TWI843722B - 增強功能之經修飾免疫細胞及其篩選方法 - Google Patents

增強功能之經修飾免疫細胞及其篩選方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供經基因編輯的經修飾的免疫細胞或其前驅物（例如，經基因編輯的經修飾的T細胞），其包括對標靶抗原具有專一性的外源T細胞受體（TCR）及／或嵌合抗原受體（CAR），以及在一或多個內源基因座中的插入及／或缺失，其中內源基因座編碼T細胞功能的調節子，從而導致免疫細胞具有增強的功能。本發明亦提供組成物和治療方法。本發明提供篩選具有增強的免疫功能（例如，T細胞功效、T細胞記憶及／或T細胞持久性）的TCR或CAR-T細胞的方法。

Description

增強功能之經修飾免疫細胞及其篩選方法
本申請案享有以下美國臨時申請案優先權之權利：於2018年3月27日申請，申請號為62/648,722。前述案件通過引用而將其整體納入本文。
關於聯邦政府贊助研究或開發的聲明
本發明是在政府支持下完成，由國立衛生研究院(NIH)授予CA120409補助。政府對本發明享有一定的權利。
過繼性細胞療法領域目前包括CAR-和TCR-改造的T細胞，並已從基礎免疫原理發展出典範轉移的臨床免疫療法。過繼性細胞療法的T細胞被改造以用於表現所選擇的標靶細胞的人工受體，為攻擊癌症提供了令人興奮的新方法，並且對於慢性感染和自體免疫具有相同的前景。利用合成生物學的原理、免疫學和基因改造的進步可能產生顯示所需特異性和增強功能的人類T細胞。舉例來說，用CD19-特異性CAR T細胞治療的晚期B細胞白血病和淋巴瘤患者的臨床試驗已經成功誘發成人和兒童的持久性緩解。
T細胞衰竭是在許多慢性感染和癌症期間出現的T細胞功能障礙的狀態。其定義為較差的效應物功能(effector function)、抑制性受體的持續表現以及不同於功能性效應子或記憶T細胞的轉錄狀態。衰竭阻止了對感染和腫瘤的最佳控制。基於有效T細胞之療法的另一個障礙是T細胞容易受到標靶細胞微環境的免疫抑制。例如，PD-L1在攝護腺癌細胞微環境中抑制TCR-或CAR-改造的T細胞的功能。
因此，本領域亟需鑑定調節T細胞功能的基因。特別是，本領域需要鑑定調節TCR-或CAR-改造的T細胞功能的基因。
本發明基於以下研究結果：無偏的體內全基因體篩選可鑑定調節 T細胞功能(例如，T細胞功效、T細胞記憶及/或T細胞持久性)的基因。本發明提供篩選具有增強的免疫功能(例如標靶細胞殺傷)的TCR-或CAR-T細胞的方法。本發明的篩選方法導致鑑定出幾種基因，這些基因的下調導致TCR-或CAR-T細胞具有增強的免疫功能。因此，本發明提供了經修飾的免疫細胞，其包括外源TCR及/或CAR，以及內源基因座中的插入及/或缺失，其中內源基因座編碼T細胞功能的調節子。
另一方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，其包括在編碼一轉錄調節因子(transcriptional modulator)之一基因座中的一插入及/或缺失，其中插入及/或缺失能夠下調內源(endogenous)轉錄調節因子的基因表現；以及一外源T細胞受體(exogenous T cell receptor，TCR)及/或嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
在某些例示性實施例中，基因座中的插入及/或缺失是由一CRISPR相關系統所介導。在某些例示性實施例中，基因座中的插入及/或缺失是由CRISPR/Cas9所介導。在某些例示性實施例中，轉錄調節因子是一轉錄因子(transcription factor)或一表觀遺傳學調節子(epigenetic regulator)。
在某些例示性實施例中，轉錄因子是SIX2或KLF4。在某些例示性實施例中，轉錄因子是SIX2。在某些例示性實施例中，在編碼SIX2之基因座中的插入及/或缺失能夠下調SIX2的基因表現，及/或下調SIX2下游的一或多種標靶的基因表現。在某些例示性實施例中，轉錄因子是KLF4。在某些例示性實施例中，在編碼KLF4之基因座中的插入及/或缺失能夠下調KLF4的基因表現，及/或下調KLF4下游的一或多種標靶的基因表現。
在某些例示性實施例中，表觀遺傳學調節子是一組織蛋白甲基化的調節因子。在某些例示性實施例中，組織蛋白甲基化的調節因子是組織蛋白甲基轉移酶複合體的組分。在某些例示性實施例中，組織蛋白甲基轉移酶複合體的組分是組織蛋白-離胺酸-N-甲基轉移酶2D(histone-lysine-N-methyltransferase 2D，KMT2D)。
在某些例示性實施例中，組織蛋白甲基轉移酶複合體的組分是 PAGR1。在某些例示性實施例中，在編碼PAGR1之基因座中的插入及/或缺失能夠下調PAGR1相關組織蛋白甲基轉移酶複合體下游的一或多種標靶的基因表現。在某些例示性實施例中，PAGR1相關組織蛋白甲基轉移酶複合體下游的一或多種標靶是選自於ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3及TNFAIP3所組成的群組。
在某些例示性實施例中，外源TCR是選自於野生型TCR、高親和力TCR及嵌合TCR所組成的群組。在某些例示性實施例中，外源TCR包括至少一個雙硫鍵。在某些例示性實施例中，外源TCR包括TCR α鏈及TCR β鏈。
在某些例示性實施例中，外源CAR包括一抗原結合域(antigen-binding domain)、一跨膜域(transmembrane domain)及一胞內域(intracellular domain)。在某些例示性實施例中，抗原結合域是選自於抗體、scFv或Fab所組成的群組。在某些例示性實施例中，外源CAR更包括一鉸鏈域(hinge domain)。在某些例示性實施例中，鉸鏈域是選自於抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈域、包括CD8胺基酸序列的鉸鏈或其任意組合所組成的群組。在某些例示性實施例中，跨膜域是選自於人工疏水序列和第I型跨膜蛋白的跨膜域、T細胞受體的α、β或zeta鏈、CD28、CD3ε(CD3 epsilon)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154所組成的群組。在某些例示性實施例中，胞內域包括至少一個共刺激域，共刺激域是選自於TNFR超家族中蛋白質的共刺激域、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C及B7-H3所組成的群組。在某些例示性實施例中，胞內域包括選自於人類CD3 zeta鏈的細胞質訊息傳遞域、FcγRIII、FcsRI、Fc受體的細胞質尾、免疫受體酪胺酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的細胞質受體、TCR zeta，FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d所組成的群組的胞內域。
另一方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包 括：在編碼一蛋白之一或多個基因座中的一插入及/或缺失，該蛋白選自於AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組，其中該插入及/或缺失能夠下調一或多種內源基因的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
另一方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼一蛋白之一或多個基因座中的一插入及/或缺失，該蛋白選自於C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組，其中該插入及/或缺失能夠下調一或多種內源基因的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
另一方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼一蛋白之一或多個基因座中的一插入及/或缺失，該蛋白選自於KLF4、PAGR1及SIX2所組成的群組，其中該插入及/或缺失能夠下調一或多種內源基因的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
另一方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼KLF4之一基因座中的一插入及/或缺失，其中該插入及/或缺失能夠下調內源KLF4的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
另一方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼SIX2之基因座中的一插入及/或缺失，其中該插入及/或缺失能夠下調內源SIX2的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
另一方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼PAGR1之基因座中的一插入及/或缺失，其中該插入及/或缺失能夠下調內源PAGR1的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
在某些例示性實施例中，標靶細胞上的抗原是腫瘤相關抗原(TAA)。在一些實施例中，經修飾的細胞是自體細胞。在某些例示性實施例中，經修飾的細胞衍生自人類。在某些例示性實施例中，該經修飾的細胞是經修飾的T細胞。
另一方面，本發明提供一種產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法包括：a)將一第一核酸引入免疫細胞中，第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及b)將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一內源轉錄調節因子的基因表現。
在某些例示性實施例中，內源轉錄調節因子是一轉錄因子或一表觀遺傳學調節子。在某些例示性實施例中，轉錄因子是SIX2或KLF4。在某些例示性實施例中，下調轉錄因子的基因表現導致SIX2之下調的基因表現，及/或SIX2下游的一或多種標靶之下調的基因表現。在某些例示性實施例中，下調轉錄因子的基因表現導致KLF4之下調的基因表現，及/或KLF4下游的一或多種標靶之下調的基因表現。
在某些例示性實施例中，表觀遺傳學調節子是一組織蛋白甲基化的調節因子。在某些例示性實施例中，組織蛋白甲基化的調節因子是一組織蛋白甲基轉移酶複合體的組分。在某些例示性實施例中，組織蛋白甲基轉移酶複合體的組分是組織蛋白-離胺酸-N-甲基轉移酶2D(KMT2D)。在某些例示性實施例中，組織蛋白甲基轉移酶複合體的組分是PAGR1。在某些例示性實施例中，下調組織蛋白甲基轉移酶複合體的組分的基因表現導致PAGR1之下調的基因表現，及/或PAGR1相關組織蛋白甲基轉移酶複合體下游的一或多種標靶之下調的基因表現。在某些例示性實施例中，PAGR1相關組織蛋白甲基轉移酶複合體下游的一或多種標靶是選自於ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3及TNFAIP3所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：a)將一第一核酸引入免疫細胞中，第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR) 的核酸序列；以及b)將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：a)將一第一核酸引入免疫細胞中，第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及b)將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：a)將一第一核酸引入免疫細胞中，第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及b)將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於KLF4、PAGR1及SIX2所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：a)將一第一核酸引入免疫細胞中，第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及b)將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源KLF4的基因表現。
另一方面，本發明提供一種產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：a)將一第一核酸引入免疫細胞中，第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及b)將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源SIX2的基因表現。
另一方面，本發明提供一種產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞 的方法，包括：a)將一第一核酸引入免疫細胞中，第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及b)將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源PAGR1的基因表現。
在某些例示性實施例中，第一核酸是透過一病毒轉導過程而引入的。在某些例示性實施例中，病毒轉導過程包括使細胞與一病毒載體接觸，而病毒載體包括該第一核酸。在某些例示性實施例中，病毒載體是選自於反轉錄病毒載體(retroviral vector)、慢病毒載體(lentiviral vector)、腺病毒載體(adenoviral vector)及腺相關病毒載體(adeno-associated viral vector)所組成的群組。
在某些例示性實施例中，一或多種能夠下調基因表現的多肽及/或核酸包括一CRISPR相關系統。在某些例示性實施例中，CRISPR相關系統包括一CRISPR核酸酶及一引導RNA(guide RNA)。在某些例示性實施例中，引導RNA包括一引導序列，引導序列與一內源基因的一標靶序列充分地互補。在某些例示性實施例中，引導RNA包括SEQ ID NO：31至66中任一者所示的核酸序列。在某些例示性實施例中，CRISPR核酸酶及引導RNA包括一核糖核蛋白(RNP)複合體。
在某些例示性實施例中，標靶序列係位在PAGR1基因內，且包括SEQ ID NO：31至36中任一者所示的核酸序列。在某些例示性實施例中，標靶序列係位在SIX2基因內，且引導RNA包括SEQ ID NO：43至48中任一者所示的核酸序列。在某些例示性實施例中，標靶序列係位在USP27X基因內，且引導RNA包括SEQ ID NO：49至54中任一者所示的核酸序列。在某些例示性實施例中，標靶序列係位在CEACAM19基因內，且引導RNA包括SEQ ID NO：55至60中任一者所示的核酸序列。在某些例示性實施例中，標靶序列係位在C1orf141基因內，且引導RNA包括SEQ ID NO：61至66中任一者所示的核酸序列。
在某些例示性實施例中，CRISPR核酸酶及/或引導RNA由一多核苷酸所編碼。在某些例示性實施例中，多核苷酸包括載體及/或合成的 mRNA。
在某些例示性實施例中，一或多種能夠下調基因表現的多肽及/或核酸是透過電穿孔而引入的。在某些例示性實施例中，標靶細胞上的抗原是腫瘤相關抗原(TAA)。在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是自體細胞。在某些例示性實施例中，經修飾的細胞衍生自人類。在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是經修飾的T細胞。
另一方面，本發明提供一種增強經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的功能的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一內源轉錄調節因子的基因表現。
另一方面，本發明提供一種增強經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的功能的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種增強經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的功能的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種增強經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的功能的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或 多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於KLF4、PAGR1及SIX2所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種增強經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的功能的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源KLF4的基因表現。
另一方面，本發明提供一種增強經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的功能的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源SIX2的基因表現。
另一方面，本發明提供一種增強經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的功能的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源PAGR1的基因表現。
在某些例示性實施例中，功能是腫瘤浸潤(tumor infiltration)。在某些例示性實施例中，功能是腫瘤殺傷(tumor killing)。在某些例示性實施例中，功能是免疫抑制。在某些例示性實施例中，功能是對PD-1、LAG-3、TIM-3及/或CTLA-4的免疫抑制的抵抗力。
另一方面，本發明提供一種抑制經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的經活化誘導之細胞死亡的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一內源轉錄調節因子的基因表現。
另一方面，本發明提供一種抑制經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的經活化誘導之細胞死亡的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR) 及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種抑制經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的經活化誘導之細胞死亡的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種抑制經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的經活化誘導之細胞死亡的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，一或多種內源基因是選自於KLF4、PAGR1及SIX2所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種抑制經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的經活化誘導之細胞死亡的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源KLF4的基因表現。
另一方面，本發明提供一種抑制經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的經活化誘導之細胞死亡的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源SIX2的基因表現。
另一方面，本發明提供一種抑制經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的經活化誘導之細胞死亡的方法，其中經修飾的細胞包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力，該方法包括：將一或多種多肽及/或核酸引入免疫細胞中，一或多種多肽及/或核酸能夠下調內源PAGR1的基因表現。
在某些例示性實施例中，標靶細胞上的抗原是腫瘤相關抗原(TAA)。在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是自體細胞。在某些例示性實施例中，經修飾的細胞衍生自人類。在某些例示性實施例中，經修飾的細胞是經修飾的T細胞。
另一方面，本發明提供一種鑑定一基因的方法，基因在下調時導致一免疫細胞或其前驅細胞的功能增強，該方法包括以下步驟：a)向多個免疫細胞中引入編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之一外源T細胞受體(TCR)及/或一嵌合抗原受體(CAR)的一核酸庫，從而產生多個經修飾的免疫細胞；b)向多個經修飾的免疫細胞中引入多種靶向多個內源基因的試劑，從而產生多個經編輯的免疫細胞；c)將多個經編輯的免疫細胞與腫瘤細胞接觸；d)選擇一或多個表現出免疫細胞功能增強的經編輯的免疫細胞；以及e)鑑定在步驟d)所選擇的一或多個經編輯的免疫細胞中被下調的內源基因，從而鑑定出該基因，當該基因被下調時，導致免疫細胞或其前驅細胞的功能增強。
在某些例示性實施例中，步驟a)及步驟b)是同時進行的。在某些例示性實施例中，步驟b)中的多種試劑各自包括編碼一獨特引導RNA之一核酸，該獨特引導RNA靶向多種內源基因。在某些例示性實施例中，步驟b)中的多種試劑各自包括CRISPR核酸酶多肽或編碼CRISPR核酸酶的核酸。在某些例示性實施例中，步驟b)中的多種試劑各自包括CRISPR相關系統。在某些例示性實施例中，CRISPR相關系統包括一CRISPR核酸酶及一引導RNA。在某些例示性實施例中，引導RNA包含一引導序列，引導序列與一基因的一標靶序列充分地互補，該基因調節免疫細胞的功能。在某些例示性實施例中，CRISPR核酸酶及引導RNA包括一核糖核蛋白(RNP)複合體。在某些例示性實施例中，鑑定步驟e)包括鑑定該獨特引導RNA，該獨特引導RNA靶向下調的基因。
另一方面，本發明提供一種鑑定一基因的方法，該基因在下調時導致一免疫細胞或其前驅細胞的功能增強，該方法包括以下步驟：a)向多個免疫細胞中引入編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之一外源T細胞受體(TCR)及/或一嵌合抗原受體(CAR)的一核酸庫，並編碼多個引導RNA，多個引導RNA各自靶向多個內源基因中的獨特區，從而產生多個經修飾的免疫細胞；b)向多個經修飾的免疫細胞中引入CRISPR核酸酶或編碼CRISPR核酸酶的核酸，從而產生多個經編輯的免疫細胞，其中多個內源基因的基因表現被下調；c)將多個經編輯的免疫細胞與腫瘤細胞接觸；d)選擇一或多個表現出免疫細胞功能增強的經編輯的免疫細胞；以及e)鑑定在步驟d)所選擇的一或多個經編輯的免疫細胞中被下調的內源基因，從而鑑定出該基因，當該基因被下調時，導致免疫細胞或其前驅細胞的功能增強。
在某些例示性實施例中，接觸步驟c)包括將多個經編輯的免疫細胞與包括腫瘤細胞的腫瘤細胞株接觸。在某些例示性實施例中，接觸步驟包括將多個經編輯的免疫細胞施用到包括腫瘤細胞的攜帶腫瘤的生物體中。
另一方面，本發明提供一種包括一或多種核酸的核酸庫，其中一或多種核酸包括：一第一核酸，其編碼一獨特引導RNA；以及一第二核酸，其編碼對一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)。
在某些例示性實施例中，第一核酸包括一引導序列，該引導序列與一內源基因的一標靶序列充分地互補。在某些例示性實施例中，一或多種核酸是載體。在某些例示性實施例中，載體包括一第一表現盒(cassette)，其包含可操作地連接至第一核酸的第一啟動子，以及一第二表現盒，其包含可操作地連接至第二核酸的第二啟動子。在某些例示性實施例中，第二表現盒更包括一多核苷酸序列，多核苷酸編碼一可選擇的標記物。在某些例示性實施例中，可選擇的標記物是螢光蛋白。
另一方面，本發明提供用於前述實施方案及/或實施例中任一項的方法的前述實施方案及/或實施例中任一項的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞。
從以下結合附圖對例示性實施例的詳細描述，將更全面地理解本發明的前述特徵和優點。
圖1A~1B顯示用單發CRISPR系統產生經基因修飾的TCR-或CAR-T細胞庫的示意圖。圖1A顯示了單發CRISPR構築體的設計的示意圖。圖1B顯示了經基因修飾的TCR-或CAR-T細胞庫的製備的示意圖。
圖2顯示了根據本發明的一個實施例使用TCR-或CAR-T細胞庫的體外全基因體篩選(genome wide screen)的設計示意圖。
圖3A~3B顯示了根據本發明的一個實施例使用TCR-或CAR-T細胞庫的體外全基因體篩選(genome wide screen)的設計示意圖。圖3A顯示調節T細胞功能的基因的篩選示意圖。圖3B顯示調節T細胞記憶和持久性的基因的篩選示意圖。
圖4A~4B顯示用經照射的標靶腫瘤細胞刺激的體外CAR-T細胞庫的擴增倍數的圖。圖4A顯示CD19導向的CAR-T細胞庫(CAR19)的擴增倍數的圖。 圖4B顯示用PC3-PSCA腫瘤細胞刺激的PSCA導向的CAR-T細胞庫的擴增倍數的圖。
圖5A~5B顯示腫瘤控制和經分離的腫瘤浸潤淋巴球的功能的流式細胞儀分析。圖5A顯示CAR19庫T細胞消除Nalm6-GFP腫瘤細胞。圖5B顯示在PC3-PSCA腫瘤細胞與PSCA-CAR庫T細胞共培養後T細胞活化標記物CD137的上調。
圖6顯示用於體內全基因體篩選的庫和選擇過程的示意圖，以鑑定CAR-T細胞療法的抑制途徑。
圖7顯示了從單一引導RNA的深度定序和相對富集以及TOP候選物的可能功能來鑑定的基因。
圖8A~8B顯示PC3-PSCA攝護腺癌活體內CRISPR篩選中的前20個候選物。圖8A顯示了在PC3-PSCA模型中透過CRISPR篩選鑑定的前20個潛在治療標靶的熱圖。圖8B顯示了前20個潛在治療標靶的富集倍數。
圖9顯示CaPan1胰腺癌活體內CRISPR篩選中的前20個候選物的熱圖。
圖10A~10B顯示了在不同腫瘤中重疊的TOP候選物。圖10A顯示了來自不同腫瘤的前100、200和500個篩選命中的重疊基因。圖10B顯示了重疊候選者的折疊富集。
圖11顯示了TOP候選物的等級和倍數變化的圖。
圖12A~12C顯示了PC3-PSCA攝護腺癌模型中候選物的驗證。圖12A顯示了PC3-PSCA攝護腺癌模型中候選物驗證的生物發光腫瘤成像。在NSG小鼠的側腹中建立PC3-PSCA腫瘤(n=3)。三週後，用1 x 106個WT或KO PSCA CAR-T細胞(i.v.)處理小鼠。在(第0天)之前和用單次T細胞注射處理小鼠之後進行生物發光成像。圖12B顯示了成像的定量數據。圖12C顯示了腫瘤體積的數據。
圖13A~13C顯示了CaPan1胰腺癌模型中候選物的驗證。圖13A顯示了CaPan1胰腺癌模型中候選物驗證的生物發光腫瘤成像。在NSG小鼠的側腹中建立CaPan1腫瘤(n=3)。三週後，用1 x 106個WT或KO PSCA CAR-T細胞(i.v.)處理小鼠。在(第0天)之前和用單次T細胞注射處理小鼠之後進行生物發光成像。圖13B顯示了成像的定量數據。圖13C顯示了腫瘤體積的數據。
圖14A~14C顯示了A549-NY-ESO肺癌模型中候選物的驗證。圖14A顯示了A549-NY-ESO肺癌模型中候選物驗證的生物發光腫瘤成像。在NSG小鼠的側腹中建立A549-NY-ESO腫瘤(n=3)。三週後，用1 x 107個WT或KONY-ESO TCR-T細胞(i.v.)處理小鼠。在(第0天)之前和用單次T細胞注射處理小鼠之後進行生物發光成像。圖14B顯示了成像的定量數據。圖14C顯示了腫瘤體積的數據。
圖15A~15E顯示PAGR1、Klf4和SIX2 KO在體外增強腫瘤控制的數據。圖15A顯示了與PC3-PSCA和A375腫瘤共培養的PAGR1、Klf4和SIX2 KO CAR-T細胞的CD107a檢測。圖15B顯示了與CaPan1腫瘤共培養的PAGR1、Klf4和SIX2 KO CAR-T細胞的CD107A檢測。圖15C和15D顯示了基因剔除的CAR-T細胞的殺傷能力。圖15E顯示了基因剔除的CAR-T細胞的CFSE增生檢測的結果。
圖16A~16C顯示PAGR1和Klf4 KO增強PC3-PSCA腫瘤控制的結果。圖16A顯示了PC3-PSCA攝護腺癌模型中候選物驗證的生物發光腫瘤成像。在NSG小鼠的側腹中建立PC3-PSCA腫瘤(n=3)。三週後，用1 x 106個WT或KO PSCA CAR-T細胞(i.v.)處理小鼠。在(第0天)之前和用單次T細胞注射處理小鼠之後進行生物發光成像。圖16B顯示了成像的定量數據。圖16C顯示了腫瘤體積的數據。
圖17A~17B顯示PAGR1 KO增強CaPan1腫瘤控制的結果。圖17A顯示了CaPan1胰腺癌模型中候選物驗證的生物發光腫瘤成像。在NSG小鼠的側腹中建立CaPan1腫瘤(n=3)。三週後，用1 x 106個WT或KO PSCA CAR-T細胞(i.v.)處理小鼠。在(第0天)之前和用單次T細胞注射處理小鼠之後進行生物發光成像。圖17B顯示了腫瘤體積的數據。
圖18A~18H顯示PAGR1增強CAR-T細胞腫瘤累積和抑制抵抗力的結果。圖18A顯示了PC3-PSCA模型中腫瘤浸潤的CAR-T細胞的數量。圖18B顯示了CaPan1模型中腫瘤浸潤的CAR-T細胞的數量。圖18C顯示了從腫瘤中分離的不同CAR-T細胞殺死標靶腫瘤細胞的百分比。圖18D~18G顯示了在不同腫瘤浸潤的CAR-T細胞上的抑制分子的表現水平。圖18H顯示PAGR1 KO增強腫瘤浸潤細胞的殺傷能力的結果。
圖19A~19B顯示PAGR1 KO減少CAR-T細胞凋亡的結果。圖19A顯示活化誘導細胞死亡後不同KO CAR-T細胞凋亡的圖。圖19B顯示與標靶腫瘤細胞共培養後不同KO CAR-T細胞的凋亡的圖。
圖20A~20D顯示PAGR1 KO透過表觀遺傳學調節增強CAR-T細胞功能的結果。圖20A顯示了在珠子刺激之前和之後基因KOT細胞中的H3K4單甲基化和二甲基化的西方墨點法的結果圖。圖20B顯示了PAGR1 KO和野生型T細胞中KMT2D下游基因的即時PCT結果。圖20C顯示了在負調節子ARID1A和PRMT1上的H3K4單甲基化的ChIP測定的結果。圖20D顯示透過即時PCR測量的促存活基因Bcl2和Myc的mRNA水平。
圖21顯示PAGR1 KO在同種模型中增強過繼性T細胞療法的結果。過繼轉移野生型、PAGR1和Klf4 KO OT-IT細胞後B16-OVA腫瘤的體積。在C57/BL6 小鼠的側腹中建立B16-OVA腫瘤(n=4)。8天後，用1 x 106個WT或KO OT-I T細胞(i.v.)處理小鼠。在用單次T細胞注射處理小鼠之前(第0天)和之後進行腫瘤測量。
圖22顯示了對DNMT3A進行細胞內染色以確定所選gRNA的剔除效率的結果。
圖23顯示了攜帶用於同源導向修復的供體模板的AAV質體的圖譜。
圖24顯示了CRISPR/Cas9和AAV介導的同源重組以將GFP敲入DNMT3A基因座的示意圖。方框表示同源臂和gRNA標靶基因座。
圖25顯示了在慢病毒/AAV感染後CD19BBz和EGFP的表現。
圖26顯示了使用本文所述的REP方案分選和擴增的T細胞中CD19BBz和EGFP的表現。
圖27顯示了透過PCR擴增DNMT3A DNA和轉基因之間的接合處來確認EGFP敲入DNMT3A gRNA標靶區域的結果。方框表示DNMT3A的同源臂和gRNA標靶基因座。箭頭代表PCR引子。
圖28顯示CD107a在CD4和CD8 CD19BBz+KI細胞中以顯著水平表現的結果。
圖29顯示INFγ在CD4和CD8 CD19BBz+KI細胞中以顯著水平表現的結果。
圖30顯示TNFα在CD4和CD8 CD19BBz+KI細胞中以顯著水平表現的結果。
圖31顯示IL-2在CD4 CD19BBz+KI細胞中以較高水平表現，但在CD8細胞中以低於CD19BBz T細胞中的水平表現的結果。
圖32顯示重複刺激後CD8細胞數量的結果。
圖33顯示在連續殺傷測定結束時存活的癌細胞數的結果。
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如經修飾的T細胞)的組成物和方法，其包括外源(例如重組、轉基因或改造的)T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)。在一些實施 例中，對經修飾的免疫細胞進行基因編輯，使得一或多種內源基因的表現被下調。這些基因編輯的經修飾的免疫細胞具有增強的免疫功能。在一些實施例中，本發明的基因編輯的經修飾的免疫細胞對免疫抑制具有抵抗力，例如對腫瘤微環境的免疫抑制因子具有抵抗力。在某些實施例中，免疫細胞具有編碼調節免疫細胞功能的內源基因的基因破壞。在某些實施例中，內源基因負調控免疫細胞功能，使得當內源基因下調時，免疫細胞具有增強的免疫細胞功能。
在一些實施例中，所提供的免疫細胞、組成物和方法改變或減少腫瘤微環境中T細胞抑制途徑或訊號的作用。本發明的經修飾的免疫細胞抵消可以負面控制T細胞活化和T細胞功能的抑制性受體或配體的上調及/或表現。舉例來說，某些免疫檢查點蛋白(例如，PD-1或PD-L1)在T細胞及/或腫瘤微環境中的表現可降低過繼性T細胞療法的效力和功效。在過繼性細胞療法的背景下，這種抑制途徑可能反而會損害某些所需的效用功能。腫瘤微環境中的腫瘤細胞及/或細胞通常上調某些抑制性蛋白質(例如PD-L1和PD-L2)，從而傳遞抑制訊號。前述蛋白質也可以在腫瘤微環境中的T細胞上被上調，例如在腫瘤浸潤性T細胞上，這可以發生在透過抗原受體(例如，TCR及/或CAR)或某些其他活化訊號發出訊號後。前述事件可能有助於基因改造的免疫細胞(例如，TCR-或CAR-T細胞)獲得衰竭的表型，例如當存在於表現前述蛋白質的其他細胞附近時，這反過來可導致功能降低。因此，本發明的經修飾的免疫細胞解決了T細胞衰竭及/或缺乏T細胞持久性(persistence)的問題，這是傳統過繼性細胞療法的功效和治療結果的障礙。
本發明還提供體外和體內的篩選方法，以鑑定參與腫瘤微環境中T細胞抑制途徑或訊號的基因。本發明還提供了體外和體內的篩選方法，以鑑定調節T細胞記憶和持久性的基因。T細胞記憶由稱為記憶T細胞的T細胞子集所賦予。記憶T細胞是先前遇到標靶抗原並反應的T細胞。在第二次遇到相同的標靶抗原時，相較於免疫系統對標靶抗原的第一次反應，記憶T細胞可以複製以產生更快和更強的免疫反應。本領域已知某些抑制途徑或訊號可以防止T細胞記憶。因此，本發明的經修飾的免疫細胞可具有更強的持久性和功效。
應當理解的是，本文中描述的方法不限於本文公開的特定方法和 實驗條件，因為前述方法和條件都是可以改變的。還應當理解的是，本文使用的術語僅用於描述特定實施例，而非對本發明的限制。
此外，除非另有說明，本文所述的實驗使用本領域技術範圍內的習知分子和細胞生物學和免疫學技術。前述技術是技術人員所熟知的，並且已在文獻中有充分的解釋。參見，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，including all supplements，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第四版)，其由MR Green和J.Sambrook和Harlow等人所著、Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(2013，第2版)。
A.定義
除非另外定義，否則所有本文使用的技術和科學術語的涵義，通常與本發明所屬技術領域的通常知識者所能理解的相同。如果存在任何潛在的歧義，本文提供的定義優先於任何字典或外來的定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，複數術語應包括單數。除非另有說明，否則「或」的使用意味著「及/或」。術語「包括」以及例如「包含」和「具有」之類的其他形式的用語非限制性的。
通常，本文所述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質和核酸化學和雜交結合使用的命名法是本領域公知且常用的。本文提供的方法和技術通常根據本領域熟知的常規方法進行，並且如在整個本說明書中引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻中所述，除非另有說明。酶促反應和純化技術是根據製造商的說明書進行的，如本領域通常實現的或如本文中所述的。本文所述的分析化學、合成有機化學以及藥物和藥物化學相關的術語和實驗室程序和技術是本領域公知且常用的。標準技術用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及患者的治療。
以下定義所選擇的術語可以更容易地理解本發明。
如本文所使用的，「一」及「一種」是指一個或多於一個(即至少一個)的物體。舉例來說，「一元件」是指一個元件或多於一個元件。
當涉及例如量、持續時間等可測量值時，術語「約」意味著包括 距離特定值±20%或±10%的變化範圍、更優選地為±5%、甚至更優選地為±1%、還更優選地為±0.1%，只要此種變化程度適合用於執行本文所揭露的方法。
如本文所使用的，術語「活化」在T細胞方面是指，其已經充分刺激而被誘發出細胞增生的狀態。活化還與細胞激素(cytokine)的誘導產生有關，並使其產生可檢測的效用功能(effector function)。術語「活化的T細胞」表示正在進行細胞分裂的T細胞。
如本文所使用的，術語「減輕」疾病是指著降低該疾病的一或多種症狀的嚴重程度。
如本文所使用的，術語「抗原」被定義為會引起免疫反應的分子。這種免疫反應可能涉及抗體產生，或特定的免疫活性細胞的活化，或兩者皆有。本領域技術人員能夠理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白質或肽，都可以作為抗原。
此外，抗原可以衍生自重組或基因體DNA。本領域技術人員能夠理解，任何DNA，包含編碼有會引發免疫反應之蛋白的核苷酸序列或其部分序列的DNA，其係編碼有如本文使用的術語「抗原」。此外，本領域技術人員能夠理解，抗原不需要由整段基因的核苷酸序列來編碼。很明顯地，本發明包括但不限於使用多於一個基因的部分核苷酸序列，而這些核苷酸序列係以各種方式進行組合排列，以引起所需的免疫反應。再者，本領域技術人員能夠理解抗原不需要由一「基因」所編碼。很明顯地，抗原可以是以合成方式產生或從生物樣品中獲得。這樣的生物樣品可以包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞或生物流體。
如本文所使用的，術語「自體的」是指源自同一個體的任何物質，其隨後被重新引入該個體中。
術語「共刺激分子」是指T細胞上的同源結合配偶體，其專一性地與共刺激配體結合，從而介導T細胞的共刺激反應，例如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於MHC第I型分子、BTLA和Toll配體受體。
如本文所使用的，術語「共刺激訊號」是指與主要訊號(例如TCR/CD3連接)搭配的訊號，兩者共同導致T細胞增生及/或關鍵分子的上調 或下調。
「疾病」是動物無法維持體內恆定的健康狀態，且如果疾病沒有改善則該動物的健康狀態會繼續惡化。相反地，動物的「病症(disorder)」是指動物能夠維持體內恆定的健康狀態，但該動物的健康狀態不如沒有病症時的那樣良好。如果不及時治療，病症並不一定會導致動物的健康狀態進一步變差。
如本文所使用的，術語「下調」是指減少或剔除一或多種基因的表現。
如本文所使用的，術語化合物的「有效量」或「治療有效量」是指如本文所述的化合物、調配物、材料或組成物的劑量，能有效實現特定的生物學結果、提供治療，或預防的益處。前述結果可包括但不限於當投予至哺乳動物時，與不存在本發明組成物時所檢測到的免疫反應相比，該組成物的量可引起可檢測程度的免疫抑制反應或免疫耐受反應。免疫反應可以容易地以許多本領域所認可的方法加以評估。本領域技術人員能夠理解，本文所施用的組成物其量的變化可以基於許多因素所決定，例如所治療的疾病或病症、所治療的哺乳動物的年齡、健康狀況、身體狀況、疾病的嚴重程度以及所給予的特定化合物等。
「編碼」是指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性。其在生物過程中用作合成其他具有確定核苷酸序列(即，rRNA、tRNA及mRNA)或確定胺基酸序列的聚合物和大分子的模板，該些聚合物和大分子會具有相應的生物學特性。因此，在細胞或其他生物系統中，如果對應於一基因的mRNA轉錄和轉譯產生一蛋白質，則該基因編碼該蛋白質。編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列相同並且通常顯示在序列表中)與非編碼股(係用作基因或cDNA轉錄的模板)均可被稱為編碼蛋白質或該基因或cDNA的其他產物。
如本文所使用的，術語「內源」是指來自生物體、細胞、組織或系統的任何物質，或在生物體、細胞、組織或系統內部所產生的任何物質。
如本文所使用的，術語「表位」定義為抗原上的小化學分子，其可引發免疫反應，誘發B及/或T細胞反應。抗原可具有一或多個表位。大多 數抗原具有多個表位。亦即，該些抗原是多價的。通常，表位的大小約為10個胺基酸及/或糖。優選地，表位為約4至18個胺基酸，更優選地約5至16個胺基酸，甚至更優選地為6至14個胺基酸，更優選地約7至12個胺基酸，最優選地約8至10個胺基酸。本領域技術人員能夠理解，一般來說，抗原專一性的主要條件是分子的整體三維結構，而非其特定的一維序列，因而由此區分不同表位。基於本文的揭露內容，本發明的肽可以是一表位。
如本文所使用的，術語「外源」是指從生物體、細胞、組織或系統外引入的任何物質，或從生物體、細胞、組織或系統外所產生的任何物質。
如本文所使用的，術語「擴增」是指數量增加，例如T細胞數量的增加。在一實施例中，離體擴增的T細胞數量相對於其於培養基中的初始數量有所增加。在另一實施例中，相對於培養基中的其他細胞，離體擴增的T細胞其數量有所增加。如本文所使用的，術語「離體(ex vivo)」是指已經從活體(例如人類)中移出，並在體外繁殖的細胞(例如，在培養皿、試管或生物反應器中)。
如本文所使用的，術語「表現」定義為特定核苷酸序列藉由其啟動子所驅動的轉錄及/或轉譯。
「表現載體」是指包括重組多核苷酸的載體，前述重組多核苷酸包括與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包含有順式作用元件(cis-acting element)，且其數量足以進行表現。其他用於表現的元件可以由宿主細胞提供或在體外表現系統中提供。表現載體包括本領域已知的所有類型，例如黏接質體(cosmid)、質體(例如裸露的質體或包含在微脂體中的質體)及併入重組多核苷酸的病毒(例如，仙台病毒(Sendai viruses)、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所使用的，術語「同一性(identity)」是指兩個聚合分子之間的次單元序列同一性，特別是在兩個胺基酸分子之間，例如兩個多肽分子之間。當兩個胺基酸序列的相同位置具有相同的殘基時，例如，若兩個多肽分子中的一位置都被精胺酸所佔據-則它們在該位置是具有同一性的。兩個胺基酸序列在相同比對位置中相同殘基的同一性或箱同程度通常以百分比進行表 示。兩個胺基算序列之間的同一性是匹配或相同位置量的直接函數。舉例來說，如果兩個序列中有一半位置(例如，長度為10個次單元的胺基酸聚合物中有5個位置)是相同的，則這兩個序列的同一性為50%；如果90%的位置(例如10個中有9個)是匹配的或相同，則兩個序列的同一性為90%。
如本文所使用的，術語「免疫反應」定義為對於抗原的細胞反應，這種反應發生在淋巴細胞將抗原性分子鑑定為外來物並誘發抗體形成及/或活化淋巴球以除去抗原時。
如本文所使用的，術語「免疫抑制」是指總體免疫反應的降低。
「插入/缺失」，通常縮寫為「indel」，是一種基因多態性，其中特定核苷酸序列在基因體中存在(插入)或不存在(缺失)。
「分離的」是指從自然狀態改變或移除。舉例來說，自然存在於活體動物中的核酸或肽即不屬於「分離的」，但是與其自然狀態下的共存物質部分或完全分離開來的相同核酸或肽，即屬於「分離的」。分離的核酸或蛋白質可以純化的形式存在，或者可以存在於非自然環境中，例如宿主細胞內。
如本文所使用的，術語「敲落(knockdown)」是指降低一或多種基因的基因表現。
如本文所用的，術語「敲入」是指已插入標靶序列(例如，內源基因座)的外源核酸序列。例如，CAR/TCR敲入標靶位點(例如，內源基因座)是指編碼嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)的核酸序列，其已被插入標靶基因序列的標靶位置。在一些實施例中，當標靶序列是基因時，產生敲入，導致外源核酸序列與控制標靶基因表現的任何上游及/或下游調節元件可操作地連接。在一些實施例中，產生敲入，導致外源核酸序列不與控制標靶基因表現的任何上游和/或下游調節元件可操作地連接。
如本文所使用的，術語「剔除(knockout)」是指消除一種或多種基因的基因表現。
如本文所使用的，術語「慢病毒(lentivirus)」是指反轉錄病毒科的一個屬。慢病毒屬於反轉錄病毒中獨特的一種類，因其能感染非分裂細胞。它們可以將大量遺傳訊息傳遞到宿主細胞的DNA中，因此是基因傳遞載體中最 有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒。衍生自慢病毒的載體提供了在體內實現顯著水平基因轉移的手段。
如本文所使用的，術語「經修飾的」是指本發明的分子或細胞狀態或結構的改變。分子可以以多種方式進行修飾，包括以化學上地、結構上地和功能上地方式來進行。細胞可以藉由引入核酸來進行修飾。
如本文所使用的，術語「調節」，是指相較於沒有治療或化合物的個體及/或在其他方面相同但未經治療的個體，在受試者中介導了可檢測程度的增加或減少的反應。該術語包括擾亂及/或影響天然訊號或反應，從而介導受試者(優選地為人類)的有益治療反應。
在本文中，以下列縮寫來表示常見的核酸鹼基。「A」是指腺苷、「C」是指胞嘧啶、「G」是指鳥苷、「T」是指胸苷、「U」是指尿苷。
術語「寡核苷酸」通常是指短的多核苷酸。應當理解的是，當核苷酸序列由DNA序列(即A、T、C、G)表示時，也包括其中以「U」取代「T」的RNA序列(即A、U、C、G)。
除非另有說明，否則「編碼一胺基酸序列的核苷酸序列」包括所有編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列以及該等核苷酸序列之簡併形式。編碼蛋白質或RNA的「核苷酸序列」也可包括內含子，以至於編碼蛋白質的核苷酸序列在某些形式中可含有內含子。
免疫原性組成物的「非腸胃道」給藥包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)、或胸骨內注射(intrasternal injection)或輸注技術。
如本文所使用的，術語「多核苷酸」定義為核苷酸鏈。此外，核酸是指核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領域技術人員能夠理解核酸是多核苷酸，其可以水解成單體「核苷酸」。單體核苷酸可以水解成核苷。如本文所使用的，多核苷酸包括但不限於透過本領域可用的任何方法獲得的所有核酸序列，該些方法包括但不限於重組方法及合成方法。重組方法係即使用傳統選殖(cloning)技術及PCR等方式從重組庫或細胞基因體進行選殖以獲得核酸序列。
如本文所使用的，術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可互換使用，並且指由透過肽鍵共價連接的胺基酸殘基所組成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且不限制蛋白質或肽序列可包含的胺基酸的最大數量。多肽包括任何肽或蛋白質，其包括透過肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸。如本文所使用的，該術語是指短鏈，其在本領域中通常也稱為肽、寡肽及寡聚物；例如較長的鏈，其在本領域通常稱為蛋白質，其中有很多種類。「多肽」包括，例如，生物活性片段、實質上同源的多肽(substantially homologous polypeptides)、寡肽、同二聚體(homodimers)、異二聚體(heterodimers)、多肽變異體(variants)、經修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
如本文關於抗體所使用的術語「專一性結合」是指辨識特定抗原但基本上不辨識或結合樣品中的其他分子的抗體。例如，專一性結合來自一個物種抗原的抗體，也可以與來自一或多個物種的該抗原結合。但是，這種跨物種反應性本身並不會改變抗體為專一性的分類。在另一個實例中，專一性結合至一抗原的抗體，也可以結合至該抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反應性本身並不會改變抗體為專一性的分類。在一些情況下，術語「專一性結合」或「特異性結合」可用於指稱抗體、蛋白質或肽與第二化學物質間的相互作用，以表示該相互作用係取決於該化學物質上存有特定結構(例如，抗原決定位(antigenic determinant)或表位(epitope))。舉例來說，抗體通常辨識並結合至蛋白質的特定結構而不是通常的蛋白質。如果抗體對表位「A」具有專一性，則在有標記的「A」和抗體的反應中，存在有表位A(或游離的，未標記的A)分子時，則有標記的A與抗體的結合量將會降低。
術語「刺激」是指透過刺激分子(例如，TCR/CD3複合體)與其同源配體的結合所誘導的初級反應，進而介導訊息傳遞事件，例如但不限於透過TCR/CD3複合體所介導的訊息傳遞。刺激可以介導某些分子的表現改變，例如TGF-β的下調及/或細胞骨架結構的重組等。
如本文所使用的，術語「刺激分子」是指T細胞上的分子，其係專一性結合至抗原呈現細胞上的同源刺激配體。
如本文所使用的，術語「刺激配體」是指當存在於抗原呈現細胞(例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等)上時，該配體可以專一性結合至T細胞上的同源結合配偶體(請參考本文中「刺激分子」的描述)，從而介導T細胞的初級反應，包括但不限於活化、免疫反應的引發、增生等。刺激配體是本領域習知的，並且，特別是包括載有肽的MHC第I型分子、抗CD3抗體、抗CD28抗體的超級促效劑、及抗CD2抗體的超級促效劑。
術語「受試者」是指包括可以被引發免疫反應的活體(例如哺乳動物)。如本文所使用的，「受試者」或「患者」可以是人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如綿羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物。優選地，受試者是人類。
「標靶位」或「標靶序列」是指核酸序列，其定義出在足以發生結合的情況下會與結合分子進行專一性結合的核酸的一部分。在一些實施例中，標靶序列是指基因體核酸序列，其定義核酸的一部分，結合分子可以在足以發生結合的條件下特異性結合。
如本文所使用的，術語「T細胞受體」或「TCR」是指一種膜蛋白複合體，其反應抗原的呈現而參與T細胞的活化。TCR負責辨識與主要組織相容性複合體分子結合的抗原。TCR由α(alpha)和β(beta)鏈的異二聚體組成，但是在一些細胞中TCR由γ和δ(gamma/delta)鏈組成。TCR可以α/β和γ/δ形式存在，其在結構上相似，但其解剖位置及功能並不相同。每條鏈由兩個胞外域組成，即可變區和恆定區。在一些實施例中，TCR可以在任何包含有TCR的細胞上進行修飾，包括例如輔助型T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節T細胞、自然殺手T細胞及γδ T細胞。
如本文所使用的，術語「治療」(therapeutic)意指治療處理及/或預防。治療效果係透過抑制、緩解或根除疾病狀態來獲得。
「移植物」是指待移植的生物相容性晶格(biocompatible lattice)或捐贈者組織、器官或細胞。移植的實例可包括但不限於皮膚細胞或組織、骨髓及實體器官，例如心臟、胰臟、腎臟、肺臟及肝臟。移植也可以意指任何要向宿主施用的材料。例如，移植可以意指核酸或蛋白質。
如本文所使用的，術語「轉染的(transfected)」或「轉化的(transformed)」或「轉導的(transduced)」是指將外源核酸轉移或引入宿主細胞的過程。「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」細胞是已經用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。細胞包括受試者初代細胞及其後代。
如本文所使用的，術語「治療」是指降低受試者所經歷的疾病或病症的至少一種體徵或症狀的頻率或嚴重性。
「載體」是組成物，其包括分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部。本領域已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關的多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。該術語還應解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、微脂體等。病毒載體的實例包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體等。
範圍：在本發明全文中，各個實施例可以範圍的形式呈現。應該理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便及簡潔，不應該被解釋為對本發明範圍的限制。因此，範圍的描述應被視為是具體公開了所有可能的子範圍以及該範圍內的單一數值。例如，從1到6的範圍的描述應該被視為具有特定公開的子範圍，例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及在該範圍內的單一及部分數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。無論何種大小的範圍皆適用。
B.T細胞受體
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如經修飾的T細胞)的組成物和方法，其包括外源T細胞受體(TCR)。因此，在一些實施例中，標靶細胞已經被改變以含有特異性T細胞受體(TCR)基因(例如，編碼α/β TCR的核酸)。TCR或其抗原結合部包括辨識別標靶多肽(例如腫瘤、病毒或自體免疫蛋白的抗原)的肽表位或T細胞表位的那些部位。在一些實施例中，TCR對腫瘤相關抗原(例如人類NY-ESO-1)具有結合專一性。
在一些實施例中，包括外源T細胞受體(TCR)的經修飾的T 細胞可用於本發明的篩選方法，例如，用以鑑定在調節時增強TCR-T細胞功能的基因標靶。
TCR是雙硫鍵連接的異二聚體蛋白，其由六種不同的膜結合鏈組成，其參與T細胞對於抗原反應的活化。存在α/β TCR和γ/δ TCR。α/β TCR包含TCR α鏈和TCR β鏈。表現包含TCR α鏈和TCR β鏈的TCR的T細胞通常稱為α/β T細胞。γ/δ TCR包含TCR γ鏈和TCR δ鏈。表現包含TCR γ鏈和TCR δ鏈的TCR的T細胞通常稱為γ/δ T細胞。本文的TCR是包含TCR α鏈和TCR β鏈的TCR。
TCR α鏈和TCR β鏈各自包含兩個胞外域，即可變區和恆定區。TCR α鏈可變區和TCR β鏈可變區是TCR對標靶抗原的親和力是必需的。每個可變區包含三個高度變異區或互補性決定區(CDR)，其用以與標靶抗原的結合。TCR α鏈的恆定區和TCR β鏈的恆定區靠近細胞膜。TCR還包含跨膜區和短的細胞質尾區。CD3分子與TCR異二聚體組裝在一起。CD3分子包含特徵序列基序，用於酪胺酸磷酸化，稱為免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)。近端訊息傳導事件是透過CD3分子所介導，因此，TCR-CD3複合體的相互作用在介導細胞辨識事件中起重要的作用。
TCR的刺激由抗原呈現細胞上的主要組織相容性複合體分子(MHC)觸發，前述抗原呈現細胞將抗原肽呈現給T細胞，並與TCR相互作用以誘發一系列細胞內訊息傳遞的級聯反應。TCR的接合啟動正和負訊號級聯，其導致細胞增生、細胞激素產生及/或活化誘導的細胞死亡。
本發明的TCR可以是野生型TCR、高親和力TCR及/或嵌合TCR。高親和力TCR可以是野生型TCR被修飾的結果，其與野生型TCR相比對於標靶抗原具有較高的親和力。高親和力TCR可以是親和力成熟的TCR。修飾TCR及/或TCR的親和力成熟的方法是本領域技術人員已知的。用於改造和表現TCR的技術包括但不限於TCR異二聚體的產生，其包括連接對應次單元的天然雙硫橋(Garboczi等人，(1996)，Nature 384(6605)：134-4；Garboczi等人，(1996)，J Immunol 157(12)：5403-10、Chang等人，(1994)，PNAS USA 91：11408-11412、Davodeau等人，(1993)，J.Biol.Chem.268(21)：15455-15460、 Golden等人，(1997)，J.Imm.Meth.206：163-169；美國專利號6,080,840)。
在一實施例中，外源TCR是完整TCR、其抗原結合部分，或其抗原結合片段。在一實施例中，TCR是完整或全長TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。在一些實施例中，TCR是抗原結合部分，其小於全長TCR但與MHC分子中特定肽鍵結合，例如與MHC-肽複合體結合。在一些情況下，TCR的抗原結合部分或片段可以僅包含全長或完整TCR的結構域的一部分，但是其仍然與完整TCR一樣，都能夠結合肽表位，例如MHC-肽複合體。在一些情況下，抗原結合部分含有TCR的可變域，例如TCR的可變鏈和可變β鏈，足以形成與特定MHC-肽複合體結合的結合位點。通常，TCR的可變鏈含有參與辨識肽、MHC及/或MHC-肽複合體的互補性決定區(CDR)。
在一實施例中，TCR的可變域含有高度變異環或CDR，其通常是抗原辨識和結合能力及專一性的主要貢獻者。在一些實施例中，TCR的CDR或其組合形成一特定TCR分子其全部或基本上全部的抗原結合位點。TCR鏈可變區內的各種CDR通常由框架區(framework region，FR)分開，在TCR分子中，與CDR相比，框架區的變異度通常較低(參見例如，Jores等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87：9138,1990、Chothia等人，EMBO J.7：3745,1988、並參見Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.27：55,2003)。在一些實施例中，CDR3是主要負責抗原結合或專一性的CDR，或者是在一特定TCR可變區的三個CDR中，最主要進行抗原辨識及/或與肽-MHC中已處理過的肽部分產生相互作用的CDR。在一些情況下，α鏈的CDR1可以與某些抗原肽的N端部分產生相互作用。在一些情況下，β鏈的CDR1可以與肽的C端部分產生相互作用。在一些情況下，在辨識MHC-肽複合體中的MHC部分或與其產生相互作用時，CDR2的作用最強或是主要負責的CDR。在一些實施例中，β-鏈的可變區可含有額外的高度變異區(CDR4或HVR4)，其通常參與超級抗原結合而非抗原辨識(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8：411-426)。
在一些實施例中，TCR含有可變α域(Va)及/或可變β域(Vβ)或其抗原結合片段。在一些實施例中，TCR的α-鏈及/或β-鏈還可含有恆定域、跨膜域及/或短細胞質尾區(參見，例如，Janeway等人，Immunobiology：The Immune System in Health and Disease,3 Ed.,Current Biology Publications,p.4：33,1997)。在一些實施例中，α鏈恆定域是由TRAC基因(IMGT命名法)所編碼或是其變異體。在一些實施方案中，β鏈恆定區由TRBC1或TRBC2基因(IMGT命名法)所編碼或是其變異體。在一些實施例中，恆定域與細胞膜相鄰。例如，在一些情況下，由兩條鏈所形成的TCR在其細胞外部分含有兩個近膜恆定域和兩個遠膜可變域，而可變域各自含有CDR。
確定或鑑定TCR的各種域或區是技術人員習知的。在一些實施例中，TCR的殘基是已知的，或可以根據國際免疫遺傳學訊息系統(International Immunogenetics Information System，IMGT)的編號系統來鑑定(參見例如www.imgt.org、並參見Lefranc等人(2003)Developmental and Comparative Immunology,2&；55-77、以及The T Cell Factsbook 2nd Edition,Lefranc and LeFranc Academic Press 2001)。使用該系統，在TCR Va鏈及/或vβ鏈內的CDR1序列對應於殘基編號27至38的胺基酸，在TCR Va鏈及/或vβ鏈中的CDR2序列對應於殘基編號56至65胺基酸，在TCR Va鏈及/或vβ鏈內的CDR3序列對應於殘基編號105至117的胺基酸。IMGT編號系統不應被解釋為本發明的限制，因為仍有其他本領域技術人員已知的編號系統，並且使用任何可用的編號系統來辨識前述TCR的各個域或區，對於本領域技術人員來說是已知的。
在一些實施例中，TCR可以是兩條鏈α和β(或可選地為γ和δ)的異二聚體，其例如通過一雙硫鍵或複數雙硫鍵連接。在一些實施例中，TCR的恆定域可含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成雙硫鍵，進而連接TCR的兩條鏈。在一些實施例中，TCR可以在α和β鏈中各具有額外的半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定域中含有兩個雙硫鍵。在一些實施例中，恆定域和可變域中各含有由半胱胺酸殘基形成的雙硫鍵。
在一些實施例中，所述用於改造細胞的TCR是從已知的TCR序列所產生，例如vα、β鏈的序列，對於該序列，基本上全長的編碼序列是容易取得的。從細胞來源獲得全長TCR序列(包括V鏈序列)的方法是眾所周知的。在一些實施例中，編碼TCR的核酸可以從多種來源獲得，例如透過聚合酶連鎖反應(PCR)來擴增在特定細胞內或從特定細胞所分離出的TCR編碼核酸，或 合成公眾可得的TCR去氧核醣核酸(DNA)序列。在一些實施例中，TCR取自生物來源，例如來自細胞、又例如來自T細胞(例如毒殺性T細胞)、T細胞融合瘤或其他可公開可得的來源。在一些實施例中，T細胞可以取自體內所分離出的細胞。在一些實施例中，T細胞可以是培養的T細胞融合瘤或殖株(clone)。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可以從已知的TCR序列產生。在一些實施例中，用於標靶抗原(例如癌症抗原)的高親和力T細胞殖株，係從患者中被分離，並引入細胞中。在一些實施例中，針對標靶抗原的TCR殖株已經可以從經人類免疫系統基因(例如，人類白細胞抗原系統或HLA)所改造的轉基因小鼠來產生。標靶抗原例如是腫瘤抗原(參見例如，Parkhurst等人，(2009)Clin Cancer Res.15：169-180 and Cohen et al.(2005)J Immunol.175：5799-5808)。在一些實施例中，係使用噬菌體顯現法來分離針對標靶抗原的TCR(參見例如，Varela-Rohena等人，(2008)Nat Med.14：1390-1395 and Li(2005)Nat Biotechnol.23：349-354)。
在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分是經修飾或經改造的部分。在一些實施例中，係以導向進化方法來產生具有改變性質的TCR，例如對特定MHC-肽複合體具有更高的親和力。在一些實施例中，係透過顯現法實現導向進化(directed evolution)，包括但不限於酵母顯現法(Holler等人，(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人，(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌體顯現法(Li等人，(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)、或T細胞顯現法(Chervin等人，(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些實施例中，顯現方法會涉及工程化或修改已知的親代或參考TCR。例如，在一些情況下，野生型TCR可用作突變TCR的生產模板，其CDR中有一或多個殘基發生突變，且其突變體具有所需的改變性質，例如對標靶抗原的更高親和力。
在前述的一些實施例中，TCR可含有引入的雙硫鍵或鍵。在一些實施例中，則沒有天然的雙硫鍵。在一些實施例中，形成鏈間天然雙硫鍵的一或多個天然半胱胺酸(例如在α鏈和β鏈的恆定域中)係被另一個殘基取代，例如被絲胺酸或丙胺酸取代。在一些實施例中，可以透過將α鏈和β鏈上的非半胱胺酸殘基(例如在α鏈和β鏈的恆定域中)突變為半胱胺酸來形成引入的 雙硫鍵。TCR的例示性非天然雙硫鍵如國際專利號WO2006/000830及WO2006/037960中所描述。在一些實施例中，半胱胺酸可以在α鏈的殘基Thr48及β鏈的Ser57、在α鏈的殘基Thr45及β鏈的Ser77、在α鏈的殘基Tyr10及β鏈的Ser17、在α鏈的殘基Thr45和β鏈的Asp59及/或在α鏈的殘基Ser15及β鏈的Glu15處被引入。在一些實施例中，重組TCR中非天然半胱胺酸殘基的存在(例如，產生一個或多個非天然雙硫鍵)有利於在引入它的細胞中，產生所需的重組TCR，而非表現含有天然TCR鏈的不匹配TCR對(mismatched TCR pair)。
在一些實施例中，TCR鏈含有跨膜域。在一些實施例中，跨膜域帶正電荷。在某些情況下，TCR鏈含有細胞質尾區。在一些實施例中，TCR的每條鏈(例如α或β)可具有一個N-端免疫球蛋白可變域、一個免疫球蛋白恆定域、跨膜區和C-端的短細胞質尾區。在一些實施例中，例如透過細胞質尾區，TCR係與參與介導訊息轉導的CD3複合體的不變蛋白質相連。在一些情況下，該結構使TCR與其他分子如CD3及其次單元結合。例如，具有跨膜區的恆定域的TCR，可以將蛋白質固定在細胞膜中並與CD3訊息傳遞器或複合體的不變次單元結合。CD3訊息傳遞次單元(例如CD3y、CD35、CD3s和CD3ζ鏈)的細胞內尾區，含有一或多種免疫受體酪胺酸活化基序或ITAM，其與TCR複合體的訊息傳遞能力有關。
在一些實施例中，TCR是全長TCR。在一些實施例中，TCR是抗原結合部分。在一些實施例中，TCR是二聚體TCR(dimeric TCR，dTCR)。在一些實施例中，TCR是單鏈TCR(single-chain TCR，sc-TCR)。TCR可以是與細胞結合的或可溶性形式。在一些實施例中，依據所提供方法的目的，TCR是表現在細胞表面上的細胞結合形式。在一些實施例中，dTCR含有第一多肽及第二多肽。在第一多肽中，對應於TCR a鏈可變區序列的一序列，融合至對應於TCR a鏈恆定區細胞外序列的一序列之N端；在第二多肽中，對應於TCR β鏈可變區序列的一序列，融合至對應於TCR β鏈恆定區細胞外序列的一序列之N端，而第一多肽和第二多肽透過雙硫鍵連接。在一些實施例中，前述的鍵可以對應於天然二聚體αβ TCR中的鏈間天然雙硫鍵。在一些實施例中，天然TCR 不具有鏈間雙硫鍵。例如，在一些實施例中，可以將一個或多個半胱胺酸併入dTCR多肽對的恆定區細胞外序列中。在一些情況下，可能需要天然和非天然雙硫鍵。在一些實施例中，TCR含有跨膜序列以固定至膜上。在一些實施例中，dTCR含有TCR α鏈及TCR β鏈。其TCR α鏈含有可變α域、恆定α域和連接到恆定α域的C端第一二聚化基序。其TCR β鏈含有可變β域、恆定β域和連接到恆定β域的C端第一二聚化基序，其中第一和第二二聚化基序能夠產生相互作用以在第一二聚化基序中的胺基酸和第二二聚化基序中的胺基酸之間形成共價鍵，將TCR α鏈和TCR β鏈連接在一起。
在一些實施例中，TCR是單鏈TCR(scTCR)，其是胺基酸單鏈並含有能夠結合至MHC-肽複合體的α鏈和β鏈。一般來說，本領域技術人員可以使用已知的方法來產生scTCR，參見例如國際專利號WO 96/13593、WO 96/18105、WO99/18129、WO04/033685、WO2006/037960、WO2011/044186；美國專利號7,569,664、及Schlueter,C.J.et al.J.Mol.Biol.256,859(1996)中所述的方法。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接子序列。前述第一片段由對應於TCR α鏈可變區的胺基酸序列所構成，而前述第二片段由與TCR β鏈恆定區細胞外序列N端融合的TCR β鏈可變區序列的胺基酸序列所構成。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及，可選地，連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接子序列。前述第一片段由對應於TCR β鏈可變區的胺基酸序列所構成，而前述第二片段由與TCR α鏈恆定區細胞外序列N端融合的TCR β鏈可變區序列的胺基酸序列所構成。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接子序列。前述第一片段由與鏈細胞外恆定區序列N端融合的α鏈可變區序列的胺基酸序列所構成，而前述第二片段由與序列β鏈細胞外恆定及跨膜序列N端融合的β鏈可變區序列所構成。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及，可選地，連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接子序列。前述第一片段由與β鏈細胞外恆定區序列N端融合的TCR β鏈可變區序列所構成，而前述第二片段由與鏈細胞外恆定域序列及跨膜序列N端融合的α鏈可變區序列所構成。在一些 實施例中，為了將scTCR與MHC-肽複合體結合，a鏈和β鏈必須配對，使其可變區序列的方向係被安排為針對前述結合。多種促進scTCR中α和β配對的方法是本領域習知的。在一些實施例中，係包括有連接子序列，其連接α和β鏈以形成單一多肽鏈。在一些實施例中，連接子應該具有足夠的長度以跨越α鏈的C端和β鏈的N端之間的距離，或足以跨越跨越α鏈的N端和β鏈的C端之間的距離，同時連接子的長度還須確保不能太長，以避免其阻斷或降低scTCR與標靶肽-MHC複合體的結合。在一些實施例中，連接第一和第二TCR片段的scTCR的連接子可以是任何能夠形成單個多肽鏈的連接子，同時保留TCR結合專一性。在一些實施例中，連接子序列可以例如具有公式-P-AA-P-，其中P是脯胺酸，AA代表一胺基酸序列，該胺基酸是甘胺酸和絲胺酸。在一些實施例中，第一和第二片段配對，使其可變區序列的方向被安排為針對這種結合。因此，在某些情況下，連接子具有足夠的長度以跨越第一片段的C端和第二片段的N端之間的距離，或足以跨越第一片段的N端和第二片段的C端之間的距離，但是不能太長以避免阻斷或降低scTCR結合到標靶配體。在一些實施例中，連接子可含有或約10至45個胺基酸，例如10至30個胺基酸或26至41個胺基酸殘基，例如29、30、31或32個胺基酸。在一些實施方例中，scTCR在單個胺基酸鏈的殘基之間含有雙硫鍵，在一些情況下，其可以促進單鏈分子的α和β區之間配對的穩定性(參見例如美國專利號7,569,664)。在一些實施例中，scTCR含有共價雙硫鍵，其將α鏈恆定域的免疫球蛋白區的殘基連接至單鏈分子的β鏈恆定域的免疫球蛋白區域的殘基。在一些實施例中，雙硫鍵對應於天然dTCR中存在的天然雙硫鍵。在一些實施例中，天然TCR中不具有雙硫鍵。在一些實施例中，雙硫鍵是引入的非天然雙硫鍵，例如，透過將一個或多個半胱胺酸併入scTCR多肽的第一和第二鏈區的恆定區細胞外序列。例示性的半胱胺酸突變包括如前所述的任何突變。在一些情況下，天然和非天然雙硫鍵可同時存在。
在一些實施例中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)都可以連接至訊息傳遞域，以在T細胞表面上產生有活性的TCR。在一些實施例中，TCR係表現在細胞表面上。在一些實施例中，TCR確實含有對應於跨膜序列的序列。在一些實施例中，跨膜域可以是Ca或CP跨膜域。在一些實施例中，跨膜域可 以來自非TCR來源，例如來自CD3z、CD28或B7.1的跨膜區。在一些實施例中，TCR確實含有對應於細胞質序列的序列。在一些實施例中，TCR含有CD3z訊息傳遞域。在一些實施例中，TCR能夠與CD3形成TCR複合體。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可以是重組產生的天然形式蛋白質或其突變形式。在其突變形式中，有一或多種性質(例如結合特徵)已被改變。在一些實施例中，TCR可以衍生自各種動物物種的其中之一，例如人類、小鼠、大鼠或其他哺乳動物。
在一些實施例中，TCR對標靶細胞上的標靶抗原具有親和力。標靶抗原可包括與標靶細胞有關的任何類型蛋白質或其表位。例如，TCR可以對標靶細胞上的標靶抗原具有親和力，其指出標靶細胞的特定疾病狀態。在一些實施例中，標靶抗原係經MHC處理和呈現。
在一實施例中，標靶細胞抗原是紐約食道-1(New York esophageal-1，NY-ESO-1)肽。NY-ESO-1屬於癌症-睾丸(cancer-testis，CT)抗原蛋白質群組。NY-ESO-1是體外高度免疫原性的抗原，並透過MHC呈現給T細胞。辨識A2呈現的表位NY-ESO157-165、SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)的CTL係生長自骨髓瘤患者的血液和淋巴結。對該表位具有專一性的T細胞殖株已被證實可殺死腫瘤細胞。辨識NY-ESO157-165表位的高親和力TCR可辨識HLA-A2陽性、NY-ESO-1陽性細胞株(但不辨識缺乏HLA-A2或NY-ESO的細胞)。因此，本文的TCR可以是對HLA-A2限制(HLA-A2-restricted)的NY-ESO-1(SLLMWITQC；SEQ ID NO：1)有專一性的TCR。在一實施例中，本文的NY-ESO-1 TCR是野生型NY-ESO-1 TCR。野生型NY-ESO-1 TCR可包括但不限於8F NY-ESO-1 TCR(在本文中也被稱為「8F」或「8F TCR」)和1G4 NY-ESO-1 TCR(在本文中也被稱為「1G4」或「1G4 TCR」)。在一實施例中，本文的NY-ESO-1 TCR是親和力增強的1G4 TCR，也稱為Ly95。1G4 TCR和親和力增強的1G4 TCR已描述於美國專利號8,143,376中。這不應被解釋為以任何方式對本發明進行限制，因為對任何標靶抗原具有親和力的TCR都適用於本發明的組成物或方法。在一些實施例中，包括對NY-ESO-1具有親和力的外源T細胞受體(TCR)的經修飾的免疫細胞可用於本發明的篩選方法，例如，用於 鑑定在調節時增強NY-ESO-1 TCR-T細胞功能的基因標靶。在本發明的篩選方法中鑑定的基因標靶不限於基因標靶，其在修飾時調節對特定抗原標靶具有親和力的TCR-T細胞的功能。在本發明的篩選方法中鑑定的基因標靶可以是基因標靶，其在被修飾時調節任何TCR-T細胞的功能(即，對任何抗原標靶具有親和力)。在一些實施例中，在包括使用TCR-T細胞的本發明篩選方法中鑑定的基因標靶可以是TCR-T細胞功能的整體調節子，其獨立於其中包含的TCR的特異性。
在一些實施例中，在本發明的篩選方法中鑑定的基因標靶可以是基因標靶，其在被修飾時調節任何TCR-T細胞的功能(即，對任何標靶抗原具有親和力)。在一些實施例中，在本發明的篩選方法中鑑定的基因標靶可以是基因標靶，其在被修飾時調節任何CAR-T細胞的功能(即，對任何標靶抗原具有親和力)。在一些實施例中，基因標靶可以是T細胞功能的調節子。因此，基因標靶在被修飾時會調節對任何標靶抗原具有親和力的任何TCR-或CAR-T細胞的功能。
因此，包括外源TCR及/或CAR的經修飾的免疫細胞可以被編輯以修飾作為T細胞功能調節子的基因標靶。這種經修飾的免疫細胞可具有增強的免疫細胞功能(例如，標靶細胞殺傷)。
C.嵌合抗原受體
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如經修飾的T細胞)的組成物和方法，其包括嵌合抗原受體(CAR)。因此，在一些實施例中，免疫細胞已經被基因修飾以表現CAR。本發明的CAR包括抗原結合域、跨膜域、鉸鏈域及胞內訊息傳遞域。
抗原結合域可以與CAR的另一個域可操作地連接，例如本文其他部分描述的跨膜域或胞內域，用於在細胞中表現。在一實施例中，編碼抗原結合域的第一核酸序列與編碼跨膜域的第二核酸可操作地連接，並且進一步可操作地連接至編碼胞內域的第三核酸序列。
本文所述的抗原結合域可以組合至任何本文所述的跨膜域、胞內域，或細胞質域、或可組合至其他任何本文所述涵括在CAR中的域。本發明的 標的CAR還可包括如本文所述的間隔域。在一些實施例中，各個抗原結合域、跨膜域和胞內域係透過連接子(linker)分開。
抗原結合域
CAR的抗原結合域是CAR的胞外區，其用於結合特定的標靶抗原，包括蛋白質、碳水化合物和醣脂。在一些實施例中，CAR包括對標靶細胞上的標靶抗原的親和力。標靶抗原可包括與標靶細胞相關的任何類型的蛋白質或其表位。舉例來說，CAR可以包括對標靶細胞上的標靶抗原的親和力，其指出標靶細胞的特定疾病狀態。
在一實施例中，標靶細胞抗原是攝護腺幹細胞抗原(PSCA)。因此，在一實施例中，本文的CAR對標靶細胞上的PSCA具有親和力。在一實施例中，標靶細胞抗原是CD19。因此，在一實施例中，本文的CAR對標靶細胞上的CD19具有親和力。這不應被解釋為以任何方式對本發明進行的限制，因為對任何標靶抗原具有親和力的CAR皆適用於本發明的組成物或方法。
如本文所述的，對標靶細胞上的特定標靶抗原具有親和力的本文的CAR，可包括有標靶專一性的結合域。在一些實施例中，標靶專一性的結合域是鼠類標靶專一性的結合域，例如，標靶專一性的結合域是鼠類來源的。在一些實施例中，標靶專一性的結合域是人類標靶專一性的結合域，例如，標靶專一性的結合域是人類來源的。在一實施例中，對標靶細胞上的PSCA具有親和力的本文的CAR，可包括有PSCA結合域。在一實施例中，對標靶細胞上的CD19具有親和力的本文的CAR，可包括有CD19結合域。
在一些實施例中，本文的CAR可以對一或多種標靶細胞上的一或多種標靶抗原具有親和力。在一些實施例中，CAR可以對標靶細胞上的一或多種標靶抗原具有親和力。在前述實施例中，CAR是雙特異性CAR或多特異性CAR。在一些實施例中，CAR包括一或多種標靶特異性的結合域，其賦予對一或多種標靶抗原的親和力。在一些實施例中，CAR包含一或多種標靶特異性的結合域，其賦予對相同標靶抗原的親和力。舉例來說，包括對相同標靶抗原具有親和力的一或多個標靶特異性結合域的CAR，可以結合至標靶抗原的不同表位。當CAR中存在多個標靶特異性結合域時，該等結合域可以串聯排列並且可 以透過連接子肽分開。舉例來說，在包括有兩個標靶特異性結合域的CAR中，該等結合域係透過寡肽或多肽連接子、Fc鉸鏈區或膜鉸鏈區在單個多肽鏈上共價連接。
在一些實施例中，抗原結合域選自於抗體、抗原結合片段(antigen binding fragment，Fab)及單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)所組成的群組。在一些實施例中，本發明的PSCA結合域選自於PSCA-特異性抗體、PSCA-特異性Fab及PSCA-特異性scFv所組成的群組。在一實施例中，PSCA結合域是PSCA-特異性抗體。在一實施例中，PSCA結合域是PSCA-特異性Fab。在一實施例中，PSCA結合域是PSCA-特異性scFv。在一些實施例中，本發明的PSCA結合域選自於CD19-特異性抗體、CD19-特異性Fab及CD19-特異性scFv所組成的群組。在一實施例中，CD19結合域是CD19-特異性抗體。在一實施例中，CD19結合域是CD19-特異性Fab。在一實施例中，CD19結合域是CD19-特異性scFv。
抗原結合域可包括結合抗原的任何域，並且可包括但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體、人類抗體、人源化抗體、非人類抗體和其任何片段。在一些實施例中，抗原結合域部分包括哺乳動物抗體或其片段。抗原結合域的選擇可取決於標靶細胞表面上存在的抗原的類型和數量。
如本文所使用的，術語「單鏈可變片段」或「scFv」是免疫球蛋白(例如，小鼠或人類)的重鏈可變區(heavy chain，VH)和輕鏈可變區(light chain，VL)的融合蛋白，其共價連接以形成VH：VL異二聚體。重鏈(VH)和輕鏈(VL)直接連接或透過肽編碼的連接子連接，前述連接子連接VH的N端與VL的C端，或連接VH的C端與VL的N端。在一些實施例中，抗原結合域(例如，PSCA結合域)包括scFv，其從N端到C端的構型為VH-連接子-VL。在一些實施例中，抗原結合域包括scFv，其從N端到C端的構型為VL-連接子-VH。本領域技術人員能夠選擇適用於本發明的構型配置。
連接子通常富含甘胺酸以獲得可撓性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性。連接子可以連接胞外抗原結合域的重鏈可變區和輕鏈可變區。連接子的非限制性實例已公開於Shen等人，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008) 及WO2014/087010中，其內容通過引用而將其整體併入本文。各種連接子序列是本領域已知的，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)連接子，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：2)、(GGGS)n(SEQ ID NO：3)及(GGGGS)n(SEQ ID NO：4)，其中n表示至少為1的整數。例示性的連接子序列可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：5)、GGSGG(SEQ ID NO：6)、GSGSG(SEQ ID NO：7)、GSGGG(SEQ ID NO：8)、GGGSG(SEQ ID NO：9)、GSSSG(SEQ ID NO：10)、GGGGS(SEQ ID NO：11)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：12)等。本領域技術人員能夠選擇適合用於本發明的連接子序列。在一實施例中，本發明的抗原結合域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH和VL由具有胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：12)的連接子序列所分開。前述連接子序列可以由核酸序列GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT(SEQ ID NO：13)編碼。
儘管去除了恆定區並引入了連接子，但scFv蛋白仍保有原始免疫球蛋白的專一性。單鏈Fv多肽抗體可以由包含VH和VL編碼序列的核酸來表現，如Huston等人於Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85：5879-5883,1988中所述的。也請參見美國專利號5,091,513、5,132,405及4,956,778、以及美國專利公開號20050196754及20050196754。下列文獻中已經描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(參見例如，Zhao等人，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455-51、Peter等人，J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12、Shieh等人，J Imunol 2009 183(4)：2277-85、Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6)：955-63、Fife等人，J Clin Invst 2006 116(8)：2252-61、Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3)：173-84、Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10：31-40))。下列文獻中已經描述了具有刺激活性的促效性scFv(參見例如，Peter等人，J Bioi Chem 2003 25278(38)：36740-7、Xie等人，Nat Biotech 1997 15(8)：768-71、Ledbetter等人，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6)：427-55、Ho等人，BioChim Biophys Acta 2003 1638(3)：257-66)。
如本文所使用，「Fab」是指抗體結構的片段，其結合抗原但是 是單價且不具有Fc部分，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗體產生兩個Fab片段和一個Fc片段(例如，重(H)鏈恆定區；不與抗原結合的Fc區)。
如本文所使用，「F(ab')2」是指透過胃蛋白酶消化完整IgG抗體產生的抗體片段，而該片段具有兩個抗原結合(ab')(二價)區，其中每個(ab')區包含兩個獨立的胺基酸鏈，各H鏈的一部分和輕鏈(L)透過S-S鍵連接以與抗原結合，且該等H鏈的剩餘部分則連接在一起。「F(ab')2」片段可以分成兩個獨立的Fab'片段。
在一些實施例中，抗原結合域可以衍生自最終前述CAR將被使用的相同物種。例如，為了要在人類中使用，CAR的抗原結合域可包括如本文所述的人類抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合域可以衍生自最終前述CAR將被使用的不同物種。例如，為了要在人類中使用，CAR的抗原結合域可包括如本文所述的鼠類抗體或其片段。
跨膜域
本發明的CAR可包括跨膜域，其將CAR的抗原結合域連接至CAR的胞內域。標的CAR的跨膜域是能夠跨越細胞(例如免疫細胞或其前驅細胞)的細胞膜的區域。跨膜域用於插入細胞膜，例如真核細胞膜。在一些實施例中，跨膜域插入抗原結合域和CAR的胞內域之間。
在一些實施例中，跨膜域天然地與CAR中的一或多個域相關。在一些實施例中，跨膜域可以透過一或多個胺基酸取代來選擇或修飾，以避免這些域與相同或不同的表面膜蛋白的跨膜域結合，以最小化與受體複合體的其他成員的相互作用。
跨膜域可以源自天然或合成來源。在天然來源的情況下，該域可以衍生自任何膜結合或跨膜蛋白，例如第I型跨膜蛋白。在合成來源的情況下，跨膜域可以是促進CAR插入細胞膜的任何人工序列，例如人工疏水序列。在本發明中特別使用的跨膜域的實例包括但不限於衍生自(即至少包括的跨膜域)T細胞受體的α、β或zeta鏈、CD28、CD3ε(epsilon)、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、，CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、類Toll受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、 TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9。在一些實施例中，跨膜域可以是合成的，在這種情況下，它將主要包含疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。優選地，在合成跨膜域的每個末端發現苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。
本文所述的跨膜域可組合至任何本文所述的抗原結合域、胞內域、或其他任何可包括在標的CAR中的域。
在一些實施例中，跨膜域還包含鉸鏈區。本發明的標的CAR還可包括鉸鏈區。CAR的鉸鏈區是親水區，其位於抗原結合域和跨膜域之間。在一些實施例中，該域促進CAR進行適當的蛋白質折疊。鉸鏈區是CAR的可選組件。鉸鏈區包括一域，而該域可選自於抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈序列或其組合。鉸鏈區的實例包括但不限於CD8a鉸鏈、由多肽製成的人工鉸鏈，其可以小至三個甘胺酸(Gly)，也可以為IgG的CH1和CH3域(例如人類IgG4)。
在一些實施例中，本文的標的CAR包括一鉸鏈區，其係將抗原結合域連接至跨膜域，而前述跨膜域又連接至胞內域。鉸鏈區優選地能夠支持抗原結合域以辨識並結合標靶細胞上的標靶抗原(參見例如，Hudecek等人，Cancer Immunol.Res.(2015)3(2)：125-135)。在一些實施例中，鉸鏈區是可撓性域，因此使抗原結合域具有最佳的辨識結構，辨識如腫瘤細胞上標靶抗原的特定結構和密度(Hudecek等人，同上註)。鉸鏈區的可撓性使鉸鏈區域適應於許多不同的構型中。
在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區是衍生自受體(例如，CD8衍生的鉸鏈區)的鉸鏈區多肽。
鉸鏈區的長度可為約4個胺基酸至約50個胺基酸，例如約4個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約25個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約40個胺基酸、或約40個胺基酸至約50個胺基酸。在一些實施例中，鉸鏈區的長度可以大於5個胺基酸、大於10個胺基酸、大於15個胺基酸、大於20個胺基酸、大於25個胺基酸、大於30個胺基酸、大於35個胺基酸、大於40個胺基酸、大於45個胺基酸、大於50個胺基酸、大於55 個胺基酸或更大。
適合的鉸鏈區可以很容易地選擇，並且可以是任何一種的適合長度，例如1個胺基酸(例如，Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸、4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸，且可以是1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。適合的鉸鏈區可具有大於20個胺基酸的長度(例如，30、40、50、60或更多個胺基酸)。
例如，鉸鏈區包括甘胺酸聚合物((G)n)、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：2)及(GGGS)n(SEQ ID NO：3)，其中n是至少為一的整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物，及本領域已知的其它可撓性連接子。可以使用甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物；Gly和Ser都是相對非結構化的，因此可以作為組分之間的中性系鏈(neutral tether)。可以使用甘胺酸聚合物；甚至與丙胺酸相比，甘胺酸獲得顯著更多的phi-psi空間，並且其所受到的限制比更長側鏈的殘基要來得更少(參見例如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2：73-142)。例示性鉸鏈區可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：5)、GGSGG(SEQ ID NO：6)、GSGSG(SEQ ID NO：7)、GSGGG(SEQ ID NO：8)、GGGSG(SEQ ID NO：9)、GSSSG(SEQ ID NO：10)等。
在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列是本領域已知的：參見例如，Tan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1)：162-166、及Huck等人，Nucleic Acids Res.(1986)14(4)：1779-1789。作為非限制性實例，免疫球蛋白鉸鏈區可包括以下胺基酸序列的其中之一：DKTHT(SEQ ID NO：14)、CPPC(SEQ ID NO：15)、CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO：16)(參見例如，Glaser等人，J.Biol.Chem.(2005)280：41494-41503)、ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：17)、KSCDKTHTCP(SEQ ID NO：18)、KCCVDCP(SEQ ID NO：19)、KYGPPCP(SEQ ID NO：20)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：21，人類IgG1鉸鏈)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：22，人類IgG2鉸鏈)、ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：23， 人類IgG3鉸鏈)、SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO：24，人類IgG4鉸鏈)等。
鉸鏈區可包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、鉸鏈區的胺基酸序列。在一實施例中，與野生型(天然存在的)鉸鏈區相比，鉸鏈區可包括一或多個胺基酸取代及/或插入及/或缺失。舉例來說，人類IgG1鉸鏈的His229可以被Tyr取代，因此該鉸鏈區包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO：25)，參見例如Yan等人，J.Biol.Chem.(2012)287：5891-5897。在一實施例中，鉸鏈區可包含衍生自人類CD8的胺基酸序列或其變異體。
胞內訊息傳遞域
本發明的標的CAR還包括胞內訊息傳遞域。術語「胞內訊息傳遞域」和「胞內域」在本文中可交替使用。CAR的胞內訊息傳遞域負責活化表現有該CAR的細胞(例如免疫細胞)的至少一種效用功能。胞內訊息傳遞域轉導效用功能訊號並引導該細胞(例如免疫細胞)執行其特化功能，例如，損傷及/或破壞標靶細胞。
用於本發明的胞內域其實例包括但不限於表面受體、共刺激分子、以及任何分子的細胞質部分，前述分子係共同作用以啟動T細胞中的訊息傳遞。其實例也包括任何前述分子的衍生物或其變異體、以及任何具有相同功能的合成序列。
胞內訊息傳遞域的實例包括但不限於T細胞受體複合體的ζ鏈或其任何同源物，例如η鏈、FcεRIγ及β鏈、MB1(Iga)鏈、B29(Ig)鏈等、人類CD3 zeta鏈、CD3多肽(△、δ及ε)，syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Eyn、Lyn等)和其他涉及T細胞轉導的分子，例如CD2、CD5及CD28。在一實施例中，胞內訊息傳遞域可以是人類CD3 zeta鏈、FcγRIII、FcsRI、Fc受體的細胞質尾區、具有細胞質受體的免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)，及其組合。
在一實施例中，CAR的胞內域包括一或多種共刺激分子的任何部分，例如來自CD2、CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-IBB、PD-1、任何其衍生物或其變異體、任何具有相同功能的合成序列、及其任意組合。
胞內域的其他實例包括來自一或多種分子或受體的片段或域，該 一或多種分子或受體包括但不限於TCR、CD3 zeta、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、常見FcRγ(common FcR gamma)、FcRβ(Fc Epsilon Rib)、CD79a、CD79b、Fcγ Rlla、DAP10、DAP 12、T細胞受體(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴球功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)專一性結合的配體、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD 103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD 18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、類Toll受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、變異體或片段、任何具有相同功能的共刺激分子的合成序列、及其任何組合。
胞內域的其他實例包括但不限於各種其他免疫訊號受體中某些類型的胞內訊息傳遞域。該些免疫訊號受體包括但不限於第一代、第二代和第三代T細胞訊息傳遞蛋白，其包括CD3、B7家族共刺激，及腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族受體(參見例如，Park and Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6)：651-653)。另外，胞內訊息傳遞域可包括NK及NKT細胞所使用的訊息傳遞域(參見例如，Hermanson and Kaufman,Front.Immunol.(2015)6：195)，例如NKp30(B7-H6)的訊息傳遞域(參見例如，Zhang等人，J.Immunol.(2012)189(5)：2290-2299)及DAP 12(參見例如，Topfer等人，J.Immunol.(2015)194(7)：3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10及CD3z。
適用於本發明的標的CAR胞內訊息傳遞域，包括任何所需訊息傳遞域，該訊息傳遞域係響應於CAR的活化(即，被抗原和二聚化劑所活化)而提供獨特和可檢測訊號(例如，細胞一或多種細胞激素的產量增加、標靶基因的轉錄變化、蛋白質活性的改變；細胞行為的變化：例如細胞死亡、細胞增生、細胞分化、細胞存活、細胞訊號反應的調節等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域包括至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個等)如下所述的ITAM基序。在一實施例中，胞內訊息傳遞域包括DAP10/CD28型訊息傳遞鏈。在一實施例中，胞內訊息傳遞域並非共價連接至膜結合的CAR，而是散布在細胞質中。
適用於本發明標的CAR的胞內訊息傳遞域，包括基於免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)的胞內訊息傳遞多肽。在一些實施例中，ITAM基序在胞內訊息傳遞域中重複兩次，其中ITAM基序的第一重複和第二重複彼此間隔6至8個胺基酸。在一實施例中，標的CAR的胞內訊息傳遞域包含3個ITAM基序。
在一些實施例中，胞內訊息傳遞域包括人類免疫球蛋白受體的訊息傳遞域，其含有基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)，例如但不限於FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(參見例如，Gillis等人，Front.Immunol.(2014)5：254)。
合適的胞內訊息傳遞域可以是含有ITAM基序的部分，其衍生自含有ITAM基序的多肽。例如，合適的胞內訊息傳遞域可以是來自任何含有ITAM基序蛋白質的含ITAM基序域。因此，合適的胞內訊息傳遞域不需要包含衍生它的整個蛋白質的完整序列。含有ITAM基序的合適多肽其實例包括但不限於：DAP12、FCER1G(Fcε受體Iγ鏈)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3 zeta)及CD79A(抗原受體複合體相關蛋白α鏈)。
在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自DAP12(也稱為TYROBP、TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、KARAP、PLOSL、DNAX-活化蛋白12、KAR相關蛋白、TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、殺傷活化受體相關蛋白、殺傷活化受體相關蛋白等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自FCER1G (也稱為FCRG、Fcε受體Iγ鏈、Fc受體γ鏈、fc-ε RI-γ、fcRγ、fceR1γ、高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ、免疫球蛋白E受體、高親和力γ鏈等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3δ鏈(也稱為CD3D、CD3-DELTA、T3D、CD3抗原、δ次單元、CD3δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3複合體)、OKT3、δ鏈、T細胞受體T3δ鏈、T細胞表面醣蛋白CD3δ鏈等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3ε鏈(也稱為CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈，T細胞表面醣蛋白CD3ε鏈、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3γ鏈(也稱為CD3G、T細胞受體T3γ鏈、CD3-GAMMA、T3G、γ多肽(TiT3複合體)等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3 zeta鏈(也稱為CD3Z、T細胞受體T3 zeta鏈、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一實施例中，胞內訊息傳遞域衍生自CD79A(也稱為B細胞抗原受體複合體相關蛋白α鏈、CD79a抗原(免疫球蛋白相關α)、MB-1膜醣蛋白、ig-α、膜結合免疫球蛋白相關蛋白、表面IgM相關蛋白等)。在一實施例中，適用於本文的FN3 CAR的胞內訊息傳遞域包括DAP10/CD288型訊息傳遞鏈。在一實施例中，適用於本文的FN3 CAR的胞內訊息傳遞域包括ZAP70多肽。在一實施例中，胞內訊息傳遞域包括TCR zeta、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的細胞質訊息傳遞域。在一實施例中，CAR中的胞內訊息傳遞域包括人類CD3 zeta的細胞質訊息傳遞域。
雖然通常可以使用整個胞內訊息傳遞域，但在許多情況下不必使用整個鏈。在使用胞內訊息傳遞域的截短部分的情況下，可以使用前述截短部分來代替完整的鏈，只要其長度足夠轉導效用功能訊號。胞內訊息傳遞域包括足以轉導效用功能訊號的胞內訊息傳遞域的任何截短部分。
本文所述的胞內訊息傳遞域可組合至下列域：任何本文所述的抗原結合域、跨膜域、或其他任何可包含在CAR中的域。
D.核酸和表現載體
本發明提供了編碼外源TCR及/或CAR的核酸。在一實施例 中，本發明的核酸包括編碼外源TCR的核酸序列(例如，NY-ESO-1 TCR)。在一實施例中，本發明的核酸包括編碼外源CAR(例如，PSCA CAR)的核酸序列。
在一些實施例中，本文的核酸係用來例如在哺乳動物細胞中產生如本文所述的TCR及/或CAR。在一些實施例中，本文的核酸係用來擴增編碼有TCR-或CAR-的核酸。
如本文所述，本文的TCR包括TCR α鏈和TCR β鏈。因此，本文提供了編碼TCR α鏈的核酸及編碼TCR β鏈的核酸。在一些實施例中，編碼TCR α鏈的核酸與編碼TCR β鏈的核酸是分開的。在一例示性實施例中，編碼TCR α鏈的核酸和編碼TCR β鏈的核酸位於同一個核酸內。
在一些實施例中，本發明的核酸包括含有TCR α鏈編碼序列和TCR β鏈編碼序列的核酸。在一些實施例中，本發明的核酸包括核酸，其包括TCR α鏈編碼序列和TCR β鏈編碼序列，前述序列透過連接子分開。用於本發明的連接子允許多個蛋白質可以由同一個核酸序列(例如，多順反子或雙順反子序列)編碼，其被轉譯為多蛋白，前述多蛋白被解離成獨立的蛋白質組分。例如，用於本文的核酸的連接子包括TCR α鏈編碼序列和TCR β鏈編碼序列，使TCR α鏈和TCR β鏈會轉譯為多蛋白，該多蛋白解離成獨立的TCR α鏈和TCR β鏈組分。
在一些實施例中，連接子包含一核酸序列，其編碼內部核醣體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)。如本文所使用的，「內部核醣體進入位點」或「IRES」是指促進內部核醣體直接進入蛋白質編碼區的起始密碼子(例如ATG)的元件，從而使基因進行端帽不依賴性(cap-independent)的轉譯。各種內部核醣體進入位點是本領域技術人員已知的，其包括但不限於，可從病毒或細胞mRNA來源所獲得的IRES，例如免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)、血管內皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子2、類胰島素生長因子、轉譯起始因子eIF4G、酵母菌轉錄因子TFIID及HAP4、及IRES可從例如心臟病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、弗里德氏鼠類白血病病毒(Friend murine leukemia virus，FrMLV)和莫洛尼氏鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus， MoMLV)所獲得的。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的IRES。
在一些實施例中，連接子包含編碼自我截切肽的核酸序列。如本文所使用，「自我截切肽」或「2A肽」是指一種寡肽，其使多個蛋白質被編碼為多蛋白，其在轉譯時解離成組分蛋白。術語「自我截切」的使用並非意指蛋白質的水解切割反應。各種自我截切肽或2A肽是本領域技術人員已知的，包括但不限於在小核糖核酸病毒科中所發現的下列病毒，例如口蹄疫病毒(FMDV)，馬鼻炎A病毒(ERAV0)、明脈扁刺蛾病毒(TaV)及豬鐵士古病毒-1(PTV-1)、及心臟病毒例如泰勒病毒(Theilovirus)及腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)。來自FMDV、ERAV、PTV-1，和TaV的2A肽在本文中分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」和「T2A」。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的自我截切肽。
在一些實施例中，連接子還包含編碼弗林蛋白酶(furin)切割位的核酸序列。弗林蛋白酶是一種普遍表現的蛋白酶，其存在於反式高基氏體中，並在蛋白質分泌之前對其前驅物進行加工。弗林蛋白酶在其共通辨識序列的COOH-末端進行切割。各種弗林蛋白酶的共通辨識序列(或「弗林蛋白酶切割位」)是本領域技術人員已知的，其包括但不限於Arg-X1-Lys-Arg(SEQ ID NO：26)或Arg-X1-Arg-Arg(SEQ ID NO：27)、X2-Arg-X1-X3-Arg(SEQ ID NO：28)及Arg-X1-X1-Arg(SEQ ID NO：29)，例如Arg-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO：30)，其中X1是任何天然存在的胺基酸，X2是Lys或Arg，X3是Lys或Arg。本領域技術人員將能夠選擇合適的弗林蛋白酶切割位用於本發明。
在一些實施例中，連接子包含編碼弗林蛋白酶切割位和2A肽的組合的核酸序列。其實例包括但不限於包含編碼弗林蛋白酶和F2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和E2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和P2A的核酸序列的連接子、包含編碼弗林蛋白酶和T2A的連接子。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的組合。在前述實施例中，連接子可進一步包含弗林蛋白酶和2A肽之間的間隔序列。各種間隔序列是本領域已知的，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)間隔子，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：2)及(GGGS)n(SEQ ID NO：3)，其中n表示至少為1的整數。例示性間隔序列可 包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：5)、GGSGG(SEQ ID NO：6)、GSGSG(SEQ ID NO：7)、GSGGG(SEQ ID NO：8)、GGGSG(SEQ ID NO：9)、GSSSG(SEQ ID NO：10)等。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的間隔序列。
在一些實施例中，本發明的核酸可以與轉錄控制單元(例如啟動子和促進子(enhancer)等)可操作地連接。適合的啟動子和促進子是本領域技術人員已知的。
為了在細菌細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。為了在真核細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及促進子單元、巨細胞病毒立即早期啟動子(cytomegalovirus immediate early promoter)、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的長末端重複中的啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子，以及各種本領域已知的組織專一性啟動子。合適的可逆啟動子(reversible promoter)，係包括可逆誘導型啟動子(reversible inducible promoter)，是本領域已知的。前述可逆啟動子可以分離並衍生自許多生物，例如真核生物和原核生物。對來自第一生物體的可逆啟動子的修飾以用於第二生物體(例如，第一生物為原核生物而第二生物為真核生物、或是一第一生物為真核生物而第二生物為原核生物等)是本領域公知的。前述可逆啟動子，和基於前述可逆啟動子但也包含其他控制蛋白的系統，係包括但不限於醇調節啟動子(alcohol regulated promoter)(例如，乙醇去氫酶I(alcA)基因啟動子、對乙醇反式活化蛋白(alcohol transactivator proteins，A1cR)產生反應的啟動子)等、四環素調節啟動子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等的啟動子系統)、類固醇調節啟動子(例如，大鼠糖皮質素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視色素啟動子系統，甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素(ecdysone)啟動子系統、美服培酮(mifepristone)啟動子系統等)、金屬調節啟動子(如金屬硫蛋白啟動子系統等)、相關病原調節之啟動子(如水楊酸調節啟動子、乙烯調節啟動子、苯并噻二唑調節啟動子等)、溫度調節啟動子(例如，熱休克誘導型啟動子(如HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等))、光調節啟動子、 合成誘導型啟動子及前述啟動子的類似物等。
在一些實施例中，啟動子是CD8細胞專一性啟動子、CD4細胞專一性啟動子、嗜中性球專一性啟動子或NK專一性啟動子。例如，啟動子可以是CD4基因啟動子：參見例如，Salmon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：7739、及Marodon等人，(2003)Blood 101：3416。另一個實例啟動子可以是CD8基因啟動子。NK細胞的專一性表現可以藉由使用NcrI(p46)啟動子來達成：參見例如，Eckelhart et al.Blood(2011)117：1565。
為了在酵母菌細胞中表現，合適的啟動子是組成型啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等；或可調控的啟動子，如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子及AOX1(例如，用於畢赤酵母菌屬(Pichia))。選擇合適的載體和啟動子是本領域普通技術人員的公知常識。適用於原核宿主細胞的啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子、trp啟動子、lac操縱子啟動子、雜交啟動子(hybrid promoter)，例如lac/tac雜交啟動子、tac/trc雜交啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子、trc啟動子、tac啟動子等、araBAD啟動子、體內調控的啟動子，例如ssaG啟動子或相關啟動子(參見例如，美國專利公開號20040131637)、pagC啟動子(Pulkkinen及Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93、Alpuche-Aranda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21)：10079-83)，nirB啟動子(Harborne等人，Mol.Micro.(1992)6：2805-2813)等(參見例如，Dunstan等人，Infect.Immun.(1999)67：5133-5141、McKelvie等人，Vaccine(2004)22：3243-3255、及Chatfield等人，Biotechnol.(1992)10：888-892)、sigma70啟動子，例如共通sigma70啟動子(參見例如，GenBank登錄號AX798980、AX798961及AX798183)、固定相啟動子(stationary phase promoter)，例如dps啟動子、spv啟動子等、源自致病島(pathogenicity island)SPI-2的啟動子(參見例如WO96/17951)、actA啟動子(參見例如，Shetron-Rama等人，Infect.Immun.(2002)70：1087-1096)、rpsM啟動子(參見例如，Valdivia 及Falkow Mol.Microbiol.(1996).22：367)、tet啟動子(參見例如，Hillen,W.及Wissmann，A.(1989)In Saenger,W.and Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular and Structural Biology,Protein--Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,Vol.10,pp.143-162)、SP6啟動子(參見例如，Melton等人，Nucl.Acids Res.(1984)12：7035)等等。適用於原核生物如大腸桿菌的強效啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7和PLambda。用於細菌宿主細胞的操縱子的非限制性實例包括乳糖啟動操縱子(當與乳糖接觸時，LacI抑制蛋白改變結構，進而阻止Lad抑制蛋白與操縱子結合)、色胺酸啟動操縱子(當與色胺酸複合時，TrpR抑制蛋白具有結合操縱子的結構；在不存在色胺酸的情況下，TrpR抑制蛋白具有不與操縱子結合的結構)及tac啟動操縱子(參見例如deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：21-25)。
合適的啟動子的其他實例包括立即早期巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子序列。該啟動子序列是強效組成型啟動子序列，其能夠驅動任何與其可操作地連接的多核苷酸序列的高水平表現。也可以使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、家禽白血病病毒啟動子，艾伯斯坦-巴爾病毒迅早期啟動子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)、EF-1α啟動子、以及人類基因啟動子，例如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌胺酸激酶啟動子。此外，本發明不應僅限於使用組成型啟動子，本發明亦涵蓋誘導型啟動子。誘導型啟動子可以作為一種分子開關，在有需要時，可用來啟動與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現，或是在不想要發生這種表現時，用來關閉與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現。誘導型啟動子的實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、黃體素啟動子及四環素啟動子。
在一些實施例中，含有合適啟動子的基因座或構築體或轉基因，係透過誘導系統的誘導來進行不可逆轉換。適用於誘導不可逆轉換的系統是本領域熟知的，例如，不可逆轉換的誘導可以利用Cre-lox介導的重組(參見例如， Fuhrmann-Benzakein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28：e99，其公開內容通過引用併入本文)。任何本領域已知的重組酶、核酸內切酶、連接酶、重組位點等的合適組合，皆可用於產生不可逆轉換的啟動子。本文中所述的進行位點專一性重組的方法、機制及需求，可用於產生不可逆轉換的啟動子，並且是本領域熟知的，參見例如Grindley等人，Annual Review of Biochemistry(2006)567-605、及Tropp,Molecular Biology(2012)(Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,Mass.)中所述內容，其公開內容以引用方式而納入本文。
在一些實施例中，本發明的核酸還包含編碼有TCR及/或CAR誘導型表現盒(inducible expression cassette)的核酸序列。在一實施例中，TCR及/或CAR誘導型表現盒係用於產生在TCR及/或CAR訊息傳遞後所釋放的轉基因多肽產物。參見例如，Chmielewski及Abken，Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8)：1145-1154、及Abken,Immunotherapy(2015)7(5)：535-544。在一些實施例中，本文的核酸更包括編碼與T細胞活化反應性啟動子可操作地連接的細胞激素的核酸序列。在一些實施例中，與T細胞活化反應性啟動子可操作地連接的細胞激素位於獨立的核酸序列上。在一實施例中，細胞激素是IL-12。
本發明的核酸可以存在於表現載體及/或轉殖載體中。表現載體可包括可篩選標記、複製起始序列及提供載體複製及/或維持的其他特徵。合適的表現載體包括例如質體、病毒載體等。本領域技術人員已知大量合適的載體和啟動子、且目前已有許多商售可購得而用於產生標的重組構築體。可透過實例提供以下載體，且不應解釋為本發明的限制：細菌：pBs、噬菌體、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，Calif，美國)、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(Pharmacia)。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近的方便限制性位點(convenient restriction site)，讓編碼有異源蛋白質的核酸序列得以插入。表現宿主可具有操作性的可篩選標記。合適的表現載體包括但不限於病毒載體(例如基於痘病毒的病毒載體、小兒麻痺病毒、腺病毒(參見例如，Li等人，Invest. Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2543-2549、Borras等人，Gene Ther.(1999)6：515-524、Li及Davidson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7700-7704、Sakamoto等人，H.Gene Ther.(1999)5：1088-1097、WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)、腺相關病毒(參見例如，Ali等人，Hum.Gene Ther.(1998)9：81-86、Flannery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6916-6921、Bennett等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38：2857-2863、Jomary等人，Gene Ther.(1997)4：683 690、Rolling等人，Hum.Gene Ther.(1999)10：641-648、Ali等人，Hum.Mol.Genet.(1996)5：591-594、Srivastava於WO 93/09239、Samulski等人，J.Vir.(1989)63：3822-3828、Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165及Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：10613-10617))、SV40、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(參見例如，Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：10319-23、Takahashi等人，J.Virol.(1999)73：7812-7816)、反轉錄病毒載體(例如，鼠類白血病病毒、脾臟壞死病毒及衍生自反轉錄病毒的載體，例如勞氏肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、家禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)及乳癌病毒)及前述病毒載體的類似物等。
適合使用的其他表現載體例如但不限於慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體、經改造的雜交病毒載體、轉位子所介導的載體等。病毒載體技術是本領域公知的，並且描述於例如Sambrook等人，2012，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press，NY)，以及其他病毒學和分子生物學手冊中。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。
傳統上，合適的載體含有可在至少一種生物中發揮功能的複製起始序列、啟動子序列、方便的限制性內切核酸酶位點及一或多個可篩選的標記(例如，WO 01/96584、WO 01/29058及美國專利號6,326,193)。
在一些實施例中，表現載體(例如，慢病毒載體)可用於將TCR及/或CAR引入免疫細胞或其前驅細胞(例如T細胞)中。因此，本發明的表 現載體(例如，慢病毒載體)可包含編碼有TCR及/或CAR的核酸。在一些實施例中，表現載體(例如，慢病毒載體)將包含有助於TCR及/或CAR的功能性表現的其他單元。在一些實施例中，包含編碼TCR及/或CAR核酸的表現載體，還包含哺乳動物啟動子。在一實施例中，載體還包含延長因子-1-α啟動子(EF-1α啟動子)。使用EF-1α啟動子可以提高下游轉基因(例如TCR及/或CAR編碼核酸序列)的表現效率。生理啟動子(例如，EF-1α啟動子)可能較不會誘發由嵌入所介導的遺傳毒性，並且可消除反轉錄病毒載體轉化幹細胞的能力。適用於載體(例如慢病毒載體)的其他生理學啟動子是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體中。在一些實施例中，載體(例如，慢病毒載體)還包含非必需順式作用序列(non-requisite cis acting sequence)，前述序列可以改善效價和基因表現。非必需順式作用序列的一個非限制性實例是中心多嘌呤管道和中心終止序列(central polypurine tract and central termination sequence，cPPT/CTS)，其對於有效的反轉錄和細胞核輸入是重要的。其他非必需的順式作用序列是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。在一些實施例中，載體還包含轉錄後調控元件。轉錄後調控元件可以改善RNA轉譯、改善轉基因表現並穩定RNA轉錄物。轉錄後調控元件的一個實例是土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)。因此，在一些實施例中，用於本發明的載體還可包含WPRE序列。各種轉錄後調節元件是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。本發明的載體可以進一步包含其他元件，例如用於RNA轉運的rev反應元件(rev response element，RRE)、包裝序列(packaging sequences)和5'和3'長末端重複(LTR)。術語「長末端重複」或「LTR」是指位於反轉錄病毒DNA末端的鹼基對的域，其包含U3、R和U5區。LTR通常提供表現反轉錄病毒基因所需的功能(例如，基因轉錄物的促進、起始及多腺苷酸化)和病毒複製。在一實施例中，本發明的載體(例如，慢病毒載體)包括3'U3缺失的LTR。因此，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可包含本文所述元件的任何組合，以增強轉基因功能性表現的效率。例如，除了編碼TCR及/或CAR的核酸之外，本發明的載體(例如， 慢病毒載體)可以包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5'LTR、3'U3缺失的LTR'。
本發明的載體可以是自我去活化載體(self-inactivating vector)。如本文所使用的，術語「自我去活化載體」是指其中3'LTR促進子啟動子區(U3區)已被修飾(例如，透過缺失或取代)的載體。自我去活化載體可以在病毒第一次複製後阻止病毒轉錄。因此，自我去活化載體可以僅感染一次，然後嵌入到宿主基因體(例如哺乳動物基因體)中，且不能進一步被傳遞。因此，自我去活化載體可以大幅的降低產生出具有複製能力病毒的風險。
在一些實施例中，本發明的核酸可以是RNA，例如體外合成的RNA。用於體外合成RNA的方法是本領域技術人員已知的，任何已知的方法皆可用來合成包含編碼本發明TCR及/或CAR序列的RNA。將RNA引入宿主細胞的方法是本領域已知的。參見例如，Zhao等人，Cancer Res.(2010)15：9053。將包含編碼本發明的TCR及/或CAR的核苷酸序列的RNA引入宿主細胞，係可在體外或離體或體內進行。例如，宿主細胞(例如，NK細胞、胞毒性T淋巴球等)可以用包含本發明編碼TCR及/或CAR核苷酸序列的RNA，在體外或離體進行電穿孔。
為了評估多肽或其部分的表現，待引入細胞的表現載體還可含有可篩選標記基因或報導基因，或兩者皆有，以便於從被病毒載體所轉染或感染的細胞群中鑑定和選出有表現的細胞。在一些實施例中，可篩選標記可以在獨立的DNA片段上攜帶，並用於共轉染步驟。可篩選標記和報導基因的兩側可以接有適當的調控序列，以使其能夠在宿主細胞中表現。有用的可篩選標記例如包括但不限於抗生素抗藥性基因。
報導基因係用來鑑定潛在被轉染的細胞和評估調控序列的功能。一般來說，報導基因在受體生物體或組織中是不存在或不表現的，且編碼有一多肽，該多肽的表現可透過一些易於檢測的特性(例如酵素活性)顯現出來。在將DNA引入受體細胞後，在適當的時間評估報導基因的表現。合適的報導基因可包括但不限於下列基因：編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌的鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。
E.經修飾的免疫細胞
本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如T細胞)，其包括本文所述之外源TCR及/或CAR。因此，前述經修飾的細胞具有由其所表現的TCR及/或CAR引導的特異性。例如，包括NY-ESO-1 TCR的本發明的經修飾細胞對標靶細胞上的NY-ESO-具有特異性。
經基因編輯的免疫細胞
本發明提供了經基因編輯修飾的細胞。在一些實施例中，基因編輯本發明的經修飾細胞(例如，包含外源TCR及/或CAR的經修飾細胞)以破壞一或多種內源基因的表現。在一些實施例中，經基因編輯的免疫細胞(例如，T細胞)在一或多種內源基因的表現上有減少、缺失、消除、剔除或破壞。
在一些實施例中，係對本發明經修飾的細胞進行基因編輯，以破壞選自下列群組的一或多種內源基因的表現：脂蛋白A2(APOA2)、5-氮雜胞嘧啶核甘誘導2(5-Azacytidine Induced 2，AZI2)、BTB域和CNC同系物2(Bach2)、C10orf129(也稱為乙醯輔酶A合成酶中鏈家族成員6；ACSM6)、C1orf141、C1orf64(也稱為類固醇受體相關和調節蛋白；SRARP)，C-C基序趨化介素配體7(CCL7)、週期蛋白I家族成員2(CCNI2)、氯離子通道附件1(CLCA1)、氯離子核苷酸敏感通道1A(CLNS1A)、生物時鐘調節子(CLOCK)、富含半胱胺酸的跨膜模組1(CYSTM1)、防禦素α4(DEFA4)、具有序列相似性的家族124成員A(FAM124A)、FAM86A(也稱為真核延伸因子2離胺酸甲基轉移酶；EEF2KMT)、多肽N-乙醯半乳糖胺轉移酶2(GALNT2)、含有5的乙二醛酶域(GLOD5)、G蛋白偶聯受體35(GPR35)、缺氧調節因子-1(HRF1)、富含組胺酸的醣蛋白(HRG)、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、驅動蛋白家庭成員27(KIF27)、Kruppel樣因子4(Klf4)、肌凝蛋白結合蛋白H(MYBPH)、NDC、NADH：泛醌氧化還原酶次單元S4(NDUFS4)、PAXIP1相關麩胺酸富集蛋白1(PAGR1)、Parvin γ(PARVG)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMVK)、蛋白激酶CAMP激活的催化次單員β(PRKACB)、前MRNA加工因子39(PRPF39)、懷孕特殊β-1-醣蛋白5(PSG5)、攝護腺素I2受體(PTGIR)、 小兒麻痺病毒受體相關3(PVRL3)、SIX同源匣2(SIX2)、跨膜蛋白249(TMEM249)、跨膜蛋白48(TMEM48)、四肽肽重複域27(TTC27)、泛素特異性胜肽酶27、X-連接(X-Linked；USP27X)、含WD重複的蛋白85(WDR85)、YY1相關蛋白1(YY1AP)、以及鋅和環指2(Zinc And Ring Finger 2，ZNRF2)。
使用CAR(嵌合抗原受體)T細胞和TCR重導向T細胞的免疫療法在癌症患者的治療中已經顯示出各種功效。限制其作用的主要問題之一是在腫瘤細胞持續刺激後T細胞被耗竭。被衰竭的T細胞具有降低的效用功能，例如細胞激素的產生和對腫瘤細胞的細胞毒性，並且它們表現更高水平的檢查點抑制分子，例如PD-1和CTLA-4。在臨床上PD-1和CTLA-4抗體已用於治療多種類型的癌症。然而，大多數患者並未從這些療法中得到好處。被衰竭的T細胞的全基因體表觀遺傳學景觀(epigenetic landscape)已經顯示其不同於作用性T細胞和記憶T細胞，並且這些被衰竭的T細胞不能透過例如PD-L1阻斷來重建/重新激活(remodeled/reinvigorated)(參見Pauken等人(2016)Science，354(6316)：1160-1165)。不受任何理論束縛，改變的表觀遺傳學景觀可能限制被衰竭的T細胞，使其不被檢查點抗體完全重新激活。
在某些實施例中，本文的經修飾的細胞被基因編輯以破壞轉錄調節因子的表現。如本文其他部分所述，本發明顯示轉錄調節因子(例如轉錄因子或表觀遺傳學調節子)的破壞用於增強免疫細胞(例如T細胞)的功能。不受任何理論束縛，破壞轉錄調節因子(例如，轉錄因子或表觀遺傳學調節子)的表現可導致參與負調控免疫細胞功能(例如，T細胞存活)的基因的表現降低及/或增加參與正調控免疫細胞功能(例如，促存活因子)的基因的表現，從而增加基因編輯的免疫細胞的功效。
因此，本發明的經修飾細胞的轉錄調節因子的表現被破壞(例如，經修飾的T細胞的轉錄因子或表觀遺傳學調節子的表現被破壞)，可以抵抗衰竭，並且在一些實施例中，可以透過檢查點抗體(例如，抗-PD-1、抗-CTLA-4、抗-PDL1抗體)另外被重新激活。
舉例來說，本文將PAGR1、Klf4和SIX2鑑定為當表現被破壞時， 能夠增強免疫細胞(例如T細胞)功能的基因。在一例示性實施例中，本文的經修飾細胞被基因編輯以破壞PAGR1的表現。在一例示性實施例中，本文的經修飾細胞被基因編輯以破壞Klf4的表現。在一例示性實施例中，本文的經修飾細胞被基因編輯以破壞SIX2的表現。在一些實施例中，本文的經修飾細胞被基因編輯以破壞選自於PAGR1、Klf4和SIX2的一或多種基因的表現。
當轉錄調節因子(例如轉錄因子或表觀遺傳學調節子)的表現被破壞導致作用於轉錄調節因子下游的一或多個基因的表現下調時，本發明的經修飾的細胞可以是被基因編輯以破壞一或多個下游作用基因的表現。舉例來說，Klf4和SIX2是調節本領域已知的一或多種下游基因表現的轉錄因子。因此，本發明提供了經基因編輯的經修飾細胞，以破壞由Klf4及/或SIX2調節的一或多種基因的表現。在另一個實例中，PAGR1是表觀遺傳調節子組織蛋白-離胺酸-N-甲基轉移酶2D(histone-lysine-N-methyltransferase 2D，KMT2D)的已知組分。如本文其他部分所述，PAGR1的破壞導致以下一或多種基因的表現：降低富含AT的相互作用域1A(ARID1A)、富含AT的相互作用域3B(ARID3B)、額外性梳狀1(Additional Sex Combs Like 1，ASXL1)、DNA甲基轉移酶3α(DNMT3A)、雙特異性磷酸酶1(DUSP1)、促分裂蛋白激酶激酶激酶8(MAP3K8)、PAX交互作用蛋白1(PAXIP1)、蛋白精胺酸甲基轉移酶1(PRMT1)、細胞激素訊息傳遞抑制因子3(SOCS3)、及/或TNFα誘導的蛋白3(TNFAIP3)。因此，本發明提供了經基因編輯的經修飾細胞，以破壞選自ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3和TNFAIP3的一或多種基因的表現。
在其他實施例中，本文的經修飾的細胞被基因編輯以破壞內源PDCD1基因產物(程序性死亡1受體；PD-1)的表現。破壞內源PD-1的表現可以產生「檢查點」抵抗性修飾細胞，導致腫瘤控制增加。檢查點抵抗性修飾細胞還可以透過破壞例如但不限於腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B和T淋巴細胞衰弱蛋白(BTLA/CD272)、CD96、胞毒性T淋巴球相關蛋白4(CTLA-4/CD152)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、淋巴球活化基因-3(LAG3)、具有Ig和ITIM 域的T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞免疫球蛋白域和黏蛋白域3(TIM-3)、或T細胞活化的V域Ig抑制因子(VISTA)的表現來產生。
因此，本發明經修飾細胞係經基因編輯以破壞任何本文所述的內源基因的表現。因此，在一些實施例中，本發明經修飾的細胞(例如，包含外源TCR及/或CAR的經修飾細胞)係經基因編輯以破壞一或多個本文所述的內源基因的表現。
各種基因編輯技術是本領域技術人員已知的。基因編輯技術包括但不限於歸巢內切酶(homing endonucleases)、鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、類轉錄活化因子反應物(transcription activator-like effector，TALE)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和常間回文重複序列叢集-常間回文重複序列叢集關聯蛋白系統9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR-associated protein 9(Cas9))。歸巢內切酶通常將其DNA基質切割為二聚體，並且不具有不同的結合和切割域。ZFN會辨識由兩個鋅指結合位點所組成的標靶位點，前述鋅指結合位點係位於長度為5至7鹼基對(base pair，bp)的FokI切割域辨識間隔序列的兩旁。TALEN辨識由兩個TALE DNA結合位點所組成的標靶位點，其位於長度為12至20鹼基對的FokI切割域辨識間隔序列的兩旁。Cas9核酸酶靶向與位於相容的前間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)上游的單引導RNA(gRNA)內的靶向序列互補的DNA序列。據此，本領域技術人員將能夠為本發明選擇合適的基因編輯技術。
在一些實施例中，其係透過使用RNA引導的核酸酶系統，例如對基因(例如，PAGR1、Klf4、SIX2)具有專一性的CRISPR-Cas系統(例如CRISPR-Cas9系統)來進行基因編輯以破壞前述基因。在一些實施例中，將含有Cas9和引導RNA(gRNA)、含有靶向基因座區的標靶域的介質引入細胞中。在一些實施例中，前述介質為，或包含有，Cas9多肽和gRNA(Cas9/gRNA RNP)的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)複合體。在一些實施例中，前述介質包含含有Cas9和gRNA的核酸(例如質體)。在一些實施例中，引入過程係包括以體外方式使介質或其部分與細胞接觸，其可包括將該細胞及介質培養或培 育達24、36或48小時或3、4、5、6、7、或8天。在一些實施例中，引入過程還可以包括向細胞中遞送試劑。在各種實施例中，根據本發明的方法，組成物和細胞係利用Cas9和gRNA的核糖核蛋白(RNP)複合體直接遞送至細胞，例如透過電穿孔。在一些實施例中，RNP複合體包括已被修飾為包含3'端poly-A尾部和5'端抗-反向端帽類似物(Anti-Reverse Cap Analog，ARCA)端帽的gRNA。
CRISPR/Cas9系統是用於誘發標靶基因改變的簡便且有效的系統。Cas9蛋白的標靶辨識，需要位在引導RNA(gRNA)內的「種子」序列和位在gRNA結合區上游而含有保守雙核苷酸的PAM序列。因此，可以透過重新設計細胞株(例如293T細胞)、初代細胞及TCR T細胞中的gRNA來設計CRISPR/Cas9系統，以切割幾乎任何DNA序列。透過共表現單個Cas9蛋白與兩個或更多個的gRNA，CRISPR/Cas9系統得以同時靶向多個基因體基因座，使得該系統適於進行多基因編輯或標靶基因的協同活化。
Cas9蛋白和引導RNA會形成辨識和切割標靶序列的複合體。Cas9由六個域組成：REC I、REC II、Bridge Helix、PAM相互作用、HNH和RuvC。REC I域會結合引導RNA，而Bridge Helix係結合至標靶DNA。HNH和RuvC域是核酸酶域。引導RNA被設計為具有與標靶DNA序列互補的5'端。在引導RNA與Cas9蛋白結合後，會發生結構變化，以活化蛋白質。一旦活化，Cas9會透過與其PAM序列所匹配的序列相結合來搜索標靶DNA。PAM一個長度為兩個或三個核苷酸鹼基的序列，並且緊接於引導RNA的互補區域下游。在一個非限制性實例中，PAM序列是5'-NGG-3'。當Cas9蛋白質以適當的PAM發現其標靶序列時，它會將PAM上游的鹼基解鏈並將它們與引導RNA上的互補區域配對，然後RuvC和HNH核酸酶域會在PAM上游第三個核苷酸鹼基的後方對標靶DNA進行切割。
用於抑制基因表現的CRISPR/Cas系統的一個非限制性實例(CRISPRi)係描述於美國專利申請公開號US20140068797。CRISPRi係誘發永久性基因破壞，其係利用RNA引導的Cas9內切核酸酶來引入DNA雙股斷裂，而觸發易誤修復(error-prone repair)途徑以導致移碼突變(frame shift mutation)。不具催化活性(catalytically dead)的Cas9缺乏內切核酸酶活性。當與引導RNA 共表現時，會產生一DNA辨識複合體，其專一性地干擾轉錄延伸、RNA聚合酶結合或轉錄因子結合。前述CRISPRi系統能有效抑制標靶基因的表現。
當將標靶基因專一性的引導核酸序列和Cas內切核酸酶引入細胞並形成能夠使Cas內切核酸酶在標靶基因處引入雙股斷裂的複合體時，會發生CRISPR/Cas基因破壞。在某些實施例中，CRISPR/Cas系統包含有表現載體，例如但不限於pAd5F35-CRISPR載體。在其他實施例中，Cas表現載體會誘發Cas9內切核酸酶的表現。本發明也可使用其他內切核酸酶，包括但不限於Cas12a(Cpf1)、T7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、以及其他本領域已知的核酸酶及其任何組合。
在某些實施例中，誘導Cas表現載體的過程包括將細胞暴露於介質中，前述介質會活化Cas表現載體中的誘導型啟動子。在前述實施例中，Cas表現載體包括誘導型啟動子，例如其係透過暴露於抗生素(例如，透過四環素或四環素的衍生物，例如去氧羥四環素)來誘導的。本發明也可以使用其他本領域技術人員已知的誘導型啟動子。誘導劑可以是選擇性條件(例如，暴露於試劑，例如抗生素)，其會導致誘導型啟動子的誘發，這將導致Cas表現載體的表現。
如本文所使用的，術語「引導RNA」或「gRNA」是指在細胞中促進RNA引導的核酸酶(例如Cas9)與標靶序列(例如基因體或游離序列)特異性結合(或「靶向」)的任何核酸。
如本文所使用的，「模組化(modular)」或「雙RNA」引導係包含多於一種，通常為兩種，獨立的RNA分子，例如CRISPR RNA(crRNA)和反式活化crRNA(tracrRNA)，其通常與彼此相聯，例如透過雙工(duplexing)。在下列文獻中描述了gRNA及其組成部分(參見例如，Briner等人，Mol.Cell,56(2),333-339(2014)，其通過引用併入本文)。
如本文所使用的，「單分子gRNA」、「嵌合gRNA」或「單引導RNA(single guide RNA，sgRNA)」係包含單個RNA分子。sgRNA可以是連接在一起的crRNA和tracrRNA。舉例來說，crRNA的3'端可以與tracrRNA的5'端連接。舉例來說，透過橋接crRNA的互補區域的4個核苷酸(例如， GAAA)」「四環(tetraloop)」或「連接子」序列(在其3'端)和tracrRNA(在其5'端)，crRNA和tracrRNA可以連接成單一個單分子或嵌合gRNA。
如本文所使用的，「重複」序列或區是crRNA的3'端或其附近的核苷酸序列，其與tracrRNA的抗重複序列互補。
如本文所使用的，「抗重複」序列或區是tracrRNA的5'端或其附近的核苷酸序列，其與crRNA的重複序列互補。
關於引導RNA結構和功能的其他細節，包括用於基因體編輯的gRNA/Cas9複合體，至少可以在下列文獻中找到相關描述：Mali等人，Science,339(6121),823-826(2013)、Jiang等人，Nat.Biotechnol.31(3).233-239(2013)、及Jinek等人，Science,337(6096),816-821(2012)，其通過引用併入本文。
如本文所使用的，「引導序列」或「靶向序列」是指gRNA的核苷酸序列，無論是單分子的還是模組化的，其與需要編輯的細胞基因體中在DNA序列中的標靶域或標靶多核苷酸完全或部分互補。通常引導序列的長度為10至30個核苷酸，優選的長度為16至24個核苷酸(例如，長度為16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸)，並且位於或接近於Cas9 gRNA的5'端。
如本文所使用的，「標靶域」或「標靶多核苷酸序列」或「標靶序列」是細胞基因體中與gRNA引導序列互補的DNA序列。
在形成CRISPR複合體的情況下，「標靶序列」是指一序列，而引導序列係被設計為對該序列具有一些互補性。標靶序列和引導序列之間的雜交會促進CRISPR複合體的形成。如果存在足夠的互補性以引起雜交並促進CRISPR複合體的形成，則兩者不一定需要完全互補。標靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在某些實施例中，標靶序列係位於細胞的細胞核或細胞質中。在其他實施例中，標靶序列可以位在真核細胞的細胞胞器內，例如粒線體或細胞核。通常，在CRISPR系統下，形成CRISPR複合體(包含與標靶序列雜交並與一或多種Cas蛋白複合的引導序列)，會導致標靶序列的一條或兩條股中或附近(例如，在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個鹼基對)被切割。與標靶序列一樣，只要足以起作用，前述切割被認為不需要完全互補。
在某些實施例中，係將驅動CRISPR系統的一或多種元件表現的一或多種載體引入宿主細胞中，使得CRISPR系統元件的表現會導向在一或多個標靶位點形成有CRISPR複合體。舉例來說，Cas核酸酶、crRNA和tracrRNA各自可以與獨立載體上的個別調節元件為可操作地連接。或者，可以將由相同或不同調節元件所表現的兩種或更多種元件組合在單一載體中，而有一或多個額外的載體以提供任何不為第一載體的CRISPR系統中所含括的組分。在單個載體中組合的CRISPR系統元件，可以以任何合適的方向排列，例如位於5'的一個元件是相對於第二元件的(「上游」)或位於3'的一個元件是相對於第二元件的(「下游」)。一個元件的編碼序列可以與第二元件的編碼序列位在同一股或另一股上，並且以相同或相反的方向排列。在某些實施例中，單個啟動子會驅動下列單元的表現：編碼有CRISPR酶的轉錄物和一或多個引導序列、tracr配對序列(其係可選擇性地與引導序列可操作地連接)和嵌在一或多個內含子序列內的tracr序列(例如，在不同的內含子中的每個、在至少一個內含子中的兩個或更多個，或全部都在單個內含子中)。
在某些實施例中，CRISPR酶是一融合蛋白的一部分，該融合蛋白係包含有一或多個異源蛋白域(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個除了CRISPR酶之外的域)。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何額外的蛋白質序列，並且可選擇性地包含任何兩個域之間的連接子序列。可以與CRISPR酶融合的蛋白質域其實例包括但不限於表位標籤、報導基因序列，和具有以下一或多種活性的蛋白質域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA切割活性和核酸結合活性。其他可以形成包含有CRISPR酶的融合蛋白的域，係描述於美國專利申請公開號US20110059502，在此以引用方式而納入本文。在某些實施例中，標記的CRISPR酶用於找出標靶序列的位置。
常規基於病毒和非病毒的基因轉移方法，可在哺乳動物和非哺乳動物細胞或標靶組織中引入核酸。前述方法係可將編碼有CRISPR系統單元的核酸施用於培養中的細胞或宿主生物中。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、RNA(例如，本文所述載體的轉錄物)、裸核酸和與遞送載體複合的核酸，其 例如是微脂體。病毒載體遞送系統包括DNA和RNA病毒，其在遞送至細胞後具有附加型或嵌入的基因體(Anderson,1992,Science 256：808-813；及Yu等人，1994,Gene Therapy 1：13-26)。
在一些實施例中，CRISPR/Cas係衍生自第II型CRISPR/Cas系統。在其他實施例中，CRISPR/Cas系統係衍生自Cas9核酸酶。可用於本發明的例示性Cas9核酸酶包括但不限於化膿性葡萄球菌Cas9(S.pyogenes Cas9，SpCas9)、金黃色葡萄球菌Cas9(S.aureus Cas9，SaCas9)、嗜熱鏈球菌Cas9(S.thermophilus Cas9，StCas9)、腦膜炎雙球菌Cas9(N.meningitidis Cas9，NmCas9)、空腸曲桿菌Cas9(C.jejuni Cas9，CjCas9)和嗜熱細菌Cas9(Geobacillus Cas9，GeoCas9)。
一般來說，Cas蛋白包含至少一個RNA辨識及/或RNA結合域。RNA辨識及/或RNA結合域會與引導RNA相互作用。Cas蛋白還可以包含核酸酶域(即，DNase或RNase域)、DNA結合域、解旋酶域、RNA酶域、蛋白質-蛋白質相互作用域、二聚化域以及其他域。Cas蛋白可經修飾以增加核酸結合親和力及/或專一性，改變酶活性、及/或改變蛋白質的另一性質。在某些實施例中，融合蛋白中的類Cas蛋白可以衍生自野生型Cas9蛋白或其片段。在其他實施例中，Cas可以衍生自經修飾的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的胺基酸序列可經修飾以改變蛋白質的一或多種性質(例如，核酸酶活性、親和力、穩定性等)。或者，可以從蛋白質中除去不參與RNA所引導的切割的Cas9蛋白域，使得經修飾的Cas9蛋白質較野生型Cas9蛋白質來得小。通常，Cas9蛋白包含至少兩個核酸酶(即DNase)域。舉例來說，Cas9蛋白可包含類RuvC核酸酶域和類HNH核酸酶域。RuvC和HNH域係共同作用以切割單股，進而在DNA中形成雙股斷裂(Jinek等人，2012,Science,337：816-821)。在某些實施例中，可以將Cas9衍生的蛋白質修飾為僅含有一個功能性核酸酶域(類RuvC或類HNH核酸酶域)。舉例來說，可以修飾Cas9衍生的蛋白質，使得一個核酸酶域發生缺失或突變，而不再發揮作用(即，不存在核酸酶活性)。在一些實施例中，其中一個核酸酶域無活性時，Cas9衍生的蛋白質能夠將切口(nick)引入雙股核酸(這種蛋白質被稱為「切口酶(nickase)」)，但不能切割雙股 DNA。在上述任何實施例中，任何或所有核酸酶域可以用眾所周知的方法(例如是定點突變、PCR介導的突變及總基因合成、以及其他本領域已知的方法)來產生一或多種缺失突變、插入突變及/或取代突變，進而使其去活化。
在一個非限制性實施例中，載體會驅動CRISPR系統的表現。本領域充滿了適用於本發明的載體。所用的載體係適用於複製，並且係可選擇性地嵌入到真核細胞中。典型的載體含有轉錄和轉譯終止子、起始序列，和可調節所需核酸序列表現的啟動子。本發明的載體也可用於核酸標準基因遞送方法。用於基因遞送的方法是本領域已知的(美國專利號5,399,346、5,580,859和5,589,466，其全部內容通過引用併入本文)。
此外，載體可以用病毒載體的形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域中是公知的，並且在例如Sambrook等人的下列文獻(4th Edition,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,2012)、以及其他病毒學和分子生物學手冊中有描述。可用作載體的病毒包括但不限於，反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)、γ反轉錄病毒和慢病毒。一般來說，合適的載體含有在至少一種生物體中起作用的複製起始序列、啟動子序列、便利的限制性內切核酸酶位點，和一或多種可選擇標記(例如，WO 01/96584、WO 01/29058、及美國專利號6,326,193)。
在一些實施例中，引導RNA和Cas9可以核糖核蛋白(RNP)複合體的形式(例如Cas9/RNA-蛋白質複合體)遞送至細胞。RNP係由與gRNA所複合的純化Cas9蛋白來組成。並且，如本領域中是眾所周知的，會有效遞送至多種細胞中，包括但不限於幹細胞和免疫細胞(A Addgene,Cambridge,MA,Mirus Bio LLC,Madison,WI)。在一些實施例中，其係透過電穿孔將Cas9/RNA-蛋白質複合體遞送到細胞中。
在一些實施例中，其係使用CRISPR/Cas9來編輯本發明被基因編輯所修飾的細胞，以破壞經修飾細胞(例如，經修飾的T細胞)中的一或多種內源基因。在一些實施例中，CRISPR/Cas9係用來破壞內源TRAC、TRBC、PDCD1、A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CD96、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3、及/或VISTA 基因座中的一或多種，從而導致TRAC、TRBC、PD-1、A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA(CD272)、CD96、CTLA-4(CD152)、IDO、KIR、LAG3、TIGIT、TIM-3、及/或VISTA的下調。在一些實施例中，CRISPR/Cas9係用來破壞內源TRAC、TRBC、PDCD1、及/或TIM-3。
在一些實施例中，CRISPR/Cas9係用來破壞內源APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、及/或ZNRF2基因座中的一或多種，從而導致APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、及/或ZNRF2的下調。在某些例示性實施例中，CRISPR/Cas9係用來破壞內源PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19及/或C1orf14基因座中的一或多個，從而導致PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19及/或C1orf14的下調。適合用來破壞內源PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19及/或C1orf141中的一或多種的gRNA，係如表1中所示。
Figure 108110802-A0305-02-0066-1
Figure 108110802-A0305-02-0067-2
本領域技術人員能夠理解，引導RNA序列可以胸苷(T)或尿苷(U)核苷酸列出。
在一些實施例中，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼一轉錄調節因子之一基因座中的一插入及/或缺失，其中該插入及/或缺失能夠下調內源轉錄調節因子的基因表現。在一些實施例中，基因座中的插入及/或缺失是由CRISPR介導的基因座中的插入及/或缺失。在一些實施例中，基因座是本文所述的任何一種內源標靶基因。因此，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼本文所述的任何一種基因之基因座中的經CRISPR介導的插入及/或缺失，其中該經CRISPR介導的插入及/或缺失能夠下調該基因的基因表現。
在一些實施例中，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼一轉錄調節因子之一基因座中的一插入及/或缺失，其中插入及/或缺失能夠下調內源轉錄調節因子的基因表現；以及一外源T細胞受體 (TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。在一些實施例中，基因座中的插入及/或缺失是由CRISPR介導的基因座中的插入及/或缺失。在一些實施例中，基因座是本文所述的任何一種內源標靶基因。因此，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在編碼本文所述的任何一種基因中之基因座中的經CRISPR介導的插入及/或缺失，其中該經CRISPR介導的插入及/或缺失能夠下調該基因的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
在一些實施例中，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在一基因座中的經CRISPR介導的插入及/或缺失，該基因座編碼內源APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、及/或ZNRF2基因座，其中經CRISPR介導的插入及/或缺失能夠下調APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、及/或ZNRF2的基因表現。
在一些實施例中，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括：在一基因座中的經CRISPR介導的的插入及/或缺失，該基因座編碼內源APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、 PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、及/或ZNRF2基因座，其中經CRISPR介導的插入及/或缺失能夠下調APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP及/或ZNRF2的基因表現；以及一外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)，其對標靶細胞上的一抗原具有親和力。
因此，本文經修飾細胞的基因編輯的方法包括將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，該一或多種內源基因是選自於APOA2、AZI2、Bach2、C10orf129、C1orf141、C1orf64、CCL7、CCNI2、CLCA1、CLNS1A、CLOCK、CYSTM1、DEFA4、FAM124A、FAM86A、GALNT2、GLOD5、GPR35、HRF1、HRG、hsa-mir1273d、hsa-mir-6505、KIF27、Klf4、MYBPH、NDC、NDUFS4、PAGR1、PARVG、PMVK、PRKACB、PRPF39、PSG5、PTGIR、PVRL3、TMEM249、TMEM48、TTC27、USP27X、WDR85、YY1AP、及/或ZNRF2所組成的群組。在一實施例中，本文經修飾細胞的基因編輯的方法包括將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，該一或多種內源基因是選自於PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19及C1orf141所組成的群組。在一實施例中，本文經修飾細胞的基因編輯的方法包括將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，該一或多種內源基因是選自於PAGR1、Klf4及SIX2所組成的群組。在一實施例中，本文經修飾細胞的基因編輯的方法包括將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調內源PAGR1的基因表現。在一實施例中，本文經修飾細胞的基因編輯的方法包括將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調內源Klf4的基因表現。在一實施例中，本文經修飾細胞的基因編輯的方法包括將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調內源SIX2的基因表現。
在一實施例中，產生本發明的經修飾的細胞的方法包括：1)將一核酸引入細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；以及2)將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，該一或多種內源基因是選自於PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19及C1orf141。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的細胞的方法包括：1)將一核酸引入細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；以及2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19及/或C1orf141的基因表現(例如SEQ ID NO：31~66)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調PAGR1、SIX2、KLF4、USP27X、CEACAM19及/或C1orf141的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：31至66中任一者所示的標靶序列的基因表現。
在一實施例中，產生本發明的經修飾的細胞的方法包括：1)將一核酸引入細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；以及2)將一或多種核酸引入細胞中，一或多種核酸能夠下調一或多種內源基因的基因表現，該一或多種內源基因是選自於PAGR1、KLF4及SIX2。
在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調PAGR1、KLF4及/或SIX2的基因表現(例如SEQ ID NO：31~38)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調PAGR1、KLF4及/或SIX2的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：31至48中任一者所示的標靶序列的基因表現。
在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調PAGR1的基因表現(例如SEQ ID NO：31~36)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調PAGR1的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：31至36中任一者所示的標靶序列的基因表現。
在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調SIX2的基因表現(例如SEQ ID NO：37~42)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調SIX2的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：37至42中任一者所示的標靶序列的基因表現。
在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調Klf4的基因表現(例如SEQ ID NO：43~48)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調Klf4的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：43至48中任一者所示的標靶序列的基因表現。
在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調USP27X的基因表現(例如SEQ ID NO：49~54)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調USP27X的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：49至54中任一者所示的標靶序列的基因表現。
在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調CEACAM19的基因表現(例 如SEQ ID NO：55~60)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調CEACAM19的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：55至60中任一者所示的標靶序列的基因表現。
在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調C1orf141的基因表現(例如SEQ ID NO：61~66)。在一例示性實施例中，產生本發明的經修飾的T細胞的方法包括：1)將一核酸引入T細胞中，該核酸包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列；2)將一核酸引入細胞中，該核酸能夠下調C1orf141的基因表現，其中該核酸能夠下調包括SEQ ID NO：61至66中任一者所示的標靶序列的基因表現。
經CRISPR介導的修飾的非限制性類型包括取代、插入、缺失和插入/缺失(INDEL)。修飾可以位於標靶位點的任何部分(例如，本文所述的任何一種標靶基因的內源基因座)，包括但不限於外顯子、剪接供體或剪接受體。
在一些實施例中，所提供的組成物和方法包括在一免疫細胞組成物中，有至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的免疫細胞具有所需的基因修飾。舉例來說，被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞內源基因(如PAGR1、KLF4或SIX2)的細胞組成物中有約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的免疫細胞具有基因破壞情況、不表現標靶內源多肽、不含有標靶基因的相鄰(contiguous)及/或功能性拷貝。在一些實施例中，根據本發明的方法，組成物和細胞包括被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一標靶基因的細胞組成物中有至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞，係不表現標靶多肽，例如不在免疫細胞的表面表現。在一些實施例中，被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一標靶基因的細胞組成物中，有至少或大於約50%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞(例如gRNA)其等位基因雙雙被剔除，即在前述比例的細胞中包含雙對偶基因缺失(biallelic deletion)。
在一些實施例中提供了組成物和方法，在被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一標靶基因的細胞組成物中，其中在標靶基因內或附近(例如在切割位點上游或下游的：在或大約在100個鹼基對內、在或大約在50個鹼基對內、在或大約在25個鹼基對內、在或大約在10個鹼基對內)由Cas9介導的切割效率(插入或缺失%)為至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞。
在一些實施例中，所提供的細胞、組成物和方法在被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一標靶基因的細胞組成物中，導致了有至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞，其透過內源所遞送的訊號發生減少或破壞。
在一些實施例中，根據本發明提供的組成物，係包含用重組受體改造的細胞，且其內源受體表現有減少、缺失、消除、剔除或破壞(例如PAGR1、KLF4或SIX2的基因破壞)。而在相同的條件下，與由相應或參考組成物改造的細胞所表現的受體(該細胞包含受體但不包含基因的基因破壞或多肽表現)相比，本發明組成物的受體仍有功能或活性。在一些實施例中，在相同的條件下，與包含改造細胞(其係以重組受體改造但不包含基因破壞或表現被靶向的多肽)的相應或參考組成物相比，由所提供的組成物改造的細胞係保留功能特性或活性。在一些實施例中，與前述相應或參考組成物相比，該細胞係保留細胞毒性、增殖能力、存活特性或細胞激素分泌能力。
在一些實施例中，當在相同條件下評估時，組成物中的免疫細胞與相應或參考組成物中的細胞表型相比，保留了一或多個免疫細胞的表型。在一些實施例中，組成物中的細胞係包括初級細胞、作用性記憶細胞、中樞記憶細胞、中樞記憶幹細胞、作用性記憶細胞及長壽作用性記憶細胞。在一些實施例中，表現重組受體(例如TCR及/或CAR)並且包含被基因破壞之標靶基因(例如，PAGR1、KLF4或SIX2)的T細胞或T細胞的百分比，係表現出非活 化的、長壽記憶或中樞記憶表型，其與以重組受體改造但沒有基因破壞的相應或參考細胞群或細胞組成物相同或基本上相同。在一些實施例中，前述性質、活性或表型可以在體外檢測中測量，例如以下列方式培養該細胞來進行：透過將細胞培養在藉由TCR及/或CAR所靶向的抗原的存在下、與表現該抗原的細胞及/或抗原受體活化培養基中。在一些實施例中，可以在電穿孔或其他介質引入後的不同天數來評估任何所欲評估的活性、性質或表型，例如在3、4、5、6、7天後或之後。在一些實施例中，在相同條件下評估時，與含有重組受體改造細胞(其標靶基因未被破壞)的相應組成物的活性相比，組成物中的前述活性、性質或表型保留至少80%、85%、90%、95%或100%。
如本文所使用的，「相應組成物」或「相應的免疫細胞群」(也稱為「參考組成物」或「參考細胞群」)是指在相同或基本相同的條件所下獲得、分離、生成、產生，及/或培養的免疫細胞(例如，T細胞)，而該免疫細胞或免疫細胞群，係不引入前述介質。在一些實施例中，除了不含有介質的引入之外，前述免疫細胞與係與引入有試劑的免疫細胞接受相同或實質上相同的處理，使得任何一種或多種可以影響細胞的活性或性質(包括抑制性分子的上調或表現)的條件，除了有引入介質之外，在細胞之間不變或實質上不變。
用於評估T細胞標誌物有無表現及/或表現量的方法和技術是本領域已知的。用於檢測前述標記物的抗體和試劑是本領域熟知的，並且容易獲得。用於檢測前述標記物的檢測法和方法包括但不限於流式細胞分析法，包括細胞內流式細胞分析法、ELISA、ELISPOT、磁珠陣列術(cytometric bead array)或其他多重方法、西方墨點法和其他基於免疫親和性的方法。在一些實施例中，表現抗原受體(例如TCR及/或CAR)的細胞可以透過流式細胞分析法或其他基於免疫親和性的方法，來檢測前述細胞所特有的標記物之表現，接著可以將前述細胞對另一個T細胞表面標記或標記物進行共染色。
在一些實施例中，細胞、組成物和方法係用來將過繼性轉移的免疫細胞(前述細胞係例如經改造以表現外源TCR及/或CAR的細胞，例如T細胞)中標靶基因的表現進行缺失、剔除、破壞或減少處理。在一些實施例中，所述方法係以離體方式在初代細胞上進行，前述初代細胞係例如來自受試者的 初代免疫細胞(例如T細胞)。在一些實施例中，產生或生成前述基因改造的T細胞的方法，係包括向一群含有免疫細胞(例如T細胞)的細胞中引入一或多種編碼重組受體的核酸(例如外源TCR及/或CAR)和一或多種介質，前述介質能夠破壞一編碼有內源受體的基因。如本文所使用的，術語「引入」包括各種以體外或體內方式將DNA引入細胞的方法，這些方法包括轉化、轉導、轉染(例如電穿孔)和感染。載體可將編碼DNA的分子引入細胞中。可能的載體包括質體載體和病毒載體。病毒載體包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體或其他載體，例如腺病毒載體或腺相關載體。
含有T細胞的細胞群可以是從受試者獲得的細胞，例如從下列來源獲得：周邊血液單核細胞(PBMC)樣品、未分級(unfractionated)的T細胞樣品、淋巴細胞樣品、白血球樣品、血球分離產品或白血球分離產品。在一些實施例中，可以使用正向或負向選擇和富集方法來分離或選擇T細胞以富集群體中的T細胞。在一些實施例中，群體含有CD4+、CD8+或CD4+和CD8+ T細胞。在一些實施例中，引入編碼基因改造抗原受體核酸的步驟和引入介質的步驟(例如Cas9/gRNA RNP)可以同時發生或以任何順序相繼發生。在一些實施例中，在引入外源受體和一或多種基因編輯介質(例如Cas9/gRNA RNP)之後，在一定條件下培養或培育細胞以刺激細胞的擴增及/或增殖。
因此，本發明提供了增強免疫細胞(例如T細胞)的細胞，組成物和方法，其在過繼性細胞療法中發揮功用，包括提供改善的功效，其係例如透過增加所施用的基因改造細胞的活性和效力，同時保持持久性或暴露於轉移細胞的時間。在一些實施例中，與某些習知方法相比，當施用於受試者體內時，基因改造的細胞會表現出擴增及/或持久性的增加。在一些實施例中，當施用於受試者體內時，所提供的免疫細胞會表現出持久性的增加。在一些實施例中，與透過替代方法實現的基因改造免疫細胞相比(例如未引入介質，以減少或破壞編碼內源受體基因表現的T細胞)，在施用於受試者時，本發明的基因改造免疫細胞的持久性增加。在一些實施例中，持久性增加至少或約至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
在一些實施例中，施用細胞之持久性的程度或範圍可在施用於受試者後進行檢測或定量。例如，在一些實施例中，其係以定量PCR(qPCR)來評估在受試者血液或血清或器官或組織(例如，疾病部位)中表現有外源受體(例如，TCR及/或CAR)細胞的數量。在一些實施例中，持久性被量化為每微克的DNA中編碼有外源受體的DNA或質體的拷貝數，或者是每微升樣品(例如血液或血清)中表現有受體的細胞數量，或在每微升樣品的總周邊血液單核細胞(PBMC)數中每微升樣品的總白細胞數中，或每微升樣品的總T細胞數中，表現有受體的細胞數量。在一些實施例中，也可以用流式細胞分析來檢測表現受體的細胞，其係使用對受體具有專一性的抗體來進行。基於細胞的測定也可用來檢測功能細胞的數量或百分比，其例如是能夠結合及/或中和及/或誘導反應(例如細胞毒性反應、針對疾病或病症，或表現辨識抗原受體)的細胞。在任何前述實施例中，與外源受體(例如外源TCR及/或CAR)相關的另一種標記物的表現程度或表現量可用來區分受試者中被施用的細胞與內源細胞。
F.產生經基因修飾的免疫細胞的方法
本發明提供了產生或製造本發明的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如T細胞)的方法，用於腫瘤免疫療法，例如過繼性免疫療法。細胞通常透過引入編碼外原受體(例如，TCR及/或CAR)的一或多種基因改造的核酸來進行改造。在一些實施例中，還使用能夠破壞標靶基因(例如，編碼PAGR1的基因)的介質(例如Cas9/gRNA RNP)與編碼外源受體的核酸同時或依序引入細胞中。
在一些實施例中，使用同源重組修復(homology directed repair)將編碼外源TCR及/或CAR的核酸插入標靶位點(例如，本文所述的任何一種標靶基因的內源基因座)。
如本文所使用的，「同源重組修復」或「HDR」是修復細胞中雙股DNA斷裂的機制。HDR通常依賴於同源重組的過程，其中核酸序列同源性的片段用於修復雙股DNA斷裂。在HDR期間，核酸供體的同源序列的股侵入或雜交至切割的DNA的切除部分。使DNA聚合酶用切除的DNA作為引子並使用侵入的供體序列作為模板來延長切割的DNA。在延伸和斷裂修復後，切割 位點處的新序列具有在修復過程中使用的核酸供體中存在的任何序列。HDR的過程進一步描述Jasin等人的文獻中(Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2013 Nov；5(11)：a012740)，在此引入本文作為參考。
在一些實施例中，核酸供體模板(例如，用於插入編碼TCR及/或CAR的核酸序列)可以與基因編輯複合體(例如，CRISPR/Cas系統)一起使用，以使得能夠在宿主細胞的同源標靶核酸中的特定核苷酸位置進行基因體改造(例如，在特定等位基因上是複合接合的同源染色體)。在一些實施例中，本文提供了用於靶向基因編輯的方法，該方法包括將核酸供體模板與重組基因編輯複合體的至少一種組分遞送至細胞(例如，疾病受試者的細胞)，在重組基因編輯複合體誘導染色體中標靶位點的基因損傷(例如，缺口或雙股斷裂)的條件下，本發明的供體模板介導修復機制(例如，HDR)，從而修復損傷。
在某些實施例中，核酸供體模板(在本文中也稱為外源供體DNA序列)透過同源重組促進編碼TCR及/或CAR的核酸序列插入標靶位點(例如，內源基因座)。因此，在某些實施例中，使用外源供體DNA序列透過同源重組將編碼TCR及/或CAR的核酸序列插入標靶位點(例如，內源基因座)。在某些實施例中，外源供體DNA序列包括5'端同源臂，其包括SEQ ID NO：162所示的核苷酸序列。在某些實施例中，外源供體DNA序列包括SEQ ID NO：163所示的核苷酸序列。在某些實施例中，外源供體DNA序列包括3'端同源臂，其包含SEQ ID NO：164所示的核苷酸序列。在某些實施例中，外源供體DNA序列包含SEQ ID NO：165所示的核苷酸序列。
5'端同源臂(SEQ ID NO：162)：
Figure 108110802-A0305-02-0077-3
Figure 108110802-A0305-02-0078-4
hPGK啟動子-eGFP-WPRE-BghPolyA(SEQ ID NO：163)：
Figure 108110802-A0305-02-0078-5
Figure 108110802-A0305-02-0079-6
3'端同源臂(SEQ ID NO：164)：
Figure 108110802-A0305-02-0079-7
Figure 108110802-A0305-02-0080-8
5'端同源臂-hPGK啟動子-eGFP-WPRE-BghPolyA-3'端同源臂的完整序列(SEQ ID NO：165)：
Figure 108110802-A0305-02-0080-9
Figure 108110802-A0305-02-0081-10
Figure 108110802-A0305-02-0082-11
Figure 108110802-A0305-02-0083-12
在一些實施例中，供體DNA序列可包括轉錄控制單元，例如但不限於MND啟動子、CMB啟動子、EF-1α啟動子、PGK啟動子。在一些實施例中，供體DNA序列可包括報導分子，例如但不限於螢光標記物(例如GFP)、表皮生長因子受體(EGFR)、神經生長因子受體(NGFR)、誘導型凋亡蛋白酶。當供體DNA序列包括主要插入單元(例如，編碼TCR及/或CAR的核酸序列)和次要單元(例如報導分子)時，可能需要協調表現。本領域已知多種協調表現一或多種基因的方法。在一些實施例中，主要插入單元(例如，編碼TCR及/或CAR的核酸序列)和次要插入單元(例如GFP)透過連接子分開。用於本發明的連接子允許多個蛋白質可以由同一個核酸序列(例如，多順反子或雙順反子序列)編碼，其被轉譯為多蛋白(polyprotein)，前述多蛋白被解離成獨立的蛋白質組分。舉例來說，用於本文的供體核酸的連接子包括編碼TCR及/或CAR的核酸序列和報導基因，其允許TCR及/或CAR和報導基因產物轉譯為多蛋白，其解離成獨立的TCR及/或CAR和報導基因產物組分。可以使用的各種連接子公開於本文其他部分，例如IRES或2A肽。
在一些實施例中，係透過表現載體將外源受體(例如TCR及/或CAR)引入細胞中。本文提供了包含編碼有TCR及/或CAR的核酸的表現載體。合適的表現載體包括慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒(adeno associated virus，AAV)載體、腺病毒載體、經改造的雜交病 毒、裸DNA(包括但不限於轉位子所介導的載體，例如Sleeping Beauty轉位子、Piggybak轉位子及Integrases轉位子(如Phi31))。其他某些合適的表現載體包括單純皰疹病毒(HSV)和反轉錄病毒表現載體。
腺病毒表現載體係基於腺病毒，而腺病毒嵌入到基因體DNA中的能力不好，但轉染宿主細胞的效率高。腺病毒表現載體含有足夠的腺病毒序列，其足以：(a)支持表現載體的包裝，及(b)最終在宿主細胞中表現TCR及/或CAR。在一些實施例中，腺病毒基因體是36kb的線性雙股DNA，其中，為了製備本發明的表現載體，可以插入外源DNA序列(例如，編碼外源TCR及/或CAR的核酸)以取代大片段的腺病毒DNA(參見例如，Danthinne and Imperiale,Gene Therapy(2000)7(20)：1707-1714)。
另一種表現載體是基於腺相關病毒的，其係利用腺病毒偶合系統。該AAV表現載體嵌入到宿主基因體中的頻率很高。它可以感染非分裂中的細胞，進而使其可將基因遞送到哺乳動物細胞中，例如，在組織培養物中或體內。AAV載體能夠感染相當多種的宿主。關於AAV載體的產生和使用的細節，係描述於美國專利號5,139,941及4,797,368中。
反轉錄病毒表現載體能夠嵌入到宿主基因體中，遞送大量外來遺傳物質，感染許多不同的物種和細胞類型，並被包裝在特殊細胞株中。透過在某些位置將核酸(例如，編碼外源TCR及/或CAR的核酸)插入病毒基因體中，以產生具有複製缺陷的病毒，來構築反轉錄病毒載體。儘管反轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型，但TCR及/或CAR的嵌入和穩定表現需要宿主細胞的分裂。
慢病毒載體係衍生自慢病毒。慢病毒是複雜的反轉錄病毒，除了常見的反轉錄病毒基因gag、pol和env之外，其還含有具有調節或結構功能的其他基因(參見例如，美國專利號6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)。透過將HIV毒力基因進行多次減毒以產生慢病毒載體，例如，讓env、vif、vpr、vpu和nef等基因產生缺失，而使載體具備生物安全性。慢病毒載體能夠感染非分裂中的細胞，並且可以用於體內和離體的 基因轉移和表現，例如編碼TCR及/或CAR的核酸(參見例如美國專利號5,994,136)。
可以透過本領域技術人員已知的任何方法將包括本發明內容的核酸的表現載體引入宿主細胞中。如果需要，表現載體可包括用於轉染的病毒序列。或者，可以透過融合、電穿孔、基因槍法、轉染、脂質轉染或其類似方式等引入表現載體。宿主細胞可以在引入表現載體之前，係在培養基中生長和擴增，接著進行適當的處理以引入和嵌入載體。然後可以將宿主細胞擴增，並可以藉助載體中存有的標記來進行篩選。可以使用本領域已知的各種標記，並且可以包括hprt、新黴素抗藥性、胸苷激酶、潮黴素抗藥性等。如本文所使用的，術語「細胞」、「細胞株」和「細胞培養物」可以是可以交替使用的。在一些實施例中，宿主細胞是免疫細胞或其前驅細胞，例如T細胞、NK細胞或NKT細胞。
本發明還提供了基因改造細胞，其包括並穩定表現有本發明的TCR及/或CAR。在一些實施例中，基因改造細胞是基因改造T-淋巴細胞(T細胞)、初級T細胞(naive T cells，TN)，記憶T細胞(例如，中樞記憶T細胞(TCM)、作用記憶細胞(effector memory cell，TEM))、自然殺手細胞(NK細胞)和能夠產生治療相關子代的巨噬細胞。在一實施例中，基因改造細胞是自體細胞。
將具有本發明內容的核酸的表現載體穩定的轉染至宿主細胞，可以用來產生經修飾的細胞(例如，包含TCR及/或CAR)。其他產生本發明經修飾細胞的方法，包括但不限於化學轉化方法(例如，使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物(dendrimer)、微脂體及/或陽離子聚合物)、非化學轉化方法(例如，電穿孔、光學轉化、基因電轉移及/或流體動力學遞送)，及/或基於顆粒的方法(例如，使用基因槍及/或磁性轉染進行的基因交付(impalefection))。表現本發明的TCR及/或CAR的轉染細胞可以離體方式進行擴增。
以物理方式將表現載體引入宿主細胞的方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、基因槍法(particle bombardment)、顯微注射、電穿孔或其類似方法等。產生包括載體及/或外源核酸的細胞的方法是本領域習知的。參見例如， Sambrook等人，(2001),Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。以化學方式將表現載體引入宿主細胞的方法包括膠體分散系統(例如巨分子複合體、奈米膠囊、微球體、珠子)和基於脂質的系統(包括水包油的乳劑、微胞(micelles)、混合微胞和微脂體)。
適合使用的脂質可以由市面上購得。例如，二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(dimyristyl phosphatidylcholine，「DMPC」)可購自Sigma，St.Louis，MO、雙二十六烷基磷酸(dicetyl phosphate，「DCP」)可購自K&K實驗室(Plainview，NY)、膽固醇(cholesterol，「Choi」)可購自Calbiochem-Behring、二肉荳蔻醯磷脂醯甘油酯(dimyristyl phosphatidylglycerol，「DMPG」)和其他脂質可購自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham，AL)。脂質在氯仿或氯仿/甲醇中的儲備原液，可以儲存在約-20℃。因為氯仿比甲醇更容易蒸發，因此可以被用作唯一的溶劑。「微脂體」是通用術語，其係指因雙層脂質進行封閉生成或聚集而產生的各種單層及多層脂質載體。微脂體之特徵為具有囊泡結構，其具有雙層磷脂膜，而內部為水性介質。多層微脂體具有多個脂質層，其係藉由水性介質所分隔。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們會自動的形成。在形成封閉結構之前，脂質組分會進行自體重排，並在雙層脂質之間截留水和溶於水中的溶質(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。本實施例還包括在溶液中具有與正常囊泡結構不同結構的組成物。例如，脂質可呈現微胞結構(micellar structure)或僅以脂質分子之不均勻聚集體的形式存在。本實施例還包括脂質轉染試劑-核酸複合體(lipofectamine-nucleic acid complexes)。
無論是將外源核酸引入宿主細胞中的方法、或是以其他使細胞暴露於本發明抑制劑的方法，為了要證實核酸在宿主細胞中之存在，可以進行多種檢測。前述檢測包括，例如，本領域技術人員所習知的分子生物學檢測(例如南方墨點法和北方Northern墨點法、RT-PCR和PCR)、例如檢測特定肽的存在或不存在的生物化學檢測(例如透過免疫學方法(ELISA和蛋白質墨點法))，或透過本文所述的測定法鑑定落入本發明範圍內的試劑。
在一實施例中，引入宿主細胞的核酸是RNA。在另一實施例中，RNA是mRNA，其包含體外轉錄RNA或人工合成RNA。RNA可以係利用聚合 酶連鎖反應(PCR)所產生的模板透過體外轉錄方式所產生。任何來源的標靶DNA可以藉由PCR直接轉化成模板，並利用適合的引子和RNA聚合酶來進行體外mRNA合成。DNA的來源可以是，例如，基因體DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合適的DNA來源。
使用PCR產生mRNA體外轉錄用的模板，然後將其引入細胞。進行PCR的方法是本領域習知的。用於PCR的引子係經設計而具有與可作為PCR模板的DNA區域實質上互補的區域。如本文所使用的，「實質上互補的」是指係指引子序列中之大部分或全部鹼基為互補。實質上互補的序列能夠在PCR的退火條件下與預期的DNA目標發生黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板的任何部分實質上互補。例如，可以設計引子以擴增一基因在細胞中通常會發生轉錄的部分(開放閱讀框)，其包括5'和3'UTR。引子還可以經設計以擴增一基因的一部分，其係編碼有特定目標域。在一實施例中，引子係經設計以擴增人類cDNA的編碼區，包括全部或部分的5'和3'UTR。適用於PCR的引子，可透過本領域習知的合成方法來產生。「正向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列上游的DNA模板核苷酸實質上互補。「上游」在本文中用於指相對於編碼股中待擴增DNA序列的5'位置。「反向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列下游的雙股DNA模板基本上互補。「下游」在本文中用於指相對於編碼股中待擴增DNA序列的3'位置。
本文也可以利用能夠促進RNA穩定性及/或轉譯效率的化學結構。RNA優選地具有5'和3'UTR。在一實施例中，5'UTR的長度為0至3000個核苷酸。待添加到編碼區的5'和3'UTR序列的長度可以不同方法來改變，包括但不限於設計會黏接至UTR不同區域的PCR引子。使用前述方法，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以修飾所需的5'和3'UTR的長度，用以使所轉錄出的RNA於轉染後有最佳的轉譯效率。
5'和3'UTR部分可以是標靶基因天然存在的內源5'和3'端的UTR。或者，可以透過在正向和反向引子中併入UTR序列，或透過其他任何對模板的修飾，來添加對標靶基因而言不是內源的UTR序列。使用對標靶基因而 言不是內源的UTR序列，有助於修飾RNA的穩定性及/或轉譯效率。例如，目前已知3'UTR序列中的AU富含單元(AU-rich elements)會降低mRNA的穩定性。因此，基於本領域熟知的UTR特性來選擇或設計3'UTR，可以增加所轉錄出的RNA穩定性。
在一實施例中，5'UTR可含有內源基因的克紮克(Kozak)序列。或者，當如上所述係透過PCR添加對標靶基因而言不是內源的5'UTR時，可以透過添加5'UTR序列來重新設計共通Kozak序列。Kozak序列可以提高某些RNA轉錄物的轉譯效率，但似乎並非所有的RNA都需要此種序列來進行有效率的轉譯。本領域中已知有許多mRNA需要Kozak序列。在其他實施例中，5'UTR可以衍生自RNA病毒，其RNA基因體在細胞中是穩定的。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5'UTR中以阻止mRNA的核酸外切酶降解。
為了能夠在無需基因轉殖也能夠從DNA模板進行RNA合成，轉錄啟動子應連接到待轉錄序列上游的DNA模板上。當充當RNA聚合酶啟動子的序列被添加到正向引子的5'末端時，RNA聚合酶啟動子在PCR產物中會被併入待轉錄的開放閱讀框的上游。在一實施例中，啟動子是T7聚合酶啟動子，如本文其他部分所述。其他有用的啟動子包括但不限於T3和SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3和SP6啟動子的共通核苷酸序列是本領域已知的。
在一實施例中，mRNA在5'末端具有封帽並在3'端具有Poly(A)尾部，其確定細胞中核醣體結合，轉譯起始和mRNA的穩定性。在環狀DNA模板上，例如質體DNA，RNA聚合酶會產生長多聯體(concatemeric)產物，其不適於在真核細胞中表現。質體DNA的轉錄物，其於3' UTR末端線性化後會產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化，轉染至真核細胞後亦不會發生作用。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄物的3'末端延伸超出模板的最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf，Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)、Nacheva及Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003))。
在PCR期間使用含有聚胸腺苷酸尾(例如，100個胸腺苷酸所聚 合而成，尺寸可為50至5000個胸腺苷酸)之反向引子，或在PCR之後藉由其他任何方法-包括但不限於DNA接合或體外重組，可以在轉錄用DNA模板上生成polyA/T區段。聚腺苷酸尾也讓RNA穩定且減少其降解。一般而言，聚腺苷酸尾的長度與經轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚腺苷酸尾為100至5000個腺苷。
在使用Poly(A)聚合酶(例如大腸桿菌polyA聚合酶，E-PAP)進行體外轉錄後，可以進一步延長RNA的聚腺苷酸尾部。在一實施例中，將聚腺苷酸尾部的長度從100個核苷酸增加至300至400個核苷酸，可導致RNA的轉譯效率增加約2倍。另外，不同化學基團與3'末端的連接可以增加mRNA穩定性。這種連接可含有修飾的/人工的核苷酸、適配體和其他化合物。例如，可以使用聚腺苷酸聚合酶將ATP類似物併入聚腺苷酸尾部。ATP類似物可以進一步增加RNA的穩定性。
5'端帽也為RNA分子提供穩定性。在優選的實施例中，本文公開的方法所產生的RNA包括5'端帽。提供5'端帽的方法是本領域已知的，且描述於下列文獻中：Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)、Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)、Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005)。
在一實施例中，將RNA電穿孔到細胞中，例如體外轉錄的RNA。本文可以包括任何適用於細胞電穿孔的溶質，其可以包含促進細胞滲透性和活性的因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑和介面活性劑。
在一些實施例中，本發明的核酸可以是RNA，例如體外合成的RNA，其編碼TCR及/或CAR。用於體外合成RNA的方法是本領域已知的，任何已知的方法皆可用來合成包含編碼本發明TCR及/或CAR的RNA。將RNA引入宿主細胞的方法是本領域已知的。參見例如，Zhao等人，Cancer Res.(2010)15：9053。將包含編碼本發明的TCR及/或CAR的RNA引入宿主細胞，係可在體外或離體或體內進行。例如，宿主細胞(例如，NK細胞、胞毒性T淋巴球等)可以用包含編碼TCR及/或CAR的核苷酸序列的RNA，在體外或離體進行電穿孔。
本文所公開的方法可應用於基礎研究和治療領域中關於T細胞活性的調節，用於癌症、幹細胞，急性和慢性感染以及自體免疫疾病，包括分析經基因修飾的T細胞殺死標靶癌細胞的能力。
該方法還提供了大範圍地控制表現量的能力，其係透過改變例如啟動子或輸入RNA的量，裨能單獨調節表現量。此外，基於PCR的mRNA產生技術，對於設計出具有不同結構和其域組合之mRNA，有很大的幫助。
本發明RNA轉染方法其中一個優點是，RNA轉染基本上是暫時性的且無需載體。RNA轉基因可以被遞送至淋巴球，並在簡短的體外細胞活化後於其中表現，其係作為最小表現卡匣而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉基因不會嵌入到宿主細胞基因體中。由於RNA的轉染效率及其一致性地修飾整個淋巴球族群的能力，故無須進行細胞轉殖。
用體外轉錄的RNA(in vitro-transcribed RNA，IVT-RNA)對T細胞來進行基因修飾，係利用兩種不同的策略，這兩種策略都已經在各種動物模型中測試過。透過脂質轉染或電穿孔用體外轉錄的RNA轉染細胞。理想的是能夠使用各種修飾來穩定IVT-RNA，以使轉移的IVT-RNA的表現能夠延長。
在文獻中已知有某些IVT載體，其以標準化方式用作體外轉錄的模板，並且以產生穩定RNA轉錄物的方式進行基因修飾。目前，本領域所使用的方法是基於具有以下結構的質體載體：能使RNA進行轉錄的5'RNA聚合酶啟動子，接著是目標基因(其3'及/或5端為'非轉譯區(UTR))、以及含有50至70個腺核苷酸的3'端多腺苷酸卡匣。在體外轉錄之前，透過II型限制酶將環狀質體在多腺苷酸卡匣的下游進行線性化(辨識序列對應於切割位點)。因此，多腺苷酸卡匣對應於轉錄物中後面的聚腺苷酸序列。該程序的結果為一些核苷酸在線性化後保留為酶切位點的一部分，並在3'末端延伸或掩蔽聚腺苷酸序列。目前尚不清楚這種非生理性突出物是否會影響這種構築體在細胞內所產生的蛋白量。
另一方面，透過電穿孔將RNA構築體遞送到細胞中。參見例如，US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教示的將核酸構築體電穿孔到哺乳動 物細胞中的調配物和方法。前述方式的各種參數，包括任何已知細胞類型所需的電穿孔電場強度，基本上已揭露於相關研究文獻以及本領域許多專利和申請案中。參見例如美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264及美國專利號7,173,116。應用於治療的電穿孔裝置可以在市面上買到，例如MedPulserTM DNA電穿孔處理系統(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，並且描述於下列專利中，例如美國專利號4,522,517、6,567,694、6,516,223、5,993,434、6,181,964、6,241,701及6,233,482。電穿孔也可用於體外轉染細胞，例如在US 20070128708A1中所述的。電穿孔也可用於在體外將核酸遞送到細胞中。因此，利用本領域技術人員已知的各種可用裝置和電穿孔系統中的任何一種，透過電穿孔所介導的將核酸(包括表現構築體)施用於細胞，提供了一種將目標RNA遞送至標靶細胞的新方法。
在一些實施例中，可以在引入編碼外源受體(例如TCR及/或CAR)的核酸分子及基因編輯介質(例如Cas9/gRNA RNP)之前、期間及/或之後培養或培育免疫細胞(例如T細胞)。在一些實施例中，可以在引入編碼外源受體的核酸分子之前、期間或之後培養或培育細胞(例如T細胞)，例如在用編碼外源受體的病毒載體(例如慢病毒載體)轉導細胞之前、期間或之後。在一些實施例中，可以在引入基因編輯介質(例如Cas9/gRNA RNP)之前、期間或之後培養或培育細胞(例如T細胞)，例如在用介質遞送至細胞(例如透過電穿孔)之前、期間或之後。在一些實施例中，培養可以在引入編碼外源受體的核酸分子和引入基因編輯介質(例如Cas9/gRNA RNP)的條件下進行。在一些實施例中，該方法包括在引入編碼標的外源受體的核酸分子及基因編輯介質(例如Cas9/gRNA RNP)之前用刺激或活化劑(例如抗CD3/抗CD28抗體)活化或刺激細胞。
在一些實施例中，引入基因編輯介質，例如Cas9/gRNA RNP是在引入編碼外源受體的核酸分子之後進行的。在一些實施例中，在引入介質之前，允許細胞休息，例如，透過去除任何刺激或活化劑。在一些實施例中，在引入介質之前，不去除刺激劑或活化劑及/或細胞激素。本領域技術人員將能夠決定將一或多種核酸序列中的每一種引入宿主細胞的順序。
G.免疫細胞的來源
在擴增之前，免疫細胞的來源是從受試者獲得，將其用於離體操作。用於離體操作的標靶細胞的來源還可以包括例如自體的或異體捐贈者的血液、臍帶血或骨髓。例如，免疫細胞的來源可以來自待用本發明的經修飾免疫細胞治療的受試者，例如是受試者的血液、受試者的臍帶血或受試者的骨髓。受試者的非限制性實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。優選地，受試者是人類。
免疫細胞可以從許多來源獲得，包括血液、周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾組織、臍帶、淋巴或淋巴器官。免疫細胞是免疫系統的細胞，例如先天性或適應性的免疫細胞，例如骨髓類(myeloid)或淋巴類(lymphoid)細胞(包括淋巴球，通常是T細胞及/或NK細胞)。其他例示性細胞包括幹細胞，例如全能幹細胞和多能幹細胞，多能幹細胞包括誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。在一些實施例中，細胞是人類細胞。關於待治療的受試者，細胞可以是同種異體的及/或自體的。細胞通常是初代細胞，例如直接從受試者分離及/或從受試者分離並冷凍的細胞。
在某些實施例中，免疫細胞是T細胞，例如CD8+ T細胞(例如，CD8+初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用性記憶T細胞)、CD4+ T細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、調節性T細胞(Treg)、幹細胞記憶T細胞、淋巴前驅細胞、造血幹細胞、自然殺手細胞(NK細胞)或樹突細胞。在一些實施例中，細胞是單核球或顆粒性白血球，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性白血球及/或嗜鹼性白血球。在一實施例中，標靶細胞是誘導性多能幹細胞(iPS)或源自iPS細胞的細胞，例如，從受試者產生的iPS細胞，被操縱以改變(例如，誘導突變)或操縱以表現一或多個標靶基因的分子，並分化成例如T細胞、例如CD8+ T細胞(例如，CD8+初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用性記憶T細胞)、CD4+ T細胞、幹細胞記憶T細胞、淋巴前驅細胞或造血幹細胞。
在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型的一個或多個亞組，例如整個T細胞群、CD4+細胞、CD8+細胞及其亞群，其亞群可例如由 功能、活化狀態、成熟度、分化的潛力、擴增、再循環、定位及/或持久性能力、抗原專一性、抗原受體類型、在特定器官或腔室中的存在、標記或細胞激素分泌圖譜、及/或分化程度所定義。在T細胞及/或CD4+及/或CD8+ T細胞的亞型和亞群中，有初級T(TN)細胞、作用性T細胞(TEFF)、記憶T細胞及其亞型，其例如為幹細胞記憶T(stem cell memory T，TSCM)細胞、中樞記憶T(TCM)細胞、作用性記憶T(TEM)細胞或終極分化作用性記憶T細胞(terminally differentiated effector memory T cell)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助型T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T(mucosa-associated invariant T，MAIT)細胞，天然存在和適應性調節T(Treg)細胞、輔助型T細胞，如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助型細胞T細胞、α/β T細胞和δ/γ T細胞。在某些實施例中，可以使用本領域可獲得的任何數量的T細胞株。
在一些實施例中，所述方法包括從受試者中分離免疫細胞、製備、加工、培養及/或改造前述細胞。在一些實施例中，改造細胞的製備包括一個或多個培養及/或製備步驟。如上所述的改造細胞可以從樣品中分離，例如生物樣品，例如從受試者獲得、或來自受試者的樣品。在一些實施例中，分離細胞的受試者是患有疾病或病症、或需要細胞療法、或將施用細胞療法的受試者。在一些實施例中，受試者是需要特定治療干預的人類，例如過繼性細胞療法，其中細胞被分離、加工及/或改造。因此，在一些實施例中，細胞是初代細胞，例如初代人類細胞。樣品包括直接取自受試者的組織、液體和其他樣品，以及來自一個或多個處理步驟的樣品，處理步驟可例如是分離、離心、基因改造(例如用病毒載體轉導)、清洗及/或培養。生物樣品可以是直接從生物來源或經過處理的樣品所獲得的樣品。生物樣品包括但不限於體液，例如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液和汗、組織和器官樣品，也包括由其衍生的加工樣品。
在一些實施例中，衍生出或分離出細胞的樣品是血液或血液衍生樣品，或為或來源於血球分離術或白血球分離術的產物。例示性樣品包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織生檢、腫瘤、白血病、 淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾、其他淋巴組織、肝、肺、胃、小腸、大腸、腎、胰臟、乳房、骨、攝護腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃腺或其他器官、及/或由其衍生的細胞。在細胞療法的情況下，樣品包括例如過繼性細胞療法，來自自體和同種異體來源的樣品。
在一些實施例中，細胞衍生自細胞株，例如T細胞株。在一些實施例中，細胞獲取自異種來源，例如，來自小鼠、大鼠、非人靈長類動物及豬。在一些實施例中，細胞的分離包括一種或多種製備及/或基於細胞的非親和力分離步驟。舉例來說，在一些實例中，細胞係在一種或多種試劑的存在下進行清洗、離心及/或培養，以除去不需要的組分、富集所需組分、裂解，或除去對特定試劑敏感的細胞。在一些實例中，基於一或多種性質來分離細胞，例如密度、黏附性質、尺寸、靈敏度及/或對特定組分的抗性。
在一些實例中，來自受試者循環血液的細胞係例如透過血球分離或白血球分離而獲得。在一些實施例中，樣品含有淋巴細胞(其包括T細胞、單核細胞、顆粒性白血球、B細胞、其他有核的白血球)、紅血球及/或血小板，並且在一些實施例中，包含除了紅血球和血小板之外的細胞。在一些實施例中，從受試者所收集到的血球細胞被清洗，以例如除去血漿部分，並將細胞置於合適的緩衝液或培養液中用於後續處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗細胞。在一些實施例中，根據製造商的說明透過切向流過濾(tangential flow filtration，TFF)完成清洗步驟。在一些實施例中，在清洗後將細胞重新懸浮於各種生物相容性緩衝液中。在某些實施例中，去除血球細胞樣品的組分並將細胞直接重新懸浮於培養液中。在一些實施例中，所述方法包括基於密度的細胞分離方法，例如，裂解紅血球並透過Percoll或Ficoll梯度進行離心而從周邊血液製備白血球。
在一實施例中，免疫獲得的細胞是來自個體循環血液，其係透過血球分離或白血球分離而獲得。血球分離的產物通常包括淋巴細胞，其包括T細胞、單核細胞、顆粒性白血球、B細胞、其他有核的白血球、紅血球及血小板。透過血球分離獲得的細胞可以被清洗以去除血漿部分並將細胞置於適當的緩衝液或培養基中，例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或不含鈣並且可能不含鎂或者可能 不含許多(如果不是全部)的二價陽離子的清洗溶液，用於後續處理步驟。清洗後，可將細胞重新懸浮於各種生物相容性緩衝液中，例如無Ca、無Mg的PBS。或者，可以去除單採血球分離樣品中的不需要的組分，並將細胞直接重新懸浮於培養基中。
在一些實施例中，分離方法包括基於細胞中一或多種特定分子的表現或存在，來分離不同細胞類型。前述特定分子可例如表面蛋白、細胞內標記物或核酸等表面標記物。在一些實施例中，可以使用任何已知基於這些標記的分離方法。在一些實施例中，分離是基於親和力或免疫親和力來分離。例如，在一些實施例中，分離包括根據欲分離的細胞和細胞群其是否表現有一或多種標記物(通常是細胞表面標記物)，或其表現量。舉例來說，其係透過與標記物專一性結合的抗體或結合配偶體一起培養。接著，通常透過清洗步驟，並將結合至抗體或結合搭配物的細胞與未結合至抗體或結合搭配物的細胞進行分離。
前述分離步驟可以基於正向選擇及/或負向選擇，正向選擇保留了與試劑結合的細胞供進一步的使用，負向選擇保留了未與抗體或結合配偶體結合的細胞。在一些實例中，兩種部分皆被保留以供進一步使用。在一些實施例中，當無法取得能從一混雜群體中專一性識別出單一細胞類型的抗體時，此時負向篩選的方式特別好用。因此，分離所根據的標記物最好是非目標群體細胞所表現的標記物。分離率不需要到達100%，也不需要完全去除特定的細胞群體或表現有特定標記物的細胞。舉例而言，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的正向篩選或富集，係指增加這些細胞的數量或百分比，但不表示完全去除不表現該標記的細胞。同樣地，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的負向篩選、去除或耗竭，是指減少這些細胞的數量或百分比，但無須完全去除這些細胞。
在一些實例中，進行多次分離步驟，其係將一步驟所得出的正向選擇或負向選擇部分進行另一次的分離步驟，例如隨後的正向或負向選擇。在一些實例中，單次分離步驟可以同時剔除表現多種標記物的細胞，例如透過將細胞與多個抗體或結合配偶體一起培養，每個抗體或結合配偶體能夠專一性地 辨識出負向選擇用的標記物。同樣地，透過將細胞與多種抗體或在各種細胞類型上表現的結合配偶體一起培養，可以同時對多種細胞類型進行正向選擇。
在一些實施例中，一種或多種T細胞群為富含有或被剔除掉一或多種特定標記物(例如表面標記物)呈陽性(標記物+)或表現高水平(標記物hlgh)的細胞，或者為富含有或被剔除掉一或多種標記物為陰性(標記物-)或表現相對低水平(標記物low)。例如，在一些實施例中，其係透過正向或負向選擇技術來分離出T細胞的特定亞群。舉例來說，其可以是一或多種表面標記物為陽性或高表現量的細胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及/或CD45RO+ T細胞。在某些情況下，此類標記物是在某些T細胞群(例如非記憶細胞)上不存在或其表現量相對較低，但這些標記物存在在某些其他T細胞群(如記憶細胞)中或其表現量相對較高。在一實施例中，細胞(例如CD8+細胞或T細胞，例如CD3+細胞)富含有(即正向選擇出)CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及/或CD62L為陽性或高表面表現量的細胞，及/或剔除(例如，用負向選擇以去除)CD45RA為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實施例中，細胞富含有或剔除掉CD122、CD95、CD25、CD27及/或IL7-Ra(CD127)為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實例中，CD8+ T細胞富含有CD45RO為陽性(或CD45RA為陰性)和CD62L為陽性的細胞。舉例來說，可以使用CD3/CD28綴合的磁珠(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)來正向選擇CD3+、CD28+ T細胞。
在一些實施例中，將T細胞與PBMC樣品分離的方式係對不會在T細胞(例如，B細胞、單核球或其他白血球)上表現的標記物(例如，CD14)進行負向選擇。在一些實施例中，係使用CD4+或CD8+篩選步驟來分離出CD4+輔助細胞與CD8+胞毒性T細胞。藉由對在一或多個初始、記憶及/或作用T細胞亞群上有表現或表現量較高的標記物進行正向或負向選擇，以將這些CD4+和CD8+群體進一步分選成亞群。在一些實施例中，舉例而言，藉由以基於與相應亞群相關的表面抗原進行正向或負向選擇，CD8+細胞會進一步富含或剔除掉初始、中樞記憶、作用記憶和/或中樞記憶幹細胞。在一些實施例中，會對中樞 記憶T(TCM)細胞進行富集，以增加療效，例如改善投與後的長期存活率、擴增程度和/或移植狀況。在某些方面，這些亞群的療效尤其顯著。在一些實施例中，將富含有TCM的CD8+T細胞和CD4+T細胞合併起來，會進一步增強療效。
在實施例中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血液淋巴細胞的CD62L+和CD62L-亞群中。PBMC可以富含有或剔除掉CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分，例如使用抗CD8和抗CD62L抗體。在一些實施例中，CD4+ T細胞群和CD8+ T細胞亞群，例如富含中樞記憶(TCM)細胞的亞群。在一些實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞的富集是基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD127的陽性或高表面表現；在某些實施例中，前述富集是基於對表現有或有高度表現的CD45RA及/或顆粒酶B的細胞的負向選擇。在一些實施例中，其係透過剔除表現有CD4、CD14、CD45RA的細胞以及對表現有CD62L的細胞進行正向選擇或富集，來分離出富含有TCM細胞的CD8+群體。在一實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞的富集是藉由以下方式進行：選出沒有CD4表現的細胞，將其作為起始物，接著以CD14和CD45RA的表現進行負向選擇，並且以CD62L進行正向選擇。在某些情況下，前述選擇是同時進行的，而在其他情況是依序進行，但其順序不拘。在一些方面，用在製備CD8+細胞群體或亞群過程中針對CD4表現進行選擇的相同步驟也會用在產生CD4+細胞群體或亞群的過程中，致使針對以CD4進行分離後，且視情況在一或多個進一步的正向或負向選擇步驟之後，陽性和陰性部分兩者都會保留下來，且其會用於所述方法的後續步驟中。
透過鑑定具有細胞表面抗原的細胞群，將CD4+ T輔助型細胞分類為初級、中樞記憶和作用性細胞。CD4+淋巴細胞可透過標準方法獲得。在一些實施例中，初級CD4+ T淋巴細胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，中樞記憶CD4+細胞是CD62L+和CD45RO+。在一些實施例中，作用性CD4+細胞是CD62L-和CD45RO。在一實例中，為了以負向選擇來富集出CD4+細胞，所用的單株抗體混合物通常會包括抗-CD14、抗-CD20、抗-CD11b、抗-CD16、抗-HLA-DR和抗-CD8的抗體。在一些實施例中， 抗體或結合搭配物係結合於固體載體或基質(例如，磁珠或順磁珠)，以便在正向和/或負向選擇中分離細胞。
在一些實施例中，在基因改造前或於基因改造過程中，將細胞進行培養及/或培育。培養步驟可包括培育、栽培(cultivation)、刺激、活化及/或繁殖。在一些實施例中，組成物或細胞在刺激條件或刺激劑的存在下進行培養。前述條件包括經設計以模擬抗原暴露及/或使細胞俾便進行基因改造(例如，引入重組抗原受體)等條件，前述條件係用來誘導群體中細胞的增殖、擴增、活化及/或存活。前述條件可包括一或多種特定介質、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑，例如營養素、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，例如細胞激素、趨化因子、抗原、結合配偶體、融合蛋白、重組可溶性受體及任何其他細胞活化試劑。在一些實施例中，刺激條件或試劑包括一或多種試劑，例如配體，其能夠活化TCR複合體的細胞內訊息傳遞域。在一些實施例中，該試劑在T細胞中開啟或啟動TCR/CD3細胞內訊息級聯。前述試劑可包括抗體，例如對TCR組分及/或共刺激受體具有專一性的抗體，例如抗CD3、抗CD28、例如與固體支持物如珠子結合的抗體、及/或一種或多種細胞激素。任選地，擴增方法可以進一步包括向培養基中加入抗CD3及/或抗CD28抗體的步驟(例如，濃度至少約0.5ng/ml)。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15。舉例來說，刺激劑包括濃度為至少約10個單位/mL的IL-2。
在另一實施例中，其係透過裂解紅血球和剔除單核細胞以從周邊血液中分離出T細胞，例如，透過PERCOLLTM梯度離心。或者，T細胞可以從臍帶中分離出來。在任何情況下，以正向或負向選擇技術可進一步分離出T細胞的特定亞群。
以前述方式所分離出的臍帶血單核細胞可以剔除掉表現有某些抗原的細胞，包括但不限於CD34、CD8、CD14、CD19和CD56。剔除掉前述細胞，可使用經分離的抗體，包含抗體的生物樣品(如腹水)、與物理支持物結合的抗體，及與細胞結合的抗體。
以負向選擇來富集T細胞群，可以使用針對被負向選擇過的細胞所特有的表面標記物的抗體組合。優選的方法是透過負向磁性免疫黏附或流式 細胞儀來進行細胞分選及/或選擇，前述方法係使用一單株抗體混合物，該單株抗體混合物係針對會表現在經負向選擇過的細胞上的細胞表面標記物。舉例來說，為了以負向選擇來富集CD4+細胞，所使用的單株抗體混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。
為了透過正向或負向選擇來分離出所需的細胞群，可以改變細胞和表面(例如珠子等顆粒)的濃度。在某些實施例中，可能需要顯著降低珠子和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞濃度)，以確保細胞和珠子的最大接觸。舉例來說，在一實施例中，其係使用20億個細胞/毫升的濃度。在一實施例中，其係使用10億個細胞/毫升的濃度。在另一實施例中，其係使用大於1億個細胞/毫升。在另一實施例中，其係使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/毫升的細胞濃度。在另一實施例中，其係使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/毫升的細胞濃度。在進一步的實施例中，其可以使用125或150百萬個細胞/毫升的濃度。使用高濃度可導致細胞產量增加、細胞活化程度提高和細胞擴增情況更好。
在清洗步驟後也可以將T細胞冷凍，這不需要單核細胞去除步驟。雖然不希望受理論約束，但冷凍和隨後的解凍步驟可透過去除細胞群中的顆粒性白血球和一定程度的單核細胞提供了更均勻的產物。在去除血漿和血小板的清洗步驟之後，可以將細胞懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數在本領域中是已知的並且在這種情況下是有用的，但在非限制性實例中，其中一種方法係涉及使用含有20% DMSO和8%人類血清白蛋白的PBS、或其他合適的細胞冷凍介質。接著，將細胞以每分鐘1℃的速率冷凍至-80℃，並將其儲存在液態氮儲存槽的氣相中。本發明可以使用其他受控制冷凍方法，也可以用不受控地在-20℃或液態氮中進行的立即冷凍法。
在一實施例中，T細胞群包含在下列細胞內，例如周邊血液單核細胞、臍帶血細胞、純化的T細胞群和T細胞株。在另一實施例中，周邊血液單核細胞包含T細胞群。在另一實施例中，經純化的T細胞包含T細胞群。
在某些實施例中，可以從樣品中分離出T調節細胞(Tregs)。前述樣品可包括但不限於臍帶血或周邊血液。在某些實施例中，其係透過流式 細胞儀的分選來分離出Tregs。在分離之前，可透過任何本領域已知的方法對樣品中的Tregs進行富集。經分離的Tregs可以在使用前進行冷凍保存及/或擴增。分離Tregs的方法係描述於美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105以及美國專利申請號13/639,927中，其內容以及其整體併入本文。
H.免疫細胞的擴增
無論是在將細胞進行修飾以表現標的CAR、顯性負受體及/或轉換受體、及/或雙特異性抗體、及/或其組合之前還是之後，都可以使用如下列文獻中所述的方法對細胞進行活化和擴增。例如美國專利號6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041、以及美國專利申請號20060121005。舉例來說，本發明的T細胞可以透過與一表面接觸來擴增，而該表面係附著有一刺激試劑與一配體。前述刺激試劑會刺激CD3/TCR複合體相關訊號，而前述配體會刺激T細胞表面的共刺激分子。具體而言，T細胞群可以透過與下列物質接觸而被刺激：抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定在表面上的抗CD2抗體，或與鈣離子載體結合的蛋白質激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)。為了共刺激T細胞表面上的輔助分子，會使用結合輔助分子的配體。例如，可以在適於刺激T細胞增殖的條件下，使T細胞與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。抗CD28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，前述抗體都可以用於本發明，其他本領域的已知方法和試劑也可以用於本發明(參見例如，ten Berge等人，Transplant Proc.(1998)30(8)：3975-3977、Haanen等人，J.Exp.Med.(1999)190(9)：1319-1328、及Garland等人，J.Immunol.Methods(1999)227(1-2)：53-63)。
透過本文所公開的方法來擴增T細胞，其可以增加約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及可以是前述數值間的任一、所有、全部、或部分整數之倍數。在一實施例中，T細胞的擴增範圍約20倍至約50倍之間。
培養後，T細胞可以在培養裝置中的細胞培養基中培養一段時間，或直到細胞達到匯合滿度(confluency)或高細胞密度，以便在將細胞傳遞到另一個培養裝置之前到達最佳傳代。培養裝置可以是通常用於體外培養細胞的任何培養裝置。優選地，在將細胞傳遞到另一個培養裝置之前，滿度為70%或更高。更優選地，滿度為90%或更高。前述一段時間可以是適合於體外培養細胞的任何時間。T細胞培養基可在T細胞培養期間的任何時間被替換。優選地，T細胞培養基每2至3天更換一次，然後從培養裝置中收取T細胞，T細胞可立即使用或冷凍保存以備後續使用。在一實施例中，本發明包括冷凍保存的擴增的T細胞。在將核酸引入T細胞之前，會將冷凍保存的T細胞解凍。
在另一實施例中，該方法包括分離T細胞和擴增T細胞。在另一實施例中，本發明還包括在擴增前冷凍T細胞以保存之。在另一實施例中，冷凍保存的T細胞會被解凍，以用於將編碼嵌合膜蛋白的RNA進行電穿孔。
另一種離體擴增細胞的方法，係描述於美國專利號5,199,942中(其通過引用併入本文)。美國專利號5,199,942中所述的擴增細胞的方法，可以是本文所述的擴增方法的替代形式或與其他擴增方法一起使用。簡而言之，離體培養和T細胞的擴增，包括添加例如美國專利號5,199,942中所述的因子或其他因子到細胞生長因子中，例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體。在一實施例中，T細胞之擴增包括將T細胞與選自於由flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit所組成之群組的因子一起培養。
如本文所述的培養步驟(與本文所述的與試劑接觸或在電穿孔後)時間可以非常短，例如小於24小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進一步描述的培養步驟(與本文所述的藥劑接觸)可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
有各種術語用於描述培養中的細胞。細胞培養通常用來指稱自活體生物中取出並在受控制的條件下生長的細胞。初代細胞培養是指直接自生物體中取出細胞、組織或器官，並在進行第一次繼代培養之前的培養。當細胞在促進細胞生長及/或分裂的條件下置於生長培養基中時，細胞在培養下擴增， 產生更大的細胞群。當細胞在培養下擴增時，細胞增生速率通常透過細胞倍增所需的時間量來測量，也稱為倍增時間。
每一輪的繼代培養稱為一次繼代。當細胞進行繼代培養時，它們被稱為已經繼代。特定的細胞群或細胞有時被稱為或透過其繼代的次數來表徵。例如，已繼代十次的培養細胞群可稱為P10培養物。初代培養物，即從組織中所分離出的細胞的第一次培養物，命名為P0。在第一次繼代培養後，將細胞稱為二級培養物(P1或第1代)。在第二次繼代培養後，該些細胞變成三級培養物(P2或第2代)，依此類推。本領域技術人員將理解，在繼代期間可能存在許多群體倍增。因此，培養群體倍增的次數會大於繼代次數。在繼代期間細胞的擴增(即群體倍增的數量)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基質、培養基和繼代之間的時間。
在一實施例中，細胞可以培養數小時(約3小時)至約14天或期間的任何整數值的小時數。適合T細胞培養的條件包括適當的培養基(例如，MEM培養基(Minimal Essential Media)、或RPMI 1640培養基、或X-vivo 15，(Lonza))，其可包含增殖和活性所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人類血清)，介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α、或本領域技術人員已知的任何其他用於細胞生長的添加劑。其他用於細胞生長的添加劑，包括但不限於介面活性劑、血漿蛋白(plasmanate)及還原劑，例如N-乙醯基-半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，並可添加胺基酸、丙酮酸鈉和維生素，且可不含血清，或可補充有適當量的血清(或血漿)或一組確定的激素，及/或足以使T細胞生長和擴增的細胞激素的量。抗生素，例如青黴素和鏈黴素，僅在實驗培養物中添加，而不包括在要注入受試者的細胞培養物中。標靶細胞係維持在支持生長所需的條件下，例如適當的溫度(例如37℃)和氣體環境下(例如空氣加5% CO2)。
用於培養T細胞的培養基可包括可共刺激T細胞的試劑。例如，可以刺激CD3的試劑是抗CD3的抗體，可以刺激CD28的試劑是抗CD28的抗體。透過本文公開的方法所分離的細胞可以擴增大約10倍、20倍、30倍、40 倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多。在一實施例中，其係透過抗CD3抗體所披覆的KT64.86人工抗原呈現細胞(aAPC)來擴增人類T調節細胞。擴增和活化T細胞的方法可以在美國專利號7,754,482、8,722,400及9,555,105中找到，其內容以及其整體併入本文。
在一實施例中，擴增T細胞的方法可以進一步包括分離經擴增的T細胞，以供進一步的應用。在另一實施例中，擴增方法可以進一步包括將擴增過的T細胞進行後續的電穿孔，然後進行培養。後續的電穿孔可以包括將編碼有介質的核酸引入到擴增過的T細胞群中，例如轉導擴增的T細胞、轉染擴增的T細胞，或用電穿孔方式將核酸引入擴增過的T細胞，其中前述試劑會進一步刺激T細胞。前述試劑可以刺激T細胞，例如透過刺激其進一步的擴增、反應功能或其他T細胞功能。
I.治療方法
本文所述的經修飾的細胞(例如，T細胞)可包含在用於治療的組成物中。該組成物可包括醫藥組成物，並且還包括醫藥上可接受的載劑。包括有經修飾免疫細胞的醫藥組成物，可以一治療有效量的方式進行投予。
在一實施例中，本發明包括用於過繼性細胞轉移療法的方法，其包括向有需要的受試者施用本發明經修飾的T細胞。另一方面，本發明包括治療受試者疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用經修飾的T細胞群。
本發明亦包括在有需要的個體治療疾病或病症的方法，包括向個體施用本發明的經基因編輯修飾的細胞(例如，經基因編輯修飾的T細胞)。在一實施例中，在有需要的個體治療疾病或病症的方法包括向個體施用包括外源TCR及/或CAR的經基因編輯修飾的細胞。
用於過繼性細胞療法的免疫細胞的施用方法是已知的，並且可以與本文所提供的方法和組成物一起使用。例如，過繼性T細胞治療方法描述於例如Gruenberg等人的美國專利申請公開號2003/0170238；Rosenberg的美國專 利號4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10)：577-85)中。參見，例如，Themeli等人，(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；Tsukahara等人，(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等人，(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。在一些實施例中，細胞療法，例如過繼性T細胞療法是透過自體轉移進行的，其中細胞從接受細胞療法的受試者中分離及/或以其他方式製備，或者從衍生自受試者的樣品中製備。因此，在一些實施例中，細胞來自有需要治療的受試者，例如患者，並且在分離和加工後將細胞施用於相同的受試者。
在一些實施例中，細胞療法，例如過繼性T細胞療法，透過同種異體轉移進行，其中從接受或最終接受細胞治療的受試者以外的受試者分離及/或以其他方式製備細胞，例如第一受試者。在這樣的實施例中，接著將細胞施用於相同物種的不同受試者中，例如第二受試者。在一些實施例中，第一和第二受試者在遺傳上是相同的。在一些實施例中，第一和第二受試者在遺傳上是相似的。在一些實施例中，第二受試者表現與第一受試者相同的HLA類型或超類型(supertype)。
在一些實施例中，在施用細胞或含有細胞的組成物之前，用靶向疾病或病症(例如腫瘤)的治療劑治療受試者。在一些實施例中，其他治療劑對於受試者是難治的或無反應的。在一些實施例中，受試者患有持續性或複發性疾病，例如在用另一種治療性干預治療後，包括化療，放射線及/或造血幹細胞移植(HSCT)，例如同種異體HSCT。在一些實施例中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但給藥有效地治療了受試者。
在一些實施例中，受試者對其他治療劑有反應，並且用治療劑治療減輕了疾病負擔。在一些實施例中，受試者最初對治療劑有反應，但隨著時間的推移疾病或病症發生復發。在一些實施例中，受試者未復發。在一些這樣的實施例中，鑑定出受試者處於復發的風險中，例如復發的高風險，因此預防性地施用細胞，例如用以降低復發的可能性或防止復發。在一些實施例中，受試者未接受過另一種治療劑的預先治療。
在一些實施例中，受試者患有持續性或復發性疾病，例如在用另一種治療性干預治療後，包括化療、放射線及/或造血幹細胞移植(HSCT)， 例如同種異體HSCT。在一些實施例中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但給藥有效地治療了受試者。
本發明的經修飾的免疫細胞可以施用於動物以治療癌症，動物優選地是哺乳動物，更優選地是人類。此外，本發明的細胞可用於治療任何與癌症有關的病症，尤其是細胞介導而針對腫瘤細胞的的免疫反應，其係被寄望治療或減輕該疾病。用本發明的經修飾的細胞或醫藥組成物治療的癌症類型包括癌、胚細胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、及惡性腫瘤，例如肉瘤、上皮癌和黑色素瘤。其他例示性癌症包括但不限於乳癌、攝護腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲狀腺癌等。癌症可以是非實體瘤(例如血液腫瘤)或實體瘤。還包括成人腫瘤/癌症和小兒腫瘤/癌症。在一實施例中，癌症是實體瘤或血液腫瘤。在一實施例中，癌症是癌。在一實施例中，癌症是肉瘤。在一實施例中，癌症是白血病。在一實施例中，癌症是實體瘤。
實體瘤是通常不包括囊腫或液體區域的異常組織塊。實體瘤可以是良性或惡性的。不同類型的實體瘤是以形成它們的細胞類型來命名的(例如肉瘤、癌及淋巴瘤)。實體瘤如肉瘤和癌的實例包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、攝護腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓質癌、乳突狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、髓樣上皮癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睾丸瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS腫瘤(例如神經膠瘤(例如腦幹神經膠瘤和混合膠瘤))、神經膠質母細胞瘤(也稱為多形性神經膠質母細胞瘤)星細胞瘤、CNS淋巴瘤、胚細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦膜瘤、神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤和腦轉移瘤)。
可透過本文公開的方法治療的癌包括但不限於食道癌、肝細胞 癌、基底細胞癌(一種皮膚癌)、鱗狀細胞癌(各種組織)、膀胱癌，包括移行細胞癌(膀胱惡性腫瘤)、支氣管癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌，包括肺的小細胞癌和非小細胞癌、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣上皮癌、腎細胞癌、原位管癌(ductal carcinoma in situ)或膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、骨原性癌(osteogenic carcinoma)、上皮癌和鼻咽癌。
可透過本文公開的方法治療的肉瘤包括但不限於纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮細胞瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤和其他軟組織肉瘤。
在某些例示性實施例中，本發明的經修飾的免疫細胞用於治療骨髓瘤或與骨髓瘤相關的病症。骨髓瘤或與其相關的病症的實例包括但不限於輕鏈骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、意義不明單株伽瑪球蛋白症(MGUS)、漿細胞瘤(例如，孤立性、多發孤立性、髓外漿細胞瘤)、類澱粉蛋白變性症和多發性骨髓瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療多發性骨髓瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療難治性骨髓瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療復發性骨髓瘤。
在某些例示性實施例中，本發明的經修飾的免疫細胞用於治療黑色素瘤或與黑色素瘤相關的病症。黑色素瘤或與其相關的病症的實例包括但不限於淺表擴散性黑色素瘤、結節性黑色素瘤、小痣性惡性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、非黑色素瘤或皮膚黑色素瘤(如皮膚、眼、外陰、陰道、直腸黑色素瘤)。在一實施例中，本文的方法用於治療皮膚黑色素瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療難治性黑色素瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療復發性黑色素瘤。
在又一其他例示性實施例中，本發明的經修飾的免疫細胞用於治療肉瘤或與肉瘤相關的病症。肉瘤或與其相關的病症的實例包括但不限於血管肉瘤、軟骨肉瘤、伊文氏肉瘤、纖維肉瘤、胃腸道基質瘤、平滑肌肉瘤、脂肉 瘤、惡性周邊神經鞘腫瘤、骨肉瘤、多形性肉瘤、橫紋肌肉瘤及滑膜肉瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療滑膜肉瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療脂肉瘤例如黏液/圓形細胞脂肪瘤、分化/去分化脂肪瘤及多形性脂肪瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療難治性肉瘤。在一實施例中，本文的方法用於治療復發性肉瘤。
對於接受治療的受試者而言，待施用的本發明的細胞可以是自體的。
本發明細胞的施用可以以任何本領域技術人員已知的方便方式來進行。其可以透過噴霧吸入、注射、攝食、輸血、植入或移植等方法將本發明的細胞施用於受試者。本文所述的組成物可透過靜脈內(i.v.)注射、腹腔內、經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內的方式給予患者。在其他情況下，係將本發明的細胞直接注射到受試者的發炎部位、受試者的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。
在一些實施例中，細胞以所需的劑量施用，其在一些方面包括細胞或細胞類型的所需劑量或數量、及/或所細胞類型的需比例。因此，在一些實施例中，細胞的劑量基於細胞總數(或每公斤體重的數量)和個別群體或亞型的所需比例，例如CD4+與CD8+的比例。在一些實施例中，細胞劑量基於個別群體或個別細胞類型中所需的細胞總數(或每公斤體重的數量)。在一些實施例中，劑量基於前述特徵的組合，例如總細胞的所需數量、所需比例和個別群體中所需的細胞總數。
在一些實施例中，細胞的群體或亞型，例如CD8+和CD4+ T細胞，在所需劑量的總細胞(例如所需劑量的T細胞)的耐受差異之內被施用。在一些實施例中，所需劑量是所需的細胞數或施用細胞的受試者每單位體重所需的細胞數，例如細胞數/公斤。在一些實施例中，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重的最小細胞數。在一些實施例中，在以所需劑量施用的總細胞中，個別群體或亞型以所需的輸出比例(例如CD4+至CD8+比例)或附近存在，例如，在一定的耐受差異或誤差內的比例。
在一些實施例中，細胞在一或多種細胞的個別群體或亞型的所需 劑量的耐受差異之內被施用，例如所需劑量的CD4+細胞及/或所需劑量的CD8+細胞。在一些實施例中，所需劑量是細胞的亞型或群體的所需數量，或施用細胞的受試者其每單位體重所需的前述細胞的數量，例如細胞數/公斤。在一些方面，所需劑量等於或高於群體或亞型的最小細胞數，或每單位體重的群體或亞型的最小細胞數。因此，在一些實施例中，劑量基於所需的總細胞的固定劑量和所需的比例、及/或基於一或多個(例如每個)各亞型或亞群體的所需固定劑量。因此，在一些實施例中，劑量基於所需的T細胞的固定或最小劑量和所需的CD4+與CD8+細胞的比例、及/或基於所需的CD4+及/或CD8+細胞的固定或最小劑量。
在某些實施例中，細胞或細胞亞型的個別群體以約一百萬至約一千億個細胞的範圍施用於受試者，例如，100萬至約500億個細胞(例如，大約500萬個細胞、大約2500萬個細胞、大約5億個細胞、大約10億個細胞、大約50億個細胞、大約200億個細胞、大約300億個細胞、大約400億個細胞，或者上述任意兩個值所定義的範圍)，例如，大約1000萬至大約1000億個細胞(例如，大約2000萬個細胞、大約3000萬個細胞、大約4000萬個細胞、大約6000萬個細胞、大約7000萬個細胞、大約8000萬個細胞、大約9000萬個細胞、大約100億個細胞、大約250億個細胞、大約500億個細胞、大約750億個細胞、大約900億個細胞，或者上述任意兩個值所定義的範圍)，在某些情況下大約1億個細胞至大約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或這些範圍之間的任何值。
在一些實施例中，總細胞的劑量及/或個別亞群的細胞的劑量在約1x105個細胞/公斤體重至約1x1011個細胞/公斤體重的範圍內、104或約1011個細胞/公斤體重，例如105至106個細胞/公斤體重之間，例如，約1 x 105個細胞/公斤體重、1.5 x 105個細胞/公斤體重、2 x 105個細胞/公斤體重或1 x 106個細胞/公斤體重。舉例來說，在一些實施例中，細胞在等於或在一定誤差範圍內被施用，等於或約為104或等於或約為109個T細胞/公斤體重之間，例如105至106個T細胞/公斤體重之間，舉例來說，等於或約為1 x 105個T細胞/公斤體重、1.5 x 105個T細胞/公斤體重、2 x 105個T細胞/公斤體重、或1 x 106個T細胞/公斤體重。在其他例示性實施例中，用於本發明的方法的經修飾的細胞的合適劑量範圍包括但不限於自約1x105個細胞/公斤至約1x106個細胞/公斤、自約1x106個細胞/公斤至約1x107個細胞/公斤、自約1x107個細胞/公斤至約1x108個細胞/公斤、自約1x108個細胞/公斤至約1x109個細胞/公斤、自約1x109個細胞/公斤至約1x1010個細胞/公斤、自約1x1010個細胞/公斤至約1x1011個細胞/公斤。在一例示性實施例中，用於本發明的方法的合適劑量為約1x108個細胞/公斤。在一例示性實施例中，用於本發明的方法的合適劑量為約1x107個細胞/公斤。在其他實施例中，合適的劑量為自約1x107個總細胞至約5x107個總細胞。在一些實施例中，合適的劑量為自約1x108個總細胞至約5x108個總細胞。在一些實施例中，合適的劑量為自約1.4x107個總細胞至約1.1x109個總細胞。在一例示性實施例中，用於本發明的方法的合適劑量是約7x109個總細胞。
在一些實施例中，細胞在等於或在約為104和等於或約為109 CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重的一定誤差範圍內被施用，例如105和106 CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重之間，舉例來說，等於或約為1 x 105 CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重、1.5 x 105 CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重、2 x 105 CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重、或1 x 106 CD4+及/或CD8+細胞/公斤體重。在一些實施例中，細胞在等於或在一定誤差範圍內、或大於、及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個CD4+細胞，及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個CD8+細胞，及/或至少約1 x 106、約2.5 x 106、約5 x 106、約7.5 x 106、或約9 x 106個T細胞被施用。在一些實施例中，細胞在等於或在約為108至1012之間或約1010至1011個T細胞之間、約108至1012之間或約1010至1011個CD4+細胞之間及/或約108至1012之間或約1010至1011個CD8+細胞之間的一定誤差範圍內被施用。
在一些實施例中，細胞在多種細胞群或亞型(例如CD4+和CD8+細胞或亞型)的所需輸出比例的耐受範圍或其範圍內被施用。在一些方面，所需比例可以是特定比例或可以是比例範圍，例如，在一些實施例中，所需比例(例如，CD4+與CD8+細胞的比例)在等於或約5：1至等於或約5：1之間(或 大於約1：5且小於約5：1)、或等於或約1：3至等於或約3：1之間(或大於約1：3且小於約3：1)，例如介於等於或約2：1至等於或約1：5之間(或大於約1：5且小於約2：1，例如約為5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5或1：5。在一些方面，所需比例的耐受差異在約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%之間，或包括其範圍內的任何值。
在一些實施例中，將一定劑量的經修飾的細胞以單劑量或多劑量被施用於有需要的受試者。在一些實施例中，一定劑量的經修飾細胞以多劑量被施用，例如，每週一次或每7天一次、每2週一次或每14天一次、每3週一次或每21天一次、每4週一次或每28天一次。在一例示性實施例中，將單劑量的經修飾的細胞施用於有需要的受試者。在一例示性實施例中，透過快速靜脈內輸注將單劑量的經修飾的細胞施用於有需要的受試者。
對於預防或治療疾病，適當的劑量可取決於待治療的疾病類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重程度和病程，細胞是否用於預防或治療目的、先前的治療、受試者的臨床病史和對細胞的反應，以及主治醫師的自由裁量權。在一些實施例中，組成物和細胞適合一次或在一系列治療中施用於受試者。
在一些實施例中，細胞作為組合治療的一部分施用，例如與另一種治療性干預同時或依序、或任何順序施用，該治療性干預例如抗體或改造細胞或受體或試劑，例如細胞毒性劑或治療劑。在一些實施例中，細胞與一或多種額外的治療劑共同施用或與另一種治療干預同時或以任何順序依序施用。在一些情況下，細胞與另一種療法以足夠接近的時間共同施用，使得細胞群增強一或多種額外的治療劑的作用，或反之亦然。在一些實施例中，在一或多種額外的治療劑之前施用細胞。在一些實施例中，在一或多種額外的治療劑之後施用細胞。在一些實施例中，前述一或多種額外的藥劑包括細胞激素，例如IL-2， 以增強持久性。在一些實施例中，該方法包括施用化學治療劑。
在某些實施例中，本發明的經修飾的細胞(例如，包括TCR及/或CAR的經修飾的細胞)可以與免疫檢查點抗體(例如，抗-PD1、抗-CTLA-4、或抗PDL1抗體)組合施用於受試者。舉例來說，經修飾的細胞可以與靶向例如PD-1(程序性死亡1蛋白)的抗體或抗體片段組合施用。抗-PD-1抗體的實例包括但不限於彭博羅珠單抗(pembrolizumab，KEYTRUDA®，以前稱為蘭布羅株單抗(lambrolizumab，也稱為MK-3475))和納武單抗(nivolumab、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、OPDIVA®)、或其抗原結合片段。在某些實施例中，經修飾的細胞可以與抗-PD-L1抗體或其抗原結合片段組合施用。抗-PD-L1抗體的實例包括但不限於BMS-936559、MPDL3280A(TECENTRIQ®，阿特珠單抗(Atezolizumab))和MEDI4736(得瓦魯單抗(Durvalumab)，Imfinzi)。在某些實施例中，經修飾的細胞可以與抗-CTLA-4抗體或其抗原結合片段組合施用。抗-CTLA-4抗體的實例包括但不限於伊匹單抗(Ipilimumab)(商品名Yervoy)。其他類型的免疫檢查點調節劑可以包括但不限於小分子、siRNA、miRNA及CRISPR系統。免疫檢查點調節劑可以在施用包括CAR的經修飾細胞之前、之後或同時進行施用。在某些實施例中，組合治療包括免疫檢查點調節劑可以增加包括本發明的經修飾細胞的療法的治療功效。
在施用細胞後，改造細胞群的生物活性在一些實施例中被測量，例如透過許多已知方法中的任何一種進行測量。要評估的參數包括被改造的或天然的T細胞或其他免疫細胞與抗原的特異性結合，體內，例如透過成像，或離體，例如透過ELISA或流式細胞儀。在某些實施例中，可以使用本領域已知的任何合適的方法測量改造細胞破壞標靶細胞的能力，例如Kochenderfer等人，J.Immunotherapy,32(7)：689-702(2009)，及Herman等人，J.Immunological Methods,285(1)：25-40(2004)中所描述的方法。在某些實施例中，透過測定一或多種細胞激素(例如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表現和/或分泌來測量細胞的生物活性。在一些實施例中，透過評估臨床結果(例如腫瘤負擔或負荷的減少)來測量生物活性。
在某些實施例中，向個體提供二級治療。
在一些實施例中，可以在CAR T細胞療法之前對受試者施用調理療法(conditioning therapy)。在一些實施例中，調理療法包括向受試者施用有效量的環磷醯胺。在一些實施例中，調理療法包括向受試者施用有效量的氟達拉濱(fludarabine)。在優選的實施例中，調理療法包括向受試者施用有效量的環磷醯胺和氟達拉濱的組成物。在CAR T細胞療法之前施用調理療法可以增加CAR T細胞療法的功效。調理患者T細胞療法的方法描述於美國專利No.9,855,298中，其通過引用整體併入本文。
在某些實施例中，向個體提供二級治療。二級治療包括但不限於化療、放射線、手術和藥物治療。
在一些實施例中，本發明的特定劑量方案包括在施用經修飾的T細胞之前的淋巴球清除步驟。在一例示性實施例中，淋巴球清除步驟包括施用環磷醯胺及/或氟達拉濱(fludarabine)。
在一些實施例中，淋巴球清除步驟包括以約200mg/m2/天至約2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天、或500mg/m2/天)的劑量施用環磷醯胺。在一例示性實施例中，環磷醯胺的劑量為約300mg/m2/天。在一些實施例中，淋巴球清除步驟包括以約20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、60mg/m2/天)的劑量施用氟達拉濱。在一例示性實施例中，氟達拉濱的劑量為約30mg/m2/天。
在一些實施例中，淋巴球清除步驟包括以約200mg/m2/天至約2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天或500mg/m2/天)的劑量施用環磷醯胺，並以約20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)的劑量施用氟達拉濱。在一例示性實施例中，淋巴球清除步驟包括以約300mg/m2/天的劑量施用環磷醯胺，以及以約30mg/m2/天的劑量施用氟達拉濱。
在一例示性實施例中，環磷醯胺的劑量在三天內為300mg/m2/天，且氟達拉濱的劑量在三天內為30mg/m2/天。
淋巴清除性化療可以安排在相對於在第0天輸注T細胞(例如，CAR-T、TCR-T，經修飾的T細胞等)的第-6至-4天(具有-1天範圍，即在第-7 天至第-5天給藥)給藥。在一例示性實施例中，對於患有癌症的受試者，受試者在施用經修飾的T細胞之前3天透過靜脈內輸注接受包括300mg/m2環磷醯胺的淋巴清除性化療。在一例示性實施例中，對於患有癌症的受試者，受試者在施用經修飾的T細胞之前透過靜脈內輸注接受包括300mg/m2環磷醯胺的淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療以持續3天的方式進行。
在一例示性實施例中，對於患有癌症的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括氟達拉濱，劑量為約20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)。在一例示性實施例中，對於患有癌症的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括30mg/m2劑量的氟達拉濱以持續3天的方式進行。
在一例示性實施例中，對於患有癌症的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括環磷醯胺的劑量為約200mg/m2/天至約2000mg/m2/天(例如，200mg/m2/天、300mg/m2/天，或500mg/m2/天)以及氟達拉濱的劑量約為20mg/m2/天至約900mg/m2/天(例如，20mg/m2/天、25mg/m2/天、30mg/m2/天、或60mg/m2/天)。在一例示性實施例中，對於患有癌症的受試者，該受試者接受淋巴清除性化療，該淋巴清除性化療包括劑量為約300mg/m2/天的環磷醯胺以及30mg/m2劑量的氟達拉濱，以持續3天的方式進行。
本發明的細胞可以以適當的臨床前和臨床實驗和試驗中所決定的劑量、途徑和時間來施用。細胞組成物可以在這些劑量範圍內進行多次給藥。如本領域技術人員所決定的，本發明細胞的施用可以與其他治療所需疾病或病症的方法組合。
本領域已知，輸注CAR T細胞後的一種副作用是免疫激活的開始，稱為細胞激素釋放症候群(CRS)。CRS是免疫激活，導致發炎性細胞激素升高。臨床和實驗室測量範圍從輕度CRS(全身症狀及/或2級器官毒性)到嚴重CRS(sCRS；
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3級器官毒性、攻擊性臨床干預及/或可能危及生命)。臨床特徵包括：高燒、不適、疲勞、肌痛、噁心、厭食、心跳過速/低血壓、微血管滲漏、心功能不全、腎損害、肝衰竭和廣泛性血管內凝固。在CAR T細胞輸注後，細胞激素顯著的升高，包括干擾素-γ、顆粒球巨噬細胞群落刺激生長因 子、IL-10及IL-6。一個CRS特徵是細胞激素的升高，包括IL-6(嚴重升高)，IFN-γ、TNF-α(中度)及IL-2(輕度)。目前還觀察到臨床可用的炎症標記物包括鐵蛋白和C-反應蛋白(CRP)的升高與CRS有關。CRS的存在通常與過繼性轉移細胞的擴增和進行性免疫激活相關。目前已經證明CRS的嚴重程度取決於輸注時的疾病負擔，因為具有高腫瘤負擔的患者經歷更多的嚴重CRS。
因此，本發明在CRS診斷後提供了適當的CRS管理策略，以減輕不受控制的炎症的生理症狀，而不會抑制經改造的細胞(例如CAR T細胞)的抗腫瘤功效。CRS管理策略在本領域中是已知的。例如，可施用全身性皮質類固醇以快速逆轉sCRS(例如，3級CRS)的症狀而不損害初始抗腫瘤反應。
在一些實施例中，可以施用抗IL-6R抗體。抗IL-6R抗體的實例是食品和藥物管理局批准的單株抗體托珠單抗(tocilizumab)，也稱為atlizumab(以Actemra或RoActemra銷售)。托珠單抗是針對介白素-6受體(IL-6R)的人源化單株抗體。施用托珠單抗已經證明幾乎立即逆轉CRS。
CRS通常基於觀察到的綜合症狀的嚴重程度進行管理，並且干預措施也是依此定制。CRS管理決策可能基於臨床症狀和病徵以及對干預措施的反應，而不僅僅基於實驗室數值。
輕度至中度病例通常採用液體治療、非類固醇抗發炎藥(NSAID)和抗組織胺藥物的症狀管理治療，用以緩解症狀。更嚴重的病例包括任何程度的血液動力學不穩定的患者；如果出現任何血液動力學不穩定，建議施用托珠單抗。在一些實施例中，CRS的一線管理可以是托珠單抗，在60分鐘內以8mg/kg IV的標記劑量(不超過800mg/dose)給藥；托珠單抗可重複Q8小時。如果對第一劑托珠單抗具有次佳反應，可考慮增加額外劑量的托珠單抗。托珠單抗可以單獨給藥或與皮質類固醇治療組合給藥。具有持續或進行性CRS症狀、12~18小時臨床改善不足或對托珠單抗反應差的患者可以用高劑量皮質類固醇治療，通常是氫化皮質酮100mg IV或甲基腎上腺皮質酮1~2mg/kg。在患有更嚴重的血流動力學不穩定或更嚴重的呼吸道症狀的患者中，患者可在CRS的早期施用高劑量皮質類固醇治療。CRS管理規則可以依據已公佈的標準為基準(Lee等人(2019)Biol Blood Marrow Transplant,doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758； Neelapu等人(2018)Nat Rev Clin Oncology,15：47；Teachey等人(2016)Cancer Discov,6(6)：664-679)。
在用CAR-T療法治療的患者(Henter，2007)中觀察到與巨噬細胞活化症候群(MAS)或噬血症候群(HLH)一致的特徵，與CRS的臨床表現一致。MAS似乎是對CRS發生的免疫活化有反應，因此應該被認定是CRS的表現。MAS類似於HLH(也是對免疫刺激的反應)。MAS的臨床症候群的特徵在於高度非弛張發熱，影響三個譜系中至少兩個的血球減少症和肝脾腫大。它與高血清鐵蛋白、可溶性介白素-2受體和三酸甘油酯有關，並且降低循環自然殺手(NK)的活性。
包括本發明的外源TCR及/或CAR的經修飾的免疫細胞可用於如本文所述的治療方法中。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞包括基因座中的插入及/或缺失，其能夠下調內源基因的基因表現。在一些實施例中，內源基因是當該基因被下調時，會增強包括外源TCR及/或CAR的免疫細胞功能的基因。例如但不限於，內源基因是當該基因被下調時，會增強腫瘤浸潤、腫瘤殺傷及/或對包括外源TCR及/或CAR的免疫細胞的免疫抑制的抗抗力的基因。
在一些實施例中，基因座中的插入及/或缺失能夠下調一或多種選自於C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組的基因的表現。在一些實施例中，基因座中的插入及/或缺失能夠下調一或多種選自於AZI2、C1orf141、CCDC33、CCL7、CEACAM19、KLF4、MFSD5、PAGR1、SIX2及USP27X所組成的群組的基因的表現。在一些實施例中，基因座中的插入及/或缺失能夠下調一或多種選自於KLF4、PAGR1及SIX2所組成的群組的基因的表現。在一些實施例中，基因座中的插入及/或缺失能夠下調PAGR1的表現。在一些實施例中，基因座中的插入及/或缺失能夠下調PAGR1相關基因的表現，例如ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3或TNFAIP3。
因此，當在本文所述的治療方法中使用時，包括本發明的外源TCR及/或CAR的經修飾的免疫細胞增強了經修飾的免疫細胞的能力，進而執 行其功能。因此，本發明提供了一種用於增強經修飾的免疫細胞的功能的方法，以用於本文所述的治療方法。
J.醫藥組成物和調配物
本文還提供了免疫細胞群、含有前述細胞及/或富含前述細胞的組成物。舉例來說，表現重組受體的細胞占組成物內總細胞數的比例為，或占某特定類型細胞(如T細胞或CD8+或CD4+細胞)的比例為50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。這些組成物中包含適用於投與的醫藥組成物和調配物，例如用於過繼性細胞療法。本文還提供了將細胞和組成物投予至受試者(例如患者)的治療方法。
本文還提供了包括用於投予之細胞的組成物，其包括醫藥組成物和調配物，例如單位劑量形式的組成物，其包括於給定劑量或其部分中所投予的細胞數量。醫藥組成物和調配物通常包括一或多種可選的醫藥上可接受的載劑或賦形劑。在一些實施例中，組成物包括至少一種額外的治療劑。
術語「醫藥調配物」是指一種製劑，其所呈形式允許所含活性成分之生物活性得以有效發揮，且不含有其他會對所投與之個體產生不可接受毒性之成分。「醫藥上可接受的載劑」是指醫藥調配物中除了活性成分以外的成分，其對受試者是無害的。醫藥上可接受的載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在一些實施例中，載劑的選擇在某種程度上係由特定細胞及/或透過施用方法來決定。因此，有多種調配物係適合用於本發明。例如，醫藥組成物可含有防腐劑。合適的防腐劑可包括例如，對羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及羥基氯苯胺。在一些實施例中，其係使用兩種或更多種防腐劑的混合物。防腐劑或其混合物通常佔組成物總重量約0.0001%至約2%。載劑係描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed中。醫藥上可接受的載劑通常在所用劑量和濃度下對受試者是無害的，並且其係包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲雙銨、羥基氯苯胺、氯化本索寧、苯酚、丁基或芐基醇、對羥苯甲酸酯類，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、及間 甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；醣類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子(salt-forming counterion)如鈉；金屬複合體(例如鋅-蛋白質複合體)；及/或非離子介面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，緩衝劑包括在組成物中。合適的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀和各種其他酸和鹽類。在一些實施例中，其係使用兩種或以上緩衝劑的混合物。緩衝劑或其混合物的總量通常佔組成物總重量約0.001%至約4%。製備可施用的醫藥組成物的方法是已知的。例示性方法更詳細地描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams & Wilkins；21st ed.(May 1,2005)中。
調配物可包括水溶液。調配物或組成物還可含有一種以上適用以細胞治療的特定適應症、疾病或病症的活性成分，前述活性成分優選地具有與細胞互補的活性，各活性不會相互作用而產生不利的影響。前述活性成分適合以對預期目的有效的劑量組合存在。因此，在一些實施例中，醫藥組成物還包含其他醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑，例如天冬醯胺酸酶、硫酸布他卡因、卡鉑、順鉑、道諾黴素、艾黴素(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、胺甲喋呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春花鹼(vinblastine)、及/或長春花新鹼(vincristine)。在一些實施例中，醫藥組成物含有有效治療或預防疾病或病症的細胞量，例如治療有效量或預防有效量。某些實施例中的治療或預防功效，係透過定期評估接受治療的受試者來進行監測。所需劑量可透過單次推注施用細胞、透過多次推注施用細胞、或透過連續輸注施用細胞來遞送。
調配物包括口服、靜脈內、腹腔內、皮下、肺、經皮、肌肉內、鼻腔內、口腔、舌下或栓劑給藥的調配物。在一些實施例中，其係非經腸胃道來施用細胞群。本文所用的術語「非經腸胃道」包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道和腹腔內給藥。在一些實施例中，係透過靜脈內、腹腔內或皮下注 射等周邊全身遞送方式將細胞施用於受試者。一些實施例中的組成物係以無菌液體調配物的形式來提供，其例如等張性水溶液、懸浮液、乳液、分散體或黏性組成物，在一些實施例中其可以緩衝至選定的pH值。液體調配物通常比凝膠、其他黏性組成物和固體組成物更容易製備。另外，液體組成物在某些程度上更便於給藥，特別是透過注射。另一實施例中，黏性組成物可以配製在適當的黏度範圍內，使其能與特定組織接觸的更久。液體或黏性組成物可包含載劑，其可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其合適的混合物。
無菌的注射溶液可以透過將細胞摻入溶劑中來製備，例如與合適的載劑，稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理食鹽水、葡萄糖、右旋糖等)混合。組成物可含有輔助物質，例如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH值緩衝劑、凝膠或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑及/或顏色，這取決於給藥途徑和所需的調配物。在某些實施例中，可以參考標準文本來製備合適的調配物。
在本文的組成物中可以加入各種增強組成物穩定性和無菌性的添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可用來確保防止微生物的作用。延長可注射藥物形式的吸收，可透過使用延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。
一般來說，用於體內施用的調配物是無菌的。舉例來說，透過無菌過濾膜過濾可以容易地達到無菌。
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K.核酸和免疫細胞庫
本發明提供了用於本文其他部分所述的篩選方法的核酸庫。核酸 庫包括一或多種核酸。在一些實施例中，該庫包含一或多種核酸，包括第一核酸，其編碼獨特靶向序列。獨特靶向序列可以是能夠靶向內源基因座的任何區域的任何序列。在一實施例中，獨特靶向序列能夠靶向內源基因座並在內源基因座的標靶序列中產生插入及/或缺失。在一實施例中，本發明的核酸庫包括一或多種核酸，其中該一或多種核酸包括編碼獨特靶向序列的第一核酸。在一些實施例中，本發明的核酸庫包括一或多種核酸，其中該一或多種核酸包括編碼獨特靶向序列的第一核酸，並且該庫包括至少一種核酸，該至少一種核酸編碼靶向人類基因體的各個基因(例如，開放閱讀框)的獨特靶向序列。
人類基因體中估計有19,000~20,000個基因。因此，在一些實施例中，本發明的核酸庫包括至少19,000~20,000個核酸，該核酸包括編碼獨特靶向序列的第一核酸，該靶向序列靶向人類基因體的19,000~20,000個基因。舉例來說，本發明的核酸庫包括超過100個核酸，該核酸包括編碼獨特靶向序列的第一核酸，該靶向序列靶向人類基因體的至少100個獨特基因(例如，開放閱讀框)。舉例來說，本發明的核酸庫包括超過200個核酸，例如超過300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000個核酸，各個核酸包括編碼靶向人類基因體的至少200個獨特基因的第一核酸，例如靶向人類基因體的300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000個獨特基因的第一核酸。
在又一實施例中，本發明的核酸庫包括一或多種核酸，其包括編碼獨特靶向序列的第一核酸，該獨特靶向序列靶向人類基因體的19,000~20,000個基因中的每一個中的一或多個部分。在此類實施例中，本發明的核酸庫據說具有人類基因體的一或多次覆蓋。舉例來說，人類基因體的各個基因可以被靶向一或多次，例如2或多次、3或多次、4或多次、5或多次、10或多次、15或多次、20或多次，並且本發明的核酸庫包括人類基因體的至少2倍的覆蓋率，例如，至少3倍的覆蓋率、至少4倍的覆蓋率、至少5倍的覆蓋率、至少10倍的覆蓋率、至少15倍的覆蓋率、至少20倍的覆蓋率。舉例來說，在一實施例中， 包括人類基因體的至少3倍覆蓋率的本發明核酸庫包括超過600，例如超過900、1200、1500、3000、4500、6000、9000、12,000、15,000、18,000、21,000、24,000、27,000、30,000、33,000、36,000、39,000、42,000、45,000、48,000、51,000、54,000、57,000、60,000個核酸，該核酸包括編碼至少200個靶向獨特基因的獨特靶向序列的第一核酸，例如，300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000個靶向人類基因體至少三次的獨特基因的獨特靶向序列的第一核酸。在前述實施例中，靶向序列靶向相同基因的相同基因標靶獨特區。在另一實例中，在一實施例中，包括人類基因體的至少6倍覆蓋率的本發明的核酸庫包括超過1200，例如超過1800、2400、3000、6000、9000、12,000、18,000、24,000、30,000、36,000、42,000、48,000、54,000、60,000、66,000、72,000、78,000、84,000、90,000、96,000、102,000、108,000、114,000、120,000個核酸，該核酸包括編碼至少200個靶向獨特基因的獨特靶向序列的第一核酸，例如，300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000個靶向人類基因體至少六次的獨特基因的獨特靶向序列的第一核酸。在該實施例中，至少六個獨特靶向序列靶向相同基因(例如，開放閱讀框)的至少六個獨特區。本領域技術人員將能夠容易地確定用於感興趣的篩選的適當的覆蓋水平和核酸庫的適當大小(例如，獨特標靶的數量)。
標的核酸庫的第一核酸可以更包括與獨特靶向序列可操作地連接的啟動子序列。舉例來說，標的核酸庫的第一核酸可進一步包括與獨特靶向序列可操作地連接的U6啟動子序列。U6啟動子招募RNA聚合酶III，其除了轉錄小RNA以外，也可用於驅動獨特靶向序列的轉錄。適合用於驅動小RNA轉錄的任何啟動子序列可以與標的核酸庫的第一核酸的獨特靶向序列可操作地連接。前述啟動子的另一個實例是H1啟動子。因此，在一實施例中，本發明的核酸庫包括一或多種核酸，該核酸包括第一核酸，該第一核酸包括與編碼獨特靶向序列的核酸序列可操作地連接的U6啟動子。適合用於驅動獨特靶向序列轉錄的多種啟動子是本領域已知的。技術人員將能夠容易地確定使用哪種啟動子可 以滿足所需的篩選的需求。
在一些實施例中，本發明的標的核酸庫包括一或多種核酸，該核酸包括編碼獨特靶向序列的第一核酸，例如獨特的引導RNA。獨特的引導RNA包括與內源基因的標靶區充分地互補的序列。在一實施例中，包括人類基因體的至少6倍覆蓋率的本發明的核酸庫包括超過1200，例如超過1800、2400、3000、6000、9000、12,000、18,000、24,000、30,000、36,000、42,000、48,000、54,000、60,000、66,000、72,000、78,000、84,000、90,000、96,000、102,000、108,000、114,000、120,000個核酸，該核酸包括編碼靶向(例如，充分地互補)至少200個獨特標靶區域的獨特引導RNA的第一核酸，例如，300、400、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000個人類基因至少六次的獨特基因。
在一些實施例中，該核酸庫包含編碼外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的第二核酸。在一些實施例中，由第二核酸編碼的外源TCR及/或CAR具有對標靶抗原的親和力，例如已知的標靶抗原。在一些實施例中，由第二核酸編碼的外源TCR及/或CAR具有對例如NY-ESO-1或PSCA的親和力。
在一些實施例中，標的核酸庫的第二核酸可以更包括與編碼外源TCR及/或CAR的核酸可操作地連接的延伸因子-1-α啟動子(EF-1α啟動子)。使用EF-1α啟動子可以提高下游轉基因(例如，編碼TCR及/或CAR的核酸序列)的表現效率。適用於驅動下游轉基因，例如TCR及/或CAR，表現的任何啟動子序列可以與編碼外源TCR及/或CAR的核酸可操作地連接。在一實施例中，本發明的核酸庫包含第二核酸，其包括與編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列可操作地連接的EF-1α啟動子。適用於驅動下游轉基因表現的多種啟動子是本領域已知的。技術人員將能夠容易地確定使用哪種啟動子可以滿足所需的篩選的需求。
在一些實施例中，標的核酸庫的第一和第二核酸各自位於不同的核酸上。在此類實施例中，可將可選擇的標記物(例如可檢測的標記物或抗性 基因)併入第一及/或第二核酸中。在第一和第二核酸各自位於不同核酸上的實施例中，當將該庫引入細胞群時，可選擇的標記物可用於確定哪些細胞包括第一和第二核酸。在一些實施例中，第一和第二核酸位於同一個核酸上。可選擇的標記物可以併入到包括第一和第二核酸的核酸中。在一實施例中，可選擇的標記物是報導基因，例如，包括編碼報導蛋白的核酸序列，例如螢光蛋白。這種可選擇的標記物可用於確定哪些細胞已成功地用標的核酸庫的核酸轉化或轉導。
在一例示性實施例中，標的核酸庫的第一和第二核酸位於同一個核酸上。例如，參見圖1。在一實施例中，標的核酸庫包括一或多種核酸，其中該核酸包括編碼獨特靶向序列的第一核酸，和包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列的第二核酸。在一實施例中，標的核酸庫括含一或多種核酸，其中該核酸包括第一核酸，該第一核酸包括U6啟動子序列，U6啟動子序列可操作地連接至編碼獨特靶向序列的核酸序列，以及EF-1α啟動子序列，其可操作地連接至編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列的序列。
在標的核酸庫中使用病毒載體的該些實施例中，核酸庫的成員作為容納病毒基因體核酸的病毒顆粒，其中該核酸庫的指定顆粒成員的病毒基因體核酸包括載體域和標的核酸(例如，包括編碼獨特靶向序列的第一核酸的核酸，和包括編碼外源TCR及/或CAR的核酸序列的第二核酸)。此類核酸庫可稱為經包裝的病毒核酸庫。在某些實施例中特別感興趣的是使用經包裝的病毒核酸庫，其使用病毒載體域，其提供核酸庫的單一成員進入指定的標靶細胞(例如標靶免疫細胞)。
在本發明的經包裝的病毒核酸庫中，不同核酸庫的成員的病毒基因體核酸將共享共同的載體域。因此，核酸庫成員將共享共同的載體序列，使得標的核酸庫的不同成員的殼體化病毒基因體核酸的序列基本上(如果不是完全相同的話)是相同的。載體域的序列取決於載體的性質可以變化很大。在一些情況下，載體域包括在經包裝的細胞中產生重組病毒構築體所必需的序列，核酸庫成員在標靶細胞(例如免疫細胞)中的轉導和複製以及該核酸庫(例如，引導RNA和TCR及/或CAR的表現)的成員的表現、報導分子或其他效應子 和基因。載體域的產生以及包括其的標的核酸庫可以使用任何合適的基因工程技術完成，包括但不限於PCR的標準技術、寡核苷酸合成、限制性內切酶切割、位點特異性切割、位點特異性重組、連接、轉形、質體純化和DNA定序。
在一些情況下，載體域選自病毒的病毒基因體，前述病毒基因體選自腺病毒、腺相關、牛痘、皰疹、泡沫等病毒所組成的群組，其中此類病毒通常用於基因轉移應用。在一些情況下，載體域是反轉錄病毒載體區，其是衍生自反轉錄病毒的域。反轉錄病毒是屬於反轉錄病毒科的任何病毒，包括具有兩個獨特特徵的單股RNA動物病毒。首先，反轉錄病毒的基因體是二倍體，由兩個拷貝數的RNA組成。其次，該RNA由病毒顆粒相關酵素反轉錄酶反轉錄成雙股DNA。接著，該雙股DNA或原病毒可以整合到宿主基因體(例如，標靶免疫細胞的基因體)中。因此，在某些方面，標的核酸庫的各個成員被配置成整合到標靶免疫細胞的基因體中。整合可以是非特異性的或特異性的整合至特定染色體位置。在某些方面，設計病毒載體以使用位點特異性重組(例如，使用Cre-Lox或其他重組系統)、鋅指核酸內切酶、CRISPR核酸內切酶，在衍生自天然整合的載體的病毒的特定位點中的特定染色體位點整合。
在某些方面，標的核酸庫的成員是非整合載體，例如，其中標的核酸庫的各個成員是基於非整合的慢病毒、腺病毒或腺相關病毒載體。
根據某些實施例，反轉錄病毒載體區是腺相關病毒載體區，例如衍生自腺相關病毒(AAV)的載體。可以使用具有任何感興趣血清型的任何合適的基於AAV的載體，包括例如在McCarty(2008)Mol.Therapy 16：1648-1656；Nonnenmacher(2012)Gene Therapy 19：649-658；及Jayandharan等人(2008)Gene Therapy 15：1287-1293中描述的基於AAV的載體。
在一些實施例中，反轉錄病毒載體區是慢病毒載體區，例如衍生自慢病毒的載體。慢病毒是反轉錄病毒家族的成員。慢病毒載體可以用VSV-G假型化，並衍生自人類免疫缺陷病毒(HIV)，其為使人類獲得免疫缺乏症候群(AIDS)的病原體；威司奈-梅迪(visan-maedi)，其導致綿羊的腦炎(visna)或肺炎；山羊關節炎-腦炎病毒，其導致山羊的免疫缺陷、關節炎和腦病；馬傳染性貧血病毒(EIAV)，其引起馬的自體免疫溶血性貧血和腦病；貓免疫缺陷 病毒(FIV)，其導致貓的免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其引起牛的淋巴結腫大和淋巴球增多症；以及猴免疫缺陷病毒(SIV)，其導致非人靈長類動物的免疫缺陷和腦病。基於HIV的載體可以保留<5%的親代基因體，且<25%的基因體可以併入包裝構築體中，這使得產生具有突變回復體複製能力的HIV的可能性最小化。載體區可包括形成慢病毒的5'和3'LTR的序列。在一些情況下，載體域包括來自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及來自慢病毒的去活化的或自我去活化的3'LTR。LTR序列可以是來自任何物種的任何慢病毒的LTR序列。舉例來說，它們可以是來自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。在需要時，標的病毒核酸庫可以由自我去活化載體組成，其含有下游長末端重複序列中調控元件的缺失，消除了載體活化作用所需的包裝訊號的轉錄。因此，載體區可包括去活化的或自我去活化的3'LTR。3'LTR可以透過任何方便的方法自我去活化。舉例來說，3'LTR的U3元件可含有其促進子序列的缺失，例如TATA盒、Sp1和NF-κB位點。因此，將自我去活化3'LTR整合到宿主細胞基因體中的原病毒將包括去活化的5'LTR。任選地，來自慢病毒5'LTR的U3序列可以用病毒構築體中的啟動子序列替換。這可能會增加從包裝細胞株中回收的病毒滴度。還可以包括促進子序列。
標的病毒核酸庫的病毒基因體核酸可含有其他元件，其中這些元件可以有很大的變化。舉例來說，報導基因可以與內部啟動子處於功能性關係，例如螢光標記蛋白的基因。額外的基因元件可以與獨立的啟動子/促進子可操作地連接和控制。
在一些實施例中，標的病毒核酸庫的各個成員可包括效應子盒，例如，如下文和在2012年5月8日所申請的審查中的美國臨時專利申請號61/644,324中有更詳細的描述，其內容通過引用併入本文。術語「效應子」用於指可以影響另一分子或分子(例如標靶基因或標靶基因的產物)的轉錄、轉譯、表現，加工或功能的生物化學分子。效應子可以是全長蛋白質、蛋白質域、肽、單股或雙股去氧或核糖寡核苷酸、siRNA、小分子RNA、CRISPR RNA、核糖酵素、反義RNA、包括小RNA和非編碼RNA的調控RNA、或其模擬物或類似物。效應子盒包括至少一種效應子序列，其中效應子序列可以與啟動子可操作 地連接，例如，用於在包括效應子構築體的細胞中表現效應子序列。任選地，效應子盒可包括效應子特異性條碼，例如，以便於鑑定效應子序列。
可以使用任何方便的方法以產生本標的方法的實施例中使用的核酸庫。例如，標的核酸庫可以通過許多不同方法合成或酶促進(enzymatically)產生，並且合適的寡核苷酸和多核苷酸載體可以使用標準重組DNA技術純化，如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)中所述的技術純化，以及根據例如美國衛生部HHS，美國國立衛生研究院(NIH)重組DNA研究指南中所述的規定純化。
在一些實施例中，製備標的核酸庫包括在足以產生轉染質體的條件下將核酸庫的各個成員與包括載體域或載體序列的載體構築體組合，前述轉染質體在轉染包裝細胞後導致其產生含有標的核酸庫(作為包裹在病毒蛋白殼中的基因體核酸的一部分)的病毒顆粒。為了製備用於轉染的產物轉染質體，可以將標的核酸庫的各個成員插入載體核酸中，其中可以使用任何合適的方法進行。合適方法的實例包括但不限於：DNA連接酶介導的接合、重組酶介導的接合、使用In-Fusion® PCR方法(Clontech Laboratories,Mountain View,Calif.)、Gateway®選殖技術(Life Technologies,Carlsbad,Calif.)等。
接著可以將所得的產物轉染質體用於轉染合適的包裝細胞株以產生標的核酸庫病毒顆粒。包裝細胞株提供反式所需的病毒蛋白，用於將病毒基因體RNA包裝成病毒顆粒。包裝細胞株可以是能夠表現反轉錄病毒蛋白的任何細胞株，包括HEK293、HeLa、D17、MDCK、BHK、NIH3T3、CHO、CrFK和Cf2Th。在一些實施例中，標的病毒核酸庫的各個成員與病毒報導構築體一起使用，前述病毒報導構築體可以在組成型或條件(可調控的)啟動子的控制下包括一或多個報導基因。包裝細胞株可以穩定表現必需的病毒蛋白。前述包裝細胞株描述於，例如，美國專利號6,218,181。或者，可以用包括編碼必需病毒蛋白的核酸的質體暫時性轉染包裝細胞株。在另一實施例中，用二或多種質體共轉染不能穩定表現必需的病毒蛋白的包裝細胞株。一種質體包括病毒構築體，其為標的核酸庫的成員。其他質體包括編碼必需蛋白質的核酸，該必需蛋 白質使細胞產生能夠感染所欲感染的宿主細胞的功能性病毒。包裝細胞株可能不表現套膜基因產物。在這種情況下，包裝細胞株將病毒基因體包裝成缺乏套膜蛋白的顆粒。由於套膜蛋白部分地負責病毒顆粒的宿主範圍，所以病毒優選地是假型的。「假型」反轉錄病毒是具有套膜蛋白的反轉錄病毒顆粒，前述套膜蛋白來自RNA基因體來源的病毒以外的病毒。套膜蛋白可以來自不同的反轉錄病毒或非反轉錄病毒。一種套膜蛋白是水泡性口炎病毒G(VSV-G)蛋白。因此，包裝細胞株可以用質體轉染，該質體包括編碼膜相關蛋白的序列，例如VSV-G，其使得病毒能夠進入標靶細胞。本領域技術人員可以選擇合適的特定假型及/或更有效地用於所使用的標靶細胞。除了賦予特定宿主範圍之外，選擇的假型可以使病毒濃縮至非常高的滴度。或者，病毒可以用親嗜性(ecotropic)套膜蛋白假型化，前述套膜蛋白限制特定物種的感染。
本發明還提供了包括標的核酸庫的多種免疫細胞。在一實施例中，多個免疫細胞中的各個包括標的核酸庫的成員，例如，標的核酸庫的單個成員，其包括核酸，該核酸包括編碼單一獨特靶向序列的第一核酸，以及編碼TCR及/或CAR的第二核酸。在轉導條件下使多種免疫細胞與標的核酸庫接觸。
用標的病毒核酸庫轉導多個免疫細胞中的一或多種標靶細胞可以透過任何方便的方案完成，並且可以至少部分地取決於標靶細胞類型和所用的病毒載體。舉例來說，轉導可以包括解凍冷凍的標的病毒核酸庫，將細胞樣品懸浮在細胞培養基(例如，D-MEM)中，該細胞培養基可以補充有血清(例如，10% FBS)及/或轉導促進劑(例如，溴化己二甲銨(Polybrene®))。將核酸庫和細胞懸浮液組合在細胞培養盤中，並將培養盤置於37℃的CO2培養箱中一段合適的時間。在某些方面，將細胞培養1至24小時，例如4至16小時，例如8至12小時。
轉導條件可以優化以實現將標的核酸庫的單一成員的遞送和表現至指定的標靶細胞中。例如，在某些方面，透過使用足夠複雜的包裝病毒核酸庫並以合適的病毒感染劑量(MOI)進行轉導步驟，以實現用標的病毒核酸庫的單一成員轉導至任何指定標靶細胞。該病毒感染劑量為感染物(例如病毒顆粒)與標靶細胞(例如標靶免疫細胞)的比例。在一些實施例中，轉導以MOI 為1或更低、0.9或更低、0.8或更低、0.7或更低、0.6或更低、0.5或更低、0.4或更低、0.3或更低、0.2或更低、或0.1或更低的條件下進行。特別有趣的是轉導條件導致多個免疫細胞中的每一個含有標的病毒核酸庫的一個單一成員。在這樣的實施例中，各個免疫細胞包括核酸，其包括編碼單一獨特靶向序列的第一核酸(例如，單一獨特的引導RNA)，和編碼TCR及/或CAR的第二核酸。
在一些實施例中，使包括標的核酸庫的多個免疫細胞與編輯劑(editing agent)接觸。如本文所使用的，「編輯劑」是指基於標的核酸庫所包括的獨特靶向序列在內源基因座中引入插入及/或缺失的任何試劑。在一實施例中，編輯劑是CRISPR核酸酶多肽，或編碼CRISPR核酸酶的核酸。在標的核酸庫的第一和第二核酸位於同一個核酸上的實施例中，編輯劑可以是CRISPR核酸酶，或編碼CRISPR核酸酶的核酸。在實施例中，其中標的核酸庫的第一和第二核酸位於不同的核酸上，編輯劑可以是CRISPR相關系統。在這樣的實施例中，CRISPR相關系統包括標的核酸庫的第一核酸，例如CRISPR相關系統包括獨特的靶向序列。當多個免疫細胞包括標的核酸庫的成員並與編輯劑接觸時，多個免疫細胞中在內源基因座(如由獨特的靶向序列決定)中包括插入及/或缺失，以及外源TCR及/或CAR。這種多個經基因編輯的、經修飾的免疫細胞在本文中可稱為經基因修飾的TCR/CAR免疫細胞(例如T細胞)庫。
在一些實施例中，無論篩選方法是在體外還是在體內進行(如本文其他部分所述)，細胞均衍生自細胞株，例如T細胞株。在一些實施例中，細胞獲取自宿主生物體來源，例如但不限於，來自小鼠、大鼠、非人靈長類動物和豬。
L.篩選方法
本發明提供一種鑑定基因的方法(例如，用於篩選基因的方法)，該基因調節免疫細胞的功能(例如，當該基因下調時，導致免疫細胞或其前驅細胞的功能增強)。舉例來說，該基因可以但不限於通常用於抑制免疫細胞功能的基因，或者可以是通常用於增強免疫細胞功能的抑制劑的基因，或者可以是通常用於抑制免疫細胞功能的促進劑的基因。本發明還提供了鑑定調節免疫細胞記憶和持久性的基因的方法(例如，T細胞記憶和T細胞持久性)。在一實 施例中，本發明提供了鑑定基因的方法，該基因在下調時增強免疫細胞記憶及/或增強免疫細胞持久性。在一實施例中，本發明提供了鑑定基因的方法，該基因在下調時增強T細胞記憶及/或增強T細胞持久性。
在一些實施例中，本發明提供了鑑定調節免疫細胞功能的基因的方法(例如，當該基因下調時，導致包括外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的免疫細胞或其前驅細胞的功能增強)。當本文其他部分描述的任何內源基因下調時，可以導致包括外源TCR及/或CAR的免疫細胞的功能增強。鑑定方法包括向多個免疫細胞(例如T細胞群)引入本文其他部分描述的標的核酸庫。在一些實施例中，前述多個免疫細胞是經修飾以表現對抗原具有親和力的外源TCR及/或CAR的多個T細胞。在一些實施例中，多個經修飾的免疫細胞細胞是經修飾的T淋巴球(T細胞)、初級T細胞(TN)、記憶T細胞(例如，中樞記憶T細胞(TCM)、作用記憶細胞(effector memory cell，TEM))、自然殺手細胞(NK細胞)和巨噬細胞。在一實施例中，基因改造細胞是自體細胞。在這樣的實施例中，透過引入靶向多個內源基因的多種試劑(例如，基因編輯劑)進一步修飾多個經修飾的免疫細胞，從而產生多個經編輯的免疫細胞。
在一例示性實施例中，前述多個免疫細胞是由標的核酸庫修飾的多個T細胞，以表現對抗原具有親和力的外源TCR及/或CAR，並表現獨特的靶向序列(例如，獨特的引導RNA)。在這樣的實施例中，透過引入多個基因編輯劑(例如，CRISPR核酸酶)進一步修飾多個經修飾的免疫細胞，前述基因編輯劑導致獨特標靶序列靶向的內源基因的插入及/或缺失，從而產生多個經編輯的免疫細胞。經編輯的免疫細胞包括內源基因座(由獨特的靶向序列決定)中的插入及/或缺失以及外源TCR及/或CAR。
用於鑑定調節免疫細胞功能的基因的方法(例如，當該基因下調時，導致免疫細胞或其前驅細胞的功能增強)可以在體外或體內進行。在一實施例中，鑑定方法在體外進行。用於鑑定調節免疫細胞功能的基因的體外方法(例如，當該基因下調時，導致免疫細胞或其前驅細胞(例如，T細胞)功能增強)在示意性地顯示於圖2中。如圖所示，體外篩選方法包括使經基因編輯的、 經修飾的TCR/CAR免疫細胞庫(例如，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫)與標靶腫瘤細胞接觸。在這樣的實施例中，免疫細胞包括TCR/CAR而具有對標靶腫瘤細胞的親和力。舉例來說，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫包括表現對特異性抗原(例如PSCA CAR)具有親和力的TCR/CAR的T細胞，並且T細胞庫與表現該特異性抗原的標靶腫瘤細胞(例如，表現PSCA的標靶腫瘤細胞)接觸。使T細胞庫與標靶腫瘤細胞接觸的步驟代表「挑戰」，例如腫瘤細胞挑戰。每次挑戰都會產生富集的TCR/CAR T細胞庫。舉例來說，在第一次挑戰時，可以分離出第一個富集的TCR/CAR T細胞庫。在一或多個挑戰時，例如，二或多個挑戰、三或多個挑戰、四或多個挑戰、五或多個挑戰，可以分離出第二或多個、例如第三或多個，第四或多個、第五或多個、第六或多個富集的TCR/CAR T細胞庫。在連續挑戰後，最終富集的TCR/CAR T細胞庫可包括T細胞，其中內源基因已被編輯以賦予T細胞增強的功能(例如，T細胞持久性，T細胞功效)。
在一實施例中，鑑定方法在體內進行。用於鑑定調節免疫細胞功能的基因的體內方法(例如，當該基因下調時，導致免疫細胞或其前驅細胞(例如，T細胞)的功能增強)示意性地顯示於圖3A中。如圖所示，體內篩選方法包括將經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR免疫細胞庫(例如，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫)輸注到攜帶腫瘤的標靶模式生物中。舉例來說，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫包括表現對特異性抗原(例如PSCA CAR)具有親和力的TCR/CAR的T細胞，並且T細胞庫被輸注到攜帶腫瘤的生物體中，其中生物體具有表現特異性抗原的腫瘤(例如，表現PSCA的腫瘤)，接著從被輸注的攜帶腫瘤的生物體中分離出腫瘤浸潤淋巴球，從而導致TCR/CAR T細胞庫的富集。輸注步驟類似於本文所述的體外篩選方法的「挑戰」步驟。因此，在一些實施例中，可以連續進行多次輸注(「挑戰」)以進一步富集分離所得的TCR/CAR T細胞庫。
適用於本發明的體內篩選方法的模式生物包括但不限於小鼠、大鼠、非人靈長類動物和豬。合適的模式生物通常包括具有天然免疫細胞庫(例如，T細胞庫)的生物。在一些實施例中，其中鑑定方法在體內進行，經基因編 輯的、經修飾的TCR/CAR免疫細胞(例如，T細胞)庫由免疫細胞群(例如，T細胞)產生，該免疫細胞群是從作為輸注的受試者的同一個動物中所獲得。舉例來說，其中體內篩選方法包括將經標的基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫注入攜帶腫瘤的小鼠中，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫可以從小鼠T細胞群中產生。在一些實施例中，其中鑑定方法在體內進行，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR免疫細胞(例如，T細胞)庫由免疫細胞群(例如，T細胞)產生，該免疫細胞群是從作為輸注的受試者的不同動物中所獲得。舉例來說，其中體內篩選方法包括將經標的基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫注入攜帶腫瘤的小鼠中，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫可以從人類T細胞群中產生。技術人員將能夠容易地確定免疫細胞的適當來源和適當的輸注對象。
用於鑑定調節免疫細胞記憶及/或免疫細胞持久性的基因的體內方法(例如，當該基因下調時，導致T細胞記憶及/或T細胞持久性增強)示意性地顯示於圖3A中。如圖所示，體內篩選方法包括將經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR免疫細胞庫(例如，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫)輸注到攜帶腫瘤的標靶模式生物中。舉例來說，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫包括表現對特異性抗原(例如PSCA CAR)具有親和力的TCR/CAR的T細胞，並且T細胞庫被輸注到攜帶腫瘤的生物體中，其中生物體具有表現特異性抗原的腫瘤(例如，表現PSCA的腫瘤)。在一實施例中，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫將能夠將攜帶腫瘤的生物體中大部分腫瘤清除。在一實施例中，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫將能夠將攜帶腫瘤的生物體中的腫瘤完全清除。在一實施例中，經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫將能夠將攜帶腫瘤的生物體中的腫瘤清除至使用標準方法檢測不到的水平。一旦經基因編輯的、經修飾的TCR/CAR T細胞庫從攜帶腫瘤的器官清除腫瘤，進行腫瘤再接種以將腫瘤細胞重新引入已清除攜帶腫瘤的生物體中。再接種的腫瘤可以由記憶庫T細胞控制，然後從再接種的生物體中分離出腫瘤浸潤淋巴球，從而富集TCR/CAR T細胞庫。
一旦分離出富集的TCR/CAR免疫細胞庫(例如，富集的 TCR/CAR T細胞庫)，可以使用標準定序方法來鑑定調節免疫細胞功能、免疫細胞記憶及/或免疫細胞持久性(例如，T細胞功能、T細胞記憶及/或T細胞持久性)的基因。幾種DNA萃取和分析方法包括在本發明的方法中。如本文所使用的，「深度定序」表明該過程的深度比研究中的序列的長度大許多倍。深度定序包括在次世代定序方法中，包括但不限於單分子實時定序(Pacific Bio)、離子半導體(離子流定序)、焦磷酸根定序法(454)、合成定序(Illumina)、連接測序(SOLiD定序)和鏈終止(Sanger定序)。技術人員將能夠確定富集的TCR/CAR免疫細胞庫中被富集的標靶基因。
雖然已經參考本發明的特定實施例描述了本發明，但是本領域技術人員應該理解，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以進行各種改變並且可以替換等同物。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本文公開的實施例的範圍的情況下，可以使用合適的等同物進行本文所述方法的其他合適的修改和改變。另外，可以進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、過程、過程步驟或步驟適用本發明的目的、精神和範圍。所有這些修改都包括在權利要求的範圍內。現在已經詳細描述了某些實施例，透過參考以下實驗例將更清楚地理解前述實施例，前述實施例僅用以說明，而非對本發明的限制。
實施例
以下實施例為非限制性的，並且涉及透過使用單發第II型CRISPR系統產生T細胞基因剔除庫的組成物和方法。在一方面包括用於產生編碼T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)基因以及sgRNA庫的單發sgRNA庫的方法。在另一方面包括透過單發sgRNA庫並隨後電穿孔能夠改變內源基因表現的Cas9內切核酸酶來產生經修飾的T細胞。本發明還描述了透過在多個NSG腫瘤小鼠模型中用NY-ESO-1 TCR或PSCA CAR篩選兩個CRISPR/Cas9 T細胞庫來進行體外和體內全基因體篩選的方法。分離自處理小鼠的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的DNA的深度定序鑑定了一組經富集的gRNA，其靶向hsa-mir-4508、C1orf141、PAGR1、CEACAM19、MFSD5、SIX2、KLF4、USP27X、CCDC33和ZNF124的基因。在攝護腺癌(PC3-PASC)、胰腺癌(CaPan1) 或肺癌(A549)的NSG小鼠腫瘤模型中測試具有內源C1orf141、PAGR1、CEACAM19、SIX2、KLF4、USP27X或CCDC33下調的CAR-T或TCR-T細胞。不受任何理論束縛的，本發明發現PAGR1、SIX2和Klf4下調可以在體外和體內改善不同小鼠腫瘤模型中的T細胞功能。
材料和方法
初代人類淋巴球：如Human gene therapy 2011,22(12)：1575-1586中所述的，用塗佈有CD3和CD28刺激抗體(Life Technologies,Grand Island,NY,Catalog)的微珠刺激初代淋巴球。T細胞在第10天以1 x 108個細胞/小瓶的濃度冷凍保存在90%胎牛血清和10%二甲基亞碸(DMSO)的溶液中。
初代T細胞的繁殖：初代人類T細胞在補充有10% FCS、100-U/ml青黴素、100-g/ml硫酸鏈黴素、10-mM Hepes的RPMI 1640中培養，並用塗佈有抗-CD3/抗-CD28的磁珠以1：3細胞與珠子的比例刺激。每2天計數細胞並餵食一次，並且一旦T細胞休眠，其是透過降低的生長動力學和細胞大小確定的，將T細胞用於功能性測定或冷凍保存。
生成用於慢病毒轉導的PSCA CAR單發構築體：合成PSCA CAR並次選殖到人類GeCKO慢病毒sgRNA庫v2(lentiGuide-Puro)中。該庫被擴增並產生用於轉導T細胞的慢病毒載體。
使用單發CRISPR編輯CAR T細胞的基因：使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA試劑盒(Life Technologies,AM1345,Carlsbad,CA)體外轉錄Cas9 mRNA。使用HiScribeTM T7高產量RNA合成試劑盒轉錄gRNA。Cas9蛋白購自PNA Bio(CP01)。使用BTX830電穿孔儀對具有單發CAR或CAR T細胞的CRISPR試劑進行電穿孔。
簡言之，用OPTI-MEM將T細胞清洗三次，並以1~3 x 108個細胞/ml的終濃度重新懸浮於OPTI-MEM(Invitrogen)中。隨後，將0.1ml細胞與IVT RNA混合並在2mm光析管中進行電穿孔。使用BTX830(Harvard Apparatus BTX)在360V和1ms的條件下將20微克的Cas9 mRNA電穿孔到細胞中。電穿孔後，立即將細胞置於2ml預熱的培養基中，並在IL-2(100IU/ml)的存在下於37℃和5% CO2下培養。
流式細胞儀：使用以下具有指定的特異性和適當的同種型控制組的單株抗體和試劑。購自BD Biosciences(San Jose，CA)：APC綴合的抗CD3(555335)。使用CellQuest 3.3版(BD Biosciences，San Jose，CA)在FACS Accuri(BD Biosciences，San Jose，CA)上獲得數據，並透過FCS Express 3.00版(De Novo Software，Los Angeles，CA)或FlowJo 7.6.1版(Tree Star，Inc.Ashland，OR)進行分析。
小鼠異種移植研究：所有動物實驗方案均根據實驗動物照護及使用委員會批准和進行。如前所述進行研究並進行某些修改。簡言之，對於Nalm6腫瘤模型，在第0天透過尾靜脈向6至10週齡的NSG小鼠注射1x106個Nalm6腫瘤細胞。在腫瘤接種後第7天開始進行T細胞處理。T細胞以2 x 106個細胞/小鼠(2M)的劑量給藥。
實施例1：具有CRISPR庫的TCR或CAR-T細胞中的全基因體功能篩選
包括單發CRISPR系統的經基因修飾的TCR-或CAR-T細胞庫可用於體外或體內的全基因體功能篩選。使用如圖1A所示的構築體根據本發明的實施例製備經基因修飾的TCR-或CAR-T細胞CRISPR庫。以圖1B所示的方法進行該細胞庫的製備。以圖2所示進行體外全基因體篩選，並以圖3A和3B所示的方法，進行體內全基因體篩選。圖4A和4B顯示用照射的標靶腫瘤細胞體外刺激的CAR-T細胞庫對於CD19-導向的CAR-T細胞庫(圖4A)和PSCA導向的CAR-T細胞庫(圖4B)擴增倍數。圖5顯示了CD19-導向的CAR-T細胞庫和PSCA-導向的CAR-T細胞庫的功能分析。CD19-導向的CAR-T細胞庫的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)能夠消除Nalm6-GFP腫瘤細胞(圖5A)。PSCA-導向的CAR-T細胞庫的TIL能夠在與PC3-PSCA腫瘤細胞共培養後上調T細胞活化標記物CD137(圖5B)。
實施例2：具有CRISPR庫的CAR-T細胞中的全基因體功能篩選
CAR-T細胞庫經歷體內選擇。簡言之，透過將CAR-T細胞注射到攜帶PC3-PSCA腫瘤的小鼠體內以直接進行選擇。在CAR-T細胞輸注後14 天，收集腫瘤浸潤的CAR-T細胞(圖6)。
實施例3：深度定序和數據分析
透過將條碼和接頭序列併入PCR引子中來實現條碼DNA庫的製備。進行Miseq以鑑定各種引導RNA的富集。發現超過240個引導RNA顯示超過5次的相對富集，包括40個富集10次以上的引導RNA(圖7)。透過體內篩選鑑定的Top候選物包括Klf4、Bach和PTGIR，發現其顯示sgRNA富集50至100倍(圖8A和8B)。不受任何理論束縛，這些結果指出單發CRISPR系統是用於體內篩選CAR-T細胞負調節基因的有效且可靠的系統。
實施例4：鑑定不同腫瘤類型中的常見CAR-T細胞調節基因
為了進一步驗證候選物，在攜帶胰腺癌-CaPan1的天然PSCA抗原中進行另一個體內篩選，其與PC3-PSCA腫瘤相比具有相對較低的抗原表現。進行類似的篩選方法，並透過深度定序測量富集的sgRNA。前20個富集的候選者與先前的篩選沒有任何重疊(圖9)。
不受任何理論的束縛，這些差異可能是由於不同腫瘤類型之間的不同代謝途徑的偏好、抑制性分子譜及/或微環境。透過比較前100個候選物，發現兩個候選物在兩個篩選中高度富集：Klf4和PAGR1。在兩個篩選的前200個中找到了十個重疊的候選物。發現所有10個候選物在PC3-PSCA模型中富集50至100倍，且在CaPan1模型中甚至更高(圖10A和10B)。圖11顯示了top候選物的等級和倍數變化。
表2列出了兩個獨立實驗中的前10個富集的標靶基因。
Figure 108110802-A0305-02-0134-13
表3列出了腫瘤動物模型中選擇的候選標靶基因。
Figure 108110802-A0305-02-0135-14
實施例5：腫瘤模型中的候選物驗證
為了驗證腫瘤模型中的功能，在CAR-T細胞中獨立的剔除了六個潛在候選物，並在表現PSCA的PC3-PSCA和CaPan1腫瘤小鼠模型中進行了測試。在PAGR1、Klf4和SIX2 KO組別中觀察到加速的腫瘤清除(圖12A~12C)。當在PSCA低表現腫瘤模型中測試時，PAGR1和SIX2 KO增強了CAR-T細胞的功能(圖13A~13C)。為了測試這些候選物是否增強TCR-T細胞的功能，在A549-NY-ESO肺癌中用NY-ESO-1 TCR T細胞的進行了另一個驗證。PAGR1 KO NY-ESO-1 TCR-T細胞顯示出比野生型對應體更好的腫瘤控制(圖14A~14C)。
基於腫瘤模型中優異的腫瘤清除率，進一步研究了PAGR1、Klf4和SIX2。為了測試這些基因如何調控CAR-T細胞功能，在體外測試了基因剔除CAR-T細胞的功能。無論使用何種sgRNA，在所有三種基因剔除的CAR-T細胞中均觀察到顯著升高的去顆粒(圖15A和15B)。與野生型控制組相比，該觀察結果與剔除的CAR-T細胞的腫瘤細胞毒性提高一致(圖15C和15D)。當剔除時，三種候選物也增強了CAR-T細胞增生，其透過CSFE測定證實(圖15E)。在PC3-PSCA和CaPan1模型中進行了第二次驗證。PAGR1 KO在兩種模型中顯示出優異的腫瘤控制，且Klf4 KO在PC3-PSCA模型中顯示出增強的腫瘤控制(圖16A~16C和圖17A~17B)。
實施例6：PAGR1 KO增強CAR-T細胞腫瘤累積和抑制抵抗力
PAGR1和Klf4 KO均顯著增加PC3-PSCA腫瘤浸潤CART細胞的數量。進一步發現PAGR1 KO CAR-T細胞比野生型CAR-T細胞顯著浸潤(圖18A和18B)。本實施例顯示PAGR1 KO腫瘤浸潤的CAR-T細胞在體外表現出優異的腫瘤清除率(圖18C)。不受任何理論束縛，這些結果可能顯示PAGR1 KO賦予對CAR-T細胞的抑制的抵抗力。實際上，本實施例顯示腫瘤浸潤的PAGR1 KO CAR-T細胞比其他組別表現更少的抑制分子(圖18D~18G)。圖18H也顯示PAGR1 KO增強了腫瘤浸潤細胞的殺傷能力。
實施例7：PAGR1 KO透過組蛋白甲基化的表觀遺傳學調節減少細胞凋亡
與野生型CAR-T細胞相比，透過CD3/CD28珠子刺激或透過與標靶腫瘤細胞共培養的抗原暴露(圖19A和19B)，PAGR1 KO都顯著降低CAR-T細胞凋亡。據先前報導，PAGR1是組織蛋白甲基轉移酶複合體的組織蛋白-離胺酸-N-甲基轉移酶2D(KMT2D)的組分。PAGR1 KO表現出降低的H3K4單甲基化和二甲基化，這與B細胞淋巴瘤中KMT2D功能喪失的表型一致(圖20A)。在PAGR1 KO CAR-T細胞中觀察到由KMT2D調節的下游基因的表現降低(圖20B)。本實施例顯示細胞存活ARID1A和PRMT1啟動子的負調節子的H3K4單甲基化佔有率大大降低(圖20C)，而促存活因子(例如Bcl2和Myc)的RNA水平則上升(圖20D)。
實施例8：PAGR1 KO在同種模型中增強過繼性T細胞療法
為了測試這些候選物的下調是否會增強免疫活性模型中過繼性T細胞療法的功能，將PAGR1和Klf4 KO OT-I小鼠T細胞輸注到攜帶B16-OVA腫瘤的小鼠中。如透過腫瘤大小所證實的，PAGR1 KO相較於野生型控制組顯著增強了OT-1小鼠T細胞的功能(圖21)。
Figure 108110802-A0305-02-0136-15
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Figure 108110802-A0305-02-0139-19
實施例9：產生用於過繼性免疫療法的DNMT3A剔除CAR T細胞
實施例9~12描述了透過剔除DNMT3A基因產生用於過繼性免疫療法的抗衰竭T細胞的方法。篩選靶向DNMT3A的gRNA，然後使用CRISPR/Cas9和AAV介導的同源重組將GFP敲入DNMT3A基因座，其消除DNMT3A基因。由EGFP和位於gRNA標靶側翼的同源臂組成的供體DNA透過AAV感染引入T細胞中。CD19BBz CAR也透過慢病毒感染轉導到T細胞中。透過FACS分選以選擇具有GFP敲入的CD19BBz+T細胞並在體外擴增。當與癌細胞共培養時，這些細胞表現出細胞激素(IL2、INFγ和TNFα)的增加和去顆粒化。在癌細胞被反復刺激後，DNMT3A的剔除也增加了CD19BBz CAR T細胞的增生和抗腫瘤作用。
材料和方法
初代人類淋巴球： 透過使用RosetteSep試劑盒(Stem Cell Technologies，Vancouver BC，Canada)進行負向選擇，在白血球分離術後從健康志願者供體分離出初代人類CD4和CD8 T細胞。用抗CD3/CD28 Dynabead(Life Technologies，Grand Island，NY)刺激初代淋巴球。
CRISPR的設計和構築 ：如前所述透過PCR合成Cas9 DNA(Cong,L.等人(2013)Science 339,819-823；Slaymaker,I.M.等人(2016)Science 351,84-88))並選殖到RNA體外轉錄(IVT)載體、pD-A載體(Zhao,Y.等人(2010)Cancer Research 70,9053-9061)。使用基於網絡的CRISPR演算法(crispr.mit.edu and chopchop.rc.fas.harvard.edu)選擇gRNA。將所選擇的sgRNA選殖到MSGV載體中，在T7啟動子的控制下透過體外轉錄合成。經化學修飾的gRNA(S1、S2、S3和S4)由Synthego(Menlo Park，CA)製備。如(Ren,J.等人(2017)Clinical cancer research,23(9),2255-2266)所述產生並儲存體外轉錄的Cas9 mRNA和sgRNA。
慢病毒和AAV轉導： 在第0天用CD3/CD28 dynabead刺激T細胞，並在第1天用CD19BBz慢病毒進行轉導。在第4天進行gRNA電穿孔後3小時將AAV載體加入細胞中。
DNMT3A基因編輯和敲入的分析： 如前所述(Ren,J.等人(2017)Clinical cancer research,23(9),2255-2266)進行CRISPR/Cas9基因編輯。在進行 RNA電穿孔後2或3天從細胞中萃取基因體DNA。用於擴增基因體DNA片段和分析DNMT3A剔除效率的PCR引子列於表6中。TIDE(透過分解追蹤Indels)和ICE(CRISPR編輯推論)工具用於量化indel頻率。透過對DNMT3A DNA和PGK-EGFP-WPRE-BGH PolyA轉基因的接合進行定序來確認敲入。使用引子CTTCTGTCACTGTTCCGGGTTTTG(SEQ ID NO：67)和GCCACTCCCACTGTCCTTTCCTA(SEQ ID NO：68)進行PCR擴增5'端的敲入。使用引子CACAAGGGTAGCGGCGAAGATC(SEQ ID NO：69)和ACATGCCCAGAAGCGGTGGA(SEQ ID NO：70)進行PCR擴增3'端的敲入。
Figure 108110802-A0305-02-0141-20
構築體： 用MluI和PmlI切割PAAV6-MCS質體(Cell Biolabs，Inc)，並將2907bp片段作為骨架。透過IDT合成DNMT3A 5臂、WPRE-BGH PolyA和DNMT3A 3'臂的DNA片段。將DNMT3A gRNA 8-2、8-3和8-4(aaggcacccgctgggtcatgtggttcggagacgg)(SEQ ID NO：95)的標靶序列加到5'臂和3'臂的5'端。以PCR擴增PGK啟動子-EGFP。透過重疊PCR組裝DNMT3A 5'臂-PGK啟動子-EGFP-WPRE-BGH PolyA-DNMT3A 3'臂的片段，用MluI和PmlI切割，然後與PAAV6骨架連接。AAV載體由Genecopoeia(Rockville，MD) 產生。
快速T細胞擴增方案： 在第0天將10萬個T細胞與25百萬個經照射的同種異體周邊血液單核細胞在含有30ng/ml小鼠抗人類CD3單株抗體(Thermo Fisher Scientific 16-0037-85)的25ml R10培養基中混合。在第2天將300IU/ml介白素-2加入培養物中。在第5天用含有300IU/ml IL-2的新鮮培養基替換20ml的培養基。在第8天和第11天將細胞分離並用含有300IU/ml IL-2的新鮮培養基餵食，並在第14天冷凍保存。
流式細胞儀： 使用以下具有指定的特異性和適當的同種型控制組的單株抗體和試劑。購自BD Biosciences(San Jose，CA)：APC綴合的抗CD3(555335)、FITC-抗-CD8(555366)、PE-抗-CD8(555635)、PE-抗-CD107a(555801)、PECy7-抗-TNF(557647)及V450-抗-INFγ(560371)。購自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.(West Grove，PA)：生物素-SP AffiniPure山羊抗小鼠IgG(115-065-072)。購自Biolegend(San Diego，CA)：BV785-抗-CD45(304048)、AF700-抗-CD8a(300920)、AF647-抗-顆粒酶B(515406)和BV605-抗-IL-2(500332)。
對於細胞內之細胞激素的染色，首先使用LIVE/DEADTM可固定死亡細胞染色試劑盒(LIVE/DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit，Thermo Fisher Scientific)對細胞進行染色以排除死細胞。接下來，使用FIX & PERM細胞固定/透化試劑盒(Thermo Fisher Scientific)對細胞進行表面抗原染色、固定和透化，然後將細胞激素染色。數據在Fortessa(BD Biosciences，San Jose，CA)上獲得，並用FlowJo 7.6.1版(Tree Star,Inc.,Ashland,OR)分析。
連續殺傷側定： 在第1天，將10萬個T細胞與20萬個K562、K562-CD19、Raji或Nalm6細胞共培養。在第4天和第7天移除培養基並在新鮮培養基中加入20萬個腫瘤細胞。用LIVE/DEADTM Fixable Aqua(Invitrogen)、CD4和CD8以及Countbright絕對計數微珠(Invitrogen)染色，用於CD4細胞、CD8細胞和腫瘤細胞的計數。
實施例10：篩選靶向DNMT3A的gRNA
使用TIDE和ICE工具評估靶向DNMT3A外顯子7~15和19的 gRNA的剔除效率(表7~10)。進行DNMT3A的細胞內染色以確認所選擇的gRNA的剔除效率(圖22)。
Figure 108110802-A0305-02-0143-21
Figure 108110802-A0305-02-0143-22
Figure 108110802-A0305-02-0144-23
Figure 108110802-A0305-02-0144-24
Figure 108110802-A0305-02-0144-25
Figure 108110802-A0305-02-0145-26
實施例11：將GFP敲入CAR T細胞中的DNMT3A基因座
首先用CD19BBz慢病毒轉導T細胞，然後透過CRISPR/Cas9在DNMT3A基因座上使用gRNA 8.2和8.3進行基因編輯。攜帶DNMT3A同源臂和EGFP的AAV載體(圖23~24)用於感染T細胞，並用作同源導向修復的模板以敲入EGFP。在第10天進行FACS以檢測CD19BBz和EGFP的表現(圖25)。未轉導的細胞(NTD)不表現CD19BBz和EGFP。CD19BBz細胞僅被CD19BBz慢病毒轉導。69.2%的細胞表現CD19BBz，但其不表現EGFP。透過FACS分選這些CAR T細胞。對於由慢病毒和AAV(CD19BBz+KI)轉導的T細胞而言，77.77%的細胞表現CD19BBz，3.85%的細胞表現EGFP。透過FACS分選2.87%雙陽性細胞。使用快速T細胞擴增方案(REP)擴增NTD、分選的CD19BBz T細胞和分選的CD19BBz+EGFP+細胞。用REP方案擴增後，在CD19BBz組別中有95%的細胞表現CD19BBz，在CD19BBz+KI組別中有87.5%的細胞表現CD19BBz和EGFP(圖26)。透過PCR擴增DNMT3A DNA與轉基因之間的接合來檢測EGFP敲入DNMT3A gRNA標靶區(圖27)。
實施例12：DNMT3A的剔除增強了CD19BBz T細胞的功能
將NTD、CD19BBz和CD19BBz+KI T細胞與不表現CD19的K562癌細胞和表現CD19：K19(在K562細胞中強制表現CD19)、Nalm6和Raji的三種癌細胞株共培養。CD107a以顯著水平表現，顯示CD19BBz+KI細胞去顆粒增加(圖28)。在CD4和CD8 CD19BBz+KI細胞中以較高水平誘導INFγ和TNFα(圖29~30)。儘管IL-2在CD8細胞中以較低水平表現，但其在CD4 CD19BBz+KI細胞中以較高水平表現(圖31)。在第1天、第4天和第7天，腫瘤細胞反復挑戰T細胞，然後在第10天計數CD8 T細胞和腫瘤細胞的數量。當與CD19+腫瘤細胞共培養時，CD19BBz KI T細胞相較於CD19BBz T細胞的數量顯著較多(圖32)，指出DNMT3A的剔除增加了抗原刺激後的細胞增生。更重要的是，CD19BBz KI T細胞幾乎完全消除了Nalm6細胞，而CD19BBz T細胞在重複刺激後未能有效地控制Nalm6細胞(圖33)。
AAV載體的供體DNA遞送結合CRISPR/Cas9基因編輯技術成功地將EGFP敲入T細胞中的DNMT3A基因中。EGFP+敲入細胞可以在體外分選和擴增，並且它們對癌細胞的反應表現出細胞激素產生、增生和細胞毒性的增加。DNMT3A在T細胞耗竭發展中對於重新DNA甲基化是必需的。該方法產生具有更強抗腫瘤功能的DNMT3A剔除CAR T細胞。
其他實施例
本文中對變量的任何定義中的元件列表的敘述包括將該變量定義為所列元件的任何單個元件或組合(或子組合)。本文對實施例的描述包括作為任何單個實施例的該實施例或者與任何其他實施例或其部分的組合。
本文中各專利、專利申請案、以及引用的公開文獻，其全部內容皆藉由引用而納為本文揭露之一部。本發明雖已參照前述實施例方式進行揭露，但對於其他本發明所屬技術領域具有通常知識者來說，仍可設計出未脫離本發明精神與範疇的其他實施例與變形，至為灼然。後附之申請專利範圍之解釋應包含所有此種實施例及其等效變更。
<110> 賓夕法尼亞大學董事會THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA
<120> 增強功能之經修飾免疫細胞及其篩選方法
<130> 046483-7202TW1(01863)
<140> TW108110802
<141> 2019-03-27
<150> US 62/648,722
<151> 2018-03-27
<160> 165
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NY-ESO157-165
<400> 1
Figure 108110802-A0305-02-0147-27
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> 重複
<222> (1)..(5)
<223> 重複n次，其中n至少為1
<400> 2
Figure 108110802-A0305-02-0148-28
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> 重複
<222> (1)..(4)
<223> 重複n次，其中n至少為1
<400> 3
Figure 108110802-A0305-02-0148-29
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> 重複
<222> (1)..(5)
<223> 重複n次，其中n至少為1
<400> 4
Figure 108110802-A0305-02-0148-30
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 5
Figure 108110802-A0305-02-0149-31
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 6
Figure 108110802-A0305-02-0149-32
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 7
Figure 108110802-A0305-02-0149-33
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 8
Figure 108110802-A0305-02-0150-34
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 9
Figure 108110802-A0305-02-0150-35
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 10
Figure 108110802-A0305-02-0150-37
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 11
Figure 108110802-A0305-02-0150-36
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 12
Figure 108110802-A0305-02-0151-41
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 13
Figure 108110802-A0305-02-0151-40
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 14
Figure 108110802-A0305-02-0151-39
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 15
Figure 108110802-A0305-02-0151-38
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 16
Figure 108110802-A0305-02-0152-42
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 17
Figure 108110802-A0305-02-0152-43
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 18
Figure 108110802-A0305-02-0152-44
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 19
Figure 108110802-A0305-02-0153-48
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 20
Figure 108110802-A0305-02-0153-47
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 21
Figure 108110802-A0305-02-0153-46
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 22
Figure 108110802-A0305-02-0153-45
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 23
Figure 108110802-A0305-02-0154-49
<210> 24
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 24
Figure 108110802-A0305-02-0154-50
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 絞鏈
<400> 25
Figure 108110802-A0305-02-0154-51
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 26
Figure 108110802-A0305-02-0155-53
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 27
Figure 108110802-A0305-02-0155-52
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Arg或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Arg或Lys
<400> 28
Figure 108110802-A0305-02-0156-54
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸
<400> 29
Figure 108110802-A0305-02-0156-55
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> furin切割位
<400> 30
Figure 108110802-A0305-02-0156-56
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
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<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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Figure 108110802-A0305-02-0157-61
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 50
Figure 108110802-A0305-02-0161-87
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 51
Figure 108110802-A0305-02-0161-88
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 52
Figure 108110802-A0305-02-0162-89
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 53
Figure 108110802-A0305-02-0162-90
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 54
Figure 108110802-A0305-02-0162-91
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 55
Figure 108110802-A0305-02-0162-92
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 56
Figure 108110802-A0305-02-0163-93
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 57
Figure 108110802-A0305-02-0163-94
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 58
Figure 108110802-A0305-02-0163-95
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 59
Figure 108110802-A0305-02-0163-96
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 60
Figure 108110802-A0305-02-0164-97
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 61
Figure 108110802-A0305-02-0164-98
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 62
Figure 108110802-A0305-02-0164-99
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 63
Figure 108110802-A0305-02-0164-100
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 64
Figure 108110802-A0305-02-0165-101
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 65
Figure 108110802-A0305-02-0165-102
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 66
Figure 108110802-A0305-02-0165-103
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 67
Figure 108110802-A0305-02-0165-104
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 68
Figure 108110802-A0305-02-0166-105
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 69
Figure 108110802-A0305-02-0166-106
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 70
Figure 108110802-A0305-02-0166-107
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 71
Figure 108110802-A0305-02-0166-108
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 72
Figure 108110802-A0305-02-0167-109
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 73
Figure 108110802-A0305-02-0167-110
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 74
Figure 108110802-A0305-02-0167-111
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 75
Figure 108110802-A0305-02-0167-112
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 76
Figure 108110802-A0305-02-0167-113
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 77
Figure 108110802-A0305-02-0168-114
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 78
Figure 108110802-A0305-02-0168-115
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 79
Figure 108110802-A0305-02-0168-116
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 80
Figure 108110802-A0305-02-0168-117
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 81
Figure 108110802-A0305-02-0169-118
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 82
Figure 108110802-A0305-02-0169-119
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 83
Figure 108110802-A0305-02-0169-120
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 84
Figure 108110802-A0305-02-0169-121
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 85
Figure 108110802-A0305-02-0170-122
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 86
Figure 108110802-A0305-02-0170-124
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 87
Figure 108110802-A0305-02-0170-125
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 88
Figure 108110802-A0305-02-0170-126
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 89
Figure 108110802-A0305-02-0171-127
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 90
Figure 108110802-A0305-02-0171-128
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 91
Figure 108110802-A0305-02-0171-129
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 92
Figure 108110802-A0305-02-0171-130
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 93
Figure 108110802-A0305-02-0172-132
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 94
Figure 108110802-A0305-02-0172-133
<210> 95
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 95
Figure 108110802-A0305-02-0172-134
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 96
Figure 108110802-A0305-02-0172-135
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 97
Figure 108110802-A0305-02-0173-136
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 98
Figure 108110802-A0305-02-0173-137
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 99
Figure 108110802-A0305-02-0173-138
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 100
Figure 108110802-A0305-02-0173-139
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 101
Figure 108110802-A0305-02-0173-140
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 102
Figure 108110802-A0305-02-0174-141
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> gRNA
<400> 103
Figure 108110802-A0305-02-0174-142
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> gRNA
<400> 104
Figure 108110802-A0305-02-0174-143
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 105
Figure 108110802-A0305-02-0174-145
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> gRNA
<400> 106
Figure 108110802-A0305-02-0175-146
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 107
Figure 108110802-A0305-02-0175-147
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> gRNA
<400> 108
Figure 108110802-A0305-02-0175-148
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> gRNA
<400> 109
Figure 108110802-A0305-02-0175-149
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 110
Figure 108110802-A0305-02-0176-150
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 111
Figure 108110802-A0305-02-0176-151
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> gRNA
<400> 112
Figure 108110802-A0305-02-0176-152
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 113
Figure 108110802-A0305-02-0176-153
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
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<400> 114
Figure 108110802-A0305-02-0177-154
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
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<400> 115
Figure 108110802-A0305-02-0177-155
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 116
Figure 108110802-A0305-02-0177-156
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<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 117
Figure 108110802-A0305-02-0177-157
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 118
Figure 108110802-A0305-02-0178-158
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> gRNA
<400> 119
Figure 108110802-A0305-02-0178-159
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 120
Figure 108110802-A0305-02-0178-160
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 121
Figure 108110802-A0305-02-0178-161
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 122
Figure 108110802-A0305-02-0179-162
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 123
Figure 108110802-A0305-02-0179-163
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
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<223> gRNA
<400> 124
Figure 108110802-A0305-02-0179-164
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 125
Figure 108110802-A0305-02-0179-165
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 126
Figure 108110802-A0305-02-0179-166
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 127
Figure 108110802-A0305-02-0180-167
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 128
Figure 108110802-A0305-02-0180-168
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> gRNA
<400> 129
Figure 108110802-A0305-02-0180-169
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 130
Figure 108110802-A0305-02-0180-170
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 131
Figure 108110802-A0305-02-0181-176
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 132
Figure 108110802-A0305-02-0181-173
<210> 133
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 133
Figure 108110802-A0305-02-0181-174
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 134
Figure 108110802-A0305-02-0181-175
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 135
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Claims (19)

  1. 一種經修飾的免疫細胞，包括：(a)在編碼內源PAXIP1相關麩胺酸富集蛋白1(PAXIP1 Associated Glutamate Rich Protein 1，PAGR1)、SIX同源匣2(SIX Homeobox 2，SIX2)或Kruppel樣因子4(Kruppel Like Factor 4，KLF4)之基因座中的插入及/或缺失，其中該插入及/或缺失能夠下調內源PAGR1、SIX2或KLF4的基因表現；以及(b)外源T細胞受體(exogenous T cell receptor，TCR)及/或嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，其對標靶細胞上的抗原具有親和力。
  2. 如請求項1所述之經修飾的免疫細胞，其中(a)該基因座中的該插入及/或缺失是由CRISPR相關系統所介導；及/或(b)該基因座中的該插入及/或缺失是由CRISPR/Cas9所介導。
  3. 如請求項1所述之經修飾的免疫細胞，其中下調基因表現導致PAGR1相關組織蛋白甲基轉移酶複合體、SIX2或KLF4下游的一或多種標靶之下調的基因表現。
  4. 如請求項3所述之經修飾的免疫細胞，其中該PAGR1相關組織蛋白甲基轉移酶複合體下游的一或多種標靶是選自於ARID1A、ARID3B、ASXL1、DNMT3A、DUSP1、MAP3K8、PAXIP1、PRMT1、SOCS3及TNFAIP3所組成的群組。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中：(a)該外源TCR是選自於野生型TCR、高親和力TCR及嵌合TCR所組成的群組；(b)該外源TCR包括至少一個雙硫鍵；及/或(c)該外源TCR包括TCR α鏈及TCR β鏈。
  6. 如請求項1至4中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該外源CAR包括抗原結合域、跨膜域及胞內域。
  7. 如請求項6中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中：(a)該抗原結合域是選自於抗體、scFv或Fab所組成的群組； (b)該跨膜域是選自於人工疏水序列和第I型跨膜蛋白的跨膜域、T細胞受體的α、β或zeta鏈、CD28、CD3ε(CD3 epsilon)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154所組成的群組；(c)該胞內域包括至少一個共刺激域，該共刺激域是選自於TNFR超家族中蛋白質的共刺激域、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C及B7-H3所組成的群組；及/或(d)該胞內域包括選自於人類CD3 zeta鏈的細胞質訊息傳遞域、FcγRIII、FcsRI、Fc受體的細胞質尾、免疫受體酪胺酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的細胞質受體、TCR zeta，FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d所組成的群組的該胞內域。
  8. 如請求項6所述之經修飾的免疫細胞，更包括鉸鏈域，其中該鉸鏈域是選自於抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈域、包括CD8胺基酸序列的鉸鏈或其任意組合所組成的群組。
  9. 如請求項1至4中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中：(a)標靶細胞上的該抗原是腫瘤相關抗原(TAA)，或(b)該經修飾的細胞是(i)自體細胞，(ii)衍生自人類，及/或(iii)經修飾的T細胞。
  10. 一種產生如請求項1所述之經修飾的免疫細胞的方法，該方法包括：(a)將一第一核酸引入免疫細胞中，該第一核酸包括編碼對標靶細胞上的一抗原具有親和力之外源T細胞受體(TCR)及/或嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列；以及(b)將一或多種多肽及/或核酸引入該免疫細胞中，該一或多種多肽及/或核酸能夠下調一內源PAGR1、SIX2或KLF4的基因表現。
  11. 如請求項10所述之方法，其中該一或多種能夠下調基因表現的多肽及/或核酸包括一CRISPR相關系統。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該CRISPR相關系統包括一CRISPR核酸酶及一引導RNA(guide RNA)。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該引導RNA包括一引導序列，該引導序列與一內源基因的一標靶序列充分地互補，及/或該CRISPR核酸酶及該引導RNA包括一核糖核蛋白(RNP)複合體。
  14. 如請求項11所述之方法，其中該標靶序列係位在：(a)PAGR1基因內，且包括SEQ ID NO：31至36中任一者所示的核酸序列；(b)SIX2基因內，且其中該引導RNA包括SEQ ID NO：37至42中任一者所示的核酸序列；或(c)KLF4基因內，且其中該引導RNA包括SEQ ID NO：43至48中任一者所示的核酸序列。
  15. 如請求項11所述之方法，其中該引導RNA包括SEQ ID NO：31至66中任一者所示的核酸序列。
  16. 如請求項11所述之方法，其中該CRISPR核酸酶及/或該引導RNA係編碼多核苷酸。
  17. 如請求項10所述之方法，其中相對於該免疫細胞的功能，該經修飾的免疫細胞的功能被增強。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該功能是腫瘤浸潤、腫瘤殺傷、對免疫抑制的抵抗力或對PD-1、LAG-3、TIM-3及/或CTLA-4的免疫抑制的抵抗力。
  19. 如請求項10所述之方法，其中該經修飾的免疫細胞的經活化誘導之細胞死亡被抑制。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10526598B2 (en) * 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
WO2021064655A1 (en) * 2019-10-02 2021-04-08 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput genetic screening
CN114929867A (zh) * 2020-01-21 2022-08-19 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种经修饰的免疫效应细胞及其用途
EP4127188A4 (en) * 2020-03-31 2024-08-21 Walking Fish Therapeutics MODIFIED B CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
GB202005184D0 (en) * 2020-04-08 2020-05-20 Autolus Ltd Method
CN111537735A (zh) * 2020-05-15 2020-08-14 江西赛基生物技术有限公司 抗体检测试剂盒以及在免疫分析方面的应用
WO2022046760A2 (en) * 2020-08-25 2022-03-03 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
CN114107291B (zh) * 2020-08-27 2024-05-03 苏州因特药物研发有限公司 一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法
CN112111014A (zh) * 2020-09-22 2020-12-22 廖文强 一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞
EP4251741A1 (en) 2020-11-30 2023-10-04 CRISPR Therapeutics AG Gene-edited natural killer cells
WO2022125982A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing mhc class ii in a cell
CA3206284A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing hla-a in a cell
JP2024501246A (ja) 2020-12-23 2024-01-11 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞中のｃｉｉｔａを遺伝子修飾するための組成物及び方法
IL304069A (en) 2020-12-30 2023-08-01 Intellia Therapeutics Inc Engineered T cells
CA3209779A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
JP2024506016A (ja) 2021-02-08 2024-02-08 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫療法のためのｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ｔｉｍ３）組成物及び方法
WO2022170194A2 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Lymphocyte activation gene 3 (lag3) compositions and methods for immunotherapy
WO2022170172A1 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Natural killer cell receptor 2b4 compositions and methods for immunotherapy
KR20240038000A (ko) * 2021-07-08 2024-03-22 메딕 라이프 사이언시스 인코포레이티드 신규 약물 및 약물 표적 식별을 위한 고처리량 스크리닝 시스템
CN117940153A (zh) 2021-08-24 2024-04-26 因特利亚治疗公司 用于基于细胞的疗法的程序性细胞死亡蛋白1(pd1)组合物和方法
CN113980965B (zh) * 2021-09-30 2024-05-14 南京凯玛生物科技有限公司 一种双功能表达载体及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞
EP4426338A2 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd38 compositions and methods for immunotherapy
CN116904514A (zh) * 2022-04-18 2023-10-20 玥特农生物科技河北有限责任公司 用双aav载体同步定点基因编辑制备car-t细胞的方法
TW202409271A (zh) 2022-06-16 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中之ｍｈｃ １類之組成物及方法
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2024059787A1 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Disruption of asxl1 in t cells to enhance immunotherapy
WO2024078570A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 Peking University Modified immune cells and uses thereof
CN115725693B (zh) * 2022-10-31 2024-02-13 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种模拟cfDNA甲基化标准品的制备方法及其应用
WO2024186971A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Intellia Therapeutics, Inc. Cish compositions and methods for immunotherapy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017069958A2 (en) * 2015-10-09 2017-04-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110311494A1 (en) * 2009-02-26 2011-12-22 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Methods of reprogramming renal cells
WO2014066137A1 (en) 2012-10-22 2014-05-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for enhancing cancer immunotherapy
SI2986729T1 (sl) * 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
DK3004337T3 (da) * 2013-05-29 2017-11-13 Cellectis Fremgangsmåde til konstruktion af T-celler til immunoterapi ved brug af RNA-guidet Cas nuklease-system
CN104195137A (zh) * 2014-08-11 2014-12-10 徐州医学院 抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法
AU2015339743C1 (en) * 2014-10-31 2021-04-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Altering gene expression in modified T cells and uses thereof
KR20170094165A (ko) * 2014-12-23 2017-08-17 제넨테크, 인크. 화학요법-내성 암을 치료 및 진단하는 조성물 및 방법
CN109072200A (zh) * 2015-12-23 2018-12-21 莫纳什大学 细胞重编程
US20200283743A1 (en) 2016-08-17 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP3510145A4 (en) * 2016-09-06 2020-03-25 The Children's Medical Center Corporation IMMUNCELLS FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS
WO2018049025A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017069958A2 (en) * 2015-10-09 2017-04-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets

Also Published As

Publication number Publication date
CN118325839A (zh) 2024-07-12
US11920130B2 (en) 2024-03-05
US20190345491A1 (en) 2019-11-14
EP3775229A1 (en) 2021-02-17
US11447769B2 (en) 2022-09-20
CN112204148B (zh) 2024-04-30
US20230032532A1 (en) 2023-02-02
EP3775229A4 (en) 2021-12-15
CN118325840A (zh) 2024-07-12
TW202003845A (zh) 2020-01-16
WO2019191114A1 (en) 2019-10-03
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