CN108753828A - 一种bancr基因的干扰载体、载体系统及其应用 - Google Patents

一种bancr基因的干扰载体、载体系统及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108753828A
CN108753828A CN201810666957.8A CN201810666957A CN108753828A CN 108753828 A CN108753828 A CN 108753828A CN 201810666957 A CN201810666957 A CN 201810666957A CN 108753828 A CN108753828 A CN 108753828A
Authority
CN
China
Prior art keywords
interference
carrier
bancr
genes
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810666957.8A
Other languages
English (en)
Inventor
朱月春
杨丽娟
杨惠鑫
杨雨叶
白宏刚
蒋露
易子寒
张巧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Medical University
Original Assignee
Kunming Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Medical University filed Critical Kunming Medical University
Priority to CN201810666957.8A priority Critical patent/CN108753828A/zh
Publication of CN108753828A publication Critical patent/CN108753828A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种BANCR基因的干扰载体、载体系统及其应用。本发明所述干扰载体由RNA干扰载体骨架和针对BANCR基因的干扰序列组成，其中，所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明所述干扰载体、载体系统和应用能够高效地敲减人BANCR基因，为人BANCR基因的研究提供平台，为基于BANCR的基因治疗方法提供依据。

Description

一种BANCR基因的干扰载体、载体系统及其应用
技术领域
本发明涉及基因敲减领域，具体而言，涉及一种BANCR基因的干扰载体、载体系统及其应用。
背景技术
长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们虽然不编码蛋白质，但以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控和转录后调控等多个层面上调控基因的表达。lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具备生物学功能，然而，近年来的相关研究表明，lncRNA同时参与了染色质修饰、X染色体沉默、转录干扰、转录激活、核运输等多个重要的调控过程，尤其是在肿瘤发生发展过程中也起到了重要作用。直到目前，发现的具有功能的lncRNA已超过7000个，其中有些可以作为肿瘤诊断及监测进展的指标，并能够为肿瘤的治疗提供靶点，未来也许也可以作为肿瘤的疗效判定标准之一。
BANCR(BRAF activated long non-coding RNA)是新发现的一个lncRNA，位于第9号染色体，全长688bp，它是由BRAF基因发生突变(BRAF V600E)产生的。目前发现，BANCR参与Wnt信号通路、MAPK信号通路、EMT过程、NF-kappaB1过程和炎症反应，BANCR的过表达与黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、甲状腺癌、胃癌、结肠癌、非小细胞肺癌等的发生和转移有关。BANCR在未来可能在肿瘤的诊断和治疗中发挥诊断性标记物以及抗肿瘤药物靶点的重要作用，对提高肿瘤及相关疾病的临床诊断及治愈率，具有重要作用。但目前关于BANCR的具体作用机制及其与各信号通路的具体关系尚为研究清楚。
慢病毒干扰载体能够对目标基因进行有效敲减，为研究基因功能提供良好的平台。因此，提供能够高效敲减BANCR基因的慢病毒干扰载体对研究BANCR基因的功能十分重要，同时，也对后续依赖于BANCR的基因治疗方法提供理论基础。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种BANCR基因的干扰载体；
本发明的第二目的在于提供一种BANCR基因的干扰载体系统；
本发明的第三目的在于提供一种针对BANCR基因的shRNA；
本发明的第四目的在于提供一种构建前述干扰载体的方法；
本发明的第五目的在于提供一种干扰BANCR基因的慢病毒；
本发明的第六目的在于提供前述干扰载体或干扰载体系统在敲减BANCR基因中的应用。
本发明提供的前述干扰载体、干扰载体系统、shRNA、载体构建方法、慢病毒以及相关应用，能够解决高效敲除人BANCR基因的技术问题，为人BANCR基因的研究提供平台，为基于BANCR的基因治疗方法提供依据。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种BANCR基因的干扰载体，所述干扰载体由RNA干扰载体骨架和针对人BANCR基因的干扰序列组成，其中，所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些具体的实施方式中，所述RNA干扰载体骨架选自RNA干扰腺病毒载体或RNA干扰慢病毒载体；
优选地，所述RNA干扰载体骨架为RNA干扰慢病毒载体；更优选地，所述RNA干扰慢病毒载体为LV3。
本发明还涉及一种BANCR基因的干扰载体系统，所述干扰载体系统包括前述干扰载体和辅助载体。
在一些具体的实施方式中，所述辅助载体为包装质粒，优选地，所述包装质粒为pGag/Pol、pRev和pVSV-G。
本发明还涉及一种针对BANCR基因的shRNA，所述shRNA由正义链和与之互补配对的反义链组成，其中，所述正义链和反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：9-10所示。
本发明还涉及一种构建前述干扰载体的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将SEQ ID NO：9-10所示的寡核苷酸通过退火形成双链shRNA；
(2)将步骤(1)所述shRNA与经过酶切的RNA干扰载体骨架进行连接，即得所述干扰载体。
在一些具体的实施方式中，所述RNA干扰载体骨架为慢病毒载体LV3。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括：将所述干扰载体进行包装、转染和收集，即得干扰人BANCR基因的慢病毒。
本发明还涉及一种干扰人BANCR基因的慢病毒，所述慢病毒根据前述方法制备而成。
本发明还涉及前述干扰载体或干扰载体系统在敲减人BANCR基因中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述干扰载体、干扰载体系统、shRNA、载体构建方法、慢病毒以及相关应用，能够将人BANCR基因的表达敲减至20～30％左右，可解决高效敲除BANCR基因的技术问题，为BANCR基因的研究提供平台，为基于BANCR的基因治疗方法提供依据。
(2)本发明优选干扰载体骨架为慢病毒干扰载体，与传统的电转染、脂质体转染等物理化学转染方法相比，除了保证良好的生物安全性，更具高效性和稳定性。
(3)本发明优选慢病毒干扰载体骨架为LV3载体，其包括H1启动子，能够有效启动shRNA的转录，在多种细胞中稳定表达；LV3载体中还包括具有独立启动子的GFP，既保留了GFP的作用，也避免GFP对目的基因功能产生影响；所述GFP基因能够准确追踪载体进入细胞内的位置，并且能够了解不同环境下该病毒的感染效率，使BANCR基因研究更直观。
(4)本发明所述干扰载体系统优选地包括三种辅助质粒pGag/Pol、pRev和pVSV-G，不但提供病毒包装所需的反式作用因子，同时采用“自我灭活”修饰，阻止子代病毒自我复制和转移，从而确保产生的慢病毒具备良好的生物安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的LV3质粒的物理图谱；
图2为本发明实施例2提供的已插入BANCR shRNA序列的重组载体图；
图3为本发明实施例3提供的克隆到载体上的shRNA序列测序结果图；
图4为本发明实施例6提供的瞬时转染BANCR shRNA的A375细胞中BANCR基因的表达情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
选择干扰载体及设计和合成人LncRNA BANCR基因的shRNA序列
选取表达绿色荧光蛋白的LV3作为干扰载体，用Designer3.0(Genepharma)软件设计人LncRNA BANCR基因的干扰序列，所述人LncRNA BANCR基因在GenBank中的登记号为：Gene ID:100885775，所述干扰序列共4组，其核苷酸序列如表1所示。
表1人LncRNA BANCR基因的干扰序列
名称 序列 SEQ ID NO.
KD#1 5’-CTGACCCTAAGGAAATAGACT-3’ 1
KD#2 5’-CGATCATCTTGCCCAGAAACA-3’ 2
KD#3 5’-GGAGTGGCGACTATAGCAAAC-3’ 3
KD#4 5’-GGACTCCATGGCAAACGTTGT-3’ 4
根据干扰序列设计互补配对的shRNA序列：其中，shRNA正义模板链的通式为：5’-GATCC-G-干扰序列-TTCAAGAGA-与干扰序列反向互补的序列-C-TTTTTTG-3’；
shRNA反义模板链的通式为：5’-AATTCAAAAAA-G-干扰序列-TCTCTTGAA-与干扰序列反向互补的序列-C-G-3’。
shRNA序列中的loop结构选用TTCAAGAGA以避免形成终止信号，正义链模板的5’端添加GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补，反义链模板的5’端添加AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补；所述shRNA的序列如表2所示：
表2人LncRNA BANCR基因的shRNA序列
合成shRNA正义链和反义链，分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μM；配置退火反应体系，进行退火处理，得到浓度为10μM的双链shRNA；将所得shRNA溶液稀释50倍，使其终浓度为200nM，用于连接反应。所述退火反应体系如表3所示，退火循环程序如表4所示：
表3人LncRNA BANCR基因shRNA序列的退火反应体系
试剂 体积(μL)
10×shDNA退火缓冲液 5
正义链(100μM) 5
反义链(100μM) 5
ddH2O 35
表4人LncRNA BANCR基因shRNA序列的退火循环程序
温度(℃) 时间
95 5min
85 5min
75 5min
70 5min
72 5min
实施例2
人LncRNA BANCR基因慢病毒干扰载体的构建
对LV3载体进行双酶切：在无菌的0.2mL EP反应管，取LV3载体10μg，用BamHI和EcoR I限制性内切酶进行双酶切；将上述体系混匀后，37℃反应1h；此时，经过双酶切的LV3为线性化载体，将线性化的LV3通过Agarose电泳及Agarose Gel DNA Purification KitVer2.0回收。具体酶切体系如表5所示：
表5 LV3载体的双酶切体系
试剂 体积(μL)
2×Buffer Tango 10μL
LV3 DNA 10μg
BamHI 5U
EcoRI 5U
ddH2O To 100μL
利用T4连接酶体系，将实施例1中退火后得到的双链shRNA重组克隆到线性化的LV3载体中，反应体系如表6所示。
表6 shRNA-LV 3连接体系
试剂 体积(μl)
10×T4 Ligation Buffer 2
LV3(BamHI+EcoR I) 1
shRNA template(100nM) 1
T4 DNA ligase 1
ddH2O 15
使用移液器上下吹打上述混合物数次，轻轻混匀各组分，置于22℃反应1h。LV3质粒的物理图谱如图1所示。已插入双链shRNA的重组载体如图2所示，从图2中可看到双链shRNA的插入位置。
实施例3
重组载体的转化与鉴定
重组连接产物的转化：将装有感受态细胞DH5α的离心管冰上放置4min，待感受态细胞解冻后，加入10μl重组连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30min。将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90s，不要摇动离心管。快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3min。向每支离心管加入800μl LB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250rpm，培育45min使细菌复苏。取200μl培育后的细胞均匀涂布于含50μg/ml Ampicillin LB平板上。等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16h。
重组载体的鉴定：从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Ampicillin)LB培养基的试管中，将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250rpm，培养16h。将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，将抽提好的质粒进行双酶切鉴定。酶切37℃，1h后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液用甘油保存。将测序结果与目的基因shRNA序列进行比对，正解无误，显示重组载体构建成功，如图3所示。此外，用保存的甘油菌液接菌LB培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒。
实施例4
慢病毒包装、收集及滴度检测
病毒包装：将对数生长期的293T细胞接种至15cm培养皿，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液，混匀后置于37℃，5％CO2培养箱培养过夜。次日，在一支无菌的5ml离心管中加入1.5ml无血清DMEM，按比例加入含目的序列的重组质粒(实施例3所获重组载体)和包装质粒pGag/Pol、pRev和pVSV-G,混匀，取另一支无菌的5ml离心管，加入1.5ml无血清DMEM，再加入300μl RNAi-Mate，混匀，室温放置5min后将两管混合，室温放置20-25min。除去15cm培养皿中的培养液，加入8ml无血清的DMEM培养液。将转染混合物逐滴加入15cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37℃，5％CO2培养箱中温育4-6h。吸弃转染液，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养箱继续培养72h。
病毒收集：将培养皿中细胞上清液吸到50ml离心管中，4℃，4000rpm，4min。低速离心后，将离心管上清液倒入50ml注射器内，用0.45μm过滤器过滤。滤液在离心机中进行超速离心，4℃，20000rpm，2h。将浓缩液收集分装至冻存管中。分装的病毒液贴上标签，-80℃冰箱保存。
病毒滴度检测：取对数生长期的293T细胞，按3×104个细胞/孔的浓度接种于96孔板，混匀后于37℃，5％CO2培养箱培养24h。次日，将慢病毒原液10μl，用10％FBS的DMEM培养液十倍稀释3-5个梯度。吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μl稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37℃，5％CO2培养箱培养24h。吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入100μl10％FBS的DMEM培液，于37℃，5％CO2培养箱继续培养72h。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
病毒滴度(BT＝TU/ml，transducing units)计算公式：
TU/μl＝(P×N/100×V)×1/DF，其中，P＝％GFP+cells，N＝转染时的细胞数，V＝每孔加入病毒稀释液体积(μl)，DF＝稀释因子(dilution factor)＝1(undiluted)、10-1(diluted 1/10)、10-2(diluted 1/100)。
实施例5
慢病毒感染A375细胞：取对数生长期的A375细胞，按2.5×105个细胞/孔的浓度接种于24孔板中，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱培养过夜；次日，制备病毒稀释液(DMEM培养基400μl+终浓度5μg/ml Polybrene)，将实施例4包装的慢病毒原液按1:9加入到稀释液中，将稀释液加入到细胞培养孔中，37℃，5％CO2培养箱培养过夜。12-24h后移去细胞侵染后的病毒液，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱继续培养24-48h，在荧光倒置显微镜下观察结果。培养48h后，荧光倒置显微镜下可见绝大多数细胞呈现较强的绿色荧光，提示重组慢病毒载体成功感染A375细胞。
实施例6
实时荧光定量PCR检测瞬时转染后细胞内目的基因的表达量：
细胞总RNA提取：瞬时转染96h后的A375细胞(实施例5)用DEPC处理的PBS漂洗一次，加入400μL RNA裂解液重悬细胞；在裂解液中加入400μL异丙醇和30μL磁珠，颠倒混匀，室温放置10分钟，放置于磁力架上待磁珠完全吸附后吸弃液体，500μL RNA抽提去蛋白液洗涤磁珠；再向离心管中加入500μL 80％乙醇重悬磁珠，重复上述洗涤步骤1次，第二次洗涤待磁珠完全吸附后充分吸弃液体(不要有残留)，室温晾干5-10min；在无RNA酶的1.5mL离心管用移液器配置以下DNase I反应液，将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入75μLDNase I反应液，移液器吹打重悬磁珠，37℃孵育15min，每隔5分钟轻弹管底悬浮磁珠，以防磁珠成团。加入700μL RNA抽提去蛋白液重悬磁珠，再加500μL 80％乙醇重悬磁珠；待磁珠完全吸附后吸弃液体，室温晾干2min。向离心管中加入50-100μL洗脱液EB，56℃孵育5分钟，将离心管重新放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后小心将总RNA溶液转移至新的离心管，放入-80℃保存备用。
逆转录合成cDNA：取总RNA 2ng-2μg，用Reverse Transcriptase M-MLV逆转录酶，按说明合成cDNA。具体步骤：先在总RNA中加入2μL随机引物，加水(DEPC处理)补足至15μL，混匀，70℃温育混合物5min后，冰上骤冷。再依次加入5×Reaction Buffer 4μL，10mMdNTPs mix 0.8μL，MMLV RTase RNaseH(100U)0.5μL，42℃温育45min，最后85℃加热10min灭活反转录酶终止反应后冰上冷却。反应液用作PCR模板。
荧光定量PCR：按说明书配置反应体系，上机进行PCR扩增和检测。反应总体系为20μL，分别是2×Real-time PCR Master Mix 10μL，上下游引物(20μM)各0.1μL，cDNA模板2μL，rTaq DNA polymerase(5U/μL)0.4μL，用灭菌水补足至20μL。
其中，BANCR基因荧光定量PCR引物序列如下：
BANCR-FO：5’-CTCGCTTTCACTTTATGGATTC-3’(SEQ ID NO：13)；BANCR-RE：5’-GGGTCAGGGGTCTCTTCAG-3’(SEQ ID NO：14)。
另外，还设计了GAPDH基因的对照实验组，其中GAPDH基因荧光定量PCR引物序列如下：
GAPDH-FO：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’(SEQ ID NO：15)；GAPDH-RE：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’(SEQ ID NO：16)。
反应条件95℃，3min预变性；循环内95℃，30s变性，62℃退火40s，共40个循环，并在每个循环延伸末收集荧光信号，绘制扩增曲线，计算转染不同shRNA慢病毒载体后，A375细胞中BANCR基因的表达水平，具体检测结果参见说明书附图图4。根据说明书附图图4可知，干扰序列KD#3对BANCR基因的敲减效果最好，干扰序列KD#2的敲减效果次之，而KD#1和KD#4对BANCR基因的表达无明显影响。
实施例7
慢病毒感染SW480细胞：取对数生长期的SW480细胞，按3.0×105个细胞/孔的浓度接种于24孔板中，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱培养过夜；次日，制备病毒稀释液(DMEM培养基400μl+终浓度10μg/ml Polybrene)，将实施例4包装的慢病毒原液按1:9加入到稀释液中，将稀释液加入到细胞培养孔中，37℃，5％CO2培养箱培养过夜。12-24h后移去细胞侵染后的病毒液，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱继续培养24-48h，在荧光倒置显微镜下观察结果。培养48h后，荧光倒置显微镜下可见绝大多数细胞呈现较强的绿色荧光，提示重组慢病毒载体成功感染SW480细胞。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学
<120> 一种BANCR基因的干扰载体、载体系统及其应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgaccctaa ggaaatagac t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgatcatctt gcccagaaac a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggagtggcga ctatagcaaa c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggactccatg gcaaacgttg t 21
<210> 5
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatccgctga ccctaaggaa atagactttc aagagaagtc tatttcctta gggtcagctt 60
ttttg 65
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aattcaaaaa agctgaccct aaggaaatag acttctcttg aaagtctatt tccttagggt 60
cagcg 65
<210> 7
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatccgcgat catcttgccc agaaacattc aagagatgtt tctgggcaag atgatcgctt 60
ttttg 65
<210> 8
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aattcaaaaa agcgatcatc ttgcccagaa acatctcttg aatgtttctg ggcaagatga 60
tcgcg 65
<210> 9
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatccgggag tggcgactat agcaaacttc aagagagttt gctatagtcg ccactccctt 60
ttttg 65
<210> 10
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aattcaaaaa agggagtggc gactatagca aactctcttg aagtttgcta tagtcgccac 60
tcccg 65
<210> 11
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatccgggac tccatggcaa acgttgtttc aagagaacaa cgtttgccat ggagtccctt 60
ttttg 65
<210> 12
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aattcaaaaa agggactcca tggcaaacgt tgttctcttg aaacaacgtt tgccatggag 60
tcccg 65
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctcgctttca ctttatggat tc 22
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gggtcagggg tctcttcag 19
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
catgagaagt atgacaacag cct 23
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agtccttcca cgataccaaa gt 22

Claims (10)

1.一种BANCR基因的干扰载体，其特征在于，所述干扰载体由RNA干扰载体骨架和针对BANCR基因的干扰序列组成，其中，所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体骨架选自RNA干扰腺病毒载体或RNA干扰慢病毒载体；
优选地，所述RNA干扰载体骨架为RNA干扰慢病毒载体；更优选地，所述RNA干扰慢病毒载体为LV3。
3.一种人BANCR基因的干扰载体系统，其特征在于，所述干扰载体系统包括权利要求1或2所述干扰载体和辅助载体。
4.根据权利要求3所述的干扰载体系统，其特征在于，所述辅助载体为包装质粒，优选地，所述包装质粒为pGag/Pol、pRev和pVSV-G。
5.一种针对人BANCR基因的shRNA，所述shRNA由正义链和与之互补配对的反义链组成，其中，所述正义链和反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：9-10所示。
6.一种构建权利要求1～2任一项所述干扰载体的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将如SEQ ID NO：9-10所示的寡核苷酸通过退火形成双链shRNA；
(2)将步骤(1)所述shRNA与经过酶切的RNA干扰载体骨架进行连接，即得所述干扰载体。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述RNA干扰载体骨架为慢病毒载体LV3。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述干扰载体进行包装、转染和收集，即得干扰BANCR基因的慢病毒。
9.一种干扰BANCR基因的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒根据权利要求8所述方法制备而成。
10.权利要求1～2任一项所述干扰载体或权利要求3～4任一项所述干扰载体系统在敲减BANCR基因中的应用。
CN201810666957.8A 2018-06-26 2018-06-26 一种bancr基因的干扰载体、载体系统及其应用 Pending CN108753828A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810666957.8A CN108753828A (zh) 2018-06-26 2018-06-26 一种bancr基因的干扰载体、载体系统及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810666957.8A CN108753828A (zh) 2018-06-26 2018-06-26 一种bancr基因的干扰载体、载体系统及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108753828A true CN108753828A (zh) 2018-11-06

Family

ID=63977746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810666957.8A Pending CN108753828A (zh) 2018-06-26 2018-06-26 一种bancr基因的干扰载体、载体系统及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108753828A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105102983A (zh) * 2012-12-27 2015-11-25 奎斯特诊断投资股份有限公司 Ddr2突变作为黑素瘤或基底细胞癌的可靶向的特征
CN106967687A (zh) * 2017-04-05 2017-07-21 昆明医科大学 Bancr过表达型人皮肤黑色素瘤稳转细胞株及其制备方法和应用
CN107119118A (zh) * 2017-05-04 2017-09-01 南京盖斯夫医药科技有限公司 Bancr长链非编码rna及其小分子抑制剂在抑制卵巢癌肝转移中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105102983A (zh) * 2012-12-27 2015-11-25 奎斯特诊断投资股份有限公司 Ddr2突变作为黑素瘤或基底细胞癌的可靶向的特征
CN106967687A (zh) * 2017-04-05 2017-07-21 昆明医科大学 Bancr过表达型人皮肤黑色素瘤稳转细胞株及其制备方法和应用
CN107119118A (zh) * 2017-05-04 2017-09-01 南京盖斯夫医药科技有限公司 Bancr长链非编码rna及其小分子抑制剂在抑制卵巢癌肝转移中的应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINJUN ZHANG等: "Downregulation of BANCR Promotes Aggressiveness in Papillary Thyroid Cancer via the MAPK and PI3K Pathways", 《JOURNAL OF CANCER》 *
刘子豪等: "长链非编码RNA BANCR在食管鳞癌中的表达及对细胞增殖和侵袭能力的影响", 《现代生物医学进展》 *
周明等: "常规脂质体介导shRNA转染建立CYP2E1表达沉默的人肝实质细胞模型", 《现代生物医学进展》 *
戴国俊等: "鸡斑联蛋白基因的慢病毒干扰载体的构建及筛选", 《畜牧兽医学报》 *
方肇勤: "《分子生物学技术在中医药研究中的应用》", 30 September 2008, 上海科学技术出版社 *
王露等: "慢病毒介导RNA干扰沉默Fas基因在脐带间充质干细胞中的表达", 《南方医科大学学报》 *
郭勤浩: "长链非编码RNA BANCR在结直肠癌中的功能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
郭勤浩等: "BRAF激活的长链非编码RNA在结直肠癌中的表达及功能", 《中华消化外科杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Role of microRNAs in hepatitis B virus replication and pathogenesis
CN107586777A (zh) 人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物
CN108165549B (zh) 人工环状rna的通用表达框架及其应用
CN108486060B (zh) 一种用于治疗肿瘤的外泌体及其制备方法和应用
CN106967687A (zh) Bancr过表达型人皮肤黑色素瘤稳转细胞株及其制备方法和应用
CN105039342B (zh) 能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用
CN109022436A (zh) 特异抑制3β-HSD基因表达的shRNA重组载体构建与应用
CN110129319B (zh) 一种PRALR的siRNA及其用途
CN108753828A (zh) 一种bancr基因的干扰载体、载体系统及其应用
CN101906417B (zh) 针对乙肝病毒的shRNA及携带其的重组腺相关病毒基因治疗载体
CN106191118B (zh) 一种慢病毒干扰载体及其构建方法和应用
CN108465108A (zh) 一种预防或治疗脑胶质瘤的特异性基因靶点
CN106811485A (zh) Bancr基因过表达慢病毒载体、bancr慢病毒及构建方法和应用
CN109266684B (zh) 一种构建病原感染敏感性动物模型的方法
CN106811484A (zh) 一种牛pdhb基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法
CN114181937A (zh) 一种沉默人LINC01614表达的shRNA分子及其应用
CN107334777A (zh) 干扰btf3在抑制黑色素瘤细胞增殖中的新用途
CN102229928B (zh) 人rbbp6基因的小干扰rna及其应用
CN103667430B (zh) 一种八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物
CN116716302B (zh) 一种用于降低食管癌细胞中nek2基因表达的核酸分子
CN108753731A (zh) 一种bancr基因敲减稳转细胞、其构建方法和应用
CN110846319A (zh) 一种人内含子源性27碱基microRNA及在调节血压中应用
CN105002181B (zh) 一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病毒和抗肿瘤应用
CN109402117A (zh) 一种沉默小鼠肠道rasgrp1表达的腺相关病毒及其制备方法和应用
CN109136225A (zh) 一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA、慢病毒及其构建方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181106

RJ01 Rejection of invention patent application after publication