KR20240038000A - 신규 약물 및 약물 표적 식별을 위한 고처리량 스크리닝 시스템 - Google Patents

신규 약물 및 약물 표적 식별을 위한 고처리량 스크리닝 시스템 Download PDF

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KR20240038000A
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규호 한
홍-표 이
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메딕 라이프 사이언시스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 신규 약물 및 약물 표적을 식별하기 위한 고처리량 스크리닝 시스템 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 면역-가교 단백질, 가이드 RNA 라이브러리, 및/또는 3D 종양 모델을 사용하여 표적 세포의 동종 쌍 및 면역 세포 간의 상호작용을 대규모로 분석할 수 있다.

Description

신규 약물 및 약물 표적 식별을 위한 고처리량 스크리닝 시스템
1. 관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 7월 8일에 출원된, 미국 가출원 제 63/219,665 호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 여기에 포함된다.
2. 발명의 배경
면역요법은 암 치료를 위한 강력한 치료 접근법이다. 그러나, 관문 차단 면역요법은 많은 환자, 특히 고형 종양 환자에게 효과가 없기 때문에 적용이 제한적이었다. 변경된 신호 전달 경로, 면역-억제 종양 미세 환경, 및 종양 미세 환경에 대한 효과적인 T 세포의 침투 불량을 포함하는, 여러 내인성 및 외인성 요인이 내성에 기여하는 것으로 제안되었다. 연구자들은 암 환자의 약물 반응 기전 및 임상 결과를 연구하고, 기존 면역 요법에 반응이 없거나 반응이 낮은 환자를 위한 새로운 치료법을 개발함으로써 한계를 극복하기 위해 노력해왔다. 그러나, 전통적으로 약물 반응 및 면역 인식을 스크리닝하는 데 사용되는 세포-기반 분석 시스템은 다양한 암 및/또는 면역 이펙터 세포 유형에 보편적으로 적용할 수 없기 때문에 해당 분야의 연구가 어려웠다. 전통적인 고처리량 스크리닝 시스템은 유전적으로 동일한, 동계 마우스 모델로 준비된 면역 세포 및 암 모델이 필요하기 때문에 대규모 연구에 적합하지 않다. 더욱이, 2차원 (2D) 세포 배양은 세포 및 세포외 환경 사이의 상호작용의 교란 및 세포 형태, 극성, 및 분열 방법의 변화를 유도하기 때문에, 2D 세포 배양의 사용은 종양 미세환경을 재현하지 못했다.
따라서, 신규 약물 표적을 식별하고 보다 효과적인 약물을 개발하기 위해서는 더 나은 고처리량 분석 시스템이 필요하다.
3. 발명의 요약
본 개시는 신규 약물 표적의 식별 및 암 또는 면역 질병의 치료용 약물의 개발을 위한 세포-기반 고처리량 스크리닝 시스템을 제공한다.
여기서 제공된 분석 시스템은 1) T 세포 및 NK 세포와 같은 특정 면역 이펙터 세포를 모집하고 활성화할 수 있는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 단일-사슬 가변 단편 (scFv))를 포함하는 면역-가교 단백질, 및/또는 2) RNA-가이드 뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR)를 사용하는 고처리량 스크리닝 플랫폼을 활용한다.
상기 면역-가교 단백질은 T 세포의 CD3 또는 NK 세포의 NKp46과 같은, 면역 세포 마커에 결합하는 scFV 분자를 함유하는 인공 단백질이다. 따라서, 상기 면역-가교 단백질은 면역 이펙터 세포와 특이적으로 상호작용을 할 수 있다. 출원인은 암세포에서 발현된 상기 면역-가교 단백질이 면역 이펙터 단백질을 모집하고 활성화하여, 상기 암세포의 표적화된 사멸을 유도할 수 있음을 입증하였다. 상기 면역-가교 단백질 및 상기 면역 세포 마커 사이의 상호작용은 이들의 출처와 관계없이 면역 세포 및 암세포 사이의 특이적이고 선택적인 상호작용을 재현할 수 있게 해준다. 따라서, 암세포에서 발현된 상기 면역-가교 단백질은 상기 암세포에 대한 면역 이펙터 세포의 활성화를 유도하고 상기 활성화된 면역 이펙터 세포에 대한 암세포의 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 상기 시스템은 상기 활성화된 면역 이펙터 세포에 대한 암세포의 반응 조절에 관여하여, 면역-종양 기능에 관여하는, 약물 및/또는 유전자의 고처리량 스크리닝에 사용될 수 있다.
출원인은 마이크로캡슐-기반 구획화 기술을 사용하여 상기 고처리량 시크리닝 시스템을 3D 종양 배양 시스템과 추가로 결합했다. 이는 다른 샘플과 혼선 없이 단일 조직-배양 용기에서 복수 암 샘플의 3D 성장을 허용하였다. 상기 종양 샘플의 바코드화는 복수 샘플의 다중화 및 역다중화를 허용하는 동시에 이들의 신원을 추적하게 한다. 이전에는, 대규모 3D 배양이 기술적으로 까다롭고, 힘들며 시간이 많이 걸렸다. 따라서, 3D 배양의 사용은 전통적인 2D 암 모델보다 환자 종양의 더 나은 재현을 제공할 것으로 예상되지만 고처리량 스크리닝에서 제한되어 왔다. 본 개시는 상기 한계를 극복하고 각 암 샘플에 바코드가 부착된, 다중 종양 샘플의 동시 배양 및 분석이 가능한 마이크로캡슐-기반 3D 배양 시스템을 채택하였다.
3D 배양 시스템에서, 암세포는 마이크로캡슐에 캡슐화되어, 구형 종양으로 성장할 수 있다. 개별 마이크로캡슐 집단에 캡슐화된 여러 암 샘플을 모아서 단일 조직-배양 용기에서 배양할 수 있다. 배양 후, 상기 종양 샘플을 마이크로캡슐에서 수집하고 이의 게놈 DNA를 추출하고 분석하여, 예를 들어, DNA 바코드, CRISPR 시스템의 경우 sg RNA 서열을 서열분석하는 등에 의해, 배양물에 남아있는 암세포를 특성화할 수 있다. 이 시스템은 전통적인 시스템의 확장성 한계를 근본적으로 해결하고 시간이 많이 걸리고 힘든 과정을 대폭 단순화하여 3D 종양에서 약물 시험 및 CRISPR 기능 유전체학을 가능하게 한다.
따라서, 본 개시는 a. 면역 세포 마커에 대한 scFv, b. 막횡단 도메인, c. 세포질 도메인, 및 d. 리포터 도메인으로서, 선택적으로 상기 리포터 도메인은 형광 단백질인, 리포터 도메인:을 N 말단에서 C 말단까지 포함하는 면역-가교 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포 마커는 T 세포 또는 NK 세포의 세포 표면 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포 마커는 CD3이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포 마커는 NKp46이다. 일부 구현예에서, 상기 막횡단 도메인은 B7의 막횡단 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 세포질 도메인은 B7의 세포질 도메인이다.
일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 상기 면역-가교 단백질의 세포내 또는 세포외 부분에 면역염색을 위한 에피토프를 추가로 포함하며, 선택적으로 상기 에피토프는 HA 에피토프 및 V5 에피토프로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 상기 면역-가교 단백질의 N-말단에 신호 펩티드, 선택적으로 H7 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 상기 면역-가교 단백질의 세포외 부분에 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3 영역을 추가로 포함한다.
본 개시는 또한 여기서 기술된 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 면역-가교 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한 여기서 기술된 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역-가교 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일 측면에서, 본 개시는 복수의 표적화-라이브러리 구조물을 포함하는 표적화 라이브러리를 제공하며, 여기서 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 복수의 게놈 표적 부위 중 하나를 표적으로 하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 바코드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 10,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 15,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 20,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 50,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 100,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 상기 sgRNA-코딩 서열 및 상기 바코드 서열의 고유한 쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 메가뉴클레아제 (MN)이다.
일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 CAS9이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 렌티바이러스 벡터이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 세포 집단을 제공하며, 상기 집단 내에 적어도 복수의 세포가 여기서 기술된 표적화-라이브러리 구조물을 포함하고, 상기 세포 집단은 복수 유형의 표적화-라이브러리 구조물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 본 개시의 상기 면역-가교 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 본 개시의 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드 또는 상기 면역-가교 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 암세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 암세포주이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 복수 세포주를 포함하고, 여기서 각각의 세포주는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 세포주-특이적 바코드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 원발성 암세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 한 명 이상의 암 환자로부터의 원발성 암세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 복수의 암 환자로부터의 원발성 암세포를 포함하고, 여기서 단일 암 환자로부터의 세포는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 환자-특이적 바코드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 고형 종양 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 본 개시의 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드, 상기 면역-가교 벡터, 또는 상기 표적화 라이브러리로 형질감염되었다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 여기서 제공된 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드 또는 상기 면역-가교 벡터, 및 상기 표적화 라이브러리로 형질감염되었다.
일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 마커 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 마커 단백질은 루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 외인성 엔도뉴클레아제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 메가뉴클레아제 (MN)이다. 일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 CAS9이다. 일부 구현예에서, 상기 집단 내에 적어도 복수의 세포가 여기서 기술된 상기 면역-가교 단백질을 포함한다.
본 개시의 일 측면은 본 개시의 상기 세포 집단을 캡슐화하는 마이크로캡슐 풀을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 동일한 바코드 서열을 포함하는 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 동일한 바코드 서열은 세포주-특이적 바코드 또는 환자 특이적 바코드의 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 동일한 대상체로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 동일한 암 환자로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 단일 세포주로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다.
일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2개 이상의 상이한 바코드 서열을 포함하는 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 2개 이상의 상이한 바코드 서열은 세포주-특이적 바코드 또는 환자 특이적 바코드의 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2명 이상의 대상체로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2명 이상의 암 환자로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2개 이상의 세포주로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다.
일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 풀은, 면역 세포를 추가로 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 수지상 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 대식세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 풀은 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 3D 종양 오가노이드를 형성한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 a. 본 개시의 상기 세포 집단을 배양하거나 상기 마이크로캡슐 풀을 배양하는 단계; 및 b. 상기 배양물에서 얻은 세포를 분석하는 단계:의 단계를 포함하는, 고처리량 스크리닝 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 분석 단계는 상기 배양물로부터 얻은 세포의 표적화-라이브러리 구조물을 서열분석하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분석 단계는 상기 표적화-라이브러리 구조물에서 바코드 서열을 서열분석하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분석 단계는 상기 표적화-라이브러리 구조물에서 sgRNA의 코딩 서열을 서열 분석하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 면역 세포의 존재 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포의 부존재 하에 상이한 세포 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 면역-종양 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포의 존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포 및 면역 세포의 부존재 하에 상기 배양물로부터의 세포를 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 면역-종양 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 수지상 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 대식세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 하나 이상의 약물의 존재 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 면역 세포의 존재 하에 추가로 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 약물의 부존재 하에 상이한 세포 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 약물의 존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포 및 하나 이상의 약물의 부존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 약물을 식별하여 효과적인 약물을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 약물 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포의 부존재 하에 상이한 세포 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포의 존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포 및 면역 세포의 부존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 약물을 식별하여 효과적인 약물을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 약물 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 배양 단계는 배양 접시 또는 멀티-웰 플레이트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양 단계는 복수의 마이크로캡슐에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양 단계는 3D 종양 오가노이드에서 수행된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 여기서 제공되는 a. 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 면역-가교 벡터, 및 b. 상기 표적화 라이브러리:를 포함하는 고처리량 스크리닝용 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 외인성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레아제 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 외인성 뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 및 메가뉴클레아제 (MN)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 외인성 뉴클레아제는 CAS9이다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 마커 단백질을 코딩하는 마커 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 마커 단백질은 루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레아제 폴리뉴클레오티드 또는 상기 마커 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 선택적으로 렌티바이러스 벡터이다.
4. 도면의 여러 관점에 대한 간략한 설명
본 개시의 이들 및 기타 특징, 측면, 및 이점은 다음의 설명, 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 실시예 1에 기술된 바와 같이 면역-가교 단백질 (pMED178, pMED179, pMED200, 및 pMED201)을 생성하기 위한 구조물의 구조를 제공한다.
도 2a 및 2b는 OVA 또는 HA 항원을 사용하여 면역 조절제를 식별하기 위한 전통적인 고처리량 시스템 (도 2a) 및 면역-가교 단백질을 사용하는 신규 시스템 (도 2b)을 비교한다.
도 3은 실시예 2에 기술된 바와 같이 면역-가교 단백질을 사용하는 고처리량 CRISPR 스크리닝 절차를 도시한다.
도 4는 실시예 4에 기술된 바와 같이 면역-가교 단백질을 사용하는 고처리량 약물 스크리닝 시스템을 도시한다.
도 5는 실시예 6에 기술된 바와 같이 다중 3D 종양 모델을 사용하는 고처리량 약물 스크리닝 시스템을 도시한다.
도 6a는 대조군 GFP 세포와 비교하여 인간 순수 T 세포의 존재 하에 면역-가교 단백질 (pMED178 또는 pMED200)을 발현하는 암세포의 상대적 성장을 제공한다. 도 6b는 암세포가 면역-가교 단백질 (pMED178 또는 pMED200)을 발현함에 따라, 초기 T 세포 활성화 마커인, CD69에 의해 측정된 T 세포 활성화 수준 (%)을 나타낸다.
도 7은 실시예 2에 기술된 게놈-규모 CRISPR 스크리닝 데이터의 볼케이노 플롯이다.
도 8은 실시예 6에 기술된 바와 같이 3D 종양 모델에서 다중화된 CRISPR 기능 유전체의 도식을 제공한다.
도 9a는 개별적으로 배양된 암 (비혼합) 샘플 및 다중화된 암 샘플 (혼합) 사이의 sgRNA 수를 비교하기 위해 수행된 실험 절차를 개략적으로 설명한다. 도 9b는 혼합 샘플 및 비혼합 샘플 사이의 sgRNA 수의 쌍별 상관관계 (pairwise correlation)를 보여주는 히트맵이다.
도 10a는 실시예 7에 기술된 3D 결장 종양 모델 (RKO)로부터의 게놈-규모 CRISPR 스크리닝 데이터의 볼케이노 플롯이다. 도 10b는 실시예 7에 기술된 바와 같이 3D 난소 종양 모델 (OVCAR8)로부터의 게놈-규모 CRISPR 스크리닝 데이터의 볼케이노 플롯이다.
도 11a는 세포 분석기 (Bio-Rad ZE5)에 의해 측정된 바와 같이 표시된 면역-가교를 갖는 암세포에 노출된 PBMC에서의 CD3+/CD8+ 및 CD3+/CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 11b는 세포 분석기 (Bio-Rad ZE5)에 의해 측정된 바와 같이 상기 표시된 면역-가교를 갖는 암세포에 노출된 PBMC에서의 CD8+/CD25+ (CD25+: T 세포 활성화 마커) 및 CD4+/CD25+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도 12는 살아있는-세포 시간-경과 현미경 시스템인, Incucyte S3 (Sartorius)에서 면역-가교 (pMED178, pMED179, pMED200 및 pMED201)의 GFP 신호에 의해 측정된 종양 질량을 제공한다. PMBC를 추가한 후 PBMC+ 및 PBMC- 샘플 사이의 상대적 종양 질량을 플롯팅하였다. pMED200은 지속적으로 상당한 종양 세포 사멸을 유도한 반면 pMED178은 일관성이 없었다. pMED179 및 pMED201 (음성 대조군)은 인간 PBMC에서 유의미한 종양 세포 사멸을 유도하지 않는다.
도 13은 pMED200을 발현하는 야생형 및 PD-L1 KO 세포가 PBMC에 대해 차등적인 민감성을 나타냄을 보여준다. hPBMC를 야생형 및 PD-L1 KO 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포주에 첨가하고 상대적 종양 질량을 종양에서 발현된 GFP 마커에 의해 Incucyte S3에서 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 3가지 상이한 PBMC 조합 (PBMC#1, #2, 및 #1+2)이 사용되었다. 이 종양-면역 공동-배양 기능 분석은 pMED200이 다양한 유전적 내용을 가진 인간 면역 세포 및 종양 세포 사이의 특정 상호작용을 재현하는 데 사용될 수 있음을 명확하게 입증했다.
도 14a는 GFP 신호를 가진 종양 세포 배양물의 이미지를 제공한다. 상기 배양물은 hPBMC가 있거나 없는 아가로스 겔에서 접종된 표시된 유전자 녹아웃이 있는 TNBC 세포 (TNBC#1)를 포함한다. PD-L1, PTPN2 KO 및 MEDIC_001 KO가 야생형보다 hPBMC에 의한 더 큰 종양 감소를 보여주었다.
도 14b는 도 14a에서 제공된 배양물에서 측정된 PBCM + 및 PBMC- 샘플 사이의 상대적 종양 질량을 요약한 그래프이다. 이는 야생형, PD-L1 KO, MEDIC_001 KO, 및 PTPN2 KO TNBC#1 종양에 대한 데이터를 제공한다.
도 15a는 GFP 신호를 가진 종양 세포 배양물의 이미지를 제공한다. 상기 배양물은 hPBMC가 있거나 없는 아가로스 겔에서 접종된 표시된 유전자 녹아웃이 있는 TNBC 세포 (TNBC#2)를 포함한다. PD-L1, PTPN2 KO 및 MEDIC_001 KO가 야생형보다 hPBMC에 의한 더 큰 종양 감소를 보여주었다.
도 15b는 도 15a에서 제공된 배양물에서 측정된 PBCM + 및 PBMC- 샘플 사이의 상대적 종양 질량을 요약한 그래프이다. 이는 야생형, PD-L1 KO, MEDIC_001 KO, 및 PTPN2 KO TNBC#2 종양에 대한 데이터를 제공한다.
5. 발명의 상세한 설명
5.1. 정의
용어 “항원-결합 단백질” (ABP)는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 항원-결합 도메인은 자연 발생 항체와 유사한 특이성 및 친화성으로 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 항체로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 본질적으로 항체로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 대안적인 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 대안적인 스캐폴드로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 본질적으로 대안적인 스캐폴드로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 항체 단편으로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 scFv이다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 본질적으로 항체 단편으로 구성된다. 예를 들어, “항- CD3 ABP”, 또는 “CD3-특이적 ABP”는, 여기서 제공된 바와 같이, CD3의 항원에 특이적으로 결합하는 ABP이다.
여기서 사용된 용어 “단쇄 Fv” 또는 “sFv” 또는 “scFv” 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에서 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 VH 및 VL은 일반적으로 펩티드 링커에 의해 연결된다. Pl
Figure pct00001
ckthun A. (1994) 참조. 일부 구현예에서, 상기 링커는 (GGGGS)n이다. 일부 구현예에서, n = 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. Antibodies from Escherichia coli 참조. Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.)에서, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, New York의 전체 내용이 참조로 포함된다.
표적 분자에 대한 ABP 또는 scFv의 결합과 관련하여, 특정 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 표적) 또는 특정 항원의 에피토프에 대한 용어 “결합”, “특이적 결합”, “특이적으로 결합한다”, “에 대해 특이적인”, “선택적으로 결합한다”, 및 “에 대해 선택적인”은 비특이적 또는 비선택적 상호작용 (예를 들어, 비표적 분자의 경우)과 측정 가능하게 다른 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 표적 분자에 대한 결합을 측정하고 비표적 분자에 대한 결합과 비교함으로써 측정될 수 있다. 특이적 결합은 또한 표적 분자에서 인식되는 에피토프를 모방하는 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수도 있다. 이 경우, 표적 분자에 대한 ABP의 결합이 대조군 분자에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이 표시된다.
5.2. 기타 해석 관례
여기서 언급된 범위는 언급된 종점을 포함하는, 범위 내의 모든 값을 약칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 입체 중심을 갖는 화합물에 대한 언급은 각각의 입체이성질체, 및 이의 입체이성질체의 모든 조합을 의미한다.
5.3. 면역-가교 단백질
본 개시는 세포 표면에서 발현되어 면역 세포를 모집하고 활성화할 수 있는 면역-가교 단백질을 제공한다. 예를 들어, 상기 면역-가교 단백질은 암세포에서 발현되어 암세포가 하나 이상의 면역 이펙터 세포를 활성화할 수 있게 만들 수 있다.
상기 면역-가교 단백질은 N 말단에서 C 말단까지: 면역 세포 마커에 대한 항원 결합 단백질 (“ABP”)(예를 들어, scFv 또는 다른 항체 단편), 및 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 리포터 도메인을 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 리포터 도메인은 형광 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 면역염색을 위한 에피토프를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 신호 펩티드 (예를 들어, H7)을 추가로 포함한다.
상기 면역-가교 단백질의 ABP는 모집되고 활성화되는 표적 면역 세포를 기반으로 결정된다. 상기 면역 세포는 B 세포, T 세포, 사이토카인-유도 사멸 세포, 비만 세포, NK 세포, 수지상 세포 또는 대식세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 하나 이상의 면역 세포에 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 하나 이상의 면역 세포 유형에 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 ABP는 T 세포 및/또는 NK 세포에 특이적이다.
일부 구현예에서, ABP는 표적 면역 세포의 표면에서 발현되는 막 단백질에 특이적이다. 일부 구현예에서, ABP는 B 세포, T 세포, 사이토카인-유도 사멸 세포, 비만 세포, NK 세포, 수지상 세포 또는 대식세포의 세포 표면 단백질에 특이적이나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, CD3에 특이적인 ABP는 T 세포를 활성화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, NKp46에 특이적인 ABP는 NK 세포를 활성화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, scFv는 ABP로서 사용된다. 예를 들어, ABP는 CD3에 특이적인 scFv, 또는 NKp46에 특이적인 scFv이다. 일부 구현예에서, scFv 이외의 항체 또는 항체 단편은 ABP로서 사용된다.
일부 구현예에서, 해당 분야에서 공지된 ABP가 사용된다. 예를 들어, 2C11 (Liao and Roffler, Gene Ther. 2000; De Jonge et al., Mol. Immunol. 1995 참조), OKT3 (see Norman Ther Drug Monit 1995 참조)과 같은 CD3에 대한 mAb의 scFv, 또는 29A1.4 (ThermoFisher Scientific에서 구입 가능) 및 VIV-KM1 (Invitrogen에서 구입 가능)과 같은 NKp46에 대한 mAb의 scFv는 상기 면역-가교 단백질로 사용된다.
상기 면역-가교 단백질은 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 상기 막횡단 도메인은 막횡단 단백질의 막횡단 부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 마우스 B7의 상기 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 막횡단 도메인은 서열번호 1의 서열 (NP_001346827.1의 아미노산 249-271)을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 막횡단 도메인은 서열번호 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포질 도메인은 막 단백질의 세포질 부분이다. 일부 구현예에서, B7의 상기 세포질 도메인이 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포질 도메인은 서열번호 2의 서열(NP_001346827.1의 아미노산 272-306)을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 세포질 도메인은 서열번호 2과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 상기 면역-가교 단백질의 발현 검출을 위한 리포터 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 리포터 단백질은 형광 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 형광 단백질은 GFP이다.
일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 인간 IgG1의 γ1 도메인 서열 (힌지-CH2-CH3 영역)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 γ1 도메인은 상기 면역-가교 단백질의 이량체화를 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 γ1 도메인은 scFv의 이량체화를 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 면역-가교 단백질의 이량체화를 유도할 수 있는 γ1 도메인 이외의 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 γ1 도메인이 없다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 상기 면역-가교 단백질의 이량체화를 유도하는 도메인이 없다.
일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 H7 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 상기 면역-가교 단백질의 표적화 및 폴딩에 관여한다. 상기 면역-가교 단백질의 표적화 및/또는 폴딩을 도울 수 있는 H7 이외의 단백질의 신호 펩티드가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질은 상기 면역-가교 단백질의 면역염색 또는 정제를 위한 에피토프를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 에피토프는 상기 면역-가교 단백질의 세포내, 세포외 부분, 또는 둘 다에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 에피토프는 HA 에피토프 또는 V5 에피토프이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 여기서 제공된 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (면역-가교 폴리뉴클레오티드) 또는 이의 부분을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 상기 면역-가교 단백질의 발현을 유도 또는 조절하는 조절 영역에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바코드 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 여기서 제공된 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 또는 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터는 단리되었다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터는 세포 내에 존재한다.
일 측면에서, 본 개시는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터의 복제 및 증폭을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터의 생산을 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 상기 면역-가교 단백질의 생산을 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터로부터 발현된 상기 면역-가교 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포 또는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 암세포이다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 암세포주이다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 암 환자로부터 얻은 원발성 암세포이다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 암 동물 모델로부터 얻은 원발성 암세포이다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 상기 면역-가교 단백질의 발현을 기준으로 분류되었다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 상기 세포로부터 발현된 상기 면역-가교 단백질의 활성을 기준으로 분류되었다.
상기 숙주 세포는 하나 이상의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 핵산-단백질 복합체, 또는 이들의 임의의 조합으로 일시적으로 또는 비일시적으로 형질전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터는 상기 숙주 세포의 게놈으로 안정적으로 통합된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 숙주 세포 집단을 제공하며, 각각의 숙주 세포는 상기 면역-가교 단백질 및/또는 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 복수 공여자 또는 세포주로부터의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 복수 암 환자로부터의 원발성 암세포를 포함한다.
5.4. 가이드 RNA의 표적화 라이브러리
또 다른 측면에서, 본 개시는 복수의 표적화-라이브러리 구조물을 포함하는 라이브러리를 제공한다. 각각의 상기 표적화-라이브러리 구조물은 가이드 RNA를 코딩하는 서열 (gRNA-코딩 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 단일 가이드 RNA (sgRNA)이다. 일부 구현예에서, 상기 가이드 RNA는 이중 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상기 표적화-라이브러리 구조물은 하나 이상의 gRNA-코딩 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 gRNA는 하나 이상의 게놈 표적 부위를 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 gRNA는 복수의 게놈 표적 부위 중 하나를 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 라이브러리 구조물 내의 각각의 gRNA는 고유한 게놈 표적 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 라이브러리 구조물 내의 일부 gRNA는 중첩되는 게놈 표적 영역에 결합한다.
일부 구현예에서, gRNA는 가이드 서열을 포함한다. 가이드 서열은 상기 표적 서열과 혼성화하고 복합체화된 핵산-가이드 뉴클레아제의 상기 표적 서열에 대한 서열-특이적 결합을 지시하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 가이드 서열 및 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 또는 99% 이상일 수 있다. 최적의 정렬은 서열 정렬을 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75개 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20개 미만의 뉴클레오티드이다. 바람직한 구현예에서, 상기 가이드 서열은 길이가 10-30개 뉴클레오티드이다. 상기 가이드 서열은 길이가 15-20개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 가이드 서열은 길이가 15개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 가이드 서열은 길이가 16개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 가이드 서열은 길이가 17개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 가이드 서열은 길이가 18개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 가이드 서열은 길이가 19개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 가이드 서열은 길이가 20개 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 10,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 50,000, 100,000, 500,000, 또는 1,000,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 바코드 서열을 추가로 포함한다. 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 상기 gRNA-코딩 서열 및 상기 바코드 서열의 고유한 쌍을 포함할 수 있고 상기 바코드 서열은 상기 구조물 내 gRNA의 게놈 표적 부위를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 바코드 서열은 합성, 비천연 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 표적화-라이브러리 구조물은 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 추가로 포함한다. 상기 엔도뉴클레아제는 동일한 구조물의 gRNA와 상용성이 있어 표적화 가능한 뉴클레아제 활성을 갖는 리보핵산단백질 입자 (RNP)를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 gRNA 및 상기 엔도뉴클레아제는 동일한 종으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 gRNA 및 상기 엔도뉴클레아제는 상이한 종으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 gRNA 및/또는 상기 엔도뉴클레아제는 자연적으로 발생하지 않고 인공적으로 생성된다.
일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), MAD 엔도뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제 (MN)이다. 일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 CAS9이다.
일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 렌티바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터이다.
5.5. 고처리량 분석을 위한 암세포
본 개시의 일 측면은 여기서 기술된 고처리량 분석을 위해 변형된 세포 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 암세포를 포함한다. 상기 암세포는 면역-가교 단백질을 포함하도록 각각 변형된, 암세포 집단일 수 있다. 상기 암세포는 여기서 기술된 표적화-라이브러리 구조물을 포함하도록 각각 변형된, 암세포 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 면역-가교 단백질 및 표적화-라이브러리 구조물 모두를 포함하도록 변형된다. 세포 집단은 복수의 유형의 표적화-라이브러리 구조물을 집합적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 상기 표적 세포의 게놈에서 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 50,000, 100,000, 500,000, 또는 1,000,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는, 복수의 유형의 표적화-라이브러리 구조물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포 집단은 인간 게놈에서 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 50,000, 100,000, 500,000, 또는 1,000,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는, 복수의 유형의 표적화-라이브러리 구조물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암세포는 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함한다. 면역-가교 단백질을 포함하는 상기 암세포는 면역 세포 마커에 결합하여 면역 세포와 상호작용하고 활성화할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 T 세포, NK 세포, B 세포, 또는 다른 유형의 면역 세포를 활성화할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역-가교 단백질을 포함하는 상기 암세포는 하나 이상의 세포 유형을 활성화할 수 있다. 예를 들어, 일부 암세포는 T 세포 및 NK 세포를 모두 활성화할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암세포는 원발성 암세포이다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 암 환자로부터 얻은 암세포이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 한 명의 암 환자의 복수의 조직으로부터의 암세포이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 한 명의 암 환자의 하나의 조직으로부터의 암세포이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 한 명의 암 환자의 복수 유형의 종양으로부터의 암세포이다.
일부 구현예에서, 상기 암세포는 한 명 이상의 암 환자로부터 얻어진다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 한 명 이상의 암 환자로부터의 동일한 유형의 조직으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 한 명 이상의 암 환자로부터의 동일한 종양이다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 한 명 이상의 암 환자로부터의 복수의 종양이다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 암세포주이다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 고형 종양 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 암세포는 육종(sarcoma) 또는 암종(carcinoma)이다. 상기 암세포는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장 및 직장암, 자궁내막암, 신장암, 입술 및 구강암, 간암, 흑색종, 중피종, 비소세포폐암, 비흑색종 피부암, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 소세포폐암, 또는 갑상선암 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 혈액암 세포이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 바코드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 바코드는 세포 유형 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 바코드는 세포주 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 바코드는 각 공여자에 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 바코드는 각 샘플에 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 바코드는 각 세포주에 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 바코드는 각 종양 유형에 특이적이다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 복수의 세포주를 포함하며, 각각의 세포주는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 세포주-특이적 바코드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 복수의 공여자로부터의 세포를 포함하고, 각각의 공여자로부터의 세포는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 공여자-특이적 바코드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 복수의 샘플로부터의 세포를 포함하고, 각각의 샘플로부터의 세포는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 샘플-특이적 바코드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 복수의 세포 유형으로부터의 세포를 포함하고, 각각의 세포 유형으로부터의 세포는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 세포 유형-특이적 바코드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 면역-가교 단백질 또는 표적화-라이브러리 구조물을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터로 형질감염되었다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 면역-가교 단백질 및 표적화-라이브러리 구조물을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터로 형질감염되었다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 면역-가교 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 분자 및 표적화-라이브러리 구조물을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 분자로 형질감염되었다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 면역-가교 단백질 및 표적화-라이브러리 구조물 모두를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드 분자로 형질감염되었다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 면역-가교 단백질 및/또는 표적화-라이브러리 구조물을 코딩하는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 마커 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 마커 단백질은 루시퍼라제 또는 형광 단백질 (예를 들어, GFP, YEP)이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 외인성 엔도뉴클레아제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), MAD 엔도뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제 (MN)이다. 일부 구현예에서, 상기 외인성 엔도뉴클레아제는 상기 표적화-라이브러리 구조물에 의해 코딩된 gRNA와 양립 가능하다. 일부 구현예에서, 상기 외인성 엔도뉴클레아제는 CAS9이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 외인성 엔도뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 외인성 엔도뉴클레아제를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 세포로 전기천공된다.
5.6. 3D 종양 모델
또 다른 측면에서, 본 개시는 여기서 기술된 상기 세포 또는 상기 세포 집단의 3차원 (3D) 배양을 제공한다. 3D 세포 배양을 위한 해당 분야에서 이용 가능한 다양한 방법이 채택되고 사용될 수 있다. 예를 들어, 3D 세포 배양 시스템은 초저 부착 플레이트 방법 (ultra-low attachment plate method), 행잉 드롭 방법 (hanging drop method), 현탁 배양 방법과 같은 스캐폴드-프리 (scaffold-free) 방법, 및 스캐폴드-기반 기술을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 현탁 배양 방법이 사용된다. 이 경우, 여기서 기술된 상기 세포를 캡슐화하는 마이크로캡슐 풀을 상기 현탁 배양 방법에서 사용할 수 있다. 상기 마이크로캡슐은 10 μm 내지 10 mm, 10 μm 내지 1 mm, 50 μm 내지 1 mm, 100 μm 내지 1 mm, 200 μm 내지 500 μm, 또는 약 250 μm 내지 500 μm의 직경을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 마이크로캡슐은 여기서 기술된 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 상기 각각의 마이크로캡슐은 동일한 바코드 서열을 포함하는 세포를 캡슐화할 수 있다. 상기 바코드 서열은 세포주, 공여자 (예를 들어, 암 환자), 세포 유형 또는 샘플에 특이적일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 각각의 마이크로캡슐은 동일한 세포주, 동일한 공여자, 동일한 세포 유형, 또는 동일한 샘플의 세포를, 구체적으로 바코드화하여 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 각각의 마이크로캡슐은, 하나 이상의 바코드 서열을 집합적으로 포함하는 세포를 캡슐화할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 마이크로캡슐에서 캡슐화된 세포는 이질적이다 (예를 들어, 복수의 세포주, 복수의 공여자로부터의 세포, 복수의 세포 유형 또는 샘플의 세포).
일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 동일한 대상체로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 동일한 암 환자로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 단일 세포주로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다.
일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 2개 이상의 상이한 바코드 서열을 포함하는 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 2개 이상의 상이한 바코드 서열은 세포주 또는 세포 유형-특이적 바코드 또는 공여자 특이적 바코드에 특이적 서열이다.
일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 2명 이상의 대상체로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 3명, 4명, 5명, 6명, 7명, 또는 8명 이상의 대상체로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 2명 이상의 암 환자로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 3명, 4명, 5명, 6명, 7명, 또는 8명 이상의 암 환자로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 이들의 공여자에 특이적으로 바코드화된다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 상기 세포 유형 또는 샘플 유형에 특이적으로 바코드화된다.
일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 2개 이상의 세포주로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 각각의 마이크로캡슐은 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개 이상의 세포주로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단은 상기 세포주에 특이적으로 바코드화된다.
일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐은 면역 세포를 추가로 캡슐화한다. 상기 면역 세포는 T 세포, NK 세포, B 세포, 사이토카인-유도 사멸 세포, 비만 세포, 수지상 세포, 또는 대식세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 마이크로캡슐은: T 세포, NK 세포, B 세포, 사이토카인-유도 사멸 세포, 비만 세포, 수지상 세포, 또는 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된, 하나 이상의 면역 세포를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함한다.
상기 마이크로캡슐 풀은 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 동안, 상기 배양 배지는 교반기, 회전 배양 플라스크 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 교반될 수 있다.
상기 배양에서, 상기 세포 집단은 3D 종양 오가노이드를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 마이크로캡슐 풀은 동일한 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 상기 배지는 제1 면역 가교 단백질을 포함하는 세포를 캡슐화하는 제1 마이크로캡슐 풀, 및 제2 면역 가교 단백질을 포함하는 세포를 캡슐화하는 제2 마이크로캡슐 풀 모두를 배양하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 제1 마이크로캡슐 풀은 제1 표적화 라이브러리를 포함하는 세포를 캡슐화하고 상기 제2 마이크로캡슐 풀은 제2 표적화 라이브러리를 포함하는 세포를 캡슐화한다. 또 다른 구현예에서, 상기 제1 마이크로캡슐 풀은 제1 바코드 서열을 포함하는 세포를 캡슐화하고, 상기 제2 마이크로캡슐 풀은 제2 바코드 서열을 포함하는 세포를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 마이크로캡슐 풀은 제1 면역 세포를 포함하는 세포를 캡슐화하고, 상기 제2 마이크로캡슐 풀은 제2 면역 세포를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 2개 이상 (예를 들어, 3개, 4개, 5개 이상)의 마이크로캡슐 풀은 함께 배양된다.
5.7. 고처리량 분석 방법
본 개시는 또한 여기서 기술된, 상기 면역-가교 단백질, 표적화-라이브러리 구조물, 세포 집단, 및/또는 마이크로캡슐을 사용한 고처리량 분석 방법을 제공한다. 상기 분석 방법은 신약 또는 약물 타겟 식별을 포함하되 이에 제한되지 않는, 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 방법은 암세포의 면역 반응의 강화 또는 감소와 연관된 유전적 변형을 식별하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 면역 세포의 세포독성 효과를 강화하거나 감소시키는 암세포의 게놈 부위 또는 유전자를 식별할 수 있다. 다른 경우에, 상기 면역 세포의 세포독성 효과를 강화하거나 감소시킬 수 있는 화합물을 식별할 수 있다. 일부 구현예에서, 암세포의 면역 반응의 강화 또는 감소와 연관된 하나 이상의 시험 화합물이 식별된다. 상기 식별된 유전적 변형 또는 상기 식별된 시험 화합물(들)에 의해 영향을 받는 표적 단백질은 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 식별된 화합물은 면역 반응 (예를 들어, 세포독성)을 조절하기 위해 대상 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 식별된 게놈 부위 또는 상기 식별된 게놈 부위에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 조절할 수 있는 제제는 면역 반응 (예를 들어, 세포독성)을 조절하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 식별된 게놈 부위 또는 상기 식별된 게놈 부위에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 조절할 수 있는 상기 식별된 화합물 또는 제제는 투여 시 환자에서 암세포의 감소 또는 제거를 유도할 수 있다. 상기 제제는 상기 게놈 부위에 의해 코딩된 단백질, 상기 게놈 부위에 의해 코딩된 단백질의 활성화제 또는 억제제, 또는 상기 식별된 게놈 부위로부터의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 상기 게놈 부위로부터 발현되는 단백질에 대한 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 상기 게놈 부위로부터 발현되는 전사물에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및 상기 식별된 화합물은 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 상기 식별된 화합물은 면역 종양 요법의 치료 효과를 증가시키기 위해 암 환자에게 다른 면역 종양 요법과 함께 투여될 수 있다.
면역-가교 단백질을 사용한 고처리량 스크리닝
대부분의 T 세포는 동계 표적 세포로부터 MHC I 또는 MHC II 분자에 의해 제시되는 경우에만 특정 펩티드 항원을 인식한다. 따라서, 전통적인 고처리량 스크리닝 방법은 1) 특정 항원(예. OVA: 난알부민 또는 HA: 해마플루티닌)을 인식하는 T 세포를 생산하는 특정 형질전환 마우스 모델 및 2) 상기 동계 마우스 모델에서 유래된 암 모델이 필요하다. 이는 암 모델의 선택 및 그러한 스크리닝 과정의 확장성을 심각하게 제한한다.
면역-가교 단백질을 발현하는 암세포는 임의의 동종이계 출처로부터 면역 세포를 모집/활성화할 수 있다. 상기 면역-가교 시스템을 사용하면, 다양한 면역 세포를 가진 동종이계 암 모델에서 면역 조절제의 고처리량 스크린을 수행할 수 있다.
예를 들어, 면역-가교 단백질을 발현하는 암세포는 면역 세포와 함께 배양되어 상기 면역 세포에 대한 상기 암세포의 반응이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포독성 효과가 결정된다. 특정 유형의 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포) 또는 이들의 조합에 대한 암세포 반응이 결정될 수 있다. 상기 면역 세포에 반응성 또는 비반응성인 암세포를 선택하거나 분리할 수 있다. 예를 들어, 상기 면역 세포에 민감한 암세포는 제거되고, 상기 면역 세포에 덜 민감한 암세포는 농축된다. 특정 암세포의 농축 및 탈농축은 상기 배양물로부터 얻은 상기 세포의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 게놈 DNA, RNA, 바코드 서열)을 서열분석하는 것에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 특성화는 상기 배양물로부터 얻은 상기 세포의 바코드 서열을 서열분석하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 특성화는 유전자형 특성의 서열분석 및 식별을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역-가교 단백질을 발현하는 암세포는 리포터 유전자를 발현하도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라제이다. 상기 리포터 유전자는 상기 면역-가교 단백질과 동일한 구조물 또는 상이한 구조물에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역-가교 단백질을 발현하는 암세포의 면역 반응이 하나 이상의 시험 화합물의 존재 하에 시험된다. 상기 방법은 상기 면역 반응을 변경할 수 있는 시험 화합물 또는 이들의 조합을 식별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암세포에 대한 면역 세포의 세포독성 효과를 강화시킬 수 있는 화합물을 식별할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시험 화합물에 특히 반응성인 암세포를 식별하고 특성화할 수 있다. 여기서 사용된, 용어, 시험 화합물은, 소분자 (예를 들어, 유기 또는 무기 화합물, 천연 또는 인공 화합물) 또는 생물학적 제제 (예를 들어, 백신, 세포, 혈액, 혈액 성분, 알레르기 유발 물질, 유전자, 조직, 또는 단백질)을 지칭한다.
일부 구현예에서, 상기 면역 반응은 3D 종양 모델에서 시험된다. 일부 구현예에서, 면역-가교 단백질을 발현하는 암세포 및 면역 세포는 마이크로캡슐에 함께 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 면역-가교 단백질을 발현하는 암세포 및 면역 세포 모두를 각각 캡슐화한, 마이크로캡슐 풀은 배양 배지에서 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 풀은 복수 유형의 암세포 (예를 들어, 복수 세포주, 암 유형, 복수 공여자로부터의 세포 등)을 집합적으로 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 내의 암세포는 세포 샘플, 유형, 공여자 등에 특이적으로 바코드화된다. 일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 풀은 복수 유형의 면역 세포 (T 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포, 및/또는 PBMC)를 집합적으로 캡슐화한다.
일부 구현예에서, 상기 마이크로캡슐 풀은 동일한 배양 배지에서 배양되고, 하나 이상의 시험 화합물이 상기 배양 배지에 적용된다. 복수의 시험 화합물을 시험할 때, 이들은 개별적으로, 연속적으로 또는 조합하여 적용될 수 있다.
따라서, 여기서 제공되는 방법은 암세포 집단을 배양하는 단계 또는 마이크로캡슐 풀을 배양하는 단계, 및 상기 배양물로부터 얻은 세포를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 암세포 집단은 면역 세포의 존재 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 분석 단계는 상기 배양물로부터 얻은 세포의 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 것을 포함한다. 상기 서열분석은 상기 세포의 신원과 관련된 정보를 제공할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 세포의 바코드 서열 또는 내인성 (예를 들어, 게놈 서열 또는 mRNA 서열) 서열일 수 있다.
다양한 암세포에 특이적인 복수 바코드를 사용하는 경우, 약물 없음 및 약물 조건 하에 암세포 바코드를 서열분석하고 2가지 다른 조건 하에 존재하는 세포 유형을 비교 이해할 수 있다. 일부 구현예에서, 다양한 종양 샘플을 나타내는, 바코드 비율은, 복수 종양 샘플에 걸친 약물 반응을 이해하기 위해 계산된다.
일부 구현예에서, 면역-가교 단백질을 발현하고 선택적으로 리포터 단백질을 함께 발현하는 암세포는 면역 세포의 존재 하에 다중-웰 플레이트에서 배양된다. 그 후, 시험 화합물을 개별적으로 각 웰에 적용한다. 상기 시험 약물로 처리되거나 처리되지 않은 상기 세포의 성장 및/또는 기타 물리적 또는 생물학적 특성을 결정하고 비교한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포의 존재 또는 부존재 하에 배양된 상기 세포의 상기 성장 및/또는 기타 물리적 또는 생물학적 특성을 결정하고 비교한다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 존재 하에 암세포에 대한 세포독성을 강화하는 시험 약물이 식별된다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 부존재 하에 암세포에 대한 세포독성 효과를 갖는 시험 화합물이 식별된다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포의 존재 하에 암세포에 대한 세포독성을 강화하지만, 상기 면역 세포의 부존재 하에는 그렇지 않은, 시험 화합물이 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포의 부존재 하에 암세포에 대한 세포독성을 강화하지만, 상기 면역 세포의 존재 하에는 그렇지 않은, 시험 화합물이 선택된다. 일부 구현예에서, 특정 유형의 면역 세포에 의해서만 암세포에 대한 세포독성을 강화하는 시험 화합물이 선택된다. 일부 구현예에서, 여러 유형의 면역 세포에 의해 암세포에 대한 세포독성을 강화하는 시험 화합물이 선택된다.
고처리량 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR) 스크리닝
여기서 기술된 분석 시스템은 여기서 기술된 가이드 RNA의 표적화 라이브러리 및 외인성 엔도뉴클레아제를 사용하여 유전적으로 변형된 암세포를 분석하는 데 사용될 수 있다. 상기 유전적 변형에 따른 면역 반응과 무관한 암세포의 면역 반응의 변화 또는 상기 암세포의 성장속도 변화는 여기서 제공되는 상기 분석 시스템을 사용하여 분석될 수 있다. 상기 유전적 변형 및 상기 면역 반응의 변화 또는 상기 암 내재 성장속도의 변화 사이의 관계를 분석함으로써 신규 약물 또는 약물 표적을 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 외인성 엔도뉴클레아제, 및 표적화-라이브러리 구조물을 포함하는 표적화 라이브러리를 포함하도록 변형된 암세포를 얻는 단계 및 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 표적화 라이브러리에 의해 유전적 변형 (예를 들어, 녹아웃)을 위한 조건에서 상기 암세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 바코드 서열을 포함하도록 추가로 변형된다. 상기 변형된 암세포는 여기서 기술된 3D 종양 모델에서 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 주 동안) 배양된다. 상기 배양 후 특정 암세포의 농축 및 탈농축은 상기 암세포에 특이적인 gRNA, 바코드, 또는 기타 서열의 수를 서열분석함으로써 측정될 수 있다. 상기 분석으로부터, 암세포 성장과 연관된 유전적 변형을 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 외인성 엔도뉴클레아제, 및 표적화-라이브러리 구조물을 포함하는 표적화 라이브러리를 포함하도록 변형된 암세포를 얻는 단계 및 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 표적화 라이브러리에 의한 유전적 변형 (예를 들어, 녹아웃)을 위한 조건에서 상기 암세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 암세포는 바코드 서열을 포함하도록 추가로 배양된다. 상기 변형된 암세포를 2개 그룹으로 나누어 한 그룹은 하나 이상의 시험 약물의 존재 하에 배양되고 다른 그룹은 하나 이상의 시험 약물의 부존재 하에 배양된다. 상기 암세포는 여기서 기술된 3D 종양 모델에서 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 주 동안) 배양된다. 상기 배양 후 특정 암세포의 농축 및 탈농축은 상기 암세포에 특이적인 gRNA, 바코드, 또는 기타 서열의 수를 서열분석함으로써 측정될 수 있다. 상기 분석으로부터, 암세포 성장 및 상기 하나 이상의 시험 약물의 반응과 연관된 유전적 변형을 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 면역-가교 단백질, 외인성 엔도뉴클레아제, 및 표적화-라이브러리 구조물을 포함하는 표적화 라이브러리를 포함하도록 변형된 암세포를 얻는 단계 및 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 표적화 라이브러리에 의한 유전적 변형 (예를 들어, 녹아웃)을 위한 조건에서 상기 암세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 외인성 엔도뉴클레아제 및 표적화-라이브러리 구조물을 포함하는 표적화 라이브러리를 포함하도록 변형된 암세포를 얻는 단계, 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 표적화 라이브러리에 의한 유전적 변형 (예를 들어, 녹아웃)을 위한 조건에서 상기 암세포를 배양하는 단계, 및 상기 변형된 암세포에 면역 가교-단백질 또는 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA의 하나 이상의 표적화 라이브러리가 사용된다. 복수 라이브러리 각각은 고유하게 바코드가 지정될 수 있다. 상기 바코드된 표적화 라이브러리는 복수 종양 샘플에 개별적으로 도입될 수 있다. 상기 종양 샘플은 마이크로캡슐로 캡슐화되고, 다중화되며 주어진 스크리닝 기간 동안 배양될 수 있다. 상기 스크리닝이 끝나면, 상기 종양 세포의 게놈 DNA를 추출하고 sgRNA 및/또는 연관 바코드를 서열분석할 수 있다. gRNA 수는 상기 바코드 또는 각 종양 샘플에 고유한 상기 gRNA 코딩 서열에 의해 역다중화될 수 있으며 원래 종양 샘플까지 추적된 상기 gRNA 수는 각 종양 샘플에서 gRNA에 의한 돌연변이의 표현형 효과를 결정하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 2개의 암 샘플 (샘플1 및 샘플2)이 고유하게 바코드화된 gRNA (BC1 및 BC2)의 표적화 라이브러리를 사용하여 별도로 형질도입된다. 상기 암 샘플은 개별적으로 (비혼합 샘플) 또는 혼합물 (혼합 샘플)로 시험될 수 있다. gRNA는 역다중화 없이 비혼합 샘플에서 계산될 수 있다. 그러나 혼합 샘플의 gRNA는 역다중화되어야 한다. 일부 구현예에서, 혼합 샘플의 gRNA는 바코드에 의해 역다중화된다. 상기 gRNA는 각 종양 샘플에 대해 계산될 수 있다.
다중화 및 역다중화 단계를 포함하는 방법은 2개의, 다중화 종양 샘플에서 2개의 게놈-규모 스크리닝이 동시에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 3, 4, 5개 이상의 게놈-규모 스크리닝이 동시에 수행될 수 있다.
상기 유전적으로 변형된 암세포는 면역 세포가 암세포와 상호작용할 수 있는 조건에서 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 기타 면역 세포)와 배양될 수 있다. 상기 면역 세포와 함께 1회 또는 복수 펄스 처리를 통해, 암세포를 상기 면역 세포에 더 민감하게 만드는 녹아웃 클론이 더 크게 감소하거나 제거되고, 암세포를 상기 면역 세포에 더 강한 내성을 갖게 만드는 클론이 농축된다. 이러한 암세포의 농축 및 탈농축은 gRNA, 바코드, 또는 상기 암세포에 특이적인 기타 서열 수를 서열분석함으로써 측정될 수 있다. 구체적으로, gRNA, 바코드 또는 기타 특이적 서열의 시퀀싱 수는 면역 세포로 처리된 암세포 및 면역 세포로 처리되지 않은 암세포 간에 비교될 수 있다. gRNA, 바코드 또는 기타 특이적 서열의 수는 상기 암세포의 유전적 변형을 특성화, 예를 들어, 돌연변이 및 이의 효과의 식별 및 위치 찾기를 하는 데 사용될 수 있다.
상기 분석 결과는 다양한 유전적 변형의 표현형 효과, 구체적으로 면역 세포에 대한 반응 및/또는 내인성 종양 성장 속도에 대한 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 시험 화합물은 상기 유전적으로 변형된 암세포 및 상기 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 배양물에 적용된다. 상기 하나 이상의 시험 화합물의 적용 후, 특정 암세포의 농축 및 탈농축은 gRNA, 바코드 또는 상기 암세포에 특이적인 기타 서열의 수를 서열분석함으로써 측정될 수 있다. 면역 세포의 존재 또는 부존재 하에 상기 하나 이상의 시험 화합물로 처리된 암세포 및 상기 하나 이상의 시험 화합물로 처리되지 않은 암세포 사이의 gRNA, 바코드 또는 기타 특이적 서열의 수를 서열분석하는 것의 비교는 다양한 유전적 변형 및/또는 상기 면역 반응에 대한 시험 화합물의 표현형 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암세포 및 상기 면역 세포는 3D 종양 모델에서 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 암세포 및 상기 면역 세포는 마이크로캡슐에서 배양된다. 일부 구현예에서, gRNA는 바코드를 추가로 포함하는 구조물에서 클로닝된다. 암세포에서 gRNA의 수를 서열 분석하는 것을 측정하는 것은 상기 바코드 서열을 서열 분석함으로써 수행될 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, Cas9 발현 암세포는 면역-가교 단백질을 코딩하는 구조물로 형질도입된다. 그런 다음 20,000 개의 인간 유전자를 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 렌티바이러스의 표적화 라이브러리가 암세포로 형질도입된다. 이는 상기 면역-가교 단백질을 발현하는 20,000개의 녹아웃 암세포 풀을 생성한다. T 세포 또는 NK 세포는 PBMC로부터 제조되어 암세포에 적용된다. 복수 펄스의 면역 세포 처리를 통해, 암세포를 상기 면역 세포에 내성을 갖게 만드는 녹아웃 클론은 농축되는 반면, 암세포를 상기 면역 세포에 더 민감하게 만드는 녹아웃 클론은 농축되지 않는다. 이러한 녹아웃 클론의 농축 및 탈농축은 상기 면역 세포 처리된 암세포의 sgRNA의 심층-서열분석 수를 처리되지 않은 암세포의 sgRNA의 것과 비교하여 측정된다.
자가면역 질환 약물 후보물질의 고처리량 스크리닝
여기서 개시된 고처리량 스크리닝 방법 및 시스템은 비암세포를 분석하는 데도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질환의 치료를 위한 신약 또는 약물 표적을 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 자가면역 질환 환자로부터 얻은 세포는 상기 면역-가교 단백질을 발현하도록 변형되고 멀티-웰 플레이트에 플레이팅된다. 시험 화합물 라이브러리는 면역 세포의 존재 또는 부존재 하에 상기 세포를 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 상기 시험 화합물은 면역 세포가 있거나 없는 면역-가교 단백질을 발현하는 상기 세포를 포함하는 멀티-웰 플레이트에 적용될 수 있다.
세포 성장 및 기타 물리적 또는 생물학적 특성이 다양한 조건의 세포, 예를 들어, 면역 세포의 존재 및 면역 세포의 부존재 하에 약물 화합물로 처리된 세포, 또는 약물 화합물로 처리된 세포 및 약물 화합물로 처리되지 않은 세포 사이에서 측정되고 비교될 수 있다. 상기 비교로부터, 상기 세포 및 면역 세포 사이의 상호작용 조절에 관여하는 시험 화합물이 식별된다. 일부 구현예에서, 비정상적인 면역 반응을 감소 또는 제거하는 시험 화합물이 식별된다.
여기서 기술된 방법을 사용하여 식별된 시험 화합물은 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
5.8. 키트
일 측면에서, 본 개시는 여기서 제공된 고처리량 분석 및 방법을 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 상기 면역-가교 단백질 또는 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 표적 세포로 형질감염될 수 있고 상기 면역-가교 단백질의 발현을 유도할 수 있는 발현 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 상기 면역-가교 단백질 또는 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 가이드 RNA의 표적화 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표적화 라이브러리는 gRNA 코딩 서열을 포함한다. 상기 라이브러리의 gRNA는 15,000개 부위, 20,000개 부위, 50,000개 이상의 부위, 100,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표적화 라이브러리는 gRNA 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 바코드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 엑소뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), MAD 엔도뉴클레아제, 및 메가뉴클레아제 (MN)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 외인성 뉴클레아제는 CAS9이다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 마커 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 마커 단백질은 루시퍼라제 또는 기타 리포터 단백질이다.
일부 구현예에서, 상기 뉴클레아제 폴리뉴클레오티드 또는 상기 마커 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 선택적으로 렌티바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 하나 이상의 바코드 서열을 추가로 포함한다.
6. 실시예
6.1. 실시예 1: 면역-가교 단백질의 설계 및 적용
고처리량 스크리닝 시스템을 개발하기 위해 여러 면역-가교 단백질이 도 1에 도시된 바와 같이 설계되고 생성되었다. 상기 면역-가교 단백질은 면역 세포 마커 (예를 들어, CD3, NKp46)에 특이적인 scFv를 포함한다. 상기 scFv의 안정적인 막 발현을 위해 재조합 단백질을 코딩하는 폴리유클레오티드를 렌티바이러스 벡터에 클로닝하고 암세포에 형질도입하였다.
상기 재조합 막 단백질이 암세포에서 발현되면, 이는 모든 동종이계 출처로부터 면역 세포를 모집/활성화할 수 있다.
예로서, pMED178, pMED179, pMED200 및 pMED201에 대한 구조물 설계도가 도 1에 제공된다. 상기 구조물은 H7 신호 펩티드; pMED178 및 pMED200에 대한 scFv의 이량체화를 유도하기 위한 인간 IgG1의 γ1 도메인 서열 (힌지-CH2-CH3 영역); 면역염색을 위한 V5 에피토프; B7 (B 림프구 활성 항원)의 막횡단 도메인; scFv의 고발현을 달성하기 위한 B7의 세포질 도메인 (B7-ct); 및 EGFP 형광 마커를 포함한다. 상기 단백질은 마우스 T 세포를 활성화하기 위한 pMED179 및 pMED201에 대한 마우스 CD3에 대한 scFV 및 인간 T 세포를 활성화하기 위한 pMED178 및 pMED200에 대한 인간 CD3에 대한 scFV - 두 개 scFv 중 하나를 추가로 포함한다. 상이한 면역 세포 마커를 표적으로 하는 scFv는 다양한 활성화 신호를 사용하여 면역 이펙터 세포의 동일하거나 싱아힌 유형을 모집/활성화하는 데 사용될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, pMED178 구조물은 EF1a 프로모터에 이어 H7 신호 펩티드, HA 에피토프, 인간 CD3scFv, 인간 IgG1의 γ1 도메인 서열 (힌지-CH2-CH3 영역), V5 에피토프, 막횡단 도메인, B7의 세포질 도메인 및 리포터 단백질 (EGFP):를 포함하는 pMED178 면역-가교 단백질의 코딩 서열을 포함한다.
pMED179 구조물은 EF1a 프로모터에 이어 H7 신호 펩티드, HA 에피토프, 마우스 CD3scFv, 인간 IgG1의 γ1 도메인 서열 (힌지-CH2-CH3 영역), V5 에피토프, 막횡단 도메인, B7의 세포질 도메인 및 리포터 단백질 (EGFP):를 포함하는 pMED179 면역-가교 단백질의 코딩 서열을 포함한다.
pMED200 구조물은 EF1a 프로모터에 이어 H7 신호 펩티드, HA 에피토프, 인간 CD3scFv, V5 에피토프, 막횡단 도메인, B7의 세포질 도메인 및 리포터 단백질 (EGFP):를 포함하는 pMED200 면역-가교 단백질의 코딩 서열을 포함한다.
pMED201 구조물은 EF1a 프로모터에 이어 H7 신호 펩티드, HA 에피토프, 마우스 CD3scFv, V5 에피토프, 막횡단 도메인, B7의 세포질 도메인 및 리포터 단백질 (EGFP):를 포함하는 pMED201 면역-가교 단백질의 코딩 서열을 포함한다.
상기 pMED178 및 pMED200 구조물을 암세포에 형질감염시켜 T 세포에 의한 선택적 사멸을 유도하는 면역-가교 단백질의 능력을 테스트하였다. MDA-MB-231 세포 (삼중 음성 유방암 모델)을 1) GFP 대조군, 2) pMED178 면역-가교 (이합체 인간 CD3 scFV), 또는 3) pMED200 면역-가교 (단량체 인간 CD3 scFV)를 코딩하는 구조물로 형질도입하였다. 상기 형질감염된 MDA-MB-231 암세포를 인간 순수 T 세포에 처리하고 MDA-MB-231 세포의 성장을 측정하였다. 대조군 GFP 세포와 비교한 면역-가교 세포의 상대적 성장을 초기 T 세포 처리 후 120 시간에 걸쳐 플롯팅하고 도 6a에 제공하였다. 데이터는 T 세포에 대한 반응으로 pMED178 및 pMED200 암세포의 선택적 감소를 보여준다.
T 세포에 의한 면역-가교 세포의 선택적 사멸은 별도의 실험 세트에서 추가로 확인되었다. 구체적으로, 다양한 암 세포주 (H460, A549, RKO, SK-HEP1, HCC1806, HEP3B, 및 KNS81)를 면역-가교 구조물 (pMED178, pMED179, pMED200 및 pMED201) 중 하나로 형질감염시키고 3D 스페로이드(종양)로 배양하였다. 인간 PBMC (hPBMC)를 암세포에 첨가하고 살아있는-세포 시간-경과 현미경 시스템인, Incucyte S3 (Sartorius)을 사용하여 면역-가교 단백질의 GFP 신호로 종양 질량을 모니터링하였다. PMBC를 추가한 후 시간에 걸쳐 PBMC+ 및 PBMC- 사이의 상대적 종양 질량을 계산하고 도 12에 플롯팅하였다. pMED200은 지속적으로 상당한 종양 세포 사멸을 유도한 반면 pMED178은 일관성이 없었다. pMED179 및 pMED201 (음성 대조군)은 인간 PBMC에서 유의미한 종양 세포 사멸을 유도하지 않았다.
초기 T 세포 활성화 마커인, CD69를 사용하여 각 조건에서 T 세포의 활성화를 또한 측정하였다. 결과는 도 6b에 제공된다. 이는 pMED178 및 pMED200 암 세포의 면역-가교 단백질이 PBMC에서 순수 T 세포를 활성화할 수 있음을 보여준다.
상기 면역-가교 단백질로 형질감염된 암세포는 또한 도 11a에 제공된 바와 같이 순수 인간 PBMC에서 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 발현을 유도할 수 있다. 표시된 면역-가교 단백질을 갖는 암세포에 노출된 PBMC에서 CD3+/CD8+ 및 CD3+/CD4+ 세포의 백분율을 세포 분석기 (Bio-Rad ZE5)로 측정하였다. pMED200은 특히 효과적이었으며, 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 확장을 통계적으로 유의미한 수준으로 유도하였다.
pMED200으로 형질감염된 암세포는 또한 T 세포 활성화 마커인, CD25를 사용하여 T 세포의 활성화에 대하여 테스트되었다. 도 11b는 pMED200을 발현하는 암세포에 노출된 후 순수 인간 PBMC에서 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 증가를 보여준다.
pMED179 및 pMED201은 T 세포에서 활성화를 나타내지 않았다. pMED179 및 pMED201은 마우스 CD3에만 결합하고, 인간 CD3에는 결합하지 않기 때문에 마우스 T 세포에만 작용하므로 상기 결과는 예상되었다. pMED178을 발현하는 암세포는 pMED200에 비해 T 세포의 현저히 낮은 활성화를 나타났다. 이론에 얽매이지 않고, T 세포에 대한 더 낮은 활성은 상기 면역-가교 단백질의 과도한 응집을 유도하여, pMED178을 발현하는 세포에 세포독성을 초래하는 pMED178의 감마 도메인(γ)과 연관되어 있는 것으로 여겨진다. pMED200은 훨씬 약한 올리고머화를 보여주며, 이는 과도한 응집 및 독성 없이 노출된 T-세포 활성화를 강화시키는 것으로 보인다.
6.2. 실시예 2: 면역-종양 표적을 식별하기 위한 고처리량 CRISPR 스크리닝 시스템
MDA-MB-231 암세포는 Cas9 및 상기 면역-가교 단백질을 발현하도록 변형되었다. 상기 세포는 20,000 개의 인간 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 렌티바이러스 풀을 포함하도록 추가로 변형되었다. 이러한 변형은 막에 상기 면역-가교 단백질을 발현하는 20,00 녹아웃 암세포의 라이브러리를 제공하였다 (도 3(1) 및 (2) 참조).
PBMC로부터 T 세포 (또는 NK 세포)를 제조하고 상기 면역-가교 단백질을 발현하는 녹아웃 암세포에 적용하였다. (도 2B 및 도 3(3) 참조) 면역 세포 처리를 복수 회 펄스하면, 상기 면역 세포에 내성이 있는 녹아웃 암세포는 농축되는 반면, 상기 면역 세포에 민감한 녹아웃 클론은 탈농축되었다. 상기 면역 세포 처리에 의해 농축 또는 탈농축된 녹아웃 클론은 상기 면역 세포를 처리한 암세포 라이브러리 및 상기 면역 세포를 처리하지 않은 암세포 라이브러리에서 sgRNA의 심층-시퀀싱 수를 비교하여 결정되었다. (도 3(5) 및 (6) 참조). 실험을 통해, 면역-종양 약물 표적이 식별되었다 (도 7 참조). 부정적인 면역 효과는 유전자의 결실이 MDA-MB-231 암세포를 면역 세포 공격에 더 취약하게 만드는 것을 의미하는 반면 긍정적인 면역 효과는 유전자의 결실이 암세포를 면역 세포에 더 강한 내성을 갖게 한다는 것을 의미한다.
게놈-규모 CRISPR 스크리닝 데이터의 볼케이노 플롯이 도 7에 제공된다. MDA-MB-231 세포에서 발현되어 더 강력한 부정적인 면역 효과를 나타낼 것으로 예상되는 잘 알려진 면역 억제제인, PD-L1을 포함하는, 여러 표적 (예를 들어, PTPN2, IRF1, RELA, PD-L1)을 식별한다. PD-L1은 실제로 부정적인 면역 효과가 있는 최고의 히트작 중 하나로 식별되었다. PTPN2, IRF1, 및 RELA는 면역 조절제로도 알려져 있으며 최고 히트작으로도 식별되었다. 이는 여기서 제공된 고처리량 분석 방법이 신규 약물 및 약물 표적을 식별하는 데 효과적인 방법임을 보여준다.
6.3. 실시예 3: 면역-종양 표적의 식별 및 검증을 위한 면역-가교 단백질의 사용
야생형 및 PD-L1 KO 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포주를 pMED200 구조물로 형질감염시켜 pMED200 면역-가교 단백질을 발현시켰다. 상기 야생형 및 pMED200을 발현하는 PD-L1 KO 세포를 배양하고 세 가지 다른 PBMC 조합 (PBMC#1, #2, 및 #1+2)에 노출시켰다. 배양물 내 종양 질량을 종양에서 발현된 GFP 마커에 의해 Incucyte S3에서 시간 경과에 따라 모니터링하고 상대적 종양 질량 (PBMC+/PBMC-)을 계산하여 도 13에 플롯팅하였다. 결과는 pMED200을 발현하는 PD-L1 KO 종양 세포가 pMED200을 발현하는 WO 종양 세포에 비해 PBMC에 훨씬 더 민감하다는 것을 보여준다. 이 종양-면역 공동-배양 기능 분석은 pMED200이 다양한 유전적 내용을 가진 인간 면역 세포 및 종양 세포 사이의 특정 상호작용을 재현하는 데 사용될 수 있고 새로운 면역-종양 표적을 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
상기 기능적 종양-면역 공동-배양 분석은 실시예 2에 기술된 실험으로부터 식별된 추가적인 면역-종양 표적 (PTPN2 및 MEDIC_001)에 대해 수행되었다. 야생형 및 PD-L1, PTPN2 또는 MEDIC_001 KO 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포주를 pMED200 구조물로 형질감염시켰고 hPBMC가 있거나 없는 아가로스 겔에 접종하였다. 종양 성장은 Leica Thunder Microscopy에서 종양의 GFP 신호로 모니터링되었으며 이미지는 도 14a 및 15a에 제공되었다. PBCM+ 및 PBMC- 샘플 간의 상대 종양 질량을 야생형, PD-L1 KO, MEDIC_001 KO, 및 PTPN2 KO TNBC#1 종양에 걸쳐 측정하고 도 14b 및 15b에 제공되었다. 그 결과는 PD-L1, PTPN2 KO 및 MEDIC_001 KO가 야생형보다 hPBMC에 의한 더 큰 종양 감소를 보여줌으로써 훨씬 더 민감하다는 것을 보여주었다.
6.4. 실시예 4: 면역-종양 약물 후보물질 또는 자가면역 질환 약물 후보물질에 대한 고처리량 약물 화합물 스크리닝
암세포를 상기 면역-가교 단백질 및 루시퍼라제를 발현하도록 변형하고 다중-웰 플레이트에 플레이팅하였다 (도 4 참조). 면역 세포의 존재 또는 부존재 하에 암세포를 약물 화합물의 라이브러리로 처리하였다. 면역 세포의 존재 및 면역 세포의 부존재 하에 약물 화합물로 처리된 암세포 간의 세포 성장을 측정하고 비교하였다. 비교를 통해, 암세포 및 면역 세포 사이의 상호작용을 조절하는 약물 화합물이 식별되었다.
상기 면역-가교 단백질 및 루시퍼라제를 포함하도록 변형된 비암세포로 유사한 실험을 수행하였다. 상기 세포를 다중-웰 플레이트에 플레이팅하고 면역 세포의 존재 및 부존재 하에 약물 화합물의 라이브러리로 처리하였다. 세포 성장 및 기타 물리적 또는 생물학적 특성을 측정하고 면역 세포의 존재 및 면역 세포의 부존재 하에 약물 화합물로 처리된 세포를 비교하였다. 비교를 통해, 상기 변형된 세포에 대한 면역 세포의 비정상적인 세포독성 효과에 관여하는 약물 화합물이 식별되었다. 상기 식별된 약물 화합물은 자가면역 질환 치료에 사용될 수 있다.
6.5. 실시예 5: 3D 종양 모델의 생성
3D 종양 모델은 종양 샘플을 마이크로캡슐에 캡슐화하여 생성되었다. 마이크로캡슐은 하기 설명된 대로 생성되었다.
산화 알지네이트: 나트륨 알지네이트를 이전에 기술된 바와 같이 처리하였다. 간단히, 알지네이트 2g을 증류수 100ml에 용해시켰다. 알지네이트 산화 백분율을 조절하기 위해 다양한 양의 과요오드산나트륨을 알지네이트 용액에 첨가하고 암실에서 일정하게 교반하면서 반응을 17 시간 동안 진행하였다. 다양한 양의 에틸렌 글리콜을 용액에 첨가하고 실온에서 30 분동안 상기 용액에서 교반하였다. 생성된 용액을 탈이온수에서 3일 동안 투석하였다 (분자량 컷오프 10 kDa). 이어서 생성물을 멸균 여과하고, 냉동시키고 동결건조시켰다.
용액 및 세포 현탁액 제조: 2% wt/vol 나트륨 알지네이트를 오토클레이브된 DI 물에 용해시키고 0.5mM SDS 계면활성제를 첨가하여 외부 용액을 제조하였다. 상기 용액을 멸균하고 4 ℃에 보관하였다. 산화된 알지네이트 (3% wt/vol)를 성장 배지에 용해시키고 A형 젤라틴 용액과 혼합하였다. 무효소 세포 해리 완충액 (Accutase)을 사용하여 세포를 분리하고 무혈청 DMEM에 최종 농도 3천만 세포/ml로 재현탁했다. 내부 용액 (IS)은 상기 세포 용액을 알지네이트-젤라틴 (또는 MatrigelTM) 혼합물 또는 PEG와 같은 대체 하이드로겔 매트릭스 물질과 혼합하여 제조되었다.
캡슐화 과정 및 캡슐화 효율의 특성화: 마이크로캡슐 생산은 전기 음향 마이크로 분사 시스템 (Bushi, Encapsulator)을 사용하여 수행되었다. 두 가지 용액 (외부 용액 및 내부 용액)을 제조하여 마이크로캡슐을 제조하고 각 압력병에 옮겼다. 외부 용액 및 내부 용액 모두 공심 노즐 시스템을 포함하는 마이크로캡슐 생산 장치로 공기압에 의해 밀어 넣어졌다. 투명한 마이크로캡슐 체인을 만들기 위해 액체 유속 및 진동 주파수를 각각 조절하였다. 마이크로캡슐 체인의 액체 제트는 정전기 분산 장치를 활성화하여 깔때기-모양의 다중-라인 스트림으로 변환되었다. 정전하 하에서 분리된 캡슐을 100mM 염화칼슘 및 미량의 Tween 20 계면활성제가 함유된 경화액에 투입하여 고체화하였다. 마이크로캡슐을 200μm 세포 여과기로 즉시 체질하고, 300mM D-소르비톨 용액으로 세척하고 15 분 이내로 적절한 배양 배지로 옮겼다. 사용 후, 미세 유동 장치를 소독제, 70% 에탄올 및 탈이온수로 세척하였다. 캡슐화 효율은 현미경으로 촬영한 수백 개의 캡슐의 이미지 분석을 통해 평가되었다. 세포를 포함하는 마이크로캡슐은 초당 약 500개의 속도로 생산되며 수 분 동안 수집된다.
6.6. 실시예 6: 다중화 3D 종양 모델에서의 약물 테스트
각 종양 샘플에 고유한 DNA 바코드를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 복수 종양 샘플을 형질도입하였다. (도 5(1)) 고유 바코드는 도 5에서 “BC1,” “BC2,” “BC3,” 등으로 표시된다.
그런 다음 바코드가 표시된, 복수 종양 샘플을 상기 실시예 5에 기술된 대로, 크기가 100 μm 내지 1 mm 범위인 마이크로캡슐로 캡슐화하였다. 상기 마이크로캡슐의 외부 층은 단단한/비유연성 알지네이트 기반 껍질인 반면, 내부 층은 내부 종양 세포의 고정-독립적인 3D 성장을 허용하는 분해 가능하고, 유연한 하이드로겔이었다. 예를 들어, Matrigel, 분해성 알지네이트 하이드로겔, 분해성 PEG, 및 임의의 기타 하이드로겔 폴리머를 세포의 3D 배양에 사용할 수 있다. 이어서 복수 종양 샘플을 함유하는 마이크로캡슐을 시험 약물의 존재 또는 부존재 하에 배양하였다. 반응 후, 마이크로캡슐로부터 종양 세포를 추출하고 바코드 분석을 위해 종양 세포로부터 게놈 DNA를 제조하였다. (도 5(5) 및 5(6)) 복수 종양 샘플에 걸쳐 약물 반응을 이해하기 위해 약물이 없는 조건과 약물 조건 사이의 바코드 비율을 계산하였다. DNA 바코드된 암 샘플의 다중화는 이전에 약물 시험을 위해 시도되었지만 (Yu et al., 2016), 이는 주로 판독값 (PRISM 검출)이 다른 시험관 내 2D 암 모델 (또는 마우스 모델)로 제한된다. 여기서 설명된 방법은 전통적인 세포 DNA 바코드 방법과 마이크로-캡슐 캡슐화 기술을 결합하여 종양 간 혼선(crosstalk) 없이 다중화 3D 종양 모델에서 약물 시험을 허용한다는 점에서 새로운 것이며, 이는 다중-웰 플레이트를 기반으로 한 보다 전통적인 방법과 비교하면 3D 종양에서 이러한 약물 스크린을 수행하는 데 드는 시간 및 비용을 크게 줄일 수 있다.
6.7. 실시예 7: 3D 종양 모델에서 다중화된 CRISPR 기능 유전체
3D 종양 모델에서 다중화된 CRISPR 기능 유전체의 도식은 도 8에서 제공된다. 하나의 게놈-규모 CRISPR 라이브러리는 20,000개의 인간 유전자를 표적으로 하는 수십만 개의 sgRNA를 포함한다. 복수 세트의 게놈-규모 CRISPR 라이브러리는 각 종양 샘플에 고유한 DNA 서열로 개별적으로 바코드화되었다. (예를 들어, 도 8의 BC1 및 BC2) 그런 다음 바코드된 CRISPR 라이브러리는 Han, K. et al. (2020) “CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities”, Nature, 580 (7801), pp. 136-141에 개시된 프로토콜을 사용하여 종양 샘플에 별도로 형질도입되었다. 이어서 종양 샘플을 도 5에서 상기 기술된 바와 같이 마이크로캡슐로 캡슐화하였다.
복수 세트의 종양 샘플을 다중화하고 배양하였다. 28일 동안 배양한 후, 종양 세포를 추출하고 상기 종양 샘플로부터 게놈 DNA를 제조하였다. sgDNA 및 관련 DNA 바코드는 페어드-엔드 (paired-end) 서열분석 프로토콜을 사용하여 Illumina NGS에 의해 판독되고 계산되었으며, 마지막으로 sgRNA 수는 각 종양 샘플에 고유한 DNA 바코드에 의해 역다중화되었다. 원래 종양 샘플까지 추적된 sgRNA 수는 각 종양 샘플에서 CRISPR-유도된 유전적 변화를 계산하는 데 사용되었다.
예를 들어, 2개의 혼합 암 샘플로부터의 sgRNA 수의 역다중화는 도 9a에 도시되어 있다. 2개의 암 샘플 (샘플1 및 샘플2)은 고유하게 바코드된 (BC1 및 BC2) 게놈-규모 CRISPR 라이브러리를 사용하여 별도로 형질도입되었다. 상기 2개의 암 샘플을 개별적으로 배양하거나 (샘플 1 (비혼합) 또는 샘플 2 (비혼합)) 혼합하여 함께 배양하였다 (샘플 1 & 2 (혼합)) (도 9a 참조).
이들의 게놈 DNA는 2개의 암 샘플로부터 개별적으로 (비혼합 샘플) 또는 2개의 혼합 암 샘플 (혼합 샘플)로부터 추출되었다. sgRNA는 역다중화가 필요하지 않은, 비혼합 샘플에서 계산되었다. 혼합 샘플의 sgRNA를 먼저 DNA 바코드로 역다중화하고 각 종양 샘플에 대해 계산하였다. 비혼합 또는 혼합 샘플에서 샘플1 및 샘플 2의 sgRNA 수의 쌍 상관관계 (pairwise correlation)를 비교하였고 이들의 쌍 상관관계 값을 도 9b의 히트맵으로 제공한다. 상기 히트맵은 혼합 샘플의 역다중화 sgRNA 수가 비혼합 샘플의 원래 개수와 유사하다는 것을 명확하게 보여준다: 샘플1 (비혼합)은 샘플 1 (혼합)과 높은 상관관계 (>0.95 피어슨 상관관계 (pearson correlation))를 보여준다. 샘플2 (비혼합)는 샘플 2 (혼합)과도 높은 상관관계를 보여준다. *로 표시된 샘플은 NGS용 시퀀싱 라이브러리를 만들기 위해 2단계 PCR로 준비한 반면 다른 모든 샘플은 1단계 PCR로 준비하였다.
2개의 게놈-규모 CRISPR 스크린은 도 8에 기술된 절차에 따라 2개의, 다중화된 종양 샘플 (RKO (결장 종양) 및 OVCAR8 (난소 종양) 샘플)에서 동시에 수행되었다. sgRNA를 앞서 기술한 대로 역다중화하고 계수하였으며 역다중화된 sgRNA 수로부터 각 종양 샘플에 대해 CRISPR 효과를 계산하였다. 도 10a 및 도 10b는 CRISPR 유도된 녹아웃 (x-축) 및 신뢰도 점수 (y-축)의 성장 효과를 기반으로 암 세포 성장에 영향을 미치는 유전자를 플롯팅하였다. 상기 분석은 암세포 성장과 연관이 있는 것으로 알려진, 여러 유전자 (예를 들어, UBA6, YPEL5, CDK2, XRN1, SDHA, SLC7A5, PRKRA, CAD)를 식별하였다.
7. 등가물 및 참조에 의한 통합
본 개시는 특히 바람직한 구현예 및 다양한 대안적인 구현예를 참조하여 도시되고 설명되었지만, 관련 기술분야의 당업자는 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 본 개시의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서의 본문 내에 인용된 모든 참고 문헌, 등록 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해, 전체 내용이 참조로 포함된다.
8. 서열목록

Claims (98)

  1. a. 면역 세포 마커에 대한 scFv,
    b. 막횡단 도메인,
    c. 세포질 도메인, 및
    d. 리포터 도메인으로서, 선택적으로 상기 리포터 도메인은 형광 단백질인, 리포터 도메인
    :을 N 말단에서 C 말단까지 포함하는 면역-가교(immune-bridge) 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포 마커는 T 세포 또는 NK 세포의 세포 표면 단백질인, 면역-가교 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포 마커는 CD3인, 면역-가교 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포 마커는 NKp46인, 면역-가교 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 B7의 막횡단 도메인인, 면역-가교 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포질 도메인은 B7의 세포질 도메인인, 면역-가교 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역-가교 단백질의 세포내 또는 세포외 부분에 면역염색을 위한 에피토프를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 에피토프는 HA 에피토프 및 V5 에피토프로부터 선택되는, 면역-가교 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역-가교 단백질의 N-말단에 신호 펩티드, 선택적으로 H7 신호 펩티드를 추가로 포함하는, 면역-가교 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역-가교 단백질의 세포외 부분에 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3 영역을 추가로 포함하는, 면역-가교 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 면역-가교 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역-가교 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드인, 면역-가교 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 면역-가교 벡터.
  14. 복수의 표적화-라이브러리 구조물을 포함하는 표적화 라이브러리로서, 각각의 상기 표적화-라이브러리 구조물은 복수의 게놈 표적 부위 중 하나를 표적화하는 sgRNA을 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함하는, 표적화 라이브러리(targeting library).
  15. 제14항에 있어서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 바코드 서열을 추가로 포함하는, 표적화 라이브러리.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 10,000개 이상의 부위를 집합적으로(collectively) 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함하는, 표적화 라이브러리.
  17. 제16항에 있어서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 15,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함하는, 표적화 라이브러리.
  18. 제17항에 있어서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 20,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함하는, 표적화 라이브러리.
  19. 제18항에 있어서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 50,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함하는, 표적화 라이브러리.
  20. 제19항에 있어서, 상기 복수의 표적화-라이브러리 구조물은 인간 게놈에서 100,000개 이상의 부위를 집합적으로 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 sgRNA-코딩 서열을 포함하는, 표적화 라이브러리.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 상기 sgRNA-코딩 서열 및 상기 바코드 서열의 고유한 쌍을 포함하는, 표적화 라이브러리.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 추가로 포함하는, 표적화 라이브러리.
  23. 제22항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), MAD 엔도뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제 (MN)인, 표적화 라이브러리.
  24. 제23항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 CAS9인, 표적화 라이브러리.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 바이러스 벡터 또는 플라스미드인, 표적화 라이브러리.
  26. 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 표적화-라이브러리 구조물은 렌티바이러스 벡터인, 표적화 라이브러리.
  27. 세포 집단으로서, 상기 집단 내의 적어도 복수의 세포가 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항의 표적화-라이브러리 구조물을 포함하고, 상기 세포 집단은 복수 유형의 표적화-라이브러리 구조물을 집합적으로 포함하는, 세포 집단.
  28. 제27항에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 단백질을 추가로 포함하는, 세포 집단.
  29. 제27항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제10항의 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 벡터를 포함하는, 세포 집단.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암세포인, 세포 집단.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포는 하나 이상의 암세포주인, 세포 집단.
  32. 제31항에 있어서, 복수 세포주를 포함하고, 각각의 세포주는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 세포주-특이적 바코드를 포함하는, 세포 집단.
  33. 제30항에 있어서, 상기 세포는 원발성 암세포인, 세포 집단.
  34. 제33항에 있어서, 상기 세포는 한 명 이상의 암 환자로부터의 원발성 암세포인, 세포 집단.
  35. 제34항에 있어서, 복수의 암 환자로부터의 원발성 암세포를 포함하고, 단일 암 환자로부터의 세포는 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드 상의 고유한 환자-특이적 바코드를 포함하는, 세포 집단.
  36. 제30항에 있어서, 상기 세포는 고형 종양 세포인, 세포 집단.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 제10항의 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 벡터, 또는 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항의 상기 표적화 라이브러리로 형질감염되었던 것인, 세포 집단.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포는 제10항의 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 벡터, 및 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항의 상기 표적화 라이브러리로 형질감염되었던 것인, 세포 집단.
  39. 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화-라이브러리 구조물 또는 면역-가교 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 마커 단백질을 추가로 포함하는, 세포 집단.
  40. 제39항에 있어서, 상기 마커 단백질은 루시퍼라제인, 세포 집단.
  41. 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는, 세포 집단.
  42. 제41항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), MAD 엔도뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제 (MN)인, 세포 집단.
  43. 제42항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 CAS9인, 세포 집단.
  44. 세포 집단으로서, 상기 집단 내의 적어도 복수의 세포가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 단백질을 포함하는, 세포 집단.
  45. 제27항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 세포 집단을 캡슐화하는 마이크로캡슐 풀(pool).
  46. 제45항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 동일한 바코드 서열을 포함하는 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  47. 제46항에 있어서, 상기 동일한 바코드 서열은 세포주-특이적 바코드 또는 환자 특이적 바코드의 서열인, 마이크로캡슐 풀.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 동일한 대상체로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  49. 제48항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 동일한 암 환자로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  50. 제48항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 단일 세포주로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  51. 제45항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2개 이상의 상이한 바코드 서열을 포함하는 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  52. 제51항에 있어서, 상기 2개 이상의 상이한 바코드 서열은 세포주-특이적 바코드 또는 환자 특이적 바코드의 서열인, 마이크로캡슐 풀.
  53. 제45항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2명 이상의 대상체로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  54. 제45항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2명 이상의 암 환자로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  55. 제45항에 있어서, 상기 마이크로캡슐 각각은 2개 이상의 세포주로부터 얻은 상기 세포 집단의 하위세트를 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 추가로 캡슐화하는, 마이크로캡슐 풀.
  57. 제56항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포를 포함하는, 마이크로캡슐 풀.
  58. 제56항에 있어서, 상기 면역 세포는 NK 세포를 포함하는, 마이크로캡슐 풀.
  59. 제56항에 있어서, 상기 면역 세포는 수지상 세포를 포함하는, 마이크로캡슐 풀.
  60. 제56항에 있어서, 상기 면역 세포는 대식세포를 포함하는, 마이크로캡슐 풀.
  61. 제56항에 있어서, 상기 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하는, 마이크로캡슐 풀.
  62. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지에서 배양된, 마이크로캡슐 풀.
  63. 제45항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 3D 종양 오가노이드를 형성하는, 마이크로캡슐 풀.
  64. a. 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항의 상기 세포 집단을 배양하거나 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항의 상기 마이크로캡슐 풀을 배양하는 단계; 및
    b. 상기 배양물에서 얻은 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 고처리량 스크리닝 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 분석 단계는 상기 배양물로부터 얻은 세포의 표적화-라이브러리 구조물을 서열분석하는 것을 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 분석 단계는 상기 표적화-라이브러리 구조물의 바코드 서열을 서열분석하는 것을 포함하는, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 분석 단계는 상기 표적화-라이브러리 구조물의 sgRNA의 코딩 서열을 서열분석하는 것을 포함하는, 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 면역 세포의 존재 하에 배양되는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 면역 세포의 부존재 하에 상이한 세포 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 면역-종양 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 면역 세포의 존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포 및 면역 세포의 부존재 하에 상기 배양물로부터의 세포를 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 면역-종양 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포를 포함하는, 방법.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 NK 세포를 포함하는, 방법.
  76. 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 수지상 세포를 포함하는, 방법.
  77. 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 대식세포를 포함하는, 방법.
  78. 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하는, 방법.
  79. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 하나 이상의 약물의 존재 하에 배양되는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 세포 집단은 추가로 면역 세포의 존재 하에 배양되는, 방법.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 상기 하나 이상의 약물의 부존재 하에 상이한 세포 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 하나 이상의 약물의 존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포 및 하나 이상의 약물의 부존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포를 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 약물을 식별하여 효과적인 약물을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  84. 제82항에 있어서, 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 약물 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  85. 제80항에 있어서, 면역 세포의 부존재 하에 상이한 세포 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 면역 세포의 존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포 및 면역 세포의 부존재 하에 상기 배양물로부터 얻은 세포를 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 약물을 식별하여 효과적인 약물을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  88. 제86항에 있어서, 하나 이상의 배양 조건에서 세포의 생존 또는 사멸과 연관된 게놈 부위를 식별하여 약물 표적을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  89. 제64항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 단계는 배양 접시 또는 멀티-웰 플레이트에서 수행되는, 방법.
  90. 제64항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 단계는 복수의 마이크로캡슐에서 수행되는, 방법.
  91. 제64항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 단계는 3D 종양 오가노이드에서 수행되는, 방법.
  92. a. 제10항의 상기 면역-가교 폴리뉴클레오티드, 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 상기 면역-가교 벡터, 및
    b. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항의 상기 표적화 라이브러리를 포함하는 고처리량 스크리닝 키트.
  93. 제92항에 있어서, 외인성 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레아제 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 키트.
  94. 제93항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레아제는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문 반복 (CRISPR) 연관 단백질, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), MAD 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제 (MN)로 이루어진 군으로부터 선택된, 키트.
  95. 제93항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레아제는 CAS9인, 키트.
  96. 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 단백질을 코딩하는 마커 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 키트.
  97. 제96항에 있어서, 상기 마커 단백질은 루시퍼라제인, 키트.
  98. 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제 폴리뉴클레오티드 또는 상기 마커 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터이고, 선택적으로 렌티바이러스 벡터인, 키트.
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