CN110257390A - 刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和应用 - Google Patents

刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法，特点是刺参Bax基因序列如SEQIDNO.1所示；刺参Bax编码蛋白序列如SEQIDNO.2所示，其开放阅读框蛋白氨基酸序列如SEQID NO.3所示；用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参Bax蛋白的开放阅读框基因序列；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是获得的重组复性蛋白具有诱导刺参体腔细胞凋亡的作用，且根据其蛋白序列制备的多克隆抗体具有减缓刺参体腔细胞凋亡以及修复刺参腐皮综合症创面的作用。

Description

刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程 菌构建方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法。
背景技术
细胞凋亡是一种为维持内环境稳定，由内部遗传机制控制，按照自身程序进行的活动和生理性死亡过程。当受到外源性和内源性因素（辐射、有机毒物和重金属、病原感染）刺激时，宿主中受损、多余和危险的细胞主要通过外源性和内源性途径清除。因此，细胞凋亡被认为是一种主动的先天性免疫防御机制，尤其是对于无适应性免疫的无脊椎动物。根据作用方式的不同，细胞凋亡可以分为促细胞凋亡和抑细胞凋亡两大类。机体中正常的细胞处在连续增殖与细胞凋亡的平衡中，而细胞凋亡发生与否受到机体细胞中促凋亡蛋白与抑凋亡蛋白的相对比例所调控。若促凋亡蛋白过表达则会表现出机体健康细胞的自杀，如艾滋病、局部缺血、精神变性紊乱等；若抑凋亡蛋白过表达则会导致细胞的无限繁殖，如癌症等。因此，细胞凋亡相关蛋白在机体内的平衡表达对于宿主的健康发展至关重要。
Bax（Bcl-2-associated X protein）蛋白是鉴定的第一个促细胞凋亡蛋白，它主要通过改变线粒体膜电位并释放细胞色素c（Cyt c），释放的Cyt c进而与凋亡蛋白酶活化因子形成多聚复合体并启动caspase级联反应中的caspase-3和caspase-7，完成相应底物的剪切，从而引起细胞凋亡。近年来研究表明Bax的表达与人类疾病的发生和发展过程密切相关。研究发现，Bax的表达水平与肿瘤的分化程度、临床分期等指标密切相关；而且，Bax的特异性抗体还用来治疗因Bax过度表达而导致的乳腺癌发生等疾病。然而，目前对于Bax生物学功能的研究主要集中在人和其他哺乳动物，在低等脊椎动物和无脊椎动物中的研究相对较少。而此类细胞凋亡调节蛋白的出现，不但为临床抗感染治疗提供了新的“武器”，而且为解决针对性的靶向治疗疾病提供了新的思路。因此，深入研究主要水产养殖品种免疫防御机制，为解决海水养殖业病害预防，开展健康养殖和实现养殖业可持续发展具有重要意义。
刺参（Apostichopus japanicus），是属于棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由灿烂弧菌为主要病原引起的刺参腐皮综合症严重制约了该产业的健康和可持续发展。目前在防治刺参腐皮综合症中，大多使用抗生素和水体消毒剂防治，但抗生素的大量使用诱导致病菌产生耐药性，导致抗生素失效，水体消毒剂往往对刺参有较大的刺激作用。作为海洋无脊椎动物，刺参的免疫应答主要由体腔细胞和体腔液中的免疫因子共同介导的。前期研究同样表明，刺参体腔细胞的功能类似于脊椎动物血细胞功能，在病原入侵下能够发挥细胞免疫和体液免疫的作用。因此，从刺参本身入手，深度解析其免疫防御机制，构建水产动物自身细胞凋亡调控基因表达工程菌及相应抗体，进而产业化高产量且价格低廉的防治腐皮综合症的天然制剂已迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法，该重组表达的Bax蛋白能够诱导刺参体腔细胞凋亡，Bax多克隆抗体处理灿烂弧菌感染后的刺参，患腐皮综合症刺参创面能够得到明显修复。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种刺参Bax基因，该基因为SEQID NO.1所示的cDNA序列。该序列全长3261 bp，包括720 bp的开放阅读框，编码240个氨基酸，5’非编码区长177 bp，3’非编码区长2364 bp，具有多聚腺苷酸信号以及序列末端含有典型的poly A尾巴。
上述刺参Bax基因的克隆方法，步骤如下：根据与Bax基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：
（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码Bax基因的EST序列，选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆；
（2）RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：CGTTTTCGCATCAAGACTCGCG，3’上游特异性引物2：GGAGGAATGGCAACTTTGAGGCT；扩增3’接头引物outer3：AGCCTCAAAGTTGCCATTCCTCC，扩增3’接头引物inner3：GAATAGCCTCTCAAAGTTGCCATTCCTCCAAGAAA；
（3）RACE扩增获取刺参Bax基因全长序列，具体步骤如下：
a．总RNA提取：通过刺参体腔液收集体腔细胞制备RNA提取液；
b．3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物outer3进行PCR 扩增，取PCR产物1μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物inner3进行PCR扩增得到3’端目的条带；
c．将扩增产物3’端目的条带用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺参Bax基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示。
上述RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液 2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的接头引物 1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL；扩增条件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 120 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
2、一种刺参Bax基因的编码蛋白，该编码蛋白为SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该蛋白分子量为26.90 KDa，等电点为8.79，无信号肽序列，编码序列的99-200位为Bcl结构域，编码序列的216-238位为transmembrane region结构域，含有四个半胱氨酸（Cys）。
3、一种刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质，该蛋白质为SEQID NO.3所示的氨基酸序列。
4、一种刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质基因构建重组刺参Bax基因工程菌的方法，步骤如下：
（1）设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参Bax开放阅读框基因序列，即权利要求6所述的刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质；
（2）将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-Bax；
（3）对重组质粒pET28a（+）-Bax进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。
具体步骤如下：
（1）Bax开放阅读框序列基因克隆及重组蛋白的构建与表达
a．总RNA提取：取刺参体腔液，收集体腔细胞，制备得到RNA提取液；
b．cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参编码Bax开放阅读框蛋白的氨基酸序列SEQIDNO.3所示，其中
含BamH I位点Bax上游扩增引物：GGATCCATGGCGGGAAGTGTTGAAACAT，
含Not I位点Bax下游扩增引物：GCGGCCGCTTATTTGGTGAATAGCCTC；
c．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，含Mg2+ 的10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的含BamH I位点Bax上游扩增引物 1.0μL，浓度10 μM 的含Not I位点Bax下游扩增引物 1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL ；扩增条件：95 ℃ 10min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 120 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
d．PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e．重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Not I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在700 bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-Bax重组质粒；
f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-Bax，转化到表达宿主BL21（DE3）获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 ug/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物；
（2）重组蛋白的纯化
将100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000 rpm离心10min，去上清液，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清，再次12000 rpm离心20 min ，取上清液；取1 mL Ni-NTA SefinoseTM Resin上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与上柱的Ni-NTA SefinoseTM Resin混合，4 ℃混匀1 h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10 mL，洗脱10次后；加入1 mL变性蛋白洗脱液浸泡10 min ，收集洗脱液，重复洗脱5次，合并每次收集的洗脱液，将获得的部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳对收集的蛋白进行鉴定，获得的目的蛋白即为重组刺参Bax开放阅读框蛋白；
（3）重组蛋白的复性
将纯化后的刺参Bax开放阅读框重组蛋白依次用包含6 M、3 M、2 M、1 M、0.5 M和0 M尿素的GdnHCl透析液进行透析，每步透析在4 ℃下至少12 h，随后，经超纯水除去盐离子，即得到重组刺参Bax基因工程菌，其中在包含1 M和0.5 M尿素的GdnHCl透析液中加入375 μMGSSG和400 μM L-精氨酸。
所述的包涵体洗涤液配方为：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5% Triton×100，pH=7.9；
所述的包涵体溶解液配方为：8 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；
所述的杂蛋白洗涤液配方为：6 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，2 M咪唑，pH=7.9；
所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，2 M咪唑，pH=4.5；
所述的GdnHCl透析液配方为：pH 8.0的50 mM Tris-HCl，50 mM β-ME，1 mM EDTA， 200mM NaCl和6M GdnHCl；
所述的含6 M尿素的 GdnHCl透析液配方为：6 M 尿素，pH 8.0的50 mM Tris-Hcl，50mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl；
所述的含3 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：3 M 尿素，pH 8.0的50 mM Tris-Hcl，50mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl；
所述的含2 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：2 M 尿素，pH 8.0的50 mM Tris-Hcl，50mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl；
所述的含1 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：1 M 尿素，375 μM GSSG、400 μM L-arginine，pH 8.0的50 mM Tris-HCl，50 mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl；
所述的含0.5 M尿素的 GdnHCl透析液配方为：0.5 M 尿素，375 μM GSSG、400 μM L-arginine，pH 8.0的50 mM Tris-HCl，50 mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl。
5、一种重组刺参Bax基因工程菌制备重组刺参Bax基因的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：取浓度为1 g/L的重组刺参Bax基因工程菌溶液腹腔注射两只四周龄的雌性Balb/c小鼠，免疫程序为：首次进行免疫的抗原量为100 μg/只，第二次和第三次免疫抗原用量为75 μg/只，每次免疫之间间隔一周时间；最后一次免疫抗原-重组刺参Bax基因工程菌一周后，采用摘眼球法收集血液并放置到冰上，4 ℃静置过夜后，5000 g，离心10 min获得抗血清，即得到重组刺参Bax基因的多克隆抗体。
6、一种重组刺参Bax基因工程菌的应用，其表达的重组表达蛋白具有诱导刺参体腔细胞凋亡作用，根据重组刺参Bax基因工程菌制备的多克隆抗体在制备刺参体腔细胞凋亡减缓剂和/或刺参腐皮综合症创面修复剂方面的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和多克隆抗体的制备方法，其利用基因工程技术，通过3’端cDNA快速扩增（3’-RACE）的方法，首次从刺参中克隆得到了Bax基因cDNA序列，同时对刺参Bax开放阅读框基因序列进行重组质粒的构建和表达，获得了一株具有蛋白诱导活性的基因工程菌（pET28a（+）-Bax），重组刺参Bax蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有特异性识别和封闭体内Bax蛋白，平衡患腐皮综合症刺参中促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白比例，并进而高效修复刺参腐皮综合症创面的作用，对研制新型高效腐皮综合症天然制剂具有重要价值，可以作为绿色疾病制剂在刺参病害防治中发挥作用。
附图说明
图1为刺参重组Bax蛋白的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标准，1为诱导pET-28a空载；2为未诱导重组蛋白包涵体；3为诱导6 h重组蛋白包涵体；4为纯化后重组蛋白；
图2为刺参注射重组6 × histidine-tag蛋白（rHis）（20 μL，2.5 μg/μL）对刺参体腔细胞凋亡水平作用效果图；
图3为刺参注射重组Bax蛋白（20 μL，2.5 μg/μL）对刺参体腔细胞凋亡水平作用效果图；
图4为刺参注射重组Bax蛋白（40 μL，2.5 μg/μL）对刺参体腔细胞凋亡水平作用效果图；
图5为刺参注射多克隆抗体（20 μL，3.0 μg/μL）对刺参腐皮综合症及体腔细胞凋亡水平作用效果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
Bax基因克隆与序列分析
（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码Bax基因的EST序列，选取编码刺参Bax部分片段的EST克隆；
（2）RACE引物设计：根据编码刺参Bax部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：CGTTTTCGCATCAAGACTCGCG，3’上游特异性引物2：GGAGGAATGGCAACTTTGAGGCT；扩增3’接头引物outer3：AGCCTCAAAGTTGCCATTCCTCC，扩增3’接头引物inner3：GAATAGCCTCTCAAAGTTGCCATTCCTCCAAGAAA；
（3）RACE扩增获取Bax基因全长序列，具体步骤如下：
a．总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集体腔细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL， 4 ℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b．3’-RACE扩增：将上述RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™RTase试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增3’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物outer3进行PCR 扩增，取PCR产物1μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物inner进行PCR得到3’端目的条带；
c．将上述扩增产物用凝胶回收试剂盒（百泰克）回收，回收产物与载体pMD19-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到全长序列；
其中，RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的Adaptor 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL；扩增条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 30 s、60℃ 120 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
最终得到的刺参Bax基因cDNA序列如SEQID NO.1所示，该序列全长3261 bp，包括720bp的开放阅读框，编码240个氨基酸，5’非编码区长177 bp，3’非编码区长2364 bp，具有多聚腺苷酸信号以及序列末端含有典型的poly A尾巴；刺参BPI基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，该蛋白分子量为26.90 KDa，等电点为8.79，无信号肽序列，编码序列的99-200位为Bcl结构域，编码序列的216-238位为transmembrane region结构域，含有四个半胱氨酸（Cys）。
具体实施例二
重组刺参Bax基因工程菌的构建方法
1、Bax开放阅读框基因序列克隆及重组蛋白的构建与表达
a、总RNA提取：取刺参体腔液，1.0 mL，800 g离心5 min，收集体腔细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL， 4 ℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara）逆转录合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参编码Bax蛋白开放阅读框蛋白的序列（氨基酸序列如SEQID NO.3所示），即如下所示：
含BamH I位点Bax上游扩增引物：GGATCCATGGCGGGAAGTGTTGAAACAT，
含Not I位点Bax下游扩增引物：GCGGCCGCTTATTTGGTGAATAGCCTC；
c、PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10 × PCR缓冲液（含Mg2+ ）2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0μL，浓度10 μM的含BamH I位点Bax上游扩增引物 1.0 μL，浓度10 μM 的含Not I位点Bax下游扩增引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL ；扩增条件：95 ℃ 10min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 120 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
d、PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（百泰克）回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基（LB平板培养基配方为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e、重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Not I（New England Biolabs，NEB）限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在700 bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-Bax重组质粒；
f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒（Omega公司）纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-Bax，转化到表达宿主BL21（DE3）（Novagen公司）获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 ug/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物；
2、重组蛋白的纯化
将100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000 rpm离心10min，去上清液，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清，再次12000 rpm离心20 min ，取上清液；取1 mL Ni-NTA SefinoseTM Resin（上海生工，编号：BSP033）上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与上柱的Ni-NTA SefinoseTM Resin混合，4 ℃混匀1 h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10mL，洗脱10次后；加入1 mL变性蛋白洗脱液浸泡10 min ，收集洗脱液，重复洗脱5次，合并每次收集的洗脱液，将获得的部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳对收集的蛋白进行鉴定，获得的目的蛋白即为重组刺参Bax开放阅读框蛋白；（图1，箭头所示即为目的蛋白）；
上述包涵体洗涤液配方为：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5%Triton × 100，pH = 7.9；
上述包涵体溶解液配方为：8 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.2% Triton × 100，30 mM咪唑，pH = 7.9；
上述杂蛋白洗涤液配方为：6 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton × 100，2 M咪唑，pH = 7.9；
变性蛋白洗脱液配方为：1.2 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，2 M咪唑，pH=4.5。
3、重组蛋白的复性
将纯化后的重组刺参Bax蛋白（7.5 μM）分别用包含6 M、3 M、2 M、1 M、0.5 M和0 M尿素的GdnHCl透析液进行透析，每步透析在4 ℃下至少12 h，随后，经超纯水除去盐离子，即获得重组刺参Bax基因工程菌。其中在包含1 M和0.5 M尿素的GdnHCl透析液中加入375 μMGSSG和400 μM L-arginine。透析后的蛋白经冷冻干燥机除水后，将获得的重组刺参Bax基因工程菌溶入PBS缓冲液中，获得所需浓度的刺参Bax基因工程菌并保存于-20 ℃备用。
GdnHCl透析液配方为：50 mM Tris-HCl （PH 8.0），50 mM β-ME，1 mM EDTA，200mM NaCl和6 M GdnHCl。
含6 M尿素的 GdnHCl透析液配方为：6 M 尿素，50 mM Tris-Hcl （PH 8.0），50 mMβ-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl。
含3 M尿素的GdnHCl透析液配方为：3 M 尿素，50 mM Tris-Hcl （PH 8.0），50 mMβ-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl。
含2 M尿素的 GdnHCl透析液配方为：2 M 尿素，50 mM Tris-Hcl （PH 8.0），50 mMβ-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl。
含1 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：1 M 尿素，375 μM GSSG、400 μM L-arginine，50 mM Tris-Hcl （PH 8.0），50 mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 MGdnHCl。
含0.5 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：0.5 M 尿素，375 μM GSSG、400 μM L-arginine，50 mM Tris-Hcl （PH 8.0），50 mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 MGdnHCl。
具体实施例三
一种重组刺参Bax基因的多克隆抗体制备
取上述具体实施例二制备获得的重组刺参Bax基因工程菌（1 g/L）腹腔注射两只四周龄的雌性Balb/c小鼠，免疫程序为：首次进行免疫的抗原量为100 μg/只，第二次和第三次免疫抗原用量为75 μg/只，每次免疫之间间隔一周时间。最后一次免疫抗原-重组刺参Bax基因工程菌一周后，采用摘眼球法收集血液并放置到冰上，4 ℃静置过夜后，5000 g，离心10 min获得抗血清，即得到重组刺参Bax基因的多克隆抗体；经间接ELISA方法按比例稀释抗体检测效价后（1：9600），离心分装，并保存在-80℃备用。
具体实施例四
刺参Bax重组蛋白对刺参体腔细胞凋亡及其多克隆抗体对腐皮综合症修复作用效果分析
1、实验方法
取大小均匀、健康的90只刺参（35g ± 5g）暂养于实验室控温养殖系统（温度16 ℃，盐度28，PH 8.1）。暂养三天后，饲养的刺参随机分为6组（15头/组），分别为对照A组、对照B组、实验A组、实验B组、抗体A组以及空白对照组。将保种的灿烂弧菌（Vibrio splendidus）接种于2216液体培养基（胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1 g/L，pH = 7.6）于28 ℃，150 r/min培养至OD600 = 1.0；随后，对照A组、对照B组、实验A组、实验B组和抗体组刺参分别浸泡攻毒终浓度为107 CFU/mL的灿烂弧菌（Vibrio splendidus），而补充同样体积海水的刺参设为空白对照组。
细胞凋亡测试方法说明：处理后的各对照组和实验组刺参经解剖后，于16 ℃，800g，离心10 min，弃上清并收集体腔细胞；去除多余体腔液，在超净台中避光加入195 μL的FITC结合液，轻轻混匀后，在超净台中避光分别加入5 μL FITC和10 μL PI后，混匀体腔细胞；之后再加入等体积的等渗抗凝剂轻轻混匀，于室温避光缓慢摇动孵育10-20 min，孵育结束后放于冰水混合物中；随后，在流式管中加入600 μL等渗缓冲液以保证流式管的上样体积不低于1 mL，并加入孵育完成的样品轻轻重悬混匀后，使用流式细胞仪进行上机检测。
2、实验结果分析
攻毒2天后，对照A组刺参注射20 μL无菌PBS缓冲液，注射无菌PBS缓冲液 2天后，随机挑选5头刺参取体腔液，体腔液在4 ℃，800 × g离心5 min后获得体腔细胞，并应用FACSan流式细胞仪检测体腔细胞凋亡水平变化。
攻毒2天后，对照B组刺参注射20 μL（2.5 μg/μL）rHis蛋白，注射rHis蛋白2天后，刺参体腔细胞凋亡水平如图2所示。体腔细胞凋亡水平较空白对照组和对照A组刺参均略有升高，分别上调为6.26倍和1.13倍；所有动物实验重复三次。
攻毒2天后，实验A组刺参注射20 μL（2.5 μg/μL）重组Bax蛋白即重组刺参Bax基因工程菌，注射重组Bax蛋白2天后刺参体腔细胞凋亡水平如图3所示。实验A组刺参较对照B组刺参体腔细胞凋亡水平显著升高，上调2.42倍。所有动物实验重复三次。
攻毒2天后，实验B组刺参注射重组40 μL（2.5 μg/μL）重组Bax 蛋白，注射重组Bax蛋白2天后刺参体腔细胞凋亡水平如图4所示。实验B组刺参较对照B组和实验A组刺参体腔细胞凋亡水平显著升高，分别上调6.04和3.64倍；所有动物实验重复三次。
攻毒2天后，抗体组刺参注射Bax多克隆抗体（20 μL，3.0 μg/μL），注射多克隆抗体2天后刺参体腔细胞凋亡水平和腐皮综合症状态如图5所示。抗体注射组刺参较对照A和对照B组刺参，体腔细胞凋亡水平显著下降，下降倍数分别为1.65倍和1.13倍；且刺参腐皮综合症较对照A组刺参（腐皮面积： 4.5 ± 1.1 cm2）出现了减缓现象，腐皮面积为：2.1 ±0.7 cm2。所有动物实验重复三次。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3261
<212> DNA
<213> 刺参Bax基因全长
<400> 1
GACAAGCAGCTTTGCGGCCGCCTCGCTTCGCTTACAATATATCAGCTTTGTATAGTCAGTGTAGCGTCCTTTGACTGTTTGGCTGTAGTCGCTTGCAACACACACCCGCTAGTCCCATAGTTATTTTCTACATTCTTGTAATTTCGGCAGCACTTCGACAAGAGAAAGCAACATAACATGGCGGGAAGTGTTGAAAACATTAAGTTAGGGAAAGAAATTGGGAAGGAGTTGAGGAAAAACTACAAGACGGAACCAAAGTCATCACCGATGTCGACCCGTCGTGCTGACAGTATCAATGGTAACGATAGTACAACTGATAGTGCTACAACACCACTGCTCTCTCATTTAAACATGGCAAAAGACTCCGTGGAATTTGACATTGCTAACGAAGCACGCTCGCTTGGGAGAGATTTCGTTCATTATAAAGTTGGATTTTCTAATACGAGACCTACTTCTCTGTTTGCAGAAACTCTTCGTAGAGTAGGGGACGAAATTGAAGAAAAGTACAACATTTCTTTGAACGGAATCATAAACCAGTTAAAATATGATCCCAATAAAGACGGAAGGCGAGCATTTAACGCAAGTTTGGATGCCATGTTTGCAGAAGGACCGTGTAGTTGGGGTAGGGTGGTAATGGTTTACGTTTTCGCATCAAGACTCGCGAAATACTGTCAAAAGCAAAACAGAGACAGTTCTTGTATTGAAAATTTGGTTAATTATTCTGGAGATTATGTTGCAAACAATTTGACTATGTGGATCAAAGAACAGGGCGGATGGTTGGATTTCTGTGACAAGTTCAAAGCCAATGACTGGAGGGACAAGGCAGTCTTTAATTCACTGTTGGTAACGGGGCTGTTTCTTGGAGGAATGGCAACTTTGAGGCTATTCACCAAATAAAGTGACGACTGAAAACAGACATCAGACATGCGTTGTTAGCTACTTAATGGTGGCCTTTTCCAGATTTCTTGCCGCTACATTTCTCTGGAATGTCTCTGCTTCAAGGACAATTGGAGACCTGAGGAAGTGGTCAAGTTTTTGCCAAAGATTGACTCATGCACAAAAACCGCTGCTGTCAGACATTGAACTGAGGGCTCAGTCAACAAATTCATTTCAACAGATCTATGGAATTGTTGAAGATGGATACCAGAGTTTCTCTTTTGCAAAGGTCCATTGAAAATTATATTATCATTGCCAGCTCAATTATATAATGTGTGCCTGTGCATTGTTTCTACATATATTATGCACCACATTGTATGGAGTGATTACATTGGTTAAGGTAAAACTTTCCAGAAGTATGCAGTAGTCTTGATGTGGTTCCACATGTAGCATGAATTTGTAGCATGAGAGATAAATTGAAACTTTTTGAGTAGAGAAATCTGCCATACTCATCACCATTCTGATAATTATCTTGATATTACTTAGAACATGTACCCTAGTACTTGAATTAAAAGCTGAACCAGCGAATATGTTTTTCTTTCCCATCTTTTTTCCTGACAGCTGAGGTACCACTGACTGTGACAGACATCTTTTGACATTTATAATAGTCGGTGTAATGGTATTATACTACATTAATACGTTGGTTTCATGTTACTGTGTCCATGTAGGTTGATACACACATGAGCTATCTTTTGTCAAGTAACTGAAAGCTCAATATGATTTGATATAAGGTACAGTATATATGTGAAGTAGTTAAGTGTCTGGTGACATGCTAAAGCAGTGTCGATTTATTCTATTAGTAAATGAGTTCAAAGTGCAATTCCATTTCATTACATCAATTGTAACATTTAAGCCTTTAGTTAAGGTTCAATAGTATTAACTATTAAGAGTATAGTGGTATTTAGAACTTTCAAACTTTGAAAATGTAATTTATGATATTCTTTCTGGTAGCTCTGCCTGTTTACTAGTCTAAAAGACCAACACAGTATCAAGAGTTGTTCAATACATAATAAAATTTGTTACAGATGATTATAACTGTGTAGGTGTGTATGTACTAGAGAATTAGCATATATGTTCTAGATTTCCATATTGCCATTGTGGCTCTCTTATACCAAGTCAGTTTTCTATACAGCCAAACCTAGCATCATATGTGTCACAAGTTGTTCCTTAGTATGTGTTGTTGCAATTAACGTAATCCAGGGCTTGCTAATAGCACTGTGGTTCATTATGTGATGTTCATGTTGTACAGTTTAAACTGAACACTTTGGGAACAGACTCTGCATGTGTAGTGTACAAGCGTTCAGTACAGTAATGGTAAATGTGAATTGTGTAGTCTGTATTGTTAAGCCCTTAATTATTAAAGTATGCAAAGATCACATTTATGTTGTGGTAAAAACTTGTAATAAACGTATCACCTTGTTTCTGTGTACACAATACAATGTATGACATGTTAGGTTTCTGCACATTGTATGCTTGAGTGTATGTGCAGTCTGCTGATGAATTTAAAGTTTTTGTAACATTTTGTTATGTAATTTCATACTTTATCAAGGTTGTTTTCTTTTGCAGGACAGACAAAATTTTAACTTCATCTTGGTAAATTTTGGTCAACATTATCAGAGACTGTCCCTGCATGATGTAGCATTAACTGGTTGATCTGAAATTAACAAGTTCAGAATTCAGGAAGTAACACCTTCACTGCGATAGCGCGCAGTGTGGGCAGGATATGAAAACTGTTGGGAATTTCCCGTATTCTTCCCTTCAGTTTAAAGGGAAGTAGATGGTTGTTTTAAATATCTAGGGTCACAATGAAAGTAATATGTATCACATATACAACCTTGTGCTTAAATTTAGAATACAGTCAATGAGTAGGCAAGCAGGAAACTTACTGATCCATGACTTTAAACTGTTTACTAAGCTGGAGGGAGGTTCAAGGGAAGAATGCAAAAATTCTTCACCGGATTTTTGCCTCAAAACAGATCAATTGGAATGGATATAGCAAACATGATAAAAGAAAAGTAAATTATAATAAAAAATGGAAACGGTTGGGAATTTTCAGTATCCTTCATTTTGTACTTGATTTTTTTTTAGTTTAAAGGGAAGTAGATGGTAGTTTTAAAAACCTAGGATTGAAATGAAAGCAGTATGTATCACATATACAACCTTATGCTAGCTACATTTACATAACAGTAGCCACAAAGATAAAGGATAATAAAATTGATATAATATTCATAGATTTTCGATGACATTATTTACGTTCTAGAAAACTGTCTAAAATCAAATCTGAGGAAAGTAGTGAGGGTAGTATTTCATATTCGAAAAAAAAAA3261
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> 刺参Bax基因编码蛋白
<400> 2
FRQHFDKRKQHNMAGSVENIKLGKEIGKELRKNYKTEPKSSPMSTRRADSINGNDSTTDSATTPLLSHLNMAKDSVEFDIANEARSLGRDFVHYKVGFSNTRPTSLFAETLRRVGDEIEEKYNISLNGIINQLKYDPNKDGRRAFNASLDAMFAEGPCSWGRVVMVYVFASRLAKYCQKQNRDSSCIENLVNYSGDYVANNLTMWIKEQGGWLDFCDKFKANDWRDKAVFNSLLVTGLFLGGMATLRLFTK 251
<210> 3
<211> 239
<212> PRT
<213> 刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质
<400> 3
MAGSVENIKLGKEIGKELRKNYKTEPKSSPMSTRRADSINGNDSTTDSATTPLLSHLNMAKDSVEFDIANEARSLGRDFVHYKVGFSNTRPTSLFAETLRRVGDEIEEKYNISLNGIINQLKYDPNKDGRRAFNASLDAMFAEGPCSWGRVVMVYVFASRLAKYCQKQNRDSSCIENLVNYSGDYVANNLTMWIKEQGGWLDFCDKFKANDWRDKAVFNSLLVTGLFLGGMATLRLFTK 239
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 3’上游特异性引物1
<400> 4
CGTTTTCGCATCAAGACTCGCG 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 3’上游特异性引物2
<400> 5
GGAGGAATGGCAACTTTGAGGCT 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 扩增3’接头引物outer3
<400> 6
AGCCTCAAAGTTGCCATTCCTCC 23
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 扩增3’接头引物inner3
<400> 7
GAATAGCCTCTCAAAGTTGCCATTCCTCCAAGAAA 35
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 含有BamH I位点Bax上游扩增引物
<400> 8
GGATCCATGGCGGGAAGTGTTGAAACAT 28
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 含有Xho I位点Bax下游扩增引物
<400> 9
GCGGCCGCTTATTTGGTGAATAGCCTC 27

Claims (10)

1.一种刺参Bax基因，其特征在于该基因为SEQID NO.1所示的cDNA序列。
2.一种权利要求1所述的刺参Bax基因的克隆方法，其特征在于步骤如下：根据与Bax基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：
（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码Bax基因的EST序列，选取编码刺参BPI部分片段的EST克隆；
（2）RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：CGTTTTCGCATCAAGACTCGCG，3’上游特异性引物2：GGAGGAATGGCAACTTTGAGGCT；扩增3’接头引物outer3：AGCCTCAAAGTTGCCATTCCTCC，扩增3’接头引物inner3：GAATAGCCTCTCAAAGTTGCCATTCCTCCAAGAAA；
（3）RACE扩增获取刺参Bax基因全长序列，具体步骤如下：
a．总RNA提取：通过刺参体腔液收集体腔细胞制备RNA提取液；
b．3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物outer3进行PCR 扩增，取PCR产物1μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物inner3进行PCR扩增得到3’端目的条带；
c．将扩增产物3’端目的条带用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺参Bax基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示。
3.根据权利要求2所述的一种刺参Bax基因的克隆方法，其特征在于上述RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液 2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的接头引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL；扩增条件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 120 s、72 ℃ 1min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
4.一种权利要求1所述的刺参Bax基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。
5.一种权利要求4所述的刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质，其特征在于该蛋白质为SEQID NO.3所示的氨基酸序列。
6.一种利用权利要求5所述的刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质基因构建重组刺参Bax基因工程菌的方法，其特征在于步骤如下：
（1）设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参Bax开放阅读框基因序列，即权利要求6所述的刺参Bax开放阅读框基因序列蛋白质；
（2）将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-Bax；
（3）对重组质粒pET28a（+）-Bax进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的一种重组刺参Bax基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）Bax开放阅读框序列基因克隆及重组蛋白的构建与表达
a．总RNA提取：取刺参体腔液，收集体腔细胞，制备得到RNA提取液；
b．cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参编码Bax开放阅读框蛋白的氨基酸序列SEQIDNO.3所示，其中
含BamH I位点Bax上游扩增引物：GGATCCATGGCGGGAAGTGTTGAAACAT，
含Not I位点Bax下游扩增引物：GCGGCCGCTTATTTGGTGAATAGCCTC；
c．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，含Mg2+ 的10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的含BamH I位点Bax上游扩增引物 1.0 μL，浓度10 μM 的含Not I位点Bax下游扩增引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL ；扩增条件：95 ℃ 10min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 120 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
d．PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 ug/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e．重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Not I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在700 bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-Bax重组质粒；
f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-Bax，转化到表达宿主BL21（DE3）获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 ug/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物；
（2）重组蛋白的纯化
将100 mL细菌沉淀物用10 mL包涵体洗涤液重悬，超声破碎菌体，12000 rpm离心10min，去上清液，用5 mL包涵体溶解液重悬沉淀，超声破碎，至溶液变清，再次12000 rpm离心20 min ，取上清液；取1 mL Ni-NTA SefinoseTM Resin上柱，用无菌水洗两次，再用包涵体溶解液平衡一次；将上清液与上柱的Ni-NTA SefinoseTM Resin混合，4 ℃混匀1 h，收集流出液，将流出液重复上柱2次；用杂蛋白洗涤液洗涤介质，每次10 mL，洗脱10次后；加入1 mL变性蛋白洗脱液浸泡10 min ，收集洗脱液，重复洗脱5次，合并每次收集的洗脱液，将获得的部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳对收集的蛋白进行鉴定，获得的目的蛋白即为重组刺参Bax开放阅读框蛋白；
（3）重组蛋白的复性
将纯化后的重组刺参Bax开放阅读框蛋白依次用包含6 M、3 M、2 M、1 M、0.5 M和0 M尿素的GdnHCl透析液进行透析，每步透析在4 ℃下至少12 h，随后，经超纯水除去盐离子，即得到重组刺参Bax基因工程菌，其中在包含1 M和0.5 M尿素的GdnHCl透析液中加入375 μMGSSG和400 μM L-arginine。
8.根据权利要求7所述的一种重组刺参Bax基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的包涵体洗涤液配方为：2 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5% Triton×100，pH=7.9；所述的包涵体溶解液配方为：8 M尿素，20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%β-巯基乙醇，0.2% Triton×100，30 mM咪唑，pH=7.9；所述的杂蛋白洗涤液配方为：6 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，0.1% β-巯基乙醇，0.1% Triton×100，2 M咪唑，pH=7.9；所述的变性蛋白洗脱液配方为：1.2 M尿素，1 M Tris-HCl，2.5 M NaCl，2 M咪唑，pH=4.5；所述的GdnHCl透析液配方为：pH 8.0的50 mM Tris-HCl，50 mM β-ME，1 mM EDTA， 200 mMNaCl和6M GdnHCl；所述的含6 M尿素的 GdnHCl透析液配方为：6 M 尿素，pH 8.0的50 mMTris-Hcl，50 mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl；所述的含3 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：3 M 尿素，pH 8.0的50 mM Tris-Hcl，50 mM β-ME，1 mM EDTA，200mM NaCl和6 M GdnHCl；所述的含2 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：2 M 尿素，pH 8.0的50mM Tris-Hcl，50 mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl；所述的含1 M 尿素的GdnHCl透析液配方为：1 M 尿素，375 μM GSSG、400 μM L-arginine，pH 8.0的50 mM Tris-HCl，50 mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl；所述的含0.5 M尿素的 GdnHCl透析液配方为：0.5 M 尿素，375 μM GSSG、400 μM L-arginine，pH 8.0的50 mM Tris-HCl，50mM β-ME，1 mM EDTA，200 mM NaCl和6 M GdnHCl。
9.一种利用权利要求6-8中任一项所述的重组刺参Bax基因工程菌制备重组刺参Bax基因的多克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：取浓度为1 g/L重组刺参Bax基因工程菌溶液腹腔注射两只四周龄的雌性Balb/c小鼠，免疫程序为：首次进行免疫的抗原量为100μg/只，第二次和第三次免疫抗原用量为75 μg/只，每次免疫之间间隔一周时间；最后一次免疫抗原-重组刺参Bax基因工程菌一周后，采用摘眼球法收集血液并放置到冰上，4 ℃静置过夜后，5000 g，离心10 min获得抗血清，即得到重组刺参Bax基因的多克隆抗体。
10.一种重组刺参Bax基因工程菌的应用，其特征在于：根据重组刺参Bax基因工程菌制备的多克隆抗体在制备刺参体腔细胞凋亡减缓剂和/或刺参腐皮综合症创面修复剂方面的应用。
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