ES2749620T3 - Variantes de polipéptidos de PH20, formulaciones y usos de los mismos - Google Patents

Variantes de polipéptidos de PH20, formulaciones y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un polipéptido de PH20 modificado, que comprende uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 no modificado, donde: el polipéptido de PH20 no modificado consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66; el polipéptido de PH20 modificado muestra mayor actividad hialuronidasa que es al menos 120 % de la actividad hialuronidasa en comparación con el polipéptido de PH20 sin modificar que no contiene el reemplazo o reemplazos de aminoácidos; el reemplazo de aminoácidos está en una posición correspondiente a una posición seleccionada de entre 1, 12, 15, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 39, 46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97, 118, 120, 127, 131, 135, 141, 142, 147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263, 269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 291, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359, 371, 377, 380, 389, 392, 395, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 y 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican mediante alineación del polipéptido de PH20 con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, a condición de que si el polipéptido de PH20 modificado incluye solamente un único reemplazo de aminoácido, el reemplazo no corresponde al reemplazo de aminoácidos N219A en referencia a las posiciones a los aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3; y el polipéptido de PH20 comprende hasta 10 reemplazos de aminoácidos en comparación con el polipéptido de PH20 sin modificar que no contiene el o los reemplazos.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de polipéptidos de PH20, formulaciones y usos de los mismos
Campo de la invención
Se proporcionan polipéptidos de hialuronidasa de PH20 modificados, incluyendo polipéptidos modificados que muestran actividad aumentada. También se proporcionan composiciones y usos de los mismos.
Antecedentes
El hialuronano (ácido hialurónico; HA) es un polipéptido que se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en tejidos conectivos blandos. hA también se encuentra predominantemente en piel, cartílago y en líquido sinovial en mamíferos. El hialuronano también es el constituyente principal del vítreo del ojo.
HA tiene un papel en diversos procesos fisiológicos, tales como en homeostasis de proteínas en plasma y agua (Laurent TC et al. (1992) FASEB J 6: 2397-2404). Ciertas enfermedades están relacionadas con la expresión y/o producción de hialuronano. Las enzimas degradantes de hialuronano, tales como hialuronidasas, son enzimas que degradan hialuronano. Catalizando la degradación de HA, las enzimas degradantes de hialuronano (por ejemplo, hialuronidasas) pueden usarse para tratar enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de HA u otros glucosaminoglucanos. Además, ya que HA es un componente importante de la barrera intersticial, las enzimas degradantes de hialuronano (por ejemplo, hialuronidasa) aumentan la permeabilidad tisular y por lo tanto pueden
usarse para aumentar la dispersión y el suministro de agentes terapéuticos. Se han usado terapéuticamente diversas hialuronidasas (por ejemplo, Hydase™, Vitrase™ y Wydase™), típicamente como agentes de dispersión y propagación en combinación con otros agentes terapéuticos. Muchos de estos son formas ovinas o bovinas, que pueden ser inmunogénicas para tratamiento de seres humanos. Se necesitan enzimas degradantes de hialuronano mejoradas, tales como hialuronidasas, y composiciones de las mismas que puedan usarse para el tratamiento.
El documento WO2009/128917 describe polipéptidos de hialuronidasa solubles que se modifican por conjugación
con un polímero, tal como un resto de PEG, para su uso en el tratamiento de tumores o cánceres. La hialuronidasa
puede ser un polipéptido de PH20 soluble. Zhang et al. (2009, Journal of Biological Chemistry, 284(14); 9433-9442) describe la hialuronidasa humana, Hyal1, y desvela que los restos ácidos y los restos de tirosina en el sitio activo son importantes para actividad hialuronidasa.
Sumario
La presente invención proporciona un polipéptido de PH20 modificado, que comprende uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 no modificado, en el que: el polipéptido de PH20 no modificado consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-36; el polipéptido de PH20 modificado presenta mayor actividad hialuronidasa que es al menos 120% de la actividad hialuronidasa en comparación con el polipéptido de PH20 sin modificar que no contiene el reemplazo o reemplazos de aminoácidos; el reemplazo de aminoácidos está en una posición de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de entre 1, 12, 15,
24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 39, 46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97,
118, 120, 127, 131, 135, 141, 142, 147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206,
209, 212, 213, 215, 219, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263, 269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359, 371, 377, 380, 389, 392, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 y 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, en donde se identifican posiciones de aminoácidos correspondientes por alineamiento del polipéptido de PH20 teniendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, a condición de que si el polipéptido de PH20 incluye solamente un único reemplazo de aminoácido, el reemplazo no corresponde al reemplazo de aminoácido N219A en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3; y el polipéptido de PH20 modificado comprende hasta 10 remplazos de aminoácidos en comparación con el polipéptido de PH20 no modificado que no contiene el reemplazo
o los reemplazos.
Se proporcionan polipéptidos de PH20 modificados de acuerdo con las reivindicaciones que tienen una propiedad o propiedades alteradas en comparación el polipéptido de PH20 que no tiene la modificación o las modificaciones. Las modificaciones incluyen reemplazos de aminoácidos. Se describen en el presente documento estructura/función detallada de prácticamente cada aminoácido en un polipéptido de PH20, así como la identificación de restos y loci que contribuyen a la alteración de una propiedad, tal como estabilidad en condiciones particulares. Por lo tanto, se describen polipéptidos de PH20 modificados que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos que dan como resultado un polipéptido de PH20 que conserva la actividad y/o muestra estabilidad aumentada o alterada en una diversidad de condiciones. La actividad conservada es actividad hialuronidasa que es al menos aproximadamente
120% del polipéptido de PH20 que no incluye el reemplazo. Son modificaciones los reemplazos de aminoácidos.
Para fines del presente documento, los reemplazos de aminoácidos se indican por la letra de aminoácido individual seguido de la posición de aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 3 en la que se produce el reemplazo. Los expertos en la materia conocen bien abreviaturas de aminoácidos individuales para restos de aminoácidos (véase,
por ejemplo Tabla 1) y se usan en el presente documento a lo largo de la descripción y los ejemplos. Por ejemplo, el reemplazo con P en una posición correspondiente a la posición 204 en un polipéptido de PH20 en referencia a las posiciones de restos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3 significa que el reemplazo abarca F204P en un polipéptido de PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3, o el mismo reemplazo en la posición correspondiente en otro polipéptido de PH20.
Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 que contienen al menos un reemplazo de aminoácido en un polipéptido de PH20, por el que el polipéptido de p H20 modificado muestra estabilidad aumentada en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. La estabilidad aumentada puede manifestarse como resistencia aumentada a una o más condiciones proteicas que son desnaturalizantes para proteínas. La estabilidad de PH20 modificada y no modificada se compara en las mismas condiciones. Las condiciones de desnaturalización de proteínas ejemplares incluyen, pero sin limitación, temperatura elevada mayor de 30 °C o aproximadamente 30 °C, agitación, baja salinidad, incluyendo esencialmente o sustancialmente o nada de sal, y presencia de excipientes que tienden a desnaturalizar proteínas. Son ejemplos de dichos excipientes antiadherente o antiadherentes, aglutinante o aglutinantes, recubrimiento o recubrimientos, carga o cargas y diluyente o diluyentes, saporífero o saporíferos, colorante o colorantes, lubricante o lubricantes, emoliente o emolientes, conservante o conservantes, detergente o detergentes, sorbente o sorbentes y combinaciones de los mismos.
Los polipéptidos de PH20 modificado descritos en el presente documento puede ser uno en el que la forma no modificada del mismo tiene al menos aproximadamente 68 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y contiene además modificaciones que alteran la estabilidad y/o pueden ser un polipéptido de PH20 que incluye hasta aproximadamente 100, 110, 120, 130, 150 diferencias de aminoácidos con respecto a PH20 pero conservan la actividad enzimática, particularmente, al menos aproximadamente 40 % de la actividad del polipéptido de PH20 no modificado y muestra estabilidad aumentada, tal como estabilidad en condiciones desnaturalizantes. Por lo tanto, se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que tienen al menos 68 % o aproximadamente 68 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que tienen al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Son ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados polipéptidos que contienen reemplazo o reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 que contiene la secuencia de restos de aminoácidos como se expone en cualquiera de las Se Q ID NO: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861 u 870.
Por ejemplo, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada que contiene un reemplazo de aminoácidos en un polipéptido de PH20 que confiere la estabilidad aumentada, en el que la estabilidad aumentada se manifiesta como resistencia aumentada a la desnaturalización en presencia de una o más condiciones de desnaturalización de proteínas, la estabilidad se aumenta en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos, y el polipéptido de PH20 no modificado consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o es un fragmento truncado C terminal del mismo que es un polipéptido de PH20 soluble o tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con el mismo. Como antes, el polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada muestra estabilidad aumentada frente a una condición de desnaturalización que es temperatura mayor de o aproximadamente 30 °C, agitación; baja o ninguna sal; o presencia de un excipiente o un agente desnaturalizante, tal como un antiadherente o antiadherentes, aglutinante o aglutinantes, recubrimiento o recubrimientos, carga o cargas y diluyente o diluyentes, saporífero o saporíferos, colorante o colorantes, lubricante o lubricantes, emoliente o emolientes, conservante o conservantes, detergente o detergentes, sorbente o sorbentes o edulcorante o edulcorantes y una combinación de los mismos, y en particular un conservante. En algunos ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada, la condición de desnaturalización es una temperatura mayor de 30 °C, y el polipéptido de PH20 modificado muestra mayor actividad hialuronidasa a la temperatura comparada con el polipéptido de PH20 no modificado que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos en los que las actividades se comparan en las mismas condiciones. En otros ejemplos, la condición de desnaturalización de proteínas es la presencia de bajas concentraciones de sal de menos de 100 mM, y el polipéptido de PH20 modificado muestra actividad hialuronidasa aumentada en presencia de las concentraciones bajas de sal en comparación con el polipéptido de PH20 no modificado que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos donde las actividades se comparan en las mismas condiciones.
En cualquiera de los ejemplos anteriores de un polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada, la estabilidad puede evaluarse basándose en una diversidad de parámetros incluyendo actividad hialuronidasa, solubilidad, agregación y/o cristalización. La estabilidad puede evaluarse en presencia de una condición desnaturalizante. Cuando se compara la estabilidad de dos o más polipéptidos, la estabilidad se evalúa en las mismas condiciones. En algunos casos, entre los polipéptidos de PH20 proporcionados en el presente documento, el polipéptido de PH20 modificado muestra al menos 120 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180%, 200%, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 1500 %, 2000 %, 3000 %, 4000 %, 5000 % o más de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos.
En cualquiera de los ejemplos anteriores de un polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada, las condiciones desnaturalizantes incluyen la presencia de excipientes que desnaturalizan proteínas. Es ejemplar de dichas condiciones la presencia de un conservante, tal como un conservante fenólico. Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz de uno o más conservantes fenólicos. Una cantidad antimicrobiana eficaz es la cantidad total de uno o más agentes conservantes fenólicos, que pueden expresarse como un porcentaje (%) de la concentración en masa (p/v) que es o está entre (o al menos aproximadamente o aproximadamente) de 0,05 % a 0,6 %, 0,1 % a 0,4 %, 0,1 % a 0,3 %, 0,15 % a 0,325 %, 0,15 % a 0,25 %, 0,1 % a 0,2 %, 0,2 % a 0,3 % o 0,3 % a 0,4 %, inclusive. Los conservantes fenólicos ejemplares incluyen, pero sin limitación, fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico y un parabeno, tal como metilparabeno, propilparabeno, m-cresol, fenol o m-cresol y fenol. Son ejemplos de la estabilidad obtenida mediante polipéptidos de PH20 modificados descritos los que muestran al menos 15% o aproximadamente 15% de la actividad hialuronidasa durante al menos 4 horas en presencia de conservante o conservantes en comparación con el polipéptido de PH20 modificado en ausencia de conservante. La actividad se compara en las mismas condiciones excepto por la presencia de conservante o conservantes. Por ejemplo, se describen polipéptidos de PH20 modificados que muestran al menos (o al menos aproximadamente) 16%, 17%, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de la actividad hialuronidasa en presencia de un conservante o conservantes fenólicos en comparación con la ausencia del mismo conservante o los mismos conservantes. Por lo tanto, entre los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento, hay polipéptidos de PH20 que, en virtud del reemplazo o los reemplazos de aminoácidos, son fenofílicos en comparación con polipéptidos de PH20 sin dicho reemplazo. Se incluyen polipéptidos de PH20 modificados en los que la actividad hialuronidasa se muestra después de al menos 5 describen, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 3 semanas, 4 semanas o más en presencia del conservante o conservantes en comparación con la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 modificado en ausencia de conservante durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones excepto por la presencia de conservante o conservantes.
En ejemplos de un polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada frente a un conservante fenólico, puede mostrarse estabilidad aumentada en un conservante fenólico en condiciones de temperatura que incluyen cualquier temperatura entre, por ejemplo, 0 °C y 40 °C, tal como entre o aproximadamente entre 0 °C y 40 °C, 2 °C y 6 °C, 24 °C y 32 °C y 35 °C y 40 °C. Los polipéptidos ejemplares muestran estabilidad aumentada a temperaturas de entre o aproximadamente entre 30 °C y 45 °C, 35 °C y 45 °C, 30 °C y 37 °C, 35 °C y 37 °C o 37 °C y 42 °C, cada uno inclusive. El polipéptido de PH20 modificado particular y las condiciones dependen de la formulación pretendida, las condiciones a las que se expondrá la formulación y/o la aplicación pretendida.
Los polipéptidos de PH20 modificados ejemplares y particulares que muestran estabilidad aumentada, tal como estabilidad aumentada frente a un conservante fenólico, incluyen los que contienen una única modificación de aminoácido, tal como un reemplazo, y combinaciones de modificaciones, tales como al menos 1 o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y más modificaciones. Estas incluyen polipéptidos de PH20 modificados que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos, donde al menos un reemplazo está en una posición de aminoácido correspondiente (es decir, por alineamiento) a una posición seleccionada de entre 10, 12, 20, 22, 26, 34, 36, 46, 50, 52, 58, 68, 70, 74, 82, 83, 84, 86, 97, 127, 131, 138, 142, 143, 144, 166, 169, 174, 193, 195, 196, 204, 205, 206, 213, 219, 234, 237, 238, 240, 249, 261, 267, 277, 279, 291, 309, 310, 314, 315, 317, 318, 347, 367, 375, 376, 399, 401, 407, 416, 419, 421, 431, 433, 439, 440, 443 o 445 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, en las que se identifican posiciones de aminoácidos correspondientes por alineamiento del polipéptido de PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. Son ejemplos de dichas modificaciones al menos un reemplazo de aminoácido seleccionado de entre reemplazo con: glicina (G) en una posición correspondiente a la posición 10; K en una posición correspondiente a la posición 12; S en una posición correspondiente a la posición 20; T en una posición correspondiente a la posición 22; M en una posición correspondiente a la posición 26; W en una posición correspondiente a la posición 34; N en una posición correspondiente a la posición 36; L en una posición correspondiente a la posición 46; M en una posición correspondiente a la posición 50 T en una posición correspondiente a la posición 52; S en una posición correspondiente a la posición 52 C en una posición correspondiente a la posición 58; K en una posición correspondiente a la posición 58 R en una posición correspondiente a la posición 58; N en una posición correspondiente a la posición 58 Y en una posición correspondiente a la posición 58; P en una posición correspondiente a la posición 58 H en una posición correspondiente a la posición 58; P en una posición correspondiente a la posición 68 V en una posición correspondiente a la posición 70; E en una posición correspondiente a la posición 74 L en una posición correspondiente a la posición 82; N en una posición correspondiente a la posición 82 V en una posición correspondiente a la posición 83; Q en una posición correspondiente a la posición 83 S en una posición correspondiente a la posición 83; G en una posición correspondiente a la posición 83 N en una posición correspondiente a la posición 84; A en una posición correspondiente a la posición 86 K en una posición correspondiente a la posición 86; E en una posición correspondiente a la posición 97 L en una posición correspondiente a la posición 97; R en una posición correspondiente a la posición 127; R en una posición correspondiente a la posición 131 L en una posición correspondiente a la posición 138 K en una posición correspondiente a la posición 142; N en una posición correspondiente a la posición 142 P en una posición correspondiente a la posición 142; S en una posición correspondiente a la posición 142 T en una posición correspondiente a la posición 142; G en una posición correspondiente a la posición 143 K en una posición correspondiente a la posición 143; T en una posición correspondiente a la posición 144 Q en una posición correspondiente a la posición 166; T en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 169; G en una posición correspondiente a la posición 174 N en una posición correspondiente a la posición 174; Q en una posición correspondiente a la posición 193 T en una posición correspondiente a la posición 195; N en una posición correspondiente a la posición 195 E en una posición correspondiente a la posición 196; R en una posición correspondiente a la posición 196 P en una posición correspondiente a la posición 204; A en una posición correspondiente a la posición 205 E en una posición correspondiente a la posición 205 I en una posición correspondiente a la posición 206 A en una posición correspondiente a la posición 213 I en una posición correspondiente a la posición 219 M en una posición correspondiente a la posición 234; T en una posición correspondiente a la posición 237 H en una posición correspondiente a la posición 238; Q en una posición correspondiente a la posición 240 V en una posición correspondiente a la posición 249; A en una posición correspondiente a la posición 261 K en una posición correspondiente a la posición 261; T en una posición correspondiente a la posición 267 K en una posición correspondiente a la posición 277; H en una posición correspondiente a la posición 279 V en una posición correspondiente a la posición 279; V en una posición correspondiente a la posición 291 E en una posición correspondiente a la posición 309; Q en una posición correspondiente a la posición 310 Y en una posición correspondiente a la posición 314; Y en una posición correspondiente a la posición 315 N en una posición correspondiente a la posición 317; W en una posición correspondiente a la posición 317 D en una posición correspondiente a la posición 318; G en una posición correspondiente a la posición 347 A en una posición correspondiente a la posición 367; R en una posición correspondiente a la posición 375 R en una posición correspondiente a la posición 376; V en una posición correspondiente a la posición 399 E en una posición correspondiente a la posición 401; A en una posición correspondiente a la posición 407 L en una posición correspondiente a la posición 416; K en una posición correspondiente a la posición 419 H en una posición correspondiente a la posición 421; E en una posición correspondiente a la posición 431 T en una posición correspondiente a la posición 433; V en una posición correspondiente a la posición 433 C en una posición correspondiente a la posición 439; P en una posición correspondiente a la posición 440 G en una posición correspondiente a la posición 443; N en una posición correspondiente a la posición 445, en referencia a posiciones de restos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el polipéptido de PH20 modificado puede contener al menos un reemplazo de aminoácido seleccionado den entre el reemplazo con: T en una posición correspondiente a la posición 52, K en una posición correspondiente a la posición 58, R en una posición correspondiente a la posición 58, P en una posición correspondiente a la posición 68, V en una posición correspondiente a la posición 83, P en una posición correspondiente a la posición 204, A en una posición correspondiente a la posición 261, T en una posición correspondiente a la posición 267, K en una posición correspondiente a la posición 277 and H en una posición correspondiente a la posición 421, en referencia a posiciones de restos de aminoácidos expuestas en s Eq ID NO: 3. Un polipéptido de PH20 modificado ejemplar es uno que incluye P (o un aminoácido conservativo del mismo) en una posición correspondiente a la posición 204 en un polipéptido de PH20 en referencia a las posiciones de restos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Por lo tanto, se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada en presencia de un conservante fenólico que contiene un reemplazo de aminoácido en un polipéptido de PH20 que confiere la estabilidad aumentada, en el que la estabilidad aumenta en comparación con el polipéptido no modificado sin el reemplazo de aminoácido, y el polipéptido de PH20 no modificado tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o es un fragmento truncado en el extremo C terminal del mismo que es un polipéptido de PH20 soluble o tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con el mismo. Por ejemplo, el polipéptido de PH20 no modificado es un polipéptido de PH20 soluble que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de la SEQ ID NO: 3 o 32-66. En ejemplos particulares, el polipéptido de PH20 modificado tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En cualquiera de dichos ejemplos de un polipéptido de PH20 modificado, el polipéptido contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 o más reemplazos de aminoácidos. En ejemplos del presente documento, el polipéptido de PH20 modificado es un PH20 humano.
El polipéptido de PH20 modificado muestra estabilidad en presencia de conservantes fenólicos si muestra al menos 15% de la actividad hialuronidasa en presencia de un conservante o conservantes durante al menos 4 horas en comparación con la actividad hialuronidasa en ausencia del conservante o los conservantes fenólicos, donde la actividad se compara en las mismas condiciones excepto por la presencia del conservante o los conservantes fenólicos. En cualquiera de los ejemplos anteriores, el polipéptido de PH20 modificado es estable en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz de uno o más conservantes fenólicos, tal como una cantidad total de uno o más agentes conservantes fenólicos como un porcentaje (%) de la concentración en masa (p/v) que es de o de aproximadamente 0,05% a 0,6%, 0,1 % a 0,4%, 0,1 % a 0,3%, 0,15% a 0,325 %, 0,15% a 0,25%, 0,1 % a 0,2 %, 0,2 % a 0,3 % o 0,3 % a 0,4 %, inclusive. El conservante fenólico puede ser un fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico o un parabeno, tal como m-cresol, fenol, o m-cresol y fenol. El reemplazo de aminoácidos puede ser en el resto de aminoácido 204, 58, 10, 12, 20, 22, 26, 34, 36, 46, 50, 52, 68, 70, 74, 82, 83, 84, 86, 97, 127, 131, 138, 142, 143, 144, 166, 169, 174, 193, 195, 196, 205, 206, 213, 219, 234, 237, 238, 240, 249, 261, 267, 277, 279, 291, 309, 310, 314, 315, 317, 318, 347, 367, 375, 376, 399, 401, 407, 416, 419, 421, 431, 433, 439, 440, 443 o 445 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por el alineamiento del polipéptido de PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el reemplazo de aminoácido es G en una posición correspondiente a la posición 10; K en una posición correspondiente a la posición 12; S en una posición correspondiente a la posición 20; T en una posición correspondiente a la posición 22; M en una posición correspondiente a la posición 26; W en una posición correspondiente a la posición 34; N en una posición correspondiente a la posición 36; L en una posición correspondiente a la posición 46; M en una posición correspondiente a la posición 50; T en una posición correspondiente a la posición 52; S en una posición correspondiente a la posición 52; C en una posición correspondiente a la posición 58; K en una posición correspondiente a la posición 58; R en una posición correspondiente a la posición 58; N en una posición correspondiente a la posición 58; Y en una posición correspondiente a la posición 58; P en una posición correspondiente a la posición 58; H en una posición correspondiente a la posición 58; P en una posición correspondiente a la posición 68; V en una posición correspondiente a la posición 70; E en una posición correspondiente a la posición 74; L en una posición correspondiente a la posición 82; N en una posición correspondiente a la posición 82; V en una posición correspondiente a la posición 83; Q en una posición correspondiente a la posición 83; S en una posición correspondiente a la posición 83; G en una posición correspondiente a la posición 83; N en una posición correspondiente a la posición 84; A en una posición correspondiente a la posición 86; K en una posición correspondiente a la posición 86; E en una posición correspondiente a la posición 97; L en una posición correspondiente a la posición 97; R en una posición correspondiente a la posición 127; R en una posición correspondiente a la posición 131 L en una posición correspondiente a la posición 138; K en una posición correspondiente a la posición 142 N en una posición correspondiente a la posición 142; P en una posición correspondiente a la posición 142 S en una posición correspondiente a la posición 142 T en una posición correspondiente a la posición 142 G en una posición correspondiente a la posición 143; K en una posición correspondiente a la posición 143 T en una posición correspondiente a la posición 144; Q en una posición correspondiente a la posición 166 T en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 169 G en una posición correspondiente a la posición 174; N en una posición correspondiente a la posición 174 Q en una posición correspondiente a la posición 193 T en una posición correspondiente a la posición 195 N en una posición correspondiente a la posición 195; E en una posición correspondiente a la posición 196 R en una posición correspondiente a la posición 196; P en una posición correspondiente a la posición 204; A en una posición correspondiente a la posición 205; E en una posición correspondiente a la posición 205; I en una posición correspondiente a la posición 206; A en una posición correspondiente a la posición 213 I en una posición correspondiente a la posición 219; M en una posición correspondiente a la posición 234; T en una posición correspondiente a la posición 237; H en una posición correspondiente a la posición 238; Q en una posición correspondiente a la posición 240; V en una posición correspondiente a la posición 249; A en una posición correspondiente a la posición 261; K en una posición correspondiente a la posición 261 T en una posición correspondiente a la posición 267; K en una posición correspondiente a la posición 277; H en una posición correspondiente a la posición 279; V en una posición correspondiente a la posición 279; V en una posición correspondiente a la posición 291; E en una posición correspondiente a la posición 309; Q en una posición correspondiente a la posición 310; Y en una posición correspondiente a la posición 314; Y en una posición correspondiente a la posición 315; N en una posición correspondiente a la posición 317 W en una posición correspondiente a la posición 317; D en una posición correspondiente a la posición 318 G en una posición correspondiente a la posición 347; A en una posición correspondiente a la posición 367; R en una posición correspondiente a la posición 375; R en una posición correspondiente a la posición 376; V en una posición correspondiente a la posición 399; E en una posición correspondiente a la posición 401 A en una posición correspondiente a la posición 407; L en una posición correspondiente a la posición 416; K en una posición correspondiente a la posición 419; H en una posición correspondiente a la posición 421 E en una posición correspondiente a la posición 431 T en una posición correspondiente a la posición 433; V en una posición correspondiente a la posición 433; C en una posición correspondiente a la posición 439; P en una posición correspondiente a la posición 440; G en una posición correspondiente a la posición 443; o N en una posición correspondiente a la posición 445, en referencia a las posiciones de restos de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 3. En particular, el reemplazo de aminoácido es T en una posición correspondiente a la posición 52, K en una posición correspondiente a la posición 58, R en una posición correspondiente a la posición 58, P en una posición correspondiente a la posición 68, V en una posición correspondiente a la posición 83, P en una posición correspondiente a la posición 204, A en una posición correspondiente a la posición 261, T en una posición correspondiente a la posición 267, K en una posición correspondiente a la posición 277 o H en una posición correspondiente a la posición 421, en referencia a las posiciones de restos de aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 3, tal como el reemplazo con P en una posición correspondiente a la posición 204 o R en una posición correspondiente a la posición 58. El polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada frente a conservantes fenólicos puede estar sustancialmente purificado o aislado. El polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada frente a conservantes fenólicos puede modificarse por glucosilación, sialación, albuminación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación y fosforilación y generalmente está glucosidado, por lo que el polipéptido comprende al menos un resto de N-acetilglucosamina unido a cada uno de al menos tres restos de asparagina (N), tal como en restos de aminoácidos correspondientes a los restos de aminoácidos 200, 333 y 358 de SEQ ID NO: 3. El polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada frente a conservantes fenólicos puede conjugarse con un polímero, tal como PEG o dextrano y/o puede conjugarse con un resto que es un dominio de multimerización, una toxina, un marcador detectable o un fármaco.
Entre los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad aumentada están los que muestran actividad hialuronidasa aumentada a la temperatura elevada en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos, tales como al menos 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más actividad hialuronidasa durante al menos 4 horas en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos. Además, entre los polipéptidos están los que muestran actividad, pero también típicamente muestran estabilidad aumentada u otra propiedad a temperaturas elevadas, tal como un polipéptido de PH20 modificado que muestra al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % de la actividad hialuronidasa durante al menos 4 horas a una temperatura de entre o aproximadamente entre 32 °C y 37 °C en comparación con la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 modificado a una temperatura de entre o aproximadamente entre 2 °C y 8 °C, donde la actividad se compara en las mismas condiciones excepto por las diferencias de temperatura. La actividad hialuronidasa puede mostrarse después de al menos 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 3 semanas, 4 semanas o más a temperaturas elevadas de entre o aproximadamente entre 32 °C y 37 °C en comparación con la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 modificado a una temperatura entre o aproximadamente entre 2 °C y 8 °C, donde la actividad se compara durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones excepto por la diferencia de temperatura. Son ejemplos de dichos polipéptidos modificados los que contienen al menos un reemplazo de aminoácido en una posición de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de entre 1, 11, 12, 14, 20, 26, 29, 34, 50, 58, 70, 82, 83, 84, 86, 87, 140, 142, 143, 147, 152, 166, 167, 172, 174, 178, 193, 195, 206, 212, 213, 219, 233, 237, 240, 267, 277, 291,292, 309, 313, 314, 317, 318, 347, 367, 368, 371, 374, 389, 392, 395, 396, 406, 419, 421, 439 y 443 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por alineamiento del polipéptido de PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. Las mutaciones ejemplares incluyen, por ejemplo, reemplazo con R en una posición correspondiente a la posición 1; S en una posición correspondiente a la posición 11; I en una posición correspondiente a la posición 12; V en una posición correspondiente a la posición 14; S en una posición correspondiente a la posición 20; M en una posición correspondiente a la posición 26; con R en una posición correspondiente a la posición 29; W en una posición correspondiente a la posición 34; M en una posición correspondiente a la posición 50; K en una posición correspondiente a la posición 58; Q en una posición correspondiente a la posición 58; Q en una posición correspondiente a la posición 58; V en una posición correspondiente a la posición 70; L en una posición correspondiente a la posición 82; Q en una posición correspondiente a la posición 83; R en una posición correspondiente a la posición 84; A en una posición correspondiente a la posición 86; S en una posición correspondiente a la posición 87; K en una posición correspondiente a la posición 140; S en una posición correspondiente a la posición 142 T en una posición correspondiente a la posición 142; K en una posición correspondiente a la posición 143 S en una posición correspondiente a la posición 147; T en una posición correspondiente a la posición 152 T en una posición correspondiente a la posición 166; D en una posición correspondiente a la posición 167 A en una posición correspondiente a la posición 172; G en una posición correspondiente a la posición 174 N en una posición correspondiente a la posición 174; R en una posición correspondiente a la posición 178 Q en una posición correspondiente a la posición 193 T en una posición correspondiente a la posición 195; I en una posición correspondiente a la posición 206; S en una posición correspondiente a la posición 212 A en una posición correspondiente a la posición 213; I en una posición correspondiente a la posición 219; G en una posición correspondiente a la posición 233; T en una posición correspondiente a la posición 237 A en una posición correspondiente a la posición 240; Q en una posición correspondiente a la posición 240 ; T en una posición correspondiente a la posición 267; E en una posición correspondiente a la posición 277 S en una posición correspondiente a la posición 291; H en una posición correspondiente a la posición 292 V en una posición correspondiente a la posición 292; S en una posición correspondiente a la posición 309 H en una posición correspondiente a la posición 313; S en una posición correspondiente a la posición 314; I en una posición correspondiente a la posición 317; T en una posición correspondiente a la posición 317; W en una posición correspondiente a la posición 317; R en una posición correspondiente a la posición 318 G en una posición correspondiente a la posición 347; A en una posición correspondiente a la posición 367 R en una posición correspondiente a la posición 368; S en una posición correspondiente a la posición 371 P en una posición correspondiente a la posición 374; A en una posición correspondiente a la posición 389 V en una posición correspondiente a la posición 392; A en una posición correspondiente a la posición 395 H en una posición correspondiente a la posición 396; N en una posición correspondiente a la posición 406 H en una posición correspondiente a la posición 419; K en una posición correspondiente a la posición 419 R en una posición correspondiente a la posición 421; S en una posición correspondiente a la posición 421 A en una posición correspondiente a la posición 439; C en una pDosición correspondiente a la posición 439; y G en una posición correspondiente a la posición 443, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. En ejemplos particulares descritos en el presente documento, cualquiera de dichos polipéptidos de PH20 modificados contienen una única modificación de aminoácido, tal como un reemplazo, y combinaciones de modificaciones, tales como al menos o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y más modificaciones. La modificación, tal como reemplazo, puede estar en un polipéptido de PH20 no modificado que
tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o es un fragmento truncado C terminal del mismo que
es un polipéptido de PH20 soluble, tal como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 o 32-66, o tiene al menos
85 % de identidad de secuencia con el mismo. Por ejemplo, cualquiera de dichos polipéptidos de PH20 modificados tienen al menos 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
También se describen polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada en condiciones de
baja salinidad, tales como, por ejemplo, concentraciones de NaCl de menos de 100 mM, tales como, pero sin limitación, concentraciones de NaCl menores de 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20
mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o menos. Entre los polipéptidos de PH20 modificados están los que muestran actividad hialuronidasa aumentada a concentraciones menores de sal en comparación con el polipéptido de PH20 que no contienen el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos. Dicha actividad incluye, por ejemplo, al menos más de 100%, o al menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200 %, 300%, 400 %,
500 % o más actividad hialuronidasa en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos. Son ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 los que muestran al menos 60 % de la actividad hialuronidasa en bajas concentraciones de sal, tal como entre o aproximadamente entre NaCl 10 mM y
NaCl 100 mM, inclusive (o concentraciones comparables de otras sales o mezclas de sales), en comparación con la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 modificado en NaCl 150 mM, donde las actividades se comparan en
las mismas condiciones excepto por la diferencia de la concentración salina. En ejemplos particulares descritos en el presente documento, cualquiera de dichos polipéptidos de PH20 modificados contienen una única modificación de aminoácido, tal como un reemplazo y combinaciones de aminoácidos, tales como al menos o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y más modificaciones. La modificación, tal como reemplazo, puede estar en un polipéptido de PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta
en s Eq ID NO: 7 o es un fragmento truncado C terminal del mismo que es un polipéptido de PH20 soluble, tal como
se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 o 32-66, o tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con el mismo. Por ejemplo, cualquiera de dichos polipéptidos de PH20 modificados tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
También se proporcionan polipéptidos de PH20 modificados que contienen al menos un reemplazo de aminoácido
en un polipéptido de PH20, donde el polipéptido de PH20 modificado muestra actividad hialuronidasa aumentada en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Cuando se compara la actividad entre polipéptidos, la actividad se compara en las mismas condiciones. Son ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados cualquiera que contenga un reemplazo o reemplazos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69 o 72, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,
95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66. En particular, se proporcionan polipéptidos de PH20 modificados que contienen un reemplazo de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66. Entre los polipéptidos de PH20 modificados están los que muestran al menos 120%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200 %, 250 %, 300%, 350 %, 400 %, 500 %,
1500 %, 2000%, 3000 %, 4000 %, 5000 % o más de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos.
La actividad puede evaluarse a cualquier temperatura, en particular dicha actividad está presente cuando la hialuronidasa se expone a una temperatura que es una temperatura entre o aproximadamente entre 2 °C y 8 °C.
Estos polipéptidos de PH20 modificados contienen al menos un reemplazo de aminoácido en una posición de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de entre 1, 12, 15, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 39,
46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97, 118, 120, 127, 131, 135, 141, 142,
147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263,
Figure imgf000008_0001
269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 291, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359, 371, 377, 380, 389, 392, 395, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 y 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por alineamiento del polipéptido de PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. Las modificaciones ejemplares incluyen al menos un reemplazo de aminoácido seleccionado de entre reemplazo con: histidina (H) en una posición correspondiente a la posición 1; Q en una posición correspondiente a la posición 1; E en una posición correspondiente a la posición 12; T en una posición correspondiente a la posición 12 V en una posición correspondiente a la posición 15; E en una posición correspondiente a la posición 24 H en una posición correspondiente a la posición 24; E en una posición correspondiente a la posición 26 K en una posición correspondiente a la posición 26; K en una posición correspondiente a la posición 27 R en una posición correspondiente a la posición 27; E en una posición correspondiente a la posición 29; I en una posición correspondiente a la posición 29; L en una posición correspondiente a la posición 29; M en una posición correspondiente a la posición 29; P en una posición correspondiente a la posición 29 S en una posición correspondiente a la posición 29; V en una posición correspondiente a la posición 29; G en una posición correspondiente a la posición 30; H en una posición correspondiente a la posición 30 K en una posición correspondiente a la posición 30; M en una posición correspondiente a la posición 30 R en una posición correspondiente a la posición 30; S en una posición correspondiente a la posición 30 A en una posición correspondiente a la posición 31 C en una posición correspondiente a la posición 31; H en una posición correspondiente a la posición 31 I en una posición correspondiente a la posición 31; K en una posición correspondiente a la posición 31 L en una posición correspondiente a la posición 31; P en una posición correspondiente a la posición 31 R en una posición correspondiente a la posición 31; S en una posición correspondiente a la posición 31 T en una posición correspondiente a la posición 31; V en una posición correspondiente a la posición 31 F en una posición correspondiente a la posición 32; G en una posición correspondiente a la posición 32 H en una posición correspondiente a la posición 32; W en una posición correspondiente a la posición 33 F en una posición correspondiente a la posición 37; N en una posición correspondiente a la posición 39 T en una posición correspondiente a la posición 39; R en una posición correspondiente a la posición 46 F en una posición correspondiente a la posición 48; H en una posición correspondiente a la posición 48 N en una posición correspondiente a la posición 48; Q en una posición correspondiente a la posición 52 K en una posición correspondiente a la posición 58; Q en una posición correspondiente a la posición 58 W en una posición correspondiente a la posición 63; V en una posición correspondiente a la posición 67 H en una posición correspondiente a la posición 68; Q en una posición correspondiente a la posición 68; A en una posición correspondiente a la posición 69; C en una posición correspondiente a la posición 69; F en una posición correspondiente a la posición 69; G en una posición correspondiente a la posición 69 I en una posición correspondiente a la posición 69; L en una posición correspondiente a la posición 69; M en una posición correspondiente a la posición 69; P en una posición correspondiente a la posición 69; R en una posición correspondiente a la posición 69; W en una posición correspondiente a la posición 69; Y en una posición correspondiente a la posición 69; A en una posición correspondiente a la posición 70; C en una posición correspondiente a la posición 70; F en una posición correspondiente a la posición 70; G en una posición correspondiente a la posición 70; H en una posición correspondiente a la posición 70; K en una posición correspondiente a la posición 70; L en una posición correspondiente a la posición 70; N en una posición correspondiente a la posición 70; P en una posición correspondiente a la posición 70; R en una posición correspondiente a la posición 70; S en una posición correspondiente a la posición 70; T en una posición correspondiente a la posición 70; V en una posición correspondiente a la posición 70; R en una posición correspondiente a la posición 71; S en una posición correspondiente a la posición 71; M en una posición correspondiente a la posición 72; Q en una posición correspondiente a la posición 72; H en una posición correspondiente a la posición 73; L en una posición correspondiente a la posición 73; W en una posición correspondiente a la posición 73; A en una posición correspondiente a la posición 74; C en una posición correspondiente a la posición 74; G en una posición correspondiente a la posición 74; N en una posición correspondiente a la posición 74; P en una posición correspondiente a la posición 74; R en una posición correspondiente a la posición 74; S en una posición correspondiente a la posición 74; V en una posición correspondiente a la posición 74; W en una posición correspondiente a la posición 74; F en una posición correspondiente a la posición 75; L en una posición correspondiente a la posición 75; R en una posición correspondiente a la posición 75; T en una posición correspondiente a la posición 75; G en una posición correspondiente a la posición 84; R en una posición correspondiente a la posición 84; A en una posición correspondiente a la posición 86; C en una posición correspondiente a la posición 87; T en una posición correspondiente a la posición 87; Y en una posición correspondiente a la posición 87 C en una posición correspondiente a la posición 92; I en una posición correspondiente a la posición 93; R en una posición correspondiente a la posición 94; G en una posición correspondiente a la posición 97; Q en una posición correspondiente a la posición 118; F en una posición correspondiente a la posición 120 ; V en una posición correspondiente a la posición 120; Y en una posición correspondiente a la posición 120; H en una posición correspondiente a la posición 127; N en una posición correspondiente a la posición 127; G en una posición correspondiente a la posición 131; R en una posición correspondiente a la posición 131 ; v en una posición correspondiente a la posición 131; D en una posición correspondiente a la posición 135; G en una posición correspondiente a la posición 135; R en una posición correspondiente a la poosición 135, con H en una posición correspondiente a la posición 141 ; Y en una posición correspondiente a la posición 141 ; R en una posición correspondiente a la posición 142; R en una posición correspondiente a la posición 147 ; v en una posición correspondiente a la posición 147; K en una posición correspondiente a la posición 148 ; G en una posición correspondiente a la posición 150 K en una posición correspondiente a la posición 151 ; L en una posición correspondiente a la posición 151; M en una posición correspondiente a la posición 151 ; Q en una posición correspondiente a la posición 151; R en una posición correspondiente a la posición 151 ; R en una posición correspondiente a la posición 152; G en una posición correspondiente a la posición 155 ; k en una posición correspondiente a la posición 155; D en una posición correspondiente a la posición 156 ; a en una posición correspondiente a la posición 163; E en una posición correspondiente a la posición 163 ; k en una posición correspondiente a la posición 163; R en una posición correspondiente a la posición 163 ; M en una posición correspondiente a la posición 164; D en una posición correspondiente a la posición 165 ; n en una posición correspondiente a la posición 165 A en una posición correspondiente a la posición 166 ; F en una posición correspondiente a la posición 166; H en una posición correspondiente a la posición 166 ; L en una posición correspondiente a la posición 166; Q en una posición correspondiente a la posición 166 ; R en una posición correspondiente a la posición 166; T en una posición correspondiente a la posición 166 ; y en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 169 ; R en una posición correspondiente a la posición 170 K en una posición correspondiente a la posición 174 ; d en una posición correspondiente a la posición 198 K en una posición correspondiente a la posición 206 ; L en una posición correspondiente a la posición 206; N en una posición correspondiente a la posición 212 M en una posición correspondiente a la posición 213; N en una posición correspondiente a la posición 213 M en una posición correspondiente a la posición 215; S en una posición correspondiente a la posición 219 K en una posición correspondiente a la posición 233; R en una posición correspondiente a la posición 233 M en una posición correspondiente a la posición 234; R en una posición correspondiente a la posición 236 E en una posición correspondiente a la posición 237; S en una posición correspondiente a la posición 238 I en una posición correspondiente a la posición 247; T en una posición correspondiente a la posición 257 P en una posición correspondiente a la posición 259; Y en una posición correspondiente a la posición 260 K en una posición correspondiente a la posición 261; N en una posición correspondiente a la posición 261 K en una posición correspondiente a la posición 263; R en una posición correspondiente a la posición 263 A en una posición correspondiente a la posición 269; L en una posición correspondiente a la posición 271 M en una posición correspondiente a la posición 271; T en una posición correspondiente a la posición 272 D en una posición correspondiente a la posición 276; S en una posición correspondiente a la posición 276 Y en una posición correspondiente a la posición 276; K en una posición correspondiente a la posición 277 R en una posición correspondiente a la posición 277; T en una posición correspondiente a la posición 277 H en una posición correspondiente a la posición 278; K en una posición correspondiente a la posición 278 N en una posición correspondiente a la posición 278; R en una posición correspondiente a la posición 278 S en una posición correspondiente a la posición 278; T en una posición correspondiente a la posición 278 Y en una posición correspondiente a la posición 278; M en una posición correspondiente a la posición 282 V en una posición correspondiente a la posición 291; A en una posición correspondiente a la posición 293 C en una posición correspondiente a la posición 293; F en una posición correspondiente a la posición 293 M en una posición correspondiente a la posición 293; P en una posición correspondiente a la posición 293 Q en una posición correspondiente a la posición 293; V en una posición correspondiente a la posición 293 E en una posición correspondiente a la posición 305; G en una posición correspondiente a la posición 308 N en una posición correspondiente a la posición 308; E en una posición correspondiente a la posición 309 L en una posición correspondiente a la posición 309; N en una posición correspondiente a la posición 309 Q en una posición correspondiente a la posición 309; R en una posición correspondiente a la posición 309 T en una posición correspondiente a la posición 309; A en una posición correspondiente a la posición 310 G en una posición correspondiente a la posición 310; K en una posición correspondiente a la posición 313 R en una posición correspondiente a la posición 313; H en una posición correspondiente a la posición 315 I en una posición correspondiente a la posición 317; K en una posición correspondiente a la posición 317 R en una posición correspondiente a la posición 317; M en una posición correspondiente a la posición 318 H en una posición correspondiente a la posición 320; K en una posición correspondiente a la posición 320 R en una posición correspondiente a la posición 320; R en una posición correspondiente a la posición 324 A en una posición correspondiente a la posición 325; D en una posición correspondiente a la posición 325 E en una posición correspondiente a la posición 325; G en una posición correspondiente a la posición 325 H en una posición correspondiente a la posición 325; K en una posición correspondiente a la posición 325 M en una posición correspondiente a la posición 325; N en una posición correspondiente a la posición 325 Q en una posición correspondiente a la posición 325; S en una posición correspondiente a la posición 325 V en una posición correspondiente a la posición 326 I en una posición correspondiente a la posición 328 K en una posición correspondiente a la posición 328; L en una posición correspondiente a la posición 328 S en una posición correspondiente a la posición 328; Y en una posición correspondiente a la posición 328 G en una posición correspondiente a la posición 347; S en una posición correspondiente a la posición 347; V en una posición correspondiente a la posición 353; con T en una posición correspondiente a la posición 359 R en una posición correspondiente a la posición 371; P en una posición correspondiente a la posición 377; T en una posición correspondiente a la posición 377; W en una posición correspondiente a la posición 380 Y en una posición correspondiente a la posición 380; K en una posición correspondiente a la posición 389; M en una posición correspondiente a la posición 392; R en una posición correspondiente a la posición 395; M en una posición correspondiente a la posición 399; T en una posición correspondiente a la posición 399; W en una posición correspondiente a la posición 399; G en una posición correspondiente a la posición 405; D en una posición correspondiente a la posición 407; Q en una posición correspondiente a la posición 407; A en una posición correspondiente a la posición 409; Q en una posición correspondiente a la posición 409 T en una posición correspondiente a la posición 410; P en una posición correspondiente a la posición 418 F en una posición correspondiente a la posición 419 I en una posición correspondiente a la posición 419 K en una posición correspondiente a la posición 419; R en una posición correspondiente a la posición 419 S en una posición correspondiente a la posición 419; H en una posición correspondiente a la posición 421 K en una posición correspondiente a la posición 421; N en una posición correspondiente a la posición 421 Q en una posición correspondiente a la posición 421; R en una posición correspondiente a la posición 421 S en una posición correspondiente a la posición 421; K en una posición correspondiente a la posición 425 A en una posición correspondiente a la posición 431; H en una posición correspondiente a la posición 431 K en una posición correspondiente a la posición 431; Q en una posición correspondiente a la posición 431 R en una posición correspondiente a la posición 431; S en una posición correspondiente a la posición 431 V en una posición correspondiente a la posición 431; L en una posición correspondiente a la posición 433 R en una posición correspondiente a la posición 433; T en una posición correspondiente a la posición 433 V en una posición correspondiente a la posición 433; K en una posición correspondiente a la posición 436 I en una posición correspondiente a la posición 437; M en una posición correspondiente a la posición 437 T en una posición correspondiente a la posición 438; V en una posición correspondiente la posición 439 H en una posición correspondiente a la posición 440; R en una posición correspondiente la posición 440 F en una posición correspondiente a la posición 441; R en una posición correspondiente la posición 442 A en una posición correspondiente a la posición 443; M en una posición correspondiente la posición 443 M en una posición correspondiente a la posición 445; P en una posición correspondiente la posición 445 A en una posición correspondiente a la posición 446; D en una posición correspondiente a la posición 447; N en una posición correspondiente a la posición 447; y/o con Q en una posición correspondiente a la posición 447, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Entre los polipéptidos que muestran actividad hialuronidasa aumentada están los que muestran al menos 2,0 veces la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Por ejemplo, entre estos están los polipéptidos de PH20 modificados que contienen al menos un reemplazo de aminoácido en una posición de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de entre 24, 29, 31, 48, 58, 69, 70, 75, 84, 97, 165, 166, 271, 278, 317, 320, 325 y 326 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por alineamiento del polipéptido de PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3, tal como polipéptidos de PH20 modificados que contienen al menos un reemplazo de aminoácido seleccionado de entre el reemplazo con: E en una posición correspondiente a la posición 24; E en una posición correspondiente a la posición 29; V en una posición correspondiente a la posición 31; N en una posición correspondiente a la posición 48; K en una posición correspondiente a la posición 58; Q en una posición correspondiente a la posición 58; A en una posición correspondiente a la posición 69; F en una posición correspondiente a la posición 69; G en una posición correspondiente a la posición 69; P en una posición correspondiente a la posición 69; R en una posición correspondiente a la posición 69; A en una posición correspondiente a la posición 70; F en una posición correspondiente a la posición 70; G en una posición correspondiente a la posición 70; H en una posición correspondiente a la posición 70; H en una posición correspondiente a la posición 70; N en una posición correspondiente a la posición 70; R en una posición correspondiente a la posición 70; T en una posición correspondiente a la posición 70; V en una posición correspondiente a la posición 70; L en una posición correspondiente a la posición 75; T en una posición correspondiente a la posición 75; G en una posición correspondiente a la posición 84; G en una posición correspondiente a la posición 97; D en una posición correspondiente a la posición 165; L en una posición correspondiente a la posición 166 R en una posición correspondiente a la posición 166; T en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 271; H en una posición correspondiente a la posición 278; R en una posición correspondiente a la posición 278; K en una posición correspondiente a la posición 317 K en una posición correspondiente a la posición 320; E en una posición correspondiente a la posición 325, con G en una posición correspondiente a la posición 325 ; K en una posición correspondiente a la posición 325; N en una posición correspondiente a la posición 325; Q en una posición correspondiente a la posición 325; y V en una posición correspondiente a la posición 326; en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Entre cualquiera de los polipéptidos proporcionados en el presente documento que muestran actividad hialuronidasa aumentada, cualquiera de dichos polipéptidos de PH20 según las reivindicaciones contienen una única modificación de aminoácido, tal como un reemplazo, y combinaciones de modificaciones, tales como al menos 1 o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones. La modificación, tal como reemplazo, puede ser en un polipéptido de PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o es un fragmento truncado en el extremo C terminal del mismo que es un polipéptido de PH20 soluble, tal como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 o 32-66. Por ejemplo, cualquiera de dichos polipéptidos de PH20 modificados tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
También se describen polipéptidos de PH20 modificados que contienen al menos un reemplazo de aminoácido en el polipéptido de PH20 cuya secuencia se expone en SEQ ID NO: 7, un fragmento truncado en el extremo C terminal del mismo, un fragmento soluble del mismo, o en un polipéptido de PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7, donde al menos un reemplazo o reemplazos de aminoácidos están en una posición de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 54, 58, 59, 60, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91,92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 110, 114, 117, 118, 119, 120, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 186, 192, 193, 195, 196, 197, 198, 200, 202, 204, 205, 206, 208, 209, 211,212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221,222, 224, 226, 230, 231,232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 245, 247, 248, 251,253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 271,272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291,292, 293, 294, 297, 298, 300, 301,302, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311,312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321,323, 324, 325, 326, 327, 328, 331,334, 335, 338, 339, 342, 343, 347, 348, 349, 351,353, 356, 357, 358, 359, 360, 361,367, 368, 369, 371,373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381,383, 385, 387, 388, 389, 391,392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 401,403, 404, 405, 406, 407, 409, 410, 411,412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,422, 425, 426, 427, 428, 431,432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441,442, 443, 444, 445, 446 y 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 3 o 7, donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por alineamiento del polipéptido de PH20 con el polipéptido expuestos en SEQ ID NO: 3; y siempre que si el polipéptido de PH20 modificado contiene un reemplazo en una posición correspondiente a la posición 13, 47, 131 o 219 el reemplazo no es reemplazo con una alanina (A). Entre estos polipéptidos de PH20 modificados están los que muestran al menos 40 % de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácido, donde, como en todos los casos del presente documento la actividad se compara en las mismas condiciones.
Se incluyen entre estos polipéptidos los que contienen un reemplazo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 y 72, o en una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 91 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72. En particular, el polipéptido de PH20 modificado contiene reemplazos de aminoácidos en SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, que son polipéptidos que son un fragmento truncado en el extremo C terminal de SEQ ID NO: 7, o un polipéptido de PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 %idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. En particular, entre cualquiera de dichos polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento están cualquiera incluyendo en los que el reemplazo de aminoácido es un reemplazo de aminoácido expuesto en la Tabla 3 posterior. Por ejemplo, dichos polipéptidos de PH20 modificados incluyen los que tienen al menos un reemplazo de aminoácido en una posición de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de entre 1, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 58, 59, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 82, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 94, 97, 102, 104, 107, 114, 118, 120, 127, 128, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 174, 175, 178, 179, 193, 195, 196, 198, 204, 205, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 220, 221, 222, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 240, 247, 248, 249, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 267, 269, 271, 272, 273, 274, 276, 277, 278, 279, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 293, 298, 305, 307, 308, 309, 310, 313, 314, 315, 317, 318, 320, 321, 324, 325, 326, 328, 335, 347, 349, 351, 353, 356, 359, 367, 368, 369, 371, 373, 374, 375, 376, 377, 380, 381, 383, 385, 389, 392, 393, 395, 396, 399, 401, 404, 405, 406, 407, 409, 410, 412, 416, 418, 419, 421, 425, 427, 428, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446 o 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Son ejemplos de dichos reemplazos los que contienen al menos un reemplazo de aminoácido seleccionado de entre reemplazo con: histidina (H) en una posición correspondiente a la posición 1; A en una posición correspondiente a la posición 1; E en una posición correspondiente a la posición 1; G en una posición correspondiente a la posición 1; K en una posición correspondiente a la posición 1; Q en una posición correspondiente a la posición 1; R en una posición correspondiente a la posición 1; A en una posición correspondiente a la posición 6; M en una posición correspondiente a la posición 8; Q en una posición correspondiente a la posición 9; G en una posición correspondiente a la posición 10; H en una posición correspondiente a la posición 10; S en una posición correspondiente a la posición 11; E en una posición correspondiente a la posición 12 I en una posición correspondiente a la posición 12; K en una posición correspondiente a la posición 12; T en una posición correspondiente a la posición 12; V en una posición correspondiente a la posición 14; V en una posición correspondiente a la posición 15; M en una posición correspondiente a la posición 15; S en una posición correspondiente a la posición 20; T en una posición correspondiente a la posición 22; E en una posición correspondiente a la posición 24; H en una posición correspondiente a la posición 24; R en una posición correspondiente a la posición 24; A en una posición correspondiente a la posición 26; E en una posición correspondiente a la posición 26; K en una posición correspondiente a la posición 26; M en una posición correspondiente a la posición 26; Q en una posición correspondiente a la posición 26; R en una posición correspondiente a la posición 26; D en una posición correspondiente a la posición 27; K en una posición correspondiente a la posición 27; R en una posición correspondiente a la posición 27; R en una posición correspondiente a la posición 28; E en una posición correspondiente a la posición 29; I en una posición correspondiente a la posición 29; K en una posición correspondiente a la posición 29; L en una posición correspondiente a la posición 29; M en una posición correspondiente a la posición 29; P en una posición correspondiente a la posición 29; R en una posición correspondiente a la posición 29; S en una posición correspondiente a la posición 29; T en una posición correspondiente a la posición 29; V en una posición correspondiente a la posición 29; G en una posición correspondiente a la posición 30; H en una posición correspondiente a la posición 30; K en una posición correspondiente a la posición 30; L en una posición correspondiente a la posición 30; M en una posición correspondiente a la posición 30; R en una posición correspondiente a la posición 30; S en una posición correspondiente a la posición 30; A en una posición correspondiente a la posición 31; C en una posición correspondiente a la posición 31; G en una posición correspondiente a la posición 31; H en una posición correspondiente a la posición 31 I en una posición correspondiente a la posición 31; K en una posición correspondiente a la posición 31; L en una posición correspondiente a la posición 31; P en una posición correspondiente a la posición 31; R en una posición correspondiente a la posición 31; S en una posición correspondiente a la posición 31; T en una posición correspondiente a la posición 31; V en una posición correspondiente a la posición 31; W en una posición correspondiente a la posición 31; C en una posición correspondiente a la posición 32; F en una posición correspondiente a la posición 32; G en una posición correspondiente a la posición 32; H en una posición correspondiente a la posición 32; W en una posición correspondiente a la posición 33; G en una posición correspondiente a la posición 33; W en una posición correspondiente a la posición 34; Q en una posición correspondiente a la posición 35; V en una posición correspondiente a la posición 35; H en una posición correspondiente a la posición 36; N en una posición correspondiente a la posición 36; F en una posición correspondiente a la posición 37 M en una posición correspondiente a la posición 37; Y en una correspondiente a la posición 38 A en una posición correspondiente a la posición 39; L en una correspondiente a la posición 39 N en una posición correspondiente a la posición 39; T en una correspondiente a la posición 39 L en una posición correspondiente a la posición 40; T en una correspondiente a la posición 41 L en una posición correspondiente a la posición 46; R en una correspondiente a la posición 46 D en una posición correspondiente a la posición 47; F en una correspondiente a la posición 47 T en una posición correspondiente a la posición 47; W en una correspondiente a la posición 47, con F en una posición correspondiente a la posición 48 H en una correspondiente a la posición 48 K en una posición correspondiente a la posición 48; N en una correspondiente a la posición 48 R en una posición correspondiente a la posición 49; D en una correspondiente a la posición 50 S en una posición correspondiente a la posición 50; M en una correspondiente a la posición 50 N en una posición correspondiente a la posición 52; Q en una correspondiente a la posición 52 R en una posición correspondiente a la posición 52; S en una correspondiente a la posición 52 T en una posición correspondiente a la posición 52; C en una correspondiente a la posición 58 K en una posición correspondiente a la posición 58; L en una correspondiente a la posición 58 P en una posición correspondiente a la posición 58; Q en una correspondiente a la posición 58 R en una posición correspondiente a la posición 58; H en una correspondiente a la posición 58 N en una posición correspondiente a la posición 58; Y en una correspondiente a la posición 58 N en una posición correspondiente a la posición 59; K en una correspondiente a la posición 63 L en una posición correspondiente a la posición 63; M en una correspondiente a la posición 63 R en una posición correspondiente a la posición 63; W en una correspondiente a la posición 63 V en una posición correspondiente a la posición 67; H en una correspondiente a la posición 68 P en una posición correspondiente a la posición 68; Q en una correspondiente a la posición 68 A en una posición correspondiente a la posición 69; C en una correspondiente a la posición 69 E en una posición correspondiente a la posición 69; F en una correspondiente a la posición 69 G en una posición correspondiente a la posición 69 I en una correspondiente a la posición 69 L en una posición correspondiente a la posición 69; M en una correspondiente a la posición 69 P en una posición correspondiente a la posición 69; R en una correspondiente a la posición 69 T en una posición correspondiente a la posición 69; W en una correspondiente a la posición 69 Y en una posición correspondiente a la posición 69; A en una correspondiente a la posición 70 C en una posición correspondiente a la posición 70; F en una correspondiente a la posición 70 G en una posición correspondiente a la posición 70; H en una correspondiente a la posición 70 K en una posición correspondiente a la posición 70; L en una correspondiente a la posición 70 N en una posición correspondiente a la posición 70; P en una correspondiente a la posición 70 R en una posición correspondiente a la posición 70; S en una correspondiente a la posición 70 T en una posición correspondiente a la posición 70; V en una correspondiente a la posición 70 Y en una posición correspondiente a la posición 70; G en una correspondiente a la posición 71 N en una posición correspondiente a la posición 71; R en una correspondiente a la posición 71 S en una posición correspondiente a la posición 71; K en una correspondiente a la posición 72 M en una posición correspondiente a la posición 72; Q en una correspondiente a la posición 72 A en una posición correspondiente a la posición 73; H en una correspondiente a la posición 73 K en una posición correspondiente a la posición 73; L en una correspondiente a la posición 73 Q en una posición correspondiente a la posición 73; R en una correspondiente a la posición 73 T en una posición correspondiente a la posición 73; W en una correspondiente a la posición 73 A en una posición correspondiente a la posición 74; C en una correspondiente a la posición 74 E en una posición correspondiente a la posición 74; F en una correspondiente a la posición 74 G en una posición correspondiente a la posición 74; H en una correspondiente a la posición 74 K en una posición correspondiente a la posición 74; L en una correspondiente a la posición 74 M en una posición correspondiente a la posición 74; N en una correspondiente a la posición 74 P en una posición correspondiente a la posición 74; R en una correspondiente a la posición 74 S en una posición correspondiente a la posición 74; V en una correspondiente a la posición 74 W en una posición correspondiente a la posición 74; F en una correspondiente a la posición 75 L en una posición correspondiente a la posición 75; M en una correspondiente a la posición 75 R en una posición correspondiente a la posición 75; T en una correspondiente a la posición 75 L en una posición correspondiente a la posición 79; L en una correspondiente a la posición 82 N en una posición correspondiente a la posición 82; V en una correspondiente a la posición 83 Q en una posición correspondiente a la posición 83; S en una correspondiente a la posición 83 G en una posición correspondiente a la posición 83; E en una correspondiente a la posición 84 F en una posición correspondiente a la posición 84; G en una correspondiente a la posición 84 N en una posición correspondiente a la posición 84; R en una correspondiente a la posición 84 A en una posición correspondiente a la posición 86; H en una correspondiente a la posición 86 K en una posición correspondiente a la posición 86; N en una correspondiente a la posición 86 S en una posición correspondiente a la posición 86; T en una correspondiente a la posición 86 W en una posición correspondiente a la posición 86; C en una correspondiente a la posición 87 G en una posición correspondiente a la posición 87; L en una correspondiente a la posición 87 M en una posición correspondiente a la posición 87; R en una correspondiente a la posición 87; S en una posición correspondiente a la posición 87; T en una posición correspondiente a la posición 87; V en una posición correspondiente a la posición 87; Y en una posición correspondiente a la posición 87; C en una posición correspondiente a la posición 89; A en una posición correspondiente a la posición 90; E en una posición correspondiente a la posición 90; H en una posición correspondiente a la posición 90; K en una posición correspondiente a la posición 90; N en una posición correspondiente a la posición 90; R en una posición correspondiente a la posición 90; C en una posición correspondiente a la posición 92; L en una posición correspondiente a la posición 92; I en una posición correspondiente a la posición 93; L en una posición correspondiente a la posición 93; Q en una posición correspondiente a la posición 93; R en una posición correspondiente a la posición 93; S en una posición correspondiente a la posición 93; T en una posición correspondiente a la posición 93; D en una posición correspondiente a la posición 94; Q en una posición correspondiente a la posición 94; R en una posición correspondiente a la posición 94; A en una posición correspondiente a la posición 97; C en un resto de aminoácido correspondiente a la posición 97; D en una posición correspondiente a la posición 97; E en una posición correspondiente a la posición 97; G en una posición correspondiente a la posición 97; L en una posición correspondiente a la posición 97; S en una posición correspondiente a la posición 97; S en una posición correspondiente a la posición 102 T en una posición correspondiente a la posición 102; R en una posición correspondiente a la posición 104; L en una posición correspondiente a la posición 107; A en una posición correspondiente a la posición 114; Q en una posición correspondiente a la posición 118; H en una posición correspondiente a la posición 120 ; F en una posición correspondiente a la posición 120 I en una posición correspondiente a la posición 120 S en una posición correspondiente a la posición 120; V en una posición correspondiente a la posición 120 Y en una posición correspondiente a la posición 120; E en una posición correspondiente a la posición 127 H en una posición correspondiente a la posición 127; N en una posición correspondiente a la posición 127; Q en una posición correspondiente a la posición 127; R en una posición correspondiente a la posición 127; I en una posición correspondiente a la posición 128; R en una posición correspondiente a la posición 130; G en una posición correspondiente a la posición 131 I en una posición correspondiente a la posición 131 M en una posición correspondiente a la posición 131; Q en una posición correspondiente a la posición 131 R en una posición correspondiente a la posición 131; V en una posición correspondiente a la posición 131 ; N en una posición correspondiente a la posición 132; L en una posición correspondiente a la posición 132 D en una posición correspondiente a la posición 135; G en una posición correspondiente a la posición 135; R en una posición correspondiente a la posición 135, con L en una posición correspondiente a la posición 138 T en una posición correspondiente a la posición 139; K en una posición correspondiente a la posición 140 H en una posición correspondiente a la posición 141; R en una posición correspondiente a la posición 141 S en una posición correspondiente a la posición 141; W en una posición correspondiente a la posición 141 Y en una posición correspondiente a la posición 141; D en una posición correspondiente a la posición 142 G en una posición correspondiente a la posición 142; K en una posición correspondiente a la posición 142 N en una posición correspondiente a la posición 142; P en una posición correspondiente a la posición 142; Q en una posición correspondiente a la posición 142; R en una posición correspondiente a la posición 142 S en una posición correspondiente a la posición 142; T en una posición correspondiente a la posición 142 G en una posición correspondiente a la posición 143; K en una posición correspondiente a la posición 143 R en una posición correspondiente a la posición 144; T en una posición correspondiente a la posición 144 P en una posición correspondiente a la posición 146; R en una posición correspondiente a la posición 146 A en una posición correspondiente a la posición 147; F en una posición correspondiente a la posición 147 L en una posición correspondiente a la posición 147; R en una posición correspondiente a la posición 147 S en una posición correspondiente a la posición 147; V en una posición correspondiente a la posición 147 H en una posición correspondiente a la posición 148; K en una posición correspondiente a la posición 148 ; Q en una posición correspondiente a la posición 148; T en una posición correspondiente a la posición 149 V en una posición correspondiente a la posición 149; A en una posición correspondiente a la posición 150 D en una posición correspondiente a la posición 150; G en una posición correspondiente a la posición 150 N en una posición correspondiente a la posición 150; S en una posición correspondiente a la posición 150 W en una posición correspondiente a la posición 150; Y en una posición correspondiente a la posición 150 A en una posición correspondiente a la posición 151; H en una posición correspondiente a la posición 151 K en una posición correspondiente a la posición 151; L en una posición correspondiente a la posición 151 M en una posición correspondiente a la posición 151; Q en una posición correspondiente a la posición 151 R en una posición correspondiente a la posición 151; S en una posición correspondiente a la posición 151 T en una posición correspondiente a la posición 151; V en una posición correspondiente a la posición 151 W en una posición correspondiente a la posición 151; Y en una posición correspondiente a la posición 151 R en una posición correspondiente a la posición 152; T en una posición correspondiente a la posición 152 W en una posición correspondiente a la posición 152; D en una posición correspondiente a la posición 155 G en una posición correspondiente a la posición 155; K en una posición correspondiente a la posición 155 R en una posición correspondiente a la posición 155; D en una posición correspondiente a la posición 156 ; Q en una posición correspondiente a la posición 158; S en una posición correspondiente a la posición 158 S en una posición correspondiente a la posición 160; E en una posición correspondiente a la posición 162 A en una posición correspondiente a la posición 163; E en una posición correspondiente a la posición 163 K en una posición correspondiente a la posición 163; Q en una posición correspondiente a la posición 163 R en una posición correspondiente a la posición 163; S en una posición correspondiente a la posición 163 M en una posición correspondiente a la posición 164; V en una posición correspondiente a la posición 164 D en una posición correspondiente a la posición 165; F en una posición correspondiente a la posición 165 N en una posición correspondiente a la posición 165; S en una posición correspondiente a la posición 165 V en una posición correspondiente a la posición 165; A en una posición correspondiente a la posición 166 E en una posición correspondiente a la posición 166; F en una posición correspondiente a la posición 166 H en una posición correspondiente a la posición 166; L en una posición correspondiente a la posición 166 Q en una posición correspondiente a la posición 166; R en una posición correspondiente a la posición 166 T en una posición correspondiente a la posición 166; W en una posición correspondiente a la posición 166 Y en una posición correspondiente a la posición 166; D en una posición correspondiente a la posición 167 L en una posición correspondiente a la posición 169; R en una posición correspondiente a la posición 170 A en una posición correspondiente a la posición 172; R en una posición correspondiente a la posición 173 G en una posición correspondiente a la posición 174; K en una posición correspondiente a la posición 174 N en una posición correspondiente a la posición 174; R en una posición correspondiente a la posición 174 T en una posición correspondiente a la posición 174; T en una posición correspondiente a la posición 175 K en una posición correspondiente a la posición 178; R en una posición correspondiente a la posición 178 K en una posición correspondiente a la posición 179; Q en una posición correspondiente a la posición 193 T en una posición correspondiente a la posición 195; N en una posición correspondiente a la posición 195; con E en una posición correspondiente a la posición 196 R en una posición correspondiente a la posición 196; con D en una posición correspondiente a la posición 198 P en una posición correspondiente a la posición 204 A en una posición correspondiente a la posición 205; E en una posición correspondiente a la posición 205 L en una posición correspondiente a la posición 205; T en una posición correspondiente a la posición 205 I en una posición correspondiente a la posición 206; K en una posición correspondiente a la posición 206 L en una posición correspondiente a la posición 206; R en una posición correspondiente a la posición 206; R en una posición correspondiente a la posición 209; N en una posición correspondiente a la posición 212 S en una posición correspondiente a la posición 212; A en una posición correspondiente a la posición 213 M en una posición correspondiente a la posición 213; N en una posición correspondiente a la posición 213 H en una posición correspondiente a la posición 215; M en una posición correspondiente a la posición 215 I en una posición correspondiente a la posición 219; K en una posición correspondiente a la posición 219 S en una posición correspondiente a la posición 219; H en una posición correspondiente a la posición 220 I en una posición correspondiente a la posición 220; L en una posición correspondiente a la posición 220; V en una posición correspondiente a la posición 220; Q en una posición correspondiente a la posición 221 G en una posición correspondiente a la posición 222; F en una posición correspondiente a la posición 232; G en una posición correspondiente a la posición 233; K en una posición correspondiente a la posición 233; R en una posición correspondiente a la posición 233; M en una posición correspondiente a la posición 234 A en una posición correspondiente a la posición 235; R en una posición correspondiente a la posición 236; C en una posición correspondiente a la posición 237; E en una posición correspondiente a la posición 237; H en una posición correspondiente a la posición 237; Q en una posición correspondiente a la posición 237 T en una posición correspondiente a la posición 237; E en una posición correspondiente a la posición 238; H en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 238; S en una posición correspondiente a la posición 238; A en una posición correspondiente a la posición 240; Q en una posición correspondiente a la posición 240 I en una posición correspondiente a la posición 247; A en una posición correspondiente a la posición 248; V en una posición correspondiente a la posición 249; G en una posición correspondiente a la posición 257 T en una posición correspondiente a la posición 257; R en una posición correspondiente a la posición 257 N en una posición correspondiente a la posición 258; S en una posición correspondiente a la posición 258; P en una posición correspondiente a la posición 259; M en una posición correspondiente a la posición 260 Y en una posición correspondiente a la posición 260; A en una posición correspondiente a la posición 261 K en una posición correspondiente a la posición 261; N en una posición correspondiente a la posición 261 K en una posición correspondiente a la posición 263; R en una posición correspondiente a la posición 263 T en una posición correspondiente a la posición 267; A en una posición correspondiente a la posición 269 L en una posición correspondiente a la posición 271; M en una posición correspondiente a la posición 271 D en una posición correspondiente a la posición 272; T en una posición correspondiente a la posición 272 H en una posición correspondiente a la posición 273; Y en una posición correspondiente a la posición 273 F en una posición correspondiente a la posición 274; D en una posición correspondiente a la posición 276; H en una posición correspondiente a la posición 276; M en una posición correspondiente a la posición 276 R en una posición correspondiente a la posición 276; S en una posición correspondiente a la posición 276 Y en una posición correspondiente a la posición 276; A en una posición correspondiente a la posición 277 E en una posición correspondiente a la posición 277; H en una posición correspondiente a la posición 277; K en una posición correspondiente a la posición 277; M en una posición correspondiente a la posición 277; N en una posición correspondiente a la posición 277; Q en una posición correspondiente a la posición 277; R en una posición correspondiente a la posición 277; S en una posición correspondiente a la posición 277 T en una posición correspondiente a la posición 277; E en una posición correspondiente a la posición 278 F en una posición correspondiente a la posición 278; G en una posición correspondiente a la posición 278 H en una posición correspondiente a la posición 278; K en una posición correspondiente a la posición 278; N en una posición correspondiente a la posición 278; R en una posición correspondiente a la posición 278 S en una posición correspondiente a la posición 278; T en una posición correspondiente a la posición 278 Y en una posición correspondiente a la posición 278; H en una posición correspondiente a la posición 279; M en una posición correspondiente a la posición 282; S en una posición correspondiente a la posición 283 H en una posición correspondiente a la posición 285 T en una posición correspondiente a la posición 287 S en una posición correspondiente a la posición 289 S en una posición correspondiente a la posición 291 V en una posición correspondiente a la posición 291 C en una posición correspondiente a la posición 292 F en una posición correspondiente a la posición 292; H en una posición correspondiente a la posición 292 K en una posición correspondiente a la posición 292 R en una posición correspondiente a la posición 292 V en una posición correspondiente a la posición 292 A en una posición correspondiente a la posición 293 C en una posición correspondiente a la posición 293 D en una posición correspondiente a la posición 293 F en una posición correspondiente a la posición 293 K en una posición correspondiente a la posición 293; M en una posición correspondiente a la posición 293 P en una posición correspondiente a la posición 293 Q en una posición correspondiente a la posición 293 V en una posición correspondiente a la posición 293 Y en una posición correspondiente a la posición 293; G en una posición correspondiente a la posición 298 E en una posición correspondiente a la posición 305; G en una posición correspondiente a la posición 307; D en una posición correspondiente a la posición 308; G en una posición correspondiente a la posición 308 K en una posición correspondiente a la posición 308 N en una posición correspondiente a la posición 308 R en una posición correspondiente a la posición 308 E en una posición correspondiente a la posición 309; G en una posición correspondiente a la posición 309 H en una posición correspondiente a la posición 309 L en una posición correspondiente a la posición 309; M en una posición correspondiente a la posición 309; N en una posición correspondiente a la posición 309; Q en una posición correspondiente a la posición 309 R en una posición correspondiente a la posición 309 S en una posición correspondiente a la posición 309 T en una posición correspondiente a la posición 309 V en una posición correspondiente a la posición 309 A en una posición correspondiente a la posición 310 G en una posición correspondiente a la posición 310 Q en una posición correspondiente a la posición 310 S en una posición correspondiente a la posición 310 A en una posición correspondiente a la posición 313 G en una posición correspondiente a la posición 313 H en una posición correspondiente a la posición 313 K en una posición correspondiente a la posición 313 P en una posición correspondiente a la posición 313 R en una posición correspondiente a la posición 313 T en una posición correspondiente a la posición 313 Y en una posición correspondiente a la posición 313; con S en una posición correspondiente a la posición 314; Y en una posición correspondiente a la posición 314 A en una posición correspondiente a la posición 315 H en una posición correspondiente a la posición 315 Y en una posición correspondiente a la posición 315 A en una posición correspondiente a la posición 317 I en una posición correspondiente a la posición 317 K en una posición correspondiente a la posición 317; N en una posición correspondiente a la posición 317 Q en una posición correspondiente a la posición 317 R en una posición correspondiente a la posición 317 S en una posición correspondiente a la posición 317 T en una posición correspondiente a la posición 317; W en una posición correspondiente a la posición 317 D en una posición correspondiente a la posición 318 H en una posición correspondiente a la posición 318; K en una posición correspondiente a la posición 318 M en una posición correspondiente a la posición 318 R en una posición correspondiente a la posición 318 H en una posición correspondiente a la posición 320 K en una posición correspondiente a la posición 320 R en una posición correspondiente a la posición 320 R en una posición correspondiente a la posición 321 S en una posición correspondiente a la posición 321 N en una posición correspondiente a la posición 324 R en una posición correspondiente a la posición 324 A en una posición correspondiente a la posición 325 D en una posición correspondiente a la posición 325 E en una posición correspondiente a la posición 325; G en una posición correspondiente a la posición 325 H en una posición correspondiente a la posición 325 K en una posición correspondiente a la posición 325; M en una posición correspondiente a la posición 325 N en una posición correspondiente a la posición 325 Q en una posición correspondiente a la posición 325 S en una posición correspondiente a la posición 325 V en una posición correspondiente a la posición 325 L en una posición correspondiente a la posición 326 V en una posición correspondiente a la posición 326 C en una posición correspondiente a la posición 328 G en una posición correspondiente a la posición 328; I en una posición correspondiente a la posición 328 K en una posición correspondiente a la posición 328; L en una posición correspondiente a la posición 328 S en una posición correspondiente a la posición 328 Y en una posición correspondiente a la posición 328 S en una posición correspondiente a la posición 335 A en una posición correspondiente a la posición 347 G en una posición correspondiente a la posición 347 S en una posición correspondiente a la posición 347; M en una posición correspondiente a la posición 349 R en una posición correspondiente a la posición 349 S en una posición correspondiente a la posición 351 V en una posición correspondiente a la posición 353; con H en una posición correspondiente a la posición 356; S en una posición correspondiente a la posición 356 E en una posición correspondiente a la posición 359 H en una posición correspondiente a la posición 359 T en una posición correspondiente a la posición 359 A en una posición correspondiente a la posición 367 G en una posición correspondiente a la posición 367 K en una posición correspondiente a la posición 367 S en una posición correspondiente a la posición 367 A en una posición correspondiente a la posición 368 E en una posición correspondiente a la posición 368 K en una posición correspondiente a la posición 368; L en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 368; M en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 368; R en una posición correspondiente a la posición 368; T en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 368; H en una posición correspondiente a la posición 369; R en una posición correspondiente a la posición 369; F en una posición correspondiente a la posición 371; H en una posición correspondiente a la posición 371; K en una posición correspondiente a la posición 371; L en una posición correspondiente a la posición 371; R en una posición correspondiente a la posición 371; S en una posición correspondiente a la posición 371; M en una posición correspondiente a la posición 373; H en una posición correspondiente a la posición 374 P en una posición correspondiente a la posición 374; A en correspondiente a la posición 375 G en una posición correspondiente a la posición 375; K en correspondiente a la posición 375 R en una posición correspondiente a la posición 375; D en correspondiente a la posición 376 E en una posición correspondiente a la posición 376; Q en correspondiente a la posición 376 R en una posición correspondiente a la posición 376; T en correspondiente a la posición 376 V en una posición correspondiente a la posición 376; Y en correspondiente a la posición 376 D en una posición correspondiente a la posición 377; E en correspondiente a la posición 377 H en una posición correspondiente a la posición 377; K en correspondiente a la posición 377 P en una posición correspondiente a la posición 377; R en correspondiente a la posición 377 S en una posición correspondiente a la posición 377; T en correspondiente a la posición 377 W en una posición correspondiente a la posición 380; Y en correspondiente a la posición 380 S en una posición correspondiente a la posición 381 I en correspondiente a la posición 383 K en una posición correspondiente a la posición 383; L en correspondiente a la posición 383 S en una posición correspondiente a la posición 383; A en correspondiente a la posición 385 Q en una posición correspondiente a la posición 385; V en correspondiente a la posición 385 A en una posición correspondiente a la posición 389; G en correspondiente a la posición 389 L en una posición correspondiente a la posición 389; K en correspondiente a la posición 389 Q en una posición correspondiente a la posición 389; S en correspondiente a la posición 389 A en una posición correspondiente a la posición 392; F en correspondiente a la posición 392 M en una posición correspondiente a la posición 392; Q en correspondiente a la posición 392 R en una posición correspondiente a la posición 392; V en correspondiente a la posición 392 F en una posición correspondiente a la posición 393; M en correspondiente a la posición 393 A en una posición correspondiente a la posición 395; H en correspondiente a la posición 395 R en una posición correspondiente a la posición 395; A en correspondiente a la posición 396 H en una posición correspondiente a la posición 396; Q en correspondiente a la posición 396 S en una posición correspondiente a la posición 396; K en correspondiente a la posición 399 M en una posición correspondiente a la posición 399; T en correspondiente a la posición 399 V en una posición correspondiente a la posición 399; W en correspondiente a la posición 399 A en una posición correspondiente a la posición 401; E en correspondiente a la posición 401 A en una posición correspondiente a la posición 404; G en correspondiente a la posición 405 F en una posición correspondiente a la posición 406; N en correspondiente a la posición 406 A en una posición correspondiente a la posición 407; D en correspondiente a la posición 407 E en una posición correspondiente a la posición 407; F en correspondiente a la posición 407 H en una posición correspondiente a la posición 407; Q en correspondiente a la posición 407 P en una posición correspondiente a la posición 407; A en correspondiente a la posición 409 Q en una posición correspondiente a la posición 409; T en correspondiente a la posición 410 Q en una posición correspondiente a la posición 412; R en correspondiente a la posición 412 V en una posición correspondiente a la posición 412; L en correspondiente a la posición 416 E en una posición correspondiente a la posición 418; L en correspondiente a la posición 418 P en una posición correspondiente a la posición 418; R en correspondiente a la posición 418 V en una posición correspondiente a la posición 418; F en correspondiente a la posición 419 H en una posición correspondiente a la posición 419 I en correspondiente a la posición 419 K en una posición correspondiente a la posición 419; R en correspondiente a la posición 419 S en una posición correspondiente a la posición 419; Y en correspondiente a la posición 419 A en una posición correspondiente a la posición 421; H en correspondiente a la posición 421 K en una posición correspondiente a la posición 421; N en correspondiente a la posición 421 Q en una posición correspondiente a la posición 421; R en correspondiente a la posición 421 S en una posición correspondiente a la posición 421; G en correspondiente a la posición 425 K en una posición correspondiente a la posición 425; Q en correspondiente a la posición 427 T en una posición correspondiente a la posición 427; L en correspondiente a la posición 428 A en una posición correspondiente a la posición 431; G en correspondiente a la posición 431 E en una posición correspondiente a la posición 431; H en correspondiente a la posición 431 K en una posición correspondiente a la posición 431; L en correspondiente a la posición 431 N en una posición correspondiente a la posición 431; Q en correspondiente a la posición 431 R en una posición correspondiente a la posición 431; S en correspondiente a la posición 431 V en una posición correspondiente a la posición 431; A en correspondiente a la posición 433 H en una posición correspondiente a la posición 433 I en correspondiente a la posición 433 K en una posición correspondiente a la posición 433; L en correspondiente a la posición 433 R en una posición correspondiente a la posición 433; T en correspondiente a la posición 433 V en una posición correspondiente a la posición 433; W en correspondiente a la posición 433 K en una posición correspondiente a la posición 436 I en correspondiente a la posición 437 M en una posición correspondiente a la posición 437; A en correspondiente a la posición 438 D en una posición correspondiente a la posición 438; E en correspondiente a la posición 438 L en una posición correspondiente a la posición 438; N en correspondiente a la posición 438 T en una posición correspondiente a la posición 438; A en correspondiente a la posición 439 C en una posición correspondiente a la posición 439; K en correspondiente a la posición 439; P en una posición correspondiente a la posición 439; Q en una posición correspondiente a la posición 439; T en una posición correspondiente a la posición 439; V en una posición correspondiente a la posición 439; D en una posición correspondiente a la posición 440; H en una posición correspondiente a la posición 440; M en una posición correspondiente a la posición 440; P en una posición correspondiente a la posición 440; R en una posición correspondiente a la posición 440; S en una posición correspondiente a la posición 440; A en una posición correspondiente a la posición 441; F en una posición correspondiente a la posición 441; C en una posición correspondiente a la posición 442; G en una posición correspondiente a la posición 442; R en una posición correspondiente a la posición 442; A en una posición correspondiente a la posición 443; E en una posición correspondiente a la posición 443; F en una posición correspondiente a la posición 443; G en una posición correspondiente a la posición 443; M en una posición correspondiente a la posición 443; N en una posición correspondiente a la posición 443; E en una posición correspondiente a la posición 444; H en una posición correspondiente a la posición 444; V en una posición correspondiente a la posición 444; H en una posición correspondiente a la posición 445; M en una posición correspondiente a la posición 445; N en una posición correspondiente a la posición 445; P en una posición correspondiente a la posición 445; Q en una posición correspondiente a la posición 445; S en una posición correspondiente a la posición 445; T en una posición correspondiente a la posición 445; V en una posición correspondiente a la posición 445; W en una posición correspondiente a la posición 445; A en una posición correspondiente a la posición 446; M en una posición correspondiente a la posición 446; W en una posición correspondiente a la posición 446; D en una posición correspondiente a la posición 447; E en una posición correspondiente a la posición 447; G en una posición correspondiente a la posición 447 I en una posición correspondiente a la posición 447; N en una posición correspondiente a la posición 447; P en una posición correspondiente a la posición 447; Q en una posición correspondiente a la posición 447; T en una posición correspondiente a la posición 447, y/o reemplazo con V en una posición correspondiente a la posición 447, cada uno en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Entre estos polipéptidos de PH20 modificados están los que muestran al menos 120 % de la actividad de la PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácido particular. Dicha actividad incluye al menos 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800%, 900 %, 1000%, 2000 %, 3000 % o más de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácido, donde, como en todos los casos del presente documento, las actividades se comparan en las mismas condiciones.
En particular, se describen polipéptidos de PH20 modificados que contienen al menos un reemplazo de aminoácido en un polipéptido de PH20 expuesto en SEQ ID NO: 7, un fragmento truncado en el extremo C terminal del mismo, o en un polipéptido de PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o un fragmento truncado correspondiente, donde: los polipéptidos de PH20 modificados muestran menos del 20 % de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácido, donde las actividades se comparan en las mismas condiciones; el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos están en una posición de aminoácido correspondiente a una posición seleccionada de entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
,
0, , 9, , , , , 0,
Figure imgf000018_0001
7,
aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3 o 7;
las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por el alineamiento del polipéptido de PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3; y siempre que:
(i) si el polipéptido de PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 200, 333, 358 o 393 el reemplazo no es reemplazo con una alanina (A);
(ii) si el polipéptido de PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 111 o 249 el reemplazo no es reemplazo con una asparagina (N);
(iii) si el polipéptido de PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 113 el reemplazo no es reemplazo con una glutamina (Q);
(iv) si el polipéptido de PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 176 el reemplazo no es reemplazo con una glicina (G); y
(v) si el polipéptido de PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 252 el reemplazo no es reemplazo con una treonina (T).
Son ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados cualquiera que contenga un reemplazo o reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o en una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 91 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72. Por ejemplo, el polipéptido de PH20 modificado contiene un reemplazo o reemplazos de aminoácidos en SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, que son polipéptidos que son un fragmento truncado en el extremo C terminal de SEQ ID NO: 7, o un polipéptido de PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 91 % a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. En ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento, los polipéptidos de PH20 modificados pueden mostrar actividad similar o igual a la PH20 sin la modificación, o pueden mostrar actividad aumentada o actividad que es menor del 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1 %, 0,05% o menos de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácido. Son ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados cualquiera expuesto en la Tabla 5.
Entre todos y cada uno de los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento y anteriormente, el polipéptido de PH20 modificado es uno que no consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las Se Q ID NO: 3, 6-66, 69-72, 856-861, 869 u 870. En particular, entre cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento anteriormente o en otra parte del presente documento están cualquiera que contenga un reemplazo o reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 69 o 72 siempre que: (i) cuando el polipéptido de PH20 modificado incluya solamente un único reemplazo de aminoácido el reemplazo no corresponde a los reemplazos de aminoácidos V12A, N47A, D111N, E113Q, N131A, R176G, N200A, N219A, E249Q, R252T, N333A o N358A, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3; (ii) donde el polipéptido de PH20 modificado incluye solamente dos reemplazos de aminoácidos los reemplazos no corresponden a los reemplazos de aminoácidos P13A/L464W, N47A/N131A, N47A/N219A, N131A/N219A o N333A/N358A en referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO: 3; y (iii) donde el polipéptido de PH20 modificado incluye solamente tres reemplazos de aminoácidos los reemplazos no corresponden a los reemplazos de aminoácidos N47A/N131A/N219A, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados anteriores y cualquiera descrito en el presente documento y descrito anteriormente y posteriormente puede contener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, o más de los reemplazos de aminoácidos. Los polipéptidos de PH20 modificados pueden incluir una secuencia señal, incluyendo la secuencia nativa o una secuencia heteróloga o una secuencia modificada, y también incluyen un polipéptido de PH20 maduro que carece de la secuencia señal.
Entre cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento anteriormente o descritos posteriormente están los polipéptidos de PH20 modificados que contienen o tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 73-855 o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 73-855 y que contiene al menos un reemplazo de aminoácido, tal como cualquiera descrito anteriormente o en otra parte del presente documento, en referencia a posiciones comparadas con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. En cualquiera de los ejemplos de los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento, el polipéptido de PH20 modificado no tiene o contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 8-31, 69-72, 856-861, 869 u 870.
Los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden estar sustancialmente purificados o aislados, pueden mostrar actividad catalítica a pH neutro, pueden secretarse tras expresión de células y son solubles en el sobrenadante y/o pueden incluir aminoácidos modificados, tales como una modificación seleccionada de entre glucosilación, sialación, albuminación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación, conjugación con un polímero, tal como PEGilación o conjugación con dextrano, conjugación con otro resto, tal como un dominio de multimerización, toxina, marcador o fármaco detectable y fosforilación. El polipéptido de PH20 modificado puede estar glucosilado, tal como conteniendo al menos un resto de N-acetilglucosamina unido a cada uno de al menos tres restos de asparagina (N), donde, por ejemplo, los tres restos de asparagina corresponden a los restos de aminoácidos 200, 333 y 358 de SEQ ID NO: 3. Los dominios de multimerización incluyen dominios Fc.
También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados de acuerdo con las reivindicaciones. Se proporcionan vectores, eucariotas y procariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico. Los vectores incluyen vectores de expresión e incluyen vectores de mamífero, incluyendo vectores virales. Los vectores virales incluyen vectores de adenovirus, vectores de retrovirus, vectores de virus vaccinia, virus de herpes simple y vectores de citomegalovirus, y otros vectores virales similares. Son de interés vectores oncolíticos que se acumulan en o se dirigen a tumores. También se proporcionan células que contienen las moléculas de ácido nucleico y células que contienen los vectores. Las células pueden ser procariotas o eucariotas, particularmente células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO).
También se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que se produce por cualquiera de las células proporcionadas. Por lo tanto, se describen en el presente documento métodos para producir un polipéptido de PH20 modificado cultivando cualquiera de las células proporcionadas en el presente documento en condiciones por las que se produce un polipéptido de PH20 modificado codificado y se secreta por la célula, y recuperando el polipéptido expresado. Se proporciona en el presente documento un método para producir un polipéptido de PH20 modificado introduciendo cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento o cualquiera de los vectores proporcionados en el presente documento en una célula capaz de incorporar restos de azúcar ligados a N en el polipéptido, cultivando la célula en condiciones en las que se produce un polipéptido de PH20 modificado codificado y se secreta por la célula, y recuperando el polipéptido expresado. En dichos ejemplos, el ácido nucleico está unido operativamente con un promotor. La célula cultivada puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO).
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados de acuerdo con las reivindicaciones o cualquiera de los ácidos nucleicos o vectores proporcionados en el presente documento. Las composiciones pueden formularse con otros agentes y/o con otros componentes, tales como conservantes. Las composiciones pueden formularse de modo que los componentes, particularmente el PH20 y cualquier otro agente activo, permanezcan activos o sean estables en condiciones preseleccionadas. Además, como se describe en el presente documento, los polipéptidos de PH20 se modifican de modo que muestren estabilidad aumentada en diversas condiciones. Por ejemplo, se describen composiciones en las que el polipéptido de PH20 modificado es estable (es decir, conserva actividad como se describe en el presente documento) a una temperatura de o de aproximadamente 2 °C a 8 °C, inclusive, durante al menos 1 mes o es estable a una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, inclusive, durante al menos 3 días. Se describen composiciones en las que el polipéptido de PH20 modificado en la composición es estable a una temperatura de o de aproximadamente 2 °C a 8 °C, inclusive, durante al menos 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, 26 meses, 27 meses, 28 meses, 29 meses o 30 meses. También se describen composiciones en las que el polipéptido de PH20 modificado en la composición es estable a una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, inclusive, durante al menos 3 días, al menos 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días o más. Las composiciones farmacéuticas pueden contener un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las condiciones, formulaciones, componentes y polipéptido de PH20 modificado se seleccionan para conseguir una estabilidad deseada. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para administración directa o pueden requerir dilución. Pueden formularse para administración de dosificación múltiple o individual. Las composiciones ejemplares incluyen concentraciones de PH20 modificado entre o entre aproximadamente 0,1 pg/ml y 100 pg/ml, 1 pg/ml y 50 pg/ml o 1 pg/ml y 20 pg/ml, o 10 U/ml y 5000 U/ml, 50 U/ml y 4000 U/ml, 100 U/ml y 2000 U/ml, 300 U/ml y 2000 U/ml, 600 U/ml y 2000 U/ml, o 100 U/ml y 1000 U/ml. Las sales ejemplares incluyen NaCl a una concentración, por ejemplo, de menos de o aproximadamente o 200 mM, 180 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o menos, o entre o aproximadamente entre 0,1 mM y 200 mM, 0,1 mM y 100 mM, 120 mM y 200 mM, 10 mM y 50 mM, 10 mM y 90 mM, 80 mM y 200 mM, 80 mM y 140 mM, 50 mM y 100 mM, 80 mM y 100 mM, 50 mM y 80 mM, 100 mM y 140 mM o 120 mM y 140 mM.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante o una mezcla de conservantes, tal como uno, dos, tres, cuatro o más de un conservante o conservantes fenólicos, un conservante o conservantes no fenólicos o un conservante o conservantes fenólicos y un conservante o conservantes no fenólicos, tales como, pero sin limitación, fenol, m-cresol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-1-butanol, diclorhidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol, acetato fenilmercúrico, glicerol, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato sódico, o­ cresol, p-cresol, clorocresol, cetrimida, cloruro de bencetonio, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno y cualquier combinación de los mismos. Los fenoles incluyen, por ejemplo, fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico y parabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno. Las concentraciones antimicrobianas eficaces de uno o más agentes conservantes (como un porcentaje (%) de concentración en masa (p/v)) pueden estar entre 0,05 % y 0,6 %, 0,1 % y 0,4 %, 0,1 % y 0,3 %, 0,15 % y 0,325 %, 0,15 % y 0,25 %, 0,1 % y 0,2 %, 0,2 % y 0,3 % o 0,3 % y 0,4 % inclusive. Son ejemplos de los mismos composiciones farmacéuticas donde los conservantes son fenol, m-cresol o fenol y m-cresol y la cantidad como un % de concentración en masa (p/v) en la formulación está entre o aproximadamente entre 0,1 % y 0,25 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,05 % y 0,2 % de mcresol, está entre o aproximadamente entre 0,10% y 0,2% de fenol y entre o aproximadamente entre 0,6% y 01,8 % de m-cresol, entre o aproximadamente entre 0,1 % y 0,15 % de fenol y 0,8 % y 0,15 % de m-cresol, está entre o aproximadamente entre 0,10 % y 0,15 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,06 y 0,09 % de mcresol o está entre o aproximadamente entre 0,12 % y 0,18 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,14 y 0,22 % de m-cresol.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener un agente terapéuticamente activo adicional. El agente activo puede formularse en la composición o proporcionarse como una combinación con la composición que contiene PH20, pero en una composición separada para administración por separado, secuencialmente, intermitentemente, simultáneamente o juntas. Los agentes terapéuticamente activos incluyen, por ejemplo, un agente seleccionado de entre un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida, un agente antiparkinsoniano, un agente antimalárico, un agente anticonvulsionante, un agente antidepresivo, un agente antiartrítico, un agente antifúngico, un agente antihipertensivo, un agente antipirético, un agente antiparasitario, un agente antihistamínico, un agente agonista alfa adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador beta adrenérgico, un agente bloqueador de canales de calcio, un agente farmacológico cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestionante, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolito, un agente hipnótico, un agente hormonal, un agente hiperglucémico, un agente relajante muscular, un agente contractor muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente vitamínico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente inhibidor de la enzima conversora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica y un inductor de sueño. Son ejemplos de dichos agentes anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, una preparación de inmunoglobulina, un bisfosfonato, una citocina, un agente quimioterapéutico, un factor de coagulación y una insulina. Las insulinas incluyen, por ejemplo, insulinas basales e insulinas de acción rápida, tales como insulina regular, particularmente insulina humana recombinante, y análogos de insulina, tales como insulina lispro, insulina aspart o insulina glulisina. Son insulinas de acción rápida particulares las que tienen una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 863 o una insulina con una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta como las posiciones de restos de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO: 864 y una cadena B con una secuencia de aminoácidos expuesta como las posiciones de restos de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 864 o un análogo de insulina que se selecciona de entre una insulina que tiene una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene un secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las s Eq NOS: 865-867. La cantidad de insulina de acción rápida en las composiciones puede determinarse de forma empírica, pero típicamente puede ser de 10 U/ml a 1000 U/ml, 50 U/ml a 500 U/ml, 100 U/ml a 1000 U/ml o 500 U/ml a 1000 U/ml, inclusive.
En ejemplos particulares, se describe en el presente documento una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad aumentada frente a un conservante fenólico y una insulina, tal como una insulina de acción rápida. Los polipéptidos de PH20 modificados e insulina pueden proporcionarse en cantidades terapéuticamente eficaces. Por ejemplo, se describen en el presente documento una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestra estabilidad aumentada frente a un conservante fenólico en una cantidad que es de aproximadamente 100 U/ml a 1000 U/ml y una insulina de acción rápida en una cantidad que es de o de aproximadamente 10 U/ml a 1000 U/ml. Por ejemplo, la insulina de acción rápida puede ser un análogo de insulina, tal como insulina lispro, insulina aspart o insulina glulisina u otro análogo. Cualquiera de dichas composiciones farmacéuticas puede formularse a un pH que es de o de aproximadamente 7,0 a 7,6. Cualquiera de dichas composiciones farmacéuticas también puede formularse para contener sal, tal como NaCI, a una concentración que es de o de aproximadamente 0,1 mM a 200 mM y/o una cantidad antimicrobiana eficaz de al menos un conservante donde la composición contiene en general al menos un conservante fenólico. La cantidad antimicrobiana eficaz es una cantidad total de uno o más agentes conservantes como un porcentaje (%) de concentración en masa (p/v) que es o es entre 0,05 % y 0,6 %. El conservante o los conservantes fenólicos pueden ser un fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico o un parabeno. En cualquiera de los ejemplos anteriores de una composición farmacéutica, la composición también puede contener un tensioactivo, tal como un polipropilenglicol, polietilenglicol, glicerina, sorbitol, poloxámero o polisorbato, en una cantidad como un % de concentración en masa (p/v) en la formulación que es al menos o al menos aproximadamente 0,001 %; un agente tamponante que es un agente de unión no metálico o es un agente de unión metálico, tal como Tris, histidina, fosfato o citrato, donde la concentración del agente tamponante es entre o entre aproximadamente 1 mM y 100 mM; glicerina en una concentración menor de 60 mM; un antioxidante, tal como cisteína, triptófano o metionina, a una concentración entre o de aproximadamente entre 2 mM y 50 mM, inclusive; y/o cinc a una concentración de entre o aproximadamente entre 0,001 y 0,1 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U). También se describen en el presente documento sistemas de bucle cerrado, bombas de insulina incluyendo bombas de insulina de infusión subcutánea continua (CSII) y bolígrafos de insulina que contienen cualquiera de las composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse en métodos o usos para tratar diabetes, tales como diabetes mellitus de tipo 1, diabetes mellitus de tipo 2 o diabetes gestacional.
Otros agentes terapéuticos en cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación adalimumabs, agalsidasas beta, alefacepts, ampicilinas, anakinras, vacunas antipoliomielíticas, antitimocitos, azitromicinas, becaplerminas, caspofunginas, cefazolinas, cefepimas, cefotetans, ceftazidimas, ceftriaxonas, cetuximabs, cilastatinas, ácidos clavulánicos, clindamicinas, darbepoetinas alfa, daclizumabs, difteria, antitoxinas diftéricas, toxoides diftéricos, efalizumabs, epinefrinas, eritropoyetinas alfa, etanercepts, filgrastims, fluconazoles, hormonas foliculoestimulantes, folitropinas alfa, folitropinas beta, fosfenitoínas, gadodiamidas, gadopentetatos, gatifloxacinas, glatirámeros, GM-CSF, goserelinas, acetatos de goserelina, granisetrones, Haemophilus influenzae B, haloperidoles, vacunas de la hepatitis, vacunas de la hepatitis A, vacunas de la hepatitis B, tiuxetanos de ibritumomab, ibritumomabs, tiuxetanos, inmunoglobulinas, vacunas de Haemophilus influenzae, vacunas de virus de la gripe, infliximabs, insulina lispro, protamina lispro neutra 75 % (NPL)/insulina lispro 25 %, protamina neutra Hagedorn (NPH) 50 %/insulina regular 50 %, NPH 70 %/insulina regular 30 %; insulina regular, insulina NPH, insulina ultra, insulina ultralenta e insulinas glargina, interferones, interferón alfa, interferones beta, interferones gamma, interferón alfa-2a, interferón alfa 2-b, interferón alfacon, interferón alfa-n, interferones beta, interferones beta-1a, interferones gamma, interferón alfa-con, iodixanoles, iohexoles, iopamidoles, ioversoles, quetorolacos, laronidasas, levofloxacinas, lidocaínas, linezolidas, lorazepams, vacunas de sarampión, virus de sarampión, virus de paperas, vacunas de virus de sarampión-paperas-rubeola, vacunas de rubeola, medroxiprogesteronas, meropenemos, metilprednisolonas, midazolams, morfinas, octreotidas, omalizumabs, ondansetrones, palivizumabs, pantoprazoles, pegaspargasas, pegfilgrastims, peg-interferón alfa-2a, peg-interferón alfa-2b, pegvisomants, vacunas de pertussis, piperacilinas, vacunas pneumocócicas y vacunas conjugadas pneumocócicas, prometazinas, reteplasas, somatropinas, sulbactams, sumatriptanos, tazobactamas, tenecteplasas, toxoides purificados del tétanos, ticarcilinas, tositumomabs, triamcinolonas, acetonidas de triamcinolona, hexacitonidas de triamcinolona, vancomicinas, inmunoglobulinas de varicela zóster, vacunas de varicela, otras vacunas, alemtuzumabs, alitretinoínas, alopurinoles, altretaminas, amifostinas, anastrozoles, arsénicos, trióxidos de arsénico, asparaginasas, vacunas de bacilo Calmette-Guerin (BCG), BCG vivo, bexarotenos, bleomicinas, busulfanes, busulfán intravenoso, busulfanes orales, calusteronas, capecitabinas, carboplatinos, carmustinas, carmustinas con polifeprosanes, celecoxibs, clorambucilos, cisplatinos, cladribinas, ciclofosfamidas, citarabinas, citarabinas liposomales, dacarbazinas, dactinomicinas, daunorubicinas liposomales, daunorubicinas, daunomicinas, diftitoxes de denileucina, dexrazoxanos, docetaxeles, doxorrubicinas, doxorrubicinas liposomales, propionatos de dromostanolona, soluciones B de Elliott, Epirubicinas, epoetinas alfa, estramustinas, etopósidos, fosfatos de etopósido, etopósidos VP-16, exemestanos, floxuridinas, fludarabinas, fluorouracilos, 5-fluorouracilos, fulvestrants, gemcitabinas, gemtuzumabs, ozogamicinas, ozogamicinas de gemtuzumab, hidroxiureas, idarubicinas, ifosfamidas, mesilatos de imatinib, irinotecanes, letrozoles, leucovorinas, levamisoles, lomustinas, CCNU, mecloretaminas, mostazas de nitrógeno, megestroles, acetatos de megestrol, melfalanes, L-PAM, mercaptopurinas, 6-mercaptopurinas, mesnas, metotrexatos, metoxsalenos, mitomicinas, mitomicinas C, mitotanos, mitoxantronas, nandrolonas, fenpropionatos de nandrolona, nofetumomabs, oprelvekinas, oxaliplatinos, paclitaxeles, pamidronatos, pegademasas, pentostatinas, pipobromanes, plicamicinas, mitramicinas, porfímeros, porfímeros sódicos, procarbazinas, quinacrinas, rasburicasas, rituximabs, sargramostimas, estreptozocinas, talcos, tamoxifenos, temozolomidas, tenipósidos, testolactonas, tioguaninas, 6-tioguaninas, trietilentiofosforamidas (tiotepas), topotecanos, toremifenos, trastuzumabs, tretinoínas, mostazas de uracilo, valrubicinas, vinblastinas, vincristinas, vinorelbinas, zoledronatos, acivicinas, aclarubicinas, acodazoles, acroninas, adozelesinas, aldesleucinas, ácidos retinoicos, alitretinoínas, ácidos 9-cis-retinoicos, alvocidibs, ambazonas, ambomicinas, Ametantronas, Aminoglutetimidas, Amsacrinas, Anaxironas, Ancitabinas, Antramicinas, Apaziquonas, Argimesnas, Asperlinas, Atrimustinas, Azacitidinas, Azetepas, Azotomicinas, Banoxantronas, Batabulinas, Batimastatos, Benaxibinas, Bendamustinas, Benzodepas, Bicalutamidas, Bietaserpinas, Biricodares, Bisantrenos, Dimesilatos de Bisnafida, Bizelesinas, Bortezomibs, Brequinares, Bropiriminas, Budotitanos, Cactinomicinas, Canertinibs, Caracemidas, Carbetímeros, Carboquonas, Carmofures, Carubicinas, Carzelesinas, Cedefingoles, Cemadotinas, Clorambucilos, Cioteroneles, Cirolemicinas, Clanfenures, Clofarabinas, Crisnatoles, Decitabinas, Dexniguldipinas, Dexormaplatinos, Dezaguaninas, Diaziquonas, Dibrospidios, Dienogests, Dinalinas, Disermolidas, Dofequidares, Doxifluridinas, Droloxifenos, Duazomicinas, Ecomustinas, Edatrexatos, Edotecarinas, Eflornitinas, Elacridares, Elinafidas, Elsamitrucinas, Emitefures, Enloplatinos, Enpromatos, Enzastaurinas, Epipropidinas, Eptaloprosts, Erbulozoles, Esorubicinas, Etanidazoles, Etoglúcidos, Etoprinas, Exisulindes, Fadrozoles, Fazarabinas, Fenretinidas, Fluoximesteronas, Flurocitabinas, Fosquidonas, Fostriecinas, Fotretaminas, Galarrubicinas, Galocitabinas, Geroquinoles, Gimatecanos, Gimeracilos, Gloxazonas, Glufosfamidas, Ilmofosinas, Ilomastats, Imexones, Improsulfanes, Indisulams, Inproquonas, Interleucinas, Interleucinas-2, Interleucinas recombinantes, Intoplicinas, Iobenguanos, Iproplatinos, Irsogladinas, Ixabepilonas, Quetotrexatos, L-Alanosinas, Lanreotidas, Lapatinibs, Ledoxantronas, Leuprolides, Leuprorelinas, Lexacalcitoles, Liarozoles, Lobaplatinos, Lometrexoles, Lonafarnibs, Losoxantronas, Lurtotecanes, Mafosfamidas, Mannosulfanes, Marimastats, Masoprocoles, Maitansinas, Mecloretaminas, Melengestroles, Melfalanes, Menogarilos, Mepitiostanos, Metesindes, Metomidatos, Metoprinas, Meturedepas, Miboplatinos, Miproxifenos, Misonidazoles, Mitindomidas, Mitocarcinas, Mitocrominas, Mitoflaxonas, Mitogillinas, Mitoguazonas, Mitomalcinas, Mitonafidas, Mitoquidonas, Mitosperes, Mitozolomidas, Mivobulinas, Mizoribinas, Mofarotenos, Mopidamoles, Mubritinibs, Ácidos Micofenólicos, Nedaplatinos, Neizarabinas, Nemorrubicinas, Nitracrinas, Nocodazoles, Nogalamicinas, Nolatrexedes, Nortopixantronas, Ormaplatinos, Ortataxeles, Oteracilos, Oxisuranos, Oxofenarsinas, Patupilonas, Peldesinas, Peliomicinas, Pelitrexoles, Pemetrexedes, Pentamustinas, Peplomicinas, Perfosfamidas, Perifosinas, Picoplatinos, Pinafides, Piposulfanos, Pirfenidonas, Piroxantronas, Pixantronas, Plevitrexedes, Plomestanos, Porfiromicinas, Prednimustinas, Propamidinas, Prospidios, Pumitepas, Puromicinas, Pirazofurinas, Ranimustinas, Riboprinas, Ritrosulfanos, Rogletimidas, Roquinimexes, Rufocromomicinas, Sabarrubicinas, Safingoles, Satraplatinos, Sebriplatinos, Semustinas, Simtrazenos, Sizofiranos, Sobuzoxanos, Sorafenibs, Esparfosatos, Ácidos Esparfósicos, Esparsomicinas, Espirogermanios, Espiromustinas, Espiroplatinos, Esqualaminas, Estreptonigrinas, Estreptovaricinas, Sufosfamidas, Sulofenures, Tacedinalines, Talisomicinas, Talimustinas, Tariquidares, Tauromustinas, Tecogalanes, Tegafures, Teloxantronas, Temoporfinas, Teroxironas, Tiamiprinas, Tiamiprinas, Tiazofurinas, Tilomisoles, Tilorones, Timcodares, Timonacics, Tirapazaminas, Topixantronas, Trabectedinas, Ecteinascidina 743, Trestolonas, Triciribinas, Trilostanos, Trimetrexatos, Tetranitratos de Triplatino, Triptorelinas, Trofosfamidas, Tubulozoles, Ubenimexes, Uredepas, Valspodares, Vapreotidas, Verteporfinas, Vinblastinas, Vindesinas, Vinepidinas, Vinfluninas, Vinformidas, Vinglicinatos, Vinleucinoles, Vinleurosinas, Vinrosidinas, Vintriptoles, Vinzolidinas, Vorozoles, Xantomicinas A, Guameciclinas, Zeniplatinos, Zilascorbs [2-H], Zinostatinas, Zorubicinas, Zosuquidares, Acetazolamidas, Aciclovires, Adipiodonas, Alatrofloxacinas, Alfentanilos, extractos alergénicos, inhibidores de Alfa 1-proteinasa, Alprostadilos, Amicacinas, Aminoácidos, ácidos Aminocaproicos, Aminofilinas, Amitriptilinas, Amobarbitales, Amrinonas, Analgésicos, vacunas Antipoliomielíticas, sueros antirrábicos, inmunoglobulinas Antitetánicas, vacunas del tétanos, Antitrombinas III, sueros Antiveneno, Argatrobanes, Argininas, ácidos Ascórbicos, Atenololes, Atracurios, Atropinas, Aurotioglucosas, Azatioprinas, Aztreonams, Bacitracinas, Baclofenos, Basiliximabs, ácidos Benzoicos, Benztropinas, Betametasonas, Biotinas, Bivalirudinas, antitoxinas de Botulismo, Bretilios, Bumetanidas, Bupivacaínas, Buprenorfinas, Butorfanoles, Calcitoninas, Calcitrioles, Calcios, Capreomicinas, Carboprosts, Carnitinas, Cefamandoles, Cefoperazonas, Cefotaximas, Cefoxitinas, Ceftizoximas, Cefuroximas, Cloranfenicoles, Cloroprocaínas, Cloroquinas, Clorotiazidas, Clorpromazinas, ácidos Condroitinsulfúricos, Coriogonadotropinas alfa, Cromos, Cidofovires, Cimetidinas, Ciprofloxacinas, Cisatracurios, Clonidinas, Codeínas, Colchicinas, Colistinas, Colágenos, triflutatos ovinos de Corticorelina, Corticotrofinas, Cosintropinas, Cianocobalaminas, Ciclosporinas, Cisteínas, Dacliximabs, Dalfopristinas, Dalteparinas, Danaparoides, Dantrolenos, Deferoxaminas, Desmopresinas, Dexametasonas, Dexmedetomidinas, Dexpantenoles, Dextranos, dextranos de hierro, ácidos Diatrizoicos, Diazepams, Diazoxidas, Diciclominas, Digibinds, Digoxinas, Dihidroergotaminas, Diltiazems, Difenhidraminas, Dipiridamoles, Dobutaminas, Dopaminas, Doxacurios, Doxaprams, Doxercalciferoles, Doxiciclinas, Droperidoles, Difilinas, ácidos Edéticos, Edrofonios, Enalaprilats, Efedrinas, Epoprostenoles, Ergocalciferoles, Ergonovinas, Ertapenems, Eritromicinas, Esmololes, Estradioles, Estrogénicos, ácidos Etacrínicos, Etanolaminas, Etanoles, aceites Etiodizados, ácidos Etidrónicos, Etomidatos, Famotidinas, Fenoldopams, Fentanilos, Flumazenilos, Fluoresceínas, Flufenazinas, ácidos Fólicos, Fomepizoles, Fomiviresens, Fondaparinuxes, Foscarnets, Fosfenitoínas, Furosemidas, Gadoteridoles, Gadoversetamidas, Ganciclovires, Gentamicinas, Glucagones, Glucosas, Glicinas, Glicopirrolatos, Gonadorelinas, Gonadotropinas coriónicas, polisacáridos de Haemophilus B, Heminas, Herbales, Histaminas, Hidralazinas, Hidrocortisonas, Hidromorfonas, Hidroxocobalaminas, Hidroxizinas, Hiosciaminas, Ibutilidas, Imiglucerasas, carminas de Índigo, Indometacinas, yoduros, Iopromidas, ácidos Iotalámicos, ácidos Ioxáglicos, Ioxilanos, Isoniazidas, Isoproterenoles, vacunas de la encefalitis Japonesa, Kanamicinas, Ketaminas, Labetaloles, Lepirudinas, Levobupivacaínas, Levotiroxinas, Lincomicinas, Liotironinas, hormonas Luteinizantes, vacunas de enfermedad de Lyme, Mangafodipires, Mantoles, vacunas de polisacáridos Meningocócicos, Meperidinas, Mepivacaínas, Mesoridazinas, Metaraminoles, Metadonas, Metocarbamoles, Metohexitales, Metildopatos, Metilergonovinas, Metoclopramidas, Metoprololes, Metronidazoles, Minociclinas, Mivacurios, ácidos Morruicos, Moxifloxacinas, Muromonabs-CD3, mofetilos Micofenolatos, Nafcillinas, Nalbufinas, Nalmefenos, Naloxonas, Neostigminas, Niacinamidas, Nicardipinas, Nitroglicerinas, Nitroprúsidos, Norepinefrinas, Orfenadrinas, Oxacilinas, Oximorfonas, Oxitetraciclinas, Oxitocinas, Pancuronios, Pantenoles, ácidos Pantoténicos, Papaverinas, Peginterferones alfa 2A, Penicilinas G, Pentamidinas, Pentazocinas, Pentobarbitales, Perflutrenos, Perfenazinas, Fenobarbitales, Fentolaminas, Fenilefrinas, Fenitoínas, Fisostigminas, Fitonadionas, Polimixina, Pralidoximas, Prilocaínas, Procainamidas, Procaínas, Proclorperazinas, Progesteronas, Propranololes, hidróxidos de Piridostignina, Piridoxinas, Quinidinas, Quinupristinas, inmunoglobulinas de Rabia, vacunas de Rabia, Ranitidinas, Remifentanilos, Riboflavinas, Rifampinas, Ropivacaínas, Samarios, Escopolaminas, Selenios, Sermorelinas, Sincalidas, Somatrems, Espectinomicinas, Estreptoquinasas, Estreptomicinas, Succinilcolinas, Sufentanilos, Sulfametoxazoles, Tacrolimus, Terbutalinas, Teriparatides, Testosteronas, antitoxinas del Tétanos, Tetracaínas, Tetradecil sulfatos, Teofillinas, Tiaminas, Tietilperazinas, Tiopentales, hormonas estimulantes de Tiroides, Tinzaparinas, Tirofibanes, Tobramicinas, Tolazolinas, Tolbutamidas, Torsemidas, ácidos Tranexámicos, Treprostiniles, Trifluoperazinas, Trimetobenzamidas, Trimetoprims, Trometaminas, Tuberculinas, vacunas Tifoideas, Urofolitropinas, Uroquinasas, ácidos Valproicos, Vasopresinas, Vecuronios, Verapamilos, Voriconazoles, Warfarinas, vacunas de la fiebre Amarilla, Zidovudinas, Zincs, clorhidratos de Ziprasidona, Aclacinomicinas, Actinomicinas, Adriamicinas, Azaserinas, 6-Azauridinas, Carzinofilinas, Cromomicinas, Denopterinas, 6 Diazo 5 Oxo-L-Norleucinas, Enocitabinas, Floxuridinas, Olivomicinas, Pirarrubicinas, Piritrexims, Pteropterinas, Tegafures, Tubercidinas, Alteplasas, Arcitumomabs, bevacizumabs, Toxinas Botulínicas de Tipo A, Toxinas Botulínicas de Tipo B, Pendetidas de Capromab, Daclizumabs, Dornasas alfa, Drotrecoginas alfa, Pentetatos de Imciromab, Yodo-131, un agente antibiótico; un inhibidor de angiogénesis; sustancias anti-cataratas y anti-retinopatía diabética; inhibidores de anhidrasa carbónica; midriáticos; agentes de terapia fotodinámica; análogos de prostaglandina; factor de crecimiento; antineoplásicos; antimetabolitos, antivirales; amebicidas y anti-protozoarios; anti-tuberculosis y antilepróticos; antitoxinas y antiveninas; factor antihemófilo, complejo coagulante anti-inhibidor, antitrombina III, Factor de coagulación V, Factor de coagulación IX, fracción de proteína del plasma, factor de von Willebrand; agente antiplaquetario, un factor estimulante de colonias (CSF); un estimulante de la eritropoyesis; hemostáticos y albúminas; Inmunoglobulinas, inhibidores de trombina; anticoagulantes; un fármaco antiinflamatorio esteroideo seleccionado de entre alclometasonas, algestonas, beclometasonas, betametasonas, budesonidas, clobetasoles, clobetasonas, clocortolonas, cloprednoles, corticosteronas, cortisonas, cortivazoles, deflazacorts, desonidas, desoximetasonas, dexametasonas, diflorasonas, diflucortolonas, difluprednatos, enoxolonas, fluazacorts, flucloronidas, flumetasonas, flunisolidas, fluocinolonas, fluocinonidas, fluocortinas, fluocortolonas, fluorometolonas, fluperolonas, fluprednidenos, fluprednisolonas, flurandrenolidas, fluticasonas, formocortales, halcinonidas, halobetasoles, halometasonas, halopredonas, hidrocortamatos, hidrocortisonas, etabonato de loteprednol, mazipredonas, medrisonas, meprednisonas, metilprednisolonas, furoato de mometasona, parametasonas, prednicarbatos, prednisolonas, prednisonas, prednivales, prednilidenos, rimexolonas, tixocortoles y triamcinolonas; Docosanoles, prostaglandinas, análogos de prostaglandina, antiprostaglandinas y precursores de prostaglandina; mióticos, colinérgicos y anticolinesterasa; y anti-alergénicos.
Las composiciones y polipéptidos de PH20 modificados pueden usarse para tratar cualquier afección normalmente tratada por el polipéptido de PH20 o el agente terapéuticamente activo. Estas incluyen, por ejemplo, afecciones en las que el hialuronano desempeña un papel o está asociado con la etiología de la enfermedad debido, por ejemplo, a la acumulación o sobreproducción de hialuronano. Se describen por lo tanto en el presente documento, usos de las composiciones y polipéptidos de PH20 modificados para tratar una enfermedad o afección asociada con hialuronano administrando cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados o composiciones descritas en el presente documento. Las enfermedades o afecciones asociadas con hialuronano incluyen, por ejemplo, enfermedad inflamatoria y tumores o cánceres, incluyendo un cáncer de estadio tardío, cánceres metastáticos y cánceres indiferenciados, tales como cáncer ovárico, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (SCC), cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama y cáncer de colon. El polipéptido de PH20 puede modificarse para mostrar semivida aumentada para dichos tratamientos. Por ejemplo, el polipéptido de PH20 puede modificarse con un polímero tal como un resto de PEG para dichos tratamientos.
También se describen métodos para aumentar el suministro de un agente terapéutico a un sujeto: administrando a un sujeto cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificaciones o composiciones descritas en el presente documento y administrando el agente terapéutico. El agente terapéutico puede administrarse en la misma composición o por separado, y puede administrarse antes o después, simultáneamente o intermitentemente, con la administración del polipéptido o los polipéptidos de PH20. La administración incluye cualquier vía, incluyendo administración intravenosa y subcutánea tal como simultáneamente con, intermitentemente con, o después de la administración del agente terapéutico. Los agentes terapéuticos incluyen cualquiera de los expuestos anteriormente, en otra parte del presente documento y/o conocidos por los expertos en la materia.
También se describen métodos para tratar un exceso de glucosaminoglucanos; para tratar un tumor; para tratar la acumulación de glucosaminoglucano en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular; para tratar un trastorno oftálmico; para tratar enfermedad pulmonar; para aumentar la penetración de agentes quimioterapéuticos en tumores sólidos; para tratar la celulitis; para tratar un trastorno proliferativo; o para aumentar la biodisponibilidad de fármacos y otros agentes terapéuticos administrando los polipéptidos de PH20 modificados o composiciones descritas en el presente documento.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas para tratar un tumor; para tratar la acumulación de glucosaminoglucanos en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular; para tratar un trastorno oftálmico; para tratar enfermedad pulmonar; para aumentar la penetración de agentes terapéuticos en tumores sólidos; o para aumentar la biodisponibilidad de fármacos y otros agentes terapéuticos; para su uso en el tratamiento de un tumor.
Se describe en el presente documento un método para identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra estabilidad en una condición de desnaturalización que incluye las etapas de: a) ensayar la actividad de una enzima degradante de hialuronano modificada en una composición que contiene un agente desnaturalizante y/o en una condición desnaturalizante; b) ensayar la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada en la misma composición y/o en las mismas condiciones que a) excepto sin el agente o condición desnaturalizante; y c) seleccionar o identificar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra actividad en a) que es al menos 5 % de la actividad en b). En dicho ejemplo, la actividad es actividad hialuronidasa. En algunos ejemplos de los métodos, se selecciona o se identifica una enzima degradante de hialuronano modificada si la actividad en a) es al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de la actividad en b), por ejemplo, se selecciona o identifica una enzima degradante de hialuronano modificada si la actividad en a) es al menos 40 % o más de la actividad en b). El método también puede incluir las etapas de: d) comparar la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada en a) con la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada ensayada en las mismas condiciones; y e) identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra al menos 120%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 1500%, 2000 %, 3000 %, 4000 %, 5000 % o más de la actividad hialuronidasa en comparación con la enzima degradante de hialuronano no modificada.
También se describe en el presente documento un método para identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra estabilidad, tal como estabilidad aumentada, en una condición de desnaturalización, que incluye las etapas de: a) ensayar la actividad de una enzima degradante de hialuronano modificada en una composición que contiene un agente desnaturalizante y/o en una condición desnaturalizante; b) ensayar la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente en una composición que contiene el mismo agente desnaturalizante y/o en la misma condición desnaturalizante que a), por lo que la actividad se ensaya en las mismas condiciones que a); y c) seleccionar o identificar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra mayor actividad que la enzima degradante de hialuronano no modificada, identificando o seleccionando de este modo una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra estabilidad aumentada en una condición desnaturalizante. En dicho ejemplo, la actividad puede ser una actividad hialuronidasa. En ejemplos del método, se selecciona o se identifica una enzima degradante de hialuronano modificada si la actividad es al menos 120 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 200 %, 250 %, 300%, 350%, 400 %, 500 %, 1500%, 2000%, 3000 %, 4000 %, 5000 % o más de la actividad en comparación con la enzima degradante de hialuronano no modificada. En dicho ejemplo, el método también puede incluir las etapas adicionales de: d) ensayar la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada seleccionada o identificada en una composición que contiene un agente desnaturalizante y/o en una condición desnaturalizante; e) ensayar la actividad de la misma enzima degradante de hialuronano modificada seleccionada o identificada en la misma composición y/o en las mismas condiciones que d) excepto sin el agente o la condición desnaturalizante; y f) seleccionar o identificar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra actividad en d) que es al menos 5 % de la actividad en e). En dicho ejemplo, la actividad es actividad hialuronidasa. En algunos ejemplos de los métodos, se selecciona o identifica una enzima degradante de hialuronano modificada si la actividad en d) es al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de la actividad en e), por ejemplo, se selecciona o identifica una enzima degradante de hialuronano modificada si la actividad en d) es al menos 40 % o más de la actividad en e).
En cualquier de los métodos descritos en el presente documento para identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada, el agente o la condición desnaturalizante está causado por temperatura, agitación, ausencia de sal o baja salinidad o la presencia de un excipiente. Por ejemplo, el agente o la condición desnaturalizante está provocado por temperatura elevada que es de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, tal como más de o más de aproximadamente 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, 40 °C, 41 °C o 42 °C. En otros ejemplos, el agente o la condición desnaturalizante es la ausencia de sal o baja salinidad menor de 100 mM, tal como baja salinidad menor de 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM. En ejemplos adicionales, el agente o la condición desnaturalizante es un excipiente desnaturalizante seleccionado de entre antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, cargas y diluyentes, saporíferos, colorantes, lubricantes, emolientes, conservantes, sorbentes y edulcorantes.
En ejemplos particulares de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada, el agente o la condición desnaturalizante es un conservante o conservantes, por ejemplo, un conservante o conservantes fenólicos. El conservante o conservantes fenólicos pueden ser un fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico o un parabeno. Por ejemplo, el agente o la condición desnaturalizante es un conservante o conservantes que son fenol y/o m-cresol. En dichos ejemplos, la cantidad total de conservante fenólico en la composición, como porcentaje (%) de concentración en masa (p/v), es de o de aproximadamente 0,05 % a 0,6 %, 0,1 % a 0,4 %, 0,1 % a 0,3 %, 0,15 % a 0,325 %, 0,15 % a 0,25 %, 0,1 % a 0,2 %, 0,2 % a 0,3 % o 0,3 % a 0,4 % inclusive.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada, antes de ensayar la actividad de una composición de enzima degradante de hialuronano en a) y/o b), la enzima degradante de hialuronano se expone a la condición de desnaturalización o el agente desnaturalizante durante un tiempo predeterminado. El tiempo predeterminado es un periodo de tiempo que selecciona el usuario dependiendo de la enzima degradante de hialuronano particular que se hace evolucionar o se selecciona, la condición de desnaturalización o agente desnaturalizante particular, la cantidad o alcance de la condición de desnaturalización o agente desnaturalizante, la aplicación o uso de la enzima degradante de hialuronano y otros factores similares. Por ejemplo, el tiempo predeterminado puede ser de o de aproximadamente 1 minuto a 1 mes, 1 minuto a 3 semanas, 1 minuto a 2 semanas, 1 minuto a 1 semana, 1 minuto a 24 horas, 1 minuto a 12 horas, 30 minutos a 6 horas o 1 hora a 4 horas, tal como al menos o aproximadamente al menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, 7 días, dos semanas o un mes.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada, la enzima degradante de hialuronano modificada es una que contiene un reemplazo, una inserción o una supresión de aminoácidos en comparación con una enzima degradante de hialuronano no modificada. Por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano modificada contiene un reemplazo de aminoácidos tal como un único reemplazo de aminoácido o dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más reemplazos de aminoácidos en comparación con una forma no modificada de la enzima degradante de hialuronano. En aspectos particulares del método, se explora una biblioteca o colección de enzimas degradantes de hialuronano modificadas para hacer evolucionar o identificar o solucionar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra estabilidad, tal como estabilidad aumentada, en una condición desnaturalizante. Por lo tanto, en ejemplos de los métodos del presente documento, se ensayan una pluralidad de enzimas degradantes de hialuronano modificadas en a) y/o b). En dichos ejemplos, la pluralidad de enzimas degradantes de hialuronano modificadas están modificadas en comparación con la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente para generar una colección de enzimas degradantes de hialuronano modificadas, por lo que cada proteína modificada en la colección se ensaya en cada uno de a) y/o b). En la colección o biblioteca, cada enzima degradante de hialuronano modificada contiene un único reemplazo de aminoácido en comparación con la forma no modificada de la enzima degradante de hialuronano, de modo que la pluralidad de enzimas modificadas es tal que el aminoácido en cada posición modificada se reemplaza por hasta 1-19 otros aminoácidos distintos del aminoácido original en la posición, por lo que cada enzima degradante de hialuronano modificada contiene un reemplazo de aminoácido diferente, y cada aminoácido a lo largo de la longitud de la enzima degradante de hialuronano, o una parte seleccionada de la misma, se reemplaza.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la enzima degradante de hialuronano modificada está modificada en comparación con una enzima degradante de hialuronano no modificada mediante inserción, supresión o reemplazo de un aminoácido o aminoácidos. La enzima degradante de hialuronano no modificada puede ser una condroitinasa o puede ser una hialuronidasa. En ejemplos del presente documento, la hialuronidasa no modificada es una hialuronidasa PH20 o forma truncada de la misma que carece de un sitio de unión a anclaje de glucosilfofatidilinositol (GPI) C terminal o una parte del sitio de unión a anclaje de GPI, por lo que la forma truncada muestra actividad hialuronidasa. La hialuronidasa PH20 puede ser una PH20 humana, de mono, bovina, ovina, de rata, de zorro, de ratón o de cobaya. En ejemplos particulares, la hialuronidasa PH20 es una PH20 humana o una forma truncada en el extremo C terminal de la misma. Por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano no modificada es una que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870, tal como al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861 u 870. De acuerdo con la invención, la enzima degradante de hialuronano no modificada es una hialuronidasa PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para identificar o seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra estabilidad, el método se realiza in vitro. También se describe cualquiera de los métodos que son por iteraciones, por lo que las etapas del método se repiten una pluralidad de veces, donde en cada repetición, se generan y ensayan más enzimas degradantes de hialuronano modificadas de una enzima degradante de hialuronano modificada seleccionada, por lo que la enzima degradante de hialuronano modificada evoluciona para mostrar estabilidad aumentada en una condición de desnaturalización. También se describe en el presente documento una enzima degradante de hialuronano modificada identificada por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de PH20 humana de longitud completa (expuesta en SEQ ID NO: 7) y variantes truncadas en el extremo C terminal solubles de la misma. El resto de aminoácido C terminal de variantes truncadas en el extremo C terminal ejemplares de PH20 de longitud completa se indica en negrita. Las secuencias de aminoácidos completas de variantes truncadas en el extremo C terminal ejemplares de PH20 de longitud completa también se proporcionan en SEQ ID NO: 3 y 32-66. El resto de aminoácido C terminal de una PH20 soluble ejemplar, cuya secuencia completa se expone en SEQ ID NO: 3, también se indica por subrayado. Se indican mediante resaltado posiciones ejemplares, no limitantes, para reemplazos de aminoácidos. Las posiciones correspondientes pueden identificarse por alineamiento de una secuencia de interés con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66, y en particular con SEQ ID NO: 3.
La Figura 2 representa alineamientos ejemplares de p H20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con otros polipéptidos de PH20. Un “*” significa que los restos alineados son idénticos, un “:” significa que los restos alineados no son idénticos, pero son similares y contienen restos de aminoácidos conservativos en la posición alineada, y un “.” Significa que los restos alineados son similares y contienen restos de aminoácidos semiconservativos en la posición alineada. Se indican mediante resaltado posiciones correspondientes, ejemplares, no limitantes, para reemplazos de aminoácidos. Por ejemplo, la Figura 2A representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de chimpancé expuesta en SEQ ID NO: 10. La Figura 2B representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de mono Rhesus expuesta en SEQ ID NO: 12. La Figura 2C representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de mono Cynomolgus expuesta en SEQ ID NO: 14. La Figura 2D representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 bovina expuesta en SEQ ID NO: 16. La Figura 2E representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de ratón expuesta en SEQ ID NO: 20. La Figura 2F representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de rata expuesta en SEQ ID NO: 22. La Figura 2G representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de conejo expuesta en SEQ ID NO: 24. La Figura 2H representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de cobaya expuesta en SEQ ID NO: 29. La Figura 2I representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de zorro expuesta en SEQ ID NO: 31. La Figura 2J representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de gibón expuesta en SEQ ID NO: 857. La Figura 2K representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de tití expuesta en SEQ ID NO: 859. La Figura 2L representa el alineamiento de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de orangután expuesta en SEQ ID NO: 861.
Descripción detallada
Esquema
A. Definiciones
B. Hialuronidasa PH20
1. Estructura
2. Función
3. Polipéptidos de PH20 solubles
C. Polipéptidos de PH20 modificados
1. Mutantes activos
a. Actividad aumentada
b. Estabilidad aumentada
i. Fenófilos
ii. Termófilos
iii. Ausencia de sal
2. Mutantes Inactivos
3. Modificaciones adicionales
a. Inmunogenicidad reducida
b. Conjugación con polímeros
D. Métodos para identificar enzimas degradantes de hialuronano modificadas con propiedades o actividades alteradas
1. Enzimas degradantes de hialuronano y bibliotecas de enzimas degradantes de hialuronano modificadas 2. Exploración o ensayo con respecto a una actividad o propiedad deseada
3. Selección o identificación
4. Métodos por iteraciones
E. Producción de polipéptidos modificados y moléculas de ácido nucleico codificantes
1. Aislamiento o preparación de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de PH20
2. Generación de ácido nucleico mutante o modificado y que codifica polipéptidos
3. Vectores y células
4. Expresión
a. Células procariotas
b. Células de levadura
c. Insectos y células de insectos
d. Expresión de mamíferos
e. Plantas y células vegetales
5. Purificación
6. Modificación de polipéptidos por PEGilación
F. Composiciones farmacéuticas y formulaciones, dosificaciones y administración
1. Formulaciones (líquidos, inyectables, soluciones y emulsiones)
a. Liofilizadas
b. Formulaciones ejemplares
i. NaCl
ii. pH y tampón
iii. Conservantes
iv. Estabilizadores
2. Composiciones para otras vías de administración
3. Dosificaciones y administración
4. Co-formulaciones de PH20-insulina ejemplares
5. Envasado, artículos de fabricación y kits
G. Métodos para evaluar la actividad hialuronidasa
1. Actividad hialuronidasa
2. Solubilidad
3. Pureza, cristalización o agregación
4. Farmacodinámica/farmacocinética
H. Métodos de tratamiento y terapia de combinación
1. Métodos de suministro de agentes terapéuticos y suministro de insulina
2. Métodos de tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano
3. Otros usos
4. Anticoncepción
I. Ejemplos
A. DEFINICIONES
A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la invención o las invenciones. En caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos del presente documento, prevalecerán los de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro de dichos identificadores o direcciones, se entenderá que dichos identificadores pueden cambiar y la información particular en internet puede aparecer y desaparecer, pero puede encontrarse información equivalente buscando en internet. La referencia a la misma demuestra la disponibilidad y diseminación pública de dicha información.
Como se usa en el presente documento, una enzima degradante de hialuronano se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un polímero de hialuronano (también denominado ácido hialurónico o HA) en fragmentos de menor peso molecular. Son enzimas degradantes de hialuronano ejemplares hialuronidasas, y condroitinasas y liasas particulares que tienen la capacidad de despolimerizar hialuronano. Las condroitinasas ejemplares que son enzimas degradantes de hialuronano incluyen, pero sin limitación, condroitín ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitín AC liasa (también conocida como condroitín sulfato liasa o condroitín sulfato eliminasa) y condroitín C liasa. La condroitín ABC liasa contiene dos enzimas, condroitín sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitín sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Unas condroitín sulfato-ABC endoliasas y condroitín sulfato-ABC exoliasas ejemplares incluyen, pero sin limitación, las de Proteus vulgaris y Pedobacter heparinus (la condroitín-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 922; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46). Las enzimas de condroitinasa AC ejemplares de bacterias incluyen, pero sin limitación, las de Pedobacter heparinus, expuestas en SEQ ID NO: 923, Victivallis vadensis, expuesta en SEQ ID NO: 924 y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1): 29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5): 387-444). Las enzimas condroitinasa C ejemplares de bacterias incluyen, pero sin limitación, las de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2): 121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262: 127-133).
Como se usa en el presente documento, hialuronidasa se refiere a una clase de enzimas que degradan hialuronano. Las hialuronidasas incluyen, pero sin limitación, hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) y hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero sin limitación, murinas, caninas, felinas, leporinas, aviares, bovinas, ovinas, porcinas, equinos, ícticas, de ranas, bacterianas y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas humanas ejemplares incluyen HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 y p H20. También se incluyen entre las hialuronidasas, hialuronidasas solubles, incluyendo PH20 ovina y bovina y PH20 soluble. Las hialuronidasas ejemplares incluyen cualquiera expuesta en SEQ ID NO: 6, 7-31, 69, 70, 71, 72, 856-861, 869-921, formas maduras de las mismas (que carecen de la secuencia señal) o variantes alélicas o de especie de las mismas. Las hialuronidasas también incluyen forman truncadas de las mismas que muestran actividad hialuronidasa, incluyendo variantes truncadas en el extremo C terminal que son solubles.
Como se usa en el presente documento, PH20 se refiere a un tipo de hialuronidasa que aparece en el espermatozoide y es activa neutra. PH20 aparece en la superficie del espermatozoide, y en el acrosoma derivado del lisosoma, donde se une con la membrana acrosómica interna. PH20 incluye las de cualquier origen incluyendo, pero sin limitación, humano, de chimpancé, de mono Cynomolgus, de mono Rhesus, murino, bovino, ovino, de cobaya, de conejo y de rata. Los polipéptidos de PH20 ejemplares, incluyendo formas precursoras y maduras, incluyen los de ser humano (SEQ iD n O: 6 y 7), chimpancé (SEQ ID NO: 8, 9, 10, 869 y 870), mono Rhesus (SEQ ID NO: 11 y 12), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 13 y 14), vaca (por ejemplo, SEQ ID NO: 15-18); ratón (SEQ ID NO: 19 y 20); rata (SEQ ID NO: 21 y 22); conejo (SEQ ID NO: 23 y 24); oveja (SEQ ID NO: 25-27), cobaya (SEQ ID NO: 28 y 29); zorro (SEQ ID NO: 30 y 31); gibón (SEQ ID NO: 856 y 857), tití (SEQ ID NO: 858 y 859) y orangután (SEQ iD NO: 860 y 861). La referencia PH20 incluye polipéptidos de PH20 precursores y polipéptidos de PH20 maduros (tales como en los que se ha retirado una secuencia señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NO: 7, o las formas maduras de los mismos. Los polipéptidos de PH20 también incluyen los que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y los que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, PEGilación, albuminación, glucosilación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones de los polipéptidos conocidas en la técnica. Son ejemplos de hialuronidasas solubles bovinas u ovinas disponibles en el mercado hialuronidasa Vitrase® (hialuronidasa ovina) y hialuronidasa Amphadase® (hialuronidasa bovina).
Como se usa en el presente documento, una PH20 soluble se refiere a un polipéptido caracterizado por su solubilidad en condiciones fisiológicas. En general, una PH20 soluble carece de toda o una parte de una secuencia de unión a anclaje de glucofosfatidilo (GPI), o no se ancla de otro modo lo suficiente a la membrana celular. Por ejemplo, un PH20 soluble puede ser una variante truncada en el extremo C terminal de una PH20 que carece de una secuencia contigua de aminoácidos que corresponde a toda o a una parte de una secuencia de unión a anclaje de glucofosfatidilo (GPI). Por lo tanto, tras la expresión a partir de una célula, una PH20 soluble se secreta al medio. Las proteínas de PH20 solubles pueden distinguirse, por ejemplo, por su división en la fase acuosa de una solución de Triton X-114 calentada a 37 °C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256: 1604-7). Las hialuronidasas ancladas a membrana, tales como ancladas a lípidos, se dividirán en la fase rica en detergente, pero se dividirán en la fase pobre en detergente o acuosa después del tratamiento con Fosfolipasa-C. Se incluyen entre hialuronidasas PH20 solubles las hialuronidasas ancladas a membrana en las que una o más regiones asociadas con el anclaje de la hialuronidasa con la membrana se ha retirado o modificado, donde la forma soluble conserva actividad hialuronidasa. Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas recombinantes y las contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. Son ejemplos de dichas hialuronidasas solubles PH20 humana soluble (SEQ ID NO: 3 o 32-66). Otras hialuronidasas solubles incluyen PH20 ovina (SEQ ID NO: 25-27) y bovina (SEQ ID NO: 16 o 18).
Como se usa en el presente documento, PH20 humana soluble (sHuPH20) incluye polipéptidos de PH20 humanos que carecen de una secuencia contigua de aminoácidos del extremo C terminal de PH20 humana que incluye toda o una parte de la secuencia de anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) (polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C terminal) de modo que tras la expresión, los polipéptidos son solubles en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 humanos solubles son polipéptidos truncados en el extremo C terminal de PH20 humana expuestos como SEQ ID NO: 6 en su forma precursora o en SEQ ID NO: 7 en su forma madura que carece de la secuencia señal, o variantes alélicas de los mismos (por ejemplo, expuestas en cualquiera de las SEQ ID NO: 68­ 72). La solubilidad puede evaluarse por cualquier método adecuado que demuestre solubilidad en condiciones fisiológicas. Es un ejemplo de dichos métodos el ensayo de Triton® X-114, que evalúa la división en la fase acuosa y que se ha descrito anteriormente. Además, un polipéptido de PH20 humano soluble es, si se produce en células CHO, tales como células CHO-S, un polipéptido que se expresa y se secreta en el medio de cultivo celular. Los polipéptidos de PH20 humanos solubles, sin embargo, no se limitan a los producidos en células CHO, sino que pueden producirse en cualquier célula o por cualquier método, incluyendo expresión recombinante y síntesis de polipéptidos. La referencia a secreción de células CHO es de definición. Por lo tanto, si un polipéptido puede expresarse y secretarse en células CHO y es soluble en el medio, es decir, se divide en la fase acuosa cuando se extrae con Triton® X-114, es un polipéptido de PH20 soluble tanto si se produce así como si no. Los polipéptidos precursores para polipéptidos de sHuPH20 pueden incluir una secuencia señal, tal como una secuencia señal heteróloga o no heteróloga (es decir, nativa). Son ejemplos de los precursores los que incluyen una secuencia señal, tal como la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa en las posiciones de aminoácidos 1-35 (véase, por ejemplo, aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 6).
Como se usa en el presente documento, “nativo” o “de tipo silvestre” en referencia a un polipéptido de PH20 se refiere a un polipéptido de PH20 codificado por un gen de PH20 de origen natural o nativo, incluyendo variantes alélicas, que está presente en un organismo, incluyendo un ser humano y otros animales, en la naturaleza. Se pretende que la referencia a PH20 de tipo silvestre sin referencia a una especie abarque cualquier especie de una PH20 de tipo silvestre. Se incluyen entre los polipéptidos de PH20 de tipo silvestre los polipéptidos precursores codificados, fragmentos de los mismos, y formas procesadas de los mismos, tales como una forma madura que carece del péptido señal así como cualquier forma procesada pre o postraduccionalmente o modificada del mismo. También se incluyen entre los polipéptidos de PH20 nativos los que se modifican postraduccionalmente incluyendo, pero sin limitación, los que se modifican por glucosilación, carboxilación y/o hidroxilación. Las secuencias de aminoácidos de PH20 humana de tipo silvestre ejemplar se exponen en SEQ ID NO: 6 y 7 y las de variantes alélicas, incluyendo formas maduras de las mismas, se exponen en SEQ ID NO: 68-72. Otros animales producen PH20 nativa, incluyendo, pero sin limitación, secuencias nativas o de tipo silvestre expuestas en cualquiera de las SEQ ID NO: 8-31, 856-861, 869 u 870.
Como se usa en el presente documento, la modificación es en referencia a modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye supresiones, inserciones y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones postraduccionales u otros cambios a la molécula que puede producirse debido a conjugación o enlace, directa o indirectamente, con otro resto. Los métodos de modificación de un polipéptido son rutinarios para los expertos en la materia, tal como usando metodologías de ADN recombinante.
Como se usa en el presente documento, una “enzima degradante de hialuronano modificada” se refiere a una enzima degradante de hialuronano que contiene una modificación en comparación con una enzima degradante de hialuronano de referencia o no modificada. La modificación puede ser un reemplazo de aminoácido (sustitución), inserción (adición) o supresión de uno o más restos de aminoácidos. El resto de aminoácido puede ser un aminoácido natural o no natural. En algunos casos, la modificación puede ser una modificación postraduccional. Una enzima degradante de hialuronano modificada puede tener hasta 150 diferencias de aminoácidos en comparación con una enzima degradante de hialuronano de referencia o no modificada, siempre que la enzima degradante de hialuronano modificada resultante muestre actividad hialuronidasa. Típicamente, una enzima degradante de hialuronano modificada contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 modificaciones de aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, una enzima degradante de hialuronano no modificada se refiere a un polipéptido de partida que se selecciona para modificación. El polipéptido de partida puede ser una forma de tipo silvestre, de origen natural, de un polipéptido. Además, el polipéptido de partida puede alterarse o mutarse, de modo que difiera de una isoforma de tipo silvestre nativa pero no obstante se hace referencia al él en el presente documento como un polipéptido no modificado de partida en relación con los polipéptidos modificados posteriormente producidos en el presente documento. Por lo tanto, las proteínas existentes conocidas en la técnica que se han modificado para tener un aumento o reducción deseados en una actividad o propiedad particular en comparación con una proteína de referencia no modificada pueden seleccionarse y usarse como el polipéptido no modificado de partida. Por ejemplo, una proteína que se ha modificado de su forma nativa por uno o más cambios de aminoácidos individuales y posee un aumento o una reducción de una propiedad deseada, tal como un cambio en un resto o restos de aminoácidos para alterar la glucosilación, puede seleccionarse para modificación, y por lo tanto, se denomina en el presente documento no modificada, para modificación adicional. Una enzima degradante de hialuronano no modificada incluye enzimas degradantes de hialuronano humanas y no humanas, incluyendo enzimas degradantes de hialuronano de mamíferos no humanos y bacterias. Son enzimas degradantes de hialuronano no modificadas ejemplares cualquiera de las expuestas en SEQ ID NO: 2, 3, 6, 7-66, 68-72, 856-861, 869-924 o formas truncadas en el extremo C terminal, maduras, de las mismas que muestran actividad hialuronidasa, o una enzima degradante de hialuronano que muestra al menos 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 2, 3, 6, 7-66, 68-72, 856-861, 869-924. Se entiende que una enzima degradante de hialuronano no modificada generalmente es una que no contiene la modificación o las modificaciones, tales como reemplazo o reemplazos de aminoácidos de una enzima degradante de hialuronano modificada.
Como se usa en el presente documento, “polipéptido de PH20 modificado” o “polipéptido de PH20 variante” se refiere a un polipéptido de PH20 que contiene al menos una modificación de aminoácido, tal como al menos un reemplazo de aminoácido como se describe en el presente documento, en su secuencia de aminoácidos en comparación con un polipéptido de PH20 no modificado de referencia. Un polipéptido de PH20 modificado puede tener hasta 150 reemplazos de aminoácidos, siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante muestre actividad hialuronidasa. Típicamente, un polipéptido de PH20 modificado contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 reemplazos de aminoácidos. Se entiende que un polipéptido de PH20 modificado también puede incluir una cualquiera o más modificaciones adicionales, además de al menos un reemplazo de aminoácido como se describe en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, un polipéptido de PH20 no modificado se refiere a un polipéptido de PH20 de partida que se selecciona para modificación. El polipéptido de partida puede ser una forma de tipo silvestre, de origen natural, de un polipéptido. Además, el polipéptido de partida puede alterarse o mutarse, de modo que difiere de una isoforma de tipo silvestre nativa pero se hace referencia a él no obstante en el presente documento como un polipéptido no modificado de partida en relación con los polipéptidos modificados posteriormente producidos en el presente documento. Por lo tanto, las proteínas existentes conocidas en la técnica que se han modificado para tener un aumento o una reducción deseados en una actividad o propiedad particular en comparación con una proteína de referencia no modificada pueden seleccionarse y usarse como el polipéptido no modificado de partida. Por ejemplo, una proteína que se ha modificado a partir de su forma nativa por uno o más cambios de aminoácidos individuales y posee un aumento o una reducción de una propiedad deseada, tal como un cambio en un resto o restos de aminoácidos para alterar la glucosilación, pueden seleccionarse para modificación, y por lo tanto se hace referencia a ella en el presente documento como no modificada, para modificación adicional. Los polipéptidos de PH20 no modificados ejemplares son un polipéptido de PH20 humano o variante alélica o de especie del mismo u otras variantes, incluyendo polipéptidos maduros y precursores. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 de referencia ejemplares son un polipéptido de PH20 de longitud completa maduro expuesto en SEQ ID NO: 7, 69 o 72, o en formas truncadas en extremo C terminal del mismo tal como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 y 32-66, o en un polipéptido de PH20 que muestra al menos 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,
90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72. Un polipéptido de PH20 de referencia también puede incluir la forma precursora correspondiente tal como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 68, 70, 71 u otras formas precursoras, o en un polipéptido de PH20 que muestra al menos 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,
90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 68, 70, 71. Se entiende que una enzima degradante de hialuronano no modificada generalmente es una que no contiene la modificación o las modificaciones, tal como reemplazo o reemplazos de aminoácidos de una enzima degradante de hialuronano modificada.
Como se usa en el presente documento, un resto ligado a N se refiere a un resto de aminoácido de asparagina (N) de un polipéptido que es capaz de glucosilarse por modificación postraduccional de un polipéptido. Los restos ligados a N ejemplares de PH20 humana incluyen los aminoácidos N47, N131, N200, N219, N333, N358 y N365 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (correspondiente a los restos de aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368, N393 y N490 de PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 6).
Como se usa en el presente documento, un polipéptido N-glucosilado se refiere a un polipéptido de PH20 que contiene enlace oligosacárido de al menos tres restos de aminoácidos con enlaces N, por ejemplo restos ligados a N correspondientes a los restos de aminoácidos N200, N333 y N358 de SEQ ID No : 3 o 7. Un polipéptido N glucosilado puede incluir un polipéptido donde tres, cuatro, cinco y hasta todos los restos ligados a N se unen con un oligosacárido. Los oligosacáridos ligados a N pueden incluir oligomanosa, oligasacáridos complejos, híbridos o sulfatados, u otros oligosacáridos y monosacáridos.
Como se usa en el presente documento, un polipéptido N parcialmente glucosilado se refiere a un polipéptido que contiene mínimamente un N-acetilglucosamina glucano unido con al menos tres restos ligados a N. Un polipéptido parcialmente glucosilado puede incluir diversas formas de glucano, incluyendo monosacáridos, oligosacáridos y formas de azúcar ramificadas, incluyendo las formadas por tratamiento de un polipéptido con EndoH, EndoF1, EndoF2 y/o EndoF3.
Como se usa en el presente documento, “condiciones” se refiere a cualquier parámetro que pueda influir en la actividad o propiedades de una proteína o un agente. Para fines del presente documento, las condiciones se refieren en general a la presencia, incluyendo cantidad, de excipientes, vehículos u otros componentes en una formulación distinta del agente activo (por ejemplo, hialuronidasa PH20 modificada); temperatura; tiempo (por ejemplo, tiempo de almacenamiento o exposición); recipiente de almacenamiento; propiedades de almacenamiento (por ejemplo, agitación) y/u otras condiciones asociadas con exposición o uso.
Como se usa en el presente documento, “desnaturalización” o “desnaturalizar” o variaciones gramaticales de las mismas en referencia a una proteína se refieren a un cambio bioquímico en una proteína de modo que una propiedad o actividad de la proteína se reduzca o elimine. El cambio bioquímico puede ser un cambio en la estructura terciaria de la proteína para desplegar. La propiedad o actividad puede anularse completamente o puede reducirse en 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más.
Como se usa en el presente documento, la propiedad se refiere a una propiedad física o estructural, tal como la estructura tridimensional, pI, semivida, conformación y otras características físicas tales. Por ejemplo, un cambio en una propiedad puede manifestarse como la solubilidad, agregación o cristalización de una proteína.
Como se usa en el presente documento, la actividad se refiere a una actividad o actividades funcionales de un polipéptido o parte del mismo asociado con una proteína de longitud completa (completa). Las actividades funcionales incluyen, pero sin limitación, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti-polipéptido), inmunogenicidad, capacidad de formar multímeros, y la capacidad de unirse específicamente con un receptor o ligando para el polipéptido.
Como se usa en el presente documento, la actividad hialuronidasa se refiere a la capacidad para catalizar enzimáticamente la escisión de ácido hialurónico. El ensayo XXII de la Farmacopea de Estados Unidos (USP) para hialuronidasa determina la actividad hialuronidasa indirectamente midiendo la cantidad de sustrato de ácido hialurónico de mayor peso molecular, o hialuronano, (HA) que permanece después de permitir que la enzima reaccione con la Ha durante 30 min a 37 °C (USP Xx II-n F XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Puede usarse una solución de Patrón de Referencia en un ensayo para determinar la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Se conocen en la técnica y se describen en el presente documento ensayos in vitro para determinar la actividad hialuronidasa de hialuronidasas, tales como PH20, incluyendo polipéptidos de PH20 modificados. Los ensayos ejemplares incluyen el ensayo de microturbidez descrito en el presente documento que mide la escisión de ácido hialurónico por hialuronidasa indirectamente detectando el precipitado insoluble formado cuando el ácido hialurónico no escindido se une con albúmina de suero. Los Patrones de Referencia pueden usarse, por ejemplo, para generar una curva patrón para determinar la actividad en unidades de la hialuronidasa que se ensaya.
Como se usa en el presente documento, activo neutro se refiere a la capacidad de un polipéptido de PH20 para catalizar enzimáticamente la escisión de ácido hialurónico a pH neutro, tal como a un pH entre o aproximadamente entre pH 6,0 y pH 7,8.
Como se usa en el presente documento, “actividad aumentada” en referencia a una hialuronidasa PH20 modificada significa que, cuando se ensaya en las mismas condiciones, la hialuronidasa PH20 modificada muestra mayor actividad hialuronidasa en comparación con una hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada muestra al menos o aproximadamente al menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200 %, 250 %,
300 %, 400 %, 500 % , 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % o más de la actividad de la hialuronidasa PH20 no modificada o de referencia.
Como se usa en el presente documento, “solubilidad” en referencia a una proteína se refiere a una proteína que es homogénea en una solución acuosa, por lo que las moléculas proteicas se difunden y no se sedimentan espontáneamente. Por lo tanto, una solución de proteína soluble es una en la que hay ausencia de una partícula visible o definida en una solución que contiene la proteína, de modo que las partículas no pueden filtrarse fácilmente.
En general, una proteína es soluble si no hay ninguna partícula visible o definida en la solución. Por ejemplo, una proteína soluble si no contiene o contiene pocas partículas que puedan retirarse por un filtro con un tamaño de poro de 0,22 |im.
Como se usa en el presente documento, la agregación o cristalización en referencia a una proteína se refiere a la presencia de partículas visibles o definidas en una solución que contiene la proteína. Típicamente, las partículas son de más de 10 |im de tamaño, tal como mayores de 15 |im, 20 |im, 25 |im, 30 |im, 40 |im, surgir agregación o cristalización debido a solubilidad reducida, desnaturalización aumentada de una proteína o la formación de enlaces covalentes.
Como se usa en el presente documento, “condición desnaturalizante” o “condición de desnaturalización” se refieren a cualquier condición o agente que, cuando se expone a una proteína, afecta a o influye en la degradación o desnaturalización de la proteína, en general como resultado de una pérdida o pérdida parcial de la estructura terciaria o secundaria de la proteína. Las condiciones de desnaturalización pueden dar como resultado efectos tales como pérdida o reducción de la actividad, pérdida o reducción de la solubilidad, agregación y/o cristalización. No es necesario que la condición desnaturalizante sea una que sea completamente letal para la proteína, pero no obstante es una que conduce a una reducción en la actividad de la proteína a lo largo del tiempo. Por lo tanto, una condición es desnaturalizante si la actividad de la proteína se reduce en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %,
80 %, 90 %, 95 % o más en presencia de la condición que en su ausencia. Una condición desnaturalizante puede deberse a una tensión externa o condición física (por ejemplo, agitación, temperatura, tiempo de almacenamiento, ausencia de un estabilizante) o puede deberse a la presencia de un agente desnaturalizante Por ejemplo, la condición desnaturalizante puede estar causada por calor, ácido o un desnaturalizante químico. Las condiciones desnaturalizantes ejemplares incluyen, pero sin limitación, la presencia de un ácido o una base fuerte, una sal inorgánica concentrada, un disolvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo), urea, pH alto o bajo (extremos de pH), temperatura elevada (por ejemplo, calor), la presencia de excipientes que pueden ser desnaturalizantes (por ejemplo, conservantes fenólicos o detergentes) y agente estabilizante bajo o sustancialmente ausente que de otro modo se requiere para estabilidad de la proteína (por ejemplo, NaCl).
Como se usa en el presente documento, “agente desnaturalizante” o “desnaturalizante” se refiere a cualquier sustancia, molécula o compuesto que provoque desnaturalización. Por ejemplo, un agente desnaturalizante puede incluir un ácido o una base fuerte, una sal inorgánica concentrada, un disolvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo), un conservante, un detergente u otro excipiente.
Como se usa en el presente documento, “resistencia a una condición de desnaturalización” se refiere a cualquier cantidad de reducción o eliminación reducida de una propiedad o actividad de la proteína asociada con o provocada por desnaturalización. Por ejemplo, la desnaturalización se asocia con o provoca cristalización o agregación aumentada, solubilidad reducida o actividad disminuida. Por lo tanto, la resistencia a desnaturalización significa que la proteína muestra agregación o cristalización reducida, solubilidad aumentada o actividad aumentada o mayor (por ejemplo, actividad hialuronidasa) cuando se expone a una condición desnaturalizante en comparación con una proteína de referencia (por ejemplo enzima no modificada). No es necesario que la resistencia a una condición de desnaturalización sea absoluta o permanente, pero puede conseguirse porque la desnaturalización de la enzima degradante de hialuronano modificada se produce más lentamente que la enzima no modificada en la condición de desnaturalización de modo que se consigue una actividad o propiedad de la enzima degradante de hialuronano modificada durante más tiempo. Por ejemplo, una enzima degradante de hialuronano modificada, tal como una hialuronidasa PH20 modificada, muestra resistencia a una condición de desnaturalización si muestra, por ejemplo,
1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, ... 20 %, ... 30 %, ... 40 %, ... 50 %, ... 60 %, ..., 70 %, ... 80 %,
... 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % más resistencia a desnaturalización en presencia de una condición de desnaturalización o agente desnaturalizante que un polipéptido no modificado. En algunos casos, un polipéptido modificado muestra 105%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300 %, 400 %, 500 %, o más resistencia aumentada a desnaturalización en comparación con un polipéptido no modificado.
Como se usa en el presente documento, la estabilidad de una hialuronidasa PH20 modificada significa que muestra resistencia a desnaturalización provocada por una condición de desnaturalización o agente desnaturalizante. Un polipéptido de PH20 modificado muestra estabilidad si conserva algo de actividad en presencia de una condición de desnaturalización o agente desnaturalizante, tal como al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la actividad hialuronidasa original o inicial antes de exposición a la condición o las condiciones desnaturalizantes. En general, una hialuronidasa PH20 modificada es estable si conserva al menos 50 % o más de la actividad hialuronidasa en una condición de desnaturalización en comparación con la ausencia de la condición de desnaturalización. Los expertos en la materia conocen ensayos para evaluar la actividad hialuronidasa y se describen en el presente documento. Se entiende que no es necesario que la estabilidad de la enzima sea permanente o a largo plazo, sino que se manifiesta durante un periodo de tiempo en el que se desea la actividad. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada es estable si muestra una actividad durante al menos 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, un mes, seis meses o un año tras la exposición, o durante la exposición, a una o más condiciones o agentes desnaturalizantes (por ejemplo, la presencia de un excipiente desnaturalizante tal como un conservante). Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada es estable si muestra una actividad tras o durante la exposición a una o más condiciones o agentes desnaturalizantes (por ejemplo, presencia de un excipiente desnaturalizante tal como un conservante) durante al menos un mes a temperaturas de o de aproximadamente 2 °C a 8 °C, inclusive o durante al menos 3 días a una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, inclusive.
Por lo tanto, “estable” o “estabilidad”, en referencia a una formulación o una co-formulación descrita en el presente documento, se refiere a una en la que una enzima degradante de hialuronano modificada, tal como una hialuronidasa PH20 modificada, en la misma es estable tras la exposición a una o más condiciones o agentes desnaturalizantes en la misma (por ejemplo, presencia de un excipiente desnaturalizante tal como un conservante) durante al menos un mes a temperaturas de o de aproximadamente 2 °C a 8 °C, inclusive o durante al menos 3 días a una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °, inclusive.
Como se usa en el presente documento, “estabilidad aumentada” en referencia a una hialuronidasa PH20 modificada significa que, en presencia de la misma condición o las mismas condiciones desnaturalizantes o de desnaturalización (por ejemplo, presencia de un excipiente desnaturalizante tal como un conservante), la hialuronidasa PH20 modificada muestra mayor actividad hialuronidasa en comparación con una hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada muestra estabilidad aumentada si muestra al menos o aproximadamente al menos 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % o más de la actividad de la hialuronidasa PH20 no modificada o de referencia en presencia de una condición o condiciones desnaturalizantes o de desnaturalización (por ejemplo, en presencia de un excipiente desnaturalizante tal como un conservante).
Como se usa en el presente documento, “temperaturas elevadas” se refiere a temperaturas que son mayores que la temperatura ambiente. En general, una temperatura elevada es una temperatura que es al menos, mayor de, o aproximadamente 30 °C, tal como de 30 °C a 42 °C y en general de 32 °C a 37 °C o de 35 °C a 37 °C, inclusive.
Como se usa en el presente documento, la temperatura ambiente se refiere a un intervalo generalmente de aproximadamente o exactamente 18 °C hasta aproximadamente o exactamente 32 °C. Los expertos en la materia apreciarán que la temperatura ambiente varía según la localización y las condiciones predominantes. Por ejemplo, las temperaturas ambiente puede ser mayores en climas más cálidos tales como Italia o Texas.
Como se usa en el presente documento, la indicación de que las proteínas se “comparan en las mismas condiciones” significa que diferentes proteínas se tratan de forma idéntica o sustancialmente de forma idéntica de modo que una cualquiera o más condiciones que puedan influir en la actividad o propiedades de una proteína o agente no se varían o sustancialmente no se varían entre los agentes de ensayo. Por ejemplo, cuando la actividad hialuronidasa de un polipéptido de PH20 modificado se compara con un polipéptido de PH20 no modificado una cualquiera o más de las condiciones tales como la cantidad o concentración del polipéptido; presencia, incluyendo cantidad, de excipientes, vehículos u otros componentes en una formulación distintos del agente activo (por ejemplo, hialuronidasa PH20 modificada); temperatura; tiempo de almacenamiento; recipiente de almacenamiento; propiedades de almacenamiento (por ejemplo, agitación) y/u otras condiciones asociadas con exposición o uso son idénticas o sustancialmente idénticas entre los polipéptidos comparados.
Como se usa en el presente documento, “tiempo predeterminado” se refiere a un tiempo que se establece o se decide previamente. Por ejemplo, el tiempo predeterminado puede ser un tiempo elegido previamente que se asocia con la duración deseada de actividad de una enzima degradante de hialuronano dependiendo de la aplicación o el uso deseados de la proteína. Un tiempo predeterminado puede ser horas, días, meses o años. Por ejemplo, un tiempo predeterminado puede ser al menos aproximadamente o aproximadamente 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, seis meses, un año o más.
Como se usa en el presente documento, “almacenamiento” significa que una formulación no se administra inmediatamente a un sujeto una vez preparada, sino que se mantiene durante un periodo de tiempo en condiciones particulares (por ejemplo, temperatura, tiempo y/o forma (por ejemplo, forma líquida o liofilizada) particulares) antes de su uso. Por ejemplo, una formulación líquida puede mantenerse durante días, semanas, meses o años, antes de su administración a un sujeto a temperaturas variadas tales como refrigerada (0 °C a 10 °C, tal como 2 °C a 8 °C), temperatura ambiente (por ejemplo, temperatura hasta 32 °C, tal como 18 °C a aproximadamente o exactamente 32 °C), o temperatura elevada (por ejemplo, de 30 °C a 42 °C, tal como 32 °C a 37 °C o 35 °C a 37 °C).
Como se usa en el presente documento, un “excipiente” se refiere a un compuesto en una formulación de un agente activo que no proporciona el efecto biológico del agente activo cuando se administra en ausencia del agente activo. Los excipientes ejemplares incluyen, pero sin limitación, sales, tampones, estabilizantes, modificadores de la tonicidad, metales, polímeros, tensioactivos, conservantes, aminoácidos y azúcares.
Como se usa en el presente documento, un agente estabilizante se refiere a un compuesto añadido la formulación para proteger el polipéptido de PH20 modificado u otro agente activo de la degradación, si es necesario, tal como debido a condiciones de desnaturalización a las que se expone una formulación del presente documento cuando se manipula, se almacena o se usa. Por lo tanto, se incluyen agentes que evitan la degradación de proteínas de otros componentes en las composiciones. Son ejemplos de dichos agentes aminoácidos, derivados de aminoácidos, aminas, azúcares, polioles, sales y tampones, tensioactivos, inhibidores o sustratos y otros agentes como se describe en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, un ensayo de eficacia antimicrobiana o ensayo de eficacia conservante (PET) demuestra la eficacia del sistema conservante en un producto. Un producto se inocula con una cantidad controlada de organismos específicos. El ensayo compara después el nivel de microorganismos hallados en una muestra de control frente a la muestra de ensayo durante un periodo de 28 días. En general, los mercados destinatarios tienen diferentes requisitos de PET. Por ejemplo, los requisitos de PET de la Farmacopea de Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) difieren. Los expertos en la materia conocen parámetros para realizar un ensayo de eficacia antimicrobiana, incluyendo en diferentes mercados, como se describe en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante se refiere a una cantidad del conservante que destruye o inhibe la propagación de organismos microbianos en una muestra que puede introducirse desde almacenamiento o uso. Por ejemplo, para recipientes de múltiples dosis, una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante inhibe el crecimiento de microorganismos que pueden introducirse a partir de dosis individuales de extracción repetida. Las USP y EP (EPA y EPB) tienen requisitos antimicrobianos que determinan la eficacia conservante, y que varían en su rigurosidad. Por ejemplo, una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante es una cantidad tal que se produzca al menos una reducción de 1,0 unidades log-io en organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación en un ensayo de eficacia conservante antimicrobiana (APET). En un ejemplo particular, una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante es una cantidad tal que se produzca una reducción de al menos 1,0 unidades log-10 en organismos bacterianos a los 7 días después de inoculación, se produzca una reducción al menos 3,0 unidades log-^ de organismos bacterianos a los 14 días después de inoculación, al menos no se produzca aumento adicional en organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación, y al menos no se produzca aumento en organismos fúngicos después de 7 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante es una cantidad tal que se produzca al menos una reducción de 1,0 unidades log-^ de organismos bacterianos a las 24 horas después de la inoculación, se produzca una reducción de al menos 3,0 unidades log-^ de organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación, no se produzca ningún aumento adicional en organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación, se produzca una reducción de al menos 1,0 unidades log-^ de organismos fúngicos a los 14 días después de la inoculación, y no se produzca al menos un aumento adicional en organismos fúngicos después de 28 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante es una cantidad tal que se produce una reducción de al menos 2,0 unidades log-^ de organismos bacterianos a las 6 horas después de la inoculación, se produzca una reducción de al menos 3,0 unidades log-^ de organismos bacterianos a las 24 horas después de la inoculación, no se produzca ninguna recuperación de organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación de la composición con el inoculo microbianos, se produzca una reducción de al menos 2,0 unidades log-^ de organismos fúngicos a los 7 días después de la inoculación, y no se produzca al menos ningún aumento adicional en organismos fúngicos después de 28 días después de la inoculación.
Como se usa en el presente documento, “conservante” se refiere a una sustancia de origen natural o producida de forma sintética o recombinante que, cuando se añade a una molécula o composición proteica, evita el crecimiento microbiano, incluyendo crecimiento bacteriano o fúngico, en la composición.
Como se usa en el presente documento, un “conservante fenólico” se refiere a un conservante que contiene un grupo hidroxilo unido a un anillo de carbono aromático, tal como un anillo de benceno. Los conservantes fenólicos ejemplares incluyen pero sin limitación, fenol, m-cresol, ácido p-hidroxibenzoico, metilparabeno, etilparabeno y propilparabeno. Por ejemplo, los cresoles, incluyendo meta-cresol (m-cresol), tienen un grupo metilo sustituido en el anillo de benceno de una molécula de fenol.
Como se usa en el presente documento, un “fenófilo” se refiere a una proteína, tal como un polipéptido de PH20 modificado, que muestra estabilidad en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz de un conservante o conservantes. El término “fenólfilo” puede usarse indistintamente en el presente documento con “fenófilo” y tiene el mismo significado. Por ejemplo, un polipéptido de PH20 modificado que es un fenófilo o fenólfilo muestra típicamente estabilidad aumentada en comparación con una hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos cuando se ensaya en la misma condición o condiciones desnaturalizantes que contienen un conservante o conservantes fenólicos. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada muestra al menos o aproximadamente al menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % o más de la actividad de la hialuronidasa PH20 no modificada o de referencia en presencia de un conservante o conservantes fenólicos.
Como se usa en el presente documento, un “termófilo” se refiere a una proteína, tal como un polipéptido de PH20 modificado, que muestra estabilidad a temperaturas elevadas mayores de o aproximadamente 30 °C, tales como de 30 °C a 42 °C, y en general de 32 °C a 37 °C o de 35 °C a 37 °C. Por ejemplo, un polipéptido de PH20 modificado que es un termófilo típicamente muestra estabilidad aumentada en comparación con una hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos cuando se ensaya en la misma condición o las mismas condiciones desnaturalizantes de temperatura elevada. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada muestra al menos o aproximadamente al menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % o más de la actividad de la hialuronidasa PH20 no modificada o de referencia a temperaturas elevadas.
Como se usa en el presente documento, el término “detergente” se usa indistintamente con el término “tensioactivo” o “agente tensioactivo”. Los tensioactivos son típicamente compuestos orgánicos que son anfifílicos, es decir, que contienen tanto grupos hidrófobos (“colas”) como grupos hidrófilos (“cabezas”), que hacen a los tensioactivos solubles tanto en disolventes orgánicos como en agua. Un tensioactivo puede clasificarse por la presencia de grupos con carga formal en su cabeza. Un tensioactivo no iónico no tiene grupos de carga en su cabeza, mientras que un tensioactivo iónico porta una carga neta en su cabeza. Un tensioactivo zwitteriónico contiene una cabeza con dos grupos con carga opuesta. Algunos ejemplos de tensioactivos comunes incluyen: aniónico (basado en aniones sulfato, sulfonato o carboxilato): perfluorooctanoato (PFOA o PFO), sulfonato de perfluorooctano (PFOS), dodecil sulfato sódico (SDS), lauril sulfato de amonio y otras sales de alquil sulfato, laureth sulfato sódico (también conocido como lauril éter sulfato sódico o SLES), alquil benceno sulfonato; catiónicos (basados en cationes de amonio cuaternario): bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB) también conocido como bromuro de hexadecil trimetil amonio, y otras sales alquiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de sebo polietoxilada (POEA), cloruro de benzalkonio (BAC), cloruro de benzetonio (BZT); Zwitteriónicos (anfotéricos): dodecil betaína; cocamidopropil betaína; coco anfo glicinato; no iónicos: alquil poli(etilen óxido), alquilfenol poli(etilen óxido), copolímeros de poli(etilen óxido) y poli(propilen óxido) (conocidos comercialmente como Poloxámeros o Poloxaminas), alquil poliglucósidos, incluyendo octil glucósido, decil maltósido, alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetílico y alcohol oleílico), cocamida MEA, cocamida DEA, polisorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes Triton y óxido de dodecil dimetilamina.
Como se usa en el presente documento, un “tampón” se refiere a una sustancia, generalmente una solución, que puede mantener su pH constante, a pesar de la adición de ácidos fuertes o bases fuertes e influencias externas de temperatura, presión, volumen o potencial redox. Un tampón evita un cambio en la concentración de otra sustancia química, por ejemplo, sistemas donantes y aceptores de protones que evitan cambios notables en la concentración de ion hidrógeno (pH). Los valores de pH de todos los tampones son dependientes de la temperatura y la concentración. La elección de tampón para mantener un valor o intervalo de pH puede determinarse empíricamente por un experto en la materia basándose en la capacidad de tamponamiento conocida de tampones conocidos. Los tampones ejemplares incluyen pero sin limitación, tampón de bicarbonato, tampón de cacodilato, tampón de fosfato o tampón Tris. Por ejemplo, el tampón Tris (trometamina) es un tampón basado en amina que tiene una pKa de 8,06 y tiene un intervalo de pH eficaz entre 7,9 y 9,2. Para tampones Tris, el pH aumenta aproximadamente 0,03 unidades por °C de reducción de temperatura, y se reduce de 0,03 a 0,05 unidades por dilución décuple.
Como se usa en el presente documento, los restos de a-aminoácidos de origen natural son los restos de los 20 aaminoácidos hallados en la naturaleza que se incorporan en proteínas mediante el reconocimiento específico de la molécula de ARNt con carga con su codón de ARNm afín en seres humanos.
Como se usa en el presente documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser mono o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están marcados opcionalmente, tal como con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan moléculas monocatenarias. Dichas moléculas son típicamente de una longitud tal que su diana es estadísticamente única o de bajo número de copias (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para explorar o actuar como cebadores en una biblioteca. En general una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de longitud.
Como se usa en el presente documento, un péptido se refiere a un polipéptido que es de 2 a 40 aminoácidos de longitud.
Como se usa en el presente documento, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento se identifican según sus abreviaturas de tres letras o una letra conocidas (Tabla 1). Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las asignaciones de una letra convencionales usadas habitualmente en la técnica.
Como se usa en el presente documento, un “aminoácido” es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para fines del presente documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en los que el carbono a tiene una cadena lateral).
Como se usa en el presente documento, “resto de aminoácido” se refiere a un aminoácido formado tras digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Se supone que los restos de aminoácido descritos en el presente documento están en la forma isomérica “L”. Los restos en la forma isomérica “D”, que se designan así, pueden sustituir cualquier resto de aminoácido L siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo terminal de un polipéptido. Manteniendo la nomenclatura de polipéptido convencional descrita en J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), y adoptada en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, se muestran abreviaturas para restos de aminoácidos en la Tabla 1:
Tabla 1 - Tabla de Corres ondencia
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Debería observarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos representadas en el presente documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de amino terminal a carboxilo terminal. Además, la expresión “resto de aminoácido” se define ampliamente para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados y poco habituales, tales como los indicados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822. Además, debería observarse que un guion al comienzo o final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos, con un grupo amino terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo terminal tal como COOH.
Como se usa en el presente documento, “aminoácidos de origen natural” se refiere a los 20 aminoácidos L que aparecen en polipéptidos.
Como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural pero se ha modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen por lo tanto, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitación, los D-estereoisómeros de aminoácidos. Se describen en el presente documento aminoácidos no naturales ejemplares y se conocen por los expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, una mezcla isocinética es una en la que las relaciones molares de aminoácidos se han ajustado basándose en sus velocidades de reacción indicadas (véase, por ejemplo, Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34: 1681).
Como se usa en el presente documento, los expertos de la presente materia conocen sustituciones de aminoácidos conservativas adecuadas y estas pueden realizarse en general sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a Edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224). Dichas sustituciones pueden realizarse de acuerdo con las expuestas en la TABLA 2 a continuación:
TABLA 2
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Otras sustituciones también son permisibles y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.
Como se usa en el presente documento, una construcción de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, mono o bicatenaria, que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no hallada en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
Como se usa en el presente documento, un segmento de ADN es una parte de una molécula de ADN mayor que tiene atributos específicos. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una parte de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, que, cuando se lee en la dirección de 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido específico.
Como se usa en el presente documento, el término polinucleótido significa un polímero mono o bicatenario de desoxirribonucleótidos o bases ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se proporciona en el presente documento en términos de nucleótidos (abreviado “nt”) o pares de bases (abreviado “pb”). El término nucleótidos se usa para moléculas mono y bicatenarias donde el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias este se usa para indicar longitud global y se entenderá que es equivalente a la expresión pares de bases. Los expertos en la materia reconocerán que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las mismas pueden estar escalonados; por lo tanto todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica bicatenaria no pueden estar emparejados. Dichos extremos desapareados, en general, no superarán los 20 nucleótidos de longitud.
Como se usa en el presente documento, “en una posición correspondiente a” o indicación de que los nucleótidos o las posiciones de aminoácidos “corresponden a” nucleótidos o posiciones de aminoácidos en una secuencia desvelada, tal como se expone en el listado de Secuencias, se refiere a nucleótidos o posiciones de aminoácidos identificados tras el alineamiento con la secuencia desvelada para maximizar la identidad usando un algoritmo de alineamiento convencional, tal como el algoritmo GAP. Para fines del presente documento, el alineamiento de una secuencia de PH20 es con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66, y en particular SEQ ID NO: 3. Por lo tanto, la referencia en el presente documento a que una posición o reemplazo de aminoácido corresponde a posiciones en referencia a SEQ ID NO: 3 también significa que la posición o el reemplazo de aminoácido corresponde a posiciones en referencia a cualquiera de las SEQ ID NO: 7 o 32-66, ya que las secuencias en las mismas son idénticas a los restos correspondientes como se expone en SEQ ID NO: 3. Alineando las secuencias, un experto en la materia puede identificar restos correspondientes, por ejemplo, usando restos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. En general, para identificar posiciones correspondientes, las secuencias de aminoácidos se alinean de modo que se obtiene la coincidencia de mayor orden (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). La Figura 2 ejemplifica alineamientos ejemplares e identificación de restos correspondientes ejemplares para reemplazo.
Como se usa en el presente documento, “identidad de secuencia” se refiere al número de aminoácidos o bases nucleotídicas idénticos o similares en una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. La identidad de secuencia puede determinarse por alineamiento de secuencias de secuencias de ácido nucleico o proteínas para identificar regiones de similitud o identidad. Para fines del presente documento, la identidad de secuencia se determina en general por alineamiento para identificar restos idénticos. El alineamiento puede ser local o global, pero para fines del presente documento el alineamiento es en general un alineamiento global donde se compara la longitud completa de cada secuencia. Pueden identificarse coincidencias, desapareamientos y huecos entre secuencias comparadas. Los huecos son aminoácidos o nucleótidos nulos insertados entre los restos de secuencias alineadas de modo que se alinean caracteres idénticos o similares. En general, puede haber huecos internos y terminales. La identidad de secuencia puede determinarse teniendo en cuenta los huecos como el número de restos idénticos/longitud de la secuencia más corta x 100. Cuando se usan penalizaciones de hueco, la identidad de secuencia puede determinarse sin penalización para huecos finales (por ejemplo, los huecos terminales no se penalizan). Como alternativa, la identidad de secuencia puede determinarse sin tener en cuenta huecos como el número de posiciones idénticas/longitud de la secuencia alineada total x 100.
Como se usa en el presente documento, un “alineamiento global” es un alineamiento que alinea dos secuencias de principio a fin, alineando cada letra en cada secuencia solamente una vez. Un alineamiento se produce, independientemente de si hay o no similitud o identidad entre las secuencias. Por ejemplo, la identidad de secuencia del 50 % basada en “alineamiento global” significa que en un alineamiento de la secuencia completa de dos secuencias comparadas cada una de 100 nucleótidos de longitud, el 50% de los restos son iguales. Se entiende que el alineamiento global también puede usarse para determinar la identidad de secuencia incluso cuando la longitud de las secuencias alineadas no es igual. Las diferencias en los extremos terminales de las secuencias se tendrán en cuenta para determinar la identidad de secuencia, a no ser que se seleccione “sin penalización para huecos finales”. En general, se usa un alineamiento global en secuencias que comparten similitud significativa sobre la mayor parte de su longitud. Los algoritmos ejemplares para realizar alineamiento global incluyen el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)). Están disponibles públicamente programas ejemplares para realizar alineamiento global e incluyen la Herramienta de Alineamiento de Secuencia Global disponible en el sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov/), y el programa disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.
Como se usa en el presente documento, un “alineamiento local” es un alineamiento que alinea dos secuencias, pero que solamente alinea las partes de las secuencias que comparten similitud o identidad. Por lo tanto, un alineamiento local determina si están presentes sub-segmentos de una secuencia en otra secuencia. Si no hay similitud, no se obtendrá ningún alineamiento. Los algoritmos de alineamiento local incluyen algoritmos de BLAST o Smith-Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Por ejemplo, la identidad de secuencia del 50% basada en “alineamiento local” significa que en un alineamiento de la secuencia completa de dos secuencias comparadas de cualquier longitud, una región de similitud o identidad de 100 nucleótidos de longitud tiene 50 % de los restos que son iguales en la región de similitud o identidad.
Para fines del presente documento, la identidad de secuencia puede determinarse por programas de algoritmo de alineamientos convencionales usados con penalizaciones de hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), como se describe en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización de 0,10 adicional para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos finales. Si dos moléculas de ácido nucleico cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos o dos polipéptidos cualesquiera tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % “idénticas” u otras variaciones similares que indican un porcentaje de identidad, puede determinarse usando algoritmos informáticos conocidos basados en alineamiento local o global (véase por ejemplo, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software, que proporciona enlaces a docenas de bases de datos y programas de alineamiento disponibles públicamente y conocidos). En general, para fines del presente documento la identidad de secuencia se determina usando algoritmos informáticos basados en alineamiento global, tales como la Herramienta de alineamiento de secuencia Global de Needleman-Wunsch disponible de NCBI/BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome); LAlign (William Pearson que implementa el algoritmo de Huang y Miller (Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357)); y el programa de Xiaoqui Huang disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html. En general, cuando se comparan secuencias de nucleótidos en el presente documento, se usa un alineamiento con penalización para huecos finales. También puede usarse alineamiento local cuando las secuencias que se comparan son sustancialmente de la misma longitud.
Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término “ identidad” representa una comparación o un alineamiento entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. En un ejemplo no limitante, “al menos 90% idéntico a” se refiere a porcentajes de identidad de 90 a 100% en relación con el polipéptido o polinucleótido de referencia. La identidad a un nivel del 90 % o más es indicativa del hecho de que, suponiendo para fines de ejemplo que se compara una longitud de polipéptido o polinucleótido de ensayo y de referencia de 100 aminoácidos o nucleótidos, no más del 10 % (es decir, 10 de 100) de aminoácidos o nucleótidos en el polipéptido o polinucleótido de ensayo difieren de los de los polipéptidos de referencia. Pueden realizarse comparaciones similares entre un polinucleótido de ensayo y uno de referencia. Dichas diferencias pueden representarse como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente sobre la longitud completa de una secuencia de aminoácidos o pueden agruparse en una o más localizaciones de diversa longitud hasta la máxima permisible, por ejemplo, 10/100 diferencias de aminoácidos (aproximadamente el 90 % de identidad). Las diferencias también pueden deberse a supresiones o truncamientos de restos de aminoácidos. Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos. Dependiendo de la longitud de las secuencias comparadas, en el nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente 85-90 %, el resultado puede ser independiente del programa y los parámetros de hueco establecidos; dichos altos niveles de identidad pueden evaluarse fácilmente, con frecuencia sin basarse en el software.
Como se usa en el presente documento, una variante alélica o variación alélica se refiere a dos o más formas alternativas cualesquiera de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural mediante mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos alterada. La expresión “variante alélica” también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo silvestre y/o forma predominante de un polipéptido de una población o un único miembro de referencia de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre especies típicamente tienen al menos 80 %, 90 % o más identidad de aminoácidos con una forma de tipo silvestre y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es interespecies o intraespecies. En general, las variantes alélicas intraespecie tienen al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad o más con una forma de tipo silvestre y/o predominante, incluyendo 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad con una forma de tipo silvestre y/o predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en el presente documento se refiere en general a variaciones en proteínas entre miembros de la misma especie.
Como se usa en el presente documento, “alelo”, que se usa indistintamente en el presente documento con “variante alélica” se refiere a formas alternativas de un gen o partes del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o la misma posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigoto para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un único nucleótido o varios nucleótidos, y pueden incluir modificaciones tales como sustituciones, supresiones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede estar en forma de un gen que contiene una mutación.
Como se usa en el presente documento, las variantes de especies se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamífero, tales como ratón y ser humano. Son ejemplos de variantes de especie descritas en el presente documento PH20 de primate, tal como, pero sin limitación, ser humano, chimpancé, macaco, mono cynomolgus, gibón, orangután o tití. En general, las variantes de especie tienen 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % de identidad de secuencia. Los restos correspondientes entre y dentro de variantes de especie pueden determinarse comparando y alineando secuencias para maximizar el número de nucleótidos o restos coincidentes, por ejemplo, de modo que la identidad entre las secuencias sea igual a o mayor de 95 %, igual a o mayor de 96 %, igual a o mayor de 97 %, igual a o mayor de 98 %, o igual a o mayor de 99 %. Después se proporciona a la posición de interés el número asignado en la molécula de ácido nucleico de referencia. El alineamiento puede efectuarse manualmente o visualmente, particularmente cuando la identidad de secuencia es mayor del 80 %.
Como se usa en el presente documento, sustancialmente puro significa suficientemente homogéneo para parecer libre de impurezas fácilmente detectables, como se determina por métodos convencionales de análisis, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usados por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o suficientemente puro de modo que la purificación adicional no alteraría de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la materia conocen métodos para purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros. Un compuesto sustancialmente químicamente puro puede, sin embargo, ser una mezcla de esteroisómeros o isómeros. En dichos casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
Como se usa en el presente documento, el polipéptido o la proteína aislado o purificado o parte biológicamente activa del mismo está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido del que deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones son sustancialmente libres si parecen libres de impurezas fácilmente detectables como se determina por métodos convencionales de análisis, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usados por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o suficientemente pura de modo que la purificación adicional no alteraría de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la materia conocen métodos para purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros. Un compuesto sustancialmente químicamente puro, sin embargo, puede ser una mezcla de esteroisómeros. En dichos casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
Por lo tanto, la referencia a un polipéptido sustancialmente purificado, tal como un polipéptido de PH20 sustancialmente purificado se refiere a preparaciones de proteínas de PH20 que están sustancialmente libres de este material celular, incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína está separada de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. La expresión sustancialmente libre de material celular puede incluir preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también denominadas en el presente documento proteínas contaminantes), en general menos de aproximadamente 20 % de proteínas no enzimáticas o 10 % de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente 5 % de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce de forma recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio cultivo representa menos de aproximadamente o exactamente 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación de proteína enzimática.
Como se usa en el presente documento, la expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína se separa de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco), 20 %, 10 %, 5 % o menos de precursores químicos o productos químicos o componentes no enzimáticos.
Como se usa en el presente documento, sintético, en referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula polipeptídica que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.
Como se usa en el presente documento, la producción por medio recombinante o usando métodos de ADN recombinante significa el uso de métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.
Como se usa en el presente documento, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir un ácido nucleico heterólogo en células para expresión o replicación del mismo. Los vectores típicamente permanecen episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales tales cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y uso de dichos vehículos se conocen bien por los expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está unido operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión generalmente derivan de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula hospedadora apropiada, da como resultado expresión del ADN clonado. Los expertos en la materia conocen bien vectores de expresión apropiados e incluyen los que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y los que permanecen episómicos o los que se integran en el genoma de la célula hospedadora.
Como se usa en el presente documento, vector también incluye “vectores de virus” o “vectores virales”. Los vectores virales son virus modificados técnicamente que se unen operativamente con genes exógenos para transferencia (como vehículos o lanzaderas) de los genes exógenos a células. Los vectores virales incluyen, pero sin limitación, vectores adenovirales, vectores retrovirales y vectores de virus vaccinia.
Como se usa en el presente documento, “operativamente” o “unido operativamente” cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos se disponen de modo que actúen en concierto para sus fines pretendidos, por ejemplo, la transcripción se inicia cadena abajo de promotor y cadena arriba de cualquier secuencia transcrita. El promotor es habitualmente el dominio con el que se une la maquinaria transcripcional para iniciar la transcripción y continúa por el segmento codificante hasta el terminador.
Como se usa en el presente documento, un conjugado se refiere a un polipéptido de PH20 modificado unido directa o indirectamente con uno o más polipéptidos o restos químicos adicionales. Dichos conjugados incluyen proteínas de fusión, las producidas por conjugados químicos y las producidas por cualquier otro método por el que se una al menos un polipéptido de PH20, directa o indirectamente con otro polipéptido o resto químico siempre que el conjugado conserve actividad hialuronidasa. Los ejemplos de conjugados descritos en el presente documento incluyen polipéptidos de PH20 unidos directa o indirectamente con un dominio de multimerización (por ejemplo, un resto Fc), una toxina, un marcador o un fármaco.
Como se usa en el presente documento, una proteína de fusión se refiere a un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que contiene una secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico y la secuencia codificante de otra molécula de ácido nucleico en la que las secuencias codificantes están en la misma fase de lectura de modo que cuando la construcción de fusión se transcribe y traduce en una célula hospedadora, se produce la proteína que contiene las dos proteínas. Las dos moléculas pueden estar adyacentes en la construcción o separadas por un polipéptido enlazador que contiene 1, 2, 3 o más, pero típicamente menos de 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos. El producto proteico codificado por una construcción de fusión se denomina polipéptido de fusión. Los ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen fusiones de Fc.
Como se usa en el presente documento, un polímero que está conjugado con un polipéptido de PH20 modificado se refiere a cualquier polímero que está unido covalentemente o de otro modo de forma estable, directamente o mediante un enlazador, con dicho polipéptido. Dichos polímeros típicamente aumentan la semivida en suero e incluyen, pero sin limitación, restos siálicos, restos de polietilenglicol (PEG), dextrano y azúcar y otros restos, tal como para glucosilación.
Como se usa en el presente documento, se pretende que el término evaluar o determinar incluya determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de un producto, y también para obtener un índice, relación, porcentaje, visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta.
Como se usa en el presente documento, una “composición” se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o compuestos. Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, una pasta, acuosa, no acuosa, o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en el presente documento, una formulación se refiere a una composición que contiene al menos un agente farmacéutico o terapéutico activo y uno o más excipientes.
Como se usa en el presente documento, una co-formulación se refiere a una composición que contiene dos o más agentes activos o farmacéuticos o terapéuticos y uno o más excipientes. Por ejemplo, una co-formulación de una insulina de acción rápida y una enzima degradante de hialuronano contiene una insulina de acción rápida, una enzima degradante de hialuronano y uno o más excipientes.
Como se usa en el presente documento, “una combinación” se refiere a cualquier asociación entre dos o más artículos o elementos. Las combinaciones ejemplares incluyen, pero sin limitación, dos o más composiciones farmacéuticas, una composición que contiene dos o más principios activos, tal como dos polipéptidos de PH20 modificados; un polipéptido de PH20 modificado y un agente antineoplásico, tal como un compuesto quimioterapéutico; un polipéptido de PH20 modificado y un agente terapéutico (por ejemplo, una insulina); un polipéptido de PH20 modificado y una pluralidad de agentes terapéuticos y/o de captura de imágenes, o cualquier asociación de los mismos. Dichas combinaciones pueden envasarse como kits.
Como se usa en el presente documento, un kit es una combinación envasada, opcionalmente que incluye instrucciones para uso de la combinación y/u otras reacciones y componentes para dicho uso.
Como se usa en el presente documento, “enfermedad o trastorno” se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta de causa o condición incluyendo, pero sin limitación, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas, y caracterizada por síntomas identificables.
Como se usa en el presente documento, una enfermedad, un trastorno o una afección asociado a hialuronano se refiere a cualquier enfermedad o afección en la que los niveles de hialuronano están elevados como causa, consecuencia u observados de otro modo en la enfermedad o afección. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano se asocian con expresión de hialuronano elevada en un tejido o una célula, presión de líquido intersticial aumentada, volumen vascular reducido y/o contenido de agua aumentado en un tejido. Las enfermedades, los trastornos o las afecciones asociados a hialuronano pueden tratarse mediante administración de una composición que contiene una enzima degradante de hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo una hialuronidasa soluble, bien sola o bien en combinación con o además de otro tratamiento y/o agente. Las enfermedades y afecciones ejemplares incluyen, pero sin limitación, cánceres ricos en hialuronano, por ejemplo, tumores, incluyendo tumores sólidos tales como cánceres de estadio tardío, cánceres metastásicos, cánceres indiferenciados, cáncer ovárico, cáncer in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (SCC), cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, cáncer de colon y otros cánceres. Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano ejemplares también son enfermedades que están asociadas con presión de líquido intersticial elevada, tales como enfermedades asociadas con presión del disco y edema, por ejemplo, edema provocado por trasplante de órganos, ictus, traumatismo cerebral u otra lesión. Las enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano ejemplares incluyen enfermedades y afecciones asociadas con presión de líquido intersticial elevada, volumen vascular reducido y/o contenido de agua aumentado en un tejido, incluyendo cánceres, presión de disco y edema. En un ejemplo, el tratamiento de la afección, enfermedad o trastorno asociado a hialuronano incluye alivio, reducción u otro efecto beneficioso en uno o más de presión de líquido intersticial aumentada (IFP), volumen vascular reducido y contenido de agua aumentado en un tejido.
Como se usa en el presente documento, “tratar” a un sujeto con una enfermedad o afección significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o totalmente, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o una prevención de empeoramiento de síntomas o progresión de una enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de un interferón modificado y composiciones descritas en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, un agente farmacéuticamente eficaz o agente terapéutico incluye cualquier agente bioactivo que pueda mostrar un efecto terapéutico para tratar una enfermedad o un trastorno. Se describen en el presente documento agentes terapéuticos ejemplares. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, anestésicos, vascoconstrictores, agentes de dispersión, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo moléculas pequeñas farmacológicas, incluyendo, pero sin limitación, bisfosfonatos y proteínas terapéuticas, incluyendo, pero sin limitación, insulina, moléculas de IgG, anticuerpos, citocinas y factores de coagulación.
Como se usa en el presente documento, “ insulina” se refiere a una hormona, un precursor o un análogo sintético o recombinante de la misma que actúa para aumentar la captación de glucosa y almacenamiento y/o reducción de la producción de glucosa endógena. Los expertos en la materia conocen bien insulina y análogos de la misma, incluyendo en humana y variantes alélicas y de especies de la misma. La insulina se traduce como un polipéptido precursor designado preproinsulina (110 aminoácidos para insulina humana), que contiene un péptido señal que dirige la proteína al retículo endoplásmico (RE) en el que la secuencia señal se escinde, dando como resultado proinsulina. La proinsulina se procesa adicionalmente para liberar un péptido de cadena conectora o C (una cadena C de 31 aminoácidos en insulina humana). La insulina resultante contiene una cadena A (21 aminoácidos de longitud en insulina humana; expuesta en SEQ ID NO: 862) y una cadena B (30 aminoácidos de longitud en insulina humana; expuesta en SEQ ID NO: 863) que se reticulan por enlaces disulfuro. Una insulina humana completamente reticulada contiene tres enlaces disulfuro: uno entre la posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B, un segundo entre la posición 20 de la cadena A y la posición 19 de la cadena B, y un tercero entre las posiciones 6 y 11 de la cadena A. La referencia a una insulina incluye insulinas monoméricas y multiméricas, incluyendo insulinas hexaméricas, así como insulinas humanizadas. Son polipéptidos de insulina ejemplares los de origen mamífero, incluyendo humano. La referencia a insulina incluye preproinsulina, proinsulina y polipéptidos de insulina en formas monocatenarias o bicatenarias, formas truncadas de las mismas que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especie de insulina humana, variantes codificadas por variantes de corte y empalme y otras variantes, tales como análogos de insulina. Una insulina ejemplar es insulina humana que tiene una secuencia de aminoácidos de las cadenas A y B de insulina humana expuestas en SEQ ID NO: 862 y 863, respectivamente, y variantes o análogos de las mismas que muestran al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con las mismas con una o ambas de la cadena A o cadena B y que actúa para aumentar la captación de glucosa y/o almacenamiento y/o reducción de la producción de glucosa endógena. Una insulina ejemplar adicional es la insulina porcina que tiene una secuencia de aminoácidos para la preproinsulina como se expone en SEQ ID NO: 864, por la que la cadena A corresponde a las posiciones de restos de aminoácidos 88-108 y la cadena B corresponde al aminoácido, y variantes o análogos de la misma que muestran al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma con una o ambas de la cadena A o la cadena B y que actúa para aumentar la captación de glucosa y almacenamiento y/o reducción de la producción de glucosa endógena.
Como se usa en el presente documento, “insulina de acción rápida” se refiere a cualquier insulina que muestre niveles de insulina pico a las o aproximadamente no más de cuatro horas después de administración subcutánea a un sujeto. Las insulinas de acción rápida incluyen cualquier insulina o cualquier composición de insulina de acción rápida para administración aguda a un sujeto diabético en respuesta a una afección hiperglucémica real, percibida o anticipada en el sujeto que surge en el momento de, o en un periodo de aproximadamente cuatro horas después de la administración de la insulina de acción rápida (tal como afección hiperglucémica prandial, que resulta de o se anticipa que resulta del consumo de un alimento), por lo que la insulina de acción rápida es capaz de prevenir, combatir o aliviar la afección hiperglucémica aguda. Las insulinas de acción rápida incluyen insulinas recombinantes e insulinas aisladas (también denominadas insulinas “regulares”) tales como la insulina comercializada como insulina humana, insulinas porcinas e insulinas bovinas, así como análogos de insulina de acción rápida (también denominados análogos de insulina de acción rápida en el presente documento) diseñados para tener acción rápida en virtud de cambios de aminoácidos. Las preparaciones de insulina regular ejemplares incluyen, pero sin limitación, insulinas regulares humanas, tales como las comercializadas con las marcas comerciales Humulin® R, Novolin® R y Velosulin®, Insulina Humana, USP e Inyección de Insulina Humana, USP, así como formulaciones ácidas de insulina, tales como, por ejemplo, Toronto Insulin, Old Insulin y Clear Insulin, e insulinas regulares de cerdo, tales como Iletin II® (insulina porcina). Las insulinas regulares típicamente tienen un comienzo de acción de entre 30 minutos y una hora, y un nivel pico de insulina de 2-5 horas después de la administración.
Como se usa en el presente documento, los análogos de insulina de acción rápida (también denominados análogos de insulina de acción veloz) son insulinas que tienen un comienzo de acción rápido. Las insulinas rápidas típicamente son análogos de insulina que se han modificado técnicamente, tal como mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos, para ser de acción más rápida que las insulinas regulares. Los análogos de insulina de acción rápida típicamente tienen una aparición de acción de 10-30 minutos después de la inyección, con niveles picos de insulina observados 30-90 minutos después de la inyección. Son análogos de insulina de acción rápida ejemplares análogos de insulina humana que contienen uno o más cambios de aminoácidos en la cadena A y/o cadena B de insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 862 u 863, respectivamente, y que muestran un comienzo de acción 10-30 minutos después de la inyección con niveles picos de insulina observados 30-90 minutos después de la inyección. Los análogos de insulina de acción rápida ejemplares incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, insulina lispro (por ejemplo, insulina Humalog®), insulina aspart (por ejemplo, insulina NovoLog®), e insulina glulisina (por ejemplo, insulina Apidra®) la composición de insulina de acción rápida comercializada como VIAject® y VIAtab® (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 7.279.457). La secuencia de aminoácidos de análogos de insulina de acción rápida ejemplares tiene una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de en SEQ ID NO: 865-867. También se incluye cualquier otra insulina que tenga una aparición de acción de 30 minutos o menos y un nivel pico antes de 90 minutos, típicamente 30-90 minutos, después de la inyección.
Como se usa en el presente documento, una insulina humana se refiere a una insulina que se produce de forma sintética o recombinante basándose en el polipéptido humano, incluyendo variantes alélicas y análogos del mismo.
Como se usa en el presente documento, las insulinas humanas de acción rápida o composiciones de insulina de acción rápida humanas incluyen cualquier insulina humana o composición de una insulina humana que sea de acción rápida, pero excluye insulinas no humanas, tales como insulina regular de cerdo.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “insulinas de acción basal” o “ insulinas basales” se refieren a insulinas administradas para mantener un nivel insulina basal como parte de un régimen de tratamiento general para tratar una afección crónica tal como diabetes. Típicamente, una insulina de acción basal se formula para mantener un nivel de insulina aproximadamente de estado estacionario mediante la liberación controlada de insulina cuando se administra periódicamente (por ejemplo, una vez o dos veces al día). Las insulinas de acción basal incluyen insulinas cristalinas (por ejemplo, NPH y Lente®, insulina protamina, insulina surfeno), análogos de insulina basal (insulina glargina, HOE 901, NovoSol Basal) y otras formulaciones químicas de insulina (por ejemplo, goma arábiga, lecitina o suspensiones oleosas) que retardan la velocidad de absorción de la insulina regular. Como se usa en el presente documento, las insulinas de acción basal pueden incluir insulinas que se entiende habitualmente que tienen acción larga (alcanzando típicamente una concentración pico relativamente baja, mientras que tienen una duración máxima de acción de más de aproximadamente 20-30 horas) o de acción intermedia (que provocan típicamente concentraciones pico de insulina aproximadamente a las 4-12 horas después de la administración).
Como se usa en el presente documento, el tratamiento significa cualquier modo en que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad u otra indicación, se alivien o se alteren de otro modo de forma beneficiosa.
Como se usa en el presente documento, el efecto terapéutico significa un efecto resultante del tratamiento de un sujeto que altera, típicamente mejora o alivia los síntomas de una enfermedad o afección o que cura una enfermedad o afección. Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto que da como resultado un efecto terapéutico después de la administración a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano.
Como se usa en el presente documento, un paciente se refiere a un sujeto humano que muestra síntomas de una enfermedad o un trastorno.
Como se usa en el presente documento, el alivio de los síntomas de una enfermedad o un trastorno particular por un tratamiento, tal como mediante administración de una composición farmacéutica u otro producto terapéutico, se refiere a cualquier reducción, bien permanente o bien temporal, duradera o transitoria, de los síntomas que puede atribuirse a o asociarse con la administración de la composición o el producto terapéutico.
Como se usa en el presente documento, la prevención o profilaxis se refiere a métodos en los que el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección se reduce.
Como se usa en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “dosis terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por lo tanto, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, aliviar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o un trastorno.
Como se usa en el presente documento, la forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y envasadas individualmente como se conoce en la técnica.
Como se usa en el presente documento, una formulación de dosificación individual se refiere a una formulación que contiene una única dosis de agente terapéutico para administración directa. Las formulaciones de dosificaciones individuales generalmente no contienen ningún conservante.
Como se usa en el presente documento, una formulación multidosis se refiere a una formulación que contiene múltiples dosis de un agente terapéuticos y que pueden administrarse directamente para proporcionar varias dosis individuales del agente terapéutico. Las dosis pueden administrarse a lo largo del transcurso de minutos, horas, semanas, días o meses. Las formulaciones multidosis pueden permitir ajuste de dosis, agrupamiento de dosis y/o separación de dosis. Debido a que las formulaciones multidosis se usan a lo largo del tiempo, generalmente contienen uno o más conservantes para prevenir el crecimiento microbiano.
Como se usa en el presente documento, un “artículo de fabricación” es un producto que se prepara y se vende. Como se usa a lo largo de la presente solicitud, se entiende que el término abarca un agente terapéutico con un PH20 soluble, tal como esPH20 o un esPH20 solo, contenido en los mismos artículos de envasado o artículos de envasado separados.
Como se usa en el presente documento, fluido se refiere a cualquier composición que pueda afluir. Fluidos por lo tanto abarca composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones similares.
Como se usa en el presente documento, un “control” o “patrón” se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de ensayo, excepto que no se trata con un parámetro de ensayo, o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no aquejado de la afección de interés. Un control también puede ser un control interno. Por ejemplo, un control puede ser una muestra, tal como un virus, que tiene una propiedad o actividad conocida.
Como se usa en el presente documento, las formas singulares “un” y “el” incluyen referentes plurales a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un” agente incluye uno o más agentes.
Como se usa en el presente documento, el término “o” se usa para indicar “y/o” a no ser que se indique explícitamente que se refiera solamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes.
Como se usa en el presente documento, los intervalos y cantidades pueden expresarse como “aproximadamente” un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, “aproximadamente 5 bases” significa “aproximadamente 5 bases” y también “5 bases”.
Como se usa en el presente documento, “opcional” u “opcionalmente” significa que el acontecimiento o la circunstancia descrita a continuación sucede o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho acontecimiento o dicha circunstancia sucede y casos en los que no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo está sustituido o no está sustituido.
Como se usa en el presente documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos están, a no ser que se indique de otro modo, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión de IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica (véase (1972) Biochem. 11: 1726).
Para mayor claridad de la divulgación, y no como limitación, la descripción detallada se divide en las siguientes subsecciones.
B. Hialuronidasa PH20
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados de acuerdo con las reivindicaciones. PH20 (también conocida como proteína de superficie de espermatozoide, molécula de adhesión de espermatozoide 1 o SPAM1) es una hialuronidasa que hidroliza hialuronano (también denominado ácido hialurónico, hialuronato o HA) hallado en tejidos conectivos tales como la matriz extracelular. Los polímeros de hialuronano están compuestos de unidades de disacáridos repetidas, ácido D-glucurónico (GlcA) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc), unidos entre sí mediante enlaces glucosídicos p-1— 4 y p-1 —>3 alternantes. Las cadenas de hialuronano pueden alcanzar aproximadamente 25.000 repeticiones de disacáridos o más de longitud, y los polímeros de hialuronano pueden variar de tamaño de aproximadamente 5.000 a 20.000.000 Da in vivo. El hialuronano, también denominado ácido hialurónico o hialuronato, es un glucosaminoglucano no sulfatado que está ampliamente distribuido por todos los tejidos conectivos, epiteliales y neurales. El hialuronano es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente importante de la barrera intersticial. PH20 es una endo-p-N-acetil-hexosaminidasa que hidroliza el enlace glucosídico p-1— 4 de ácido hialurónico en diversas longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. PH20 tiene actividades tanto hidrolítica como transglucosidasa. Además de degradar el ácido hialurónico, PH20 también puede degradar condroitín sulfatos, tales como C4-S y C6-S. PH20 puede mostrar actividad hialuronidasa a pH ácido y a pH neutro.
1. Estructura
Se ha clonado ADNc de PH20 de numerosas especies de mamífero. Los polipéptidos precursores de PH20 ejemplares, incluyen, pero sin limitación, polipéptidos de PH20 humanos (SEQ ID NO: 6), bovinos (SEQ ID NO: 15 o 17), de conejo (SEQ ID NO: 23), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 13), cobaya (SEQ ID NO: 28), rata (SEQ ID NO: 21), ratón (SEQ ID NO: 19), chimpancé (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 869) mono Rhesus (SEQ ID NO: 11), zorro (SEQ ID NO: 30), Gibón (SEQ ID NO: 856), Tití (SEQ ID NO: 858) u orangután (SEQ ID NO: 860). El transcrito de ARNm se traduce típicamente para generar una proteína precursora que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en el extremo N terminal. Después del transporte al RE, el péptido señal se retira para producir un polipéptido de PH20 maduro. Los polipéptidos de PH20 maduros ejemplares, incluyen, pero sin limitación, polipéptidos de PH20 humanos (SEQ ID n O: 7), bovinos (SEQ ID NO: 16 o 18), de conejo (Se Q ID NO: 24), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 14), cobaya (SEQ ID NO: 29), rata (SEQ ID NO: 22), ratón (s Eq ID NO: 20), chimpancé (SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 870), mono Rhesus (SEQ ID NO: 12), Zorro (SEQ ID NO: 31), Gibón (SEQ ID NO: 857), Tití (SEQ ID NO: 859) u orangután (SEQ ID NO: 861). Por ejemplo, el transcrito de ARNm de PH20 humano se traduce normalmente para generar una proteína precursora de 509 aminoácidos (SEQ ID NO: 6) que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en el extremo N terminal (posiciones de restos de aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 6). Por lo tanto, después del transporte al RE y retirada del péptido señal, se produce un polipéptido maduro de 474 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. También se conocen secuencias de PH20 de ovinos (véase por ejemplo, SEQ ID NO: 25-27).
En particular, PH20 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6. La PH20 humana madura que carece de una secuencia señal se expone en SEQ ID NO: 7. Se conocen variantes alélicas y otras variantes de PH20. Se han presentado otras secuencias de PH20. Por ejemplo, se conoce una variante de PH20 como se expone en la secuencia precursora expuesta en SEQ ID NO: 68 que contiene un Ala en la posición 48 y un Trp en la posición 499, o la secuencia madura de la misma expuesta en SEQ ID NO: 69 que contiene las diferencias correspondientes en las posiciones 13 y 464, respectivamente, en comparación con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7 (véase, por ejemplo, Gmachl et al. (1993) FEBS Lett., 336: 545-548; n.° de referencia de GenBank AAC60607). Además, se ha identificado una variante natural de PH20 que contiene una Glutamina (Gln; Q) en la posición 5 en comparación con la secuencia precursora de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 70, véase también Varela et al. (2011) Nature, 469:539-542). Otra variante natural contiene una Alanina (Ala; A) en la posición 47 en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 (como se expone en SEQ ID NO: 71) y correspondiente a la posición 12 en comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (como se expone en SEQ ID NO: 72).
La secuencia y estructura de polipéptidos de PH20 está altamente conservada. La identidad de secuencia entre y dentro de proteínas de PH20 de diversas especies es de aproximadamente 50 % a 90 %. La secuencia señal N terminal hidrófoba de 35 aminoácidos de longitud está en general conservada entre polipéptidos de hialuronidasa PH20. Las hialuronidasas PH20 contienen una región de dominio de hialuronidasa central común de aproximadamente 340 aminoácidos de longitud que corresponde a los restos de aminoácidos 38-374 de la secuencia de PH20 humana precursora expuesta en SEQ ID NO: 6. Un polipéptido de PH20 maduro que carece de la secuencia señal y que contiene una secuencia contigua de aminoácidos que tiene un resto de aminoácido C terminal correspondiente al resto de aminoácido 464 de SEQ ID NO: 6 (por ejemplo, restos de aminoácidos correspondientes a las posiciones 36-464 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6) es la secuencia mínima requerida para actividad hialuronidasa (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 10/795.095, que está expedida como Patente de Estados Unidos n.° 7.767.429; véase también Publicación de Estados Unidos n.° US20100143457).
Dentro de la región de dominio hialuronidasa común, al menos 57 aminoácidos están conservados entre y dentro de especies (véase por ejemplo, Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247: 810-814; ten Have et al. (1998) Reprod. Fertil. Dev., 10: 165-72; Chowpongpang et al. (2004) Biotechnology Letters, 26: 1247-1252). Por ejemplo, las hialuronidasas PH20 contienen 12 restos de cisteína conservados correspondientes a los restos de aminoácidos 25, 189, 203, 316, 341, 346, 352, 400, 402, 408, 423 y 429 de la secuencia de aminoácidos de una PH20 madura que carece de la secuencia señal tal como se expone en SEQ ID NO: 3 o 7 (correspondiente a los restos de aminoácidos 60, 224, 238, 351, 376, 381, 387, 435, 437, 443, 458 o 464 de PH20 humana de longitud completa expuesta en SEQ ID NO: 6). Los restos de cisteína correspondientes a 25 y 316 y restos de cisteína correspondientes a 189 y 203 forman enlaces disulfuro. Los otros restos de cisteína también forman enlaces disulfuro, están implicados en la maduración de proteína postraduccional y/o en la modulación de la actividad. Por ejemplo, cuatro enlaces disulfuro adicionales se forman entre los restos de cisteína C376 y C387; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y C464 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID NO: 6 (correspondiente a las posiciones C341 y C352; entre C346 y C400; entre C402 y C408; y entre C423 y C429 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7, respectivamente).
Los restos de aminoácidos correspondientes a los restos de aminoácidos D111, E113 y E249 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7, son restos ácidos parte del sitio activo enzimático y están conservados entre y dentro de especies de PH20. Los restos de aminoácidos R176, R246, R252 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 también están conservados entre y dentro de especies y contribuyen a la unión a sustrato y/o actividad hialuronidasa. Las mutaciones de aminoácidos D111N, E113Q, R176G, E249n y R252T dan como resultado enzimas que no tienen actividad enzimática detectable o actividad enzimática residual (véase, por ejemplo, Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247: 810-814).
Los resultados del presente documento confirman el requisito de restos de aminoácidos de PH20 correspondientes a las posiciones 25, 111, 113, 176, 189, 203, 246, 249, 252, 316, 341, 346, 352, 400, 402, 408, 423 y 429 de la secuencia de aminoácidos expuesta en una PH20 madura que carece de la secuencia señal tal como se expone en SEQ ID NO: 3 o 7 para actividad hialuronidasa, ya que la mutagénesis de estos restos da como resultado una enzima que no está activa (por ejemplo, no se expresa o está inactiva cuando se expresa, véase por ejemplo, las Tablas 5 y 10). La excepción es que el reemplazo de aminoácidos correspondiente a R176K y C316D dio como resultado mutantes que generaron algo de actividad hialuronidasa residual.
También se requiere glucosilación para actividad hialuronidasa de PH20 basándose en el motivo de reconocimiento NxS o NxT. Hay seis oligosacáridos ligados a N en restos de aminoácidos correspondientes a las posiciones N47, N131, N200, n 219, N333 y N358 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (correspondientes a los restos de aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 6). En particular, al menos los sitios de glucosilación ligados a N correspondientes a los restos de aminoácidos N200, N333 y N358 se requieren para secreción y/o actividad de la enzima (véase, por ejemplo, Pubicación de Estados Unidos n.° US20100143457). Por ejemplo, un polipéptido de PH20 que contiene mutaciones de aminoácidos N200A, N333A, N358A o N333A/N393A da como resultado proteínas inactivas. Las mutaciones individuales de sitios de glucosilación N47A, N131A, N219A, N47A/N131A, N47A/N219A, N131A/N291A conservan la actividad. El sitio de glucosilación ligado a N correspondiente al resto de aminoácido N368 de PH20 humano expuesto en SEQ ID NO: 6 está conservado entre y dentro de especies (véase, por ejemplo, Chowpongpang et al. (2004) Biotechnology Letters, 26: 1247-1252). Las hialuronidasas PH20 también contienen sitios de glusocilación ligados a O. Por ejemplo, PH20 humano tiene un oligosacárido ligado a O en el resto de aminoácido correspondiente al aminoácido al aminoácido T440 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (correspondiente al resto de aminoácido T475 en SEQ ID NO: 6).
Además de los sitios catalíticos, PH20 también contiene un sitio de unión de hialuronano. Este sitio está localizado en la región de Péptido 2, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 205-235 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 6 y las posiciones 170-200 del polipéptido maduro expuesto en SEQ iD NO: 3 o 7. Esta región está altamente conservada entre hialuronidasas y es similar al motivo de unión a heparina. La mutación del resto de arginina en la posición 176 (correspondiente al polipéptido de PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7), a una glicina da como resultado un polipéptido con solamente aproximadamente 1 % de la actividad hialuronidasa del polipéptido de tipo silvestre (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247: 810-814).
Los polipéptidos de PH20 contienen un anclaje de glucosil fosfatidilinositol (GPI) unido al extremo C terminal de la proteína que ancla la proteína a la monocapa extracelular de la membrana plasmática de células. Al menos las PH20 humanas, de mono, de ratón y de cobaya están unidas fuertemente a la membrana plasmática mediante el anclaje de GPI, que puede liberarse tratando con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC; véase por ejemplo, Lin et al. (1994) Journal of Cell Biology, 125: 1157-1163; Lin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 10071 -10075). Otras enzimas PH20, tales como pH20 bovina, están unidas débilmente a la membrana plasmática y no se anclan mediante un anclaje sensible a fosfolipasa. Como se analiza posteriormente, las formas activas solubles que, cuando se expresan, no están unidas a membrana sino que se secretan pueden generarse mediante la retirada de todo o una parte del sitio señal de unión a anclaje de GPI (véase también Patente de Estados Unidos n.° 7.767.429; Publicación de Estados Unidos n.° US20100143457). Estos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de PH20 solubles expuestos en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 o 32-66, o formas precursoras de los mismos que contienen una secuencia señal.
Las proteínas ancladas con GPI, por ejemplo PH20 humana, se traducen con un péptido señal N terminal escindible que dirige la proteína al retículo endoplásmico (RE). En el extremo C terminal de estas proteínas hay otra secuencia señal que dirige la adición de un anclaje de GPI preformado al polipéptido dentro del lumen del RE. Se produce adición del anclaje de GPI después de escisión de la parte C terminal en una posición de aminoácido específica, denomina el sitio o (típicamente localizado aproximadamente 20-30 aminoácidos del extremo C terminal). Aunque parece no haber secuencia consenso para identificar la localización del sitio o, las proteínas ancladas a GPI contienen una secuencia señal de unión de anclaje de GPI C terminal o dominio que contiene típicamente una región predominantemente hidrófoba de 8-20 aminoácidos, precedida por una región espaciadora hidrófila de 8-12 aminoácidos e inmediatamente cadena abajo del sitio o. Esta región espaciadora hidrófila es con frecuencia rica en aminoácidos con carga y prolina (White et al. (2000) J. Cell Sci. 113(Pt.4): 721-727). Hay en general una región de aproximadamente 11 aminoácidos antes de la posición o-1 que se caracteriza por una baja cantidad de la estructura secundaria predicha, una región alrededor del sitio de escisión (sitio o), de o-1 a o+2 que se caracteriza por la presencia de restos de cadena lateral pequeños, la región espaciadora entre las posiciones o+3 y o+9 y una cola hidrófoba de o+10 al extremo C terminal (Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9: 392).
Aunque no hay ninguna secuencia señal consenso de unión a anclaje de GPI, se han desarrollado diversos métodos por ordenador y algoritmos que pueden usarse para identificar dichas secuencias en polipéptidos (véase, por ejemplo, Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250: 571-582; Eisenhaber et al. (1999) J. Mol. Chem. 292: 741­ 758; Kronegg y Buloz, (1999), “Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)”, 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser et al. (2005) Bioinformatics 21: 1846-1852; Omaetxebarria et al. (2007) Proteomics 7: 1951-1960; Pierleoni et al. (2008) BMC Bioinformatics 9: 392), incluyendo los que ya están disponibles en sitios web bioinformáticos, tales como el sitio de herramientas Proteómicas ExPASy (expasy.ch/tools/). Por lo tanto, un experto en la materia puede determinar si un polipéptido de PH20 probablemente contenga una secuencia señal de unión a anclaje a GPI y, por lo tanto, si el polipéptido de PH20 es una proteína anclada a GPI.
La unión covalente de un anclaje de GPI con el extremo C terminal de PH20 humana y, por lo tanto, la naturaleza unida a membrana de PH20, se ha confirmado usando estudios de hidrólisis de fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) (véase por ejemplo, Lin et al., (1994) J. Biol. Chem. 125: 1157-1163). La fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) y D (PI-PLD) hidrolizan el anclaje de GPI, liberando el polipéptido de PH20 de la membrana celular. La bibliografía de la técnica anterior indica que se ha identificado un sitio de escisión de sitio o de PH20 humana entre Ser-490 y Ala-491 y para PH20 de mono se identifica entre Ser491 y Thr492 (Lin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci, (1993) 90: 10071-10075). Por lo tanto, la bibliografía indica que una secuencia señal de unión a anclaje de GPI de PH20 humana se localiza en las posiciones de aminoácidos 491-509 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 6, y el sitio o es la posición de aminoácido 490. Por lo tanto, en esta modelización de PH20 humana, los aminoácidos 491-509 se escinden después del transporte al RE y un anclaje de GPI está unido covalentemente con el resto de serina en la posición 490.
2. Función
PH20 se expresa normalmente en espermatozoide de un gen específico de testículo individual. PH20 es una proteína asociada a espermatozoide implicada en la fertilización. PH20 se localiza normalmente en la superficie de espermatozoide y en el acrosoma derivado de lisosoma, donde se une con la membrana acrosómica interna. PH20 es multifuncional y muestra actividad hialuronidasa, actividad de señalización celular mediada por hialuronano (HA) y actúa como un receptor de espermatozoide para la zona pelúcida que rodea al oocito cuando está presente en espermatozoide que ha reaccionado con acrosoma (RA). Por ejemplo, PH20 está implicado de forma natural en la adhesión espermatozoide-óvulo y ayuda a la penetración por el espermatozoide de la capa de células del cumulus digiriendo ácido hialurónico. Además de ser una hialuronidasa, PH20 también parece ser un receptor para la señalización celular inducida por HA, y un receptor para la zona pelúcida que rodea al oocito. Debido al papel de PH20 en la fertilización, puede usarse PH20 como un antígeno para inmunoanticoncepción.
PH20 es una hialuronidasa activa neutra, aunque puede mostrar actividad activa frente a ácidos en algunos casos. La actividad hialuronidasa de PH20 se muestra por la PH20 asociada a membrana acrosómica interna y membrana plasmática. La PH20 de membrana plasmática muestra actividad hialuronidasa solamente a pH neutro, mientras que la PH20 asociada a membrana acrosómica interna muestra actividad enzimática activa frente a ácido. La base estructural para estas diferencias se debe a la presencia de dos sitios catalíticos en PH20. Un primer sitio catalítico se designa como la región de Péptido 1, correspondiente a los restos de aminoácidos 142-172 de SEQ ID NO: 6, que está implicado en la actividad enzimática de PH20 a pH neutro. Un segundo sitio catalítico se designa como la región de péptido 3, correspondiente a los restos de aminoácido 277-297 de SEQ ID NO: 6, que está implicada en la actividad enzimática a pH menor. Se produce un cambio en la estructura de la PH20 asociada a membrana acrosómica interna después de la reacción de acrosoma, por lo que PH20 se escinde endoproteolíticamente pero se mantiene unida por enlaces disulfuro. El resultado de la endoproteólisis es que la región de péptido 3 se activa y puede por lo tanto efectuar actividad neutra y ácida a PH20 (véase por ejemplo, Cherr et al. (2001) Matrix Biology, 20: 515-525). Además, después de la reacción de acrosoma, se generan formas de menor peso molecular por liberación de la membrana acrosómica interna (por ejemplo, se genera una forma soluble de 53 kDa de PH20 en monos). La forma o las formas del menor peso molecular también son activas frente a ácidos.
La actividad hialuronidasa de PH20 explica la actividad de propagación observada en extractos de testículos animales que se han usado clínicamente durante décadas para aumentar la dispersión y absorción de fármacos (véase, por ejemplo, Bookbinder et al. (2006) J Controlled Release, 114: 230-241). Por ejemplo, se han desarrollado preparaciones farmacéuticas que contienen hialuronidasa como extractos fraccionados de testículos bovinos para uso terapéutico como agentes de propagación y en otras aplicaciones (Schwartzman (1951) J. Pedia!, 39: 491-502). Las preparaciones de extractos testiculares bovinos originales incluyeron, por ejemplo, extractos comercializados con los nombres comerciales Wydase®, Hylase®, “Dessau”, Neopermease®, Alidase® y Hyazyme®. Se sabe ahora que la actividad de propagación de preparaciones de extractos testiculares se debe a la actividad hialuronidasa PH20. Por ejemplo, en 2001 se identificó una hialuronidasa de espermatozoide en toro como la hialuronidasa PH20 (Lalancette et al. (2001) Biol. Reprod., 65: 628-36). Catalizando la hidrólisis del ácido hialurónico, la hialuronidasa PH20 reduce la viscosidad de ácido hialurónico, aumentando de este modo la permeabilidad tisular. Por lo tanto, se usan formas solubles de PH20 como un agente de propagación o dispersión junto con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y suministro, y para mejorar el perfil de farmacocinética y farmacodinámica del agente, fármaco o proteína coadministrado (véase por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 7.767.429; Bookbinder et al. (2006) J Controlled Release, 114: 230-241).
3. Polipéptidos de PH20 solubles
PH20 puede existir en forma unida a membrana o asociada a membrana, o puede secretarse al medio cuando se exprese a partir de células, y por lo tanto puede existir en forma soluble. PH20 soluble puede detectarse y diferenciarse de PH20 insoluble, unida a membrana usando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, los que usan un ensayo de Triton® X-114. En este ensayo, las hialuronidasas PH20 solubles se dividen a la fase acuosa de una solución de Triton® X-114 calentada a 37 °C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256: 1604-7) mientras que las hialuronidasas PH20 ancladas a membrana se dividen a la fase rica en detergente. Por lo tanto, además de usar algoritmos para evaluar si un polipéptido de PH20 está anclado a GPI de forma natural y por lo tanto unido a membrana, pueden realizarse también experimentos de solubilidad.
Las enzimas PH20 solubles incluyen hialuronidasas que contienen una secuencia señal de unión a anclaje de GPI, pero que están unidas débilmente a la membrana de modo que no contienen un anclaje sensible a fosfolipasa. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 solubles incluyen PH20 ovina o bovina. Se han preparado diversas formas de hialuronidasas PH20 solubles tales y se han aprobado para su uso terapéutico en sujetos, incluyendo seres humanos. Por ejemplo, las preparaciones de hialuronidasa derivadas de animales incluyen Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular ovina purificada, y Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular bovina.
Las enzimas PH20 solubles también incluyen forman truncadas de hialuronidasas PH20 asociadas a membrana humanas o no humanas que carecen de uno o más restos de aminoácidos de una secuencia señal de unión a anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) y conservan la actividad hialuronidasa (véase por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 7.767.429; Publicación de Estados Unidos n.° US20100143457). Por lo tanto, en lugar de tener un anclaje de GPI unido covalentemente al extremo C terminal de la proteína en el RE y anclarse a la monocapa extracelular de la membrana plasmática, estos polipéptidos se secretan cuando se expresan a partir de células y son solubles. En casos en los que la enzima degradante de hialuronano soluble conserva una parte de la secuencia señal de unión a anclaje de GPI, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos de aminoácidos en la secuencia señal de unión a anclaje de GPI puede conservarse, siempre que el polipéptido sea soluble (es decir, se secrete cuando se exprese a partir de células) y activo.
Las hialuronidasas solubles ejemplares que están truncadas en el extremo C terminal y carecen de toda o una parte de la secuencia señal de unión a anclaje de GPI incluyen, pero sin limitación, polipéptidos de PH20 de origen primate, tales como, por ejemplo, polipéptidos de PH20 humanos y de chimpancé. Por ejemplo, pueden prepararse polipéptidos de PH20 solubles mediante truncamiento C terminal de un polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 7, 10, 12, 14, 69, 72, 857, 859, 861 u 870 o variantes de las mismas que muestran al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 10, 12, 14, 69, 72, 857, 859, 861 u 870, donde el polipéptido resultante es activo, soluble y carece de todos o una parte de los restos de aminoácidos de la secuencia señal de unión a anclaje de GPI.
Son polipéptidos de PH20 solubles ejemplares los polipéptidos de PH20 humanos truncados C terminales que son maduros (que carecen de una secuencia señal), solubles y muestran actividad neutra, y que contienen una secuencia contigua de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 que tiene mínimamente un resto de aminoácido truncado en el extremo C terminal o después del resto de aminoácido 464 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 solubles incluyen polipéptidos truncados en el extremo C terminal que contienen mínimamente una secuencia contigua de los aminoácidos 36-464 of SEQ ID NO: 6, o incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 %, por ejemplo al menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % de identidad de secuencia con una secuencia contigua de aminoácidos que tiene un resto de aminoácido C terminal después del aminoácido 464 de SEQ ID NO: 6 y conserva actividad hialuronidasa. Son polipéptidos de PH20 humanos truncados en el extremo C terminal ejemplares polipéptidos maduros (que carecen de una secuencia señal) que incluyen una secuencia contigua de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 con un resto C terminal después de 464 tal como después de la posición de aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, o una variante de la misma que muestra al menos 85 % de identidad de secuencia, tal como al menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % de identidad de secuencia con la misma y conserva actividad hialuronidasa. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 C terminales ejemplares tienen una secuencia de aminoácidos de 36 a 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481,482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, o una variante de la misma que muestra al menos 85 % de identidad de secuencia, tal como al menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % de identidad de secuencia con la misma y conserva actividad hialuronidasa. Los polipéptidos de PH20 solubles incluyen cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 32-66 o una secuencia de aminoácidos que muestre al menos 85 % de identidad de secuencia, tal como al menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3 o 32-66.
En particular, un polipéptido de PH20 humano soluble es un polipéptido que está truncado después del aminoácido 482 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6. Dicho polipéptido puede generarse a partir de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia señal y codifica los aminoácidos 36-482, por ejemplo, como se expone en SEQ ID NO: 1 (que contiene una secuencia señal de IgG kappa) o SEQ ID NO: 67 (que contiene la secuencia señal nativa). El procesamiento postraduccional retira la secuencia señal, dejando una PH20 humana recombinante soluble de 447 aminoácidos (SEQ ID NO: 3). Un producto producido tras la expresión de un vector expuesto en SEQ ID NO: 4 o 5, y que contiene una molécula de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 67, da como resultado un producto secretado, designado rHuPH20, en el medio de cultivo que muestra heterogeneidad en el extremo C terminal de modo que el producto incluye una mezcla de especies que puede incluir una cualquiera o más de SEQ ID NO: 3 y 44-48 en diversa abundancia. Típicamente, rHuPH20 se produce en células que facilitan la glucosilación N correcta para conservar actividad, tales como células de mamífero, por ejemplo células CHO (por ejemplo, células CHO DG44). Hylenex® (Halozyme) es una hialuronidasa recombinante humana producida por células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas por ingeniería genética que contienen ácido nucleico que codifica un polipéptido de PH20 humano truncado (designado rHuPH20).
C. POLIPÉPTIDOS DE PH20 MODIFICADOS
Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados o variantes de acuerdo con las reivindicaciones. Los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento muestran actividades o propiedades alteradas en comparación con un polipéptido de PH20 de referencia. Entre los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento se incluyen polipéptidos de PH20 que son mutantes activos, por lo que los polipéptidos muestran al menos 40 % de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene la modificación de aminoácido (por ejemplo, reemplazo de aminoácido). En particular, se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 que muestran actividad hialuronidasa y que muestran estabilidad aumentada en comparación con la PH20 que no contiene la modificación de aminoácidos. También se describen polipéptidos de PH20 modificados que están inactivos y que pueden usarse, por ejemplo, como antígenos en vacunas de anticoncepción.
Las modificaciones pueden ser una única modificación de aminoácido, tal como reemplazos de aminoácidos individuales (sustituciones), inserciones o supresiones, o múltiples modificaciones de aminoácidos, tales como múltiples reemplazos, inserciones o supresiones de aminoácidos. Son modificaciones ejemplares reemplazos de aminoácidos, incluyendo reemplazos de aminoácidos individuales o múltiples. El reemplazo de aminoácidos puede ser una sustitución conservativa, tal como se expone en la Tabla 2, o una sustitución no conservativa, tal como cualquiera descrita en el presente documento. Los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento pueden contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más posiciones modificadas en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene la modificación.
Las modificaciones descritas en el presente documento pueden estar en cualquier polipéptido de PH20, incluyendo, formas precursoras, maduras o truncadas en el extremo C terminal, siempre que la forma modificada muestre actividad hialuronidasa. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 contienen modificaciones en comparación con un polipéptido de PH20 de tipo silvestre, nativo o de referencia expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870, o en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 65%, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870. Por ejemplo, las modificaciones se realizan en un polipéptido de PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 72; un polipéptido de PH20 bovino que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 16 o 18; un polipéptido de p H20 de conejo que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 24, un polipéptido de PH20 de mono Cynomolgus que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 14; un polipéptido de p H20 de cobaya que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 29, un polipéptido de PH20 de rata que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 22; un polipéptido de PH20 de ratón que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 20; un polipéptido de PH20 de chimpancé que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 10 u 870; un polipéptido de PH20 de mono Rhesus que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 12; un polipéptido de PH20 de Zorro que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 31; un polipéptido de PH20 de Gibón que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 857; un polipéptido de PH20 de Tití que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 859; un polipéptido de PH20 de Orangután que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 861; o un polipéptido de PH20 de oveja que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o expuesta en SEQ ID NO: 25-27; o en variantes de secuencia o variantes truncadas que muestran al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24-27, 29, 31, 69, 72, 857, 859, 861 u 870.
En particular, se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 que contienen modificaciones comparadas con un polipéptido de p H20 expuesto en SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 68 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72. Por ejemplo, las modificaciones descritas en el presente documento también pueden realizarse en un polipéptido de PH20 expuesto como SEQ ID NO: 10, 12, 14, 24, 857, 859, 861 u 870.
En particular, se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 que son polipéptidos de PH20 que contienen una modificación descrita en el presente documento, y que cuando se expresan a partir de células se secretan al medio como una proteína soluble. Por ejemplo, las modificaciones se realizan en un polipéptido de PH20 soluble que está truncado en el extremo C terminal dentro de o cerca de la parte C terminal que contiene la secuencia señal de anclaje de GPI de un polipéptido de PH20 que contiene una secuencia señal de anclaje de GPI. El truncamiento C terminal puede ser un truncamiento o una supresión de 8 aminoácidos contiguos del extremo C terminal, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos en el extremo C terminal, siempre que el polipéptido truncado en el extremo C terminal resultante muestre actividad hialuronidasa y se secrete a partir de células (por ejemplo, el medio) cuando se exprese. En algunos ejemplos, las modificaciones descritas en el presente documento se realizan en un polipéptido de PH20 que es un polipéptido truncado en el extremo C terminal de SEQ ID NO: 7, 10, 12, 14, 69, 72, 857, 859, 861 u 870 o una variante del mismo que muestra al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 10, 12, 14, 69, 72, 857, 859, 861 u 870. En particular, las modificaciones proporcionadas en el presente documento se realizan en un polipéptido de PH20 humano truncado en el extremo C terminal o soluble que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento contienen reemplazos de aminoácidos o sustituciones, adiciones o supresiones, truncamientos o combinaciones de los mismos en referencia al polipéptido de PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3.
También pueden realizarse modificaciones en la forma precursora correspondiente que contiene un péptido señal de cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24-27, 29, 31, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861 u 870. Por ejemplo, pueden realizarse modificaciones descritas en el presente documento en una forma precursora expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 28, 30, 856, 858, 860 u 869 o en una variante de la misma que muestra al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 28, 30, 856, 858, 860 u 869.
En ejemplos de polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento, el polipéptido de PH20 modificado no contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-66, 68-72, 856­ 861, 869 u 870. Típicamente, el polipéptido de PH20 es un polipéptido de PH20 humano, y no contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 8-31, 856-861, 869 u 870.
En general, cualquier modificación, tal como un reemplazo, una supresión o una sustitución de aminoácidos, puede realizarse en un polipéptido de PH20, a condición de que la modificación no sea un reemplazo de aminoácido donde la única modificación sea un reemplazo de un único aminoácido que sea V12A, N47A, D111N, E113Q, N131A, R176G, N200A, N219A, E249Q, R252T, N333A o N358A. Además, cuando el polipéptido de PH20 modificado contiene solamente dos reemplazos de aminoácidos, los reemplazos de aminoácidos no son P13A/L464W, N47A/N131A, N47A/N219A, N131A/N219A o N333A/N358A. En un ejemplo adicional, cuando el polipéptido de PH20 modificado contiene solamente tres reemplazos de aminoácidos, los reemplazos de aminoácidos no son N47A/N131A/N219A. Se describen en detalle posteriormente modificaciones ejemplares descritas en el presente documento.
Para fines del presente documento, las referencias a posiciones y aminoácidos para modificación en el presente documento, incluyendo reemplazo o reemplazos de aminoácidos, son en referencia al polipéptido de PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3. Está dentro del nivel de un experto en la materia realizar cualquiera de las modificaciones descritas en el presente documento en otro polipéptido de PH20 identificando el resto de aminoácido correspondiente en otro polipéptido de PH20, tal como cualquiera expuesto en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24-27, 28, 29, 30, 31, 32-66, 68-72, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 869 u 870 o una variante del mismo que muestra al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24-27, 28, 29, 30, 31, 32-66, 68-72, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 869 u 870. Pueden identificarse posiciones correspondientes en otro polipéptido de PH20 mediante alineamiento del polipéptido de PH20 con la referencia al polipéptido de PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la Figura 2 representa el elemento de polipéptidos de PH20 ejemplares con SEQ ID NO: 3, y la identificación de posiciones correspondientes ejemplares. Además, ya que SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 y 72 son todos formas de una PH20 humana madura con un resto de aminoácido C terminal diferente, la numeración de restos de aminoácidos en cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 32-66, 69 y 72 es la misma que SEQ ID NO: 3, y por lo tanto los restos correspondientes de cada uno son idénticos a los expuestos en SEQ ID NO: 3 (véase por ejemplo, Figura 1). Además, las SEQ ID NO expuestas en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 70 o 71 son formas precursoras de las mismas que difieren en solamente la presencia de una secuencia señal. Para fines de modificación (por ejemplo, reemplazo de aminoácidos), el resto de aminoácido correspondiente puede ser cualquier resto de aminoácido, y no es necesario que sea idéntico al resto expuesto en SEQ ID NO: 3. Típicamente, el resto de aminoácido correspondiente identificado por alineamiento con restos en SEQ ID NO: 3 es un resto de aminoácido que es idéntico a SEQ ID NO: 3, o es un resto de aminoácido conservativo o semi-conservativo para el mismo (véase por ejemplo, la Figura 2). También se entiende que los reemplazos ejemplares proporcionados en el presente documento pueden realizarse en el resto correspondiente en un polipéptido de PH20, siempre que el reemplazo sea diferente al que existe en la forma no modificada del polipéptido de PH20. Basándose en esta descripción y la descripción de otra parte del presente documento, está dentro del nivel de un experto en la materia generar un polipéptido de PH20 modificado que contiene una cualquiera o más de la mutación descrita, y ensayar cada uno con respecto a una propiedad o actividad como se describe en el presente documento.
También pueden realizarse modificaciones en un polipéptido de PH20 a un polipéptido de PH20 que también contiene otras modificaciones, incluyendo modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones que no están en la secuencia primaria del polipéptido. Por ejemplo, las modificaciones descritas en el presente documento pueden estar en un polipéptido de PH20 que está en un polipéptido de fusión o un polipéptido quimérico. Los polipéptidos de PH20 modificados de acuerdo con las reivindicaciones también incluyen polipéptidos que están conjugados con un polímero, tal como un reactivo de PEG.
También se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de PH20 según las reivindicaciones. En ejemplos particulares, la secuencia de ácido nucleico puede tener codones optimizados, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. El uso codónico particular depende del organismo hospedador en el que se exprese el polipéptido modificado. Un experto habitual en la materia está familiarizado con codones óptimos para expresión en células de mamífero o humanas, bacterias o levaduras, incluyendo por ejemplo E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, la información de uso codónico está disponible de la Base de Datos de Uso Codónico disponible en kazusa.or.jp.codon (véase Richmond (2000) Genome Biology, 1:reports241 para una descripción de la base de datos). Véase también, Forsburg (1994) Yeast, 10: 1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19: 4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Res., 12: 8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78). En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico codificantes también pueden modificarse para contener una secuencia señal heteróloga para alterar (por ejemplo, aumentar) la expresión y secreción del polipéptido. Es un ejemplo de una secuencia señal heteróloga un ácido nucleico que codifica la secuencia señal de IgG kappa (expuesta en SEQ ID NO: 868).
Los polipéptidos modificados y moléculas de ácido nucleico codificantes proporcionadas en el presente documento pueden producirse por técnicas de ADN recombinante convencionales conocidas por los expertos en la materia. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para efectuar mutación de uno cualquiera o más aminoácidos en una proteína diana. Los métodos incluyen mutagénesis dirigida o aleatoria convencional de moléculas de ácido nucleico codificantes, o métodos de síntesis de polipéptidos de fase sólida. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de PH20 pueden someterse a mutagénesis, tal como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico codificante, PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida, PCR solapante, redistribución génica u otros métodos recombinantes. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos puede después introducirse en una célula hospedadora para expresarse de forma heteróloga. Por lo tanto, también se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados según las reivindicaciones. En algunos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados se producen de forma sintética, tal como usando síntesis peptídica de fase sólida o de fase en solución.
En las subsecciones posteriores, se describen polipéptidos de PH20 modificados ejemplares que muestran propiedades y actividades alteradas, y que codifican moléculas de ácido nucleico.
1. Mutantes activos
Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 y que muestran actividad hialuronidasa. Los polipéptidos de PH20 modificados pueden mostrar de 40 % a 5000 % de la actividad hialuronidasa de un polipéptido de PH20 de tipo silvestre o de referencia, tal como el polipéptido expuesto en las SEQ ID NO: 3 o 7. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento muestran al menos 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200 %, 300 %, 400%, 500 %, 600%, 700 %, 800 %, 900%, 1000 %, 2000%, 3000 % o más de la actividad hialuronidasa de un polipéptido de PH20 de tipo silvestre o de referencia según las reivindicaciones, tal como el polipéptido correspondiente que no contiene la modificación de aminoácido (por ejemplo, reemplazo de aminoácido), por ejemplo, un polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7. Por ejemplo, las posiciones ejemplares que pueden modificarse, por ejemplo por reemplazo o sustitución de aminoácidos, incluyen, pero sin limitación, cualquiera de las posiciones correspondientes a la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,
51, 52, 54, 58, 59, 60, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91,
92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 110, 114, 117, 118, 119, 120, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 186, 192, 193, 195, 196, 197, 198, 200, 202, 204, 205, 206, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 224, 226, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 245, 247, 248, 251, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 297, 298, 300, 301, 302, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 331, 334, 335, 338, 339, 342, 343, 347, 348, 349, 351, 353, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 367, 368, 369, 371, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 383, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 401, 403, 404, 405, 406, 407, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 425, 426, 427, 428, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446 o 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Típicamente, el resto de aminoácido que está modificado (por ejemplo, reemplazado con otro aminoácido) en la posición correspondiente a cualquiera de las posiciones anteriores en un polipéptido de PH20 es un resto idéntico, un resto conservado o un resto de aminoácido semi-conservativo con respecto al resto de aminoácido expuesto en SEQ ID NO: 3.
Para conservar la actividad hialuronidasa, no se realizan típicamente modificaciones en las posiciones que son menos tolerantes al cambio o requeridas para actividad hialuronidasa. Por ejemplo, no se realizan modificaciones en general en una posición correspondiente a la posición 7, 16, 17, 18, 19, 21, 25, 53, 55, 56, 57, 62, 64, 76, 78, 80, 88, 95, 100, 101, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 121, 123, 126, 129, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 194, 199, 201, 203, 207, 210, 223, 225, 227, 228, 229, 241, 243, 244, 246, 249, 250, 252, 254, 262, 268, 282, 295, 296, 298, 299, 303, 319, 322, 329, 330, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 346, 350, 352, 354, 355, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 372, 382, 384, 386, 390, 400, 402, 408, 423, 424, 429, 430, 431, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Además, en ejemplos donde se realizan modificaciones en cualquiera de las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 22, 23, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
, 157, , 182,
3, 284, , 312, 8, 349,
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3, 385,
referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, la modificación o las modificaciones no son el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos correspondientes expuestas en la Tabla 5 o 10 en el presente documento, que son reemplazos de aminoácidos que dan como resultado un polipéptido inactivo. Por ejemplo, si la modificación es una modificación en una posición correspondiente a la posición 2 en referencia a SEQ ID NO: 3, la modificación no es reemplazo a una histidina (H), lisina (K), triptófano (W) o tirosina (Y).
Se exponen reemplazos de aminoácidos ejemplares en cualquiera de las posiciones correspondientes en la Tabla 3.
La referencia a la posición de aminoácido correspondiente en la Tabla 3 es en referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO: 3. Se entiende que los reemplazos pueden realizarse en la posición correspondiente en otro polipéptido de PH20 mediante alineamiento con el mismo con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 (véase por ejemplo, Figura 1 y 2), por lo que la posición correspondiente es la posición alineada. En ejemplos particulares, el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos pueden estar en la posición correspondiente en un polipéptido de PH20 como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870 o una variante del mismo que tiene al menos 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el mismo, siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante muestre al menos 40 % de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácido. En particular, el reemplazo o los reemplazos pueden estar en una posición correspondiente en un polipéptido de PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o una variante del mismo que muestra al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72. En un ejemplo, uno cualquiera o más de los reemplazos están en SEQ ID NO: 3, siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante muestre al menos 40 % de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3.
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O Ora
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En ejemplos particulares, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo o reemplazos de aminoácidos en una posición o posiciones correspondientes a 1, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 58, 59, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 82, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 94, 97, 102, 104, 107, 114, 118, 120, 127, 128, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 174, 175, 178, 179, 193, 195, 196, 198, 204, 205, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 220, 221, 222, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 240, 247, 248, 249, 257, 258, 259, 260, 261,263, 267, 269, 271, 272, 273, 274, 276, 277, 278, 279, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 293, 298, 305, 307, 308, 309, 310, 313, 314, 315, 317, 318, 320, 321, 324, 325, 326, 328, 335, 347, 349, 351, 353, 356, 359, 367, 368, 369, 371, 373, 374, 375, 376, 377, 380, 381, 383, 385, 389, 392, 393, 395, 396, 399, 401, 404, 405, 406, 407, 409, 410, 412, 416, 418, 419, 421, 425, 427, 428, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446 o 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden ser reemplazos en posiciones correspondientes a reemplazo de Leucina (L) en la posición 1 (L1), P6, V7, I9, P10, N11, V12, F14, L15, A20, S22, F24, L26, G27, K28, F29, D30, E31, P32, L33, D34, M35, S36, L37, F38, S39, F40, I41, I46, N47, A48, T49, G50, G52, V58, D59, Y63, I67, D68, S69, I70, T71, G72, V73, T74, V75, I79, K82, I83, S84, G86, D87, L89, D90, A92, K93, K94, T97, V102, N104, M107, E114, T118, A120, D127, V128, K130, N131, R132, E135, Q138, Q139, Q140, N141, V142, Q143, L144, L146, T147, E148, A149, T150, E151, K152, Q155, E156, E158, A160, K162, D163, F164, L165, V166, E167, 1169, K170, G172, K173, L174, L175, N178, H179, H193, K195, K196, G198, F204, N205, V206, K209, D212, D213, S215, N219, E220, S221, T222, T232, Q233, Q234, S235, P236, V237, A238, T240, V247, R248, E249, P257, D258, A259, K260, S261, L263, A267, T269, I271, V272, F273, T274, Q276, V277, L278, K279, S282, Q283, E285, V287, T289, G291, E292, T293, A298, G305, L307, S308, I309, M310, M313, K314, S315, L317, L318, D320, N321, E324, T325, I326, N328, T335, Q347, Q349, V351, I353, N356, S359, P367, D368, N369, A371, Q373, L374, E375, K376, G377, F380, T381, R383, K385, E389, E392, Q393, S395, E396, Y399, S401, S404, T405, L406, S407, K409, E410, A412, D416, D418, A419, D421, A425, G427, A428, D431, F433, P436, P437, M438, E439, T440, E441, E442, P443, Q444, I445, F446 o Y447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Los reemplazos de aminoácidos ejemplares en los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, reemplazo con: histidina (H) en una posición correspondiente a la posición 1; A en una posición correspondiente a la posición 1; E en una posición correspondiente a la posición 1; G en una posición correspondiente a la posición 1; K en una posición correspondiente a la posición 1; Q en una posición correspondiente a la posición 1; R en una posición correspondiente a la posición 1; A en una posición correspondiente a la posición 6; M en una posición correspondiente a la posición 8; Q en una posición correspondiente a la posición 9; G en una posición correspondiente a la posición 10; H en una posición correspondiente a la posición 10 S en una posición correspondiente a la posición 11; E en una posición correspondiente a la posición 12 I en una posición correspondiente a la posición 12; K en una posición correspondiente a la posición 12 T en una posición correspondiente a la posición 12; V en una posición correspondiente a la posición 14 V en una posición correspondiente a la posición 15; M en una posición correspondiente a la posición 15 S en una posición correspondiente a la posición 20; T en una posición correspondiente a la posición 22; E en una posición correspondiente a la posición 24; H en una posición correspondiente a la posición 24; R en una posición correspondiente a la posición 24; A en una posición correspondiente a la posición 26; E en una posición correspondiente a la posición 26; K en una posición correspondiente a la posición 26; M en una posición correspondiente a la posición 26; Q en una posición correspondiente a la posición 26; R en una posición correspondiente a la posición 26; D en una posición correspondiente a la posición 27; K en una posición correspondiente a la posición 27; R en una posición correspondiente a la posición 27; R en una posición correspondiente a la posición 28; E en una posición correspondiente a la posición 29; I en una posición correspondiente a la posición 29; K en una posición correspondiente a la posición 29; L en una posición correspondiente a la posición 29; M en una posición correspondiente a la posición 29; P en una posición correspondiente a la posición 29; R en una posición correspondiente a la posición 29; S en una posición correspondiente a la posición 29; T en una posición correspondiente a la posición 29; V en una posición correspondiente a la posición 29; G en una posición correspondiente a la posición 30; H en una posición correspondiente a la posición 30; K en una posición correspondiente a la posición 30; L en una posición correspondiente a la posición 30; M en una posición correspondiente a la posición 30; R en una posición correspondiente a la posición 30; S en una posición correspondiente a la posición 30; A en una posición correspondiente a la posición 31; C en una posición correspondiente a la posición 31 G en una posición correspondiente a la posición 31; H en una posición correspondiente a la posición 31 I en una posición correspondiente a la posición 31; K en una posición correspondiente a la posición 31 L en una posición correspondiente a la posición 31; P en una posición correspondiente a la posición 31 R en una posición correspondiente a la posición 31; S en una posición correspondiente a la posición 31 T en una posición correspondiente a la posición 31; V en una posición correspondiente a la posición 31 W en una posición correspondiente a la posición 31; C en una posición correspondiente a la posición 32; F en una posición correspondiente a la posición 32; G en una posición correspondiente a la posición 32; H en una posición correspondiente a la posición 32; W en una posición correspondiente a la posición 33; G en una posición correspondiente a la posición 33; W en una posición correspondiente a la posición 34; Q en una posición correspondiente a la posición 35; V en una posición correspondiente a la posición 35; H en una posición correspondiente a la posición 36; N en una posición correspondiente a la posición 36 F en una posición correspondiente a la posición 37; M en una correspondiente a la posición 37 Y en una posición correspondiente a la posición 38; A en una correspondiente a la posición 39 L en una posición correspondiente a la posición 39; N en una correspondiente a la posición 39 T en una posición correspondiente a la posición 39; L en una correspondiente a la posición 40 T en una posición correspondiente a la posición 41; L en una correspondiente a la posición 46 R en una posición correspondiente a la posición 46; D en una correspondiente a la posición 47 F en una posición correspondiente a la posición 47; T en una correspondiente a la posición 47; W en una posición correspondiente a la posición 47 con F en una correspondiente a la posición 48 H en una posición correspondiente a la posición 48; K en una correspondiente a la posición 48 N en una posición correspondiente a la posición 48; R en una correspondiente a la posición 49 D en una posición correspondiente a la posición 50; S en una correspondiente a la posición 50 M en una posición correspondiente a la posición 50; N en una correspondiente a la posición 52 Q en una posición correspondiente a la posición 52; R en una correspondiente a la posición 52 S en una posición correspondiente a la posición 52; T en una correspondiente a la posición 52 C en una posición correspondiente a la posición 58; K en una correspondiente a la posición 58 L en una posición correspondiente a la posición 58; P en una correspondiente a la posición 58 Q en una posición correspondiente a la posición 58; R en una correspondiente a la posición 58 H en una posición correspondiente a la posición 58; N en una correspondiente a la posición 58 Y en una posición correspondiente a la posición 58; N en una correspondiente a la posición 59 K en una posición correspondiente a la posición 63; L en una correspondiente a la posición 63 M en una posición correspondiente a la posición 63; R en una correspondiente a la posición 63; W en una posición correspondiente a la posición 63; V en una correspondiente a la posición 67 H en una posición correspondiente a la posición 68; P en una correspondiente a la posición 68 ; Q en una posición correspondiente a la posición 68; A en una correspondiente a la posición 69 C en una posición correspondiente a la posición 69; E en una correspondiente a la posición 69 F en una posición correspondiente a la posición 69; G en una correspondiente a la posición 69 ; I en una posición correspondiente a la posición 69; L en una correspondiente a la posición 69 M en una posición correspondiente a la posición 69; P en una correspondiente a la posición 69 R en una posición correspondiente a la posición 69; T en una correspondiente a la posición 69; W en una posición correspondiente a la posición 69; Y en una correspondiente a la posición 69 A en una posición correspondiente a la posición 70; C en una correspondiente a la posición 70 F en una posición correspondiente a la posición 70; G en una correspondiente a la posición 70 H en una posición correspondiente a la posición 70; K en una correspondiente a la posición 70 L en una posición correspondiente a la posición 70; N en una correspondiente a la posición 70 P en una posición correspondiente a la posición 70; R en una correspondiente a la posición 70 S en una posición correspondiente a la posición 70; T en una correspondiente a la posición 70 V en una posición correspondiente a la posición 70; Y en una correspondiente a la posición 70 G en una posición correspondiente a la posición 71; N en una correspondiente a la posición 71 R en una posición correspondiente a la posición 71; S en una correspondiente a la posición 71 K en una posición correspondiente a la posición 72; M en una correspondiente a la posición 72 ; Q en una posición correspondiente a la posición 72; A en una correspondiente a la posición 73 H en una posición correspondiente a la posición 73; K en una correspondiente a la posición 73 L en una posición correspondiente a la posición 73; Q en una correspondiente a la posición 73 R en una posición correspondiente a la posición 73; T en una correspondiente a la posición 73; W en una posición correspondiente a la posición 73; A en una correspondiente a la posición 74 C en una posición correspondiente a la posición 74; E en una correspondiente a la posición 74 F en una posición correspondiente a la posición 74; G en una correspondiente a la posición 74 H en una posición correspondiente a la posición 74; K en una correspondiente a la posición 74 L en una posición correspondiente a la posición 74; M en una correspondiente a la posición 74 N en una posición correspondiente a la posición 74; P en una correspondiente a la posición 74 R en una posición correspondiente a la posición 74; S en una correspondiente a la posición 74; V en una posición correspondiente a la posición 74; W en una correspondiente a la posición 74 F en una posición correspondiente a la posición 75; L en una correspondiente a la posición 75 M en una posición correspondiente a la posición 75; R en una correspondiente a la posición 75 T en una posición correspondiente a la posición 75; L en una correspondiente a la posición 79 L en una posición correspondiente a la posición 82; N en una correspondiente a la posición 82 V en una posición correspondiente a la posición 83; Q en una correspondiente a la posición 83 S en una posición correspondiente a la posición 83; G en una correspondiente a la posición 83 E en una posición correspondiente a la posición 84; F en una correspondiente a la posición 84 G en una posición correspondiente a la posición 84; N en una correspondiente a la posición 84 R en una posición correspondiente a la posición 84; A en una correspondiente a la posición 86 H en una posición correspondiente a la posición 86; K en una correspondiente a la posición 86 N en una posición correspondiente a la posición 86; S en una correspondiente a la posición 86 T en una posición correspondiente a la posición 86; W en una correspondiente a la posición 86 C en una posición correspondiente a la posición 87; G en una correspondiente a la posición 87 L en una posición correspondiente a la posición 87; M en una correspondiente a la posición 87; R en una posición correspondiente a la posición 87; S en una posición correspondiente a la posición 87; T en una posición correspondiente a la posición 87; V en una posición correspondiente a la posición 87; Y en una posición correspondiente a la posición 87; C en una posición correspondiente a la posición 89; A en una posición correspondiente a la posición 90; E en una posición correspondiente a la posición 90; H en una posición correspondiente a la posición 90; K en una posición correspondiente a la posición 90; N en una posición correspondiente a la posición 90; R en una posición correspondiente a la posición 90; C en una posición correspondiente a la posición 92; L en una posición correspondiente a la posición 92; I en una posición correspondiente a la posición 93; L en una posición correspondiente a la posición 93; Q en una posición correspondiente a la posición 93; R en una posición correspondiente a la posición 93; S en una posición correspondiente a la posición 93; T en una posición correspondiente a la posición 93; D en una posición correspondiente a la posición 94; Q en una posición correspondiente a la posición 94; R en una posición correspondiente a la posición 94; A en una posición correspondiente a la posición 97; C en un resto de aminoácido correspondiente a la posición 97; D en una posición correspondiente a la posición 97; E en una posición correspondiente a la posición 97; G en una posición correspondiente a la posición 97; L en una posición correspondiente a la posición 97; S en una posición correspondiente a la posición 97; S en una posición correspondiente a la posición 102; T en una posición correspondiente a la posición 102 R en una posición correspondiente a la posición 104; L en una posición correspondiente a la posición 107 A en una posición correspondiente a la posición 114; Q en una posición correspondiente a la posición 118 H en una posición correspondiente a la posición 120; F en una posición correspondiente a la posición 120; I en una posición correspondiente a la posición 120; S en una posición correspondiente a la posición 120 V en una posición correspondiente a la posición 120; Y en una posición correspondiente a la posición 120 E en una posición correspondiente a la posición 127; H en una posición correspondiente a la posición 127 N en una posición correspondiente a la posición 127; Q en una posición correspondiente a la posición 127 ; R en una posición correspondiente a la posición 127 I en una posición correspondiente a la posición 128 R en una posición correspondiente a la posición 130; G en una posición correspondiente a la posición 131 ; I en una posición correspondiente a la posición 131; M en una posición correspondiente a la posición 131 ; Q en una posición correspondiente a la posición 131; R en una posición correspondiente a la posición 131 V en una posición correspondiente a la posición 131; N en una posición correspondiente a la posición 132 L en una posición correspondiente a la posición 132; D en una posición correspondiente a la posición 135 G en una posición correspondiente a la posición 135; R en una posición correspondiente a la posición 135, con L en una posición correspondiente a la posición 138 ; T en una posición correspondiente a la posición 139 K en una posición correspondiente a la posición 140; H en una posición correspondiente a la posición 141 R en una posición correspondiente a la posición 141; S en una posición correspondiente a la posición 141 W en una posición correspondiente a la posición 141; Y en una posición correspondiente a la posición 141 D en una posición correspondiente a la posición 142; G en una posición correspondiente a la posición 142 K en una posición correspondiente a la posición 142; N en una posición correspondiente a la posición 142 P en una posición correspondiente a la posición 142; Q en una posición correspondiente a la posición 142 R en una posición correspondiente a la posición 142; S en una posición correspondiente a la posición 142 T en una posición correspondiente a la posición 142; G en una posición correspondiente a la posición 143 K en una posición correspondiente a la posición 143; R en una posición correspondiente a la posición 144 T en una posición correspondiente a la posición 144; P en una posición correspondiente a la posición 146 R en una posición correspondiente a la posición 146; A en una posición correspondiente a la posición 147 F en una posición correspondiente a la posición 147; L en una posición correspondiente a la posición 147 R en una posición correspondiente a la posición 147; S en una posición correspondiente a la posición 147 V en una posición correspondiente a la posición 147; H en una posición correspondiente a la posición 148 K en una posición correspondiente a la posición 148; Q en una posición correspondiente a la posición 148; T en una posición correspondiente a la posición 149; V en una posición correspondiente a la posición 149 A en una posición correspondiente a la posición 150; D en una posición correspondiente a la posición 150 G en una posición correspondiente a la posición 150; N en una posición correspondiente a la posición 150 S en una posición correspondiente a la posición 150; W en una posición correspondiente a la posición 150 Y en una posición correspondiente a la posición 150; A en una posición correspondiente a la posición 151 H en una posición correspondiente a la posición 151; K en una posición correspondiente a la posición 151 L en una posición correspondiente a la posición 151; M en una posición correspondiente a la posición 151 ; Q en una posición correspondiente a la posición 151; R en una posición correspondiente a la posición 151 S en una posición correspondiente a la posición 151; T en una posición correspondiente a la posición 151 ; V en una posición correspondiente a la posición 151; W en una posición correspondiente a la posición 151 Y en una posición correspondiente a la posición 151; R en una posición correspondiente a la posición 152 T en una posición correspondiente a la posición 152; W en una posición correspondiente a la posición 152 D en una posición correspondiente a la posición 155; G en una posición correspondiente a la posición 155 K en una posición correspondiente a la posición 155; R en una posición correspondiente a la posición 155 D en una posición correspondiente a la posición 156; Q en una posición correspondiente a la posición 158 S en una posición correspondiente a la posición 158; S en una posición correspondiente a la posición 160 E en una posición correspondiente a la posición 162; A en una posición correspondiente a la posición 163 E en una posición correspondiente a la posición 163; K en una posición correspondiente a la posición 163; Q en una posición correspondiente a la posición 163; R en una posición correspondiente a la posición 163 S en una posición correspondiente a la posición 163; M en una posición correspondiente a la posición 164 V en una posición correspondiente a la posición 164; D en una posición correspondiente a la posición 165 F en una posición correspondiente a la posición 165; N en una posición correspondiente a la posición 165 S en una posición correspondiente a la posición 165; V en una posición correspondiente a la posición 165 A en una posición correspondiente a la posición 166; E en una posición correspondiente a la posición 166 F en una posición correspondiente a la posición 166; H en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 166; Q en una posición correspondiente a la posición 166 R en una posición correspondiente a la posición 166; T en una posición correspondiente a la posición 166 W en una posición correspondiente a la posición 166; Y en una posición correspondiente a la posición 166 D en una posición correspondiente a la posición 167; L en una posición correspondiente a la posición 169 R en una posición correspondiente a la posición 170; A en una posición correspondiente a la posición 172 R en una posición correspondiente a la posición 173; G en una posición correspondiente a la posición 174 K en una posición correspondiente a la posición 174; N en una posición correspondiente a la posición 174 R en una posición correspondiente a la posición 174; T en una posición correspondiente a la posición 174 T en una posición correspondiente a la posición 175; K en una posición correspondiente a la posición 178 R en una posición correspondiente a la posición 178; K en una posición correspondiente a la posición 179 Q en una posición correspondiente a la posición 193; T en una posición correspondiente a la posición 195; N en una posición correspondiente a la posición 195; con E en una posición correspondiente a la posición 196; R en una posición correspondiente a la posición 196; con D en una posición correspondiente a la posición 198 P en una posición correspondiente a la posición 204; A en una posición correspondiente a la posición 205 E en una posición correspondiente a la posición 205; L en una posición correspondiente a la posición 205 T en una posición correspondiente a la posición 205; I en una posición correspondiente a la posición 206 K en una posición correspondiente a la posición 206; L en una posición correspondiente a la posición 206; R en una posición correspondiente a la posición 206; R en una posición correspondiente a la posición 209 N en una posición correspondiente a la posición 212; S en una posición correspondiente a la posición 212; A en una posición correspondiente a la posición 213; M en una posición correspondiente a la posición 213 N en una posición correspondiente a la posición 213; H en una posición correspondiente a la posición 215; M en una posición correspondiente a la posición 215; A en una posición correspondiente a la posición 219 I en una posición correspondiente a la posición 219; K en una posición correspondiente a la posición 219 S en una posición correspondiente a la posición 219; H en una posición correspondiente a la posición 220 I en una posición correspondiente a la posición 220; L en una posición correspondiente a la posición 220; V en una posición correspondiente a la posición 220; Q en una posición correspondiente a la posición 221 G en una posición correspondiente a la posición 222; F en una posición correspondiente a la posición 232; G en una posición correspondiente a la posición 233; K en una posición correspondiente a la posición 233; R en una posición correspondiente a la posición 233; M en una posición correspondiente a la posición 234 A en una posición correspondiente a la posición 235; R en una posición correspondiente a la posición 236 C en una posición correspondiente a la posición 237; E en una posición correspondiente a la posición 237; H en una posición correspondiente a la posición 237; Q en una posición correspondiente a la posición 237 T en una posición correspondiente a la posición 237; E en una posición correspondiente a la posición 238; H en una posición correspondiente a la posición 238; S en una posición correspondiente a la posición 238; A en una posición correspondiente a la posición 240; Q en una posición correspondiente a la posición 240 I en una posición correspondiente a la posición 247; A en una posición correspondiente a la posición 248; V en una posición correspondiente a la posición 249; G en una posición correspondiente a la posición 257 T en una posición correspondiente a la posición 257; R en una posición correspondiente a la posición 257 N en una posición correspondiente a la posición 258; S en una posición correspondiente a la posición 258; P en una posición correspondiente a la posición 259; M en una posición correspondiente a la posición 260 Y en una posición correspondiente a la posición 260; A en una posición correspondiente a la posición 261 K en una posición correspondiente a la posición 261; N en una posición correspondiente a la posición 261 K en una posición correspondiente a la posición 263; R en una posición correspondiente a la posición 263 T en una posición correspondiente a la posición 267; A en una posición correspondiente a la posición 269 L en una posición correspondiente a la posición 271; M en una posición correspondiente a la posición 271 D en una posición correspondiente a la posición 272; T en una posición correspondiente a la posición 272 H en una posición correspondiente a la posición 273; Y en una posición correspondiente a la posición 273 F en una posición correspondiente a la posición 274; D en una posición correspondiente a la posición 276; H en una posición correspondiente a la posición 276; M en una posición correspondiente a la posición 276 R en una posición correspondiente a la posición 276; S en una posición correspondiente a la posición 276 Y en una posición correspondiente a la posición 276; A en una posición correspondiente a la posición 277 E en una posición correspondiente a la posición 277; H en una posición correspondiente a la posición 277; K en una posición correspondiente a la posición 277; M en una posición correspondiente a la posición 277; N en una posición correspondiente a la posición 277; Q en una posición correspondiente a la posición 277 R en una posición correspondiente a la posición 277; S en una posición correspondiente a la posición 277 T en una posición correspondiente a la posición 277; E en una posición correspondiente a la posición 278 F en una posición correspondiente a la posición 278; G en una posición correspondiente a la posición 278 H en una posición correspondiente a la posición 278; K en una posición correspondiente a la posición 278; N en una posición correspondiente a la posición 278; R en una posición correspondiente a la posición 278 S en una posición correspondiente a la posición 278; T en una posición correspondiente a la posición 278 Y en una posición correspondiente a la posición 278; H en una posición correspondiente a la posición 279; M en una posición correspondiente a la posición 282 S en una posición correspondiente a la posición 283 H en una posición correspondiente a la posición 285 T en una posición correspondiente a la posición 287 S en una posición correspondiente a la posición 289 S en una posición correspondiente a la posición 291 V en una posición correspondiente a la posición 291 C en una posición correspondiente a la posición 292 F en una posición correspondiente a la posición 292; H en una posición correspondiente a la posición 292 K en una posición correspondiente a la posición 292 R en una posición correspondiente a la posición 292 V en una posición correspondiente a la posición 292 A en una posición correspondiente a la posición 293 C en una posición correspondiente a la posición 293 D en una posición correspondiente a la posición 293 F en una posición correspondiente a la posición 293 K en una posición correspondiente a la posición 293; M en una posición correspondiente a la posición 293 P en una posición correspondiente a la posición 293 Q en una posición correspondiente a la posición 293 V en una posición correspondiente a la posición 293 Y en una posición correspondiente a la posición 293; G en una posición correspondiente a la posición 298 E en una posición correspondiente a la posición 305; G en una posición correspondiente a la posición 307; D en una posición correspondiente a la posición 308; G en una posición correspondiente a la posición 308 K en una posición correspondiente a la posición 308 N en una posición correspondiente a la posición 308 R en una posición correspondiente a la posición 308 E en una posición correspondiente a la posición 309; G en una posición correspondiente a la posición 309 H en una posición correspondiente a la posición 309 L en una posición correspondiente a la posición 309; M en una posición correspondiente a la posición 309; N en una posición correspondiente a la posición 309; Q en una posición correspondiente a la posición 309 R en una posición correspondiente a la posición 309 S en una posición correspondiente a la posición 309 T en una posición correspondiente a la posición 309 V en una posición correspondiente a la posición 309 A en una posición correspondiente a la posición 310 G en una posición correspondiente a la posición 310 Q en una posición correspondiente a la posición 310 S en una posición correspondiente a la posición 310 A en una posición correspondiente a la posición 313 G en una posición correspondiente a la posición 313 H en una posición correspondiente a la posición 313 K en una posición correspondiente a la posición 313 P en una posición correspondiente a la posición 313 R en una posición correspondiente a la posición 313 T en una posición correspondiente a la posición 313 Y en una posición correspondiente a la posición 313; con S en una posición correspondiente a la posición 314; Y en una posición correspondiente a la posición 314 A en una posición correspondiente a la posición 315 H en una posición correspondiente a la posición 315 Y en una posición correspondiente a la posición 315 A en una posición correspondiente a la posición 317 I en una posición correspondiente a la posición 317 K en una posición correspondiente a la posición 317; N en una posición correspondiente a la posición 317 Q en una posición correspondiente a la posición 317 R en una posición correspondiente a la posición 317 S en una posición correspondiente a la posición 317 T en una posición correspondiente a la posición 317; W en una posición correspondiente a la posición 317 D en una posición correspondiente a la posición 318 H en una posición correspondiente a la posición 318; K en una posición correspondiente a la posición 318 M en una posición correspondiente a la posición 318 R en una posición correspondiente a la posición 318 H en una posición correspondiente a la posición 320 K en una posición correspondiente a la posición 320 R en una posición correspondiente a la posición 320 R en una posición correspondiente a la posición 321 S en una posición correspondiente a la posición 321 N en una posición correspondiente a la posición 324 R en una posición correspondiente a la posición 324 A en una posición correspondiente a la posición 325 D en una posición correspondiente a la posición 325 E en una posición correspondiente a la posición 325; G en una posición correspondiente a la posición 325 H en una posición correspondiente a la posición 325 K en una posición correspondiente a la posición 325; M en una posición correspondiente a la posición 325 N en una posición correspondiente a la posición 325 Q en una posición correspondiente a la posición 325 S en una posición correspondiente a la posición 325 V en una posición correspondiente a la posición 325 L en una posición correspondiente a la posición 326 V en una posición correspondiente a la posición 326 C en una posición correspondiente a la posición 328 G en una posición correspondiente a la posición 328; I en una posición correspondiente a la posición 328 K en una posición correspondiente a la posición 328 L en una posición correspondiente a la posición 328 S en una posición correspondiente a la posición 328 Y en una posición correspondiente a la posición 328 S en una posición correspondiente a la posición 335 A en una posición correspondiente a la posición 347 G en una posición correspondiente a la posición 347 S en una posición correspondiente a la posición 347; M en una posición correspondiente a la posición 349 R en una posición correspondiente a la posición 349 S en una posición correspondiente a la posición 351 V en una posición correspondiente a la posición 353; con H en una posición correspondiente a la posición 356; S en una posición correspondiente a la posición 356 E en una posición correspondiente a la posición 359 H en una posición correspondiente a la posición 359 T en una posición correspondiente a la posición 359 A en una posición correspondiente a la posición 367 G en una posición correspondiente a la posición 367 K en una posición correspondiente a la posición 367 S en una posición correspondiente a la posición 367 A en una posición correspondiente a la posición 368 E en una posición correspondiente a la posición 368 K en una posición correspondiente a la posición 368; L en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 368; M en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 368; R en una posición correspondiente a la posición 368; T en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 368; H en una posición correspondiente a la posición 369; R en una posición correspondiente a la posición 369; F en una posición correspondiente a la posición 371; H en una posición correspondiente a la posición 371; K en una posición correspondiente a la posición 371; L en una posición correspondiente a la posición 371; R en una posición correspondiente a la posición 371; S en una posición correspondiente a la posición 371 M en una posición correspondiente a la posición 373; H en correspondiente a la posición 374 P en una posición correspondiente a la posición 374; A en correspondiente a la posición 375 G en una posición correspondiente a la posición 375; K en correspondiente a la posición 375 R en una posición correspondiente a la posición 375; D en correspondiente a la posición 376 E en una posición correspondiente a la posición 376; Q en correspondiente a la posición 376 R en una posición correspondiente a la posición 376; T en correspondiente a la posición 376 V en una posición correspondiente a la posición 376; Y en correspondiente a la posición 376 D en una posición correspondiente a la posición 377; E en correspondiente a la posición 377 H en una posición correspondiente a la posición 377; K en correspondiente a la posición 377 P en una posición correspondiente a la posición 377; R en correspondiente a la posición 377 S en una posición correspondiente a la posición 377; T en correspondiente a la posición 377 W en una posición correspondiente a la posición 380; Y en correspondiente a la posición 380 S en una posición correspondiente a la posición 381 I en correspondiente a la posición 383 K en una posición correspondiente a la posición 383; L en correspondiente a la posición 383 S en una posición correspondiente a la posición 383; A en correspondiente a la posición 385 Q en una posición correspondiente a la posición 385; V en correspondiente a la posición 385 A en una posición correspondiente a la posición 389; G en correspondiente a la posición 389 L en una posición correspondiente a la posición 389; K en correspondiente a la posición 389 Q en una posición correspondiente a la posición 389; S en correspondiente a la posición 389 A en una posición correspondiente a la posición 392; F en correspondiente a la posición 392 M en una posición correspondiente a la posición 392; Q en correspondiente a la posición 392 R en una posición correspondiente a la posición 392; V en correspondiente a la posición 392 F en una posición correspondiente a la posición 393; M en correspondiente a la posición 393 A en una posición correspondiente a la posición 395; H en correspondiente a la posición 395 R en una posición correspondiente a la posición 395; A en correspondiente a la posición 396 H en una posición correspondiente a la posición 396; Q en correspondiente a la posición 396 S en una posición correspondiente a la posición 396; K en correspondiente a la posición 399 M en una posición correspondiente a la posición 399; T en correspondiente a la posición 399 V en una posición correspondiente a la posición 399; W en correspondiente a la posición 399 A en una posición correspondiente a la posición 401; E en correspondiente a la posición 401 A en una posición correspondiente a la posición 404; G en correspondiente a la posición 405 F en una posición correspondiente a la posición 406; N en correspondiente a la posición 406 A en una posición correspondiente a la posición 407; D en correspondiente a la posición 407 E en una posición correspondiente a la posición 407; F en correspondiente a la posición 407 H en una posición correspondiente a la posición 407; Q en correspondiente a la posición 407 P en una posición correspondiente a la posición 407; A en correspondiente a la posición 409 Q en una posición correspondiente a la posición 409; T en correspondiente a la posición 410 Q en una posición correspondiente a la posición 412; R en correspondiente a la posición 412 V en una posición correspondiente a la posición 412; L en correspondiente a la posición 416 E en una posición correspondiente a la posición 418; L en correspondiente a la posición 418 P en una posición correspondiente a la posición 418; R en correspondiente a la posición 418 V en una posición correspondiente a la posición 418; F en correspondiente a la posición 419 H en una posición correspondiente a la posición 419 I en correspondiente a la posición 419 K en una posición correspondiente a la posición 419; R en correspondiente a la posición 419 S en una posición correspondiente a la posición 419; Y en correspondiente a la posición 419 A en una posición correspondiente a la posición 421; H en correspondiente a la posición 421 K en una posición correspondiente a la posición 421; N en correspondiente a la posición 421 Q en una posición correspondiente a la posición 421; R en correspondiente a la posición 421 S en una posición correspondiente a la posición 421; G en correspondiente a la posición 425 K en una posición correspondiente a la posición 425; Q en correspondiente a la posición 427 T en una posición correspondiente a la posición 427; L en correspondiente a la posición 428 A en una posición correspondiente a la posición 431; G en correspondiente a la posición 431 E en una posición correspondiente a la posición 431; H en correspondiente a la posición 431 K en una posición correspondiente a la posición 431; L en correspondiente a la posición 431 N en una posición correspondiente a la posición 431; Q en correspondiente a la posición 431 R en una posición correspondiente a la posición 431; S en correspondiente a la posición 431 V en una posición correspondiente a la posición 431; A en correspondiente a la posición 433 H en una posición correspondiente a la posición 433 I en correspondiente a la posición 433 K en una posición correspondiente a la posición 433; L en correspondiente a la posición 433 R en una posición correspondiente a la posición 433; T en correspondiente a la posición 433 V en una posición correspondiente a la posición 433; W en correspondiente a la posición 433 K en una posición correspondiente a la posición 436 I en correspondiente a la posición 437 M en una posición correspondiente a la posición 437; A en correspondiente a la posición 438 D en una posición correspondiente a la posición 438; E en correspondiente a la posición 438 L en una posición correspondiente a la posición 438; N en correspondiente a la posición 438 T en una posición correspondiente a la posición 438; A en correspondiente a la posición 439; C en una posición correspondiente a la posición 439; K en una posición correspondiente a la posición 439; P en una posición correspondiente a la posición 439; Q en una posición correspondiente a la posición 439; T en una posición correspondiente a la posición 439; V en una posición correspondiente a la posición 439; D en una posición correspondiente a la posición 440; H en una posición correspondiente a la posición 440; M en una posición correspondiente a la posición 440; P en una posición correspondiente a la posición 440; R en una posición correspondiente a la posición 440; S en una posición correspondiente a la posición 440; A en una posición correspondiente a la posición 441; F en una posición correspondiente a la posición 441; C en una posición correspondiente a la posición 442; G en una posición correspondiente a la posición 442; R en una posición correspondiente a la posición 442; A en una posición correspondiente a la posición 443; E en una posición correspondiente a la posición 443; F en una posición correspondiente a la posición 443; G en una posición correspondiente a la posición 443; M en una posición correspondiente a la posición 443; N en una posición correspondiente a la posición 443; E en una posición correspondiente a la posición 444; H en una posición correspondiente a la posición 444; V en una posición correspondiente a la posición 444; H en una posición correspondiente a la posición 445; M en una posición correspondiente a la posición 445; N en una posición correspondiente a la posición 445; P en una posición correspondiente a la posición 445; Q en una posición correspondiente a la posición 445; S en una posición correspondiente a la posición 445; T en una posición correspondiente a la posición 445; V en una posición correspondiente a la posición 445; W en una posición correspondiente a la posición 445; A en una posición correspondiente a la posición 446; M en una posición correspondiente a la posición 446; W en una posición correspondiente a la posición 446; D en una posición correspondiente a la posición 447; E en una posición correspondiente a la posición 447; G en una posición correspondiente a la posición 447 I en una posición correspondiente a la posición 447; N en una posición correspondiente a la posición 447; P en una posición correspondiente a la posición 447; Q en una posición correspondiente a la posición 447; T en una posición correspondiente a la posición 447, y/o reemplazo con V en una posición correspondiente a la posición 447, cada una en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Son ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 74-855, o que tenga una secuencia de aminoácidos que muestre al menos 68 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 74-855 y contenga el reemplazo de aminoácido y muestre actividad hialuronidasa.
Cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados anteriores descritos en el presente documento pueden mostrar propiedades o actividades alteradas, tales como mejoradas o aumentadas, en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene la modificación de aminoácido (por ejemplo, reemplazo de aminoácido). Por ejemplo, las actividades o propiedades alteradas pueden ser una actividad catalítica aumentada y/o una estabilidad aumentada en condiciones desnaturalizantes.
a. Actividad aumentada
Se proporciona en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados o variantes que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 y que muestran actividad hialuronidasa aumentada en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos. En particular, los polipéptidos de PH20 modificados o variantes proporcionados en el presente documento muestran actividad hialuronidasa aumentada en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácidos, por ejemplo, el polipéptido de p H20 expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66 y en particular el polipéptido de Ph 20 expuesto en SEQ ID NO: 3.
De acuerdo con las reivindicaciones, el polipéptido de PH20 modificado puede mostrar actividad hialuronidasa que es al menos 120%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200 %, 250%, 300 %, 350 %, 400 %, 500%, 1500%, 2000 %, 3000 %, 4000 %, 5000 % de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos, en las mismas condiciones. Por ejemplo, la actividad hialuronidasa aumenta al menos o aproximadamente al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces o más.
En ejemplos particulares, los polipéptidos de PH20 modificados contienen un reemplazo de aminoácido en una o más posiciones de aminoácidos identificadas como asociadas con actividad hialuronidasa aumentada. Como se describe en el presente documento, tales posiciones se han identificado usando mutagénesis y métodos de selección o exploración para identificar las posiciones que dan como resultado actividad hialuronidasa aumentada. El polipéptido de PH20 también puede contener otras modificaciones, tales como otros reemplazos de aminoácidos, que solos no están asociados con actividad aumentada siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante muestre actividad hialuronidasa aumentada en comparación con la PH20 que no contiene la modificación o las modificaciones de aminoácidos, tales como reemplazo o reemplazos de aminoácidos. El polipéptido de PH20 modificado proporcionado en el presente documento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 reemplazos de aminoácidos. También pueden incluirse modificaciones adicionales, tales como inserciones o supresiones. El reemplazo o los reemplazos pueden estar en un polipéptido de PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66.
Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento contienen un reemplazo de aminoácido (sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 1, 12, 15, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 39, 46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97, 118, 120, 127, 131, 135, 141, 142, 147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263, 269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 291, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359, 371, 377, 380, 389, 392, 395, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 o 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden ser reemplazos en posiciones correspondientes al reemplazo de Leucina (L) en la posición 1 (L1), V12, L15, F24, L26, G27, F29, D30, E31, P32, L33, L37, S39, I46, A48, G52, V58, Y63, I67, D68, S69, I70, T71, G72, V73, T74, V75, S84, G86, D87, A92, K93, K94, T97, T118, A120, D127, N131, E135, N141, V142, T147, E148, T150, E151, K152, Q155, E156, D163, F164, L165, V166, I169, K170, L174, G198, V206, K209, D212, D213, S215, N219, Q233, Q234, P236, A238, V247, P257, A259, K260, S261, L263, T269, I271, V272, Q276, V277, L278, S282, G291, T293, G305, S308, I309, M310, M313, S315, L317, L318, D320, E324, T325, I326, N328, Q347, I353, S359, A371, G377, F380, E389, E392, S395, Y399, T405, S407, K409, E410, D418, A419, D421, A425, D431, F433, P436, P437, M438, E439, T440, E441, E442, P443, I445, F446 o Y447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Son ejemplos de dichos polipéptidos de PH20 modificados los polipéptidos que muestran al menos 1,5 veces o más la actividad del polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácido.
Los ejemplos de reemplazos de aminoácidos en los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, reemplazos: con histidina (H) en una posición correspondiente a la posición 1; Q en una posición correspondiente a la posición 1; E en una posición correspondiente a la posición 12; T en una posición correspondiente a la posición 12; V en una posición correspondiente a la posición 15; E en una posición correspondiente a la posición 24 H en una posición correspondiente a la posición 24; E en una posición correspondiente a la posición 26 K en una posición correspondiente a la posición 26; K en una posición correspondiente a la posición 27 R en una posición correspondiente a la posición 27; E en una posición correspondiente a la posición 29 I en una posición correspondiente a la posición 29; L en una posición correspondiente a la posición 29; M en una posición correspondiente a la posición 29; P en una posición correspondiente a la posición 29 S en una posición correspondiente a la posición 29; V en una posición correspondiente a la posición 29; G en una posición correspondiente a la posición 30; H en una posición correspondiente a la posición 30; K en una posición correspondiente a la posición 30; M en una posición correspondiente a la posición 30 R en una posición correspondiente a la posición 30; S en una posición correspondiente a la posición 30 A en una posición correspondiente a la posición 31; C en una posición correspondiente a la posición 31 H en una posición correspondiente a la posición 31 I en una posición correspondiente a la posición 31 K en una posición correspondiente a la posición 31; L en una posición correspondiente a la posición 31 P en una posición correspondiente a la posición 31; R en una posición correspondiente a la posición 31 S en una posición correspondiente a la posición 31; T en una posición correspondiente a la posición 31 V en una posición correspondiente a la posición 31; F en una posición correspondiente a la posición 32; G en una posición correspondiente a la posición 32; H en una posición correspondiente a la posición 32; W en una posición correspondiente a la posición 33; F en una posición correspondiente a la posición 37 N en una posición correspondiente a la posición 39; T en una posición correspondiente a la posición 39 R en una posición correspondiente a la posición 46; F en una posición correspondiente a la posición 48; H en una posición correspondiente a la posición 48; N en una posición correspondiente a la posición 48 Q en una posición correspondiente a la posición 52; K en una posición correspondiente a la posición 58; Q en una posición correspondiente a la posición 58; W en una posición correspondiente a la posición 63 V en una posición correspondiente a la posición 67; H en una posición correspondiente a la posición 68 Q en una posición correspondiente a la posición 68; A en una posición correspondiente a la posición 69 C en una posición correspondiente a la posición 69; F en una posición correspondiente a la posición 69 G en una posición correspondiente a la posición 69 I en una posición correspondiente a la posición 69 L en una posición correspondiente a la posición 69; M en una posición correspondiente a la posición 69 P en una posición correspondiente a la posición 69; R en una posición correspondiente a la posición 69; W en una posición correspondiente a la posición 69; Y en una posición correspondiente a la posición 69 A en una posición correspondiente a la posición 70; C en una posición correspondiente a la posición 70 F en una posición correspondiente a la posición 70; G en una posición correspondiente a la posición 70 H en una posición correspondiente a la posición 70; K en una posición correspondiente a la posición 70 L en una posición correspondiente a la posición 70; N en una posición correspondiente a la posición 70 P en una posición correspondiente a la posición 70; R en una posición correspondiente a la posición 70 S en una posición correspondiente a la posición 70; T en una posición correspondiente a la posición 70 V en una posición correspondiente a la posición 70; R en una posición correspondiente a la posición 71 S en una posición correspondiente a la posición 71; M en una posición correspondiente a la posición 72; Q en una posición correspondiente a la posición 72; H en una posición correspondiente a la posición 73; L en una posición correspondiente a la posición 73; W en una posición correspondiente a la posición 73; A en una posición correspondiente a la posición 74; C en una posición correspondiente a la posición 74; G en una posición correspondiente a la posición 74; N en una posición correspondiente a la posición 74; P en una posición correspondiente a la posición 74; R en una posición correspondiente a la posición 74; S en una posición correspondiente a la posición 74; V en una posición correspondiente a la posición 74; W en una posición correspondiente a la posición 74; F en una posición correspondiente a la posición 75; L en una posición correspondiente a la posición 75; R en una posición correspondiente a la posición 75; T en una posición correspondiente a la posición 75; G en una posición correspondiente a la posición 84; R en una posición correspondiente a la posición 84; A en una posición correspondiente a la posición 86; C en una posición correspondiente a la posición 87; T en una posición correspondiente a la posición 87; Y en una posición correspondiente a la posición 87; C en una posición correspondiente a la posición 92 I en una posición correspondiente a la posición 93; L en una posición correspondiente a la posición 93; R en una posición correspondiente a la posición 93; T en una posición correspondiente a la posición 93; R en una posición correspondiente a la posición 94; G en una posición correspondiente a la posición 97; Q en una posición correspondiente a la posición 118 F en una posición correspondiente a la posición 120 V en una posición correspondiente a la posición 120 Y en una posición correspondiente a la posición 120 H en una posición correspondiente a la posición 127 N en una posición correspondiente a la posición 127 G en una posición correspondiente a la posición 131 R en una posición correspondiente a la posición 131 V en una posición correspondiente a la posición 131 D en una posición correspondiente a la posición 135 G en una posición correspondiente a la posición 135 R en una posición correspondiente a la posición 135, con H en una posición correspondiente a la posición 141; Y en una posición correspondiente a la posición 141 R en una posición correspondiente a la posición 142 R en una posición correspondiente a la posición 147 V en una posición correspondiente a la posición 147 K en una posición correspondiente a la posición 148 G en una posición correspondiente a la posición 150 K en una posición correspondiente a la posición 151 L en una posición correspondiente a la posición 151 M en una posición correspondiente a la posición 151 ; Q en una posición correspondiente a la posición 151 R en una posición correspondiente a la posición 151 R en una posición correspondiente a la posición 152 G en una posición correspondiente a la posición 155 K en una posición correspondiente a la posición 155 D en una posición correspondiente a la posición 156 A en una posición correspondiente a la posición 163 E en una posición correspondiente a la posición 163 K en una posición correspondiente a la posición 163 R en una posición correspondiente a la posición 163 M en una posición correspondiente a la posición 164 D en una posición correspondiente a la posición 165 N en una posición correspondiente a la posición 165 A en una posición correspondiente a la posición 166 F en una posición correspondiente a la posición 166 H en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 166 Q en una posición correspondiente a la posición 166 R en una posición correspondiente a la posición 166 T en una posición correspondiente a la posición 166 Y en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 169 R en una posición correspondiente a la posición 170 K en una posición correspondiente a la posición 174 D en una posición correspondiente a la posición 198 K en una posición correspondiente a la posición 206 L en una posición correspondiente a la posición 206; N en una posición correspondiente a la posición 212 M en una posición correspondiente a la posición 213 N en una posición correspondiente a la posición 213 M en una posición correspondiente a la posición 215 S en una posición correspondiente a la posición 219 ; K en una posición correspondiente a la posición 233 R en una posición correspondiente a la posición 233 M en una posición correspondiente a la posición 234 R en una posición correspondiente a la posición 236 E en una posición correspondiente a la posición 237 S en una posición correspondiente a la posición 238; I en una posición correspondiente a la posición 247 T en una posición correspondiente a la posición 257 P en una posición correspondiente a la posición 259 Y en una posición correspondiente a la posición 260 K en una posición correspondiente a la posición 261 N en una posición correspondiente a la posición 261 K en una posición correspondiente a la posición 263 R en una posición correspondiente a la posición 263 A en una posición correspondiente a la posición 269 L en una posición correspondiente a la posición 271 M en una posición correspondiente a la posición 271 T en una posición correspondiente a la posición 272 D en una posición correspondiente a la posición 276 S en una posición correspondiente a la posición 276 Y en una posición correspondiente a la posición 276 K en una posición correspondiente a la posición 277 R en una posición correspondiente a la posición 277 T en una posición correspondiente a la posición 277 H en una posición correspondiente a la posición 278 K en una posición correspondiente a la posición 278 N en una posición correspondiente a la posición 278 R en una posición correspondiente a la posición 278 S en una posición correspondiente a la posición 278 T en una posición correspondiente a la posición 278 Y en una posición correspondiente a la posición 278; M en una posición correspondiente a la posición 282 V en una posición correspondiente a la posición 291 A en una posición correspondiente a la posición 293 C en una posición correspondiente a la posición 293 F en una posición correspondiente a la posición 293 M en una posición correspondiente a la posición 293 P en una posición correspondiente a la posición 293 ; Q en una posición correspondiente a la posición 293 V en una posición correspondiente a la posición 293 E en una posición correspondiente a la posición 305; G en una posición correspondiente a la posición 308 N en una posición correspondiente a la posición 308 E en una posición correspondiente a la posición 309 L en una posición correspondiente a la posición 309; N en una posición correspondiente a la posición 309 ; Q en una posición correspondiente a la posición 309 R en una posición correspondiente a la posición 309 T en una posición correspondiente a la posición 309 A en una posición correspondiente a la posición 310; G en una posición correspondiente a la posición 310; K en una posición correspondiente a la posición 313; R en una posición correspondiente a la posición 313; H en una posición correspondiente a la posición 315; I en una posición correspondiente a la posición 317; K en una posición correspondiente a la posición 317; R en una posición correspondiente a la posición 317; M en una posición correspondiente a la posición 318; H en una posición correspondiente a la posición 320; K en una posición correspondiente a la posición 320; R en una posición correspondiente a la posición 320; R en una posición correspondiente a la posición 324; A en una posición correspondiente a la posición 325; D en una posición correspondiente a la posición 325; E en una posición correspondiente a la posición 325; G en una posición correspondiente a la posición 325; H en una posición correspondiente a la posición 325; K en una posición correspondiente a la posición 325; M en una posición correspondiente a la posición 325; N en una posición correspondiente a la posición 325; Q en una posición correspondiente a la posición 325; S en una posición correspondiente a la posición 325; V en una posición correspondiente a la posición 326 I en una posición correspondiente a la posición 328; K en una posición correspondiente a la posición 328; L en una posición correspondiente a la posición 328; S en una posición correspondiente a la posición 328; Y en una posición correspondiente a la posición 328; G en una posición correspondiente a la posición 347; S en una posición correspondiente a la posición 347; V en una posición correspondiente a la posición 353; con T en una posición correspondiente a la posición 359; R en una posición correspondiente a la posición 371; P en una posición correspondiente a la posición 377; T en una posición correspondiente a la posición 377; W en una posición correspondiente a la posición 380; Y en una posición correspondiente a la posición 380; K en una posición correspondiente a la posición 389; M en una posición correspondiente a la posición 392; R en una posición correspondiente a la posición 395; M en una posición correspondiente a la posición 399; T en una posición correspondiente a la posición 399; W en una posición correspondiente a la posición 399; G en una posición correspondiente a la posición 405; D en una posición correspondiente a la posición 407; Q en una posición correspondiente a la posición 407; A en una posición correspondiente a la posición 409; Q en una posición correspondiente a la posición 409; T en una posición correspondiente a la posición 410; P en una posición correspondiente a la posición 418 F en una posición correspondiente a la posición 419 I en una posición correspondiente a la posición 419 K en una posición correspondiente a la posición 419; R en una posición correspondiente a la posición 419 S en una posición correspondiente a la posición 419; H en una posición correspondiente a la posición 421 K en una posición correspondiente a la posición 421; N en una posición correspondiente a la posición 421 Q en una posición correspondiente a la posición 421; R en una posición correspondiente a la posición 421 S en una posición correspondiente a la posición 421; K en una posición correspondiente a la posición 425; A en una posición correspondiente a la posición 431; H en una posición correspondiente a la posición 431 K en una posición correspondiente a la posición 431; Q en una posición correspondiente a la posición 431 R en una posición correspondiente a la posición 431; S en una posición correspondiente a la posición 431 V en una posición correspondiente a la posición 431; L en una posición correspondiente a la posición 433; R en una posición correspondiente a la posición 433; T en una posición correspondiente a la posición 433; V en una posición correspondiente a la posición 433; K en una posición correspondiente a la posición 436; I en una posición correspondiente a la posición 437; M en una posición correspondiente a la posición 437; T en una posición correspondiente a la posición 438; V en una posición correspondiente a la posición 439; H en una posición correspondiente a la posición 440; R en una posición correspondiente a la posición 440; F en una posición correspondiente a la posición 441; R en una posición correspondiente a la posición 442; A en una posición correspondiente a la posición 443; M en una posición correspondiente a la posición 443; M en una posición correspondiente a la posición 445; P en una posición correspondiente a la posición 445; A en una posición correspondiente a la posición 446; D en una posición correspondiente a la posición 447; N en una posición correspondiente a la posición 447; y/o con Q en una posición correspondiente a la posición 447, cada uno en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Los polipéptidos de PH20 modificados pueden contener una cualquiera o más de las sustituciones de aminoácidos enumeradas, en cualquier combinación, con o sin modificaciones adicionales, siempre que el polipéptido de PH20 muestre actividad hialuronidasa, tal como actividad hialuronidasa aumentada en comparación del polipéptido de PH20 que no contiene la modificación o las modificaciones, por ejemplo, actividad hialuronidasa aumentada al menos 1,5 veces.
En algunos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en una posición o posiciones correspondientes a la posición o posiciones 24, 29, 31, 48, 58, 69, 70, 75, 84, 97, 165, 166, 271,278, 317, 320, 325 y/o 326 en referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, los reemplazos de aminoácidos ejemplares incluyen, pero sin limitación, reemplazo con: E en la posición correspondiente a la posición 24; E en una posición correspondiente a la posición 29; V en una posición correspondiente a la posición 31; N en una posición correspondiente a la posición 48; K en una posición correspondiente a la posición 58; Q en una posición correspondiente a la posición 58; A en una posición correspondiente a la posición 69; F en una posición correspondiente a la posición 69; G en una posición correspondiente a la posición 69; P en una posición correspondiente a la posición 69; R en una posición correspondiente a la posición 69; A en una posición correspondiente a la posición 70; F en una posición correspondiente a la posición 70; G en una posición correspondiente a la posición 70; H en una posición correspondiente a la posición 70; H en una posición correspondiente a la posición 70; N en una posición correspondiente a la posición 70; R en una posición correspondiente a la posición 70; T en una posición correspondiente a la posición 70; V en una posición correspondiente a la posición 70; L en una posición correspondiente a la posición 75; T en una posición correspondiente a la posición 75; G en una posición correspondiente a la posición 84; G en una posición correspondiente a la posición 97; D en una posición correspondiente a la posición 165; L en una posición correspondiente a la posición 166; R en una posición correspondiente a la posición 166 T en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 271 H en una posición correspondiente a la posición 278; R en una posición correspondiente a la posición 278; K en una posición correspondiente a la posición 317; K en una posición correspondiente a la posición 320; E en una posición correspondiente a la posición 325, con G en una posición correspondiente a la posición 325; K en una posición correspondiente a la posición 325; N en una posición correspondiente a la posición 325; Q en una posición correspondiente a la posición 325; V en una posición correspondiente a la posición 326; cada uno con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Los polipéptidos de PH20 modificados pueden contener una cualquiera o más de las sustituciones de aminoácidos enumeradas, en cualquier combinación, con o sin modificaciones adicionales, siempre que el polipéptido de PH20 muestre actividad hialuronidasa, tal como actividad hialuronidasa aumentada en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene la modificación o las modificaciones, por ejemplo, actividad hialuronidasa aumentada al menos 2,0 veces.
Los polipéptidos de PH20 modificados ejemplares que muestran actividad aumentada en comparación con el polipéptido de PH20 no modificado (por ejemplo, expuesto en SEQ ID NO: 3) son cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 73, 78, 86, 89, 91, 95, 96, 99, 100, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 123-126, 128-136, 139-141, 149, 154, 155, 159, 164, 165, 167, 173, 178, 181, 191-193, 195-197, 199-205, 207-221, 225, 226, 228, 229, 231, 233, 237-239, 242, 247-254, 256, 257, 267, 269, 270, 277, 283, 293, 295, 296, 298, 300, 303, 308, 316, 318, 321, 322, 324, 325, 330, 334, 335, 338-340, 344, 348, 355, 367, 369, 371, 377, 384-388, 394, 398, 399, 401, 406-408, 410, 412, 414, 416, 419, 421-426, 428, 430, 431, 435, 448, 455, 456, 459, 462, 463, 465, 469, 478-480, 482, 484, 490, 493, 497, 501, 503, 505, 506-508, 510-512, 514, 518, 522, 523, 527, 531, 533, 537-543, 545, 551, 558, 559, 561, 563-566, 569, 572, 574, 576, 579, 581-583, 585, 587, 588, 594, 596, 602, 605, 606, 609, 613, 618-620, 624-634, 637, 640-644, 647, 648, 652, 657, 675, 695, 698, 699, 700, 712, 717, 725, 731, 732, 734, 738, 742, 746, 748-750, 757, 760, 762-765, 768-773, 775, 779, 782, 783, 786-789, 794-797, 799-801, 807, 814, 816, 819, 822, 825, 826, 830, 836, 838, 844, 847, 851, 853 o que tenga una secuencia de aminoácidos que muestre al menos 68 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 73, 78, 86, 89, 91, 95, 96, 99, 100, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 123-126, 128-136, 139-141, 149, 154, 155, 159, 164, 165, 167, 173, 178, 181, 191-193, 195-197, 199-205, 207-221,225, 226, 228, 229, 231, 233, 237-239, 242, 247-254, 256, 257, 267, 269, 270, 277, 283, 293, 295, 296, 298, 300, 303, 308, 316, 318, 321, 322, 324, 325, 330, 334, 335, 338-340, 344, 348, 355, 367, 369, 371, 377, 384-388, 394, 398, 399, 401, 406-408, 410, 412, 414, 416, 419, 421-426, 428, 430, 431, 435, 448, 455, 456, 459, 462, 463, 465, 469, 478­ 480, 482, 484, 490, 493, 497, 501, 503, 505, 506-508, 510-512, 514, 518, 522, 523, 527, 531, 533, 537-543, 545, 551, 558, 559, 561, 563-566, 569, 572, 574, 576, 579, 581-583, 585, 587, 588, 594, 596, 602, 605, 606, 609, 613, 618-620, 624-634, 637, 640-644, 647, 648, 652, 657, 675, 695, 698, 699, 700, 712, 717, 725, 731, 732, 734, 738, 742, 746, 748-750, 757, 760, 762-765, 768-773, 775, 779, 782, 783, 786-789, 794-797, 799-801, 807, 814, 816, 819, 822, 825, 826, 830, 836, 838, 844, 847, 851, 853 y contiene el reemplazo de aminoácido y muestra actividad hialuronidasa aumentada en comparación con el polipéptido no modificado correspondiente.
b. Estabilidad aumentada
Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 que muestran estabilidad aumentada. En particular, los polipéptidos de PH20 muestran estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 pueden mostrar estabilidad aumentada en diversas condiciones de almacenamiento. Los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran presentación de estabilidad aumentada, entre otros parámetros, resistencia aumentada a condiciones de desnaturalización, incluyendo pero sin limitación, condiciones de desnaturalización provocadas por temperatura (por ejemplo, temperatura elevada tal como calor), agitación, sal baja o ausente, y/o presencia de excipientes. Los excipientes ejemplares incluyen, pero sin limitación, antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, cargas y diluyentes, saporíferos, colorantes, lubricantes, emolientes, conservantes, sorbentes o edulcorantes. Por ejemplo, diversos excipientes, tales como conservantes, pueden actuar como agentes desnaturalizantes de proteínas. Los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad proteica aumentada muestran agregación reducida, precipitación reducida y/o actividad aumentada cuando se exponen a una condición de desnaturalización en comparación con la PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácido. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran al menos o al menos aproximadamente o 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 % o más actividad aumentada cuando se exponen a una condición de desnaturalización en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácido cuando se expone a la misma condición de desnaturalización.
Los polipéptidos de PH20 descritos en el presente documento que muestran estabilidad aumentada son polipéptidos de PH20 modificados o variantes que contienen un reemplazo (sustitución), supresión o inserción de aminoácidos u otra modificación. Típicamente, los polipéptidos de p H20 descritos en el presente documento que muestran estabilidad aumentada contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el remplazo o los reemplazos de aminoácidos, por ejemplo, el polipéptido de PH20 expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870 o una variante del mismo que tiene al menos 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el mismo. En particular, los polipéptidos de PH20 modificados o variantes descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácido, por ejemplo, el polipéptido de PH20 expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 66, 69 o 72 y en particular el polipéptido de PH20 expuesto en la SEQ ID NO: 3.
En los ejemplos particulares, los polipéptidos de PH20 modificados contienen un reemplazo de aminoácido en una o más posiciones de aminoácidos identificadas como asociadas con estabilidad aumentada. Como se describe en el presente documento, dichas posiciones pueden identificarse usando mutagénesis sin selección o métodos de exploración para identificar las posiciones que dan como resultado estabilidad (por ejemplo, actividad aumentada) del polipéptido en comparación con la PH20 correspondiente que no contiene la modificación tras exposición a una o más condiciones de desnaturalización. El polipéptido de PH20 puede contener otras modificaciones, tales como otros reemplazos de aminoácidos, que por sí solas no están asociadas con la provisión de estabilidad, siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante muestre estabilidad aumentada en una o más condiciones de desnaturalización en comparación con la PH20 que no contiene la modificación o las modificaciones de aminoácidos, tales como el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos, y muestra actividad hialuronidasa. Los polipéptidos de PH20 modificados descrito en el presente documento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 o más reemplazos de aminoácidos. También pueden incluirse modificaciones adicionales, tales como inserciones o supresiones. El reemplazo de aminoácido puede ser en un polipéptido de PH20 como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870 o una variante del mismo que tiene al menos 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con el mismo. Por ejemplo, los reemplazos pueden ser en un polipéptido de PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72 o una variante del mismo.
Son ejemplos de polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento polipéptidos de PH20 que muestran estabilidad aumentada tras exposición a compuestos de fenol, alta temperatura (calor) y/o ausencia de NaCl.
i. Fenófilos
Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada en presencia de compuestos fenólicos. Las formulaciones multidosis deben contener conservantes antimicrobianos para protegerlos de contaminación microbiana. Para productos farmacológicos parenterales, incluyendo insulina y otros agentes terapéuticos, los conservantes más comunes son compuestos fenólicos, tales como fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico y parabenos incluyendo metilparabeno y propilparabeno. Los conservantes típicamente deben estar presentes a suficientes concentraciones para satisfacer las normas reguladoras. Por ejemplo, los requisitos reguladores afirman que la eficacia antimicrobiana de la formulación debe satisfacer los requisitos de ensayo de eficacia conservante (PET) de los mercados diana. En la actualidad diferentes agencias reguladoras tienen diferentes criterios de farmacopea con respecto a eficacia antimicrobiana para productos farmacéuticos diseñados para dosificación múltiple. Los requisitos de PET de la Farmacopea de Estados Unidos (USP) y de la Farmacopea Europea (EP) difieren considerablemente, imponiendo restricciones adicionales en el desarrollo de formulaciones multidosis. La Tabla 4 muestra los criterios para que fármacos inyectables cumplan los criterios de USP y EP. Típicamente, las formulaciones que cumplen los requisitos antimicrobianos de EP (EPA o EPB) contienen más conservante que las formuladas solamente para cumplir los requisitos antimicrobianos de USP.
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continuación
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Los conservantes antimicrobianos pueden interaccionar con proteínas que dan como resultado agregaciones y efectos negativos en la estabilidad. Por lo tanto, aunque son un componente necesario, los conservantes plantean un problema significativo en el desarrollo de formulaciones de proteínas estables, multidosis, porque típicamente inducen agregación de la proteína en solución acuosa. En particular, cantidades crecientes o altas de conservantes pueden influir negativamente en la estabilidad de una proteína, incluyendo efectos sobre la estabilidad física (agregación o precipitación) que pueden influir en la actividad proteica. Por ejemplo, para cumplir los requisitos de eficacia conservativa EP, pueden requerirse cantidades relativamente altas de compuestos fenólicos, tales como fenol o m-cresol, que pueden influir en la estabilidad de la formulación proteica. Por ejemplo, se mostrado que conservantes tales como fenol, m-cresol y alcohol bencílico inducen agregación de hormona del crecimiento humana (Maa y Hsu (1996) Int. J. Pharm.140: 155-168), receptor de interleucina 1 recombinante (Remmele (1998) Pharm. Res.15: 200-208), factor de crecimiento de tipo insulina humana I (Fransson (1997) Pharm. Res. 14: 606-612), rhIFN-Y (Lam (1997) Pharm. Res. 14:725-729) y citocromo c (Singh et al., (2011) J. Pharm Sci., 100: 1679-89). El efecto desestabilizante que los conservantes tienen en proteínas en solución ha sido un factor limitante en el desarrollo de formulaciones multidosis, y, hasta la fecha, la mayoría de los productos terapéuticos proteicos se han formulado solo para uso individual.
La hialuronidasa PH20, tal como rHuPH20, pierde rápidamente actividad en presencia de conservantes, probablemente debido al desplegamiento de la proteína y posterior formación de agregados. Por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos del presente documento, los conservantes reducen la actividad enzimática de PH20, particularmente a temperaturas elevadas (véase también Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/520.962 y Solicitudes de Estados Unidos n.° 13/507.263 y 13/507.262). Por ejemplo, después de incubación con m-cresol al 0,4 % durante 4 horas, PH20 (por ejemplo, rHuPH20) conserva solamente aproximadamente el 10 % de su actividad (véase por ejemplo, Ejemplo 5). Cuando se incuba en presencia de fenol 0,1 % y m-cresol 0,15 % o 0,315 % durante 6 días a 37 °C, PH20 (por ejemplo, rHuPH20) conserva actividad de aproximadamente 0 % a 15 %, dependiendo de la presencia de otros excipientes o cantidades de otros excipientes en la formulación (véase, por ejemplo, Ejemplos 9 y 10). Por ejemplo, la presencia de una concentración mayor de sal generalmente aumenta la estabilidad de PH20. En particular, la temperatura de fusión de PH20, tal como rHuPH20, se reduce significativamente cuando se añaden conservantes fenólicos, tales como m-Cresol, a la formulación. Por ejemplo, la temperatura de desplegamiento de rHuPH20 se reduce de 44 °C a 24 °C. Las temperaturas de desplegamiento de PH20 menores conducen a agregación de PH20 aumentada, especialmente a temperaturas elevadas, y actividad enzimática reducida. El efecto desestabilizante probablemente se deba a la naturaleza hidrófoba de los conservantes fenólicos. La hidrofobicidad de los compuestos fenólicos puede conducir a la interacción con rHuPH20 mediante unión no específica con la proteína, alterando en última instancia la integridad estructural de rHuPH20. Esto se traduce en una pérdida significativa de la actividad enzimática rHuPH20 en presencia de conservantes.
Los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad aumentada en presencia de conservantes fenólicos muestran más de 15 % de actividad enzimática en presencia de al menos un conservante fenólico durante al menos 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 3 semanas, 4 semanas o más en comparación con la actividad enzimática del polipéptido de PH20 modificado en ausencia de conservante durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones (excepto por la presencia de conservante). En algunos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran al menos 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más actividad enzimática en presencia de un conservante fenólico en comparación con en ausencia del conservante. Por ejemplo, el compuesto conservante fenólico puede ser fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico y/o parabenos incluyendo metilparabeno o propilparabeno.
En ejemplos particulares, la estabilidad aumentada en presencia de conservante se muestra en condiciones de temperatura de entre o aproximadamente entre 0 °C y 40 °C, tal como entre o aproximadamente entre 2 °C y 6 °C, 24 °C y 32 °C o 35 °C y 40 °C, y en general a o aproximadamente a 4 °C o 5 °C, 30 °C o 37 °C. Se entiende que ya que la alta temperatura también puede tener un efecto desestabilizante en la actividad de PH20 (véase posteriormente), el porcentaje de actividad enzimática de un polipéptido de PH20 modificado descrito en el presente documento en presencia de conservante es mayor a temperaturas menores que a temperaturas mayores.
En general, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada, y las actividades enzimáticas indicadas, en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz de conservante que destruye o inhibe la propagación de organismos microbianos en una muestra de la composición. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz de conservante que destruye o inhibe la propagación de organismos microbianos de modo que se produzca una reducción de al menos 1,0 unidades log10 en organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación. En algunos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz de conservante que destruye o inhibe la propagación de organismos microbianos de modo que, cuando se ensaya en un ensayo de eficacia de conservante antimicrobiano (APET), después de inoculación de la composición con un inóculo microbiano hay al menos una reducción de 1,0 unidades log10 en organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación, al menos una reducción de 3,0 unidades log10 de organismos bacterianos a los 14 días después de la inoculación, al menos ningún aumento adicional en organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación, y al menos ningún aumento en organismos fúngicos después de 7 días después de la inoculación. En otros ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz de conservante que destruye o inhibe la propagación de organismos microbianos de modo que, cuando se ensaya en un ensayo de eficacia de conservante antimicrobiano (APET), después de la inoculación de la composición con un inóculo microbiano hay al menos una reducción de 1,0 unidades log10 de organismos bacterianos a las 24 horas después de la inoculación, al menos una reducción de 3,0 unidades log10 de organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación, ningún aumento adicional en organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación, al menos una reducción de 1,0 unidades log10 de organismos fúngicos a los 14 días después de la inoculación, y al menos ningún aumento adicional en organismos fúngicos después de 28 días después de la inoculación. En otro ejemplo más, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de una cantidad antimicrobiana eficaz del conservante que destruye o inhibe la propagación de organismos microbianos de modo que, cuando se ensaya en un ensayo de eficacia de conservante antimicrobiano (APET), después de la inoculación de la composición con un inóculo microbiano hay al menos una reducción de 2,0 unidades log10 de organismos bacterianos a las 6 horas después de la inoculación, al menos una reducción de 3,0 unidades log10 de organismos bacterianos a las 24 horas después de la inoculación, ninguna recuperación de organismos bacterianos después de 28 días tras la inoculación de la composición con el inóculo microbiano, al menos una reducción de 2,0 unidades log10 de organismos fúngicos a los 7 días después de la inoculación, y al menos ningún aumento adicional en organismos fúngicos después de 28 días después de la inoculación.
Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada, y la actividad enzimática anteriormente enumerada, en presencia de una cantidad total de uno o más agentes conservantes fenólicos como un porcentaje (%) de concentración en masa (p/v) que es o está entre 0,05 % y 0,6 %, 0,1 % y 0,4 %, 0,1 % y 0,3 %, 0,15 % y 0,325 %, 0,15 % y 0,25 %, 0,1 % y 0,2 %, 0,2 % y 0,3 % o 0,3 % y 0,4 % inclusive.
En general, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de m-cresol y/o fenol. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de m-cresol en una cantidad como un % de concentración en masa (p/v) en una formulación que contiene el polipéptido de PH20 modificado de entre o aproximadamente entre 0,05 % y 0,6 % , 0,1 % y 0,4 %, 0,1 % y 0,3 %, 0,15 % y 0,325 %, 0,15 % y 0,25 %, 0,1 % y 0,2 %, 0,2 % y 0,3 % o 0,3 % y 0,4 %. En otros ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de fenol en una cantidad a un % de concentración de masa (p/v) en una formulación que contiene el polipéptido de PH20 modificado de entre o aproximadamente entre 0,05 % y 0,6 % 0,1 % y 0,4 %, 0,1 % y 0,3 %, 0,15 % y 0,3 %, 0,15 % y 0,25 %, 0,1 % y 0,2 %, 0,2 % y 0,3 % o 0,3 % y 0,4 % de m-cresol. En ejemplos adicionales, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad aumentada en presencia de fenol y m-cresol en una cantidad como un % de concentración en masa (p/v) en una formulación que contiene el polipéptido de PH20 modificado de entre o aproximadamente entre 0,05 % y 0,25 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,05 % y 0,3 % de m-cresol, entre o aproximadamente entre 0,10 % y 0,2 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,6 % y 0,18 % de m-cresol, entre o aproximadamente entre 0,1 % y 0,15 % de fenol y 0,8 % y 0,15 % de m-cresol, entre o aproximadamente entre 0,10 % y 0,15 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,06 % y 0,09 % de m-cresol o entre o aproximadamente entre 0,12 % y 0,18 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,14 % y 0,22 % de mcresol.
En ejemplos del presente documento, los polipéptidos de PH20 modificados muestran más del 15%, tal como al menos 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más actividad enzimática en presencia de al menos aproximadamente entre o entre 0,3 % y 0,4 %, inclusive, de m-cresol y/o fenol durante al menos 4 horas a 37 °C en comparación con la actividad enzimática del polipéptido de PH20 modificado en ausencia del conservante durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones (excepto por la presencia de conservante). Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados muestran más del 15 %, tal como al menos 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % %, 60 %, 65 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más actividad enzimática en presencia de aproximadamente o 0,4 % de m-cresol durante al menos 4 horas a 37 °C en comparación con la actividad enzimática del polipéptido de PH20 modificado en ausencia del conservante durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones (excepto por la presencia de conservante). Los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento también muestran más del 15 %, tal como al menos 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más actividad enzimática en presencia de al menos aproximadamente entre o entre 0,2 % y 0,4 %, inclusive, de mcresol y/o fenol durante al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o 6 días a 37 °C en comparación con la actividad enzimática del polipéptido de PH20 modificado en ausencia de conservante durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones (excepto por la presencia de conservante). Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran más del 15%, tal como al menos 16%, 17%, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95% o más de actividad enzimática en presencia de aproximadamente o 0,10% de fenol y aproximadamente 0,15 % de m-cresol durante al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o 6 días a 37 °C en comparación con la actividad enzimática del polipéptido de PH20 modificado en ausencia de conservante durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones (excepto por la presencia de conservante). En otros ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran más del 15 % tal como al menos 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más actividad enzimática en presencia de aproximadamente o 0,315 % de m-cresol durante al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o 6 días, en general durante al menos 6 días, a 37 °C en comparación con la actividad enzimática del polipéptido de PH20 modificado en ausencia de conservante durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones (excepto por la presencia de conservante).
Por ejemplo, dichos polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad aumentada frente a compuestos de fenol contienen un remplazo (sustitución) de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 10, 12, 20, 22, 26, 34 ,36 , 46, 50, 52, 58, 68, 70, 74, 82, 83, 84, 86, 97, 127, 131, 138, 142, 143, 144, 166, 169, 174, 193, 195, 196, 204, 205, 206, 213, 219, 234, 237, 238, 240, 249, 261, 267, 277, 279, 291, 309, 310, 314, 315, 317, 318, 347, 367, 375, 376,399, 401,407, 416, 419, 421, 431, 433, 439, 440, 443 o 445 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden ser reemplazos en una o más posiciones correspondientes al reemplazo de (P) en la posición 10 (P10), V12, A20, S22, L26, D34, S36, I46, G50, G52, V58, D68, I70, T74, K82, I83, S84, Q86, T97, D127, N131, Q138, V142, Q143, L144, V166, I169, L174, H193, K195, K196, F204, N205, V206, D213, N219 , Q234, V237, A238, T240, E249, S261, A267, V277K279, G291, I309, M310, K314, S315, L317, Q347, P367, E375, K376, Y399, S401, S407, D416, A419, D421, D431, F433, E439, T440, P443 o 1445 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Los ejemplos de reemplazos de aminoácidos en los polipéptidos de PH20 descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, reemplazo con: glicina (G) en una posición correspondiente a la posición 10; K en una posición correspondiente a la posición 12; S en una posición correspondiente a la posición 20; T en una posición correspondiente a la posición 22; M en una posición correspondiente a la posición 26; W en una posición correspondiente a la posición 34; N en una posición correspondiente a la posición 36; L en una posición correspondiente a la posición 46; M en una posición correspondiente a la posición 50; T en una posición correspondiente a la posición 52; S en una posición correspondiente a la posición 52; C en una posición correspondiente a la posición 58; K en una posición correspondiente a la posición 58; R en una posición correspondiente a la posición 58; N en una posición correspondiente a la posición 58; Y en una posición correspondiente a la posición 58; P en una posición correspondiente a la posición 58; H en una posición correspondiente a la posición 58; P en una posición correspondiente a la posición 68; V en una posición correspondiente a la posición 70; E en una posición correspondiente a la posición 74; L en una posición correspondiente a la posición 82; N en una posición correspondiente a la posición 82; V en una posición correspondiente a la posición 83; Q en una posición correspondiente a la posición 83; S en una posición correspondiente a la posición 83; G en una posición correspondiente a la posición 83; N en una posición correspondiente a la posición 84; A en una posición correspondiente a la posición 86; K en una posición correspondiente a la posición 86; E en una posición correspondiente a la posición 97; L en una posición correspondiente a la posición 97; R en una posición correspondiente a la posición 127; R en una posición correspondiente a la posición 131 L en una posición correspondiente a la posición 138; K en una posición correspondiente a la posición 142; N en una posición correspondiente a la posición 142; P en una posición correspondiente a la posición 142 S en una posición correspondiente a la posición 142 T en una posición correspondiente a la posición 142; G en una posición correspondiente a la posición 143; K en una posición correspondiente a la posición 143; T en una posición correspondiente a la posición 144; Q en una posición correspondiente a la posición 166 T en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 169; G en una posición correspondiente a la posición 174; N en una posición correspondiente a la posición 174; Q en una posición correspondiente a la posición 193 T en una posición correspondiente a la posición 195; N en una posición correspondiente a la posición 195; E en una posición correspondiente a la posición 196; R en una posición correspondiente a la posición 196; P en una posición correspondiente a la posición 204; A en una posición correspondiente a la posición 205; E en una posición correspondiente a la posición 205; I en una posición correspondiente a la posición 206; A en una posición correspondiente a la posición 213; I en una posición correspondiente a la posición 219; M en una posición correspondiente a la posición 234; T en una posición correspondiente a la posición 237; H en una posición correspondiente a la posición 238; Q en una posición correspondiente a la posición 240; V en una posición correspondiente a la posición 249; A en una posición correspondiente a la posición 261; K en una posición correspondiente a la posición 261; T en una posición correspondiente a la posición 267; K en una posición correspondiente a la posición 277; H en una posición correspondiente a la posición 279; V en una posición correspondiente a la posición 279; V en una posición correspondiente a la posición 291; E en una posición correspondiente a la posición 309; Q en una posición correspondiente a la posición 310; Y en una posición correspondiente a la posición 314; Y en una posición correspondiente a la posición 315; N en una posición correspondiente a la posición 317; W en una posición correspondiente a la posición 317; D en una posición correspondiente a la posición 318; G en una posición correspondiente a la posición 347; A en una posición correspondiente a la posición 367; R en una posición correspondiente a la posición 375; R en una posición correspondiente a la posición 376; V en una posición correspondiente a la posición 399; E en una posición correspondiente a la posición 401; A en una posición correspondiente a la posición 407; L en una posición correspondiente a la posición 416; K en una posición correspondiente a la posición 419; H en una posición correspondiente a la posición 421; E en una posición correspondiente a la posición 431; T en una posición correspondiente a la posición 433; V en una posición correspondiente a la posición 433; C en una posición correspondiente a la posición 439; P en una posición correspondiente a la posición 440; G en una posición correspondiente a la posición 443; N en una posición correspondiente a la posición 445, cada una en referencia a las posiciones de restos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
El reemplazo o los reemplazos de aminoácidos pueden estar en un polipéptido de PH20 como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870 o una variante del mismo que tiene al menos
75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %,
97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el mismo. Por ejemplo, el reemplazo o los reemplazos pueden
estar en un polipéptido de PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de SEQ ID N°: 3, 7, 32-66,
69 o 72 o una variante del mismo.
Son ejemplos de polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada frente a compuestos de fenol en comparación con el polipéptido de PH20 no modificado (por ejemplo, expuesto en SEQ ID NO: 3) cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID N°: 83 , 88, 93, 94, 101, 144, 148,
158, 171, 176, 175, 177, 178, 180, 182, 183, 184, 185, 194, 221, 240, 259, 260, 261,262, 263,264, 268, 270, 272,
307, 309, 327, 334, 341, 351, 352, 353, 356, 357, 358, 359, 361, 424, 426, 430, 434, 436, 443, 444, 449, 450, 451, 454, 461,467, 480, 487, 489, 492, 495, 504, 505, 509, 527, 544, 576, 589, 600, 603, 647, 658, 683, 687, 733, 736, 741, 754, 763, 768, 781, 796, 797, 809, 818, 829 u 837 o que tenga una secuencia de aminoácidos que muestre al menos 68 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 83,
88, 93, 94, 101, 144, 148, 158, 171, 176, 175, 177, 178, 180, 182, 183, 184, 185, 260, 261, 262, 263, 264, 268, 270,
272, 307, 309, 327, 334, 341, 351, 352, 353, 356, 357, 358, 359, 361,424, 446, 445, 446, 447, 449, 461, 467, 480, 487, 489, 492, 495, 504, 505, 509, 527, 544, 576, 589, 600, 603, 607, 612, 614, 647, 733, 736, 741, 754, 763, 768, 781, 796, 797, 809, 818, 829 u 837 y contiene el reemplazo de aminoácido, muestra actividad hialuronidasa y muestra estabilidad aumentada en presencia de compuestos de fenol en comparación con
el polipéptido no modificado correspondiente.
En particular, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo
de aminoácido con P en una posición correspondiente al resto de aminoácido 204 en referencia a SEQ ID NO: 3.
Típicamente, el polipéptido de PH20 modificado es un polipéptido humano. Por ejemplo, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido F204P en una secuencia
de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 69, 72 o 32-66, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 69, 72 o 32-66 siempre que el polipéptido modificado contenga el reemplazo de aminoácido correspondiente a F204P. En otros casos, el polipéptido de PH20 modificado
es un polipéptido no humano. Por ejemplo, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido F204P en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ
ID NO: 10, 12, 14, 857, 859, 861 u 870 o una secuencia que muestra al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %,
92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO:
10, 12, 14, 857, 859, 861 u 870 siempre que el polipéptido modificado contenga el reemplazo de aminoácido correspondiente a F204P. En un ejemplo adicional, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido F205P en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ
ID NO: 24 o Y204P en SEQ ID No : 31, o una secuencia que muestra al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %,
92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 24 o 31. Es un ejemplos de dicho polipéptido de PH20 modificado un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta
en SEQ ID NO: 449, o que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 68 %, 70 %, 75 %, 80 %,
85 % , 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 449 y contiene el reemplazo de aminoácido F204P, muestra actividad hialuronidasa aumentada y muestra estabilidad aumentada frente a compuestos de fenol en comparación con el polipéptido no modificado correspondiente (por ejemplo, SEQ ID NO: 3). En cualquiera de los ejemplos anteriores, el polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido con P en una posición correspondiente al resto de aminoácido 204 en referencia a SEQ ID NO: 3 no tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15­ 22, 28 o 29.
En otro ejemplo, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente al resto de aminoácido 58 en referencia a SEQ ID NO: 3. Son ejemplos de reemplazos de aminoácidos el reemplazo con lisina (K) o con arginina (R) en una posición correspondiente al resto de aminoácido 58 en referencia a SEQ ID NO: 3. Típicamente, el polipéptido de PH20 modificado es un polipéptido humano. Por ejemplo, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido V58K o V58R en una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 69, 72 o 32-66, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 69, 72 o 32-66. En otros casos, el polipéptido de PH20 modificado es un polipéptido no humano. Por ejemplo, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido V58K o V58R en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, 12, 14, 20, 22, 24, 29, 857, 859, 861 u 870 o una secuencia que muestra al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 20, 22, 24, 29, 857, 859, 861 u 870. En un ejemplo adicional, se describe en el presente documento un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido A58R en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 o 31, o una secuencia que muestra al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 16 o 31. Es un ejemplo de dicho polipéptido de PH20 modificado un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 182, o que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 68 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 182, que contiene el reemplazo de aminoácido V58R y muestra actividad hialuronidasa aumentada y muestra estabilidad aumentada en presencia de compuestos de fenol en comparación con el polipéptido no modificado correspondiente (por ejemplo, SEQ ID NO: 3).
11. Termófilos
A temperaturas elevadas, las hialuronidasas PH20 pueden perder actividad. Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada a temperaturas elevadas de entre o aproximadamente entre 30 °C y 45 °C, inclusive, tal como entre o aproximadamente entre 35 °C y 42 °C, en particular a o aproximadamente a 37 °C. Por ejemplo, se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que son estables a temperaturas elevadas mayores de 32 °C tales como de 35 °C a 45 °C, de 37 °C a 42 °C y en particular a o aproximadamente a 37 °C durante al menos 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días o al menos 7 días. Pueden usarse polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad a temperaturas elevadas pueden usarse en aplicaciones donde las temperaturas están elevadas, pueden fluctuar o pueden aumentar. Esto puede suceder, por ejemplo, en métodos de administración que utilizan bombas u otros dispositivos de infusión continua.
En particular, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad a temperaturas elevadas muestran actividad hialuronidasa aumentada a temperatura elevada en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene la modificación, por ejemplo, reemplazo de aminoácido. Los polipéptidos de PH20 pueden mostrar actividad hialuronidasa aumentada tras incubación a temperaturas elevadas mayores de 32 °C tales como 35 °C a 45 °C o 37 °C a 42 °C, en particular a o aproximadamente a 37 °C durante al menos 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días o al menos 7 días en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene la modificación incubada en las mismas condiciones. Por ejemplo, la actividad hialuronidasa puede aumentarse al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 % 500 % o más en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene la modificación incubada en las mismas condiciones. Por ejemplo, la actividad hialuronidasa puede aumentarse al menos 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más en comparación con el polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene la modificación incubada en las mismas condiciones.
En otros ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad a temperaturas elevadas conservan la actividad hialuronidasa a temperaturas elevadas en comparación con la actividad del polipéptido de PH20 modificado incubado a temperaturas no elevadas en las mismas condiciones (excepto por las diferencias en temperatura). Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados muestran más de o aproximadamente 50 %, tal como más de o al menos 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la actividad a temperaturas elevadas mayores de 32 °C tales como de 35 °C a 45 °C o de 37 °C a 42 °C, en particular a o aproximadamente a 37 °C en comparación con la actividad de la PH20 a temperaturas no elevadas de entre o aproximadamente entre 2 °C y 8 °C. En algunos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad a temperaturas elevadas muestran actividad aumentada a temperaturas elevadas en comparación con la actividad del polipéptido de PH20 modificado incubado a temperaturas no elevadas en las mismas condiciones (excepto por la diferencia de temperatura). Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados muestran más de o aproximadamente 10 % de actividad aumentada, tal como más de o al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de actividad a temperaturas elevadas mayores de 32 °C tales como de 35 °C a 45 °C o de 37 °C a 42 °C, en particular a o aproximadamente a 37 °C en comparación con la actividad de la PH20 a temperaturas no elevadas de entre o aproximadamente entre 2 °C y 8 °C. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados muestran más de o al menos aproximadamente 1,1 veces la actividad hialuronidasa, tal como más de o al menos 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más de la actividad a temperaturas elevadas mayores de 32 °C tales como de 35 °C a 45 °C o de 37 °C a 42 °C, en particular a o aproximadamente a 37 °C en comparación con la actividad de la PH20 a temperaturas no elevadas de entre o aproximadamente entre 2 °C y 8 °C.
Por ejemplo, dichos polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad aumentada a temperaturas elevadas contienen un reemplazo de aminoácido (sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 1, 11, 12, 14, 20, 26, 29, 34, 50, 58, 70, 82, 83, 84, 86, 87, 140, 142, 143, 147, 152, 166, 167, 172, 174, 178, 193, 195, 206, 212, 213, 219,233, 237, 240, 267, 277, 291, 292, 309, 313, 314, 317, 318, 347, 367, 368, 371, 374, 389, 392, 395, 396, 406, 419, 421, 439 o 443 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden ser reemplazos en una o más posiciones correspondientes al reemplazo de (L) en la posición 1 (L1), N11, V12, F14, A20, L26, F29, D34, G50, V58, I70, K82 , I83, S84, Q86, D87, Q140, V142, Q143, T147, K152, V166, E167, G172, L174, N178, H193, K195, V206, D212, D213, N219, Q233, V237, T240, A267, V277 , G39, E292, I309, M313, K314, L317, L318, Q347, P367, D368, A371, L374, E389, E392, S395, E396, L406, A419, D421, E439 o P443, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. El polipéptido de PH20 modificado resultante muestra estabilidad aumentada a temperaturas elevadas mayores de 32 °C tales como de 35 °C a 45 °C, de 37 °C a 42 °C y en particular a o aproximadamente a 37 °C durante al menos 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días o más.
Los reemplazos de aminoácidos ejemplares en los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, reemplazo con: R en una posición correspondiente a la posición 1; S en una posición correspondiente a la posición 11; I en una posición correspondiente a la posición 12; V en una posición correspondiente a la posición 14; S en una posición correspondiente a la posición 20; M en una posición correspondiente a la posición 26; con R en una posición correspondiente a la posición 29; W en una posición correspondiente posición 34; M en una posición correspondiente a posición 50; K en una posición correspondiente posición 58; Q en una posición correspondiente a posición 58; Q en una posición correspondiente posición 58; V en una posición correspondiente a posición 70; L en una posición correspondiente posición 82; Q en una posición correspondiente a posición 83; R en una posición correspondiente posición 84; A en una posición correspondiente a posición 86; S en una posición correspondiente posición 87; K en una posición correspondiente a posición 140; S en una posición correspondiente posición 142; T en una posición correspondiente a posición 142; K en una posición correspondiente posición 143; S en una posición correspondiente posición 147; T en una posición correspondiente posición 152; T en una posición correspondiente posición 166; D en una posición correspondiente posición 167; A en una posición correspondiente posición 172; G en una posición correspondiente posición 174; N en una posición correspondiente posición 174; R en una posición correspondiente posición 178; Q en una posición correspondiente la posición 193; T en una posición correspondiente posición 195; I en una posición correspondiente a la posición 206; S en una posición correspondiente posición 212; A en una posición correspondiente a la posición 213; I en una posición correspondiente posición 219; G en una posición correspondiente la posición 233; T en una posición correspondiente posición 237; A en una posición correspondiente la posición 240; Q en una posición correspondiente posición 240; T en una posición correspondiente posición 267; E en una posición correspondiente posición 277; S en una posición correspondiente posición 291; H en una posición correspondiente posición 292; V en una posición correspondiente posición 292; S en una posición correspondiente posición 309; H en una posición correspondiente posición 313; S en una posición correspondiente posición 314; I en una posición correspondiente posición 317; T en una posición correspondiente a posición 317; W en una posición correspondiente posición 317; R en una posición correspondiente a posición 318; G en una posición correspondiente posición 347; A en una posición correspondiente posición 367; R en una posición correspondiente posición 368; S en una posición correspondiente posición 371; P en una posición correspondiente posición 374; A en una posición correspondiente posición 389; V en una posición correspondiente posición 392; A en una posición correspondiente posición 395; H en una posición correspondiente posición 396; N en una posición correspondiente a posición 406; H en una posición correspondiente posición 419; K en una posición correspondiente a la posición 419; R en una posición correspondiente a la posición 421; S en una posición que corresponde a la posición 421; A en una posición correspondiente a la posición 439; C en una posición correspondiente a la posición 439; o G en una posición correspondiente a la posición 443, cada uno en referencia a las posiciones de restos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
El reemplazo o los reemplazos de aminoácidos pueden estar en un polipéptido de PH20 como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870 o una variante del mismo que tiene al menos 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el mismo. Por ejemplo, el reemplazo o los reemplazos pueden ser en un polipéptido de PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de las SEQ ID N°: 3, 7, 32­ 66, 69 o 72 o una variante del mismo.
Los polipéptidos de PH20 modificados ejemplares que muestran estabilidad aumentada frente a compuestos de fenol en comparación con el polipéptido de PH20 no modificado (por ejemplo, expuestos en SEQ ID NO: 3) son cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 79, 85, 87, 90, 93, 101, 114, 144, 171, 178, 181, 221, 259, 262, 269, 270, 282, 343, 356, 357, 359, 368, 395, 426, 429, 432, 434, 436, 441, 443, 444, 454, 460, 461, 467, 477, 487, 491, 492, 509, 525, 550, 554, 557, 584, 593, 599, 605, 611, 612, 617, 647, 658, 667, 676, 679, 709, 720, 723, 727, 740, 761, 763, 772, 773, 808, 809 u 829 o que tenga una secuencia de aminoácidos que muestre al menos 68 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 79, 85, 87, 90, 93, 101, 114, 144, 171, 178, 181, 221, 259, 262, 269, 270, 282, 343, 356,357, 359, 368, 395, 426, 429, 432, 434, 436, 441, 443, 444, 454, 460, 461, 467, 477, 487, 491, 492, 509, 525, 550, 554, 557 , 584, 593, 599, 605, 611, 612, 617, 647, 658, 667, 676, 679, 709, 720, 723, 727, 740, 761, 763, 772, 773, 808, 809 u 829 y contiene el reemplazo de aminoácido, muestra actividad hialuronidasa y muestra estabilidad aumentada frente a temperaturas elevadas en comparación con el polipéptido no modificado correspondiente.
Mi. Ausencia de sal
PH20 se desnaturaliza en presencia de baja salinidad o ausencia de sal. Por lo tanto, PH20 requiere una alta concentración salina de entre o aproximadamente entre 140 mM y 200 mM para mantener la estabilidad. Otros agentes terapéuticos, por ejemplo, insulina, muestran solubilidad reducida y cristalización/agregación aumentada en presencia de alta salinidad. Por lo tanto, los requisitos de alta salinidad de PH20 pueden afectar a la solubilidad y/o actividad de agentes terapéuticos coformulados, mientras que la presencia de baja salinidad puede reducir la actividad de PH20. Esto puede crear problemas para generar coformulaciones de PH20.
Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada en presencia de bajas concentraciones de sal (por ejemplo NaCl) menores de 100 mM, por ejemplo, menores de 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o menos. En general, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento muestran estabilidad en presencia de bajas concentraciones de sal, por ejemplo, bajas concentraciones de NaCl de entre o aproximadamente entre NaCl 10 mM y NaCl 100 mM, tal como entre o aproximadamente entre NaCl 15 mM y 80 mM. Los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que muestran estabilidad a bajas concentraciones de sal, tales como bajas concentraciones de NaCl (es decir, menos de 100 mM o menos), muestran actividad hialuronidasa aumentada en comparación con la PH20 correspondiente que no contiene la modificación o las modificaciones (por ejemplo, reemplazos de aminoácidos). Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados muestran actividad aumentada más de o aproximadamente 10 %, tal como más de o al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de actividad a bajas concentraciones de sal, tales como bajas concentraciones de NaCl (es decir, menos de 100 mM), en comparación con la actividad de la PH20 correspondiente que no contiene la modificación o las modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, reemplazo o reemplazos de aminoácidos en las mismas condiciones). Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados muestran más de o al menos aproximadamente 1,1 veces la actividad hialuronidasa, tal como más de o al menos 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más de la actividad a bajas concentraciones de NaCl menores de 100 mM en comparación con la actividad de la PH20 correspondiente que no contiene la modificación o las modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, reemplazo o reemplazos de aminoácidos en las mismas condiciones.
2. Mutantes inactivos
Se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 modificados que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 y que están inactivos, por lo que los polipéptidos no muestran actividad hialuronidasa o muestran actividad hialuronidasa baja o disminuida. Los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que están inactivos en general muestran menos del 20 %, tal como menos del 10 %, de la actividad hialuronidasa de un polipéptido de PH20 de tipo silvestre o de referencia, tal como el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados descritos en el presente documento que están inactivos muestran menos de 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 % 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 % o menos de la actividad hialuronidasa de un polipéptido de PH20 de tipo silvestre o de referencia, tal como el polipéptido correspondiente que no contiene la modificación de aminoácido (por ejemplo, reemplazo de aminoácidos), por ejemplo, un polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7.
Por ejemplo, se describen en el presente documento polipéptidos de PH20 que están inactivos y que se modifican, por ejemplo mediante reemplazo o sustitución de aminoácidos, en comparación con un polipéptido de PH20 de tipo silvestre o de referencia. Por ejemplo, un polipéptido de PH20 modificado descrito en el presente documento que está inactivo contiene uno o más reemplazos de aminoácidos en la posición o las posiciones correspondientes a la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 25, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44. 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 143, 144, 145, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 182.
183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 207, 208, 209, 210, 211,212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288,289, 290, 291,292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 310, 311, 312, 313, 314,315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 331, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343 , 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368 , 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 408, 410, 411,412, 413, 414, 415, 416, 417, 419, 420, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 434, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444 o 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante esté inactivo y muestre menos del 20%, y generalmente menos del 10%, de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Típicamente, el resto de aminoácido que se modifica (por ejemplo, se reemplaza) en la posición correspondiente a cualquiera de las posiciones anteriores en un polipéptido de PH20 es un resto idéntico, un resto conservativo o un resto de aminoácido semiconservativo con respecto al resto de aminoácido expuesto en SEQ ID NO: 3.
Se exponen reemplazos de aminoácidos ejemplares en cualquiera de las posiciones correspondientes anteriores en la Tabla 5. La referencia a la posición correspondiente en la Tabla 5 es en referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO: 3. Se entiende que los reemplazos pueden realizarse en la posición correspondiente en otro polipéptido de PH20 por alineamiento con el mismo con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 (véase por ejemplo, Figuras 1 y 2), por lo que la posición correspondiente es la posición alineada. El reemplazo o los reemplazos de aminoácidos pueden estar en la posición correspondiente en un polipéptido de PH20 como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870 o una variante del mismo que tiene al menos 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el mismo, siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante esté inactivo. Por ejemplo, el reemplazo o los reemplazos pueden estar en una posición correspondiente en un polipéptido de PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o una variante del mismo. En particular, uno cualquiera o más de los reemplazos están en SEQ ID NO: 3, siempre que el polipéptido de PH20 modificado resultante esté inactivo y muestre menos del 20%, y generalmente menos del 10%, de la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3.
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3. Modificaciones adicionales y conjugados
Los polipéptidos de PH20 modificados incluyen los que contienen modificaciones químicas o postraduccionales. En algunos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Las modificaciones químicas y postraduccionales incluyen, pero sin limitación, PEGilación, sialación, albuminación, glucosilación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica.
También, además de una cualquiera o más modificaciones de aminoácidos, tales como reemplazos de aminoácidos, proporcionados en el presente documento, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden conjugarse o fusionarse con cualquier resto usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos químicos y recombinantes, siempre que el polipéptido resultante conserve la actividad hialuronidasa. Por ejemplo, además de una cualquiera o más modificaciones de aminoácidos, tales como reemplazos de aminoácidos, proporcionados en el presente documento, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento también pueden contener otras modificaciones que están o no en la secuencia primaria del polipéptido, incluyendo, pero sin limitación, modificación con un resto de carbohidrato, un resto de polietilenglicol (p Eg ), un resto de ácido siálico, un dominio Fc de inmunoglobulina G, o cualquier otro dominio o resto. Por ejemplo, dichas modificaciones adicionales pueden realizarse para aumentar la estabilidad o semivida en suero de la proteína.
En algunos casos, el dominio u otro resto es un agente dirigido, incluyendo cualquier agente que dirija el conjugado a uno o más tipos celulares uniéndose selectivamente con un receptor de superficie celular u otro resto de superficie celular. Por ejemplo, el dominio u otro resto es un agente dirigido que dirige el conjugado a células tumorales. En dichos ejemplos, un polipéptido de PH20 modificado, tal como cualquiera proporcionado en el presente documento, se une directa o indirectamente con un agente dirigido. Dichos agentes de dirección incluyen, pero sin limitación, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, anticuerpos y hormonas, o variantes alélicas, muteínas, o fragmentos de los mismos siempre que el agente de dirección se internalice por un receptor de superficie celular. Se describen posteriormente modificaciones ejemplares, no limitantes, adicionales.
a. Inmunogenicidad reducida
Los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden prepararse para tener inmunogenicidad reducida. La inmunogenicidad reducida puede efectuarse por cambios de secuencia que eliminan epítopos antigénicos del polipéptido o alterando modificaciones postraduccionales. Un experto en la materia está familiarizado con métodos para identificar epítopos antigénicos en un polipéptido (véase, por ejemplo, Liang et al. (2009) BMC Bioinformatics, 10: 302; Yang et al. (2009) Rev. Med. Virol., 19: 77-96). En algunos ejemplos, uno o más aminoácidos pueden modificarse para retirar o alterar un epítopo antigénico.
En otro ejemplo, la alteración de la glucosilación de una proteína también puede efectuar inmunogenicidad. Por ejemplo, se contempla alteración de la glucosilación del péptido, siempre que los polipéptidos contengan mínimamente al menos N-acetilglucosamina en restos de aminoácidos correspondientes a los restos de aminoácidos expuestos como N200, N333 y N358 de SEQ ID NO: 3 o 7.
Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 pueden modificarse de modo que carezcan de fucosa, particularmente bifucosilación. En particular, los polipéptidos de PH20 proporcionados en el presente documento no están bifucosilados. Esto puede conseguirse expresando y produciendo el polipéptido de PH20 en células hospedadoras que no efectúan bifucosilación. La fucosa es una desoxihexosa que está presente en una amplia diversidad de organismos, incluyendo mamíferos, insectos y plantas. Los glucanos fucosilados se sintetizan mediante fucosiltransferasas; véase, por ejemplo, Ma et al., Glycobiology, 16 (12): 158R-184R, (2006); Nakayama et al., J. Biol. Chem., 276: 16100-16106 (2001); y Sturla et al., Glycobiology, 15 (10): 924-935 (2005). En seres humanos, la fucosa existe frecuentemente como una modificación terminal de estructuras de glucano, y se ha mostrado que la presencia de fucosa a1,6 unida a N-acetilglucosamina es importante en el procesamiento y reconocimiento de glucoproteínas. En insectos, las estructuras centrales de N-glucano muestran bifucosilación con enlaces a1,6 y a1,3. La fucosilación central en células de insecto con enlaces a1,3 genera un epítopo de carbohidrato que es inmunogénico en seres humanos (véase, por ejemplo, Publicación de Estados Unidos n.° 20070067855). Por ejemplo, pueden generarse polipéptidos de PH20 proporcionados en el presente documento en células hospedadoras que son incapaces de bifucosilar el polipéptido. Por lo tanto, aunque pueden usarse células de insecto u otras células que bifucosilan para expresión de los polipéptidos, típicamente se usan células de mamífero, tales como células CHO.
En algunos ejemplos, pueden generarse polipéptidos de PH20 desfucosilados, o deficientes en fucosa, en células de insecto con rutas de glucosilación modificadas, mediante el uso de vectores de expresión de baculovirus que contienen genes de procesamiento de oligosacáridos eucariotas, creando de este modo sistemas de expresión de células de insecto “adaptados a mamíferos” (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 6.461.863). Como alternativa, la antigenicidad puede eliminarse por expresión de polipéptidos de PH20 en células de insecto que carecen de a1,3-fucosilatransferasa (FT3) (véase, por ejemplo, Publicación de Estados Unidos n.° 20070067855).
En otros ejemplos, pueden generarse polipéptidos de PH20 deficientes en fucosa o desfucosilados, por ejemplo, en líneas celulares que producen proteínas desfucosiladas, incluyendo células CHO LecO3 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem Biophys., 249: 533-545 (1986); Publicación de Patente de Estados Unidos n.° 2003/0157108; y documento WO 2004/056312) y líneas celulares nuligénicas, tales como gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO nuligénicas (Yamane-Ohnuki et al. Biotech, Bioeng. 87: 614 (2004)).
b. Conjugación con polímeros
En algunos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento se conjugan con polímeros. Los polímeros ejemplares que pueden conjugarse con los polipéptidos de PH20 incluyen homopolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir, poli-OH), poliaminas (es decir, poli-NH2) y ácidos policarboxílicos (es decir, poli-COOH) y heteropolímeros adicionales, es decir, polímeros que contienen uno o más grupos de acoplamiento diferentes, por ejemplo, grupos hidroxilo y grupos amina. Los ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas incluyen moléculas poliméricas seleccionadas de entre óxidos de polialquileno (PAO), tales como polialquilenglicoles (PAG), incluyendo polietilenglicoles (PEG), metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, PEG-glicidiléteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), polietilenglicoles ramificados (PEG), alcohol polivinílico (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D,L-aminoácidos, polietilen-coanhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico, dextranos incluyendo carboximetil-dextranos, heparina, albúmina homóloga, celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietil almidones e hidroxipropil almidones, glucógeno, agarosas y derivados de los mismos, goma de guar, pululano, inulina, goma xantana, carragenina, pectina, hidrolizados de ácido algínico y biopolímeros.
Típicamente, los polímeros son óxidos de polialquileno (PAO), tales como óxidos de polietileno, tales como PEG, típicamente mPEG, que tienen pocos grupos reactivos capaces de reticular. Típicamente los polímeros son moléculas poliméricas no tóxicas tales como (metoxi) polietilenglicol (mPEG) que pueden conjugarse covalentemente con los polipéptidos de PH20 (por ejemplo, con los grupos de unión en la superficie de proteína) usando una química relativamente simple.
Las moléculas poliméricas adecuadas para unión con los polipéptidos de PH20 incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxipolietilenglicoles (mPEG), PEG-glicidil éteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEG ramificados y óxido de polietileno (PEO) (véase por ejemplo, Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris y Zalipsky (eds.) "Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1): 125-136, 2000; Harris y Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3): 214-21; y Tsubery, J Biol. Chem 279(37): 38118-24, 2004). La molécula polimérica puede ser de un peso molecular que varía típicamente de aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 60 kDa. La molécula polimérica que se conjuga con un polipéptido de PH20 proporcionado en el presente documento puede tener un peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 kDa.
Se conocen en la técnica diversos métodos para modificar polipéptidos uniendo covalentemente (conjugando) un PEG o derivado de PEG (es decir, “PEGilación”) (véase por ejemplo documentos US 2006/0104968, u S 5.672.662, US 6.737.505 y US 2004/0235734). Las técnicas para PEGilación incluyen, pero sin limitación, enlazadores especializados y químicas de acoplamiento (véase, por ejemplo, Roberts, Adv. Drug Rev. 54: 459-476, 2002), unión de múltiples restos de PEG con un único resto de conjugación (tal como mediante el uso de PEG ramificados; véase, por ejemplo, Guiotto et al., Bioorg Med. Chem. Lett. 12: 177-180, 2002), PEGilación específica de sitio y/o monoPEGilación (véase por ejemplo, Chapman et al., Nature Biotech, 17: 780-783, 1999) y PEGilación enzimática dirigida (véase, por ejemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 487-504, 2002) (véase, también, por ejemplo, Lu y Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138; Lu y Felix (1993) Peptide Res. 6: 140-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46: 253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154: 3088-95; véase también, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10): 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2): 3S-8S). Los métodos y técnicas descritos en este campo pueden producir proteínas que tienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG unidos con una única molécula proteica (véase, por ejemplo, documento US 2006/0104968).
Se han descrito en la técnica numerosos reactivos para PEGilación. Dichos reactivos incluyen, pero sin limitación, PEG activado por N-hidroxisuccinimidilo (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, mPEG succinimidil-alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidil propionato, mPEG succinimidil butanoato, mPEG carboximetil succinimidil éster de ácido 3-hidroxibutanoico, PEG-succinimidil propionato homobifuncional, PEG propionaldehído homobifuncional, PEG butiraldehído homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, p-nitrofenilcarbonato PEG, mPEG-benzotriazol carbonato, propionaldehído PEG, mPEG butiraldehído, mPEG2 butiraldehído ramificado, mPEG acetilo, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG maleimida “sin enlazador”, mPEG vinilsulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG ortopiridil disulfuro, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona PEG-NHS, acrilato PEG-NHS, fluoresceína PEG-NHS y biotina PEG-NHS (véase por ejemplo, Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6: 62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12: 197-207, 1997; documentos US 5.672.662; U.S.
5.932.462; U.S. 6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S. 4.179.337; U.S. 5.122.614; U.S. 5.324.844; U.S.
5.446.090; U.S. 5.612.460; U.S.5.643.575; U.S. 5.766.581; U.S.5.795.569; U.S. 5.808.096; U.S.5.900.461; U.S.
5.919.455; U.S. 5.985.263; U.S. 5.990.237; U.S. 6.113.906; U.S. 6.214.966; US 6.258.351; U.S. 6,340,742; U.S. 6.413.507; U.S. 6.420.339; U.S.6.437.025; U.S. 6.448.369; U.S.6.461.802; US 6.828.401; U.S.6.858.736; U.S.
2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S.2002/0072573; US 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; WO 0187925; y WO 2005000360).
D. MÉTODOS PARA IDENTIFICAR ENZIMAS DEGRADANTES DE HIALURONANO MODIFICADAS CON PROPIEDADES O ACTIVIDADES ALTERADAS
Se describen en el presente documento métodos para identificar una enzima degradante de hialuronano modificada o variante, tal como una hialuronidasa modificada o un polipéptido de PH20 modificado, que muestra una actividad o propiedad alterada en comparación con una enzima degradante de hialuronano no modificada. En particular, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para explorar con respecto a una o más enzimas degradantes de hialuronano modificadas, tales como uno o más de hialuronidasa o polipéptido de PH20 modificados, que muestra actividad aumentada y/o estabilidad aumentada en presencia de un agente o condición de desnaturalización. Por ejemplo, los métodos pueden usarse para identificar una enzima degradante de hialuronano modificada o variante, tal como una hialuronidasa modificada o variante o polipéptido de PH20 modificado o variante, que muestra estabilidad aumentada en virtud de resistencia aumentada a condiciones de desnaturalización, incluyendo pero sin limitación, condiciones de desnaturalización causadas por temperatura (por ejemplo, temperatura elevada tal como calor), agitación, ausencia de sal o baja salinidad, presencia de un excipiente y/o un agente desnaturalizante. Los agentes desnaturalizantes o excipientes ejemplares incluyen, pero sin limitación, antiadherentes, aglutinantes, recubrimiento, cargas y diluyentes, saporíferos, colorantes, lubricantes, emolientes, conservantes, sorbentes o edulcorantes. Por ejemplo, diversos excipientes, tales como conservantes, pueden actuar como agentes desnaturalizantes de proteínas. En el método, la actividad también puede compararse con una enzima degradante de hialuronano no modificada en las mismas condiciones de desnaturalización, y una enzima degradante de hialuronano modificada identificada o seleccionada que muestra mayor actividad que la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente.
En el método, se describen una o más enzimas degradantes de hialuronano modificadas. En algunos ejemplos, se prepara una biblioteca de moléculas modificadas. Se describen en el presente documento métodos de mutagénesis y generación de bibliotecas o colecciones de moléculas variantes y se conocen por los expertos en la materia usando técnicas de ADN recombinante convencionales. En un ejemplo, las enzimas que se ensayan pueden agruparse y explorarse, por lo que el método permite la selección de solamente las enzimas que muestren una actividad deseada. En otro ejemplo, las enzimas ensayadas pueden separarse físicamente y explorarse individualmente, tal como formateando en matrices, tales como matrices direccionables.
Las enzimas degradantes de hialuronano modificadas se pueden ensayar o explorar con respecto a actividad hialuronidasa en presencia y ausencia de una o más condiciones de desnaturalización o agente desnaturalizante. Después de ensayar en ambos conjuntos de condiciones, las actividades se evalúan para identificar enzimas degradantes de hialuronano modificadas que muestran actividad en presencia de la condición de desnaturalización. El nivel o la cantidad de actividad deseados seleccionados como un punto de corte en los métodos puede determinarse empíricamente por el usuario, y depende de factores tales como la enzima degradante de hialuronano particular, la aplicación o el uso deseado de la enzima de degradante de hialuronano, la condición de desnaturalización o agente desnaturalizante particular y otros factores similares. Típicamente, se identifica una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra al menos 5 % o 10 % de la actividad en presencia de un agente o una condición desnaturalizante en comparación con su ausencia, y en general al menos 15 %, 20 %, 30 % 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, por ejemplo al menos 40 % de la actividad.
Adicionalmente o como alternativa, la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada en presencia de una o más condiciones de desnaturalización o agentes desnaturalizantes se compara con la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente en presencia del mismo agente o condición o los mismos agentes o condiciones de desnaturalización. En dichos ejemplos, se entiende que la actividad de la enzima modificada y no modificada se ensaya en las mismas condiciones (por ejemplo, tiempo, temperatura, composición), excepto por la diferencia en la enzima particular ensayada (no modificada frente a modificada). Se identifica una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra mayor actividad, tal como al menos 110%, 120%, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 % 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada.
El método puede realizarse múltiples veces, por lo que las etapas del método se repiten 1, 2, 3, 4 o 5 veces. El método descrito en el presente documento también es por iteraciones. En un ejemplo, después de realizarse el método, cualquier enzima degradante de hialuronano modificada identificada puede modificarse o modificarse adicionalmente para aumentar u optimizar la actividad.
Se proporciona una descripción de las etapas del método y componentes del método en las subsecciones a continuación.
1. Enzimas degradantes de hialuronano y bibliotecas de enzimas degradantes de hialuronano modificadas
En los métodos del presente documento, se ensayan una o más enzimas degradantes de hialuronano modificadas, tales como una hialuronidasa o un polipéptido de PH20, con respecto a una actividad o propiedad deseada, tal como estabilidad aumentada (por ejemplo, resistencia aumentada a una condición de desnaturalización). La enzima degradante de hialuronano modificada puede modificarse en comparación con una enzima degradante de hialuronano no modificada, tal como cualquier enzima degradante de hialuronano conocida en la técnica. Las enzimas degradantes de hialuronano son una familia de enzimas que degradan ácido hialurónico, que es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Las enzimas degradantes de hialuronano actúan para degradar hialuronano escindiendo polímeros de hialuronano, que están compuestos de unidades de disacáridos repetidas: ácido D-glucurónico (GlcA) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) unidos entre sí mediante enlaces glucosídicos (3-1 — 4^ y (3-1 — ^3 alternantes. Catalizando la hidrólisis de ácido hialurónico, un constituyente principal de la barrera intersticial, las enzimas degradantes de hialuronano reducen la viscosidad del ácido hialurónico, aumentando de este modo la permeabilidad tisular. En consecuencia, las enzimas degradantes de hialuronano para los usos y métodos descritos en el presente documento incluyen cualquier enzima que tenga la capacidad de catalizar la escisión de una cadena o un polímero de disacárido de hialuronano. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano escinde el enlace glucosídico p-1— 4 en la cadena o polímero de hialuronano. En otros ejemplos, la enzima degradante de hialuronano cataliza la escisión del enlace glucosídico p-1— 3 en la cadena o polímero de hialuronano
Las enzimas degradantes de hialuronano incluyen enzimas que están unidas a membrana o que son formas solubles que se secretan de células. Por lo tanto, cuando las enzimas degradantes de hialuronano incluyen una secuencia señal de anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) y/o están de otro modo ancladas a membrana o son insolubles, dichas enzimas degradantes de hialuronano pueden proporcionarse en forma soluble por truncamiento C terminal o supresión de toda o una parte de la secuencia señal de anclaje de GPI para hacer a la enzima secretada y soluble. Por lo tanto, las enzimas degradantes de hialuronano incluyen variantes truncadas en el extremo C terminal, por ejemplo, truncadas para retirar toda o una parte de una secuencia señal de anclaje de GPI. Son ejemplos de dichas hialuronidasas solubles hialuronidasas PH20 solubles, tales como cualquiera expuesta en la Patente de Estados Unidos n.° 7.767.429; Publicaciones de Estados Unidos n.° US 2004/0268425 y US 2010/0143457.
Son enzimas degradantes de hialuronano ejemplares las hialuronidasas animales no humanas o humanas, hialuronidasas bacterianas, hialuronidasas de sanguijuelas o condroitinasas que muestran actividad degradante de hialuronano, incluyendo formas solubles o truncadas de las mismas que están activas. Son hialuronidasas animales no humanas ejemplares cualquiera de las expuestas en cualquiera de las SEQ ID NO: 8-31, 856-861, 869, 870, 871­ 886, o variantes truncadas en el extremo C terminal, maduras, que son solubles y activas, o formas activas de las mismas. Son hialuronidasas humanas ejemplares cualquiera de las expuestas en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 6, 7, 32-66, 68-72 u 887-890, o variantes truncadas en el extremo C terminal, maduras, que son solubles y activas, o formas activas de las mismas, y en particular cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32, 66, 69 o 72. Son hialuronidasas bacterianas ejemplares cualquiera de las expuestas en cualquiera de las SEQ ID NO: 891-919 o variantes truncadas en el extremo C terminal, maduras, que son solubles y activas, o formas activas de las mismas. Se exponen hialuronidasas ejemplares de sanguijuelas en SEQ ID NO: 920 o 921, o variantes truncadas en el extremo C terminal, maduras, que son solubles y activas, o formas activas de las mismas. Se exponen condroitinasas ejemplares que tienen actividad enzimática degradante de hialuronano en SEQ ID NO: 922-924, o variantes truncadas en el extremo C terminal maduras, que son solubles y activas, o formas activas de las mismas.
Por ejemplo, se ensayan uno o más polipéptidos de PH20 modificados con respecto a una actividad o propiedad deseada, tal como estabilidad aumentada (por ejemplo, resistencia aumentada a una condición de desnaturalización). El polipéptido de PH20 modificado puede modificarse en comparación con un polipéptido de PH20 no modificado, tal como cualquier polipéptido de PH20 conocido, polipéptido nativo, de tipo silvestre o de referencia. Por ejemplo, el polipéptido de PH20 modificado se modifica en comparación con una forma de longitud completa, soluble o activa de un polipéptido de PH20, tal como cualquiera expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o un polipéptido que muestra al menos 85 %, tal como al menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % %, 99 % o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72. En ejemplos particulares del método del presente documento, el polipéptido de PH20 de partida o no modificado tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
Pueden explorarse bibliotecas o colecciones de enzimas degradantes de hialuronano modificadas. Las enzimas degradantes de hialuronano pueden modificarse por cualquier proceso conocido por un experto en la materia que puede alterar la estructura de una proteína. Los ejemplos de modificaciones incluyen reemplazo, adición y supresión de uno o más aminoácidos de la proteína para formar bibliotecas o colecciones de enzimas degradantes de hialuronano modificadas. Está dentro del nivel de un experto en la materia generar proteínas modificadas o variantes para su uso en los métodos del presente documento. Se conocen bien en la técnica métodos de mutagénesis e incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida tal como por ejemplo QuikChange (Stratagene) o mutagénesis de saturación. Los métodos de mutagénesis incluyen, pero sin limitación, mutagénesis mediada por sitio, mutagénesis por PCR, mutagénesis por casete, mutagénesis dirigida, mutagénesis de puntos aleatorios, mutagénesis usando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificado por fosforotioato, mutagénesis que usa ADN bicatenario con huecos, reparación con desapareamientos puntuales, mutagénesis que usa cepas hospedadoras deficientes en reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis de supresión, mutagénesis por síntesis génica total, reparación de rotura bicatenaria y muchos otros conocidos por expertos en la materia. En los métodos del presente documento, puede efectuarse mutagénesis a lo largo de la longitud completa de una proteína o dentro de una región de una proteína. La mutación puede realizarse racionalmente o aleatoriamente.
En algunos ejemplos, los métodos descritos en el presente documento se realizan de modo que la identidad de cada proteína mutante se conozca a priori antes de ensayarse la proteína. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden conducir a mutagénesis y exploración o métodos de ensayo que sean abordables. Esto puede permitir la facilidad de las comparaciones entre las actividades de proteínas ensayadas sin la necesidad de secuenciar proteínas identificadas. Por ejemplo, pueden usarse métodos de mutagénesis dirigida para generar individualmente proteínas mutantes. Puede realizarse mutagénesis mediante reemplazo de restos de aminoácidos individuales en posiciones diana específicas una a una, de modo que cada mutante individual generado sea el producto individual de cada reacción de mutagénesis individual. Las moléculas de ADN mutantes pueden diseñarse, generarse por mutagénesis y clonarse individualmente, tal como en matrices abordables, de modo que estén físicamente separadas entre sí y cada una es el producto individual de una reacción de mutagénesis independiente. Los aminoácidos seleccionados para reemplazar las posiciones diana en la proteína particular que se optimiza pueden ser los 19 aminoácidos restantes, o un grupo más restringido que contiene solamente aminoácidos seleccionados. En algunos métodos descritos en el presente documento, cada aminoácido que se reemplaza se reemplaza independientemente por 19 de los aminoácidos restantes o por menos de 19 de los aminoácidos restantes, tales como 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 de los aminoácidos restantes.
2. Exploración o ensayo con respecto a una actividad o propiedad deseada
La actividad hialuronidasa u otra actividad de una composición que contiene una enzima degradante de hialuronano modificada se explora o se ensaya en condiciones que exponen la enzima degradante de hialuronano a una condición de desnaturalización o un agente desnaturalizante (presencia de condición de desnaturalización o agente desnaturalizante). No es necesario que la condición desnaturalizante o el agente desnaturalizante sea una condición o un agente que sea completamente letal para la enzima, pero en general es cualquier condición o agente que desestabilice la actividad enzimática a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la condición de desnaturalización puede ser una condición provocada por temperatura (por ejemplo, temperatura elevada tal como mayor de o aproximadamente o 30 °C, por ejemplo, de 3o °C a 42 °C tal como o aproximadamente 37 °C), agitación, baja salinidad o ninguna sal (por ejemplo, NaCl), y/o provocada por la presencia de un agente desnaturalizante, tal como la presencia de excipientes (por ejemplo, presencia de conservantes).
Para fines de seleccionar o identificar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestre estabilidad o estabilidad aumentada en la condición de desnaturalización, la actividad puede compararse con la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada en ausencia de la condición de desnaturalización y/o la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente en presencia de la condición de desnaturalización. Por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano modificada también puede explorarse o ensayarse en las mismas condiciones, excepto sin incluir una condición desnaturalizante o agente desnaturalizante (ausencia de condición de desnaturalización o agente desnaturalizante). Si se desea, la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente (por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano que no contiene el reemplazo o los reemplazos de aminoácidos) también puede ensayarse en las mismas condiciones que exponen la enzima degradante de hialuronano a la misma condición de desnaturalización o un agente desnaturalizante.
Por ejemplo, cada miembro de una biblioteca o colección de enzimas degradantes de hialuronano modificadas se incuba en o se expone a una o más condiciones desnaturalizantes. La incubación o exposición puede producirse in vivo o in vitro. Típicamente, el ensayo se realiza in vitro. La misma enzima modificada también se expone o incuba frente a una condición de referencia o de control que no contiene la condición de desnaturalización. Las actividades en ambas condiciones se comparan para identificar enzimas degradantes de hialuronano modificadas que muestran estabilidad tras exposición a una condición o condiciones de desnaturalización. Además, en la exploración o identificación de actividad de la enzima en los dos conjuntos diferentes de condiciones, generalmente las únicas condiciones que varían en el ensayo están relacionadas con la presencia o ausencia de una o más condiciones de desnaturalización. Las otras condiciones del ensayo, incluyendo pero sin limitación, tiempo, temperatura y/u otras condiciones de incubación, pueden ser iguales para ambos conjuntos de condiciones.
Por ejemplo, puede conseguirse exposición mediante incubación de una enzima degradante de hialuronano modificada en un tampón de ensayo o composición que se ha modificado o ajustado para contener un agente desnaturalizante tal como un excipiente o baja salinidad o ausencia de sal. Los agentes desnaturalizantes o excipientes ejemplares incluyen, pero sin limitación, antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, cargas y diluyentes, saporíferos, colorantes, lubricantes, emolientes, conservantes, sorbentes o edulcorantes. La elección de tampón que se usa puede determinarse empíricamente por un experto en la materia dependiendo del parámetro o los parámetros particulares que se modifiquen. Son tampones de ensayo ejemplares los tampones de Good (véase, por ejemplo, Good et al. (1966) Biochemistry, 5: 467-477). Los ejemplos de dichos tampones incluyen, pero sin limitación tampones ACES, ADA, BES, Bicina, BIS-TRIS, CAPS, HEPES, MES, MOPS, PIPES, TRIS o Trizma®. Además, la cantidad o concentración del excipiente o la sal puede determinarse empíricamente por un experto en la materia dependiendo de la elección de excipiente o sal y el nivel o la actividad deseados de la enzima degradante de hialuronano modificada.
En un ejemplo, el tampón de ensayo o composición se modifica por la inclusión de una cantidad de un agente desnaturalizante o excipiente desnaturalizante que es un conservante, por ejemplo, un conservante fenólico. El conservante fenólico puede ser fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico y parabenos incluyendo metilparabeno y propilparabeno. En particular, el conservante fenólico es fenol y/o m-cresol. La cantidad total de uno o más agentes conservantes fenólicos como un porcentaje (%) de concentración en masa (p/v) puede ser entre 0,05 % y 0,6 %, 0,1 % y 0,4 %, 0,1 % y 0,3 %, 0,15 % y 0,325 % , 0,15 % y 0,25 %, 0,1 % y 0,2 %, 0,2 % y 0,3 % o 0,3 % y 0,4 % inclusive. En dicho ejemplo, la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada se ensaya o se evalúa en presencia de dicha cantidad total (por ejemplo, entre o aproximadamente entre 0,05 % y 0,6 %) de uno o más conservantes, por ejemplo, uno o más conservantes fenólicos. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano modificada también puede ensayarse o evaluarse en una condición de control o referencia en la que el tampón de ensayo o la composición no se modifica para contener un conservante. En ciertos casos, como control, la actividad de enzimas degradantes de hialuronano modificadas también puede compararse con la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente que no contiene la modificación o las modificaciones en condiciones que contienen un agente conservante y/o en condiciones que no contienen un agente conservante.
En otro ejemplo, el tampón de ensayo se modifica por la presencia de una condición de desnaturalización que es baja salinidad o ausencia de sal. Como se analiza en otra parte en el presente documento, las enzimas degradantes de hialuronano, tales como PH20, generalmente requieren sal (por ejemplo, NaCl, Lys-Lys o MgCh) para su actividad. Por lo tanto, la ausencia de sal o baja salinidad es desnaturalizante para la enzima. En un ejemplo, el tampón de ensayo se modifica mediante la inclusión de una cantidad de sal que es menor de 100 mM, por ejemplo, menor de 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o menos. En dicho ejemplo, la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada se ensaya en ausencia de sal o en presencia de sal que es menor de 100 mM. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano modificada también puede ensayarse o evaluarse en una condición de control o referencia en la que el tampón de ensayo contiene una mayor concentración salina, generalmente entre o aproximadamente entre 140 mM y 200 mM. En ciertos casos, como control, la actividad de enzimas degradantes de hialuronano modificadas también puede compararse con la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente que no contiene la modificación o las modificaciones en condiciones que contienen baja salinidad o ausencia de sal, tal como menos de 100 mM y/o en condiciones que contienen sal en una cantidad que está entre o aproximadamente entre 140 mM y 200 mM.
También puede conseguirse exposición de una enzima degradante de hialuronano a una condición de desnaturalización mediante incubación de una enzima degradante de hialuronano modificada en condiciones que se sabe que son desnaturalizantes, tal como en condiciones de temperatura elevada tales como una temperatura mayor de o aproximadamente o 30 °C (por ejemplo, de 30 °C a 42 °C tal como o aproximadamente 37 °C) o agitación. Por ejemplo, la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada se ensaya a temperaturas elevadas mayores de o aproximadamente o de 30 °C a 42 °C. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano modificada también puede ensayarse o evaluarse en una condición de control o referencia donde la temperatura es menor de 30 °C, tal como entre o aproximadamente entre 0 C y 25 °C, por ejemplo de 0 °C a 5 °C o de 18 °C a 25 °C. En ciertos casos, como control, la actividad de las enzimas degradantes de hialuronano modificadas también puede compararse con la enzima degradante de hialuronano no modificada correspondiente que no contiene la modificación o las modificaciones a temperaturas elevadas mayores de o aproximadamente o 30 °C a 42 °C y/o temperaturas menores de 30 °C, tal como entre o aproximadamente entre 0 °C y 25 °C, por ejemplo, 0 °C y 5 °C o 18 °C y 25 °C.
La enzima degradante de hialuronano modificada puede exponerse a una o más de una de las condiciones. La exposición a una condición puede producirse simultáneamente, posteriormente, intermitentemente o periódicamente con respecto a la exposición a una o más condiciones distintas.
En un ejemplo, en el método del presente documento, la enzima degradante de hialuronano modificada se incuba o se expone a la condición de desnaturalización o el agente desnaturalizante antes de realizar un ensayo con respecto a actividad hialuronidasa. Por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano modificada se incuba en presencia de un agente desnaturalizante o se expone a una o más condiciones de desnaturalización o condiciones de control, tales como una o más de las condiciones de desnaturalización o condiciones de control como se ha descrito anteriormente. La incubación o exposición puede ser durante cualquier periodo de tiempo deseado, y puede determinarse empíricamente por un experto en la materia. Por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano modificada puede incubarse o exponerse a una o más condiciones de desnaturalización, agentes desnaturalizantes o condiciones de control durante o aproximadamente durante 1 minuto a 1 mes, tal como 1 minuto a 3 semanas, 1 minuto a 2 semanas, 1 minuto a 1 semana, 1 minuto a 24 horas, 1 minuto a 12 horas, tal como 30 minutos a 6 horas o 1 hora a 4 horas, y en general al menos o aproximadamente al menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Después del momento de incubación o exposición, la muestra o composición que contiene la enzima degradante de hialuronano modificada (o enzima de control no modificada) se evalúa con respecto a ensayo de hialuronidasa. En otro ejemplo, la enzima degradante de hialuronano modificada se expone o se incuba en una o más condiciones de desnaturalización y se evalúa simultáneamente o concurrentemente con respecto a la actividad hialuronidasa. En cualquier ejemplo donde se evalúe una enzima degradante de hialuronano modificada, se entiende que una enzima degradante de hialuronano no modificada que no contiene la modificación o las modificaciones también puede evaluarse en condiciones de ensayo similares para comparación.
Se conocen bien en la técnica ensayos para evaluar la actividad hialuronidasa. Se describen ejemplos de dichos ensayos en la sección G. En un ejemplo, la actividad hialuronidasa puede evaluarse en un ensayo de microturbidez, en el que la cantidad de HA no degradado se mide por la adición de un reactivo que precipita HA (por ejemplo, cloruro de cetilpiridinio (CPC) o suero acidificado) después de permitir que la enzima reaccione con HA. En otro ejemplo, la actividad hialuronidasa puede evaluarse usando un ensayo de microtitulación en el que se mide el ácido hialurónico biotinilado residual después de incubación con hialuronidasa (véase por ejemplo, Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251: 263-269, Publicación de Patente de Estados Unidos n.° 20050260186). Las actividades resultantes en cada una de las condiciones ensayadas se determinan y se comparan.
3. Selección o identificación
En el método, después de explorar enzimas degradantes de hialuronano modificadas en una o más condiciones de desnaturalización, las actividades hialuronidasa de las enzimas ensayadas se comparan. El método se practica para identificar una enzima degradante de hialuronano modificada que es más resistente a desnaturalización por una condición o un agente desnaturalizante, por el que la actividad de la enzima es indicativa de la estabilidad de la enzima como una medida de su resistencia a la desnaturalización. Se entiende que puede tolerarse algo de reducción de la actividad enzimática, como resultado de desnaturalización, en diversas aplicaciones, y por lo tanto el método puede practicarse para seleccionar una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra una actividad necesaria tras exposición a una condición de desnaturalización para permitir su uso o aplicación (por ejemplo, actividad terapéutica). Por ejemplo, puede seleccionarse una enzima modificada que pierda actividad más lentamente que la enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia correspondiente, pero cuya actividad conservada es suficiente para una aplicación o un fin particular.
En ejemplos de los métodos del presente documento, la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada se evalúa tras exposición a una primera condición de desnaturalización y también se evalúa después de exposición a una segunda condición que es una condición de control o no de desnaturalización, y las actividades hialuronidasas resultantes se comparan. Para comparación, en algunos ejemplos, la actividad puede representarse como una relación de la actividad o un porcentaje de la actividad en una condición de desnaturalización en comparación con una condición de control o no de desnaturalización. Por ejemplo, cuando el parámetro que difiere entre la primera y segunda condición es la presencia de conservante (por ejemplo, conservante fenólico), la actividad puede representarse como una relación de la actividad o porcentaje de actividad observado en presencia de conservante (por ejemplo, conservante fenólico) frente a actividad en ausencia de conservante (por ejemplo, conservante fenólico). En otro ejemplo, donde el parámetro que difiere entre la primera y segunda condición es la temperatura, la actividad puede representarse como una relación de la actividad o el porcentaje de actividad observado en presencia de temperatura elevada (por ejemplo, de 30 °C a 42 °C) en comparación con actividad en presencia de una temperatura inferior tal como de 0 °C a 25 °C, por ejemplo de 0 °C a 5 °C o de 18 °C a 25 °C.
Se selecciona o identifica una enzima degradante de hialuronano modificada que conserva o muestra cualquier actividad deseada en presencia de la condición de desnaturalización en comparación con su ausencia. El punto de corte particular de actividad para selección de enzimas en el presente documento depende del usuario y/o la práctica del método particular y puede determinarse empíricamente dependiendo de factores tales como la condición de desnaturalización o el agente desnaturalizante particulares, la enzima degradante de hialuronano modificada particular, la aplicación deseada de la enzima degradante de hialuronano identificada o seleccionada y otros factores similares. En general, una enzima degradante de hialuronano modificada seleccionada o identificada muestra estabilidad si se mide o evalúa cualquier actividad detectable tras exposición o incubación con una condición de desnaturalización o agente desnaturalizante. Por ejemplo, una enzima degradante de hialuronano modificada seleccionada o identificada muestra estabilidad, o resistencia a una condición de desnaturalización o agente desnaturalizante, si muestra al menos 5 % o 10 % de la actividad de la misma enzima en ausencia de la condición de desnaturalización o agente desnaturalizante, y en general si la enzima degradante de hialuronano modificada muestra una actividad que es al menos 15 % de la actividad hialuronidasa inicial antes de la incubación en presencia de la condición de desnaturalización. Por ejemplo, se selecciona o identifica una enzima degradante de hialuronano modificada que muestra al menos (o al menos aproximadamente) 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 110%, 120 %, 130 %, 140 %, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de la actividad hialuronidasa inicial de la enzima degradante de hialuronano modificada ensayada en una condición de control o no de desnaturalización.
En otros ejemplos de los métodos del presente documento, la actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada se evalúa tras exposición a una condición de desnaturalización y la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia también se evalúa tras exposición a las mismas condiciones de desnaturalización. En dichos ejemplos, las actividades se comparan cuando las enzimas se exponen a las mismas condiciones. Para comparación, la actividad en una condición de desnaturalización puede representarse como una relación de actividad o un porcentaje de actividad de una enzima degradante de hialuronano modificada en comparación con una enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia. En dichos ejemplos, se selecciona un enzima degradante de hialuronano modificada que muestra mayor actividad en una condición de desnaturalización que la enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia. Por lo tanto, la enzima degradante de hialuronano modificada es una que es más resistente a la condición. Por ejemplo, donde la condición de desnaturalización sea la presencia de conservante (por ejemplo, conservante fenólico), la actividad observada en presencia de conservante (por ejemplo, conservante fenólico) puede representarse como una relación de la actividad o porcentaje de actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada en comparación con la enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia. En otro ejemplo, donde la condición de desnaturalización es alta temperatura, la actividad observada en presencia de temperatura elevada (por ejemplo, de 30 °C a 42 °C) puede representarse como una relación de la actividad o el porcentaje de actividad de la enzima degradante de hialuronano modificada en comparación con la enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia.
En dichos ejemplos, se identifica o selecciona una enzima degradante de hialuronano modificada, tal como una PH20 modificada, que muestra una relación de actividad que es mayor de o al menos 1,1, de modo que la enzima muestra mayor actividad que la enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia en la condición de desnaturalización. Por ejemplo, la relación es de al menos o al menos aproximadamente 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 o mayor. Una enzima degradante de hialuronano modificada (por ejemplo, una PH20 modificada) puede seleccionarse si su actividad es al menos 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad de la enzima degradante de hialuronano no modificada o de referencia cuando se ensaya en las mismas condiciones. Por lo tanto, se identifican enzimas degradantes de hialuronano modificadas que muestran mayor estabilidad o estabilidad mejorada en comparación con la enzima degradante de hialuronano no modificada o una enzima degradante de hialuronano de referencia como se manifiesta por resistencia aumentada a una condición de desnaturalización o agente desnaturalizante.
4. Métodos por iteraciones
El método descrito en el presente documento también es por iteraciones. En un ejemplo, después de realizarse el método, cualquier enzima degradante de hialuronano modificada que se ha identificado que muestra estabilidad, tal como estabilidad aumentada, en una condición de desnaturalización puede modificarse o modificarse adicionalmente para aumentar u optimizar la estabilidad. Puede crearse una biblioteca secundaria introduciendo modificaciones adicionales en una primera enzima degradante de hialuronano modificada identificada. Por ejemplo, pueden combinarse modificaciones que se ha identificado que confieren estabilidad, tal como aumento de estabilidad, para generar una biblioteca combinatoria. La segunda biblioteca puede ensayarse usando los ensayos y métodos descritos en el presente documento.
En otro ejemplo de un aspecto por iteraciones del método, las enzimas degradantes de hialuronano modificadas que se ha identificado que no muestran estabilidad tal como estabilidad aumentada (por ejemplo, de modo que no sean activas o no tengan actividad aumentada en la condición de desnaturalización), pueden modificarse adicionalmente y volver a ensayarse con respecto a estabilidad en una condición de desnaturalización. Las modificaciones adicionales pueden dirigirse cerca de regiones particulares (por ejemplo, restos de aminoácidos particulares) asociadas con la actividad y/o estabilidad de la molécula. Por ejemplo, los restos que están asociados con la actividad y/o estabilidad de la molécula generalmente son restos críticos que están implicados en el plegamiento estructural u otras actividades de la molécula. Por lo tanto, dichos restos se requieren para actividad, generalmente en cualquier condición. Los restos críticos pueden identificarse porque, cuando se mutan, se anula o reduce una actividad normal de la proteína. Por ejemplo, pueden identificarse restos críticos que, cuando se mutan en una enzima degradante de hialuronano, muestran actividad hialuronidasa reducida o eliminada en una condición de ensayo normal o de control. Puede generarse una biblioteca adicional de proteínas modificadas con mutaciones de aminoácidos dirigidas en o cerca de los restos de aminoácidos críticos identificados, tales como restos de aminoácidos críticos adyacentes a los identificados. En algunos ejemplos, las mutaciones pueden ser reemplazo de aminoácidos por cualquier otro de hasta 19 restos de aminoácidos distintos. La biblioteca secundaria puede ensayarse usando los ensayos y métodos descritos en el presente documento.
E. Producción de polipéptidos de PH20 modificados y de moléculas de ácido nucleico codificantes
Pueden obtenerse polipéptidos de un polipéptido de PH20 modificado expuesto en el presente documento por métodos bien conocidos en la técnica para purificación de proteínas y expresión de proteínas recombinantes. Los polipéptidos también pueden sintetizarse químicamente. Pueden obtenerse técnicamente formas modificadas o variantes, incluyendo truncadas, a partir de un polipéptido de tipo silvestre usando métodos de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, pueden modificarse técnicamente polipéptidos de PH20 modificados a partir de un polipéptido de tipo silvestre, tal como mediante mutagénesis dirigida.
1. Aislamiento o preparación de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de PH20
Los polipéptidos pueden clonarse o aislarse usando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonación y aislamiento de moléculas de ácido nucleico. Dichos métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y exploración de bibliotecas, incluyendo exploración de hibridación de ácido nucleico, exploración basada en anticuerpos y exploración basada en actividad. Por ejemplo, cuando los polipéptidos se producen por medios recombinantes, puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para identificación de ácidos nucleicos que codifican genes deseados. Puede usarse cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc de longitud completa o parcial (es decir, que abarca región codificante completa) o clon de ADN genómico que codifica una PH20, tal como a partir de una fuente celular o tisular.
Pueden usarse métodos para amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido deseado, incluyendo por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ejemplos de dichos métodos incluyen uso de un termociclador Perkin-Elmer Cetus y Taq polimerasa (Gene Amp). Puede usarse un material que contiene ácido nucleico como material de partida a partir del que puede aislarse una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado. Por ejemplo, en métodos de amplificación pueden usarse preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos tisulares, muestras de fluidos (por ejemplo, sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos. La fuente puede ser de cualquier especie eucariótica incluyendo, pero sin limitación, fuentes vertebradas, mamíferas, humanas, porcinas, bovinas, felinas, aviares, equinas, caninas y otras de primates. También pueden usarse bibliotecas de ácido nucleico como una fuente de material de partida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse basándose en secuencias expresadas a partir de las que se genera un polipéptido deseado. Los cebadores pueden diseñarse basándose en la retrotraducción de una secuencia de aminoácidos polipeptídica. Si se desea, pueden usarse cebadores degradados para amplificación. Pueden usarse cebadores oligonucleotídicos que hibridan con secuencias en los extremos 3' y 5' de la secuencia deseada como cebadores para amplificar por secuencias de PCR a partir de una muestra de ácido nucleico. Pueden usarse cebadores para amplificar la PH20 de longitud completa entera, o una secuencia truncada de la misma, tal como un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de PH20 solubles proporcionados en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación pueden secuenciarse y puede confirmarse que codifican un polipéptido deseado.
Las secuencias de nucleótidos adicionales pueden unirse con una molécula de ácido nucleico que codifica polipéptidos, incluyendo secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción para el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican la proteína central. Además, secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales pueden unirse operativamente con una molécula de ácido nucleico que codifica polipéptidos. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelular, y secuencias de secreción, por ejemplo secuencias señal heterólogas, diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Dichas secuencias se conocen por los expertos en la materia. Por ejemplo, las secuencias señal heterólogas ejemplares incluyen, pero sin limitación, secuencias señal heterólogas de IgG kappa humanas y de ratón expuestas en SEQ ID NO: 868. Las secuencias de restos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican regiones de unión a proteínas también pueden unirse a moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Dichas regiones incluyen, pero sin limitación, secuencias de restos que facilitan o codifican proteínas que facilitan la captación de una enzima en células diana específicas, o alteran de otro modo la farmacocinética de un producto de un gen sintético.
Además, pueden añadirse marcadores u otros restos, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación de afinidad del polipéptido. Por ejemplo, secuencias de restos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican un marcador epitópico u otro marcador detectable también pueden unirse a moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican un marcador His o un Marcador Flag.
Los ácidos nucleicos identificados y aislados pueden después insertarse en un vector de clonación apropiado. Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados plasmídicos de pCMV4, pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ejemplificado en el presente documento (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 4 y 5). La inserción en un vector de clonación puede conseguirse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos terminales cohesivos complementarios. La inserción puede efectuarse usando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativamente, puede producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos de ADN; estos enlazadores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen proteico pueden modificarse mediante cola homopolimérica.
Pueden introducirse moléculas recombinantes en células hospedadoras mediante, por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia génica. La transformación de células hospedadoras con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de proteína aislado, ADNc o secuencia de ADN sintetizada permite la generación de múltiples copias del gen. Por lo tanto, el gen puede obtenerse en grandes cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinantes de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado.
Además de la producción recombinante, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden producirse por síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida (véase, por ejemplo, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc., 85: 2149-2154). Puede realizarse síntesis de proteínas in vitro usando técnicas manuales o mediante automatización. Puede conseguirse síntesis automática, por ejemplo, usando el Sintetizador Peptídico Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City CA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Diversos fragmentos de un polipéptido pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos.
2. Generación de ácido nucleico muíante o modificado y que codifica polipéptidos
Las modificaciones proporcionadas en el presente documento de acuerdo con las reivindicaciones pueden realizarse por técnicas de ADN recombinante convencionales tales como las rutinarias para los expertos en la materia. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para efectuar mutación de uno cualquiera o más aminoácidos en una proteína diana. Los métodos incluyen mutagénesis dirigida convencional (usando, por ejemplo, un kit, tal como QuikChange disponible de Stratagene) de moléculas de ácido nucleico codificantes, o mediante métodos de síntesis de polipéptidos de fase sólida.
3. Vectores y células
Para expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, tales como cualquier polipéptido de PH20 modificado descrito en el presente documento, el ácido nucleico que contiene toda o una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de proteína insertada. Las señales de transcripción y traducción necesarias también pueden proporcionarse por el promotor nativo para genes de enzimas y/o sus regiones flanqueantes.
También se proporcionan vectores que contienen un ácido nucleico que codifica la enzima de acuerdo con la reivindicación. También se proporcionan células que contienen los vectores de acuerdo con las reivindicaciones. Las células incluyen células eucariotas y procariotas, y los vectores son cualquiera adecuado para su uso en las mismas. En general, la célula es una célula que es capaz de efectuar glucosilación de la proteína codificada.
Se proporcionan células procariotas y eucariotas que contienen los vectores. Dichas células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Arqueas, células vegetales, células de insecto y células animales. Las células se usan para producir una proteína de las mismas cultivando las células anteriormente descritas en condiciones en las que la proteína codificada se expresa por la célula, y recuperando la proteína expresada. Para fines del presente documento, por ejemplo, la enzima puede secretarse al medio.
Una cepa de células hospedadoras puede seleccionarse por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional puede influir en el plegamiento y/o la función del polipéptido. Diferentes células hospedadoras, tales como, pero sin limitación, CHO (DG44, DXB11, CHO-K1), HeLa, MCDK, 293 y WI38 tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales y pueden seleccionarse para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína introducida. En general, la elección de célula es una que es capaz de introducir glucosilación ligada a N en el polipéptido expresado. Por lo tanto, se describen células eucariotas que contienen los vectores. Son células eucariotas ejemplares las células de mamífero de Ovario de Hámster Chino (CHO). Por ejemplo, se usan células CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (por ejemplo, células DG44) para producir polipéptidos proporcionados en el presente documento. Obsérvese que la expresión bacteriana de un polipéptido de PH20 proporcionado en el presente documento no dará como resultado un polipéptido catalíticamente activo, pero cuando se combina con maquinaria de glucosilación apropiada, la PH20 puede glucosilarse artificialmente.
Se proporcionan vectores de acuerdo con las reivindicaciones que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de PH20 modificado, y puede acoplarse a la secuencia señal nativa o heteróloga, así como múltiples copias de la misma. Los vectores pueden seleccionarse para expresión de la proteína enzimática en la célula o de modo que la proteína enzimática se exprese como una proteína secretada.
Puede usarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector para expresar la secuencia codificante de proteína. Estos incluyen pero sin limitación sistemas de células de mamífero infectados con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófago, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de vectores varían en sus fortalezas y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedador-vector usado, puede usarse uno cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados.
Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales de control de la traducción/transcripción apropiadas y secuencias codificantes de proteínas. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN y sintéticas recombinantes in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican proteína, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de las mismas, puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresen en un hospedador transformado con la molécula o las moléculas de ADN recombinantes. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse por cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. El promotor puede no ser nativo de los genes para una proteína deseada. Los promotores que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, el promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290: 304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al Al. Cell 22: 787­ 797 (1980)), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)); promotores de vectores de expresión procariotas, tales como el promotor de p-lactamasa (Jay et al., (1981) Pro. Natl Acad. Sci. USA 78: 5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Pro. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983); véase también Gilbert y Villa Komaroff, "Useful Proteins from Recombinant Bacteria", Scientific American 242: 74-94 (1980)); promotores de vectores de expresión vegetales, tales como el promotor de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213 (1984)) o el promotor de ARN 35S de virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9: 2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310: 115-120 (1984)); elementos promotores de levaduras y otros hongos tales como el promotor de Gal4, el promotor de la alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol quinasa, el promotor de fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control de la transcripción animales que muestran especificidad tisular y se han usado en animales transgénicos: región de control de gen de elastasa I que está activo en células de acinos pancreáticos (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984), Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp, Quant. Biol. 50: 399-409 (1986), MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)); región de control de gen de la insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315: 115-122 (1985)), región de control de genes de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38: 647 (1984), Adams et al., Nature 318: 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), región de control de virus de tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45: 485-495 (1986)), región de control de gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al., Genes and Devel 1: 268-276 (1987)), región de control de gen de alfa-fetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648 (1985) Hammer et al., Science 235: 53-58 (1987)), región de control de gen de antitripsina alfa 1 que está activa en hígado (Kelsey et al., Genes y Devel 1: 161-171 (1987)), región de control del gen de beta globina que está activa en células mieloides (Magram et al. , Nature 315: 338-340 (1985), Kollias y col., Cell 46: 89-94 (1986)), región de control del gen de proteína básica de mielina que está activa en células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., Cell 48: 703-712 (1987)), región de control del gen de cadena ligera de miosina 2 que está activa en músculo esquelético (Shani, Nature 314: 283-286 (1985)) y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que está activa en gonadótropos del hipotálamo (Mason et al., Science 234: 1372-1378 (1986)).
Se puede usar un vector que contiene un promotor unido operativamente con ácidos nucleicos que codifican una proteína deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo de la misma, uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Dependiendo del sistema de expresión, también se requieren señales de inicio específicas para traducción eficaz de una secuencia de PH20. Estas señales incluyen las secuencias de codón de inicio ATG y adyacentes. En casos donde el codón de inicio y secuencias cadena arriba de PH20 o formas solubles de las mismas se inserten en el vector de expresión apropiado, no es necesaria ninguna señal de control de la traducción adicional. En casos donde solo se inserta una secuencia codificante, o una parte de la misma, deben proporcionarse señales de control de la transcripción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en la fase de lectura correcta para asegurar la transcripción del inserto completo. Los elementos de la transcripción y codones de inicio exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse por la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol, 153: 516-544).
Los vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión de pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también bibliografía publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor de fago T5 (reconocido por a Rn polimerasa de E. coli) y un módulo de represión de operador de doble lac para proporcionar expresión de alto nivel, estrechamente regulada, de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de unión ribosómico sintético (RBS II) para traducción eficaz, una secuencia codificante de marcador His6x, terminadores de la transcripción tü y T1, origen de replicación de ColE1 y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de un marcador de His6x en el extremo C o N terminal de la proteína recombinante. Dichos plásmidos incluyen pQE32, pQE30 y pQE31 que proporcionan múltiples sitios de clonación para las tres fases de lectura y posibilitan la expresión de proteínas marcadas con His6x en el extremo N terminal. Otros vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, patente de Estados Unidos 4.952.496, disponible de Novagen, Madison, WI; véase también bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor de T7lac, terminador de T7, el operador de lac de E. coli inducible y el gen represor de lac; PET 12a-c, que contiene el promotor de T7, terminador de T7 y la señal de secreción de ompT de E. coli; y pET15b y pET19b (Novagen, Madison, WI), que contienen una secuencia líder His-Tag™ para su uso en purificación con una columna de His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de purificación sobre la columna, la región promotora de T7-lac y el terminador de T7.
Típicamente, los vectores pueden ser plásmidos, vectores virales, u otros conocidos en la técnica, usados para expresión del polipéptido de PH20 modificado in vivo o in vitro. Por ejemplo, el polipéptido de PH20 modificado se expresa en células de mamífero, incluyendo, por ejemplo, Células de Ovario de Hámster Chino (CHO). Un vector ejemplar para expresión de células de mamífero es el vector de expresión HZ24. El vector de expresión HZ24 derivó de la cadena principal del vector pCI (Promega). Contiene ADN que codifica el gen de resistencia a beta-lactamasa (AmpR), un origen de F1 de replicación, una región promotora/potenciadora temprana-inmediata de Citomegalovirus (CMV) y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El vector de expresión también tiene un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón.
Pueden emplearse vectores virales, tales como vectores de adenovirus, retrovirus o virus vaccinia. En algunos ejemplos, el vector es un vector retroviral defectuoso o atenuado u otro viral (véase Patente de Estados Unidos n.° 4.98Ü.286). Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (véase Miller et al., NET. Enzymol., 217: 581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales se han modificado para suprimir secuencias retrovirales que no son necesarias para el empaquetamiento del genoma viral y la integración en ADN de la célula hospedadora.
En algunos ejemplos, los virus armados con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PH20 modificado pueden facilitar su replicación y propagarse por ejemplo dentro de un tejido diana. El tejido diana puede ser un tejido canceroso por lo que el virus tiene capacidad de replicación selectiva dentro del tumor. El virus también puede ser un virus no lítico en el que el virus replica selectivamente bajo un promotor específico tisular. A medida que los virus replican, la coexpresión del polipéptido de PH20 con genes virales facilitará la propagación del virus in vivo.
4. Expresión
Pueden producirse polipéptidos de PH20 modificados por cualquier método conocido por los expertos en la materia incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas pueden expresarse en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades requeridas y formas de las proteínas, tales como por ejemplo, las necesarias para administración y tratamiento. Los hospedadores de expresión incluyen organismos procariotas y eucariotas tales como E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los hospedadores de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas así como los tipos de modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del hospedador de expresión puede realizarse basándose en estos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costes de producción y la necesidad y los métodos para purificación.
Están disponibles muchos vectores de expresión y son conocidos por los expertos en la materia y pueden usarse para expresión de proteínas. La elección de vector de expresión estará influida por la elección del sistema de expresión hospedador. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores de la transcripción y opcionalmente potenciadores, señales de traducción y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión que se usan para transformación estable típicamente tienen un marcador seleccionable que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, puede usarse un origen de replicación para amplificar el número de copias del vector.
Los polipéptidos de PH20 modificados también pueden utilizarse o expresarse como fusiones proteicas. Por ejemplo, una fusión enzimática puede generarse para añadir funcionalidad adicional a una enzima. Los ejemplos de proteínas de fusión enzimática incluyen, pero sin limitación, fusiones de una secuencia señal, un marcador tal como para localización, por ejemplo, un marcador His6x o His6 o un marcador myc, o un marcador para purificación, por ejemplo, una fusión de GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o asociación a membrana.
Para producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se desea expresión estable. Por ejemplo, pueden transformarse líneas celulares que expresan de forma estable un polipéptido de PH20 modificado usando vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse a medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el cultivo y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Las células resistentes de células transformadas de forma estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para los tipos celulares.
Puede usarse cualquier variedad de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, M et al. (1977) Cell, 11: 223-32) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, I et al., Cell, 22: 817-23), que pueden emplearse en células TK o APRT, respectivamente. Además, puede usarse resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como la base de selección. Por ejemplo, pueden usarse DHFR, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, M et al., (1980) Proc. Nat. Ac. Sci., 77: 3567-70); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F et al., (1981) J. Mol. Biol., 150: 1-14); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente. Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permiten que las células utilicen indol en lugar de triptófano o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman SC y RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, 85: 8047-51). También pueden usarse marcadores visibles, tales como pero sin limitación, antocianinas, beta glucuronidasa y su sustrato, GUS y luciferasa y su sustrato luciferina, para identificar transformantes y también para cuantificar la cantidad de expresión proteica transitoria o estable atribuible a un sistema de vector particular (Rhodes CA et al. (1995) Methods Mol. Biol.
55: 121-131).
Puede supervisarse la presencia y expresión de polipéptidos de PH20. Por ejemplo, la detección de un polipéptido funcional puede determinarse ensayando el medio acondicionado con respecto a actividad de enzima hialuronidasa en condiciones apropiadas. Se describen en el presente documento ensayos ejemplares para evaluar la solubilidad y actividad de proteínas expresadas.
a. Células procariotas
Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida por los expertos en la materia. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles. Dichos promotores son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que muestran algo de toxicidad frente a las células hospedadoras. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor de lac, el promotor de trp, el promotor de tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor de APL regulado por temperatura.
Las proteínas, tales como cualquiera descrita en el presente documento, pueden expresarse en el ambiente citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un ambiente reductor, y para algunas moléculas, esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Pueden usarse agentes reductores tales como ditiotreitol y p-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea para resolubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo efectúa expresión de proteínas en el espacio periplásmico de bacterias lo que proporciona un ambiente oxidante y de tipo chaperonina y disulfuro isomerasas, que pueden ayudar en la producción de proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona con la proteína para expresar que dirige la proteína al periplasma. El líder se retira después por peptidasas señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder que se dirigen al periplasma incluyen el líder pelB del gen de pectato liasa y el líder derivado del gen de la fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la fuga de la proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y sencilla del sobrenadante de cultivo. Pueden obtenerse proteínas que no se secretan del periplasma por lisis osmótica. De forma similar a la expresión citoplásmica, en algunos casos las proteínas pueden volverse insolubles y pueden usarse desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y la solubilidad, típicamente se usan temperaturas entre 25 °C y 37 °C. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglucosiladas. Por lo tanto, si las proteínas requieren glucosilación para su función, puede añadirse glucosilación in vitro después de purificación de células hospedadoras.
b. Células de levadura
Levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son hospedadores de expresión de levadura bien conocidos que pueden usarse para la producción de proteínas, tales como cualquiera descrita en el presente documento. La levadura puede transformarse con vectores de replicación episómicos o mediante integración cromosómica estable por recombinación homóloga. Típicamente, se usan promotores inducibles para regular la expresión génica. Los ejemplos de dichos promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneína, tales como CUP1, AOX1 u otros promotores de Pichia u otra levadura. Los vectores de expresión incluyen con frecuencia un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en levadura son con frecuencia solubles. La coexpresión con chaperoninas tales como Bip y proteína disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levadura pueden dirigirse para secreción usando fusiones de péptidos señal de secreción tales como la señal de secreción del factor alfa de tipo apareamiento de levadura de Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de superficie de células de levadura tales como el receptor de adhesión de apareamiento Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Puede modificarse técnicamente un sitio de escisión de proteasa tal como para la proteasa Kex-2 para retirar las secuencias fusionadas de los polipéptidos expresados a medida que salen de la ruta de secreción. La levadura también tiene capacidad de glucosilación en motivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Insectos y células de insecto
Las células de insecto, particularmente que usen expresión de baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos tales como polipéptidos de PH20. Las células de insecto expresan altos niveles de proteína y son capaces de la mayoría de las modificaciones postraduccionales usadas por eucariotas superiores. Los baculovirus tienen una serie de hospedadores restrictiva que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de expresión eucariota. Los vectores de expresión típicos usan un promotor para alto nivel de expresión tal como el promotor de polihedrina de baculovirus. Los sistemas de baculovirus usados habitualmente incluyen un baculovirus, tal como el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) o el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV), y una línea celular de insecto, tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para expresión de alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula para expresar se fusiona inmediatamente cadena abajo del codón de inicio de la polihedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en células de insecto y pueden usarse para secretar la proteína expresada al medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con patrones de glucosilación similares a los sistemas celulares de mamífero. Son células de insecto ejemplares las que se han alterado para reducir la inmunogenicidad, incluyendo las que tienen vectores de expresión de baculovirus “adaptados a mamíferos” y las que carecen de la enzima FT3.
Un sistema de expresión alternativo en células de insecto emplea células transformadas de forma estable. Pueden usarse para expresión líneas celulares tales como las células Schnieder 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus). El promotor de metalotioneína de Drosophila puede usarse para inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción por metales pesados con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen típicamente mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.
d. Expresión de mamíferos
Los sistemas de expresión de mamíferos pueden usarse para expresar proteínas incluyendo polipéptidos de PH20. Las construcciones de expresión pueden transferirse a células de mamífero mediante infección viral tal como por adenovirus o mediante transferencia de ADN directa tales como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamífero incluyen típicamente un sitio de recubrimiento terminal de ARNm, una caja TATA, una secuencia de inicio de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. También pueden añadirse elementos IRES para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, tal como un marcador seleccionable. Dichos vectores incluyen con frecuencia potenciadores-promotores de la transcripción para expresión de alto nivel, por ejemplo el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus (CMV) humano y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (VSR). Estos promotores-potenciadores están activos en muchos tipos celulares. También pueden usarse promotores de tipo tisular y celular y regiones potenciadores para expresión. Las regiones promotoras/potenciadoras ejemplares incluyen, pero sin limitación, las de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus del tumor mamario de ratón, albúmina, alfa fetoproteína, antitripsina alfa 1, beta globina, proteína básica de mielina, cadena ligera de miosina 2 y control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica. Los marcadores seleccionables pueden usarse para seleccionar y mantener células con la construcción de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforribosil transferasa, aminoglucósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Por ejemplo, puede realizarse expresión en presencia de metotrexato para seleccionar solamente las células que expresan el gen de DHFR. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular tales como TCR-^ y FcsRI-y puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.
Están disponibles muchas líneas celulares para expresión de mamíferos incluyendo células de ratón, de rata, humanas, de mono, de pollo y de hámster. Las líneas celulares ejemplares incluyen pero sin limitación CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretora) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 y HKB.
También están disponibles líneas celulares adaptadas a medios sin suero que facilitan la purificación de proteínas secretadas del medio de cultivo celular. Los ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. n.° 11619-012) y la línea celular EBNA-1 sin suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84: 332-42.). También están disponibles líneas celulares que se adaptan para cultivar en medios especiales optimizados para expresión máxima. Por ejemplo, las células DG44 CHO se adaptan para crecer en cultivo en suspensión en un medio sin productos animales, químicamente definido.
e. Plantas
Pueden usarse células vegetales y plantas transgénicas para expresar proteínas tales como cualquiera descrita en el presente documento. Típicamente se transfieren construcciones de expresión a plantas usando transferencia de ADN directa tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG en protoplastos, y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y técnicas de transformación se dividen habitualmente entre hospedadores dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco, y hospedadores monocotiledóneos, tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores vegetales usados para la expresión incluyen el promotor del virus de mosaico de la coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Se usan con frecuencia marcadores seleccionables tales higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa para facilitar la selección y el mantenimiento de células transformadas. Pueden mantenerse células vegetales transformadas en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse en células completas. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas modificadas técnicamente para producir polipéptidos de hialuronidasa. Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glucosilación a las células de mamífero, esto puede influir en la elección de la proteína producida en estos hospedadores.
5. Purificación
Pueden cultivarse células hospedadoras transformadas con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de PH20 modificado en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante se secreta en general, pero puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. Como entenderán los expertos en la materia, los vectores de expresión que contienen ácido nucleico que codifica PH20 pueden diseñarse con secuencias señal que facilitan la secreción directa de PH20 mediante membranas celulares procariotas o eucariotas.
Por lo tanto, los métodos para purificación de polipéptidos de células hospedadoras dependerán de las células hospedadoras elegidas y los sistemas de expresión. Para moléculas secretadas, las proteínas se purifican en general a partir del medio de cultivo después de retirar las células. Para la expresión intracelular, las células pueden lisarse y las proteínas purificarse del extracto. Cuando se usan organismos transgénicos tales como plantas y animales transgénicos para expresión, pueden usarse tejidos u órganos como material de partida para preparar un extracto de células lisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que pueden recogerse y, si es necesario, las proteínas pueden extraerse y purificarse adicionalmente usando métodos convencionales en la técnica.
Las proteínas, tales como polipéptidos de PH20 modificados, pueden purificarse usando técnicas de purificación de proteínas convencionales conocidas en este campo incluyendo, pero sin limitación, SDS-PAGE, fraccionamiento de tamaño y cromatografía de exclusión por tamaño, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico, tal como cromatografía de intercambio aniónico. También pueden utilizarse técnicas de purificación de afinidad para mejorar la eficacia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos, receptores y otras moléculas que se unen con enzimas hialuronidasas PH20 en purificación de afinidad. Por ejemplo, puede purificarse PH20 soluble de medio acondicionado.
Las construcciones de expresión también pueden modificarse técnicamente para añadir un marcador de afinidad a una proteína tal como un epítopo de myc, fusión de GST o His6 y purificarse por afinidad con anticuerpo de myc, resina de glutatión o Ni-resina, respectivamente, Dichos marcadores pueden unirse con la secuencia de nucleótidos que codifica una PH20 soluble como se describe en otra parte del presente documento, lo que puede facilitar la purificación de proteínas solubles. Por ejemplo, puede expresarse un polipéptido de PH20 modificado como una proteína recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de proteínas. Dichos dominios facilitadores de purificación incluyen, pero sin limitación, péptidos quelantes metálicos tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una secuencia enlazadora escindible tal como Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de PH20 expresado es útil para facilitar la purificación. Uno de dichos vectores de expresión posibilita la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de PH20 en y un sitio de escisión de enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados), mientras que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido de la proteína de fusión.
La pureza puede evaluarse por cualquier método conocido en la técnica incluyendo electroforesis en gel, métodos de HPLC ortogonales, tinción y técnicas espectrofotométricas. La proteína expresada y purificada puede analizarse usando cualquier ensayo o método conocido por un experto en la materia, por ejemplo, cualquiera descrito en la sección G. Estos incluyen ensayos basados en las propiedades físicas y/o funcionales de la proteína, incluyendo, pero sin limitación, análisis por electroforesis en gel, inmunoensayo y ensayos de actividad hialuronidasa.
Dependiendo del sistema de expresión y las células hospedadoras usados, el polipéptido resultante puede ser heterogéneo debido a peptidasas presentes en el medio de cultivo tras la producción y purificación. Por ejemplo, el cultivo de PH20 soluble en células CHO puede dar como resultado una mezcla de polipéptidos heterogéneos.
6. Modificación de polipéptidos por PEGilación
Se ha usado ampliamente polietilenglicol (PEG) en biomateriales, biotecnología y medicina principalmente debido a que PEG es un polímero biocompatible, no tóxico, soluble en agua que es típicamente no inmunogénico (Zhao y Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). En el área de suministro de fármacos, se han usado ampliamente derivados de PEG en unión covalente (es decir, “PEGilación”) con proteínas para reducir la inmunogenicidad, proteólisis y eliminación de los riñones y para potenciar la solubilidad (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16: 157-82, 1995). De forma similar, PEG se ha unido a fármacos de bajo peso molecular, relativamente hidrófobos para potenciar la solubilidad, reducir la toxicidad y alterar la biodistribución. Típicamente, los fármacos PEGilados se inyectan como soluciones.
Una aplicación estrechamente relacionada es la síntesis de redes de PEG degradables reticuladas o formulaciones para su uso en suministro de fármacos ya que mucha de la misma química usada en el diseño de vehículos farmacológicos solubles, degradables, también puede usarse en el diseño de geles degradables (Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993). También se sabe que pueden formarse complejos intermacromoleculares mezclando soluciones de dos polímeros complementarios. Dichos complejos se estabilizan generalmente mediante interacciones electrostáticas (polianión-policatión) y/o enlaces de hidrógeno (poliácido-polibase) entre los polímeros implicados, y/o mediante interacciones hidrófobas entre los polímeros en un ambiente acuoso (Krupers et al., Eur. Polym J. 32: 785-790, 1996). Por ejemplo, la mezcla de soluciones de ácido poliacrílico (PAAc) y óxido de polietileno (PEO) en las condiciones apropiadas da como resultado la formación de complejos basados principalmente en los enlaces de hidrógeno. La disociación de estos complejos en condiciones fisiológicas se ha usado para el suministro de fármacos libres (es decir, no PEGilados). Además, se han formado complejos de polímeros complementarios a partir tanto de homopolímeros como de copolímeros.
Se han descrito en la técnica numerosos reactivos para PEGilación. Dichos reactivos incluyen, pero sin limitación, reacción del polipéptido con PEG activo por N-hidroxisuccinimidilo (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, mPEG succinimidil alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidil propionato, mPEG succinimidil butanoato, mPEG carboximetil succinimidil éster de ácido 3-hidroxibutanoico, PEG-succinimidil propionato homobifuncional, PEG propionaldehído homobifuncional, PEG butiraldehído homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, p-nitrofenil-carbonato PEG, mPEG-benzotriazol carbonato, propionaldehído PEG, mPEG butiraldehído, mPEG2 butiraldehído ramificado, mPEG acetilo, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG maleimida “sin enlazador”, mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG ortopiridil disulfuro, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona PEG-NHS, acrilato PEG-Nh S, fluoresceína PEG-NHS y biotina PEG-NHS (véase, por ejemplo, Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6: 62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12: 197-207, 1997; documentos U.S. 5.672.662; U.S. 5.932.462; U.S.6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S.
4.179.337; U.S.5.122.614; U.S. 5.324.844; U.S. 5.446.090; U.S.5.612.460; U.S. 5.643.575; U.S. 5.766.581; U.S.
5.795.569; U.S.5.808.096; U.S. 5.900.461; U.S. 5.919.455; U.S.5.985.263; U.S. 5.990.237; U.S. 6.113.906; U.S.
6.214.966; U.S.6.258.351; U.S. 6.340.742; U.S. 6.413.507; U.S.6.420.339; U.S. 6.437.025; U.S. 6.448.369; U.S.
6.461.802; U.S. 6.828.401; U.S. 6.858.736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S.
2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S.
2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WO05000360; U.S. 2005/0114037; U.S.
2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; y WO 0187925).
En un ejemplo, el polietilenglicol tiene un peso molecular que varía de aproximadamente 3 kD a aproximadamente 50 kD y típicamente de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 30 kD. Puede conseguirse unión covalente del PEG con el fármaco (conocido como “PEGilación”) por técnicas de síntesis químicas conocidas. Por ejemplo, la PEGilación de la proteína puede conseguirse haciendo reaccionar PEG activado por NHS con la proteína en condiciones de reacción adecuadas.
Aunque se han descrito numerosas reacciones para PEGilación, las que son más aplicables en general confieren direccionalidad, utilizan condiciones de reacción suaves y no necesitan procesamiento corriente abajo extensivo para retirar catalizadores tóxicos o productos secundarios. Por ejemplo, monometoxi PEG (mPEG) tiene solamente un hidroxilo terminal reactivo, y por lo tanto su uso limita algo de la heterogeneidad de la mezcla de productos de PEG-proteína resultante. La activación del grupo hidroxilo al final del polímero en frente del grupo metoxi terminal es generalmente necesaria para conseguir PEGilación proteica eficaz, siendo el objetivo hacer al PEG derivatizado más susceptible a ataque nucleófilo. El nucleófilo atacante es habitualmente el grupo amino épsilon de un resto de lisilo, pero también pueden reaccionar otras aminas (por ejemplo, la alfa-amina N terminal o las aminas de anillo de histidina) si las condiciones locales son favorables. Es posible una unión más dirigida en proteínas que contienen una única lisina o cisteína. Este último resto puede dirigirse por PEG-maleimida para modificación específica de tiol. Como alternativa, puede hacerse reaccionar PEG hidrazida con una enzima degradante de hialuronano oxidada con peryodato y reducirse en presencia de NaCNBH3. Más específicamente, los azúcares CMP PEGilados pueden hacerse reaccionar con una enzima degradante de hialuronano en presencia de glucosil transferasas apropiadas. Una técnica es la técnica de “PEGilación” donde varias moléculas poliméricas se acoplan con el polipéptido en cuestión. Cuando se usa esta técnica, el sistema inmunitario tiene dificultades para reconocer los epítopos en la superficie del polipéptido responsable de la formación de anticuerpos, reduciendo de este modo la respuesta inmunitaria. Para que polipéptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del cuerpo humano proporcionen un efecto fisiológico particular (es decir, productos farmacéuticos) la respuesta inmunitaria potencial típica es una respuesta de IgG y/o IgM, mientras que los polipéptidos que se inhalan a través del sistema respiratorio (es decir, polipéptido industrial) pueden provocar potencialmente una respuesta de IgE (es decir, respuesta alérgica). Una de las teorías que explica la respuesta inmunitaria reducida es que la molécula o las moléculas poliméricas protegen el epítopo o los epítopos en la superficie del polipéptido responsable de la respuesta inmunitaria que conduce a la formación de anticuerpos. Otra teoría o al menos un factor parcial es que cuanto más pesado sea el conjugado, más reducida será la respuesta inmunitaria resultante.
Típicamente, para preparar el polipéptido de PH20 PEGilado proporcionado en el presente documento, se conjugan restos de PEG, mediante unión covalente, con los polipéptidos. Las técnicas para PEGilación incluyen, pero sin limitación, enlazadores especializados y químicas de acoplamiento (véase por ejemplo, Roberts, Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476, 2002), unión de múltiples restos de PEG con un único sitio de conjugación (tal como mediante el uso de PEG ramificados; véase por ejemplo, Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12: 177-180, 2002), PEGilación específica de sitio y/o mono-PEGilación (véase, por ejemplo, Chapman et al., Nature Biotech. 17: 780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida (véase, por ejemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 487-504, 2002). Los métodos y técnicas descritos en este campo pueden producir proteínas que tienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG unidos a una única molécula proteica (véase, por ejemplo, documento U.S. 2006/0104968).
Como un método ilustrativo ejemplar para preparar un polipéptido de PH20 PEGilado, se han aplicado cada uno de PEG aldehídos, succinimidas y carbonatos a restos de PEG conjugados, típicamente succinimidil PEG, con rHuPH20. Por ejemplo, rHuPH20 se ha conjugado con reactivos de succinimidil monoPEG (mPEG) ejemplares incluyendo mPEG-Succinimidil Propionatos (mPEG-SPA), mPEG-Succinimidil Butanoatos (mPEG-SBA) y (para unión de PEG “ramificados”) mPEG2-N-Hidroxilsuccinimida. Estos succinimidil ésteres PEGilados contienen cadenas principales de carbono de diferentes longitudes entre el grupo de PEG y el reticulador activado, y un grupo PEG individual o ramificado. Estas diferencias pueden usarse, por ejemplo, para proporcionar diferentes cinéticas de reacción y para restringir potencialmente sitios disponibles para unión de PEG con rHuPH20 durante el proceso de conjugación.
Los succinimidil PEG (como anteriormente) que contienen PEG lineales o ramificados pueden conjugarse con PH20. Pueden usarse PEG para generar PH20 que contienen de forma reproducible moléculas que tienen, en promedio, entre aproximadamente tres y seis o de tres a seis moléculas de PEG por hialuronidasa. Dichas composiciones de rHuPH20 PEGiladas pueden purificarse fácilmente para producir composiciones que tienen actividades específicas de aproximadamente 25.000 o 30.000 unidades/mg de proteína de actividad hialuronidasa, y que están sustancialmente libres de PH20 no PEGilada (menos del 5 % no PEGilada).
Usando diversos reactivos de PEG, pueden prepararse versiones ejemplares de un polipéptido de PH20 PEGilado, por ejemplo, usando mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD), y versiones ramificadas basadas en mPEG2-NHS (40 kD) y mPEG2-NHS (60 kD). Pueden generarse versiones PEGiladas de PH20 usando químicas de NHS, así como carbonatos, y aldehídos, usando cada uno de los siguientes reactivos: mPEG2-NHS-40K ramificado, mPEG-NHS-10K ramificado, mPEGNHS-20K ramificado, mPEG2-NHS-60K ramificado; mPEG-SBA-5K, mPEG-SBA-20K, mPEG-SBA-30K; mPEG-SMB-20K, mPEG-SMB-30K; mPEG-butiraldehído; mPEG-SPA-20K, mPEG-SPA-30K; y PEG-NHS-5K-biotina. También puede prepararse PH20 PEGilada usando reactivos de PEG disponibles de Dowpharma, una división de Dow Chemical Corporation; incluyendo polipéptido de PH20 PEGilados con p-nitrofenilcarbonato PEG de Dowpharma (30 kDa) y con propionaldehído PEG (30 kDa).
En un ejemplo, la PEGilación incluye conjugación de mPEG-SBA, por ejemplo, mPEG-SBA-30K (que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa) u otro succinimidil éster de un derivado de ácido butanoico PEG, con un polipéptido de PH20. Los succinimidil ésteres de derivados de ácido butanoico PEG, tales como mPEG-SBA-30K se acoplan fácilmente con grupos amino de proteínas. Por ejemplo, la conjugación covalente de m-PEG-SBA-30K y rHuPH20 (que es de aproximadamente 60 KDa de tamaño) proporciona enlaces amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra en el Esquema 1, a continuación.
Esquema 1
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rHuPH20 PEGilada
Típicamente, el mPEG-SBA-30K u otro PEG se añade al polipéptido de PH20 a una relación molar de pEG:polipéptido de 10:1 en un tampón adecuado, por ejemplo, NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8 o tampón fosfato 70 mM, pH 7, seguido de esterilización, por ejemplo, esterilización por filtración y conjugación continuada, por ejemplo, con agitación, durante una noche a 4 °C en una cámara frigorífica. En un ejemplo, el PEG-PH20 conjugado se concentra y se cambia su tampón.
Se conocen en la técnica otros métodos de acoplamiento de succinimidil éster de derivados de ácido butanoico PEG, tales como mPEG-SBA-30K (véase por ejemplo, documentos U.S. 5.672.662; U.S. 6.737.505; y U.S.
2004/0235734). Por ejemplo, un polipéptido, tal como un polipéptido de PH20, puede acoplarse a un derivado de PEG activado por NHS mediante reacción en un tampón de borato (0,1 M, pH 8,0) durante una hora a 4 °C. La proteína PEGilada resultante puede purificarse por ultrafiltración. Otro método hace reaccionar el polipéptido con mPEG-SBA en agua desionizada a la que se añade trietilamina para aumentar el pH hasta 7,2-9. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias horas para completar la PEGilación.
Los expertos en la materia conocen métodos para PEGilación de polipéptidos de PH20, incluyendo, por ejemplo, hialuronidasas derivadas de animales y enzimas degradantes de hialuronano bacterianas. Véase, por ejemplo, Patente Europea n.° EP 0400472, que describe la PEGilación de hialuronidasa de testículo bovino y condroitín ABC liasa. Además, la Publicación de Estados Unidos n.° 2006014968 describe PEGilación de una hialuronidasa derivada de PH20 humana. Por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano PEGilada contiene en general al menos 3 restos de PEG por molécula. En algunos ejemplos, el polipéptido de PH20 contiene de tres a seis moléculas de PEG. En otros ejemplos, la enzima puede tener una relación molar de PEG con respecto a proteína de entre 5:1 y 9:1, por ejemplo, 7:1.
F. Composiciones farmacéuticas y formulaciones, dosificaciones y administración
Se proporcionan en el presente documento para administración composiciones farmacéuticas de cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones. Se preparan composiciones farmacéuticamente aceptables a la vista de aprobaciones por una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea reconocida en general para su uso en animales y en seres humanos. Típicamente, los compuestos se formulan en composiciones farmacéuticas utilizando técnicas y procedimientos bien conocidos en este campo (véase por ejemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Cuarta Edición, 1985, 126).
En particular, se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que son estables como una formulación líquida durante periodos de tiempo prolongados durante al menos 1 mes a temperaturas de o de aproximadamente 2 °C a 8 °C, inclusive o durante al menos durante 3 días a una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, inclusive. Las composiciones farmacéuticas, en particular formulaciones líquidas, pueden estar limitadas por la estabilidad del agente activo, que puede ser susceptible a efectos de condiciones de almacenamiento (tiempo o duración de almacenamiento, temperatura y/o agitación) y/o componentes de formulación contenidos en la composición. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas estables contienen en general un polipéptido de PH20 modificado como se describe en la Sección C.1.b que muestra estabilidad aumentada manifestada como una resistencia aumentada a una o más condiciones de desnaturalización de proteínas. Dichas condiciones de desnaturalización de proteínas pueden incluir, pero sin limitación, temperatura elevada mayor de o igual a o aproximadamente 30 °C, agitación, baja salinidad o ausencia de sal, y presencia de excipientes. La estabilidad aumentada se caracteriza por tipo de almacenamiento mejorado, fragmentación reducida y/o formación de agregados reducida, mientras que aún conserva la actividad del agente o los agentes activos, por ejemplo, la hialuronidasa PH20. Dichas formulaciones pueden proporcionarse como formulaciones líquidas “ listas para usar” sin reconstitución adicional y/o sin ningún requisito para dilución adicional. En algunos ejemplos, las formulaciones también pueden prepararse en una forma liofilizada o concentrada.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de PH20 modificado pueden co-administrarse con otro agente terapéutico. En dichos ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados pueden formularse por separado como una composición farmacéutica y administrarse antes de, simultáneamente con, intermitentemente con, o posteriormente a una segunda composición que contiene un agente terapéutico activo. En otros ejemplos, los polipéptidos de PH20 modificados pueden co-formularse con formulaciones farmacéuticas de otros agentes terapéuticos.
En particular, se describen en el presente documento co-formulaciones que contienen un polipéptido de PH20 modificado como se describe en el presente documento y un agente terapéutico que es un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida, un agente anti-parkinsoniano, un agente anti-malárico, un agente anticonvulsivo, un agente antidepresivo, un agente anti-artrítico, un agente antifúngico, un agente antihipertensivo, un agente antipirético, un agente antiparasitario, un agente antihistamínico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente broncodilatador, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador beta adrenérgico, un agente bloqueador de canal de calcio, un agente farmacológico cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestivo, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente electrolítico, un agente hipnótico, un agente hormonal, un agente hiperglucémico, un agente relajante muscular, un agente contractor muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente vitamínico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente inhibidor de enzima conversora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica o un inductor del sueño. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden formularse con un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal, una inmunoglobulina, un antibiótico, un bisfosfonato, una citocina, un agente quimioterapéutico, un factor de coagulación o una insulina. Se describen agentes terapéuticos ejemplares que pueden co-formularse con un polipéptido de PH20 modificado en la Sección H. En particular, se describen en el presente documento co-formulaciones que contienen un polipéptido de PH20 modificado y una insulina, tal como una insulina de acción rápida, por ejemplo, una insulina regular o un análogo de insulina de acción rápida (acción veloz). Las co-formulaciones proporcionadas en el presente documento incluyen co-formulaciones estables, por lo que los agentes activos, es decir, el polipéptido de PH20 modificado y el agente terapéutico, muestran estabilidad aumentada y conservan actividad durante periodos prolongados como se describe en el presente documento.
Las formulaciones que contienen polipéptido PH20 proporcionado en el presente documento, incluyendo formulaciones separadas de las mismas y coformulaciones, son estables durante periodos de tiempo prolongados, incluyendo a diversas temperaturas y en diversas condiciones de almacenamiento o uso tales como agitación. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento son estables y conservan actividad de agente o agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20) en condiciones “de refrigerador”, por ejemplo, de 2 °C a 8 °C, tal como a o aproximadamente a 4 °C, durante al menos 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, 26 meses, 27 meses, 28 meses, 29 meses o 30 meses o más. En otro ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento son estables y conservan actividad de agente o agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20) a temperatura ambiente por ejemplo de 18 °C a 32 °C, generalmente de 20 °C a 32 °C, tal como de 28 °C a 32 °C, durante al menos 2 semanas a 1 año, por ejemplo, al menos 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses o al menos 1 año o más. En un ejemplo adicional, las formulaciones descritas en el presente documento son estables y conservan actividad de agente o agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20) a temperaturas elevadas de aproximadamente o más de 30 °C, generalmente de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, tal como de 32 °C a 37 °C o 35 °C a 37 °C o aproximadamente o 37 °C durante al menos 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días o más.
Las composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Una composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y otros de dichos agentes. También se contemplan formulaciones tópicas. La formulación debería adaptarse al modo de administración.
1. Formulaciones - líquidos, inyectables, emulsiones
La formulación en general se prepara para adaptarse a la vía de administración. Se contempla en el presente documento administración parenteral, generalmente caracterizada por inyección o infusión, bien por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa o vía intradérmica. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un disolvente justo antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para combinarse con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Pueden prepararse inyectables en formas convencionales, bien como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o bien como emulsiones. Por ejemplo, las composiciones que contienen un polipéptido de PH20 modificado, formuladas por separado o co-formuladas con otro agente terapéutico, pueden proporcionarse como una preparación farmacéutica en forma líquida como una solución, jarabe o suspensión. En forma líquida, las preparaciones farmacéuticas pueden proporcionarse como una preparación concentrada para diluir a una concentración terapéuticamente eficaz antes de su uso. En general, las preparaciones se proporcionan en una forma de dosificación que no requiere dilución para su uso. En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas pueden presentarse en forma liofilizada para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
Los inyectables se diseñan para administración local y sistémica. Para fines del presente documento, se desea administración local para administración directa al intersticio afectado. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas. Si se administran por vía intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS) y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
La concentración del compuesto farmacéuticamente activo se ajusta de modo que una inyección o infusión proporciona una cantidad eficaz para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso y la condición del paciente o animal como se conoce en la técnica. Las preparaciones parenterales de dosis unitaria pueden envasarse, por ejemplo, en una ampolla, un cartucho, un vial o una jeringa sin aguja. El volumen de solución líquida o preparación de polvo reconstituido, que contiene el compuesto farmacéuticamente activo, está en función de la enfermedad para tratar y el artículo particular de fabricación elegido para el envase. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles, como se conoce y se practica en la técnica. El porcentaje de compuesto activo contenido en dichas composiciones parenterales depende en alta medida de la naturaleza específica del mismo, así como la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir vehículos u otros excipientes. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden contener uno cualquiera o más de un diluyente o diluyentes, adyuvante o adyuvantes, antiadherente o antiadherentes, aglutinante o aglutinantes, recubrimiento o recubrimientos, carga o cargas, saporífero o saporíferos, colorante o colorantes, lubricante o lubricantes, emoliente o emolientes, conservante o conservantes, detergente o detergentes, sorbente o sorbentes o edulcorante o edulcorantes y una combinación de los mismos o vehículo con el que se administra un polipéptido de PH20 modificado. Por ejemplo, los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones, incluyendo preparaciones líquidas, pueden prepararse por medios convencionales con aditivos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad de vehículo adecuada para proporcionar la forma para administración apropiada al paciente. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un vehículo típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de dextrosa isotónica, inyección de agua estéril, inyección de Ringer con lactato y dextrosa. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen, pero sin limitación, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropil metilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen, pero sin limitación, lecitina o goma arábiga. Los detergentes incluyen, pero sin limitación, polisorbato 80 (TWEe N 80). Los vehículos no acuosos incluyen, pero sin limitación, aceite de almendra, ésteres oleosos o aceites vegetales fraccionados. Los agentes o conservantes antimicrobianos incluyen, pero sin limitación, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico, m-cresol, fenol. Un diluyente incluye, pero sin limitación, lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa. Un lubricante incluye, pero sin limitación, estearato de magnesio, estearato cálcico o talco. Un aglutinante incluye pero sin limitación, almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melaza, polivinilpirrolidona, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes tales conocidos por los expertos en la materia. Los agentes isotónicos incluyen, pero sin limitación, cloruro sódico y dextrosa. Los tampones incluyen, pero sin limitación, fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato sódico. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Otros recipientes farmacéuticos adecuados incluyen, pero sin limitación, almidón, glucosa, lactosa, dextrosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, solución salina, agua y etanol. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua e hidróxido sódico, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para ajuste de pH. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de sustancias adyuvantes no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes de pH, por ejemplo, acetato, citrato sódico, derivados de ciclodextrina, sorbitán monolaurato, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina, estabilizantes, potenciadores de la solubilidad, y otros de dichos agentes tales como por ejemplo, acetato sódico, fosfato sódico, sorbitán monolaurato, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.
En particular, pueden añadirse agentes antimicrobianos (por ejemplo conservantes) en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas (por ejemplo, una cantidad antimicrobiana eficaz) para preparaciones parenterales envasadas en recipientes de múltiples dosis, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil y propil-p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio.
El volumen de las formulaciones, incluyendo las formulaciones que contienen PH20 formuladas por separado o co­ formuladas descritas en el presente documento, puede ser cualquier volumen adecuado para el recipiente en el que se proporciona. En algunos ejemplos, las formulaciones se proporcionan en un vial, jeringa, bolígrafo, depósito para una bomba o un sistema de bucle cerrado, o cualquier otro recipiente adecuado. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento están entre o aproximadamente entre 0,1 ml y 500 ml, tal como 0,1 ml y 100 ml, 1 ml y 100 ml, 0,1 ml y 50 ml, tal como al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente o 0,1 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml o más.
a. Polvos liofilizados
Son de interés en el presente documento polvos liofilizados, que pueden reconstituirse para administración como soluciones, emulsiones y otras mezclas. También pueden reconstituirse y formularse como sólidos o geles.
El polvo liofilizado, estéril, se prepara disolviendo un compuesto de enzima en una solución de tampón. La solución de tampón puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o la solución reconstituida, preparada a partir del polvo. La esterilización por filtración posterior de la solución seguida de liofilización en condiciones convencionales conocidas por los expertos en la materia proporciona la formulación deseada. Puede prepararse una formulación líquida como se ha descrito anteriormente en el presente documento. La mezcla resultante se esteriliza por filtración o se trata para retirar partículas y para asegurar la esterilidad, y se reparte en viales para liofilización. Por ejemplo, el polvo liofilizado puede prepararse disolviendo un excipiente, tal como dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado, en un tampón adecuado, tal como citrato, fosfato sódico o potásico u otro de dichos tampones conocidos por los expertos en la materia. Después, se añade una enzima seleccionada a la mezcla resultante, y se agita hasta que se disuelve.
Cada vial se prepara para contener una única dosificación o múltiples dosificaciones del compuesto. El polvo liofilizado puede almacenarse en condiciones apropiadas, tal como aproximadamente 4 °C hasta temperatura ambiente. La reconstitución de este polvo liofilizado con una solución de tampón apropiada proporciona una formulación para uso en administración parenteral.
b. Formulaciones ejemplares
Se conocen en la técnica formulaciones de dosis individual de PH20. Por ejemplo, Hylenex® recombinante (inyección de hialuronidasa humana) contiene, por ml, 8,5 mg de NaCl (145 mM), 1,4 mg de fosfato sódico dibásico (9,9 mM), 1,0 mg de albúmina humana, 0,9 mg de edetato disódico (2,4 mM), 0,3 mg de CaCl2 (2,7 mM) y NaOH para ajustar el pH a 7,4. Otras formulaciones de hialuronidasa soluble humana, tales como las formulaciones de rHuPH20 descritas en la Publicación de Patente de Estados Unidos n.° US2011/0053247, incluyen NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0; o histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0. Cualquier de los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden formularse de forma similar.
Además de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de PH20 modificado y/u otro agente terapéutico, las composiciones farmacéuticas ejemplares descritas en el presente documento, incluyendo formulaciones que contienen PH20 formuladas por separado y co-formuladas, pueden contener una concentración de NaCl y se preparan a un pH requerido para mantener la estabilidad del agente o los agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20 y/u otro agente terapéutico co-formulado). Para formulaciones multidosis y otras formulaciones almacenadas durante un tiempo prolongado, las composiciones generalmente también contienen uno o más conservantes. También pueden incluirse agentes estabilizantes adicionales y otros excipientes. Se describen posteriormente componentes ejemplares.
i. Sal (por ejemplo NaCI)
En ejemplos del presente documento, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento contienen una concentración de sal, tal como cloruro sódico (NaCl), para mantener la estabilidad del agente o los agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20). Se requiere en general sal, tal como NaCl, para conservar la estabilidad y actividad de PH20. Concentraciones salinas bajas de generalmente menos de 120 mM pueden tener efectos deletéreos en la actividad de PH20 a lo largo del tiempo y dependiendo de las condiciones de temperatura. Por lo tanto, la ausencia de sal (por ejemplo NaCl) o una baja concentración de sal (por ejemplo NaCl) pueden dar como resultado inestabilidad de la proteína. En algunos ejemplos del presente documento, sin embargo, polipéptidos de PH20 modificados que muestran estabilidad aumentada en ausencia de baja salinidad o ausencia de sal, tales como NaCl bajo o ausencia de NaCl (véase, por ejemplo, Sección C.1.b.iii), no son susceptibles de desnaturalización. Además, la presencia de sal (por ejemplo NaCl) puede tener diferentes efectos en otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, la solubilidad de insulina y análogos de insulina tiende a aumentar con menor concentración salina (por ejemplo, <140 mM) y altas concentraciones salinas pueden dar como resultado cristalización/agregación de insulina, especialmente a temperaturas menores (véase por ejemplo, Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/520.962; Solicitudes de Estados Unidos n.° de Serie 13/507.263 y 13/507.262; y Solicitud de PCT Internacional n.° PCT/US2012/042816). Por lo tanto, se preparan composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento de acuerdo con los requisitos del agente o los agentes activos. Está dentro del nivel de un experto en la materia evaluar la estabilidad del agente o los agentes activos en la formulación y en diversas condiciones de almacenamiento (véase por ejemplo, Sección G). En ejemplos particulares del presente documento, las composiciones farmacéuticas, incluyendo las formulaciones que contienen PH20 formuladas por separado o co-formuladas descritas en el presente documento, contienen NaCl a una concentración de entre o aproximadamente entre 10 mM y 200 mM, tal como 10 mM y 50 mM, 50 mM y 200 mM, 50 mM y 120 mM, 50 mM y 100 mM, 50 mM y 90 mM, 120 mM y 160 mM, 130 mM y 150 mM, 80 mM y 140 mM, 80 mM y 120 mM, 80 mM y 100 mM, 80 mM y 160 mM, 100 mM y 140 mM, 120 mM y 120 mM o 140 mM y 180 mM.
ii. pH y tampón
En ejemplos del presente documento, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se pueden preparar a un pH para mantener la estabilidad del agente o los agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20). Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se pueden preparar a un pH de entre o aproximadamente entre 6,5 y 7,8, tal como entre o aproximadamente entre 6,5 y 7,2, 7,0 y 7,8, 7,0 y 7,6 o 7,2 y 7,4. La referencia al pH en el presente documento se basa en la medición de pH a temperatura ambiente. Se entiende que el pH puede cambiar durante el almacenamiento a lo largo del tiempo, pero típicamente permanecerá entre o entre aproximadamente pH 6,5 y o y aproximadamente 7,8. Por ejemplo, el pH puede variar en 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 o más. Las co-formulaciones ejemplares descritas en el presente documento tienen un pH de o de aproximadamente 7,0 0,2, 7,1 0,2, 7,2 0,2, 7,3 0,2, 7,4 0,2, 7,5 0,2 o 7,6 0,2 cuando se preparan. Si es necesario, el pH puede ajustarse usando agentes acidificantes para reducir el pH o agentes alcalinizantes para aumentar el pH. Los agentes acidificantes ejemplares incluyen, pero sin limitación, ácido acético, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, solución de fosfato sódico monobásica y ácido fosfórico. Los agentes alcalinizantes ejemplares incluyen, pero sin limitación, solución de fosfato sódico dibásico, carbonato sódico o hidróxido sódico.
Las composiciones se preparan en general usando un agente tamponante que mantiene el intervalo de pH. Puede usarse cualquier tampón en formulaciones descritas en el presente documento siempre que no afecten de forma adversa a la estabilidad del agente o los agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20) y apoyen el intervalo de pH requerido necesario. Los ejemplos de tampones particularmente adecuados incluyen Tris, succinato, acetato, tampones de fosfato, citrato, aconitato, malato y carbonato. Los expertos en la materia, sin embargo, reconocerán que las formulaciones descritas en el presente documento no están limitadas a un tampón particular, siempre que el tampón proporcione un grado aceptable de estabilidad del pH o “capacidad de tampón” en el intervalo indicado. En general, un tampón tiene una capacidad de tampón adecuada a una distancia de aproximadamente 1 unidad de pH de su pK (Lachman et al. En: The Theory and Practice of Industrial Pharmacy 3a Ed. (Lachman, L., Lieberman, HA. y Kanig, J.L., Eds.), Lea y Febiger, Filadelfia, p. 458-460, 1986). La idoneidad del tampón puede estimarse basándose en tabulaciones de pK publicadas o puede determinarse empíricamente por métodos bien conocidos en la técnica. El pH de la solución puede ajustarse al criterio de valoración deseado dentro del intervalo como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, usando cualquier ácido o base aceptable.
Los tampones que pueden incluirse en las co-formulaciones descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, Tris (trometatina), histidina, tampones fosfato, tales como fosfato sódico dibásico y tampones de citrato. Dichos agentes tamponantes pueden estar presentes en las co-formulaciones a concentraciones entre o aproximadamente entre 1 mM y 100 mM, tal como 10 mM y 50 mM o 20 mM y 40 mM, tal como a o aproximadamente a 30 mM. Por ejemplo, dichos agentes tamponantes pueden estar presentes en las coformulaciones en una concentración de o aproximadamente de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM o más.
iii. Conservante o conservantes
En ejemplos del presente documento, las formulaciones multidosis o formulaciones almacenadas durante periodos prolongados contienen una cantidad antimicrobiana eficaz de conservante o mezcla de conservantes en una cantidad para tener un efecto bacteriostático o fungistático. En ejemplos particulares, los conservantes están presentes en una concentración suficiente para proporcionar los requisitos antimicrobianos de, por ejemplo, la Farmacopea de Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP), incluyendo los requisitos antimicrobianos de EP (EPA) y los requisitos antimicrobianos de EP preferidos (EPB) (véase Tabla 4). Ya que la presencia de conservantes, y en particular conservantes fenólicos particulares, pueden tener efectos deletéreos en la estabilidad de PH20, dichas formulaciones típicamente contienen un polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada en presencia de conservantes, tales como cualquiera descrito en la Sección C.1.b.i del presente documento. En general, la cantidad mantiene la estabilidad del agente o los agentes activos (por ejemplo hialuronidasa PH20).
Una cantidad antimicrobiana eficaz de conservante es una cantidad que muestra actividad antimicrobiana mediante destrucción o inhibición de la propagación de organismos microbianos en una muestra de la composición como se evalúa en un ensayo de eficacia de conservante antimicrobiano (APET). Un experto en la materia está familiarizado con el ensayo de eficacia de conservante antimicrobiano y estándares a cumplir según la USP y EPA o EPB para cumplir los requisitos mínimos. En general, el ensayo de eficacia de conservante antimicrobiano implica exponer una composición con inóculos establecidos de microorganismos adecuados, es decir, bacterias, levaduras y hongos, almacenar la preparación inoculada a una temperatura establecida, retirar muestras a intervalos temporales especificados y contar los organismos en la muestra (véase, Sutton y Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 56(4): 300-311; The United States Pharmacopeial Convention, Inc., (efectivo el 1 de enero de 2002), The United States Pharmacopeia 25a Revisión, Rockville, MD, Capítulo <51> Antimicrobial Effectiveness Testing; y European Pharmacopoeia, Capítulo 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservation). Los microorganismos usados en la exposición en general incluyen tres cepas de bacterias, concretamente E. coli (ATCC n.° 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC n.° 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC n.° 6538), levadura (Candida albicans ATCC n.° 10231) y hongo (Aspergillus niger ATCC n.° 16404), todas las cuales se añaden de modo que la composición inoculada contenga 105 o 10° unidades formadores de colonias (ufc) de microorganismo por ml de composición. Las propiedades conservantes de la composición se consideran adecuadas si, en las condiciones del ensayo, hay un descenso significativo o ningún aumento, como se especifica en la Tabla 3 en el número de microorganismos en la composición inoculada después de los momentos y a las temperaturas establecidas. Los criterios para evaluación se proporcionan con respecto a la reducción logarítmica en el número de microorganismos viables en comparación con la muestra inicial o el punto temporal previo.
Los ejemplos no limitantes de conservantes que pueden incluirse en las co-formulaciones descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, fenol, meta-cresol (m-cresol), metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-1-butanol, diclorhidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1-3-diol), acetato fenilmercúrico, glicerol (glicerina), imidurea, clorhexidina, deshidroacetato sódico, orto-cresol (o-cresol), para-cresol (p-cresol), clorocresol, cetrimida, cloruro de bencetonio, etilparabeno, propilparabeno o butilparabeno y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener un único conservante. En otros ejemplos, las formulaciones contienen al menos dos conservantes diferentes o al menos tres conservantes diferentes. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener dos conservantes tales como L-fenilalanina y mcresol, L-fenilalanina y metilparabeno, L-fenilalanina y fenol, m-cresol y metilparabeno, fenol y metilparabeno, mcresol y fenol u otras combinaciones similares. En un ejemplo, el conservante en la formulación contiene al menos un conservante fenólico. Por ejemplo, la formulación contiene fenol, m-cresol o fenol y m-cresol.
En las formulaciones descritas en el presente documento, la cantidad total del o los agentes conservantes como un porcentaje (%) de concentración en masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo, entre de o entre aproximadamente de 0,1 % a 0,4 %, tal como 0,1 % a 0,3 %, 0,15 % a 0,325 %, 0,15 % a 0.25 %, 0,1 % a 0,2 %, 0,2 % a 0,3 % o 0,3 % a 0,4 %. En general, las formulaciones contienen menos de 0,4 % (p/v) de conservante. Por ejemplo, las co-formulaciones descritas en el presente documento contienen al menos o aproximadamente al menos 0,1 %, 0,12%, 0,125%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16% 0,17%, 0,175%, 0,18%, 0,19%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,325 %, 0,35 % pero menos del 0,4 % de conservante total.
En algunos ejemplos, las formulaciones descritas en el presente documento contienen entre o entre aproximadamente 0,1 % y 0,25 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,05 % y 0,2 % de m-cresol, tal como entre o aproximadamente entre 0,10 % y 0,2 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,06 % y 0,18 % de mcresol, o entre o aproximadamente entre 0,1 % y 0,15 % de fenol y entre o aproximadamente entre 0,08 % y 0,15 % de m-cresol. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento contienen o contienen aproximadamente 0,1 % de fenol y 0,075 % de m-cresol; 0,1 % de fenol y 0,15 % de m-cresol; 0,125 % de fenol y 0,075 % de m-cresol; 0,13 % de fenol y 0,075 % de m-cresol; 0,13 % de fenol y 0,08 % de m-cresol; 0,15 % de fenol y 0,175 % de m-cresol; o 0,17 % de fenol y 0,13 % de m-cresol.
iv. Estabilizantes
En ejemplos del presente documento, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento opcionalmente pueden contener uno o más agentes estabilizantes adicionales para mantener la estabilidad del agente o los agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20). Se incluyen entre los tipos de estabilizantes que pueden estar contenidos en las formulaciones proporcionadas en el presente documento aminoácidos, derivados de aminoácidos, aminas, azúcares, polioles, sales y tampones, tensioactivos y otros agentes. Las formulaciones descritas en el presente documento contienen al menos un estabilizante. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento contienen al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más estabilizantes. Por lo tanto, pueden incluirse uno cualquiera o más de un aminoácido, derivados de aminoácidos, aminas, azúcares, polioles, sales y tampones, tensioactivos y otros agentes en las formulaciones del presente documento. En general, las formulaciones del presente documento contienen al menos un tensioactivo y un tampón apropiado. Opcionalmente, las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener otros estabilizantes adicionales. Otros componentes incluyen, por ejemplo, uno o más modificadores de la tonicidad, uno o más agentes antioxidantes u otros estabilizantes.
Los estabilizantes de aminoácidos ejemplares, derivados de aminoácidos o aminas incluyen, pero sin limitación, L-Arginina, Glutamina, Glicina, Lisina, Metionina, Prolina, Lis-Lys, Gly-Gly, óxido de trimetilamina (TMAO) o betaína. Los azúcares y polioles ejemplares incluyen, pero sin limitación, glicerol, sorbitol, manitol, inositol, sacarosa o trehalosa. Las sales y tampones ejemplares incluyen, pero sin limitación, cloruro de magnesio, sulfato sódico, Tris tal como Tris (100 mM) o Benzoato sódico. Los tensioactivos ejemplares incluyen, pero sin limitación, poloxámero 188 (por ejemplo, Pluronic® F68), polisorbato 80 (PS80), polisorbato 20 (PS20). Otros estabilizantes incluyen, pero sin limitación, ácido hialurónico (HA), albúmina de suero humano (HSA), ácido fenilbutírico, ácido taurocólico, polivinilpirrolidona (PVP) o cinc.
En ejemplos particulares del presente documento, las formulaciones contienen uno o más detergentes, tales como tensioactivos, para mantener la estabilidad del agente o los agentes activos (por ejemplo, hialuronidasa PH20). Por ejemplo, los tensioactivos pueden inhibir la agregación de PH20 y minimizar la pérdida de absorción. Los tensioactivos en general son tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos que pueden incluirse en las formulaciones del presente documento incluyen, pero sin limitación, ésteres de ácidos grasos y parciales y éteres de alcoholes polihídricos tales como glicerol o sorbitol, poloxámeros y polisorbatos. Por ejemplo, los tensioactivos ejemplares en las formulaciones del presente documento incluyen uno cualquiera o más de poloxámero 188 (PLURONICS® tal como PLURONIC® F68), TETRONICS®, polisorbato 20, polisorbato 80, PEG 400, PEG 3000, Tween® (por ejemplo, Tween® 20 o Tween® 80), Triton® X-100, SPAN®, MYRJ®, BRIJ®, CREMOPHOR®, polipropilenglicoles o polietilenglicoles. En algunos ejemplos, las formulaciones del presente documento contienen poloxámero 188, polisorbato 20, polisorbato 80, generalmente poloxámero 188 (pluronic F68). Las formulaciones descritas en el presente documento generalmente contienen al menos un tensioactivo, tal como 1, 2 o 3 tensioactivos.
En las formulaciones descritas en el presente documento, la cantidad total del o los tensioactivos como un porcentaje (%) de concentración en masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo, entre de o entre aproximadamente de 0,005 % a 1,0 %, a 0,5 % tal como de 0,01 % a 0,1 % o de 0,01 % a 0,02 %. En general, las formulaciones contienen al menos 0,01 % de tensioactivo y contienen menos de 1,0 %, tal como menos de 0,5 % o menos de 0,1 % de tensioactivo. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener exactamente o aproximadamente 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,015 %, 0,02 %, 0,025 %, 0,03 %, 0,035 %, 0,04 %, 0,045 %, 0,05 %, 0,055 %, 0,06 %, 0,065 %, 0,07 %, 0,08 %, o 0,09 % de tensioactivo. En ejemplos particulares, las formulaciones proporcionadas en el presente documento contienen o contienen aproximadamente de 0,01 % a o a aproximadamente 0,05 % de tensioactivo.
Pueden incluirse modificadores de tonicidad en la formulación descrita en el presente documento para producir una solución con la osmolalidad deseada. Las formulaciones descritas en el presente documento tienen una osmolalidad de entre o aproximadamente entre 245 mOsm/kg a 305 mOsm/kg. Por ejemplo, la osmolalidad es o es de aproximadamente 245 mOsm/kg, 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 265 mOsm/kg, 270 mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285 mOsm/kg, 290 mOsm/kg, 295 mOsm/kg, 300 mOsm/kg o 305 mOsm/kg. En algunos ejemplos, las formulaciones tienen una osmolalidad de o de aproximadamente 275 mOsm/kg. Los modificadores de la tonicidad incluyen, pero sin limitación, glicerina, NaCl, aminoácidos, polialcoholes, trehalosa y otras sales y/o azúcares. La cantidad particular puede determinarse empíricamente para conservar actividad enzimática y/o tonicidad.
En otros casos, se incluye glicerina (glicerol) en las formulaciones. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento contienen típicamente glicerina menos de 60 mM, tal como menos de 55 mM, menos de 50 mM, menos de 45 mM, menos de 40 mM, menos de 35 mM, menos de 30 mM, menos de 25 mM, menos de 20 mM, menos de 15 mM, 10 mM o menos. La cantidad de glicerina depende típicamente de la cantidad de NaCl presente: cuanto más NaCl esté presente en la formulación, menos glicerina se requiere para conseguir la osmolalidad u osmolaridad deseada. Por lo tanto, por ejemplo, en formulaciones que contienen mayores concentraciones de NaCl, es necesario incluir poca glicerina o no es necesario incluir nada de glicerina en la formulación. Por el contrario, en formulaciones que contienen concentraciones de NaCl ligeramente menores, puede incluirse glicerina. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener glicerina a una concentración de 40 mM a 60 mM, tal como menos de 50 mM, tal como de 20 mM a 50 mM, por ejemplo a o aproximadamente a 50 mM.
Las formulaciones descritas en el presente documento también pueden contener antioxidantes para reducir o prevenir la oxidación, en particular oxidación del polipéptido de PH20. Por ejemplo, la oxidación puede efectuarse por altas concentraciones de tensioactivo u oligómeros de hialuronano. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero sin limitación, cisteína, triptófano y metionina. En ejemplos particulares, el antioxidante es metionina. Las formulaciones descritas en el presente documento pueden incluir un antioxidante a una concentración de entre o de aproximadamente entre 5 mM y o y aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM y 40 mM, 5 mM y 20 mM o 10 mM y 20 mM. Por ejemplo, puede proporcionarse metionina en las formulaciones del presente documento a una concentración de entre o de aproximadamente entre 5 mM y o y aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM y 40 mM, 5 mM y 20 mM o 10 mM y 20 mM. Por ejemplo, puede incluirse un antioxidante, por ejemplo, metionina, a una concentración que es o es aproximadamente 5 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. En algunos ejemplos, las formulaciones contienen metionina de 10 mM a 20 mM, tal como metionina a o aproximadamente a 10 mM o 20 mM.
Las formulaciones descritas en el presente documento también pueden contener un estabilizante de aminoácidos, que contribuye a la estabilidad de la preparación. El estabilizante puede ser un aminoácido no polar o básico. Los aminoácidos no polares y básicos ejemplares incluyen, pero sin limitación, alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina y prolina. Por ejemplo, el aminoácido estabilizante es glicina o prolina, típicamente glicina. El estabilizante puede ser un único aminoácido o puede ser una combinación de 2 o más de dichos aminoácidos. Los aminoácidos estabilizantes pueden ser aminoácidos naturales, análogos de aminoácidos, aminoácidos modificados o equivalentes de aminoácidos. En general, el aminoácido es un aminoácido L. Por ejemplo, cuando se usa prolina como el estabilizante, esta es en general L-prolina. También es posible usar equivalentes de aminoácidos, por ejemplo, análogos de prolina. La concentración de estabilizante de aminoácidos, por ejemplo, glicina, incluido en la formulación varía de aminoácido 0,1 M a 1 M, típicamente de 0,1 M a 0,75 M, generalmente de 0,2 M a 0,5 M, por ejemplo, al menos o aproximadamente 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,75 M o más aminoácido. El aminoácido, por ejemplo glicina, puede usarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, tal como clorhidrato, bromhidrato, sulfato, acetato, etc. La pureza del aminoácido, por ejemplo glicina, debería ser al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,5 % o más.
En ejemplos del presente documento, si es necesario, se incluyen inhibidores de hialuronidasa en una formulación para estabilizar PH20, en particular para reducir los efectos de agentes y condiciones de otro modo desestabilizantes, tales como, por ejemplo, baja salinidad, alto pH, la presencia de conservantes y temperaturas elevadas, presentes en la formulación. Dicho componente en general no se requiere para composiciones farmacéuticas que contengan un polipéptido de PH20 modificado como se describe en el presente documento que muestre estabilidad aumentada en dichas condiciones. Cuando se proporciona, el inhibidor de hialuronidasa se proporciona al menos a su concentración de equilibrio. Un experto en la materia está familiarizado con diversas clases de inhibidores de hialuronidasa (véase por ejemplo, Girish et al. (2009) Current Medicinal Chemistry, 16: 2261-2288, y referencias citadas en la misma). Un experto en la materia conoce o puede determinar por métodos convencionales en la técnica la concentración en equilibrio de un inhibidor de hialuronidasa en una reacción o composición estable del presente documento.
Un inhibidor de hialuronidasa ejemplar para su uso en las composiciones del presente documento es hialuronano (HA). El ácido hialurónico (HA, también conocido como hialuronano e hialuronato) es el sustrato natural para PH20. HA es un glucosaminoglucano no sulfatado que está ampliamente distribuido por todos los tejidos conectivos, epiteliales y neurales. Es un polímero de hasta 25.000 unidades de disacáridos, compuestos a su vez de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina. El peso molecular de HA varía de aproximadamente 5 kDa a 200.000 kDa. Puede usarse cualquier tamaño de HA en las composiciones como un estabilizante. En algunos ejemplos, e1HA es un disacárido, compuesto de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina. En otros ejemplos, el HA es un oligosacárido, tal como un tetrasacárido, que contiene 2 unidades de disacáridos repetidas, o como alternativa, el HA usado en las coformulaciones descritas en el presente documento puede contener múltiples unidades de disacáridos repetidas, tales como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más unidades de disacáridos. En otro ejemplo, el HA usado en las formulaciones descritas en el presente documento tiene un peso molecular que es de o de aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 5.000 kDa; de o de aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 1.000 kDa; de o de aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 500 kDa; o de o de aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 200 kDa. Los oligosacáridos de HA ejemplares para uso en las formulaciones del presente documento tienen un peso molecular de o de aproximadamente 6,4 kDa, 74,0 kDa o 234,4 kDa. Las formulaciones pueden contener de 1 mg/ml a 20 mg/ml de HA, de 8 mg/ml a 12 mg/ml, tal como al menos o aproximadamente 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml o 20 mg/ml o más HA. En algunos ejemplos, la relación molar de HA con respecto a PH20 es o es de aproximadamente 100.000:1, 95.000:1, 90.000:1, 85.000:1, 80.000:1, 75.000:1, 70.000:1, 65.000:1, 60.000:1 , 55.000:1, 50.000:1, 45.000:1, 40.000:1, 35.000:1, 30.000:1, 25.000:1, 20.000:1, 15.000:1, 10.000:1, 5.000:1, 1.000:1, 900 :1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1 o 100:1 o menos.
En algunos ejemplos, se usa un compuesto nicotínico como un agente estabilizante. Los compuestos nicotínicos incluyen, pero sin limitación, nicotinamida, ácido nicotínico, niacina, niacinamida, vitamina b 3 y/o sales de los mismos y/o cualquier combinación de los mismos. En aplicaciones particulares, el agente estabilizante puede incluir un compuesto nicotínico, un aminoácido o aminoácidos (véase por ejemplo, Publicación Internacional n.° WO2010149772). Por ejemplo, el aminoácido puede ser arginina, ácido glutámico y/o sales de los mismos o combinaciones de los mismos.
2. Composiciones para otras vías de administración
Dependiendo de la afección tratada también se contemplan en el presente documento otras vías de administración, tales como aplicación tópica, parches transdérmicos, administración oral y rectal.
Por ejemplo, son formas de dosificación farmacéutica para administración rectal supositorios rectales, cápsulas y comprimidos para efecto sistémico. Los supositorios rectales incluyen cuerpos sólidos para inserción en el recto que se funden o se ablandan a la temperatura corporal liberando uno o más principios activos farmacológica o terapéuticamente. Son sustancias farmacéuticamente aceptables utilizadas en supositorios rectales bases o vehículos y agentes para aumentar el punto de fusión. Los ejemplos de bases incluyen manteca de cacao (aceite de teobroma), glicerina-gelatina, carbowax (polioxietilenglicol) y mezclas apropiadas de mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Pueden usarse combinaciones de las diversas bases. Los agentes para inducir el punto de fusión de supositorios incluyen espermaceti y cera. Pueden prepararse supositorios rectales bien mediante el método de compresión o por moldeo. El peso típico de un supositorio rectal es de aproximadamente 2 a 3 g. Se fabrican comprimidos y cápsulas para administración rectal usando la misma sustancia farmacéuticamente aceptable y por los mismos métodos como para formulaciones para administración oral. Pueden proporcionarse formulaciones adecuadas para administración rectal como supositorios de dosis unitaria. Estos pueden prepararse mezclando el compuesto activo con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y después moldeando la mezcla resultante.
Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno fosfato cálcico); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica.
Las formulaciones adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen, por ejemplo, grageas que contienen el compuesto activo en una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; y pastillas que contienen el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga.
Se preparan mezclas tópicas como se describe para la administración local y sistémica. Las mezclas resultantes pueden ser soluciones, suspensiones, emulsiones o similares y se formulan como cremas, geles, pomadas, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendajes, parches dérmicos o cualquier otra formulación adecuada para administración tópica.
Los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden formularse como aerosoles para aplicación tópica, tal como por inhalación (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 4.044.126, 4.414.209 y 4.364.923, que describen aerosoles para suministro de un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmente asma). Estas formulaciones, para administración al tracto respiratorio, pueden estar en forma de un aerosol o una solución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solas o en combinación con un vehículo inerte tal como lactosa. En dicho caso, las partículas de la formulación típicamente tendrán diámetros de menos de 50 micrómetros, o menos de 10 micrómetros.
Los compuestos pueden formularse para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica a la piel y membranas mucosas, tales como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones y para aplicación al ojo o para aplicación intracisternal o intraespinal. Se contempla la administración tópica para suministro transdérmico y también para administración a los ojos o la mucosa, o para terapias de inhalación. También pueden administrarse soluciones nasales del compuesto activo solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables.
Se proporcionan formulaciones adecuadas para administración transdérmica. Pueden proporcionarse en cualquier formato adecuado, tal como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un periodo de tiempo prolongado. Dichos parches contienen el compuesto activo en una solución acuosa opcionalmente tamponada de, por ejemplo, 0,1 a 0,2 M de concentración con respecto al compuesto activo. También pueden suministrarse formulaciones adecuadas para administración transdérmica mediante iontoforesis (véase, por ejemplo, Tyle, P, Pharmaceutical Research 3 (6): 318-326 (1986)) y típicamente toman la forma de una solución acuosa tamponada opcionalmente del compuesto activo.
También pueden administrarse composiciones farmacéuticas mediante formulaciones de liberación controlada y/o dispositivos de suministro (véase por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 3.536.809, 3.598.123, 3.630.200, 3.845.770, 3.916.899, 4.008.719, 4.769.027, 5.059.595, 5.073.543, 5.120.548 5.591.767, 5.639.476, 5.674.533 y 5.733.566).
3. Dosificaciones y administración
Los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden formularse como composiciones farmacéuticas para administración en dosificación individual o dosificación múltiple. El polipéptido de PH20 se incluye en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. La concentración terapéuticamente eficaz puede determinarse empíricamente ensayando los polipéptidos en sistemas in vitro e in vivo conocidos tal como usando los ensayos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Bouffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39: 249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37: 8899-8905; D'Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 76: 1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem., 247: 242-246; véase también por ejemplo, Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68: 8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70: 7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227: 822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93: 1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226: 318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77: 1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212: 906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207) y después extrapolarse a partir de los mismos para dosificaciones para seres humanos.
La cantidad de una PH20 modificada para administrar para el tratamiento de una enfermedad o afección puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, pueden emplearse ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosificación precisa, que puede determinarse de forma empírica, puede depender de la enzima particular, la vía de administración, el tipo de enfermedad para tratar y la gravedad de la enfermedad.
Por lo tanto, se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento están en función de la enfermedad que se trate y pueden determinarse de forma empírica usando protocolos de ensayo conocidos o mediante extrapolación a partir de datos de ensayo in vivo o in vitro. Debe observarse que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la gravedad de la afección para aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deberían ajustarse a lo largo del tiempo según las necesidades individuales y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración expuestos en el presente documento son solamente ejemplares y no se pretende que limiten el alcance o el uso de composiciones y combinaciones que los contienen. Las composiciones pueden administrarse cada hora, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente o una vez. En general, se eligen regímenes de dosificación para limitar la toxicidad. Debería observarse que el médico a cargo sabrá cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la terapia para reducir la dosificación debido a toxicidad, o disfunciones de la médula ósea, hígado o riñón u otros tejidos. Por el contrario, el médico a cargo también sabrá cómo y cuándo ajustar el tratamiento a mayores niveles si la respuesta clínica no es adecuada (evitando efectos secundarios tóxicos).
Típicamente, una dosis terapéuticamente eficaz de una enzima PH20 modificada es o es de aproximadamente 10 unidades (U) a 500.000 unidades, de 100 unidades a 100.000 unidades, de 500 unidades a 50.000 unidades, de 1000 unidades a 10.000 unidades, de 5000 unidades a 7500 unidades, de 5000 unidades a 50.000 unidades, o de 1.000 unidades a 10.000 unidades, en general de 1.000 a 50.000 unidades, en una solución o suspensión estabilizada o una forma liofilizada. Por ejemplo, puede administrarse un polipéptido de PH20 a una dosis de al menos o aproximadamente al menos o 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2.000 U, 3.000 U, 4.000 Unidades, 5.000 U o más. Las formulaciones pueden proporcionarse en formas de dosis unitaria tales como, pero sin limitación, ampollas, jeringas y comprimidos o cápsulas envasados individualmente.
La enzima PH20 puede administrarse sola o con otro agente u otros agentes farmacológicamente eficaces o agente o agentes terapéuticos, en un volumen total de 0,1-100 ml, 1-50 ml, 10-50 ml, 10-30 ml, 1-20 ml o 1-10 ml, típicamente 10-50 ml. Típicamente, los volúmenes de inyecciones o infusiones de una composición que contiene PH20 son de al menos o al menos aproximadamente 0,01 ml, 0,05 ml, 0,1 ml, 0,2 ml, 0,3 ml, 0,4 ml, 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml o más. Las formulaciones descritas en el presente documento contienen un polipéptido de PH20 modificado en una cantidad entre o aproximadamente entre 30 unidades/ml y 3000 U/ml, 300 U/ml y 2000 U/ml o 600 U/ml y 2000 U/ml o 600 U/ml y 1000 U/ml, tal como al menos o aproximadamente al menos 30 U/ml, 35 U/ml, 40 U/ml, 50 U/ml, 100 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ml, 600 U/ml, 700 U/ml, 800 U/ml, 900 U/ml, 1000 U/ml, 2000 U/ml o 3000 U/ml. Por ejemplo, las formulaciones descritas en el presente documento contienen una PH20 que está en una cantidad que es al menos de 100 U/ml a 1000 U/ml, por ejemplo al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente o 600 U/ml.
El polipéptido de PH20 puede proporcionarse como una solución en una cantidad que es de al menos o aproximadamente o es de 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ml, 600 U/ml, 800 U/ml o 1000 U/ml, o puede proporcionarse en una forma más concentrada, por ejemplo en una cantidad que es al menos o aproximadamente o es de 2000 U/ml, 3000 Unidades/ml, 4000 U/ml, 5000 U/ml, 8000 U/ml, 10.000 U/ml o 20.000 U/ml para su uso directamente o para dilución con la concentración eficaz antes de su uso. Las composiciones de polipéptidos de PH20 pueden proporcionarse como una formulación líquida o liofilizada.
Cuando la PH20 se coformula con un agente terapéutico, las dosificaciones pueden proporcionarse como una relación de la cantidad de un polipéptido de PH20 con respecto a la cantidad del agente terapéutico administrado. Por ejemplo, puede administrarse un polipéptido de PH20 a 1 U de hialuronidasa/U de agente terapéutico (1:1) a 50:1 o más, por ejemplo, a o aproximadamente a 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 , 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25 :1, 30:1, 35:1,40:1,45:1, 50:1 o más.
Las formulaciones descritas en el presente documento, incluyendo coformulaciones y/o formulaciones estables, pueden prepararse para administración de dosis individual, administración de dosis múltiple o administraciones de infusión continua. También se contempla en el presente documento la implantación de un sistema de liberación lenta o liberación sostenida, de modo que se mantenga un nivel constante de dosificación (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 3.710.795).
Por ejemplo, se proporcionan formulaciones de compuestos farmacéuticamente terapéuticamente activos y derivados de los mismos para administración a seres humanos y animales en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiple. Por ejemplo, los compuestos pueden formularse como comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, soluciones o suspensiones orales o emulsiones de aceite-agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto o compuestos terapéuticamente activos suficientes para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el transportador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Los ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas y comprimidos o cápsulas envasados individualmente. Pueden administrarse formas de dosis unitaria en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente para administrar en formas de dosis unitarias segregadas. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o frascos de pintas o galones. Por lo tanto, la forma de dosis múltiple es una multitud de dosis unitarias que no se segregan en el envasado. En general, pueden prepararse formas de dosificación o composiciones que contienen principio activo en el intervalo de 0,005 % a 100 % con el resto compuesto de vehículo no tóxico
Se formulan composiciones descritas en el presente documento típicamente para administración por vía subcutánea, aunque se contemplan otras vías de administración, tales como cualquier vía conocida por los expertos en la materia incluyendo administración intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intralesional, inyección intraperitoneal, epidural, vaginal, rectal, local, ótica, transdérmica o cualquier vía de administración. Los expertos en la materia conocen formulaciones adecuadas para dichas vías. La administración puede ser local, tópica o sistémica dependiendo del locus del tratamiento. La administración local a un área que necesita tratamiento puede conseguirse, por ejemplo, pero sin limitación, mediante infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito de herida después de cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante. También pueden administrarse composiciones con otros agentes biológicamente activos, bien secuencialmente, bien intermitentemente o bien en la misma composición.
La vía más adecuada en cualquier caso depende de una diversidad de factores, tales como la naturaleza de la enfermedad, la tolerancia del sujeto a una vía de administración particular, la gravedad de la enfermedad, y la composición particular que se use. Típicamente, las composiciones descritas en el presente documento se administran por vía parenteral. En algunos ejemplos, se administran composiciones de polipéptidos de PH20 modificados de modo que alcancen el intersticio de piel o tejidos, degradando de este modo el espacio intersticial para posterior suministro de un agente terapéutico. Por lo tanto, en algunos ejemplos, se contempla la administración directa bajo la piel, tal como mediante métodos de administración subcutánea. Por lo tanto, en un ejemplo, puede conseguirse administración local mediante inyección, tal como de una jeringa u otro artículo de fabricación que contiene un dispositivo de inyección tal como una aguja. En otro ejemplo, puede conseguirse administración local mediante infusión, lo que puede facilitarse mediante el uso de una bomba u otro dispositivo similar. También se contemplan otros modos de administración. Por ejemplo, pueden administrarse por vía intravenosa polipéptidos de PH20 modificados, incluyendo formas conjugadas con semivida aumentada tales como formas PEGiladas de los mismos. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
Pueden emplearse métodos de administración para reducir la exposición de polipéptidos de PH20 modificados seleccionados a procesos degradantes, tales como degradación proteolítica e intervención inmunológica mediante respuestas antigénicas e inmunogénicas. Los ejemplos de dichos métodos incluyen administración local en el sitio de tratamiento. La PEGilación de productos terapéuticos aumenta la resistencia a la proteólisis, aumenta la semivida en plasma y reduce la antigenicidad e inmunogenicidad. Se conocen en la técnica ejemplos de metodologías de PEGilación (véase por ejemplo, Lu y Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu y Felix, Peptide Res., 6: 140-6, 1993, Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 1995, Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J. Immunol., 154: 3088-95, 1995, véase también Caliceti et al (2003) Adv. Drug Rev. 55 (10): 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). También puede usarse PEGilación en el suministro de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por ejemplo, la PEGilación de adenovirus puede aumentar la estabilidad y la transferencia génica (véase, por ejemplo, Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20 (9): 1444-51).
Se conocen diversos otros sistemas de suministro y pueden utilizarse para administrar polipéptidos de PH20 seleccionados, tales como pero sin limitación, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor y suministro de moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de PH20 seleccionados tales como sistemas de suministro de retrovirus.
Por lo tanto, también pueden emplearse liposomas y/o nanopartículas con la administración de polipéptidos de PH20 solubles. Se forman liposomas a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y espontáneamente forman vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)). Las MLV tienen en general diámetros de 25 nm a 4 |im. La sonicación de MLV da como resultado la formación de vesículas unilamelares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 angstroms que contienen una solución acuosa en el núcleo.
Los fosfolípidos pueden formar una diversidad de estructuras distintas de liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la relación molar del lípido con respecto a agua. A relaciones bajas del lípido con respecto a agua, se forman liposomas. Las características físicas de liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad frente a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que altera notablemente su permeabilidad. La transición de fase implica un cambio desde una estructura estrechamente empaquetada, ordenada, conocida como el estado de gel, a una estructura poco empaquetada, menos ordenada, conocida como el estado fluido. Esto sucede a una temperatura de transición de fase característica y da como resultado un aumento de la permeabilidad a iones, azúcares y fármacos.
Los liposomas interaccionan con células mediante diferentes mecanismos: endocitosis mediante células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, bien mediante fuerzas hidrófobas o electrostáticas débiles no específicas, o bien mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con la membrana de célula plasmática mediante inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con liberación simultánea de contenidos liposómicos al citoplasma; y mediante transferencia de lípidos liposómicos a membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin ninguna asociación de los contenidos del liposoma. La variación de la formulación del liposoma puede alterar el mecanismo que está operativo, aunque pueden actuar más de uno al mismo tiempo. Las nanocápsulas generalmente pueden inmovilizar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debido a sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0,1 |im) deberían diseñarse usando polímeros que pueden degradarse in vivo. Se contemplan para su uso en el presente documento nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos, y dichas partículas pueden prepararse fácilmente.
4. Co-formulación de insulina-PH20 ejemplar.
Se describen en el presente documento co-formulaciones estables de una insulina de acción rápida, tal como un análogo de insulina de acción rápida (acción veloz) y un polipéptido de PH20 modificado. Puede incluirse cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento en una co-formulación con insulina, tal como cualquiera de las co-formulaciones descritas en la Solicitud de Estados Unidos n.° Serie 13/507.263 o 13/507.262 o en una Solicitud de PCT Internacional n.° de Serie PCT/US2012/042816.
En particular, el polipéptido de PH20 modificado es un polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada en condiciones de desnaturalización, tales como cualquiera expuesta en las Secciones C.1.b. En particular, el polipéptido de PH20 es un polipéptido de PH20 modificado que muestra estabilidad aumentada con respecto a uno o más conservantes fenólicos, tal como cualquiera expuesto en la Sección C.1.b.i. Por ejemplo, el polipéptido de PH20 es un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido con P en una posición correspondiente a la posición 204 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, tal como F204P en referencia a cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66. En otros ejemplos, el polipéptido de PH20 es un polipéptido de PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácido con R en una posición correspondiente a la posición 58 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, tal como V58R en referencia a cualquiera de SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66.
La insulina de acción rápida puede ser una insulina regular o un análogo de insulina de acción rápida (acción veloz). La insulina es un polipéptido que cuando se procesa está compuesto de 51 aminoácidos que contienen una cadena A y B. En general, la insulina contiene una cadena A de aproximadamente 21 aminoácidos y una cadena B de aproximadamente 30 aminoácidos. Las cadenas A y B se unen por enlaces disulfuro. Las insulinas regulares ejemplares incluyen, por ejemplo, una insulina humana (con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 863) o una insulina porcina (con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como las posiciones de restos de aminoácidos 88-108 de s Eq ID NO: 864, y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como las posiciones de restos de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 864). Son análogos de insulina de acción rápida ejemplares variantes de insulina que contienen una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con una insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 862 y 863 (cadenas A y B). Por ejemplo, los expertos en la materia conocen análogos de insulina ejemplares, e incluyen, pero sin limitación, glulisina que tiene una cadena expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que es una variante de SEQ ID NO: 863 (cadena B; LysB3, GluB29), HMR-1 153 que tiene una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que es una variante de SEQ ID NO: 863 (cadena B; LysB3, IleB28), insulina aspart que tiene una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que es una variante de SEQ ID NO: 863 (cadena B; AspB28), e insulina lispro que tiene una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que es una variante de SEQ ID NO: 863 (cadena B; LysB28, ProB29). En cada caso anterior, la nomenclatura de los análogos se basa en una descripción de la sustitución de aminoácido en posiciones específicas en la cadena A o B de insulina, numeradas desde el extremo N de la cadena, en la que el resto de la secuencia es de insulina humana natural. Se exponen ejemplos de dichas formas análogas en SEQ ID NO: 862 (cadena A) y que tienen una cadena B expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 865-867.
Las co-formulaciones son estables como una formulación líquida durante periodos de tiempo prolongados durante al menos 1 mes a temperaturas de o de aproximadamente 2 °C a 8 °C, inclusive, o durante al menos 3 días a una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, inclusive. Por ejemplo, las co-formulaciones son estables y conservan actividad de la hialuronidasa PH20 e insulina en condiciones de “refrigerador”, por ejemplo, de 2 °C a 8 °C, tal como a o aproximadamente 4 °C, durante al menos 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, o 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, 26 meses, 27 meses, 28 meses, 29 meses o 30 meses o más. En otro ejemplo, las formaciones descritas en el presente documento son estables y conservan actividad de la hialuronidasa PH20 e insulina a temperatura ambiente por ejemplo de 18 °C a 32 °C, en general de 20 °C a 32 °C, tal como de 28 °C a 32 °C, durante al menos 2 semanas a 1 año, por ejemplo, al menos 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses o al menos 1 año o más. En un ejemplo adicional, las formulaciones descritas en el presente documento son estables y conservan actividad de la hialuronidasa PH20 e insulina a temperaturas elevadas de aproximadamente o más de 30 °C, en general de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, tal como de 32 °C a 37 °C o de 35 °C a 37 °C o de aproximadamente o 37 °C durante al menos 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días o más.
Los expertos en la materia conocen bien ensayos para evaluar la estabilidad de agentes activos. La sección G proporciona ensayos ejemplares para evaluar la estabilidad de hialuronidasa PH20. La estabilidad de insulina puede evaluarse usando métodos similares bien conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, la estabilidad y solubilidad de insulina puede evaluarse mediante evaluación visual (por ejemplo, incluyendo cambios de color, claridad, presencia de agregados o agrupamiento y adhesión de material, o escarchado), clarificación con ácido, microscopía óptica, cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC), bioensayos in vitro o in vivo y cromatografía de exclusión por tamaño desnaturalizante y no desnaturalizante (SEC). Los bioensayos in vitro o in vivo para actividad de insulina incluyen, pero sin limitación, un ensayo de unión competitiva que usa células que expresan receptores de insulina (por ejemplo, membranas de células placentarias humanas) y una insulina radiomarcada (véase por ejemplo, Weiss et al., (2001) J. Biol. Chem. 276: 40018-40024; Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54: 251-258); captación de glucosa estimulada por insulina (Louveau et al., (2004) J Endocrin. 181: 271­ 280, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54: 251-258); ensayos para evaluar la producción de glucosa en presencia de insulina (Wang et al., (2000) J. Biochem., 275: 14717-14721, Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54: 251-258); y estudios que usan modelos animales diabéticos y/o sanos (Atkinson et al., (1999) Nature Med. 5: 601-604); ratones Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY), ratas gordas diabéticas de Zucker (ZDF) y ratas Gato-Katazaki (GK) (Cefalu (2006) ILAR Journal 47: 186-198).
Los ejemplos de dichas formulaciones contienen de 100 U/ml a 1000 U/ml de un polipéptido de PH20, y en particular a o aproximadamente o al menos 600 U/ml; 10 U/ml a 1000 U/ml de una insulina de acción rápida, y en particular a o al menos o aproximadamente a 100 U/ml; NaCl a una concentración de entre o aproximadamente entre 80-140 mM; un pH de entre o aproximadamente entre 7,0 y 7,8; un agente tamponante que mantiene el intervalo de pH de entre o de aproximadamente entre 7,0 y 7,8; de 0,1 % a 0,4% de conservante como una concentración en masa (p/v). Opcionalmente, puede incluirse un agente estabilizante adicional. Por ejemplo, las co-formulaciones descritas en el presente documento contiene de 1 mM a 100 mM de un agente tamponante. Por ejemplo, las co-formulaciones descritas en el presente documento contienen de 0,005 % a 0,5 % de tensioactivo. Las co-formulaciones ejemplares descritas en el presente documento también pueden contener glicerina (glicerol) menos 60 mM y antioxidante de 2 mM a o a aproximadamente 50 mM.
Las siguientes formulaciones estables son ejemplares solamente y proporcionan una plataforma a partir de la que puede realizarse ajustes menores. Se entiende que pueden realizarse cambios muy pequeños en las concentraciones de los diversos excipientes y otros componentes (por ejemplo, 15% de las concentraciones indicadas), o cambios pequeños en el pH, conservando al mismo tiempo parte de si no toda la solubilidad y estabilidad de insulina y estabilidad de p H20. También puede realizarse cambios adicionales añadiendo o retirando excipientes. Por ejemplo, puede cambiarse el tipo de tensioactivo estabilizante.
Por ejemplo, las co-formulaciones ejemplares en el presente documento contienen de 100 U/ml a 1000 U/ml de un polipéptido de PH20 modificado, y en particular al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 600 U/ml de un polipéptido de PH20 modificado; de 10 U/ml a 1000 U/ml de una insulina de acción rápida, y en particular al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 100 U/ml de una insulina de acción rápida; Tris de o de aproximadamente 10 mM a o a aproximadamente 50 mM (por ejemplo, Tris de o de aproximadamente 20 mM a 40 mM, tal como o como aproximadamente Tris 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM o 40 mM); NaCl de o de aproximadamente 80 mM a o a aproximadamente 160 mM (por ejemplo NaCl a o aproximadamente a 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM o 160 mM), metionina de o de aproximadamente 2 mM a o a aproximadamente 50 mM (por ejemplo, metionina a o aproximadamente a 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM); glicerina de o de aproximadamente 0 mM a o a aproximadamente 50 mM (por ejemplo, glicerina a o aproximadamente a 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM); poloxámero 188 de o de aproximadamente 0,005 % a o a aproximadamente 0,5%, tal como de 0,01% a 0,05% (por ejemplo, poloxámero 188 a o aproximadamente a 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04% o 0,05%); fenol de o de aproximadamente 0,05% a o aproximadamente 0,25% (por ejemplo, fenol a o aproximadamente a 0,1 %, 0,12%, 0,125%, 0,13%, 0,14%, 0,15 %, 0,16 % o 0,17 %); y m-cresol de o de aproximadamente 0,05 % a o aproximadamente 0,4 % (por ejemplo, m-cresol a o aproximadamente a 0,075 %, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,12%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16% o 0,17 %). Las formulaciones se preparan con un pH de o de aproximadamente 7,0 a o a aproximadamente 7,6 (por ejemplo, a o aproximadamente a pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 o 7,6), En ejemplos adicionales, se incluye cinc a una concentración de o aproximadamente de 0,017 mg/100 U, 0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022 mg/100 U o 0,024 mg/100 U de insulina.
En ejemplos particulares, la insulina de acción rápida es insulina aspart, insulina lispro o insulina glulisina. Son coformulaciones ejemplares descritas en el presente documento que contienen un polipéptido de PH20 modificada e insulina lispro las que contienen Tris de o aproximadamente de 25 mM a o a aproximadamente 35 mM (por ejemplo, Tris a o aproximadamente 30 mM); NaCl de o de aproximadamente 70 mM a o a aproximadamente 100 mM (por ejemplo, NaCl a o aproximadamente 80 mM o 100 mM); metionina de o de aproximadamente 10 mM a o a aproximadamente 30 mM (por ejemplo, metionina a o aproximadamente 10 mM o 20 mM); glicerina de o de aproximadamente 40 mM a o a aproximadamente 60 mM (por ejemplo, glicerina a o aproximadamente 50 mM); poloxámero 188 de o de aproximadamente 0,005 % a o a aproximadamente 0,05 % (por ejemplo, poloxámero 188 a o aproximadamente 0,01 %); de o de aproximadamente 0,017 mg de cinc/100 U de insulina a o a aproximadamente 0,024 mg de cinc/100 U de insulina (por ejemplo, 0,017 mg de cinc/100 U de insulina, 0,018 mg/100 U, 0,02 mg/100 U, 0,022 mg/100 U o 0,024 mg de cinc/100 U de insulina); fenol de o de aproximadamente 0,08% a o a aproximadamente 0,17% (por ejemplo, fenol 0,1 %, 0,125% o 0,13%); y m-cresol de o de aproximadamente 0.07 % a o a aproximadamente 0.17 % (por ejemplo, m-cresol 0.075 %, 0.08 %, 0.13 % o 0.15 %). Por ejemplo, las co-formulaciones pueden contener fenol a o aproximadamente 0,1% y m-cresol 0,015%; fenol a o aproximadamente 0,125 % y m-cresol 0,075 %; fenol a o aproximadamente 0,13 % y m-cresol 0,075 %; fenol a o aproximadamente 0,13% y m-cresol 0,08%; o fenol a o aproximadamente 0.17% y m-cresol 0,13%. Dichas formulaciones de insulina lispro y un polipéptido de PH20 modificado se preparan con un pH de o de aproximadamente de 7,0 a o a aproximadamente 7,5 (típicamente un pH de o aproximadamente de pH 7,2).
Son co-formulaciones ejemplares descritas en el presente documento que contienen un polipéptido de PH20 modificado e insulina aspart los que contienen Tris de o de aproximadamente 25 mM a o a aproximadamente 35 mM (por ejemplo, Tris a o aproximadamente 30 mM); NaCl de o de aproximadamente 70 mM a o a aproximadamente 120 mM (por ejemplo, NaCl a o aproximadamente 80 mM o 100 mM); metionina de o de aproximadamente 2 mM a o a aproximadamente 30 mM, tal como de 2 mM a 10 mM o de 5 mM a 30 mM (por ejemplo, metionina a o aproximadamente a 5 mM, 10 mM o 20 mM); poloxámero 188 de o de aproximadamente 0,005% a o a aproximadamente 0,05% (por ejemplo, poloxámero 188 a o aproximadamente 0,01%); fenol de o de aproximadamente 0,08 % a o a aproximadamente 0,17 % (por ejemplo, fenol 0,1 %, 0,125 % o 0,13 %); y m-cresol de o de aproximadamente 0,07 % a o a aproximadamente 0,17 % (por ejemplo, m-cresol 0,075 %, 0,08 %, 0,13 % o 0,15 %). Por ejemplo, las co-formulaciones pueden contener fenol a o aproximadamente 0,1 % y m-cresol 0,015 %; fenol a o aproximadamente 0,125 % y m-cresol 0,075 %; fenol a o aproximadamente 0,13 % y m-cresol 0,075 %; fenol a o aproximadamente 0,13% y m-cresol 0,08%; o fenol a o aproximadamente 0,17% y m-cresol 0,13%. Dichas formulaciones de insulina aspart y un polipéptido de PH20 modificado se preparan con un pH de o aproximadamente 7,0 a o a aproximadamente 7,6 (típicamente un pH de o aproximadamente pH 7,4 o 7,3).
Son formulaciones ejemplares adicionales descritas en el presente documento que contienen un polipéptido de PH20 modificado e insulina aspart las que no contienen fenol. Dichas formulaciones ejemplares contienen Tris de o de aproximadamente 25 mM a o a aproximadamente 35 mM (por ejemplo, Tris a o aproximadamente 30 mM); NaCl de o de aproximadamente 70 mM a o a aproximadamente 120 mM (por ejemplo, NaCI a o aproximadamente 80 mM o 100 mM); metionina de o de aproximadamente 2 mM a o a aproximadamente 30 mM, tal como metionina 2 mM a 10 mM o 5 mM a 30 mM (por ejemplo, metionina a o aproximadamente a 5 mM, 10 mM o 20 mM); poloxámero 188 de o de aproximadamente 0,005 % a o a aproximadamente 0,05% (por ejemplo, poloxámero 188 a o aproximadamente 0,01 %); y m-cresol de o de aproximadamente 0,07 % a o a aproximadamente 0,4 %, tal como mcresol de o de aproximadamente 0,2% a 0,4% (por ejemplo, m-cresol 0,3%, 0,315%, 0,35%, 0,4%). Dichas formulaciones de insulin aspart y polipéptido de PH20 modificado se preparan con un pH de o aproximadamente de 7,0 a o a aproximadamente 7,6 (típicamente un pH de o aproximadamente de pH 7,4 o 7,3).
Son co-formulaciones ejemplares descritas en el presente documento que contienen un polipéptido de PH20 modificado e insulina glulisina las que contienen Tris de o de aproximadamente 25 mM a o a aproximadamente 35 mM (por ejemplo, Tris a o aproximadamente 30 mM); NaCl de o de aproximadamente 100 mM a o a aproximadamente 150 mM (por ejemplo, NaCl a o aproximadamente 100 mM o 140 mM); metionina de o de aproximadamente 10 mM a o a aproximadamente 30 mM (por ejemplo, metionina a o aproximadamente 10 mM o 20 mM); glicerina de o de aproximadamente 40 mM a o a aproximadamente 60 mM (por ejemplo, glicerina a o aproximadamente 50 mM); poloxámero 188 de o de aproximadamente 0,005 % a o a aproximadamente 0,05 % (por ejemplo, poloxámero 188 a o aproximadamente 0,01%); fenol de o de aproximadamente 0,08% a o a aproximadamente 0,17% (por ejemplo, fenol 0,1 %, 0,125% o 0,13%); y m-cresol de o de aproximadamente 0,07 % a o a aproximadamente 0,17 % (por ejemplo, m-cresol 0,075 %, 0,08 %, 0,13 % o 0,15 %). Por ejemplo, las co-formulaciones pueden contener fenol a o aproximadamente 0,1% fenol y m-cresol 0,015%; fenol a o aproximadamente 0,125 % y m-cresol 0,075 %; fenol a o aproximadamente 0,13 % y m-cresol 0,075 %; fenol a o aproximadamente 0,13% y m-cresol 0,08%; o fenol a o aproximadamente 0,17% y m-cresol 0,13%. Dichas formulaciones de insulina glulisina y un polipéptido de PH20 modificado se preparan con un pH de o aproximadamente de 7,0 a o a aproximadamente 7,6 (típicamente un pH de o aproximadamente pH 7,4).
5. Envasado, artículos de fabricación y kits
Pueden envasarse compuestos farmacéuticos de polipéptidos de PH20 modificados, o ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, o derivados o variantes de los mismos como artículos de fabricación que contienen material de envasado, una composición farmacéutica que es eficaz para tratar una enfermedad o un trastorno, y un marcador que indica que la composición farmacéutica o molécula terapéutica va a usarse para tratar la enfermedad o el trastorno. También pueden envasarse en un artículo de fabricación combinaciones de un polipéptido de PH20 modificado seleccionado, o un derivado o variante del mismo y un agente terapéutico.
Los artículos de fabricación descritos en el presente documento contienen materiales de envasado. Los expertos en la materia conocen bien materiales de envasado para su uso en el envasado de productos farmacéuticos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.252. Los ejemplos de materiales envasados farmacéuticos incluyen, pero sin limitación, paquetes de blíster, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, botellas, y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada y modo pretendido de administración y tratamiento. Los artículos de fabricación pueden incluir una aguja u otro dispositivo de inyección para facilitar la administración (por ejemplo, administración sub-epidérmica) para fines de inyección local. Se contempla una amplia serie de formulaciones de los compuestos y composiciones descritos en el presente documento incluyen un polipéptido de PH20 modificado y un agente terapéutico, tal como una insulina de acción rápida, que se sabe que trata una enfermedad o trastorno particular. La elección del envase depende de la PH20 y/o el agente terapéutico, y si dichas composiciones se envasaran juntas o por separado. En un ejemplo, la PH20 puede envasarse como una mezcla con el agente terapéutico. En otro ejemplo, los componentes pueden envasarse como composiciones separadas.
También pueden tratarse como kits polipéptidos de PH20 modificados, agentes terapéuticos y/o artículos de fabricación de los mismos. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para administración proporcionado como un artículo de fabricación. Por ejemplo, un polipéptido de PH20 puede proporcionarse con un dispositivo para administración, tal como una jeringa, un inhalador, una copa de dosificación, un gotero o un aplicador. Las composiciones pueden estar contenidas en el artículo para administración o pueden proporcionarse por separado para añadir posteriormente. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para aplicación incluyendo dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para diagnóstico. Por ejemplo, dichos kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o actividad de la proteasa seleccionada en un sujeto.
G. Métodos para evaluar la actividad y estabilidad de PH20
Pueden usarse ensayos para evaluar la estabilidad y la actividad de los polipéptidos de PH20 proporcionados en el presente documento. Los ensayos pueden usarse para evaluar la actividad hialuronidasa del polipéptido de PH20 en condiciones particulares, temperatura y/o a lo largo del tiempo. Dichos ensayos pueden usarse, por ejemplo, para determinar la estabilidad del polipéptido de PH20 en condiciones de desnaturalización específicas, incluyendo, pero sin limitación, temperaturas elevadas mayores de o aproximadamente o 30 °C (por ejemplo, de 30 °C a 42 °C tal como o aproximadamente 37 °C), agitación, presencia de excipientes (por ejemplo, conservante), o baja NaCI o ausencia de NaCl (sal). Por ejemplo, la estabilidad en condiciones específicas puede supervisarse evaluando la actividad, solubilidad y estabilidad (por ejemplo, formación de agregados, etc.) en ausencia de exposición a la condición de desnaturalización y después en diversos puntos temporales en lo sucesivo en presencia de la condición. Por lo tanto, la estabilidad puede evaluarse a lo largo del tiempo. La estabilidad también puede evaluarse comparando uno cualquiera o más de actividad, solubilidad o agregación en presencia de una o más condiciones de desnaturalización en comparación con un polipéptido de PH20 nativo, de tipo silvestre o de referencia. Los ensayos también pueden usarse para realizar pequeños ajustes a las formulaciones descritas en el presente documento conservando al mismo tiempo la estabilidad de ambos agentes activos.
1. Actividad hialuronidasa
La actividad de un polipéptido de PH20 modificado puede evaluarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo de USP XXII para hialuronidasa determina la actividad indirectamente midiendo la cantidad de sustrato de ácido hialurónico no degradado o hialuronano, (HA) que permanece después de que se permita que la enzima reaccione con el HA durante 30 min a 37 °C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Puede usarse un Patrón de Referencia de Hialuronidasa (USP) o solución de Hialuronidasa Patrón del Formulario Nacional (NF) en un ensayo para determinar la actividad, en unidades, de cualquier hialuronidasa. En un ejemplo, la actividad se mide usando un ensayo de microturbidez. Este se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con un reactivo que lo precipita, tal como suero acidificado o cloruro de cetilpiridinio (CPC). La actividad se mide incubando hialuronidasa con hialuronato sódico (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (por ejemplo, 10 minutos) y precipitando después el hialuronato sódico no digerido con la adición de suero acidificado o CPC. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un periodo de desarrollo adicional. La reducción de la turbidez que resulta de la actividad hialuronidasa en el sustrato de hialuronato sódico es una medida de la actividad enzimática hialuronidasa.
En otro ejemplo, la actividad hialuronidasa se mide usando un ensayo de microtitulación en el que se mide el ácido hialurónico biotinilado residual después de incubación con hialuronidasa (véase por ejemplo, Frost y Stern (1997) Axial. Biochem. 251: 263-269, publicación de patente de Estados Unidos n.° 20050260186). Los grupos carboxilo libres en los restos de ácido glucurónico de ácido hialurónico están biotinilados, y el sustrato de ácido hialurónico biotinilado está acoplado covalentemente a una placa de microtitulación. Después de incubación con hialuronidasa, el sustrato de ácido hialurónico biotinilado residual se detecta usando una reacción de avidina-peroxidasa, y se compara con el obtenido después de la reacción con patrones de hialuronidasa de actividad conocida.
Se conocen en la técnica otros ensayos para medir la actividad hialuronidasa y pueden usarse en los métodos del presente documento (véase, por ejemplo., Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229: 35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322: 257-263).
Muchos ensayos de hialuronidasa se han basado en la medición de la generación de nuevos grupos de N-acetilamino reductores (Bonner y Cantey, Clin. Chim. Acta 13: 746-752, 1966), o pérdida de viscosidad (De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys. 121: 548-554, 1967) o turbidez (Dorfman y Ott, J. Biol. Chem. 172: 367, 1948). Con sustratos purificados todos estos métodos son suficientes para la determinación de la presencia o ausencia de la actividad endoglucosidasa.
También pueden usarse sustratos de glucosaminoglucanos sustancialmente purificados en un ensayo de desplazamiento en gel. Los glucosaminoglucanos se mezclan con PH20 recombinante, tal como una PH20 soluble, para ensayar con respecto a actividad endoglucosidasa que da como resultado un desplazamiento en la movilidad del sustrato dentro del gel. Los ejemplos de dichos sustratos incluyen, pero sin limitación, condroitín-4 y 6 sulfato, dermatán sulfato, heparán-sulfato, que pueden obtenerse de Sigma Chemical. Puede obtenerse hialuronano del cordón umbilical humano de ICN. Por ejemplo, cada sustrato de ensayo puede diluirse hasta o aproximadamente 0,1 mg/ml en un intervalo de tampón de pH 3,5-7,5. En dicho ensayo ejemplar, pueden mezclarse muestras de o de aproximadamente 10 pl de PH20 soluble purificada o medio acondicionado de células que expresan PH20 con o aproximadamente con 90 pl de sustrato de ensayo en tampón deseado e incubarse durante 3 horas a 37 °C. Después de la incubación, las muestras se neutralizan con tampón de muestra (Tris EDTA pH 8,0, azul bromofenol y glicerol) seguido de electroforesis. Pueden detectarse glucosaminoglucanos usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pueden detectarse, glucosaminoglucanos tiñendo los geles usando azul alciano 0,5 % en ácido acétido glacial 3 % durante una noche seguido de decoloración en ácido acético glacial 7 %. La degradación se determina por comparación de movilidad de sustrato en presencia y ausencia de enzima.
La actividad hialuronidasa también puede detectarse por zimografía en gel de sustrato (Guentenhoner et al. (1992) Matrix 12: 388-396). En este ensayo, se aplica una muestra a un gel de SDS-PAGE que contiene ácido hialurónico y las proteínas en la muestra se separaron por electroforesis. El gel se incuba después en un tampón de ensayo de enzima y posteriormente se tiñe para detectar el ácido hialurónico en el gel. La actividad hialuronidasa se visualiza como una zona aclarada en el gel de sustrato.
La capacidad de un polipéptido de PH20, incluyendo un polipéptido de PH20 modificado proporcionado en el presente documento, para actuar como agente de propagación o difusión también puede evaluarse. Por ejemplo, puede inyectarse colorante de azul de tripano por vía subcutánea con o sin un polipéptido de PH20 en la piel lateral en cada lado de ratones desnudos. Después se mide el área coloreada, tal como con un microcalibrador, para determinar la capacidad del polipéptido de PH20 para actuar como un agente de propagación (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2o060lO4968).
La actividad funcional de un polipéptido de PH20 puede compararse y/o normalizarse con respecto a un patrón de referencia usando cualquiera de estos ensayos. Esto puede realizarse para determinar cuál es una cantidad funcionalmente equivalente de un polipéptido de PH20. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido de PH20 para actuar como un agente de propagación y difusión puede evaluarse inyectándolo en la piel lateral de ratones con azul de tripano, y puede determinarse la cantidad requerida para conseguir la misma cantidad de difusión como, por ejemplo, 100 unidades de un patrón de referencia de hialuronidasa. La cantidad de polipéptido de PH20 requerida es, por lo tanto, funcionalmente equivalente a 100 unidades de hialuronidasa.
2. Solubilidad
La solubilidad de un polipéptido de PH20 puede determinarse por cualquier método conocido por un experto en la materia. Un método para determinar la solubilidad es división por detergente. Por ejemplo, puede distinguirse un polipéptido de PH20 soluble, por ejemplo, por su división en la fase acuosa de una solución de Triton® X-114 a 37 °C (Bordier et al., (1981) J. Biol. chem., 256: 1604-1607). Los polipéptidos anclados a membrana, tales como hialuronidasas ancladas al lípido, incluyendo hialuronidasas ancladas a GPI, se dividirán a la fase rica en detergente, pero se dividirán a la fase acuosa o pobre en detergente después del tratamiento con fosfolipasa C. La fosfolipasa C es una enzima que escinde el enlace de fosfoglicerol hallado en proteínas ancladas a GPI. El tratamiento con PLC provocará la liberación de proteínas ligadas a GPI desde la membrana celular externa.
3. Pureza, cristalización o agregación
La estabilidad de un polipéptido de PH20 proporcionado en el presente documento también puede evaluarse usando otros métodos y ensayos conocidos en la técnica. Además de evaluar la estabilidad basándose en la actividad hialuronidasa, la estabilidad puede evaluarse mediante inspección visual, porcentaje de recuperación, pureza de proteínas y aparente temperatura de fusión.
Por ejemplo, la pureza de proteínas puede medirse mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). La pureza de proteínas, como se determina por RP-HPLC, es el porcentaje del pico principal de proteína de PH20 presente, en comparación con todas las especies de proteínas presentes. Por lo tanto, RP-HPLC y métodos similares conocidos por un experto en la materia, pueden evaluar la degradación de la enzima. La pureza de las proteínas puede evaluarse a lo largo del tiempo. La pureza de proteínas también puede evaluarse en presencia de una o más condiciones de desnaturalización y en diversas cantidades de las mismas. El porcentaje de recuperación también puede determinarse como el porcentaje relativo de polipéptido en diversas condiciones (condiciones de desnaturalización, tiempo de almacenamiento, modo de almacenamiento tal como recipiente o vaso, u otros parámetros similares que pueden alterarse) en comparación con una muestra de referencia. La estabilidad de polipéptidos de PH20 también puede determinarse midiendo la oxidación de la hialuronidasa por RP-HPLC. El porcentaje de oxidación es una medida de la suma de las áreas pico de los picos principal (ox-1) y secundario (ox-2).
En un ejemplo, la temperatura de fusión de un polipéptido de PH20, tal como un polipéptido de PH20 modificado, puede determinarse midiendo el radio hidrodinámico de partículas mediante dispersión dinámica de la luz en diversas condiciones (por ejemplo, condiciones de desnaturalización u otras condiciones de almacenamiento). Un aumento del tamaño de partícula y una reducción de la temperatura de fusión indica desnaturalización y posterior agregación de la hialuronidasa.
Otros métodos conocidos por un experto en la materia que pueden usarse para determinar la estabilidad de la hialuronidasa en las coformulaciones descritas en el presente documento, incluyen electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), inmunotransferencia, espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de masas, dicroísmo circular (DC) y ensayos de fluorescencia basados en colorante.
4. Farmacodinámica/farmacocinética
El efecto de la administración de un polipéptido de PH20, tal como un polipéptido de PH20 modificado, solo o en combinación con otro agente terapéutico, en las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de cualquier agente administrado también pueden evaluarse in vivo usando modelos animales y/o sujetos humanos, tal como en la situación de un ensayo clínico. Pueden realizarse estudios farmacocinéticos o farmacodinámicos usando modelos animales o puede realizase durante estudios con pacientes a los que se ha administrado un polipéptido de PH20 o polipéptido de PH20 modificado.
Los modelos animales incluyen, pero sin limitación, ratones, ratas, conejos, perros, cobayas y modelos de primates no humanos, tales como monos cynomolgus o macacos rhesus. En algunos casos, se realizan estudios de farmacocinética o farmacodinámica usando animales sanos. En otros ejemplos, los estudios se realizan usando modelos animales de una enfermedad para la que se considera la terapia con hialuronano, tales como modelos animales de cualquier enfermedad o trastorno asociado con hialuronano, por ejemplo un modelo tumoral.
Las propiedades farmacocinéticas de un polipéptido de PH20, tal como un polipéptido de PH20 modificado, pueden evaluarse midiendo dichos parámetros como la concentración máxima (pico) (Cmáx), el tiempo pico (es decir, cuando se produce la máxima concentración; Tmáx), la concentración mínima (es decir, la concentración mínima entre dosis; Cmín), la semivida de eliminación (T1 /2) y el área bajo la curva (es decir, el área bajo la curva generada por la representación de tiempo frente a concentración; ABC), después de la administración. La biodisponibilidad absoluta de la hialuronidasa puede determinarse comparando el área bajo la curva de hialuronidasa después de suministro subcutáneo (ABCsc) con la ABC de hialuronidasa después de suministro intravenoso (ABCiv). La biodisponiblidad absoluta (F), puede calcularse usando la fórmula: F = ([ABC]sc x dosissc) / ([ABC]A x dosisiv). Puede administrarse una serie de dosis y diferente frecuencia de dosificación en los estudios farmacocinéticos para evaluar el efecto del aumento o la reducción de concentraciones de enzima, tal como polipéptido de PH20 modificado, en la dosis.
H. Métodos de tratamiento y terapia de combinación
Se describen en el presente documento métodos y usos de cualquiera de los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento que muestran actividad hialuronidasa basándose en su capacidad para degradar glucosaminoglucano o glucosaminoglucanos tales como hialuronano. Debido a dicha actividad, los polipéptidos de PH20 modificados pueden usarse como un factor de propagación para aumentar el suministro y/o la biodisponibilidad de agentes terapéuticos administrados por vía subcutánea. El suministro de cualquier agente terapéutico, incluyendo pero sin limitación, péptidos, proteínas, moléculas pequeñas farmacológicas, ácidos nucleicos o virus puede facilitarse o potenciarse mediante la coadministración con un polipéptido de PH20 modificado proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse polipéptidos de PH20 modificados para aumentar el suministro de agentes terapéuticos tales como anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), citocinas, inmunoglobulina, una insulina, o factores de coagulación, a un locus deseado, tal como aumentando la penetración de agentes quimioterapéuticos en tumores sólidos. Los polipéptidos de PH20 modificados también pueden usarse para tratar una enfermedad de hialuronano o trastorno que se caracteriza por un exceso o acumulación de hialuronano. Por ejemplo, pueden usarse polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento de acuerdo con las reivindicaciones para tratar un tumor; para tratar la acumulación de glucosaminoglucano en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular; para tratar un trastorno oftálmico; y/o para tratar enfermedad pulmonar.
Otros métodos y usos de un polipéptido de PH20 modificado incluyen cualquiera que conozca un experto en la materia. Por ejemplo, se han preparado diversas formas de hialuronidasas PH20 y se han aprobado para uso terapéutico en seres humanos. Por ejemplo, las preparaciones de hialuronidasa derivadas de animal incluyen Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular ovina purificada, y Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular bovina. Hylenex® (Halozyme Therapeutics) es una hialuronidasa recombinante humana producida por células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas por ingeniería genética que contienen ácido nucleico que codifica rHuPH20 (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.°. 7.767.429). Los usos terapéuticos aprobados para hialuronidasas incluyen uso como un adyuvante para aumentar la absorción y dispersión de otros agentes terapéuticos para hipodermoclisis (administración de líquido subcutáneo), y como un accesorio en la urografía subcutánea para mejorar la reabsorción de agentes radiopacos. Además de estas indicaciones, las hialuronidasas pueden usarse como un producto terapéutico o agente cosmético para el tratamiento de enfermedades y afecciones adicionales. Por ejemplo, la hialuronidasa se usa habitualmente, por ejemplo, para bloqueo peribulbar en anestesia local antes de la cirugía oftálmica. La presencia de la enzima evita la necesidad de bloqueos adicionales y reduce el tiempo hasta la aparición de aquinesia (pérdida de movimiento del ojo). El bloqueo peribulbar y sub-Tenon son las aplicaciones más comunes de la hialuronidasa para procedimientos oftálmicos. La hialuronidasa también puede promover aquinesia en cirugía cosmética, tal como blefaroplastias y eliminación de arrugas. Se entiende que pueden usarse hialuronidasas PH20 solubles proporcionadas en el presente documento, incluyendo hialuronidasas esPH20, en cualquier método de tratamiento o terapia de combinación para el que se use una hialuronidasa PH20 (véase por ejemplo, publicaciones de Estados Unidos n.° US20040268425; US20050260186; US20060104968; y solicitudes de Estados Unidos n.° de serie 12/381.844, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US20100074885; 12/386.249, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US20090311237; 12/387.225, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US20090304665; y 12/386.222, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US2010003238).
Se describen métodos ejemplares, no limitantes, y sus usos, en las siguientes subsecciones.
I. Métodos de suministro de agentes terapéuticos
Como se ha observado anteriormente, la hialuronidasa es una sustancia de propagación o difusión que modifica la permeabilidad del tejido conectivo mediante la hidrólisis de ácido hialurónico, un polisacárido hallado en la sustancia fundamental intercelular de tejido conectivo y de ciertos tejidos especializados, tales como el cordón umbilical y el humor vítreo. Cuando no está presente ningún factor de propagación, los materiales inyectados por vía subcutánea, tales como fármacos, proteínas, péptidos y ácido nucleico, se propagan muy lentamente. La coinyección con hialuronidasa, sin embargo, puede provocar propagación rápida. La velocidad de difusión es proporcional a la cantidad de enzima, y el grado de difusión es proporcional al volumen de solución.
Los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse para promover o potenciar los agentes de suministro y moléculas a cualquiera de una diversidad de tejidos de mamífero in vivo. Se puede usar para facilitar la difusión y, por lo tanto, promover el suministro, de agentes farmacológicos de moléculas pequeñas así como agentes farmacológicos de moléculas mayores, tales como proteínas, ácidos nucleicos y ácidos ribonucleicos, y composiciones macromoleculares que pueden contener una combinación de componentes incluyendo, pero sin limitación, ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, lípidos, moléculas basadas en lípidos y fármacos (véase por ejemplo., publicaciones de Estados Unidos n.° US20040268425; US20050260186; y US20060104968). Los polipéptidos de PH20 modificados pueden coadministrarse y/o coformularse con un agente terapéutico para mejorar la biodisponibilidad así como características farmacocinéticas (PK) y/o farmacodinámicas (PD) de agentes coformulados o coadministrados. Los parámetros de PK/PD que pueden mejorarse usando PH20 soluble, tal como esPH20, incluyen medidas tales como Cmáx (la concentración máxima de agente obtenida después de absorción, por ejemplo, en el torrente sanguíneo), Tmáx (el tiempo requerido para conseguir la concentración máxima), T1/2 (el tiempo requerido para que la concentración descienda a la mitad), Cmín (la concentración mínima de agente después de metabolismo y excreción), ABC (área bajo la curva de concentración frente a tiempo, una medida de la cantidad general de biodisponibilidad), concentraciones en diversos tejidos de interés (incluyendo, por ejemplo, la velocidad de consecución de concentraciones deseadas, los niveles generales, y la duración del mantenimiento de los niveles deseados), y Emáx (el efecto máximo conseguido).
Los métodos de tratamiento descritos en el presente documento incluyen terapias de combinación con un agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o trastorno para el que trata el agente terapéutico. Cualquier agente terapéutico que alivie o reduzca de otro modo la gravedad de una enfermedad o afección puede combinarse con un polipéptido de PH20 modificado proporcionado en el presente documento para aumentar la biodisponibilidad de dicho agente terapéutico. En particular, los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en todas y cada una de las combinaciones descritas en solicitudes véase, por ejemplo, publicaciones de Estados Unidos n.° US20040268425; US20050260186; US20060104968 y solicitudes de Estados Unidos n.° de serie 12/381.844, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US20100074885; 12/386.249, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US20090311237; 12/387.225, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US20090304665; y 12/386.222, publicada como publicación de Estados Unidos n.° US2010003238 en lugar de la hialuronidasa o enzima degradante de hialuronidasa desvelada.
Pueden administrarse polipéptidos de PH20 modificados antes, después de, intermitentemente con o simultáneamente con la preparación de agente terapéutico. En general, el polipéptido de PH20 modificado se administra antes de o simultáneamente con la administración de la preparación de agente terapéutico para permitir que la PH20 degrade el ácido hialurónico en el espacio intersticial. La PH20 puede administrarse en un sitio diferente del sitio de administración de la molécula terapéutica o la PH20 soluble puede administrarse en un sitio igual que el sitio de administración de la molécula terapéutica.
Los ejemplos de agentes farmacéuticos, terapéuticos y cosméticos y moléculas que pueden administrarse con hialuronidasa incluyen, pero sin limitación, un agente quimioterapéutico o antineoplásico, un agente analgésico, un agente antibiótico, un agente antiinflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida, un agente antiparkinsoniano, un agente antimalárico, un agente anticonvulsivo, un agente antidepresivo, un agente antiartrítico, un agente antifúngico, un agente antihipertensivo, un agente antipirético, un agente antiparasitario, un agente antihistamínico, un agente agonista alfa adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador beta adrenérgico, un agente bloqueador de canales de calcio, un agente farmacológico cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente cosmético o estético, un agente descongestionantes, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolito, un agente hipnótico, un agente hormonal, un agente hiperglucémico, un agente relajante muscular, un agente contractivo muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpatomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un inductor del sueño, un agente simpatomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente vitamínico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, o un agente inhibidor de enzima conversora de angiotensina, y cualquier combinación de los mismos. En particular, los agentes terapéuticos incluyen anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, bisfosfonatos, insulinas, factores de coagulación, citocinas e inmunoglobulinas.
Por ejemplo, pueden usarse polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento para aumentar el suministro de agentes quimioterapéuticos. También se han usado hialuronidasas para potenciar la actividad de productos quimioterapéuticos y/o la accesibilidad de tumores a productos quimioterapéuticos (Schuller et al., 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32: 173, n.° de resumen 1034; Czejka et al., 1990, Pharmazie 45: H.9; Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1: 55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27: 390). La quimioterapia de combinación con hialuronidasa es eficaz en el tratamiento de una diversidad de cánceres incluyendo cáncer de vejiga urinaria (Horn et al., 1985, J. Surg. Oncol. 28: 304-307), carcinoma de células escamosas (Kohno et al., 94, J. Cancer Res. Oncol. 120: 293-297), cáncer de mama (Beckenlehner et al., 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118: 591-596), y cáncer gastrointestinal (Scheithauer et al., 1988, Anticancer Res. 8: 391-396). En este ejemplo, la hialuronidasa PH20 modificada potencia la penetración de agentes quimioterapéuticos u otros antineoplásicos en tumores sólidos, tratando de este modo la enfermedad.
Las composiciones que contienen PH20 soluble pueden inyectarse por vía intratumoral con agentes antineoplásicos o por vía intravenosa para cánceres diseminados o tumores difíciles de alcanzar. El agente antineoplásico puede ser un producto quimioterapéutico, un anticuerpo, un péptido, o un vector de terapia génica, virus o ADN. Adicionalmente, puede usarse hialuronidasa para reclutar células tumorales al grupo de ciclación para sensibilización en tumores previamente quimiorrefractarios que han adquirido resistencia a múltiples fármacos (St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44).
Los agentes antineoplásicos ejemplares que pueden administrarse después de, simultáneamente con o antes de la administración de una PH20 soluble, tales como una esPH20 soluble, incluyen, pero sin limitación acivicinas; aclarubicinas; acodazoles; acroninas; adozelesinas; aldesleucinas; alentuzumabs; alitretinoínas (ácidos 9-cisretinoicos); alopurinoles; altretaminas; alvocidibs; ambazonas; ambomicinas; ametantronas; amifostinas; aminoglutetimidas; amsacrinas; anastrozoles; anaxironas; ancitabinas; antramicinas; apazicuonas; argimesnas; trióxidos arsénicos; asparaginasas; asperlinas; atrimustinas; azacitidinas; azetepas; azotomicinas; banoxantronas; batabulinas; batimastats; BCG vivo; benaxibinas; bendamustinas; benzodepas; bexarotenos; bevacizumab; bicalutamidas; bietaserpinas; biricodares; bisantrenos; bisantrenos; dimesilatos de bisnafida; bizelesinas; bleomicinas; bortezomibs; brequinares; bropiriminas; budotitanos; busulfanes; cactinomicinas; calusteronas; canertinibs; capecitabinas; caracemidas; carbetimeros; carboplatinos; carbocuonas; carmofures; carmustinas con polifeprosanos; carmustinas; carubicinas; carzelesinas; cedefingoles; celecoxibs; cemadotinas; clorambucilos; cioteroneles; ciplactino; cirolemicinas; cisplatinos; cladribinas; clanfenures; clofarabinas; crisnatoles; ciclofosfamidas; citarabinas liposómicas; citarabinas; dacarbazinas; dactinomicinas; darbepoetinas alfa; daunorrubicinas liposómicas; daunorrubicinas/daunomicinas; daunorrubicinas; decitabinas; denileucinas diftitoxes; dexniguldipinas; dexonas; dexrazoxanos; dezaguaninas; diazicuonas; dibrospidios; dienogests; dinalinas; disermolidas; docetaxeles; dofequidares; doxifluridinas; doxorrubicinas liposómicas; doxorrubicina HCL; inyección de liposima de doxorrubicina HCL; doxorrubicinas; droloxifenos; propionatos de dromostanolona; duazomicinas; ecomustinas; edatrexatos; edotecarinas; eflornitinas; elacridares; elinafidas; soluciones B de Elliott; elsamitrucinas; emitefures; enloplatinos; enpromatos; enzastaurinas; epipropidinas; Epirubicinas; epoetinas alfa; eptaloprosts; erbulozoles; esorrubicinas; estramustinas; etanidazoles; etoglúcidos; fosfatos de etopósidos; etopósidos VP-16; etopósidos; etoprinas; exemestanos; exisulindes; fadrozoles; fazarabinas; fenretinidas; filgrastims; floxuridinas; fludarabinas; fluorouracilos; 5-fluorouracilos; fluoximesteronas; flurocitabinas; fosquidonas; fostriecinas; fostriecinas; fotretaminas; fulvestrants; galarrubicinas; galocitabinas; gemcitabinas; gemtuzumabs/ozogamicinas; geroquinoles; gimatecanos; gimeracilos; gloxazonas; glufosfamidas; acetatos de goserelina; hidroxiureas; ibritumomabs/tiuxetanos; idarubicinas; ifosfamidas; ilmofosinas; ilomastats; mesilatos de imatinib; imexones; improsulfanes; indisulams; improcuonas; interferones alfa-2a; interferones alfa-2b; interferones alfa; interferones beta; interferones gamma; interferones; interleucinas-2 y otras interleucinas (incluyendo interleucinas recombinantes); intoplicinas; iobenguanos [131-1]; iproplatinos; irinotecanes; irsogladinas; ixabepilonas; quetotrexatos; L-alanosinas; lanreotidas; lapatinibs; ledoxantronas; letrozoles; leucovorinas; leuprolides; leuprorelinas (leuprolides); levamisoles; lexacalcitoles; liarozoles; lobaplatinos; lometrexoles; lomustinas/CCNU; lomustinas; lonafarnibs; losoxantronas; lurtotecanes; mafosfamidas; manosulfanos; marimastats; masoprocoles; maitansinas; mecloretaminas; mecloretaminas/mostazas de nitrógeno; acetatos de megestrol; megestroles; melengestroles; melfalanes; melfalanes L-PAM; menogarilos; mepitiostanos; mercaptopurinas; 6-mercaptopurina; mesnas; metesindes; metotrexatos; metoxsalenos; metomidatos; metoprinas; meturedepas; miboplatinos; miproxifenos; misonidazoles; mitindomidas; mitocarcinas; mitocrominas; mitoflaxonas; mitogilinas; mitoguazonas; mitomalcinas; mitomicinas C; mitomicinas; mitonafidas; mitoquidonas; mitoesperes; mitotanos; mitoxantronas; mitozolomidas; mivobulinas; mizoribinas; mofarotenos; mopidamoles; mubritinibs; ácidos micofenólicos; fenpropionatos de nandrolona; nedaplatinos; nelarabinas; nemorrubicinas; nitracrinas; nocodazoles; nofetumomabs; nogalamicinas; nolatrexedes; nortopixantronas; octreótidos; oprelvequinas; ormaplatinos; ortataxeles; oteracilos; oxaliplatinos; oxisuranos; oxofenarsinas; paclitaxeles; pamidronatos; patupilonas; pegademasas; pegaspargasas; pegfilgrastims; peldesinas; peliomicinas; pelitrexoles; pemetrexedes; pentamustinas; pentostatinas; peplomicinas; perfosfamidas; perifosinas; picoplatinos; pinafidas; pipobromanes; piposulfanes; pirfenidonas; piroxantronas; pixantronas; plevitrexedes; mitramicinas de plicamicina; plicamicinas; plomestanos; plomestanos; porfímeros sódicos; porfímeros; porfiromicinas; prednimustinas; procarbazinas; propamidinas; prospidios; pumitepas; puromicinas; pirazofurinas; quinacrinas; ranimustinas; rasburicasas; riboprinas; ritrosulfanes; rituximabs; rogletimidas; roquinimexes; rufocromomicinas; sabarrubicinas; safingoles; sargramostims; satraplatinos; sebriplatinos; semustinas; simtrazenos; sizofiranos; sobuzoxanos; sorafenibs; esparfosatos; ácidos esparfósicos; esparsomicinas; espirogermanios; espiromustinas; espiroplatinos; espiroplatinos; escualaminas; estreptonigrinas; estreptovaricinas; estreptozocinas; sufosfamidas; sulofenures; malato de sunitinib; 6-TG; tacedinalinas; talcos; talisomicinas; talimustinas; tamoxifenos; tariquidares; tauromustinas; tecogalanes; tegafures; teloxantronas; temoporfinas; temozolomidas; tenipósidos/VM-26; tenipósidos; teroxironas; testolactonas; tiamiprinas; tioguaninas; tiotepas; tiamiprinas; tiazofurinas; tilomisoles; tiloronas; timcodares; timonácicos; tirapazaminas; topixantronas; topotecanes; toremifenos; tositumomabs; trabectedinas (ecteinascidina 743); trastuzumabs; trestolonas; tretinoínas/ATRA; triciribinas; trilostanos; trimetrexatos; tetranitratos de triplatino; triptorelinas; trofosfamidas; tubulozoles; ubenimexes; mostazas de uracilo; uredepas; valrubicinas; valspodares; vapreotidas; verteporfinas; vinblastinas; vincristinas; vindesinas; vinepidinas; vinfluninas; vinformidas; vinglicinatos; vinleucinoles; vinleurosinas; vinorelbinas; vinrosidinas; vintriptoles; vinzolidinas; vorozoles; xantomicinas A (guameciclinas); zeniplatinos; zilascorbs [2-H]; zinostatinas; zoledronato; zorubicinas; y zosuquidares, por ejemplo:
Aldesleucinas (por ejemplo, PROLEUKIN®); Alemtuzumabs (por ejemplo, CAMPATH®); Alitretinoínas (por ejemplo, PANRETIN®); Alopurinoles (por ejemplo, Zy LOPRIM®); Altretaminas (por ejemplo, h Ex ALEN®); Amifostinas (por ejemplo, Et Hy OL®); Anastrozoles (por ejemplo, ARMIDEX®); Trióxidos de arsénico (por ejemplo, TRISENOX®); Asparaginasas (por ejemplo, ELSPAR®); BCG vivo (por ejemplo, TICE® BCG); Bexarotenos (por ejemplo, TARGRETIN®); Bevacizumab (AVASTIN®); Bleomicinas (por ejemplo, BLENOXAn E®); Busulfán intravenoso (por ejemplo, BUSULFEX®); Busulfanes orales (por ejemplo, MYLERAN™); Calusteronas (por ejemplo, METHOSARB®); Capecitabinas (por ejemplo, XELODA®); Carboplatinos (por ejemplo, pA rAPlAt IN®); Carmustinas (por ejemplo, BCNU®, BiCNU®); Carmustinas con Polifeprosanos (por ejemplo, GLIADEL® Wafer); Celecoxibs (por ejemplo, CELEBREX®); Clorambucilos (por ejemplo, LEUKERAN®); Cisplatinos (por ejemplo PLATINOL®); Cladribinas (por ejemplo, LEUSTATIN®, 2-CdA®); Ciclofosfamidas (por ejemplo, Cy TOXAN®, NEOSAR®); Citarabinas (por ejemplo, CYTOSAR-U®); Citarabinas liposómicas (por ejemplo, DepoCyt®); Dacarbazinas (por ejemplo, DTIC-Domeu): Dactinomicinas (por ejemplo, COSMEGEN®); Darbepoetinas Alfa (por ejemplo, ARANESP®); Daunorrubicinas liposómicas (por ejemplo, DAUNOXOME®); Daunorrubicinas/Daunomicinas (por ejemplo, CERUBIDINE®); Denileucinas Difitoxes (por ejemplo, ONTAK®); Dexrazoxanos (por ejemplo, Z iNECAr D®); Docetaxeles (por ejemplo, TAXOTERE®); Doxorrubicinas (por ejemplo, ADRIAMYCIN®, RUBEX®); Doxorrubicinas liposómicas, incluyendo inyecciones de liposoma de doxorrubicina HCL (por ejemplo, DOXIL®); Propionatos de dromostanolona (por ejemplo, Inyección de DROMOSTANOLONE® y MAs Te RONE®); Soluciones B de Elliott (por ejemplo, Elliott's B Solution®); Epirubicinas (por ejemplo, ELLENCE®); Epoetinas alfa (por ejemplo, EPOGEN®); Estramustinas (por ejemplo, Em Cy T®); Fosfatos de etopósidos (por ejemplo, ETOPOp Ho S®); Etopósidos VP-16 (por ejemplo, VEPESlD®); Exemestanos (por ejemplo, AROMASlN®); Filgrastims (por ejemplo, NEUPOGEN®); Floxuridinas (por ejemplo, FUDR®); Fludarabinas (por ejemplo, f Lu DARA®); Fluorouracilos incluyendo 5-FU (por ejemplo, ADRUCIL®); Fulvestrants (por ejemplo, FASLODEx ®); Gemcitabinas (por ejemplo, GEMZAR®); Gemtuzumabs/Ozogamicinas (por ejemplo, MYLOt A r G®); Acetatos de goserelina (por ejemplo, ZOLADEX®); Hidroxiureas (por ejemplo, HYDReA®); Ibritumomabs/Tiuxetanos (por ejemplo, ZEv A l IN®); Idarubicinas (por ejemplo, IDAm YCIN®); Ifosfamidas (por ejemplo, IFEX®); Mesilatos de imatinib (por ejemplo, GLEEVEC®); Interferones alfa-2a (por ejemplo, ROFe Ro N-A®); Interferones alfa 2b (por ejemplo, iNt Ro N A ®); Irinotecanes (por ejemplo, CAMpTo SAR®); Letrozoles (por ejemplo, FEMARA®); Leucovorinas (por ejemplo, WELLCOVORIN®, Le UCOVORIN®); Levamisoles (por ejemplo, ERGAMISOL®); Lomustinas/CCNU (por ejemplo, CeeNU®); Mecloretaminas/mostazas de nitrógeno (por ejemplo, MUSTARGEN®); Acetatos de megestrol (por ejemplo, MEGACE®); Melfalanes/L-PAM (por ejemplo, ALk ErAN®); Mercaptopurina incluyendo 6-MP (por ejemplo, PURINETHOL®); Mesnas (por ejemplo, MESn Ex ®); Metotrexatos; Metoxsalenos (por ejemplo, UVa DeX®); Mitomicinas C (por ejemplo, Mu Ta MYCIN®, MITOZYTREX®); Mitotanos (por ejemplo, LYSODREN®); Mitoxantronas (por ejemplo, NOVANTRONE®); Fenpropionatos de Nandrolona (por ejemplo, DURABOLIN-50®); Nofetumomabs (por ejemplo, VERLUMA®); Oprelvequinas (por ejemplo, NEUMe Ga ®); Oxaliplatinos (por ejemplo, ELOXATIN®); Paclitaxeles (por ejemplo, PAXe Ne®, Ta XOL®); Pamidronatos (por ejemplo, AREDIA®); Pegademasas (por ejemplo, a Da Ge N®); Pegaspargasas (por ejemplo, ONCASPAR®); Pegfilgrastims (por ejemplo, NEULASTA®); Pentostatinas (por ejemplo, NIPe Nt ®); Pipobromanes (por ejemplo, Ve RCYTE®); Plicamicina/mitramicinas (por ejemplo, MlTHRACIN®); Porfímeros sódicos (por ejemplo, PHOTOFRIN®); Procarbacinas (por ejemplo, MATu lA n E®); Quinacrinas (por ejemplo, ATABRINE®); Rasburicasas (por ejemplo, ELITEK®); Rituximabs (por ejemplo, RITUXAN®); Sargramostims (por ejemplo, PROKINE®); Estreptozocinas (por ejemplo, ZANOSAR®); Malatos de Sunitinib (por ejemplo, SUt En T®); Talcos (por ejemplo, SCLEROSo L®); Tamoxifenos (por ejemplo, NOLVADEX®); Temozolomidas (por ejemplo, TEMODAr®); Tenipósidos/VM-26 (por ejemplo, VUm On®); Testolactonas (por ejemplo, TESLAC®); Tioguaninas incluyendo 6-TG; Tiotepas (por ejemplo, THIOPLEX®); Topotecanes (por ejemplo, HYCAMTIN®); Toremifenos (por ejemplo, FARESTON®); Tositumomabs (por ejemplo, BEXXAR®); Trastuzumabs (por ejemplo, HERCEpTIN®); Tretinoínas/ATRA (por ejemplo, Ve SANO iD®); Mostazas de Uracilo; Valrubicinas (por ejemplo, VALSTAR®); Vinblastinas (por ejemplo, VEl Ba N®); Vincristinas (por ejemplo, ONCOVIN®); Vinorelbinas (por ejemplo, NAVELBINE®); y Zoledronatos (por ejemplo, ZOMETA®).
Por ejemplo, los agentes antibióticos ejemplares incluyen, pero sin limitación,, Aminoglucósidos; Anfenicoles; Ansamicinas; Carbacefemos; Carbapenemos; Cefalosporinas o Cefemos; Cefamicinas; Clavams; Lipopéptidos cíclicos; Diaminopirimidinas; Cetólidos; Lincosamidas; Macrólidos; Monobactamos; Nitrofuranos; Oxacefems; Oxazolidinonas; Penemos, tienamicinas y beta lactamas misceláneas; Penicilinas; Antibióticos polipeptídicos; Quinolonas; Sulfonamidas; Sulfonas; Tetraciclinas; y otros antibióticos (tales como Clofoctoles, ácidos Fusídicos, Hexedinas, Metenaminas, Nitrofurantoínas Nitroxolinas, Ritipenems, Taurolidinas, Xibomoles).
También se incluyen entre agentes terapéuticos ejemplares factores de coagulación u otros modificadores sanguíneos tales como factores antihemofílicos, complejos coagulantes antiinhibidor, antitrombina III, factor de coagulación V, factor de coagulación VIII, factor de coagulación IX, fracciones proteicas del plasma, factores de von Willebrand; agentes antiplaquetarios (incluyendo, por ejemplo, abciximabs, anagrelidas, cilostazoles, bisulfatos de clopidogrel, dipiridamoles, epoprostenoles, eptifibatidas, tirofibanes, factores estimulantes de colonias (CSF) (incluyendo, por ejemplo, CSL de Granulocitos y CSF de Granulocitos y macrófagos); Estimulantes de la eritropoyesis (incluyendo, por ejemplo, eritropoyetinas tales como darbepoetinas alfas) y epoetinas alfa, hemostáticos y albúminas (incluyendo, por ejemplo, aprotininas, combinaciones de factores antihemófilos y plasma, Acetatos de Desmopresina y albúminas); inmunoglobulinas, así como inmunoglobulinas de la hepatitis B, inhibidores de trombina (incluyendo por ejemplo inhibidores de trombina directos y lepirudina) y drotrecoginas alfa; anticoagulantes (incluyendo, por ejemplo, dalteparinas, enoxaparinas y otras heparinas, y warfarinas).
Los anticuerpos ejemplares u otros agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, Cetuximab (IMC-C225; Erbitux®); Trastuzumab (Herceptin®); Rituximab (Rituxan®; MabThera®); Bevacizumab (Avastin®); Alemtuzumab (Campath®; Campath-1H®; Mabcampath®); Panitumumab (ABX-Eg F; Vectibix®); Ranibizumab (Lucentis®); Ibritumomab; Tiuxetano de Ibritumomab (Zevalin ®); Tositumomab; Yodo I 131 Tositumomab (BEXXAR®); Catumaxomab (Removab®); Gemtuzumab; ozogamicina de Gemtuzumab (Mylotarg®); Abatacept (CTLA4-Ig; Orencia®); Belatacept (L104EA29YIg; LEA29Y; LEA); Ipilimumab (MDX-010; MDX-101); Tremelimumab (ticilimumab; CP-675,206); PRS-010 (véase por ejemplo, documento US20090042785); PRS-050 (documentos US7585940; US20090305982); Aflibercept (VEGF Trap, AVE005, Holash et al., (2002) PNAS 99: 11393-11398); Volociximab (M200); F200 (fragmento de Fab IgG4 quimérico (humano/murino) de Volociximab (M200)); IgG1 qumérico de ratón/humano MORAb-009 (documento US20050054048); proteína de fusión Soluble: Fv anti mesotelina unido a una exotoxina A de Pseudomonas truncada (SS1P (Ca T-5001); documento US20070189962); Cixutumumab (IMC-A12); Nimotuzumab (h-R3) (Spicer (2005) Curr Opin Mol Ther 7:182-191); Zalutumumab (HuMax-EGFR; Lammerts van Bueren et al. (2008) PNAS 105:6109-14); Necitumumab IMC-11F8 (Li et al. (2008) Structure 16:216-227); Sym004 (Pedersen et al. 2010 Cancer Res 70:588-597); y mAb-425.
En particular, los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas, Interferón beta, Interferones alfa-2a, Interferón alfa-I, Interferones alfa n3, Interferón beta-1, Interferones beta-1a, Interferones gamma-lb, Peginterferón alfa-2 y Peginterferón alfa-2b, insulina, un bisfosfato (por ejemplo, Pamidronatos o Zoledronatos), Docetaxeles, Doxorrubicinas, Doxorrubicinas liposómicas y bevacizumabs.
Otros agentes terapéuticos ejemplares que pueden combinarse mediante coadministración y/o coformulación con un polipéptido de PH20 proporcionado descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, Adalimumabs, Agalsidasas Beta, Alefacepts, Ampicilinas, Anakinras, Vacunas Antipoliomielíticas, anti timocitos, Acitromicinas, Becaplerminas, Caspofunginas, Cefazolinas, Cefepimas, Cefotetanos, Ceftacidimas, Ceftriaxonas, Cetuximabs, Cilastatinas, ácidos clavulánicos, Clindamicinas, Darbepoetinas alfa, Daclizumabs, difteria, antitoxinas diftéricas, toxoides diftéricos, Efalizumabs, Epinefrinas, eritropoyetinas alfa, Etanercepts, Filgrastims, Fluconazoles, hormonas folículo-estimulantes, folitropinas alfa, Folitropinas beta, Fosfenitoínas, Gadodiamidas, Gadopentetatos, Gatifloxacinas, Glatirámeros, GM-CSF, Goserelinas, acetatos de Goserelina, Granisetrones, B de Haemophilus influenzae, Haloperidoles, Vacunas de la hepatitis, Vacunas de la hepatitis A, Vacunas de la hepatitis B, Tiuxetanos de Ibritumomab, Ibritumomabs, Tiuxetanos, Inmunoglobulinas, Vacunas de Haemophilus influenzae, Vacunas de virus de la gripe, Infliximabs, Insulinas, Insulinas Glarginas, Interferones, Interferones alfa, Interferones Beta, Interferones Gamma, Interferones alfa-2a, Interferones alfa-2b, Interferones alfa-1, Interferones alfa-n3, Interferones Beta, Interferones Beta-1a, Interferones Gamma, Interferones alfa-consenso, Iodixanoles, Iohexoles, Iopamidoles, Ioversoles, Ketorolacos, Laronidasas, Levofloxacinas, Lidocaínas, Linezolidas, Lorazepams, Vacunas de sarampión, Virus de sarampión, Virus de las paperas, Vacunas de virus del sarampión-paperas-rubéola, Vacunas de la rubéola, Medroxiprogesteronas, Meropenems, Metilprednisolonas, Midazolams, Morfinas, Octreótidas, Omalizumabs, Ondansetrones, Palivizumabs, Pantoprazoles, Pegaspargasas, Pegfilgrastims, Peg-Interferón Alfa-2a, Peg-Interferón Alfa-2b, Pegvisomantes, Vacunas de Pertussis, Piperacilinas, Vacunas Neumocócicas y Vacunas Conjugadas Neumocócicas, Prometacinas, Reteplasas, Somatropinas, Sulbactams, Sumatriptanos, Tazobactams, Tenecteplasas, toxoides purificados del tétanos, Ticarcilinas, Tositumomabs, Triamcinolonas, acetónidos de triamcinolonas, hexacetónidos de triamcinolonas, vancomicinas, inmunoglobulinas de varicela zoster, vacunas de varicela, otras vacunas, Alemtuzumabs, Alitretinoínas, Alopurinoles, Altretaminas, Amifostinas, Anastrozoles, arsénicos, trióxidos de arsénico, asparaginasas, vacunas de Bacilo Calmette-Guerin (BCG), BCG vivo, Bexarotenos, Bleomicinas, Busulfanes, Busulfán intravenoso, Busulfanes orales, Calusteronas, Capecitabinas, Carboplatinos, Carmustinas, Carmustinas con Polifeprosanes, Celecoxibs, Clorambucilos, Cisplatinos, Cladribinas, Ciclofosfamidas, Citarabinas, Citarabinas liposómicas, Dacarbacinas, Dactinomicinas, Daunorrobucinas liposómicas, Daunorrubicinas, Daunomicinas, Denileucinas Diftitoxes, Dexrazoxanos, Docetaxeles, Doxorrubicinas, Doxorrubicinas liposómicas, Propionatos de dromostanolona, Soluciones B de Elliott, Epirubicinas, Epotinas alfa, Estramustinas, Etopósidos, Fosfatos de etopósido, Etopósido VP-16, Exemestanos, Floxuridinas, Fludarabinas, Fluorouracilos, 5-Fluorouracilos, Fulvestrants, Gemcitabinas, Gemtuzumabs, Ozogamicinas, Ozogamicinas de gemtuzumab, Hidroxiureas, Idarubicinas, Ifosfamidas, Mesilatos de imatinib, Irinotecanes, Letrozoles, Leucovorinas, Levamisoles, Lomustinas, CCNU, Mecloretaminas, Mostazas de nitrógeno, Megestroles, Acetatos de megestrol, Melfalanes, L-PAM, Mercaptopurinas, 6-Mercaptopurinas, Mesnas, Metotrexatos, Metoxsalenos, Mitomicinas, Mitomicinas C, Mitotanos, Mitoxantronas, Nandrolonas, Fenpropionatos de nandrolona, Nofetumomabs, Oprelvequinas, Oxaliplatinos, Paclitaxeles, Pamidronatos, Pegademasas, Pentostatinas, Pipobromanes, Plicamicinas, Mitramcinas, Porfímeros, Porfímeros sódicos, Procarbacinas, Quinacrinas, Rasburicasas, Rituximabs, Sargramostims, Estreptozocinas, Talcos, Tamoxifenos, Temozolomidas, Tenipósidos, Testolactonas, Tioguaninas, 6-Tioguaninas, Trietilentiofosforamidas (teotepas), Topotecanes, Toremifenos, Trastuzumabs, Tretinoínas, Mostazas de uracilo, Valrubicinas, Vinblastinas, Vincristinas, Aminorelbinas, Zolendronatos, Acivicinas, Aclarobucinas, Acodazoles, Acroninas, Adozelesinas, Alesleucinas, Ácidos Retinoicos, Alitretinoínas, Ácidos 9-Cis-Retinoicos, Alvocidibs, Ambazonas, Ambomicinas, Ametantronas, Aminoglutetimidas, Amsacrinas, Anaxironas, Ancitabinas, Antramicinas, Apacicuonas, Argimesnas, Asperlinas, Atrimustinas, Azacitidinas, Azetepas, Azotomicinas, Banoxantronas, Batabulinas, Batimastats, Benaxibines, Bendamustinas, Benzodepas, Bicalutamidas, Bietaserpinas, Biricodares, Bisantrenos, Dimesilatos de Bisnafida, Bicelesinas, Bortezomibs, Brequinares, Bropiriminas, Budotitanos, Cactinomicinas, Canertinibs, Caracemidas, Carbetímeros, Carbocuonas, Carmofures, Carubicinas, Carcelesinas, Cedefingoles, Cemadotinas, Clorambucilos, Cioteronelos, Cirolemicinas, Clanfenures, Clofarabinas, Crisnatoles, Decitabinas, Dexniguldipinas, Dexormaplatinos, Dezaguaninas, Diacicuonas, Dibrospidios, Dienogests, Dinalinas, Disermolidas, Dofequidares, Doxifluridinas, Droloxifenos, Duazomocinas, Ecomustinas, Edatrexatos, Edotecarinas, Eflomitinas, Elacridares, Elinafidas, Elsamitrucinas, Emitefures, Enloplatinos, Empromatos, Enzastaurinas, Epipropidinas, Eptaloprosts, Erbulozoles, Esorubicinas, Etanidazoles, Etoglúcidos, Etoprinas, Exisulindes, Fadrozoles, Fazarabinas, Fenretinidas, Floximesteronas, Flurocitabinas, Fosquidonas, Fostriecinas, Fotretaminas, Galarubicinas, Galocitabinas, Geroquinoles, Gimatecanos, Gimeracilos, Gloxazonas, Glufosfamidas, Ilmofosinas, Ilomastats, Imexones, Improsulfanes, Indisulams, Inprocuonas, Interleucinas, Interleucinas 2, Interleucinas recombinantes, Intoplicinas, Iobenguanos, Iproplatinos, Irsogadinas, Ixabepilones, Ketotrexatos, L-Alanosinas, Lanreotidas, Lapatinibs, Ledoxantronas, Leuprolides, Leuprorelinas, Lexacalcitoles, Liarozoles, Lobaplatinos, Lometrexoles, Lonafarnibs, Losoxantronas, Lurtotecanos, Mafosfamidas, Manosulfanos, Marimastats, Masoprocoles, Maitansinas, Mecloretaminas, Melengestroles, Melfalanes, Menogarilos, Mepitiostanos, Metesindes, Metomidatos, Metoprinas, Meturedepas, Miboplatinos, Miproxifenos, Misonidazoles, Mitindomidas, Mitocarcinas, Mitocrominas, Mitoflaxonas, Mitogilinas, Mitoguazonas, Mitomalcinas, Mitonafidas, Mitoquidonas, Mitosperes, Mitozolomidas, Mivobulinas, Mizoribinas, Mofarotenos, Mopidamoles, Mubritinibs, Ácidos micofenólicos, Nedaplatinos, Neizarabinas, Nemorubicinas, Nitracrinas, Nocodazoles, Nogalamicinas, Nolatrexedes, Nortopixantronas, Ormaplatinos, Ortataxeles, Oteracilos, Oxisuranos, Oxofenarsinas, Patupilonas, Peldesinas, Peliomicinas, Pelitrexoles, Pemetrexedes, Pentamustinas, Peplomicinas, Perfosfamidas, Perifosinas, Picoplatinos, Pinafidas, Piposulfanos, Pirfenidonas, Piroxantronas, Pixantronas, Plevitrexedes, Plomestanos, Porfiromicinas, Prednimustinas, Propamidinas, Prospidios, Pumitepas, Puromicinas, Pirazofurinas, Ranimustinas, Riboprinas, Ritrosulfanos, Rogletimidas, Roquinimexes, Rufocromomicinas, Sabarubicinas, Safingoles, Satraplatinos, Sebriplatinos, Semustinas, Simtracenos, Sizofiranos, Sobuzoxanos, Sorafenibs, Esparfosatos, Ácidos Esparfósicos, Esparsomicinas, Espirogermanios, Espiromustinas, Espiroplatinos, Escualaminas, Estreptonigrinas, Estreptovaricinas, Sufosfamidas, Sulofenures, Tacedinalinas, Talisomicinas, Talimustinas, Tariquidares, Tauromustinas, Tecogalanes, Tegafures, Teloxantronas, Temoporfinas, Teroxironas, Tiamiprinas, Tiamiprinas, Tiazofurinas, Tilomisoles, Tiloronas, Timcodares, Timonacics, Tirapazaminas, Topixantronas, Trabectedinas, Ecteinascidina 743, Trestolonas, Triciribinas, Trilostanos, Trimetrexatos, Tetranitratos de Triplatino, Triptorelinas, Trofosfamidas, Tubulozoles, Ubenimexes, Uredepas, Valspodares, Vapreotidas, Verteporfinas, Vinblastinas, Vindesinas, Vinepidinas, Vinfluninas, Vinformidas, Vinglicinatos, Vinleucinoles, Vinleurosinas, Vinrosidinas, Vintriptoles, Vinzolidinas, Vorozoles, Xantomicinas A, Guameciclinas, Zeniplatinos, Zilascorbs [2-H], Zinostatinas, Zorubicinas, Zosuquidares, Acetazolamidas, Aciclovires, Adipiodonas, Alatrofloxacinas, Alfentanilos, Extractos alergénicos, Inhibidores de Alfa 1-proteinasa, Alprostadilos, Amicacinas, Aminoácidos, Ácidos Aminocaproicos, Aminofilinas, Amitriptilinas, Amobarbitales, Amrinonas, Analgésicos, Vacunas antipoliomielíticas, Sueros antirrábicos, Inmunoglobulinas antitetánicas, Vacunas tetánicas, Antitrombinas III, Sueros Antiveneno, Argatrobanes, Argininas, Ácidos ascórbicos, Atenololes, Atracurios, Atropinas, Aurotioglucosas, Azatioprinas, Aztreonams, Bacitracinas, Baclofenos, Basiliximabs, Ácidos benzoicos, Benztropinas, Betametasonas, Biotinas, Bivalirudinas, Anidoxinas de botulismo, Bretilios, Bumetanidas, Bupivacaínas, Buprenorfinas, Butorfanoles, Calcitoninas, Calcitrioles, Calcios, Capreomicinas, Carboprosts, Carnitinas, Cefamandoles, Cefoperazonas, Cefotaximas, Cefoxitinas, Ceftizoximas, Cefuroximas, Cloranfenicoles, Cloroprocaínas, Cloroquinas, Clorotiazidas, Clorpromacinas, Ácidos condroitinsulfúricos, Coriogonadotropinas Alfa, Cromios, Cidofovirs, Cimetidinas, Ciprofloxacinas, Cisatracurios, Clonidinas, Codeínas, Colchicinas, Colistinas, Colágenos, Trifllutatos de Corticorelina Ovinos, Corticotrofinas, Cosintropinas, Cianocobalaminas, Ciclosporinas, Cisteínas, Dacliximabs, Dalfopristinas, Dalteparinas, Danaparoides, Dantrolenos, Deferoxaminas, Desmopresinas, Dexametasonas, Dexmedetomidinas, Dexpantenoles, Dextranos, Dextranos de hierro, Ácidos diatrizoicos, Diazepams, Diazoxidas, Diciclominas, Digibinds, Digoxinas, Dihidroergotaminas, Diltiazems, Difenidraminas, Dipiridamoles, Dobutaminas, Dopaminas, Doxacurios, Doxaprams, Doxercalciferoles, Doxiciclinas, Droperidoles, Difilinas, Ácidos Edéticos, Edrofonios, Enalaprilats, Efedrinas, Epoprostenoles, Ergocalciferoles, Ergonovinas, Ertapenemos, Eritromicinas, Esmololes, Estradioles, Estrógenos, Ácidos etacrínicos, Etanolaminas, Etanoles, Aceites Etiodizados, Ácidos Etidrónicos, Etomidatos, Factores VIII, Famotidinas, Fenoldopams, Fentanilos, Flumacenilos, Fluoresceínas, Flufenazinas, Ácidos fólicos, Fomepizoles, Fomivirsenes, Fondaparinuxes, Foscarnets, Fosfenitoínas, Furosemidas, Gadoteridoles, Gadoversetamidas, Ganciclovires, Gentamicinas, Glucagones, Glucosas, Glicinas, Glucopirrolatos, Gonadorelinas, Gonadotropinas Coriónicas, Polisacáridos de Haemophilus B, Heminas, Herbales, Histaminas, Hidralazinas, Hidrocortisonas, Hidromorfonas, Hidroxocobalaminas, Hidroxizinas, Hiosciaminas, Ibutilidas, Imiglucerasas, Carmines de Índigo, Indometacinas, Yoduros, Iopromidas, Ácidos iotalámicos, Ácidos Ioxáglicos, Ioxilanos, Isoniazidas, Isoproterenoles, Vacunas de la Encefalitis Japonesa, Kanamicinas, Ketaminas, Labetaloles, Lepirudinas, Levobupivacaínas, Levotiroxinas, Lincomicinas, Liotironinas, Hormonas luteinizantes, Vacunas de enfermedad de Lyme, Mangafodipires, Mantoles, Vacunas de polisacáridos meningocócicos, Meperidinas, Mepivacaínas, Mesoridazinas, Metaraminoles, Metadonas, Metocarbamoles, Metohexitales, Metildopatos, Metilergonovinas, Metoclopramidas, Metoprololes, Metronidazoles, Minociclinas, Mivacurios, Ácidos Morruicos, Moxifloxacinas, Muromonab-CD3, Mofetiles micofenolato, Nafcilinas, Nalbufinas, Nalmefenos, Naloxonas, Neostigminas, Niacinamidas, Nicardipinas, Nitroglicerinas, Nitroprúsidos, Norepinefrinas, Orfenadrinas, Oxacilinas, Oximorfonas, Oxitetraciclinas, Oxitcinas, Pancurios, Pantenoles, Ácidos pantoténicos, Papaverinas, Peginterferón-alfa (por ejemplo, interferón alfa 2a o 2b), Penicilinas G, Pentamidinas, Pentazocinas, Pentobarbitales, Perflutrenos, Perfenazinas, Fenobarbitales, Fentolaminas, Fenilefrinas, Fenitoínas, Fisostigminas, Fitonadionas, Polimixinas B, Pralidoximas, Prilocaínas, Procainamidas, Procaínas, Proclorperazinas, Progesteronas, Propranololes, Hidróxidos de Piridostigmina, Piridoxinas, Quinidinas, Quinupristinas, Inmunoglobulinas de la rabia, Vacunas de la rabia, Ranitidinas, Remifentanilos, Riboflavinas, Rifampinas, Ropivacaínas, Samarios, Escopolaminas, Selenios, Sermorelinas, Sincálidos, Somatrems, Espectinomicinas, Estreptoquinasas, Estreptomicinas, Succinilcolinas, Sufentanilos, Sulfametoxazoles, Tacrolimus, Terbutalinas, Teriparátidos, Testosteronas, Antitoxinas tetánicas, Tetracaínas, Tetradecil sulfatos, Teofilinas, Tiaminas, Tietilperacinas, Tiopentales, Hormonas estimulantes del tiroides, Tinzaparinas, Tirofibanes, Tobramicinas, Tolazolinas, Tolbutamidas, Torsemidas, Ácidos tranexámicos, Treprostiniles, Trifluoperacinas, Trimetobenzamidas, Trimetoprims, Trometaminas, Tuberculinas, Vacunas tifoideas, Urofolitropinas, Uroquinasas, Ácidos valproicos, Vasopresinas, Vecuronios, Verapamilos, Voriconazoles, Warfarinas, Vacunas de la fiebre amarilla, Zidovudinas, Cincs, Clorhidratos de Ziprasidona, Aclacinomicinas, Actinomicinas, Adriamicinas, Azaserinas, 6-Azauridinas, Carzinofilinas, Cromomicinas, Denopterinas, 6-Diazo-5-Oxo-L-Norleucinas, Enocitabinas, Floxuridinas, Olivomicinas, Piritrexims, Pteropterinas, Tegafures, Tubercidinas, Alteplasas, Arcitumomabs, Bevacizumabs, Toxina Botulínica de Tipo A, Toxina Botulínica de Tipo B, Pendetidas de Capromab, Daclizumabs, Dornasas alfa, Drotrecoginas alfa, Pentetatos de Imciromab y Yodo 131.
Suministro de insulina
Los métodos descritos en el presente documento incluyen métodos de coadministración de un polipéptido de PH20 modificado y una insulina para aumentar el suministro subcutáneo de la insulina, tal como una insulina de acción rápida (véase por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 7.767.429; Patente de Estados Unidos n.° 7.846.431; Publicación de Estados Unidos n.° US20090304665, y Solicitud de Estados Unidos n.° de Serie 13/507.263, 13/507.262 y 13/507.261). Dichos métodos incluyen métodos de administración directa, y métodos de infusión continua y por bomba, incluyendo sistemas de bomba abierta y cerrada. Por ejemplo, son insulinas ejemplares que pueden administrarse con una hialuronidasa PH20 proporcionada en el presente documento insulinas de acción rápida o análogos de insulina. Por ejemplo, una insulina coadministrada incluye una insulina regular, insulina aspart, insulina lispro, insulina glulisina u otras variantes análogas similares. Son insulinas ejemplares insulinas que contienen una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B expuesta en SEQ ID NO: 863 o variantes que contienen una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con una insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 862 y 863 (cadenas A y B). Por ejemplo, los expertos en la materia conocen análogos de insulina ejemplares e incluyen, pero sin limitación, los expuestos en SEQ Id NO: 862 (cadena A) y que tienen una cadena B expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 865-867.
Las coformulaciones pueden administrarse por vía subcutánea para tratar cualquier afección que sea susceptible de tratamiento con insulina. Los usos terapéuticos incluyen, pero sin limitación, tratamiento para diabetes mellitus de tipo 1, diabetes mellitus de tipo 2, diabetes gestacional y para control glucémico en pacientes críticamente enfermos. Por ejemplo, las coformulaciones de una insulina de acción rápida y enzima degradante de hialuronano pueden administrarse por vía subcutánea en dosis discretas, tales como mediante una jeringa o un bolígrafo de insulina, antes de una comida como terapia de insulina prandial en sujetos con diabetes para conseguir el control glucémico. Las coformulaciones también pueden administrarse por vía subcutánea o por vía intraperitoneal usando una bomba de insulina o en el contexto de un sistema de bucle cerrado para controlar continuamente los niveles de glucosa en sangre a lo largo del día y la noche y/o para controlar las excursiones glucémicas postprandiales. Está dentro de la experiencia de un médico tratante identificar dichas enfermedades o afecciones.
Para cualquier enfermedad o afección, incluyendo todas las ejemplificadas anteriormente, para las que se indica o se ha usado una insulina de acción rápida y para las que están disponibles otros agentes y tratamientos, las coformulaciones pueden usarse en combinación con las mismas. Dependiendo de la enfermedad o afección para tratar, las combinaciones ejemplares incluyen, pero sin limitación, combinaciones con fármacos antidiabéticos, incluyendo, pero sin limitación, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, tiazolidinedionas, inhibidores de alfaglucosidasa, análogos peptídicos, incluyendo análogos peptídicos de tipo glucagón (GLP) y análogos peptídicos inhibidores gástricos (GIP) e inhibidores de DPP-4. En otro ejemplo, las coformulaciones de una insulina de acción rápida y polipéptido de PH20 modificado descrito en el presente documento pueden administrarse en combinación con, antes de, intermitentemente con, o después de una o más insulinas adicionales, incluyendo insulina de acción rápida, e insulinas de acción basal.
2. Métodos de enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano (por ejemplo, tumores)
En particular, la hialuronidasa PH20 puede usarse para tratar enfermedades o afecciones asociadas con hialuronano. Típicamente, las enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano se asocian con expresión de hialuronano elevada en un tejido, célula o fluido corporal (por ejemplo, tejido tumoral o tejido asociado a tumor, sangre o espacio intersticial) en comparación con un control, por ejemplo, otro tejido, célula o fluido corporal. La expresión de hialuronano elevada puede estar elevada en comparación con un tejido, célula o fluido corporal normal, por ejemplo, un tejido, célula o fluido corporal que es análogo a la muestra que se ensaya, pero aislado de un sujeto diferente, tal como un sujeto que es normal (es decir, no tiene una enfermedad o afección, o no tiene el tipo de enfermedad o afección que tiene el sujeto que se ensaya), por ejemplo, un sujeto no tiene una enfermedad o afección asociada con hialuronano. La expresión de hialuronano elevada puede estar elevada en comparación con un tejido análogo de otro sujeto que tiene una enfermedad o afección similar, pero cuya enfermedad no es tan grave y/o no está asociada a hialuronano o expresa relativamente menos hialuronano y por lo tanto está asociada con hialuronano en menor grado. Por ejemplo, el sujeto que se ensaya puede ser un sujeto con un cáncer asociado a hialuronano, donde las cantidades de HA en el tejido, célula o fluido están relativamente elevadas en comparación con un sujeto que tiene un cáncer menos grave, tal como un estadio temprano, diferenciado u otro tipo de cáncer. En otro ejemplo, la célula, tejido o fluido contiene niveles elevados de hialuronano en comparación con una muestra de control, tal como un fluido, tejido, extracto (por ejemplo, extracto celular o nuclear), ácido nucleico o preparación peptídica, línea celular, biopsia, patrón u otra muestra, con una cantidad conocida o cantidad relativa de HA, tal como una muestra, por ejemplo una línea celular tumoral, que se sabe que expresa niveles relativamente bajos de HA, tales como líneas celulares tumorales ejemplares descritas en el presente documento que expresan bajos niveles de HA, por ejemplo, la línea celular HCT 116, la línea celular HT29, la línea celular NC1H460, la línea celular DU145, la línea celular Capan-1 y tumores de modelos tumorales generados usando dichas líneas celulares.
Las enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano incluyen las asociadas con alta presión de fluido intersticial, tal como presión de disco, trastornos proliferativos, tales como cáncer e hiperplasia prostática benigna, y edema. El edema puede resultar de o manifestarse en, por ejemplo, trasplante de órganos, ictus o traumatismo cerebral. Los trastornos proliferativos incluyen, pero sin limitación, cáncer, proliferación de células del músculo liso, esclerosis sistémica, cirrosis del hígado, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, cardiomiopatía idiopática, lupus eritematoso, retinopatía, por ejemplo, retinopatía diabética u otras retinopatías, hiperplasia cardíaca, trastornos asociados al sistema reproductor, tales como hiperplasia prostática benigna (BPH) y quistes ováricos, fibrosis pulmonar, endometriosis, fibromatosis, hamartomas, linfangiomatosis, sarcoidosis, tumores desmoides. Los cánceres incluyen tumores sólidos y linfáticos/sanguíneos y enfermedad metastásica, y tumores indiferenciados. Los tumores susceptibles de tratamiento típicamente muestran expresión celular y/o estromal de un hialuronano, en comparación con un tejido no canceroso del mismo tipo tisular o en comparación con un tumor no metastásico del mismo tipo tumoral. Los cánceres incluyen uno cualquiera o más de cáncer ovárico, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (SCC), cáncer de próstata, cáncer pancreático, otros cánceres gástricos, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, cáncer de cerebro y cáncer de colon.
Los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento, tales como formas PEGiladas de los mismos, pueden usarse para tratar tumores. Por lo tanto, además de sus efectos antineoplásicos indirectos, las hialuronidasas también tienen efectos anticarcinogénicos directos. La hialuronidasa evita el crecimiento de tumores trasplantados a ratones (De Maeyer et al., 1992, Int. J. Cancer 51: 657-660) e inhibe la formación de tumor tras exposición a carcinógenos (Pawlowski et al., 1979, Int. J. Cancer 23: 105-109, Haberman et al., 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D. C., 22:105, resumen n.° 415). Se ha demostrado que la hialuronidasa PH20 trata diversos tumores (véase por ejemplo, Publicación de Estados Unidos n.° US2010/0003238 y Solicitud de Estados Unidos n.° de serie 13/135.817, publicada como Publicación de Estados Unidos n.° US20120020951).
El cáncer rico en hialuronano puede ser un cáncer en el que las células cancerosas producen HALO, cánceres que tienen expresión elevada de hialuronano (como se determina por inmunotinción, por ejemplo, tinción histológica de secciones del tumor), cánceres que tienen HAS2 (Hialuronano sintasa 2) elevada, cánceres que no producen hialuronidasa (HYAL1) in vitro. Los cánceres ricos en hialuronano pueden identificarse por cualquier método para evaluar la expresión de hialuronano, y otros métodos conocidos para evaluar la expresión de proteína/ARNm.
Se han identificado varios cánceres ricos en hialuronano. En algunos casos, la expresión de hialuronano se correlaciona con mal pronóstico, por ejemplo, la tasa de supervivencia y/o tasa de supervivencia sin recurrencia reducidas, metástasis, angiogénesis, invasión de células cancerosas en otros tejidos/áreas y otros indicadores de mal pronóstico. Dicha correlación se ha observado, por ejemplo, en tumores ricos en hialuronano incluyendo cáncer ovárico, SCC, ISC, cáncer prostático, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer pancreático, (véase, por ejemplo, Anttila et al., Cancer Research, 60: 150-155 (2000), Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148: 86-94 (2003), Lipponen et al, Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001), Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95: 12-17 (2001), Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156 (2): 529-536 (2000); Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)). Por lo tanto, los cánceres ricos en hialuronano pueden tratarse mediante la administración de una hialuronidasa, tal como una PH20 soluble, para tratar uno o más síntomas del cáncer. Los tumores ricos en hialuronano incluyen, pero sin limitación, los de próstata, mama, colon, ovario, estómago, cabeza y cuello y otros tumores y cánceres.
Otras enfermedades o afecciones asociadas a hialuronano que se asocian con exceso de glucosaminoglucanos y que pueden tratarse con un polipéptido de PH20 modificado proporcionado en el presente documento incluyen, pero sin limitación, enfermedad cardiovascular (por ejemplo, después de reperfusión por isquemia; en arteriosclerosis); vitrectomía y trastornos y afecciones oftálmicos (por ejemplo, en métodos para licuar el humor vítreo del ojo; reducir la presión postoperatoria; otros procedimientos quirúrgicos oculares tales como glaucoma, cirugía del humor vítreo y la retina y en trasplante de la córnea); en hipodermolisis (es decir, infusión de líquidos y electrolitos en la hipodermis de la piel); aplicaciones cosméticas (por ejemplo, en el tratamiento de celulitis, edema de “piel de cerdo” o edema de “piel de naranja”); trasplante de órganos (por ejemplo, asociado con edemas intersticiales en relación con injerto de un órgano); enfermedad pulmonar.
3. Otros usos
En ejemplos adicionales de su uso terapéutico, pueden usarse polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento, para dichos fines como un antídoto para la necrosis local a partir de inyección paravenosa de sustancias necróticas tales como alcaloides de la vinca (Few et al. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12, 23­ 26), tratamiento de quistes ganglionares (Paul et al. (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219-21) y tratamiento de necrosis tisular debida a insuficiencia venosa (Elder et al., 1997) Lancet 648 - 649). También pueden usarse polipéptidos de PH20 modificados para tratar quistes ganglionares (también conocidos como un quiste de muñeca, quiste de biblia o quiste de tendón dorsal), que son la masa de tejido blando más habitual de la mano y son sacos llenos de fluidos que pueden sentirse bajo la piel.
Pueden usarse polipéptidos de PH20 modificados en el tratamiento de lesión de la médula espinal degradando proteoglucanos de condroitín sulfato (CSPG). Después de lesión de la médula espinal, se producen cicatrices gliales que contienen CSPG por astrocitos. Los CSPG desempeñan un papel crucial en la inhibición del crecimiento de axones. Además, se ha mostrado que la expresión de CSPG aumenta después de lesión del sistema nervioso central (SNC). También puede utilizarse PH20 soluble para el tratamiento de discos herniados en un proceso conocido como quimonucleólisis. La condroitinasa ABC, una enzima que escinde sustratos similares a la hialuronidasa, puede inducir la reducción de presión intradiscal en la columna lumbar. Hay tres tipos de lesiones de disco. Un disco protruido es uno que está intacto pero sobresale. En un disco extruido, la envoltura fibrosa se ha desgarrado y el NP ha supurado, pero aún está conectado al disco. En un disco secuestrado, se ha soltado un fragmento del NP del disco y está libre en el canal espinal. La quimionucleolisis es típicamente eficaz en discos protruidos y extruidos, pero no en lesiones de disco secuestrado.
4. Anticoncepción
Los polipéptidos de PH20 modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse como vacunas en aplicaciones anticonceptivas. PH20 está presente en el tracto reproductor masculino, y se expresa tanto en el testículo como en el epidídimo y está presente en el espermatozoide. PH20 desempeña un papel en la fertilización facilitando la entrada del espermatozoide a través de la capa del cumulus que rodea el óvulo no fertilizado. PH20 también es capaz de unirse con ácido hialurónico (HA) en la zona pelúcida durante las fases tempranas de la fertilización. Esta unión también inicia la señalización intracelular que ayuda en la reacción del acrosoma. Se ha mostrado que la inmunización con PH20 es un anticonceptivo eficaz en cobayas macho (Primakoff et al (1988) Nature 335: 543-546, Tung et al (1997) Biol. Reprod. 56: 1133-1141). También se ha mostrado que es un anticonceptivo eficaz en cobayas hembra debido a la generación de anticuerpos anti PH20 que evitan la unión del espermatozoide y el óvulo. En los ejemplos del presente documento, los polipéptidos de PH20 modificados pueden ser enzimas inactivas, tales como cualquiera descrita en las Secciones C.2. Los polipéptidos pueden administrarse directamente o pueden administrarse como un virus recombinante para suministrar el antígeno.
I. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para fines ilustrativos solamente y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Ejemplo 1
GENERACIÓN DE HIALURONIDASA PH20 HUMANA RECOMBINANTE (RHUPH20)
A. Generación de una línea celular que expresa rHuPH20 soluble
Se generó una hialuronidasa PH20 humana recombinante designada rHuPH20 como se ha descrito en la Publicación de Estados Unidos n.° US20110053247 publicada. Brevemente, el plásmido pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24) (expuesto en SEQ ID NO: 5) se usó para transfectar Ovario de Hámster Chino (células CHO) (véase por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 7.767.429 y 7.781.607 y Publicación de Estados Unidos n.° 2006­ 0104968). El vector plasmídico HZ24 para expresión de rHuPH20 soluble contiene una cadena principal de vector pCI (Promega), ADN que codifica los aminoácidos 1-482 de hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO: 2), un sitio de entrada de ribosomas interno (IRES) del virus ECMV (Clontech), y el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón. La cadena principal del vector pCI también incluye ADN que codifica el gen de resistencia a beta-lactamasa (AmpR), un origen f1 de replicación, una región promotora/potenciadora inmediata-temprana de citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El ADN que codifica la construcción rHuPH20 soluble contiene un sitio NheI y una secuencia consenso de Kozak antes del ADN que codifica la metionina en la posición de aminoácido 1 de la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa de PH20 humana, y un codón de terminación después del ADN que codifica la tirosina correspondiente a la posición de aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 2, seguido de un sitio de restricción BamHI.
Se sembraron células DG44 CHO no transfectadas en medio CD-CHO modificado de GIBCO para células DHFR(-), complementado con Glutamina 4 mM y Pluronic F68/L 18 ml/l (Gibco), a 0,5 x 106 células/ml en un matraz de agitación en preparación para transfección. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 a 5 % en un incubador humidificado, agitando a 120 rpm. Se ensayaron células DG44 CHO no transfectadas que crecían exponencialmente con respecto a viabilidad antes de la transfección.
Se sedimentaron sesenta millones de célu -7las viables del cultivo celular DG44 CHO no transfectado y se resuspendieron hasta una densidad de 2 x 10 células en 0,7 ml de tampón de transfección 2x (HeBS 2 x: Hepes 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,4 mM, dextrosa 12 mM). A cada alícuota de células resuspendidas, se añadieron 0,09 ml (250 pg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado por digestión durante una noche con Cla I (New England Biolabs), y las soluciones de células/ADN se transfirieron a cubetas de electroporación BTX de 0,4 cm de hueco (Gentronics) a temperatura ambiente. Se realizó una electroporación de control negativo sin ADN plasmídico mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmidos se sometieron a electroporación con una descarga de capacitador de 330 V y 960 pF o a 350 V y 960 pF.
Las células se retiraron de las cubetas después de electroporación y se transfirieron a 5 ml de medio CD-CHO modificado para células DHFR(-), complementado con Glutamina 4 mM y Plurionic F68/l 18 ml/l (Gibco), y se permitió que crecieran en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos sin selección durante 2 días a 37 °C en CO25 % en un incubador humidificado.
Dos días después de la electroporación, se retiraron 0,5 ml de medio de cultivo tisular de cada pocillo y se ensayaron con respecto a la presencia de actividad hialuronidasa, usando el ensayo de microturbidez descrito en el Ejemplo 8. Los resultados se exponen en la Tabla 6.
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Se recogieron células de la Transfección 2 (350 V) del pocillo de cultivo tisular, se contaron y se diluyeron hasta 1 x 104 a 2 x 104 células viables por ml. Se transfirió una alícuota de 0,1 ml de la suspensión celular a cada pocillo de cinco placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron cien microlitros de medio CD-CHO (GIBCO) que contenía complemento de GlutaMAX™-1 4 mM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) y sin complementos de hipoxantina y timidina a los pocillos que contenían células (volumen final de 0,2 ml). Se identificaron diez clones de las 5 placas cultivadas sin metotrexato (Tabla 7).
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Se expandieron seis clones de HZ24 en cultivo y se transfirieron a matraces de agitación como suspensiones celulares individuales. Los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 y 4D10 se sembraron en placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos usando una estrategia de dilución infinita bidimensional en la que las células se diluyeron 1:2 en vertical por la placa, y 1:3 en horizontal por la placa, comenzando a 5000 células en el pocillo de arriba a la izquierda. Los clones diluidos se cultivaron en un fondo de 500 células DG44 CHO no transfectadas por pocillo, para proporcionar los factores de crecimiento necesarios para los días iniciales de cultivo. Se prepararon diez placas por subclón, con 5 placas que contenían metotrexato 50 nM y 5 placas sin metotrexato.
El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexato, y 11 del tratamiento con metotrexato 50 nM). Se midió la actividad hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (>50 unidades/ml) y estos 8 subclones se expandieron a matraces de cultivo tisular T-25. Los clones aislados del protocolo de tratamiento con metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato 50 nM. El clon 3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM dando lugar a clones productores de actividad hialuronidasa en más de 1.000 Unidades/ml en matraces de agitación (clon 3D35M o Gen1 3D35M). Se preparó después un banco de células maestro (MCB) de las células 3D35M.
B. Producción de células Gen2 que contienen PH20 humana soluble (rHuPH20)
La línea celular Gen1 3D35M descrita en el Ejemplo 1.A se adaptó a mayores niveles de metotrexato para producir clones de generación 2 (Gen2). Se sembraron células 3D35M a partir de cultivos que contenían metotrexato establecidos en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 1,0 pM. Las células se adaptaron a un mayor nivel de metotrexato cultivando y pasándolas 9 veces durante un periodo de 46 días en un incubador humidificado a 37 °C, CO27 %. La población amplificada de células se clonó mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio con metotrexato 2,0 pM. Después de aproximadamente 4 semanas, los clones se identificaron y se seleccionó el clon 3E10B para expansión. Se incubaron células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 2,0 pM durante 20 pases. Se creó un banco de células maestro (MCB) de la línea celular 3E10B y se congeló y se usó para estudios posteriores.
La amplificación de la línea celular continuó cultivando células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 4,0 pM. Después del 12° pase, las células se congelaron en viales como un banco de células de investigación (RCB). Un vial del RCB se descongeló y se cultivó en medio que contenía metotrexato 8,0 pM. Después de 5 días, la concentración de metotrexato en el medio se aumentó a 16,0 pM, después 20,0 pM 18 días después. Se clonaron células del 8° pase en medio que contenía metotrexato 20,0 pM mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 20,0 pM. Los clones se identificaron 5-6 semanas después y el clon 2B2 se seleccionó para expansión en medio que contenía metotrexato 20,0 pM. Después del 11° pase, se congelaron células 2B2 en viales como un banco celular de investigación (RCB).
Las células 2B2 resultantes son células DG44 CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-) que expresan PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20). La PH20 soluble está presente en células 2B2 en un número de copias de aproximadamente 206 copias/célula. El análisis de transferencia de Southern de ADN de células 2B2 genómico digerido con Spe I, Xba I y BamH I/Hind III usando una sonda específica de rHuPH20 reveló el siguiente perfil de digestión de restricción: una banda de hibridación principal de ~7,7 kb y cuatro bandas de hibridación secundarias ~13,9, ~6,6, ~5,7 y ~4,6 kb) con ADN digerido con Spe I; una banda de hibridación principal de ~5,0 kb y dos bandas de hibridación secundarias (~13,9 y ~6,5 kb) con a Dn digerido con Xba I; y una banda de hibridación individual de ~1,4 kb observada usando A d N de 2B2 digerido con BamH I/Hind III.
C. Producción de rHuPH20 soluble de Gen2 en 300 l de cultivo celular en biorreactor
Se descongeló un vial de HZ24-2B2 y se expandió desde matraces de agitación a través de matraces de centrifugación de 36 l en medio CD-CHo (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con metotrexato 20 pM y GlutaMAX-1™ (Invitrogen). Brevemente, el vial de células se descongeló en un baño de agua a 37 °C, se añadió medio y las células se centrifugaron. Las células se resuspendieron en un matraz de agitación de 125 ml con 20 ml de medio nuevo y se colocaron en un incubador de CO27 %, a 37 °C. Las células se expandieron hasta 40 ml en el matraz de agitación de 125 ml. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, el cultivo se expandió a un matraz de centrifugación de 125 ml en un volumen de cultivo de 100 ml. El matraz se incubó a 37 °C, CO2 7 %. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, el cultivo se expandió a un matraz de centrifugación de 250 ml en un volumen de cultivo de 200 ml, y el matraz se incubó a 37 °C, CO27 %. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, el cultivo se expandió a un matraz de centrifugación de 1 l en un volumen de cultivo de 800 ml y se incubó a 37 °C, CO27 %. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml el cultivo se expandió a un matraz de centrifugación de 6 l en un volumen de cultivo de 5000 ml y se incubó a 37 °C, CO27 %. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml el cultivo se expandió en un matraz de centrifugación de 36 l en volumen de cultivo de 32 l y se incubó a 37 °C, CO27 %.
Se esterilizó un reactor de 400 l y se añadieron 230 ml de medio CD-CHO. Antes de su uso, se comprobó si el reactor tenía contaminación. Se transfirieron aproximadamente 30 l de células de los matraces de centrifugación de 36 l al biorreactor de 400 l (Braun) a una densidad de inoculación de 4,0 x 105 células viables por ml y un volumen total de 260 l. Los parámetros fueron: punto de ajuste de temperatura, 37 °C; velocidad del impulsor 40-55 RPM; Presión del Vaso: 20,68 kPa; Chorro de Aire 0,5-1,5 l/min; Superposición de aire: 3 l/min. Se tomaron muestras del reactor diariamente para recuentos celulares, verificación de pH, análisis de medios, producción y conservación de proteínas. Además, durante el procesamiento se añadieron suministros de nutrientes. A las 120 horas (día 5), se añadieron 10,4 l de medio de suministro n.° 1 (CD-CHO 4 x glucosa 33 g/l Glutamax-1™ 160 ml/l Yeastolato 83 ml/l de rHuInsulina 33 mg/l). A las 168 horas (día 7), se añadieron 10,8 l de suministro n.° 2 (CD-CHO 2 x glucosa 33 g/l Glutamax-1™ 80 ml/l Yeastolato 167 ml/l butirato sódico 0,92 g/l), y la temperatura del cultivo se cambió a 36,5 °C. A las 216 horas (día 9), se añadieron 10,8 l de suministro n.° 3 y la temperatura del cultivo se cambió a 36 °C. A las 264 horas (día 11), se añadieron 10,8 l de suministro n.° 4 (Cd -CHO 1x glucosa 33 g/l Glutamax-1™ 33 ml/l Yeastolato 250 ml/l butirato sódico 0,92 g/l), y la temperatura de cultivo se cambió a 35,5 °C. Se observó que la adición del medio de suministro potenciaba drásticamente la producción de rHuPH20 soluble en los estadios finales de producción. El reactor se recogió a los 14 o 15 días o cuando la viabilidad de las células descendió por debajo del 40 %. El proceso dio como resultado una productividad final de 17.000 unidades por ml con una densidad celular máxima de 12 millones de células/ml. En el momento de la recogida, se tomaron muestras del cultivo para micoplasma, biocarga, endotoxina y virus in vitro e in vivo, mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y actividad enzimática.
El cultivo se bombeó por una bomba peristáltica a través de cuatro módulos de sistema de filtración Millistak (Millipore) en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra diatomea graduadas a 4-8 |im y una capa de tierra diatomea graduada a 1,4-1,1 |im, seguido de una membrana de celulosa, después a través de un sistema de filtración Millistak individual (Millipore) que contiene una capa de tierra diatomea graduada a 0,4-0,11 |im y una capa de tierra diatomea graduada a <0,1 |im, seguido de una membrana de celulosa, y después a través de un filtro final de 0,22 |im a una bolsa flexible de un único uso estéril con una capacidad de 350 l. El fluido de cultivo celular recogido se complementó con EDTA 10 mM y Tris 10 mM hasta un pH de 7,5. El cultivo se concentró 10x con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) usando cuatro filtros de poliéter sulfona (PES) de punto de corte de peso molecular (PCPM) de 30 kDa de TFF Sartoslice (Sartorius), seguido de un intercambio de tampón 10X con Tris mM, Na2SO420 mM, pH 7,5 a un filtro final de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento estéril de 50 l.
El producto recogido diafiltrado y concentrado se inactivó para virus. Antes de la inactivación viral, se preparó una solución de Triton® X-100 10 %, tri(n-butil) fosfato (TNBP) 3 %. El producto recogido diafiltrado y concentrado se expuso a Triton® X-100 1 %, TNBP 0,3 % durante 1 hora en un vaso de reacción de vidrio de 36 l inmediatamente antes de la purificación en la columna Q.
D. Purificación de rHuPH20 soluble en Gen2
Se preparó una columna de intercambio iónico de Q Sepharose (Pharmacia) (9 l de resina, H = 29 cm, D = 20 cm). Se recogieron muestras de lavado para una determinación del pH, la conductividad y la endotoxina (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5. Después de la inactivación viral, el producto recogido diafiltrado y concentrado se cargó en la columna Q a un caudal de 100 cm/h. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. La proteína se eluyó con Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 en un filtro final de 0,22 |im a una bolsa estéril. La muestra de eluato se ensayó con respecto a carga biológica, concentración de proteínas y actividad hialuronidasa. Se tomaron lecturas de absorbancia A280 al comienzo y al final del intercambio.
A continuación se realizó cromatografía de interacción hidrófoba de Fenil-Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna de Fenil-Sepharose (PS) (19-21 l de resina, H = 29 cm, D = 30 cm). El lavado se recogió y se tomaron muestras de él para determinar el pH, la conductividad y la endotoxina (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCl20,1 mM, pH 7,0. El eluato de proteínas de la columna de Q sepharose se complementó con sulfato de amonio 2 M, fosfato potásico 1 M y soluciones de reserva de CaCl2 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0,5 mM y 0,1 mM, respectivamente. La proteína se cargó en la columna de PS a un caudal de 100 cm/h y se recogió el flujo continuo de la columna. La columna se lavó con fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCl20,1 M pH 7,0 a 100 cm/h y el lavado se añadió al flujo continuo recogido. Combinado con el lavado de columna, el flujo continuo se pasó a través de un filtro final de 0,22 |im a una bolsa estéril. Se tomaron muestras de flujo continuo para determinar la carga biológica, concentración de proteínas y actividad enzimática.
Se preparó una columna de boronato de aminofenilo (Prometics). El lavado se recogió y se tomaron muestras de él para determinar el pH, la conductividad y la endotoxina (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. El flujo continuo de PS que contenía proteína purificada se cargó en la columna de boronato de aminofenilo a un caudal de 100 cm/h. La columna se lavó con fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. La columna se lavó con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0. La columna se lavó con bicina 20 mM, cloruro sódico 100 mM, pH 9,0. La proteína se eluyó con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 y se pasó a través de un filtro estéril a una bolsa estéril. La muestra eluida se ensayó con respecto a carga biológica, concentración de proteínas y actividad enzimática.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Biorad). El lavado se recogió y se ensayó con respecto a pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL). La columna se equilibró con fosfato potásico 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. La proteína purificada con boronato de aminofenilo se complementó a concentraciones finales de fosfato potásico 5 mM y CaCh 0,1 mM y se cargó en la columna de HAP a un caudal de 100 cm/h. La columna se lavó con fosfato potásico 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl20,1 mM. La columna se lavó a continuación con fosfato potásico 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. La proteína se eluyó con fosfato potásico 70 mM, pH 7,0 y se pasó a través de un filtro estéril de 0,22 |im a una bolsa estéril. La muestra eluida se ensayó con respecto a carga biológica, concentración de proteínas y actividad enzimática.
La proteína purificada de HAP se pasó después a través de un filtro de retirada de virus. El filtro Viosart esterilizado (Sartorius) se preparó en primer lugar lavando con 2 l de fosfato potásico 70 mM, pH 7,0. Antes de su uso, se tomaron muestras del tampón filtrado para determinar el pH y la conductividad. La proteína purificada por HAP se bombeó mediante una bomba peristáltica a través del filtro de retirada de virus 20 nM. La proteína filtrada en fosfato potásico 70 mM, pH 7,0 se pasó a través de un filtro final de 0,22 |im a una bolsa estéril. La muestra filtrada se ensayó con respecto a concentración de proteínas, actividad enzimática, oligosacáridos, monosacáridos y perfiles de ácido siálico. La muestra también se ensayó con respecto a impurezas relacionadas con el proceso.
La proteína en el filtrado se concentró después a 10 mg/ml usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon slice de punto de corte de peso molecular (PCPM) de 10 kDa (Sartorius). El filtro se preparó en primer lugar lavando con histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0 y se tomaron muestras del permeado para determinar el pH y la conductividad. Después de la concentración, se tomaron muestras de la proteína concentrada y se ensayó con respecto a concentración de proteínas y actividad enzimática. Se realizó un intercambio de tampón 6x en la proteína concentrada al tampón final: histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0. Después del intercambio de tampón, la proteína concentrada se pasó a través de un filtro de 0,22 |im a una bolsa de almacenamiento estéril de 20 l. Se tomaron muestras de la proteína y se ensayó con respecto a concentración de proteínas, actividad enzimática, grupos sulfhidrilo libres, perfiles de oligosacáridos y osmolalidad. Se usó el número de lote WRS2 como un patrón en los ensayos descritos posteriormente, los resultados mostraron que la descripción del ensayo para la apariencia era transparente e incolora; el pH era de 7,4; el nivel de endotoxinas era <0,01 UE/ml; la osmolalidad era de 308 mOsm/kg; la densidad era de 1,005 g/ml; el contenido de rHuPH20 era de 1,3 ppm; y la actividad hialuronidasa era de 145 U USP/ml.
La proteína a granel esterilizada por filtración se distribuyó después de forma aséptica a 20 ml en viales de Teflón estériles de 30 ml (Nalgene). Los viales se congelaron después inmediatamente y se almacenaron a -20 5 °C.
Ejemplo 2
GENERACIÓN DE BIBLIOTECA DE MUTANTES DE PH20
A. Clonación y mutagénesis
En este ejemplo, se creó una biblioteca de hialuronidasa PH20 humana clonando ADN que codificaba PH20 humana en un plásmido seguido de transfección y expresión de proteínas.
La biblioteca se creó por mutagénesis de un molde de PH20 que es una versión con codones optimizados de PH20 con una secuencia líder Ig Kappa. Específicamente, para generar la biblioteca de variantes, el vector de expresión HZ24-PH20(OHO)-IRES-SEAp (expuesto en SEQ ID NO: 4) se usó como un molde, que contiene la secuencia de nucleótidos que codifican PH20 expuesta en SEQ ID NO: 1, que codifica una PH20 precursora expuesta en SEQ ID NO: 2 o una PH20 madura expuesta en SEQ ID NO: 3 que carece de los restos 1-22 correspondientes a la secuencia señal de IgK. La cadena principal del vector derivó del vector HZ24 original que contenía el marcador de selección de DHFR (véase Ejemplo 1 y SEQ ID NO: 5) con la adición de una secuencia líder de IgK y optimización de codones. El vector de expresión también se modificó para contener el gen para fosfatasa alcalina secretada (SEAP). Por lo tanto, además de la secuencia que codifica PH20, el vector de expresión HZ24-PH20(OHO)-IRES-SEAP también contiene un sitio de entrada de ribosomas interno (EMCV IRES) que está ligado a la secuencia codificante del gen para la fosfatasa alcalina secretada (SEAP), y un promotor de CMV individual que conduce la expresión de PH20 y SEAP en la construcción. También contiene un gen para resistencia a ampicilina. En referencia a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, la secuencia de nucleótidos que codifica PH20 corresponde a los nucleótidos 1058-2464 (incluyendo la secuencia líder de IgK), la secuencia de nucleótidos que codifica SEAP corresponde a los nucleótidos 2970-4529, y el gen de resistencia a ampicilina corresponde a los nucleótidos 5778-6635.
La primera biblioteca se creó para generar proteínas variantes codificadas donde cada uno de los restos 23-469 de SEQ ID NO: 2 (correspondientes a los restos 1-447 de SEQ ID NO: 3 o los restos 36-482 de SEQ ID NO: 6) se cambió a uno de aproximadamente 15 restos de aminoácidos, de modo que cada miembro contenía un único cambio de aminoácido. La biblioteca resultante contenía 6753 miembros variantes, conteniendo cada uno una única mutación de aminoácido en comparación con los restos 23-469 de SEQ ID NO. 2 (correspondiente a los restos 1­ 447 de SEQ ID NO: 3 o los restos 36-482 de SEQ ID NO: 6). Se prepararon reservas de glicerol de la biblioteca resultante y se almacenaron a -80 °C. Los reemplazos de aminoácidos (mut) en cada miembro se enumeran en la Tabla 8 posterior, y corresponden a reemplazos de aminoácidos en referencia a la secuencia de aminoácidos de PH20 expuesta en SEQ ID NO: 3 (y SEQ ID NO: 7 o 32-66, que son la secuencia madura de PH20 u otros fragmentos truncados en el extremo C terminal de la misma). Los codones mutados correspondientes (cod) de cada variante de PH20 en la biblioteca también se enumeran en la Tabla 8, y corresponden a cambios de restos de nucleótidos en el nucleótido codificante correspondiente para PH20 expuesto como 1058-2464 de SEQ ID NO: 4. Cada miembro se expresó y se exploró con respecto a actividad hialuronidasa como se describe posteriormente.
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2. Expresión
Para la expresión de cada mutante, se transfectó ADN de plásmido HZ24-PH20-IRES-SEAP que contenía ADNc que codificaba una de la PH20 variante o que codificaba PH20 de tipo silvestre en células CHO-S en monocapa (Invitrogen, Cat. n.° 11619-012) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat. n.° 11668-027) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se sembraron células CHO-S la noche antes de la transfección y se cultivaron en DMEM con FBS 10 % para ser confluentes al 80 % al día siguiente. Después, el medio de las células CHO-S se reemplazó con Opti-MEM. Se preparó una mezcla de ADN plasmídico y Lipofectamine (0,2 |ig de ADN y 0,5 |il de Lipofectamine). La mezcla de Lipofectamine/ADN se añadió a células CHO-S y se incubó durante una noche. Al día siguiente, las células se complementaron con medio sin suero CD-CHO (Invitrogen, Cat. n.° 10743-029). Se recogió sobrenadante de células transfectadas en diversos puntos temporales después de la transfección, y en general 96 horas después de la transfección. El sobrenadante, que contenía la proteína de PH20 variante o PH20 de tipo silvestre que tenía una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, se almacenó a -20 °C. Se exploraron las actividades de los sobrenadantes como se describe en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 3
EXPLORACIÓN DE BIBLIOTECA CON UN ENSAYO DE ACTIVIDAD HIALURONIDASA PARA IDENTIFICAR MUTANTES DE ACTIVIDAD
En este ejemplo, se exploraron sobrenadantes de variantes de PH20 expresadas generadas en el Ejemplo 2 usando un ensayo de actividad hialuronidasa para evaluar la actividad de cada mutante. Además, también se midió la actividad de la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) para permitir la normalización de la actividad de PH20 de los mutantes expresados con respecto al tipo silvestre de PH20. Se identificaron mutantes activos e inactivos.
1. Generación del sustrato de HA biotinilado (bHA)
Se biotiniló un HA 1,2-MDa (Lifecore) para su uso como un sustrato en el ensayo de actividad hialuronidasa. En primer lugar, se disolvieron 1,2 gramos (g) de HA 1,2 MDa a 4 °C en 600 ml de ddH2O durante una semana a una concentración de 2 mg/ml con agitación. A continuación, se disolvieron 645,71 mg de Hidrazida de Biotina en 100 ml de DMSO hasta una concentración de 25 mM (6,458 mg/ml, 247,8 mg en 38,37 ml de DMSO). La solución de biotina se calentó brevemente a 37 °C hasta que la solución fue transparente. Además, se disolvieron 368,61 mg de Sulfo-NHS en 20 ml de ddH2O para preparar una solución 100X (Sulfo-NHS 18,4 mg/ml). Se preparó una solución de EDC de carbodiimida soluble en agua 30 mM (1000X) disolviendo 17,63 mg de EDC en 3 ml de ddH2O a una concentración de 5,7513 mg/ml justo antes de iniciarse la reacción.
A cuatro (4) frascos cerrados estériles de 1000 ml, se añadieron los siguientes componentes a temperatura ambiente (TA) y en el siguiente orden con agitación: 1) 200 ml de solución de HA 2 mg/ml; 2) 80 ml de MES 0,5 M, pH 5,0 con mezcla suave; y 3) 91,6 ml de ddH2O con mezcla suave. A continuación, se añadieron secuencialmente 24 ml de Biotina-Hidrazida 25 mM y 4 ml de solución de Sulfo-NHS 100X, inmediatamente seguido de la adición de 500 |il de EDC. Después de la adición de cada componente, la solución se mezcló invirtiendo tres veces y agitando. Después de la adición del último componente, la solución se mezcló agitando durante una noche a 4 °C. Después, se añadió clorhidrato de guanidina a una concentración final de 4 M añadiendo 38,2 g por cada 100 ml y se permitió que se disolvieran completamente antes de ajustar el volumen de solución a 600 ml con ddH2O.
Para diálisis, se transfirieron 200 ml de cada lote de la solución de clorhidrato de guanidina de HA conjugada a membranas de diálisis. Durante el transcurso de tres días, la solución se dializó frente a ddH2O con un cambio en ddH2O al menos seis veces. El volumen resultante de aproximadamente 840 ml se ajustó hasta un volumen final de 1000 ml con ddH2O. La concentración final del hialuronano biotinilado (bHA) fue de 0,4 mg/ml.
2. Ensayo de actividad hialuronidasa
El ensayo enzimático fue una modificación del método descrito en Frost et al. (1997) (A Microtiter-Based Assay for Hyaluronidase Activity Not Requiring Specialized Reagents. Analytical Biochemistry (1997) 251: 263-269) que proporciona una medida de la actividad hialuronidasa de PH20.
En primer lugar, se unió sustrato de HA biotinilado (bHA) a placas de microtitulación de plástico para generar placas de ensayo. Brevemente, se distribuyeron 100 |il de b-HA a 1 mg/ml en tampón de carbonato 0,5 M (pH 9,6) a cada pocillo de una microplata de alta unión (Immunolon 4 HBX de unión extra alta; Thermo Scientific). La placa se cubrió con un sellante de placas y se almacenó entre 2-8 °C durante 24-48 horas.
Después, la placa de ensayo se lavó con tampón de lavado solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X que contenía Tween 20 0,5% (v/v) (PBST). Se generó PBST a partir de PBS 1X (generado del Catálogo n.° P5368, Sigma (Tampón de Fosfato 10 mM, Cloruro Potásico 2,7 mM, Cloruro Sódico 137 mM, pH 7,4) colocando los contenidos de un paquete de PBS en un cilindro graduado de 1 l con 800 ml de agua desionizada, se disolvió removiendo o agitando y añadiendo suficiente cantidad de agua a 1 l) añadiendo 500 |il de Tween 20 (Catálogo n.° 6505; EMD Bioscience) a 900 ml de PBS 1X y añadiendo suficiente cantidad de agua hasta 1 l. Se realizó lavado usando el lavador de placas BioTek ELx405 Select CW (BioTek) lavando cinco (5) veces con 300 |il de tampón de lavado PBST por pocillo para cada lavado. Al final de cada lavado, la placa se golpeó suavemente en una servilleta de papel para retirar el exceso de líquido de cada pocillo. Antes de la incubación con muestras, se añadieron 200 |il de Tampón de Bloqueo (Albúmina de Suero Bovino (BSA) 1,0 % p/v en PBS) a cada pocillo y la placa de ensayo se incubó a 37 °C durante aproximadamente 1 hora antes. El tampón de bloqueo se generó añadiendo 2,5 g de BSA (n.° Catálogo 001-000-162; Jackson Immuno Research) a 200 ml de PBS 1x , removiendo, añadiendo una cantidad suficiente de PBS 1X a 250 ml y filtrando a través de una unidad de filtro de PES 0,2 |iM.
Se diluyeron sobrenadantes de PH20 variantes o de tipo silvestre transfectados generados como se ha descrito en el Ejemplo 1 en 1:25 por duplicado en tampón de diluyente de ensayo (tampón HEPES pH 7,4; HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl21 mM, BSA 1 mg/ml, pH 7,4, Tween-20 0,05%) en microplacas de alta unión 4XHB no recubiertas). Para la curva patrón, se prepararon diluciones en serie 1:3 de rHuPH20 (generada como se ha descrito en el Ejemplo 1 con una actividad específica de 145 U/ml) en tampón de diluyente de ensayo por duplicado comenzando desde 4 U/ml para patrones de la siguiente manera: 3 U/ml, 1 U/ml, 1/3 U/ml, 1/9 U/ml, 1/27 U/ml, 1/81 U/ml y 1/243 U/ml. Se transfirieron cien microlitros (100 |il) de cada patrón y muestra a las placas de ensayo y se incubaron durante aproximadamente 1,5 horas a 37 °C.
Después de la incubación, la placa se lavó con PBST usando el lavador de placas BioTek ELx405 Select CW lavando cinco (5) veces con 300 |il de tampón de lavado PBST por pocillo para cada lavado. Al final de cada lavado, la placa se golpeó suavemente en una servilleta de papel para retirar el exceso de líquido de cada pocillo. Después, se añadieron 100 |il de Estreptavidina-HRP (SA-HRP) diluido 1:5000 a cada pocillo de la placa y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Para la dilución, se diluyó una reserva de conjugado de Estreptavidina-HRP 1 mg/ml (Catálogo n.° 21126; Thermo Scientific) 1:5000 en tampón de dilución (BsA 1 mg/ml; Tween20 0,025 %, NaCl 137 mM, Tris 20 mM, pH 7,5). Después de la incubación, la placa se lavó con PBST usando el lavador de placas BioTek ELx405 Select CW lavando cinco (5) veces con 300 |il de tampón de lavado PBST por pocillo para cada lavado. Al final de cada lavado, la placa se golpeó suavemente en una servilleta de papel para retirar el exceso de líquido de cada pocillo. Después, se añadieron 100 |il de solución TMB (Catálogo n.° 52-00-03; KPL; temperatura ambiente y protegido de la luz) a cada pocillo durante aproximadamente cinco (5) minutos a temperatura ambiente o hasta que se produjo un desarrollo de color óptimo. Para detener la reacción, se añadieron 100 |il de Ácido Sulfúrico 1,0 N o solución de Terminación TMB (Catálogo n.° 50-85-06) a cada pocillo y las placas se golpearon suavemente para mezclar. Se midió la densidad óptica a 450 nm en un periodo de 30 minutos desde la adición de la solución de terminación. Ya que más PH20 en un patrón o una muestra conduciría a menos bHA disponible para unirse con SA-HRP, el valor de densidad óptica (450 nm) era inversamente proporcional a concentración de actividad hialuronidasa en cada muestra de ensayo.
3. Actividad de SEAP
También se midió la actividad de fosfatasa alcalina secretada (SEAP) en el sobrenadante de cultivo celular usando un ensayo colorimétrico de fosfatasa alcalina placentaria usando pNPP como un sustrato de fosfatasa (kit de pNPP SEAP Anaspec SensoLyte; Catálogo n.° 72144, Anaspec) según las instrucciones del fabricante. La señal de absorbancia se midió a densidad óptica (DO) de 405 nm.
Los criterios para la exploración de alto rendimiento (HTP) fueron que el sobrenadante transfectado diera como resultado una señal de SEAP de > 0,1 y la señal para el control de tipo silvestre de rHuPH20 produjera una señal de > 1 U/ml. Además, los criterios para cada exploración fueron que las curvas patrón tuvieran una relación de señal con respecto a ruido (S/N) para el patrón de 0 U/ml frente al patrón de 3 U/ml a DO405 de > 5, tuvieran menos de tres (3) patrones con un coeficiente de variación (CV) > 10% y al menos cuatro (4) de los patrones estuvieran en el intervalo lineal.
Ejemplo 4
VARIANTES DE PH20 SELECCIONADAS CON ACTIVIDAD HIALURONIDASA ALTERADA
Cada variante generada se exploró con actividad hialuronidasa como se ha descrito en el Ejemplo 3. La expresión de SEAP se usó para normalizar la actividad de PH20 de cada variante con respecto al tipo silvestre de PH20. Se identificaron mutantes que mostraban actividad hialuronidasa alterada en comparación con el tipo silvestre.
1. Mutantes activos
Se seleccionaron mutantes activos por los que al menos una muestra duplicada mostraba más de 40 % de la actividad de tipo silvestre cuando se normalizó con respecto a la actividad de SEAP. Los mutantes activos identificados se exponen en la Tabla 9. La Tabla expone el reemplazo de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de PH20 expuesta en s Eq ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de mutantes ejemplares también se expone por referencia a una SEQ ID NO. La Tabla también expone la actividad hialuronidasa promedio de duplicados ensayados normalizados por valores de SEAP en comparación con el promedio de actividades de PH20 de tipo silvestre en cada placa, que también se normalizaron por sus propios valores SEAP. Por ejemplo, un valor de 0,40 indica que la variante muestra 40 % de la actividad hialuronidasa de PH20 de tipo silvestre, un valor de 1 indica que la variante muestra una actividad hialuronidasa similar de tipo silvestre y un valor de 3,00 indica que la variante muestra 300 % de la actividad hialuronidasa de PH20 de tipo silvestre o actividad aumentada 3 veces en comparación con el tipo silvestre.
Los resultados en la Tabla 9 muestran que más de 600 mutantes ensayados muestran actividad que está aumentada en comparación con el tipo silvestre. Por ejemplo, aproximadamente 536 mutantes muestran 120% o más del 120% de la actividad hialuronidasa de PH20 de tipo silvestre y aproximadamente 75 de los mutantes muestran 300 % o más de 300 % de la actividad hialuronidasa de p H20 de tipo silvestre. En particular, los resultados en la Tabla 9 muestran que la actividad hialuronidasa en comparación con el tipo silvestre de mutante S69A es aproximadamente 22 veces; de mutante S69R es aproximadamente 14 veces; de mutante I70A es aproximadamente 27 veces; de mutante I70K es aproximadamente 14 veces; de mutante I70R es aproximadamente 14 veces; y de mutante I271L es aproximadamente 10 veces.
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2. Mutantes inactivos
Los otros mutantes que mostraron menos de 20 % de actividad hialuronidasa de PH20 de tipo silvestre, en al menos uno de los duplicados, se volvieron a explorar para confirmar que los mutantes muertos estaban inactivos. Para confirmar los mutantes inactivos, el ensayo de actividad hialuronidasa descrito en el Ejemplo 3 se modificó para incorporar una etapa de incubación de muestra-sustrato a 37 °C durante una noche antes de la medición de la actividad enzimática. Se pretende que el ensayo modificado detecte actividades de PH20 por debajo de 0,2 U/ml.
La preparación de las placas recubiertas con bHA y el bloqueo de las placas antes de la adición de los sobrenadantes de variantes transfectadas o PH20 de tipo silvestre fue la misma que se ha descrito en el Ejemplo 3. El ensayo se modificó de la siguiente manera. En primer lugar, se diluyeron sobrenadantes de variantes transfectadas o PH20 de tipo silvestre que no contenía una mutación generada como se ha descrito en el Ejemplo 2 por duplicado 1:25 en diluyente de ensayo. Para la curva patrón, se realizaron diluciones en serie 1:3 de rHupH20 (generada como se ha descrito en el Ejemplo 1) en diluyente de ensayo por duplicado comenzando desde 0,1 U/ml hasta 0,00014 U/ml. También se incluyó un pocillo en blanco. Después, se añadieron 100 pl de las muestras diluidas o patrón a pocillos predesignados de la placa recubierta con bHA y bloqueada y se dejó incubar a 37 °C durante una noche. Después de la incubación, las placas se lavaron y se detectó la unión a bHA como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3. La densidad óptica se midió a 450 nm dentro en un periodo de 30 minutos después de la adición de la solución de terminación.
Los mutantes inactivos reconfirmados identificados se exponen en la Tabla 10. La Tabla expone el reemplazo de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de PH20 expuesta en SEQ ID NO: 3.
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Ejemplo 5
ENSAYO CON RESPECTO A ACTIVIDAD HIALURONIDASA EN CONDICIONES DE TEMPERATURA Y FENÓFILAS
Se ensayaron sobrenadantes de variantes de actividad de PH20 expuestos en la Tabla 9, como se ha identificado en el Ejemplo 4, con respecto a estabilidad en condiciones termófilas y/o fenófilas. El ensayo para medir la actividad hialuronidasa en condiciones de temperatura y fenófilas usando HA biotinilado (bHA) como sustrato para medir la actividad hialuronidasa se modificó a partir del ensayo original descrito en el Ejemplo 3 porque incorporó una incubación a 37 °C durante 4 horas de muestras con o sin m-cresol antes de la medición de la actividad enzimática. El ensayo se usó para identificar mutantes de PH20 con propiedades termófilas (actividad mayor a la condición de 37 °C que a 4 °C) y/o con propiedades fenófilas (mayor actividad en presencia de m-cresol que PH20 de tipo silvestre).
1. Exploración primaria
Antes de incubar muestras con bHA, se diluyeron muestras de PH20 variantes en pocillos designados de una placa 4XHB no recubierta para preincubación a 37 °C durante 4 horas en las siguientes condiciones: 1) preincubación a 37 °C con m-cresol 0,4 %; y 2) preincubación a 37 °C sin m-cresol 0,4 %. Para la preincubación a 37 °C con m-cresol 0,4 %, se preparó una reserva de intermedio de m-cresol 1 % a partir de una solución de reserva de m-cresol 50 % (v/v). Brevemente, en un vial de vidrio Wheaton de 2 ml se preparó una reserva al 50 % de m-cresol (Fluka, Catálogo n.° 65996; Spectrum, Catálogo n.° C2773) en metanol basándose en la densidad (D = 1,034 g/l). El vial se selló y se almacenó a -20 °C con protección de la luz en alícuotas pequeñas. Después, se generó la reserva de intermedio 1 % por dilución en tampón de ensayo HEPES (HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl21 mM, BSA 1 mg/ml, pH 7,4, Tween-20 0,05 %) diariamente inmediatamente antes de su uso en una campana extractora con agitación vorticial.
Después, los duplicados de muestras de sobrenadante variantes transfectadas expuestas en la Tabla 9, generadas como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2, se sometieron cada una por separado a una dilución 1:2,5 de mcresol 1 % y tampón de ensayo de HEPES/sobrenadante transfectado para obtener una concentración final de 0,4 % de m-cresol. Para la preincubación a 37 °C sin m-cresol 0,4 %, se sometieron muestras de sobrenadantes variantes transfectadas a dilución 1:2,5 en tampón de ensayo HEPES/sobrenadante transfectado. Además, para cada condición, también se ensayó un control de destrucción interna añadiendo 3 U/ml de rHuPH20 en tampón HEPES pH 7,4 (generado como se ha descrito en el Ejemplo 1) que se diluyó igual que se ha descrito anteriormente para las muestras transfectadas. Las placas se sellaron con sellantes de placas y se incubaron a 37 °C durante 4 horas.
La preparación de las placas recubiertas con bHA y el bloqueo de las placas antes de la adición de los sobrenadantes variantes transfectados o PH20 de tipo silvestre fue igual que se ha descrito en el Ejemplo 3. El ensayo se modificó adicionalmente de la siguiente manera. En primer lugar, se diluyeron muestras por duplicado 1:10 en tampón de ensayo HEPES en placas 4XHB. Para cada variante, las muestras que se ensayaron eran 1) sobrenadante variante transfectado no preincubado (sin incubación; 4 °C); 2) sobrenadantes variantes transfectados preincubados a 37 °C durante 4 horas con m-cresol 0,4 % (Cresol); o 3) sobrenadante variante transfectado preincubado a 37 °C durante 4 horas sin m-cresol 0,4 % (sin cresol, 37 °C). Además, también se ensayaron las muestras con adiciones. Se preparó una curva patrón que usaba rHuPH20 como se ha descrito en el Ejemplo 3 sin m-cresol. Se transfirieron cien microlitros (100 j l) de cada patrón y muestra a pocillos predesignados de la placa recubierta con bHA y bloqueada y se incubaron durante aproximadamente 1,5 horas a 37 °C. Por lo tanto, cada muestra de cada variante se ensayó por cuadruplicado debido a la preincubación de muestras duplicadas de cada sobrenadante variante transfectado en la etapa de preincubación y el duplicado adicional de cada muestra en el ensayo de bHA.
Después de la incubación, las placas se lavaron y se unieron con bHA detectado como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3. La densidad óptica se midió a 450 nm en un periodo de 30 minutos desde la adición de la solución de terminación.
La actividad U/ml se calculó a partir de la curva patrón y se comparó. Los resultados se representaron como el porcentaje (%) de actividad restante con cada uno de los siguientes parámetros: relación de actividad en 1) preincubación a 37 °C sin m-cresol/4 °C; 2) 37 °C después de preincubación con m-cresol/4 °C; y 3) 37 °C después de preincubación con m-cresol/después de preincubación a 37 °C sin m-cresol. Se identificaron los aciertos de fenófilos iniciales para reconfirmación como los que en un ensayo por duplicado mostraron un porcentaje de actividad restante en la condición 3) de > 20 % de la actividad original a 37 °C
Los aciertos iniciales se volvieron a explorar usando un ensayo de reexploración en placas de 6 pocillos. Para la reexploración, el ADN plasmídico correspondiente al acierto potencial se transformó en bacterias E. coli y se preparó ADN plasmídico y se purificó usando MaxiPrep según las instrucciones de los fabricantes. Se confirmó la secuencia de ADN.
El ADN plasmídico se transfectó en células CHO-S en monocapa (Invitrogen, Cat. n.° 11619-012) cultivadas en placas de 6 pocillos a una densidad de aproximadamente 50-80 % de confluencia usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat. n.° 11668-027) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se realizaron transfecciones por duplicado. Las células se incubaron a 37 °C en un incubador de CO2 durante 96 horas después de la transfección antes de recoger el sobrenadante para el ensayo. Como controles, las células también se transfectaron con el vector de expresión HSA24-PH20(OHO)-SEAP-SEAP (SEQ ID NO: 4) que contiene una secuencia de PH20 de tipo silvestre con codones optimizados (OHO). También se incluyeron como controles células de simulación.
Noventa y seis (96) horas después de la transfección, se recogió sobrenadante de cada muestra, incluyendo los controles de OHO y simulación, y se ensayó con respecto a actividad hialuronidasa en diversas condiciones como se ha descrito anteriormente: 1) sobrenadante variante transfectado no preincubado (sin incubación; 4 °C); 2) sobrenadantes variantes transfectados preincubados a 37 °C durante 4 horas con m-cresol 0,4 % (Cresol; 37 °C); o 3) sobrenadante variante transfectado preincubado a 37 °C durante 4 horas sin m-cresol 0,4 % (sin cresol; 37 °C). Se determinó la actividad hialuronidasa como se ha descrito anteriormente usando el ensayo de bHA.
Los resultados se evaluaron como se ha descrito anteriormente. Se generó actividad hialuronidasa absoluta (U/ml) a partir de la curva patrón. Además, se determinó el porcentaje de actividad como una relación de la actividad a 37 °C/4 °C, 37 °C más m-cresol/4 °C, y 37 °C más m-cresol/37 °C. Los resultados se exponen en las Tablas 11 y 12 a continuación.
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2. Sumario de resultados para F204P
Para el mutante F204P, los resultados anteriores de sobrenadante ensayado de transfección transitoria de células CHO-S incubadas en presencia de m-cresol en un ensayo de actividad enzimática de bHA mostraron que la proteína mutante F204P era altamente resistente a tratamiento con m-cresol 0,4 %. Los resultados mostraron que la actividad que permanecía después de 4 horas de incubación con m-cresol 0,4 % a 37 °C era aproximadamente igual a la actividad observada cuando la enzima se incubó a 4 °C o a 37 °C en ausencia de m-cresol. El control positivo (WT PH20 - OHO) mostró una reducción de la actividad del 75 % y 83 % el día del ensayo (como se ensaya a partir de dos transfecciones de OHO diferentes). Esto demostró que el fenófilo F204P era capaz de conservar de 60 % a 90 % o más de su actividad por encima de la actividad residual de la enzima de control PH20 de tipo silvestre.
Para confirmar la estabilidad de F204P tras tratamiento con m-cresol o exposición a temperatura aumentada, se realizó una segunda transfección de F204P por duplicado usando células CHO-S y se ensayó de nuevo sobrenadante clarificado con respecto a su estabilidad a 4 °C, a 37 °C durante 4 horas con m-cresol 0,4 % y a 37 °C durante 4 horas sin m-cresol 0,4 %. Los resultados confirmaron que la enzima mutante F204P conservaba una alta cantidad de actividad hialuronidasa después de la incubación de 4 horas en m-cresol a 37 °C. Los resultados fueron similares a los resultados observados en la primera exploración del mutante, conservando F204P cualquiera desde 57 % hasta más de 90 % de su actividad por encima de la actividad residual de la enzima de control PH20 de tipo silvestre después de la incubación de 4 horas.
Se expone en la Tabla 13 un sumario de la actividad enzimática de F204P en comparación con el control de tipo silvestre.
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Ejemplo 6
EXPRESIÓN A GRAN ESCALA Y PURIFICACIÓN DE VARIANTE DE ACIERTO DE PH20
1. Expresión y purificación
Se transfectó ADN del plásmido HZ24-PH20-IRES-SEAP que contenía ADNc que codificaba una de las PH20 variantes en células CHO-S monocapa como se ha descrito en general en el Ejemplo 2. Las células CHO-S se cultivaron en matraces de agitación usando medio CD-CHO complementado con GlutaMAX (8 mM). El día de la transfección, se prepararon 15 matraces de aproximadamente 300 ml de volumen que contenían las células CHO-S a una densidad aproximada de 1,0 x 106 células/ml. Cada matraz de 300 ml se transfectó usando 375 |jg de ADN plasmídico que codificaba el mutante F204P combinado con 375 j l de reactivo de transfección Freestyle MAX. El ADN plasmídico transfectado tenía una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4 que contenía un cambio de codón de TTC a CCT en las posiciones de nucleótidos 1733-1735, codificando de este modo el mutante F204P. Después se permitió que las células transfectadas permanecieran en cultivo durante 96 horas, tras lo cual las células y los medios se recogieron y se agruparon. Las células se sedimentaron por centrifugación (4000 x g, 20'), y el sobrenadante se conservó para purificación de la proteína F204P (aproximadamente 4,5 litros).
El sobrenadante en bruto se concentró 10x usando un sistema de filtro de flujo tangencial (TFF) de 30 kDa (Millipore Pellicon XL, Bimax 30, volumen vacío de 200 ml; área de superficie de filtro de 50 cm2) hasta que el volumen fue de aproximadamente 450 ml. El permeado se guardó para ensayo para detectar el flujo continuo de la proteína F204P. Después se realizó un intercambio de tampón de flujo libre para el retenido usando 4 litros de tampón (NaPO4 10 mM; NaCl 25 mM, pH 7,2). El volumen del retenido se redujo de nuevo hasta aproximadamente 200 ml, y después se purgó el permeado restante en el sistema (volumen vacío ~200 ml) y el sistema se lavó abundantemente usando aproximadamente 50 ml de tampón para producir un producto concentrado final de aproximadamente 450 ml.
Se preparó una columna de afinidad anti-rHuPH20 acoplando IgG de conejo anti rHuPH20 purificado por afinidad a antígeno con Sepharose 4 Fast Flow activado por CNBr (GEHealth catálogo n.° 17-0981-01). Brevemente, se suspendieron 0,7 g de polvo de Sepharose 4 preactivado en HCl 1 mM en una columna de vidrio de 10 ml durante 30 minutos para permitir que el polvo se hinchara. La solución se drenó de la columna y se lavó con 15 volúmenes de gel (aproximadamente 30 ml) de HCl 1 mM por gravedad. La columna se lavó con 5 volúmenes de gel de tampón de acoplamiento (NaHCO3 0,1 M, NaCl 0,5 M a pH 8,3). A continuación, se añadieron 5 mg de IgG de conejo anti rHuPH20 a > 1,0 mg/ml en tampón de acoplamiento a la columna a una relación de proteína/gel de 2-3 mg/ml de gel. La columna se rotó en vertical a 4 °C durante una noche. El flujo continuo se recogió para determinación de la eficacia de acoplamiento. El gel se lavó con 2 volúmenes de gel de tampón de acoplamiento, y después se lavó y se resuspendió en etanolamina 1 M pH 9,5 durante 2 horas a temperatura ambiente para bloquear sitios activados no utilizados. El gel se lavó 6 veces con 5 volúmenes en gel por lavad alternando tampón de acoplamiento y NaAc 0,1, NaCl 0,5 M, pH 4,5. El gel se lavó después con 10 volúmenes de gel de TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5). Se determinó la eficacia de acoplamiento (1-concentración de proteína después del acoplamiento/concentración de proteína antes del acoplamiento x 100 %). El gel acoplado a anticuerpo se almacenó en TBS con NaN3 0,02 % a 4 °C.
El producto de sobrenadante concentrado se cargó posteriormente en una columna de afinidad anti rHuPH20 a una velocidad aproximada de 5 ml/min. La elución se realizó de acuerdo con el procedimiento convencional usando un sistema de purificación G E™ AKTA FPLC (GE Healthcare, Producto n.° 18-1900-26), por lo que la proteína se eluyó mediante un lavado de glicina de pH bajo (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5) En fracciones de 1 ml. Cada fracción se neutralizó inmediatamente por la adición de 100 j l de Tris 1 M, pH 7,5.
La proteína eluida se ensayó resolviendo bandas proteicas en un gel de Tris-glicina de gradiente de SDS-PAGE de 4-20%. Se usaron patrones de PM preteñidos SeeBlue®Plus2 (Life Technologies, Catálogo n.° LC5925) como patrones de peso molecular, y se usaron 50 ng de rHuPH20 (como se ha descrito en el Ejemplo 1) como un control positivo. El gel de poliacrilamida se tiñó con Instant Blue para mostrar la proteína total de cada fracción. Para confirmar que las bandas en el gel son PH20, el gel se transfirió a una membrana de PVDF (Invitrogen), que se sometió a Transferencia de Western usando un anticuerpo primario de conejo anti PH20 generado inmunizando conejos con rHuPH20 y un anticuerpo secundario de Cabra anti conejo-HRP (Calbiochem, Cat. n.° DC03L).
Después, se volvió a cargar el flujo continuo de la carga inicial de la columna de afinidad en la columna dos veces debido a la baja capacidad de la columna de afinidad. Todas las fracciones que contenían la proteína se combinaron después dando como resultado un volumen total que era aproximadamente de 13 ml. Este producto se dializó después durante una noche frente a cuatro litros de tampón (NaPO4 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,2) usando un casete de diálisis Slide-A-Lyzer G2 (PCPM 20.000) con una capacidad de 15 ml. Después se cambió el tampón y el producto se dializó frente a unos segundos cuatro litros nuevos del mismo tampón. La proteína F204P se concentró después usando una columna de Centrifugación Amicon Ultra (Millipore, PCPM 10.000) hasta un volumen final de aproximadamente 450 j l (10 minutos a 4000 xg).
2. Caracterización de proteína
La proteína purificada se caracterizó con respecto a su concentración, actividad y pureza proteica.
Para determinar la concentración proteica de la proteína purificada, se realizó un ELISA de cuantificación como se ha descrito en el Ejemplo 7. Además, se determinó la actividad hialuronidasa como se ha descrito en el Ejemplo 3.
Se estimó que la concentración proteica después de centrifugación era de aproximadamente 400 |jg/ml. La proteína purificada también se resolvió en un gel de Tris-glicina de gradiente de SDS-PAGE de 4-20 %, que después se tiñó con Instant Blue. Los resultados de tinción demostraron que la proteína era esencialmente una proteína de un único peso molecular de aproximadamente 63 kDa, similar al control de rHuPH20. No se detectaron productos degradantes apreciables por este método. Se describen en la Tabla 14 rendimientos aproximados de la proteína en diversos puntos temporales y actividad durante la purificación.
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La pureza de la proteína purificada se determinó por HPLC de fase inversa (RP-HPLC). El tiempo de elución desde la columna de fase inversa fue esencialmente idéntico al observado con la hialuronidasa humana recombinante (HUB), y proporciona una base para la estimación aproximada de la pureza de la muestra a aproximadamente 80­ 90 %.
Ejemplo 7
CUANTIFICACIÓN USANDO ELISA
La cuantificación de PH20 o variantes se realizó usando un ELISA que captura la proteína usando un anticuerpo de captura anti rHuPH20 monoclonal. Específicamente, un día antes de realizar el ELISA, se recubrieron placas de 4HBX de 96 pocillos con anticuerpo de captura (anticuerpo policlonal de conejo anti PH20 purificado con Proteína G generado por inmunización de conejos con rHuPH20; reserva de 1 mg/ml) a 1 jg/m l en fosfato 100 mM (pH 7,2) en un volumen total de 100 j l por pocillo. Las placas se almacenaron a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, las placas se lavaron 5x con PBS 1x a 300 jl/pocillo con un lavador de placas. Después de cada lavado, las placas se secaron por golpes suaves en servilletas de papel. Después, las placas se bloquearon con 200 j l de PBS que contenía Tween 20 (PBST 1x) por pocillo a temperatura ambiente durante 1 hora.
Los patrones y muestras se añadieron a la placa. Para generación del patrón, se diluyó nuevamente una reserva de 1 mg/ml de rHuPH20 (Ejemplo 1) a 50 jg/m l en un tampón de ensayo HEPES pH 7,4 como una reserva intermedia. Después, para los patrones, la reserva de 50 jg/m l se diluyó por duplicado en 360 j l de PBST 0,5x a 300 ng/ml para el primer patrón (primera fila). Para las otras filas convencionales, se añadieron 240 j l de PBST 0,5x a cada pocillo, y se realizaron diluciones en serie 1:3. Para las muestras de sobrenadante transfectadas, se añadieron 360 j l por pocillo por duplicado a la primera fila, y cada una se diluyó también en serie como se ha descrito anteriormente en PBST 0,5 x. Para muestras purificadas, se añadieron 100 j l por pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de incubación, las placas se lavaron 5x con PBST 1x a 300 jl/pocillo usando un lavador de placas. Después de cada lavado, las placas se secaron por golpes suaves en servilletas de papel.
Se preparó un anticuerpo anti-PH20 conjugado con HRP para detección usando un kit de conjugación de HRP (Pierce, Thermo-Fisher, Catálogo n.° 31489). Se diluyó 1 mg de un anticuerpo policlonal de conejo purificado para Proteína G generado por inmunización de conejos con rHuPH20 en 1 ml de PBS y 1 ml de tampón de kit de carbonato 2 x. A continuación, se añadieron 100 j l de peroxidasa a 1 ml de la solución de anticuerpo anterior y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, se añadieron 10 j l de reserva de NaBH4 en una campana extractora, y la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para detener la reacción, se añadieron 20 j l de etanolamina y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. A esta se añadieron 1/25 de volumen de albúmina de suero humano 5 % (jeringa de 0,1 ml) para proporcionar una reacción de reserva de albúmina de 2 mg/ml. El pH se ajustó a aproximadamente 7,9 mediante la adición de 250 j l de Tris 1 M pH 7,4. La concentración de la reserva fue de 400 jg/ml. La solución de reserva se diluyó adicionalmente 1/10 en PBS Tween20 (0,05 %) que contenía albúmina de suero humano 0,5 % y conservantes, y después se esterilizó por filtración. La reserva se almacenó a 4 °C o se congeló a -20 °C.
Se detectaron anticuerpos usando el anticuerpo anti PH20 conjugado con HRP que se diluyó 1000x en PBST 0,5 x. Se añadieron 100 |jl del anticuerpo diluido a todos los pocilios de la placa y la placa se incubó durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron 5x con PBST 1x a 300 jl/pocillo usando un lavador de placas. Después de cada lavado, las placas se secaron por golpes suaves en servilletas de papel. Después, se añadieron 100 j l de sustrato de TMB a cada pocillo y la reacción se detuvo después de 5-10 minutos añadiendo 100 j l de solución de terminación por pocillo. La placa se leyó a DO450.
Ejemplo 8
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE PH20
La actividad enzimática de PH20 en muestras tales como cultivos celulares, fracciones de purificación y soluciones purificadas se determinó usando un ensayo turbidimétrico, que se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando se une ácido hialurónico con cloruro de cetilpiridinio (CPC). La actividad se mide incubando PH20 con hialuronano durante un periodo de tiempo definido (30 minutos) y después precipitando el hialuronano no digerido con la adición de CDC. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm. La reducción de la turbidez resultante de la actividad enzimática en el sustrato de hialuronano es una medida de la actividad enzimática de PH20. El método se realiza usando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo de ensayo de PH20 (patrón de rHuPH20 generado como se ha descrito en el Ejemplo 1), y se realizan mediciones de actividad de la muestra en relación con esta curva de calibración.
Se prepararon diluciones de la muestra y patrones en Solución de Diluyente de Enzima (NaCl 70 mM, albúmina de suero humano 0,1 % [HSA], hidrolizado de gelatina 0,67 g/l en tampón de PIPES 25 mM, pH 5,5). Las muestras se diluyeron hasta una concentración apropiada. También se preparó ácido hialurónico (HA, PM promedio de 20 - 50 kDa) de Lifecore Biomedical (Chaska, Mn ) a 1 mg/ml en solución de sustrato que contiene PIPES 25 mM, NaCl 70 mM a pH 5,5. Se mezclaron cantidades iguales de las dos soluciones anteriores para preparar una mezcla de reacción de 1 ml y se incubaron a 37 °C durante 30 min. La reacción se detuvo mediante la adición de 4 ml de Solución de Cloruro de Cetilpirinidio (CPC, 5,0 mg/ml). Después de agitación vorticial breve, la turbidez de la mezcla de muestra se leyó a 640 nm y la actividad se determinó ajustando frente a una curva patrón. Se calculó la actividad específica (unidades/mg) dividiendo la actividad enzimática (U/ml) por la concentración de proteínas (mg/ml).
Ejemplo 9
ESTABILIDAD DE LA VARIANTE DE PH20 F204P EN CONSERVANTE
Para confirmar los resultados de exploración, se formuló una cantidad que se estimó que era de aproximadamente 450 U/ml de la proteína F204P purificada como se ha descrito en el Ejemplo 6 en fosfato sódico 10 mM, pH 6,5, NaCl 120 mM, metionina 10 mM, Pluronic F-68 0,01 %, fenol 0,1 % y m-cresol 0,15%. También se preparó un artículo de ensayo que también contenía una cantidad que se estimó que era de aproximadamente 450 U/ml de rHuPH20 de tipo silvestre (generado como se ha descrito en el Ejemplo 1) en la misma formulación para actuar como un control. Cada solución de formulación se separó en alícuotas en 0,5 ml y se cargó en 2 ml de vidrio de borosilicato de Tipo I USP con un tapón de goma clorobutilo y un sello de aluminio. Los viales se incubaron a 5 °C, 30 °C o 37 °C. Se extrajeron muestras del incubador en diversos tiempos y se midió la actividad enzimática como se ha descrito en el Ejemplo 8.
Los resultados de las mediciones de actividad enzimática se muestran en la Tabla 15. Como puede verse, el control de tipo silvestre de rHuPH20 mostró una rápida reducción de la actividad cuando se incubó a 37 °C en presencia de conservantes fenólicos. Por el contrario, el mutante F204P no mostró ninguna pérdida significativa de actividad a lo largo del estudio. Los resultados también muestran que la actividad de PH20 se conserva después de incubación durante hasta 4 semanas a 5 °C y 30 °C en comparación con la actividad del control de tipo silvestre de rHuPH20 que no contiene la mutación. Estos resultados confirman que F204P tolera el nivel de EPB de conservante (fenol 0,1 % y m-cresol 0,15 %) y es estable a 37 °C durante hasta al menos 6 días a 5 °C y 30 °C durante más de un mes.
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Ejemplo 10
ESTABILIDAD DE LA VARIANTE DE PH20 F204P EN COFORMULACIÓN DE INSULINA
Se ensayó la variante de PH20 F204P con respecto a su estabilidad en una coformulación que contenía un análogo de insulina (insulina aspart o insulina lispro).
En las coformulaciones ensayadas, la insulina lispro fue un producto comercial (Insulina Lispro: Eli Lilly Humalog® (insulina Lispro) 100 U/ml, Lote A572364).
En las coformulaciones ensayadas, el análogo de insulina aspart fue una aspart reprocesada preparada agrupando 12 viales (10 ml cada uno) de un producto comercial (Insulina Aspart: Novo Nordisk, NovoRapid® (insulina Aspart), Lote XS60195), que se concentró usando un concentrador de columna Amicon Ultracel-10 K hasta que la concentración final fue de aproximadamente 5 veces la concentración original. El análogo de insulina se precipitó mediante la adición de acetato sódico 1 M, pH 5,3 y cloruro de cinc 30 mM (ZnCl2, EMD, Cat n.° ZX0065-1) a 1/10 del volumen de solución de proteína. La solución se colocó en hielo durante 30 minutos seguido de centrifugación a 5600 rpm durante 20 minutos en una Centrífuga Avanti J-E con rotor de cubeta oscilante JS-5,3 (Beckman Coulter). El sobrenadante se decantó y el sedimento se resuspendió y se lavó con acetato sódico 20 mM, cloruro de cinc 2 mM, solución de pH 5,5. La solución resuspendida se centrifugó como se ha descrito anteriormente. La etapa de lavado se repitió en total 5 veces. Se realizó un lavado final con acetato sódico 20 mM, pH 5,5 para retirar todos los restos de cloruro de cinc. La pasta de proteína resultante se disolvió con agua que contenía HCl 20 mM. Después de una disolución completa, se añadió Tris 250 mM, pH 10,7 a una concentración de Tris final de 20 mM. El pH de la solución resultante se ajustó de modo que el análogo de insulina se formuló como se describe posteriormente y la concentración de proteína se ajustó a aproximadamente 15-20 mg/ml. Un análogo de insulina preparado de este modo típicamente tuvo un rendimiento de aproximadamente 90 % con una concentración de conservante residual de menos de 100 veces el material de partida.
Brevemente, se generaron (3) formulaciones que contenían cada una 600 Unidades (U) de PH20-F204P o rHuPH20 de tipo silvestre (generado como se ha descrito en el Ejemplo 1) para un total de 6 formulaciones como se expone en la Tabla 16:
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Cada solución de formulación se distribuyó en alícuotas de 0,5 ml en viales de vidrio de borosilicato de Tipo I USP de 2 ml con un tapón de goma de clorobutilo y un sello de aluminio. Los viales se incubaron a 5 °C, 30 °C y 37 °C. Las muestras se retiraron del incubador en puntos temporales programados para mediciones de actividad enzimática como se ha descrito en el Ejemplo 8.
Los resultados de las mediciones de actividad enzimática para muestras incubadas a 37 °C, 30 °C y 5 °C se muestran en las Tablas 17-19, respectivamente. A 37 °C, la actividad enzimática de muestras que contienen rHuPH20 de tipo silvestre (F2, F4 y F6) se perdió casi totalmente en dos días de incubación. Por el contrario, después de 6 días de incubación a 37 °C, la formulación F3 y F5, que contienen PH20-F204P, perdieron solamente aproximadamente 10 % y 30 %, respectivamente. La PH20-F204P formulada en Humalog comercial (F1) perdió la mayoría de su actividad en 2 días a 37 °C más probablemente debido a la falta de NaCl en la formulación.
Se observó una tendencia similar para las actividades enzimáticas de ampollas incubadas a 30 °C entre PH20-F204P y rHuPH20. Para formulaciones que contienen un nivel conservante de EPA, las diferencias entre de tipo silvestre y F204P fueron drásticas (Tabla 17; F1 y F5 frente a F2 y F6). Cuando la concentración de conservante se redujo a un nivel de EPB (F3 y F4), la F204P aún rindió mejor que rHuPH20 de tipo silvestre, aunque hubo una estabilidad de rHuPH20 ligeramente mayor en comparación con las condiciones de EPA. En los niveles conservantes tanto de EPA como de EPB, PH20-F204P fue capaz de mantener su actividad hasta 14 días a 30 °C, cuando se incluyó NaCl 100 mM en la formulación.
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Ejemplo 11
ESTABILIDAD DE V58R-PH20 EN COFORMULACIÓN DE INSULINA
A. Estabilidad de V58R-PH20
La variante de PH20 V58R se expresó en células CHO-S como se ha descrito en el Ejemplo 2 o en el Ejemplo 6. El ADN plasmídico transfectado tenía una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4 que contenía un cambio de codón de GTG a CGG en las posiciones de nucleótidos 1295-1297, codificando de este modo el mutante V58R. El mutante V58R se ensayó con respecto a su estabilidad en una coformulación que contiene insulina aspart (análogo de insulina aspart preparado como se ha descrito en el Ejemplo 10) y en niveles de conservante de EPA o EPB. Brevemente, se generaron cuatro (4) formulaciones que contenían cada una 600 Unidades (U) de PH20-V58R o rHuPH20 de tipo silvestre (generado como se ha descrito en el Ejemplo 1) como se expone en la Tabla 20. Las formulaciones F1 y F2 representan los niveles de conservante de EPB mientras que las formulaciones F3 y F4 representan los niveles de conservante de EPA.
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Cada solución de formulación se distribuyó en alícuotas de 0,5 ml en viales de vidrio de borosilicato de Tipo I USP de 2 ml con un tapón de goma de clorobutilo y un sello de aluminio. Los viales se incubaron a 30 °C y 37 °C. Las muestras se extrajeron del incubador en puntos temporales programados para mediciones de actividad enzimática como se ha descrito en el Ejemplo 8.
Los resultados de las mediciones de actividad enzimática para muestras incubadas a 37 °C y 30 °C se muestran en la Tabla 21 y la Tabla 22. A 37 °C, la actividad enzimática de muestras que contienen rHuPH20 de tipo silvestre (F2 y F4) se perdió casi totalmente en dos días de incubación. Por el contrario, después de 6 días de incubación a 37 °C, las formulaciones F1 (EPB) y F3 (EPA), que contenían V58R-PH20, perdieron solamente aproximadamente 25 % y 40 % de actividad, respectivamente. A 30 °C, la actividad enzimática de muestras que contenían rHuPH20 de tipo silvestre también se redujo drásticamente en presencia de niveles de conservantes de EPA o EPB en un mes de incubación, aunque hubo una pérdida ligeramente menos drástica de actividad en presencia de niveles de conservante de EPB. Por el contrario, para V58R-PH20, no hubo ninguna pérdida de actividad enzimática para ninguna de las formulaciones ensayadas hasta 1 mes.
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B. Comparación de la estabilidad de F204P y V58R
La variante de PH20 V58R-PH20 se comparó con F204P con respecto a su estabilidad en una coformulación que contenía insulina aspart (análogo de insulina aspart preparado como se ha descrito en el Ejemplo 10) y a niveles de conservante de EPA o EPB. Brevemente, se generaron ocho (8) formulaciones como se expone en la Tabla 23. Las formulaciones F1-F4 representan los niveles de conservante de EPB mientras que las formulaciones F5-F8 representan los niveles de conservantes de EPA. Las formulaciones F3 y F4 y las formulaciones F7 y F8 fueron idénticas y representan las formulaciones de control de tipo silvestre usadas para los estudios de EPB o EPA, respectivamente.
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Cada solución de formulación se distribuyó en alícuotas de 0,5 ml en viales de vidrio de borosilicato de Tipo I USP de 2 ml con un tapón de goma de clorobutilo y un sello de aluminio. Los viales se incubaron a 30 °C y 37 °C. Las muestras se extrajeron del incubador en puntos temporales programados para medidas de la actividad enzimática como se ha descrito en el Ejemplo 8.
Los resultados muestran que el porcentaje de actividad hialuronidasa en las formulaciones ensayadas después de preincubación a 37 °C fue ligeramente mayor para ambos mutantes de PH20 cuando se formularon en niveles de conservante de EPB y no de EPA. Aunque el porcentaje de actividad restante fue mayor del 80 % para ambos mutantes ensayados después de 6 días de incubación en formulaciones que contenían niveles de conservante de EPB, fue menor en presencia de niveles de conservante de EPA. Por ejemplo, la actividad restante a los 6 días en niveles de conservante de EPA fue ligeramente menor del 80 % después de 6 días para F204P-PH20, mientras que fue solamente de aproximadamente 40 % para V58R-PH20. Por lo tanto, los resultados también muestran que a 37 °C, V58R-PH20 es algo menos estable que la F204-PH20, en particular en una formulación con niveles de conservante de EPA. Después de incubación a 30 °C durante al menos una semana, las F204P-PH20 y V58R-PH20 fueron estables y mostraron casi 100 % de actividad inicial en presencia de niveles conservantes tanto de EPA como de EPB. Por el contrario, rHuPH20 mostró solamente aproximadamente 40 % de su actividad inicial después de 4 semanas a 30 °C en presencia de niveles conservantes de EPB, mientras que no mostró ninguna actividad detectable después de 4 semanas a 30 °C en presencia de niveles de conservante de EPA.
Ejemplo 12
EXPRESIÓN DE F204P-PH20 USANDO UN VECTOR DE EXPRESIÓN DE LENTIVIRUS
Se generó un vector de expresión de lentivirus pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFP-Bsd que contenía un ADNc de hialuronidasa mutante con codones optimizados que codificaba F204P-PH20. La secuencia de pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFPBsd se expone en SEQ ID NO: 925. El vector pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFP contiene un gen de resistencia a ampicilina (AmpR) localizado en los nucleótidos 8611-9471, un promotor de EF1a en los restos 1933 a 2327, un Ir Es en los restos 4786-5370, un GFP-Bsd en los restos 5394-6527 y nucleótidos que codifican F204P-PH20 en los restos 3369-4781.
Se produjo lentivirus como se describe en Bandaranayake et al. ((2011) Nucleic Acids Research, 39: e143). Brevemente, se sembraron células 293T (ATCC) a 6 x 106 células en placas de cultivo tisular de 10 cm. Después de 24 horas, se mezclaron 6 mg de psPAX2 (SEQ ID NO: 926; plásmido Addgene n.° 12260), 3 mg de PMD2.G (SEQ ID NO: 927; plásmido Addgene n.° 12259) y 9 mg de plásmido de vector lentiviral pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFP-Bsd en 1,5 ml de Opti-MEM (Life Technologies). Se diluyeron 45 ml de Lipofectamine 2000 (LF2000; Life Technologies) en 1,5 ml de Opti-MEM (Life Technologies). El ADN y LF2000 se mezclaron suavemente, y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el ADN y el lípido formaran complejos. Entre tanto, el medio de cultivo de una noche se reemplazó con 5,0 ml de DMEM FBS 10 % sin antibióticos. Se añadió un volumen de 3,0 ml que contenía los complejos de ADN-LF2000 a las células 293T. El medio que contenía los complejos de ADN-LF2000 se remplazaron con 10 ml de medio completo a las 12-16 horas después de la transfección. El sobrenadante se recogió a las 48 horas después de la transfección y el medio se transfirió a tubo de almacenamiento de polipropileno. El medio que contenía virus se centrifugó a 1300 rpm durante 5 minutos para sedimentar cualquier célula 293T que se portara durante la recogida. El sobrenadante se transfirió cuidadosamente a un tubo de almacenamiento de polipropileno estéril.
Se cultivaron células CHO-S (Invitrogen) en medio CHO-S (Invitrogen) con agitación a 120 rpm a 37 °C y CO2 5 % en matraces de agitación de 125 ml purgados (Nalgene). Para transducción, se añadieron células CHO-S a pocillos de una placa de seis pocillos a 2 x 106 células por pocillo en 2 ml de medio de CHO-S que contenía bromuro de hexadimetrina 4 |ig/ml a una concentración final de 4 |ig/ml (Polybrene; SIGMA). Se añadió virus a cada pocillo a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y las células se incubaron con agitación (120 rpm) a 37 °C y CO2 5 % durante 6 horas. Después las células se recogieron y se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad (500 x g, 5 min). El medio de transducción se retiró y se reemplazó con 10 ml de medio CHO-S nuevo (Invitrogen) complementado con GlutaMax (50 ml/litro) y se transfirió a un matraz T-25. Tres días después de la infección, se añadió blasticidina (Invitrogen) al medio de cultivo a una concentración de 1 |ig/ml. El medio se cambió regularmente a intervalos de 3-4 días, y las células se transfirieron a un matraz T75 para expansión. Dos semanas después de la infección inicial, las células se expandieron a matraces de agitación y se mantuvieron en cultivo usando medio que contenía blasticidina 1 |ig/ml. Se recogió proteína F204-PH20 secretada al medio CHO-S y se purificó por cromatografía de afinidad usando una columna de afinidad anti-rHuPH20 como se ha descrito en el Ejemplo 6. La proteína se preparó en tampón API convencional (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5).
Ejemplo 13
ANÁLISIS DE ESTRUCTURA SECUNDARIA Y TEMPERATURA DE FUSIÓN
La estructura secundaria y temperatura de fusión de la variante de PH20 F204P se ensayó y se comparó con rHuPH20 de tipo silvestre (generado como se ha descrito en el Ejemplo 1) para evaluar adicionalmente la estabilidad de la variante. La estructura secundaria se ensayó por dicroísmo circular. Se empleó un Jasco J-810-150S equipado con PTC-424S para la medición espectral de DC y los espectros de DC se recogieron por Spectra Manager (Versión 1.5, Jasco). Se describen procedimientos para preparación instrumental y recogida de datos en la Tabla 24.
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1. Preparación y medición de muestras
Se prepararon doscientos (200) |il de una muestra de proteínas de 0,1 mg.ml diluida en tampón de Mcllvaine (Mcllvaine (1921) JBC 49:183) ajustado a pH 6,5. También se generó una serie de muestras de la variante F204P que varió en su PH por ajuste usando tampón de Mcllvaine a un intervalo de pH de 5,0 a 7,5 como se expone en la Tabla 25. Además, también se generaron muestras ajustando la concentración de NaCl de 17,5 mM a 140 mM como se expone en la Tabla 26. Las muestras se filtraron usando un filtro de jeringa de 0,2 |im antes de la medición. Se generaron muestras similares para rHuPH20. Después, se transfirieron muestras de 200 |il a una cubeta rectangular que tenía una anchura de 1 mm y se puso en un espectropolarímetro Jasco J-810. Se recogieron los espectros de Dc de las muestras en las condiciones descritas en la Tabla 20. Se calculó la temperatura de fusión (Tm) usando Spectra Manager (v 1.5, Jasco) a partir de la intensidad espectral de DC medida al intervalo de temperatura de 30 °C a 75 °C. Las cubetas se limpiaron mediante limpiador Chromerge® (C577-12, Fisher scientific) entre carga de muestra individual y después del ciclo.2
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2. Resultados
Los resultados muestran que la estructura secundaria de F204P es similar a rHuPH20. En función de la temperatura, el dicroísmo circular mostró que se midió un cambio en la absorción con temperaturas crecientes. En función del pH, la distribución de Tm fue estrechamente comparable tanto a F204P como a rHuPH20 y la mayor Tm para cada una se obtuvo entre pH 5,5 y pH 6,0. Los resultados, sin embargo, mostraron que la Tm de la variante de F204P era aproximadamente 9 °C mayor en todos los intervalos ensayados que el rHuPH20 de tipo silvestre. Este resultó indicó que el mutante F204P es más estable frente a condiciones de tensión térmica. En función de la sal, los resultados muestran que la rHuPH20 F204P y de tipo silvestre mostraron ambas una Tm creciente con mayor concentración salina, lo que muestra que ambas tienen una inclinación proporcional hacia la concentración salina.
Ejemplo 14
Evaluación de la actividad enzimática en un ensayo de dispersión de azul de tripano intradérmico
Se evaluó la actividad de propagación de la variante de PH20 F204P usando un ensayo in vivo de dispersión de colorante. Brevemente, se formularon tanto la variante de PH20 F204P purificada (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 12) como rHuPH20 de tipo silvestre (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1) en tampón de API (Histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5) a una concentración de 10.000 U/ml. Las reservas se diluyeron adicionalmente a tres concentraciones diana de 1000, 100 y 10 U/ml por diluciones 1:10 en serie en tampón de API. Las proteínas purificadas (bien rHuPH20 o bien F204P-PH20) se diluyeron 1:1 con Azul de Tripano 0,4 % (solución líquida 0,4%; Catálogo n.° 15250, Invitrogen) para proporcionar una concentración final de 5, 50 y 500 U/ml de proteína, conteniendo cada uno azul de tripano 0,2 %. También se preparó un control de vehículo (tampón de API). Se usaron cuarenta y dos (42) ratones homocigotos hembra NCr nu/nu en el estudio con seis ratones usados por grupo como se expone en la Tabla 27.
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Se administraron cuarenta (40 |il) de muestras en una única inyección intradérmica. El área de dispersión de colorante se midió a los 2,5, 5, 10, 15 y 20 minutos después de la inyección y se registró por captura de imágenes fotográficas mediante fotografía del sitio de inyección con una cámara digital Nikon D29 con un micro-objetivo fijo de 60 mm. Se usó un medidor de distancia láser (Leica D3) para situar con precisión la cámara a una distancia predeterminada del área de colorante de Azul de Tripano en el animal. El área del colorante se determinó usando Image-Pro Analyzer 7.0 (MediaCybernetics, Inc). Las áreas calculadas se expresaron como mm2.
Los resultados se exponen en la Tabla 28. Los resultados mostraron que la actividad de dispersión de la variante de PH20 F204P era sustancialmente idéntica a la actividad de dispersión de rHuPH20. La capacidad de aumentar el área de dispersión de colorante fue dependiente de la dosis, teniendo ambas proteínas mayor actividad a 500 U/ml. Los resultados también mostraron que el área de dispersión de colorante aumentó con el tiempo después de la inyección intra-dérmica. Las áreas de dispersión de colorante de rHuPH20 y F204P-PH20 fueron significativamente mayores que las áreas de dispersión de colorante para los controles (p<0,05) en todos los puntos temporales cuando se formularon a todas las concentraciones (5, 50 y 500 U/ml) con la excepción de rHuPH20 a la menor concentración (5 U/ml). Al compararlas entre sí, rHuPH20 y F204P-PH20 mostraron efectos de dispersión similares, aunque hubo una diferencia significativa en la dispersión entre los grupos a 5 U/ml y 500 U/ml pero no a 50 U/ml. En resumen, los resultados muestran que tanto rHuPH20 como F204P-PH20 proporcionaron un aumento estadísticamente significativo del área de dispersión de colorante en comparación con el control de vehículo.
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Ejemplo 15
Evaluación de la actividad enzimática por reconstitución de barrera dérmica
Se evaluó la actividad de F204P-PH20 y se comparó con rHuPH20 para medir la cantidad de tiempo requerida para que la barrera dérmica se reconstituya después de administración de hialuronidasa intradérmica. La reconstitución dérmica se evaluó comparando la duración de la actividad de propagación de hialuronidasa como se evalúa supervisando el área de difusión de Azul de Tripano 0,4 % a lo largo del tiempo. Las proteínas usadas en el estudio fueron variante de PH20 F204P purificada (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 12) y rHuPH20 de tipo silvestre (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1) que se formularon ambas en tampón de API (Histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5). Se usó vehículo (tampón de API) como un control. Se usaron ratones macho NCr nu/nu homocigotos en el estudio con tres animales por punto temporal para un total de quince ratones usados por grupo como se expone en la Tabla 29.
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Todos los ratones recibieron dos dosis intradérmicas de control de vehículo o rHuPH20 o F204P-PH20 a 100 U/ml en 0,04 ml en el tiempo de estudio 0. El mismo control o artículo de ensayo se inyectó en los laterales opuestos de cada animal (derecha, R; izquierda, L). Los sitios de inyección se marcaron con un marcador permanente. Se administró Tinción de Azul de Tripano (solución líquida 0,4 %; 15250, Invitrogen) a un volumen de 0,04 ml por inyección intradérmica en el mismo sitio de inyección a las 0,5, 1, 4, 24 y 48 horas después de la inyección del artículo de ensayo o control. A los 5 y 20 minutos después de la inyección de la Tinción con Azul de Tripano, se midió el área del colorante en el sitio de inyección por captura de imágenes digitales de la región como se ha descrito en el Ejemplo 14.
Los resultados se exponen en la Tabla 30. Los resultados muestran que cuando el área de dispersión de colorante se midió en diversos puntos temporales después de la administración del artículo de ensayo o control, hubo un aumento estadísticamente significativo en el área de dispersión de colorante a los 30 min y 1 hora después de la inyección de rHuPH20 o F204P-PH20. A las 4 horas después de la administración de las enzimas, sin embargo, no hubo un aumento estadísticamente significativo en el área de dispersión de colorante en comparación con el control. Además, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el área de dispersión de colorante entre los grupos de tratamiento de rHuPH20 y F204P-PH20. Por lo tanto, la duración de la actividad de propagación de rHuPH20 y F204P fue similar y muestra que rHuPH20 y F204P-PH20 tienen rendimiento in vivo comparable.
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Ejemplo 16
Farmacocinética in vivo de F204P-PH20 en comparación con rHuPH20
Se comparó la farmacocinética (PK) de rHuPH20 y F204P-PH20 después de administración intravenosa en la vena de la cola midiendo los niveles de hialuronidasa en plasma a lo largo del tiempo después de la administración. Las proteínas usadas en el estudio fueron la variante de PH20 F204P (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 12; concentración de lote 1,02 mg/ml) y rHuPH20 de tipo silvestre (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1; concentración de lote 0,95 mg/ml) formuladas en tampón de API (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5). Las proteínas se prepararon a una concentración de 0,087 mg/ml en tampón de API para un volumen de dosis de aproximadamente 5 ml. Se usó como control un animal al que no se le administró proteína (control pre-dosis). Se usaron cuarenta y dos (42) ratones macho CD-1 (-20-30 gramos) en un estudio con seis animales por grupo de tratamiento como se expone en la Tabla 31.
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Se administró a los ratones por vía intravenosa 0,433 mg/kg de rHuPH20 o F204P-PH20 por inyección en la vena de la cola. Se obtuvieron muestras sanguíneas de animales 1 minuto, 5 minutos y 10 minutos después de la administración. Se obtuvieron muestras sanguíneas por sangrado terminal (punción cardiaca) y se recogieron en tubos de recogida de sangre que contenían el anti-coagulante EDTA para la preparación de plasma. Las muestras de sangre se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos y el plasma se retiró y se congeló a -80 °C hasta la evaluación de la actividad hialuronidasa usando el ensayo de microturbidez descrito en el Ejemplo 8.
Los resultados se exponen en la Tabla 32. Los resultados muestran que la actividad hialuronidasa no se detecta en plasma antes del tratamiento con hialuronidasa. En 1 minuto después del tratamiento con hialuronidasa rHuPH20 o F204P-PH20, hay una cantidad detectablemente alta de actividad hialuronidasa presente en el plasma, que es similar entre ambos grupos de tratamiento. A lo largo del tiempo, la actividad hialuronidasa se reduce rápidamente para ambos grupos de tratamiento, aunque hay actividad hialuronidasa detectable presente en el plasma 10 minutos después de la administración. En los puntos temporales de 5 minutos y 10 minutos después de la administración, la actividad en el plasma en animales tratados con F204P-PH20 es mayor que en animales tratados con rHuPH20. Esto muestra que F204P-PH20 muestra actividad algo mayor durante un periodo de tiempo prolongado, y por lo tanto muestra mayor semivida in vivo que rHuPH20.
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Ya que resultarán evidentes para los expertos en la materia modificaciones, se pretende que la presente invención se limite solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de PH20 modificado, que comprende uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido de PH20 no modificado, donde:
el polipéptido de PH20 no modificado consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, 7 o 32-66;
el polipéptido de PH20 modificado muestra mayor actividad hialuronidasa que es al menos 120 % de la actividad hialuronidasa en comparación con el polipéptido de PH20 sin modificar que no contiene el reemplazo o reemplazos de aminoácidos;
el reemplazo de aminoácidos está en una posición correspondiente a una posición seleccionada de entre 1, 12, 15, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 39, 46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97, 118, 120, 127, 131, 135, 141, 142, 147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263, 269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 291, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359, 371, 377, 380, 389, 392, 395, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 y 447 en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican mediante alineación del polipéptido de PH20 con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, a condición de que si el polipéptido de PH20 modificado incluye solamente un único reemplazo de aminoácido, el reemplazo no corresponde al reemplazo de aminoácidos N219A en referencia a las posiciones a los aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3; y
el polipéptido de PH20 comprende hasta 10 reemplazos de aminoácidos en comparación con el polipéptido de PH20 sin modificar que no contiene el o los reemplazos.
2. El polipéptido de PH20 modificado de la reivindicación 1, donde el reemplazo de aminoácidos se selecciona de entre:
histidina (H) en una posición correspondiente a la posición 1; Q en una posición correspondiente a la posición 1; V en una posición correspondiente a la posición 15; E en una posición correspondiente a la posición 24; H en una posición correspondiente a la posición 24; K en una posición correspondiente a la posición 27; R en una posición correspondiente a la posición 27 E en una posición correspondiente a la posición 29 I en una posición correspondiente a la posición 29; L en una posición correspondiente a la posición 29; M en una posición correspondiente a la posición 29 P en una posición correspondiente a la posición 29; S en una posición correspondiente a la posición 29; V en una posición correspondiente a la posición 29; G en una posición correspondiente a la posición 30; H en una posición correspondiente a la posición 30; K en una posición correspondiente a la posición 30; M en una posición correspondiente a la posición 30; R en una posición correspondiente a la posición 30 S en una posición correspondiente a la posición 30; A en una posición correspondiente a la posición 31 C en una posición correspondiente a la posición 31; H en una posición correspondiente a la posición 31 I en una posición correspondiente a la posición 31; K en una posición correspondiente a la posición 31 L en una posición correspondiente a la posición 31; P en una posición correspondiente a la posición 31 R en una posición correspondiente a la posición 31; S en una posición correspondiente a la posición 31 T en una posición correspondiente a la posición 31; V en una posición correspondiente a la posición 31 F en una posición correspondiente a la posición 32; G en una posición correspondiente a la posición 32; H en una posición correspondiente a la posición 32; W en una posición correspondiente a la posición 33 F en una posición correspondiente a la posición 37; N en una posición correspondiente a la posición 39 T en una posición correspondiente a la posición 39; F en una posición correspondiente a la posición 48; H en una posición correspondiente a la posición 48; N en una posición correspondiente a la posición 48; W en una posición correspondiente a la posición 63; V en una posición correspondiente a la posición 67; A en una posición correspondiente a la posición 69; C en una posición correspondiente a la posición 69; F en una posición correspondiente a la posición 69; G en una posición correspondiente a la posición 69 I en una posición correspondiente a la posición 69; L en una posición correspondiente a la posición 69; M en una posición correspondiente a la posición 69; P en una posición correspondiente a la posición 69; R en una posición correspondiente a la posición 69; W en una posición correspondiente a la posición 69; Y en una posición correspondiente a la posición 69; R en una posición correspondiente a la posición 71 S en una posición correspondiente a la posición 71; M en una posición correspondiente a la posición 72; Q en una posición correspondiente a la posición 72; H en una posición correspondiente a la posición 73; L en una posición correspondiente a la posición 73; W en una posición correspondiente a la posición 73 F en una posición correspondiente a la posición 75; L en una posición correspondiente a la posición 75 R en una posición correspondiente a la posición 75; T en una posición correspondiente a la posición 75 C en una posición correspondiente a la posición 87; T en una posición correspondiente a la posición 87; Y en una posición correspondiente a la posición 87; C en una posición correspondiente a la posición 92 I en una posición correspondiente a la posición 93; L en una posición correspondiente a la posición 93 R en una posición correspondiente a la posición 93; T en una posición correspondiente a la posición 93; R en una posición correspondiente a la posición 94; Q en una posición correspondiente a la posición 118; F en una posición correspondiente a la posición 120 V en una posición correspondiente a la posición 120; Y en una posición correspondiente a la posición 120 D en una posición correspondiente a la posición 135 G en una posición correspondiente a la posición 135 R en una posición correspondiente a la posición 135 H en una posición correspondiente a la posición 141 Y en una posición correspondiente a la posición 141 R en una posición correspondiente a la posición 147 V en una posición correspondiente a la posición 147 K en una posición correspondiente a la posición 148 G en una posición correspondiente a la posición 150 K en una posición correspondiente a la posición 151 L en una posición correspondiente a la posición 151 M en una posición correspondiente a la posición 151 Q en una posición correspondiente a la posición 151 R en una posición correspondiente a la posición 151 R en una posición correspondiente a la posición 152 G en una posición correspondiente a la posición 155 K en una posición correspondiente a la posición 155 D en una posición correspondiente a la posición 156 A en una posición correspondiente a la posición 163 E en una posición correspondiente a la posición 163 K en una posición correspondiente a la posición 163 R en una posición correspondiente a la posición 163 M en una posición correspondiente a la posición 164 D en una posición correspondiente a la posición 165 N en una posición correspondiente a la posición 165 R en una posición correspondiente a la posición 170 D en una posición correspondiente a la posición 198 N en una posición correspondiente a la posición 212; M en una posición correspondiente a la posición 215 S en una posición correspondiente a la posición 219 K en una posición correspondiente a la posición 233; R en una posición correspondiente a la posición 233 R en una posición correspondiente a la posición 236 I en una posición correspondiente a la posición 247 T en una posición correspondiente a la posición 257 P en una posición correspondiente a la posición 259 Y en una posición correspondiente a la posición 260 K en una posición correspondiente a la posición 263 R en una posición correspondiente a la posición 263 A en una posición correspondiente a la posición 269 L en una posición correspondiente a la posición 271 M en una posición correspondiente a la posición 271 T en una posición correspondiente a la posición 272 D en una posición correspondiente a la posición 276 S en una posición correspondiente a la posición 276 Y en una posición correspondiente a la posición 276 H en una posición correspondiente a la posición 278 K en una posición correspondiente a la posición 278 N en una posición correspondiente a la posición 278 R en una posición correspondiente a la posición 278 S en una posición correspondiente a la posición 278 T en una posición correspondiente a la posición 278 Y en una posición correspondiente a la posición 278; M en una posición correspondiente a la posición 282 A en una posición correspondiente a la posición 293 C en una posición correspondiente a la posición 293 F en una posición correspondiente a la posición 293; M en una posición correspondiente a la posición 293 P en una posición correspondiente a la posición 293; Q en una posición correspondiente a la posición 293 V en una posición correspondiente a la posición 293; E en una posición correspondiente a la posición 305; G en una posición correspondiente a la posición 308 N en una posición correspondiente a la posición 308 K en una posición correspondiente a la posición 313 R en una posición correspondiente a la posición 313 H en una posición correspondiente a la posición 320 K en una posición correspondiente a la posición 320 R en una posición correspondiente a la posición 320 R en una posición correspondiente a la posición 324 A en una posición correspondiente a la posición 325 D en una posición correspondiente a la posición 325 E en una posición correspondiente a la posición 325; G en una posición correspondiente a la posición 325 H en una posición correspondiente a la posición 325; K en una posición correspondiente a la posición 325; M en una posición correspondiente a la posición 325; N en una posición correspondiente a la posición 325; Q en una posición correspondiente a la posición 325 S en una posición correspondiente a la posición 325 V en una posición correspondiente a la posición 326 I en una posición correspondiente a la posición 328; K en una posición correspondiente a la posición 328 L en una posición correspondiente a la posición 328 S en una posición correspondiente a la posición 328 Y en una posición correspondiente a la posición 328 V en una posición correspondiente a la posición 353 T en una posición correspondiente a la posición 359; R en una posición correspondiente a la posición 371 P en una posición correspondiente a la posición 377 T en una posición correspondiente a la posición 377; W en una posición correspondiente a la posición 380 Y en una posición correspondiente a la posición 380; K en una posición correspondiente a la posición 389; M en una posición correspondiente a la posición 392; R en una posición correspondiente a la posición 395; G en una posición correspondiente a la posición 405; A en una posición correspondiente a la posición 409; Q en una posición correspondiente a la posición 409 T en una posición correspondiente a la posición 410 P en una posición correspondiente a la posición 418 K en una posición correspondiente a la posición 425 K en una posición correspondiente a la posición 436 I en una posición correspondiente a la posición 437; M en una posición correspondiente a la posición 437 T en una posición correspondiente a la posición 438 F en una posición correspondiente a la posición 441 R en una posición correspondiente a la posición 442 A en una posición correspondiente a la posición 446; D en una posición correspondiente a la posición 447 N en una posición a la posición 447; y/o con Q en una posición correspondiente a la posición 447, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:3.
3. Un polipéptido de PH20 modificado de la reivindicación 1, donde el reemplazo de aminoácidos se selecciona de entre E en una posición correspondiente a la posición 12; E en una posición correspondiente a la posición 26; K en una posición correspondiente a la posición 26; R en una posición correspondiente a la posición 46; Q en una posición correspondiente a la posición 52; Q en una posición correspondiente a la posición 58; H en una posición correspondiente a la posición 68; Q en una posición correspondiente a la posición 68; A en una posición correspondiente a la posición 70; C en una posición correspondiente a la posición 70; F en una posición correspondiente a la posición 70; G en una posición correspondiente a la posición 70; H en una posición correspondiente a la posición 70; K en una posición correspondiente a la posición 70; L en una posición correspondiente a la posición 70; N en una posición correspondiente a la posición 70; P en una posición correspondiente a la posición 70; R en una posición correspondiente a la posición 70; S en una posición correspondiente a la posición 70; T en una posición correspondiente a la posición 70; A en una posición correspondiente a la posición 74; C en una posición correspondiente a la posición 74; G en una posición correspondiente a la posición 74; N en una posición correspondiente a la posición 74; P en una posición correspondiente a la posición 74; R en una posición correspondiente a la posición 74; S en una posición correspondiente a la posición 74; V en una posición correspondiente a la posición 74; W en una posición correspondiente a la posición 74; G en una posición correspondiente a la posición 84; R en una posición correspondiente a la posición 84; G en una posición correspondiente a la posición 97; H en una posición correspondiente a la posición 127 N en una posición correspondiente a la posición 127; G en una posición correspondiente a la posición 131 V en una posición correspondiente a la posición 131; R en una posición correspondiente a la posición 142 A en una posición correspondiente a la posición 166 F en una posición correspondiente a la posición 166 H en una posición correspondiente a la posición 166 L en una posición correspondiente a la posición 166 R en una posición correspondiente a la posición 166; Y en una posición correspondiente a la posición 166 K en una posición correspondiente a la posición 174; K en una posición correspondiente a la posición 206; M en una posición correspondiente a la posición 213; N en una posición correspondiente a la posición 213 S en una posición correspondiente a la posición 238; N en una posición correspondiente a la posición 261 R en una posición correspondiente a la posición 277; T en una posición correspondiente a la posición 277; L en una posición correspondiente a la posición 309; N en una posición correspondiente a la posición 309; Q en una posición correspondiente a la posición 309; R en una posición correspondiente a la posición 309; T en una posición correspondiente a la posición 309; A en una posición correspondiente a la posición 310; G en una posición correspondiente a la posición 310; H en una posición correspondiente a la posición 315; I en una posición correspondiente a la posición 317; K en una posición correspondiente a la posición 317 R en una posición correspondiente a la posición 317; M en una posición correspondiente a la posición 318 G en una posición correspondiente a la posición 347; S en una posición correspondiente a la posición 347; M en una posición correspondiente a la posición 399; T en una posición correspondiente a la posición 399; W en una posición correspondiente a la posición 399; D en una posición correspondiente a la posición 407; Q en una posición correspondiente a la posición 407; F en una posición correspondiente a la posición 419 I en una posición correspondiente a la posición 419; R en una posición correspondiente a la posición 419 S en una posición correspondiente a la posición 419; K en una posición correspondiente a la posición 421 N en una posición correspondiente a la posición 421; Q en una posición correspondiente a la posición 421 R en una posición correspondiente a la posición 421; S en una posición correspondiente a la posición 421 A en una posición correspondiente a la posición 431; H en una posición correspondiente a la posición 431 K en una posición correspondiente a la posición 431; Q en una posición correspondiente a la posición 431 R en una posición correspondiente a la posición 431; S en una posición correspondiente a la posición 431 V en una posición correspondiente a la posición 431 L en una posición correspondiente a la posición 433; R en una posición correspondiente a la posición 433; V en una posición correspondiente a la posición 439; H en una posición correspondiente a la posición 440; R en una posición correspondiente a la posición 440; A en una posición correspondiente a la posición 443; M en una posición correspondiente a la posición 443; M en una posición correspondiente a la posición 445; y/o con P en una posición correspondiente a la posición 445, en referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:3.
4. Un polipéptido de PH20 modificado de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 73, 78, 91, 95, 96, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 123-126, 128-136, 139-141, 149, 154, 155, 164, 165, 167, 191, 192, 196, 197, 199-205, 207, 208, 225, 226, 228, 229, 231,233, 237, 253, 254, 256, 257, 277, 283, 293, 295, 296, 298, 300, 303, 316, 318, 321,322, 338-340, 344, 348, 367, 369, 371,377, 384-388, 394, 398, 399, 401,406-408, 410, 412, 414, 416, 431,448, 459, 465, 469, 478, 479, 482, 493, 497, 501,503, 507, 508, 510-512, 514, 518, 522, 523, 537-543, 545, 558, 559, 561,563-566, 569, 572, 574, 594, 596, 618-620, 624-634, 637, 640-644, 652, 657, 675, 695, 698, 699, 700, 712, 717, 725, 738, 748-750, 757, 775, 799-801,807, 822, 825, 844, 847, 851 y 853, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 96 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 73, 78, 91, 95, 96, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 123-126, 128-136, 139-141, 149, 154, 155, 164, 165, 167, 191, 192, 196, 197, 199-205, 207, 208,225, 226, 228, 229, 231,233, 237, 253, 254, 256, 257, 277, 283, 293, 295, 296, 298, 300, 303, 316, 318, 321,322, 338-340, 344, 348, 367, 369, 371,377, 384-388, 394, 398, 399, 401,406­ 408, 410, 412, 414, 416, 431,448, 459, 465, 469, 478, 479, 482, 493, 497, 501,503, 507, 508, 510-512, 514, 518, 522, 523, 537-543, 545, 558, 559, 561, 563-566, 569, 572, 574, 594, 596, 618-620, 624-634, 637, 640-644, 652, 657, 675, 695, 698, 699, 700, 712, 717, 725, 738, 748-750, 757, 775, 799-801, 807, 822, 825, 844, 847, 851 y 853 y que contiene el reemplazo de aminoácidos en comparación con las posiciones correspondientes en un polipéptido de cualquiera de SEQ ID NO: 3, 7 y 32-66.
5. El polipéptido de PH20 modificado de la reivindicación 3, que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 86, 89, 99, 100, 159, 173, 181, 193, 195, 209-220, 238, 239, 242, 247-252, 267, 269, 277, 308, 324, 325, 330, 335, 355, 419, 421-423, 425, 428, 435, 455, 456, 462, 463, 484, 490, 506, 531,533, 579, 581-583, 585, 587, 588, 602, 605, 606, 609, 613, 648, 731,732, 734, 742, 746, 760, 762, 764, 765, 769-773, 779, 782, 783, 786-789, 794, 795, 814, 816, 819, 826, 830, 836 y 838, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 96 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de 86, 89, 99, 100, 159, 173, 181, 193 , 195, 209-220, 238, 239, 247-252, 267, 269, 277, 308, 324, 325, 330, 335 , 355, 419, 421- 423, 428, 435, 455, 456, 462, 463, 484, 490, 506, 531,533, 579, 581- 583, 585, 587, 588, 602 605, 606, 609, 613, 731,732, 734, 742, 746, 760, 762, 764, 765, 769-773, 779, 782, 783 786-789, 794, 795 814, 816, 819, 826 , 830 838 y que contiene el reemplazo de aminoácidos en comparación con las posiciones correspondientes en un polipéptido de cualquiera de SEQ ID NO: 3, 7 y 32-66.
6. El polipéptido de PH20 modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que muestra al menos el doble de la actividad hialuronidasa en comparación con el polipéptido de PH20 que no contiene el reemplazo o reemplazos de aminoácidos.
7. El polipéptido de PH20 modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende uno o más de una modificación seleccionada de entre glucosilación, sialación, albuminación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación y fosforilación.
8. El polipéptido de PH20 modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que comprende al menos un resto de N-acetilglucosamina unido con cada uno de al menos tres restos de asparagina (N).
9. El polipéptido de PH20 modificado de la reivindicación 8, donde los tres restos de asparagina corresponden a los restos de aminoácidos 200, 333 y 358 de SEQ ID NO: 3.
10. El polipéptido de PH20 modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que está conjugado con un polímero.
11. El polipéptido de PH20 modificado de la reivindicación 10, donde el polímero es dextrano o PEG.
12. Una molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido de PH20 modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. Un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12.
14. Una célula aislada, que comprende el vector de la reivindicación 13.
15. Un método para producir un polipéptido de PH20 modificado, que comprende:
introducir la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12 en una célula capaz de incorporar restos de azúcares ligados a N en el polipéptido;
cultivar la célula en condiciones en las que un polipéptido de PH20 modificado codificado se produce y secreta por la célula; y
recuperar el polipéptido expresado.
16. Una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido de PH20 modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16 para su uso para tratar una enfermedad o trastorno seleccionado de uno que implica acumulación de glucosaminoglucanos en el cerebro; un trastorno cardiovascular; un trastorno oftálmico; y enfermedad pulmonar.
18. La composición farmacéutica de la reivindicación 16 para su uso para tratar un tumor.
19. La composición farmacéutica de la reivindicación 16 para suministrar un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de un tumor; para su uso en el tratamiento de la acumulación de glucosaminoglucanos en el cerebro; para su uso en el tratamiento de un trastorno cardiovascular; para su uso en el tratamiento de un trastorno oftálmico; o para su uso en tratamiento de una enfermedad pulmonar.
20. La composición farmacéutica de la reivindicación 16 para aumentar la penetración de agentes terapéuticos en tumores sólidos o para aumentar la biodisponibilidad de agentes terapéuticos para su uso en el tratamiento de un tumor; para su uso en el tratamiento de la acumulación de glucosaminoglucanos en el cerebro; para su uso en el tratamiento de un trastorno cardiovascular; para su uso en el tratamiento de un trastorno oftálmico; o para su uso en el tratamiento de enfermedad pulmonar.
21. El polipéptido modificado de la reivindicación 11 para su uso para tratar un tumor; donde el polipéptido de PH20 modificado se conjuga con PEG.
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