、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子などのノックダウンを標的とする遺伝子座または遺伝子座（複数）における挿入は、細胞にとって有利である。他の好適なセーフハーバー遺伝子座は、当該技術分野において既知である。
本明細書で使用される場合、「標的化受容体」は、細胞、例えば、Ｔ細胞の表面上に存在して、標的部位、例えば、生物内の特定の細胞または組織への細胞の結合を可能にする受容体を指す。標的化受容体としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びタンパク質の細胞外受容体部分の結合時にＴ細胞を活性化することができる内部シグナル伝達ドメイン内の少なくとも膜貫通ドメインを通して作動可能に連結された細胞表面分子の受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体は、細胞外抗原認識ドメイン、例えば、抗原が結合されるときにＴ細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に連結される、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ナノボディを指す。ＣＡＲは、抗原認識ドメイン、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの４つの領域で構成される。そのような受容体は、当該技術分野において周知である（例えば、各々の内容の対応する部分が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０２００９２０５７、ＷＯ２０１９１９１１１４、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１８２０８８３７を参照のこと）。アダプター分子を介した標的細胞への免疫細胞の結合を促進する逆ユニバーサルＣＡＲ（例えば、その内容全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９２３８７２２を参照のこと）も企図される。ＣＡＲは、抗体が開発され得る任意の抗原を標的とすることができ、典型的には、標的とされる細胞または組織の表面上に表示される分子を対象とする。
本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患または障害のための投与または治療の任意の適用を指し、その疾患を阻害すること、その進行を止めること、その疾患の１つ以上の症状を緩和すること、その疾患を治癒させること、その疾患の１つ以上の症状を防止すること、またはその疾患の１つ以上の症状の再発を防止することを含む。自己免疫応答または炎症応答または障害を治療することは、疾患特異的症状の緩和をもたらす特定の障害に関連する炎症を緩和することを含み得る。本明細書に記載される操作されたＴ細胞による治療は、追加の治療薬、例えば、治療される適応症の標準的なケアの前、後、またはそれと組み合わせて使用され得る。
ヒト野生型ＴＩＭ３配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８４８６８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３５０７７で利用可能である。ＴＩＭ３ ３、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３、腎臓傷害分子－３、ＣＤ３６６抗原、ＣＤ３６６、ＫＩＭ－３、ＳＰＴＣＬ、Ｔｉｍ－３、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質、Ｔ細胞免疫グロブリンムチンファミリーメンバー、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン受容体、Ｔ細胞膜タンパク質、ＨＡＶｃｒ－２、ＴＩＭＤ－３、及びＴＩＭＤ３は、ＴＩＭ－３の遺伝子同義語である。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞における受容体を指す。一般に、ＴＣＲは、２つのＴＣＲポリペプチド鎖、α及びβを含有するヘテロ二量体受容体分子である。α及びβ鎖ＴＣＲポリペプチドは、様々なＣＤ３分子と複合体化し、抗原結合後に炎症及び自己免疫を含む免疫応答（複数可）を誘発することができる。本明細書で使用される場合、ＴＣＲのノックダウンは、任意のＴＣＲ遺伝子の部分的または全体的なノックダウン、例えば、単独で、または他のＴＣＲ遺伝子（複数可）の部分的または全体のノックダウンとの組み合わせで、ＴＲＢＣ１遺伝子の一部の欠失を指す。
「ＴＲＡＣ」は、Ｔ細胞受容体α鎖を指すために使用される。ヒト野生型ＴＲＡＣ配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８７５５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２７７７３４で利用可能である。Ｔ細胞受容体アルファ定数、ＴＣＲＡ、ＩＭＤ７、ＴＲＣＡ及びＴＲＡは、ＴＲＡＣの遺伝子同義語である。
「ＴＲＢＣ」は、Ｔ細胞受容体β鎖、例えば、ＴＲＢＣ１及びＴＲＢＣ２を指すために使用される。「ＴＲＢＣ１」及び「ＴＲＢＣ２」は、Ｔ細胞受容体β鎖をコードする２つの相同遺伝子を指し、これらは、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２遺伝子の遺伝子産物である。
ヒト野生型ＴＲＢＣ１配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８６３９；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１７５１で利用可能である。Ｔ細胞受容体ベータ定数、Ｖ＿セグメント翻訳産物、ＢＶ０５Ｓ１Ｊ２．２、ＴＣＲＢＣ１、及びＴＣＲＢは、ＴＲＢＣ１の遺伝子同義語である。
ヒト野生型ＴＲＢＣ２配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８６３８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１７７２で利用可能である。Ｔ細胞受容体ベータ定数、Ｖ＿セグメント翻訳産物、及びＴＣＲＢＣ２は、ＴＲＢＣ２の遺伝子同義語である。
「Ｔ細胞」は、抗原への曝露後の免疫応答において中心的な役割を果たす。例えば、Ｔ細胞が、エンジニアリングによって、例えば、幹細胞から、または分化転換によって、例えば、体細胞をリプログラミングすることによって形成されるとき、Ｔ細胞は、天然に存在し得るか、または非天然であり得る。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって他のリンパ球と区別することができる。この定義には、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、及び調節ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、従来の適応性Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連不変Ｔ細胞、及びガンマデルタＴ細胞を含む自然様Ｔ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋である。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ」または「ＭＨＣタンパク質」は、主要な組織適合性複合体分子（または複数）を指し、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）ならびにＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ヒトにおけるＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲ）を含む。
「ＣＩＩＴＡ」または「ＣＩＩＴＡ」または「Ｃ２ＴＡ」は、本明細書で使用される場合、「クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿００００１６．１０（範囲１０８６６２０８．．１０９４１５６２）、参照ＧＲＣｈ３８．ｐ１３を有する。核内のＣＩＩＴＡタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子転写の陽性調節因子として作用し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質発現に必要である。
「β２Ｍ」または「Ｂ２Ｍ」は、本明細書で使用される場合、「β－２ミクログロブリン」の核酸配列またはタンパク質配列を指し、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿００００１５（範囲４４７１１４９２．．４４７１８８７７）、参照ＧＲＣｈ３８．ｐ１３を有する。Ｂ２Ｍタンパク質は、核化細胞の表面上のヘテロ二量体としてＭＨＣクラスＩ分子と関連しており、ＭＨＣクラスＩタンパク質発現に必要である。
「ＨＬＡ－Ａ」という用語は、ＨＬＡ－Ａタンパク質の文脈で本明細書で使用される場合、重鎖（ＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされる）及び軽鎖（すなわち、ベータ－２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である、ＭＨＣクラスＩタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ－Ａ」または「ＨＬＡ－Ａ遺伝子」という用語は、核酸の文脈で本明細書で使用される場合、ＨＬＡ－Ａタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、「ＨＬＡクラスＩ組織適合性、Ａアルファ鎖」とも称され、ヒト遺伝子は、受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（２９９４２５３２．．２９９４５８７０）を有する。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、集団全体にわたって何千もの異なるバージョン（「対立遺伝子とも称される）を有することが知られている（また個体は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を受け取ることができる）。配列情報を含むＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の公開データベースは、ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／でアクセスすることができる。ＨＬＡ－Ａの全ての対立遺伝子は、「ＨＬＡ－Ａ」及び「ＨＬＡ－Ａ遺伝子」という用語によって包含される。
本明細書で使用される場合、「ゲノム座標内」という用語は、与えられたゲノム座標範囲の境界を含む。例えば、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３が与えられた場合、座標ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３が包含される。本出願を通して、参照されるゲノム座標は、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能なゲノム参照コンソーシアムからのヒトゲノムのＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８とも称される）アセンブリにおけるゲノム注釈に基づいている。１つのアセンブリと別のアセンブリとの間でゲノム座標を変換するためのツール及び方法は、当該技術分野において既知であり、同じ機関によって、または同じアルゴリズムを使用して生成された以前のアセンブリへの変換（例えば、ＧＲＣｈ３８からＧＲＣｈ３７への）、及び異なる機関またはアルゴリズムによって生成されたアセンブリの変換（例えば、ＧＲＣｈ３８から国際ヒトゲノムシークエンシングコンソーシアムによって生成されたＮＣＢＩ３３への）を含む、本明細書に提供されるゲノム座標をヒトゲノムの別のアセンブリの対応する座標に変換するために使用され得る。当該技術分野において既知の利用可能な方法及びツールとしては、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能なＮＣＢＩゲノム再マッピングサービス、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｅｒのウェブサイトで入手可能なＵＣＳＣ ＬｉｆｔＯｖｅｒ、及びＥｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇのウェブサイトで入手可能なＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「スプライス部位」は、アクセプタースプライス部位もしくはドナースプライス部位（以下に定義する）を構成する３個のヌクレオチド、またはスプライス部位の一部である当該技術分野で既知の任意の他のヌクレオチドを指す。例えば、Ｂｕｒｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（２１）：４３６４－４３７５（２０００）（乳類ゲノムにおけるカノニカル及び非標準的なスプライス部位を記載する）を参照のこと。「アクセプタースプライス部位」を構成する３個のヌクレオチドは、イントロンの３’における２つの保存された残基（例えば、ヒトにおけるＡＧ）及び境界ヌクレオチド（すなわち、ＡＧのエクソン３’の第１のヌクレオチド）である。アクセプタースプライス部位の「スプライス部位境界ヌクレオチド」は、以下の図では「Ｙ」と表記され、本明細書では「アクセプタースプライス部位境界ヌクレオチド」または「スプライスアクセプター部位境界ヌクレオチド」とも称され得る。「アクセプタースプライス部位」、「スプライスアクセプター部位」、「アクセプタースプライス配列」、または「スプライスアクセプター配列」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
「ドナースプライス部位」を構成する３個のヌクレオチドは、イントロン及び境界ヌクレオチド（すなわち、ＧＴのエクソン５’の第１のヌクレオチド）の５’末端における２つの保存された残基（例えば、ヒトにおけるＧＴ（遺伝子）またはＧＵ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡなどのＲＮＡにおける）である。ドナースプライス部位の「スプライス部位境界ヌクレオチド」は、以下の図では「Ｘ」と表記され、本明細書では「ドナースプライス部位境界ヌクレオチド」または「スプライスドナー部位境界ヌクレオチド」とも称され得る。「ドナースプライス部位」、「スプライスドナー部位」、「ドナースプライス配列」、または「スプライスドナー配列」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。

ＩＩ．組成物
Ａ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物
ＤＮＡ配列を改変する、例えば、ガイドＲＮＡをＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）とともに使用して、ＴＩＭ３遺伝子内で一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するのに有用な組成物が本明細書に提供される。ＴＩＭ３遺伝子を標的とするガイド配列は、表１に配列番号１～８８で示され、そのようなガイドＲＮＡが標的とするゲノム座標も同様である。
表１に配列番号１～８８で示される各々のガイド配列は、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２００）。
ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０１）。
ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２０２）。
ｓｇＲＮＡの場合、ガイド配列は、以下の修飾モチーフｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）に組み込まれてもよく、ここで、「Ｎ」は、任意の天然または非天然ヌクレオチド、好ましくはＲＮＡヌクレオチドであり得、ヌクレオチドの糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換を有する同様の化合物であり得、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、＊は、ヌクレオチド残基間のホスホロチオエート連結であり、Ｎは、集合的にガイド配列のヌクレオチド配列である。
ｓｇＲＮＡの場合、ガイド配列は、ＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ配列をさらに含んでいてもよい。ＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ配列の例は、ガイド配列の３’末端に含まれる以下の表（配列番号２０１ ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－「例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１」）に示され、以下の表に示されるようなドメインを備えている。ＬＳは、下部ステムである。Ｂは、バルジである。ＵＳは、上部ステムである。Ｈ１及びＨ２は、それぞれ、ヘアピン１及びヘアピン２である。Ｈ１及びＨ２は、総称して、ヘアピン領域と称される。構造のモデルは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９２３７０６９の図１０Ａに提供される。
例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１のヌクレオチド配列は、特定の化学修飾、配列置換及び切断のためのテンプレート配列として機能し得る。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡであり、任意選択で、化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｓｇＲＮＡは、ガイド配列及びＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ配列、例えば、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１を含む。ｓｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、ガイド配列の５’末端またはガイド配列の３’末端、例えば、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１、末端ヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば、３’末端または５’末端におけるヌクレオチドのうちの１、２、３、または４つにおける修飾を含み得る。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）連結、及び反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ＰＳ連結を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド及びＰＳ連結を含む。
特定の実施形態では、（配列番号２０１「例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１」）を例として使用して、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１は、以下のうちの１つ以上をさらに含む。
Ａ．短縮されたヘアピン１領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン１領域であって、
１．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、またはＨ１－４及びＨ１－９のうちの少なくとも１つが、ヘアピン１においてワトソン－クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、ヘアピン１領域が、任意選択で、
ａ．Ｈ１－５～Ｈ１－８のうちのいずれか１つもしくは２つ、
ｂ．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、ならびにＨ１－４及びＨ１－９のうちの１つ、２つ、もしくは３つ、または
ｃ．ヘアピン１領域の１～８個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
２．短縮されたヘアピン１領域が、４～８個のヌクレオチド、好ましくは４～６個のヌクレオチドを欠いており、
ａ．位置Ｈ１－１、Ｈ１－２、もしくはＨ１－３のうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１に対して欠失もしくは置換されているか、または
ｂ．位置Ｈ１－６～Ｈ１－１０のうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１に対して置換されているか、あるいは
３．短縮されたヘアピン１領域が、５～１０個のヌクレオチド、好ましくは５～６個のヌクレオチドを欠いており、位置Ｎ１８、Ｈ１－１２、もしくはｎのうちの１つ以上が、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１に対して置換されている、短縮されたヘアピン１領域、あるいは
Ｂ．短縮された上部ステム領域であって、短縮された上部ステム領域が、１～６個のヌクレオチドを欠いており、短縮された上部ステム領域の６、７、８、９、１０、または１１個のヌクレオチドが、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１に対して４個以下の置換を含む、短縮された上部ステム領域、あるいは
Ｃ．ＬＳ６、ＬＳ７、ＵＳ３、ＵＳ１０、Ｂ３、Ｎ７、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｈ２－２及びＨ２－１４のうちのいずれか１つ以上における例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１と比較した置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、置換、あるいは
Ｄ．上部ステム領域を有する例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１であって、上部ステム修飾が、上部ステム領域におけるＵＳ１～ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含み、
１．修飾ヌクレオチドが、任意選択で、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、もしくはそれらの組み合わせから選択されるか、または
２．修飾ヌクレオチドが、任意選択で、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１。
特定の実施形態では、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１（配列番号２０１）、または例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１を含むｓｇＲＮＡなどのｓｇＲＮＡは、３’テール、例えば、１、２、３、４個、またはそれ以上のヌクレオチドの３’テールをさらに含む。特定の実施形態では、テールは、１個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド間にＰＳ連結を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間にＰＳ連結を含む。
特定の実施形態では、ヘアピン領域は、１個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、上部ステム領域は、１個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１は、１つ以上のＹＡジヌクレオチドを含み、Ｙは、ピリミジンであり、ＹＡジヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）連結、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１は、１つ以上のＹＡジヌクレオチドを含み、Ｙは、ピリミジンであり、ＹＡジヌクレオチドは、置換ヌクレオチド、すなわち、配列置換ヌクレオチドを含み、ピリミジンは、プリンで置換される。特定の実施形態において、ピリミジンが単一ガイド内にワトソン－クリック塩基対を形成するとき、置換されたピリミジンヌクレオチドのワトソン－クリックベースのヌクレオチドは、ワトソン－クリック塩基対を維持するために置換される。











いくつかの実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）であってもよいＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を、ＴＩＭ３中の標的ＤＮＡ配列に指向させるガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を提供する。ｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、例えばｓｇＲＮＡとして、表１に示されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５から選択されるガイド配列を含み得る。ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列、任意選択で、配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または１００％の同一性を有する配列を含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列、任意選択で、配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または１００％の同一性を有するガイド配列を含む。ｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載される各実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として、または別個のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上で会合したｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含んでいてもよい。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。
本明細書に記載される各々の実施形態では、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子と、を含む。第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子は共有結合していなくてもよいが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によってＲＮＡ二本鎖を形成してもよい。
本明細書に記載される各々の実施形態では、ガイドＲＮＡは、「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として単一のＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列、あるいはｔｒＲＮＡに共有結合された、配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５から選択されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（もしくはその部分）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列の１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；もしくは配列番号１５から選択されるガイド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によって、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合される。
いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、先端切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存する。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００個より多いヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、例えば１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造などの特定の二次構造を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１～８８、好ましくは配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５のうちのいずれか１つのガイド配列を含む、１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号８９～１１１のうちのいずれか１つを含む１つ以上のｓｇＲＮＡを含む組成物を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号１～８８、好ましくは配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５の核酸のうちのいずれかと１００％、または少なくとも９５％もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ｇＲＮＡを含む組成物を提供する。
他の実施形態では、組成物は、配列番号１～８８、好ましくは配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５のガイド配列のうちのいずれか２つ以上から選択されるガイド配列を含む、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１～８８、好ましくは配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５の核酸のうちのいずれかと１００％、または少なくとも９５％もしくは９０％同一のガイド配列を各々が含む、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
本発明のガイドＲＮＡ組成物は、ＴＩＭ３遺伝子内の標的配列を認識する（例えば、それに対してハイブリダイズする）ように設計される。例えば、ＴＩＭ３標的配列は、ガイドＲＮＡを含む提供されるＣａｓ開裂によって認識され、切断され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリベースは、ガイドＲＮＡをＴＩＭ３遺伝子の標的配列に対して指向させてもよく、ガイドＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリベースは、標的配列を切断する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＴＩＭ３遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、遺伝子の特定の領域における変異（例えば、ヌクレアーゼ媒介性ＤＳＢの結果として生じるインデル、すなわち挿入または欠失に起因するフレームシフト変異）は、遺伝子の他の領域における変異よりも許容性が低くてもよく、したがって、ＤＳＢの位置は、もたらされ得るタンパク質ノックダウンの量または種類における重要な因子である。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＴＩＭ３遺伝子内の特定の位置に指向させるために使用される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＩＭ３のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、またはエクソン８内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するガイド配列を有するように設計されている。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ヒトＴＩＭ３遺伝子内に存在する標的配列または標的配列の逆相補体と１００％、または少なくとも９５％もしくは９０％同一である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡのガイド配列に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１００％相補的であるか、または同一であり得る。他の実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、少なくとも１個のミスマッチを含んでいてもよい。例えば、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列の全長は、約２０である。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１～４個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。
Ｂ．修飾ｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されている。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然または天然に存在する成分または構造の存在を記載するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格連結における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の１つもしくは両方、または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換え、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖及び／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。
上に列挙されるものなどの化学修飾を組み合わせて、２、３、４、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの各々の塩基は修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエートなどの修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１、２、３、またはそれ以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）が、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるものによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様において、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、例えば、細胞内または血清に由来するヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボとエクスビボの両方において細胞集団に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン（特にインターフェロン）発現及び放出の誘導及び細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞応答を含む。
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾された残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって代置することによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾は、帯電していないリンカーまたは非対称な電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
修飾されたリン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書においてＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による置き換えによってもまた修飾できる。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。
リン酸基は、特定の主鎖修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、帯電したリン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例は、非限定的に、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スフホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンオキシメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）を含み得る。
リン酸リンカー及びリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられている、核酸を模倣することができる足場もまた構築できる。そのような修飾は、骨格及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例は、非限定的に、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替物を含み得る。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基に対する１つ以上の修飾、すなわち糖修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されていてもよく、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが２’－アルコキシドイオンを形成するように脱プロトン化されることがもはや起こり得ないため、核酸の安定性を増強し得る。
２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中「Ｒ」がアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲであって式中Ｒが、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり、ｎが０～２０の整数であり得るもの（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基をフッ素で置き換える２’－フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えばＣ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレン架橋を介して同一のリボース糖の４’炭素へと接続し得る「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよく、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、Ｏ－アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）、及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ－アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠失している「アンロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。
「デオキシ」２’修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（ここでアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（ここでアミノは、例えば、本明細書において記載されるようなものである）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここでＲは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含み得、任意選択で、例えば本明細書において記載されるようなアミノによって置換されていてもよい。
糖修飾は、１つ以上の炭素を含み、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の１つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖、例えばＬ－ヌクレオシドを含み得る。
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書に記載される修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことのできる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、またはピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、及び塩基の合成誘導体を含み得る。
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの一方または両方の末端に存在してもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態では、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端における１つ以上の残基が化学修飾され得るか、または内部ヌクレオシドが修飾され得るか、またはｓｇＲＮＡ全体が化学修飾され得る。特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。特定の実施形態は、５’末端修飾及び３’末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、２０１７年１２月８日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ」という発明の名称のＷＯ２０１８／１０７０２８（Ａ１）に開示された修飾パターンの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、ＵＳ２０１７０１１４３３４号に開示された構造／修飾パターンの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、ＷＯ２０１７／１３６７９４に開示された構造／修飾パターンのうちの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、本明細書に示される修飾パターンのうちのいずれかを含み、ここでＮは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体は、例えば、表１で本明細書に記載されるＴＩＭ３ガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｓｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）を含み、ここで「Ｎ」は、任意の天然または非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎの全体は、表１に記載されるＴＩＭ３ガイド配列を含む。例えば、Ｎは、表１に本明細書で開示されるガイド配列のうちのいずれかで置き換えられ、任意選択で、Ｎは、配列番号１～８８、または配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８；配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８；配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７；配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７；配列番号１～４；配列番号２、４、及び１５；配列番号２、４、１５、６３、及び８７；配列番号２及び１５；配列番号６３及び８７；または配列番号１５で置き換えられる。
以下に記載される修飾のいずれも、本明細書に記載されるｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ内に存在し得る。
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを表すために使用され得る。
２’－Ｏ－メチルの修飾は、以下のように描写され得る。

ヌクレオチド糖環に影響を及ぼすことが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。
本出願では、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語を使用して、２’－Ｆで置換されたヌクレオチドを表すことができる。
２’－Ｆの置換は、以下のように描写され得る。
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合とは、ホスホジエステル連結、例えばヌクレオチド塩基間の結合での１個の非架橋リン酸酸素を硫黄が置換する結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドは、Ｓ－オリゴとも称され得る。
ＰＳ修飾を示すために、「＊」を使用し得る。本出願では、用語Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊を使用して、ＰＳ結合で隣りの（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すことができる。
本出願では、「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」という用語を使用して、２’－Ｏ－Ｍｅで置換され、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すことができる。
以下の図は、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生じる、非架橋リン酸酸素へのＳ－の置換を示す。
脱塩基ヌクレオチドは、窒素系塩基を欠いているものを指す。以下の図は、塩基を欠く脱塩基（脱プリンとしても知られる）部位を有するオリゴヌクレオチドを描写する。
反転した塩基は、通常の５’から３’への連結から反転した連結を有するものを指す（すなわち、５’から５’への連結または３’から３’への連結のいずれか）。例えば、
脱塩基ヌクレオチドは、反転した連結と結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’連結を介して末端５’ヌクレオチドに結合してもよいし、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’連結を介して末端３’ヌクレオチドに結合してもよい。末端５’または３’ヌクレオチドのいずれかにおける反転した脱塩基ヌクレオチドはまた、反転した脱塩基末端キャップと称され得る。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上、及び３’末端部における最後の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、反転した脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性もしくは性能を増加させることが当該技術分野において周知の他のヌクレオチド修飾である。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を用いて連結される。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）に示される修飾パターンを含み、ここでＮは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体は、ＴＩＭ３内の標的配列に対してヌクレアーゼを指向させるガイド配列（例えば、表１に示されるゲノム座標）を含む。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～８８のガイド配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの保存された部分、例えば、例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１として示されるｓｇＲＮＡの保存された部分、または表２及び本明細書全体で示されるｇＲＮＡの保存された部分を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１～８８のガイド配列及びＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２０２）のヌクレオチドのうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを含み、ここでヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端にあり、ｓｇＲＮＡは、本明細書または配列ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｍｕ（配列番号３００）に示されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、本明細書で提供される例示的なＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ－１及びその修飾バージョン、またはＮの全体が、標的配列にヌクレアーゼを指向させるガイド配列を含む、以下の表３に提供されるバージョンを含む。各Ｎは、独立して、修飾されているか、または非修飾である。特定の実施形態では、修飾の表示がない場合、ヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡヌクレオチド残基、すなわち、リボース糖及びホスホジエステル骨格である。

上述のように、いくつかの実施形態では、本明細書において開示される組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが修飾されていることを示すための略語として使用される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡまたは修飾ＯＲＦは、少なくとも１つ、複数、または全てのウリジン位置に、修飾ウリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、５位で修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、１位で修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンとＮ１－メチル－プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルプソイドウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンとＮ１－メチル－プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５－ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。５’キャップは、一般に、ｍＲＮＡの５’－３’鎖の第１のヌクレオチド（すなわち、第１のキャップ近位のヌクレオチド）の５’位に対して５’－トリホスフェートを介して連結した７－メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関して、以下に考察されるようにさらに修飾されてもよい）である。Ｃａｐ０において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１において、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシを含む。Ｃａｐ２において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１１１（３３）：１２０２５－３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照のこと。ヒトｍＲＮＡなどの哺乳動物ｍＲＮＡを含む、ほとんどの内因性の高級真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０、及びＣａｐ１及びＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素によって「非自己」として認識されるため、ヒトなどの哺乳動物において免疫原性である場合があり、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こし得る。ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップとのｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合があり、ｍＲＮＡの翻訳を潜在的に阻害する。
キャップは、共転写的に含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（抗逆キャップ類似体、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結する７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－トリホスフェートを含むキャップ類似体であり、開始時にインビトロで転写産物に組み込むことができる。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位のヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ７：１４８６－１４９５を参照のこと。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用して、Ｃａｐ１構造を共転写的に提供することができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化態様も、それぞれ、カタログ番号Ｎ－７４１３及びＮ－７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧの構造を以下に示す。

あるいは、転写後に、キャップをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａキャッピング酵素は市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ カタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、そのＤ１サブユニットによって与えられるＲＮＡトリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ活性、ならびにそのＤ１２サブユニットによって与えられるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０を与えるように、７－メチルグアニンをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，４０２３－４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２４４７２－２４４７９を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリ－Ａ）テールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニンを含み、任意選択で、３００個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。
Ｃ．リボ核タンパク質複合体
いくつかの実施形態では、表１からの１つ以上のガイド配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ、または表２からの１つ以上のｓｇＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む組成物を包含する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照のこと）、ならびにそれらの修飾（例えば、操作型または変異体）態様が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６０３１２１９８、ＵＳ２０１６０３１２１９９を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍもしくはＣｍｒ複合体、またはそのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはＣｍｒ２サブユニット、及びＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系に由来していてもよい。様々なＣＲＩＳＰＲ系及びＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。
Ｃａｓヌクレアーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤とともに含むｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼとともに含むｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９とともに含むｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインは、ＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、２つ以上のＲｕｖＣドメインまたは２つ以上のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用及び方法の実施形態の各々において、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導する。
いくつかの実施形態において、キメラＣａｓヌクレアーゼが使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１つのＤＮＡ鎖を切断して一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を生成することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作製する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で考察されるＣａｓヌクレアーゼ）の一態様である。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変の考察については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含有するように修飾される。例えば、薬剤タンパク質は、その核酸切断活性を低減させるために、ヌクレアーゼドメインの１つが変異されるか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低減したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低減したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または改変させるように置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照のこと。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、それぞれ、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列の反対側の鎖にニックを生成することによって（すなわち、ダブルニッキング）、ニッカーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、ダブルニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減し得る。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＤＮＡの反対側の鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡとともに使用され、標的ＤＮＡ内にダブルニックを産生する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ごく接近した位置にあるように選択された２つの別個のガイドＲＮＡとともに使用され、標的ＤＮＡ内にダブルニックを産生する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース及びニッカーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドは、触媒（クリベース／ニッカーゼ）活性を本質的に欠く一方で、ＤＮＡ結合活性を有する。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓポリペプチドは、ｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クリベース活性及びニッカーゼ活性を欠くＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、その触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、そのエンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）の一態様である。例えば、ＵＳ２０１４０１８６９５８、ＵＳ２０１５０１６６９８０を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種機能ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～１０個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合され得る。１個のＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端部またはＣ末端部で連結され得る。これをＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個以上のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じ（例えば、２個のＳＶ４０ ＮＬＳ）であってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端部で連結された２個のＳＶ４０ ＮＬＳの配列に融合される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合していてもよく、１つはＮ末端部に連結しており、１つはＣ末端部に連結している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳなしで融合され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、単節型配列、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１５）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１１６）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、双節型配列、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１１７）であってもよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１５）ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のＣ末端部で連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意選択で、融合部位に含まれる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞内半減期を修正することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が増加し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が低減し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を低減させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして機能し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素によって媒介され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってもよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激遺伝子－１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子－１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞が発現する発達的に下方制御されたタンパク質－８（ＮＥＤＤ８、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー－８（ＡＴＧ８）及び－１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜固定ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチン折りたたみ修飾因子－１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質－５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、マーカードメインであってもよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であってもよい。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグまたはエピトープタグであってもよい。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ－Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を特異的なオルガネラ、細胞型、組織、または臓器に標的化し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をミトコンドリアに標的化し得る。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、エフェクタードメインであってもよい。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤がその標的配列に指向されるとき、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼが、ｇＲＮＡによって標的配列に指向されるとき、エフェクタードメインは、標的配列を修飾するか、または影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインから選択され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－６（２０１３）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ １５４：４４２－５１（２０１３）を参照のこと。したがって、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、本質的に、ガイドＲＮＡを使用して所望の標的配列に結合するように指向され得る転写因子になる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、デアミナーゼ、例えばシチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼである。特定の実施形態では、異種機能ドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼなどのＣ－Ｔ塩基変換子（シチジンデアミナーゼ）である。
Ｄ．ｇＲＮＡの有効性の決定
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの有効性は、送達されたとき、またはＲＮＰを形成する他の構成要素とともに発現されたときに決定される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９とともに発現される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼを既に安定に発現する細胞株に送達されるか、またはその細胞株において発現される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＰの一部として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼをコードするｍＲＮＡとともに細胞に送達される。
本明細書に記載される場合、本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの使用は、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を生じる場合があり、細胞機構による修復時に挿入／欠失（インデル）変異の形態でエラーを生じ得る。インデルに起因する多くの変異は、リーディングフレームを改変するか、または未成熟終止コドンを導入し、したがって、非機能性タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、Ｃａｓ９を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞である（ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、一次ヒトＴ細胞などのＴ細胞である。一次細胞を使用することに関して、市販の一次ヒト肝細胞を使用して、実験間のより高い一貫性を提供することができる。いくつかの実施形態では、インビトロモデルにおいて（例えば、Ｔ細胞において）欠失または挿入が起こるオフターゲット部位の数は、例えば、インビトロでＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡでトランスフェクトされた細胞からゲノムＤＮＡを分析することによって決定される。いくつかの実施形態では、そのような決定は、インビトロでＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びドナーオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することを含む。そのような決定のための例示的な手順を、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＢＭＣ、及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を使用する作業実施例に提供する。
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡの有効性は、ｇＲＮＡ選択プロセスのための複数のインビトロ細胞モデルにわたって決定される。いくつかの実施形態では、選択されたｇＲＮＡとのデータの細胞株比較が行われる。いくつかの実施形態では、複数の細胞モデルで交差スクリーニングを実施する。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、ＴＩＭ３のインデルパーセントまたは遺伝子修飾パーセントによって測定される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、ＴＩＭ３遺伝子座におけるインデルパーセントまたは遺伝子修飾パーセントによって測定される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、表１または表２のゲノム座標におけるＴＩＭ３のインデルパーセントまたは遺伝子修飾パーセントによって測定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の編集パーセントを、ＴＩＭ３タンパク質産物のノックダウンを達成するために必要なインデルまたは遺伝子修飾のパーセントと比較する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、ＴＩＭ３タンパク質の発現の低減または排除によって測定される。実施形態では、当該ＴＩＭ３タンパク質の発現の低減または排除は、例えば、本明細書に記載されるようなフローサイトメトリーによって測定されるようなものである。
いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３タンパク質発現は、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、細胞集団において低減または排除される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非修飾細胞集団に対してフローサイトメトリーによって測定される場合、少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のＴＩＭ３陰性である。
「非修飾細胞」（または「非修飾細胞（複数）」）は、実験または試験における同じタイプの細胞の対照細胞（または細胞（複数））を指し、「非修飾」対照細胞は、ＴＩＭ３ガイドと接触していない。したがって、非修飾細胞（または細胞（複数））は、ガイドＲＮＡと接触していない細胞、またはＴＩＭ３を標的としないガイドＲＮＡと接触している細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におけるインデルまたは遺伝子修飾の数または頻度によって測定される。いくつかの実施形態では、細胞集団において、または標的部位におけるインデル生成の頻度に対して、非常に低い頻度（例えば、５％未満）で、オフターゲット部位でインデルを生成する有効なガイドＲＮＡが提供される。したがって、本開示は、標的細胞型（例えば、Ｔ細胞）においてオフターゲットインデル形成を示さないか、または細胞集団において、または標的部位でのインデル生成の頻度に対して、オフターゲットインデル形成の頻度が５％未満であるガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞型（例えば、Ｔ細胞）において任意のオフターゲットインデル形成を示さないガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、５個未満のオフターゲット部位においてインデルを生成するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、４、３、２、または１個未満または以下のオフターゲット部位（複数可）においてインデルを生成するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、オフターゲット部位（複数可）は、標的細胞（例えば、肝細胞）ゲノム内のタンパク質コード領域内では発生しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集事象を検出すること、例えば、挿入／欠失（「インデル」）変異の形成、及び標的ＤＮＡにおける挿入または相同性誘導修復（ＨＤＲ）事象は、タグ化プライマーを用いた線形増幅及びタグ化増幅産物の単離を利用する（本明細書ではこれ以降、「ＬＡＭ－ＰＣＲ」または「線形増幅（ＬＡ）」法と称される）。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、遺伝子の発現されたタンパク質産物を含む機能的タンパク質複合体のレベルによって測定される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、編集された細胞の生体集団がＴＣＲの喪失について分析されるＴＣＲ発現のフローサイトメトリー分析によって測定される。
Ｅ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態では、例えば、ＴＩＭ３をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾を含む操作された細胞または細胞集団は、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内因性核酸配列（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）の修飾、例えば、ノックダウンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾（例えば、ノックダウン）、及び標的化受容体をコードする異種配列（複数可）の細胞への挿入を含む、操作された細胞または細胞集団は、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内因性核酸配列（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）の修飾（例えば、ノックダウン）をさらに含む。
一般に、ＴＣＲは、２つのＴＣＲポリペプチド鎖、α及びβを含有するヘテロ二量体受容体分子である。ノックダウンを標的とするための好適なα及びβゲノム配列または遺伝子座は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＴＣＲ α鎖遺伝子配列、例えば、ＴＲＡＣの修飾、例えば、ノックダウンを含む。例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８７５５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２７７７３４（Ｔ細胞受容体アルファ定数）、ＵＳ２０１８／０３６２９７５及びＷＯ２０２００８１６１３を参照のこと。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、ＴＩＭ３をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内因性核酸配列（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）の遺伝子修飾（例えば、ノックダウン）、及びＭＨＣクラスＩ遺伝子（例えば、Ｂ２ＭまたはＨＬＡ－Ａ）の修飾（例えば、ノックダウン）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、ＴＩＭ３をコードする内因性核酸配列の遺伝子修飾、及びＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内因性核酸配列（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）の遺伝子修飾（例えば、ノックダウン）、及びＭＨＣクラスＩＩ遺伝子（例えば、ＣＩＩＴＡ）の遺伝子修飾（例えば、ノックダウン）を含む。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、ＴＩＭ３をコードする内因性核酸配列の修飾、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内因性核酸配列（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）の遺伝子修飾（例えば、ノックダウン）、及びチェックポイント阻害剤遺伝子（例えば、ＬＡＧ３、２Ｂ４、またはＰＤ－１）の遺伝子修飾（例えば、ノックダウン）を含む。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、シークエンシング、例えば、ＮＧＳによって評価されるＴＩＭ３遺伝子の遺伝子修飾を含み、細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５５％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも６０％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも６５％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも７０％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも７５％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも８５％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも７０％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも９０％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも９５％は、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも５０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも５５％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも６０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも６５％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも７０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも８０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも９０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３の発現は、例えば、ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも９５％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。ＴＩＭ３タンパク質及びｍＲＮＡ発現のアッセイは、当該技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、例えば、シークエンシング、例えば、ＮＧＳによって評価される、遺伝子編集によるＴＣＲ遺伝子配列の修飾（例えば、ノックダウン）を含み、細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、内因性ＴＣＲ遺伝子配列における挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、例えば、ＴＣＲ遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する。特定の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣである。ＴＣＲタンパク質及びｍＲＮＡ発現のアッセイは、当該技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞または細胞集団は、遺伝子編集によって、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）によって評価される、遺伝子編集によって標的化受容体をコードする配列（複数可）の挿入を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ遺伝子内の部位、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするガイドＲＮＡを使用して、ＴＣＲ遺伝子の修飾（例えば、ノックダウン）を提供する。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤とともにガイドＲＮＡを使用して修飾（例えば、ノックダウン）される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）とともにガイドＲＮＡを使用して、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子内で切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導することによって操作されたＴ細胞が本明細書に開示される。方法は、インビトロまたはエクスビボで、例えば、免疫応答を抑制するための細胞産物の製造において使用され得る。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＴＣＲ遺伝子内の本明細書に記載の部位において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、当該領域に結合する、または結合することができるガイド配列を含むことが理解されるであろう。
ＩＩＩ．治療方法及び使用、ならびに操作された細胞または免疫療法試薬を調製する方法を含む方法及び使用
本明細書に開示されるｇＲＮＡならびに関連する方法及び組成物は、操作された細胞などの免疫療法試薬を作製するのに有用である。
いくつかの実施形態では、表１のガイド配列を、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼとともに含むｇＲＮＡは、ＤＳＢを誘導し、修復中の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＴＩＭ３遺伝子内の修飾をもたらす。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪは、ヌクレオチド（複数可）の欠失または挿入を引き起こし、ＴＩＭ３遺伝子におけるフレームシフトまたはナンセンス変異を誘導する。特定の実施形態では、ＴＣＲ配列、例えば、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣを標的とするガイド配列を含むｇＲＮＡもまた、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼとともに、または別個に、細胞に送達され、ＴＣＲ配列内で遺伝子修飾を行い、全長ＴＣＲ配列の発現を阻害する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ、組成物、及び製剤は、エクスビボで細胞、例えば、免疫細胞、例えば、ＴＩＭ３遺伝子における遺伝子修飾を有するＴ細胞を産生するために使用される。修飾Ｔ細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞であってもよい。修飾Ｔ細胞は、ユニバーサルＴＣＲまたは修飾ＴＣＲなどのＴ細胞受容体を発現し得る。Ｔ細胞は、ゼータ鎖シグナル伝達モチーフを有するＣＡＲまたはＣＡＲ構築物を発現し得る。
ｇＲＮＡ組成物の送達
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、エクスビボ及びインビトロでの本明細書に開示されるガイドＲＮＡ及び組成物の送達に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質とともに送達する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される細胞または細胞集団のうちのいずれか１つを対象に送達するための方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰを介して送達される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと会合する。
いくつかの実施形態では、本発明は、開示されるｇＲＮＡ及びＬＮＰのうちのいずれか１つを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡと会合するＬＮＰは、疾患または障害を治療するための医薬として細胞を調製する際に使用するためのものである。
エレクトロポレーションは、カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つの送達のために、任意のエレクトロポレーション方法論が使用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、本明細書に開示されるｇＲＮＡ及びＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡのうちのいずれか１つを送達するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つをエクスビボで細胞に送達する方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰと会合するか、またはＬＮＰと会合しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰまたはｇＲＮＡはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと会合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ組成物は、単独で、または１つ以上のベクターにコードされて、脂質ナノ粒子に製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、各々の内容が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１７３０５４及びＷＯ２０２１／２２２２８７を参照のこと。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、及びＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９などのヌクレアーゼであってもよい）をコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９であってもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、さらにベクター配列を含んでいてもよく、ここで、ベクター配列は、自然状態ではｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡとともに見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、構成要素は、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、またはそれらは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達され得る。核酸の非ウイルス送達のための方法及び組成物は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、生物学的性質、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ＬＮＰ、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸の核酸（例えば、裸のＤＮＡ／ＲＮＡ）、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤強化された取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーション（Ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を、核酸の送達のために使用することもできる。
この説明及び例示的な実施形態は、限定として解釈されるべきではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、別途指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される量、パーセンテージ、または割合、及び他の数値を表す全ての数字は、どの場合においても「約」という用語によって、まだそれほど修飾されていない程度で修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、及び均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１－材料及び方法
次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の分析
ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して、製造者のプロトコルに従って抽出した。
ゲノム中の標的位置における編集効率を定量的に決定するために、ディープシークエンシングを使用して、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失（「インデル」）の存在を同定した。目的の遺伝子（例えば、ＴＩＭ３）内の標的部位周辺でＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅させた。プライマー配列設計は、現場で標準として行われた。シークエンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でシークエンシングした。低品質スコアを有する読み取りを除去した後に、読み取りをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）とアラインメントした。読み取り値を含む得られたファイルを、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）に対してマッピングし、目的の標的配列と重なり合った読み取り値を選択し、野生型の読み取り値の数と、挿入または欠失（「インデル」）を含む読み取り値の数を計算した。
実施例において使用される編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「インデルパーセント」）は、野生型を含む配列読み取りの総数に対する、挿入または欠失（「インデル」）を含む配列読み取りの総数であると定義される。
脂質ナノ粒子の調製。
別途指定されない限り、脂質構成要素を、様々なモル比で、１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を、２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、およそ０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。
別途指定されない限り、脂質核酸アセンブリは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、イオン化可能な脂質Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル オクタデカ－９，１２－ジエノエート、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを、それぞれ５０：３８：９：３のモル比で含んでいた。脂質核酸アセンブリは、別途指定されない限り、約６の脂質アミン対ＲＮＡホスフェートの（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で配合した。
クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水と衝突噴流混合することによって、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製した。エタノール中の脂質を、交差混合により、２体積部のＲＮＡ溶液と混合する。第４の水の流れを、直列のティー（ｔｅｅ）を通る交差の出口流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照）。ＬＮＰを室温（ＲＴ）で１時間保持し、さらに水で希釈した（およそ１：１ ｖ／ｖ）。ＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）でタンジェンシャルフロー濾過を使用して濃縮し、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用い、緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）に交換した。あるいは、ＬＮＰを、任意選択で、１００ｋＤａのアミコンスピンフィルターを使用して濃縮し、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を使用して緩衝液をＴＳＳに交換した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または－８０℃で保存した。
ｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むキャップされたポリアデニル化ｍＲＮＡを、線状プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。Ｔ７プロモーター、転写のための配列、及びポリアデニル化配列を含有するプラスミドＤＮＡを、以下の条件下、ＸｂａＩと３７°Ｃで２時間インキュベートすることによって線状化した。２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１ｘ反応緩衝液の条件で、ＸｂａＩとともに３７℃で２時間インキュベートすることによって線状化する。ＸｂａＩを、反応物を６５°Ｃで２０分間加熱することによって不活性化した。線状プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、以下の条件下、３７°Ｃで１．５～４時間インキュベートすることによって行った。５０ｎｇ／μＬの線状プラスミド、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各々、２～５ｍＭ、１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１ｘ反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ転写クリーンアップキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用し、ｍＲＮＡを精製した。あるいは、ｍＲＮＡを沈殿プロトコルにより精製し、いくつかの場合では、これに続いてＨＰＬＣベースの精製を行った。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅ消化後、ＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、ｍＲＮＡを精製する。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡについて、ＬｉＣｌ沈殿及び再構成後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ． ３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照のこと）。プールのために選択された画分を合わせ、上記の酢酸ナトリウム／エタノール沈殿によって脱塩した。さらなる代替方法において、ＬｉＣｌ沈殿法、続いてタンジェンシャルフロー濾過によるさらなる精製によって、ｍＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）での光吸光度を測定することによって決定し、転写産物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
配列番号８０１～８０３に従って、オープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡからＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを生成した（表１４の配列を参照）。配列番号８０１～８０３がＲＮＡに関して以下で言及される場合、Ｔは、Ｕ（上記のようなＮ１－メチルシュードウリジンであった）で置き換えられるべきであることが理解される。実施例で使用されるメッセンジャーＲＮＡは、５’キャップ及び３’ポリＡテール、例えば、最大１００ｎｔを含み、表１４の配列番号８０１～８０３によって同定される。






実施例２－ＨＥＫ細胞におけるＴＩＭ３ガイドの設計及びスクリーニング
目的の領域においてＰＡＭを同定するために、ヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）及び目的のユーザが規定したゲノム領域（例えば、ＴＩＭ３タンパク質コードエクソン）を用い、初期のガイド選択をインシリコで行った。同定された各ＰＡＭについて、分析を行い、統計を報告した。ｇＲＮＡ分子をさらに選択し、当該技術分野において既知のいくつかの基準（例えば、ＧＣ含有量、予測されるオンターゲット活性、及び潜在的オフターゲット活性）に基づいてランク付けした。
この実験では、合計８８個のガイドＲＮＡをＴＩＭ３（ＥＮＳＧ０００００１３５０７７）に対して設計した。ガイド配列及び対応するゲノム座標を上に提供する（表１）。
ガイドを、ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９細胞における編集効率についてスクリーニングした。Ｓｐｙ Ｃａｓ９を構成的に発現するヒト胚性腎臓腺癌細胞株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９」）を、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの約２４時間前に、細胞を９６ウェルプレート中で１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした（トランスフェクション時に約７０％のコンフルエント）。細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ１３７７８１５０）によって、製造者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。細胞を、個々のガイド（２５ｎＭ）、ｔｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）、及びＯｐｔｉＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むリポプレックスによってトランスフェクトした。ＤＮＡ単離及びＮＧＳ分析を、実施例１に記載されるように行った。表５は、ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９細胞におけるこれらのガイドによるＴＲＡＣ遺伝子座におけるインデル％を示す。

実施例３－ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３ガイドスクリーニング
実施例２のＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９細胞の編集スクリーニングからのガイドを、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞における編集効率についてスクリーニングした。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む複数のＴ細胞集団からなる。これらの細胞は、全血または白血球泳動試料から単離することができる。Ｔ細胞は、Ｃａｓ９媒介編集を使用して患者Ｔ細胞を操作することによって、がん細胞を特異的に標的とし、免疫原性が低くなるように修飾することができる。
実施例３．１．Ｔ細胞へのＲＮＰの送達
Ｔ細胞は、市販されているか（例えば、ヒト末梢血ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、Ｆｒｏｚｅｎ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ７００２９）、またはロイコパックから内部的に調製された。内部調製のために、市販のキット（例えば、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞単離キット、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、Ｔ細胞を最初にロイコパックから濃縮した。濃縮したＴ細胞を等分し、将来の使用のために（５×１０６／バイアルで）凍結させた。その後、バイアルを必要に応じて解凍し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ １６４０、ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２－メルカプトエタノール、及び任意選択でＩＬ２）中の３：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することによって活性化した。個々のｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを、等量の試薬を混合し、９５℃で２分間インキュベートし、室温まで冷却することによって予めアニーリングすることによって、ＲＮＰを生成した。予めアニーリングしたｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡからなるデュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）を、Ｓｐｙ Ｃａｓ９タンパク質とともにインキュベートし、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ９６－ｗｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット（Ｌｏｎｚａ、カタログＶ４ＳＰ－３９６０）を使用し、刺激されたヒトＴ細胞のための製造者のＡｍａｘａ（商標）９６－ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅ（商標）プロトコルを使用して、Ｓｐｙ Ｃａｓ９（１０ｎＭ）、個々のガイド（１０ｎＭ）及びトレーサーＲＮＡ（１０ｎＭ）を含有するＲＮＰで三重にトランスフェクトした。Ｔ細胞培地を、ヌクレオフェクション直後の細胞に添加し、２日間以上培養した。
ヌクレオフェクションの２日後に、ゲノムＤＮＡを、実施例１に記載されるように調製し、ＮＧＳ分析を行った。表６Ａ及び図１は、ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＮＧＳ編集％のデータを示す。

実施例３．２．ＴＩＭ３タンパク質発現のフローサイトメトリー分析
エレクトロポレーションの７日後、１：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）対細胞を使用して、細胞を再刺激した。エレクトロポレーション後１１日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＴＩＭ３表面タンパク質発現を評価した。Ｔ細胞を、ＴＩＭ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３６９３１４）を認識する抗体とインキュベートし、固定可能な生死染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログＬ３４９７５）で染色した。その後、細胞をＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。ＴＩＭ３細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを表６Ｂ及び図２Ａ～Ｂに示す。
実施例４－ＴＩＭ３ガイドのオフターゲット分析
生化学的方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６，６００－６０６；２０１７）を使用して、ＴＩＭ３を標的とするガイドを使用して、Ｃａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定した。標的インデル活性を示すガイドを、このアッセイで潜在的なオフターゲットゲノム切断部位について試験した。この実験では、ヒトＴＩＭ３を標的とする１５個のｄｇＲＮＡ及びＶＥＧＦＡを標的とする陽性対照ガイドＧ０００６４５を、精製されたヒトゲノムＤＮＡを使用してスクリーニングした。生化学アッセイにおいて６４ｎＭのガイド濃度を使用して検出された潜在的なオフターゲット部位の数を表７に示す。
実施例４．１．潜在的なオフターゲット部位を検証するための標的シークエンシング
上で使用される生化学的方法などの既知のオフターゲット検出アッセイでは、多数の潜在的なオフターゲット部位が、典型的には、設計によって回収され、他の状況、例えば目的の一次細胞において検証することができる潜在的な部位に対して「ワイドネットをキャストする」ようにする。例えば、この生化学的方法は、典型的には、このアッセイが細胞環境を含まない精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し、使用されるＣａｓ９ ＲＮＰの用量に依存するため、潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に表す。したがって、これらの方法によって特定された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的シークエンシングを使用して検証され得る。
１つのアプローチでは、一次Ｔ細胞を、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び目的のｓｇＲＮＡ（例えば、評価のための潜在的なオフターゲット部位を有するｓｇＲＮＡ）を含むＬＮＰで処理する。次いで、一次Ｔ細胞を溶解し、潜在的なオフターゲット部位（複数可）に隣接するプライマーを使用してＮＧＳ分析のためのアンプリコンを生成する。特定のレベルでのインデルの同定は、潜在的なオフターゲット部位を検証することができるが、潜在的なオフターゲット部位で見出されるインデルの欠如は、利用されたオフターゲットアッセイにおいて偽陽性を示す場合がある。
実施例５－ＣＤ３＋Ｔ細胞における単一ガイド分析
Ｔ細胞を、実施例３に概説されるように調製した。単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）を９５℃で２分間インキュベートし、室温まで冷却した。次いで、ｓｇＲＮＡをＳｐｙ Ｃａｓ９タンパク質とインキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ９６－ｗｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット（Ｌｏｎｚａ、カタログＶ４ＳＰ－３９６０）を使用し、刺激されたヒトＴ細胞のための製造者のＡｍａｘａ（商標）９６－ｗｅｌｌ Ｓｈｕｔｔｌｅ（商標）プロトコルを使用してヌクレオフェクトされた、Ｓｐｙ Ｃａｓ９（１０ｎＭ）及び個々のｓｇＲＮＡ（１０ｎＭ）を含有するＲＮＰでトランスフェクトした。Ｔ細胞培地を、ヌクレオフェクション直後の細胞に添加し、培養した。エレクトロポレーションの２日後に、細胞の一部を採取し、実施例１と同様にＮＧＳを実施した。平均編集パーセントを表８Ａ及び図３Ａに示す。
エレクトロポレーション後７日目に、ＩＬ－２及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）で培地を調製した。再刺激のための細胞対ビーズ比は、１：１であった。再刺激されたタンパク質レベルを、実施例３．２と同様に、かつ表８Ｂ及び図３Ｂに示されるようにフローサイトメトリーによって測定した。

実施例６－様々な用量のＲＮＡによるＴＩＭ３編集
Ｔ細胞を、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡと、ＴＩＭ３または対照遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡとを共製剤化する脂質ナノ粒子の増加量で編集した。
凍結保存したＴ細胞を、水浴中で解凍した。Ｔ細胞を、サイトカイン培地１０ｍＬ当たり１５×１０６の密度で再懸濁した。ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を１：１００希釈で各フラスコに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。
Ｔ細胞を採取し、サイトカイン（ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ））で調製した培地（血清を含まないＸ－ＶＩＶＯ（商標）基礎培地）中に再懸濁した。ＡｐｏＥ３を、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）５％ ＨＳ培地中の最終濃度が１ｕｇ／ｍＬになるように添加した。表７に示されるガイドで製剤化したＬＮＰを、ＡｐｏＥ培地中で２倍の最終濃度まで調製し、３７℃で１５分間インキュベートした。５０μＬのＬＮＰ－ＡｐｏＥ及び５０μＬのＴ細胞を混合し、２４時間培養した。ＮＧＳ分析を、実施例１と同様に実施した。ＮＧＳデータを表９及び図４に示す。

実施例７－ＴＩＭ３ノックアウトを有する操作されたＴ細胞
Ｔ細胞を、一連の遺伝子破壊及び挿入で操作した。健康なドナー細胞を、３つのＬＮＰで連続的に処理し、各ＬＮＰは、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ標的化をコードするｍＲＮＡと共製剤化した。最初に、ＴＲＢＣをノックアウトするように細胞を編集した。ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１ ＴＣＲ）を標的とするトランスジェニックＴ細胞受容体（配列番号１００１）を、ＡＡＶを使用して相同性指向修復テンプレートを送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に組み込んだ。最後に、ＴＩＭ３をノックアウトするようにＴ細胞を編集した。
７．１．Ｔ細胞調製
健康なヒトドナーアフェレーシスを商業的に取得し（ＨｅｍａＣａｒｅ）、洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉカタログ１３０－０７０－５２５）に再懸濁した。３人のドナーからのＴ細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏＴｅｃ、カタログ１３０－０３０－４０１、１３０－０３０－８０１）を使用し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｌｕｓ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＬＳ使い捨てキットを使用して陽性選択によって単離した。Ｔ細胞をバイアルに等分し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ０７９３０）及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒカタログ２Ｂ２５２２Ｘ）の１：１製剤中で将来の使用のために凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、Ｔ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ）：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）（２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ１００－５１２）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５）を補充した）中で一晩静置した。
７．２ＬＮＰ処理及びＴ細胞の増殖
１日目に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＢＣを標的とするｓｇＲＮＡを含有するＬＮＰ（Ｇ０１６２３９）を、１ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ヒト試薬であるＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ１３０－１１１－１６０）を１：５０の希釈でＴＣＡＭ中に２×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中で一晩プレーティングした。
３日目に、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡを含有するＬＮＰ（Ｇ０１３００６）を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１の比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ中でプレーティングした。次いで、ＷＴ１ ＴＣＲを含有するＡＡＶを、３×１０５ゲノムコピー／細胞のＭＯＩで各群に添加した。これらの編集を有する細胞は、表及び図において「ＷＴ１ Ｔ細胞」と称される。
４日目に、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び表１１に列挙されるｇＲＮＡのうちの１つを含有するＬＮＰ。ＬＮＰを、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。次いで、ＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を、１：１の比で適切な培養物に添加した。
５～１１日目に、Ｔ細胞を、Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＥＭ）：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ３７０５００１）（５％ ＣＴＳ免疫細胞血清置換（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログＡ２５９６１０１）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０２）、ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－０７）、及びＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ２００－１５））中の２４ウェルＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ８０１９２）に移した。製造者のプロトコルに従って、細胞を増殖した。Ｔ細胞を６日間拡張し、培地を１日おきに交換した。細胞を、Ｖｉ－ＣＥＬＬ細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、全ての試料が類似した倍率拡張を示した。
７．３．フローサイトメトリー及びＮＧＳによるＴ細胞編集の定量化
拡張後、編集されたＴ細胞をフローサイトメトリーによってアッセイして、ＴＣＲ挿入及びメモリー細胞表現型を決定した。Ｔ細胞を、以下の分子を標的とする抗体カクテルとともにインキュベートした。ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３００５２４）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０１０４５）、Ｖｂ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３４８１０６）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３００３２７）、ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４８４４）、ＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４２３０）、ＣＣＲ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３５３２１４）、及びＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ３０４１０６）。その後、細胞をＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。連続Ｔ細胞操作後に関連する細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを、表１０Ａ～１０Ｃ及び図５Ａ～５Ｃに示す。表１０Ａは、Ｔ細胞操作後のＣＤ８＋細胞の総パーセンテージ、及びＶｂ８抗体で検出された、操作されたＴＣＲを発現するＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞の割合を示す。表１０Ｂ及び図５Ａは、幹細胞メモリー表現型（Ｔｓｃｍ；ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）を有するＣＤ８＋Ｖｂ８＋細胞のパーセンテージを示す。表１０Ｃ及び図５Ｂは、中央メモリー細胞表現型（Ｔｃｍ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）を有するＣＤ８＋Ｖｂ８＋細胞のパーセンテージを示す。表１０Ｃ及び図５Ｃは、エフェクターメモリー表現型（Ｔｅｍ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－ＣＣＲ７－）を有する全細胞のパーセンテージを示す。フローサイトメトリー分析に加えて、実施例１に記載されるようにゲノムＤＮＡを調製し、ＮＧＳ分析を実施して、各標的部位における編集速度を決定した。表１１及び図６Ａ～６Ｂは、第３の連続編集で操作された遺伝子座におけるインデル頻度の結果を示す。



実施例８－操作されたＴ細胞を使用したＡＭＬ細胞の増殖の阻害
４日目に、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び表１４に列挙されるｇＲＮＡのうちの１つを含有するＬＮＰ。ＬＮＰを、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３５０－０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。次いで、ＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を、１：１の比で適切な培養物に添加した。
チェックポイント阻害剤は、がんなどの増殖性障害において生じ得る免疫消耗と関連付けられる。ＷＴ１に関連する増殖性障害としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む多数の血液悪性腫瘍が挙げられる。チェックポイント阻害剤の発現を低減し、ＷＴ１ ＴＣＲの発現を誘導するために実施例７の方法によって調製した細胞を、インビトロ及びインビボの両方の既知のＡＭＬモデルを使用して試験する（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００９）１１４：３７９３－３８０２を参照のこと）。
インビトロ細胞死滅アッセイを使用して、異常な増殖を有する細胞に対するＴ細胞の活性を検出することができる。実施例７の方法によって調製されたＴ細胞が標的細胞を排除する能力は、操作されたＴ細胞を、ＷＴ１抗原の高発現を伴う急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来の原発性白血病芽球（ＣＤ３３＋細胞）と共培養することによって評価される。白血病芽球は、例えば、実施例９と同様にアッセイすることができる。
ヒトＷＴ１発現ＡＭＬ細胞株を、０日目に致死用量で静脈内経路を介してマウスに注射する。実施例７の方法によって調製した細胞を、１４日目に静脈内投与する。マウスの生存をモニターする。ＷＴ１ ＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞で処置されたマウスは、ＷＴ１ ＴＣＲを発現しないＴ細胞で処置されたマウスよりも長く生存可能である。ＷＴ１ ＴＣＲの発現に加えて、チェックポイント阻害剤の発現を阻害するように操作されたＴ細胞で処置されたマウスは、ＷＴ１ ＴＣＲ及び全ての内因性チェックポイント阻害剤を発現するＴ細胞で処置されたマウスよりも長く生存可能である。
実施例９－操作されたＴ細胞による標的細胞死滅
実施例７で操作したＴ細胞を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｌｉｖｅ Ｉｍａｇｉｎｇシステムを使用して、原発性白血病芽球を殺傷する能力について評価した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を操作して、ＷＴ１ ＴＣＲをＴＲＡＣ遺伝子座に挿入し、２つのＴ細胞ドナー試料（ＷＴ１ Ｔ細胞）中のＴＲＢＣ遺伝子座をノックアウトした。第３の操作ステップでは、いくつかのＷＴ１ Ｔ細胞を、Ｇ０１８４３６またはＧ０２０８４５を使用してＴＩＭ３をノックアウトするように処理した。３人のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１患者から採取したＷＴ１を発現する原発性白血病芽球を、生細胞核標識用のＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｄ試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）で標識し、カスパーゼ３／７緑色試薬の存在下で、異なる（５：１、１：１、及び１：５）のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で操作されたリンパ球と共培養した。Ｅ：Ｔ比５：１の場合は２万芽球、Ｅ：Ｔ比１：１及び１：５の場合はで７５，０００芽球を使用した。共培養物を、５％のＦＢＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭのグルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｌｏｎｚａ）、１μｇ／ｍＬのＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｇ－ＣＳＦ及びＩＬ－３（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ中の平底９６ウェルプレートに播種した。画像を６０分ごとに撮影し、赤色標的細胞中の緑色蛍光カスパーゼ３／７シグナルを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量化した。このアッセイでは、生きたＡＭＬ細胞は赤色のみで蛍光を発するが、死んだＡＭＬ細胞は赤色及び緑色の両方で蛍光を発する。表１２及び図７Ａ～図７Ｉは、緑色及び赤色の両方で蛍光を発する各画像（ｕｍ２／画像）の平均面積の平均±ＳＥＭを示す。各エフェクター集団について、上記のように、２つの異なるＴ細胞ドナーからの操作された細胞を使用した。












実施例１０－Ｔ細胞における追加の単一ガイド分析
Ｔ細胞を、実施例３に概説されるように調製した。単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）を９５℃で２分間インキュベートし、室温まで冷却した。次いで、ｓｇＲＮＡをＳｐｙ Ｃａｓ９タンパク質とインキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット（Ｌｏｎｚａ、カタログＰＢ－Ｐ３－２２５００）を使用してヌクレオフェクトされた、Ｓｐｙ Ｃａｓ９（３ｎＭ）及び個々のｓｇＲＮＡ（６ｎＭ）を含有するＲＮＰでトランスフェクトした。Ｔ細胞培地を、ヌクレオフェクション直後の細胞に添加し、培養した。エレクトロポレーションの２日後に、細胞の一部を採取し、実施例１と同様にＮＧＳを実施した。平均編集パーセントを表１３に示す。
実施例１１－追加の実施形態
実施形態１
ｃｈｒ５：１５７０８５８３２－１５７１０９０４４のゲノム座標内に、ヒトＴＩＭ３配列における遺伝子修飾を含む、操作された細胞。
実施形態２
前記遺伝子修飾が、挿入、欠失、及び置換から選択される、実施形態１に記載の操作された細胞。
実施形態３
前記遺伝子修飾が、前記ＴＩＭ３遺伝子の発現を阻害する、請求項１または２に記載の操作された細胞。
実施形態４
前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：


任意選択で、ＴＩＭ３－１～ＴＩＭ３－４、ＴＩＭ３－６～ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－１８、ＴＩＭ３－１９、ＴＩＭ３－２２、ＴＩＭ３－２９、ＴＩＭ３－４２、ＴＩＭ３－４４、ＴＩＭ３－５８、ＴＩＭ３－６２、ＴＩＭ３－６９、ＴＩＭ３－８２、ＴＩＭ３－８６、及びＴＩＭ３－８８；ＴＩＭ３－１～ＴＩＭ３－５、ＴＩＭ３－７、ＴＩＭ３－８、ＴＩＭ３－１２～ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－２３、ＴＩＭ３－２６、ＴＩＭ３－３２、ＴＩＭ３－５６、ＴＩＭ３－５９、ＴＩＭ３－６３、ＴＩＭ３－６６、ＴＩＭ３－７５、及びＴＩＭ３－８７；ＴＩＭ３－２、ＴＩＭ３－４、ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－２３、ＴＩＭ３－５６、ＴＩＭ３－５９、ＴＩＭ３－６３、ＴＩＭ３－７５、及びＴＩＭ３－８７；ＴＩＭ３－１～ＴＩＭ３－４；ＴＩＭ３－２、ＴＩＭ－４、及びＴＩＭ３－１５；ＴＩＭ３－２、ＴＩＭ－４、ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－６３、及びＴＩＭ３－８７；ＴＩＭ３－２及びＴＩＭ３－１５；ＴＩＭ３－６３及びＴＩＭ３－８７；またはＴＩＭ３－１５によって標的とされるものから選択されるゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態５
前記操作された細胞が、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列のゲノム座標内の遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、ＴＣＲ遺伝子の発現を阻害する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６
前記ＴＣＲ遺伝子が、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣである、実施形態５に記載の操作された細胞。
実施形態７
以下から選択されるゲノム座標内にＴＲＢＣの遺伝子修飾を含む、実施形態６に記載の操作された細胞。


実施形態８
以下から選択されるゲノム座標内にＴＲＡＣの遺伝子修飾を含み、



任意選択で、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１４：２２５４７５２４－２２５４７５４４、ｃｈｒ１４：２２５４７５２９－２２５４７５４９、ｃｈｒ１４：２２５４７５２５－２２５４７５４５、ｃｈｒ１４：２２５４７５３６－２２５４７５５６、ｃｈｒ１４：２２５４７５０１－２２５４７５２１、ｃｈｒ１４：２２５４７５５６－２２５４７５７６、及びｃｈｒ１４：２２５４７５０２－２２５４７５２２から選択されるゲノム座標内にある、実施形態５～７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態９
前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を阻害する、実施形態１～８のいずれか１項に記載の操作された細胞。
実施形態１０
１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、Ｂ２Ｍ配列における遺伝子修飾であり、前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標内にある、実施形態９に記載の操作された細胞。


実施形態１１
１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、ＨＬＡ－Ａ配列における遺伝子修飾であり、任意選択で、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標、任意選択で、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にある、実施形態９に記載の操作された細胞。
実施形態１２
前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を阻害する、上記実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態１３
１つ以上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、ＣＩＩＴＡ配列における遺伝子修飾であり、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ：１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－１０９２３２８５、ｃｈｒ１６：１０９０６５４２－１０９２３２８５、またはｃｈｒ１６：１０９０６５４２－１０９０８１２１、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０、または任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９１６４３２－１０９１６４５２、ｃｈｒ１６：１０９２２４４４－１０９２２４６４、ｃｈｒ１６：１０９０７９２４－１０９０７９４４、ｃｈｒ１６：１０９０６９８５－１０９０７００５、ｃｈｒ１６：１０９０８０７３－１０９０８０９３、ｃｈｒ１６：１０９０７４３３－１０９０７４５３、ｃｈｒ１６：１０９０７９７９－１０９０７９９９、ｃｈｒ１６：１０９０７１３９－１０９０７１５９、ｃｈｒ１６：１０９２２４３５－１０９２２４５５、ｃｈｒ１６：１０９０７３８４－１０９０７４０４、ｃｈｒ１６：１０９０７４３４－１０９０７４５４、ｃｈｒ１６：１０９０７１１９－１０９０７１３９、ｃｈｒ１６：１０９０７５３９－１０９０７５５９、ｃｈｒ１６：１０９０７８１０－１０９０７８３０、ｃｈｒ１６：１０９０７３１５－１０９０７３３５、ｃｈｒ１６：１０９１６４２６－１０９１６４４６、ｃｈｒ１６：１０９０９１３８－１０９０９１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１０１－１０９０８１２１、ｃｈｒ１６：１０９０７７９０－１０９０７８１０、ｃｈｒ１６：１０９０７７８７－１０９０７８０７、ｃｈｒ１６：１０９０７４５４－１０９０７４７４、ｃｈｒ１６：１０８９５７０２－１０８９５７２２、ｃｈｒ１６：１０９０２７２９－１０９０２７４９、ｃｈｒ１６：１０９１８４９２－１０９１８５１２、ｃｈｒ１６：１０９０７９３２－１０９０７９５２、ｃｈｒ１６：１０９０７６２３－１０９０７６４３、ｃｈｒ１６：１０９０７４６１－１０９０７４８１、ｃｈｒ１６：１０９０２７２３－１０９０２７４３、ｃｈｒ１６：１０９０７６２２－１０９０７６４２、ｃｈｒ１６：１０９２２４４１－１０９２２４６１、ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－１０９０２６８２、ｃｈｒ１６：１０９１５６２６－１０９１５６４６、ｃｈｒ１６：１０９１５５９２－１０９１５６１２、ｃｈｒ１６：１０９０７３８５－１０９０７４０５、ｃｈｒ１６：１０９０７０３０－１０９０７０５０、ｃｈｒ１６：１０９０７９３５－１０９０７９５５、ｃｈｒ１６：１０９０６８５３－１０９０６８７３、ｃｈｒ１６：１０９０６７５７－１０９０６７７７、ｃｈｒ１６：１０９０７７３０－１０９０７７５０、及びｃｈｒ１６：１０８９５３０２－１０８９５３２２から選択されるゲノム座標内にある、実施形態１２に記載の操作された細胞。
実施形態１４
１つ以上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、任意選択で、ＣＩＩＴＡスプライス部位の少なくとも１つのヌクレオチドの修飾、任意選択で、
ａ）ＣＩＩＴＡスプライスドナー部位の少なくとも１つのヌクレオチドの修飾、及び／または
ｂ）ＣＩＩＴＡスプライス部位境界ヌクレオチドの修飾を含む、実施形態１２または１３に記載の操作された細胞。
実施形態１５
前記細胞が、ＴＩＭ３タンパク質の細胞表面発現が低減されている、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態１６
前記細胞が、ＴＩＭ３タンパク質の細胞表面発現が低減されており、かつＴＲＡＣタンパク質の細胞表面発現が低減されている、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態１７
ＴＲＢＣタンパク質の細胞表面発現の低減をさらに含む、実施形態１５または１６に記載の操作された細胞。
実施形態１８
ＴＩＭ３の細胞表面発現が検出レベル未満である、実施形態１６または１７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態１９
ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣのうちの少なくとも１つの細胞表面発現が、検出レベル未満である、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２０
ＴＩＭ３、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢＣの各々の細胞表面発現が、検出レベル未満である、実施形態１９に記載の操作された細胞。
実施形態２１
ｃｈｒ１：１６０８３０１６０－１６０８６２８８７のゲノム座標内に、ヒト２Ｂ４／ＣＤ２４４配列における遺伝子修飾を含む、上記実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２２
２Ｂ４／ＣＤ２４４における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：

任意選択で、２Ｂ４－１～２Ｂ４－５、２Ｂ４－１及び２Ｂ４－２、または２Ｂ４－３、２Ｂ４－４、２Ｂ４－１０、及び２Ｂ４－１７内にある、実施形態２１に記載の操作された細胞。
実施形態２３
ｃｈｒ１２：６７７２４８３－６７７８４５５のゲノム座標内に、ヒトＬＡＧ３配列における遺伝子修飾を含む、上記実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２４
ＬＡＧ３における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：

任意選択で、ＬＡＧ３－１～ＬＡＧ３－１５、ＬＡＧ３－１～ＬＡＧ３－１１、ＬＡＧ３－１～ＬＡＧ３－４、またはＬＡＧ３－１、ＬＡＧ３－４、ＬＡＧ３－５、及びＬＡＧ３－９によって標的とされるものから選択されるゲノム座標内にある、実施形態２３に記載の操作された細胞。
実施形態２５
ｃｈｒ２：２４１８４９８８１－２４１８５８９０８のゲノム座標内に、ヒトＰＤ－１配列における遺伝子修飾を含む、請求項１～２４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２６
示されるゲノム座標における遺伝子修飾が、挿入、欠失、及び置換から選択される、実施形態２１～２５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２７
前記遺伝子修飾が、前記遺伝子修飾が存在する遺伝子の発現を阻害する、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２８
前記遺伝子修飾が、インデルを含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態２９
前記遺伝子修飾が、異種コード配列の挿入を含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３０
前記遺伝子修飾が、置換を含む、実施形態１～２７及び２９のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３１
前記置換が、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む、実施形態３０に記載の操作された細胞。
実施形態３２前記遺伝子修飾が、遺伝子修飾の前に、全長タンパク質のアミノ酸配列を有する前記全長タンパク質の翻訳を妨げる、前記核酸配列の変化をもたらす、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３３
前記遺伝子修飾が、前記全長タンパク質のコード配列における未成熟終止コドンをもたらす前記核酸配列の変化をもたらす、実施形態３２に記載の操作された細胞。
実施形態３４
前記遺伝子修飾が、前記ゲノム遺伝子座からのｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの変化をもたらす核酸配列の変化をもたらす、実施形態３２に記載の操作された細胞。
実施形態３５
遺伝子修飾を含む遺伝子からのタンパク質の細胞表面発現の低減をもたらす、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３６
前記阻害が、遺伝子修飾を含む遺伝子によって調節されるタンパク質の細胞表面発現の低減をもたらす、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３７
前記細胞が、前記操作された細胞の表面上で発現される標的化受容体をコードする外因性核酸を含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態３８
前記標的化受容体が、ＣＡＲである、実施形態３７に記載の操作された細胞。
実施形態３９
前記標的化受容体が、ＴＣＲである、実施形態３７に記載の操作された細胞。
実施形態４０
前記標的化受容体が、ＷＴ１ ＴＣＲである、実施形態３９に記載の操作された細胞。
実施形態４１前記操作された細胞が、免疫細胞である、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態４２
前記操作された細胞が、単球、マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、または顆粒球である、実施形態４１に記載の操作された細胞。
実施形態４３
前記操作された細胞が、リンパ球である、実施形態４１に記載の操作された細胞。
実施形態４４
前記操作された細胞が、Ｔ細胞である、実施形態４３に記載の操作された細胞。
実施形態４５
実施形態１～４４のいずれか１つに記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
実施形態４６
実施形態１～４４のいずれか１つに記載の操作された細胞を含む、細胞集団。
実施形態４７前記細胞集団を含む薬学的組成物であって、前記細胞集団が、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の操作された細胞を含む、前記薬学的組成物。
実施形態４８
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法。
実施形態４９
先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する方法。
実施形態５０
ＡＣＴ療法として使用するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物。
実施形態５１
ａ．配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｂ．配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８の配列から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｃ．配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一または少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｄ．配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｅ．配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｆ．配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｇ．配列番号１～４から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｈ．配列番号２、４、及び１５から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｉ．配列番号２、４、１５、６３、及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｊ．配列番号２及び１５から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
ｋ．配列番号６３及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、及び
ｌ．配列番号１５のヌクレオチド配列を含むガイド配列、から選択されるヌクレオチド配列を含むＴＩＭ３配列に特異的にハイブリダイズする、ＴＩＭ３ガイドＲＮＡ。
実施形態５２
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を、配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８によって標的とされるものから選択されるゲノム座標、任意選択で、配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８によって標的とされるゲノム座標から選択される、任意選択で、配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７によって標的とされるゲノム座標から選択される、任意選択で、２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７によって標的とされるゲノム座標から選択される、任意選択で、配列番号１～４によって標的とされるゲノム座標から選択される、任意選択で、配列番号２、４、及び１５によって標的とされるゲノム座標から選択される、任意選択で、配列番号２、４、１５、６３、及び８７によって標的とされるゲノム座標から選択される、任意選択で、配列番号２及び１５によって標的とされるゲノム座標から選択されるゲノム座標、任意選択で、配列番号６３及び８７によって標的とされるゲノム座標、または任意選択で、配列番号１５によって標的とされるゲノム座標内の染色体位置に指向するガイド配列を含む、ＴＩＭ３ガイドＲＮＡ。
実施形態５３
前記ガイドＲＮＡが、デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、実施形態５１または５２のガイドＲＮＡ。
実施形態５４
前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態５１または５２のガイドＲＮＡ。
実施形態５５
前記ガイド配列に対して３’に配列番号４００のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ガイドＲＮＡが、５’末端修飾または３’末端修飾を含む、実施形態５４に記載のガイドＲＮＡ。
実施形態５６
５’末端修飾または３’末端修飾及びｇＲＮＡの保存部分をさらに含み、前記保存部分が、
Ａ．短縮されたヘアピン１領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン１領域であって、
１．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、またはＨ１－４及びＨ１－９のうちの少なくとも１つが、前記置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン１においてワトソン－クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、前記ヘアピン１領域が、任意選択で、
ａ．Ｈ１－５～Ｈ１－８のうちのいずれか１つもしくは２つ、
ｂ．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、ならびにＨ１－４及びＨ１－９のうちの１つ、２つ、もしくは３つ、または
ｃ．ヘアピン１領域の１～８個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
２．前記短縮されたヘアピン１領域が、４～８個のヌクレオチド、好ましくは４～６個のヌクレオチドを欠いており、
ａ．位置Ｈ１－１、Ｈ１－２、もしくはＨ１－３のうちの１つ以上が、配列番号４００に対して欠失もしくは置換されているか、または
ｂ．位置Ｈ１－６～Ｈ１－１０のうちの１つ以上が、配列番号４００に対して置換されているか、または
３．前記短縮されたヘアピン１領域が、５～１０個のヌクレオチド、好ましくは５～６個のヌクレオチドを欠いており、位置Ｎ１８、Ｈ１－１２、もしくはｎのうちの１つ以上が、配列番号４００に対して置換されている、前記ヘアピン１領域、あるいは
Ｂ．短縮された上部ステム領域であって、前記短縮された上部ステム領域が、１～６個のヌクレオチドを欠いており、前記短縮された上部ステム領域の６、７、８、９、１０、または１１個のヌクレオチドが、配列番号４００に対して４個以下の置換を含む、前記短縮された上部ステム領域、あるいは
Ｃ．ＬＳ６、ＬＳ７、ＵＳ３、ＵＳ１０、Ｂ３、Ｎ７、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｈ２－２、及びＨ２－１４のうちのいずれか１つ以上における配列番号４００に対する置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、前記置換、あるいは
Ｄ．上部ステム領域であって、前記上部ステムの修飾が、配列番号４００に対して前記上部ステム領域におけるＵＳ１～ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含む、前記上部ステム領域のうちの１つ以上を含む、実施形態５４に記載のガイドＲＮＡ。
実施形態５７
前記ガイド配列に対して３’にＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２００）のヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態５４に記載のガイドＲＮＡ。
実施形態５８
前記ガイド配列に対して３’もＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０１）、任意選択で前記ガイド配列に対して３’にＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２０２）のヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態５４のガイドＲＮＡ。
実施形態５９
前記ガイドＲＮＡが、ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）のパターンに従って修飾され、「Ｎ」が、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり得、ｍが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、＊が、ヌクレオチド残基間のホスホロチオエート連結であり、前記Ｎが、集合的に、任意の先行実施形態のガイド配列のヌクレオチド配列である、実施形態５７または５８に記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６０
各Ｎが、独立して、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、前記ガイド配列が、ＴＩＭ３遺伝子に対してＣａｓ９を標的とする、実施形態５９に記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６１
前記ガイドＲＮＡが、修飾を含む、実施形態５３～６０のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６２
前記修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドまたは２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６１に記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６３
前記修飾が、ヌクレオチド間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態６１または６２に記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６４
前記ガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記修飾が、ガイドＲＮＡの５’末端での５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６５
前記ガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記修飾が、ガイドＲＮＡの３’末端での５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、実施形態６１～６４のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６６
前記ガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記修飾が、ガイドＲＮＡの５’末端での４個のヌクレオチドの各々の間にＰＳ結合を含む、実施形態６１～６５のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６７
前記ガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記修飾が、ガイドＲＮＡの３’末端での４個のヌクレオチドの各々の間にＰＳ結合を含む、実施形態６１～６６のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６８
前記ガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記修飾が、ガイドＲＮＡの５’末端での最初の３個のヌクレオチドの各々に２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６１～６７のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ。
実施形態６９
前記ガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記修飾が、ガイドＲＮＡの３’末端での最後の３個のヌクレオチドの各々に２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６１～６８のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ。
実施形態７０
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ポリペプチドＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ポリペプチドをコードする核酸であり、任意選択で、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態５３～６９のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む組成物。
実施形態７１
、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＤＮＡ配列内で修飾を行うことができるポリペプチドである、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態７２
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態７１に記載の組成物。
実施形態７３
前記ヌクレアーゼが、切断、ニッカーゼ、及び不活性型ヌクレアーゼの群から選択される、実施形態７０～７２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７４
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が、
ａ．ＤＮＡコード配列、
ｂ．オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するｍＲＮＡ、
ｃ．発現ベクターにおけるコード配列、
ｄ．ウイルスベクターにおけるコード配列から選択される、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態７５
以下から選択されるゲノム座標に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含み、。



任意選択で、前記遺伝子修飾は、ｃｈｒ１４：２２５４７５２４－２２５４７５４４、ｃｈｒ１４：２２５４７５２９－２２５４７５４９、ｃｈｒ１４：２２５４７５２５－２２５４７５４５、ｃｈｒ１４：２２５４７５３６－２２５４７５５６、ｃｈｒ１４：２２５４７５０１－２２５４７５２１、ｃｈｒ１４：２２５４７５５６－２２５４７５７６、及びｃｈｒ１４：２２５４７５０２－２２５４７５２２から選択されるゲノム座標内にある、実施形態７０～７４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７６
以下から選択されるゲノム座標に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含む、実施形態７０～７５のいずれか１つに記載の組成物。


実施形態７７
ｃｈｒ：１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－ｃｈｒ１６：１０９２３２８５、ｃｈｒ１６：１０９０６５４２－１０９２３２８５、またはｃｈｒ１６：１０９０６５４２－１０９０８１２１、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０、または任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９１６４３２－１０９１６４５２、ｃｈｒ１６：１０９２２４４４－１０９２２４６４、ｃｈｒ１６：１０９０７９２４－１０９０７９４４、ｃｈｒ１６：１０９０６９８５－１０９０７００５、ｃｈｒ１６：１０９０８０７３－１０９０８０９３、ｃｈｒ１６：１０９０７４３３－１０９０７４５３、ｃｈｒ１６：１０９０７９７９－１０９０７９９９、ｃｈｒ１６：１０９０７１３９－１０９０７１５９、ｃｈｒ１６：１０９２２４３５－１０９２２４５５、ｃｈｒ１６：１０９０７３８４－１０９０７４０４、ｃｈｒ１６：１０９０７４３４－１０９０７４５４、ｃｈｒ１６：１０９０７１１９－１０９０７１３９、ｃｈｒ１６：１０９０７５３９－１０９０７５５９、ｃｈｒ１６：１０９０７８１０－１０９０７８３０、ｃｈｒ１６：１０９０７３１５－１０９０７３３５、ｃｈｒ１６：１０９１６４２６－１０９１６４４６、ｃｈｒ１６：１０９０９１３８－１０９０９１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１０１－１０９０８１２１、ｃｈｒ１６：１０９０７７９０－１０９０７８１０、ｃｈｒ１６：１０９０７７８７－１０９０７８０７、ｃｈｒ１６：１０９０７４５４－１０９０７４７４、ｃｈｒ１６：１０８９５７０２－１０８９５７２２、ｃｈｒ１６：１０９０２７２９－１０９０２７４９、ｃｈｒ１６：１０９１８４９２－１０９１８５１２、ｃｈｒ１６：１０９０７９３２－１０９０７９５２、ｃｈｒ１６：１０９０７６２３－１０９０７６４３、ｃｈｒ１６：１０９０７４６１－１０９０７４８１、ｃｈｒ１６：１０９０２７２３－１０９０２７４３、ｃｈｒ１６：１０９０７６２２－１０９０７６４２、ｃｈｒ１６：１０９２２４４１－１０９２２４６１、ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－１０９０２６８２、ｃｈｒ１６：１０９１５６２６－１０９１５６４６、ｃｈｒ１６：１０９１５５９２－１０９１５６１２、ｃｈｒ１６：１０９０７３８５－１０９０７４０５、ｃｈｒ１６：１０９０７０３０－１０９０７０５０、ｃｈｒ１６：１０９０７９３５－１０９０７９５５、ｃｈｒ１６：１０９０６８５３－１０９０６８７３、ｃｈｒ１６：１０９０６７５７－１０９０６７７７、ｃｈｒ１６：１０９０７７３０－１０９０７７５０、及びｃｈｒ１６：１０８９５３０２－１０８９５３２２から選択されるゲノム座標に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含む、実施形態７０～７６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７８
ｃｈｒ６：２９９４２８５４－２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－２９９４３６１９から選択されるゲノム座標、任意選択で、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡをさらに含む、実施形態７０～７７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７９
前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態５１～６９のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ、または実施形態７０～７８のいずれか１つのいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８０
前記組成物が、非発熱性である、実施形態７９に記載のガイドまたは組成物。
実施形態８１
前記ガイドＲＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、実施形態５１～６９のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡまたは実施形態７０～８０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８２
細胞を、実施形態５１～８１のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡまたは組成物と接触させることを含む、前記細胞内のＴＩＭ３配列において遺伝子修飾を行う方法。
実施形態８３
ＴＣＲ配列においてＴＣＲ遺伝子の発現を阻害するための遺伝子修飾を行うことをさらに含む、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４
免疫療法のための細胞集団を調製する方法であって、
ａ．ＴＩＭ３ガイドＲＮＡまたは実施形態５１～８１のいずれか１つに記載の組成物を有する集団内の細胞中のＴＩＭ３配列において遺伝子修飾を行うことと、
ｂ．前記集団の前記細胞中のＴＣＲ配列において遺伝子修飾を行い、前記集団内の前記細胞の前記表面上の前記ＴＣＲタンパク質の発現を低減することと、
ｃ．培養物中の前記細胞集団を増殖することと、を含む、前記方法。
実施形態８５
前記細胞の前記表面上の前記ＴＣＲタンパク質の発現が、前記集団内の前記細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の検出レベル未満に低減される、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６
前記集団の前記細胞におけるＴＣＲ配列の前記遺伝子修飾が、２つ以上のＴＣＲ配列の修飾を含む、実施形態８４または８５に記載の方法。
実施形態８７
２つ以上の前記ＴＣＲ配列が、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣを含む、実施形態８６の方法。
実施形態８８
任意選択で、ＴＲＡＣ遺伝子座で、前記操作された細胞、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲの前記表面上に発現される標的化受容体をコードする外因性核酸の挿入を含む、実施形態８４～８７のいずれかに記載の方法。
実施形態８９
前記細胞を、前記ＴＩＭ３ガイドＲＮＡを含むＬＮＰ組成物と接触させることをさらに含む、実施形態８４～８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０
前記細胞を、ガイドＲＮＡを含む第２のＬＮＰ組成物と接触させることを含む、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１
実施形態８２～９０のいずれか１つに記載の方法によって作製される細胞集団。
実施形態９２
細胞集団が、エクスビボで改変される、実施形態９１に記載の細胞集団。
実施形態９３
実施形態９１または９２に記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
実施形態９４
実施形態９１もしくは９２に記載の細胞集団、または実施形態９３に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法。
実施形態９５
実施形態９１もしくは９２に記載の細胞集団、または実施形態９３に記載の薬学的組成物を、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する方法。
実施形態９６
ＡＣＴ療法として使用するための、実施形態９１もしくは９２に記載の細胞集団、または実施形態９１に記載の薬学的組成物。
実施形態９７
前記集団内の細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、前記内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、ＴＩＭ３遺伝子の遺伝子修飾を含む細胞集団。
実施形態９８
前記遺伝子修飾が、実施形態１～４のいずれかで定義されるとおりである、実施形態９７に記載の細胞集団。
実施形態９９
ＴＩＭ３の発現が、例えば、前記ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態９７または９８に記載の細胞集団。
実施形態１００
細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、前記内因性ＴＣＲ遺伝子配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、ＴＣＲ遺伝子の遺伝子修飾を含む、実施形態９７～９９のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１０１
前記遺伝子修飾が、実施形態５～８のいずれかで定義されるとおりである、実施形態１００に記載の細胞集団。
実施形態１０２
ＴＣＲの発現が、例えば、前記ＴＣＲ遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態１００または１０１に記載の細胞集団。
実施形態１０３
前記集団が、少なくとも１０３、１０４、１０５または１０６個の細胞、好ましくは１０７、２×１０７、５×１０７、または１０８個の細胞を含む、実施形態９７～１０２のいずれかに記載の細胞集団。
実施形態１０４
前記集団内の細胞の少なくとも７０％が、前記内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態９７～１０３のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１０５
前記集団内の細胞の少なくとも８０％が、前記内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態９７～１０４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１０６
前記集団内の細胞の少なくとも９０％が、前記内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態９７～１０５のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１０７
前記集団内の細胞の少なくとも９５％が、前記内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、実施形態９７～１０６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１０８
ＴＩＭ３の発現が、例えば、前記ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも７０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態９７～１０７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１０９
ＴＩＭ３の発現が、例えば、前記ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも８０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態９７～１０８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１１０
ＴＩＭ３の発現が、例えば、前記ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも９０％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態９７～１０９のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１１１
ＴＩＭ３の発現が、例えば、前記ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも９５％、またはアッセイの検出限界未満まで減少する、実施形態９７～１１０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１１２
実施形態９７～１１１のいずれか１つに記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
実施形態１１３
ＡＣＴ療法として使用するための、実施形態９７～１１１のいずれかに記載の細胞集団または実施形態１１２に記載の薬学的組成物。
実施形態１１４
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８６７－１５７１０６８８７のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１１５
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１１６
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８０３－１５７１０６８２３のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１１７
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８５０－１５７１０６８７０のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１１８
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０４７２６－１５７１０４７４６のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１１９
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６６６８－１５７１０６６８８のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２０
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０４６８１－１５７１０４７０１のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２１
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０４６８１－１５７１０４７０１のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２２
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０４６８０－１５７１０４７００のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２３
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６６７６－１５７１０６６９６のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２４
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０８７２７１－１５７０８７２９１のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２５
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０９５４３２－１５７０９５４５２のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２６
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０９５３６１－１５７０９５３８１のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２７
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０９５３６０－１５７０９５３８０のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２８
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１２９
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６７５１－１５７１０６７７１のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３０
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０９５４１９－１５７０９５４３９のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３１
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０４６７９－１５７１０４６９９のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３２
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８２４－１５７１０６８４４のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３３
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０８７１１７－１５７０８７１３７のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３４
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０９５３７９－１５７０９５３９９のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３５
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８６４－１５７１０６８８４のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３６
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０９５４０５－１５７０９５４２５のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３７
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０９５４０４－１５７０９５４２４のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３８
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８８８－１５７１０６９０８のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１３９
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８８９－１５７１０６９０９のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４０
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６９３５－１５７１０６９５５のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４１
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６６４１－１５７１０６６６１のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４２
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０８７０８４－１５７０８７１０４のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４３
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０４６６３－１５７１０４６８３のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４４
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６８７５－１５７１０６８９５のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４５
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７０８７１８４－１５７０８７２０４のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４６
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０６９３６－１５７１０６９５６のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４７
前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ５：１５７１０４６９６－１５７１０４７１６のゲノム座標内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の操作された細胞、ガイドＲＮＡ、組成物、薬学的組成物、または方法。
実施形態１４８
前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：

または
それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５２９１９－２４１８５２９３９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１５－２４１８５２９３５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５０－２４１８５２７７０、ｃｈｒ２：２４１８５２２６４－２４１８５２２８４、ｃｈｒ２：２４１８５２２６５－２４１８５２２８５、ｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７、ｃｈｒ２：２４１８５２２０１－２４１８５２２２１、ｃｈｒ２：２４１８５８７８９－２４１８５８８０９、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５８７５５－２４１８５８７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５５－２４１８５２７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５８７５５－２４１８５８７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２９１９－２４１８５２９３９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１５－２４１８５２９３５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、ｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７、及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８９－２４１８５８８０９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１９－２４１８５２９３９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１５－２４１８５２９３５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５５－２４１８５２７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、及びｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５８７５５－２４１８５８７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、ｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３、ｃｈｒ２：２４１８５２１８８－２４１８５２２０８、及びｃｈｒ２：２４１８５２２０１－２４１８５２２２１から選択されるゲノム座標、または
それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８， ｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３、及びｃｈｒ２：２４１８５２２０１－２４１８５２２２１から選択されるゲノム座標、または
ｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７のゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態２５に記載の操作された細胞。

Claims (52)

  1. ｃｈｒ５：１５７０８５８３２－１５７１０９０４４のゲノム座標内に、ヒトＴＩＭ３配列における遺伝子修飾を含む、操作された細胞。
  2. 前記遺伝子修飾が、挿入、欠失、及び置換から選択される、請求項１に記載の操作された細胞。
  3. 前記遺伝子修飾が、前記ＴＩＭ３遺伝子の発現を阻害する、請求項１または２に記載の操作された細胞。
  4. 前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：


    または
    ＴＩＭ３－１～ＴＩＭ３－４、ＴＩＭ３－６～ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－１８、ＴＩＭ３－１９、ＴＩＭ３－２２、ＴＩＭ３－２９、ＴＩＭ３－４２、ＴＩＭ３－４４、ＴＩＭ３－５８、ＴＩＭ３－６２、ＴＩＭ３－６９、ＴＩＭ３－８２、ＴＩＭ３－８６、及びＴＩＭ３－８８によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０６８６７－１５７１０６８８７、ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２、ｃｈｒ５：１５７１０６８０３－１５７１０６８２３、ｃｈｒ５：１５７１０６８５０－１５７１０６８７０、ｃｈｒ５：１５７１０６６６８－１５７１０６６８８、ｃｈｒ５：１５７１０４６８１－１５７１０４７０１、ｃｈｒ５：１５７１０４６８１－１５７１０４７０１、ｃｈｒ５：１５７１０４６８０－１５７１０４７００、ｃｈｒ５：１５７１０６６７６－１５７１０６６９６、ｃｈｒ５：１５７０８７２７１－１５７０８７２９１、ｃｈｒ５：１５７０９５４３２－１５７０９５４５２、ｃｈｒ５：１５７０９５３６１－１５７０９５３８１、ｃｈｒ５：１５７０９５３６０－１５７０９５３８０、ｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５、ｃｈｒ５：１５７１０６７５１－１５７１０６７７１、ｃｈｒ５：１５７０９５４１９－１５７０９５４３９、ｃｈｒ５：１５７１０４６７９－１５７１０４６９９、ｃｈｒ５：１５７０９５３７９－１５７０９５３９９、ｃｈｒ５：１５７０９５４０５－１５７０９５４２５、ｃｈｒ５：１５７０９５４０４－１５７０９５４２４、ｃｈｒ５：１５７０８７１２６－１５７０８７１４６、ｃｈｒ５：１５７１０６８８９－１５７１０６９０９、ｃｈｒ５：１５７０８７０８４－１５７０８７１０４、ｃｈｒ５：１５７１０６８７５－１５７１０６８９５、ｃｈｒ５：１５７０８７１８４－１５７０８７２０４、及びｃｈｒ５：１５７１０４６９６－１５７１０４７１６、または
    ＴＩＭ３－１～ＴＩＭ３－５、ＴＩＭ３－７、ＴＩＭ３－８、ＴＩＭ３－１２～ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－２３、ＴＩＭ３－２６、ＴＩＭ３－３２、ＴＩＭ３－５６、ＴＩＭ３－５９、ＴＩＭ３－６３、ＴＩＭ３－６６、ＴＩＭ３－７５、及びＴＩＭ３－８７によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０６８６７－１５７１０６８８７、ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２、ｃｈｒ５：１５７１０６８０３－１５７１０６８２３、ｃｈｒ５：１５７１０６８５０－１５７１０６８７０、ｃｈｒ５：１５７１０６６６８－１５７１０６６８８、ｃｈｒ５：１５７１０４６８１－１５７１０４７０１、ｃｈｒ５：１５７１０４６８１－１５７１０４７０１、ｃｈｒ５：１５７０９５４３２－１５７０９５４５２、ｃｈｒ５：１５７０９５３６１－１５７０９５３８１、ｃｈｒ５：１５７０９５３６０－１５７０９５３８０、ｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５、ｃｈｒ５：１５７１０６８２４－１５７１０６８４４、ｃｈｒ５：１５７０８７１１７－１５７０８７１３７、ｃｈｒ５：１５７１０６８６４－１５７１０６８８４、ｃｈｒ５：１５７１０６８８８－１５７１０６９０８、ｃｈｒ５：１５７０８７２５３－１５７０８７２７３、ｃｈｒ５：１５７１０６９３５－１５７１０６９５５、ｃｈｒ５：１５７１０６６４１－１５７１０６６６１、ｃｈｒ５：１５７１０４６６３－１５７１０４６８３、及びｃｈｒ５：１５７１０６９３６－１５７１０６９５６、または
    ＴＩＭ３－２、ＴＩＭ３－４、ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－２３、ＴＩＭ３－５６、ＴＩＭ３－５９、ＴＩＭ３－６３、ＴＩＭ３－７５、及びＴＩＭ３－８７によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：それぞれ、ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２、ｃｈｒ５：１５７１０６８５０－１５７１０６８７０、ｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５、ｃｈｒ５：１５７１０６８２４－１５７１０６８４４、ｃｈｒ５：１５７１０６８８８－１５７１０６９０８、ｃｈｒ５：１５７０８７２５３－１５７０８７２７３、ｃｈｒ５：１５７１０６９３５－１５７１０６９５５、ｃｈｒ５：１５７１０４６６３－１５７１０４６８３、及びｃｈｒ５：１５７１０６９３６－１５７１０６９５６、または
    ＴＩＭ３－１～ＴＩＭ３－４によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０６８６７－１５７１０６８８７、ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２、ｃｈｒ５：１５７１０６８０３－１５７１０６８２３、及びｃｈｒ５：１５７１０６８５０－１５７１０６８７０、または
    ＴＩＭ３－２、ＴＩＭ－４、及びＴＩＭ３－１５によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２、ｃｈｒ５：１５７１０６８５０－１５７１０６８７０、及びｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５、または
    ＴＩＭ３－２、ＴＩＭ－４、ＴＩＭ３－１５、ＴＩＭ３－６３、及びＴＩＭ３－８７によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２、ｃｈｒ５：１５７１０６８５０－１５７１０６８７０、ｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５、ｃｈｒ５：１５７１０６９３５－１５７１０６９５５、及びｃｈｒ５：１５７１０６９３６－１５７１０６９５６ｙ、または
    ＴＩＭ３－２及びＴＩＭ３－１５によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０６８６２－１５７１０６８８２及びｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５、または
    ＴＩＭ３－６３及びＴＩＭ３－８７によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０６９３５－１５７１０６９５５及びｃｈｒ５：１５７１０６９３６－１５７１０６９５６、または
    ＴＩＭ３－１５によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ５：１５７１０８９４５－１５７１０８９６５内に少なくとも１個のヌクレオチドの修飾を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  5. 前記操作された細胞が、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列のゲノム座標内の遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、ＴＣＲ遺伝子の発現を阻害し、任意選択で、前記ＴＣＲ遺伝子が、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣである、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  6. 以下から選択されるゲノム座標内にＴＲＢＣの遺伝子修飾を含む、請求項５に記載の操作された細胞。


  7. 以下から選択されるゲノム座標内にＴＲＡＣの遺伝子修飾を含むか、



    または前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ１４：２２５４７５２４－２２５４７５４４、ｃｈｒ１４：２２５４７５２９－２２５４７５４９、ｃｈｒ１４：２２５４７５２５－２２５４７５４５、ｃｈｒ１４：２２５４７５３６－２２５４７５５６、ｃｈｒ１４：２２５４７５０１－２２５４７５２１、ｃｈｒ１４：２２５４７５５６－２２５４７５７６、及びｃｈｒ１４：２２５４７５０２－２２５４７５２２から選択されるゲノム座標内にある、請求項４～６のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  8. 前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、１つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を阻害する、請求項１～７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  9. １つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、Ｂ２Ｍ配列における遺伝子修飾であり、前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標内にある、請求項８に記載の操作された細胞。


  10. １つ以上のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、ＨＬＡ－Ａ配列における遺伝子修飾であり、任意選択で、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ６：２９９４２８５４－ｃｈｒ６：２９９４２９１３及びｃｈｒ６：２９９４３５１８－ｃｈｒ６：２９９４３６１９から選択されるゲノム座標、任意選択で、ｃｈｒ６：２９９４２８６４－２９９４２８８４、ｃｈｒ６：２９９４２８６８－２９９４２８８８、ｃｈｒ６：２９９４２８７６－２９９４２８９６、ｃｈｒ６：２９９４２８７７－２９９４２８９７、ｃｈｒ６：２９９４２８８３－２９９４２９０３、ｃｈｒ６：２９９４３１２６－２９９４３１４６、ｃｈｒ６：２９９４３５２８－２９９４３５４８、ｃｈｒ６：２９９４３５２９－２９９４３５４９、ｃｈｒ６：２９９４３５３０－２９９４３５５０、ｃｈｒ６：２９９４３５３７－２９９４３５５７、ｃｈｒ６：２９９４３５４９－２９９４３５６９、ｃｈｒ６：２９９４３５８９－２９９４３６０９、及びｃｈｒ６：２９９４４０２６－２９９４４０４６から選択されるゲノム座標内にある、請求項８に記載の操作された細胞。
  11. 前記細胞が、遺伝子修飾を含み、前記遺伝子修飾が、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を阻害する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  12. １つ以上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を阻害する前記遺伝子修飾が、ＣＩＩＴＡ配列における遺伝子修飾であり、前記遺伝子修飾が、ｃｈｒ：１６：１０９０２１７１－１０９２３２４２、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－１０９２３２８５、ｃｈｒ１６：１０９０６５４２－１０９２３２８５、またはｃｈｒ１６：１０９０６５４２－１０９０８１２１、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９０８１３２－１０９０８１５２、ｃｈｒ１６：１０９０８１３１－１０９０８１５１、ｃｈｒ１６：１０９１６４５６－１０９１６４７６、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９０９０２２－１０９０９０４２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１２－１０９１８５３２、ｃｈｒ１６：１０９１８５１１－１０９１８５３１、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５５－１０９１６４７５、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、ｃｈｒ１６：１０９０９００６－１０９０９０２６、ｃｈｒ１６：１０９２２４７８－１０９２２４９８、ｃｈｒ１６：１０８９５７４７－１０８９５７６７、ｃｈｒ１６：１０９１６３４８－１０９１６３６８、ｃｈｒ１６：１０９１０１８６－１０９１０２０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８１－１０９０６５０１、ｃｈｒ１６：１０９０９００７－１０９０９０２７、ｃｈｒ１６：１０８９５４１０－１０８９５４３０、及びｃｈｒ１６：１０９０８１３０－１０９０８１５０、任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９１８５０４－１０９１８５２４、ｃｈｒ１６：１０９２３２１８－１０９２３２３８、ｃｈｒ１６：１０９２３２１９－１０９２３２３９、ｃｈｒ１６：１０９２３２２１－１０９２３２４１、ｃｈｒ１６：１０９０６４８６－１０９０６５０６、ｃｈｒ１６：１０９０６４８５－１０９０６５０５、ｃｈｒ１６：１０９０３８７３－１０９０３８９３、ｃｈｒ１６：１０９０９１７２－１０９０９１９２、ｃｈｒ１６：１０９１８４２３－１０９１８４４３、ｃｈｒ１６：１０９１６３６２－１０９１６３８２、ｃｈｒ１６：１０９１６４５０－１０９１６４７０、ｃｈｒ１６：１０９２２１５３－１０９２２１７３、ｃｈｒ１６：１０９２３２２２－１０９２３２４２、ｃｈｒ１６：１０９１０１７６－１０９１０１９６、ｃｈｒ１６：１０８９５７４２－１０８９５７６２、ｃｈｒ１６：１０９１６４４９－１０９１６４６９、ｃｈｒ１６：１０９２３２１４－１０９２３２３４、ｃｈｒ１６：１０９０６４９２－１０９０６５１２、及びｃｈｒ１６：１０９０６４８７－１０９０６５０、または任意選択で、ｃｈｒ１６：１０９１６４３２－１０９１６４５２、ｃｈｒ１６：１０９２２４４４－１０９２２４６４、ｃｈｒ１６：１０９０７９２４－１０９０７９４４、ｃｈｒ１６：１０９０６９８５－１０９０７００５、ｃｈｒ１６：１０９０８０７３－１０９０８０９３、ｃｈｒ１６：１０９０７４３３－１０９０７４５３、ｃｈｒ１６：１０９０７９７９－１０９０７９９９、ｃｈｒ１６：１０９０７１３９－１０９０７１５９、ｃｈｒ１６：１０９２２４３５－１０９２２４５５、ｃｈｒ１６：１０９０７３８４－１０９０７４０４、ｃｈｒ１６：１０９０７４３４－１０９０７４５４、ｃｈｒ１６：１０９０７１１９－１０９０７１３９、ｃｈｒ１６：１０９０７５３９－１０９０７５５９、ｃｈｒ１６：１０９０７８１０－１０９０７８３０、ｃｈｒ１６：１０９０７３１５－１０９０７３３５、ｃｈｒ１６：１０９１６４２６－１０９１６４４６、ｃｈｒ１６：１０９０９１３８－１０９０９１５８、ｃｈｒ１６：１０９０８１０１－１０９０８１２１、ｃｈｒ１６：１０９０７７９０－１０９０７８１０、ｃｈｒ１６：１０９０７７８７－１０９０７８０７、ｃｈｒ１６：１０９０７４５４－１０９０７４７４、ｃｈｒ１６：１０８９５７０２－１０８９５７２２、ｃｈｒ１６：１０９０２７２９－１０９０２７４９、ｃｈｒ１６：１０９１８４９２－１０９１８５１２、ｃｈｒ１６：１０９０７９３２－１０９０７９５２、ｃｈｒ１６：１０９０７６２３－１０９０７６４３、ｃｈｒ１６：１０９０７４６１－１０９０７４８１、ｃｈｒ１６：１０９０２７２３－１０９０２７４３、ｃｈｒ１６：１０９０７６２２－１０９０７６４２、ｃｈｒ１６：１０９２２４４１－１０９２２４６１、ｃｈｒ１６：１０９０２６６２－１０９０２６８２、ｃｈｒ１６：１０９１５６２６－１０９１５６４６、ｃｈｒ１６：１０９１５５９２－１０９１５６１２、ｃｈｒ１６：１０９０７３８５－１０９０７４０５、ｃｈｒ１６：１０９０７０３０－１０９０７０５０、ｃｈｒ１６：１０９０７９３５－１０９０７９５５、ｃｈｒ１６：１０９０６８５３－１０９０６８７３、ｃｈｒ１６：１０９０６７５７－１０９０６７７７、ｃｈｒ１６：１０９０７７３０－１０９０７７５０、及びｃｈｒ１６：１０８９５３０２－１０８９５３２２から選択されるゲノム座標内にある、請求項１１に記載の操作された細胞。
  13. 前記細胞が、ＴＩＭ３タンパク質の細胞表面発現が低減されているか、または前記細胞が、ＴＩＭ３タンパク質の細胞表面発現が低減されており、かつＴＲＡＣタンパク質もしくはＴＲＢＣタンパク質の細胞表面発現が低減されている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  14. ｃｈｒ１：１６０８３０１６０－１６０８６２８８７のゲノム座標内に、ヒト２Ｂ４／ＣＤ２４４配列における遺伝子修飾を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  15. ２Ｂ４／ＣＤ２４４における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：


    または
    ２Ｂ４－１～２Ｂ４－５によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ１：１６０８４１６１１－１６０８４１６３１、ｃｈｒ１：１６０８４１８６５－１６０８４１８８５、ｃｈｒ１：１６０８６２６２４－１６０８６２６４４、ｃｈｒ１：１６０８６２６７１－１６０８６２６９１、及びｃｈｒ１：１６０８４１６２２－１６０８４１６４２、または
    ２Ｂ４－１及び２Ｂ４－２によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ１：１６０８４１６１１－１６０８４１６３１及びｃｈｒ１：１６０８４１８６５－１６０８４１８８５、または
    ２Ｂ４－３、２Ｂ４－４、２Ｂ４－１０、及び２Ｂ４－１７によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ１：１６０８６２６２４－１６０８６２６４４、ｃｈｒ１：１６０８６２６７１－１６０８６２６９１、ｃｈｒ１：１６０８４１８０６－１６０８４１８２６、及びｃｈｒ１：１６０８４１６７９－１６０８４１６９９内にある、請求項１４に記載の操作された細胞。
  16. ｃｈｒ１２：６７７２４８３－６７７８４５５のゲノム座標内に、ヒトＬＡＧ３配列における遺伝子修飾を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  17. ＬＡＧ３における前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：

    または
    ＬＡＧ３－１～ＬＡＧ３－１５によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ１２：６７７３９３８－６７７３９５８、ｃｈｒ１２：６７７４６７８－６７７４６９８、ｃｈｒ１２：６７７２８９４－６７７２９１４、ｃｈｒ１２：６７７４８１６－６７７４８３６、ｃｈｒ１２：６７７４７４２－６７７４７６２、ｃｈｒ１２：６７７５３８０－６７７５４００、ｃｈｒ１２：６７７４７２７－６７７４７４７、ｃｈｒ１２：６７７４７３２－６７７４７５２、ｃｈｒ１２：６７７７４３５－６７７７４５５、ｃｈｒ１２：６７７４７７１－６７７４７９１、ｃｈｒ１２：６７７２９０９－６７７２９２９、ｃｈｒ１２：６７７４７３５－６７７４７５５、ｃｈｒ１２：６７７３７８３－６７７３８０３、ｃｈｒ１２：６７７５２９２－６７７５３１２、及びｃｈｒ１２：６７７７４３３－６７７７４５３、または
    ＬＡＧ３－１～ＬＡＧ３－１１によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ１２：６７７３９３８－６７７３９５８、ｃｈｒ１２：６７７４６７８－６７７４６９８、ｃｈｒ１２：６７７２８９４－６７７２９１４、及びｃｈｒ１２：６７７４８１６－６７７４８３６、ｃｈｒ１２：６７７４７４２－６７７４７６２、ｃｈｒ１２：６７７５３８０－６７７５４００、ｃｈｒ１２：６７７４７２７－６７７４７４７、ｃｈｒ１２：６７７４７３２－６７７４７５２、ｃｈｒ１２：６７７７４３５－６７７７４５５、ｃｈｒ１２：６７７４７７１－６７７４７９１、及びｃｈｒ１２：６７７２９０９－６７７２９２９、または
    ＬＡＧ３－１～ＬＡＧ３－４によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ１２：６７７３９３８－６７７３９５８、ｃｈｒ１２：６７７４６７８－６７７４６９８、ｃｈｒ１２：６７７２８９４－６７７２９１４、及びｃｈｒ１２：６７７４８１６－６７７４８３６、または
    ＬＡＧ３－１、ＬＡＧ３－４、ＬＡＧ３－５、及びＬＡＧ３－９によって標的とされるものから選択されるゲノム座標：ｃｈｒ１２：６７７３９３８－６７７３９５８、ｃｈｒ１２：６７７４８１６－６７７４８３６、ｃｈｒ１２：６７７４７４２－６７７４７６２、及びｃｈｒ１２：６７７７４３５－６７７７４５５内にある、請求項１６に記載の操作された細胞。
  18. ｃｈｒ２：２４１８４９８８１－２４１８５８９０８のゲノム座標内に、ヒトＰＤ－１配列における遺伝子修飾を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  19. 前記遺伝子修飾が、以下から選択されるゲノム座標：

    または
    それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５２９１９－２４１８５２９３９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１５－２４１８５２９３５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５０－２４１８５２７７０、ｃｈｒ２：２４１８５２２６４－２４１８５２２８４、ｃｈｒ２：２４１８５２２６５－２４１８５２２８５、ｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７、ｃｈｒ２：２４１８５２２０１－２４１８５２２２１、ｃｈｒ２：２４１８５８７８９－２４１８５８８０９、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５８７５５－２４１８５８７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５５－２４１８５２７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
    それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５８７５５－２４１８５８７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２９１９－２４１８５２９３９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１５－２４１８５２９３５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、ｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７、及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
    それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８９－２４１８５８８０９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１９－２４１８５２９３９、ｃｈｒ２：２４１８５２９１５－２４１８５２９３５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５５－２４１８５２７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、及びｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７から選択されるゲノム座標、または
    それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５８７５５－２４１８５８７７５、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
    それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８及びｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３から選択されるゲノム座標、または
    それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８、ｃｈｒ２：２４１８５２７５１－２４１８５２７７１、ｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３、ｃｈｒ２：２４１８５２１８８－２４１８５２２０８、及びｃｈｒ２：２４１８５２２０１－２４１８５２２２１から選択されるゲノム座標、または
    それぞれ、ｃｈｒ２：２４１８５８７８８－２４１８５８８０８， ｃｈｒ２：２４１８５２７０３－２４１８５２７２３、及びｃｈｒ２：２４１８５２２０１－２４１８５２２２１から選択されるゲノム座標、または
    ｃｈｒ２：２４１８５８８０７－２４１８５８８２７のゲノム座標内に少なくとも１個のヌクレオチドの修飾を含む、請求項１８に記載の操作された細胞。
  20. 前記遺伝子修飾が、インデルを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  21. 前記遺伝子修飾が、異種コード配列の挿入を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  22. 前記遺伝子修飾が、置換を含み、任意選択で、前記置換が、ＣからＴへの置換またはＡからＧへの置換を含む、請求項１～１９及び２１のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  23. 前記遺伝子修飾により、遺伝子修飾前に、全長タンパク質のアミノ酸配列を有する前記全長タンパク質の翻訳を妨げる、前記核酸配列の変化がもたらされ、任意選択で、前記遺伝子修飾により、前記全長タンパク質のコード配列における早期終止コドンをもたらす前記核酸配列の変化がもたらされるか、または前記ゲノム遺伝子座からのｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの変化がもたらされる、請求項１～２２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  24. 前記細胞が、前記操作された細胞の前記表面上で発現される標的化受容体をコードする外因性核酸を含み、任意選択で、前記標的化受容体が、ＣＡＲまたはＴＣＲである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  25. 前記操作された細胞が、Ｔ細胞である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  26. 請求項１～２５のいずれか１項に記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
  27. 請求項１～２５のいずれか１項に記載の操作された細胞を含む、細胞集団。
  28. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する、方法。
  29. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物を、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する、方法。
  30. ＡＣＴ療法として使用するための、請求項１～２７のいずれか１項に記載の操作された細胞、細胞集団、または薬学的組成物。
  31. ａ．配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｂ．配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８の配列から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｃ．配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一または少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｄ．配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｅ．配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｆ．配列番号２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｇ．配列番号１～４から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｈ．配列番号２、４、及び１５から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｉ．配列番号２、４、１５、６３、及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｊ．配列番号２及び１５から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、
    ｋ．配列番号６３及び８７から選択されるヌクレオチド配列を含むガイド配列、及び
    ｌ．配列番号１５のヌクレオチド配列を含むガイド配列、から選択されるヌクレオチド配列を含むＴＩＭ３配列に特異的にハイブリダイズする、ＴＩＭ３ガイドＲＮＡ。
  32. ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を、配列番号１～１５、１８、１９、２２、２３、２６、２９、３２、４２、４４、５６、５８、５９、６２、６３、６６、６９、７５、８２、８６、８７、及び８８によって標的とされるものから選択される、または配列番号１～４、６～１５、１８、１９、２２、２９、４２、４４、５８、６２、６９、８２、８６、及び８８によって標的とされるゲノム座標から選択される、または配列番号１～５、７、８、１２～１５、２３、２６、３２、５６、５９、６３、６６、７５、及び８７によって標的とされるゲノム座標から選択される、または２、４、１５、２３、５６、５９、６３、７５、及び８７によって標的とされるゲノム座標から選択される、または配列番号１～４によって標的とされるゲノム座標から選択される、または配列番号２、４、及び１５によって標的とされるゲノム座標から選択される、または配列番号２、４、１５、６３、及び８７によって標的とされるゲノム座標から選択される、または配列番号２及び１５によって標的とされるゲノム座標から選択されるゲノム座標、または配列番号６３及び８７によって標的とされるゲノム座標、または配列番号１５によって標的とされるゲノム座標内の染色体位置に指向するガイド配列を含む、ＴＩＭ３ガイドＲＮＡ。
  33. 前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項３１または３２に記載のガイドＲＮＡ。
  34. 前記ガイド配列に対して３’に配列番号２０１のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ガイドＲＮＡが、５’末端修飾または３’末端修飾を含む、請求項３３に記載のガイドＲＮＡ。
  35. ５’末端修飾または３’末端修飾及びｇＲＮＡの保存部分をさらに含み、前記保存部分が、
    Ａ．配列番号２０１に対して、短縮されたヘアピン１領域、または置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン１領域であって、
    １．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、またはＨ１－４及びＨ１－９のうちの少なくとも１つが、前記置換されかつ任意選択で短縮されたヘアピン１においてワトソン－クリック対形成ヌクレオチドで置換されており、前記ヘアピン１領域が、任意選択で、
    ａ．Ｈ１－５～Ｈ１－８のうちのいずれか１つもしくは２つ、
    ｂ．以下のヌクレオチド対：Ｈ１－１及びＨ１－１２、Ｈ１－２及びＨ１－１１、Ｈ１－３及びＨ１－１０、ならびにＨ１－４及びＨ１－９のうちの１つ、２つ、もしくは３つ、または
    ｃ．ヘアピン１領域の１～８個のヌクレオチドを欠いているか、あるいは
    ２．前記短縮されたヘアピン１領域が、４～８個のヌクレオチド、好ましくは４～６個のヌクレオチドを欠いており、
    ａ．位置Ｈ１－１、Ｈ１－２、もしくはＨ１－３のうちの１つ以上が、配列番号２０１に対して欠失もしくは置換されているか、または
    ｂ．位置Ｈ１－６～Ｈ１－１０のうちの１つ以上が、配列番号２０１に対して置換されているか、または
    ３．前記短縮されたヘアピン１領域が、５～１０個のヌクレオチド、好ましくは５～６個のヌクレオチドを欠いており、位置Ｎ１８、Ｈ１－１２、もしくはｎのうちの１つ以上が、配列番号２０１に対して置換されている、前記ヘアピン１領域、あるいは
    Ｂ．短縮された上部ステム領域であって、前記短縮された上部ステム領域が、１～６個のヌクレオチドを欠いており、前記短縮された上部ステム領域の６、７、８、９、１０、または１１個のヌクレオチドが、配列番号２０１に対して４個以下の置換を含む、前記短縮された上部ステム領域、あるいは
    Ｃ．ＬＳ６、ＬＳ７、ＵＳ３、ＵＳ１０、Ｂ３、Ｎ７、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｈ２－２、及びＨ２－１４のうちのいずれか１つ以上における配列番号２０１に対する置換であって、置換基ヌクレオチドが、アデニンが後に続くピリミジンでもなく、ピリミジンが前に存在するアデニンでもない、前記置換、あるいは
    Ｄ．上部ステム領域であって、前記上部ステムの修飾が、配列番号２０１に対して前記上部ステム領域におけるＵＳ１～ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含む、前記上部ステム領域のうちの１つ以上を含む、請求項３３に記載のガイドＲＮＡ。
  36. 前記ガイドＲＮＡが、ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）のパターンに従って修飾され、「Ｎ」が、任意の天然または非天然のヌクレオチドであってよく、ｍが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、＊が、ヌクレオチド残基間のホスホロチオエート連結であり、前記Ｎが、集合的に任意の先行請求項に記載のガイド配列のヌクレオチド配列であり、任意選択で、各Ｎが、独立して、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、前記ガイド配列が、前記ＴＩＭ３遺伝子に対してＣａｓ９を標的とする、請求項３３または３４に記載のガイドＲＮＡ。
  37. 前記ガイドＲＮＡが、修飾を含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ。
  38. 前記修飾が、（ｉ）２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’－Ｆ修飾ヌクレオチド、（ｉｉｉ）ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、（ｉｖ）前記ガイドＲＮＡの５’末端にある最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾、（ｖ）前記ガイドＲＮＡの３’末端にある最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾、（ｖｉ）前記ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチドの各々の間のＰＳ結合、（ｖｉｉ）前記ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチドの各々の間のＰＳ結合、（ｖｉｉｉ）前記ガイドＲＮＡの前記５’末端にある最初の３個のヌクレオチドの各々での２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｘ）前記ガイドＲＮＡの前記３’末端にある最後の３個のヌクレオチドの各々での２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、または（ｉ）～（ｉｘ）のうちの１つ以上の組み合わせを含む、請求項３７に記載のガイドＲＮＡ。
  39. 請求項３１～３８のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む組成物であって、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ポリペプチドＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ポリペプチドをコードする核酸であり、任意選択で、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、前記組成物。
  40. 前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３１～３８のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ、または請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記ガイドＲＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、請求項３１～４０のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡまたは組成物。
  42. 細胞内のＴＩＭ３配列において遺伝子修飾を行う方法であって、前記細胞を、請求項３１～４１のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡまたは組成物と接触させることを含む、前記方法。
  43. ＴＣＲ配列においてＴＣＲ遺伝子の発現を阻害するための遺伝子修飾を行うことをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 免疫療法のための細胞集団を調製する方法であって、
    ａ．ＴＩＭ３ガイドＲＮＡまたは請求項３１～４１のいずれか１項に記載の組成物を有する集団内の細胞中のＴＩＭ３配列において遺伝子修飾を行うことと、
    ｂ．前記集団の前記細胞中のＴＣＲ配列において遺伝子修飾を行い、前記集団内の前記細胞の前記表面上の前記ＴＣＲタンパク質の発現を低減することと、
    ｃ．培養物中の前記細胞集団を増殖することと、を含む、前記方法。
  45. 請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法によって作製される、細胞集団。
  46. 前記細胞集団が、エクスビボで改変される、請求項４５に記載の細胞集団。
  47. 請求項４５または４６に記載の細胞集団を、それを必要とする対象に投与する、方法。
  48. 請求項４５または４６に記載の集団を、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法として対象に投与する、方法。
  49. ＡＣＴ療法として使用するための、請求項４５または４６に記載の細胞集団。
  50. ＴＩＭ３遺伝子の遺伝子修飾を含む細胞集団であって、前記集団内の細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、前記細胞集団。
  51. ＴＩＭ３の発現が、例えば、前記ＴＩＭ３遺伝子が修飾されていない、好適な対照と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または前記アッセイの検出限界未満まで減少する、請求項５０に記載の細胞集団。
  52. 前記集団内の細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、前記内因性ＴＩＭ３配列における挿入、欠失、及び置換から選択される修飾を含む、請求項５０または５１に記載の細胞集団。
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