CN104244968A - Ph20多肽变体、配制物及其应用 - Google Patents

Ph20多肽变体、配制物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了修饰的PH20透明质酸酶多肽，包括呈现出增加的稳定性和/或增加的活性的修饰的多肽。本发明还提供了组合物和配制物及其应用。

Description

PH20多肽变体、配制物及其应用
相关申请
要求各自名称为“PH20多肽变体、配制物及其应用”的2011年12月30日申请的美国临时申请号61/631,313和2012年11月1日申请的美国临时申请号61/796,208的优先权。
本申请与同日申请的名称为“PH20多肽变体、配制物及其应用”的美国申请系列号13/684,731相关，该美国申请要求美国临时申请号61/631,313和美国临时申请号61/796,208的优先权。
当允许时，每个上述相关申请的主题全文并入本文。
电子提交的序列表并入参考
电子版本序列表在此提交，其内容全文并入本文。2012年12月28日创建的电子文件大小为3.48MB，名称为3087seqPC1.txt。
发明领域
本发明提供了修饰的PH20透明质酸酶多肽，包括呈现增加的稳定性和/或增加的活性的修饰多肽。本发明还提供了其组合物和配制物及应用。
背景
乙酰透明质酸(透明质酸，HA)是在许多细胞的胞外基质、特别是软结缔组织中发现的一种多肽。HA也主要在哺乳动物的皮肤、软骨及在滑液中发现。乙酰透明质酸也是眼玻璃体的主要成分。HA在多个生理学过程中起作用，如在水和血浆蛋白质稳态中起作用(Laurent TC et al.(1992)FASEB J 6:2397-2404)。某些疾病与乙酰透明质酸的表达和/或产生相关。乙酰透明质酸降解酶如透明质酸酶是降解乙酰透明质酸的酶。通过催化HA降解，乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)可用于治疗与HA或其它糖胺聚糖的积聚相关的疾病或病症。由于HA也是间隙屏障的主要成分，因此乙酰透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)增加组织通透性，并因此可用于增加治疗剂的扩散和输送。许多透明质酸酶已经治疗性应用(例如HydaseTM、VitraseTM和WydaseTM)，典型作为分散和传播剂与其它治疗剂组合。许多这些透明质酸酶是羊或牛形式，其可以是免疫原性的以治疗人。因此需要可用于治疗的改良的乙酰透明质酸降解酶如透明质酸酶及其组合物。
发明概述
本发明提供了修饰的PH20多肽，其与不具有修饰的PH20多肽相比具有改变的性质。所述修饰包括氨基酸置换、缺失和/或插入。本发明提供了每个氨基酸在PH20多肽中的实际的详细结构/功能，以及提供了有助于在特定条件下改变性质如稳定性的残基和基因座的鉴别。因此，本发明提供了修饰的PH20多肽，其含有一或多个氨基酸置换，获得在多种条件下保留活性和/或呈现增加或改变的稳定性的PH20多肽。活性保留可例如是透明质酸酶活性，其是不包含所述置换的PH20多肽活性的至少大约40％或更多。举例的修饰是氨基酸置换。对于本发明，氨基酸置换是用一个氨基酸字母后接其中发生置换的SEQ ID NO:3的相应氨基酸位置而表示的。氨基酸残基的一个氨基酸缩写为本领域技术人员熟知(见例如表1)，并用于本发明的描述和实施例中。例如，在参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的PH20多肽中相应于位置204的位置用P置换是指所述置换涵盖SEQ IDNO:3所示PH20多肽中F204P或者在另一PH20多肽中相应位置的相同置换。
本发明提供了修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中含有至少一个氨基酸置换，其中修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比呈现增加的稳定性。增加的稳定性可以根据对使蛋白质变性的一或多种蛋白质条件的抗性增加而证明。在相同条件下对比修饰的与未修饰的PH20的稳定性。举例的蛋白质变性(或者使之变性，在本文可互换使用)条件包括但不限于高于30℃或大约30℃的提高的温度、搅拌、低盐包括基本上或实质上或者无盐，以及存在趋于变性蛋白质的赋形剂。举例的这种赋形剂是抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填剂和稀释剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、去污剂、吸附剂及其组合。
修饰的PH20多肽可以是这样的多肽，其中其未修饰形式具有与SEQ IDNO:3至少大约68％的序列相同性并进一步含有改变稳定性的修饰和/或可以是与PH20相比包含多如直至100、110、120、130、150个氨基酸差异但是仍保留未修饰的PH20多肽的酶活性特别是至少大约40％活性并呈现增加的稳定性如在变性条件下的稳定性的PH20多肽。因此，本发明包括修饰的PH20多肽，其与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少68％或大约68％的氨基酸序列相同性。本发明包括修饰的PH20多肽，其与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列相同性。举例的这种修饰的PH20多肽是在PH20多肽中含有氨基酸置换的多肽，其含有SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、870任一所示氨基酸残基序列或者与SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861或870任一序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。
例如，本发明提供了呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中含有赋予增加的稳定性的氨基酸置换，其中增加的稳定性是根据在存在一或多种蛋白质变性条件下对变性的抗性增加而证明，与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比稳定性增加，及未修饰的PH20多肽由SEQ IDNOS:7所示氨基酸序列组成或者是可溶的PH20多肽的其C-末端截短的片段或者与其具有至少85％序列相同性。如上所述，呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽呈现出对变性条件的增加的稳定性，所述变性条件是高于或大约30℃的温度、搅拌、低盐或无盐、或者存在赋形剂或变性剂如抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填剂和稀释剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、去污剂、吸附剂或甜味剂及其组合，特别是防腐剂。在呈现增加的稳定性的这种修饰的PH20多肽的一些实例中，变性条件是温度高于30℃，及修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20多肽相比在所述温度呈现出较高的透明质酸酶活性，其中所述活性是在相同条件下对比的。在其它实例中，蛋白质变性条件是存在低于100mM的低浓度盐，及修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20多肽相比在存在低浓度盐条件下呈现增加的透明质酸酶活性，其中所述活性在相同条件下对比。
在呈现增加的稳定性的任何上述修饰的PH20多肽的实例中，稳定性可以基于多种参数评定，包括透明质酸酶活性、溶解性、聚集性和/或结晶化。稳定性可以在存在变性条件下评定。当对比两或更多个多肽的稳定性时，在相同条件下评定稳定性。在一些情况中，在本发明提供的PH20多肽中，修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的透明质酸酶活性相比呈现至少120％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％或更高的透明质酸酶活性。
在呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽的任何上述实例中，变性条件包括存在使蛋白质变性的赋形剂。举例的这种条件是存在防腐剂如酚类防腐剂。本发明提供了修饰的PH20多肽，其在存在抗微生物有效量的一或多种酚类防腐剂的条件下呈现增加的稳定性。抗微生物有效量是一或多种酚类防腐剂的总量，其可以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，是或者在(或者是至少大约或是大约)0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％之间，包括端点。举例的酚类防腐剂包括但不限于苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、间甲酚、苯酚或者间甲酚和苯酚。举例的通过提供的修饰的PH20多肽实现的稳定性是与修饰的PH20多肽在不存在防腐剂的条件下相比在存在防腐剂条件下呈现至少15％或大约15％的透明质酸酶活性至少4小时的那些。活性是在除了存在防腐剂之外的相同条件下对比。例如，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在存在酚类防腐剂条件下与不存在相同防腐剂条件下相比呈现至少(或者至少大约)16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的透明质酸酶活性。因此，本发明提供了PH20多肽，在本发明提供的修饰的PH20多肽之中，其由于氨基酸置换而与不具有这种置换的PH20多肽相比是亲酚性的(phenophilic)。本发明包括修饰的PH20多肽，其中所述透明质酸酶活性与修饰的PH20多肽在不存在防腐剂条件下在相同时间及在除了存在防腐剂之外的相同条件下的透明质酸酶活性相比呈现至少5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周或更长时间。
在呈现对酚类防腐剂增加的稳定性的修饰的PH20多肽的实例中，在酚类防腐剂中增加的稳定性可以在温度条件下呈现，所述温度条件包括在例如0℃-40℃如在或大约在0℃-40℃、2℃-6℃、24℃-32℃及35℃-40℃之间的任何温度。例如多肽在或在大约30℃-45℃、35℃-45℃、30℃-37℃、35℃-37℃或37℃-42℃之间的温度呈现增加的稳定性。特别修饰的PH20多肽和条件依赖于指定配制物、所述配制物暴露于的条件和/或指定应用。
特别的及举例的呈现增加的稳定性如对于酚类防腐剂增加的稳定性的修饰的PH20多肽包括含有一个氨基酸修饰如置换及如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个修饰的修饰组合的那些多肽。这些包括修饰的PH20多肽，其含有一或多个氨基酸置换，其中至少一个置换是在相应于(即通过排列对比)选自如下位置的氨基酸位置的置换，所述如下位置参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置：10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443或445，其中相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的。举例的这种修饰是在选自如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置用如下氨基酸置换的至少一个氨基酸置换：在相应于位置10的位置用甘氨酸(G)；在相应于位置12的位置用K；在相应于位置20的位置用S；在相应于位置22的位置用T；在相应于位置26的位置用M；在相应于位置34的位置用W；在相应于位置36的位置用N；在相应于位置46的位置用L；在相应于位置50的位置用M；在相应于位置52的位置用T；在相应于位置52的位置用S；在相应于位置58的位置用C；在相应于位置58的位置用K；在相应于位置58的位置用R；在相应于位置58的位置用N；在相应于位置58的位置用Y；在相应于位置58的位置用P；在相应于位置58的位置用H；在相应于位置68的位置用P；在相应于位置70的位置用V；在相应于位置74的位置用E；在相应于位置82的位置用L；在相应于位置82的位置用N；在相应于位置83的位置用V；在相应于位置83的位置用Q；在相应于位置83的位置用S；在相应于位置83的位置用G；在相应于位置84的位置用N；在相应于位置86的位置用A；在相应于位置86的位置用K；在相应于位置97的位置用E；在相应于位置97的位置用L；在相应于位置127的位置用R；在相应于位置131的位置用R；在相应于位置138的位置用L；在相应于位置142的位置用K；在相应于位置142的位置用N；在相应于位置142的位置用P；在相应于位置142的位置用S；在相应于位置142的位置用T；在相应于位置143的位置用G；在相应于位置143的位置用K；在相应于位置144的位置用T；在相应于位置166的位置用Q；在相应于位置166的位置用T；在相应于位置169的位置用L；在相应于位置174的位置用G；在相应于位置174的位置用N；在相应于位置193的位置用Q；在相应于位置195的位置用T；在相应于位置195的位置用N；在相应于位置196的位置用E；在相应于位置196的位置用R；在相应于位置204的位置用P；在相应于位置205的位置用A；在相应于位置205的位置用E；在相应于位置206的位置用I；在相应于位置213的位置用A；在相应于位置219的位置用I；在相应于位置234的位置用M；在相应于位置237的位置用T；在相应于位置238的位置用H；在相应于位置240的位置用Q；在相应于位置249的位置用V；在相应于位置261的位置用A；在相应于位置261的位置用K；在相应于位置267的位置用T；在相应于位置277的位置用K；在相应于位置279的位置用H；在相应于位置279的位置用V；在相应于位置291的位置用V；在相应于位置309的位置用E；在相应于位置310的位置用Q；在相应于位置314的位置用Y；在相应于位置315的位置用Y；在相应于位置317的位置用N；在相应于位置317的位置用W；在相应于位置318的位置用D；在相应于于位置347的位置用G；在相应于位置367的位置用A；在相应于位置375的位置用R；在相应于位置376的位置用R；在相应于位置399的位置用V；在相应于位置401的位置用E；在相应于位置407的位置用A；在相应于位置416的位置用L；在相应于位置419的位置用K；在相应于位置421的位置用H；在相应于位置431的位置用E；在相应于位置433的位置用T；在相应于位置433的位置用V；在相应于位置439的位置用C；在相应于位置440的位置用P；在相应于位置443的位置用G；在相应于位置445的位置用N。例如，修饰的PH20多肽可含有选自在如下相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置用如下氨基酸置换的至少一个氨基酸置换：在相应于位置52的位置用T，在相应于位置58的位置用K，在相应于位置58的位置用R，在相应于位置68的位置用P，在相应于位置83的位置用V，在相应于位置204的位置用P，在相应于位置261的位置用A，在相应于位置267的位置用T，在相应于位置277的位置用K及在相应于位置421的位置用H。举例的修饰的PH20多肽是在PH20多肽中参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置相应于位置204的位置包括P(或者其保守氨基酸)的多肽。
因此，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中含有赋予增加稳定性的氨基酸置换，在存在酚类防腐剂条件下呈现增加的稳定性，其中稳定性与无所述氨基酸置换的未修饰的多肽相比是增加的，及所述未修饰的PH20多肽具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或者是其C-末端截短片段，其是可溶的PH20多肽或者与其具有至少85％序列相同性。例如，未修饰的PH20多肽是可溶的PH20多肽，其具有SEQ ID NO:3或32-66任一所示氨基酸序列。在特别的实例中，所述修饰的PH20多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％序列相同性。在修饰的PH20多肽的任何这样的实例中，所述多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75或更多个氨基酸置换。在本发明的实例中，修饰的PH20多肽是人PH20。
修饰的PH20多肽在存在酚类防腐剂条件下呈现出稳定性，与不存在酚类防腐剂条件下透明质酸酶活性相比其在存在防腐剂条件下呈现至少4小时的至少15％的透明质酸酶活性，其中所述活性是在除了存在酚类防腐剂之外的相同条件下对比的。在任何上述实例中，修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量的一或多种酚类防腐剂条件下是稳定的，如一或多种酚类防腐剂的总量以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，为或者大约为0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％，包括端点。所述酚类防腐剂可以是苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇或者对羟基苯甲酸酯如间甲酚、苯酚，或者间甲酚和苯酚。所述氨基酸置换可以在参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的氨基酸残基204、58、10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443或445，其中相应氨基酸位置是通过将所述PH20肽与SEQ ID NO:3所示多肽排列对比而鉴别的。例如，参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置，所述氨基酸置换是在相应于位置10的位置的G；在相应于位置12的位置的K；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置22的位置的T；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置36的位置的N；在相应于位置46的位置的L；在相应于位置50的位置的M；在相应于位52置的位置的T；在相应于位置52的位置的S；在相应于位置58的位置的C；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的R；在相应于位置58的位置的N；在相应于位置58的位置的Y；在相应于位置58的位置的P；在相应于位置58的位置的H；在相应于位置68的位置的P；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置74的位置的E；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置82的位置的N；在相应于位置83的位置的V；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置83的位置的S；在相应于位置83的位置的G；在相应于位置84的位置的N；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置86的位置的K；在相应于位置97的位置的E；在相应于位置97的位置的L；在相应于位置127的位置的R；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置138的位置的L；在相应于位置142的位置的K；在相应于位置142的位置的N；在相应于位置142的位置的P；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的G；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置144的位置的T；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置195的位置的N；在相应于位置196的位置的E；在相应于位置196的位置的R；在相应于位置204的位置的P；在相应于位置205的位置的A；在相应于位置205的位置的E；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置238的位置的H；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置249的位置的V；在相应于位置261的位置的A；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置279的位置的H；在相应于位置279的位置的V；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置310的位置的Q；在相应于位置314的位置的Y；在相应于位置315的位置的Y；在相应于位置317的位置的N；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的D；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置375的位置的R；在相应于位置376的位置的R；在相应于位置399的位置的V；在相应于位置401的位置的E；在相应于位置407的位置的A；在相应于位置416的位置的L；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置431的位置的E；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置439的位置的C；在相应于位置440的位置的P；在相应于位置443的位置的G；或者在相应于位置445的位置的N。特别地，参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置，所述氨基酸置换是在相应于位置52的位置的T，在相应于位置58的位置的K，在相应于位置58的位置的R，在相应于位置68的位置的P，在相应于位置83的位置的V，在相应于位置204的位置的P，在相应于位置261的位置的A，在相应于位置267的位置的T，在相应于位置277的位置的K或者在相应于位置421的位置的H，如在相应于位置204的位置的P或者在相应于位置58的位置的R的置换。呈现出对酚类防腐剂增加的稳定性的修饰的PH20多肽可以是基本上纯化的或分离的。呈现出对酚类防腐剂增加的稳定性的修饰的PH20多肽可以通过糖基化、唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟化和磷酸化而修饰，通常是糖基化的，其中所述多肽包含与至少三个天冬酰胺(N)残基如在相应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基200、333和358的氨基酸残基的每一个连接的至少一个N-乙酰葡糖胺部分。呈现出对酚类防腐剂增加的稳定性的修饰的PH20多肽可以与聚合物如PEG或葡聚糖缀合和/或可以与是多聚化结构域、毒素、可检测标记或药物的部分缀合。
在本发明提供的呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽中，其是与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比在升高的温度下呈现增加的透明质酸酶活性，如与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比，至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％或更高的透明质酸酶活性至少4小时。所述多肽也是呈现活性的那些多肽、但是也是在升高的温度典型呈现增加的稳定性或其他性质的那些多肽，如与修饰的PH20多肽在或大约在2℃-8℃温度的透明质酸酶活性相比，在或大约在32℃-37℃温度呈现至少95％、96％、97％、98％、99％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％的透明质酸酶活性至少4小时的修饰的PH20多肽，其中活性是在除了温度不同之外的相同条件下对比的。所述透明质酸酶活性与修饰的PH20多肽在或在大约2℃-8℃温度的透明质酸酶活性相比，在或在大约32℃-37℃的升高的温度在至少5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周或更长时间之后呈现，其中活性在除了温度不同之外的相同条件下比较相同时间。举例的这种修饰的多肽是在相应于选自如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的氨基酸位置含有至少一个氨基酸置换的那些多肽：1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439和443，其中相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的。举例的突变包括例如参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置在相应于位置1的位置用R置换；在相应于位置11的位置用S；在相应于位置12的位置用I；在相应于位置14的位置用V；在相应于位置20的位置用S；在相应于位置26的位置用M；在相应于位置29的位置用R；在相应于位置34的位置用W；在相应于位置50的位置用M；在相应于位置58的位置用K；在相应于位置58的位置用Q；在相应于位置58的位置用Q；在相应于位置70的位置用V；在相应于位置82的位置用L；在相应于位置83的位置用Q；在相应于位置84的位置用R；在相应于位置86的位置用A；在相应于位置87的位置用S；在相应于位置140的位置用K；在相应于位置142的位置用S；在相应于位置142的位置用T；在相应于位置143的位置用K；在相应于位置147的位置用S；在相应于位置152的位置用T；在相应于位置166的位置用T；在相应于位置167的位置用D；在相应于位置172的位置用A；在相应于位置174的位置用G；在相应于位置174的位置用N；在相应于位置178的位置用R；在相应于位置193的位置用Q；在相应于位置195的位置用T；在相应于位置206的位置用I；在相应于位置212的位置用S；在相应于位置213的位置用A；在相应于位置219的位置用I；在相应于位置233的位置用G；在相应于位置237的位置用T；在相应于位置240的位置用A；在相应于位置240的位置用Q；在相应于位置267的位置用T；在相应于位置277的位置用E；在相应于位置291的位置用S；在相应于位置292的位置用H；在相应于位置292的位置用V；在相应于位置309的位置用S；在相应于位置313的位置用H；在相应于位置314的位置用S；在相应于位置317的位置用I；在相应于位置317的位置用T；在相应于位置317的位置用W；在相应于位置318的位置用R；在相应于位置347的位置用G；在相应于位置367的位置用A；在相应于位置368的位置用R；在相应于位置371的位置用S；在相应于位置374的位置用P；在相应于位置389的位置用A；在相应于位置392的位置用V；在相应于位置395的位置用A；在相应于位置396的位置用H；在相应于位置406的位置用N；在相应于位置419的位置用H；在相应于位置419的位置用K；在相应于位置421的位置用R；在相应于位置421的位置用S；在相应于位置439的位置用A；在相应于位置439的位置用C；及在相应于位置443的位置用G。在本发明提供的特殊实例中，任何这种修饰的PH20多肽含有一个氨基酸修饰如置换及如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个修饰的修饰组合。所述修饰如置换可以在未修饰的PH20多肽中，其具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或者是其C-末端截短的片段，其是可溶的PH20多肽，如SEQ ID NO:3或32-66任一所示，或者与其具有至少85％序列相同性。例如，任何这种修饰的PH20多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％序列相同性。
本发明还提供了修饰的PH20多肽，其在低盐条件下呈现增加的稳定性，所述低盐条件如低于100mM的NaCl浓度，例如但不限于低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更低的NaCl浓度。在修饰的PH20多肽中，与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比，其在低浓度盐条件下呈现增加的透明质酸酶活性。这种活性包括例如与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比至少高于100％、或者至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％或更高的透明质酸酶活性。举例的这种修饰的PH20多肽是在低浓度盐条件如在或大约在10mMNaCl-100mM NaCl(包括端点)(或者相应浓度其它盐或盐混合物)条件下与在150mM NaCl中修饰的PH20多肽的透明质酸酶活性相比呈现至少60％透明质酸酶活性的那些多肽，其中活性是在除了盐浓度不同之外的相同条件下对比的。在本发明提供的特殊实例中，任何这种修饰的PH20多肽含有一个氨基酸修饰如置换及如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100和更多个修饰的修饰组合。所述修饰如置换可以在未修饰的PH20多肽中，其具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或者是其C-末端截短的片段，其是可溶的PH20多肽，如SEQ ID NO:3或32-66任一所示，或者与其具有至少85％序列相同性。例如，任何这种修饰的PH20多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％序列相同性。
本发明还提供了修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中含有至少一个氨基酸置换，其中修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比呈现增加的透明质酸酶活性。当对比多肽活性时，在相同条件下对比活性。这些是这样的多肽，其中未修饰的PH20与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列呈现至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列相同性，或者所得修饰的PH20与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列呈现出这种序列相同性。举例的这种修饰的PH20多肽是在SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69或72所示氨基酸序列中含有氨基酸置换的任何多肽，或者含有与SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69或72至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列的任何多肽。所述氨基酸置换也可以在SEQ IDNO:857、859、861或870所示氨基酸序列中进行，或者在与SEQ ID NO:857、859、861或870任一至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列中进行。特别地，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72所示氨基酸序列中含有氨基酸置换。在修饰的PH20多肽中，其是呈现不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的透明质酸酶活性的至少120％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％或更高的那些多肽。活性可以在任何温度评定，特别是当透明质酸酶暴露于在或大约在2℃-8℃的温度时存在这种活性。这些修饰的PH20多肽在参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置时相应于选自如下位置的氨基酸位置含有至少一个氨基酸置换：1、12、15、24、26、27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446和447，其中相应氨基酸位置通过排列对比PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别。举例的修饰包括参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置选自如下置换的至少一个氨基酸置换：在相应于位置1的位置的组氨酸(H)；在相应于位置1的位置的Q；在相应于位置12的位置的E；在相应于位置12的位置的T；在相应于位置15的位置的V；在相应于位置24的位置的E；在相应于位置24的位置的H；在相应于位置26的位置的E；在相应于位置26的位置的K；在相应于位置27的位置的K；在相应于位置27的位置的R；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置29的位置的I；在相应于位置29的位置的L；在相应于位置29的位置的M；在相应于位置29的位置的P；在相应于位置29的位置的S；在相应于位置29的位置的V；在相应于位置30的位置的G；在相应于位置30的位置的H；在相应于位置30的位置的K；在相应于位置30的位置的M；在相应于位置30的位置的R；在相应于位置30的位置的S；在相应于位置的位置31的A；在相应于位置31的位置的C；在相应于位置31的位置的H；在相应于位置31的位置的I；在相应于位置31的位置的K；在相应于位置31的位置的L；在相应于位置31的位置的P；在相应于位置31的位置的R；在相应于位置31的位置的S；在相应于位置31的位置的T；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置32的位置的F；在相应于位置32的位置的G；在相应于位置32的位置的H；在相应于位置33的位置的W；在相应于位置37的位置的F；在相应于位置39的位置的N；在相应于位置39的位置的T；在相应于位置46的位置的R；在相应于位置48的位置的F；在相应于位置48的位置的H；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置52的位置的Q；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置63的位置的W；在相应于位置67的位置的V；在相应于位置68的位置的H；在相应于位置68的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的C；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的I；在相应于位置69的位置的L；在相应于位置69的位置的M；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置69的位置的W；在相应于位置69的位置的Y；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的C；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的K；在相应于位置70的位置的L；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的P；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的S；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置71的位置的R；在相应于位置71的位置的S；在相应于位置72的位置的M；在相应于位置72的位置的Q；在相应于位置73的位置的H；在相应于位置73的位置的L；在相应于位置73的位置的W；在相应于位置74的位置的A；在相应于位置74的位置的C；在相应于位置74的位置的G；在相应于位置74的位置的N；在相应于位置74的位置的P；在相应于位置74的位置的R；在相应于位置74的位置的S；在相应于位置74的位置的V；在相应于位置74的位置的W；在相应于位置75的位置的F；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的R；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置84的位置的R；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置87的位置的C；在相应于位置87的位置的T；在相应于位置87的位置的Y；在相应于位置92的位置的C；在相应于位置93的位置的I；在相应于位置93的位置的L；在相应于位置93的位置的R；在相应于位置93的位置的T；在相应于位置94的位置的R；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置118的位置的Q；在相应于位置120的位置的F；在相应于位置120的位置的V；在相应于位置120的位置的Y；在相应于位置127的位置的H；在相应于位置127的位置的N；在相应于位置131的位置的G；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置131的位置的V；在相应于位置135的位置的D；在相应于位置135的位置的G；在相应于位置135的位置的R；在相应于位置141的位置的H；在相应于位置141的位置的Y；在相应于位置142的位置的R；在相应于位置147的位置的R；在相应于位置147的位置的V；在相应于位置148的位置的K；在相应于位置150的位置的G；在相应于位置151的位置的K；在相应于位置151的位置的L；在相应于位置151的位置的M；在相应于位置151的位置的Q；在相应于位置151的位置的R；在相应于位置152的位置的R；在相应于位置155的位置的G；在相应于位置155的位置的K；在相应于位置156的位置的D；在相应于位置163的位置的A；在相应于位置163的位置的E；在相应于位置163的位置的K；在相应于位置163的位置的R；在相应于位置164的位置的M；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置165的位置的N；在相应于位置166的位置的A；在相应于位置166的位置的F；在相应于位置166的位置的H；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置166的位置的Y；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置170的位置的R；在相应于位置174的位置的K；在相应于位置198的位置的D；在相应于位置206的位置的K；在相应于位置206的位置的L；在相应于位置212的位置的N；在相应于位置213的位置的M；在相应于位置213的位置的N；在相应于位置215的位置的M；在相应于位置219的位置的S；在相应于位置233的位置的K；在相应于位置233的位置的R；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置236的位置的R；在相应于位置237的位置的E；在相应于位置238的位置的S；在相应于位置247的位置的I；在相应于位置257的位置的T；在相应于位置259的位置的P；在相应于位置260的位置的Y；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置261的位置的N；在相应于位置263的位置的K；在相应于位置263的位置的R；在相应于位置269的位置的A；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置271的位置的M；在相应于位置272的位置的T；在相应于位置276的位置的D；在相应于位置276的位置的S；在相应于位置276的位置的Y；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置277的位置的R；在相应于位置277的位置的T；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的K；在相应于位置278的位置的N；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置278的位置的S；在相应于位置278的位置的T；在相应于位置278的位置的Y；在相应于位置282的位置的M；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置293的位置的A；在相应于位置293的位置的C；在相应于位置293的位置的F；在相应于位置293的位置的M；在相应于位置293的位置的P；在相应于位置293的位置的Q；在相应于位置293的位置的V；在相应于位置305的位置的E；在相应于位置308的位置的G；在相应于位置308的位置的N；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置309的位置的L；在相应于位置309的位置的N；在相应于位置309的位置的Q；在相应于位置309的位置的R；在相应于位置309的位置的T；在相应于位置310的位置的A；在相应于位置310的位置的G；在相应于位置313的位置的K；在相应于位置313的位置的R；在相应于位置315的位置的H；在相应于位置317的位置的I；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置317的位置的R；在相应于位置318的位置的M；在相应于位置320的位置的H；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置320的位置的R；在相应于位置324的位置的R；在相应于位置325的位置的A；在相应于位置325的位置的D；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的H；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的M；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；在相应于位置325的位置的S；在相应于位置326的位置的V；在相应于位置328的位置的I；在相应于位置328的位置的K；在相应于位置328的位置的L；在相应于位置328的位置的S；在相应于位置328的位置的Y；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置347的位置的S；在相应于位置353的位置的V；在相应于位置359的位置的T；在相应于位置371的位置的R；在相应于位置377的位置的P；在相应于位置377的位置的T；在相应于位置380的位置的W；在相应于位置380的位置的Y；在相应于位389置的位置的K；在相应于位置392的位置的M；在相应于位置395的位置的R；在相应于位置399的位置的M；在相应于位置399的位置的T；在相应于位置399的位置的W；在相应于位置405的位置的G；在相应于位置407的位置的D；在相应于位置407的位置的Q；在相应于位置409的位置的A；在相应于位置409的位置的Q；在相应于位置410的位置的T；在相应于位置418的位置的P；在相应于位置419的位置的F；在相应于位置419的位置的I；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置419的位置的R；在相应于位置419的位置的S；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置421的位置的K；在相应于位置421的位置的N；在相应于位置421的位置的Q；在相应于位置421的位置的R；在相应于位置421的位置的S；在相应于位置425的位置的K；在相应于位置431的位置的A；在相应于位置431的位置的H；在相应于位置431的位置的K；在相应于位置431的位置的Q；在相应于位置431的位置的R；在相应于位置431的位置的S；在相应于位置431的位置的V；在相应于位置433的位置的L；在相应于位置433的位置的R；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置436的位置的K；在相应于位置437的位置的I；在相应于位置437的位置的M；在相应于位置438的位置的T；在相应于位置439的位置的V；在相应于位置440的位置的H；在相应于位置440的位置的R；在相应于位置441的位置的F；在相应于位置442的位置的R；在相应于位置443的位置的A；在相应于位置443的位置的M；在相应于位置445的位置的M；在相应于位置445的位置的P；在相应于位置446的位置的A；在相应于位置447的位置的D；在相应于位置447的位置的N；和/或在相应于位置447的位置的Q。
在呈现增加的透明质酸酶活性的多肽中，其是呈现至少2.0倍不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的透明质酸酶活性的那些多肽。例如，这些多肽是修饰的PH20多肽，其参考SEQ ID NO:3所示位置在相应于选自24、29、31、48、58、69、70、75、84、97、165、166、271、278、317、320、325和326位置的氨基酸位置含有至少一个氨基酸置换，其中相应氨基酸位置是通过排列对比PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的，如参考SEQID NO:3所示氨基酸位置含有选自如下置换的至少一个氨基酸置换的修饰的PH20多肽：在相应于位置24的位置的E；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；及在相应于位置326的位置的V。
在本发明提供的呈现增加的透明质酸酶活性的任何多肽中，任何这种修饰的PH20多肽含有一个氨基酸修饰如置换及如至少或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100及更多个修饰的修饰组合。所述修饰如置换可以在未修饰的PH20多肽中，其具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或者是其C-末端截短的片段，其是可溶的PH20多肽，如SEQ ID NO:3或32-66任一所示，或者与其具有至少85％序列相同性。例如，任何这种修饰的PH20多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％序列相同性。
本发明还提供了修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中含有至少一个氨基酸置换，其序列如SEQ ID NO:7所示，其C-末端截短的片段，其可溶的片段，或者在具有与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少91％相同的氨基酸序列的PH20多肽中，其中至少一个氨基酸置换是在参考SEQ ID NO:3或7所示氨基酸位置相应于选自如下位置的氨基酸位置：1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446和447，其中相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的；且如果修饰的PH20多肽在相应于位置13、47、131或219的位置含有氨基酸置换，则所述置换不是用丙氨酸(A)置换。在这些修饰的PH20多肽中，其是呈现不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的至少40％透明质酸酶活性的那些多肽，其中在本发明的所有情况中均是在相同条件下对比活性。
本发明包括在SEQ ID NO:3、7、32-66、69和72任一所示氨基酸序列中或者在与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一呈现至少91％序列相同性的氨基酸序列中含有氨基酸置换的这些多肽。特别地，所述修饰的PH20多肽在SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72中含有氨基酸置换，其是SEQ IDNO:7的C末端截短的片段，或者具有与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有至少91％相同性的氨基酸序列的PH20多肽。特别地，本发明提供的这种修饰的PH20多肽是其中氨基酸置换是下表3所示氨基酸置换的那些多肽。例如，这种修饰的PH20多肽包括在参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置相应于选自如下位置的氨基酸位置具有至少一个氨基酸置换的那些多肽：1、6、8、9、10、11、12、14、15、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、46、47、48、49、50、52、58、59、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、79、82、83、84、86、87、89、90、92、93、94、97、102、104、107、114、118、120、127、128、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、155、156、158、160、162、163、164、165、166、167、169、170、172、173、174、175、178、179、193、195、196、198、204、205、206、209、212、213、215、219、220、221、222、232、233、234、235、236、237、238、240、247、248、249、257、258、259、260、261、263、267、269、271、272、273、274、276、277、278、279、282、283、285、287、289、291、292、293、298、305、307、308、309、310、313、314、315、317、318、320、321、324、325、326、328、335、347、349、351、353、356、359、367、368、369、371、373、374、375、376、377、380、381、383、385、389、392、393、395、396、399、401、404、405、406、407、409、410、412、416、418、419、421、425、427、428、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446或447。举例的这种置换是含有参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置选自如下置换的至少一个氨基酸置换的那些：在相应于位置1的位置的组氨酸(H)；在相应于位置1的位置的A；在相应于位置1的位置的E；在相应于位置1的位置的G；在相应于位置1的位置的K；在相应于位置1的位置的Q；在相应于位置1的位置的R；在相应于位置6的位置的A；在相应于位置8的位置的M；在相应于位置9的位置的Q；在相应于位置10的位置的G；在相应于位置10的位置的H；在相应于位置11的位置的S；在相应于位置12的位置的E；在相应于位置12的位置的I；在相应于位置12的位置的K；在相应于位置12的位置的T；在相应于位置14的位置的V；在相应于位置15的位置的V；在相应于位置15的位置的M；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置22的位置的T；在相应于位置24的位置的E；在相应于位置24的位置的H；在相应于位置24的位置的R；在相应于位置26的位置的A；在相应于位置26的位置的E；在相应于位置26的位置的K；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置26的位置的Q；在相应于位置26的位置的R；在相应于位置27的位置的D；在相应于位置27的位置的K；在相应于位置27的位置的R；在相应于位置28的位置的R；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置29的位置的I；在相应于位置29的位置的K；在相应于位置29的位置的L；在相应于位置29的位置的M；在相应于位置29的位置的P；在相应于位置29的位置的R；在相应于位置29的位置的S；在相应于位置29的位置的T；在相应于位置29的位置的V；在相应于位置30的位置的G；在相应于位置30的位置的H；在相应于位置30的位置的K；在相应于位置30的位置的L；在相应于位置30的位置的M；在相应于位置30的位置的R；在相应于位置30的位置的S；在相应于位置31的位置的A；在相应于位置31的位置的C；在相应于位置31的位置的G；在相应于位置31的位置的H；在相应于位置31的位置的I；在相应于位置31的位置的K；在相应于位置31的位置的L；在相应于位置31的位置的P；在相应于位置31的位置的R；在相应于位置31的位置的S；在相应于位置31的位置的T；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置31的位置的W；在相应于位置32的位置的C；在相应于位置32的位置的F；在相应于位置32的位置的G；在相应于位置32的位置的H；在相应于位置33的位置的W；在相应于位置33的位置的G；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置35的位置的Q；在相应于位置35的位置的V；在相应于位置36的位置的H；在相应于位置36的位置的N；在相应于位置37的位置的F；在相应于位置37的位置的M；在相应于位置38的位置的Y；在相应于位置39的位置的A；在相应于位置39的位置的L；在相应于位置39的位置的N；在相应于位置39的位置的T；在相应于位置40的位置的L；在相应于位置41的位置的T；在相应于位置46的位置的L；在相应于位置46的位置的R；在相应于位置47的位置的D；在相应于位置47的位置的F；在相应于位置47的位置的T；在相应于位置47的位置的W；在相应于位置48的位置的F；在相应于位置48的位置的H；在相应于位置48的位置的K；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置49的位置的R；在相应于位置50的位置的D；在相应于位置50的位置的S；在相应于位置50的位置的M；在相应于位置52的位置的N；在相应于位置52的位置的Q；在相应于位置52的位置的R；在相应于位置52的位置的S；在相应于位置52的位置的T；在相应于位置58的位置的C；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的L；在相应于位置58的位置的P；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置58的位置的R；在相应于位置58的位置的H；在相应于位置58的位置的N；在相应于位置58的位置的Y；在相应于位置59的位置的N；在相应于位置63的位置的K；在相应于位置63的位置的L；在相应于位置63的位置的M；在相应于位置63的位置的R；在相应于位置63的位置的W；在相应于位置67的位置的V；在相应于位置68的位置的H；在相应于位置68的位置的P；在相应于位置68的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的C；在相应于位置69的位置的E；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的I；在相应于位置69的位置的L；在相应于位置69的位置的M；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置69的位置的T；在相应于位置69的位置的W；在相应于位置69的位置的Y；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的C；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的K；在相应于位置70的位置的L；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的P；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的S；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置70的位置的Y；在相应于位置71的位置的G；在相应于位置71的位置的N；在相应于位置71的位置的R；在相应于位置71的位置的S；在相应于位置72的位置的K；在相应于位置72的位置的M；在相应于位置72的位置的Q；在相应于位置73的位置的A；在相应于位置73的位置的H；在相应于位置73的位置的K；在相应于位置73的位置的L；在相应于位置73的位置的Q；在相应于位置73的位置的R；在相应于位置73的位置的T；在相应于位置73的位置的W；在相应于位置74的位置的A；在相应于位置74的位置的C；在相应于位置74的位置的E；在相应于位置74的位置的F；在相应于位置74的位置的G；在相应于位置74的位置的H；在相应于位置74的位置的K；在相应于位置74的位置的L；在相应于位置74的位置的M；在相应于位置74的位置的N；在相应于位置74的位置的P；在相应于位置74的位置的R；在相应于位置74的位置的S；在相应于位置74的位置的V；在相应于位置74的位置的W；在相应于位置75的位置的F；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的M；在相应于位置75的位置的R；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置79的位置的L；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置82的位置的N；在相应于位置83的位置的V；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置83的位置的S；在相应于位置83的位置的G；在相应于位置84的位置的E；在相应于位置84的位置的F；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置84的位置的N；在相应于位置84的位置的R；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置86的位置的H；在相应于位置86的位置的K；在相应于位置86的位置的N；在相应于位置86的位置的S；在相应于位置86的位置的T；在相应于位置86的位置的W；在相应于位置87的位置的C；在相应于位置87的位置的G；在相应于位置87的位置的L；在相应于位置87的位置的M；在相应于位置87的位置的R；在相应于位置87的位置的S；在相应于位置87的位置的T；在相应于位置87的位置的V；在相应于位置87的位置的Y；在相应于位置89的位置的C；在相应于位置90的位置的A；在相应于位置90的位置的E；在相应于位置90的位置的H；在相应于位置90的位置的K；在相应于位置90的位置的N；在相应于位置90的位置的R；在相应于位置92的位置的C；在相应于位置92的位置的L；在相应于位置93的位置的I；在相应于位置93的位置的L；在相应于位置93的位置的Q；在相应于位置93的位置的R；在相应于位置93的位置的S；在相应于位置93的位置的T；在相应于位置94的位置的D；在相应于位置94的位置的Q；在相应于位置94的位置的R；在相应于位置97的位置的A；在相应于位置97的氨基酸残基的C；在相应于位置97的位置的D；在相应于位置97的位置的E；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置97的位置的L；在相应于位置97的位置的S；在相应于位置102的位置的S；在相应于位置102的位置的T；在相应于位置104的位置的R；在相应于位置107的位置的L；在相应于位置114的位置的A；在相应于位置118的位置的Q；在相应于位置120的位置的H；在相应于位置120的位置的F；在相应于位置120的位置的I；在相应于位置120的位置的S；在相应于位置120的位置的V；在相应于位置120的位置的Y；在相应于位置127的位置的E；在相应于位置127的位置的H；在相应于位置127的位置的N；在相应于位置127的位置的Q；在相应于位置127的位置的R；在相应于位置128的位置的I；在相应于位置130的位置的R；在相应于位置131的位置的G；在相应于位置131的位置的I；在相应于位置131的位置的M；在相应于位置131的位置的Q；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置131的位置的V；在相应于位置132的位置的N；在相应于位置132的位置的L；在相应于位置135的位置的D；在相应于位置135的位置的G；在相应于位置135的位置的R；在相应于位置138的位置的L；在相应于位置139的位置的T；在相应于位置140的位置的K；在相应于位置141的位置的H；在相应于位置141的位置的R；在相应于位置141的位置的S；在相应于位置141的位置的W；在相应于位置141的位置的Y；在相应于位置142的位置的D；在相应于位置142的位置的G；在相应于位置142的位置的K；在相应于位置142的位置的N；在相应于位置142的位置的P；在相应于位置142的位置的Q；在相应于位置142的位置的R；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的G；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置144的位置的R；在相应于位置144的位置的T；在相应于位置146的位置的P；在相应于位置146的位置的R；在相应于位置147的位置的A；在相应于位置147的位置的F；在相应于位置147的位置的L；在相应于位置147的位置的R；在相应于位置147的位置的S；在相应于位置147的位置的V；在相应于位置148的位置的H；在相应于位置148的位置的K；在相应于位置148的位置的Q；在相应于位置149的位置的T；在相应于位置149的位置的V；在相应于位置150的位置的A；在相应于位置150的位置的D；在相应于位置150的位置的G；在相应于位置150的位置的N；在相应于位置150的位置的S；在相应于位置150的位置的W；在相应于位置150的位置的Y；在相应于位置151的位置的A；在相应于位置151的位置的H；在相应于位置151的位置的K；在相应于位置151的位置的L；在相应于位置151的位置的M；在相应于位置151的位置的Q；在相应于位置151的位置的R；在相应于位置151的位置的S；在相应于位置151的位置的T；在相应于位置151的位置的V；在相应于位置151的位置的W；在相应于位置151的位置的Y；在相应于位置152的位置的R；在相应于位置152的位置的T；在相应于位置152的位置的W；在相应于位置155的位置的D；在相应于位置155的位置的G；在相应于位置155的位置的K；在相应于位置155的位置的R；在相应于位置156的位置的D；在相应于位置158的位置的Q；在相应于位置158的位置的S；在相应于位置160的位置的S；在相应于位置162的位置的E；在相应于位置163的位置的A；在相应于位置163的位置的E；在相应于位置163的位置的K；在相应于位置163的位置的Q；在相应于位置163的位置的R；在相应于位置163的位置的S；在相应于位置164的位置的M；在相应于位置164的位置的V；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置165的位置的F；在相应于位置165的位置的N；在相应于位置165的位置的S；在相应于位置165的位置的V；在相应于位置166的位置的A；在相应于位置166的位置的E；在相应于位置166的位置的F；在相应于位置166的位置的H；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置166的位置的W；在相应于位置166的位置的Y；在相应于位置167的位置的D；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置170的位置的R；在相应于位置172的位置的A；在相应于位置173的位置的R；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的K；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置174的位置的R；在相应于位置174的位置的T；在相应于位置175的位置的T；在相应于位置178的位置的K；在相应于位置178的位置的R；在相应于位置179的位置的K；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置195的位置的N；在相应于位置196的位置的E；在相应于位置196的位置的R；在相应于位置198的位置的D；在相应于位置204的位置的P；在相应于位置205的位置的A；在相应于位置205的位置的E；在相应于位置205的位置的L；在相应于位置205的位置的T；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置206的位置的K；在相应于位置206的位置的L；在相应于位置206的位置的R；在相应于位置209的位置的R；在相应于位置212的位置的N；在相应于位置212的位置的S；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置213的位置的M；在相应于位置213的位置的N；在相应于位置215的位置的H；在相应于位置215的位置的M；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置219的位置的K；在相应于位置219的位置的S；在相应于位置220的位置的H；在相应于位置220的位置的I；在相应于位置220的位置的L；在相应于位置220的位置的V；在相应于位置221的位置的Q；在相应于位置222的位置的G；在相应于位置232的位置的F；在相应于位置233的位置的G；在相应于位置233的位置的K；在相应于位置233的位置的R；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置235的位置的A；在相应于位置236的位置的R；在相应于位置237的位置的C；在相应于位置237的位置的E；在相应于位置237的位置的H；在相应于位置237的位置的Q；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置238的位置的E；在相应于氨基酸位置238的位置的H；在相应于位置238的位置的S；在相应于位置240的位置的A；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置247的位置的I；在相应于位置248的位置的A；在相应于位置249的位置的V；在相应于位置257的位置的G；在相应于位置257的位置的T；在相应于位置257的位置的R；在相应于位置258的位置的N；在相应于位置258的位置的S；在相应于位置259的位置的P；在相应于位置260的位置的M；在相应于位置260的位置的Y；在相应于位置261的位置的A；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置261的位置的N；在相应于位置263的位置的K；在相应于位置263的位置的R；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置269的位置的A；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置271的位置的M；在相应于位置272的位置的D；在相应于位置272的位置的T；在相应于位置273的位置的H；在相应于位置273的位置的Y；在相应于位置274的位置的F；在相应于位置276的位置的D；在相应于位置276的位置的H；在相应于位置276的位置的M；在相应于位置276的位置的R；在相应于位置276的位置的S；在相应于位置276的位置的Y；在相应于位置277的位置的A；在相应于位置277的位置的E；在相应于位置277的位置的H；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置277的位置的M；在相应于位置277的位置的N；在相应于位置277的位置的Q；在相应于位置277的位置的R；在相应于位置277的位置的S；在相应于位置277的位置的T；在相应于位置278的位置的E；在相应于位置278的位置的F；在相应于位置278的位置的G；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的K；在相应于位置278的位置的N；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置278的位置的S；在相应于位置278的位置的T；在相应于位置278的位置的Y；在相应于位置279的位置的H；在相应于位置282的位置的M；在相应于位置283的位置的S；在相应于位置285的位置的H；在相应于位置287的位置的T；在相应于位置289的位置的S；在相应于位置291的位置的S；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置292的位置的C；在相应于位置292的位置的F；在相应于位置292的位置的H；在相应于位置292的位置的K；在相应于位置292的位置的R；在相应于位置292的位置的V；在相应于位置293的位置的A；在相应于位置293的位置的C；在相应于位置293的位置的D；在相应于位置293的位置的F；在相应于位置293的位置的K；在相应于位置293的位置的M；在相应于位置293的位置的P；在相应于位置293的位置的Q；在相应于位置293的位置的V；在相应于位置293的位置的Y；在相应于位置298的位置的G；在相应于位置305的位置的E；在相应于位置307的位置的G；在相应于位置308的位置的D；在相应于位置308的位置的G；在相应于位置308的位置的K；在相应于位置308的位置的N；在相应于位置308的位置的R；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置309的位置的G；在相应于位置309的位置的H；在相应于位置309的位置的L；在相应于位置309的位置的M；在相应于位置309的位置的N；在相应于位置309的位置的Q；在相应于位置309的位置的R；在相应于位置309的位置的S；在相应于位置309的位置的T；在相应于位置309的位置的V；在相应于位置310的位置的A；在相应于位置310的位置的G；在相应于位置310的位置的Q；在相应于位置310的位置的S；在相应于位置313的位置的A；在相应于位置313的位置的G；在相应于位置313的位置的H；在相应于位置313的位置的K；在相应于位置313的位置的P；在相应于位置313的位置的R；在相应于位置313的位置的T；在相应于位置313的位置的Y；在相应于位置314的位置的S；在相应于位置314的位置的Y；在相应于位置315的位置的A；在相应于位置315的位置的H；在相应于位置315的位置的Y；在相应于位置317的位置的A；在相应于位置317的位置的I；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置317的位置的N；在相应于位置317的位置的Q；在相应于位置317的位置的R；在相应于位置317的位置的S；在相应于位置317的位置的T；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的D；在相应于位置318的位置的H；在相应于位置318的位置的K；在相应于位置318的位置的M；在相应于位置318的位置的R；在相应于位置320的位置的H；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置320的位置的R；在相应于位置321的位置的R；在相应于位置321的位置的S；在相应于位置324的位置的N；在相应于位置324的位置的R；在相应于位置325的位置的A；在相应于位置325的位置的D；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的H；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的M；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；在相应于位置325的位置的S；在相应于位置325的位置的V；在相应于位置326的位置的L；在相应于位置326的位置的V；在相应于位置328的位置的C；在相应于位置328的位置的G；在相应于位置328的位置的I；在相应于位置328的位置的K；在相应于位置328的位置的L；在相应于位置328的位置的S；在相应于位置328的位置的Y；在相应于位置335的位置的S；在相应于位置347的位置的A；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置347的位置的S；在相应于位置349的位置的M；在相应于位置349的位置的R；在相应于位置351的位置的S；在相应于位置353的位置的V；在相应于位置356的位置的H；在相应于位置356的位置的S；在相应于位置359的位置的E；在相应于位置359的位置的H；在相应于位置359的位置的T；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置367的位置的G；在相应于位置367的位置的K；在相应于位置367的位置的S；在相应于位置368的位置的A；在相应于位置368的位置的E；在相应于位置368的位置的K；在相应于氨基酸位置368的位置的L；在相应于氨基酸位置368的位置的M；在相应于位置368的位置的R；在相应于氨基酸位置368的位置的T；在相应于位置369的位置的H；在相应于位置369的位置的R；在相应于位置371的位置的F；在相应于位置371的位置的H；在相应于位置371的位置的K；在相应于位置371的位置的L；在相应于位置371的位置的R；在相应于位置371的位置的S；在相应于位置373的位置的M；在相应于位置374的位置的H；在相应于位置374的位置的P；在相应于位置375的位置的A；在相应于位置375的位置的G；在相应于位置375的位置的K；在相应于位置375的位置的R；在相应于位置376的位置的D；在相应于位置376的位置的E；在相应于位置376的位置的Q；在相应于位置376的位置的R；在相应于位置376的位置的T；在相应于位置376的位置的V；在相应于位置376的位置的Y；在相应于位置377的位置的D；在相应于位置377的位置的E；在相应于位置377的位置的H；在相应于位置377的位置的K；在相应于位置377的位置的P；在相应于位置377的位置的R；在相应于位置377的位置的S；在相应于位置377的位置的T；在相应于位置380的位置的W；在相应于位置380的位置的Y；在相应于位置381的位置的S；在相应于位置383的位置的I；在相应于位置383的位置的K；在相应于位置383的位置的L；在相应于位置383的位置的S；在相应于位置385的位置的A；在相应于位置385的位置的Q；在相应于位置385的位置的V；在相应于位置389的位置的A；在相应于位置389的位置的G；在相应于位置389的位置的L；在相应于位置389的位置的K；在相应于位置389的位置的Q；在相应于位置389的位置的S；在相应于位置392的位置的A；在相应于位置392的位置的F；在相应于位置392的位置的M；在相应于位置392的位置的Q；在相应于位置392的位置的R；在相应于位置392的位置的V；在相应于位置393的位置的F；在相应于位置393的位置的M；在相应于位置395的位置的A；在相应于位置395的位置的H；在相应于位置395的位置的R；在相应于位置396的位置的A；在相应于位置396的位置的H；在相应于位置396的位置的Q；在相应于位置396的位置的S；在相应于位置399的位置的K；在相应于位置399的位置的M；在相应于位置399的位置的T；在相应于位置399的位置的V；在相应于位置399的位置的W；在相应于位置401的位置的A；在相应于位置401的位置的E；在相应于位置404的位置的A；在相应于位置405的位置的G；在相应于位置406的位置的F；在相应于位置406的位置的N；在相应于位置407的位置的A；在相应于位置407的位置的D；在相应于位置407的位置的E；在相应于位置407的位置的F；在相应于位置407的位置的H；在相应于位置407的位置的Q；在相应于位置407的位置的P；在相应于位置409的位置的A；在相应于位置409的位置的Q；在相应于位置410的位置的T；在相应于位置412的位置的Q；在相应于位置412的位置的R；在相应于位置412的位置的V；在相应于位置416的位置的L；在相应于位置418的位置的E；在相应于位置418的位置的L；在相应于位置418的位置的P；在相应于位置418的位置的R；在相应于位置418的位置的V；在相应于位置419的位置的F；在相应于位置419的位置的H；在相应于位置419的位置的I；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置419的位置的R；在相应于位置419的位置的S；在相应于位置419的位置的Y；在相应于位置421的位置的A；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置421的位置的K；在相应于位置421的位置的N；在相应于位置421的位置的Q；在相应于位置421的位置的R；在相应于位置421的位置的S；在相应于位置425的位置的G；在相应于位置425的位置的K；在相应于位置427的位置的Q；在相应于位置427的位置的T；在相应于位置428的位置的L；在相应于位置431的位置的A；在相应于位置431的位置的G；在相应于位置431的位置的E；在相应于位置431的位置的H；在相应于位置431的位置的K；在相应于位置431的位置的L；在相应于位置431的位置的N；在相应于位置431的位置的Q；在相应于位置431的位置的R；在相应于位置431的位置的S；在相应于位置431的位置的V；在相应于位置433的位置的A；在相应于位置433的位置的H；在相应于位置433的位置的I；在相应于位置433的位置的K；在相应于位置433的位置的L；在相应于位置433的位置的R；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置433的位置的W；在相应于位置436的位置的K；在相应于位置437的位置的I；在相应于位置437的位置的M；在相应于位置438的位置的A；在相应于位置438的位置的D；在相应于位置438的位置的E；在相应于位置438的位置的L；在相应于位置438的位置的N；在相应于位置438的位置的T；在相应于位置439的位置的A；在相应于位置439的位置的C；在相应于位置439的位置的K；在相应于位置439的位置的P；在相应于位置439的位置的Q；在相应于位置439的位置的T；在相应于位置439的位置的V；在相应于位置440的位置的D；在相应于位置440的位置的H；在相应于位置440的位置的M；在相应于位置440的位置的P；在相应于位置440的位置的R；在相应于位置440的位置的S；在相应于位置441的位置的A；在相应于位置441的位置的F；在相应于位置442的位置的C；在相应于位置442的位置的G；在相应于位置442的位置的R；在相应于位置443的位置的A；在相应于位置443的位置的E；在相应于位置443的位置的F；在相应于位置443的位置的G；在相应于位置443的位置的M；在相应于位置443的位置的N；在相应于位置444的位置的E；在相应于位置444的位置的H；在相应于位置444的位置的V；在相应于位置445的位置的H；在相应于位置445的位置的M；在相应于位置445的位置的N；在相应于位置445的位置的P；在相应于位置445的位置的Q；在相应于位置445的位置的S；在相应于位置445的位置的T；在相应于位置445的位置的V；在相应于位置445的位置的W；在相应于位置446的位置的A；在相应于位置446的位置的M；在相应于位置446的位置的W；在相应于位置447的位置的D；在相应于位置447的位置的E；在相应于位置447的位置的G；在相应于位置447的位置的I；在相应于位置447的位置的N；在相应于位置447的位置的P；在相应于位置447的位置的Q；在相应于位置447的位置的T，和/或在相应于位置447的位置的V的置换。这些修饰的PH20多肽是呈现出不含有所述特定氨基酸置换的PH20的至少40％活性的那些多肽。活性可以在例如不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的透明质酸酶活性的40％-5000％、40％-2000％、40％-1000％、40％-500％、40％-100％、80％-2000％、80％-600％、80％-200％、80％-300％之间变化。这种活性包括不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的透明质酸酶活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％或更多，在本发明所有情况中，所述活性均是在相同条件下对比的。
特别地，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:7所示PH20多肽、其C末端截短的片段中或者在具有与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少91％相同的氨基酸序列的PH20多肽或者相应截短的片段中含有至少一个氨基酸置换，其中所述修饰的PH20多肽呈现出不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的低于20％的透明质酸酶活性，其中活性是在相同条件下对比的；所述氨基酸置换是在参考SEQ ID NO:3或7所示氨基酸位置相应于选自如下位置的氨基酸位置：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444或447；相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的；及假定：
(i)如果修饰的PH20多肽在相应于位置200、333、358或393的位置含有氨基酸置换，则所述置换不是用丙氨酸(A)置换；
(ii)如果修饰的PH20多肽在相应于位置111或249的位置含有氨基酸置换，则所述置换不是用天冬酰胺(N)置换；
(iii)如果修饰的PH20多肽在相应于位置113的位置含有氨基酸置换，则所述置换不是用谷氨酰胺(Q)置换；
(iv)如果修饰的PH20多肽含有在相应于位置176的位置的氨基酸置换，则所述置换不是用甘氨酸(G)置换；及
(v)如果修饰的PH20多肽在相应于位置252的位置含有氨基酸置换，则所述置换不是用苏氨酸(T)置换。
举例的这种修饰的PH20多肽是在具有SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示氨基酸序列的PH20多肽中或者在与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一呈现至少91％序列相同性的氨基酸序列中含有氨基酸置换的任何多肽。例如，修饰的PH20多肽在SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72中含有氨基酸置换，其是SEQ ID NO:7的C末端截短片段的多肽，或者具有与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少91％相同的氨基酸序列的PH20多肽。在本发明提供的这种修饰的PH20多肽的实例中，修饰的PH20多肽可呈现与不具有所述修饰的PH20相似或相同活性，或者可以呈现增加的活性或者低于不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的透明质酸酶活性的15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％或更低的活性。举例的这种修饰的PH20多肽如表5所示。
在本发明提供的及上述任何及所有修饰的PH20多肽中，修饰的PH20多肽是不由SEQ ID NO:3、6-66、69-72、856-861、869或870任一所示氨基酸序列组成的多肽。特别地，在本发明在此或在别处提供的任何修饰的PH20多肽中，其在具有SEQ ID NO:3、7、69或72任一所示氨基酸序列的PH20多肽中含有氨基酸置换，假定：(i)在修饰的PH20多肽仅包含一个氨基酸置换的情况中，所述置换不相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的氨基酸置换V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、E249Q、R252T、N333A或N358A；(ii)在修饰的PH20多肽包含仅两个氨基酸置换的情况中，所述置换不相应于参考SEQ ID NO:3所示位置的氨基酸置换P13A/L464W、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N219A或N333A/N358A；及(iii)在修饰的PH20多肽含有仅三个氨基酸置换的情况中，所述置换不相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的氨基酸置换N47A/N131A/N219A。
任何上述修饰的PH20多肽及本发明提供和上述及下述的任何多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48,49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或更多个氨基酸置换。修饰的PH20多肽可包含信号序列，包括天然序列与异源序列或者修饰的序列，及也包含缺少信号序列的成熟PH20多肽。
在本发明上述提供的及在下文描述的任何修饰的PH20多肽中，其是含有或具有SEQ ID NO:73-855任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:73-855任一所示氨基酸序列呈现至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列的修饰的PH20多肽，其含有至少一个氨基酸置换如上述或本文别处所述，参考SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的位置。在本发明提供的修饰的PH20多肽的任何实例中，修饰的PH20多肽不具有或含有SEQ ID NOS:8-31、69-72、856-861、869或870任一所示氨基酸序列。
本发明提供的修饰的PH20多肽可以是基本上纯化的或分离的，在中性pH可以呈现出催化活性，可以在从细胞中表达时被分泌及可溶解于上清中，和/或可包含修饰的氨基酸，如选自如下的修饰：糖基化，唾液酸化，白蛋白化，法尼基化，羧化，羟化，与聚合物缀合如PEG化或者与葡聚糖缀合，与另一部分如多聚化结构域、毒素、可检测标记或药物缀合，及磷酸化。修饰的PH20多肽可以是糖基化的，如通过含有与至少三个天冬酰胺(N)残基的每一个连接的至少一个N-乙酰葡糖胺部分而糖基化，其中例如所述三个天冬酰胺残基相应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基200、333和358。多聚化结构域包括Fc结构域。
本发明还提供了核酸分子，其编码本发明提供的任何修饰的PH20多肽。本发明提供了含有所述核酸分子的载体，真核和原核载体。所述载体包括表达载体及包括哺乳动物载体，包括病毒载体。病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒载体，及其它这种病毒载体。感兴趣的是溶瘤细胞载体，其聚集在肿瘤或者靶向肿瘤。本发明还提供了含有所述核酸分子的细胞和含有所述载体的细胞。所述细胞可以是原核或真核细胞，特别是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还提供了修饰的PH20多肽，其是通过任何提供的细胞产生的。因此，本发明提供了产生修饰的PH20多肽的方法，通过在一定条件下培养本发明提供的任何细胞，在所述条件下所述细胞产生和分泌编码的修饰的PH20多肽，并且回收表达的多肽。本发明还提供了产生修饰的PH20多肽的方法，通过将本发明提供的任何核酸或者本发明提供的任何载体导入能将N-连接的糖部分掺入所述多肽中的细胞中，在所述细胞产生及分泌编码的修饰的PH20多肽的条件下培养所述细胞，并且回收表达的多肽。在这种实例中，所述核酸与启动子可操纵地连接。培养的细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还提供了药物组合物，其含有本发明提供的任何修饰的PH20多肽或者本发明提供的任何核酸或载体。所述组合物可以与其它物质和/或其它成分如防腐剂一起配制。所述组合物可以这样配制，由此其成分、特别是PH20及任何其它活性物质在预选条件下保留活性或者是稳定的。此外，如本文所述，所述PH20多肽被修饰，由此其在不同条件下呈现增加的稳定性。例如，本发明提供了组合物，其中修饰的PH20多肽在或在大约2℃-8℃(包括端点)温度是稳定(即如本文所述保持活性)至少1个月或者在或在大约30℃-42℃(包括端点)温度稳定至少3天。本发明提供了组合物，其中所述组合物中修饰的PH20多肽在或在大约2℃-8℃(包括端点)温度稳定至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月或30个月。本发明还提供了组合物，其中所述组合物中修饰的PH20多肽在或在大约30℃-42℃(包括端点)温度稳定至少3天、至少4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、60天或更长时间。所述药物组合物可含有药物可接受的赋形剂。
选择所述条件、配制物、成分和修饰的PH20多肽以实现希望的稳定性。所述药物组合物可以配制为直接给予或者可以按需要稀释。其可以配制为多次或单一剂量给予。举例的组合物包括在或在大约如下浓度的修饰的PH20多肽：0.1μg/mL-100μg/mL、1μg/mL-50μg/mL或1μg/mL-20μg/mL、或者10U/mL-5000U/mL、50U/mL-4000U/mL、100U/mL-2000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL或者100U/mL-1000U/mL。举例的盐包括如下浓度的NaCl，例如低于或大约为或为200mM、180mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更低，或者为或为大约0.1mM-200mM、0.1mM-100mM、120mM-200mM、10mM-50mM、10mM-90mM、80mM-200mM、80mM-140mM、50mM-100mM、80mM-100mM、50mM-80mM、100mM-140mM或者120mM-140mM。
所述药物组合物可含有抗微生物有效量的防腐剂或者防腐剂混合物，如1、2、3、4或更多种酚类防腐剂、非酚类防腐剂或者酚类防腐剂与非酚类防腐剂，例如但不限于苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、氯己定二盐酸盐、氯己定二葡糖酸盐、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、溴棕三甲胺、氯化苄乙胺、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯及其任何组合。酚类包括例如苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇及对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。一或多种防腐剂的抗微生物有效浓度(质量浓度(w/v)百分比(％))可以是0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或0.3％-0.4％(包括端点)。举例的药物组合物中的防腐剂是苯酚、间甲酚或者苯酚与间甲酚，所述配制物中以质量浓度(w/v)百分比％表示的量是或大约是0.1％-0.25％的苯酚与是或大约是0.05％-0.2％的间甲酚、是或大约是0.10％-0.2％的苯酚与是或大约是0.6％-01.8％的间甲酚、是或大约是0.1％-0.15％的苯酚与0.8％-0.15％间甲酚、是或大约是0.10％-0.15％的苯酚与是或大约是0.06-0.09％的间甲酚或者是或大约是0.12％-0.18％的苯酚与是或大约是0.14-0.22％的间甲酚。
所述药物组合物可含有进一步的治疗活性剂。所述活性剂可以配制在组合物中或者与含有PH20组合物组合，但是在单独的组合物中以单独给予，相继、间歇、同时或一起给予。治疗活性剂包括例如选自如下的物质：化疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀阿米巴虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、和抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、生物杀灭剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药物、避孕药、减充血剂、利尿剂、抑郁剂、诊断剂、电解剂、催眠药、激素制剂、高血糖制剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼部用药、拟副交感神经剂、精神兴奋剂、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、尿路用药、阴道制剂、杀病毒剂、维生素制剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转换酶抑制剂、多肽、蛋白质、核酸、药物、有机分子和睡眠诱导剂。举例的这种制剂是抗体，特别是单克隆抗体、免疫球蛋白制备物、二膦酸酯/盐、细胞因子、化疗剂、凝血因子和胰岛素。胰岛素包括例如基础胰岛素和快速作用胰岛素，如普通胰岛素，特别是重组人胰岛素，及胰岛素类似物如赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素。特别的快速作用胰岛素是具有SEQ ID NO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:863所示氨基酸序列的B链的那些胰岛素，或者具有SEQ IDNO:864的氨基酸残基位置88-108所示氨基酸序列的A链和具有SEQ IDNO:864的氨基酸残基位置25-54所示氨基酸序列的B链的胰岛素，或者选自具有SEQ ID NO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:865-867任一所示氨基酸序列的B链的胰岛素的胰岛素类似物。所述组合物中快速作用胰岛素的量可以根据经验确定，但是典型可以是10U/mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-1000U/mL或者500U/mL-1000U/mL(包括端点)。
在特殊实例中，本发明提供了药物组合物，其含有本发明提供的任何修饰的PH20多肽，其呈现出对于酚类防腐剂和胰岛素如快速作用胰岛素的增加的稳定性。修饰的PH20多肽和胰岛素可以治疗有效量提供。例如，本发明提供了药物组合物，其含有本发明提供的任何修饰的PH20多肽，其呈现出对100U/mL-1000U/mL或大约100U/mL-1000U/mL量的酚类防腐剂和10U/mL-1000U/mL或大约10U/mL-1000U/mL量的快速作用胰岛素的增加的稳定性。例如，快速作用胰岛素可以是胰岛素类似物，如赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素或者其它类似物。任何这种药物组合物可以配制为pH为或为大约7.0-7.6。任何这种药物组合物也可以配制为含有盐如NaCl，浓度为或为大约0.1mM-200mM，和/或含有抗微生物有效量的至少一种防腐剂，其中所述组合物通常含有至少一种酚类防腐剂。所述抗微生物有效量是一或多种防腐剂的总量，以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，为0.05％-0.6％。所述酚类防腐剂可以是苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇或者对羟基苯甲酸酯。在任何上述药物组合物的实例中，所述组合物也可以含有表面活性剂，如聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨糖醇、泊洛沙姆(poloxamer)或聚山梨醇酯，所述配制物中的量以质量浓度(w/v)％表示，为至少或至少大约0.001％；缓冲剂，其是非金属结合剂或金属结合剂，如Tris、组氨酸、磷酸盐或柠檬酸盐，其中所述缓冲剂的浓度为或为大约1mM-100mM；甘油，浓度低于60mM；抗氧化剂，如半胱氨酸、色氨酸或甲硫氨酸，浓度为或为大约2mM-50mM，包括端点；和/或锌，浓度为或为大约0.001-0.1mg/100单位胰岛素(mg/100U)。本发明还提供了闭环系统、胰岛素泵(包括持续皮下注入胰岛素(CSII)泵)和胰岛素笔，其含有任何所述药物组合物。所述药物组合物可用于治疗糖尿病的方法或应用中，所述糖尿病如1型糖尿病、2型糖尿病或者妊娠糖尿病。
本发明提供的任何药物组合物中的其它治疗剂包括但不限于阿达木单抗、阿加糖酶β、阿莱法塞、氨苄青霉素、阿那白滞素、抗脊髓灰质炎疫苗、抗胸腺细胞、阿奇霉素、贝卡普勒明、卡泊芬净、头孢唑林、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、西妥昔单抗、西司他丁、克拉维酸、克林霉素、达依泊汀α、达克珠单抗、白喉、白喉抗毒素、白喉类毒素、依法珠单抗、肾上腺素、促红细胞生成素α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促卵泡素α、促卵泡素β、磷苯妥英、钆双胺、Gadopentetates、加替沙星、格拉默、GM-CSF's、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司琼、流感嗜血杆菌B、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、替伊莫单抗、Tiuxetans、免疫球蛋白、流感嗜血杆菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔单抗、赖脯胰岛素、75％中性赖脯鱼精蛋白(neutral protamine lispro)(NPL)/25％赖脯胰岛素、50％中性鱼精蛋白Hagedorn(NPH)/50％普通胰岛素、70％NPH/30％普通胰岛素；普通胰岛素、NPH胰岛素、超级胰岛素(Ultrainsulin)、特慢胰岛素、和甘精胰岛素、干扰素、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素α-2a、干扰素α2-b、干扰素Alphacon、干扰素α-n、干扰素β、干扰素β-1a's、干扰素γ、干扰素α-con、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉罗尼酶、左氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、劳拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹-腮腺炎-风疹病毒疫苗、风疹疫苗、甲羟孕酮、美罗培南、甲泼尼龙、咪达唑仑、吗啡、奥曲肽、奥马珠单抗、昂丹司琼、帕利珠单抗、泮托拉唑、培门冬酶、培非司亭、Peg-干扰素α-2a、Peg-干扰素α-2b、培维索孟、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗和肺炎球菌缀合物疫苗、异丙嗪、瑞替普酶、生长激素、舒巴坦、舒马普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破伤风纯化类毒素、替卡西林、托西莫单抗、曲安西龙、曲安奈德、己曲安奈德、万古霉素、水痘带状疱疹免疫球蛋白、水痘疫苗、其它疫苗、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、砒霜、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、BCGLive、贝沙罗汀、博来霉素、白消安、静脉内白消安、口服白消安、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀与聚苯丙生、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素脂质体、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素2、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、丙酸屈他雄酮、Elliott'sB溶液、表柔比星、阿法依泊汀、雌氮芥、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16s、依西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉妥珠单抗、奥佐米星、吉妥珠单抗奥佐米星、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNUs、氮芥(Mechlorethamines)、氮芥(Nitrogen mustards)、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、L-PAMs、巯嘌呤、6-巯嘌呤、美司钠、氨甲喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素类、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、苯丙酸诺龙、若莫单抗、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕玛二磷酸、培加酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、光辉霉素、卟菲尔钠、卟吩姆钠、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥普单抗、沙格司亭、链脲菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、三亚乙基硫代磷酰胺(噻替派)、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、唑来膦酸(Zoledronates)、阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、视黄酸、阿利维A酸、9-顺式-视黄酸、Alvocidibs、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那昔酮、安西他滨、氨茴霉素、Apaziquones、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、Banoxantrones、Batabulins、巴马司他、贝那昔滨、苯达莫司汀、苯佐替派、比卡鲁胺、比他舍平、比立考达、比生群、Bisnafide Dimesylates、比折来新、硼替佐米、布喹那、溴匹立明、布度钛、放线菌素C、Canertinibs、卡醋胺、卡贝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、西马多丁、苯丁酸氮芥、塞奥罗奈、西罗霉素、克兰氟脲、氯法拉滨、克立那托、地西他滨、右尼古地平、右奥马铂、地扎胍宁、地吖醌、Dibrospidiums、地诺孕素、地那林、Disermolides、Dofequidars、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、达佐霉素、依考莫司汀、依达曲沙、Edotecarins、依氟鸟氨酸、依拉克达、依利奈法德、依沙芦星、乙嘧替氟、恩洛铂、恩普氨酯、Enzastaurins、依匹哌啶、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依托格鲁、氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟甲睾酮、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他滨、吉罗酚、Gimatecans、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷酰胺、伊莫福新、伊洛马司他、伊美克、英丙舒凡、Indisulams、双丙氧亚胺醌、白介素、白介素-2s、重组白介素、茚托利辛、碘苄胍、异丙铂、伊索拉定、Ixabepilones、酮曲沙、L-阿拉诺新、兰瑞肽、Lapatinibs、来多蒽琼、亮丙瑞林、亮丙瑞林、来沙骨化醇、利阿唑、洛铂、洛美曲索、法尼醇蛋白转移酶抑制剂(Lonafarnibs)、洛索蒽醌、勒托替康、马磷酰胺、甘露舒凡、马立马司他、马索罗酚、美坦辛、氮芥、美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯氨啶、美妥替哌、米帕、米泼昔芬、米索硝唑、米丁度胺、Mitocarcins、丝裂红素、米托拉酮、米托洁林、米托胍腙、米托马星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立宾、莫法罗汀、莫哌达醇、Mubritinibs、霉酚酸、奈达铂、Neizarabines、奈莫柔比星、硝氨丙吖啶、诺考达唑、诺拉霉素、诺拉曲塞、Nortopixantrones、奥马铂、Ortataxels、奥替拉西、奥昔舒仑、氧芬胂、Patupilones、培得星、培利霉素、Pelitrexols、培美曲塞、溴新斯的明、培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、Picoplatins、吡奈非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡罗蒽醌、Pixantrones、Plevitrexeds、普洛美坦、泊非霉素、波尼莫司汀、普罗帕脒、螺丙醇、嘌嘧替派、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、罗谷亚胺、罗喹美克、链黑霉素、Sabarubicins、沙芬戈、沙铂、司铂、司莫司汀、辛曲秦、西左非兰、索布佐生、索拉非尼、Sparfosates、磷乙天冬氨酸、司帕霉素、锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、角鲨胺、链黑霉素、链伐立星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、Tacedinalines、他利霉素、他莫司汀、Tariquidars、牛磺莫司汀、Tecogalans、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替罗昔隆、硫咪嘌呤、硫咪嘌呤、噻唑羧胺核苷、噻氯咪索、替洛隆、汀考达、噻莫西酸、替拉扎明、Topixantrones、曲贝替定、海鞘素743、曲托龙、曲西立滨、曲洛司坦、三甲曲沙、Triplatin Tetranitrates、曲普瑞林、曲磷胺、妥布氯唑、乌苯美司、乌瑞替派、伐司朴达、伐普肽、维替泊芬、长春碱、长春地辛、长春匹定、长春氟宁、长春米特、长春甘酯、长春西醇、长春罗新、长春罗定、长春曲醇、长春利定、伏氯唑、黄链霉素A、胍甲环素、折尼铂、亚苄维C(2H)、净司他丁、佐柔比星、Zosuquidars、乙酰唑胺、阿昔洛韦、胆影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、变应原浸出物、α1-蛋白酶抑制剂、前列地尔、阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶碱、阿米替林、异戊巴比妥、氨力农、镇痛药、抗-脊髓灰质炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破伤风免疫球蛋白、破伤风疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精氨酸、抗坏血酸、阿替洛尔、阿曲库铵、阿托品、金硫葡糖、硫唑嘌呤、氨曲南、杆菌肽、巴氯芬、巴利昔单抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、比伐卢定、肉毒抗毒素、溴苄铵、布美他尼、布比卡因、丁丙诺啡、布托啡诺、降钙素、骨化三醇、钙、卷曲霉素、卡波前列素、肉碱、头孢孟多、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑肟、头孢呋辛、氯霉素、氯普鲁卡因、氯喹、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸软骨素、绒毛膜促性腺激素α、铬、西多福韦、西咪替丁、环丙沙星、顺阿曲库铵、可乐定、可待因、秋水仙碱、粘菌素、胶原、Corticorelin ovine triflutates、促皮质素、二十四肽促皮质素、氰钴胺、环孢菌素、半胱氨酸、达昔单抗、达福普汀、达肝素、达那肝素、丹曲林、去铁胺、去氨加压素、地塞米松、右美托咪定、右泛醇、右旋糖酐、右旋糖酐铁、泛影酸、地西泮、二氮嗪、双环维林、Digibinds、地高辛、双氢麦角胺、地尔硫卓、苯海拉明、双嘧达莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯铵、多沙普仑、度骨化醇、多西环素、氟哌利多、二羟丙茶碱、依地酸、依酚氯铵、依那普利拉、麻黄碱、依前列醇、麦角钙化醇、麦角新碱、厄他培南、红霉素、艾司洛尔、雌二醇、Estrogenics、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、羟乙磷酸、依托咪酯、法莫替丁、非诺多泮、芬太尼、氟马西尼、荧光素、氟奋乃静、叶酸、甲吡唑、福米韦生、磺达肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、钆特醇、钆弗塞胺、更昔洛韦、庆大霉素、胰高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆溴铵、戈那瑞林、绒毛膜促性腺激素、嗜血杆菌B多糖、氯化血红素、Herbals、组胺、肼苯哒嗪、氢化可的松、氢吗啡酮、羟钴胺、羟嗪、莨菪碱、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺、碘拉酸、碘克沙酸、碘昔兰、异烟肼、异丙肾上腺素、日本脑炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉贝洛尔、来匹卢定、左布比卡因、左甲状腺素、林可霉素、碘塞罗宁、促黄体激素、莱姆病疫苗、锰福地吡、Manthtols、脑膜炎球菌多糖疫苗、哌替啶、甲哌卡因、美索达嗪、间羟胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲基多巴类、甲基麦角新碱、甲氧氯普胺、美托洛尔、甲硝唑、米诺环素、米伐克龙、鱼肝油酸、莫西沙星、莫罗单抗-CD3、麦考酚酸吗乙酯、萘夫西林、纳布啡、纳美芬、纳洛酮、新斯的明、烟酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普钠、去甲肾上腺素、奥芬那君、苯唑西林、羟吗啡酮、土霉素、缩宫素、潘可龙、泛醇、泛酸、罂粟碱、PEG干扰素α2A、青霉素G、喷他脒、喷他佐辛、戊巴比妥、全氟丙烷、奋乃静、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧肾上腺素、苯妥英、毒扁豆碱、植物甲萘醌、多粘菌素、解磷定、丙胺卡因、普鲁卡因胺、普鲁卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛尔、吡啶斯的明氢氧化物、维生素B6、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁、瑞芬太尼、核黄素、利福平、罗哌卡因、钐、东莨菪碱、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人蛋氨生长素、壮观霉素、链激酶、链霉素、琥珀酰胆碱、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他罗利姆、特布他林、特立帕肽、睾酮、破伤风抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸盐/酯、茶碱、硫胺素、硫乙拉嗪、硫喷妥、促甲状腺激素、亭扎肝素、替罗非班、妥布霉素、妥拉唑啉、甲苯磺丁脲、托拉塞米、氨甲环酸、曲罗尼尔、三氟拉嗪、曲美苄胺、甲氧苄啶、氨丁三醇、结核菌素、伤寒疫苗、尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸、加压素、维库溴铵、维拉帕米、伏立康唑、华法林、黄热病疫苗、齐多夫定、锌、盐酸齐拉西酮、阿克拉霉素、放线菌素、阿霉素、偶氮丝氨酸、6-氮尿苷、嗜癌素、色霉素、二甲叶酸、6-叠氮-5-氧-L-正亮氨酸、依诺他滨、氟尿苷、橄榄霉素、吡柔比星、吡曲克辛、蝶罗呤、替加氟、杀结核菌素、阿替普酶、阿西莫单抗、贝伐珠单抗、A型肉毒菌毒素、B型肉毒菌毒素、卡罗单抗喷地肽、达克珠单抗、阿法链道酶、替加色罗α、戊酸印西洛马、碘-131；抗生素物质；血管发生抑制剂；抗白内障和抗糖尿病视网膜病变药物；碳酸酐酶抑制剂；瞳孔放大剂；光动力治疗剂；前列腺素类似物；生长因子；抗肿瘤药物；抗代谢物；抗病毒药物；杀阿米巴剂和抗原生动物剂；抗结核药和抗麻风药；抗毒素和抗蛇毒素；抗血友病因子，抗抑制剂凝血复合物，抗凝血酶III，凝血因子V，凝血因子IX，血浆蛋白级分，von Willebrand因子；抗血小板制剂，集落刺激因子(CSF)；红细胞生成刺激物；止血剂和白蛋白；免疫球蛋白；凝血酶抑制剂；抗凝血剂；类固醇抗炎药物，选自阿氯米松、阿尔孕酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼缩松、肤轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟泼尼龙、丙酮缩氟氢羟龙、氟替卡松、福莫可他、氯氟舒松、卤倍他索(halobetasols)、卤米松、卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、氯替泼诺碳酸乙酯、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、利美索龙、替可的松和曲安西龙；二十二醇，前列腺素类药物，前列腺素类似物，抗前列腺素和前列腺素前体；缩瞳剂，胆碱能药和抗胆碱酯酶；及抗变态反应药。
所述组合物和修饰的PH20多肽可用于治疗通常通过所述PH20多肽或所述治疗活性剂治疗的任何病症。这些病症包括例如其中乙酰透明质酸起作用或者乙酰透明质酸与疾病病因由于例如乙酰透明质酸积聚或过度产生而相关的病症。因此，本发明提供了所述组合物和修饰的PH20多肽通过给予任何修饰的PH20多肽或本发明提供的组合物用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或病症的方法和应用。乙酰透明质酸相关疾病或病症包括例如炎症疾病和肿瘤或癌症，包括晚期癌症、转移癌症和未分化癌症，如卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和结肠癌。所述PH20多肽可以是修饰的，以呈现出对于这种治疗的增加的半衰期。例如，针对这种治疗，所述PH20多肽可以用聚合物如PEG部分修饰。
本发明还提供了增加治疗剂输送至对象的方法，通过：给予对象本发明提供的任何修饰的PH20多肽或组合物，并给予所述治疗剂。所述治疗剂可以在同一组合物中给予或者单独给予，可以在给予PH20多肽之前或之后、同时或间歇给予。给予包括任何途径，包括静脉内和皮下给予，如与给予所述治疗剂同时、间歇或随后。所述治疗剂包括上述、本文别处和/或本领域技术人员已知的任何那些制剂。
本发明还提供了通过给予本发明提供的修饰的PH20多肽或组合物治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗糖胺聚糖在脑中积聚、治疗心血管疾病、治疗眼部病症、治疗肺部疾病、增加化疗剂渗透进实体肿瘤中、治疗蜂窝组织、治疗增殖性病症、或者增加药物和其它治疗剂的生物利用度的方法。
本发明还提供了药物组合物以用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或病症、用于输送治疗剂至对象、治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗糖胺聚糖在脑中积聚、治疗心血管病症、治疗眼部病症、治疗肺部疾病、增加化疗剂渗透至实体肿瘤中、治疗蜂窝组织、治疗增殖性病症，或者增加药物及其它治疗剂的生物利用度，以及含有PH20多肽的组合物的任何其它应用。
本发明提供了鉴别或选择在变性条件下呈现稳定性的修饰的乙酰透明质酸降解酶的方法，其包括如下步骤：a)检测修饰的乙酰透明质酸降解酶在含有变性剂的组合物中和/或在变性条件下的活性；b)检测修饰的乙酰透明质酸降解酶在与a)除了不存在变性剂或变性条件之外相同的组合物中和/或在相同条件下的活性；及c)选择或鉴别修饰的乙酰透明质酸降解酶，其呈现出在a)中的活性是在b)中活性的至少5％。在这种实例中，所述活性是透明质酸酶活性。在所述方法的一些实例中，如果在a)中的活性是在b)中活性的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高，选择或鉴别修饰的乙酰透明质酸降解酶，例如如果在a)中的活性是在b)中活性的至少40％或更高，选择或鉴别修饰的乙酰透明质酸降解酶。所述方法也可以包括步骤：d)对比修饰的乙酰透明质酸降解酶在a)中的活性与未修饰的乙酰透明质酸降解酶在相同条件下检测的活性；及e)鉴别或选择修饰的乙酰透明质酸降解酶，其与未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比呈现至少120％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％或更高的透明质酸酶活性。
本发明还提供了一种鉴别或选择修饰的乙酰透明质酸降解酶的方法，所述酶在变性条件下呈现稳定性如增加的稳定性，所述方法包括如下步骤：a)检测修饰的乙酰透明质酸降解酶在含有变性剂的组合物中和/或在变性条件下的活性；b)检测相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶在含有与a)相同的变性剂的组合物中和/或在与a)相同变性条件下的活性，其中活性在a)相同的条件下检测；及c)选择或鉴别呈现出比未修饰的乙酰透明质酸降解酶更高活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶，从而鉴别或选择在变性条件下呈现出增加的稳定性的修饰的乙酰透明质酸降解酶。在这样的实例中，所述活性可以是透明质酸酶活性。在所述方法的实例中，如果所述活性与未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比是其至少120％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％或更高活性，则选择或鉴别修饰的乙酰透明质酸降解酶。在这样的实例中，所述方法还可包括另外的步骤：d)检测含有变性剂的组合物中和/或在变性条件下选择的或鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性；e)在除了不存在变性剂或变性条件之外，在与d)相同的组合物和/或在相同条件下检测相同的选择或鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性；及f)选择或鉴别呈现出在d)中的活性是在e)中活性的至少5％的修饰的乙酰透明质酸降解酶。在这样的实例中，所述活性是透明质酸酶活性。在所述方法的一些实例中，如果在d)中所述活性是在e)中活性的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高，选择或鉴别修饰的乙酰透明质酸降解酶，例如如果在d)中所述活性是在e)中活性的至少40％或更多，选择或鉴别修饰的乙酰透明质酸降解酶。
在本发明提供的鉴别或选择修饰的乙酰透明质酸降解酶的任何方法中，所述变性剂或变性条件是由温度、搅动、无盐或低盐或者存在赋形剂导致的。例如，所述变性剂或条件是由为或大约为30℃-42℃如高于或高于大约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃的升高的温度所致。在其它实例中，所述变性剂或变性条件是不存在盐或低于100mM的低盐，如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM的低盐。在进一步的实例中，所述变性剂或条件是选自如下的变性赋形剂：抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填剂和稀释剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂和甜味剂。
在本发明提供的鉴别或选择修饰的乙酰透明质酸降解酶的任何方法的特殊实例中，所述变性剂或条件是防腐剂，例如酚类防腐剂。所述酚类防腐剂可以是苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇或者对羟基苯甲酸酯。例如，所述变性剂或条件是防腐剂，其是苯酚和/或间甲酚。在这样的实例中，所述组合物中酚类防腐剂的总量以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，是或大约是0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或0.3％-0.4％。
在本发明提供的鉴别或选择修饰的乙酰透明质酸降解酶的任何方法中，在检测在a)和/或b)中乙酰透明质酸降解酶组合物的活性之前，将乙酰透明质酸降解酶暴露于变性条件或变性剂预定时间。所述预定时间是用户根据待进化或选择的特定乙酰透明质酸降解酶、特定的变性条件或变性剂、变性条件或变性剂的量或程度、乙酰透明质酸降解酶的应用或使用及其它相似因素而选择的时间。例如，所述预定时间可以是或大约是1分钟至1个月、1分钟-3周、1分钟-2周、1分钟-1周、1分钟-24小时、1分钟-12小时、30分钟-6小时或者1小时-4小时，如至少或大约至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周或1个月。
在本发明提供的鉴别或选择修饰的乙酰透明质酸降解酶的任何方法中，所述修饰的乙酰透明质酸降解酶是与未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比含有氨基酸置换、插入或缺失的酶。例如，所述修饰的乙酰透明质酸降解酶与未修饰形式的乙酰透明质酸降解酶相比含有氨基酸置换，如1个氨基酸置换或者2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸置换。在所述方法的特殊方面，筛选修饰的乙酰透明质酸降解酶的文库或集合以进化或鉴别或选择在变性条件下呈现稳定性如增加的稳定性的修饰的乙酰透明质酸降解酶。因此，在本发明方法的实例中，在a)和/或b)中检测多个修饰的乙酰透明质酸降解酶。在这样的实例中，所述多个修饰的乙酰透明质酸降解酶与相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比被修饰，以产生修饰的乙酰透明质酸降解酶集合，其中该集合中的每个修饰的蛋白质均在a)和/或b)中检测。在所述集合或文库中，每个修饰的乙酰透明质酸降解酶与未修饰形式的乙酰透明质酸降解酶相比含有一个氨基酸置换，由此所述多个修饰的酶是这样的，即在每个修饰的位置的氨基酸由除了在该位置的原始氨基酸之外的至多1-19种其它氨基酸置换，其中每个修饰的乙酰透明质酸降解酶含有不同的氨基酸置换，沿着乙酰透明质酸降解酶长度或者其选择的一部分的每个氨基酸被置换。
在本发明提供的任何方法中，修饰的乙酰透明质酸降解酶与未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比由于氨基酸的插入、缺失或置换而被修饰。未修饰的乙酰透明质酸降解酶可以是软骨素酶或者可以是透明质酸酶。在本发明的实例中，未修饰的透明质酸酶是PH20透明质酸酶或者是其缺少C-末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着位点或者GPI锚附着位点的一部分的截短形式，其中所述截短形式呈现透明质酸酶活性。PH20透明质酸酶可以是人、猴、牛、羊、大鼠、狐狸、小鼠或豚鼠PH20。在特殊实例中，所述PH20透明质酸酶是人PH20或其C末端截短形式。例如，未修饰的乙酰透明质酸降解酶是具有SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、870任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、870任一具有至少80％序列相同性如与SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、或870任一具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的氨基酸序列的酶。在特定的实例中，未修饰的乙酰透明质酸降解酶是PH20透明质酸酶，其具有SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列，如与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一呈现至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列。
在本发明提供的鉴别或选择呈现稳定性的修饰的乙酰透明质酸降解酶的任何方法中，所述方法在体外进行。本发明还提供了重复的方法，其中所述方法的步骤重复多次，其中在每次重复中，产生并检测选择的修饰的乙酰透明质酸降解酶的进一步修饰的乙酰透明质酸降解酶，其中所述修饰的乙酰透明质酸降解酶被进化为在变性条件下呈现增加的稳定性。本发明还提供了通过本发明提供的任何方法鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶。
附图简述
图1示出全长人PH20(SEQ ID NO:7示出)及其可溶的C末端截短变体的氨基酸序列。举例的全长PH20的C末端截短变体的C末端氨基酸残基以粗体字表示。举例的全长PH20的C末端截短变体的完整氨基酸序列也在SEQ ID NO:3和32-66中提供。举例的可溶PH20的C末端氨基酸残基以下划线示出，其完整序列在SEQ ID NO:3中示出。举例的非限制性的氨基酸置换的位置以高亮示出。相应位置可以通过排列对比感兴趣的序列与SEQ ID NO:3、7或32-66任一所示序列、特别是SEQ ID NO:3所示序列而鉴别。
图2示出举例的SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与其它PH20多肽的排列对比。“*”是指排列对比的残基是相同的，“:”是指排列对比的残基是不相同的，但是是相似的且在排列对比的位置含有保守氨基酸残基，“.”是指排列对比的残基是相似的且在排列对比的位置含有半保守氨基酸残基。举例的非限制性的氨基酸置换的相应位置以加亮示出。例如，图2A示出SEQ IDNO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:10所示黑猩猩PH20的排列对比。图2B示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:12所示猕猴PH20的排列对比。图2C示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:14所示食蟹猴PH20的排列对比。图2D示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:16所示牛PH20的排列对比。图2E示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:20所示小鼠PH20的排列对比。图2F示出SEQID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:22所示大鼠PH20的排列对比。图2G示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:24所示兔PH20的排列对比。图2H示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:29所示豚鼠PH20的排列对比。图2I示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:31所示狐狸PH20的排列对比。图2J示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:857所示长臂猿PH20的排列对比。图2K示出SEQID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:859所示狨猴PH20的排列对比。图2L示出SEQ ID NO:3所示人可溶PH20与SEQ ID NO:861所示猩猩PH20的排列对比。
发明详述
大纲
A.定义
B.PH20透明质酸酶
1.结构
2.功能
3.可溶的PH20多肽
C.修饰的PH20多肽
1.活性突变体
a.增加的活性
b.增加的稳定性
i.耐酚类
ii.耐热
iii.无盐
2.失活的突变体
3.另外的修饰
a.降低的免疫原性
b.与聚合物缀合
D.鉴别具有改变的性质或活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶的方法
1.乙酰透明质酸降解酶与修饰的透明质酸降解酶的文库
2.针对希望的活性或性质进行筛选或检测
3.选择或鉴别
4.重复方法
E.修饰的多肽及编码核酸分子的产生
1.编码PH20多肽的核酸的分离或制备
2.突变体或修饰的核酸和编码多肽的产生
3.载体和细胞
4.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫和昆虫细胞
d.哺乳动物表达
e.植物和植物细胞
5.纯化
6.通过PEG化修饰多肽
F.药物组合物和配制物、剂量及给予
1.配制物(液体、可注射的溶液和乳状液)
a.冻干
b.举例的配制物
i.NaCl
ii.pH和缓冲液
iii.防腐剂
iv.稳定剂
2.其它给予途径的组合物
3.剂量及给予
4.举例的PH20-胰岛素共配制物
5.包装、产品和试剂盒
G.评定透明质酸酶活性的方法
1.透明质酸酶活性
2.溶解性
3.纯度、结晶化或聚集
4.药效学/药动学
H.治疗和组合治疗的方法
1.输送治疗剂的方法
输送胰岛素
2.治疗乙酰透明质酸相关疾病和病症的方法
3.其它应用
4.避孕
I.实施例
A.定义
除非特别定义，本文中使用的所有技术和学术用语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。在本说明书中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和公开、GenBank序列、数据库、网站及其它公开的材料除非特别指出则均以其全部内容并入本文作参考。在本文术语有多个定义的情况中，以当前章节定义为准。在参考URL或其它这种标识符或地址的情况中，应理解这种标识符可以改变，互联网上特定信息可以来来往往，但是通过搜索互联网可以发现等价信息。参考表明这种信息的可利用性和公众传播。
如本文所用，乙酰透明质酸降解酶是指催化乙酰透明质酸聚合物(也称作透明质酸或HA)裂解为小分子量片段的酶。举例的乙酰透明质酸降解酶是透明质酸酶及特别的软骨素酶和裂解酶，其具有使乙酰透明质酸解聚的能力。是透明质酸降解酶的举例的软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称作软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称作硫酸软骨素裂解酶或者硫酸软骨素消除酶(eliminase))及软骨素C裂解酶。软骨素ABC裂解酶含有两种酶，即硫酸软骨素-ABC内裂解酶(endolyase)(EC 4.2.2.20)和硫酸软骨素-ABC外裂解酶(exolyase)(EC 4.2.2.21)。举例的硫酸软骨素-ABC内裂解酶和硫酸软骨素-ABC外裂解酶包括但不限于来自普通变形菌(Proteus vulgaris)和Pedobacter heparinus的那些酶(普通变形菌硫酸软骨素-ABC内裂解酶如SEQ ID NO:922所示；Sato et al.(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1):39-46)。来自细菌的举例的软骨素酶AC酶包括但不限于来自Pedobacter heparinus的酶，如SEQ ID NO:923所示；来自Victivallisvadensis的酶，如SEQ ID NO:924所示；及来自金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)的酶(Tkalec et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology66(1):29-35；Ernst et al.(1995)Critical Reviews in Biochemistry and MolecularBiology 30(5):387-444)。来自细菌的举例的软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属(Streptococcus)和黄杆菌属(Flavobacterium)的那些酶(Hibi et al.(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2):121-4；Michelacci et al.(1976)J.Biol.Chem.251:1154-8；Tsuda et al.(1999)Eur.J.Biochem.262:127-133)。
如本文所用，透明质酸酶是指一类降解乙酰透明质酸的酶。透明质酸酶包括但不限于细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)，来自水蛭、其它寄生虫和甲壳纲动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，以及哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶包括任何非人源酶，包括但不限于源于鼠、犬、猫、野兔、禽类、牛、羊、猪、马、鱼、蛙、细菌的酶，以及来自水蛭、其它寄生虫和甲壳纲动物的任何酶。举例的人透明质酸酶包括HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和PH20。透明质酸酶也包括可溶的透明质酸酶，包括羊和牛PH20，及可溶的PH20。举例的透明质酸酶包括SEQ ID NO:6、7-31、69、70、71、72、856-861、869-921所示任何酶，其成熟形式(缺少信号序列)或者其等位基因或种变体。透明质酸酶也包括呈现透明质酸酶活性的其截短形式，包括是可溶的C末端截短变体。
如本文所用，PH20是指一种类型透明质酸酶，其在精子中出现且是中性活性的。PH-20发生在精子表面，及在溶酶体衍生的顶体中，在此其与顶体膜内面结合。PH20包括任何来源的那些，包括但不限于源于人、黑猩猩、食蟹猴、猕猴、鼠、牛、羊、豚鼠、兔和大鼠。举例的PH20多肽包括前体和成熟形式，包括来自人(SEQ ID NO:6和7)、黑猩猩(SEQ ID NO:8、9、10、869和870)、猕猴(SEQ ID NO:11和12)、食蟹猴(SEQ ID NO:13和14)、牛(例如SEQ ID NO:15-18)；小鼠(SEQ ID NO:19和20)；大鼠(SEQ ID NO:21和22)；兔(SEQ ID NO:23和24)；绵羊(SEQ ID NO:25-27)、豚鼠(SEQ IDNO:28和29)；狐狸(SEQ ID NO:30和31)；长臂猿(SEQ ID NO:856和857)、狨猴(SEQ ID NO:858和859)和猩猩(SEQ ID NO:860和861)。提及PH20包括前体PH20多肽和成熟PH20多肽(如其中已经除去信号序列的那些)、具有活性的其截短形式，及包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体，及其它变体，包括与SEQ ID NO:7所示前体多肽或者其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽。PH20多肽也包括含有化学或翻译后修饰的那些多肽，及不含有化学或翻译后修饰的那些多肽。这种修饰包括但不限于PEG化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化，及本领域已知的其它多肽修饰。举例的可商购的牛或羊可溶透明质酸酶是透明质酸酶(羊透明质酸酶)和透明质酸酶(牛透明质酸酶)。
如本文所用，可溶的PH20是指特征在于在生理条件下其溶解性的多肽。通常，可溶的PH20缺少全部或部分糖磷脂酰锚(GPI)附着序列，或者不能足以锚定细胞膜。例如，可溶的PH20可以是PH20的C末端截短变体，缺少相应于全部或部分糖磷脂酰(GPI)锚附着序列的连续氨基酸序列。因此，在从细胞中表达时，可溶的PH20分泌进培养基中。可溶的PH20蛋白质可以通过其在加热至37℃的Triton X-114溶液中分配进水相而区分(Bordier etal.,(1981)J.Biol.Chem.,256:1604-7)。膜锚定的如脂质锚定的透明质酸酶将分配进去污剂富集相，但是在用磷脂酶C处理后将分配进去污剂不足相或水相。本发明包括的可溶的PH20透明质酸酶是膜锚定的透明质酸酶，其中与透明质酸酶锚定膜相关的一或多个区域已经除去或修饰，其中所述可溶形式保留透明质酸酶活性。可溶的透明质酸酶包括重组的可溶透明质酸酶及包含于或纯化自天然来源的那些酶，例如羊或牛的睾丸提取物。举例的这种可溶的透明质酸酶是可溶的人PH20(SEQ ID NO:3或32-66)。其它可溶的透明质酸酶包括羊(SEQ ID NO:25-27)和牛(SEQ ID NO:16或18)PH20。
如本文所用，可溶的人PH20(sHuPH20)包括在人PH20的C末端缺少包括全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚序列的连续氨基酸序列的人PH20多肽(C-末端截短的PH20多肽)，由此在表达时，所述多肽在生理条件下是可溶的。例如，可溶的人PH20多肽是前体形式SEQ ID NO:6所示人PH20的C末端截短多肽，或者SEQ ID NO:7的缺少信号序列的其成熟形式，或者其等位基因变体(例如SEQ ID NO:68-72任一所示)。溶解性可以通过任何合适方法评定，证实了在生理条件下的溶解性。举例的这种方法是X-114测定，其评定了分配进水溶液相并如上述。此外，可溶的人PH20多肽如果在CHO细胞如CHO-S细胞中产生，则是在细胞培养基中表达和分泌的多肽。然而，可溶的人PH20多肽不限于在CHO细胞中产生的那些，可以在任何细胞或通过任何方法产生，包括重组表达和多肽合成。在CHO细胞中分泌是被定义的。因此，如果多肽可以在CHO细胞中表达和分泌且在培养基中是可溶的，即当用X-114提取时分配进水相，则无论其是否是如此产生的，其是可溶的PH20多肽。sHuPH20多肽的前体多肽可包括信号序列，如异源或非异源(即天然的)信号序列。举例的前体是包括信号序列如在氨基酸位置1-35(见例如SEQ ID NO:6的氨基酸1-35)的天然的35个氨基酸的信号序列的那些多肽。
如本文所用，“天然”或“野生型”的PH20多肽是指由天然或天然发生的PH20基因编码的PH20多肽，包括等位基因变体，其天然存在于生物体中包括人和其它动物中。不提及物种的野生型PH20是指涵盖任何种的野生型PH20。野生型PH20多肽是编码的前体多肽、其片段及其加工的形式，如缺少信号序列的成熟形式以及其任何翻译前或翻译后加工或修饰形式。也包括天然PH20多肽是翻译后修饰的那些多肽，包括但不限于通过糖基化、羧化和/或羟化修饰的那些多肽。举例的野生型人PH20的氨基酸序列在SEQ ID NO:6和7中示出，那些等位基因变体包括其成熟形式在SEQ IDNO:68-72中示出。其它动物产生天然PH20，包括但不限于SEQ ID NO:8-31、856-861、869或870任一所示天然或野生型序列。
如本文所用，修饰是对多肽的氨基酸序列或核酸分子的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换。修饰也可以包括由于与另一部分直接或间接缀合或连接而发生的分子的翻译后修饰或其它改变。修饰多肽的方法为本领域技术人员熟知，例如通过使用重组DNA方法进行。
如本文所用，“修饰的乙酰透明质酸降解酶”是指与参考的或未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比含有修饰的乙酰透明质酸降解酶。所述修饰可以是氨基酸置换(取代)、插入(添加)或缺失一或多个氨基酸残基。所述氨基酸残基可以是天然或非天然氨基酸。在一些情况中，所述修饰可以是翻译后修饰。修饰的乙酰透明质酸降解酶与参考的或未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比可具有至多150个氨基酸差异，只要所得修饰的乙酰透明质酸降解酶呈现透明质酸酶活性即可。典型地，修饰的乙酰透明质酸降解酶含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸修饰。
如本文所用，未修饰的乙酰透明质酸降解酶是指用于进行本发明提供的修饰而选择的起始多肽。所述起始多肽可以是天然发生的野生型形式的多肽。此外，起始多肽可以被改变或突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是相对于本文产生的随后修饰的多肽仍被称作起始未修饰的多肽。因此，本领域已知的已经被修饰为与未修饰的参考蛋白质相比具有希望的特定活性或性质增加或降低的现有蛋白质可以选择并用作起始未修饰的多肽。例如，已经从其天然形式通过一或多个单氨基酸改变而修饰并具有希望的性质增加或降低如氨基酸残基变化以改变糖基化的蛋白质可以选择用于修饰，并因此在本文称作未修饰的蛋白质以进行进一步修饰。未修饰的乙酰透明质酸降解酶包括人和非人乙酰透明质酸降解酶，包括来自非人哺乳动物和细菌的乙酰透明质酸降解酶。举例的未修饰的乙酰透明质酸降解酶是SEQ ID NO:2、3、6、7-66、68-72、856-861、869-924任一所示那些酶，或者呈现透明质酸酶活性的其成熟的C末端截短形式，或者与SEQ IDNO:2、3、6、7-66、68-72、856-861、869-924任一呈现至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的乙酰透明质酸降解酶。应理解未修饰的乙酰透明质酸降解酶通常是不含有所述修饰如修饰的乙酰透明质酸降解酶的氨基酸置换的酶。
如本文所用，“修饰的PH20多肽”或者“变体PH20多肽”是指这样的PH20多肽，在其氨基酸序列中与参考的未修饰的PH20多肽相比含有至少一个氨基酸修饰如本文所述的至少一个氨基酸置换。修饰的PH20多肽可具有至多150个氨基酸置换，只要所得修饰的PH20多肽呈现透明质酸酶活性即可。典型地，修饰的PH20多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸置换。应理解修饰的PH20多肽除了如本文所述至少一个氨基酸置换之外也可包含任一或多个其它修饰。
如本文所用，未修饰的PH20多肽是指选择用于本发明提供的修饰的起始PH20多肽。所述起始多肽可以是天然发生的野生型形式多肽。此外，所述起始多肽可以被改变或突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是相对于本文产生的随后的修饰的多肽仍称作起始未修饰的多肽。因此，可以选择本领域已知的已经被修饰为特定活性或性质与未修饰的参考蛋白质相比具有希望的增加或降低的现有蛋白质并用作起始未修饰的多肽。例如，可以选择已经从其天然形式通过一或多个单氨基酸变化而修饰并具有希望的性质增加或降低如氨基酸残基变化以改变糖基化的蛋白质进行修饰，并因此在本文仍称作未修饰的以进行进一步修饰。举例的未修饰的PH20多肽是人PH20多肽或者其等位基因或种变体或者其它变体，包括成熟或前体多肽。例如，举例的参考PH20多肽是SEQ ID NO:7、69或72所示成熟全长PH20多肽，或者其C末端截短形式如SEQ ID NO:3和32-66任一所示，或者与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一呈现至少68％、69％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的PH20多肽。参考的PH20多肽也可包括相应前体形式，如SEQ ID NO:2、6、68、70、71所示，或者其它前体形式，或者与SEQ ID NO:2、6、68、70、71任一呈现至少68％、69％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的PH20多肽。应理解未修饰的乙酰透明质酸降解酶通常是不含有所述修饰如修饰的乙酰透明质酸降解酶的氨基酸置换的酶。
如本文所用，N-连接的部分是指多肽的天冬酰胺(N)氨基酸残基，其能通过多肽的翻译后修饰而被糖基化。举例的人PH20的N-连接的部分包括SEQ ID NO:3或7所示氨基酸序列的氨基酸N47、N131、N200、N219、N333、N358和N365(相应于SEQ ID NO:6所示人PH20的氨基酸残基N82、N166、N235、N254、N368、N393和N490)。
如本文所用，N-糖基化多肽是指含有至少三个N-连接的氨基酸残基的寡糖连接的PH20多肽，例如N-连接的部分相应于SEQ ID NO:3或7的氨基酸残基N200、N333和N358。N-糖基化的多肽可包括这样的多肽，其中3、4、5和直至所有N-连接的部分均与寡糖连接。所述N-连接的寡糖可包括寡甘露糖、复合物、杂交体或者硫酸寡糖，或者其它寡糖和单糖。
如本文所用，N-部分糖基化的多肽是指这样的多肽，其最低限度含有与至少3个N-连接的部分连接的N-乙酰葡糖胺聚糖。部分糖基化的多肽可包括多种聚糖形式，包括单糖、寡糖，及分支的糖形式，包括通过用EndoH、EndoF1、EndoF2和/或EndoF3处理多肽形成的那些多肽。
如本文所用，“条件”是指可影响蛋白质或物质活性或性质的任何参数。对于本发明而言，条件通常是指配制物中除了活性剂(例如修饰的PH20透明质酸酶)之外存在赋形剂、载体或其它成分，包括其量；温度；时间(例如贮存或暴露时间)；贮存容器；贮存性质(例如搅动)和/或与暴露或应用相关的其它条件。
如本文所用，关于蛋白质所用术语“变性”是指蛋白质的生物化学改变，由此蛋白质的性质或活性被降低或消除。所述生物化学改变可以是蛋白质的三级结构的变化至未折叠(unfold)。所述性质或活性可以完全消除或者可以降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
如本文所用，性质是指物理或结构性质，如三维结构、pI、半衰期、构象及其它这种物理特性。例如，性质的改变可以通过蛋白质的溶解性、聚集或结晶化而显示。
如本文所用，活性是指多肽或其一部分与全长(完整)蛋白质相关的功能活性。功能活性包括但不限于生物学活性、催化或酶活性、抗原性(结合或与多肽竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力以及特异性结合所述多肽的受体或配体的能力。
如本文所用，透明质酸酶活性是指通过酶促催化透明质酸裂解的能力。关于透明质酸酶的美国药典United States Pharmacopeia(USP)XXII测定间接确定了透明质酸酶活性，通过测量在使所述酶与HA在37℃反应30分钟后剩余的较高分子量透明质酸或乙酰透明质酸(HA)底物的量而确定(USPXXII-NF XVII(1990)644-645United States Pharmacopeia Convention,Inc,Rockville,MD)。参考标准溶液可用于测定中以确定任何透明质酸酶的相对活性单位。确定透明质酸酶如PH20包括修饰的PH20多肽的透明质酸酶活性的体外测定为本领域已知并在本文中描述。举例的测定包括本文描述的微浊度(microturbidity)测定，其测量透明质酸酶对透明质酸的间接裂解，通过检测当未裂解的透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶沉淀而测量。可以使用参考标准，例如产生标准曲线以确定检测的透明质酸酶的单位活性。
如本文所用，中性活性是指PH20多肽在中性pH如在或在大约pH6.0-pH 7.8通过酶促催化透明质酸裂解的能力。
如本文所用，“增加的活性”是指修饰的PH20透明质酸酶，当在相同条件下检测时，修饰的PH20透明质酸酶与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20透明质酸酶相比呈现更高的透明质酸酶活性。例如，修饰的PH20透明质酸酶呈现未修饰的或参考的PH20透明质酸酶活性的至少或大约至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。
如本文所用，蛋白质的“溶解性”是指蛋白质在水溶液中是均质的，其中蛋白质分子扩散且不自发沉淀。因此，可溶的蛋白质溶液是其中在含有所述蛋白质的溶液中不存在可见的或离散粒子的溶液，由此所述粒子不可被容易过滤。通常，如果在溶液中无可见或离散粒子，则蛋白质是可溶的。例如如果其不含有或含有很少的可以通过用孔径为0.22μm的滤器除去的粒子，则蛋白质是可溶的。
如本文所用，蛋白质的聚集或结晶化是指在含有所述蛋白质的溶液中存在可见的或离散颗粒。典型地，所述颗粒大小大于10μm，如大于15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm或更大。聚集或结晶化可以由于溶解性降低、蛋白质变性增加或者共价键形成而导致。
如本文所用，“变性条件”是指任何条件或物质，当暴露于蛋白质时，其影响蛋白质的降解或变性，通常是蛋白质的三级或二级结构丧失或部分丧失的结果。变性条件可导致如活性丧失或降低、溶解性丧失或降低、聚集和/或结晶化的结果。所述变性条件不需要是使蛋白质完全失活的条件，而是导致蛋白质活性随着时间而降低的条件。因此，如果蛋白质的活性在存在所述条件较不存在所述条件下降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，则该条件是变性条件。变性条件可以是由于外部压力或物理条件(例如搅动、温度、贮存时间、无稳定剂)所致或者可以是由于存在变性剂所致。例如，所述变性条件可以是由于加热、酸或化学变性剂所致。举例的变性条件包括但不限于存在强酸或强碱、浓缩的无机盐、有机溶剂(例如乙醇或氯仿)、尿素、高或低pH值(pH值极限)、升高的温度(例如加热)、存在可以变性的赋形剂(例如酚类防腐剂或去污剂)及低或基本没有另外为蛋白质稳定性所需的稳定剂(例如NaCl)。
如本文所用，“变性剂”是指导致变性的任何物质、分子或化合物。例如，变性剂可包括强酸或强碱、浓缩的无机盐、有机溶剂(例如乙醇或氯仿)、防腐剂、去污剂或其它赋形剂。
如本文所用，“变性条件抗性”是指与变性相关或者由变性所致的蛋白质的性质或活性降低或消除的任何量的减少。例如，变性与增加的结晶化或聚集、降低的溶解性或降低的活性相关或导致这些现象。因此，变性抗性是指蛋白质当暴露于变性条件时与参考蛋白质(例如未修饰的酶)相比呈现降低的聚集或结晶化、增加的溶解性或者增加的或更高的活性(例如透明质酸酶活性)。变性条件抗性不需要是绝对的或永久的，但是可以是由于修饰的乙酰透明质酸降解酶的变性较未修饰的酶在变性条件下更缓慢出现而实现的，由此修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性或性质实现更长时间。例如，修饰的乙酰透明质酸降解酶如修饰的PH20透明质酸酶如果在存在变性条件或变性剂下较未修饰的多肽呈现例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、…20％、…30％、…40％、…50％、…60％、…、70％、…80％、…90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或更多的变性抗性，则其呈现出变性条件抗性。在一些情况中，修饰的多肽与未修饰的多肽相比呈现105％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的增加的变性抗性。
如本文所用，修饰的PH20透明质酸酶的稳定性是指其呈现出对由变性条件或变性剂所致变性的抗性。修饰的PH20多肽如果在存在变性条件或变性剂下保留一些活性，如原始或初始透明质酸酶在暴露于变性条件之前的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则其呈现稳定性。通常，修饰的PH20透明质酸酶如果在变性条件下与在不存在所述变性条件下相比保留至少50％或更多的透明质酸酶活性，则其是稳定的。评定透明质酸酶活性的测定为本领域技术人员已知并在本文中描述。应理解所述酶的稳定性不需要是永久或长期的，而是在需要该活性时期显示即可。例如，修饰的PH20透明质酸酶如果在暴露时或在暴露于一或多种变性条件或变性剂期间(例如存在变性赋形剂如防腐剂)呈现至少2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、1个月、6个月或者1年时间的活性，则其是稳定的。例如，修饰的PH20透明质酸酶如果在暴露时或暴露于一或多种变性条件或变性剂(例如存在变性赋形剂如防腐剂)期间在或在大约2℃-8℃(包括端点)的温度呈现至少1个月的活性或者在或在大约30℃-42℃(包括端点)的温度呈现至少3天的活性，则其是稳定的。
因此，本发明提供的配制物或共配制物的“稳定”或“稳定性”是指其中修饰的乙酰透明质酸降解酶如修饰的PH20透明质酸酶在暴露于一或多种变性条件或变性剂(例如存在变性赋形剂如防腐剂)时在或在大约2℃-8℃温度稳定至少1个月或者在或在大约30℃-42℃温度稳定至少3天。
如本文所用，修饰的PH20透明质酸酶的“增加的稳定性”是指在存在相同变性条件(例如存在变性赋形剂如防腐剂)下，修饰的PH20透明质酸酶与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20透明质酸酶相比呈现更高的透明质酸酶活性。例如，修饰的PH20透明质酸酶如果在存在变性条件(例如存在变性赋形剂如防腐剂)下呈现至少或大约至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高的未修饰的或参考的PH20透明质酸酶的活性，则其呈现增加的稳定性。
如本文所用，“升高的温度”是指高于室温或环境温度的温度。通常，升高的温度是至少高于或高于大约30℃，如30℃-42℃，通常是32℃-37℃或者35℃-37℃(包括端点)的温度。
如本文所用，室温是指通常在大约或在18℃至大约或在32℃的范围。本领域技术人员意识到室温随着场所和主导条件而变化。例如，室温在温热气候下如意大利或德克萨斯可以更高。
如本文所用，“在相同条件下对比”蛋白质是指对不同的蛋白质相同或基本上相同地处理，由此可影响蛋白质或物质的活性或性质的一或多个条件在检测物质之间不改变或基本上不改变。例如，当将修饰的PH20多肽的透明质酸酶活性与未修饰的PH20多肽对比时，任一或多个条件如多肽的量或浓度、所述配制物中除了活性物质(例如修饰的PH20透明质酸酶)之外赋形剂、载体或其它成分的存在包括量、温度、贮存时间、贮存容器、贮存性质(例如搅动)和/或与暴露或使用相关的其它条件在对比的多肽之间和之中是相同的或基本上相同的。
如本文所用，“预定时间”是指预先确定或决定的时间。例如，预定时间可以是与乙酰透明质酸降解酶的活性的希望的持续时间相关的根据蛋白质的希望的应用或使用而预先选择的时间。预定时间可以是小时、天、月或年。例如，预定时间可以是至少大约或大约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、6个月、1年或更长时间。
如本文所用，“贮存”是指配制物一旦制备之后不是立即给予对象，而是在使用之前在特定条件(例如特定温度、时间和/或形式(例如液体或冻干形式))下保持一段时间。例如，液体配制物在给予对象之前在不同温度下可保持几天、几周、几个月或几年，所述温度如冷藏(0℃-10℃，如2°-8℃)、室温(例如直至32℃，如18℃至大约或至32℃)或者升高的温度(例如30℃-42℃，如32℃-37℃或35℃-37℃)。
如本文所用，“赋形剂”是指活性物质的配制物中的化合物，当不存在所述活性物质给予时其不提供活性物质的生物学作用。举例的赋形剂包括但不限于盐、缓冲剂、稳定剂、渗透压修饰剂、金属、聚合物、表面活性剂、防腐剂、氨基酸和糖。
如本文所用，稳定剂是指如果需要时在所述配制物中加入的化合物，以保护修饰的PH20多肽或其它活性物质免于降解，如由于本发明的配制物当处理、贮存或使用时暴露于变性条件所致。因此，本发明包括防止蛋白质被组合物中其它成分降解的物质。举例的这种物质是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂、抑制剂或底物以及如本文所述其它物质。
如本文所用，抗微生物效力检测或防腐剂效力检测(PET)证实产物中防腐剂系统的效力。将产物用控制数量的特定生物体接种。然后该检测对比在对照样品与检测样品上在28天期间的微生物的水平。通常，目标市场具有不同的PET要求。例如，美国药典(USP)与欧洲药典(EP)的PET要求是不同的。进行抗微生物效力检测的参数，包括在不同的市场中，是为本领域技术人员已知的。
如本文所用，防腐剂的抗微生物有效量是指防腐剂杀死或抑制样品中由于贮存或使用而导入的微生物生物体增殖的量。例如，对于多剂量容器，抗微生物有效量的防腐剂抑制可能由重复抽取各次剂量而导入的微生物的生长。USP和EP(EPA和EPB)具有抗微生物要求，其确定了防腐剂效力并在严格性上有变化。例如，抗微生物有效量的防腐剂是这样的量，由此在抗微生物防腐剂效力检测(APET)中，在接种之后7天出现的细菌生物体减少至少1.0log10单位。在特殊的实例中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量，由此在接种后7天出现细菌生物体减少至少1.0log10单位，在接种后14天出现细菌生物体减少至少3.0log10单位，在接种后28天出现细菌生物体不再进一步增加，及在接种后7天出现真菌生物体至少不增加。在进一步的实例中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量，由此在接种后24小时细菌生物体减少至少1.0log10单位，在接种后7天出现细菌生物体减少至少3.0log10单位，在接种后28天出现细菌生物体不再进一步增加，在接种14天后真菌生物体减少至少1.0log10单位，及在接种后28天真菌生物体不再进一步增加。在另一实例中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量，由此在用具有微生物接种体的组合物接种后6小时出现细菌生物体减少至少2.0log10单位，在接种后24小时出现细菌生物体减少至少3.0log10单位，在接种后28天出现细菌生物体不再复原，在接种后7天出现真菌生物体减少至少2.0log10单位，及在接种后28天出现真菌生物体至少不再进一步增加。
如本文所用，“防腐剂”是指天然发生或合成或重组产生的物质，当将其加入分子或蛋白质组合物中时，防止所述组合物中微生物生长包括细菌或真菌生长。
如本文所用，“酚类防腐剂”是指这样的防腐剂，其含有附着于芳香碳环如苯环的一个羟基基团。举例的酚类防腐剂包括但不限于苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯。例如，甲酚包括间-甲酚(m-甲酚)具有在酚分子的苯环上取代的甲基。
如本文所用，“亲酚的”是指蛋白质如修饰的PH20多肽，其在存在抗微生物有效量的防腐剂条件下呈现出稳定性。术语“耐酚”与“亲酚”在本文可互换使用且具有相同含义。例如，是耐酚或亲酚的修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20透明质酸酶相比当在含有酚类防腐剂的相同变性条件下检测时典型呈现出增加的稳定性。例如，修饰的PH20透明质酸酶在存在酚类防腐剂的条件下呈现至少或大约至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高的未修饰的或参考的PH20透明质酸酶的活性。
如本文所用，“耐热”是指蛋白质如修饰的PH20多肽在高于或大约30℃如30℃-42℃及通常为32℃-37℃或35℃-37℃的升高的温度下呈现稳定性。例如，耐热的修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20透明质酸酶相比当在相同的升高的温度变性条件下检测时典型呈现增加的稳定性。例如，修饰的PH20透明质酸酶在升高温度下呈现出未修饰的或参考的PH20透明质酸酶的至少或大约至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高的活性。
如本文所用，术语“去污剂”与术语“表面活性剂”或“表面活性物质”可互换使用。表面活性剂典型是两亲有机化合物，即含有疏水性基团(尾端)和亲水性基团(头端)，其使得表面活性剂可溶解于有机溶剂和水中。表面活性剂通过在其头端存在形式上荷电基团而分类。非离子型表面活性剂在其头端无荷电基团，而离子型表面活性剂在其头端携带净电荷。两性离子表面活性剂含有具有两个相反电荷基团的头端。通常的表面活性剂的一些实例包括：阴离子表面活性剂(基于硫酸盐、磺酸盐或羧酸盐阴离子)：全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵及其它烷基硫酸盐、月桂醇聚醚硫酸酯钠(也称作月桂基乙醚硫酸钠，或SLES)、烷基苯磺酸盐；阳离子表面活性剂(基于季铵阳离子)：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)a.k.a.溴化十六碳烷基三甲铵，及其它烷基三甲基铵盐、氯化十六烷吡啶(CPC)、聚乙氧基牛脂胺(polyethoxylated tallowamine，POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)；两性离子表面活性剂(两性的)：十二烷基甜菜碱；椰油酰胺丙基甜菜碱；coco ampho glycinate；非离子表面活性剂：烷基聚(环氧乙烷),烷基苯酚聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(商业上称作泊洛沙姆或Poloxamines)、烷基多聚葡糖苷，包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷、脂肪醇(例如十六烷醇和油醇)、椰子酰胺MEA、椰子酰胺DEA、聚山梨醇酯(Tween 20、Tween 80等)、Triton去污剂，及十二烷基二甲胺氧化物。
如本文所用，“缓冲剂”是指一种物质，通常是溶液，尽管加入强酸或强碱及温度、压力、体积或氧化还原电位的外部影响，其可以保持其pH恒定。缓冲剂防止另一化学物质的浓度改变，如防止氢离子浓度(pH)显著改变的质子供体和受体系统。所有缓冲剂的pH值均是温度和浓度依赖性的。维持pH值或范围的缓冲剂的选择可以由本领域技术人员基于已知缓冲剂的缓冲能力而根据经验确定。举例的缓冲剂包括但不限于碳酸氢盐缓冲剂、二甲基胂酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或者Tris缓冲剂。例如，Tris缓冲剂(氨丁三醇)是一种基于胺的缓冲剂，其pKa为8.06，有效pH范围在7.9-9.2之间。对于Tris缓冲剂，温度每降低1℃，pH增加大约0.03单位，及每10倍稀释降低0.03-0.05单位。
如本文所用，天然发生的α-氨基酸的残基是天然发现的那些20个α-氨基酸残基，其通过在人体中荷电的tRNA分子与其关联的mRNA密码子的特异性识别掺入蛋白质中。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当提及探针或引物时，其任选是标记的，如用可检测标记如荧光标记或放射性标记进行标记，涵盖单链分子。这种分子典型长度为其靶是统计学独特的或者低拷贝数(典型低于5个，通常低于3个)以探查或引发文库。通常，探针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的至少14、16或30个连续核苷酸序列。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中存在的氨基酸是根据其已知的三个字母或一个字母缩写(表1)鉴别的。在各个核酸片段中存在的核苷酸根据本领域常用的标准单字母命名法命名。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两或更多个氨基酸。对于本发明而言，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸及氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文所用，“氨基酸残基”是指多肽在其肽键化学消化(水解)形成的氨基酸。本发明描述的氨基酸残基假定是“L”异构体形式。如此命名的“D”异构体形式残基可以由任何L-氨基酸残基取代，只要所述多肽保留希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与在J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)中描述及采用的37 C.F.R.§§1.821-1.822的标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写在表1中示出：
表1-对照表
应注意到本文以化学式表示的所有氨基酸残基序列从左至右的方向均是从氨基末端至羧基末端的常规方向。此外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对应表(表1)中列出的氨基酸以及修饰的和不常见的氨基酸，如在并入本文作参考的37 C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些。此外，应注意到在氨基酸残基序列的起始或终止处的破折号表示与一或多个氨基酸残基的进一步序列、与氨基末端基团如NH2或者与羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“天然发生的氨基酸”是指在多肽中出现的20个L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指与天然氨基酸具有相似结构但是已经被结构修饰为模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。非天然发生的氨基酸因此包括例如除了所述20个天然氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。举例的非天然氨基酸在本文描述且为本领域技术人员已知。
如本文所用，等动力混合物是其中氨基酸的摩尔比率已经基于其报道的反应率而调整的混合物(见例如Ostresh et al.,(1994)Biopolymers34:1681)。
如本文所用，合适的氨基酸保守取代为本领域技术人员已知，通常可以不用改变所得分子的生物学活性而制备。本领域技术人员意识到，通常在多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物学活性(见例如Watson et al.Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,TheBenjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。这种取代可以根据下表2所示进行：
表2
原始残基 举例的保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
其它取代也是允许的，可以根据经验确定或者根据已知保守取代确定。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链的、线性或环形DNA分子，其含有以天然未发现的方式组合和并列的DNA节段。DNA构建体以人工处理的结果存在，包括处理的分子的克隆及其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有特定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，从5’至3’方向读取时，其编码所述特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体外合成或者从天然与合成分子的组合中制备。多核苷酸分子的长度在本文以核苷酸(缩写为nt)或碱基对(缩写为bp)给出。术语核苷酸在语境允许之处用于是指单链和双链分子。当该术语用于双链分子时，其用于表示全长，且应理解为与术语碱基对等价。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链的长度可略微不同，其末端可以是错列的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸不可能均配对。这种未配对的末端通常长度不超过20个核苷酸。
如本文所用，“在相应于…的位置”是“相应于”揭示的序列如序列表所示序列中的核苷酸或氨基酸位置的核苷酸或氨基酸位置是指在使用标准排列对比算法如GAP算法与揭示的序列排列对比以使相同性最大化时鉴别的核苷酸或氨基酸位置。对于本发明而言，PH20序列的排列对比是与SEQID NO:3、7或32-66任一及特别是SEQ ID NO:3所示氨基酸序列排列对比。因此，在本文提及一个位置或氨基酸置换相应于参考SEQ ID NO:3的位置也是指所述位置或氨基酸置换相应于参考SEQ ID NO:7或32-66任一序列的位置，因为这些序列与SEQ ID NO:3所示序列中相应残基是相同的。通过序列排列对比，本领域技术人员可鉴别相应残基，例如使用保守和相同氨基酸残基为指导。通常，为了鉴别相应位置，排列对比氨基酸序列，以便获得最高等级匹配(见例如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。图2例证了举例的用于置换的相应残基的排列对比和鉴别。
如本文所用，“序列相同性”是指检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸对比中相同或相似氨基酸或核苷酸碱基的数目。序列相同性可以通过核酸或蛋白质序列的序列排列对比以鉴别相似性或相同性区域而确定。对于本发明而言，序列相同性通常是通过排列对比以鉴别相同残基而确定。排列对比可以是局部或整体的，但是对于本发明而言，排列对比通常是整体对比，其中对比每个序列的全长。在对比的序列之间可以鉴别匹配、错配和缺口。缺口是在对比的序列残基之间插入的无效氨基酸或核苷酸，以便排列对比相同或相似特性。通常，可以是内部或末端缺口。序列相同性可以通过考虑缺口以相同残基数/最短序列的长度×100而确定。当使用缺口罚分时，序列相同性可以末端缺口不罚分而确定(例如末端缺口不惩罚)。或者，序列相同性可以不考虑缺口以相同位置数/总对比序列长度×100而确定。
如本文所用，“整体对比”是从起始至末端排列对比两个序列，每个序列中每个字母仅排列对比一次。无论序列之间是否有相似性或相同性，产生对比。例如，基于“整体对比”的50％序列相同性是指在两个对比的序列的完整序列的对比中，在每长度为100个核苷酸中，50％的残基是相同的。应理解整体对比在对比的序列长度不相同的时也可用于确定序列相同性。在确定序列相同性中考虑序列的末端中的差异，除非选择“末端缺口不罚分”。通常，整体对比用于在其长度的大部分呈现显著相似性的序列。举例的进行整体对比的算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman et al.J.Mol.Biol.48:443(1970)。举例的进行整体对比的程序可公开获得，包括在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网址(ncbi.nlm.nih.gov/)可获得的Global Sequence Alignment Tool，及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html可获得的程序。
如本文所用，“局部对比”是对比两个序列，但是仅对比呈现相似性或相同性的序列的那些部分。因此，局部对比确定一个序列的亚节段在另一序列中是否存在。如果无相似性，无对比结果返回。局部对比算法包括BLAST或Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))。例如，基于“局部对比”的50％序列相同性是指在任何长度的两个对比序列的完整序列对比中，长度为100个核苷酸的相似性或相同性区域具有50％的残基在相似性或相同性区域中是相同的。
对于本发明而言，序列相同性可以通过标准排列对比算法程序确定，使用由每个供应商制定的默认缺口罚分。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元对比矩阵(含有相同性值为1，无相同性值为0)及Gribskov et al.Nucl.Acids Res.14:6745(1986)的加权对比矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分3.0，每个缺口中每个符号另加0.10罚分；及(3)末端缺口不罚分。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”核苷酸序列或者任两个多肽是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”氨基酸序列或者提及相同性百分比的其它相似变量，可以使用基于局部或整体对比的已知计算机算法确定(见例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software，提供了许多已知和可公开获得的排列对比算法数据库和程序的链接)。通常，对于本发明而言，序列相同性是使用基于整体对比的计算机算法确定的，如Needleman-WunschGlobal Sequence Alignment tool，得自NCBI/BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&Page_TYPE＝BlastHome)；LAlign(William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm(Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357))；及Xiaoqui Huang的程序，可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得。通常，当对比本发明的核苷酸序列时，使用末端缺口罚分的对比。当对比的序列的长度基本相同时，也可以使用局部对比。
因此，如本文所用，术语“相同性”是指检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的对比或排列对比。在一个非限制性实例中，“至少90％相同”是指相对于参考多肽或多核苷酸的90-100％的相同性百分比。在90％或更高水平的相同性表示这样的事实，即如果为了例证目的，对比长度为100个氨基酸或核苷酸的检测和参考多肽或多核苷酸，检测多肽或多核苷酸中不超过10％(即100中的10个)氨基酸或核苷酸与参考多肽不同。在检测和参考多核苷酸之间可以进行相似对比。这种差异可以在氨基酸序列全长随机分布的点突变表示，或者其可以集中在直至最大许可的不同长度的一或多个位置，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异也可以是由于氨基酸残基的缺失或截短所致。差异根据核酸或氨基酸取代、插入或缺失定义。根据对比序列的长度，在大约85-90％以上的同源性或相同性水平，结果可以不依赖于所述程序和缺口参数设置；这种高水平相同性可易于评定，通常不用依赖于软件。
如本文所用，等位基因变体或等位基因变化是指占据相同染色体基因座的基因的任两或更多种可选形式。等位基因变化通过突变自然产生，可导致种群内表型多样性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无变化)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文也用于表示由基因的等位基因变体编码的蛋白质。典型地，基因的参考形式编码一个种群或一个物种的一个参考成员的多肽的野生型形式和/或主导形式。典型地，等位基因变体，包括物种间或之中的变体，与相同物种的野生型和/或主导形式典型具有至少80％、90％或更高的氨基酸相同性；相同性程度依赖于所述基因及对比是种间还是种内对比。通常，种内等位基因变体与野生型和/或主导形式具有至少大约80％、85％、90％或95％或更高相同性，包括与多肽的野生型和/或主导形式96％、97％、98％、99％或更高的相同性。本文提及的等位基因变体通常是指相同物种成员中蛋白质变化。
如本文所用，“等位基因”在本文与“等位基因变体”可互换使用，是指基因或其一部分的其它形式。等位基因占据同源染色体上相同基因座或位置。当对象具有一个基因的两个相同的等位基因时，该对象被称作对该基因或等位基因是纯合的。当对象具有一个基因的两个不同等位基因时，所述对象被称作对该基因是杂合的。特定基因的等位基因在一个核苷酸或几个核苷酸可以彼此不同，可包括修饰如核苷酸取代、缺失和插入。基因的等位基因也可以是含有突变的基因形式。
如本文所用，种变体是指不同物种包括不同的哺乳动物种如小鼠和人中多肽变体。举例的本发明提供的种变体是灵长类动物PH20，例如但非限于人、黑猩猩、猕猴、食蟹猴、长臂猿、猩猩或狨猴。通常，种变体具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列相同性。种之间和之中的相应残基可以通过对比与排列对比序列以使匹配核苷酸或残基最大化而确定，例如由此序列间的相同性等于或高于95％、等于或高于96％、等于或高于97％、等于或高于98％或者等于或高于99％。然后给出感兴趣的位置在参考核酸分子中分配的数字。对比可以通过手工或目测实现，特别是在序列相同性高于80％的情况中。
如本文所用，基本上纯的是指基本上均质的，没有呈现出可易于检测的杂质，通过本领域技术人员使用标准分析方法确定，如薄层层析法(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)，以评定这种纯度，或是足够纯的，由此进一步纯化将不可检测地改变所述物质的物理和化学性质，如酶和生物学活性。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体或异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加所述化合物的比活性。
如本文所用，分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物学活性部分基本上没有来自所述蛋白质衍生自其中的细胞或组织的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当化学合成时基本上没有化学前体或其它化合物。制备物如果呈现出通过本领域技术人员使用标准分析方法确定没有易于检测的杂质，则可确定所述制备物是基本上游离的，所述分析方法如薄层层析法(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析法(HPLC)，以评定这种纯度，或是足够纯的，由此进一步纯化不可检测地改变所述物质的物理和化学性质，如酶和生物学活性。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加化合物的比活性。
因此，在提及基本上纯化的多肽如基本上纯化的PH20多肽时，是指PH20蛋白质的制备物，其基本上没有细胞材料，包括其中蛋白质与蛋白质从中分离或重组产生的细胞的细胞成分分离的蛋白质制备物。在一个实施方案中，术语基本上没有细胞材料包括酶蛋白质制备物，其具有低于大约30％(干重)的非酶蛋白质(在本文也称作污染蛋白质)，通常低于大约20％非酶蛋白质或者10％非酶蛋白质或者低于大约5％非酶蛋白质。当酶蛋白质是重组产生时，其也基本上没有培养基，即培养基低于大约或是20％、10％或5％的酶蛋白质制备物体积。
如本文所用，术语基本上没有化学前体或其它化学物包括酶蛋白质制备物，其中所述蛋白质与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物分离。该术语包括酶蛋白质制备物，其具有低于大约30％(干重)、20％、10％、5％或更低的化学前体或非酶化学物或成分。
如本文所用，提及合成时，例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用，通过重组方式或者使用重组DNA方法产生是指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，载体(或质粒)是指离散的元件，其用于将异源核酸导入细胞中以表达或复制。所述载体典型保持附加型，但是可以设计为实现基因或其一部分整合进基因组的染色体中。该术语也涵盖这样的载体，其是人工染色体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种载体的选择和使用为本领域技术人员熟知。
如本文所用，表达载体包括能表达与调节序列如启动子区域可操纵地连接的DNA的载体，所述调节序列能实现这种NDA片段的表达。这种额外的节段可包括启动子和终止子序列，及任选可包括一或多个复制起点、一或多个可选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可含有这两个元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或者其它载体，在导入合适的宿主细胞中时导致克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些载体，及保持附加型的那些载体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
如本文所用，载体也包括“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外来基因可操纵地连接以转移(作为运载体或穿梭载体)外来基因进细胞。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体和痘苗病毒载体。
如本文所用，“可操纵地”或者“可操纵地连接”当涉及DNA节段时是指该节段被安置，由此其发挥其指定目的功能，例如在启动子下游和任何转录的序列的上游起始转录。所述启动子通常是转录机制结合的结构域以起始转录及通过编码节段行进至终止子。
如本文所用，缀合是指修饰的PH20多肽与一或多个其它多肽或化学部分直接或间接连接。这种缀合物包括融合蛋白，通过化学缀合产生的那些蛋白质及通过任何其它方法产生的那些蛋白质，从而至少一个修饰的PH20多肽与另一多肽或化学部分直接或间接连接，只要所述缀合物保留透明质酸酶活性即可。举例的本发明提供的缀合物包括与多聚化结构域(例如Fc部分)、毒素、标记或药物直接或间接连接的PH20多肽。
如本文所用，融合蛋白是指由含有一个核酸分子的编码序列及来自另一核酸分子的编码序列的核酸序列编码的多肽，其中所述编码序列在同一读框中，由此当融合构建体在宿主细胞中被转录和翻译时，产生含有这两种蛋白质的蛋白质。这两个分子在构建体中可以相邻或者由接头多肽间隔，所述接头多肽含有1、2、3或更多个、但典型少于10、9、8、7、或6个氨基酸。由融合构建体编码的蛋白质产物被称作融合多肽。举例的融合多肽包括Fc融合体。
如本文所用，与修饰的PH20多肽缀合的聚合物是指与这种多肽共价或者另外直接或者通过接头稳定连接的任何聚合物。这种聚合物典型增加血清半衰期，包括但不限于唾液酸部分、聚乙二醇(PEG)部分、葡聚糖和糖以及其它部分，如糖基化。
如本文所用，术语评定或确定是指包括定量和定性确定，获得产物活性的绝对值，及也获得表示活性水平的指数、比率、百分比、图像或其它值。评定可以是直接或间接评定。
如本文所用，“组合物”是指两或更多种产物或化合物的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊、水溶液、非水溶液，或者其任何组合。
如本文所用，配制物是指含有至少一种活性药物或治疗剂及一或多种赋形剂的组合物。
如本文所用，共配制物是指含有两或更多种活性的或药物的或治疗物质及一或多种赋形剂的组合物。例如，速效胰岛素与乙酰透明质酸降解酶的共配制物含有速效胰岛素、乙酰透明质酸降解酶及一或多种赋形剂。
如本文所用，“组合”是指两或更多个项目或元件之间的任何关联。举例的组合包括但不限于两或更多种药物组合物、含有两或更多种活性成分如两种修饰的PH20多肽的组合物；修饰的PH20多肽和抗癌剂，如化疗化合物；修饰的PH20多肽和治疗剂(例如胰岛素)；修饰的PH20多肽和多种治疗剂和/或成像剂，或者其任意组合。这种组合可以包装为试剂盒。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，任选包括所述组合和/或这种使用的其它反应和成分的使用说明书。
如本文所用，“疾病或病症”是指生物体中由于包括但不限于感染、获得情况、遗传情况的原因或状况所致的病理学状况，及特征在于可鉴别的症状。
如本文所用，乙酰透明质酸相关疾病、失调或病症是指任何这样的疾病或病症，其中乙酰透明质酸水平增高是所述疾病或病症的原因、结果或另外在所述疾病或病症中观测到乙酰透明质酸水平增高。乙酰透明质酸相关疾病和病症与组织或细胞中升高的乙酰透明质酸表达、增加的组织间隙液压、降低的血管体积和/或组织中增加的水含量相关。乙酰透明质酸相关疾病、失调或病症可以通过给予组合物治疗，所述组合物含有乙酰透明质酸降解酶如透明质酸酶，例如可溶的透明质酸酶，单独给予所述组合物或者组合或另外给予另一治疗和/或药物。举例的疾病或病症包括但不限于乙酰透明质酸富集的癌症，例如肿瘤，包括实体瘤如晚期癌症、转移癌症、未分化癌症、卵巢癌、原位癌瘤(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌及其它癌。举例的乙酰透明质酸相关疾病和病症也是与升高的组织间隙液压相关的疾病，如与椎间盘压力(discpressure)和水肿相关的疾病，例如由于器官移植导致的水肿、卒中、脑外伤或其他损伤。举例的乙酰透明质酸相关疾病和病症包括与升高的组织间隙液压、降低的血管体积和/或组织中增加的水含量相关的疾病和病症，包括癌症、椎间盘压力和水肿。在一个实例中，乙酰透明质酸相关病症、疾病或失调的治疗包括对一或多个增加的组织间隙液压(IFP)、降低的血管体积及组织中增加的水含量具有改善、减轻或者其它有益作用。
如本文所用，“治疗”患有疾病或病症的对象是指所述对象的症状在治疗后部分或全部减轻，或者保持稳定。因此，治疗涵盖了预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或者疾病进展。治疗也涵盖本发明提供的修饰的干扰素和组合物的任何药物应用。
如本文所用，药物有效制剂或治疗剂包括任何生物活性制剂，其可呈现出治疗疾病或失调的治疗作用。举例的治疗剂在本文中描述。治疗剂包括但不限于麻醉剂，血管收缩剂，分散剂，常规治疗药物，包括小分子药物，包括但不限于二膦酸盐，以及治疗性蛋白质，包括但不限于胰岛素、IgG分子、抗体、细胞因子和凝血因子。
如本文所用，“胰岛素”是指激素、前体或者其合成或重组类似物，其发挥作用以增加葡萄糖摄取和贮存和/或降低内源葡萄糖产生。胰岛素及其类似物为本领域技术人员熟知，包括在人体中及其等位基因和种变体。胰岛素被翻译为称作前胰岛素原(对于人胰岛素为110个氨基酸)的前体多肽，含有使蛋白质定向内质网(ER)的信号肽，其中信号肽被裂解，获得胰岛素原。胰岛素原被加工以释放C-或联接链肽(人胰岛素中31个氨基酸的C-链)。所得胰岛素含有A链(人胰岛素中长度为21个氨基酸，SEQ ID NO:862所示)和B链(人胰岛素中长度为30个氨基酸，SEQ ID NO:863所示)，其通过二硫键交联。完全交联的人胰岛素含有三个二硫键：一个在A链的位置7与B链的位置7之间，第二个在A链的位置20与B链的位置19之间，第三个在A链的位置6与11之间。提及胰岛素包括单体和多聚体胰岛素，包括六聚体胰岛素，以及人源化胰岛素。举例的胰岛素多肽是源自哺乳动物、包括人的那些。提及胰岛素包括前胰岛素原、胰岛素原和胰岛素多肽，其是单链或双链形式、具有活性的截短形式，及包括人胰岛素的等位基因变体和种变体，由剪接变体编码的变体，及其它变体如胰岛素类似物。举例的胰岛素是人胰岛素，其具有人胰岛素A链和B链的氨基酸序列，分别如SEQ ID NO:862和863所示，及其与A链或B链之一或二者呈现至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的变体或类似物，并且起作用以增加葡萄糖摄取和贮存和/或降低内源葡萄糖产生。进一步举例的胰岛素是猪胰岛素，其具有SEQ ID NO:864所示前胰岛素原的氨基酸序列，其中A链相应于氨基酸残基位置88-108及B链相应于与A链或B链之一或者二者呈现至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸、其变体或类似物，并且起作用以增加葡萄糖摄取和贮存和/或降低内源葡萄糖产生。
如本文所用，“速效胰岛素”是指在或大约在皮下给予对象之后不超过4小时内呈现峰值胰岛素水平的任何胰岛素。速效胰岛素包括急性给予糖尿病患者以应答对象中在现时、感知的或预期的高血糖症的任何胰岛素或任何速效胰岛素组合物，在给予速效胰岛素当时或者在大约4小时内产生(如得自或预期得自摄食的膳食高血糖症)，从而速效胰岛素能预防、控制或改善急性高血糖症。速效胰岛素包括重组胰岛素和分离的胰岛素(也称作“普通”胰岛素)如以人胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素销售的胰岛素以及设计为通过氨基酸改变而速效的速效胰岛素类似物(在本文也称作速效胰岛素类似物)。举例的普通胰岛素制备物包括但不限于人普通胰岛素，如以商标R、R和Insulin Human、USP和Insulin HumanInjection,USP销售的那些以及胰岛素的酸配制物，如Toronto Insulin、OldInsulin和Clear Insulin，及普通猪胰岛素如Iletin(猪胰岛素)。普通胰岛素典型在给予后30分钟至1小时之间起作用，及在2-5小时达到峰值胰岛素水平。
如本文所用，速效胰岛素类似物(也称作速效胰岛素类似物)是这样的胰岛素，其快速起作用。快速胰岛素典型是已经工程化为比普通胰岛素更速效的胰岛素类似物，如通过导入一或多个氨基酸取代而实现。速效胰岛素类似物典型在注射后10-30分钟起作用，在注射后30-90分钟观测到峰值胰岛素水平。举例的速效胰岛素类似物是在SEQ ID NO:862或863分别所示的人胰岛素A链和/或B链中含有一或多个氨基酸改变的人胰岛素类似物，呈现出在注射后10-30分钟起作用，在注射后30-90分钟观测到峰值胰岛素水平。举例的速效胰岛素类似物包括但不限于例如赖脯胰岛素(例如胰岛素)、门冬胰岛素(例如胰岛素)和赖谷胰岛素(例如胰岛素)，速效胰岛素组合物以和销售(见例如美国专利号7,279,457)。举例的速效胰岛素类似物的氨基酸序列具有SEQ IDNO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:865-867任一所示氨基酸序列的B链。本发明还包括在注射后30分钟或更少时间起作用及在90分钟之前、典型在30-90分钟达到峰值水平的任何其它胰岛素。
如本文所用，人胰岛素是指基于人多肽合成或重组产生的胰岛素，包括其等位基因变体和类似物。
如本文所用，速效人胰岛素或者人速效胰岛素组合物包括任何是速效的人胰岛素或人胰岛素组合物，但是除外非人胰岛素，如普通猪胰岛素。
如本文所用，术语“基础作用胰岛素”或者“基础胰岛素”是指给予的以维持基础胰岛素水平的胰岛素，作为治疗如糖尿病等慢性病症的整体治疗方案的一部分。典型地，基础作用胰岛素配制为当定期给予时(例如每天一次或两次)通过胰岛素的控制释放而维持大约稳定状态胰岛素水平。基础作用胰岛素包括结晶胰岛素(例如NPH和鱼精蛋白胰岛素，surfen胰岛素)，基础胰岛素类似物(甘精胰岛素，HOE 901，NovoSol Basal)及其它胰岛素的化学配制物(例如阿拉伯树胶，卵磷脂或油悬浮液)，其延迟普通胰岛素的吸收速度。如本文所用，基础作用胰岛素可包括典型理解为长效胰岛素(典型地达到相对低峰值浓度，而具有超过大约20-30小时的最长作用持续时间)或中效胰岛素(典型地在给予后大约4-12小时导致峰值胰岛素浓度)的胰岛素。
如本文所用，治疗是指其中病症、失调或疾病的症状或其它指征改善或另外有益地改变的任何方式。
如本文所用，治疗作用是指得自治疗对象的结果，其改变、典型地改良或改善疾病或病症的症状或者治愈疾病或病症。治疗有效量是指在给予对象后获得治疗作用的组合物、分子或化合物的量。
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物如人。
如本文所用，患者是指出现疾病或失调的症状的人对象。
如本文所用，通过治疗改善特定疾病或失调的症状，如通过给予药物组合物或其它治疗剂，是指症状的任何减轻，无论是永久还是暂时的，持续的或瞬时的，其可以归因于或者与给予所述组合物或治疗剂相关。
如本文所用，阻止或预防是指其中发生疾病或病症的危险被降低的方法。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指制剂、化合物、材料或含有化合物的组合物其至少足以产生治疗作用的数量。因此，这是预防、治愈、改善、阻抑或者部分阻抑疾病或失调的症状所需的数量。
如本文所用，剂量单位形式是指本领域已知的适于人和动物对象的及单独包装的物理独立单位(physically discrete units)。
如本文所用，单一剂量配制物是指含有单一剂量治疗剂以直接给予的配制物。单一剂量配制物通常不含有任何防腐剂。
如本文所用，多剂量配制物是指含有多剂量治疗剂的配制物，其可以直接给予以提供数个单一剂量的治疗剂。所述剂量可以在数分钟、数小时、数周、数天或数月时程给予。多剂量配制物可允许剂量调整、剂量集合和/或剂量分割。由于多剂量配制物随着时间而使用，其通常含有一或多种防腐剂以防止微生物生长。
如本文所用，“产品”是指生产和销售的产物。如在本说明书中所用，该术语是指涵盖治疗剂与可溶的PH20如esPH20，或者单独的esPH20，包含于同一或单独的包装物中。
如本文所用，液体是指可以流动的任何组合物。液体因此涵盖了半固体、糊、溶液、水溶液混合物、凝胶、乳液、乳霜及其它这种组合物形式的组合物。
如本文所用，“对照”或“标准”是指这样的样品，其与检测样品基本上相同，除外的是其不用检测参数处理，或者如果其是血浆样品，其可以来自未受感兴趣的病症影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。例如，对照可以是样品，如病毒，其具有已知的性质或活性。
如本文所用，除非特别说明，则单数形式“一个/一种”包括多个指示物。因此，例如“一种制剂”包括一或多种制剂。
如本文所用，除非明确指出是唯一选项或者选项是互斥的，术语“或者”指的是“和/或”。
如本文所用，范围和量可以以“大约”的特定值或范围表示。大约也包括精确量。因此“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”及“5个碱基”。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或事实发生或不发生，及该描述包括其中所述事件或事实发生的情况或不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团是未取代或取代的。
如本文所用，除非特别指出，任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写与其通常用法、公认缩写或者IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature(see,(1972)Biochem.11:1726)是一致的。
为了清晰起见及不受限制，详细的描述分成如下部分。
B.PH20透明质酸酶
本发明提供了修饰的PH20多肽。PH20(也称作精子表面蛋白，精子粘附分子1或SPAM1)是一种透明质酸酶，其水解在结缔组织如胞外基质中发现的乙酰透明质酸(也称作透明质酸或HA)。乙酰透明质酸聚合物是由重复的二糖单位、D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)组成的，通过交替的β-1→4和β-1→3糖苷键连接在一起。乙酰透明质酸链的长度可以达到大约25,000个二糖重复或更长，乙酰透明质酸的聚合物的大小在体内可以是大约5,000-20,000,000Da。乙酰透明质酸，也称作透明质酸或透明质酸盐，是一种非硫酸化糖胺聚糖，其广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织中。乙酰透明质酸是胞外基质的一种基本成分及是间隙屏障的主要成分。PH20是内-β-N-乙酰-己糖胺酶，其将透明质酸的β1→4糖苷键水解为不同寡糖长度，如四糖和六糖。PH20具有水解及转糖苷酶活性。除了降解透明质酸，PH20还可以降解硫酸软骨素，如C4-S和C6-S。PH20在酸性pH和中性pH可呈现出透明质酸酶活性。
1.结构
PH20 cDNA已经从许多哺乳动物物种中克隆。举例的PH20前体多肽包括但不限于人(SEQ ID NO:6)、牛(SEQ ID NO:15或17)、兔(SEQ ID NO:23)、食蟹猴(SEQ ID NO:13)、豚鼠(SEQ ID NO:28)、大鼠(SEQ ID NO:21)、小鼠(SEQ ID NO:19)、黑猩猩(SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:869)、猕猴(SEQ ID NO:11)、狐狸(SEQ ID NO:30)、长臂猿(SEQ ID NO:856)、狨猴(SEQ ID NO:858)或猩猩(SEQ ID NO:860)PH20多肽。所述mRNA转录体典型被翻译以产生在N末端含有35个氨基酸的信号序列的前体蛋白质。在转运至ER之后，信号肽被除去以产生成熟PH20多肽。举例的成熟PH20多肽包括但不限于人(SEQ ID NO:7)、牛(SEQ ID NO:16或18)、兔(SEQ IDNO:24)、食蟹猴(SEQ ID NO:14)、豚鼠(SEQ ID NO:29)、大鼠(SEQ ID NO:22)、小鼠(SEQ ID NO:20)、黑猩猩(SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:870)、猕猴(SEQ ID NO:12)、狐狸(SEQ ID NO:31)、长臂猿(SEQ ID NO:857)、狨猴(SEQ ID NO:859)或者猩猩(SEQ ID NO:861)PH20多肽。例如，人PH20mRNA转录体通常被翻译以产生509个氨基酸的前体蛋白质(SEQ ID NO:6)，其在N末端含有35个氨基酸的信号序列(SEQ ID NO:6的氨基酸残基位置1-35)。因此，在转运至ER及除去信号肽之后，产生具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的474个氨基酸的成熟多肽。来自羊的PH20的序列也已知(见例如SEQ ID NO:25-27)。
特别地，人PH20具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。缺少信号序列的成熟人PH20如SEQ ID NO:7示出。已知PH20的等位基因变体及其它变体。已经报道了PH20的其它序列。例如，已知PH20变体如在前体序列如SEQ ID NO:68所示，其含有在位置48的Ala及在位置499的Trp，或者如SEQ ID NO:69所示其成熟序列，其含有与SEQ ID NO:7所示序列相比分别在位置13和464的相应差异(见例如Gmachl et al.(1993)FEBS Lett.,336:545-548；GenBank登录号AAC60607)。此外，已经鉴别了PH20的天然变体，其与SEQ ID NO:6所示前体氨基酸序列相比在位置5含有谷氨酰胺(Gln；Q)(见例如SEQ ID NO:70，也见Varela et al.(2011)Nature,469:539-542)。另一天然变体与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列相比在位置47(如SEQ ID NO:71所示)及与SEQ ID NO:3或7所示氨基酸序列相比相应于位置12(如SEQ ID NO:72所示)含有丙氨酸(Ala；A)。
PH20多肽的序列和结构是高度保守的。不同物种的PH20蛋白之间和之中的序列相同性是大约50％-90％。长度为35个氨基酸的疏水性N-末端信号序列在PH20透明质酸酶多肽之中通常是保守的。PH20透明质酸酶含有一个共同的核心透明质酸酶结构域区域，其长度为大约340个氨基酸，相应于SEQ ID NO:6所示前体人PH20序列的氨基酸残基38-374。缺少信号序列及含有具有相应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基464的C末端氨基酸残基的连续氨基酸序列的成熟PH20多肽(例如相应于SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的位置36-464的氨基酸残基)是透明质酸酶活性所需的最小序列(见例如美国专利申请号10/795,095，其授权号为美国专利号7,767,429；也见美国公开号US20100143457)。
在共同的透明质酸酶结构域区域内，在物种之间和之中至少57个氨基酸是保守的(见例如Arming et al.(1997)Eur.J.Biochem.,247:810-814；tenHave et al.(1998)Reprod.Fertil.Dev.,10:165-72；Chowpongpang et al.(2004)Biotechnology Letters,26:1247-1252)。例如，PH20透明质酸酶含有12个保守的半胱氨酸残基，相应于SEQ ID NO:3或7所示缺少信号序列的成熟PH20的氨基酸序列的氨基酸残基25、189、203、316、341、346、352、400、402、408、423和429(相应于SEQ ID NO:6所示全长人PH20的氨基酸残基60、224、238、351、376、381、387、435、437、443、458或464)。相应于25和316的半胱氨酸残基与相应于189和203的半胱氨酸残基形成二硫键。其它胱氨酸残基也形成二硫键，参与翻译后蛋白质成熟和/或活性调节。例如，在SEQ ID NO:6所示多肽的半胱氨酸残基C376与C387之间、C381与C435之间、C437与C443之间、以及C458与C464之间形成进一步的四个二硫键(分别相应于SEQ ID NO:3或7所示成熟多肽的位置C341与C352之间、C346与C400之间、C402与C408之间以及C423与C429之间)。
相应于SEQ ID NO:3或7所示氨基酸序列的氨基酸残基D111、E113和E249的氨基酸残基是酶活性位点的酸性残基部分，在PH20种之间和之中是保守的。SEQ ID NO:3或7所示氨基酸序列的氨基酸残基R176、R246、R252在种之间和之中也是保守的，有助于底物结合和/或透明质酸酶活性。氨基酸突变D111N、E113Q、R176G、E249N和R252T获得不具有可检测的酶活性或者剩余酶活性的酶(见例如Arming et al.(1997)Eur.J.Biochem.,247:810-814)。
本文结果证实相应于SEQ ID NO:3或7所示缺少信号序列的成熟PH20的氨基酸序列的位置25、111、113、176、189、203、246、249、252、316、341、346、352、400、402、408、423和429的PH20氨基酸残基为透明质酸酶活性所需，因为这些残基的诱变产生没有活性的酶(例如其不被表达或者当表达时是无活性的，见例如表5和10)。例外是相应于R176K和C316D的氨基酸置换获得产生一些剩余透明质酸酶活性的突变体。
糖基化也为PH20透明质酸酶活性所需，基于识别基序NxS或NxT。在相应于SEQ ID NO:3或7所示氨基酸序列的位置N47、N131、N200、N219、N333和N358的氨基酸残基有六个N-连接寡糖(相应于SEQ ID NO:6所示人PH20的氨基酸残基N82、N166、N235、N254、N368和N393)。特别地，至少相应于氨基酸残基N200、N333和N358的N-连接糖基化位点是所述酶的分泌和/或活性所需的(见例如美国公开号US20100143457)。例如，含有氨基酸突变N200A、N333A、N358A或N333A/N393A的PH20多肽产生无活性的蛋白质。糖基化位点N47A、N131A、N219A、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N291A的单一突变保留活性。相应于SEQ ID NO:6所示人PH20的氨基酸残基N368的N-连接糖基化位点在种之间和之中是保守的(见例如Chowpongpang et al.(2004)Biotechnology Letters,26:1247-1252)。PH20透明质酸酶也含有O-连接糖基化位点。例如，人PH20在相应于SEQ ID NO:3或7所示氨基酸序列的氨基酸T440的氨基酸残基具有一个O-连接寡糖(相应于SEQ ID NO：6中的氨基酸残基T475)。
除了催化位点，PH20还含有乙酰透明质酸结合位点。这个位点位于肽2区，相应于SEQ ID NO:6所示前体多肽的氨基酸位置205-235及SEQ IDNO:3或7所示成熟多肽的位置170-200。这个区域在透明质酸酶之中是高度保守的，且与肝素结合基序相似。在位置176(相应于SEQ ID NO:3或7所示成熟PH20多肽)的精氨酸残基突变为甘氨酸获得仅具有野生型多肽的大约1％透明质酸酶活性的多肽(Arming et al.,(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。
PH20多肽含有糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，其附着于蛋白质的C末端，使得所述蛋白质锚定于细胞质膜的外片。至少人、猴、小鼠和豚鼠PH20是通过GPI锚强力附着于质膜，其可以通过用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C处理而释放(PI-PLC；见例如Lin et al.(1994)Journal of Cell Biology,125:1157-1163；Lin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.,90:10071-10075)。其它PH20酶如牛PH20松散地附着于质膜且不通过磷脂酶敏感性锚而锚定。如下文所述，当表达时不附着于所述膜而是分泌的可溶活性形式可以通过除去所有GPI锚附着信号位点部分而产生(也见美国专利号7,767,429；美国公开号US20100143457)。这些包括例如SEQ ID NO:3或32-66任一所示可溶的PH20多肽或者其含有信号序列的前体形式。
GPI-锚定的蛋白质，例如人PH20，与可裂解的N-末端信号肽翻译，其使蛋白质定向于内质网(ER)。在这些蛋白质的C末端是另一信号序列，其指导预制的GPI-锚加入ER腔内的多肽。加入GPI锚在称作ω-位点的特定氨基酸位置的C末端部分裂解之后发生(典型位于距C末端大约20-30个氨基酸)。尽管看起来无共有序列以鉴别ω-位点的位置，但是GPI锚定的蛋白质含有C末端GPI-锚附着信号序列或结构域，其典型含有8-20个氨基酸的显著疏水性区域，之前是在ω-位点直接下游的8-12个氨基酸的亲水性间隔区。这个亲水性间隔区通常是富集荷电的氨基酸和脯氨酸(White et al.(2000)J.Cell Sci.113(Pt.4):721-727)。通常在ω-1位置之前有一个大约11个氨基酸区域，其特征在于少量的预测的二级结构，在裂解位点(ω-位点)周围从ω-1至ω+2的一个区域，特征在于存在小的侧链残基，在位置ω+3与ω+9之间的间隔区及从ω+10至C末端的疏水性尾端(Pierleoni et al.,(2008)BMCBioinformatics 9:392)。
尽管没有GPI-锚附着信号共有序列，已经揭示了各种in silico方法和算法可用于鉴别多肽中的这种序列(见例如Udenfriend et al.(1995)MethodsEnzymol.250:571-582；Eisenhaber et al.(1999)J.Mol.Chem.292:741-758；Kronegg and Buloz,(1999),“Detection/prediction of GPI cleavage site(GPI-anchor)in a protein(DGPI),”129.194.185.165/dgpi/；Fankhauser et al.(2005)Bioinformatics 21:1846-1852；Omaetxebarria et al.(2007)Proteomics7:1951-1960；Pierleoni et al.(2008)BMC Bioinformatics 9:392)，包括在生物信息学网站可易于获得的那些，如ExPASy Proteomics tools site(expasy.ch/tools/)。因此，本领域技术人员可以确定一种PH20多肽是否可能含有GPI-锚附着信号序列，及因此PH20多肽是否是GPI-锚定蛋白质。
GPI-锚共价附着于人PH20的C末端，并因此PH20的膜结合性质已经通过使用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)水解研究而证实(见例如Lin etal.,(1994)J.Biol.Chem.125:1157-1163)。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)和D(PI-PLD)水解GPI锚，从细胞膜中释放PH20多肽。现有技术文献报道了人PH20的ω-位点裂解位点在Ser-490与Ala-491之间鉴别，对于猴PH20在Ser491与Thr492之间鉴别(Lin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci,(1993)90:10071-10075)。因此，文献报道了人PH20的GPI-锚附着信号序列位于SEQ ID NO:6所示前体多肽的氨基酸位置491-509，及ω-位点是氨基酸位置490。因此，在人PH20的这个建模中，氨基酸491-509在转运至ER之后被裂解及GPI锚共价附着于位置490的丝氨酸残基。
2.功能
PH20通常在精子中从单一睾丸特异性基因表达。PH20是参与受精的精子相关蛋白。PH20通常位于精子表面上及在溶酶体衍生的顶体中，在此其结合顶体内膜。PH20是多功能的并呈现出透明质酸酶活性，乙酰透明质酸(HA)–介导的细胞信号传导活性，以及当呈递在顶体反应的(AR)精子上时作为环绕卵母细胞的透明带的精子受体。例如，PH20天然地参与精子-卵子粘附并通过消化透明质酸辅助精子穿过丘细胞层。除了是透明质酸酶之外，PH20还似乎是HA诱导的细胞信号传导的受体，及环绕卵母细胞的透明带的受体。由于PH20在受精中的作用，PH20可用作免疫避孕的抗原。
PH20是中性活性透明质酸酶，尽管其在一些情况中可呈现酸-激活活性。PH20的透明质酸酶活性是由质膜-和顶体内膜-相关的PH20呈现的。所述质膜PH20仅在中性pH呈现透明质酸酶活性，而顶体内膜相关的PH20呈现酸激活的酶活性。这些差异的结构基础是由于在PH20中存在两个催化位点。第一个催化位点称作肽1区，相应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基142-172，其参与PH20在中性pH的酶活性。第二个催化位点称作肽3区，相应于SEQ ID NO:6所示氨基酸残基277-297，其参与在较低pH的酶活性。顶体内膜相关的PH20的结构中的改变在顶体反应之后出现，从而PH20被内切蛋白酶裂解，但是通过二硫键保持在一起。内切蛋白酶解的结果是肽3区域被激活，且可因此影响PH20的中性和酸活性(见例如Cherr et al.(2001)Matrix Biology,20:515-525)。在顶体反应之后，较低分子量形式通过从顶体内膜中释放而形成(例如53kDa可溶形式PH20在猴子中产生)。较低分子量形式也是酸激活的。
PH20的透明质酸酶活性引起在动物睾丸提取物中观测到的传播活性，已经几十年临床用于增加药物的分散和吸收(见例如Bookbinder et al.(2006)J Controlled Release,114:230-241)。例如，含有透明质酸酶的药物制备物作为牛睾丸的分级分离提取物而产生，治疗性用作播散剂及用于其它应用中(Schwartzman(1951)J.Pediat.,39:491-502)。原始的牛睾丸提取物制备物包括例如以商标“Dessau,”和销售的提取物。现在已知睾丸提取物制备物的播散活性是由于PH20透明质酸酶所致。例如，在2001年，牛精子透明质酸酶被鉴别为透明质酸酶PH20(Lalancette et al.(2001)Biol.Reprod.,65:628-36)。通过催化透明质酸水解，PH20透明质酸酶降低透明质酸的粘性，从而增加组织通透性。因此，可溶形式的PH20与其它制剂、药物和蛋白质联合用作播散或分散剂以增强其分散和输送，以及改良共同给予的制剂、药物或蛋白质的药动学和药效学谱(见例如美国专利号7,767,429；Bookbinder et al.(2006)JControlled Release,114:230-241)。
3.可溶的PH20多肽
PH20可以膜结合的或者膜关联形式存在，或者当从细胞中表达时可以分泌进培养基中，从而以可溶形式存在。可溶的PH20可以检测并与不溶的膜结合PH20区分，使用本领域熟知的方法进行，包括但不限于使用X-114测定。在这个测定中，可溶的PH20透明质酸酶在加热至37℃的X-114溶液中分配至水相(Bordier et al.,(1981)J.Biol.Chem.,256:1604-7)，而膜锚定的PH20透明质酸酶分配至去污剂富集相。因此，除了使用算法评定PH20多肽是否天然是GPI锚定的及因此是膜结合的之外，也可以进行溶解性实验。
可溶的PH20酶包括透明质酸酶，其含有GPI-锚附着信号序列，但是松散地附于膜，由此其不含有磷脂酶敏感性锚。例如，可溶的PH20多肽包括羊和牛PH20。多种形式的这种可溶的PH20透明质酸酶已经制备并被许可在对象包括人中治疗性应用。例如，动物衍生的透明质酸酶制备物包括(ISTA Pharmaceuticals)，一种纯化的羊睾丸透明质酸酶，及(Amphastar Pharmaceuticals)，一种牛睾丸透明质酸酶。可溶的PH20酶还包括截短形式的非人或人膜结合的PH20透明质酸酶，其缺少糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着信号序列的一或多个氨基酸残基并保留透明质酸酶活性(见例如美国专利号7,767,429；美国公开号US20100143457)。因此，代替具有共价附着于ER中蛋白质的C末端的GPI-锚及锚定于质膜外片，这些多肽当从细胞表达时是分泌的且是可溶的。在其中可溶的乙酰透明质酸降解酶保留一部分GPI锚附着信号序列的情况中，GPI-锚附着信号序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基可以被保留，条件是所述多肽是可溶的(即当从细胞表达时是分泌的)及是活性的。
举例的是C末端截短的及缺少所有或部分GPI锚附着信号序列的可溶的透明质酸酶包括但不限于灵长目动物源的PH20多肽，如人和黑猩猩PH20多肽。例如，可溶的PH20多肽可以通过SEQ ID NO:7、10、12、14、69、72、857、859、861或870所示多肽或者与SEQ ID NO:7、10、12、14、69、72、857、859、861或870呈现至少80％、85％、90％、95％或更多序列相同性的其变体的C末端截短而产生，其中所得多肽是活性的、可溶的及缺少所有或部分来自GPI-锚附着信号序列的氨基酸残基。
举例的可溶的PH20多肽是C末端截短的人PH20多肽，其是成熟的(缺少信号序列)、可溶的及呈现中性活性，其含有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的连续氨基酸序列，最小具有在SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的氨基酸残基464或之后的C末端截短的氨基酸残基。例如，可溶的PH20多肽包括C-末端截短的多肽，其最小含有SEQ ID NO:6所示氨基酸36-464的连续序列，或者包括与具有SEQ ID NO:6所示氨基酸464之后的C末端氨基酸残基的连续氨基酸序列具有至少85％，例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性并保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。举例的C末端截短的人PH20多肽是成熟多肽(缺少信号序列)，其包含SEQ ID NO:6所示的连续氨基酸序列，具有在SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的氨基酸位置464之后如氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500之后的C末端残基，或者与其呈现至少85％序列相同性如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性及保留透明质酸酶活性的其变体。例如，举例的C末端PH20多肽具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的36-465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500位氨基酸的序列或者与其呈现至少85％序列相同性如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性及保留透明质酸酶活性的其变体的序列。可溶的PH20多肽包括具有SEQ ID NO:3或32-66所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3或32-66任一所示氨基酸序列呈现至少85％序列相同性如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性的氨基酸序列的任何多肽。
特别地，可溶的人PH20多肽是在SEQ ID NO:6所示序列的氨基酸482之后截短的多肽。这种多肽可以从含有信号序列及编码氨基酸36-482的核酸分子产生，如SEQ ID NO:1(含有IgG κ信号序列)或SEQ ID NO:67(含有天然信号序列)所示。翻译后加工除去信号序列，剩下477个氨基酸的可溶的重组人PH20(SEQ ID NO:3)。基于SEQ ID NO:4或5所示载体的表达产生的及含有SEQ ID NO:67所示核酸分子的产物在培养基中获得分泌的产物，称作rHuPH20，其呈现出在C末端的异质性，由此所述产物包括可包含不同丰度的任一或多个SEQ ID NO:3和44-48的种混合物。典型地，rHuPH20在促进正确的N-糖基化的细胞中产生以保留活性，如哺乳动物细胞，例如CHO细胞(例如DG44CHO细胞)。(Halozyme)是通过遗传工程化含有编码截短的人PH20多肽的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的人重组透明质酸酶(称作rHuPH20)。
C.修饰的PH20多肽
本发明提供了修饰或变体PH20多肽。本发明提供的修饰的PH20多肽与野生型、天然或参考PH20多肽相比呈现改变的活性或性质。本发明提供的修饰的PH20多肽包括是活性突变体的PH20多肽，其中所述多肽呈现出不含有所述氨基酸修饰(例如氨基酸置换)的相应PH20多肽的至少40％的透明质酸酶活性。特别地，本发明提供了PH20多肽，其呈现透明质酸酶活性及与不含有所述氨基酸修饰的PH20相比呈现增加的稳定性。本发明还提供了修饰的PH20多肽，其是无活性的，可用作例如避孕疫苗中的抗原。
所述修饰可以是单一氨基酸修饰，如单一氨基酸置换(取代)、插入或缺失，或者多个氨基酸修饰，如多个氨基酸置换、插入或缺失。举例的修饰是氨基酸置换，包括单一或多个氨基酸置换。所述氨基酸置换可以是保守取代，如表2所示，或者非保守取代，如本文所述任何取代。本发明提供的修饰的PH20多肽与不含有所述修饰的PH20多肽相比可含有至少或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰的位置。
本发明描述的修饰可以在任何PH20多肽中，包括前体、成熟或C末端截短形式，只要修饰的形式呈现透明质酸酶活性即可。例如，所述PH20多肽与SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示野生型、天然或参考PH20多肽相比含有修饰，或者在具有与SEQ ID NO:3、6-66、68-72、856-861、869或870任一是至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列的多肽中含有修饰。例如，所述修饰在如下多肽中产生：具有包括或由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的人PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:16或18所示氨基酸序列的牛PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的兔PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的食蟹猴PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的豚鼠PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的大鼠PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的小鼠PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:10或870所示氨基酸序列的黑猩猩PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的猕猴PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的狐狸PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:857所示氨基酸序列的长臂猿PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:859所示氨基酸序列的狨猴PH20多肽；具有包括或由SEQ ID NO:861所示氨基酸序列的猩猩PH20多肽；或者具有包括或由SEQ ID NO:25-27所示氨基酸序列的绵羊PH20多肽；或者在与SEQ ID NO:7、10、12、14、16、18、20、22、24-27、29、31、69、72、857、859、861或870任一呈现至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列变体或截短变体中。
特别地，本发明提供了与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72所示PH20多肽或者具有与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72是至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列的多肽相比含有修饰的PH20多肽。例如，本发明提供的修饰也可以在SEQ ID NO:10、12、14、24、857、859、861或870所示多肽中产生。
特别地，本发明提供了修饰的可溶的PH20多肽，其是含有本发明提供的修饰的PH20多肽，及当从细胞表达时作为可溶蛋白分泌进培养基中。例如，所述修饰是在可溶的PH20多肽中产生，其是在含有含有GPI-锚信号序列的PH20多肽的GPI-锚信号序列的C末端部分内或附近的C末端截短的。所述C末端截短可以是在C末端截短或缺失8个连续氨基酸，在C末端截短或缺失9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸，只要所得C末端截短的多肽呈现透明质酸酶活性及当表达时从细胞分泌(例如分泌进培养基)。在一些实例中，本发明提供的修饰是在可溶的PH20多肽中产生，其是SEQ ID NO:7、10、12、14、69、72、857、859、861或870的C末端截短的多肽或者是与SEQ ID NO:7、10、12、14、69、72、857、859、861或870任一呈现至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的其变体。特别地，本发明提供的修饰在可溶的或C末端截短的人PH20多肽中产生，其具有SEQ ID NO:3或32-66所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3或32-66任一所示氨基酸序列呈现至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性的氨基酸序列。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽参考SEQ ID NO:3所示PH20多肽含有氨基酸置换或取代、添加或缺失、截短或者其组合。
修饰也可以在SEQ ID NO:3、7、10、12、14、16、18、20、22、24-27、29、31、32-66、69、72、857、859、861或870任一所示含有信号肽的相应前体形式中产生。例如，本发明提供的修饰可以在SEQ ID NO:2、6、8、9、11、13、15、17、19、21、23、28、30、856、858、860或869任一所示前体形式中产生或者在与SEQ ID NO:2、6、8、9、11、13、15、17、19、21、23、28、30、856、858、860或869任一呈现至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体中产生。
在本发明提供的修饰的PH20多肽的实例中，修饰的PH20多肽不含有SEQ ID NO:3-66、68-72、856-861、869或870任一所示氨基酸序列。典型地，修饰的PH20多肽是人PH20多肽，不含有SEQ ID NO:8-31、856-861、869或870任一所示氨基酸序列。
通常，任何修饰如氨基酸置换、缺失或取代可以在PH20多肽中产生，条件是所述修饰在如下情况下不是氨基酸置换，所述情况是唯一的修饰是单一氨基酸置换V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、E249Q、R252T、N333A或N358A。而且在修饰的PH20多肽含有仅两个氨基酸置换的情况中，所述氨基酸置换不是P13A/L464W、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N219A或N333A/N358A。在进一步的实例中，在修饰的PH20多肽含有仅三个氨基酸置换的情况中，所述氨基酸置换不是N47A/N131A/N219A。举例的本发明提供的修饰在下文详细描述。
对于本发明，提及修饰位置和用于修饰的氨基酸、包括氨基酸置换，是参考SEQ ID NO:3所示PH20多肽。本领域技术人员已知在另一PH20多肽中产生本发明提供的任何修饰，通过在如SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24-27、28、29、30、31、32-66、68-72、856、857、858、859、860、861、869或870任一所示的另一PH20多肽或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24-27、28、29、30、31、32-66、68-72、856、857、858、859、860、861、869或870任一呈现至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体中鉴别相应氨基酸残基而进行。另一PH20多肽中的相应位置可以通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示PH20多肽而鉴别。例如，图2示出举例的PH20多肽与SEQ ID NO:3的排列对比，及举例的相应位置的鉴别。而且，由于SEQ ID NO:3、7、32-66、69和72是具有不同C末端氨基酸残基的成熟人PH20的所有形式，因此SEQ ID NO:7、32-66、69和72任一中的氨基酸残基的编号与SEQ ID NO:3相同，及因此每个序列的相应残基与SEQ ID NO:3所示的均相同(见例如图1)。进一步地，SEQ ID NO:2、6、70或71任一所示SEQ ID NO是其前体形式，其不同仅在于存在信号序列。对于修饰(例如氨基酸置换)而言，相应氨基酸残基可以是任何氨基酸残基，及不需要与SEQID NO:3所示残基相同。典型地，通过与SEQ ID NO:3中残基排列对比鉴别的相应氨基酸残基是与SEQ ID NO:3相同的氨基酸残基，或者是与其保守或半保守的氨基酸残基(见例如图2)。也应理解举例的本发明提供的置换可以在PH20多肽中相应残基产生，只要所述置换与未修饰形式的PH20多肽中存在的残基不同即可。基于这个描述及在本文别处的描述，本领域技术人员已知产生含有任一或多个所述突变的修饰的PH20多肽，并检测如本文所述每个多肽的性质或活性。
PH20多肽中的修饰也可以针对也含有其它修饰包括所述多肽的一级序列的修饰及不在一级序列中的修饰的PH20多肽而产生。例如，本发明描述的修饰可以在PH20多肽中，其是融合多肽或嵌合多肽。本发明提供的修饰的PH20多肽也包括与聚合物如PEG试剂缀合的多肽。
本发明还提供了编码本发明提供的任何修饰的PH20多肽的核酸分子。在特别的实例中，所述核酸序列可以是密码子优化的，例如以增加编码的序列的表达水平。所述特定密码子使用依赖于修饰的多肽在其中表达的宿主生物体。本领域技术人员熟知优化的密码子以在哺乳动物或人细胞、细菌或酵母包括例如大肠杆菌或酿酒酵母中表达。例如，密码子使用信息可得自在kazusa.or.jp.codon可获得的Codon Usage Database(见Richmond(2000)Genome Biology,1:reports241所描述的数据库)。也见Forsburg(1994)Yeast,10:1045-1047；Brown et al.(1991)Nucleic Acids Research,19:4298；Sharp et al.(1988)Nucleic Acids Res.,12:8207-8211；Sharp et al.(1991)Yeast,657-78)所述。在一些实例中，所述编码核酸分子也可以被修饰以含有异源信号序列以改变(例如增加)多肽的表达和分泌。举例的异源信号序列是编码IgG κ信号序列的核酸(在SEQ ID NO:868中示出)。
本发明提供的修饰的多肽和编码核酸可以通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。本领域已知的在靶蛋白质中实现任一或多个氨基酸突变的任何方法均可以使用。所述方法包括标准定点或随机诱变编码核酸分子，或者固相多肽合成方法。例如，对编码PH20多肽的核酸分子可以进行诱变，如随机诱变编码核酸、易错PCR、定点诱变、重叠PCR、基因改组或者其它重组方法。然后编码所述多肽的核酸可以导入异源表达的宿主细胞中。因此，本发明还提供了编码本发明提供的任何修饰的多肽的核酸分子。在一些实例中，修饰的PH20多肽是合成产生的，如使用固相或溶液相肽合成方法。
在以下章节中，描述了举例的呈现改变的性质和活性的修饰的PH20多肽及编码核酸分子。
1.活性突变体
本发明提供了修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中含有一或多个氨基酸置换及呈现透明质酸酶活性。所述修饰的PH20多肽可呈现野生型或参考PH20多肽如SEQ ID NO:3或7所示多肽的40％-5000％的透明质酸酶活性。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽呈现野生型或参考PH20多肽如不含有所述氨基酸修饰(如氨基酸置换)的相应多肽如SEQ ID NO:3或7所示多肽的至少40％的透明质酸酶活性，如至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％或更多的透明质酸酶活性。例如，举例的可以通过氨基酸置换或取代而被修饰的位置包括但不限于相应于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的任何位置：1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446或447。典型地，在相应于PH20多肽中上述任一位置的位置被修饰(例如用另一氨基酸置换)的氨基酸残基是与SEQ ID NO:3所示氨基酸残基是相同的残基、保守残基或者半保守氨基酸残基。
为了保持透明质酸酶活性，在对透明质酸酶活性的改变或需求耐受较差的那些位置典型不产生修饰。例如，通常修饰不在相应于如下参考SEQ IDNO:3所示氨基酸位置的位置产生：7、16、17、18、19、21、25、53、55、56、57、62、64、76、78、80、88、95、100、101、109、111、112、113、115、116、121、123、126、129、185、187、188、189、190、191、194、199、201、203、207、210、223、225、227、228、229、241、243、244、246、249、250、252、254、262、268、282、295、296、298、299、303、319、322、329、330、332、333、336、337、340、341、344、345、346、350、352、354、355、362、363、364、365、366、370、372、382、384、386、390、400、402、408、423、424、429、430、431。而且，在其中修饰在如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的任一位置产生的实例中，所述修饰不是本文表5或10所示相应氨基酸置换，其是导致失活多肽的氨基酸置换：2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、94、96、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、197、198、200、202、204、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、425、426、427、428、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444或447。例如，如果所述修饰是在相应于SEQ ID NO:3位置2的位置的修饰，所述修饰不是置换为组氨酸(H)、赖氨酸(K)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。
在任一上述相应位置的举例的氨基酸置换在表3中示出。表3中相应氨基酸位置是参考SEQ ID NO:3所示位置。应理解所述置换可以在另一PH20多肽中相应位置产生，通过将其与SEQ ID NO:3所示序列(见例如图1和2)排列对比，从而所述相应位置是排列对比的位置。在特殊的实例中，所述氨基酸置换可以在SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽或者与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的其变体中的相应位置，只要所得修饰的PH20多肽呈现至少40％的不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽的透明质酸酶活性即可。特别地，所述置换可以是在人PH20多肽的相应位置中，例如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示任何多肽，或者在与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一呈现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的其变体的相应位置中。在一个实例中，任一或多个置换是在SEQ ID NO:3中，只要所得修饰的PH20多肽呈现至少40％的SEQ ID NO:3所示PH20多肽的透明质酸酶活性即可。
在特别的实例中，本发明提供修饰的PH20多肽，其在相应于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的一或多个位置含有一或多个氨基酸置换：1、6、8、9、10、11、12、14、15、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、46、47、48、49、50、52、58、59、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、79、82、83、84、86、87、89、90、92、93、94、97、102、104、107、114、118、120、127、128、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、155、156、158、160、162、163、164、165、166、167、169、170、172、173、174、175、178、179、193、195、196、198、204、205、206、209、212、213、215、219、220、221、222、232、233、234、235、236、237、238、240、247、248、249、257、258、259、260、261、263、267、269、271、272、273、274、276、277、278、279、282、283、285、287、289、291、292、293、298、305、307、308、309、310、313、314、315、317、318、320、321、324、325、326、328、335、347、349、351、353、356、359、367、368、369、371、373、374、375、376、377、380、381、383、385、389、392、393、395、396、399、401、404、405、406、407、409、410、412、416、418、419、421、425、427、428、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446或447。例如，所述氨基酸位置可以是在相应于如下参考SEQ IDNO:3所示氨基酸位置置换的位置的置换：在位置1的亮氨酸(L)(L1)、P6、V8、I9、P10、N11、V12、F14、L15、A20、S22、F24、L26、G27、K28、F29、D30、E31、P32、L33、D34、M35、S36、L37、F38、S39、F40、I41、I46、N47、A48、T49、G50、G52、V58、D59、Y63、I67、D68、S69、I70、T71、G72、V73、T74、V75、I79、K82、I83、S84、G86、D87、L89、D90、A92、K93、K94、T97、V102、N104、M107、E114、T118、A120、D127、V128、K130、N131、R132、E135、Q138、Q139、Q140、N141、V142、Q143、L144、L146、T147、E148、A149、T150、E151、K152、Q155、E156、E158、A160、K162、D163、F164、L165、V166、E167、I169、K170、G172、K173、L174、L175、N178、H179、H193、K195、K196、G198、F204、N205、V206、K209、D212、D213、S215、N219、E220、S221、T222、T232、Q233、Q234、S235、P236、V237、A238、T240、V247、R248、E249、P257、D258、A259、K260、S261、L263、A267、T269、I271、V272、F273、T274、Q276、V277、L278、K279、S282、Q283、E285、V287、T289、G291、E292、T293、A298、G305、L307、S308、I309、M310、M313、K314、S315、L317、L318、D320、N321、E324、T325、I326、N328、T335、Q347、Q349、V351、I353、N356、S359、P367、D368、N369、A371、Q373、L374、E375、K376、G377、F380、T381、R383、K385、E389、E392、Q393、S395、E396、Y399、S401、S404、T405、L406、S407、K409、E410、A412、D416、D418、A419、D421、A425、G427、A428、D431、F433、P436、P437、M438、E439、T440、E441、E442、P443、Q444、I445、F446或Y447。
举例的本发明提供的修饰的PH20多肽中的氨基酸置换包括但不限于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的置换：在相应于位置1的位置的组氨酸(H)；在相应于位置1的位置的A；在相应于位置1的位置的E；在相应于位置1的位置的G；在相应于位置1的位置的K；在相应于位置1的位置的Q；在相应于位置1的位置的R；在相应于位置6的位置的A；在相应于位置8的位置的M；在相应于位置9的位置的Q；在相应于位置10的位置的G；在相应于位置10的位置的H；在相应于位置11的位置的S；在相应于位置12的位置的E；在相应于位置12的位置的I；在相应于位置12的位置的K；在相应于位置12的位置的T；在相应于位置14的位置的V；在相应于位置15的位置的V；在相应于位置15的位置的M；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置22的位置的T；在相应于位置24的位置的E；在相应于位置24的位置的H；在相应于位置24的位置的R；在相应于位置26的位置的A；在相应于位置26的位置的E；在相应于位置26的位置的K；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置26的位置的Q；在相应于位置26的位置的R；在相应于位置27的位置的D；在相应于位置27的位置的K；在相应于位置27的位置的R；在相应于位置28的位置的R；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置29的位置的I；在相应于位置29的位置的K；在相应于位置29的位置的L；在相应于位置29的位置的M；在相应于位置29的位置的P；在相应于位置29的位置的R；在相应于位置29的位置的S；在相应于位置29的位置的T；在相应于位置29的位置的V；在相应于位置30的位置的G；在相应于位置30的位置的H；在相应于位置30的位置的K；在相应于位置30的位置的L；在相应于位置30的位置的M；在相应于位置30的位置的R；在相应于位置30的位置的S；在相应于位置31的位置的A；在相应于位置31的位置的C；在相应于位置31的位置的G；在相应于位置31的位置的H；在相应于位置31的位置的I；在相应于位置31的位置的K；在相应于位置31的位置的L；在相应于位置31的位置的P；在相应于位置31的位置的R；在相应于位置31的位置的S；在相应于位置31的位置的T；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置31的位置的W；在相应于位置32的位置的C；在相应于位置32的位置的F；在相应于位置32的位置的G；在相应于位置32的位置的H；在相应于位置33的位置的W；在相应于位置33的位置的G；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置35的位置的Q；在相应于位置35的位置的V；在相应于位置36的位置的H；在相应于位置36的位置的N；在相应于位置37的位置的F；在相应于位置37的位置的M；在相应于位置38的位置的Y；在相应于位置39的位置的A；在相应于位置39的位置的L；在相应于位置39的位置的N；在相应于位置39的位置的T；在相应于位置40的位置的L；在相应于位置41的位置的T；在相应于位置46的位置的L；在相应于位置46的位置的R；在相应于位置47的位置的D；在相应于位置47的位置的F；在相应于位置47的位置的T；在相应于位置47的位置的W；在相应于位置48的位置的F；在相应于位置48的位置的H；在相应于位置48的位置的K；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置49的位置的R；在相应于位置50的位置的D；在相应于位置50的位置的S；在相应于位置50的位置的M；在相应于位置52的位置的N；在相应于位置52的位置的Q；在相应于位置52的位置的R；在相应于位置52的位置的S；在相应于位置52的位置的T；在相应于位置58的位置的C；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的L；在相应于位置58的位置的P；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置58的位置的R；在相应于位置58的位置的H；在相应于位置58的位置的N；在相应于位置58的位置的Y；在相应于位置59的位置的N；在相应于位置63的位置的K；在相应于位置63的位置的L；在相应于位置63的位置的M；在相应于位置63的位置的R；在相应于位置63的位置的W；在相应于位置67的位置的V；在相应于位置68的位置的H；在相应于位置68的位置的P；在相应于位置68的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的C；在相应于位置69的位置的E；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的I；在相应于位置69的位置的L；在相应于位置69的位置的M；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置69的位置的T；在相应于位置69的位置的W；在相应于位置69的位置的Y；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的C；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的K；在相应于位置70的位置的L；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的P；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的S；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置70的位置的Y；在相应于位置71的位置的G；在相应于位置71的位置的N；在相应于位置71的位置的R；在相应于位置71的位置的S；在相应于位置72的位置的K；在相应于位置72的位置的M；在相应于位置72的位置的Q；在相应于位置73的位置的A；在相应于位置73的位置的H；在相应于位置73的位置的K；在相应于位置73的位置的L；在相应于位置73的位置的Q；在相应于位置73的位置的R；在相应于位置73的位置的T；在相应于位置73的位置的W；在相应于位置74的位置的A；在相应于位置74的位置的C；在相应于位置74的位置的E；在相应于位置74的位置的F；在相应于位置74的位置的G；在相应于位置74的位置的H；在相应于位置74的位置的K；在相应于位置74的位置的L；在相应于位置74的位置的M；在相应于位置74的位置的N；在相应于位置74的位置的P；在相应于位置74的位置的R；在相应于位置74的位置的S；在相应于位置74的位置的V；在相应于位置74的位置的W；在相应于位置75的位置的F；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的M；在相应于位置75的位置的R；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置79的位置的L；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置82的位置的N；在相应于位置83的位置的V；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置83的位置的S；在相应于位置83的位置的G；在相应于位置84的位置的E；在相应于位置84的位置的F；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置84的位置的N；在相应于位置84的位置的R；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置86的位置的H；在相应于位置86的位置的K；在相应于位置86的位置的N；在相应于位置86的位置的S；在相应于位置86的位置的T；在相应于位置86的位置的W；在相应于位置87的位置的C；在相应于位置87的位置的G；在相应于位置87的位置的L；在相应于位置87的位置的M；在相应于位置87的位置的R；在相应于位置87的位置的S；在相应于位置87的位置的T；在相应于位置87的位置的V；在相应于位置87的位置的Y；在相应于位置89的位置的C；在相应于位置90的位置的A；在相应于位置90的位置的E；在相应于位置90的位置的H；在相应于位置90的位置的K；在相应于位置90的位置的N；在相应于位置90的位置的R；在相应于位置92的位置的C；在相应于位置92的位置的L；在相应于位置93的位置的I；在相应于位置93的位置的L；在相应于位置93的位置的Q；在相应于位置93的位置的R；在相应于位置93的位置的S；在相应于位置93的位置的T；在相应于位置94的位置的D；在相应于位置94的位置的Q；在相应于位置94的位置的R；在相应于位置97的位置的A；在相应于位置97的位置的C；在相应于位置97的位置的D；在相应于位置97的位置的E；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置97的位置的L；在相应于位置97的位置的S；在相应于位置102的位置的S；在相应于位置102的位置的T；在相应于位置104的位置的R；在相应于位置107的位置的L；在相应于位置114的位置的A；在相应于位置118的位置的Q；在相应于位置120的位置的H；在相应于位置120的位置的F；在相应于位置120的位置的I；在相应于位置120的位置的S；在相应于位置120的位置的V；在相应于位置120的位置的Y；在相应于位置127的位置的E；在相应于位置127的位置的H；在相应于位置127的位置的N；在相应于位置127的位置的Q；在相应于位置127的位置的R；在相应于位置128的位置的I；在相应于位置130的位置的R；在相应于位置131的位置的G；在相应于位置131的位置的I；在相应于位置131的位置的M；在相应于位置131的位置的Q；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置131的位置的V；在相应于位置132的位置的N；在相应于位置132的位置的L；在相应于位置135的位置的D；在相应于位置135的位置的G；在相应于位置135的位置的R；在相应于位置138的位置的L；在相应于位置139的位置的T；在相应于位置140的位置的K；在相应于位置141的位置的H；在相应于位置141的位置的R；在相应于位置141的位置的S；在相应于位置141的位置的W；在相应于位置141的位置的Y；在相应于位置142的位置的D；在相应于位置142的位置的G；在相应于位置142的位置的K；在相应于位置142的位置的N；在相应于位置142的位置的P；在相应于位置142的位置的Q；在相应于位置142的位置的R；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的G；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置144的位置的R；在相应于位置144的位置的T；在相应于位置146的位置的P；在相应于位置146的位置的R；在相应于位置147的位置的A；在相应于位置147的位置的F；在相应于位置147的位置的L；在相应于位置147的位置的R；在相应于位置147的位置的S；在相应于位置147的位置的V；在相应于位置148的位置的H；在相应于位置148的位置的K；在相应于位置148的位置的Q；在相应于位置149的位置的T；在相应于位置149的位置的V；在相应于位置150的位置的A；在相应于位置150的位置的D；在相应于位置150的位置的G；在相应于位置150的位置的N；在相应于位置150的位置的S；在相应于位置150的位置的W；在相应于位置150的位置的Y；在相应于位置151的位置的A；在相应于位置151的位置的H；在相应于位置151的位置的K；在相应于位置151的位置的L；在相应于位置151的位置的M；在相应于位置151的位置的Q；在相应于位置151的位置的R；在相应于位置151的位置的S；在相应于位置151的位置的T；在相应于位置151的位置的V；在相应于位置151的位置的W；在相应于位置151的位置的Y；在相应于位置152的位置的R；在相应于位置152的位置的T；在相应于位置152的位置的W；在相应于位置155的位置的D；在相应于位置155的位置的G；在相应于位置155的位置的K；在相应于位置155的位置的R；在相应于位置156的位置的D；在相应于位置158的位置的Q；在相应于位置158的位置的S；在相应于位置160的位置的S；在相应于位置162的位置的E；在相应于位置163的位置的A；在相应于位置163的位置的E；在相应于位置163的位置的K；在相应于位置163的位置的Q；在相应于位置163的位置的R；在相应于位置163的位置的S；在相应于位置164的位置的M；在相应于位置164的位置的V；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置165的位置的F；在相应于位置165的位置的N；在相应于位置165的位置的S；在相应于位置165的位置的V；在相应于位置166的位置的A；在相应于位置166的位置的E；在相应于位置166的位置的F；在相应于位置166的位置的H；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置166的位置的W；在相应于位置166的位置的Y；在相应于位置167的位置的D；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置170的位置的R；在相应于位置172的位置的A；在相应于位置173的位置的R；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的K；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置174的位置的R；在相应于位置174的位置的T；在相应于位置175的位置的T；在相应于位置178的位置的K；在相应于位置178的位置的R；在相应于位置179的位置的K；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置195的位置的N；在相应于位置196的位置的E；在相应于位置196的位置的R；在相应于位置198的位置的D；在相应于位置204的位置的P；在相应于位置205的位置的A；在相应于位置205的位置的E；在相应于位置205的位置的L；在相应于位置205的位置的T；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置206的位置的K；在相应于位置206的位置的L；在相应于位置206的位置的R；在相应于位置209的位置的R；在相应于位置212的位置的N；在相应于位置212的位置的S；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置213的位置的M；在相应于位置213的位置的N；在相应于位置215的位置的H；在相应于位置215的位置的M；在相应于位置219的位置的A；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置219的位置的K；在相应于位置219的位置的S；在相应于位置220的位置的H；在相应于位置220的位置的I；在相应于位置220的位置的L；在相应于位置220的位置的V；在相应于位置221的位置的Q；在相应于位置222的位置的G；在相应于位置232的位置的F；在相应于位置233的位置的G；在相应于位置233的位置的K；在相应于位置233的位置的R；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置235的位置的A；在相应于位置236的位置的R；在相应于位置237的位置的C；在相应于位置237的位置的E；在相应于位置237的位置的H；在相应于位置237的位置的Q；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置238的位置的E；在相应于氨基酸位置238的位置的H；在相应于位置238的位置的S；在相应于位置240的位置的A；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置247的位置的I；在相应于位置248的位置的A；在相应于位置249的位置的V；在相应于位置257的位置的G；在相应于位置257的位置的T；在相应于位置257的位置的R；在相应于位置258的位置的N；在相应于位置258的位置的S；在相应于位置259的位置的P；在相应于位置260的位置的M；在相应于位置260的位置的Y；在相应于位置261的位置的A；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置261的位置的N；在相应于位置263的位置的K；在相应于位置263的位置的R；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置269的位置的A；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置271的位置的M；在相应于位置272的位置的D；在相应于位置272的位置的T；在相应于位置273的位置的H；在相应于位置273的位置的Y；在相应于位置274的位置的F；在相应于位置276的位置的D；在相应于位置276的位置的H；在相应于位置276的位置的M；在相应于位置276的位置的R；在相应于位置276的位置的S；在相应于位置276的位置的Y；在相应于位置277的位置的A；在相应于位置277的位置的E；在相应于位置277的位置的H；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置277的位置的M；在相应于位置277的位置的N；在相应于位置277的位置的Q；在相应于位置277的位置的R；在相应于位置277的位置的S；在相应于位置277的位置的T；在相应于位置278的位置的E；在相应于位置278的位置的F；在相应于位置278的位置的G；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的K；在相应于位置278的位置的N；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置278的位置的S；在相应于位置278的位置的T；在相应于位置278的位置的Y；在相应于位置279的位置的H；在相应于位置282的位置的M；在相应于位置283的位置的S；在相应于位置285的位置的H；在相应于位置287的位置的T；在相应于位置289的位置的S；在相应于位置291的位置的S；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置292的位置的C；在相应于位置292的位置的F；在相应于位置292的位置的H；在相应于位置292的位置的K；在相应于位置292的位置的R；在相应于位置292的位置的V；在相应于位置293的位置的A；在相应于位置293的位置的C；在相应于位置293的位置的D；在相应于位置293的位置的F；在相应于位置293的位置的K；在相应于位置293的位置的M；在相应于位置293的位置的P；在相应于位置293的位置的Q；在相应于位置293的位置的V；在相应于位置293的位置的Y；在相应于位置298的位置的G；在相应于位置305的位置的E；在相应于位置307的位置的G；在相应于位置308的位置的D；在相应于位置308的位置的G；在相应于位置308的位置的K；在相应于位置308的位置的N；在相应于位置308的位置的R；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置309的位置的G；在相应于位置309的位置的H；在相应于位置309的位置的L；在相应于位置309的位置的M；在相应于位置309的位置的N；在相应于位置309的位置的Q；在相应于位置309的位置的R；在相应于位置309的位置的S；在相应于位置309的位置的T；在相应于位置309的位置的V；在相应于位置310的位置的A；在相应于位置310的位置的G；在相应于位置310的位置的Q；在相应于位置310的位置的S；在相应于位置313的位置的A；在相应于位置313的位置的G；在相应于位置313的位置的H；在相应于位置313的位置的K；在相应于位置313的位置的P；在相应于位置313的位置的R；在相应于位置313的位置的T；在相应于位置313的位置的Y；在相应于314位置的位置的S；在相应于位置314的位置的Y；在相应于位置315的位置的A；在相应于位置315的位置的H；在相应于位置315的位置的Y；在相应于位置317的位置的A；在相应于位置317的位置的I；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置317的位置的N；在相应于位置317的位置的Q；在相应于位置317的位置的R；在相应于位置317的位置的S；在相应于位置317的位置的T；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的D；在相应于位置318的位置的H；在相应于位置318的位置的K；在相应于位置318的位置的M；在相应于位置318的位置的R；在相应于位置320的位置的H；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置320的位置的R；在相应于位置321的位置的R；在相应于位置321的位置的S；在相应于位置324的位置的N；在相应于位置324的位置的R；在相应于位置325的位置的A；在相应于位置325的位置的D；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的H；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的M；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；在相应于位置325的位置的S；在相应于位置325的位置的V；在相应于位置326的位置的L；在相应于位置326的位置的V；在相应于位置328的位置的C；在相应于位置328的位置的G；在相应于位置328的位置的I；在相应于位置328的位置的K；在相应于位置328的位置的L；在相应于位置328的位置的S；在相应于位置328的位置的Y；在相应于位置335的位置的S；在相应于位置347的位置的A；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置347的位置的S；在相应于位置349的位置的M；在相应于位置349的位置的R；在相应于位置351的位置的S；在相应于位置353的位置的V；在相应于位置356的位置的H；在相应于位置356的位置的S；在相应于位置359的位置的E；在相应于位置359的位置的H；在相应于位置359的位置的T；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置367的位置的G；在相应于位置367的位置的K；在相应于位置367的位置的S；在相应于位置368的位置的A；在相应于位置368的位置的E；在相应于位置368的位置的K；在相应于氨基酸位置368的位置的L；在相应于氨基酸位置368的位置的M；在相应于位置368的位置的R；在相应于氨基酸位置368的位置的T；在相应于位置369的位置的H；在相应于位置369的位置的R；在相应于位置371的位置的F；在相应于位置371的位置的H；在相应于位置371的位置的K；在相应于位置371的位置的L；在相应于位置371的位置的R；在相应于位置371的位置的S；在相应于位置373的位置的M；在相应于位置374的位置的H；在相应于位置374的位置的P；在相应于位置375的位置的A；在相应于位置375的位置的G；在相应于位置375的位置的K；在相应于位置375的位置的R；在相应于位置376的位置的D；在相应于位置376的位置的E；在相应于位置376的位置的Q；在相应于位置376的位置的R；在相应于位置376的位置的T；在相应于位置376的位置的V；在相应于位置376的位置的Y；在相应于位置377的位置的D；在相应于位置377的位置的E；在相应于位置377的位置的H；在相应于位置377的位置的K；在相应于位置377的位置的P；在相应于位置377的位置的R；在相应于位置377的位置的S；在相应于位置377的位置的T；在相应于位置380的位置的W；在相应于位置380的位置的Y；在相应于位置381的位置的S；在相应于位置383的位置的I；在相应于位置383的位置的K；在相应于位置383的位置的L；在相应于位置383的位置的S；在相应于位置385的位置的A；在相应于位置385的位置的Q；在相应于位置385的位置的V；在相应于位置389的位置的A；在相应于位置389的位置的G；在相应于位置389的位置的L；在相应于位置389的位置的K；在相应于位置389的位置的Q；在相应于位置389的位置的S；在相应于位置392的位置的A；在相应于位置392的位置的F；在相应于位置392的位置的M；在相应于位置392的位置的Q；在相应于位置392的位置的R；在相应于位置392的位置的V；在相应于位置393的位置的F；在相应于位置393的位置的M；在相应于位置395的位置的A；在相应于位置395的位置的H；在相应于位置395的位置的R；在相应于位置396的位置的A；在相应于位置396的位置的H；在相应于位置396的位置的Q；在相应于位置396的位置的S；在相应于位置399的位置的K；在相应于位置399的位置的M；在相应于位置399的位置的T；在相应于位置399的位置的V；在相应于位置399的位置的W；在相应于位置401的位置的A；在相应于位置401的位置的E；在相应于位置404的位置的A；在相应于位置405的位置的G；在相应于位置406的位置的F；在相应于位置406的位置的N；在相应于位置407的位置的A；在相应于位置407的位置的D；在相应于位置407的位置的E；在相应于位置407的位置的F；在相应于位置407的位置的H；在相应于位置407的位置的Q；在相应于位置407的位置的P；在相应于位置409的位置的A；在相应于位置409的位置的Q；在相应于位置410的位置的T；在相应于位置412的位置的Q；在相应于位置412的位置的R；在相应于位置412的位置的V；在相应于位置416的位置的L；在相应于位置418的位置的E；在相应于位置418的位置的L；在相应于位置418的位置的P；在相应于位置418的位置的R；在相应于位置418的位置的V；在相应于位置419的位置的F；在相应于位置419的位置的H；在相应于位置419的位置的I；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置419的位置的R；在相应于位置419的位置的S；在相应于位置419的位置的Y；在相应于位置421的位置的A；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置421的位置的K；在相应于位置421的位置的N；在相应于位置421的位置的Q；在相应于位置421的位置的R；在相应于位置421的位置的S；在相应于位置425的位置的G；在相应于位置425的位置的K；在相应于位置427的位置的Q；在相应于位置427的位置的T；在相应于位置428的位置的L；在相应于位置431的位置的A；在相应于位置431的位置的G；在相应于位置431的位置的E；在相应于位置431的位置的H；在相应于位置431的位置的K；在相应于位置431的位置的L；在相应于位置431的位置的N；在相应于位置431的位置的Q；在相应于位置431的位置的R；在相应于位置431的位置的S；在相应于位置431的位置的V；在相应于位置433的位置的A；在相应于位置433的位置的H；在相应于位置433的位置的I；在相应于位置433的位置的K；在相应于位置433的位置的L；在相应于位置433的位置的R；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置433的位置的W；在相应于位置436的位置的K；在相应于位置437的位置的I；在相应于位置437的位置的M；在相应于位置438的位置的A；在相应于位置438的位置的D；在相应于位置438的位置的E；在相应于位置438的位置的L；在相应于位置438的位置的N；在相应于位置438的位置的T；在相应于位置439的位置的A；在相应于位置439的位置的C；在相应于位置439的位置的K；在相应于位置439的位置的P；在相应于位置439的位置的Q；在相应于位置439的位置的T；在相应于位置439的位置的V；在相应于位置440的位置的D；在相应于位置440的位置的H；在相应于位置440的位置的M；在相应于位置440的位置的P；在相应于位置440的位置的R；在相应于位置440的位置的S；在相应于位置441的位置的A；在相应于位置441的位置的F；在相应于位置442的位置的C；在相应于位置442的位置的G；在相应于位置442的位置的R；在相应于位置443的位置的A；在相应于位置443的位置的E；在相应于位置443的位置的F；在相应于位置443的位置的G；在相应于位置443的位置的M；在相应于位置443的位置的N；在相应于位置444的位置的E；在相应于位置444的位置的H；在相应于位置444的位置的V；在相应于位置445的位置的H；在相应于位置445的位置的M；在相应于位置445的位置的N；在相应于位置445的位置的P；在相应于位置445的位置的Q；在相应于位置445的位置的S；在相应于位置445的位置的T；在相应于位置445的位置的V；在相应于位置445的位置的W；在相应于位置446的位置的A；在相应于位置446的位置的M；在相应于位置446的位置的W；在相应于位置447的位置的D；在相应于位置447的位置的E；在相应于位置447的位置的G；在相应于位置447的位置的I；在相应于位置447的位置的N；在相应于位置447的位置的P；在相应于位置447的位置的Q；在相应于位置447的位置的T，和/或在相应于位置447的位置的V置换。
举例的这种修饰的PH20多肽是具有SEQ ID NO:74-855任一所示氨基酸序列或者具有与SEQ ID NO:74-855任一呈现至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列且含有所述氨基酸置换及呈现透明质酸酶活性的任何多肽。
本发明提供的任何上述修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸修饰(如氨基酸置换)的相应PH20多肽相比可呈现改变的如改良或增加的性质或活性。例如，改变的活性或性质可以是增加的催化活性和/或在变性条件下增加的稳定性。
a.增加的活性
本发明提供了修饰的或变体PH20多肽，其在PH20多肽中含有一或多个氨基酸置换及与不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽相比呈现增加的透明质酸酶活性，例如SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽或者与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体。特别地，本发明提供的修饰的或变体PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽相比呈现增加的透明质酸酶活性，例如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示PH20多肽及特别是SEQ ID NO:3所示PH20多肽。
所述修饰的PH20多肽可呈现透明质酸酶活性，在相同条件下其是不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽的透明质酸酶活性的至少或大约至少120％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％，例如SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽或者其变体。例如，所述透明质酸酶活性增加至少或大约至少1.2-倍、1.5-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、11-倍、12-倍、13-倍、14-倍、15-倍、16-倍、17-倍、18-倍、19-倍、20-倍、25-倍、30-倍、40-倍、50-倍、60-倍、70-倍、80-倍、90-倍、100-倍、200-倍、300-倍、400-倍或更多。
在特别的实例中，所述修饰的PH20多肽在经鉴别与增加的透明质酸酶活性相关的一或多个氨基酸位置含有氨基酸置换。如本文所述，这种位置已经通过使用诱变法和选择或者筛选方法鉴别，以鉴别导致增加的透明质酸酶活性的那些位置。所述PH20多肽也可含有其它修饰，如单独地与增加的活性不相关的其它氨基酸置换，只要所得修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸修饰如氨基酸置换的PH20相比呈现增加的透明质酸酶活性即可。本发明提供的修饰的PH20多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48,49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或更多个氨基酸置换。也可以包含另外的修饰，如插入或缺失。所述氨基酸置换可以在SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽或者与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体中。例如，所述置换可以在如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示人PH20多肽或者其变体中。
例如，本发明提供的修饰的PH20多肽含有在相应于如下参考SEQ IDNO:3所示氨基酸位置的一或多个氨基酸位置的氨基酸置换(取代)：1、12、15、24、26、27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446或447。例如，所述氨基酸位置可以是在相应于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的置换的位置的置换：在位置1的亮氨酸(L)(L1)、V12、L15、F24、L26、G27、F29、D30、E31、P32、L33、L37、S39、I46、A48、G52、V58、Y63、I67、D68、S69、I70、T71、G72、V73、T74、V75、S84、G86、D87、A92、K93、K94、T97、T118、A120、D127、N131、E135、N141、V142、T147、E148、T150、E151、K152、Q155、E156、D163、F164、L165、V166、I169、K170、L174、G198、V206、K209、D212、D213、S215、N219、Q233、Q234、P236、A238、V247、P257、A259、K260、S261、L263、T269、I271、V272、Q276、V277、L278、S282、G291、T293、G305、S308、I309、M310、M313、S315、L317、L318、D320、E324、T325、I326、N328、Q347、I353、S359、A371、G377、F380、E389、E392、S395、Y399、T405、S407、K409、E410、D418、A419、D421、A425、D431、F433、P436、P437、M438、E439、T440、E441、E442、P443、I445、F446或Y447的置换。举例的这种修饰的PH20多肽是呈现至少1.5-倍或更多倍不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽活性的多肽。
举例的本发明提供的修饰的PH20多肽中的氨基酸置换包括但不限于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的置换：在相应于位置1的位置的组氨酸(H)；在相应于位置1的位置的Q；在相应于位置12的位置的E；在相应于位置12的位置的T；在相应于位置15的位置的V；在相应于位置24的位置的E；在相应于位置24的位置的H；在相应于位置26的位置的E；在相应于位置26的位置的K；在相应于位置27的位置的K；在相应于位置27的位置的R；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置29的位置的I；在相应于位置29的位置的L；在相应于位置29的位置的M；在相应于位置29的位置的P；在相应于位置29的位置的S；在相应于位置29的位置的V；在相应于位置30的位置的G；在相应于位置30的位置的H；在相应于位置30的位置的K；在相应于位置30的位置的M；在相应于位置30的位置的R；在相应于位置30的位置的S；在相应于位置31的位置的A；在相应于位置31的位置的C；在相应于位置31的位置的H；在相应于位置31的位置的I；在相应于位置31的位置的K；在相应于位置31的位置的L；在相应于位置31的位置的P；在相应于位置31的位置的R；在相应于位置31的位置的S；在相应于位置31的位置的T；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置32的位置的F；在相应于位置32的位置的G；在相应于位置32的位置的H；在相应于位置33的位置的W；在相应于位置37的位置的F；在相应于位置39的位置的N；在相应于位置39的位置的T；在相应于位置46的位置的R；在相应于位置48的位置的F；在相应于位置48的位置的H；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置52的位置的Q；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置63的位置的W；在相应于位置67的位置的V；在相应于位置68的位置的H；在相应于位置68的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的C；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的I；在相应于位置69的位置的L；在相应于位置69的位置的M；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置69的位置的W；在相应于位置69的位置的Y；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的C；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的K；在相应于位置70的位置的L；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的P；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的S；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置71的位置的R；在相应于位置71的位置的S；在相应于位置72的位置的M；在相应于位置72的位置的Q；在相应于位置73的位置的H；在相应于位置73的位置的L；在相应于位置73的位置的W；在相应于位置74的位置的A；在相应于位置74的位置的C；在相应于位置74的位置的G；在相应于位置74的位置的N；在相应于位置74的位置的P；在相应于位置74的位置的R；在相应于位置74的位置的S；在相应于位置74的位置的V；在相应于位置74的位置的W；在相应于位置75的位置的F；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的R；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置84的位置的R；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置87的位置的C；在相应于位置87的位置的T；在相应于位置87的位置的Y；在相应于位置92的位置的C；在相应于位置93的位置的I；在相应于位置93的位置的L；在相应于位置93的位置的R；在相应于位置93的位置的T；在相应于位置94的位置的R；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置118的位置的Q；在相应于位置120的位置的F；在相应于位置120的位置的V；在相应于位置120的位置的Y；在相应于位置127的位置的H；在相应于位置127的位置的N；在相应于位置131的位置的G；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置131的位置的V；在相应于位置135的位置的D；在相应于位置135的位置的G；在相应于位置135的位置的R；在相应于位置141的位置的H；在相应于位置141的位置的Y；在相应于位置142的位置的R；在相应于位置147的位置的R；在相应于位置147的位置的V；在相应于位置148的位置的K；在相应于位置150的位置的G；在相应于位置151的位置的K；在相应于位置151的位置的L；在相应于位置151的位置的M；在相应于位置151的位置的Q；在相应于位置151的位置的R；在相应于位置152的位置的R；在相应于位置155的位置的G；在相应于位置155的位置的K；在相应于位置156的位置的D；在相应于位置163的位置的A；在相应于位置163的位置的E；在相应于位置163的位置的K；在相应于位置163的位置的R；在相应于位置164的位置的M；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置165的位置的N；在相应于位置166的位置的A；在相应于位置166的位置的F；在相应于位置166的位置的H；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置166的位置的Y；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置170的位置的R；在相应于位置174的位置的K；在相应于位置198的位置的D；在相应于位置206的位置的K；在相应于位置206的位置的L；在相应于位置212的位置的N；在相应于位置213的位置的M；在相应于位置213的位置的N；在相应于位置215的位置的M；在相应于位置219的位置的S；在相应于位置233的位置的K；在相应于位置233的位置的R；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置236的位置的R；在相应于位置237的位置的E；在相应于位置238的位置的S；在相应于位置247的位置的I；在相应于位置257的位置的T；在相应于位置259的位置的P；在相应于位置260的位置的Y；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置261的位置的N；在相应于位置263的位置的K；在相应于位置263的位置的R；在相应于位置269的位置的A；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置271的位置的M；在相应于位置272的位置的T；在相应于位置276的位置的D；在相应于位置276的位置的S；在相应于位置276的位置的Y；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置277的位置的R；在相应于位置277的位置的T；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的K；在相应于位置278的位置的N；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置278的位置的S；在相应于位置278的位置的T；在相应于位置278的位置的Y；在相应于位置282的位置的M；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置293的位置的A；在相应于位置293的位置的C；在相应于位置293的位置的F；在相应于位置293的位置的M；在相应于位置293的位置的P；在相应于位置293的位置的Q；在相应于位置293的位置的V；在相应于位置305的位置的E；在相应于位置308的位置的G；在相应于位置308的位置的N；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置309的位置的L；在相应于位置309的位置的N；在相应于位置309的位置的Q；在相应于位置309的位置的R；在相应于位置309的位置的T；在相应于位置310的位置的A；在相应于位置310的位置的G；在相应于位置313的位置的K；在相应于位置313的位置的R；在相应于位置315的位置的H；在相应于位置317的位置的I；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置317的位置的R；在相应于位置318的位置的M；在相应于位置320的位置的H；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置320的位置的R；在相应于位置324的位置的R；在相应于位置325的位置的A；在相应于位置325的位置的D；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的H；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的M；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；在相应于位置325的位置的S；在相应于位置326的位置的V；在相应于位置328的位置的I；在相应于位置328的位置的K；在相应于位置328的位置的L；在相应于位置的位置328的S；在相应于位置328的位置的Y；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置347的位置的S；在相应于位置353的位置的V；在相应于位置359的位置的T；在相应于位置371的位置的R；在相应于位置377的位置的P；在相应于位置377的位置的T；在相应于位置380的位置的W；在相应于位置380的位置的Y；在相应于位置389的位置的K；在相应于位置392的位置的M；在相应于位置395的位置的R；在相应于位置399的位置的M；在相应于位置399的位置的T；在相应于位置399的位置的W；在相应于位置405的位置的G；在相应于位置407的位置的D；在相应于位置407的位置的Q；在相应于位置409的位置的A；在相应于位置409的位置的Q；在相应于位置410的位置的T；在相应于位置418的位置的P；在相应于位置419的位置的F；在相应于位置419的位置的I；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置419的位置的R；在相应于位置419的位置的S；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置421的位置的K；在相应于位置421的位置的N；在相应于位置421的位置的Q；在相应于位置421的位置的R；在相应于位置421的位置的S；在相应于位置425的位置的K；在相应于位置431的位置的A；在相应于位置431的位置的H；在相应于位置431的位置的K；在相应于位置431的位置的Q；在相应于位置431的位置的R；在相应于位置431的位置的S；在相应于位置431的位置的V；在相应于位置433的位置的L；在相应于位置433的位置的R；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置436的位置的K；在相应于位置437的位置的I；在相应于位置437的位置的M；在相应于位置438的位置的T；在相应于位置439的位置的V；在相应于位置440的位置的H；在相应于位置440的位置的R；在相应于位置441的位置的F；在相应于位置442的位置的R；在相应于位置443的位置的A；在相应于位置443的位置的M；在相应于位置445的位置的M；在相应于位置445的位置的P；在相应于位置446的位置的A；在相应于位置447的位置的D；在相应于位置447的位置的N；和/或在相应于位置447的位置的Q。修饰的PH20多肽可含有任一或多个列举的氨基酸取代，与或不与另外的修饰任意组合，只要所述PH20多肽呈现透明质酸酶活性即可，如与不含有所述修饰的PH20多肽相比增加的透明质酸酶活性，例如至少1.5倍增加的透明质酸酶活性。
在一些实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在相应于如下参考SEQID NO:3所示位置的位置24、29、31、48、58、69、70、75、84、97、165、166、271、278、317、320、325和/或326含有一或多个氨基酸置换。例如，举例的氨基酸置换包括但不限于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的置换：在相应于位置24的位置的E；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；在相应于位置326的位置的V。所述修饰的PH20多肽可含有任一或多个所述的氨基酸取代，与或不与另外的修饰任意组合，只要所述PH20多肽呈现透明质酸酶活性即可，如与不含有所述修饰的PH20多肽相比增加的透明质酸酶活性，例如至少2.0-倍增加的透明质酸酶活性。
与未修饰的PH20多肽(如SEQ ID NO:3所示)相比呈现增加的活性的举例的修饰的PH20多肽是具有如下任一所示氨基酸序列的任何多肽：SEQ IDNO:73、78、86、89、91、95、96、99、100、105、106、108、109、111、112、113、115、117、118、119、120、123-126、128-136、139-141、149、154、155、159、164、165、167、173、178、181、191-193、195-197、199-205、207-221、225、226、228、229、231、233、237-239、242、247-254、256、257、267、269、270、277、283、293、295、296、298、300、303、308、316、318、321、322、324、325、330、334、335、338-340、344、348、355、367、369、371、377、384-388、394、398、399、401、406-408、410、412、414、416、419、421-426、428、430、431、435、448、455、456、459、462、463、465、469、478-480、482、484、490、493、497、501、503、505、506-508、510-512、514、518、522、523、527、531、533、537-543、545、551、558、559、561、563-566、569、572、574、576、579、581-583、585、587、588、594、596、602、605、606、609、613、618-620、624-634、637、640-644、647、648、652、657、675、695、698、699、700、712、717、725、731、732、734、738、742、746、748-750、757、760、762-765、768-773、775、779、782、783、786-789、794-797、799-801、807、814、816、819、822、825、826、830、836、838、844、847、851、853，或者是具有与SEQ ID NO:73、78、86、89、91、95、96、99、100、105、106、108、109、111、112、113、115、117、118、119、120、123-126、128-136、139-141、149、154、155、159、164、165、167、173、178、181、191-193、195-197、199-205、207-221、225、226、228、229、231、233、237-239、242、247-254、256、257、267、269、270、277、283、293、295、296、298、300、303、308、316、318、321、322、324、325、330、334、335、338-340、344、348、355、367、369、371、377、384-388、394、398、399、401、406-408、410、412、414、416、419、421-426、428、430、431、435、448、455、456、459、462、463、465、469、478-480、482、484、490、493、497、501、503、505、506-508、510-512、514、518、522、523、527、531、533、537-543、545、551、558、559、561、563-566、569、572、574、576、579、581-583、585、587、588、594、596、602、605、606、609、613、618-620、624-634、637、640-644、647、648、652、657、675、695、698、699、700、712、717、725、731、732、734、738、742、746、748-750、757、760、762-765、768-773、775、779、782、783、786-789、794-797、799-801、807、814、816、819、822、825、826、830、836、838、844、847、851、853呈现至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的氨基酸序列及与相应未修饰的多肽相比含有所述氨基酸置换并呈现增加的透明质酸酶活性的多肽。
b.增加的稳定性
本发明提供了呈现增加的稳定性的PH20多肽。特别地，所述PH20多肽呈现增加的体内和/或体外稳定性。例如，所述PH20多肽在不同的贮存条件下可呈现增加的稳定性。本发明提供的呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽在其它参数之中显示出对变性条件增加的抗性，包括但不限于由温度(如升高的温度如加热)、搅动、无盐或低盐和/或存在赋形剂所致的变性条件。举例的赋形剂包括但不限于抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填物和稀释剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂或甜味剂。例如，不同赋形剂如防腐剂可以作为蛋白质变性剂。本发明提供的呈现增加的蛋白质稳定性的修饰的PH20多肽当暴露于变性条件时与不含有所述氨基酸置换的相应PH20相比呈现降低的聚集、降低的沉淀和/或增加的活性。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽当暴露于变性条件时与不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽当暴露于相同变性条件时相比呈现至少或至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更高的增加的活性。
本发明提供的呈现增加的稳定性的PH20多肽是修饰的或变体PH20多肽，其含有氨基酸置换(取代)、缺失或插入或者其它修饰。典型地，本发明提供的呈现增加的稳定性的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽相比在PH20多肽中含有一或多个氨基酸置换，例如SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽或者与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体。特别地，本发明提供的修饰的或变体PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽相比呈现增加的稳定性，例如，SEQ IDNO:3、7、32-66、69或72任一所示PH20多肽，特别是SEQ ID NO:3所示PH20多肽。
在特别的实例中，所述修饰的PH20多肽在经鉴别与增加的稳定性相关的一或多个氨基酸位置含有氨基酸置换。如本文所述，这种位置可以通过使用诱变法和选择或筛选方法鉴别，以鉴别与不含有所述修饰的相应PH20相比在暴露于一或多种变性条件时导致稳定性(如增加的活性)的那些位置。所述PH20多肽也可以含有其它修饰，如单独地与赋予稳定性不相关的其它氨基酸置换，只要所得修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸修饰如氨基酸置换的PH20相比在一或多种变性条件下呈现增加的稳定性及呈现透明质酸酶活性即可。本发明提供的修饰的PH20多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48,49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或更多个氨基酸置换。也可以包含另外的修饰如插入或缺失。所述氨基酸置换可以在如SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽中或者在与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的其变体中。例如，所述置换可以是在人PH20多肽中，例如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示任何多肽或者其变体中。
举例的本发明提供的修饰的PH20多肽是在暴露于酚化合物、高温(加热)和/或缺少NaCl时呈现增加的稳定性的PH20多肽。
i.亲酚类化合物(Phenophiles)
本发明提供了修饰的PH20多肽，其在存在酚类化合物的条件下呈现增加的稳定性。多剂量配制物必须含有抗微生物防腐剂以保护其免于微生物污染。对于肠道外药物产物，包括胰岛素及其它治疗剂，最常用的防腐剂是酚类化合物，如苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。所述防腐剂典型必须以符合监管规则的足够浓度存在。例如，监管要求主张所述配制物的抗微生物效力必须符合目标市场的防腐剂效力检测(PET)要求。目前不同的监管机构对于设计为多次给予剂量的药物的抗微生物效力具有不同的药典标准。美国药典(USP)和欧洲药典(EP)的PET要求相当不同，在开发多剂量配制物中强迫额外的限制。表4示出符合USP和EP标准的注射药物的标准。典型地，符合EP(EPA或EPB)抗微生物要求的配制物比仅符合USP抗微生物要求配制的那些配制物含有更多的防腐剂。
*来自初始测量的接种体的Log10单位去除；未增加:较先前测量值不超过0.5log10单位增加。
抗微生物防腐剂可以与蛋白质相互作用，导致聚集和对稳定性的负作用。因此，尽管防腐剂是必要组分，由于它们通常会诱导蛋白质在水溶液中的聚集，防腐剂在蛋白质的稳定的多剂量制剂的研发中产生显著问题。特别地，增加或高剂量防腐剂可负面影响蛋白质的稳定性，包括对可影响蛋白质活性的物理稳定性的作用(聚集或沉淀)。例如，为了符合EP防腐剂效力要求，可能要求相对高量的酚类化合物如苯酚或间甲酚，其可影响蛋白质配制物的稳定性。例如，防腐剂如苯酚、间甲酚和苯甲醇已经示出诱导人生长激素(Maa and Hsu(1996)Int.J.Pharm.140:155–168)、重组白细胞介素-1受体(Remmele(1998)Pharm.Res.15:200–208)、人胰岛素样生长因子I(Fransson(1997)Pharm.Res.14:606–612)、rhIFN-γ(Lam(1997)Pharm.Res.14:725–729)和细胞色素c(Singh et al.(2011)J.Pharm Sci.,100:1679-89)的聚集。防腐剂对溶液中的蛋白质的去稳定化作用已成为多剂量配制物研发中的限制因素，并且迄今为止，大多数蛋白治疗剂配制仅用于单次使用。
PH20透明质酸酶，如rHuPH20，在防腐剂存在下快速损失活性，可能是由于蛋白质的解折叠和随后的聚集物形成所致。例如，如本文中的实施例所示，防腐剂降低PH20酶活性，特别是在升高的温度(也见美国临时申请号61/520,962；及美国申请号13/507,263和13/507,262)。例如，在与0.4％间甲酚保温4小时后，PH20(例如rHuPH20)保留仅大约10％其活性(见例如实施例5)。当在存在0.1％苯酚和0.15％或0.315％间甲酚条件下在37℃保温6天时，根据所述配制物中其它赋形剂的存在或其它赋形剂的量，PH20(例如rHuPH20)保留大约0％-15％活性(见例如实施例9和10)。例如，高浓度盐的存在通常增加PH20的稳定性。特别地，当在配制物中加入酚类防腐剂如间甲酚时，PH20如rHuPH20的解链温度显著降低。例如，rHuPH20的解折叠温度从44℃降低至24℃。较低的PH20解折叠温度导致增加的PH20聚集，尤其是在升高的温度，及降低的酶活性。去稳定化作用很可能是由于酚类防腐剂的疏水性性质所致。酚类化合物的疏水性可以通过与蛋白质的非特异性结合而导致与rHuPH20的相互作用，最终扰乱rHuPH20的结构完整性。这造成在防腐剂存在下rHuPH20酶活性的显著损失。
本发明提供的在存在酚类防腐剂条件下呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽在存在至少一种酚类防腐剂条件下在至少4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周或更长的时间与在不存在防腐剂在相同时间及在相同条件(除外存在防腐剂)下修饰的PH20多肽的酶活性相比呈现15％以上的酶活性。在一些实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在酚类防腐剂与不存在酚类防腐剂相比呈现至少16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的酶活性。例如，所述酚类防腐剂化合物可以是苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和/或对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
在特别的实例中，在存在防腐剂条件下增加的稳定性是在或大约在0℃-40℃如在或大约在2℃-6℃、24℃-32℃或者35℃-40℃及通常在或大约在4℃或5℃、30℃或37℃的温度条件下呈现的。应理解由于高温对PH20活性也可以具有去稳定化作用(见下文所述)，因此本发明提供的修饰的PH20多肽在存在防腐剂条件下的酶活性百分比在较低温度比在较高温度更高。
通常，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量的防腐剂条件下呈现增加的稳定性及显著的酶活性，所述抗微生物有效量防腐剂杀死或抑制组合物样品中微生物生物体的增殖。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量防腐剂条件下呈现增加的稳定性，所述抗微生物有效量防腐剂杀死或抑制微生物生物体增殖，由此在接种后7天出现细菌生物体去除至少1.0log10单位。在一些实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量防腐剂条件下呈现增加的稳定性，所述抗微生物有效量防腐剂杀死或抑制微生物生物体的增殖，由此当在抗微生物防腐剂效力检测(APET)中检测时，在用微生物接种体接种组合物之后，在接种后7天出现细菌生物体去除至少1.0log10单位，在接种后14天出现细菌生物体去除至少3.0log10单位，在接种后28天出现细菌生物体至少不再进一步增加，及在接种后7天出现真菌生物体至少不增加。在其它实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量防腐剂的条件下呈现增加的稳定性，所述抗微生物有效量防腐剂杀死或抑制微生物生物体的增殖，由此当在抗微生物防腐剂效力检测(APET)中检测时，在用微生物接种体接种所述组合物之后，在接种后24小时出现细菌生物体去除至少1.0log10单位，在接种后7天出现细菌生物体去除至少3.0log10单位，在接种后28天出现细菌生物体不再增加，在接种后14天出现真菌生物体去除至少1.0log10单位，及在接种后28天出现真菌生物体至少不再增加。在另一实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量防腐剂条件下呈现增加的稳定性，所述抗微生物有效量防腐剂杀死或抑制微生物生物体的增殖，由此当在抗微生物防腐剂效力检测(APET)中检测时，在用微生物接种体接种所述组合物之后，在接种后6小时出现细菌生物体去除至少2.0log10单位，在接种后24小时出现细菌生物体去除至少3.0log10单位，在用所述细菌接种物接种组合物后28天细菌生物体未恢复，在接种后7天出现真菌生物体去除至少2.0log10单位，及在接种后28天后真菌生物体至少不再增加。
例如，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在一或多种酚类防腐剂的条件下呈现增加的稳定性及上述酶活性，所述防腐剂的总量以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，其为0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％(包括端点)。
通常，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在间甲酚和/或苯酚的条件下呈现增加的稳定性。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在间甲酚条件下呈现增加的稳定性，含有修饰的PH20多肽的配制物中所述间甲酚的量以质量浓度(w/v)百分比％表示，其为或大约为0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％。在其它实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在苯酚的条件下呈现增加的稳定性，所述苯酚在含有修饰的PH20多肽的配制物中的量以质量浓度(w/v)百分比％表示，其量为或大约为0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％间甲酚。在进一步的实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在苯酚和间甲酚的条件下呈现增加的稳定性，所述苯酚和间甲酚在含有修饰的PH20多肽的配制物中的量以质量浓度(w/v)百分比％表示，为或大约为0.05％-0.25％苯酚与为或大约为0.05％-0.3％间甲酚，为或大约为0.10％-0.2％苯酚与为或大约为0.6％-0.18％间甲酚，为或大约为0.1％-0.15％苯酚与0.8％-0.15％间甲酚，为或大约为0.10％-0.15％苯酚与为大约为0.06％-0.09％间甲酚，或者为或大约为0.12％-0.18％苯酚与为或大约为0.14％-0.22％间甲酚。
在本发明的实例中，修饰的PH20多肽在存在至少大约为或为0.3％-0.4％(包括端点)间甲酚和/或苯酚及在37℃至少4小时与不存在所述防腐剂在相同时间及在相同条件下(除了防腐剂之外)的修饰的PH20多肽的酶活性相比呈现超过15％如至少16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的酶活性。例如，修饰的PH20多肽在存在大约为或为0.4％间甲酚在37℃至少4小时条件下与不存在所述防腐剂在相同时间和相同条件(除了存在防腐剂之外)下的修饰的PH20多肽的酶活性相比呈现超过15％如至少16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的酶活性。本发明提供的修饰的PH20多肽在存在至少大约为或为0.2％-0.4％(包括端点)间甲酚和/或苯酚在37℃至少1天、2天、3天、4天、5天或6天条件下与不存在所述防腐剂在相同时间和相同条件(除了存在防腐剂之外)下的修饰的PH20多肽的酶活性相比呈现超过15％如至少16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的酶活性。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在至少大约为或为0.10％苯酚或大约为或为0.15％间甲酚在37℃至少1天、2天、3天、4天、5天或6天条件下与不存在所述防腐剂在相同时间和相同条件(除了存在防腐剂之外)下的修饰的PH20多肽的酶活性相比呈现超过15％如至少16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的酶活性。在其它实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在大约为或为0.315％间甲酚在37℃至少1天、2天、3天、4天、5天或6天、通常为至少6天的条件下与不存在所述防腐剂在相同时间和相同条件(除了存在防腐剂之外)下的修饰的PH20多肽的酶活性相比呈现超过15％如至少16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的酶活性。
例如，本发明提供的呈现出对酚化合物的增加的稳定性的这种修饰的PH20多肽在相应于如下参考SEQ ID NO:3氨基酸位置的一或多个氨基酸位置含有氨基酸置换(取代)：10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443或445。例如，所述氨基酸位置可以是在相应于参考SEQ ID NO:3氨基酸位置的如下位置的置换的一或多个位置的置换：在位置10(P)(P10)、V12、A20、S22、L26、D34、S36、I46、G50、G52、V58、D68、I70、T74、K82、I83、S84、Q86、T97、D127、N131、Q138、V142、Q143、L144、V166、I169、L174、H193、K195、K196、F204、N205、V206、D213、N219、Q234、V237、A238、T240、E249、S261、A267、V277K279、G291、I309、M310、K314、S315、L317、Q347、P367、E375、K376、Y399、S401、S407、D416、A419、D421、D431、F433、E439、T440、P443或I445。
在本发明提供的修饰的PH20多肽中举例的氨基酸置换包括但不限于如下参考SEQ ID NO:3氨基酸位置的位置的置换：在相应于位置10的位置的甘氨酸(G)；在相应于位置12的位置的K；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置22的位置的T；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置36的位置的N；在相应于位置46的位置的L；在相应于位置50的位置的M；在相应于位置52的位置的T；在相应于位置52的位置的S；在相应于位置58的位置的C；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的R；在相应于位置58的位置的N；在相应于位置58的位置的Y；在相应于位置58的位置的P；在相应于位置58的位置的H；在相应于位置68的位置的P；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置74的位置的E；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置82的位置的N；在相应于位置83的位置的V；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置83的位置的S；在相应于位置83的位置的G；在相应于位置84的位置的N；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置86的位置的K；在相应于位置97的位置的E；在相应于位置97的位置的L；在相应于位置127的位置的R；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置138的位置的L；在相应于位置142的位置的K；在相应于位置142的位置的N；在相应于位置142的位置的P；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的G；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置144的位置的T；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置195的位置的N；在相应于位置196的位置的E；在相应于位置196的位置的R；在相应于位置204的位置的P；在相应于位置205的位置的A；在相应于位置205的位置的E；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置238的位置的H；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置249的位置的V；在相应于位置261的位置的A；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置279的位置的H；在相应于位置279的位置的V；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置310的位置的Q；在相应于位置314的位置的Y；在相应于位置315的位置的Y；在相应于位置317的位置的N；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的D；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置375的位置的R；在相应于位置376的位置的R；在相应于位置399的位置的V；在相应于位置401的位置的E；在相应于位置407的位置的A；在相应于位置416的位置的L；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置431的位置的E；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置439的位置的C；在相应于位置440的位置的P；在相应于位置443的位置的G；在相应于位置445的位置的N。
所述氨基酸置换可以是在SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽或者在与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体中。例如，所述置换可以是在SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示人PH20多肽中，或者在其变体中。
与未修饰的PH20多肽(例如SEQ ID NO:3所示)相比，呈现出对酚化合物增加的稳定性的举例的修饰的PH20多肽是具有如下任一所示氨基酸序列的任何多肽：SEQ ID NO:83、88、93、94、101、144、148、158、171、176、175、177、178、180、182、183、184、185、194、221、240、259、260、261、262、263、264、268、270、272、307、309、327、334、341、351、352、353、356、357、358、359、361、424、426、430、434、436、443、444、445、446、447、449、450、451、454、461、467、480、487、489、492、495、504、505、509、527、544、576、589、600、603、607、612、614、647、658、683、687、733、736、741、754、763、768、781、796、797、809、818、829或837，或者具有与SEQ ID NO:83、88、93、94、101、144、148、158、171、176、175、177、178、180、182、183、184、185、194、221、240、259、260、261、262、263、264、268、270、272、307、309、327、334、341、351、352、353、356、357、358、359、361、424、426、430、434、436、443、444、445、446、447、449、450、451、454、461、467、480、487、489、492、495、504、505、509、527、544、576、589、600、603、607、612、614、647、658、683、687、733、736、741、754、763、768、781、796、797、809、818、829或837任一所示序列呈现至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列且与相应未修饰的多肽相比含有氨基酸置换、呈现透明质酸酶活性及在存在酚化合物的条件下呈现增加的稳定性的多肽。
特别地，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在相应于参考SEQ ID NO:3的氨基酸残基204的位置含有用P的氨基酸置换。典型地，所述修饰的PH20多肽是人多肽。例如，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:3、7、69、72或32-66任一所示氨基酸序列中含有氨基酸置换F204P或者含有与SEQ ID NO:3、7、69、72或32-66任一呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列，只要所述修饰的多肽含有相应于F204P的氨基酸置换即可。在其它情况中，所述修饰的PH20多肽是非人多肽。例如，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:10、12、14、857、859、861或870所示氨基酸序列中含有氨基酸置换F204P或者含有与SEQ ID NO:10、12、14、857、859、861或870任一呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列，只要所述修饰的多肽含有相应于F204P的氨基酸置换即可。在进一步的实例中，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:24所示氨基酸序列中含有氨基酸置换F205P或者在SEQ ID NO:31所示氨基酸序列中含有氨基酸置换Y204P，或者与SEQ ID NO:24或31呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列。举例的这种修饰的PH20多肽是具有SEQ ID NO:449所示氨基酸序列的多肽，或者是具有与SEQ ID NO:449呈现至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列且与相应未修饰的多肽(如SEQ ID NO:3所示)相比含有氨基酸置换F204P、呈现增加的透明质酸酶活性及呈现出对酚化合物增加的稳定性的多肽。在任何上述实例中，在相应于参考SEQ ID NO:3的氨基酸残基204的位置含有用P的氨基酸置换的修饰的PH20多肽不具有SEQ ID NO:15-22、28或29所示氨基酸序列。
在另一实例中，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在相应于参考SEQID NO:3的氨基酸残基58的位置含有氨基酸置换。举例的氨基酸置换是在相应于参考SEQ ID NO:3的氨基酸残基58的位置用赖氨酸(K)或精氨酸(R)的置换。典型地，修饰的PH20多肽是人多肽。例如，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:3、7、69、72或32-66任一所示氨基酸序列或者在与SEQ ID NO:3、7、69、72或32-66任一呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列中含有氨基酸置换V58K或V58R。在其它情况中，修饰的PH20多肽是非人多肽。例如，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:10、12、14、20、22、24、29、857、859、861或870所示氨基酸序列或者在与SEQ ID NO:10、12、14、20、22、24、29、857、859、861或870任一呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列中含有氨基酸置换V58K或V58R。在进一步的实例中，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:16或31所示氨基酸序列或者在与SEQ ID NO:16或31呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列中含有氨基酸置换A58R。举例的这种修饰的PH20多肽是具有SEQ ID NO:182所示氨基酸序列或者具有与SEQ ID NO:182呈现至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的多肽，其与相应未修饰的多肽(例如SEQID NO:3所示)相比含有氨基酸置换V58R及呈现增加的透明质酸酶活性及在存在酚化合物的条件下增加的稳定性。
ii.耐热性化合物
在升高的温度，PH20透明质酸酶可丧失活性。
本发明提供了修饰的PH20多肽，其在或大约在30℃-45℃(包括端点)、如在或大约在35℃-42℃、特别是在或大约在37℃的升高的温度下呈现增加的稳定性。例如，本发明提供了修饰的PH20多肽，其在高于32℃的升高的温度如35℃-45℃、37℃-42℃及特别是在或大约在37℃可稳定至少3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、至少5天、至少6天或者至少7天。在升高的温度呈现稳定性的修饰的PH20多肽可用于其中温度升高、可波动或可增加的应用中。这可以发生在例如利用泵或其它持续输注装置的给予方法中。
特别地，本发明提供的在升高的温度呈现稳定性的修饰的PH20多肽与不含有所述修饰如氨基酸置换的相应PH20多肽相比在升高的温度呈现增加的透明质酸酶活性。所述PH20多肽在高于32℃如35℃-45℃或37℃-42℃、特别是在或大约在37℃的升高的温度下保温至少4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、至少5天、至少6天或至少7天时与不含有所述修饰的相应PH20多肽在相同条件下相比可呈现增加的透明质酸酶活性。例如，所述透明质酸酶活性与不含有所述修饰的相应PH20多肽在相同条件下保温相比可增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。例如，所述透明质酸酶活性与不含有所述修饰的相应PH20多肽在相同条件下保温相比可增加至少1.1-倍、1.2-倍、1.3-倍、1.4-倍、1.5-倍、1.6-倍、1.7-倍、1.8-倍、1.9-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍或更多。
在其它实例中，本发明提供的在升高的温度呈现稳定性的修饰的PH20多肽与所述修饰的PH20多肽在未升高温度的相同条件下(除了温度差异之外)下保温的活性相比在升高的温度下保留透明质酸酶活性。例如，修饰的PH20多肽在高于32℃如35℃-45℃或37℃-42℃、特别是在或大约在37℃的升高的温度与所述PH20在或大约在2℃-8℃未升高的温度下的活性相比呈现高于或高于大约50％如高于或至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性。在一些实例中，本发明提供的在升高的温度呈现稳定性的修饰的PH20多肽在升高的温度与在未升高的温度在相同条件(除了温度差异之外)下保温的所述修饰的PH20多肽的活性相比呈现增加的活性。例如，修饰的PH20多肽在高于32℃如35℃-45℃或者37℃-42℃、特别是在或大约在37℃的升高的温度与在或大约在2℃-8℃的未升高的温度下的PH20的活性相比呈现高于或大约10％增加的活性，如高于或至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的活性。例如，修饰的PH20多肽在高于32℃如35℃-45℃或者37℃-42℃、特别是在或大约在37℃的升高的温度与所述PH20在或大约在2℃-8℃的未升高的温度的活性相比呈现高于或至少大约1.1-倍的透明质酸酶活性，如高于或至少1.2-倍、1.3-倍、1.4-倍、1.5-倍、1.6-倍、1.7-倍、1.8-倍、1.9-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍或更高的活性。
例如，本发明提供的在升高的温度呈现增加的稳定性的这种修饰的PH20多肽在相应于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的一或多个氨基酸位置含有氨基酸置换(取代)：1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439或443。例如，所述氨基酸位置可以是在相应于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的置换的在一或多个位置的置换：在位置1的(L)(L1)、N11、V12、F14、A20、L26、F29、D34、G50、V58、I70、K82、I83、S84、Q86、D87、Q140、V142、Q143、T147、K152、V166、E167、G172、L174、N178、H193、K195、V206、D212、D213、N219、Q233、V237、T240、A267、V277、G291、E292、I309、M313、K314、L317、L318、Q347、P367,D368、A371、L374、E389、E392、S395、E396、L406、A419、D421、E439或P443。所得修饰的PH20多肽在高于32℃如35℃-45℃、37℃-42℃及特别是在或大约在37℃的升高的温度呈现增加的稳定性至少3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、至少5天、至少6天、至少7天或更长时间。
举例的在本发明提供的修饰的PH20多肽中的氨基酸置换包括但不限于在如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置的置换：在相应于位置1的位置的R；在相应于位置11的位置的S；在相应于位置12的位置的I；在相应于位置14的位置的V；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置29的位置的R；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置50的位置的M；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置84的位置的R；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置87的位置的S；在相应于位置140的位置的K；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置147的位置的S；在相应于位置152的位置的T；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置167的位置的D；在相应于位置172的位置的A；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置178的位置的R；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置212的位置的S；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置233的位置的G；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置240的位置的A；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置277的位置的E；在相应于位置291的位置的S；在相应于位置292的位置的H；在相应于位置292的位置的V；在相应于位置309的位置的S；在相应于位置313的位置的H；在相应于位置314的位置的S；在相应于位置317的位置的I；在相应于位置317的位置的T；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的R；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置368的位置的R；在相应于位置371的位置的S；在相应于位置374的位置的P；在相应于位置389的位置的A；在相应于位置392的位置的V；在相应于位置395的位置的A；在相应于位置396的位置的H；在相应于位置406的位置的N；在相应于位置419的位置的H；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置421的位置的R；在相应于位置421的位置的S；在相应于位置439的位置的A；在相应于位置439的位置的C；或者在相应于位置443的位置的G。
所述氨基酸置换可以是在SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽中，或者在与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体中。例如，所述置换可以是在例如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示人PH20多肽或者其变体中。
举例的与未修饰的PH20多肽(例如SEQ ID NO:3所示)相比呈现出对酚化合物增加的稳定性的修饰的PH20多肽是具有SEQ ID NO:79、85、87、90、93、101、114、144、171、178、181、221、259、262、269、270、282、343、356、357、359、368、395、426、429、432、434、436、441、443、444、454、460、461、467、477、487、491、492、509、525、550、554、557、584、593、599、605、611、612、617、647、658、667、676、679、709、720、723、727、740、761、763、772、773、808、809或829任一所示氨基酸序列或者具有与SEQ ID NO:79、85、87、90、93、101、114、144、171、178、181、221、259、262、269、270、282、343、356、357、359、368、395、426、429、432、434、436、441、443、444、454、460、461、467、477、487、491、492、509、525、550、554、557、584、593、599、605、611、612、617、647、658、667、676、679、709、720、723、727、740、761、763、772、773、808、809或829任一呈现至少68％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列且与相应未修饰的多肽相比含有所述氨基酸置换、呈现透明质酸酶活性及呈现对升高的温度的增加的稳定性的任何多肽。
iii.不存在盐
PH20在低盐或无盐条件下变性。因此，PH20需要在或大约在140mM-200mM之间的高盐浓度以维持稳定性。其它治疗剂如胰岛素在存在高盐的条件下呈现降低的溶解性和增加的结晶/聚集。因此，PH20的高盐需求可能影响共配制的治疗剂的溶解性和/或活性，而低盐的存在可降低PH20的活性。这在产生PH20共配制物中可产生问题。
本发明提供了修饰的PH20多肽，其在存在低于100mM例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更低的低浓度盐(例如NaCl)的条件下呈现增加的稳定性。通常，本发明提供的修饰的PH20多肽在存在低浓度盐的条件下呈现稳定性，例如在或大约在10mM NaCl-100mM NaCl如在或大约在15mM-80mM NaCl的低浓度的NaCl。本发明提供的在低浓度盐如低浓度NaCl(即低于100mM或更低)下呈现稳定性的修饰的PH20多肽与不含有所述修饰(如氨基酸置换)的相应PH20相比呈现增加的透明质酸酶活性。例如，修饰的PH20多肽在低浓度盐如低浓度NaCl(即低于100mM)下与不含有所述氨基酸修饰(如氨基酸置换)的相应PH20在相同条件下相比呈现高于或大约10％增加的活性，如高于或至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的活性。例如，修饰的PH20多肽在低于100mM低浓度NaCl下与在相同条件下不含有所述氨基酸修饰(例如氨基酸置换)的相应PH20的活性相比呈现高于或至少大约1.1-倍的透明质酸酶活性，如高于或至少1.2-倍、1.3-倍、1.4-倍、1.5-倍、1.6-倍、1.7-倍、1.8-倍、1.9-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍或更高活性。
2.无活性突变体
本发明提供了修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中含有一或多个氨基酸置换及其是无活性的，其中所述多肽不呈现透明质酸酶活性或者呈现低或降低的透明质酸酶活性。本发明提供的无活性的修饰的PH20多肽通常呈现野生型或参考PH20多肽如SEQ ID NO:3或7所示多肽的低于20％如低于10％的透明质酸酶活性。例如，本发明提供的无活性的修饰的PH20多肽呈现野生型或参考PH20多肽如不含有所述氨基酸修饰(如氨基酸置换)的相应多肽如SEQ ID NO:3或7所示多肽的低于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％或更低的透明质酸酶活性。
例如，本发明提供了例如与野生型或参考PH20多肽相比通过氨基酸置换或取代而无活性和修饰的PH20多肽。例如，本发明提供的无活性的修饰的PH20多肽在相应于如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的位置含有一或多个氨基酸置换：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444或447，只要所得修饰的PH20多肽是无活性的及呈现低于20％、通常低于10％的不含有所述氨基酸置换的相应PH20多肽的透明质酸酶活性。典型地，在相应于PH20多肽中上述任何位置的位置被修饰(如置换)的氨基酸残基是与SEQ ID NO:3所示氨基酸残基是相同的残基、保守的残基或半保守的氨基酸残基。
举例的在任一上述相应位置的氨基酸置换在表5中示出。表5中提及相应位置是参考SEQ ID NO:3所示位置。应理解所述置换可以在通过与SEQ ID NO:3所示序列排列对比(见例如图1和2)的另一PH20多肽的相应位置产生，其中所述相应位置是排列对比的位置。所述氨基酸置换可以在SEQ ID NO:2、3、6-66、68-72、856-861、869或870任一所示PH20多肽或者与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的其变体中的相应位置，只要所得修饰的PH20多肽是无活性的。例如，所述置换可以是在如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示人PH20多肽或其变体的相应位置。特别地，任一或多个置换是在SEQ ID NO:3中，只要所得修饰的PH20多肽是无活性的及呈现低于SEQ IDNO:3所示PH20多肽的20％、通常低于10％的透明质酸酶活性即可。
3.另外的修饰和缀合物
所述修饰的PH20多肽包括含有化学或翻译后修饰的那些多肽。在一些实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽不含有化学或翻译后修饰。化学和翻译后修饰包括但不限于PEG化、唾液酸化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化，及本领域已知的其它多肽修饰。
除了本发明提供的任一或多个氨基酸修饰如氨基酸置换之外，本发明提供的修饰的PH20多肽可以与任何部分缀合或融合，使用本领域已知的方法进行，包括化学和重组方法，条件是所得多肽保留透明质酸酶活性即可。例如，除了本发明提供的任一或多个氨基酸修饰如氨基酸置换之外，本发明提供的修饰的PH20多肽也可以在或不在多肽的一级序列中含有其它修饰，包括但不限于用碳水化合物部分、聚乙二醇(PEG)部分、唾液酸部分、免疫球蛋白G的Fc结构域或者任何其它结构域或部分修饰。例如，这种额外的修饰可以产生以增加所述蛋白质的稳定性或血清半衰期。
在一些情况中，所述结构域或其它部分是靶向剂，包括通过选择性结合细胞表面受体或者其它细胞表面部分而使缀合物靶向一或多种细胞类型的任何物质。例如，所述结构域或其它部分是靶向剂，其使所述缀合物靶向肿瘤细胞。在这种实例中，如本发明提供的任何修饰的PH20多肽与靶向剂直接或间接连接。这种靶向剂包括但不限于生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体和激素，或者其等位基因变体、突变蛋白或者其片段，只要靶向剂由细胞表面受体内在化即可。举例的非限制性的额外修饰在下文描述。
a.降低的免疫原性
可以使本发明提供的修饰的PH20多肽具有降低的免疫原性。降低的免疫原性可以通过消除多肽的抗原性表位的序列改变或者通过改变翻译后修饰而实现。本领域技术人员熟知鉴别多肽中抗原性表位的方法(见例如Lianget al.(2009)BMC Bioinformatics,10:302；Yang et al.(2009)Rev.Med.Virol.,19:77-96)。在一些实例中，一或多个氨基酸可以被修饰以除去或改变抗原性表位。
在另一实例中，改变蛋白质的糖基化也可以影响免疫原性。例如，期望改变所述肽的糖基化，只要所述多肽最低限度在相应于SEQ ID NO:3或7所示氨基酸残基N200、N333和N358的氨基酸残基含有至少N-乙酰葡糖胺即可。
例如，PH20多肽可以被修饰，由此其缺少岩藻糖，特别是双岩藻糖化(bifucosylation)。特别地，本发明提供的PH20多肽不是双岩藻糖化的。这可以通过在不导致双岩藻糖化的宿主细胞中表达和产生PH20多肽而实现。岩藻糖是一种脱氧己糖，存在于广泛的生物体中，包括哺乳动物、昆虫和植物。岩藻糖化的聚糖是通过岩藻糖基转移酶合成的；见例如Ma et al.,Glycobiology,16(12):158R-184R,(2006)；Nakayama et al.,J.Biol.Chem.,276:16100-16106(2001)；及Sturla et al.,Glycobiology,15(10):924-935(2005)。在人体中，岩藻糖通常作为聚糖结构的末端修饰而存在，与N-乙酰葡糖胺α1,6-连接的岩藻糖的存在已经示出在糖蛋白加工和识别中是重要的。在昆虫中，N-聚糖核心结构呈现出具有α1,6-和α1,3-键的双岩藻糖化。具有α1,3-键的昆虫细胞核心岩藻糖化产生碳水化合物表位，其在人体中是免疫原性的(见例如美国公开号20070067855)。例如，本发明提供的PH20多肽可以在不能使多肽双岩藻糖化的宿主细胞中产生。因此，虽然双岩藻糖化的昆虫细胞或其它细胞可用于表达所述多肽，但是典型使用哺乳动物细胞如CHO细胞。
在一些实例中，去岩藻糖化或岩藻糖缺陷的PH20多肽可以通过使用含有真核细胞寡糖加工基因的杆状病毒表达载体在具有修饰的糖基化途径的昆虫细胞中产生，从而产生“哺乳动物化”昆虫细胞表达系统(见例如美国专利号6,461,863)。或者，抗原性可以通过在缺少α1,3-岩藻糖转移酶(FT3)的昆虫细胞中表达PH20多肽而消除(见例如美国公开号20070067855)。在其它实例中，可以在例如产生去岩藻糖化蛋白质的细胞系、包括在蛋白质岩藻糖化中缺陷的Lec13 CHO细胞中产生去岩藻糖化或岩藻糖-缺陷的PH20多肽(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；U.S.Pat.Pub.No.2003/0157108；and WO 2004/056312)，及在敲除细胞系如α-1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除CHO细胞中产生(Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004))。
b.与聚合物缀合
在一些实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽与聚合物缀合。可以与PH20多肽缀合的举例的聚合物包括天然和合成的均聚物，如多元醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)以及其他杂聚物，即包含一种或多种不同偶联基团例如羟基和氨基的聚合物。合适的聚合分子的实例包括选自以下分子的聚合分子：聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇；PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)，PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)，支链聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚-D,L-氨基酸，聚乙烯-共-马来酸酐，聚苯乙烯-共-马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖，肝素，同源白蛋白，纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，壳聚糖的水解产物，淀粉如羟乙基-淀粉和羟丙基-淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜耳胶，支链淀粉，菊粉，黄原胶，角叉藻聚糖，果胶，海藻酸水解产物以及生物聚合物。
典型地，聚合物为聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚环氧乙烷，如PEG，典型为mPEG，其具有很少的能够交联的反应基。典型地，聚合物为无毒的聚合分子，如(甲氧基)聚乙二醇(mPEG)，其可以利用较简单的化学共价缀合至PH20多肽(例如缀合至蛋白表面的附着基团)。
适合于附着至PH20多肽的聚合分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物，如甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支链PEG和聚环氧乙烷(PEO)(参见例如Roberts et al.,Advanced Drug Delivery Review 2002,54:459-476；Harris andZalipsky(eds.)“Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications”ACS Symposium Series 680,1997；Mehvar et al.,J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,3(1):125-136,2000；Harris and Chess(2003)Nat Rev Drug Discov.2(3):214-21；和Tsubery,J Biol.Chem 279(37):38118-24,2004)。聚合分子的分子量通常可以为约3kDa至约60kDa。在一些实施方案中，本文提供的缀合至PH20多肽的聚合分子的分子量为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kDa。
通过共价附着(缀合)PEG或PEG衍生物(即“PEG化”)修饰多肽的各种方法为本领域已知(参见例如U.S.2006/0104968；U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；和U.S.2004/0235734)。用于PEG化的技术包括但不限于专门的接头和偶联化学(参见例如Roberts,Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476,2002)，多个PEG部分附着至单个缀合位点(如通过使用分支PEG；见例如Guiotto et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180,2002)，位点特异性PEG化和/或单PEG化(参见例如Chapman et al.,Nature Biotech.17:780-783,1999)，及定向酶促PEG化(见例如Sato,Adv.Drug Deliv.Rev.,54:487-504,2002)(也见例如Lu and Felix(1994)Int.J.Peptide Protein Res.43:127-138；Lu and Felix(1993)Peptide Res.6:140-6,1993；Felix et al.(1995)Int.J.Peptide Res.46:253-64；Benhar et al.(1994)J.Biol.Chem.269:13398-404；Brumeanu et al.(1995)J Immunol.154:3088-95；也见例如Caliceti et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10):1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8Pt 2):3S-8S)。本领域所述的方法和技术可以产生这样的蛋白，其具有附着至单个蛋白分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个PEG或PEG衍生物(参见例如U.S.2006/0104968)。
本领域已描述了多种用于PEG化的试剂。这样的试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)激活的PEG、琥珀酰亚胺基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚胺基α-丁酸甲酯、mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚胺酯、同双官能PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、同双官能PEG丙醛、同双官能PEG丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、对硝基苯碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、分支mPEG2丁醛、乙酰mPEG、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG“无接头”马来酰亚胺、mPEG乙烯砜、mPEG硫醇、mPEG邻吡啶硫酯、mPEG邻吡啶二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(参见例如Monfardini et al.,Bioconjugate Chem.6:62-69,1995；Veronese et al.,J.Bioactive CompatiblePolymers 12:197-207,1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO 01076640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；WO 0187925；和WO 2005000360)。
D.鉴别具有改变的性质或活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶的方法
本发明提供了方法用于鉴别修饰的或变体乙酰透明质酸降解酶，如修饰的透明质酸酶或修饰的PH20多肽，其与未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比呈现改变的活性或性质。特别地，本发明提供的方法可用于筛选一或多种修饰的乙酰透明质酸降解酶，如一或多种修饰的透明质酸酶或PH20多肽，其在存在变性剂或条件下呈现增加的活性和/或增加的稳定性。例如，所述方法可用于鉴别修饰的或变体乙酰透明质酸降解酶，如修饰的或变体透明质酸酶或者修饰的或变体PH20多肽，其通过对变性条件增加的抗性而呈现增加的稳定性，所述变性条件包括但不限于由温度(例如升高的温度如加热)、搅动、无盐或低盐、存在赋形剂和/或变性剂而导致的。举例的变性剂或赋形剂包括但不限于抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填物和稀释剂、香味剂、色素、润润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂或甜味剂。例如，不同赋形剂如防腐剂可作为蛋白质变性剂。在所述方法中，所述活性也可以与未修饰的乙酰透明质酸降解酶在相同变性条件下对比，及与经鉴别或选择的呈现高于相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶对比。
在所述方法中，提供了一或多种修饰的乙酰透明质酸降解酶。在一些实例中，制备修饰的分子的文库。本文描述了使用标准重组DNA技术诱变和产生变体分子的文库或集合的方法，这些方法为本领域技术人员已知。在一个实例中，可以集合并筛选待检测的酶，从而所述方法允许仅选择呈现希望活性的那些酶。在另一实例中，被检测的酶可以物理分离并单独筛选，如通过在阵列如可寻址阵列中格式化。
在所述方法的一方面，检测或筛选所述修饰的乙酰透明质酸降解酶在存在或不存在一或多种变性条件或变性剂的条件下的透明质酸酶活性。在这两种条件下检测之后，评定活性以鉴别在存在变性条件下呈现活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶。在所述方法中选择作为截断值的活性的希望水平或量由使用者根据经验确定，及依赖于如下因素：如特定的乙酰透明质酸降解酶、希望的乙酰透明质酸降解酶的应用或使用、特定的变性条件或变性剂及其它相似因素。典型地，修饰的乙酰透明质酸降解酶是经鉴别为在存在变性剂或变性条件下与不存在变性剂或变性条件下的活性相比呈现至少5％或10％的活性，通常为至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的活性，例如至少为40％的活性。
此外或或者，将所述修饰的乙酰透明质酸降解酶在存在一或多种变性条件或变性剂下的活性与相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶在存在相同变性剂或条件下的活性对比。在这种实例中，应理解所述修饰的和未修饰的酶的活性是在相同条件(例如时间、温度、成分)下检测的，不同之处是检测的特定的酶(未修饰的与修饰的)。修饰的乙酰透明质酸降解酶经鉴别为呈现更高的活性，如是未修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性的至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％或更高。
所述方法可以进行多次，从而所述方法的步骤重复1、2、3、4或5次。本发明提供的方法也是迭代(iterative)的。在一个实例中，在进行所述方法之后，可以修饰或进一步修饰任何经鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶以增加或优化活性。
下文提供了关于所述方法的步骤和组成的描述。
1.乙酰透明质酸降解酶与修饰的乙酰透明质酸降解酶的文库
在本文所述方法中，检测一或多种修饰的乙酰透明质酸降解酶如透明质酸酶或PH20多肽的希望的活性或性质，如增加的稳定性(例如对变性条件的增加的抗性)。所述修饰的乙酰透明质酸降解酶与未修饰的乙酰透明质酸降解酶如本领域已知的任何乙酰透明质酸降解酶相比可以被修饰。乙酰透明质酸降解酶是降解透明质酸的酶家族，其是胞外基质的基本成分及是间隙屏障的主要组成成分。乙酰透明质酸降解酶通过裂解乙酰透明质酸聚合物降解乙酰透明质酸，所述聚合物由如下重复二糖单位组成：D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)，通过交互的β-1→4和β-1→3糖苷键连接在一起。通过催化作为间隙屏障的主要组成成分的透明质酸的水解，乙酰透明质酸降解酶降低透明质酸的粘度，从而增加组织通透性。因此，用于本发明提供的应用和方法的乙酰透明质酸降解酶包括具有催化乙酰透明质酸二糖链或聚合物裂解的能力的任何酶。在一些实例中，乙酰透明质酸降解酶裂解乙酰透明质酸链或聚合物中的β-1→4糖苷键。在其它实例中，乙酰透明质酸降解酶催化乙酰透明质酸链或聚合物中的β-1→3糖苷键的裂解。
乙酰透明质酸降解酶包括膜结合的或从细胞中分泌的可溶形式的酶。因此，在乙酰透明质酸降解酶包括糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号序列和/或是其它膜锚定的或不可溶的情况中，这种乙酰透明质酸降解酶可以通过C末端截短或缺失全部或部分GPI锚信号序列以使所述酶是分泌及可溶的，从而以可溶形式提供。因此，乙酰透明质酸降解酶包括C末端截短的变体，例如截短以除去全部或部分GPI锚信号序列。举例的这种可溶的透明质酸酶是可溶的PH20透明质酸酶，例如美国专利号7,767,429；美国公开号US2004/0268425和US 2010/0143457所示。
举例的乙酰透明质酸降解酶是非人动物或人透明质酸酶、细菌透明质酸酶、来自水蛭的透明质酸酶或者呈现乙酰透明质酸降解活性的软骨素酶，包括其活性的可溶或截短形式。举例的非人动物透明质酸酶如SEQ ID NO:8-31、856-861、869、870、871-886任一所示，或者是可溶及活性的其成熟、C末端截短的变体，或者其活性形式。举例的人透明质酸酶如SEQ ID NO:2、3、6、7、32-66、68-72或887-890任一所示，或者是可溶的及活性的成熟、C末端截短变体，或者其活性形式，及特别是如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示。举例的细菌透明质酸酶是如SEQ ID NO:891-919任一所示，或者是可溶的及活性的成熟、C末端截短的变体，或者其活性形式。举例的来自水蛭透明质酸酶如SEQ ID NO:920或921所示，或者是可溶的及活性的成熟、C末端截短的变体，或者其活性形式。举例的具有乙酰透明质酸降解酶活性的软骨素酶如SEQ ID NO:922-924所示，或者是可溶的及活性的成熟、C末端截短的变体，或者其活性形式。
例如，检测一或多种修饰的PH20多肽的希望的活性或性质，如增加的稳定性(例如对变性条件的增加的抗性)。所述修饰的PH20多肽与未修饰的PH20多肽如任何已知PH20多肽天然、野生型或参考多肽相比可以被修饰。例如，修饰的PH20多肽与全长、可溶或活性形式PH20多肽如SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一所示多肽或者与SEQ ID NO:3、7、32-66、69或72任一呈现至少85％如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的多肽相比是修饰的。在本发明方法的特殊实例中，起始或未修饰的PH20多肽具有SEQID NO:3所示氨基酸序列。
可以筛选修饰的乙酰透明质酸降解酶的文库或集合。乙酰透明质酸降解酶可以通过本领域技术人员已知的可改变蛋白质结构的任何方法修饰。举例的修饰包括蛋白质的一或多个氨基酸的置换、添加和缺失以形成修饰的乙酰透明质酸降解酶的文库或集合。本领域技术人员已知产生修饰的或变体蛋白质以用于本发明的方法中。诱变方法为本领域熟知，包括例如定点诱变如QuikChange(Stratagene)或饱和诱变。诱变方法包括但不限于位点介导的诱变、PCR诱变、盒式诱变、定点诱变、随机点式诱变、使用含有尿嘧啶模板的诱变、寡核苷酸指导的诱变、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变、使用缺口双链DNA诱变、点错配修复、使用修复-缺陷宿主品系诱变、限制-选择和限制-纯化、缺失诱变、通过总基因合成诱变、双链破裂修复，及技术人员已知的许多其它方法。在本发明的方法中，诱变可以在蛋白质全长或蛋白质一个区域内产生。所述突变可以合理地或随机产生。
在一些实例中，进行本发明提供的方法，由此在检测蛋白质之前经推理已知每个突变蛋白质的相同性。例如，本发明提供的方法可有助于诱变和可寻址的筛选或检测方法。这可允许简易对比检测的蛋白质活性，而不需要对鉴别的蛋白质进行测序。例如，定点诱变方法可用于单独地产生突变蛋白质。诱变可以通过在特定靶位置逐个置换单个氨基酸残基而进行，由此产生的每个突变体是每个单一诱变反应的单一产物。突变体DNA分子可以设计、通过诱变产生及单独克隆，如在可寻址阵列中，由此其彼此物理分离且每一个均是独立的诱变反应的单一产物。选择的用于置换待优化的特定蛋白质上靶位置的氨基酸可以是所有剩余的19个氨基酸，或者是仅含有选择的氨基酸的更限制的基团。在本发明提供的一些方法中，被置换的每个氨基酸均单独地由剩余的19个氨基酸置换或者由少于19个的剩余氨基酸置换，如10、11、12、13、14、15、16、17或18个剩余的氨基酸。
2.筛选或检测希望的活性或性质
筛选或检测含有修饰的乙酰透明质酸降解酶的组合物的透明质酸酶活性或其它活性，在将所述乙酰透明质酸降解酶暴露于变性条件或变性剂(存在变性条件或变性剂)的条件下进行。所述变性条件或变性剂不需要是使所述酶完全死亡的条件或制剂，而通常是随着时间使酶去稳定化的条件或制剂。例如，所述变性条件可以是由温度(例如升高的温度，如高于或大约或是30℃，例如30℃-42℃，例如或大约37℃)、搅动、无盐或低盐(例如NaCl)，和/或由存在变性剂所致，如存在赋形剂(例如存在防腐剂)。
为了选择或鉴别在变性条件下呈现稳定性或增加的稳定性的修饰的乙酰透明质酸降解酶，可以将其活性与所述修饰的乙酰透明质酸降解酶在不存在所述变性条件下的活性和/或相应的未修饰的乙酰透明质酸降解酶在存在所述变性条件下的活性对比。例如，修饰的乙酰透明质酸降解酶也可以在相同条件下筛选或检测，除外的是不包含变性条件或变性剂(不存在变性条件或变性剂)。如果需要，相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶(例如不含有所述氨基酸置换的乙酰透明质酸降解酶)的活性也可以在相同条件下检测，将所述乙酰透明质酸降解酶暴露于相同变性条件或变性剂。
例如，将修饰的乙酰透明质酸降解酶的文库或集合的每个成员在或者暴露于一或多种变性条件下保温。所述保温或暴露可以在体内或体外发生。典型地，所述测定在体外进行。相同修饰的酶也在不含有所述变性条件的参考或对照条件下暴露或保温。对比在这两种条件下的活性以鉴别在暴露于变性条件时呈现稳定性的修饰的乙酰透明质酸降解酶。进一步地，在两种不同系列的条件下筛选或鉴别所述酶的活性中，通常仅在测定中变化的条件与一或多种变性条件的存在与否相关。所述测定的其它条件，包括但不限于时间、温度和/或其它保温条件，在这两个系列的条件中可以相同。
例如，暴露可以通过将修饰的乙酰透明质酸降解酶在测定缓冲剂或组合物中保温而实现，所述缓冲剂或组合物已经被修饰或调节为含有变性剂如赋形剂或者无盐或低盐。举例的变性剂或赋形剂包括但不限于抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填剂和稀释剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂或甜味剂。所用缓冲剂的选择可由技术人员根据特定参数或修改的参数根据经验确定。举例的测定缓冲剂是Good’s缓冲液(见例如Good etal.(1966)Biochemistry,5:467-477)。举例的这种缓冲剂包括但不限于ACES、ADA、BES、Bicine、BIS-TRIS、CAPS、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TRIS或缓冲液。进一步地，赋形剂或盐的量或浓度可以由本领域技术人员根据赋形剂或盐的选择及修饰的乙酰透明质酸降解酶的希望的水平或活性而根据经验确定。
在一个实例中，所述测定缓冲剂或组合物是通过包含一定量的变性剂或变性赋形剂而修饰，所述变性剂或变性赋形剂是防腐剂，例如酚类防腐剂。所述酚类防腐剂可以是苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。特别地，所述酚类防腐剂是苯酚和/或m-甲酚。一或多种酚类防腐剂的总量以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，其可以是0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％(包括端点)。在这种实例中，所述修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性在存在这种总量(例如是或大约是0.05％-0.6％)的一或多种防腐剂例如一或多种酚类防腐剂的条件下检测或评定。在一些实例中，修饰的乙酰透明质酸降解酶也可以在对照或参考条件下检测或评定，其中所述测定缓冲剂或组合物不被修饰为含有防腐剂。在某些情况中，作为对照，修饰的乙酰透明质酸酶的活性也可以与不含有所述修饰的相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶在含有防腐剂的条件下和/或在不含有防腐剂的条件下对比。
在另一实例中，所述测定缓冲剂通过存在低盐或无盐的变性条件而被修饰。如本文别处所述，乙酰透明质酸降解酶如PH20，其活性发挥通常需要盐(例如NaCl、Lys-Lys或MgCl2)。因此，不存在盐或低盐对于酶是变性条件。在一个实例中，所述测定缓冲剂通过包含低于如下量的盐而被修饰：低于100mM，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更低。在这种实例中，修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性在不存在盐或者在存在低于100mM的盐的条件下检测。在一些实例中，修饰的乙酰透明质酸降解酶也可以在对照或参考条件下检测或评定，其中测定缓冲剂含有较高盐浓度，通常为或大约为140mM-200mM。在某些情况中，作为对照，修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性也可以与不含有所述修饰的相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶在含有低盐或无盐如低于100mM的条件下和/或在含有是或大约是140mM-200mM量的盐的条件下对比。
乙酰透明质酸降解酶暴露于变性条件也可以通过将修饰的乙酰透明质酸降解酶在已知是变性的条件下保温而实现，如在升高的温度如高于或大约或是30℃(例如30℃-42℃，例如或大约37℃)或搅动的条件下。例如，修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性在高于或大约30℃-42℃的升高的温度下检测。在一些实例中，修饰的乙酰透明质酸降解酶也可以在对照或参考条件下检测或评定，其中所述温度低于30℃，如为或大约为0℃-25℃，例如0℃-5℃或者18℃-25℃。在某些情况中，作为对照，修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性也可以与不含有所述修饰的相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶在升高温度下对比，所述温度高于或大约为或为30℃-42℃，和/或在温度低于30℃，如为或大约为0℃-25℃，例如0℃-5℃或者18℃-25℃下对比。
所述修饰的乙酰透明质酸降解酶可以暴露于一或一种以上的所述条件。暴露于一种条件可以同时、相继、间歇发生或定期暴露于一或多种其它条件。
在一个实例中，在本发明的方法中，修饰的乙酰透明质酸降解酶在进行透明质酸酶活性测定之前与变性条件或变性剂保温或暴露于变性条件或变性剂。例如，将修饰的乙酰透明质酸降解酶在存在变性剂的条件下保温或者暴露于一或多种变性条件或对照条件，如上述一或多种变性条件或对照条件。所述保温或暴露可以是任何希望的时间长度，及可以由本领域技术人员根据经验确定。例如，修饰的乙酰透明质酸降解酶可以在一或多种变性条件、变性剂或对照条件下保温或暴露于该条件或大约1分钟-1个月，如1分钟-3周、1分钟-2周、1分钟-1周、1分钟-24小时、1分钟-12小时，如30分钟-6小时或者1小时-4小时，及通常至少或大约至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。在保温或暴露时间之后，评定含有修饰的乙酰透明质酸降解酶(或者对照未修饰的酶)的样品或组合物的透明质酸酶活性。在另一实例中，将修饰的乙酰透明质酸降解酶暴露于一或多种变性条件或在该条件下保温且同时或同期评定透明质酸酶活性。在其中评定修饰的乙酰透明质酸降解酶的任何实例中，应理解不含有所述修饰的未修饰的乙酰透明质酸降解酶也可以在相似测定条件下评定以进行对比。
评定透明质酸酶活性的测定为本领域熟知。举例的这种测定在章节G中描述。在一个实例中，透明质酸酶活性可以在微浊度测定(microturbidityassay)中评定，其中在使所述酶与HA反应之后，通过加入沉淀HA的试剂(例如氯化十六烷吡啶(CPC)或者酸化血清)测量未降解的HA的量。在另一实例中，透明质酸酶活性可以使用微滴定测定评定，其中在与透明质酸酶保温后，测量剩余的生物素酰化的透明质酸(见例如Frost and Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269,U.S.Pat.Publication No.20050260186)。确定并对比在每种检测条件下的所得活性。
3.选择或鉴别
在所述方法中，在一或多种变性条件下筛选修饰的乙酰透明质酸降解酶之后，对比检测的酶的透明质酸酶活性。实施所述方法以鉴别对变性条件或变性剂更具抗性的修饰的乙酰透明质酸降解酶，其中根据其对变性的抗性的测量而用所述酶的活性表示所述酶的稳定性。应理解酶活性由于变性的结果而出现的一些降低可以在各种应用中耐受，并因此所述方法可以用于选择在暴露于变性条件时呈现需要的活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶以许可其使用或应用(例如治疗活性)。例如，可以选择较相应未修饰的或参考乙酰透明质酸酶降解酶更缓慢丧失活性的修饰的酶，但是其保留的活性足以用于特定应用或目的。
在本发明方法的实例中，修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性是在暴露于第一变性条件时评定的，也在暴露于是对照或非变性条件的第二条件时评定，对比所得透明质酸酶活性。在一些实例中，为了对比，所述活性以在变性条件下的活性与在对照或非变性条件下的活性的比率或百分比表示。例如，在第一条件和第二条件之间不同的参数是存在防腐剂(例如酚类防腐剂)的情况中，活性可以在存在防腐剂(例如酚类防腐剂)条件下观测到的活性与在不存在防腐剂(例如酚类防腐剂)条件下的活性的比率或百分比表示。在另一实例中，在第一和第二条件之间不同的参数是温度的情况中，活性可以在存在升高的温度(例如30℃-42℃)下观测到的活性与在较低温度如0℃-25℃如0℃-5℃或者18℃-25℃下的活性的比率或百分比表示。
选择或鉴别在变性条件下与不存在变性条件下相比保留或呈现任何希望的活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶。选择酶的特定活性截断值依赖于特定的使用者和/或所述方法的实施，可以根据如下因素根据经验确定：如特定的变性条件或变性剂、特定的修饰的乙酰透明质酸降解酶、鉴别或选择的乙酰透明质酸降解酶的希望的应用及其它相似因素。通常，如果在暴露于或者用变性条件或变性剂保温时测量或评定了任何可检测的活性，则选择或鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶呈现稳定性。例如，如果所述酶呈现出相同酶在不存在变性条件或变性剂的条件下的活性的至少5％或10％，及通常如果修饰的乙酰透明质酸降解酶呈现出在存在变性条件下保温之前的初始透明质酸酶活性的至少15％的活性，则选择或鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶呈现稳定性或者对于变性条件或变性剂的抗性。例如，选择或鉴别修饰的乙酰透明质酸降解酶，其呈现至少(或至少大约)16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％或更高的修饰的乙酰透明质酸降解酶在对照或非变性条件下检测的初始透明质酸酶活性。
在本发明方法的其它实例中，修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性是在暴露于变性条件时评定的，未修饰的或参考乙酰透明质酸降解酶的活性也在暴露于相同变性条件下评定。在这种实例中，当所述酶暴露于相同条件时对比所述活性。为了对比，在变性条件下的活性可以表示为修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性与未修饰的或参考乙酰透明质酸降解酶的活性的比率或百分比。在这种实例中，选择在变性条件下较未修饰的或参考乙酰透明质酸降解酶呈现更高活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶。因此，修饰的乙酰透明质酸降解酶是对所述条件更具抗性的酶。例如，在变性条件是存在防腐剂(例如酚类防腐剂)的情况中，在存在防腐剂(例如酚类防腐剂)的条件下观测到的活性可以表示为修饰的乙酰透明质酸降解酶与未修饰的或参考乙酰透明质酸降解酶相比的活性的比率或百分比。在另一实例中，在变性条件是高温的情况中，在存在升高的温度(例如30℃-42℃)条件下观测到的活性可以表示为修饰的乙酰透明质酸降解酶与未修饰的或参考乙酰透明质酸降解酶相比的活性比率或百分比。
在这种实例中，鉴别或选择修饰的乙酰透明质酸降解酶如修饰的PH20，其呈现出活性比率高于或至少为1.1，由此所述酶较未修饰的或参考乙酰透明质酸降解酶在变性条件下呈现更高的活性。例如，所述比率为至少或至少大约1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或更高。如果在相同条件下检测时其活性是未修饰的或参考乙酰透明质酸降解酶活性的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％或更高，则可以选择所述修饰的乙酰透明质酸降解酶(例如修饰的PH20)。因此，修饰的乙酰透明质酸降解酶经鉴别与未修饰的乙酰透明质酸降解酶或参考乙酰透明质酸降解酶相比呈现更高或改良的稳定性，通过对变性条件或变性剂的增加的抗性而证实。
4.迭代法(Iterative Methods)
本发明提供的方法也是迭代的。在一个实例中，在进行所述方法之后，经鉴别在变性条件下呈现稳定性如增加的稳定性的任何修饰的乙酰透明质酸降解酶可以被修饰或进一步修饰以增加或优化所述稳定性。二级文库可以通过在第一次鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶中导入另外的修饰而产生。例如，可以组合经鉴别为赋予稳定性如增加稳定性的修饰以产生组合文库。所述二级文库可以使用本发明所述测定和方法检测。
在所述方法的迭代方面的另一实例中，经鉴别不呈现稳定性如增加的稳定性(例如由此其在变性条件下不是活性的或者不具有增加的活性)的修饰的乙酰透明质酸降解酶可以被进一步修饰及再次检测其在变性条件下的稳定性。所述进一步修饰可靶向接近与分子的活性和/或稳定性相关的特定区域(例如特定氨基酸残基)。例如，与所述分子的活性和/或稳定性相关的残基通常是参与所述分子的结构折叠或其它活性的关键残基。因此，这种残基通常在任何条件下为活性所需。关键残基可以被鉴别，因为当突变时，蛋白质的正常活性被消除或降低。例如，关键残基可以这样鉴别，即当在乙酰透明质酸降解酶中突变时，在正常或对照测定条件下呈现降低或消除的透明质酸酶活性。可以产生具有靶向或接近经鉴别的关键氨基酸残基如邻近鉴别的关键氨基酸残基的氨基酸突变的修饰的蛋白质的进一步文库。在一些实例中，所述突变可以是直至任何19个其它氨基酸残基的氨基酸置换。所述二级文库可以使用本发明描述的测定和方法检测。
E.修饰的PH20多肽及编码核酸分子的产生
本发明所示修饰的PH20多肽可以通过本领域熟知的蛋白质纯化和重组蛋白质表达方法获得。多肽也可以是化学合成的。修饰的或变体包括截短形式可以使用标准重组DNA方法从野生型多肽中工程化。例如，修饰的PH20多肽可以从野生型多肽中工程化，如通过定点诱变。
1.编码PH20多肽的核酸的分离或制备
多肽可以使用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何可利用的方法克隆或分离。这种方法包括PCR扩增核酸及筛选文库，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。
例如，当多肽通过重组方式产生时，可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。本领域可利用的任何方法均可用于例如从细胞或组织源中获得编码PH20的全长或部分(即涵盖完整编码区)cDNA或基因组DNA克隆。
扩增核酸的方法可用于分离编码希望的多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。这种方法例如包括使用Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(Gene Amp)。含有核酸的材料可用作起始材料，从中可以分离希望的多肽编码核酸分子。例如，在扩增方法中可使用DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、流体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品。所述来源可以源自任何真核物种，包括但不限于脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、禽、马、犬及其它灵长目动物来源。核酸文库也可以用作起始材料来源。可以设计引物以扩增希望的多肽。例如，可以基于从中产生希望的多肽的表达序列设计引物。引物可以基于多肽氨基酸序列的回译而设计。如果需要，简并引物可用于扩增。与在希望的序列的3’和5’末端的序列杂交的寡核苷酸引物可用作引物以通过PCR从核酸样品中扩增序列。引物可用于扩增完整的全长PH20或者其截短的序列，如编码本发明提供的任何可溶的PH20多肽的核酸。可以对通过扩增产生的核酸分子测序并证实其编码希望的多肽。
另外的核苷酸序列可以与多肽编码核酸分子结合，包括含有限制性核酸内切酶位点的接头序列以将合成的基因克隆进载体中，例如蛋白质表达载体或者设计为扩增核心蛋白编码DNA序列的载体。此外，指定功能性DNA元件的另外的核苷酸序列可以与编码多肽的核酸分子可操纵地连接。举例的这种序列包括但不限于设计为促进胞内蛋白质表达的启动子序列，及设计为促进蛋白质分泌的分泌序列，例如异源信号序列。这种序列为本领域技术人员已知。例如，举例的异源信号序列包括但不限于人和小鼠κIgG异源信号序列，如SEQ ID NO:868所示。另外的核苷酸残基序列如指定蛋白质结合区的碱基序列也可以与编码酶的核酸分子连接。这种区域包括但不限于促进或编码促进酶吸收进特定靶细胞或者另外改变合成的基因的产物的药动学的蛋白质的残基序列。
此外，可以加入标签或其它部分，例如有助于检测或亲和性纯化所述多肽。例如，另外的核苷酸残基序列如指定表位标签或其它检测标记的碱基序列也可以与编码酶的核酸分子连接。举例的这种序列包括编码His标签或Flag标签的核酸序列。
然后可以将鉴别的和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰的病毒，但是所述载体系统必须与使用的宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或者质粒如pCMV4、pBR322或者pUC质粒衍生物或者Bluescript载体(Stratagene,La Jolla,CA)。其它表达载体包括本发明举例说明的HZ24表达载体(见例如SEQ ID NO:4和5)。插入克隆载体中可例如通过将DNA片段与具有互补粘末端的克隆载体连接而实现。插入可以使用TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)进行。
如果用于使DNA片段化的互补限制位点不存在于克隆载体中，则所述DNA分子的末端可以经酶修饰。或者，希望的任何位点可以通过将核苷酸序列(接头)连接在DNA末端而产生；这些连接的接头可含有特异性化学合成的寡核苷酸，其编码限制性核酸内切酶识别序列。在另一方法中，裂解的载体和蛋白质基因可以通过同聚物加尾而修饰。
重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和声孔作用而导入宿主细胞中，由此产生该基因序列的许多拷贝。在特定的实施方案中，用重组DNA分子转化宿主细胞掺入分离的蛋白质基因、cDNA或合成的DNA序列，使得可以产生该基因的多个拷贝。因此，通过生长转化体、从转化体中分离重组DNA分子及当需要时从分离的重组DNA中挽回插入的基因，可以获得大量的所述基因。
除了重组产生，本发明提供的修饰的PH20多肽可以使用固相技术通过直接肽合成法产生(见例如Stewart et al.(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc.,85:2149-2154)。可以使用人工技术或通过自动化技术进行体外蛋白质合成。自动合成可以例如使用Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(PerkinElmer,Foster City CA)根据厂商提供的指导实现。多肽的各个片段可以使用化学方法单独及组合地化学合成。
2.产生突变体或修饰的核酸及编码多肽
本发明提供的修饰可以通过如本领域技术人员常规使用的标准重组DNA技术产生。本领域已知的在靶蛋白质中产生任一或多个氨基酸突变的任何方法均可以使用。方法包括编码核酸分子的标准定点诱变(使用例如试剂盒，如得自Stratagene的QuikChange)，或者通过固相多肽合成方法。
3.载体和细胞
对于重组表达一或多个希望的蛋白质，如本文描述的任何修饰的PH20多肽，可以将含有编码该蛋白质的核苷酸序列的全部或者一部分的核酸插入合适的表达载体中，即含有插入的蛋白质编码序列转录和翻译必需的元件的载体。所述必需的转录和翻译信号也可以由酶基因的天然启动子和/或其侧翼区域提供。
本发明还提供了含有编码所述酶的核酸的载体。本发明也提供了含有所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，所述载体是适用于本发明的任何载体。通常，所述细胞是能产生编码的蛋白质糖基化的细胞。
本发明提供了含有所述载体的原核细胞和真核细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌(Archea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过将上述细胞在编码的蛋白质由细胞表达的条件下生长以及回收表达的蛋白质，所述细胞用于产生其蛋白质。对于本发明，例如所述酶可以分泌进培养基中。
可以根据其调节插入序列的表达或者以希望的方式加工表达的蛋白质的能力选择宿主细胞系。这种多肽的修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化及酰化。翻译后加工可影响多肽的折叠和/或功能。不同的宿主细胞如但不限于CHO(DG44、DXB11、CHO-K1)、HeLa、MCDK、293和WI38具有针对这种翻译后活性的特异性细胞机构和特性机制，可以选择以保证导入的蛋白质的正确修饰和加工。通常，细胞的选择是其能将N-连接的糖基化导入表达的多肽中。因此，本发明提供了含有所述载体的真核细胞。举例的真核细胞是哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。例如，二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞(例如DG44细胞)用于产生本发明提供的多肽。注意本发明提供的PH20多肽的细菌表达不产生催化活性多肽，但是当与适当的糖基化机构组合时，PH20可以被人工糖基化。
本发明提供了含有编码修饰的PH20多肽的核苷酸序列的载体，其与天然或异源信号序列连接，以及其多个拷贝。可以选择所述载体以在细胞中表达酶蛋白或者由此所述酶蛋白作为分泌的蛋白质表达。
许多宿主-载体系统可用于表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或者粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的强度和特异性不同。根据使用的宿主-载体系统，可以使用任一种合适的转录和翻译元件。
本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法均可用于构建表达载体，所述表达载体含有具有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列的嵌合基因。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组技术(遗传重组)。编码蛋白质或者其结构域、衍生物、片段或者同系物的核酸序列的表达可以通过另一个核酸序列调节，由此所述基因或者其片段在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子控制。在特定的实施方案中，启动子不是希望的蛋白质基因的天然启动子。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon,Nature 290:304-310(1981))，包含于Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子(Yamamoto et al.Cell 22:787-797(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.,Nature296:39-42(1982))；原核表达载体启动子如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5543)或者tac启动子(DeBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983))，也见Gilbert and Villa-Komaroff，“UsefulProteins from Recombinant Bacteria”:in Scientific American 242:79-94(1980))；植物表达载体启动子，如胭脂碱合成酶启动子(Herrara-Estrella et al.,Nature 303:209-213(1984))或者花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Garder etal.,Nucleic Acids Res.9:2871(1981))，以及光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶启动子(Herrera-Estrella et al.,Nature 310:115-120(1984))；酵母及其它真菌的启动子元件如Gal4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，以及呈现组织特异性且已经用于转基因动物中的如下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift etal.,Cell 38:639-646(1984)；Ornitz et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonald,Hepatology 7:425-515(1987))；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan et al.,Nature 315:115-122(1985))，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et al.,Cell38:647-658(1984)；Adams et al.,Nature 318:533-538(1985)；Alexander et al.,Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987))，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder et al.,Cell 45:485-495(1986))，在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinckert et al.,Genes and Devel.1:268-276(1987))，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf et al.,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer et al.,Science 235:53-58 1987))，在肝脏中有活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey et al.,Genes and Devel.1:161-171(1987))，在骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区(Magram et al.,Nature 315:338-340(1985)；Kollias et al.,Cell 46:89-94(1986))，在脑少突神经胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead et al.,Cell48:703-712(1987))，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,Nature 314:283-286(1985))，以及在下丘脑的促性腺激素细胞中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason et al.,Science 234:1372-1378(1986))。
在特定的实施方案中，使用这样的载体，其含有与编码希望的蛋白质或者其结构域、片段、衍生物或者同系物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起点，以及任选含有一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。根据表达系统，特定的起始信号也为PH20序列的有效翻译所需。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在PH20或其可溶形式的起始密码子和上游序列被插入合适的表达载体的情况中，不需要额外的翻译控制信号。在仅插入编码序列或其一部分的情况中，必须提供包含ATG起始密码子的外源转录控制信号。进一步地，起始密码子必须符合正确的读框以保证整个插入体的转录。外源转录元件和起始密码子可以是不同来源的，天然的及合成的。表达效力可以通过包含适于使用的细胞系统的增强子而增强(Scharf et al.(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-62；Bittner et al.(1987)Methods in Enzymol,153:516-544)。
举例的转化大肠杆菌细胞的质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen,Valencia,CA；也见Qiagen描述该系统公开的文献)。pQE载体具有噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)及双lac操纵基因阻抑模块以提供重组蛋白在大肠杆菌中紧密调节的高水平表达，合成的核糖体结合位点(RBS II)以有效翻译，6×His标签编码序列，t0和T1转录终止子，ColE1复制起点，及赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。pQE载体能在重组蛋白的N或C末端的任一端安置6×His标签。这种质粒包括pQE 32、pQE30和pQE 31，其为所有三个读框提供多克隆位点以及提供N-末端6×His标记的蛋白质的表达。转化大肠杆菌细胞的其它举例的质粒载体包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496，得自Novagen,Madison,WI；也见由Novagen描述该系统公开的文献)。这种质粒包括pET 11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵基因，以及lac阻抑物基因；pET 12a-c，其含有T7启动子、T7终止子以及大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b(Novagen,Madison,WI)，其含有His-TagTM前导序列用于His柱纯化以及允许在经过柱纯化后裂解的凝血酶裂解位点，T7-lac启动子区域以及T7终止子。
典型地，载体可以是质粒、病毒载体或者本领域已知的用于在体内或体外表达修饰的PH20多肽的其它已知载体。例如，所述修饰的PH20多肽在哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。举例的哺乳动物细胞表达载体是HZ24表达载体。HZ24表达载体衍生自pCI载体主链(Promega)。其含有编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA，F1复制起点，巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区域(CMV)，以及SV40晚期聚腺苷酸化信号(SV40)。所述表达载体还具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
可以应用病毒载体如腺病毒、逆转录病毒或痘苗病毒载体。在一些实例中，所述载体是缺陷的或弱化的逆转录病毒或其它病毒载体(见美国专利号4,980,286)。例如，可以使用逆转录病毒载体(见Miller et al.,Meth.Enzymol.217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体已经被修饰为缺失不是病毒基因组包装和整合进宿主细胞DNA中所必需的逆转录病毒序列。
在一些实例中，具有编码修饰的PH20多肽的核酸的病毒可促进其在例如靶组织内复制和扩散。所述靶组织可以是癌组织，其中所述病毒能在所述肿瘤内选择性复制。所述病毒也可以是非细胞溶解性病毒，其中所述病毒在组织特异性启动子下选择性复制。由于病毒复制，PH20多肽与病毒基因的共表达将促进病毒在体内扩散。
4.表达
修饰的PH20多肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，包括体内和体外方法。希望的蛋白质可以在适于产生需要量和形式的蛋白质如给予和治疗需要的蛋白质的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白质产生水平以及在表达的蛋白质上存在的翻译后修饰的类型可有所不同。表达宿主的选择可基于这些及其它因素，如监管和安全性考虑、生产成本以及是否需要纯化以及纯化方法。
许多表达载体是本领域技术人员可利用和已知的且可用于蛋白质的表达。表达载体的选择受到宿主表达系统选择的影响。通常，表达载体可包括转录启动子及任选包括增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有选择标记，其使得可以选择和维持转化的细胞。在一些情况中，复制起点可用于扩增载体的拷贝数。
修饰的PH20多肽也可作为蛋白质融合体利用或者表达。例如，可以产生酶融合体，为酶增加另外的功能性。举例的酶融合蛋白包括但不限于信号序列、标签以及指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合体，所述标签如用于定位如6×His或His6标签或者myc标签，或者纯化标签如GST融合体。
为了长期高产量产生重组蛋白质，希望稳定的表达。例如，稳定表达修饰的PH20多肽的细胞系可以使用表达载体转化，所述表达载体含有病毒复制起点或者内源性表达元件及可选择标记基因。在导入载体之后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，之后转换为选择性培养基。可选择标记的目的是赋予选择抗性，及其存在允许成功表达导入的序列的细胞的生长和回收。稳定转化的细胞的抗性细胞可以使用适于细胞类型的组织培养技术增殖。
许多选择系统均可用于回收转化的细胞系。这些包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler,M et al.(1977)Cell,11:223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy,I et al.(1980)Cell,22:817-23)基因，其可分别用于TK-或APRT-细胞中。抗代谢物、抗生素或除草剂抗性也可用作选择基础。例如，可以使用DHFR，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler,M et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci,77:3567-70)；npt，其赋予氨基糖苷类新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin,F et al.(1981)J.Mol.Biol.,150:1-14)；及als或pat，其分别赋予氯磺隆和草铵膦(phosphinotricin)乙酰转移酶抗性。另外的选择基因已经描述，例如trpB，其使得细胞可以利用吲哚代替色氨酸，或者hisD，其使得细胞可以利用histinol代替组氨酸(Hartman SC and RC Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci,85:8047-51)。可见的标记如但不限于花青素、β-葡糖苷酸酶及其底物、GUS及荧光素酶及其底物荧光素，也可以用于鉴别转化体及也用于定量可归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白质表达的量(RhodesCA et al.(1995)Methods Mol.Biol.55:121-131)。
可以监测PH20多肽的存在和表达。例如，功能性多肽的检测可以通过在合适的条件下检测条件化培养基的透明质酸酶活性而确定。评定表达的蛋白质的溶解性和活性的测定法在本发明中提供。
a.原核细胞
原核细胞，特别是大肠杆菌，提供了产生大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简便且快速的技术。大肠杆菌的表达载体可含有可诱导启动子。这种启动子可用于诱导高水平的蛋白质表达以及用于表达对于宿主细胞呈现一些毒性的蛋白质。举例的可诱导启动子包括lac启动子、trp启动子、杂交tac启动子、T7和SP6 RNA启动子以及温度调节的λPL启动子。
如本发明提供的任何蛋白质可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是还原环境，对于一些分子而言这可以导致不溶的包涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇及变性剂如胍-HCl和尿素可用于再溶解蛋白质。另一种方法是蛋白质在细菌的细胞周质间隙内表达，其提供了氧化环境和伴侣蛋白样及二硫键异构酶，其可有助于可溶性蛋白质产生。典型地，前导序列与待表达的蛋白质融合，指导该蛋白质定向于细胞周质。然后通过细胞周质内的信号肽酶除去前导序列。举例的细胞周质靶向前导序列包括来自的果胶酸裂合酶基因的pelB前导序列以及衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况中，细胞周质表达使得表达的蛋白质渗漏进培养基中。蛋白质的分泌使得可以将其快速且简便地从培养上清中纯化。未分泌的蛋白质可以通过渗透性裂解得自细胞周质。与细胞质表达相似，在一些情况中，蛋白质可以成为不溶，可以使用变性剂和还原剂促进溶解和再折叠。诱导和生长温度也可以影响表达水平和溶解性，使用典型在25℃-37℃之间的温度。典型地，细菌产生无糖基化蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化以发挥功能，则可以在从宿主细胞中纯化之后在体外增加糖基化。
b.酵母细胞
酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)是熟知的酵母表达宿主，可用于如本文所述任何蛋白质的产生。酵母可以用附加型复制载体或者通过同源重组通过稳定的染色体整合转化。典型地，可诱导启动子用于调节基因表达。举例的这种启动子包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，如CUP1、AOX1或者其它毕赤氏酵母或者其它酵母启动子。表达载体通常包括选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3以选择和维持转化的DNA。在酵母中表达的蛋白质通常是可溶的。与伴侣蛋白如Bip和蛋白质二硫键异构酶的共表达可改善表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白质可以使用分泌信号肽融合体如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号以及与酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或者Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合体定向分泌。可以对蛋白酶裂解位点如Kex-2蛋白酶裂解位点进行工程化以从表达的多肽中除去融合的序列，因为其退出分泌途径。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
c.昆虫和昆虫细胞
昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达的昆虫细胞，可用于表达多肽如PH20多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白质且能进行高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有有限的宿主范围，其改善了安全性并减少了真核细胞表达的监管担忧。典型的表达载体使用启动子以进行高水平表达，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)以及家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)，昆虫细胞系如衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、一点粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和大红斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。对于高水平表达，待表达的分子的核苷酸序列融合在病毒的多角体蛋白起始密码子的立即下游。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中被精确加工且可用于将表达的蛋白质分泌进培养基中。此外，细胞系一点粘虫(A7S)和大红斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白质。举例的昆虫细胞是已经改变为降低免疫原性的那些细胞，包括具有“哺乳动物化”杆状病毒表达载体的那些细胞及缺少酶FT3的那些细胞。
昆虫细胞中另一种表达系统使用稳定转化的细胞。细胞系如Schneider2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在存在镉或者铜的重金属诱导的条件下诱导高水平表达。表达载体典型通过使用选择标记如新霉素和潮霉素维持。
d.哺乳动物表达
哺乳动物表达系统可用于表达包括PH20多肽的蛋白质。表达构建体可以通过病毒感染如腺病毒或者通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理方式如电穿孔和显微注射移至哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞表达载体典型包括mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)以及聚腺苷酸化元件。也可以加入IRES元件以使得可以与另一基因如选择标记双顺反子表达。这种载体通常包括转录启动子-增强子以高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区域也可用于表达。举例的启动子/增强子区域包括但不限于来自如下基因的那些区域，如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2，以及促性腺激素释放激素基因控制。选择标记可用于选择和维持具有表达构建体的细胞。举例的选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，可以在存在氨甲喋呤的条件下进行表达以选择仅表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号传导分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导蛋白质在细胞表面上以活性状态表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤以及异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8以及HKB细胞。也可以使细胞系适应于无血清培养基，其促进分泌的蛋白质从细胞培养基中纯化。例如包括CHO-S细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,cat#11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42.)。也可以使细胞系适应在优化为最大表达的特殊培养基中生长。例如，使DG44 CHO细胞适应在化学限定的无动物产物的培养基中悬浮培养生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质，如本文所述任何蛋白质。典型地使用直接DNA转移将表达构建体移至植物，所述直接DNA转移如微粒轰击和PEG介导的转移进原生质体中，以及使用农杆菌介导的转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶宿主如拟南芥和烟草与单子叶宿主如玉米和水稻之间有所不同。举例的用于表达的植物启动子包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及遍在蛋白和UBQ3启动子。选择标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进转化的细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以作为细胞培养维持，聚集体(愈伤组织)或者再生为全植物。转基因植物细胞也可以包括藻类，其被工程化为产生透明质酸酶多肽。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这可能影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
5.纯化
用编码修饰的PH20多肽的核酸序列转化的宿主细胞可以在适于编码的蛋白质从细胞培养物中表达和回收的条件下培养。通过重组细胞产生的蛋白质通常是分泌的，但是依赖于所用序列和/或载体而可以包含在细胞内。如本领域技术人员所理解，含有编码PH20的核酸的表达载体可以设计具有信号序列，其促进PH20通过原核或真核细胞膜的直接分泌。
因此，从宿主细胞纯化多肽的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质通常在除去细胞之后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞并且从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或者器官可以用作起始材料产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物生产可包括在乳或者蛋中生产多肽，其是可以收集的，且如果需要，则可以提取蛋白质并且使用本领域标准方法进一步纯化。
蛋白质，如修饰的PH20多肽，可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化，所述技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀以及离子交换层析，如阴离子交换层析。亲和性纯化技术也可用于改善制备的效率和纯度。例如，结合PH20透明质酸酶的抗体、受体及其它分子可用于亲和性纯化。例如，可溶PH20可从条件化培养基中纯化。
表达构建体也可工程化为在蛋白质中加入亲和标签如myc表位、GST融合体或者His6并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和纯化。这种标签可以结合如本文别处所述的编码可溶PH20的核苷酸序列，其可促进可溶蛋白质的纯化。例如，修饰的PH20多肽可以表达为具有加入以促进蛋白质纯化的一或多个另外的多肽结构域的重组蛋白质。这种促进纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽如组氨酸-色氨酸模块，其使得可以在固定的金属上纯化，蛋白质A结构域，其使得可以在固定的免疫球蛋白上纯化，及用于FLAGS延伸/亲和性纯化系统(Immunex Corp.,Seattle Wash.)的结构域。在纯化结构域与表达的PH20多肽之间包含可裂解接头序列如因子XA或肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA)可用于促进纯化。一种这样的表达载体提供了在肠激酶裂解位点含有PH20多肽的融合蛋白的表达。组氨酸残基促进在IMIAC(固定的金属离子亲和性层析)上纯化，而肠激酶裂解位点提供了从融合蛋白质中纯化多肽的一种方式。
纯度可以通过本领域已知的任何方法评估，包括凝胶电泳、垂直HPLC方法、染色和分光光度测定法。表达和纯化的蛋白质可以使用本领域技术人员已知的任何测定或方法分析，例如章节G中描述的任何测定和方法。这些包括基于蛋白质的物理和/或功能性性质的测定，包括但不限于通过凝胶电泳分析、免疫测定和透明质酸酶活性测定。
根据使用的表达系统和宿主细胞，所得多肽由于在产生和纯化时培养基中存在的肽酶而可以是异质的。例如，在CHO细胞中培养可溶PH20可以获得异质多肽的混合物。
6.通过PEG化(PEGylation)修饰多肽
聚乙二醇(PEG)已广泛用于生物材料、生物技术及医学，主要是因为PEG是生物相容的、无毒性、水溶性聚合物，其典型是非免疫原性的(Zhaoand Harris,ACS Symposium Series 680:458-72,1997)。在药物输送领域，PEG衍生物已广泛用于共价附着(即“PEG化”)于蛋白质以降低免疫原性、蛋白酶解及肾清除以及增强溶解性(Zalipsky,Adv.Drug Del.Rev.16:157-82,1995)。类似地，PEG已附着于低分子量相对疏水药物以增强溶解性，降低毒性及改变生物分布。典型地，PEG化药物以溶液注射。
一种密切相关的应用是合成交联的可降解的PEG网络或配制品以用于药物输送，因为许多用于设计可降解的可溶性药物载体的相同化学也可以用于设计可降解凝胶(Sawhney et al.,Macromolecules 26:581-87,1993)。还已知大分子间复合物可以通过混合两种互补聚合物的溶液而形成。这种复合物通常通过所涉及的聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子-聚阳离子)和/或氢键(多酸-多碱)和/或水性环境中聚合物之间的疏水相互作用而稳定化(Krupers et al.,Eur.Polym J.32:785-790,1996)。例如，在合适条件下混合聚丙烯酸(PAAc)和聚环氧乙烷(PEO)的溶液导致形成主要基于氢键的复合物。这些复合物在生理条件下的解离已用于输送游离药物(即非PEG化的)。另外，互补聚合物的复合物已从均聚物和共聚物形成。
许多PEG化试剂已在本领域描述。这种试剂包括但不限于所述多肽与如下试剂的反应：N-羟基琥珀酰亚氨基(NHS)活化的PEG，琥珀酰亚氨基mPEG，mPEG2-N-琥珀酰亚胺，mPEG琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯，mPEG琥珀酰亚氨基丙酸酯，mPEG琥珀酰亚氨基丁酸酯，mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚氨基酯，同双功能PEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯，同双功能PEG丙醛，同双功能PEG丁醛，PEG马来酰亚胺，PEG酰肼，对硝基苯基-碳酸酯PEG，mPEG-苯并三唑碳酸酯，丙醛PEG，mPEG丁醛，分支mPEG2丁醛，mPEG乙酰，mPEG哌啶酮，mPEG甲基酮，mPEG“无接头”马来酰亚胺，mPEG乙烯基砜，mPEG硫醇，mPEG邻吡啶基硫酯(orthopyridylthioester)，mPEG邻吡啶基二硫化物，Fmoc-PEG-NHS，Boc-PEG-NHS，乙烯基砜PEG-NHS，丙烯酸PEG-NHS，荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(见例如Monfardini et al.,Bioconjugate Chem.6:62-69,1995；Veronese et al.,J.Bioactive Compatible Polymers 12:197-207,1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；WO05000360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO 01076640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；和WO 0187925)。
在一个实例中，聚乙二醇具有从大约3kD至大约50kD、优选从大约5kD至大约30kD的分子量。PEG与药物的共价附着(已知为“PEG化”)可以通过已知的化学合成技术实现。例如，蛋白质的PEG化可以通过将NHS-活化的PEG与蛋白质在合适反应条件下反应而实现。
尽管已描述了许多PEG化反应，但是最通常应用的那些反应赋予方向性，使用温和反应条件并且不需要深入的下游加工以除去毒性催化剂或副产物。例如，单甲氧基PEG(mPEG)仅具有一个反应性末端羟基，因此其使用限制所得PEG-蛋白质产物混合物的一些异质性。聚合物末端的相对于末端甲氧基的羟基基团的活化通常是实现有效蛋白质PEG化所需的，目的在于使衍生化的PEG更易感于亲核攻击。攻击亲核体通常是赖氨酸残基的ε-氨基，但是如果局部条件是有利的则其它胺也可以反应(例如N末端α-胺或者组氨酸的环胺)。在含有单赖氨酸或半胱氨酸的蛋白质中可以进行更定向的附着。后一种残基可以被PEG-马来酰亚胺靶向进行硫醇特异性修饰。或者，PEG酰肼可以与高碘酸盐氧化的乙酰透明质酸降解酶反应并在NaCNBH3存在下被还原。更具体地，PEG化CMP糖可以与乙酰透明质酸降解酶在合适糖基转移酶存在下反应。一种技术是“PEG化”技术，其中一些聚合分子与相应多肽偶联。当使用这种技术时，免疫系统难以识别多肽表面上负责形成抗体的表位，因此降低免疫应答。对于直接导入人体循环系统中以提供特定生理学作用的多肽(即药物)，典型的潜在免疫应答是IgG和/或IgM应答，而通过呼吸系统被吸入的多肽(即工业多肽)潜在地可导致IgE应答(即变态反应)。一种解释降低的免疫应答的理论是聚合分子屏蔽多肽表面上负责导致抗体形成的免疫应答的表位。另一种理论或至少部分因素是缀合物越重，则获得越降低的免疫应答。
典型地，为制备本发明的PEG化的PH20多肽，PEG部分经共价附着与所述多肽缀合。PEG化技术包括但不限于专门的接头及偶联化学(参见例如Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476,2002)，多个PEG部分附着于单个缀合位点(如使用分支的PEG；参见例如Veronese et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180,2002)，位点特异性PEG化和/或单PEG化(参见例如Chapman et al.,Nature Biotech.17:780-783,1999)，及定向酶促PEG化(参见例如Sato,Adv.Drug Deliv.Rev.,54:487-504,2002)。本领域描述的方法和技术可以产生具有附着于单个蛋白质分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者超过10个PEG或PEG衍生物的蛋白质(参见例如U.S.2006/0104968)。
作为制备PEG化PH20多肽的示例方法的例子，PEG醛、琥珀酰亚胺及碳酸酯已各自用于将PEG部分、典型地琥珀酰亚氨基PEG缀合于rHuPH20。例如，rHuPH20已经缀合了举例的琥珀酰亚氨基单PEG(mPEG)试剂，包括mPEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA)和(用于附着“分支”PEG的)mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺。这些PEG化琥珀酰亚氨基酯含有在PEG基团和活化的交联接头与单个或分支PEG基团之间的不同长度的碳主链。这些差异可以用于例如提供不同的反应动力学及潜在限制在缀合过程期间可供PEG附着于rHuPH20的位点。
包含线性或分支PEG的琥珀酰亚氨基PEG(如上)可以缀合于PH20。PEG可以用于可重复地产生PH20，其包含分子平均具有每个透明质酸酶大约为或为3至6个PEG分子。这种PEG化rHuPH20组合物可以容易地被纯化以产生具有大约25,000或30,000单位/mg蛋白质透明质酸酶活性的比活性的组合物，并且基本上不含非PEG化PH20(小于5％非PEG化的)。
使用不同PEG试剂，可以例如用mPEG-SBA(30kD)、mPEG-SMB(30kD)以及基于mPEG2-NHS(40kD)和mPEG2-NHS(60kD)的分支形式制备举例形式的PEG化的PH20多肽。使用NHS化学及碳酸酯和醛采用以下每种试剂可以产生PH20的PEG化形式：mPEG2-NHS-40K分支的，mPEG-NHS-10K分支的，mPEG-NHS-20K分支的，mPEG2-NHS-60K分支的；mPEG-SBA-5K，mPEG-SBA-20K，mPEG-SBA-30K；mPEG-SMB-20K，mPEG-SMB-30K；mPEG-丁醛；mPEG-SPA-20K，mPEG-SPA-30K；和PEG-NHS-5K-生物素。也可以使用得自Dow Chemical Corporation分公司Dowpharma的PEG试剂制备PEG化PH20，包括用Dowpharma的对硝基苯基-碳酸酯PEG(30kDa)PEG化的PH20多肽及用丙醛PEG(30kDa)PEG化的PH20多肽。
在一个实例中，PEG化包括将mPEG-SBA例如mPEG-SBA-30K(具有大约30kDa的分子量)或另一种PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚氨基酯缀合于PH20多肽。PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚氨基酯如mPEG-SBA-30K容易偶联于蛋白质的氨基。例如，m-PEG-SBA-30K和rHuPH20的共价缀合(其大小大约为60KDa)提供了rHuPH20和mPEG之间的稳定酰胺键，如下述方案1所示。
方案1
典型地，mPEG-SBA-30K或其它PEG以PEG:多肽摩尔比10:1在合适缓冲液例如130mM NaCl/10mM HEPES pH 6.8或70mM磷酸盐缓冲液pH7中加入到PH20多肽中，随后灭菌，例如过滤灭菌，并且例如搅拌下在冷室内于4℃持续缀合过夜。在一个实例中，缀合的PEG-PH20被浓缩及进行缓冲液交换。
偶联PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚氨基酯如mPEG-SBA-30K的其它方法为本领域已知(参见例如U.S.5,672,662；U.S.6,737,505和U.S.2004/0235734)。例如，多肽如PH20多肽可以通过在硼酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)中于4℃反应1小时而偶联于NHS活化的PEG衍生物。所得PEG化蛋白质可以经超滤纯化。另一种方法将多肽与mPEG-SBA在去离子水中反应，在其中加入三乙胺以升高pH至7.2-9。所得混合物在室温搅拌若干小时以完成PEG化。
PH20多肽包括例如动物衍生的透明质酸酶和细菌乙酰透明质酸降解酶的PEG化的方法为本领域技术人员已知。见例如欧洲专利号EP 0400472描述了牛睾丸透明质酸酶和软骨素ABC裂解酶的PEG化。美国公开号2006014968描述了衍生自人PH20的人透明质酸酶的PEG化。例如，PEG化乙酰透明质酸降解酶通常每个分子含有至少3个PEG部分。在一些实例中，所述PH20多肽含有3-6个PEG分子。在其它实例中，所述酶可具有PEG与蛋白质的摩尔比率为5:1至9:1，例如7:1。
F.药物组合物及配制、剂量与给予
本发明提供了用于施用的任何修饰的PH20多肽的药物组合物。鉴于管理机构或者其它机构根据普遍公认用于动物和人的药典的许可制备药物可接受的组合物。典型地，使用本领域熟知的技术和程序将所述化合物配制为药物组合物(见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,Fourth Edition,1985,126)。
特别地，本发明提供了药物组合物，其是长时间稳定的液体配制物，在大约2℃-8℃(包括端点)稳定至少1个月，在或大约在30℃-42℃(包括端点)稳定至少3天。药物组合物，特别是液体配制物，可以受活性物质的稳定性的限制，其易受贮存条件(贮存时间或长度，温度和/或搅动)和/或组合物中包含的配制成分的影响。因此，稳定的药物组合物通常含有如章节C.1.b所述修饰的PH20多肽，其呈现出由对一或多种蛋白质变性条件增加的抗性而证明的增加的稳定性。这种蛋白质变性条件可包括但不限于高于或等于或大约30℃的升高的温度、搅动、低盐或无盐及存在赋形剂。增加的稳定性特征在于改善的贮存时间、降低的片段化和/或降低的聚集物形成，同时仍保留活性物质如PH20透明质酸酶的活性。这种配制物可以作为“现成的”液体配制物提供，不用进一步重建和/或不需要任何进一步稀释。在一些实例中，所述配制物也可以冻干或浓缩形式制备。
含有修饰的PH20多肽的药物组合物可以与另一种治疗剂共同给予。在这种实例中，修饰的PH20多肽可以单独配制为药物组合物并在给予包含活性治疗剂的第二种组合物之前、同时、间歇或随后给予。在其它实例中，修饰的PH20多肽可以与其它治疗剂的药物配制物共同配制。
特别地，本发明提供含有本发明所述修饰的PH20多肽与治疗剂的共配制物，所述治疗剂是化疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀阿米巴虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、及抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、生物杀灭剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药物、避孕药、减充血剂、利尿剂、抑郁剂、诊断剂、电解剂、催眠药、激素制剂、高血糖制剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼部用药、拟副交感神经剂、精神兴奋剂、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、尿路用药、阴道制剂、杀病毒剂、维生素制剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转换酶抑制剂、多肽、蛋白质、核酸、药物、有机分子或睡眠诱导剂。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽可以与抗体如单克隆抗体、免疫球蛋白、抗生素、二膦酸盐、细胞因子、化疗剂、凝血因子或胰岛素共同配制。可以与修饰的PH20多肽共同配制的举例的治疗剂在章节H中描述。特别地，本发明提供了含有修饰的PH20多肽和胰岛素的共配制物，所述胰岛素如速效胰岛素，例如普通胰岛素或快速作用(速效)胰岛素类似物。本发明提供的共配制物包括稳定的共配制物，从而活性物质即修饰的PH20多肽与所述治疗剂呈现出如本文所述增加的稳定性并长期保持活性。
含有本发明提供的PH20的配制物，包括其单独的配制物和共配制物，可以长期稳定，包括在不同温度及在不同贮存或使用条件如搅动下长期稳定。例如，本发明提供的配制物在“冰箱冷藏”条件下是稳定的及保持活性物质(例如PH20透明质酸酶)的活性，例如在2℃-8℃如在或大约在4℃稳定至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月或30个月或者更长时间。在另一实例中，本发明提供的配制物在室温是稳定的并保持活性物质(例如PH20透明质酸酶)活性，例如在18℃-32℃、通常在20℃-32℃如28℃-32℃稳定至少2周-1年，例如至少3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月或者至少1年或更长时间。在进一步的实例中，本发明提供的配制物在升高的温度是稳定的并保持活性物质(如PH20透明质酸酶)活性，所述温度为大约或高于30℃，通常为或大约为30℃-42℃，如32℃-37℃或者35℃-37℃或者大约为或为37℃，稳定至少4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、60天或更长时间。
组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末和缓释配方形式。组合物可以用传统结合剂和载体如甘油三酯配制为栓剂。口服配制物可以包括标准载体如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和其它这种制剂。也涵盖局部应用配制物。配制品应适合给予模式。
1.配制–液体，注射剂，乳液
所述配制物通常适于给予途径而配制。本文涵盖肠胃外给药，通常特征在于注射或输注，皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射。胃肠外给药的制备物包括注射用无菌溶液，在刚要使用之前与溶剂组合的无菌干燥可溶产物如冻干粉末包括皮下片剂，注射用无菌悬浮液，在刚要使用之前与运载体组合的无菌干燥不溶产物及无菌乳状液。注射剂可以常规形式制备，如液体溶液或者悬浮液，适于在注射之前在液体中形成溶液或者悬浮液的固体形式，或者作为乳状液。例如，含有修饰的PH20多肽的组合物，其单独配制或与另一治疗剂共同配制，可以溶液、糖浆或悬浮液等液体形式的药物制备物提供。在液体形式中，药物制备物可以作为浓缩制备物提供，在使用之前稀释为治疗有效浓度。通常，所述制备物以不需要稀释而使用的剂型提供。在另一实例中，药物制备物可以冻干形式存在，在使用前用水或其它合适的运载体重建。
注射剂可设计为局部或全身性给予。对于本发明，局部给予是直接给予受影响的间质组织。所述溶液可以是水溶液或非水溶液。如果是静脉内给予，合适载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，及含有增稠剂和增溶剂如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
调节药物活性化合物的浓度以便注射或输注提供有效量以产生希望的药物学作用。精确的剂量依赖于患者或动物的年龄、体重和病症，如本领域所已知。单位剂量胃肠外制备物可以包装在例如安瓿、药筒、小瓶或带有针头的注射器中。含有药物活性化合物的液体溶液或者重建的粉末制备物的体积是待治疗的疾病以及选择用于包装的特定制品的函数。如本领域所已知和实施，用于肠胃外给予的所有制备物必须是无菌的。这种胃肠外组合物中包含的活性化合物的百分比高度依赖于其特定性质，以及所述化合物的活性及对象的需要。
药物组合物可包含载体或其它赋形剂。例如，本发明提供的药物组合物可含有任一或多种稀释剂、佐剂、抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、去污剂、吸附剂或甜味剂及其组合，或者给予修饰的PH20多肽的运载体。例如，胃肠外制备物中使用的药物可接受的载体或赋形剂包括水溶液运载体、非水溶液运载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局麻剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、隔离剂或螯合剂及其它药物可接受的物质。配制物，包括液体制备物，可以通过常规方式用药物可接受的添加剂或赋形剂制备。
合适的药物载体例如在E.W.Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”中描述。这种组合物含有治疗有效量的化合物，通常是纯化形式，以及适量的载体，以提供适当给予患者的形式。这种药物载体可以是无菌液体，如水或油，包括源于石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物质油和芝麻油。当药物组合物是静脉内给予时，水是典型的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液也可以用作液体载体，特别是对于注射用溶液。举例的水溶液运载体包括氯化钠注射液、Ringers注射液、等渗右旋糖注射液、无菌注射用水、右旋糖和乳酸化Ringers注射液。非水性肠胃外载体包括源自植物的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油以及花生油。悬浮和分散剂包括但不限于山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或可食用的氢化脂肪、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括但不限于卵磷脂或阿拉伯树胶。去污剂包括但不限于聚山梨醇酯80(TWEEN 80)。非水溶液载体包括但不限于杏仁油、油酯或者分级分离的植物油。抗微生物剂或防腐剂包括但不限于甲基或丙基对羟基苯甲酸酯或山梨酸、m-甲酚、苯酚。稀释剂包括但不限于乳糖、蔗糖、磷酸二钙或者羧甲基纤维素。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙或滑石。结合剂包括但不限于淀粉、天然树胶如阿拉伯树胶、凝胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮及本领域技术人员已知的其它这种结合剂。等渗剂包括但不限于氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括但不限于磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局麻剂包括盐酸普鲁卡因。金属离子的隔离剂或螯合剂包括EDTA。其它合适的药物赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、葡萄糖(dextrose)、蔗糖、凝胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、盐水、水和乙醇。药物载体也包括用于水溶性运载体的乙醇、聚乙二醇和丙醇，及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。如果需要，组合物也可含有少量无毒性辅助物质如增湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、山梨聚糖单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯，稳定剂，溶解性增强剂，及其它这种物质如乙酸钠、磷酸钠、山梨聚糖单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
特别地，包装在多剂量容器中的胃肠外制备物中可以加入抑制细菌或抑制真菌浓度(例如抗微生物有效量)的抗微生物剂(例如防腐剂)，所述防腐剂包括苯酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。
所述配制物的体积，包括本发明提供的单独配制或共配制的含有PH20的配制物的体积，可以是适于提供其的容器的任何体积。在一些实例中，所述配制物提供在小瓶、注射器、注射笔、注射泵或闭环系统的贮药器或者任何其它合适的容器中。例如，本发明提供的配制物体积为或大约为0.1mL-500mL，如0.1mL-100mL、1mL-100mL、0.1mL-50mL，如至少或至少大约或大约或是0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。
a.冻干粉末
本发明感兴趣的是冻干粉末，其可以重建作为溶液、乳状液及其它混合物给予。其也可以重建和配制为固体或者凝胶。
无菌冻干粉末通过将酶化合物溶解于缓冲溶液中制备。缓冲溶液可含有改善稳定性的赋形剂或者粉末的其它药物成分或者从粉末制备的重建溶液。随后在本领域技术人员已知的标准条件下对溶液进行灭菌过滤，之后冻干，由此提供希望的配制物。可以制备如本文所述的液体配制物。所得混合物经灭菌过滤或者处理以除去微粒及保证无菌性，并分配至小瓶中以冻干。例如，冻干粉末通过在合适的缓冲液如柠檬酸、磷酸钠或者磷酸钾或者本领域技术人员已知的其它这种缓冲液中溶解赋形剂如葡萄糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或者其它合适物质而制备。然后，在所得混合物中加入选择的酶，搅拌直至其溶解。
每个小瓶含有单剂量或者多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当条件下贮存，如在大约4℃至室温下贮存。这种冻干粉末与合适的缓冲液的重建提供了用于胃肠外给予的配制物。
b.举例的配制物
本领域已知PH20的单剂量配制物。例如，重组体(透明质酸酶人注射液)每mL含有8.5mg NaCl(145mM)、1.4mg磷酸氢二钠(9.9mM)、1.0mg人白蛋白、0.9mg依地酸二钠(2.4mM)、0.3mg CaCl2(2.7mM)和NaOH用于调节pH至7.4。其它人可溶性透明质酸酶的配制物，如在美国专利公开号US2011/0053247中描述的rHuPH20配制物，其包含130mM的NaCl、10mM Hepes、pH 7.0；或10mM组氨酸、130mM的NaCl、pH 6.0。本发明提供的任何修饰的PH20多肽均可相似地配制。
除了治疗有效量的修饰的PH20多肽和/或其它治疗剂，举例的本发明提供的药物组合物，包括单独配制的及共配制的含有PH20的配制物，可含有一定浓度的NaCl及在要求的pH配制以维持活性物质(例如PH20透明质酸酶和/或其它共配制的治疗剂)的稳定性。多于多剂量配制物及长期贮存的其它配制物，所述组合物通常还含有一或多种防腐剂。也可包含进一步的稳定剂和其它赋形剂。举例的成分在下文描述。
i.盐(例如NaCl)
在本发明的实例中，本发明提供的药物组合物含有一定浓度的盐如氯化钠(NaCl)以维持活性物质(例如PH20透明质酸酶)的稳定性。盐，如NaCl，通常为保持PH20稳定性和活性所需。通常低于120mM的低盐浓度对PH20活性随着时间及依赖于温度条件可具有不利作用。因此，不存在盐(例如NaCl)或者存在低浓度盐(例如NaCl)可导致蛋白质去稳定化。在本发明的一些实例中，在不存在低盐或无盐如低浓度NaCl或无NaCl的条件下呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽(见例如章节C.1.b.iii)对于变性不敏感。而且存在盐(例如NaCl)对其它治疗剂可具有不同作用。例如，胰岛素和胰岛素类似物的溶解性在低盐浓度(例如<140mM)存在下趋于增加，而高盐浓度可导致胰岛素结晶/聚集，特别是在较低温度(见例如美国临时申请号61/520,962；美国申请系列号13/507,263和13/507,262；及PCT国际申请号PCT/US2012/042816)。因此，本发明提供的药物组合物是根据活性物质的需求而制备的。本领域技术人员已知怎样评定活性物质在配制物中及在不同贮存条件下的稳定性(见例如章节G)。在本发明的特定实例中，所述药物组合物，包括含有PH20的单独配制或共配制的配制物，含有浓度如下的NaCl：为或大约为10mM-200mM，如10mM-50mM、50mM-200mM、50mM-120mM、50mM-100mM、50mM-90mM、120mM-160mM、130mM-150mM、80mM-140mM、80mM-120mM、80mM-100mM、80mM-160mM、100mM-140mM、120mM-120mM或者140mM-180mM。
ii.pH和缓冲剂
在本发明的实例中，本发明提供的药物组合物在一定pH值制备以维持活性物质(如PH20透明质酸酶)的稳定性。例如，本发明提供的药物组合物在或大约在6.5-7.8如在或大约在6.5-7.2、7.0-7.8、7.0-7.6或者7.2-7.4的pH值制备。本发明提及pH是在室温测量的pH值。应理解pH在贮存期间随着时间可改变，但是典型保持在或大约在pH6.5至或至大约7.8。例如，pH可以变化±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5或更多。举例的本发明提供的共配制物当制备时的pH为或大约为7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2或者7.6±0.2。如果需要，pH可以调节，使用酸化剂降低pH或者使用碱化剂增加pH。举例的酸化剂包括但不限于乙酸、柠檬酸、硫酸、盐酸、磷酸一钠溶液和磷酸。举例的碱化剂包括但不限于磷酸二钠溶液、碳酸钠或氢氧化钠。
所述组合物通常使用维持pH范围的缓冲剂制备。任何缓冲剂均可以用于本发明提供的配制物中，只要其对活性物质(例如PH20透明质酸酶)的稳定性无不利影响及支持所需的必要pH范围即可。举例的特别合适的缓冲剂包括Tris、琥珀酸盐、乙酸盐、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐、乌头酸盐、苹果酸盐和碳酸盐。然而，本领域技术人员意识到本发明提供的配制物不限于特定缓冲剂，只要所述缓冲剂提供可接受程度的pH稳定性或者在指定范围的“缓冲能力”即可。通常，缓冲剂具有适当的缓冲能力，在其pK的大约1个pH单位内(Lachman et al.In:The Theory and Practice of IndustrialPharmacy 3rd Edn.(Lachman,L.,Lieberman,HA.and Kanig,J.L.,Eds.),Leaand Febiger,Philadelphia,p.458-460,1986)。缓冲剂适合性可以基于公开的pK列表估计或者可以通过本领域熟知的方法根据经验确定。溶液的pH可以调节至在上述范围内的希望的终点，例如使用任何可接受的酸或碱调节。
可包含在本发明提供的共配制物中的缓冲剂包括但不限于Tris(缓血酸胺)、组氨酸、磷酸盐缓冲剂如磷酸二钠和柠檬酸盐缓冲剂。这种缓冲剂可以或大约以1mM-100mM如10mM-50mM或者20mM-40mM如或大约如30mM的浓度存在于共配制物中。例如，这种缓冲剂在共配制物中存在的浓度为或大约为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或更高。
iii.防腐剂
在本发明的实例中，多剂量配制物或者长期贮存的配制物含有抗微生物有效量的防腐剂或者防腐剂混合物，其量为具有抑制细菌或抑制真菌作用。在特别的实例中，所述防腐剂以足够浓度存在以提供例如美国药典(USP)和欧洲药典(EP)的抗微生物要求，包括EP抗微生物要求(EPA)和优选的EP抗微生物要求(EPB)(见表4)。由于存在防腐剂特别是酚类防腐剂对PH20的稳定性有不利作用，因此这种配制物典型含有在存在防腐剂如本文章节C.1.b.i所述任何防腐剂条件下呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽。通常，所述量维持活性物质(例如PH20透明质酸酶)的稳定性。
防腐剂的抗微生物有效量是通过杀死或抑制所述组合物样品中微生物生物体的增殖而呈现抗微生物活性的量，如在抗微生物防腐剂效力检测(APET)中评定。本领域技术人员熟知抗微生物防腐剂效力检测及符合USP和EPA或EPB要求的标准以符合最低要求。通常，抗微生物防腐剂效力检测包括用合适的微生物(即细菌、酵母和真菌)的规定接种物攻击组合物，在规定温度储存接种的制备物，在指定的时间间隔取出样品，并计数样品中的生物体(参见Sutton and Porter,(2002)PDA Journal of PharmaceuticalScience and Technology 56(4):300-311；The United States PharmacopeialConvention,Inc.,(effective January 1,2002),The United States Pharmacopeia25th Revision,Rockville,MD,Chapter <51> Antimicrobial EffectivenessTesting；and European Pharmacopoeia,Chapter 5.1.3,Efficacy of AntimicrobialPreservation)。在攻击中使用的微生物通常包括3个细菌菌株，即大肠杆菌(ATCC No.8739)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC No.9027)和金黄色葡萄球菌(ATCC No.6538)，酵母(白念珠菌(Candida albicans)ATCC No.10231)和真菌(黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC No.16404)，将它们全部加入，使得接种的组合物每mL组合物含有105或106个菌落形成单位(cfu)的微生物。在下述情况下，认为组合物的防腐性质是足够的：在检验条件下，在规定的温度一段时间后，接种的组合物中的微生物的数目具有显著下降或没有增加，如表3所示。以与初始样品或之前的时间点相比，以活微生物数目的对数减少方式给出评价标准。
可包含在本发明提供的共配制物中的防腐剂的非限制性实例包括但不限于苯酚、间甲酚(m-甲酚)、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、氯己定二盐酸盐、氯己定二葡糖酸盐、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇(2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、醋酸苯汞、甘油(丙三醇)、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻-甲酚(o-甲酚)、对-甲酚(p-甲酚)、氯甲酚、溴棕三甲铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或者对羟基苯甲酸丁酯及其任何组合。例如，本发明提供的配制物可含有单一种防腐剂。在其它实例中，所述配制物含有至少两种不同防腐剂或者至少三种不同防腐剂。例如，本发明提供的配制物可含有两种防腐剂如L-苯丙氨酸与m-甲酚，L-苯丙氨酸与对羟基苯甲酸甲酯，L-苯丙氨酸与苯酚，m-甲酚与对羟基苯甲酸甲酯，苯酚与对羟基苯甲酸甲酯，m-甲酚与苯酚或者其它相似组合。在一个实例中，配制物中的防腐剂含有至少一种酚类防腐剂。例如，所述配制物含有苯酚、m-甲酚或者苯酚与m-甲酚。
在本发明提供的配制物中，一或多种防腐剂的总量以在配制物中质量浓度(w/v)百分比(％)表示，可以是例如为或大约为0.1％-0.4％，如0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％。通常，所述配制物含有低于0.4％(w/v)防腐剂。例如，本发明提供的共配制物含有至少或大约至少0.1％、0.12％、0.125％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％0.17％、0.175％、0.18％、0.19％、0.2％、0.25％、0.3％、0.325％、0.35％但是低于0.4％的全部防腐剂。
在一些实例中，本发明提供的配制物含有为或大约为0.1％-0.25％苯酚与为或大约为0.05％-0.2％m-甲酚，如为或大约为0.10％-0.2％苯酚与为或大约为0.06％-0.18％m-甲酚，或者为或大约为0.1％-0.15％苯酚与为或大约为0.08％-0.15％m-甲酚。例如，本发明提供的配制物含有或含有大约0.1％苯酚与0.075％m-甲酚；0.1％苯酚与0.15％m-甲酚；0.125％苯酚与0.075％m-甲酚；0.13％苯酚与0.075％m-甲酚；0.13％苯酚与0.08％m-甲酚；0.15％苯酚与0.175％m-甲酚；或者0.17％苯酚与0.13％m-甲酚。
iv.稳定剂
在本发明的实例中，本发明提供的药物组合物任选可含有一或多种其它稳定剂以维持活性物质(如PH20透明质酸酶)的稳定性。可包含在本发明提供的配制物中的稳定性类型是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂及其它制剂。本发明提供的配制物含有至少一种稳定剂。例如，本发明提供的配制物含有至少1、2、3、4、5、6或更多种稳定剂。因此，任一或多种氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂及其它制剂可包含在本发明的配制物中。通常，本发明的配制物至少含有表面活性剂和合适的缓冲剂。任选地，本发明提供的配制物可含有其它另外的稳定剂。其它成分包括例如一或多种张力调节剂，一或多种抗氧化剂，或者其它稳定剂。
举例的氨基酸稳定剂、氨基酸衍生物或胺包括但不限于L-精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、Lys-Lys、Gly-Gly、氧化三甲胺(TMAO)或甜菜碱。举例的糖和多元醇包括但不限于：甘油、山梨糖醇、甘露醇、肌醇、蔗糖或海藻糖。举例的盐和缓冲剂包括但不限于：氯化镁、硫酸钠、Tris(如Tris(100mM))或苯甲酸钠。举例的表面活性剂包括但不限于：泊洛沙姆188(例如F68)、聚山梨酯80(PS80)、聚山梨酯20(PS20)。其它稳定剂包括但不限于：透明质酸(HA)、人血清白蛋白(HSA)、苯基丁酸、牛磺胆酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或锌。
在本发明的特别实例中，所述配制物含有一或多种去污剂如表面活性剂以维持活性物质(例如PH20透明质酸酶)的稳定性。例如，表面活性剂可抑制PH20的聚集及使吸收性损失最小化。所述表面活性剂通常是非离子型表面活性剂。可包含在所述配制物中的表面活性剂包括但不限于多羟基醇如甘油或山梨醇的偏酯和偏醚和脂肪酸酯和醚，泊洛沙姆和聚山梨酯。例如，所述配制物中举例的表面活性剂包括以下的任意一种或多种：泊洛沙姆188(如F68)、聚山梨酯20、聚山梨酯80、PEG 400、PEG 3000、(例如20或80)、X-100、聚丙二醇或聚乙二醇。在一些实例中，本发明的配制物包含泊洛沙姆188、聚山梨酯20、聚山梨酯80，通常是泊洛沙姆188(pluronic F68)。本文提供的配制物通常包含至少一种表面活性剂，如1种、2种或3种表面活性剂。
在本发明的配制物中，一种或多种表面活性剂的总量作为在所述配制物中的质量浓度(w/v)百分比(％)可以是例如为或约为0.005％-1.0％，如为或约为0.01％-0.05％如0.01％-0.1％或0.01％-0.02％。通常，所述配制物包含至少0.01％表面活性剂并且包含小于1.0％如小于0.5％或小于0.1％表面活性剂。例如，本文提供的配制物可包含为或约为0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.08％或0.09％的表面活性剂。在特定实例中，本发明提供的配制物包含或包含大约0.01％至或至大约0.05％的表面活性剂。
在本发明提供的配制物中可以包含张力调节剂以产生具有期望的重量摩尔渗透压浓度的溶液。本发明提供的配制物具有为或约为245mOsm/kg-305mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。例如，所述重量摩尔渗透压浓度为或大约为245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、295mOsm/kg、300mOsm/kg或305mOsm/kg。在一些实例中，所述配制物的重量摩尔渗透压浓度为或大约为275mOsm/kg。张力调节剂包括但不限于：甘油、NaCl、氨基酸、多元醇、海藻糖和其它盐和/或糖。为了保留酶活性和/或张力，可以根据经验确定具体量。
在其它情况中，所述配制物中包含甘油(丙三醇)。例如，本发明提供的配制物典型含有包含低于60mM的甘油，如低于55mM、低于50mM、低于45mM、低于40mM、低于35mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、低于15mM、10mM或更低。甘油的量典型取决于存在的NaCl的量：在所述配制物中存在的NaCl越多，达到期望的重量摩尔渗透压浓度或摩尔渗透压浓度所需的甘油越少。因此，例如，在包含较高NaCl浓度的配制物中，所述配制物中需要包含很少甘油或根本不需要包含甘油。相反，在包含稍微更低NaCl浓度的配制物中，可以包含甘油。例如，本发明提供的配制物可以包含浓度为40mM-60mM如低于50mM、如20mM-50mM例如为或大约为50mM的甘油。
本发明提供的配制物也可包含抗氧化剂以减少或防止氧化特别是PH20多肽的氧化。例如，高浓度的表面活性剂或乙酰透明质酸寡聚物可以造成氧化。举例的抗氧化剂包括但不限于：半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在特定实例中，所述抗氧化剂是甲硫氨酸。本发明提供的配制物可包含浓度为或大约为5mM至或至大约50mM如5mM-40mM、5mM-20mM或者10mM-20mM的抗氧化剂。例如，可以在所述配制物中提供浓度为或大约为5mM至或至大约50mM如5mM-40mM、5mM-20mM或者10mM-20mM的甲硫氨酸。例如，可以包含如下浓度的抗氧化剂如甲硫氨酸：为或大约为5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些实例中，所述配制物含有10mM-20mM甲硫氨酸，如为或大约为10mM或20mM甲硫氨酸。
本发明提供的配制物也可含有氨基酸稳定剂，其有助于所述制备物的稳定性。所述稳定剂可为非极性氨基酸和碱性氨基酸。举例的非极性氨基酸和碱性氨基酸包括但不限于丙氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和脯氨酸。例如，所述氨基酸稳定剂是甘氨酸或脯氨酸，典型是甘氨酸。所述稳定剂可为单一氨基酸或者其可为两种或更多种这样氨基酸的组合。所述氨基酸稳定剂可为天然氨基酸、氨基酸类似物、修饰的氨基酸或氨基酸等同物。通常，所述氨基酸是L-氨基酸。例如，当使用脯氨酸作为稳定剂时，其一般为L-脯氨酸。还可能使用氨基酸等同物，例如脯氨酸类似物。包含于所述制备物中的氨基酸稳定剂如甘氨酸的浓度范围为0.1M-1M氨基酸，通常为0.1M-0.75M，一般为0.2M-0.5M，例如至少为或约为0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或更多。所述氨基酸例如甘氨酸可以药学可接受的盐的形式使用，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乙酸盐等。所述氨基酸例如甘氨酸的纯度应为至少98％、至少99％，或者至少99.5％或更高。
在本发明的实例中，如果需要，则所述配制物中包含透明质酸酶抑制剂以稳定PH20，特别是降低所述配制物中存在的其它去稳定化剂和条件的作用，如低盐、高pH、防腐剂的存在及升高的温度。这种成分通常不是含有本发明提供的在这种条件下呈现增加的稳定性的PH20多肽的药物组合物所必需的。当提供时，所述透明质酸酶抑制剂以至少在其平衡浓度提供。本领域技术人员熟知各个类别的透明质酸酶抑制剂(见例如Girish et al.(2009)Current Medicinal Chemistry,16:2261-2288，及其中引用的参考)。本领域技术人员已知或可以通过本领域标准方法确定本发明的反应或稳定组合物中透明质酸酶抑制剂的平衡浓度。
举例的用于本发明组合物中的透明质酸酶抑制剂是乙酰透明质酸(HA)。透明质酸(HA，也称作乙酰透明质酸和透明质酸盐)是PH20的天然底物。HA是一种非硫酸化的糖胺聚糖，其广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织中。其是直至25,000个二糖单位的聚合物，其自身由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺组成。HA的分子量范围是大约5kDa-200,000kDa。任何大小的HA均可用于所述组合物中作为稳定剂。在一些实例中，所述HA是二糖，由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺组成。在其它实例中，所述HA是寡糖，如四糖，含有2个重复二糖单位，或者本发明提供的共配制物中使用的HA可以含有多个重复二糖单位，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多个二糖单位。在另一实例中，本发明提供的配制物中使用的HA的分子量为或大约为5kDa至或至大约5,000kDa；为或大约为5kDa至或至大约1,000kDa；为或大约为5kDa至或至大约500kDa；或者为或大约为5kDa至或至大约200kDa。举例的用于本发明配制物中的HA寡糖的分子量为或大约为6.4kDa、74.0kDa或者234.4kDa。所述配制物可含有1mg/mL-20mg/mL HA、8mg/mL-12mg/mL，如至少或大约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL或20mg/mL或更多的HA。在一些实例中，HA与PH20的摩尔比率是或是大约100,000:1、95,000:1、90,000:1、85,000:1、80,000:1、75,000:1、70,000:1、65,000:1、60,000:1、55,000:1、50,000:1、45,000:1、40,000:1、35,000:1、30,000:1、25,000:1、20,000:1、15,000:1、10,000:1、5,000:1、1,000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1、或100:1或者更低。
在一些实例中，烟碱化合物用作稳定剂。烟碱化合物包括但不限于烟酰胺、烟酸、尼克酸、尼克酰胺、维生素B3和/或其盐和/或其任意组合。在具体应用中，所述稳定剂可以包含烟碱化合物和一种或多种氨基酸(参见例如国际公开号WO2010149772)。例如，所述氨基酸可以是精氨酸、谷氨酸和/或其盐或其组合。
2.用于其它给予途径的组合物
根据治疗的病症，其它给予途径如表面(topical)应用、经皮贴剂、口服和直肠给予也包括在本发明中。
例如，用于直肠给予的药物剂量形式是直肠栓剂、用于全身作用的胶囊剂和片剂。直肠栓剂包括用于插入直肠的固体本体，其在体温融化或软化而释放一或多种药物学或治疗活性成分。用于直肠栓剂中的药物学可接受物质是升高熔点的基质或运载体和制剂。基质的例子包括可可脂(可可豆油)、甘油-明胶、碳蜡(聚氧乙烯二醇)和脂肪酸单-、二-及三甘油酯的合适混合物。可以使用不同基质的组合。升高栓剂熔点的制剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压制方法或模塑制备。直肠栓剂的典型重量是大约2-3克。用于直肠给予的片剂和胶囊剂用与用于口服给予配制物的相同的药物学可接受物质经相同方法制造。适于直肠给予的配制物可以提供为单位剂量栓剂。它们可以通过将活性化合物与一或多种常规固体载体例如可可脂混合、然后成型所得混合物而制备。
对于口服给予，药物组合物可以采用例如片剂或胶囊剂形式，其经常规方式用药物学可接受赋形剂制备，所述赋形剂如结合剂(例如预明胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或者湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以用本领域公知方法包衣。
适合含服(舌下)给予的配制物包括例如含有在调味基质通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄耆胶中的活性化合物的锭剂(lozenge)；及含有在惰性基质如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶中的化合物的锭剂(pastille)。
表面混合物如针对局部和全身给予所述而制备。所得混合物可以是溶液、悬液、乳液等，并且被配制为乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、洗剂、喷雾、栓剂、绷带、皮肤贴剂或任何其它的适合局部给予的配制物。
所述化合物或其药物学可接受衍生物可以配制为气雾剂用于局部应用，如通过吸入(参见例如美国专利号4,044,126，4,414,209和4,364,923，其描述了用于输送治疗炎性疾病特别是哮喘的类固醇的气雾剂)。这些用于给予呼吸道的配制物可以呈气雾剂或者用于喷雾器的溶液形式，或者作为微细粉末用于吸入，其单独或者与惰性载体如乳糖组合。在这种情况中，配制物的颗粒典型地具有直径小于50微米，或小于10微米。
所述化合物可以配制用于局部或表面施用，如表面应用于皮肤或粘膜，如眼中，其形式为凝胶、乳膏和洗剂，及施用于眼睛或者用于脑池内或脊柱内应用。表面给予期望用于经皮输送以及用于给予眼睛或粘膜，或者用于吸入疗法。也可以给予活性化合物单独或者与其它药物学可接受赋形剂组合的鼻用溶液。
本发明提供了适合经皮给予的配制物。它们可以任何合适形式提供，例如独立贴剂，适于与受者的表皮保持紧密接触一段长时间。这种贴剂含有在任选地缓冲的水溶液中的活性化合物，所述活性化合物在水溶液的浓度例如是0.1至0.2M。适于经皮给予的配制物也可以经离子透入法输送(参见例如Pharmaceutical Research 3(6),318(1986))并典型采用活性化合物的任选地缓冲的水溶液的形式。
药物组合物还可以通过控制释放配制物和/或输送装置给予(参见例如美国专利号3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；；3,916,899；4,008,719；；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,591,767；5,639,476；5,674,533和5,733,566)。
3.剂量和给予
本发明提供的修饰的PH20多肽可以配制为单一剂量或多剂量给予的药物组合物。所述PH20多肽以足以对治疗的患者发挥治疗有益作用而不存在不希望的副作用的量包含于所述组合物中。治疗有效浓度可以根据经验确定，通过如使用本发明提供的或者本领域已知的测定法在已知的体外和体内系统中检测多肽而确定(见例如Taliani et al.(1996)Anal.Biochem.,240:60-67；Filocamo et al.(1997)J Virology,71:1417-1427；Sudo et al.(1996)Antiviral Res.32:9-18；Bouffard et al.(1995)Virology,209:52-59；Bianchi et al.(1996)Anal.Biochem.,237:239-244；Hamatake et al.(1996)Intervirology39:249-258；Steinkuhler et al.(1998)Biochem.,37:8899-8905；D’Souza et al.(1995)J Gen.Virol.,76:1729-1736；Takeshita et al.(1997)Anal.Biochem.,247:242-246；也见例如Shimizu et al.(1994)J.Virol.68:8406-8408；Mizutaniet al.(1996)J.Virol.70:7219-7223；Mizutani et al.(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.,227:822-826；Lu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA),93:1412-1417；Hahm et al.,(1996)Virology,226:318-326；Ito et al.(1996)J.Gen.Virol.,77:1043-1054；Mizutani et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.,212:906-911；Cho et al.(1997)J.Virol.Meth.65:201-207)，然后从中推断用于人体的剂量。
治疗疾病或病症给予的修饰的PH20的量可以通过标准临床技术确定。此外，体外测定和动物模型可用于帮助鉴别最佳剂量范围。可根据经验确定的精确剂量可依赖于特定酶、给予途径、待治疗的疾病类型以及疾病的严重性而定。
因此，应理解精确剂量和治疗持续时间是被治疗的疾病的函数并可使用已知的检验方案或通过从体内或体外测试数据外推来经验性地确定。要注意浓度和剂量值还可随被减轻的病症的严重性而变化。还要理解，对于任意特定个体，应该根据个体需要和管理或监督组合物给药的人员的专业判断随时调整具体给药方案，并且本文显示的浓度范围仅为示例性并且无意限制包含它们的组合物和组合的范围或用途。可每小时、每天、每周、每月、每年或一次给予所述组合物。通常，选择给药方案以限制毒性。应注意，主治医师根据毒性或骨髓、肝脏或肾脏或其它组织功能障碍知道怎样及何时而终止、中断或调整治疗到较低剂量。相反，如果临床响应不足(排除毒副作用)，主治医师也会知道如何以及何时将治疗调整到较高剂量。
典型地，修饰的PH20酶的治疗有效剂量在稳定化溶液或悬浮液或者冻干形式中是或是大约10单位(U)-500,000单位，100U-100,000U、500U-50,000U、1000U-10,000U、5000U-7500U、5000U-50,000U，或者1,000U-10,000U，通常为1,000-50,000U。例如，PH20多肽可以如下剂量给予：至少或大约至少或者10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或更多。所述配制物可以单位剂量形式提供，如但不限于安瓿、注射器及单独包装的片剂或胶囊剂。
所述PH20酶可以单独给予，或者与其它药物有效物质或治疗剂组合给予，总体积为0.1-100mL、1-50mL、10-50mL、10-30mL、1-20mL、或者1-10mL、典型为10-50mL。典型地，含有PH20的组合物的注射或输注体积为至少或至少大约0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。本发明提供的配制物含有修饰的PH20多肽，其量为或大约为30单位/mL-3000U/mL、300U/mL-2000U/mL或者600U/mL-2000U/mL或者600U/mL-1000U/mL，如至少或大约至少30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/mL、2000U/mL或3000U/mL。例如，本发明提供的配制物含有PH20，其量为至少100U/mL-1000U/mL，例如至少或大约至少或大约或为600U/mL。
所述PH20多肽可以溶液提供，其量为至少或大约或为100U/mL、150U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、800U/mL或1000U/mL，或者可以更浓缩的形式提供，例如其量为至少或大约或为2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、8000U/mL、10,000U/mL或20,000U/mL以直接使用或者在使用之前稀释为有效浓度。所述PH20多肽组合物可以液体或冻干配制物形式提供。
当PH20与治疗剂共同配制时，剂量可以PH20的量与给予的治疗剂的量的比率提供。例如，可以给予的PH20多肽为1U透明质酸酶/1U治疗剂(1:1)至50:1或更多，例如为或大约为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1或更多。
本发明提供的配制物，包括共配制物和/或稳定配制物，可以制备为单剂量给予、多剂量给予或者持续输注给予。本发明也涵盖缓释或持续释放系统的植入，由此维持恒定的剂量水平(见例如美国专利号3,710,795)。
例如，提供药物治疗活性化合物及其衍生物的配制物以单位剂量形式或多剂量形式给予人和动物。例如，化合物可以配制为含有适量化合物或其药物可接受的衍生物的片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒、无菌胃肠外溶液或者悬浮液、口服溶液或者悬浮液，或者油-水乳状液。每个单位剂量含有预定量的治疗活性化合物，足以产生希望的治疗作用，以及含有需要的药物载体、运载体或稀释剂。单位剂量形式例如包括安瓿和注射器及单独包装的片剂或者胶囊剂。单位剂量可以分部分或多次给予。多剂量形式是包装在一个容器中的多个相同的单位剂量形式，以独立的单位剂量形式给予。举例的多剂量形式包括小瓶、片剂或者胶囊瓶或者品脱或者加仑瓶。因此，多剂量形式是未独立包装的多个单位剂量。通常，可以制备含有0.005％-100％活性成分的剂量形式或者组合物，余量由无毒载体组成。
本发明提供的组合物典型配制为通过皮下途径给予，但是也涵盖其它给予途径，如本领域技术人员已知的任何途径，包括肌肉内、腹膜内、静脉内、皮内、灶内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳、经皮给予或者任何给予途径。适于这种途径的配制物为本领域技术人员已知。根据治疗部位，给予可以是局部、表面或者全身性的。局部给予至需要治疗的区域可以通过例如但不限于手术期间局部输注，表面应用例如在手术后与伤口敷料一起，通过注射，通过导管，通过栓剂或通过植入进行。组合物也可以与其它生物活性物质给予，相继、间歇或在同一组合物中。
在任何指定情况中最合适的途径依赖于多种因素，如疾病性质、对象对于特定给予途径的耐受、疾病严重性及使用的具体组合物。典型地，本发明提供的组合物是胃肠外给予的。在一些实例中，给予修饰的PH20多肽组合物，由此其到达皮肤或组织的细胞间隙，从而降解间隙空间以随后输送治疗剂。因此，在一些实例中，涵盖在皮下直接给予如通过皮下给予方法。因此，在一个实例中，局部给予可通过注射如注射器或者含有注射装置如针头的其它产品实现。在另一实例中，局部给予可以通过输注而实现，通过使用泵或其它相似装置而便利地给予。本发明也涵盖其它给予模式。例如，修饰的PH20多肽包括具有延长的半衰期的缀合形式如其PEG化形式，可以通过静脉内给予。药物组合物可以适于每种给予途径的剂型配制。
给予方法可用于降低选择的修饰的PH20多肽暴露于降解过程，如蛋白酶降解及通过抗原性和免疫原性应答的免疫学干预。举例的这种方法包括在治疗部位局部给予。治疗剂的PEG化增加对蛋白酶解的抗性、延长血浆半衰期及降低抗原性和免疫原性。举例的PEG化方法学为本领域已知(见例如Lu and Felix,Int.J.Peptide Protein Res.,43:127-138,1994；Lu and Felix,Peptide Res.,6:140-6,1993；Felix et al.,Int.J.Peptide Res.,46:253-64,1995；Benhar et al.,J.Biol.Chem.,269:13398-404,1994；Brumeanu et al.,JImmunol.,154:3088-95,1995；也见Caliceti et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10):1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8Pt 2):3S-8S)。PEG化也可用于在体内输送核酸分子。例如，腺病毒的PEG化可增加稳定性和基因转移(见例如Cheng et al.(2003)Pharm.Res.20(9):1444-51)。
已知多种其它输送系统并且可以用于给予选择的PH20多肽，例如但不限于脂质体中包囊、微粒、微囊、能表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞及编码选择的PH20多肽的核酸分子的输送如逆转录病毒输送系统。
因此，在某些实施方案中，脂质体和/或纳米颗粒也可以用于给予可溶的PH20多肽。脂质体从分散在水性介质的磷脂形成并自发形成多层同中心双层小泡(也称为多层小泡(MLV))。MLV通常直径从25nm至4μm。MLV的超声导致形成直径在200至500埃的小单层小泡(SUV)，其在核心中含有水溶液。
当分散在水中时，根据脂质与水的摩尔比，磷脂可以形成除脂质体之外的多种结构。在低脂质与水比率，脂质体形成。脂质体的物理特征依赖于pH、离子强度及二价阳离子的存在。脂质体可以显示对离子和极性物质的低渗透性，但是在升高的温度经历相变，其显著改变它们的渗透性。相变涉及从已知为凝胶态的紧密填充的有序结构向已知为流体态的松散填充的不太有序的结构的变化。这发生在特征性相变温度并且导致对离子、糖和药物的渗透性增加。
脂质体与细胞经不同机制相互作用：网状内皮组织系统的吞噬细胞如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的胞吞；吸附至细胞表面，经非特异性弱疏水或静电力，或者经与细胞表面成分的特异性相互作用；通过脂质体的脂双层插入到质膜中与细胞质膜融合，同时释放脂质体内容物至细胞质中；以及经脂质体脂质转移到细胞或亚细胞膜，或者反之，无需与脂质体内容物有任何关联。改变脂质体配制物可以改变运行的机制，尽管在同一时间可以有一种以上机制运行。纳米囊通常可以以稳定和可重复方式捕获化合物。为避免由于细胞内聚合物过载导致的副作用，这种超细颗粒(大小约0.1μm)应使用能体内降解的聚合物设计。满足这些要求的生物可降解聚烷基氰基丙烯酸酯纳米颗粒可用于本发明，这种颗粒可容易制备。
4.举例的PH20-胰岛素共配制物
本发明提供了速效胰岛素如速效(快速作用)胰岛素类似物与修饰的PH20多肽的稳定的共配制物。本发明提供的任何修饰的PH20多肽均可与胰岛素包含于共配制物中，如美国申请系列号13/507,263或13/507,262或者PCT国际申请系列号PCT/US2012/042816所述任何共配制物。
特别地，修饰的PH20多肽是在变性条件下呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽，如章节C.1.b所述。特别地，所述PH20多肽是对于一或多种酚类防腐剂呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽，所述防腐剂如章节C.1.b.i所述。例如，所述PH20多肽是修饰的PH20多肽，其在相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置204的位置含有具有P的氨基酸置换，如参考SEQ ID NO:3、7或32-66任一的F204P。在其它实例中，所述PH20多肽是修饰的PH20多肽，其在相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置58的位置含有具有R的氨基酸置换，如参考SEQ ID NO:3、7或32-66任一的V58R。
速效胰岛素可以是普通胰岛素或者速效(快速作用)胰岛素类似物。胰岛素是当加工时由含有A链和B链的51个氨基酸组成的多肽。通常，胰岛素含有大约21个氨基酸的A链及大约30个氨基酸的B链。A链和B链通过二硫键连接。举例的普通胰岛素包括例如人胰岛素(具有SEQ ID NO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:863所示氨基酸序列的B链)或者猪胰岛素(具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基88-108所示的氨基酸序列的A链及具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基25-54所示氨基酸序列的B链)。举例的速效胰岛素类似物是胰岛素变体，其与SEQ ID NO:862和863(A和B链)所示人胰岛素相比含有一或多个氨基酸修饰。例如，举例的胰岛素类似物为本领域技术人员已知，包括但不限于赖谷胰岛素，其具有SEQ IDNO:862所示A链及是SEQ ID NO:863变体的B链(B-链；LysB3,GluB29)；HMR-1153，其具有SEQ ID NO:862所示A链及是SEQ ID NO:863变体的B链(B-链；LysB3,IleB28)；门冬胰岛素，其具有SEQ ID NO:862所示A链及是SEQ ID NO:863变体的B链(B-链；AspB28)；以及赖脯胰岛素，其具有SEQ ID NO:862所示A链及是SEQ ID NO:863变体的B链(B-链；LysB28,ProB29)。在上述每种情况中，类似物的命名法基于在胰岛素的A链或B链上特定位置的氨基酸取代的描述，从链的N末端编号，其中序列的剩余部分是天然人胰岛素序列。举例的这种类似物形式如SEQ ID NO:862(A-链)所示，并具有SEQ ID NO:865-867任一所示B链。
所述共配制物作为液体配制物可长期稳定性的，在为或大约为2℃-8℃(包括端点)的温度稳定至少1个月，在为或大约为30℃-42℃(包括端点)的温度稳定至少3天。例如，所述共配制物在“冷藏”条件下是稳定的并保留PH20透明质酸酶和胰岛素的活性，例如在2℃-8℃如在或大约在4℃稳定及保持活性至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月或30个月或者更长时间。在另一实例中，本发明提供的配制物在室温如18℃-32℃、通常20℃-32℃如28℃-32℃是稳定的及保留PH20透明质酸酶和胰岛素活性至少2周-1年，例如至少3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月或者至少1年或更长时间。在进一步的实例中，本发明提供的配制物在大约或高于30℃、通常为或大约为30℃-42℃如32℃-37℃或35℃-37℃或者大约为或为37℃的升高的温度是稳定的及保留PH20透明质酸酶和胰岛素活性至少4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、60天或更长时间。
评定活性物质的稳定性的测定为本领域技术人员已知。章节G提供评定PH20透明质酸酶稳定性的举例测定法。胰岛素的稳定性可以使用本领域技术人员熟知的相似方法评定。例如，胰岛素稳定性和溶解性可以通过目测(例如包括颜色变化、澄清度、聚集体或集簇的存在及材料粘附，或者起霜)、酸澄清、光学显微术、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、体外或体内生物测定法以及变性和非变性大小排阻层析法(SEC)评定。胰岛素活性的体外或体内生物测定包括但不限于竞争性结合测定，使用表达胰岛素受体的细胞(例如人胎盘细胞膜)和放射性标记的胰岛素(见例如Weiss et al.,(2001)J.Biol.Chem.276:40018-40024；Duttaroy et al.,(2005)Diabetes 54:251-258)；胰岛素刺激的葡萄糖摄取(Louveau et al.,(2004)J Endocrin.181:271-280,Duttaroy et al.,(2005)Diabetes 54:251-258)；评定在存在胰岛素条件下葡萄糖产生的测定(Wang et al.,(2000)J.Biochem.,275:14717-14721,Duttaroy etal.,(2005)Diabetes 54:251-258)；以及使用糖尿病和/或健康动物模型的研究(Atkinson et al.,(1999)Nature Med.5:601-604；Nagoya-Shibata-Yasuda(NSY)mice,Zucker diabetic fatty(ZDF)rats and Gato-Katazaki(GK)rats(Cefalu(2006)ILAR Journal 47:186-198)。
这种配制物例如含有100U/mL-1000U/mL修饰的PH20多肽，特别是为或大约为或至少600U/mL；10U/mL-1000U/mL速效胰岛素，特别是或至少或大约100U/mL；NaCl，浓度为或大约为80-140mM；pH为或大约为7.0-7.8；缓冲剂，其维持pH范围为或大约为7.0-7.8；0.1％-0.4％防腐剂，以质量浓度(w/v)表示。任选地，可以包含进一步的稳定剂。例如，本发明提供的共配制物含有1mM-100mM的缓冲剂。例如，本发明提供的共配制物含有0.005％-0.5％表面活性剂。举例的本发明提供的共配制物还可含有低于60mM甘油(丙三醇)及2mM至或至大约50mM抗氧化剂。
如下稳定的配制物只是举例说明，及提供从中可进行微细调节的平台。应理解可以对各个赋形剂及其它成分浓度进行微小改变(例如所述浓度的±15％)，或者对pH略微改变，而同时保留一些或者全部的胰岛素溶解性和稳定性及PH20稳定性。通过加入或除去赋形剂也可以进行进一步改变。例如，可以改变稳定化表面活性剂的类型。
例如，举例的本发明提供的共配制物含有100U/mL-1000U/mL修饰的PH20多肽，及特别是至少或大约至少或大约600U/mL修饰的PH20多肽；10U/mL-1000U/mL速效胰岛素，及特别至少或大约至少或大约100U/mL速效胰岛素；为或大约为10mM至或至大约50mM Tris(例如为或大约为20mM-40mM Tris，如为或大约为20mM、25mM、30mM、35mM或40mMTris)；为或大约为80mM至或至大约160mM NaCl(例如为或大约为80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM或者160mM NaCl)；为或大约为2mM至或至大约50mM甲硫氨酸(例如为或大约为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM甲硫氨酸)；为或大约为0mM至或大约至50mM甘油(例如为或大约为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM甘油)；为或大约为0.005％至或至大约0.5％泊洛沙姆188如0.01％-0.05％(例如为或大约为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％泊洛沙姆188)；为或大约为0.05％至或至大约0.25％苯酚(例如为或大约为0.1％、0.12％、0.125％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％或0.17％苯酚)；及为或大约为0.05％至或至大约0.4％m-甲酚(例如为或大约为0.075％、0.08％、0.09％、0.1％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％或0.17％m-甲酚)。所述配制物的pH配制为或大约为7.0至或至大约7.6(例如为或大约为pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。在进一步的实例中，包含锌，其浓度为或大约为0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U或0.024mg/100U胰岛素。
在特定的实例中，所述速效胰岛素是门冬胰岛素、赖脯胰岛素或赖谷胰岛素。含有修饰的PH20多肽和赖脯胰岛素的举例的本发明提供的共配制物是含有为或大约为25mM至或至大约35mM Tris(例如为或大约为30mM Tris)；为或大约为70mM至或至大约100mM NaCl(例如为或大约为80mM或100mM NaCl)；为或大约为10mM至或至大约30mM甲硫氨酸(例如为或大约为10mM或20mM甲硫氨酸)；为或大约为40mM至或至大约60mM甘油(例如为或大约为50mM甘油)；为或大约为0.005％至或至大约0.05％泊洛沙姆188(例如为或大约为0.01％泊洛沙姆188)；为或大约为0.017mg锌/100U胰岛素至或至大约0.024mg锌/100U胰岛素(例如0.017mg锌/100U胰岛素，0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U或者0.024mg锌/100U胰岛素)；为或大约为0.08％至或至大约0.17％苯酚(例如0.1％,0.125％或0.13％苯酚)；及为或大约为0.07％至或至大约0.17％m-甲酚(例如0.075％、0.08％、0.13％或0.15％m-甲酚)。例如，所述共配制物可含有为或大约为0.1％苯酚与0.015％m-甲酚；为或大约为0.125％苯酚与0.075％m-甲酚；为或大约为0.13％苯酚与0.075％m-甲酚；为或大约为0.13％苯酚与0.08％m-甲酚；或者为或大约为0.17％苯酚与0.13％m-甲酚。赖脯胰岛素与修饰的PH20多肽的这种配制物的pH制备为或大约为7.0至或至大约7.5(典型地，pH为或大约为pH 7.2)。
含有修饰的PH20多肽和门冬胰岛素的举例的本发明提供的共配制物含有为或大约为25mM至或至大约35mM Tris(例如为或大约为30mMTris)；为或大约为70mM至或至大约120mM NaCl(例如为或大约为80mM或100mM NaCl)；为或大约为2mM至或至大约30mM甲硫氨酸，如2mM-10mM或者5mM-30mM甲硫氨酸(例如为或大约为5mM、10mM或20mM甲硫氨酸)；为或大约为0.005％至或至大约0.05％泊洛沙姆188(例如为或大约为0.01％泊洛沙姆188)；为或大约为0.08％至或至大约0.17％苯酚(例如0.1％、0.125％或0.13％苯酚)；及至或至大约0.07％至或至大约0.17％m-甲酚(例如0.075％、0.08％、0.13％或0.15％m-甲酚)。例如，所述共配制物可含有为或大约为0.1％苯酚与0.015％m-甲酚；为或大约为0.125％苯酚与0.075％m-甲酚；为或大约为0.13％苯酚与0.075％m-甲酚；为或大约为0.13％苯酚与0.08％m-甲酚；或者为或大约为0.17％苯酚与0.13％m-甲酚。门冬胰岛素与修饰的PH20多肽的这种配制物的pH配制为或大约为7.0至或至大约7.6(典型pH为或大约为7.4或7.3)。
本发明提供的含有修饰的PH20多肽和门冬胰岛素的配制物的进一步实例是不含有苯酚的那些配制物。这种举例的配制物含有为或大约为25mM至或至大约35mM Tris(例如为或大约为30mM Tris)；为或大约为70mM至或至大约120mM NaCl(例如为或大约为80mM或100mM NaCl)；为或大约为2mM至或至大约30mM甲硫氨酸如2mM-10mM或5mM-30mM甲硫氨酸(例如至或至大约5mM、10mM或20mM甲硫氨酸)；为或大约为0.005％至或至大约0.05％泊洛沙姆188(例如为或大约为0.01％泊洛沙姆188)；及为或大约为0.07％至或至大约0.4％m-甲酚，如为或大约为0.2％-0.4％m-甲酚(例如0.3％、0.315％、0.35％、0.4％m-甲酚)。门冬胰岛素与修饰的PH20多肽的这种配制物的pH制备为或大约为7.0至或至大约7.6(典型pH为或大约为pH 7.4或7.3)。
本发明提供的含有修饰的PH20多肽与赖谷胰岛素的举例的共配制物是含有为或大约为25mM至或至大约35mM Tris(例如为或大约为30mMTris)；为或大约为100mM至或至大约150mM NaCl(例如为或大约为100mM或140mM NaCl)；为或大约为10mM至或至大约30mM甲硫氨酸(例如为或大约为10mM或20mM甲硫氨酸)；为或大约为40mM至或至大约60mM甘油(例如为或大约为50mM甘油)；为或大约为0.005％至或至大约0.05％泊洛沙姆188(例如为或大约为0.01％泊洛沙姆188)；为或大约为0.08％至或至大约0.17％苯酚(例如0.1％、0.125％或0.13％苯酚)；及为或大约为0.07％至或至大约0.17％m-甲酚(例如0.075％、0.08％、0.13％或0.15％m-甲酚)。例如，所述共配制物可含有为或大约为0.1％苯酚与0.015％m-甲酚；为或大约为0.125％苯酚与0.075％m-甲酚；为或大约为0.13％苯酚与0.075％m-甲酚；为或大约为0.13％苯酚与0.08％m-甲酚；或者为或大约为0.17％苯酚与0.13％m-甲酚。赖谷胰岛素与修饰的PH20多肽的这种配制物的pH制备为或大约为7.0至或至大约7.6(典型pH为或大约为pH 7.4)。
5.包装、产品和试剂盒
修饰的PH20多肽或者编码此类多肽或其衍生物或变体的核酸的药物化合物可以包装为产品，其含有包装材料、对治疗疾病或病症有效的药物组合物以及表明所述药物组合物或治疗分子是用于治疗所述疾病或病症的标签。所选修饰的PH20多肽或者其衍生物或变体与治疗剂的组合也可以包装在产品中。
本发明提供的产品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，每个专利以其全部内容并入本文。药物包装材料的实例包括但不限于泡包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合所选配制物及指定的给药和治疗模式的任何包装材料。所述产品可以包括针头或其它注射装置以便于为了局部注射目的的给药(例如表皮下给药)。考虑了本文提供的化合物和组合物的多种配制物，其包括修饰的PH20多肽与已知治疗特定疾病或病症的治疗剂如速效胰岛素。包装的选择取决于PH20和/或治疗剂，以及这样的组合物是否一起或单独包装。在一个实例中，所述PH20可以包装为与治疗剂的混合物。在另一实例中，所述成分可以包装为单独的组合物。
修饰的PH20多肽、治疗剂和/或其产品也可以提供为试剂盒。试剂盒可以包括本文所述的药物组合物和作为产品提供的用于给药的物品。例如PH20多肽可以与用于给药的装置一起供应，如注射器、吸入器、剂量杯、滴管或涂药器。所述组合物可以包含在用于给药的物品中或者可以单独提供以便后来加入。试剂盒可以任选地包括施用说明，其包括剂量、给药方案和给药模式说明。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。例如，这样的剂盒可以包括用于测量个体中所选蛋白酶的浓度、量或活性的物品。
G.评定PH20活性和稳定性的方法
可以使用测定法来评价本发明提供的PH20多肽的稳定性和活性。所述测定法可以评价PH20多肽在特定条件、温度和/或随着时间的透明质酸酶活性。这种测定可用于例如确定PH20多肽在特定的变性条件下的稳定性，所述变性条件包括但不限于高于或大约或为30℃(例如30℃-42℃如是或是大约37℃)的升高的温度、搅动、存在赋形剂(例如防腐剂)或者低浓度或无NaCl(盐)。例如，在特定条件下的稳定性可以通过评价在不存在暴露于变性条件及在存在所述条件随后在各个时间点的活性、溶解性和稳定性(例如聚集体的形成等)而监测。因此，稳定性可以随着时间而评定。稳定性也可以通过对比存在一或多种变性条件下与天然野生型或参考PH20多肽相比的任一或多种活性、溶解性或聚集而评定。所述测定也可以用于对本文提供的配制物做出微小调节，同时保留两种活性物质的稳定性。
1.透明质酸酶活性
修饰的PH20多肽的活性可以使用本领域熟知方法评定。例如，用于透明质酸酶的USP XXII测定在酶与透明质酸或乙酰透明质酸(HA)于37℃反应30分钟后，通过测量剩余的未降解HA底物的量而间接确定活性(USPXXII-NF XVII(1990)644-645United States Pharmacopeia Convention,Inc,Rockville,MD)。透明质酸酶参考标准(USP)或国家配制(National Formulary，NF)标准透明质酸酶溶液可用于确定任何透明质酸酶单位活性的测定中。在一个实例中，使用微浊度测定法测量活性。这基于当透明质酸结合沉淀其的试剂如酸化血清或氯化十六烷吡啶(CPC)时形成不溶沉淀。通过将透明质酸酶与透明质酸钠(透明质酸)保温一定时间(例如10分钟)，然后加入酸化的血清或CPC沉淀未消化的透明质酸钠，由此测量活性。在额外显色时间之后，在640nm测量所得样品的浊度。得自透明质酸酶活性对透明质酸钠底物的浊度降低作为透明质酸酶活性的量度。
在另一实例中，使用微滴定测定测量透明质酸酶活性，其中在与透明质酸酶保温后测量残余的生物素化透明质酸(见例如Frost and Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269，美国专利公开号20050260186)。透明质酸的葡糖醛酸残基上的游离羧基被生物素化，将生物素化的透明质酸底物与微滴定平板共价结合。在与透明质酸酶保温后，使用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应检测残余的生物素化透明质酸底物，并与在与已知活性的透明质酸酶标准物反应之后获得的结果对比。
测量透明质酸酶活性的其它测定为本领域已知且可用于本发明的方法中(见例如Delpech et al.,(1995)Anal.Biochem.229:35-41；Takahashi et al.,(2003)Anal.Biochem.322:257-263)。
许多透明质酸酶测定基于测量产生新的还原N-乙酰氨基(Bonner andCantey,Clin.Chim.Acta 13:746-752,1966)，或者粘度的丧失(De Salegui et al.,Arch.Biochem.Biophys.121:548-554,1967)或者浊度(Dorfman and Ott,J.Biol.Chem.172:367,1948)。使用纯化的底物，所有这些方法足以确定糖苷内切酶活性的存在与否。
基本纯化的糖胺聚糖底物也可以用于凝胶移动测定中。将糖胺聚糖与重组PH20如可溶的PH20混合以检测导致凝胶内底物迁移性变动的糖苷内切酶活性。举例的这种底物包括但不限于4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素，硫酸皮肤素，硫酸肝素，其可得自Sigma Chemical。人脐带血乙酰透明质酸可得自ICN。例如，可以将每个检测底物在pH 3.5-7.5的缓冲液中稀释为或为大约0.lmg/mL。在这种举例的测定中，可以将为或大约为10μl的纯化的可溶PH20样品或者表达PH20的细胞的条件培养基与为或大约为90μl检测底物在希望的缓冲液中混合并在37℃保温3小时。在保温后，将样品用样品缓冲液(Tris EDTA pH 8.0，溴酚蓝和甘油)中和，随后进行电泳。糖胺聚糖可以使用本领域已知的任何方法检测，例如糖胺聚糖可以通过用在3％冰醋酸中的0.5％阿辛蓝对凝胶染色过夜及随后在7％冰醋酸中脱色而检测。降解通过对比存在与不存在酶的条件下的底物迁移性而确定。
透明质酸酶活性也可以通过底物凝胶酶谱法检测(Guentenhoner et al.(1992)Matrix 12:388-396)。在这个测定中，将样品应用于含有透明质酸的SDS-PAGE凝胶中，通过电泳分离样品中的蛋白质。然后将该凝胶在酶测定缓冲液中保温，随后染色以检测凝胶中的透明质酸。透明质酸酶活性以底物凝胶中透明带观测。
也可评价PH20多肽包括本发明提供的修饰的PH20多肽作为扩散剂或分散剂的能力。例如，可在有或无PH20多肽的情况下将台盼蓝染料皮下注射到裸鼠每侧的侧面皮肤中。然后例如使用微测径器测量染料面积以确定PH20多肽作为分散剂的能力(美国专利公开号20060104968)。
可使用任何这些测定法将PH20多肽的功能活性与参考标准进行对比和/或标准化。这样做可以确定PH20多肽的功能等价量。例如，可通过与台盼蓝一起在小鼠体侧皮肤注射来评价PH20多肽作为扩散剂或分散剂的能力，并且可确定达到与例如100单位透明质酸酶参比标准品相同分散量所需的量。因此，所需的PH20多肽量功能上等价于100透明质酸酶单位。
2.溶解性
PH20多肽的溶解性可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定。确定溶解性的一种方法是去污剂分配。例如，可溶性PH20多肽可以通过例如其在37℃下分配入X-114溶液的水相来区分(Bordier et al.,(1981)J.Biol.Chem.,256:1604-1607)。膜锚定多肽，如脂质锚定透明质酸酶，包括GPI-锚定透明质酸酶，会分配入去污剂富集相，但是在用磷脂酶C处理后会分配入去污剂贫乏或水相。磷脂酶C是切割在GPI-锚定蛋白中发现的磷酸甘油键的酶。用PLC处理会引起GPI-连接的蛋白从外细胞膜释放。
3.纯度、结晶或聚集
本发明提供的PH20多肽的稳定性也可以使用本领域已知的其它方法和测定评定。除了基于透明质酸酶活性评定稳定性之外，稳定性也可以通过目测、回收百分比、蛋白质纯度和表观解链温度而评定。
例如，蛋白质纯度可以通过反相高效液相层析法(RP-HPLC)测量。通过RP-HPLC确定的蛋白质纯度是主要PH20蛋白质峰值相对于存在的所有蛋白质的百分比。因此，RP-HPLC及本领域技术人员已知的相似方法可评定酶的降解。蛋白质纯度可以随着时间而评定。蛋白质纯度也可以在存在一或多种变性条件及在不同量的条件下评定。回收百分比也可以确定为所述多肽在不同条件下(变性条件，贮存时间，贮存模式如瓶或容器贮存，或者可以改变的其它相似参数)相比于参考样品的相对百分比。PH20多肽稳定性也可以通过RP-HPLC测量透明质酸酶的氧化而确定。氧化百分比是主要峰(ox-1)和次要峰(ox-2)的峰面积总和的测量。
在一个实例中，PH20多肽如修饰的PH20多肽的解链温度可以通过在不同条件(例如变性条件或者其它贮存条件)下的动态光散射测量颗粒的流体动力学半径而确定。颗粒大小的增加及解链温度的降低表明透明质酸酶的变性和随后的聚集。
可用于确定本发明提供的共配制物中透明质酸酶的稳定性的本领域技术人员已知的其它方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹、核磁共振(NMR)光谱法、质谱法、圆二色性(CD)和基于染料的荧光测定法。
4.药效学/药动学
也可以使用动物模型和/或人对象在体内评定单独或与另一治疗剂组合给予PH20多肽如修饰的PH20多肽对任何给予的制剂的药动学和药效学性质的作用，如在临床实验中进行。药动学或药效学研究可以使用动物模型进行或者在研究期间用患者进行，给予PH20多肽或修饰的PH20多肽。
动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠和非人灵长类动物模型，如食蟹猴或者猕猴。在一些情况中，药动学或药效学研究使用健康动物进行。在其它实例中，该研究使用认为应予以乙酰透明质酸治疗的疾病动物模型进行，如任何乙酰透明质酸相关疾病或者病症动物模型如肿瘤模型。
PH20多肽如修饰的PH20多肽的药动学性质可以通过在给予后测量如下这样的参数评定：最大(峰)浓度(Cmax)，峰值时间(即最大浓度出现时，Tmax)，最小浓度(即剂量之间最小浓度，Cmin)，消除半衰期(T1/2)以及曲线下面积(即在时间对应浓度绘图产生的曲线下的面积，AUC)。透明质酸酶的绝对生物利用度通过对比在皮下输送后透明质酸酶的曲线下面积(AUCsc)与静脉内输送后的透明质酸酶的AUC(AUCiv)而确定。绝对生物利用度(F)可以使用下式计算：F＝([AUC]sc×剂量sc)/([AUC]iv×剂量iv)。在药动学研究中可以给予一系列剂量和不同的给药频率以评估增加或者降低剂量中酶如修饰的PH20多肽的浓度的影响。
H.治疗方法和组合治疗
本发明提供了本发明提供的任何修饰的PH20多肽的方法和用途，所述修饰的PH20多肽基于其降解糖胺聚糖如乙酰透明质酸的能力而呈现透明质酸酶活性。由于这种活性，修饰的PH20多肽可用作播散因子以增加皮下给予的治疗剂的输送和/或生物利用度。任何治疗剂包括但不限于肽、蛋白质、小分子药物、核酸或病毒的输送均可以通过与本发明提供的修饰的PH20多肽共同给予而促进或增强。例如，修饰的PH20多肽可用于增加治疗剂如抗体(例如单克隆抗体)、细胞因子、免疫球蛋白、胰岛素或凝血因子输送至希望的部位，如通过增加化疗剂渗透进入实体肿瘤中。修饰的PH20多肽也可以用于治疗乙酰透明质酸疾病或病症，其特征在于乙酰透明质酸的过量或积聚。例如，本发明提供的修饰的PH20多肽可用于治疗肿瘤，治疗脑中糖胺聚糖积聚，治疗心血管疾病，治疗眼科疾病，治疗肺部疾病，治疗蜂窝组织，和/或治疗增殖性疾病。
修饰的PH20多肽的其它方法和用途包括本领域技术人员已知的任何方法和用途。例如，已经制备了各种形式的PH20透明质酸酶并已经许可在人体中治疗性应用。例如，动物衍生的透明质酸酶制备物包括(ISTAPharmaceuticals)，一种纯化的绵羊睾丸透明质酸酶，及(Amphastar Pharmaceuticals)，一种牛睾丸透明质酸酶。(HalozymeTherapeutics)是人重组透明质酸酶，通过遗传工程化的含有编码可溶的rHuPH20的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生(见例如美国专利号7,767,429)。透明质酸酶的许可的治疗性应用包括用作佐剂以增加皮下灌注术(皮下液体给予)的其它治疗剂的吸收和分散，及用作皮下尿路造影术中的辅助剂以改善造影剂的再吸收。除了这些指示之外，透明质酸酶可用作治疗剂或化妆品以治疗另外的疾病和病症。例如，透明质酸酶通常用于例如在眼科手术之前局部麻醉中的球周阻滞。所述酶的存在使得不需要另外的阻滞并减少了运动不能(丧失眼球运动)发生的时间。球周和sub-Tenon阻滞是透明质酸酶对于眼科手术最常用的应用。透明质酸酶在美容手术如眼睑成形术和整容术中也可以促进运动不能。应理解本发明提供的可溶的PH20透明质酸酶包括esPH20透明质酸酶可用于使用PH20透明质酸酶的任何治疗方法或组合治疗中(见例如美国公开号US20040268425；US20050260186；US20060104968；及美国申请系列号12/381,844,公开为美国公开号US20100074885；12/386,249,公开为美国公开号US20090311237；12/387,225,公开为美国公开号US20090304665；及12/386,222,公开为美国公开号US2010003238，每个专利均以其全部内容并入本文作参考)。
举例的非限制性方法和用途在如下章节中描述。
1.输送治疗剂的方法
如上所述，透明质酸酶是一种播散或扩散物质，其通过水解透明质酸(在结缔组织的细胞内基质中发现的一种多糖)及某些特定组织如脐带或玻璃体而修饰结缔组织的通透性。当无播散因子存在时，皮下注射的材料如药物、蛋白质、肽和核酸非常缓慢地扩散。然而，与透明质酸酶一起注射，可以导致迅速扩散。扩散速度与酶量成正比，扩散程度与溶液体积成正比。
本发明提供的修饰的PH20多肽可用于促进或增强在体内输送物质和分子至任何的多种哺乳动物组织中。其可用于促进扩散，并因此促进小分子药物制剂及较大分子药物制剂如蛋白质、核酸及核糖核酸以及可含有包括但不限于核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、基于脂质的分子和药物等成分组合的大分子组合物的输送(见例如美国公开号US20040268425；US20050260186；及US20060104968)。修饰的PH20多肽可以与治疗剂共同给予和/或共同配制以改良共配制或共给予的物质的生物利用度以及药动学(PK)和/或药效学(PD)特性。可以通过使用可溶的PH20如esPH20改良的PK/PD参数包括这样的测量：Cmax(在例如血流中吸收后达到的物质最大浓度)，Tmax(达到最大浓度需要的时间)，T1/2(浓度衰退一半需要的时间)，Cmin(在代谢和排泄后物质的最小浓度)，AUC(浓度对时间曲线下面积，生物利用度总量的测量)，感兴趣的各个组织中的浓度(包括例如达到所需浓度的速度，总体水平，及维持希望的水平的持续时间)，及Emax(达到的最大作用)。
本发明提供的治疗方法包括与治疗治疗剂能够治疗的疾病或病症的治疗剂的组合治疗。改善和/或另外减轻疾病或病症的严重程度的任何治疗剂均可以与本发明提供的修饰的PH20多肽组合以增加这种治疗剂的生物利用度。特别地，本发明提供的修饰的PH20多肽可用于如下述每个专利申请及所有组合中代替其揭示的透明质酸酶或乙酰透明质酸降解酶：例如美国公开号US20040268425；US20050260186；US20060104968和美国申请系列号12/381,844,公开为美国公开号US20100074885；12/386,249,公开为美国公开号US20090311237；12/387,225,公开为美国公开号US20090304665；及12/386,222,公开为美国公开号US2010003238。
修饰的PH20多肽可以在所述治疗剂制备物之前、随后、间歇或同时给予。通常，修饰的PH20多肽在给予所述治疗剂制备物之前或同时给予以允许PH20降解细胞间隙中的透明质酸。所述PH20可以在与给予治疗分子不同的部位给予，或者可溶的PH20可以在与给予治疗分子相同的部位给予。
可以与透明质酸酶一起给予的举例的药物、治疗剂和化妆品及分子包括但不限于化疗剂或抗癌剂、止痛剂、抗生素、抗炎剂、抗微生物剂、杀阿米巴虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、生物杀灭剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药物、避孕药、化妆品或美容剂、减充血剂、利尿剂、抑郁剂、诊断剂、电解剂、催眠药、激素制剂、高血糖制剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼部用药、拟副交感神经剂、精神兴奋剂、镇静剂、睡眠诱导剂、拟交感神经剂、安定剂、尿路用药、阴道制剂、杀病毒剂、维生素制剂、非类固醇抗炎剂、或者血管紧张素转换酶抑制剂，及其任何组合。特别地，治疗剂包括抗体，包括单克隆抗体，二磷酸盐/酯，胰岛素，凝血因子，细胞因子和免疫球蛋白。
例如，本发明提供的修饰的PH20多肽可用于增加化疗剂的输送。透明质酸酶也可以用于增强化疗剂的活性和/或化疗剂至肿瘤的易达性(Schulleret al.,1991,Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.32:173,abstract no.1034；Czejka etal.,1990,Pharmazie 45:H.9；Baumgartner et al.(1988)Reg.Cancer Treat.1:55-58；Zanker et al.(1986)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27:390)。化疗与透明质酸酶的组合在治疗多种癌症中是有效的，所述癌症包括膀胱癌(Hornet al.,1985,J.Surg.Oncol.28:304-307)、鳞状细胞癌(Kohno et al.,94,J.Cancer Res.Oncol.120:293-297)、乳腺癌(Beckenlehner et al.,1992,J.CancerRes.Oncol.118:591-596)以及胃肠道癌(Scheithauer et al.,1988,AnticancerRes.8:391-396)。在这个实例中，修饰的PH20透明质酸酶增强化疗剂或其它抗癌剂渗透进入实体肿瘤中，从而治疗该疾病。
含有可溶PH20的组合物可以与抗癌剂一起经肿瘤内注射或者静脉内注射针对扩散的癌或者难以达到的肿瘤。抗癌剂可以是化疗剂、抗体、肽或基因治疗载体、病毒或DNA。另外，透明质酸酶可以用于募集肿瘤细胞进入循环库，用于敏化已获得多药物抗性的先前耐药性肿瘤(St Croix et al.,(1998)Cancer Lett September 131(1):35-44)。
可以在给予可溶PH20如esPH20之后、同时或之前给予的举例的抗癌剂包括但不限于阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式-视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；Banoxantrones；Batabulins；巴马司他；BCG Live；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；比生群；Bisnafide Dimesylates；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；Canertinibs；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀与聚苯丙生；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；Ciplactin；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素脂质体；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素2；右尼古地平；Dexonas；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；地那林；Disermolides；多西他赛；Dofequidars；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射液；多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；Edotecarins；依氟鸟氨酸；依拉克达；依利奈法德；Elliott's B溶液；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依泊汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌氮芥；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；加柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/奥佐米星；吉罗酚；Gimatecans；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；醋酸戈舍瑞林；羟基脲；替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；Indisulams；双丙氧亚胺醌；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2及其它白介素(包括重组白介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；异丙铂；伊立替康；伊索拉定；Ixabepilones；酮曲沙；L-阿拉诺新；兰瑞肽；Lapatinibs；来多蒽琼；来曲唑；甲酰四氢叶酸；亮丙瑞林；亮丙瑞林(Leuprolides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNUs；洛莫司汀；法尼醇蛋白转移酶抑制剂；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥(Mechlorethamines)；氮芥(Mechlorethamines/Nitrogen mustards)；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑L-PAM；美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；美替辛德；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨啶；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；苯丙酸诺龙；奈达铂；奈拉滨；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；若莫单抗；诺拉霉素；诺拉曲塞；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；奥替拉西；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；帕玛二磷酸；Patupilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；Pelitrexols；培美曲塞；溴新斯的明；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；Picoplatins；吡奈非特；哌泊溴烷；派泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；普卡霉素光辉霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟菲尔钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；沙铂；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西左非兰；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；磷乙天冬氨酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；角鲨胺；链黑霉素；链伐立星；链脲菌素；磺磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；6-TG；Tacedinalines；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替派；硫米嘌呤；噻唑羧胺核苷；噻氯米索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743)；曲妥珠单抗；曲托龙；维A酸/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；Triplatin Tetranitrates；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；乌拉莫司汀；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄链霉素A(胍甲环素)；折尼铂；亚苄维C[2-H]；净司他丁；唑来膦酸；佐柔比星；及Zosuquidars，例如：
阿地白介素(例如)；阿仑珠单抗(例如)；阿利维A酸(例如)；别嘌呤醇(例如)；六甲蜜胺(例如)；氨磷汀(例如)；阿那曲唑(例如)；三氧化二砷(例如)；天冬酰胺酶(例如)；BCG Live(例如BCG)；贝沙罗汀(例如)；贝伐珠单抗()；博来霉素(例如)；白消安静脉内(例如)；白消安口服药(例如MYLERANTM)；卡普睾酮(例如)；卡培他滨(例如)；卡铂(例如)；卡莫司汀(例如)；卡莫司汀与聚苯丙生(例如Wafer)；塞来考昔(例如)；苯丁酸氮芥(例如)；顺铂(例如)；克拉屈滨(例如)；环磷酰胺(例如)；阿糖胞苷(例如)；阿糖胞苷脂质体(例如)；达卡巴嗪(例如DTIC-Domeυ):更生霉素(例如)；达依泊汀α(例如)；柔红霉素脂质体例如)；柔红霉素/道诺霉素(例如)；地尼白介素2(例如)；右雷佐生(例如)；多西他赛(例如)；多柔比星(例如)；多柔比星脂质体，包括多柔比星HCL脂质体注射液(例如)；丙酸屈他雄酮(例如和注射液)；Elliott's B溶液(例如Elliott's B)；表柔比星(例如)；阿法依泊汀(例如)；雌氮芥(例如)；磷酸依托泊苷(例如)；依托泊苷VP-16(例如)；依西美坦(例如)；非格司亭(例如)；氟尿苷(例如)；氟达拉滨(例如)；氟尿嘧啶包括5-FU(例如)；氟维司群(例如)；吉西他滨(例如)；吉妥珠单抗/奥佐米星(例如)；醋酸戈舍瑞林(例如)；羟基脲(例如)；替伊莫单抗(例如)；伊达比星(例如)；异环磷酰胺(例如)；甲磺酸伊马替尼(例如)；干扰素α-2a(例如)；干扰素α-2b(例如INTRON)；伊立替康(例如)；来曲唑(例如)；甲酰四氢叶酸(例如 )；左旋咪唑(例如)；洛莫司汀/CCNU(例如)；氮芥(例如)；醋酸甲地孕酮(例如)；美法仑/L-PAM(例如)；巯嘌呤包括6-MP(例如)；美司钠(例如)；甲氨蝶呤；甲氧沙林(例如)；丝裂霉素C(例如)；米托坦(例如)；米托蒽醌(例如)；苯丙酸诺龙(例如)；若莫单抗(例如)；奥普瑞白介素(例如)；奥沙利铂(例如)；紫杉醇(例如)；帕玛二磷酸(例如)；培加酶(例如)；培门冬酶(例如)；培非司亭(例如)；喷司他丁(例如)；哌泊溴烷(例如)；普卡霉素/光辉霉素(例如)；卟吩姆钠(例如)；丙卡巴肼(例如)；奎纳克林(例如)；拉布立酶(例如)；利妥昔单抗(例如)；沙格司亭(例如)；链脲菌素(例如)；苹果酸舒尼替尼(例如)；滑石(例如)；他莫昔芬(例如)；替莫唑胺(例如)；替尼泊苷/VM-26(例如)；睾内酯(例如)；硫鸟嘌呤包括6-TG；噻替派(例如)；托泊替康(例如)；托瑞米芬(例如)；托西莫单抗(例如)；曲妥珠单抗(例如)；维A酸/ATRA(例如)；乌拉莫司汀；戊柔比星(例如)；长春碱(例如)；长春新碱(例如)；长春瑞滨(例如)；和唑来膦酸(例如)。
例如，举例的抗生素包括但不限于氨基糖苷类；氯霉素类；安莎霉素类；碳头孢烯类；碳青霉烯类；头孢菌素类或头孢烯类；头霉素类；Clavams；环脂肽类；二氨基嘧啶类；酮内酯类；林可胺类；大环内酯类；单菌胺类；硝基呋喃类；氧头孢烯类；恶唑烷酮类；表霉烯类,噻烯霉素类和各种β-内酰胺类；青霉素类；多肽类抗生素；喹诺酮类；磺胺类；砜类；四环素类；及其它抗生素(如氯福克酚,夫西地酸,海克西定,乌洛托品,呋喃妥因，硝羟喹啉,利替培南,牛磺罗定,Xibomols)。
举例的治疗剂还包括凝血因子或其它血液修饰剂如抗血友病因子、抗抑制剂凝血复合物、抗凝血酶III、凝血因子V、凝血因子VIII、凝血因子IX、血浆蛋白质级分、von Willebrand因子；抗血小板制剂(包括例如阿昔单抗,阿那格雷,西洛他唑,硫酸氢氯吡格雷,双嘧达莫,依前列醇,依替巴肽,替罗非班；集落刺激因子(CSF)(包括例如粒细胞CSF和粒细胞巨噬细胞CSF)；红细胞生成刺激物(包括例如红细胞生成素如达依泊汀α)及阿法依泊汀；止血剂和白蛋白(包括例如抑肽酶、抗血友病因子与血浆醋酸去氨加压素的组合，及白蛋白)；免疫启动子以及乙型肝炎免疫球蛋白；凝血酶抑制剂(包括例如直接凝血酶抑制剂和来匹卢定)，及屈曲可净α；抗凝血剂(包括例如达肝素,依诺肝素及其它肝素，及华法林)。
举例的抗体或其它治疗剂包括但不限于西妥昔单抗(IMC-C225；)；曲妥珠单抗利妥昔单抗贝伐珠单抗阿仑珠单抗 Panitumumab(ABX-EGF；)；RanibizumabIbritumomab；Ibritumomab tiuxetan托西莫单抗；碘I131托西莫单抗Catumaxomab吉妥珠单抗；吉妥珠单抗奥佐米星阿巴他塞(CTLA4-Ig；)；Belatacept(L104EA29YIg；LEA29Y；LEA)；Ipilimumab(MDX-010；MDX-101)；Tremelimumab(ticilimumab；CP-675,206)；PRS-010(见例如US20090042785)；PRS-050(US7585940；US20090305982)；Aflibercept(VEGF Trap,AVE005；Holash et al.,(2002)PNAS 99:11393-11398)；Volociximab(M200)；F200(嵌合(人/鼠)Volociximab(M200)的IgG4 Fab片段)；MORAb-009小鼠/人嵌合IgG1(US20050054048)；可溶的融合蛋白：与截短的假单胞菌外毒素A连接的抗间皮素Fv(SS1P(CAT-5001)；US20070189962)；Cixutumumab(IMC-A12)；Nimotuzumab(h-R3)(Spicer(2005)Curr Opin Mol Ther 7:182-191)；Zalutumumab(HuMax-EGFR；Lammerts van Bueren et al.(2008)PNAS 105:6109-14)；NecitumumabIMC-11F8(Li et al.(2008)Structure 16:216-227)；Sym004(Pedersen et al.2010Cancer Res 70:588-597)；及mAb-425。
特别地，治疗剂包括但不限于免疫球蛋白，干扰素β，干扰素α-2a、干扰素α-1、干扰素α-n3、干扰素β-1、干扰素β-1a、干扰素γ-lb、Peg-干扰素α-2及Peg干扰素α-2b、胰岛素、二磷酸盐(例如帕玛二磷酸或唑来膦酸)、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体和贝伐珠单抗。
可以与本发明提供的修饰的PH2-0多肽组合共同给予和/或共同配制的其它举例的治疗剂包括但不限于阿达木单抗、阿加糖酶β、阿莱法塞、氨苄青霉素、阿那白滞素、抗脊髓灰质炎疫苗、抗胸腺细胞、阿奇霉素、贝卡普勒明、卡泊芬净、头孢唑林、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、西妥昔单抗、西司他丁、克拉维酸、克林霉素、达依泊汀α、达克珠单抗、白喉、白喉抗毒素、白喉类毒素、依法珠单抗、肾上腺素、促红细胞生成素α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促卵泡素α、促卵泡素β、磷苯妥英、钆双胺、Gadopentetates、加替沙星、格拉默、GM-CSF、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司琼、流感嗜血杆菌B、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、替伊莫单抗、Ibritumomabs、Tiuxetans、免疫球蛋白、流感嗜血杆菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔单抗、胰岛素、甘精胰岛素、干扰素、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-1、干扰素α-n3、干扰素β、干扰素β-1a、干扰素γ、干扰素α-共有、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉罗尼酶、左氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、劳拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹-腮腺炎-风疹病毒疫苗、风疹疫苗、甲羟孕酮、美罗培南、甲泼尼龙、咪达唑仑、吗啡、奥曲肽、奥马珠单抗、昂丹司琼、帕利珠单抗、泮托拉唑、培门冬酶、培非司亭、Peg-干扰素α-2a、Peg-干扰素α-2b、培维索孟、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗和肺炎球菌缀合物疫苗、异丙嗪、瑞替普酶、生长激素、舒巴坦、舒马普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破伤风纯化类毒素、替卡西林、托西莫单抗、曲安西龙、曲安奈德、己曲安奈德、万古霉素、水痘带状疱疹免疫球蛋白、水痘疫苗、其它疫苗、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、砒霜、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、BCG Live、贝沙罗汀、博来霉素、白消安、静脉内白消安、口服白消安、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀与聚苯丙生、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素脂质体、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素2、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、丙酸屈他雄酮、Elliott's B溶液、表柔比星、阿法依泊汀、雌氮芥、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16、依西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉妥珠单抗、奥佐米星、吉妥珠单抗奥佐米星、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNU、氮芥(Mechlorethamines)、氮芥(Nitrogen mustards)、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、L-PAM、巯嘌呤、6-巯嘌呤、美司钠、氨甲喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、苯丙酸诺龙、若莫单抗、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕玛二磷酸、培加酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、光辉霉素、卟菲尔钠、卟吩姆钠、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链脲菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、三亚乙基硫代磷酰胺(噻替派)、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维a酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、唑来膦酸、阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、视黄酸、阿利维A酸、9-顺式-视黄酸、Alvocidibs、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那昔酮、安西他滨、氨茴霉素、Apaziquones、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、Banoxantrones、Batabulins、巴马司他、贝那昔滨、苯达莫司汀、苯佐替派、比卡鲁胺、比他舍平、比立考达、比生群、Bisnafide Dimesylates、比折来新、硼替佐米、布喹那、溴匹立明、布度钛、放线菌素C、Canertinibs、卡醋胺、卡贝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、西马多丁、苯丁酸氮芥、塞奥罗奈、西罗霉素、克兰氟脲、氯法拉滨、克立那托、地西他滨、右尼古地平、右奥马铂、地扎胍宁、地吖醌、Dibrospidiums、地诺孕素、地那林、Disermolides、Dofequidars、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、达佐霉素、依考莫司汀、依达曲沙、Edotecarins、依氟鸟氨酸、依拉克达、依利奈法德、依沙芦星、乙嘧替氟、恩洛铂、恩普氨酯、Enzastaurins、依匹哌啶、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依托格鲁、氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉滨、芬维a胺、氟甲睾酮、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他滨、吉罗酚、Gimatecans、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷酰胺、伊莫福新、伊洛马司他、伊美克、英丙舒凡、Indisulams、双丙氧亚胺醌、白介素、白介素-2s、重组白介素、茚托利辛、碘苄胍、异丙铂、伊索拉定、Ixabepilones、酮曲沙、L-阿拉诺新、兰瑞肽、Lapatinibs、来多蒽琼、亮丙瑞林、亮丙瑞林、来沙骨化醇、利阿唑、洛铂、洛美曲索、法尼醇蛋白转移酶抑制剂、洛索蒽醌、勒托替康、马磷酰胺、甘露舒凡、马立马司他、马索罗酚、美坦辛、氮芥、美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯氨啶、美妥替哌、米帕、米泼昔芬、米索硝唑、米丁度胺、Mitocarcins、丝裂红素、米托拉酮、米托洁林、米托胍腙、米托马星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立宾、莫法罗汀、莫哌达醇、Mubritinibs、霉酚酸、奈达铂、Neizarabines、奈莫柔比星、硝氨丙吖啶、诺考达唑、诺拉霉素、诺拉曲塞、Nortopixantrones、奥马铂、Ortataxels、奥替拉西、奥昔舒仑、氧芬胂、Patupilones、培得星、培利霉素、Pelitrexols、培美曲塞、溴新斯的明、培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、Picoplatins、吡奈非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡罗蒽醌、Pixantrones、Plevitrexeds、普洛美坦、泊非霉素、波尼莫司汀、普罗帕脒、螺丙醇、嘌嘧替派、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、罗谷亚胺、罗喹美克、链黑霉素、Sabarubicins、沙芬戈、沙铂、司铂、司莫司汀、辛曲秦、西左非兰、索布佐生、索拉非尼、Sparfosates、磷乙天冬氨酸、司帕霉素、锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、角鲨胺、链黑霉素、链伐立星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、Tacedinalines、他利霉素、他莫司汀、Tariquidars、牛磺莫司汀、Tecogalans、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替罗昔隆、硫咪嘌呤、硫咪嘌呤、噻唑羧胺核苷、噻氯米索、替洛隆、汀考达、噻莫西酸、替拉扎明、Topixantrones、曲贝替定、海鞘素743、曲托龙、曲西立滨、曲洛司坦、三甲曲沙、Triplatin Tetranitrates、曲普瑞林、曲磷胺、妥布氯唑、乌苯美司、乌瑞替派、伐司朴达、伐普肽、维替泊芬、长春碱、长春地辛、长春匹定、长春氟宁、长春米特、长春甘酯、长春西醇、长春罗新、长春罗定、长春曲醇、长春利定、伏氯唑、黄链霉素A、胍甲环素、折尼铂、亚苄维c[2-H]、净司他丁、佐柔比星、Zosuquidars、乙酰唑胺、阿昔洛韦、胆影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、变应原浸出物、α1-蛋白酶抑制剂、前列地尔、阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶碱、阿米替林、异戊巴比妥、氨力农、镇痛药、抗-脊髓灰质炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破伤风免疫球蛋白、破伤风疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精氨酸、抗坏血酸、阿替洛尔、阿曲库铵、阿托品、金硫葡糖、硫唑嘌呤、氨曲南、杆菌肽、巴氯芬、巴利昔单抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、比伐卢定、肉毒抗毒素、溴苄铵、布美他尼、布比卡因、丁丙诺啡、布托啡诺、降钙素、骨化三醇、钙、卷曲霉素、卡波前列素、肉碱、头孢孟多、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑肟、头孢呋辛、氯霉素、氯普鲁卡因、氯喹、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸软骨素、绒促性素α、铬、西多福韦、西咪替丁、环丙沙星、顺阿曲库铵、可乐定、可待因、秋水仙碱、粘菌素、胶原、Corticorelin ovine triflutates、促皮质素、二十四肽促皮质素、氰钴胺、环孢素、半胱氨酸、达昔单抗、达福普汀、达肝素、达那肝素、丹曲林、去铁胺、去氨加压素、地塞米松、右美托咪定、右泛醇、右旋糖酐、右旋糖酐铁、泛影酸、地西泮、二氮嗪、双环维林、Digibinds、地高辛、双氢麦角胺、地尔硫卓、苯海拉明、双嘧达莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯铵、多沙普仑、度骨化醇、多西环素、氟哌利多、二羟丙茶碱、依地酸、依酚氯铵、依那普利拉、麻黄碱、依前列醇、麦角钙化醇、麦角新碱、厄他培南、红霉素、艾司洛尔、雌二醇、Estrogenics、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、羟乙磷酸、依托咪酯、因子VIII、法莫替丁、非诺多泮、芬太尼、氟马西尼、荧光素、氟奋乃静、叶酸、甲吡唑、福米韦生、磺达肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、钆特醇、钆弗塞胺、更昔洛韦、庆大霉素、高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆溴铵、戈那瑞林、绒膜促性腺激素、嗜血杆菌B多糖、氯化血红素、Herbals、组胺、肼苯哒嗪、氢化可的松、氢吗啡酮、羟钴胺、羟嗪、莨菪碱、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺、碘拉酸、碘克沙酸、碘昔兰、异烟肼、异丙肾上腺素、日本脑炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉贝洛尔、来匹卢定、左布比卡因、左甲状腺素、林可霉素、碘塞罗宁、促黄体激素、莱姆病疫苗、锰福地吡、Manthtols、脑膜炎球菌多糖疫苗、哌替啶、甲哌卡因、美索达嗪、间羟胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲基多巴类、甲基麦角新碱、甲氧氯普胺、美托洛尔、甲硝唑、米诺环素、米伐克龙、鱼肝油酸、莫西沙星、莫罗单抗-CD3、麦考酚酸吗乙酯、萘夫西林、纳布啡、纳美芬、纳洛酮、新斯的明、烟酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普钠、去甲肾上腺素、奥芬那君、苯唑西林、羟吗啡酮、土霉素、缩宫素、潘可龙、泛醇、泛酸、罂粟碱、PEG干扰素α(例如干扰素α2a或2b)、青霉素G、喷他脒、喷他佐辛、戊巴比妥、全氟丙烷、奋乃静、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧肾上腺素、苯妥英、毒扁豆碱、植物甲萘醌、多粘菌素B、解磷定、丙胺卡因、普鲁卡因胺、普鲁卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛尔、吡啶斯的明氢氧化物、维生素B6、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁、瑞芬太尼、核黄素、利福平、罗哌卡因、钐、东莨菪碱、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人蛋氨生长素、壮观霉素、链激酶、链霉素、琥珀酰胆碱、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他罗利姆、特布他林、特立帕肽、睾酮、破伤风抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸盐/酯、茶碱、硫胺素、硫乙拉嗪、硫喷妥、促甲状腺激素、亭扎肝素、替罗非班、妥布霉素、妥拉唑林、甲苯磺丁脲、托拉塞米、氨甲环酸、曲罗尼尔、三氟拉嗪、曲美苄胺、甲氧苄啶、氨丁三醇、结核菌素、伤寒疫苗、尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸、加压素、维库溴铵、维拉帕米、伏立康唑、华法林、黄热病疫苗、齐多夫定、锌、盐酸齐拉西酮、阿克拉霉素、放线菌素、阿霉素、偶氮丝氨酸、6-氮尿苷、嗜癌素、色霉素、二甲叶酸、6-叠氮-5-氧-L-正亮氨酸、依诺他滨、氟尿苷、橄榄霉素、吡柔比星、吡曲克辛、蝶罗呤、替加氟、杀结核菌素、阿替普酶、阿西莫单抗、贝伐珠单抗、A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、卡罗单抗喷地肽、达克珠单抗、阿法链道酶、替加色罗α、戊酸印西洛马及碘-131。
胰岛素的输送
本发明提供的方法包括共同给予修饰的PH20多肽与胰岛素以增加胰岛素如速效胰岛素的皮下输送(见例如美国专利号7,767,429；美国专利号7,846,431；美国公开号US20090304665；和美国申请系列号13/507,263；13/507,262和13/507,261)。这种方法包括直接给予及泵和持续输注方法，包括开放和密闭泵系统。例如，可以与本发明提供的修饰的PH20透明质酸酶给予的胰岛素例如是速效胰岛素或胰岛素类似物。例如，共同给予的胰岛素包括普通胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、赖谷胰岛素或者其它相似的类似物变体。举例的胰岛素是含有SEQ ID NO:862所示A链和SEQ IDNO:863所示B链的胰岛素或者与SEQ ID NO:862和863(A和B链)所示人胰岛素相比含有一或多个氨基酸修饰的变体。例如，举例的胰岛素类似物为本领域技术人员已知，包括但不限于如SEQ ID NO:862所示(A-链)及具有SEQ ID NO:865-867任一所示B链的那些。
所述共配制物可以在皮下给予以治疗可以用胰岛素治疗的任何病症。治疗性应用包括但不限于治疗1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病，以及用于垂危患者的血糖控制。例如，速效胰岛素与乙酰透明质酸降解酶的共配制物可以分立的剂量在皮下在进餐之前给予给予，如通过注射器或胰岛素笔，在糖尿病对象中与膳食胰岛素治疗一样，以实现血糖控制。所述共配制物也可以使用胰岛素泵或者在闭环系统中经皮下或腹膜内给予，以从白天至夜间持续控制血液葡萄糖水平和/或控制餐后血糖波动(glycemicexcursions)。主治医生可以鉴别这种疾病或病症。
对于任何可使用或已经使用速效胰岛素及其它药物和治疗也可利用的疾病或病症包括所有上述例证的那些疾病或病症，所述共配制物可以组合使用。根据治疗的疾病或病症，举例的组合包括但不限于与抗糖尿病药组合，包括但不限于磺脲类、双胍类、氯茴苯酸类、噻唑烷二酮类、α-葡糖苷酶抑制剂、肽类似物(包括高血糖素样肽(GLP)类似物和抑胃肽(GIP)类似物和DPP-4抑制剂。在另一实例中，速效胰岛素与本文描述的修饰的PH20多肽的共同配制物可以与一或多种其它胰岛素包括速效胰岛素和基础作用胰岛素组合，在后者之前、间歇或随后给予。
2.乙酰透明质酸相关疾病和病症(例如肿瘤)的方法
特别地，PH20透明质酸酶可用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或病症。典型地，乙酰透明质酸相关疾病和病症与在组织、细胞或体液(例如肿瘤组织或肿瘤相关组织，血液或组织间隙)中与对照如另一组织、细胞或体液中相比升高的乙酰透明质酸表达相关。升高的乙酰透明质酸表达与正常组织、细胞或体液相比可以升高，所述正常组织、细胞或体液例如是与待检测样品类似的组织、细胞或体液，但是分离自不同对象如正常对象(即不具有疾病或病症，或者不具有待检测对象所具有类型的疾病或病症)，例如不具有乙酰透明质酸相关疾病或病症的对象。升高的乙酰透明质酸表达与来自另一对象的类似组织相比可以是升高的，所述另一对象具有相似疾病或病症，但是其疾病不如前者严重和/或不是乙酰透明质酸相关的或者表达相对较低的乙酰透明质酸且因此与乙酰透明质酸相关程度较低。例如，待检测的对象可以是具有乙酰透明质酸相关癌症的对象，其中在组织、细胞或体液中的HA量与具有低严重度癌症如早期、分化的或其它类型癌症的对象相比相对升高。在另一实例中，所述细胞、组织或体液与具有已知量或相对量HA的对照样品相比含有升高水平的乙酰透明质酸，所述对照样品如体液、组织、提取物(例如细胞或核提取物)、核酸或肽制备物、细胞系、活检组织、标准或其它样品，例如已知表达相对低水平HA样品如肿瘤细胞系，如本文所述表达低水平HA的举例的肿瘤细胞系，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCI H460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系，以及来自使用这种细胞系产生的肿瘤模型的肿瘤。
乙酰透明质酸相关疾病和病症包括与高组织间隙液压相关的那些，如椎间盘压力，增殖性疾病如癌症和良性前列腺增生和水肿。水肿可得自或者在例如器官移植、卒中和脑创伤中出现。增殖性疾病包括但不限于癌症、平滑肌细胞增殖、全身性硬化、肝硬化、成人型呼吸窘迫综合征、特发性心肌病、红斑狼疮、视网膜病如糖尿病视网膜病变或其它视网膜病变、心组织增生(cardiac hyperplasia)、生殖系统相关病症如良性前列腺增生(BPH)和卵巢囊肿、肺纤维化、子宫内膜异位、纤维瘤病、错构瘤、淋巴管瘤病、类肉瘤病、硬纤维瘤。癌症包括实体癌和淋巴癌/血癌及转移癌，以及未分化肿瘤。可治疗的肿瘤与相同组织类型的非癌组织相比或者与相同肿瘤类型的非转移肿瘤相比典型呈现乙酰透明质酸的细胞和/或基质表达。癌症包括卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、其它胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌的任一或多种。
本发明提供的修饰的PH20多肽如其PEG化形式可用于治疗肿瘤。因此，除了其间接抗癌作用之外，透明质酸酶还具有直接抗肿瘤发生的作用。透明质酸酶阻止移植至小鼠的肿瘤生长(De Maeyer et al.,1992,Int.J.Cancer 51:657-660)及在暴露于致癌物时抑制肿瘤形成(Pawlowski et al.,1979,Int.J.Cancer 23:105-109；Haberman et al.,1981,Proceedings of the 17thAnnual Meeting of the American Society of Clinical Oncology,Washington,D.C.,22:105,abstract no.415)。PH20透明质酸酶已示出治疗多种肿瘤(见例如美国公开号US2010/0003238和美国申请系列号13/135,817,公开为美国公开号US20120020951)。
乙酰透明质酸富集癌症可以是其中癌细胞产生HALO的癌症、乙酰透明质酸表达升高(通过免疫染色确定，例如对肿瘤切片的组织学染色)的癌症、HAS2(乙酰透明质酸合成酶2)升高的癌症、在体外不产生透明质酸酶(HYAL1)的癌症。乙酰透明质酸富集癌症可以通过评定乙酰透明质酸表达的任何方法及评定蛋白质/mRNA表达的其它已知方法鉴别。
已经鉴别了一些乙酰透明质酸富集癌症。在一些情况中，乙酰透明质酸表达与预后不佳相关，所述预后不佳例如降低的生存率和/或无复发生存率、转移、血管发生、癌细胞侵入其它组织/区域，及其它预后不佳的指示。例如在乙酰透明质酸富集肿瘤中已经观测到这种相关性，所述肿瘤包括卵巢癌、SCC、ISC、前列腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌(见例如Anttila et al.,Cancer Research,60:150-155(2000)；Karvinen et al.,British Journal of Dermatology,148:86-94(2003)；Lipponen etal.,Eur.Journal of Cancer,849-856(2001)；Pirinen et al.,Int.J.Cancer:95:12-17(2001)；Auvinen et al.,American Journal of Pathology,156(2):529-536(2000)；Ropponen et al.,Cancer Research,58:342-347(1998))。因此，乙酰透明质酸富集癌症可以通过给予透明质酸酶如可溶的PH20治疗，以治疗癌症的一或多个症状。乙酰透明质酸富集肿瘤包括但不限于前列腺、乳腺、结肠、卵巢、胃、头颈及其它肿瘤和癌症的那些。
与过量糖胺聚糖相关的其它乙酰透明质酸相关的且可以用本发明提供的修饰的PH20多肽治疗的疾病或病症包括但不限于心血管疾病(例如在缺血再灌注后，在动脉硬化中)；眼玻璃体切除术和眼部疾病和病症(例如在液化眼玻璃体液方法中；降低手术后眼压；其它眼部手术方法如青光眼、玻璃体和视网膜手术，及在角膜移植中)；皮下灌注术(即将液体和电解质注入皮肤真皮中)；化妆应用(例如治疗蜂窝组织，“猪皮”水肿或“橘皮”水肿)；器官移植(例如与器官移植相关的组织间隙水中)；肺部疾病。
3.其它用途
在其治疗性应用的进一步实例中，本发明提供的修饰的PH20多肽可用于这样的目的：局部坏死的解毒剂，所述局部坏死来自坏死性物质如长春花碱的静脉旁注射(Few et al.(1987)Amer.J.Matern.Child Nurs.12,23-26)，神经节囊肿(ganglion cysts)的治疗(Paul et al.(1997)J Hand Surg.22(2):219-21)及由于静脉功能不全导致的组织坏死的治疗(Elder et al.(1980)Lancet 648-649)。修饰的PH20多肽也可以用于治疗神经节囊肿(也称为腕关节囊肿、Bible囊肿或背侧腱囊肿(tendon cyst))，其是手部最常见的软组织团块并且是在皮肤下触到的液体充填的液囊。
修饰的PH20多肽可以通过降解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)而用于治疗脊髓损伤。在脊髓损伤后，星形胶质细胞产生含有CSPG的神经胶质疤。CSPG在抑制轴突生长中起关键作用。另外，已显示在中枢神经系统(CNS)损伤后CSPG的表达增加。可溶的PH20还可以用于在已知为髓核化学溶解术的方法中治疗椎间盘突出。软骨素酶ABC是裂解如透明质酸酶等类似底物的酶，其可以诱导腰脊柱中的椎间盘内压降低。有三种类型的椎间盘损伤。突出的椎间盘是完整但凸出的一种。在挤出的椎间盘(extruded disk)中，纤维环(fibrous wrapper)已经破裂且NP已经露出，但是仍与椎间盘连接。在游离型(sequestered)椎间盘中，NP片段已破碎脱离椎间盘并且游离在椎管中。髓核化学溶解术通常对突出和脱出的椎间盘有效，但是对游离的椎间盘损伤无效。
4.避孕
本发明提供的修饰的PH20多肽可用作避孕应用中的疫苗。PH20存在于雄性生殖管道中，并在睾丸和附睾中表达，及存在于精子中。PH20在受精中通过促进精子进入未受精卵周围的堆积层(cumulus layer)而发挥作用。PH20在受精早期也能结合透明带上透明质酸(HA)。这种结合也起始了有助于顶体反应的细胞内信号传导。用PH20免疫已经示出在雄性豚鼠中是有效的避孕剂(Primakoff et al.(1988)Nature 335:543-546,Tung et al.(1997)Biol.Reprod.56:1133-1141)。也已经示出在雌性豚鼠中由于阻止精子与卵结合的抗PH20抗体的产生而是有效的避孕剂。在本发明的实施例中，修饰的PH20多肽可以是无活性的酶，如章节C.2所述。所述多肽可以直接给予或者可以作为重组病毒给予以输送抗原。
I.实施例
如下实施例只是例证本发明，不限制本发明的范围。
实施例1：重组人PH20透明质酸酶(rHuPH20)的产生
A.产生表达可溶性rHuPH20的细胞系
如公开的美国公开号US20110053247中所述产生命名为rHuPH20的重组人PH20透明质酸酶。简言之，使用pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)质粒(如SEQ ID NO:5所述)转染中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见例如美国专利号7,767,429和7,781,607及美国公开号2006-0104968)。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体含有pCI载体骨架(Promega)，编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482的DNA(SEQ ID NO:2)，来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)，以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架也包括编码β-内酰胺酶抗性基因的DNA(AmpR)，f1复制起点，巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区(CMV)，嵌合内含子，以及SV40晚期聚腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA含有位于编码人PH20的天然35个氨基酸信号序列的氨基酸位置1的甲硫氨酸的DNA之前的NheI位点和Kozak共有序列，以及位于编码相应于SEQ ID NO:2所示人PH20透明质酸酶的氨基酸位置482的酪氨酸的DNA之后的终止密码子，随后是BamHI限制位点。
生长在补加4mM谷氨酰胺和18mL/L Plurionic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的GIBCO修饰的CD-CHO培养基中的非转染的DG44 CHO细胞以0.5x106细胞/mL接种于摇瓶中，准备转染。细胞在增湿温箱中于5％CO2中在37℃下生长，以120rpm振荡。在转染之前测试指数生长的非转染DG44 CHO细胞的存活性。
沉淀非转染DG44 CHO细胞培养物的6千万个活细胞并在0.7ml 2x转染缓冲液(2x HeBS:40mM Hepes,pH 7.0,274mM NaCl,10mM KCl,1.4mM Na2HPO4,12mM右旋糖)中重悬至密度为2×107细胞。向每个等份重悬细胞中加入0.09mL(250μg)线性HZ24质粒(通过用Cla I(New EnglandBiolabs)过夜消化而线性化)，将所述细胞/DNA溶液转移进室温下的0.4cmgap BTX(Gentronics)电穿孔池中。用不混合质粒DNA的细胞进行阴性对照电穿孔。细胞/质粒混合物用330V和960μF或者350V和960μF的电容器放电进行电穿孔。
在电穿孔后从池中取出细胞，转移到补加4mM谷氨酰胺和18mL/LPlurionic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的5mL修饰的CD-CHO培养基中，在6孔组织培养平板的孔中不加选择而在增湿温箱中于5％CO2中在37℃下生长2天。
电穿孔后2天，从每孔中取出0.5mL组织培养基，使用实施例8所述的微量浊度测定测试透明质酸酶活性的存在。结果示于表6。
从组织培养孔收集来自转染2(350V)的细胞，计数并稀释至1×104-2×104活细胞/mL。将细胞悬液的0.1mL等份转移至5个96孔圆底组织培养平板的每个孔中。向含有细胞的孔中加入100微升含有4mM GlutaMAXTM-1补充物(GIBCOTM,Invitrogen Corporation)且不含次黄嘌呤和胸苷补充物的CD-CHO培养基(GIBCO)(终体积0.2mL)。从不加氨甲喋呤生长的5个平板中鉴别了10个克隆(表7)。
6个HZ24克隆悬浮于培养物中并作为单细胞悬液转移进摇瓶中。克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10用二维无限稀释策略铺板于96孔圆底组织培养平板中，其中细胞在平板中向下1:2稀释，横向1:3稀释，以最左上孔5000个细胞起始。稀释的克隆在每孔500个非转染DG44CHO细胞背景中生长，以提供必需的生长因子用于最初培养日子。每个亚克隆制备10个平板，其中5个平板含有50nM氨甲喋呤，5个平板不含氨甲喋呤。
克隆3D3产生24个可见亚克隆(13个来自无氨甲喋呤处理，11个来自50nM氨甲喋呤处理)。在来自24个亚克隆的8个的上清中测量到显著透明质酸酶活性(>50单位/mL)，将这8个亚克隆扩增进T-25组织培养瓶。分离自氨甲喋呤处理方案的克隆在50nM氨甲喋呤存在下扩增。克隆3D35M进一步在500nM氨甲喋呤中扩增，得到在摇瓶中产生超过1000单位/mL的透明质酸酶活性的克隆(克隆3D35M；或者Gen1 3D35M)。然后制备3D35M细胞的主细胞库(MCB)。
B.含有可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞的产生
将实施例1.A所述的Gen1 3D35M细胞系适应更高氨甲喋呤水平以产生第2代(Gen2)克隆。将3D35M细胞从建立的含有氨甲喋呤的培养物接种到含有4mM GlutaMAX-1TM和1.0μM氨甲喋呤的CD CHO培养基中。通过在46天期间在37℃、7％CO2增湿温箱中生长和传代9次而使细胞适应更高氨甲喋呤水平。通过在含有具有2.0μM氨甲喋呤的培养基的96孔组织培养平板中限制稀释而克隆扩增的细胞群。大约4周后，鉴别克隆并选择克隆3E10B进行扩增。3E10B细胞在含有4mM GlutaMAX-1TM和2.0μM氨甲喋呤的CD CHO培养基中传代20次。产生3E10B细胞系的主细胞库(MCB)，冻干并用于后续研究。
通过在含有4mM GlutaMAX-1TM和4.0μM氨甲喋呤的CD CHO培养基中培养3E10B细胞而继续扩增细胞系。在12代后，将细胞在小瓶中冷冻作为研究细胞库(RCB)。解冻1小瓶RCB并在含有8.0μM氨甲喋呤的培养基中培养。5天后，培养基中的氨甲喋呤浓度增加到16.0μM，然后18天后到20.0μM。来自在含有20.0μM氨甲喋呤的培养基中的第8代的细胞通过在含有具有4mM GlutaMAX-1TM和20.0μM氨甲喋呤的CD CHO培养基的96孔组织培养平板中限制稀释而克隆。5-6周后鉴别克隆，选择克隆2B2在含有20.0μM氨甲喋呤的培养基中扩增。在11代后，将2B2细胞在小瓶中冷冻作为研究细胞库(RCB)。
所得2B2细胞是二氢叶酸还原酶缺陷的(dhfr-)DG44CHO细胞，其表达可溶性重组人PH20(rHuPH20)。可溶性PH20以大约206个拷贝/细胞的拷贝数存在于2B2细胞中。使用rHuPH20特异性探针进行的Spe I-,Xba I-和BamHI/Hind III-消化的基因组2B2细胞DNA的Southern印迹分析揭示下述限制消化谱：由Spe I消化的DNA有一个～7.7kb的主杂交带及四个次杂交带(～13.9,～6.6,～5.7和～4.6kb)；由Xba I消化的DNA有一个～5.0kb的主杂交带和两个次杂交带(～13.9和～6.5kb)；以及用由BamHI/Hind III消化的2B2DNA观测到一个～1.4kb的单一杂交带。
C.在300L生物反应器细胞培养物中生产Gen2可溶性rHuPH20
解冻1小瓶HZ24-2B2，通过36L旋转瓶在补加20μM氨甲喋呤和GlutaMAX-1TM(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中从摇瓶中扩增。简而言之，在37℃水浴中解冻该瓶细胞，加入培养基，离心细胞。细胞重悬于具有20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中，置于37℃、7％CO2温箱中。细胞在125mL摇瓶中扩增至40mL。当细胞密度达到1.5x106细胞/mL以上时，培养物扩增进125mL旋转瓶的100mL培养体积中。摇瓶在37℃、7％CO2保温。当细胞密度达到1.5x106细胞/mL以上时，培养物扩增进250mL旋转瓶的200mL培养体积中，摇瓶在37℃、7％CO2保温。当细胞密度达到1.5x106细胞/mL以上时，培养物扩增进1L旋转瓶的800mL培养体积中并在37℃、7％CO2保温。当细胞密度达到1.5x106细胞/mL以上时，培养物扩增进6L旋转瓶的5000mL培养体积中，并在37℃、7％CO2保温。当细胞密度达到1.5x106细胞/mL以上时，培养物扩增进36L旋转瓶的32L培养体积中，并在37℃、7％CO2保温。
灭菌400L反应器并加入230mL CD-CHO培养基。在使用前，检查反应器的污染情况。将大约30L细胞从36L旋转瓶中转移进400L生物反应器(Braun)中，接种密度为4.0×105活细胞/mL，总体积为260L。参数为：温度设定值，37℃；叶轮转速，40-55RPM；容器压力:3psi；空气分散(Air Sparge)0.5-1.5L/Min.；Air Overlay:3L/min。对反应器每日取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生及保留。而且在运行中加入营养补料。在120小时(第5天)，加入10.4L的Feed#1培养基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L Glutamax-1TM+83mL/L Yeastolate+33mg/L rHuInsulin)。在168小时(第7天)，加入10.8L的Feed#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/LGlutamax-1TM+167mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，培养温度改变为36.5℃。在216小时(第9天)，加入10.8L的Feed#3(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L Glutamax-1TM+250mL/L Yeastolate+1.80g/L丁酸钠)，培养温度改变为36℃。在264小时(第11天)，加入10.8L的Feed#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1TM+250mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，培养温度改变为35.5℃。观测到补料培养基的加入显著增加最终生产阶段可溶性rHuPH20的产生。反应器在14或15天收获或者当细胞存活性降至40％以下时收获。所述方法最终产率为17000单位/mL，最大细胞密度为1千2百万细胞/mL。收获时，取样培养物用于经透射电子显微镜术(TEM)分析体外和体内支原体、生物负荷、内毒素和病毒及酶活性。
培养物经蠕动泵通过4个平行的Millistak过滤系统模块(Millipore)泵送，每个含有一层4-8μm级别的硅藻土及一层1.4-1.1μm级别的硅藻土，随后是纤维素膜，然后通过第二个单Millistak过滤系统(Millipore)，其含有一层0.4-0.11μm级别的硅藻土及一层<0.1μm级别的硅藻土，随后是纤维素膜，然后通过0.22μm最终过滤器，进入350L容积的无菌单用途柔软袋(singleuse flexible bag)中。收获的细胞培养物液体补加10mM EDTA和10mM Tris至pH为7.5。培养物用切向流过滤(TFF)装置使用4个Sartoslice TFF 30 kDa分子量截断值(MWCO)聚醚砜(PES)过滤器(Sartorious)浓缩10倍，随后用10mM Tris,20mM Na2SO4,pH 7.5进行10×缓冲液交换进入0.22μm最终过滤器而进入50L无菌储存袋中。
对所述浓缩的渗滤收获物进行病毒失活。在病毒失活前，制备10％X-100,3％三(正丁基)磷酸盐(TNBP)溶液。浓缩的渗滤收获物在即将Q柱纯化之前在36L玻璃反应容器中暴露于1％X-100,0.3％TNBP1小时。
D.Gen2可溶性rHuPH20的纯化
制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂,H＝29cm,D＝20cm)。收集洗涤样品确定pH、电导率及内毒素(LAL测定)。柱用5个柱体积的10mM Tris,20mM Na2SO4,pH 7.5平衡。病毒失活后，浓缩的渗滤收获物以流速100cm/hr上样到Q柱上。柱用5个柱体积的10mM Tris,20mM Na2SO4,pH 7.5和10mM Hepes,50mM NaCl,pH7.0洗涤。蛋白质用10mM Hepes,400mM NaCl,pH 7.0洗脱进0.22μm最终过滤器而进入无菌袋中。测试洗脱液样品的生物负荷、蛋白质浓度及透明质酸酶活性。在交换开始和结束时读取A280吸光度。
接下来进行苯基-Sepharose(Pharmacia)疏水相互作用层析。制备苯基-Sepharose(PS)柱(19-21L树脂,H＝29cm,D＝30cm)。收集洗涤液，取样分析pH、电导率及内毒素(LAL测定)。柱用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2,pH 7.0平衡。来自Q sepharose柱的蛋白质洗脱液补加2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl2贮存液以实现终浓度分别为5mM,0.5M和0.1mM。蛋白质以流速100cm/hr上样到PS柱，收集柱流经液。柱用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2 pH7.0以100cm/hr洗涤，将洗涤液加入到收集的流经液中。流经液与柱洗涤液合并，通过0.22μm最终过滤器进入无菌袋中。取样流经液分析生物负荷、蛋白质浓度及酶活性。
制备氨基苯基硼酸酯柱(Prometics)。收集洗涤液，取样分析pH、电导率及内毒素(LAL测定)。柱用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡。含有纯化蛋白质的PS流经液以流速100cm/hr上样到氨基苯基硼酸酯柱。柱用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵,pH 7.0洗涤。柱用20mM N-二(羟乙基)甘氨酸、0.5M硫酸铵,pH 9.0洗涤。柱用20mM N-二(羟乙基)甘氨酸、100mM氯化钠,pH 9.0洗涤。蛋白质用50mM Hepes,100mM NaCl,pH 6.9洗脱，通过无菌过滤器进入无菌袋中。测试洗脱样品的生物负荷、蛋白质浓度及酶活性。
制备羟基磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液，测试pH、电导率及内毒素(LAL测定)。柱用5mM磷酸钾,100mM NaCl,0.1mM CaCl2,pH 7.0平衡。氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质补充至终浓度为5mM磷酸钾和0.1mMCaCl2，以流速100cm/hr上样到HAP柱。柱用5mM磷酸钾,pH 7,100mMNaCl,0.1mM CaCl2洗涤。柱接下来用10mM磷酸钾,pH 7,100mM NaCl,0.1mM CaCl2洗涤。蛋白质用70mM磷酸钾,pH 7.0洗脱，经过0.22μm无菌过滤器进入无菌袋中。测试洗脱样品的生物负荷、蛋白质浓度及酶活性。
HAP纯化的蛋白质然后通过除去病毒的过滤器。首先用2L 70mM磷酸钾,pH7.0洗涤制备灭菌的Viosart过滤器(Sartorius)。在使用前，取样过滤的缓冲液分析pH和电导率。经蠕动泵使HAP纯化的蛋白质通过20nM除去病毒的过滤器。在70mM磷酸钾,pH 7.0中的过滤的蛋白质通过0.22μm最终过滤器进入无菌袋中。测试过滤的样品的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖及唾液酸谱。还测试了样品的方法相关杂质。
滤液中的蛋白质然后用10kDa分子量截断值(MWCO)Sartocon Slice切向流过滤(TFF)系统(Sartorius)浓缩至10mg/mL。过滤器首先用10mM组氨酸,130mM NaCl,pH 6.0洗涤而制备，取样渗透液分析pH和电导率。浓缩后，取样浓缩的蛋白质，测试蛋白质浓度和酶活性。在浓缩蛋白质上进行6×缓冲液交换进入最终缓冲液：10mM组氨酸,130mM NaCl,pH 6.0。缓冲液交换后，浓缩的蛋白质流经0.22μm过滤器进入20L无菌储存袋中。取样蛋白质并测试蛋白质浓度、酶活性、游离巯基、寡糖谱和重量摩尔渗透压浓度。在下述测定中使用货号WRS2作为标准，结果显示表观测试描述是清楚无色的；pH是7.4；内毒素水平<0.01EU/mL；重量摩尔渗透压浓度是308mOsm/Kg；密度是1.005g/mL；rHuPH20含量是1.3ppm；透明质酸酶活性是145USP U/mL。
无菌过滤的批量蛋白质然后以20mL无菌分配到30mL无菌特弗隆小瓶(Nalgene)中。小瓶然后急冻，储存在-20±5℃。
实施例2：PH20突变体文库的产生
A.克隆及诱变
在这个实施例中，通过将编码人PH20的DNA克隆进质粒随后转染和蛋白质表达而创建人透明质酸酶PH20文库。
文库通过PH20模板的诱变而产生，所述模板是具有Ig κ前导序列的PH20的密码子优化版本。具体地，为产生变体文库，使用HZ24-PH20(OHO)-IRES-SEAP表达载体(如SEQ ID NO:4所示)作为模板，其含有编码SEQ IDNO:1所示PH20的核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的前体PH20或者缺少相应于IgK信号序列的残基1-22的SEQ ID NO:3所示的成熟PH20。载体骨架衍生自含有DHFR选择标记的原始HZ24载体(参见实施例1和SEQ ID NO:5)，添加了IgK前导序列和密码子优化。所述表达载体还被修饰含有分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的基因。因此，除编码PH20的序列之外，HZ24-PH20(OHO)-IRES-SEAP表达载体还含有连接于分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的基因的编码序列的内部核糖体进入位点(EMCV IRES)，以及驱动构建体中PH20和SEAP表达的单个CMV启动子。其还含有氨苄青霉素抗性基因。参照SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，编码PH20的核苷酸序列相应于核苷酸1058-2464(包括IgK前导序列)，编码SEAP的核苷酸序列相应于核苷酸2970-4529，氨苄青霉素抗性基因相应于核苷酸5778-6635。
制备第一文库以产生编码的变体蛋白质，其中SEQ ID NO:2的残基23-469(相应于SEQ ID NO:3的残基1-447或者SEQ ID NO:6的残基36-482)的每一个被改变为大约15个氨基酸残基中的一个，由此每个成员含有单氨基酸变化。所得文库含有6753个变体成员，每个成员与SEQ ID NO:2的残基23-469(相应于SEQ ID NO:3的残基1-447或者SEQ ID NO:6的残基36-482)相比含有单氨基酸突变。制备所得文库的甘油原液并且储存在-80℃。每个成员的氨基酸置换(mut)列于下表8，相应于参考SEQ ID NO:3(以及SEQ ID NO:7或32-66，它们是PH20的成熟序列或者其其它C-末端截短的片段)所示的PH20氨基酸序列的氨基酸置换。文库中每个PH20变体的相应的突变密码子(cod)也列在表8中，相应于SEQ ID NO:4的1058-2464所示的PH20的相应编码核苷酸中的核苷酸残基变化。如下所述表达每个成员及筛选透明质酸酶活性。
2.表达
为表达每个突变体，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Cat.No.11668-027)根据厂商建议方案将含有编码变体PH20之一或者编码野生型PH20的cDNA的HZ24-PH20-IRES-SEAP质粒DNA转染进单层CHO-S细胞(invitrogen,Cat.No.11619-012)。CHO-S细胞在转染前夜接种并生长于具有10％FBS的DMEM，至第二天80％铺满。然后，CHO-S细胞的培养基用Opti-MEM置换。制备质粒DNA和lipofectamine的混合物(0.2μg DNA和0.5μL Lipofetamine)。将所述Lipofectamine/DNA混合物加入到CHO-S细胞并保温过夜。第二天，细胞补加CD-CHO无血清培养基(Invitrogen,Cat.No.10743-029)。在转染后各个时间点并且通常在转染后96小时收集转染细胞的上清。含有变体PH20蛋白或者具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的野生型PH20的上清储存在-20℃。上清的活性如下面的实施例所述进行筛选。
实施例3：用透明质酸酶活性测定筛选文库鉴别活性突变体
在本实施例中，实施例2中产生的表达的PH20变体的上清用透明质酸酶活性测定进行筛选以评估每个突变体的活性。另外，还测量了分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的活性以使得表达的突变体的PH20活性根据PH20野生型进行标准化。鉴别了有活性和无活性突变体。
1.生物素化HA(bHA)底物的产生
将1.2-MDa HA(Lifecore)生物素化以用作透明质酸酶活性测定中的底物。首先，将1.2g 1.2MDa HA以2mg/mL的浓度在4℃搅拌下溶解在600mlddH2O中一周。接着，将645.71mg生物素酰肼溶解在100mL DMSO中至浓度为25mM(6.458mg/mL,247.8mg于38.37mL DMSO中)。在37℃短暂加热生物素溶液直至所述溶液澄清。另外，将368.61mg Sulfo-NHS于20mLddH2O中溶解以制备100X溶液(18.4mg/mL Sulfo-NHS)。在反应开始前通过将17.63mg EDC以5.7513mg/mL的浓度溶解于3mL ddH2O中制备30mM(1000X)水溶性碳二亚胺EDC溶液。
在室温(RT)、搅拌下向4个1000mL无菌有帽瓶中以如下顺序加入下述成分：1)200mL 2mg/mL HA溶液；2)80mL 0.5M MES,pH 5.0，温和混合；及3)91.6mL ddH2O，温和混合。接下来，顺序加入24mL 25mM生物素酰肼和4mL 100X Sulfo-NHS溶液，随后立即加入500μL EDC。加入每种成分后，倒置3次并搅拌混合溶液。加入最后一种成分后，在4℃通过搅拌混合溶液过夜。然后，通过每100mL加入38.2g而加入盐酸胍至终浓度为4M，使之完全溶解，之后用ddH2O调整溶液体积为600mL。
为了透析，将200mL每一批缀合的HA盐酸胍溶液转移到透析膜中。在3天时间内，溶液对ddH2O进行透析，更换ddH2O至少6次。所得大约840mL的体积用ddH2O调整至终体积为1000mL。生物素化乙酰透明质酸(bHA)终浓度为0.4mg/mL。
2.透明质酸酶活性测定
酶测定是Frost et al.(1997)(A Microtiter-Based Assay for HyaluronidaseActivity Not Requiring Specialized Reagents.Analytical Biochemistry(1997)251:263-269)所述方法的修改，其提供了PH20透明质酸酶活性的测量。
首先，生物素化HA(bHA)底物与塑料微滴定板结合以产生测定平板。简而言之，将100μl以1mg/mL在0.5M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的b-HA分配到高结合微滴定板(Immunolon 4 HBX extra high binding；ThermoScientific)的每个孔中。平板用平板密封器(plate sealer)密封，储存在2-8℃24-48小时。
然后，测定平板用含有0.05％(v/v)Tween 20的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤缓冲液(PBST)洗涤。PBST是通过如下方式从1X PBS(产生自CatalogNo.P5368,Sigma(10mM磷酸盐缓冲液,2.7mM氯化钾,137mM氯化钠,pH 7.4)产生，将一袋PBS内容物置于含有800mL去离子水的1L量筒中，搅拌或振荡溶解，加入足够量的水至1L)，即加入500μl Tween 20(Catalog No.6505；EMD Bioscience)至900mL 1 X PBS并加入足够量的水至1L。用BioTekELx405 Select CW平板洗涤器(BioTek)每次洗涤每孔使用300μl PBST洗涤缓冲液洗涤5次。每次洗涤结束时，平板置于纸巾上除去每个孔中的过量液体。在与样品保温之前，向每孔中加入200μl封闭缓冲液(1.0％w/v牛血清白蛋白(BSA)于PBS中)，测定平板在37℃保温大约1小时。封闭缓冲液是通过将2.5g BSA(Catalog No.001-000-162；Jackson Immuno Research)加入到200mL 1 X PBS中、搅拌、加入足够量的1 X PBS至250mL及过滤通过0.2μM PES过滤单元而产生。
如实施例1所述产生的转染的变体或野生型PH20上清在未包被的4XHB高结合微滴定板中在测定稀释缓冲液(pH 7.4HEPES缓冲液；10mMHEPES,50mM NaCl,1mM CaCl2,1mg/mL BSA,pH 7.4,0.05％Tween-20)中一式二份1:25稀释。为了标准曲线，在测定稀释缓冲液中一式二份制备rHuPH20(如实施例1所述产生，比活性为145U/mL)的1:3系列稀释液，从3U/mL开始，标准如下：3U/mL,1U/mL,1/3U/mL,1/9U/mL,1/27U/mL,1/81U/mL,及1/243U/mL。100微升(100μl)的每个标准及样品转移到测定平板中，在37℃保温大约1.5小时。
保温后，平板用BioTek ELx405 Select CW平板洗涤器用PBST洗涤5次，每次洗涤每孔使用300μl PBST洗涤缓冲液。每次洗涤结束时，平板置于纸巾上除去每个孔中的过量液体。然后向平板的每个孔中加入100μl1:5000稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(SA-HRP)，在环境温度保温大约1小时。为了稀释，将1mg/mL链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物原液(Catalog No.21126；Thermo Scientific)在稀释缓冲液(1mg/mL BSA,0.025％Tween20,137mM NaCl,20mM Tris pH 7.5)中1:5000稀释。保温后，平板用BioTek ELx405Select CW平板洗涤器用PBST洗涤5次，每次洗涤每孔使用300μl PBST洗涤缓冲液。每次洗涤结束时，平板置于纸巾上除去每个孔中的过量液体。然后，100μl TMB溶液(Catalog No.52-00-03,KPL；环境温度，避光)加入到每孔中，在室温大约5分钟或者直至达到最佳显色。为终止反应，向每孔中加入100μl 1.0N硫酸或TMB终止溶液(Catalog No.50-85-06)，敲动平板混合。在加入终止溶液30分钟内在450nm测量光密度。因为标准或样品中更多的PH20会导致更少bHA可供结合SA-HRP，因此光密度(450nm)值与每个样品中的透明质酸酶活性浓度成反比。
3.SEAP活性
还测量了细胞培养上清中的分泌型碱性磷酸酶活性(SEAP)，使用pNPP作为磷酸酶底物(Anaspec SensoLyte pNPP SEAP kit；Catalog No.72144,Anaspec)根据厂商指导使用胎盘碱性磷酸酶比色测定进行。吸光度信号在405nm光密度(OD)测量。
高通量(HTP)筛选的标准是转染的上清产生≥0.1的SEAP信号，以及rHuPH20野生型对照信号≥1U/mL。另外，每个筛选的标准是标准曲线具有的信噪比(S/N)对于0U/mL标准品相对于3U/mL标准品在OD405时≥5，变异系数(CV)≥10％的标准品少于3个，及至少4个标准品是在线性范围内。
实施例4：具有改变的透明质酸酶活性的选择的PH20变体
如实施例3所述筛选每个产生的变体的透明质酸酶活性。SEAP表达用于将每个变体的PH20活性根据PH20野生型标准化。鉴别与野生型相比呈现改变的透明质酸酶活性的突变体。
1.活性突变体
选择活性突变体，其中当根据SEAP活性标准化时，至少一个一式两份的样品呈现高于40％野生型活性。鉴别的活性突变体示于表9中。该表示出与SEQ ID NO:3所示PH20氨基酸序列相比的氨基酸置换。举例的突变体的氨基酸序列也以SEQ ID NO示出。该表还示出了与每个平板中野生型PH20的平均活性相比通过SEAP值标准化的检测的一式两份样品的平均透明质酸酶活性，所述野生型PH20活性也通过其自己的SEAP值标准化。例如，0.40的值表示变体呈现40％的野生型PH20的透明质酸酶活性，值为1表示变体呈现与野生型相似的透明质酸酶活性，值3.00表示变体呈现300％的野生型PH20的透明质酸酶活性或者与野生型相比活性增加3倍。
表9中的结果示出超过600个检测的突变体与野生型相比呈现增加的活性。例如，大约536个突变体呈现120％或者高于120％的野生型PH20的透明质酸酶活性，及大约75个突变体呈现300％或者高于300％的野生型PH20的透明质酸酶活性。特别地，表9中的结果示出与野生型相比，突变体S69A的透明质酸酶活性是大约22倍；突变体S69R是大约14倍；突变体I70A是大约27倍；突变体I70K是大约14倍；突变体I70R是大约14倍；及突变体I271L是大约10倍。
2.无活性突变体
对一式两份样品的至少一个样品中呈现低于20％野生型PH20的透明质酸酶活性的其它突变体进行重新筛选以证实死亡突变体是无活性的。为了证实无活性突变体，对实施例3所述透明质酸酶活性测定进行修改，在测量酶活性之前掺入在37℃对底物-样品保温过夜的步骤。修改的测定用于检测低于0.2U/mL的PH20活性。
在加入转染的变体上清或野生型PH20之前的bHA包被的平板的制备及平板的封闭与实施例3所述相同。如下修改所述测定。首先，将如实施例2所述产生的转染的变体上清或不含有突变的野生型PH20在测定稀释剂中以1:25一式两份稀释。对于标准曲线，在测定稀释剂中一式两份制备rHuPH20(如实施例1所述产生)的1:3系列稀释液，从0.1U/mL开始稀释至0.00014U/mL。包括空白孔。然后，将100μl稀释样品或标准物加入预先设计的bHA包被和封闭的平板的孔中，在37℃保温过夜。在保温后，洗涤该平板并如实施例3所述检测与bHA的结合。在加入终止溶液的30分钟内在450nm测量光密度。
鉴别的重新证实的无活性突变体在表10中示出。该表示出了与SEQ IDNO:3所示PH20的氨基酸序列相比的氨基酸置换。
实施例5：测定在温度和耐酚类防腐剂条件下透明质酸酶活性
检测来自如实施例4中鉴别的表9中示出的PH20活性变体的上清在耐热和/或耐酚类防腐剂条件下的稳定性。对使用生物素酰化-HA(bHA)作为测量透明质酸酶活性的底物测量在温度和耐酚类防腐剂条件下的透明质酸酶活性的测定法从如实施例3所述的原始测定法进行修改，在测量酶活性之前掺入在37℃下与或不与m-甲酚保温4小时的步骤。所述测定也用于鉴别具有耐热性质(在37℃的活性高于在4℃的活性)和/或具有耐酚类防腐剂性质(在存在m-甲酚条件下的活性高于野生型PH20)的PH20突变体。
1.初级筛选
在样品与bHA保温之前，将变体PH20样品在未包被的4XHB平板的设计的孔中稀释，以在如下条件下在37℃预保温4小时：1)在37℃与0.4％m-甲酚预保温；及2)在37℃无0.4％m-甲酚预保温。对于在37℃与0.4％m-甲酚预保温，从50％(v/v)m-甲酚原液中制备1％m-甲酚中间原液。简而言之，在2mL Wheaton玻璃瓶中，基于密度(D＝1.034g/L)在甲醇中制备50％m-甲酚原液(Fluka,Catalog No.65996；Spectrum,Catalog No.C2773)。将该瓶密封并在-20℃以小等份避光贮存。然后，在每天马上使用之前通过在通风橱中涡旋在HEPES测定缓冲液(10mM HEPES，50mM NaCl，1mM CaCl2，1mg/mL BSA，pH 7.4，0.05％Tween-20)中稀释产生1％中间原液。
然后，将如实施例2所述产生的在表9中示出的一式两份的转染的变体上清样品均在HEPES测定缓冲液/转染的上清中单独进行1％m-甲酚的1:2.5稀释，获得0.4％终浓度的m-甲酚。对于在37℃无0.4％m-甲酚预保温，将转染的变体上清样品在HEPES测定缓冲液/转染的上清中进行1:2.5稀释。此外，对于每种条件，也检测内部杀死对照，通过将3U/mL的rHuPH20在pH 7.4HEPES缓冲液(如实施例1所述产生1)中如上述针对转染的样品同样稀释。平板用平板密封剂密封并在37℃保温4小时。
在加入转染的变体上清或野生型PH20之前bHA包被的平板的制备及平板的封闭与实施例3所述相同。对所述测定进行如下进一步修改。首先，将样品一式两份在4XHB平板中在HEPES测定缓冲液中1:10稀释。对于每种变体，在如下条件下检测样品：1)无预保温的转染的变体上清(无保温；4℃)；2)预保温的转染的变体上清在37℃与0.4％m-甲酚预保温4小时(甲酚)；或者3)预保温的转染的变体上清在37℃无0.4％m-甲酚预保温4小时(无甲酚；37℃)。此外，也检测spiked-in样品。使用rHuPH20的标准曲线如实施例3所述产生，无m-甲酚。将100μl每个标准物和样品转移至bHA-包被及封闭的平板的预设计的孔中，在37℃保温大约1.5小时。由于每个转染的变体上清一式两份样品在预保温步骤中预保温及每个样品进一步的一式两份在bHA测定中测定，因此对每个变体的每个样品均进行一式四份检测。
在保温后，洗涤平板并如实施例3所述检测与bHA的结合。在加入终止溶液的30分钟内测量在450nm的光密度。
从标准曲线中计算U/mL活性并对比。结果以在每个如下参数下剩余的活性百分比(％)表示：在1)37℃预保温无m-甲酚/4℃；2)37℃与m-甲酚/4℃预保温；及3)37℃与m-甲酚预保温后/37℃无m-甲酚预保温后的活性比率。重新证实的初始耐酚类防腐剂hit鉴别为是在一式两份测定中在条件3)下呈现出剩余活性百分比≥20％在37℃的原始活性的那些。
使用6孔平板重筛选测定对初始Hit进行重新筛选。对于重新筛选，将相应于潜在Hit的质粒DNA转化进大肠杆菌细菌中，根据厂商指导使用MaxiPrep制备质粒DNA并纯化。证实DNA序列。
将质粒DNA转染进在6孔平板上生长的单层CHO-S细胞(invitrogen,Cat.No.11619-012)中，密度为大约50-80％铺满，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Cat.No.11668-027)根据厂商建议的方案进行。一式两份进行转染。转染后将细胞在37℃在CO2保温箱中保温96小时，之后收集上清进行测定。作为对照，细胞也用含有密码子优化的野生型PH20序列(OHO)的HZ24-PH20(OHO)-IRES-SEAP表达载体(SEQ ID NO:4)转染。也包括模拟细胞作为对照。
在转染后96小时，从每个样品、包括OHO和模拟对照样品中收集上清，测定在如上述不同条件下的透明质酸酶活性：1)无预保温的转染的变体上清(无保温；4℃)；2)在37℃与0.4％m-甲酚预保温4小时的预保温的转染的变体上清(甲酚；37℃)；或者3)在37℃无0.4％m-甲酚预保温4小时的预保温的转染的变体上清(无甲酚；37℃)。如上述使用bHA测定法确定透明质酸酶活性。
如上述评定结果。从标准曲线产生绝对透明质酸酶活性(U/mL)。此外，百分比活性以在37℃/4℃、37℃+m-甲酚/4℃及37℃+m-甲酚/37℃的活性比率确定。结果在下表11和12中示出。
n/a(不可得；例如超出检测极限)
n/a(不可得；例如超出检测极限)
2.F204P结果概述
对于突变体F204P，来自在bHA酶活性测定中存在m-甲酚条件下保温的CHO-细胞的瞬时转染检测上清的上述结果示出F204P突变体蛋白对于0.4％m-甲酚处理具有高度抗性。结果示出在37℃与0.4％m-甲酚保温4小时后保留的活性大约等于当所述酶在4℃或37℃在不存在m-甲酚条件下保温时观测到的活性。阳性对照(WT PH20–OHO)示出在测定当天活性降低75％和83％(从两个不同的OHO转染中测定)。这证实耐酚类F204P能保留其活性的60％-90％或更高，高于野生型PH20对照酶剩余活性。
为了证实F204P在经m-甲酚处理或暴露于升高的温度下的稳定性，使用CHO-S细胞一式两份进行F204P的第二次转染，再次检测澄清上清在4℃、在37℃与0.4％m-甲酚保温4小时及在37℃无0.4％m-甲酚保温4小时的稳定性。结果证实F204P突变体酶在37℃在m-甲酚中保温4小时后保留高量的透明质酸酶活性。结果与在第一次筛选突变体中所见结果相似，在保温4小时后，F204P无论何处均保留其活性的57％至90％以上，高于野生型PH20对照酶的剩余活性。
与野生型对照相比，F204P的酶活性概述在表13中示出。
实施例6：PH20HIT变体的大规模表达和纯化
1.表达和纯化
将含有编码变体PH20之一的cDNA的HZ24-PH20-IRES-SEAP质粒DNA转染进如实施例2所述单层CHO-S细胞中。将CHO-S细胞在摇瓶中使用补加GlutaMAX(8mM)的CD-CHO培养基培养。在转染当天，制备大约300mL体积的含有CHO-S细胞的15个培养瓶，大约密度为1.0×106个细胞/mL。将每个300mL培养瓶用375μg编码F204P突变体的质粒DNA组合375μL的Freestyle MAX转染试剂转染。转染的质粒DNA具有如SEQID NO:4所示核苷酸序列，其在核苷酸位置1733-1735含有密码子TTC改变为CCT，从而编码F204P突变体。然后使转染的细胞在培养物中保持96小时，届时收获细胞和培养基并集合。将细胞通过离心沉淀(4000×g，20’)，保留上清以纯化F204P蛋白质(大约4.5升)。
将粗提的上清使用30kDa切向流过滤(Tangential flow filter，TFF)系统(Millipore Pellicon XL,Bimax 30，200mL空容积；50cm2滤膜表面积)浓缩10倍，直至体积为大约450mL。渗透物被留下以检测F204P蛋白质的流经物。然后进行保留物的自由流动缓冲液交换，使用4升缓冲液(10mMNaPO4；25mM NaCl,pH 7.2)。将保留物的体积再次降低至大约200mL，然后清洗系统中剩余渗透物(空容积～200mL)并将该系统用大约50mL缓冲液冲刷，产生最终大约450mL的浓缩产物。
通过将抗原亲和性纯化的兔抗-rHuPH20 IgG偶联于CNBr-激活的Sepharose 4Fast Flow(GEHealth catalog No.17-0981-01)制备抗-rHuPH20亲和性层析柱。简而言之，将0.7g预激活的Sepharose 4粉末悬浮于10mL玻璃柱中1mM HCl中30分钟以使得该粉末膨胀。从该柱中排出溶液，用15个凝胶体积(大约30mL)的冷却1mM HCl在重力作用下洗涤。将该柱用5个凝胶体积的偶联缓冲液(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)洗涤。接着，将在偶联缓冲液中>1.0mg/mL的5mg兔抗-rHuPH20 IgG加入柱中，蛋白质/凝胶比率为2-3mg/mL凝胶。将该柱在4℃头对头旋转过夜。收集流经物进行偶联效力确定。将凝胶用2个凝胶体积的偶联缓冲液洗涤，然后在1M乙醇胺pH 9.5中洗涤并在室温于其中重悬2小时以封闭未使用的激活的位点。所述凝胶每次洗涤用5个凝胶体积洗涤6次，交替使用偶联缓冲液和0.1NaAc、0.5M NaCl,pH 4.5。然后将凝胶用10个凝胶体积的TBS(20mMTris-HCl，0.15M NaCl，pH 7.5)洗涤。确定偶联效力(1次偶联后蛋白质浓度/偶联前蛋白质浓度×100％)。抗体偶联的凝胶在4℃贮存在具有0.02％NaN3的TBS中。
浓缩的上清产物随后加样于抗-rHuPH20亲和性柱，大约速度为5mL/分钟。根据标准程序使用GETM AKTA FPLC纯化系统(GE Healthcare,Product No.18-1900-26)进行洗脱，其中蛋白质通过在1mL级分中低pH甘氨酸洗涤(0.1M甘氨酸-HCl,pH 2.5)而洗脱。将每个级分通过加入100μL的1M Tris,pH 7.5立即中和。
洗脱的蛋白质通过将在4-20％ SDS-PAGE梯度Tris-甘氨酸凝胶上分辨蛋白质条带而测定。Plus2 Pre-stained MW标准(Life Teechnologies；Catalog No.LC5925)用作分子量标准，50ng rHuPH20(如实施例1所述)用作阳性对照。用Instant Blue对聚丙烯酰胺凝胶染色以示出来自每个级分的总蛋白质。为了证实凝胶上的条带是PH20，将凝胶移至PVDF膜(Invitrogen)，使用通过用rHuPH20免疫兔产生的兔抗PH20初级抗体及HRP-山羊抗兔二抗(Calbiochem,Cat.No.DC03L)对其进行Western印迹。
然后，由于亲和柱的低容量而将来自亲和柱的初始加样的流经物再加样于所述柱上两次。然后组合含有所述蛋白质的所有级分，获得总体积为大约13mL。然后将这个产物用4升缓冲液(10mM NaPO4，140mM NaCl，pH 7.2)透析过夜，使用15mL容量的Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette G2(20,000MWCO)。然后更换缓冲液，并将产物用第二个新鲜配制的4升相同缓冲液透析。然后使用Amicon超离心柱(Millipore；10,000MWCO)浓缩F204P至终体积为大约450μL(10分钟，4000×g)。
2.蛋白质的鉴定
鉴定纯化的蛋白质的蛋白质浓度、活性和纯度。
为了确定纯化的蛋白质的蛋白质浓度，如实施例7所述进行定量ELISA。也如实施例3所述确定透明质酸酶活性。离心后的蛋白质浓度估计为大约400μg/mL。将纯化的蛋白质在4-20％ SDS-PAGE梯度Tris-甘氨酸凝胶上分辨，然后用Instant Blue染色。染色结果表明所述蛋白质基本上是大约63kDa的单一分子量蛋白，与rHuPH20对照相似。通过这种方法没有检测到可察觉的降解产物。在不同时间点的蛋白质的大约产量和纯化期间的活性在表14中示出。
纯化的蛋白质的纯度通过反相HPLC(RP-HPLC)确定。反相柱的洗脱时间与用重组人透明质酸酶(HUB)观测到的基本相同，并提供了初步估计样品纯度为大约80-90％的基础。
实施例7：使用ELISA量化
使用ELISA进行PH20或变体的量化，其使用单克隆抗-rHuPH20捕获抗体捕获蛋白质。特别地，在进行ELISA前一天，将96孔4HBX平板用在100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的1μg/mL捕获抗体包被(蛋白质G纯化的兔多克隆抗-PH20抗体，通过用rHuPH20免疫兔产生；1mg/mL原液)，总体积为100μL/孔。将平板在4℃贮存过夜。第二天，使用平板洗涤器将该平板用300μL/孔的1×PBS洗涤5次。在每次洗涤后，将平板在纸巾上轻拍干燥。然后，将平板用含有Tween 20的200μL PBS(1×PBST)/孔在室温封闭1小时。
将标准物和样品加入平板。为了产生标准物，将1mg/mL的rHuPH20原液(实施例1)在HEPES pH 7.4测定缓冲液中新鲜稀释为50μg/mL作为中间原液。然后，对于标准物，第一标准物是将50μg/mL原液在360μL的0.5×PBST中一式两份稀释为300ng/mL(第一行)。对于其它标准物行，在每个孔中加入240μL的0.5×PBST，1:3系列稀释。对于转染的上清样品，在第一行中一式两份加入360μL/孔，均如上所述在0.5×PBST中系列稀释。对于纯化的样品，每孔加入100μL。将平板在室温保温2小时。保温后，使用平板洗涤器将平板用300μL/孔的1×PBST洗涤5次。每次洗涤后，将平板在纸巾上轻拍干燥。
制备HRP-缀合的抗-PH20抗体以使用HRP缀合试剂盒(Pierce,Thermo-Fisher；Catlog No.31489)检测。将通过用rHuPH20免疫兔产生的1mg蛋白G纯化的兔多克隆抗体在1mL PBS和1mL的2×碳酸盐试剂盒缓冲液中稀释。接着，将100μL过氧化物酶加入1mL上述抗体溶液中，在室温保温1小时。然后，将10μL NaBH4原液加入通风橱中，并将样品在室温保温20分钟。为了淬灭反应，加入20μL乙醇胺并在室温保温15分钟。为此，加入1/25体积的5％人血清白蛋白(0.1mL注射器)以提供2mg/mL白蛋白原液反应。通过加入250μL的1M Tris pH 7.4将pH调节为大约7.9。原液浓度为400μg/mL。将原液溶液进一步在含有0.5％人血清和防腐剂的PBSTween20(0.05％)中稀释1/10，然后过滤灭菌。将原液在4℃贮存或者在-20℃冷冻。
抗体使用在0.5×PBST中稀释1000倍的HRP-缀合的抗-PH20抗体检测。将100μL稀释的抗体加入平板的所有孔中，并将平板在室温进一步保温2小时。在保温后，使用平板洗涤器用300μL/孔的1×PBST将平板洗涤5次。在每次洗涤后，将平板在纸巾上轻拍干燥。然后在每个孔中加入100μL的TMB底物，然后在5-10分钟后通过在每个孔中加入100μL终止溶液而结束反应。在OD450读取平板。
实施例8：PH20的酶活性的确定
样品如细胞培养物、纯化级分和纯化的溶液中PH20的酶活性使用比浊测定法确定，所述测定基于当透明质酸结合氯化十六烷吡啶(CPC)时不溶沉淀物的形成。所述活性通过将PH20与乙酰透明质酸保温一定时间(30分钟)、然后加入CDC使未消化的乙酰透明质酸酶沉淀而测量。所得样品的浊度在640nm测量。得自作用于乙酰透明质酸底物的酶活性的浊度的降低用做PH20酶活性的测量。所述方法使用PH20测定工作参考标准(rHuPH20标准如实施例1所述产生)的稀释液产生的校准曲线运行，相对于这个校准曲线进行样品活性测量。
样品和标准物的稀释液在酶稀释溶液(70mM NaCl，0.1％人血清白蛋白[HSA]，0.67g/L凝胶水解产物于25mM PIPES缓冲液中，pH 5.5)中制备。将样品稀释为合适浓度。来自Lifecore Biomedical(Chaska,MN)的透明质酸(HA，平均MW为20–50kDa)也在含有25mM PIPES、70mM NaCl、pH 5.5的底物溶液中制备为1mg/mL。将等量的上述两种溶液混合以制备1mL反应混合物并在37℃保温30分钟。通过加入4mL的氯化十六烷吡啶溶液(CPC，5.0mg/mL)终止反应。短暂涡旋后，样品混合物的浊度在640nm读取，通过对标准曲线拟合确定活性。通过将所述酶活性(U/mL)除以蛋白质浓度(mg/mL)计算比活性(单位/mg)。
实施例9：F204P-PH20变体在防腐剂中的稳定性
为了证实筛选结果，将如实施例6中所述估计量为大约450U/mL的纯化的F204P蛋白在10mM磷酸钠pH 6.5、120mM NaCl、10mM甲硫氨酸、0.01％Pluronic F-68、0.1％苯酚和0.15％m-甲酚中配制。在相同配制物中也制备也含有估计量为大约450U/mL的野生型rHuPH20(如实施例1所述产生)的检测品用作对照。每个配制溶液等份为0.5mL并充填于具有氯丁基橡胶塞和铝密封的2mL USP I型硼硅酸盐玻璃瓶中。将该瓶在5℃、30℃或37℃保温。在不同时间点从保温箱中抽取样品，如实施例8所述测量酶活性。
酶活性测量结果示于表15。从中可以看出，rHuPH20野生型对照示出当在37℃在存在酚类防腐剂条件下保温时，活性快速降低。相反，F204P突变体示出在整个研究中活性未显著丧失。结果还示出与不含有所述突变的rHuPH20野生型对照的活性相比，PH20活性在5℃和30℃保温后保留直至4周。这些结果证实F204P耐受防腐剂的EPB水平(0.1％苯酚和0.15％m-甲酚)且在37℃稳定至少直至6天，在5℃和30℃稳定一个月以上。
实施例10：胰岛素配制物中F204P-PH20变体的稳定性
检测PH20变体F204P在含有胰岛素类似物(门冬胰岛素或赖脯胰岛素)的共配制物中的稳定性。
在检测的共配制物中，赖脯胰岛素是商业产品(Insulin Lispro:Eli Lilly(insulin Lispro)100U/mL,Lot A572364)。
在检测的共配制物中，门冬胰岛素类似物是再加工的门冬胰岛素，通过集合12瓶(每个10mL)商业产品(Insulin Aspart:Novo Nordisk,(insulin Aspart),Lot XS60195)、然后使用Amicon Ultracel-10K柱浓缩仪浓缩直至终浓度为原始浓度的大约5倍而制备的。通过在1/10蛋白质溶液体积中加入1M乙酸钠pH 5.3和30mM氯化锌(ZnCl2,EMD,Cat No.ZX0065-1)使所述胰岛素类似物沉淀。将所述溶液置于冰上30分钟，随后在具有JS-5.3浮桶式转头的Avanti J-E离心机(Beckman Coulter)中在5600rpm离心20分钟。倒出上清，将沉淀重悬并用20mM乙酸钠、2mM氯化锌、pH 5.5溶液洗涤。将重悬的溶液如上述离心。洗涤步骤重复共5次。最终的洗涤用20mM乙酸钠pH 5.5进行，除去所有氯化锌痕迹。所得蛋白质糊用含有20mM HCl的水溶解。在完全溶解后，加入250mM Tris、pH 10.7至Tris终浓度为20mM。调节所得溶液的pH，由此如下述配制胰岛素类似物并将蛋白质浓度调节为大约15-20mg/mL。以此方式制备的胰岛素类似物典型产量为大约90％，剩余防腐剂浓度比起始物低100倍。
简而言之，产生3个配制物，每个均含有600单位(U)的PH20-F204P或者野生型rHuPH20(如实施例1所述产生)，共6个配制物，如表16所示。
将每个配制物溶液以0.5mL等份分散于具有氯丁基橡胶塞子和铝密封的2mL USP I型硼硅酸盐玻璃小瓶中。将该小瓶在5℃、30℃和37℃保温。在规定时间点从保温箱中抽取样品，如实施例8所述进行酶活性测量。
在37℃、30℃和5℃保温的样品的酶活性测量结果分别在表17-19中示出。在37℃，含有野生型rHuPH20的样品(F2、F4和F6)的酶活性在保温2天内几乎全部丧失。相反，在37℃保温6天后，含有PH20-F204P的配制物F3和F5分别仅丧失大约10％和30％。在商业Humalog中配制的PH20-F204P(F1)很可能由于配制物内缺少NaCl而在37℃在2天内丧失大部分其活性。
注意到在PH20-F204P与rHuPH20之间在30℃保温的安瓿的酶活性的相似倾向。对于含有EPA防腐剂水平的配制物，野生型与F204P之间的差别是显著的(表17，F1与F5对比F2与F6)。当防腐剂浓度降低至EPB水平(F3和F4)时，F204P仍优于野生型rHuPH20，但是与EPA条件相比具有略高的rHuPH20稳定性。当100mM的NaCl包含于配制物中时，在EPA和EPB防腐剂水平，PH20-F204P在30℃能维持其活性直至14天。
实施例11：胰岛素共配制物中V58R-PH20的稳定性
A.V58R-PH20的稳定性
如实施例2或实施例6所述，将PH20变体V58R在CHO-S细胞中表达。转染的质粒DNA具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，其在核苷酸位置1295-1297含有密码子GTG改变为CGG，从而编码V58R突变体。检测V58R突变体在含有门冬胰岛素(如实施例10所述制备的门冬胰岛素类似物)的共配制物中及在EPA或EPB防腐剂水平下的稳定性。简而言之，产生4个配制物，每个均含有600单位(U)的PH20-V58R或者野生型rHuPH20(如实施例1所述产生)，如表20所示。配制物F1和F2表示EPB防腐剂水平，而配制物F3和F4表示EPA防腐剂水平。
将每个配制物溶液以0.5mL等份分散于具有氯丁基橡胶塞子和铝密封的2mL USP I型硼硅酸盐玻璃小瓶中。将该小瓶在30℃和37℃保温。在规定时间点从保温箱中抽取样品，如实施例8所述进行酶活性测量。
在37℃和30℃保温的样品的酶活性测量结果在表21和表22中示出。在37℃，含有野生型rHuPH20(F2和F4)的样品的酶活性在保温2天内几乎完全丧失。相反，在37℃保温6天后，含有V58R-PH20的配制物F1(EPB)和F3(EPA)分别丧失仅大约25％和40％活性。在30℃，含有野生型rHuPH20的样品的酶活性在存在EPA或EPB防腐剂水平条件下在保温1个月内也显著降低，但是在存在EPB防腐剂水平条件下活性略微不太显著地丧失。相反，对于V58R-PH20，任一检测的配制物直至1个月其酶活性无丧失。
B.对比F204P与V58R的稳定性
对比PH20变体V58R-PH20与F204P在含有门冬胰岛素(如实施例10所述制备的门冬胰岛素类似物)的共配制物中及在EPA或EPB防腐剂水平下的稳定性。简而言之，产生如表23所示8个配制物。配制物F1-F4表示EPB防腐剂水平，而配制物F5-F8表示EPA防腐剂水平。配制物F3和F4及配制物F7和F8是相同的，表示分别用于EPB或EPA研究的野生型对照配制物。
将每个配制物溶液均以0.5mL等份分散于具有氯丁基橡胶塞和铝密封的2mL USP I型硼硅酸盐玻璃小瓶中。将该小瓶在30℃和37℃保温。在规定时间点从保温箱中抽取样品，如实施例8所述进行酶活性测量。
结果示出当在EPB中且无EPA防腐剂水平中配制时，在37℃预保温之后在检测的配制物中透明质酸酶活性百分比对于两种PH20突变体均略高。虽然在含有EPB防腐剂水平的配制物中在保温6天后的两个检测的突变体的剩余活性百分比均高于80％，但是在存在EPA防腐剂水平的条件下较低。例如，在EPA防腐剂水平中在第6天的剩余活性就F204P-PH20而言在6天后略低于80％，而V58R-PH20为仅大约40％。因此，结果还示出在37℃，V58R-PH20与F204P-PH20相比有时更不稳定，特别是在具有EPA防腐剂水平的配制物中。在30℃保温至少1周后，F204P-PH20和V58R-PH20是稳定的，且在存在EPA和EPB防腐剂水平条件下均呈现几乎100％的初始活性。相反，rHuPH20在存在EPB防腐剂水平下在30℃下4周后呈现仅大约40％其初始活性，而在存在EPA防腐剂水平下在30℃下4周后呈现出不可检测的活性。
实施例12：使用慢病毒表达载体表达F204P-PH20
产生慢病毒表达载体pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFP-Bsd，其含有编码F204P-PH20的密码子优化的突变体透明质酸酶cDNA。pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFP-Bsd的序列在SEQ ID NO:925中示出。所述pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFP-Bsd载体含有位于核苷酸8611-9471的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、位于残基1933-2327的EF1a启动子、位于残基4786-5370的IRES、位于残基5394-6527的GFP-Bsd，及位于残基3369-4781的编码F204P-PH20的核苷酸。
如Bandaranayake et al.((2011)Nucleic Acids Research,39:e143)所述产生慢病毒。简而言之，将293T细胞(ATCC)以6×106个细胞铺板于10cm组织培养平板上。24小时后，将6μg的psPAX2(SEQ ID NO:926；Addgene质粒No.12260)、3μg的PMD2.G(SEQ ID NO:927；Addgene质粒#12259)和9μg慢病毒载体质粒pLV-EF1a-PH20(F204P)-IRES-GFP-Bsd混合在1.5mLOpti-MEM(Life Technologies)中。将45μL的Lipofectamine 2000(LF2000；Life Technologies)稀释进入1.5mL Opti-MEM(Life Technologies)中。将所述DNA与LF2000轻轻混合，在室温保温20分钟以使得DNA与脂质形成复合物。期间，将过夜培养基用无抗生素的5.0mL DMEM+10％FBS置换。将体积为3.0mL含有DNA-LF2000的复合物加入293T细胞中。在转染后12-16小时，将含有DNA-LF2000复合物的培养基用10mL完全培养基置换。在转染后48小时收集上清并将培养基移至聚丙烯贮存管中。将含有病毒的培养基在1300rpm旋转5分钟以沉淀在收集期间带来的任何293T细胞。小心地将上清移至无菌聚丙烯贮存管中。
将CHO-S细胞(Invitrogen)在通气的125-mL摇瓶(Nalgene)中的CHO-S培养基(Invitrogen)中在120rpm及37℃和5％CO2条件下摇动生长。为了进行转导，将CHO-S细胞加入6孔平板的孔中，以2×106个细胞/孔浓度加入含有4μg/mL海美溴铵的2ml的CHO-S培养基中，终浓度4μg/mL(Polybrene；SIGMA)。将病毒加入每个孔中，感染复数(MOI)为10，并将细胞在37℃及5％CO2条件下摇动(120rpm)保温6小时。然后收获细胞并通过低速离心(500×g，5分钟)沉淀。除去转导培养基，代之以补加了GlutaMax(50mL/升)的10mL新鲜CHO-S培养基(Invitrogen)并转移至T-25烧瓶中。在感染后3天，将杀稻瘟菌素(Invitrogen)加入生长培养基中，浓度为1μg/mL。每隔3-4天定期更换培养基，并将细胞移至T75烧瓶中扩展。在初次感染后2周，细胞扩展至摇瓶并使用含有1μg/mL杀稻瘟菌素的培养基维持培养。收集分泌进CHO-S培养基中的F204P-PH20蛋白质并使用抗-rHuPH20亲和性柱通过亲和性层析纯化，如实施例6所述。蛋白质在标准API缓冲液(10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.5)中制备。
实施例13：二级结构和解链温度分析
检测PH20变体F204P的二级结构和解链温度并与野生型rHuPH20(如实施例1所述产生)对比，以进一步评定所述变体的稳定性。二级结构通过圆二色性检测。装备PTC-424S的Jasco J-810-150S用于CD光谱测量，CD光谱通过Spectra Manager(Version 1.5,Jasco)收集。仪器设置和数据收集的程序在表24中描述。
1.样品制备与测量
制备在Mcllvaine’s缓冲液(McIlvaine(1921)JBC 49:183)中稀释的200μL的0.1mg.mL蛋白质样品，pH调节为pH 6.5。也产生一系列F204P变体样品，其pH通过使用Mcllvaine’s缓冲液调节而不同，pH范围是5.0-7.5，如表25所示。此外，样品也通过调节NaCl浓度为17.5mM-140mM而产生，如表26所示。在测量之前使用0.2μm注射器过滤器过滤样品。针对rHuPH20产生相似样品。然后，将200μL样品移至宽度为1mm的矩形比色杯中，置于Jasco J-810分光偏振仪上。在如表20所述条件下收集样品的CD光谱。解链温度(Tm)使用Spectra Manager(v 1.5,Jasco)从在30℃-75℃温度范围测量的CD光谱强度中计算。将比色杯用清洁器(C577-12,Fisherscientific)在各个样品加样与之间与运行之后进行清洁。
2.结果
结果示出F204P的二级结构与rHuPH20相似。作为温度的函数，圆二色性示出测量的吸收随着温度增加而改变。作为pH的函数，F204P与rHuPH20的Tm分布非常相似，最高Tm均在pH 5.5-pH 6.0之间获得。然而，结果示出F204P变体的Tm在所有检测范围均较野生型rHuPH20高大约9℃。这个结果表明F204P突变体针对热应激条件更稳定。作为盐的函数，结果示出F204P与野生型rHuPH20均呈现出随着盐浓度越高则Tm增加，示出这二者与盐浓度均具有成比例的斜度。
实施例14：在皮内台盼蓝分散测定中的酶活性评定
PH20变体F204P的播散活性使用染料分散体内测定法评定。简而言之，纯化的PH20变体F204P(如实施例12所述制备)和野生型rHuPH20(如实施例1所述制备)均在API缓冲液(10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.5)中配制，浓度为10,000U/mL。将原液在API缓冲液中以1:10系列稀释度进一步稀释为三个靶浓度：1000、100和10U/mL。将纯化的蛋白质(rHuPH20或F204P-PH20)用0.4％台盼蓝(0.4％液体溶液；Catalog No.15250，Invitrogen)以1:1稀释，提供终浓度为5、50和500U/mL蛋白质，每个均含有0.2％台盼蓝。也制备运载体对照(API缓冲液)。这项研究中使用42只雌性NCr nu/nu纯合小鼠，每组6只小鼠，如表27所示。
通过单次皮内注射给予40μL样品。染料分散面积在注射后2.5、5、10、15和20分钟测量，并用具有60mm定焦微距镜头的Nikon D90数码相机对注射部位拍照摄像记录。使用激光测距仪(Leica D3)将相机精确定位于距动物台盼蓝染料区域的预定距离。染料面积使用Image-Pro Analyzer 7.0(MediaCybernetics,Inc)确定。计算的面积以mm2表示。
结果在表28中示出。结果示出PH20变体F204P的分散活性基本上与rHuPH20的分散活性相同。增加染料分散面积的能力是剂量依赖性的，这两种蛋白质在500U/mL均具有最大活性。结果还示出染料分散面积随着皮内注射后的时间而增加。当在所有浓度配制时(5、50和500U/mL)，rHuPH20和F204P-PH20的染料分散面积在所有时间点均显著高于对照的染料分散面积(p<0.05)，除了rHuPH20在最低浓度(5U/mL)时。当彼此对比时，rHuPH20和F204P-PH20示出相似的分散作用，但是在5U/mL与500U/mL时两组之间的分散存在显著差异，而在50U/mL则不存在。总之，结果示出rHuPH20和F204P-PH20与运载体对照相比在染料分散面积中均提供统计学显著的增加。
实施例15：通过皮肤屏障重建评定酶活性
评定F204P-PH20的活性并与rHuPH20对比以测量在皮内给予透明质酸酶之后皮肤屏障重建其自身所需的时间量。皮肤重建通过对比透明质酸酶分散活性的持续时间而评估，通过监测0.4％台盼蓝随着时间的扩散面积而评定。这项研究中使用的蛋白质是纯化的PH20变体F204P(如实施例12所述制备)和野生型rHuPH20(如实施例1所述制备)，其均在API缓冲液(10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.5)中配制。运载体(API缓冲液)用作对照。所述研究中使用雄性NCr nu/nu纯合小鼠，每个时间点3只动物，每组共15只小鼠，如表29所示。
所有小鼠在研究时间0时均接受两次皮内剂量的运载体对照或者rHuPH20或F204P-PH20，为0.04mL中100U/mL。相同对照或检测品注射在每只动物相对的侧面(右侧，R；左侧，L)。注射部位用不褪色记号笔标示。在注射检测品或对照之后0.5、1、4、24和48小时后在相同注射部位通过皮内注射给予体积为0.04mL的台盼蓝染色剂(0.4％液体溶液；15250，Invitrogen)。在台盼蓝染色剂注射后5和20分钟，在注射部位的染料面积通过如实施例14所述对该区域进行数字成像而测量。
结果示于表30。结果示出当在给予所述检测品或对照之后不同时间点测量染料分散面积时，在注射rHuPH20或F204P-PH20后30分钟和1小时，染料分散面积存在统计学显著的增加。然而，在给予所述酶后4小时，与对照相比染料分散面积无统计学显著的增加。此外，在rHuPH20与F204P-PH20处理组之间观测到染料分散面积无统计学显著差别。因此，rHuPH20和F204P的播散活性的持续时间相似及示出rHuPH20与F204P-PH20具有相似的体内效能。
实施例16：与rHuPH20相比F204P-PH20的体内药动学
在经尾静脉静脉内给予rHuPH20和F204P-PH20之后，对比其药动学(PK)，通过测量在给予后随着时间的血浆透明质酸酶水平进行。这项研究中使用的蛋白质是纯化的PH20变体F204P(如实施例12所述制备；批次浓度为1.02mg/mL)及野生型rHuPH20(如实施例1所述制备；批次浓度为0.95mg/mL)，在API缓冲液(10mM组氨酸，130mM NaCl，pH 6.5)中配制。所述蛋白质制备为浓度为在API缓冲液中0.087mg/mL，剂量体积为大约5mL。未给予蛋白质的动物用作对照(剂量前对照)。在这项研究中使用42只雄性CD-1小鼠(～20-30克)，每个处理组6只动物，如表31所示。
小鼠通过尾静脉注射静脉内给予0.433mg/kg rHuPH20或F204P-PH20。血液样品得自在给予后1分钟、5分钟和10分钟的动物。血液样品通过末端放血(心脏穿刺)获得，收集在含有抗凝血剂EDTA的血液收集管中以制备血浆。将血液样品在500g离心10分钟，取出血浆并在-80℃冷冻直至如实施例8所述使用微浊度测定评定透明质酸酶活性。
结果示于表32。结果示出透明质酸酶活性在用透明质酸酶处理之前在血浆中未检测出。在用rHuPH20或F204P-PH20透明质酸酶处理后1分钟内，在血浆中出现可检测的高量的透明质酸酶活性，这在这两个处理组之间是相似的。随着时间，这两个处理组的透明质酸酶活性快速降低，但是在给予后10分钟的血浆中仍存在可检测的透明质酸酶活性。在给予后5分钟和10分钟的时间点，在用F204P-PH20处理的动物血浆中的活性高于用rHuPH20处理的动物中的。这示出F204P-PH20与rHuPH20相比在延长的时间呈现一些更高的活性，并因此呈现更长的体内半衰期。
BQL–低于可量化界限<0.625U/mL最小所需稀释度
a–溶血
某些修改对于本领域技术人员是明显的，本发明仅由所附权利要求书的范围限制。

Claims (232)

1.修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中包含至少一个氨基酸置换，其中：
所述修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比呈现增加的稳定性；及
增加的稳定性表现为在存在一或多种蛋白质变性条件下对变性的增加的抗性。
2.权利要求1的修饰的PH20多肽，其中所述蛋白质变性条件选自高于30℃的升高的温度、搅拌、低盐或无盐、存在赋形剂和变性剂。
3.权利要求2的修饰的PH20多肽，其中所述蛋白质变性条件由于存在赋形剂或变性剂所致，所述赋形剂或变性剂选自抗粘附剂、粘合剂、涂覆剂、充填剂和稀释剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、去污剂、吸附剂或者甜味剂及其组合中的一或多种。
4.权利要求1-3任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列呈现至少68％的氨基酸序列相同性。
5.权利要求1-4任一项的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是在具有SEQ ID NO:3、7或32-66所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、7或32-66任一至少85％相同的氨基酸序列的未修饰的PH20多肽中。
6.权利要求1-5任一项的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是在具有与SEQ ID NO:3、7或32-66任一呈现至少91％序列相同性的氨基酸序列的PH20多肽中。
7.权利要求1-6任一项的修饰的PH20多肽，其中：
所述修饰的PH20多肽在存在变性条件下与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20多肽相比呈现高于110％的透明质酸酶活性；或者
所述修饰的PH20多肽在存在变性条件下与不存在所述变性条件下的透明质酸酶活性相比呈现至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的透明质酸酶活性；或者
所述修饰的PH20多肽在存在变性条件下与在不存在所述变性条件下透明质酸酶活性相比呈现至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的溶解性；或者
所述修饰的PH20多肽在存在变性条件下与在不存在所述变性条件下的透明质酸酶活性相比呈现低于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更低的聚集或结晶化。
8.权利要求1-7任一项的修饰的PH20多肽，其中所述PH20多肽在存在变性条件下稳定至少4小时。
9.权利要求1-8任一项的修饰的PH20多肽，其中所述变性条件包含酚类防腐剂。
10.权利要求1-9任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量的一或多种酚类防腐剂时是稳定的。
11.权利要求10的修饰的PH20多肽，其中所述抗微生物有效量是一或多种酚类防腐剂的总量，以质量浓度(w/v)百分比(％)表示为或大约为0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％，包括端点。
12.权利要求9-11任一项的修饰的PH20多肽，其中所述酚类防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯中的一或多种。
13.权利要求12的修饰的PH20多肽，其中所述防腐剂是对羟基苯甲酸酯，其是对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
14.权利要求9-11任一项的修饰的PH20多肽，其中所述防腐剂是酚类防腐剂，其是m-甲酚、苯酚，或者m-甲酚和苯酚。
15.权利要求9-14任一项的修饰的PH20多肽，其中：
所述修饰的PH20多肽在存在防腐剂条件下与不存在所述防腐剂条件下的透明质酸酶活性相比呈现至少15％的透明质酸酶活性至少4小时，其中所述活性在除了存在防腐剂之外的相同条件下对比。
16.权利要求10-15任一项的修饰的PH20多肽，其包含在相应于选自如下的参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置的至少一个氨基酸置换：10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443或445，其中相应氨基酸位置通过排列对比所述PH20多肽与SEQ IDNO:3所示多肽而鉴别。
17.权利要求1-16任一项的修饰的PH20多肽，其包含选自如下置换的至少一个氨基酸置换，所述置换的位置相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置：
在相应于位置10的位置的G；在相应于位置12的位置的K；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置22的位置的T；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置36的位置的N；在相应于位置46的位置的L；在相应于位置50的位置的M；在相应于位置52的位置的T；在相应于位置52的位置的S；在相应于位置58的位置的C；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的R；在相应于位置58的位置的N；在相应于位置58的位置的Y；在相应于位置58的位置的P；在相应于位置58的位置的H；在相应于位置68的位置的P；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置74的位置的E；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置82的位置的N；在相应于位置83的位置的V；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置83的位置的S；在相应于位置83的位置的G；在相应于位置84的位置的N；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置86的位置的K；在相应于位置97的位置的E；在相应于位置97的位置的L；在相应于位置127的位置的R；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置138的位置的L；在相应于位置142的位置的K；在相应于位置142的位置的N；在相应于位置142的位置的P；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的G；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置144的位置的T；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置195的位置的N；在相应于位置196的位置的E；在相应于位置196的位置的R；在相应于位置204的位置的P；在相应于位置205的位置的A；在相应于位置205的位置的E；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置238的位置的H；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置249的位置的V；在相应于位置261的位置的A；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置279的位置的H；在相应于位置279的位置的V；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置310的位置的Q；在相应于位置314的位置的Y；在相应于位置315的位置的Y；在相应于位置317的位置的N；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的D；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置375的位置的R；在相应于位置376的位置的R；在相应于位置399的位置的V；在相应于位置401的位置的E；在相应于位置407的位置的A；在相应于位置416的位置的L；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置431的位置的E；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置439的位置的C；在相应于位置440的位置的P；在相应于位置443的位置的G；以及在相应于位置445的位置的N。
18.权利要求10-17任一项的修饰的PH20多肽，其包含选自如下置换的至少一个氨基酸置换，所述置换的位置相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置：
在相应于位置52的位置的T，在相应于位置58的位置的K，在相应于位置58的位置的R，在相应于位置68的位置的P，在相应于位置83的位置的V，在相应于位置204的位置的P，在相应于位置261的位置的A，在相应于位置267的位置的T，在相应于位置277的位置的K及在相应于位置421的位置的H。
19.权利要求10-18任一项的修饰的PH20多肽，其包含在PH20多肽中在相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置204的位置的P置换。
20.权利要求10-18任一项的修饰的PH20多肽，其包含在PH20多肽中在相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置58的位置的R置换。
21.权利要求1-20任一项的修饰的PH20多肽，其中：
所述修饰的PH20多肽在或大约在30℃-45℃、35℃-45℃、30℃-37℃、35℃-37℃或者37℃-42℃的温度呈现增加的稳定性；
所述修饰的PH20多肽在升高的温度与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20多肽相比呈现更高的透明质酸酶活性；以及
所述活性是在相同条件下对比的。
22.权利要求21的修饰的PH20多肽，其包含在相应于选自如下位置的氨基酸位置的至少一个氨基酸置换，所述如下位置参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置：1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439和443，其中相应氨基酸位置通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别。
23.权利要求22的修饰的PH20多肽，其包含选自如下相应于参考SEQID NO:3所示氨基酸位置的位置的至少一个氨基酸置换：
在相应于位置1的位置的R；在相应于位置11的位置的S；在相应于位置12的位置的I；在相应于位置14的位置的V；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置29的位置的R；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置50的位置的M；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置84的位置的R；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置87的位置的S；在相应于位置140的位置的K；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置147的位置的S；在相应于位置152的位置的T；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置167的位置的D；在相应于位置172的位置的A；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置178的位置的R；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置212的位置的S；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置233的位置的G；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置240的位置的A；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置277的位置的E；在相应于位置291的位置的S；在相应于位置292的位置的H；在相应于位置292的位置的V；在相应于位置309的位置的S；在相应于位置313的位置的H；在相应于位置314的位置的S；在相应于位置317的位置的I；在相应于位置317的位置的T；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的R；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置368的位置的R；在相应于位置371的位置的S；在相应于位置374的位置的P；在相应于位置389的位置的A；在相应于位置392的位置的V；在相应于位置395的位置的A；在相应于位置396的位置的H；在相应于位置406的位置的N；在相应于位置419的位置的H；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置421的位置的R；在相应于位置421的位置的S；在相应于位置439的位置的A；在相应于位置439的位置的C；及在相应于位置443的位置的G。
24.权利要求1-23任一项的修饰的PH20多肽，其中：
所述修饰的PH20多肽在存在低于100mM的低浓度NaCl的条件下呈现增加的稳定性；
所述修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的未修饰的PH20多肽相比在存在低浓度盐的条件下呈现增加的透明质酸酶活性；以及
所述活性是在相同条件下对比的。
25.修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中包含至少一个氨基酸置换，其中：
所述修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比呈现为至少120％透明质酸酶活性的增加的透明质酸酶活性。
26.权利要求25的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列呈现至少68％的氨基酸序列相同性。
27.权利要求25或26的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是在具有SEQ ID NO:3、7或32-66任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、7或32-66任一所示序列呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列的未修饰的PH20多肽中。
28.权利要求25-27任一项的修饰的PH20多肽，其包含在相应于选自如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置的至少一个氨基酸置换：1、12、15、24、26、27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446和447，其中相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别。
29.权利要求25-28任一项的修饰的PH20多肽，其包含选自如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的置换的至少一个氨基酸置换：
在相应于位置1的位置的组氨酸(H)；在相应于位置1的位置的Q；在相应于位置12的位置的E；在相应于位置12的位置的T；在相应于位置15的位置的V；在相应于位置24的位置的E；在相应于位置24的位置的H；在相应于位置26的位置的E；在相应于位置26的位置的K；在相应于位置27的位置的K；在相应于位置27的位置的R；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置29的位置的I；在相应于位置29的位置的L；在相应于位置29的位置的M；在相应于位置29的位置的P；在相应于位置29的位置的S；在相应于位置29的位置的V；在相应于位置30的位置的G；在相应于位置30的位置的H；在相应于位置30的位置的K；在相应于位置30的位置的M；在相应于位置30的位置的R；在相应于位置30的位置的S；在相应于位置31的位置的A；在相应于位置31的位置的C；在相应于位置31的位置的H；在相应于位置31的位置的I；在相应于位置31的位置的K；在相应于位置31的位置的L；在相应于位置31的位置的P；在相应于位置31的位置的R；在相应于位置31的位置的S；在相应于位置31的位置的T；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置32的位置的F；在相应于位置32的位置的G；在相应于位置32的位置的H；在相应于位置33的位置的W；在相应于位置37的位置的F；在相应于位置39的位置的N；在相应于位置39的位置的T；在相应于位置46的位置的R；在相应于位置48的位置的F；在相应于位置48的位置的H；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置52的位置的Q；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置63的位置的W；在相应于位置67的位置的V；在相应于位置68的位置的H；在相应于位置68的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的C；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的I；在相应于位置69的位置的L；在相应于位置69的位置的M；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置69的位置的W；在相应于位置69的位置的Y；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的C；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的K；在相应于位置70的位置的L；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的P；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的S；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置71的位置的R；在相应于位置71的位置的S；在相应于位置72的位置的M；在相应于位置72的位置的Q；在相应于位置73的位置的H；在相应于位置73的位置的L；在相应于位置73的位置的W；在相应于位置74的位置的A；在相应于位置74的位置的C；在相应于位置74的位置的G；在相应于位置74的位置的N；在相应于位置74的位置的P；在相应于位置74的位置的R；在相应于位置74的位置的S；在相应于位置74的位置的V；在相应于位置74的位置的W；在相应于位置75的位置的F；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的R；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置84的位置的R；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置87的位置的C；在相应于位置87的位置的T；在相应于位置87的位置的Y；在相应于位置92的位置的C；在相应于位置93的位置的I；在相应于位置93的位置的L；在相应于位置93的位置的R；在相应于位置93的位置的T；在相应于位置94的位置的R；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置118的位置的Q；在相应于位置120的位置的F；在相应于位置120的位置的V；在相应于位置120的位置的Y；在相应于位置127的位置的H；在相应于位置127的位置的N；在相应于位置131的位置的G；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置131的位置的V；在相应于位置135的位置的D；在相应于位置135的位置的G；在相应于位置135的位置的R；在相应于位置141的位置的H；在相应于位置141的位置的Y；在相应于位置142的位置的R；在相应于位置147的位置的R；在相应于位置147的位置的V；在相应于位置148的位置的K；在相应于位置150的位置的G；在相应于位置151的位置的K；在相应于位置151的位置的L；在相应于位置151的位置的M；在相应于位置151的位置的Q；在相应于位置151的位置的R；在相应于位置152的位置的R；在相应于位置155的位置的G；在相应于位置155的位置的K；在相应于位置156的位置的D；在相应于位置163的位置的A；在相应于位置163的位置的E；在相应于位置163的位置的K；在相应于位置163的位置的R；在相应于位置164的位置的M；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置165的位置的N；在相应于位置166的位置的A；在相应于位置166的位置的F；在相应于位置166的位置的H；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置166的位置的Y；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置170的位置的R；在相应于位置174的位置的K；在相应于位置198的位置的D；在相应于位置206的位置的K；在相应于位置206的位置的L；在相应于位置212的位置的N；在相应于位置213的位置的M；在相应于位置213的位置的N；在相应于位置215的位置的M；在相应于位置219的位置的S；在相应于位置233的位置的K；在相应于位置233的位置的R；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置236的位置的R；在相应于位置237的位置的E；在相应于位置238的位置的S；在相应于位置247的位置的I；在相应于位置257的位置的T；在相应于位置259的位置的P；在相应于位置260的位置的Y；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置261的位置的N；在相应于位置263的位置的K；在相应于位置263的位置的R；在相应于位置269的位置的A；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置271的位置的M；在相应于位置272的位置的T；在相应于位置276的位置的D；在相应于位置276的位置的S；在相应于位置276的位置的Y；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置277的位置的R；在相应于位置277的位置的T；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的K；在相应于位置278的位置的N；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置278的位置的S；在相应于位置278的位置的T；在相应于位置278的位置的Y；在相应于位置282的位置的M；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置293的位置的A；在相应于位置293的位置的C；在相应于位置293的位置的F；在相应于位置293的位置的M；在相应于位置293的位置的P；在相应于位置293的位置的Q；在相应于位置293的位置的V；在相应于位置305的位置的E；在相应于位置308的位置的G；在相应于位置308的位置的N；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置309的位置的L；在相应于位置309的位置的N；在相应于位置309的位置的Q；在相应于位置309的位置的R；在相应于位置309的位置的T；在相应于位置310的位置的A；在相应于位置310的位置的G；在相应于位置313的位置的K；在相应于位置313的位置的R；在相应于位置315的位置的H；在相应于位置317的位置的I；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置317的位置的R；在相应于位置318的位置的M；在相应于位置320的位置的H；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置320的位置的R；在相应于位置324的位置的R；在相应于位置325的位置的A；在相应于位置325的位置的D；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的H；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的M；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；在相应于位置325的位置的S；在相应于位置326的位置的V；在相应于位置328的位置的I；在相应于位置328的位置的K；在相应于位置328的位置的L；在相应于位置328的位置的S；在相应于位置328的位置的Y；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置347的位置的S；在相应于位置353的位置的V；在相应于位置359的位置的T；在相应于位置371的位置的R；在相应于位置377的位置的P；在相应于位置377的位置的T；在相应于位置380的位置的W；在相应于位置380的位置的Y；在相应于位置389的位置的K；在相应于位置392的位置的M；在相应于位置395的位置的R；在相应于位置399的位置的M；在相应于位置399的位置的T；在相应于位置399的位置的W；在相应于位置405的位置的G；在相应于位置407的位置的D；在相应于位置407的位置的Q；在相应于位置409的位置的A；在相应于位置409的位置的Q；在相应于位置410的位置的T；在相应于位置418的位置的P；在相应于位置419的位置的F；在相应于位置419的位置的I；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置419的位置的R；在相应于位置419的位置的S；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置421的位置的K；在相应于位置421的位置的N；在相应于位置421的位置的Q；在相应于位置421的位置的R；在相应于位置421的位置的S；在相应于位置425的位置的K；在相应于位置431的位置的A；在相应于位置431的位置的H；在相应于位置431的位置的K；在相应于位置431的位置的Q；在相应于位置431的位置的R；在相应于位置431的位置的S；在相应于位置431的位置的V；在相应于位置433的位置的L；在相应于位置433的位置的R；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置436的位置的K；在相应于位置437的位置的I；在相应于位置437的位置的M；在相应于位置438的位置的T；在相应于位置439的位置的V；在相应于位置440的位置的H；在相应于位置440的位置的R；在相应于位置441的位置的F；在相应于位置442的位置的R；在相应于位置443的位置的A；在相应于位置443的位置的M；在相应于位置445的位置的M；在相应于位置445的位置的P；在相应于位置446的位置的A；在相应于位置447的位置的D；在相应于位置447的位置的N；和/或在相应于位置447的位置的Q。
30.权利要求25-29任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽与不含有所述氨基酸置换的PH20多肽相比呈现至少2.0倍的透明质酸酶活性。
31.权利要求30的修饰的PH20多肽，其包含在相应于选自参考SEQ IDNO:3所示位置的24、29、31、48、58、69、70、75、84、97、165、166、271、278、317、320、325和326的位置的氨基酸位置的至少一个氨基酸置换，其中相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的。
32.权利要求31的修饰的PH20的多肽，其包含选自如下在参考SEQ IDNO:3所示氨基酸位置的位置的置换的至少一个氨基酸置换：
在相应于位置24的位置的E；在相应于位置29的位置的E；在相应于位置31的位置的V；在相应于位置48的位置的N；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的Q；在相应于位置69的位置的A；在相应于位置69的位置的F；在相应于位置69的位置的G；在相应于位置69的位置的P；在相应于位置69的位置的R；在相应于位置70的位置的A；在相应于位置70的位置的F；在相应于位置70的位置的G；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的H；在相应于位置70的位置的N；在相应于位置70的位置的R；在相应于位置70的位置的T；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置75的位置的L；在相应于位置75的位置的T；在相应于位置84的位置的G；在相应于位置97的位置的G；在相应于位置165的位置的D；在相应于位置166的位置的L；在相应于位置166的位置的R；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置271的位置的L；在相应于位置278的位置的H；在相应于位置278的位置的R；在相应于位置317的位置的K；在相应于位置320的位置的K；在相应于位置325的位置的E；在相应于位置325的位置的G；在相应于位置325的位置的K；在相应于位置325的位置的N；在相应于位置325的位置的Q；及在相应于位置326的位置的V。
33.修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:7所示PH20多肽、其C-末端截短的片段或者在具有与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少91％相同的氨基酸序列的PH20多肽中包含至少一个氨基酸置换，其中：
所述至少一个氨基酸置换是在相应于选自如下参考SEQ ID NO:3或7所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置：1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117,118、119、120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446和447；
相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别；及
条件是如果所述修饰的PH20多肽含有在相应于位置13、47、131或219的位置的氨基酸置换，则所述置换不是用丙氨酸(A)置换。
34.权利要求33的修饰的PH20多肽，其中：
所述修饰的PH20多肽呈现出不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的至少40％的透明质酸酶活性；及
所述活性是在相同条件下对比的。
35.权利要求33或34的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是在具有SEQ ID NO:3、7或32-66任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、7或32-66任一呈现至少91％序列相同性的氨基酸序列的未修饰的PH20多肽中。
36.权利要求33-35任一项的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是表3中所示的氨基酸置换。
37.修饰的PH20多肽，其在SEQ ID NO:7所示PH20多肽、其C-末端截短的片段或者在具有与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少91％相同的氨基酸序列的PH20多肽中包含至少一个氨基酸置换，其中：
所述修饰的PH20多肽呈现出低于20％的不含有所述氨基酸置换的PH20多肽的透明质酸酶活性；
所述活性是在相同条件下对比的；
所述氨基酸置换是在相应于选自如下参考SEQ ID NO:3或7所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444或447；
相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的；及
条件是：
(i)如果所述修饰的PH20多肽含有在相应于位置200、333、358或393的位置的氨基酸置换，则所述置换不是用丙氨酸(A)置换；
(ii)如果所述修饰的PH20多肽含有在相应于位置111或249的位置的氨基酸置换，则所述置换不是用天冬酰胺(N)置换；
(iii)如果所述修饰的PH20多肽含有在相应于位置113的位置的氨基酸置换，则所述置换不是用谷氨酰胺(Q)置换；
(iv)如果所述修饰的PH20多肽含有在相应于位置176的位置的氨基酸置换，则所述置换不是用甘氨酸(G)置换；及
(v)如果所述修饰的PH20多肽含有在相应于位置252的位置的氨基酸置换，则所述置换不是用苏氨酸(T)置换。
38.权利要求37的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是在具有SEQ ID NO:3、7或32-66任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、7或32-66任一呈现至少91％序列相同性的氨基酸序列的未修饰的PH20多肽中。
39.权利要求37或38的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是表5所示的氨基酸置换。
40.权利要求1-39任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20不是由SEQ ID NO:3、6-66、69、72、856-861、869或870任一所示任何氨基酸序列组成的。
41.权利要求1-40任一项的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换是在具有SEQ ID NO:3、7、69或72任一所示任何氨基酸序列的未修饰的PH20多肽中，条件是：
(i)其中所述修饰的PH20多肽仅包含单一氨基酸置换，所述置换不相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的氨基酸置换V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、E249Q、R252T、N333A或N358A；
(ii)其中所述修饰的PH20多肽仅包含两个氨基酸置换，所述置换不相应于参考SEQ ID NO:3所示位置的氨基酸置换P13A/L464W、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N219A或N333A/N358A；及
(iii)其中所述修饰的PH20多肽仅包含三个氨基酸置换，所述置换不相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的氨基酸置换N47A/N131A/N219A。
42.权利要求1-41任一项的修饰的PH20多肽，其中所述多肽是人多肽。
43.权利要求1-42任一项的修饰的PH20多肽，其中所述氨基酸置换不是在相应于参考SEQ ID NO:3的位置204的位置具有脯氨酸(P)的天然或野生型PH20多肽中。
44.权利要求1-43任一项的修饰的PH20多肽，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48,49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或更多个氨基酸置换。
45.权利要求1-44任一项的修饰的PH20多肽，其是缺少信号序列的成熟PH20多肽。
46.修饰的PH20多肽，其包含SEQ ID NO:73-855任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:73-855任一所示氨基酸序列呈现至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列。
47.权利要求1-46任一项的修饰的PH20多肽，其在中性pH呈现催化活性。
48.权利要求1-47任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽是在从细胞中表达时分泌的，且可溶解于上清中。
49.权利要求1-48任一项的修饰的PH20多肽，其是基本上纯化的或分离的。
50.权利要求1-49任一项的修饰的PH20多肽，其通过选自糖基化、唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟基化和磷酸化的修饰方式而修饰。
51.权利要求50的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽是糖基化的，其中所述多肽包含至少N-乙酰葡糖胺部分，与至少三个天冬酰胺(N)残基的每一个连接。
52.权利要求51的修饰的PH20多肽，其中所述三个天冬酰胺残基相应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基200、333和358。
53.权利要求1-52任一项的修饰的PH20多肽，其通过与聚合物缀合而修饰。
54.权利要求53的修饰的PH20多肽，其中所述聚合物是葡聚糖或PEG。
55.权利要求1-54任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽与选自多聚化结构域、毒素、可检测标记或药物的部分缀合。
56.权利要求55的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽与Fc结构域缀合。
57.核酸分子，其编码权利要求1-48任一项的修饰的PH20多肽。
58.载体，其包含权利要求57的核酸分子。
59.权利要求58的载体，其是真核或原核载体。
60.权利要求58或59的载体，其是哺乳动物载体或病毒载体。
61.权利要求60的载体，其是病毒载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体或者痘苗病毒载体。
62.细胞，其包含权利要求58-61任一项的载体。
63.权利要求62的细胞，其是哺乳动物细胞。
64.权利要求63的细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
65.修饰的PH20多肽，其由权利要求62-64任一项的细胞产生。
66.产生修饰的PH20多肽的方法，包括：
将权利要求57的核酸或者权利要求58-61任一项的载体导入能将N-连接的糖部分掺入多肽的细胞中；
在一定条件下培养所述细胞，其中编码的修饰的PH20多肽由所述细胞产生和分泌；及
回收表达的多肽。
67.权利要求66的方法，其中所述核酸与启动子可操纵地连接。
68.权利要求66或67的方法，其中所述细胞是真核细胞。
69.权利要求66-68任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
70.权利要求66-69任一项的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
71.药物组合物，其包含权利要求1-56任一项的修饰的PH20多肽。
72.权利要求71的药物组合物，其中所述组合物中修饰的PH20多肽在或在大约2℃至8℃且包括端点的温度稳定至少1个月，或者在或在大约30℃至42℃且包括端点的温度稳定至少3天。
73.权利要求71或72的药物组合物，其中所述药物组合物包含药物可接受的赋形剂。
74.权利要求71-73任一项的药物组合物，其用于单剂给予。
75.权利要求71-73任一项的药物组合物，其用于多剂给予。
76.权利要求71-75任一项的药物组合物，其中所述修饰的PH20多肽的浓度是或是大约0.1μg/mL至100μg/mL、1μg/mL至50μg/mL或者1μg/mL至20μg/mL。
77.权利要求71-76任一项的药物组合物，其中所述修饰的PH20多肽的量是或是大约10U/mL-5000U/mL、50U/mL-4000U/mL、100U/mL-2000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL或者100U/mL-1000U/mL。
78.权利要求71-77任一项的药物组合物，其中所述组合物的体积是或是大约0.5mL-50mL、1mL-10mL或者1mL-5mL。
79.权利要求71-78任一项的药物组合物，其包含浓度为低于或大约或为200mM、180mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更低的NaCl。
80.权利要求71-79任一项的药物组合物，其包含浓度为或大约为0.1mM-200mM、0.1mM-100mM、120mM-200mM、10mM-50mM、10mM-90mM、80mM-200mM、80mM-140mM、50mM-100mM、80mM-100mM、50mM-80mM、100mM-140mM或120mM-140mM的NaCl。
81.权利要求71-80任一项的药物组合物，其包含抗微生物有效量的防腐剂或者防腐剂混合物。
82.权利要求81的药物组合物，其中所述防腐剂是酚类防腐剂、非酚类防腐剂或者酚类防腐剂及非酚类防腐剂。
83.权利要求81或82的药物组合物，其中所述防腐剂选自苯酚、m-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、氯己定二盐酸盐、氯己定二葡糖酸盐、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、溴棕三甲铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯及其任何组合。
84.权利要求81-83任一项的药物组合物，其中所述组合物含有仅一种防腐剂。
85.权利要求81-83任一项的药物组合物，其中所述组合物含有2、3或4种不同防腐剂的防腐剂混合物。
86.权利要求71-85任一项的药物组合物，其包含至少一种酚类防腐剂。
87.权利要求86的药物组合物，其中所述防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯。
88.权利要求87的药物组合物，其中所述防腐剂是对羟基苯甲酸酯，其是对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
89.权利要求81-88任一项的药物组合物，其中所述抗微生物有效量是一或多种防腐剂的总量，以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，其为0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％，包括端点。
90.权利要求71-89任一项的药物组合物，其包含治疗活性剂。
91.权利要求90的药物组合物，其中所述治疗剂与所述组合物配制或者在单独组合物中。
92.权利要求90或91的药物组合物，其中所述治疗性物质是多肽、蛋白质、核酸、药物、小分子或者有机分子。
93.权利要求90-92任一项的药物组合物，其中所述治疗活性剂选自化疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀阿米巴虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、及抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、生物杀灭剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药物、避孕药、减充血剂、利尿剂、抑郁剂、诊断剂、电解剂、催眠药、激素制剂、高血糖制剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼科用药、拟副交感神经剂、精神兴奋剂、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、尿路用药、阴道制剂、杀病毒剂、维生素制剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转换酶抑制剂、或者睡眠诱导剂。
94.权利要求90-93任一项的药物组合物，其中所述治疗剂选自抗体、免疫球蛋白、二膦酸盐、细胞因子、化疗剂、凝血因子和胰岛素。
95.权利要求94的药物组合物，其中所述治疗剂是速效胰岛素。
96.权利要求95的药物组合物，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素或者胰岛素类似物。
97.权利要求95或96的药物组合物，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素，其是人胰岛素或猪胰岛素。
98.权利要求95-97任一项的药物组合物，其中：
所述速效胰岛素包含具有SEQ ID NO:862所示氨基酸序列的A链及具有SEQ ID NO:863所示氨基酸序列的B链；或者
所述速效胰岛素包含具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基位置88-108所示氨基酸序列的A链及具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基位置25-54所示氨基酸序列的B链。
99.权利要求95或96的药物组合物，其中所述速效胰岛素是选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素的胰岛素类似物。
100.权利要求99的药物组合物，其中所述胰岛素类似物选自具有SEQID NO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ NO:865-867任一所示氨基酸序列的B链的胰岛素。
101.权利要求95-100任一项的药物组合物，其中所述速效胰岛素的量是或是大约10U/mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-1000U/mL或者500U/mL-1000U/mL，包括端点。
102.权利要求90-93任一项的药物组合物，其中所述治疗剂选自阿达木单抗、阿加糖酶β、阿莱法塞、氨苄青霉素、阿那白滞素、抗脊髓灰质炎疫苗、抗胸腺细胞、阿奇霉素、贝卡普勒明、卡泊芬净、头孢唑林、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、西妥昔单抗、西司他丁、克拉维酸、克林霉素、达依泊汀α、达克珠单抗、白喉、白喉抗毒素、白喉类毒素、依法珠单抗、肾上腺素、促红细胞生成素α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促卵泡素α、促卵泡素β、磷苯妥英、钆双胺、Gadopentetates、加替沙星、格拉默、GM-CSF's、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司琼、流感嗜血杆菌B、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、替伊莫单抗、Tiuxetans、免疫球蛋白、流感嗜血杆菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔单抗、赖脯胰岛素、75％中性赖脯鱼精蛋白(NPL)/25％赖脯胰岛素、50％中性鱼精蛋白Hagedorn(NPH)/50％普通胰岛素、70％NPH/30％普通胰岛素；普通胰岛素、NPH胰岛素、超级胰岛素、特慢胰岛素、和甘精胰岛素、干扰素、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素α-2a、干扰素α2-b、干扰素Alphacon、干扰素α-n、干扰素β、干扰素β-1a、干扰素γ、干扰素α-con、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉罗尼酶、左氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、劳拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹-腮腺炎-风疹病毒疫苗、风疹疫苗、甲羟孕酮、美罗培南、甲泼尼龙、咪达唑仑、吗啡、奥曲肽、奥马珠单抗、昂丹司琼、帕利珠单抗、泮托拉唑、培门冬酶、培非司亭、Peg-干扰素α-2a、Peg-干扰素α-2b、培维索孟、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗和肺炎球菌缀合物疫苗、异丙嗪、瑞替普酶、生长激素、舒巴坦、舒马普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破伤风纯化类毒素、替卡西林、托西莫单抗、曲安西龙、曲安奈德、己曲安奈德、万古霉素、水痘带状疱疹免疫球蛋白、水痘疫苗、其它疫苗、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、砒霜、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、BCG Live、贝沙罗汀、博来霉素、白消安、静脉内白消安、口服白消安、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀与聚苯丙生、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素脂质体、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素2、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、丙酸屈他雄酮、Elliott's B溶液、表柔比星、阿法依泊汀、雌氮芥、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16s、依西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉妥珠单抗、奥佐米星、吉妥珠单抗奥佐米星、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNUs、氮芥(Mechlorethamines)、氮芥(Nitrogen mustards)、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、L-PAMs、巯嘌呤、6-巯嘌呤、美司钠、氨甲喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素类、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、苯丙酸诺龙、若莫单抗、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕玛二磷酸、培加酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、光辉霉素、卟菲尔钠、卟吩姆钠、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥普单抗、沙格司亭、链脲菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、三亚乙基硫代磷酰胺(噻替派)、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、唑来膦酸、阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、视黄酸、阿利维A酸、9-顺式-视黄酸、Alvocidibs、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那昔酮、安西他滨、氨茴霉素、Apaziquones、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、Banoxantrones、Batabulins、巴马司他、贝那昔滨、苯达莫司汀、苯佐替派、比卡鲁胺、比他舍平、比立考达、比生群、Bisnafide Dimesylates、比折来新、硼替佐米、布喹那、溴匹立明、布度钛、放线菌素C、Canertinibs、卡醋胺、卡贝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、西马多丁、苯丁酸氮芥、塞奥罗奈、西罗霉素、克兰氟脲、氯法拉滨、克立那托、地西他滨、右尼古地平、右奥马铂、地扎胍宁、地吖醌、Dibrospidiums、地诺孕素、地那林、Disermolides、Dofequidars、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、达佐霉素、依考莫司汀、依达曲沙、Edotecarins、依氟鸟氨酸、依拉克达、依利奈法德、依沙芦星、乙嘧替氟、恩洛铂、恩普氨酯、Enzastaurins、依匹哌啶、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依托格鲁、氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟甲睾酮、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他滨、吉罗酚、Gimatecans、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷酰胺、伊莫福新、伊洛马司他、伊美克、英丙舒凡、Indisulams、双丙氧亚胺醌、白介素、白介素-2s、重组白介素、茚托利辛、碘苄胍、异丙铂、伊索拉定、Ixabepilones、酮曲沙、L-阿拉诺新、兰瑞肽、Lapatinibs、来多蒽琼、亮丙瑞林、亮丙瑞林、来沙骨化醇、利阿唑、洛铂、洛美曲索、法尼醇蛋白转移酶抑制剂、洛索蒽醌、勒托替康、马磷酰胺、甘露舒凡、马立马司他、马索罗酚、美坦辛、氮芥、美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯氨啶、美妥替哌、米帕、米泼昔芬、米索硝唑、米丁度胺、Mitocarcins、丝裂红素、米托拉酮、米托洁林、米托胍腙、米托马星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立宾、莫法罗汀、莫哌达醇、Mubritinibs、霉酚酸、奈达铂、Neizarabines、奈莫柔比星、硝氨丙吖啶、诺考达唑、诺拉霉素、诺拉曲塞、Nortopixantrones、奥马铂、Ortataxels、奥替拉西、奥昔舒仑、氧芬胂、Patupilones、培得星、培利霉素、Pelitrexols、培美曲塞、溴新斯的明、培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、Picoplatins、吡奈非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡罗蒽醌、Pixantrones、Plevitrexeds、普洛美坦、泊非霉素、波尼莫司汀、普罗帕脒、螺丙醇、嘌嘧替派、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、罗谷亚胺、罗喹美克、链黑霉素、Sabarubicins、沙芬戈、沙铂、司铂、司莫司汀、辛曲秦、西左非兰、索布佐生、索拉非尼、Sparfosates、磷乙天冬氨酸、司帕霉素、锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、角鲨胺、链黑霉素、链伐立星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、Tacedinalines、他利霉素、他莫司汀、Tariquidars、牛磺莫司汀、Tecogalans、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替罗昔隆、硫咪嘌呤、硫咪嘌呤、噻唑羧胺核苷、噻氯咪索、替洛隆、汀考达、噻莫西酸、替拉扎明、Topixantrones、曲贝替定、海鞘素743、曲托龙、曲西立滨、曲洛司坦、三甲曲沙、Triplatin Tetranitrates、曲普瑞林、曲磷胺、妥布氯唑、乌苯美司、乌瑞替派、伐司朴达、伐普肽、维替泊芬、长春碱、长春地辛、长春匹定、长春氟宁、长春米特、长春甘酯、长春西醇、长春罗新、长春罗定、长春曲醇、长春利定、伏氯唑、黄链霉素A、胍甲环素、折尼铂、亚苄维C(2H)、净司他丁、佐柔比星、Zosuquidars、乙酰唑胺、阿昔洛韦、胆影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、变应原浸出物、α1-蛋白酶抑制剂、前列地尔、阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶碱、阿米替林、异戊巴比妥、氨力农、镇痛药、抗-脊髓灰质炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破伤风免疫球蛋白、破伤风疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精氨酸、抗坏血酸、阿替洛尔、阿曲库铵、阿托品、金硫葡糖、硫唑嘌呤、氨曲南、杆菌肽、巴氯芬、巴利昔单抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、比伐卢定、肉毒抗毒素、溴苄铵、布美他尼、布比卡因、丁丙诺啡、布托啡诺、降钙素、骨化三醇、钙、卷曲霉素、卡波前列素、肉碱、头孢孟多、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑肟、头孢呋辛、氯霉素、氯普鲁卡因、氯喹、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸软骨素、绒毛膜促性腺激素α、铬、西多福韦、西咪替丁、环丙沙星、顺阿曲库铵、可乐定、可待因、秋水仙碱、粘菌素、胶原、Corticorelin ovine triflutates、促皮质素、二十四肽促皮质素、氰钴胺、环孢菌素、半胱氨酸、达昔单抗、达福普汀、达肝素、达那肝素、丹曲林、去铁胺、去氨加压素、地塞米松、右美托咪定、右泛醇、右旋糖酐、右旋糖酐铁、泛影酸、地西泮、二氮嗪、双环维林、Digibinds、地高辛、双氢麦角胺、地尔硫卓、苯海拉明、双嘧达莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯铵、多沙普仑、度骨化醇、多西环素、氟哌利多、二羟丙茶碱、依地酸、依酚氯铵、依那普利拉、麻黄碱、依前列醇、麦角钙化醇、麦角新碱、厄他培南、红霉素、艾司洛尔、雌二醇、Estrogenics、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、羟乙磷酸、依托咪酯、法莫替丁、非诺多泮、芬太尼、氟马西尼、荧光素、氟奋乃静、叶酸、甲吡唑、福米韦生、磺达肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、钆特醇、钆弗塞胺、更昔洛韦、庆大霉素、胰高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆溴铵、戈那瑞林、绒毛膜促性腺激素、嗜血杆菌B多糖、氯化血红素、Herbals、组胺、肼苯哒嗪、氢化可的松、氢吗啡酮、羟钴胺、羟嗪、莨菪碱、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺、碘拉酸、碘克沙酸、碘昔兰、异烟肼、异丙肾上腺素、日本脑炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉贝洛尔、来匹卢定、左布比卡因、左甲状腺素、林可霉素、碘塞罗宁、促黄体激素、莱姆病疫苗、锰福地吡、Manthtols、脑膜炎球菌多糖疫苗、哌替啶、甲哌卡因、美索达嗪、间羟胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲基多巴类、甲基麦角新碱、甲氧氯普胺、美托洛尔、甲硝唑、米诺环素、米伐克龙、鱼肝油酸、莫西沙星、莫罗单抗-CD3、麦考酚酸吗乙酯、萘夫西林、纳布啡、纳美芬、纳洛酮、新斯的明、烟酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普钠、去甲肾上腺素、奥芬那君、苯唑西林、羟吗啡酮、土霉素、缩宫素、潘可龙、泛醇、泛酸、罂粟碱、PEG干扰素α2A、青霉素G、喷他脒、喷他佐辛、戊巴比妥、全氟丙烷、奋乃静、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧肾上腺素、苯妥英、毒扁豆碱、植物甲萘醌、多粘菌素、解磷定、丙胺卡因、普鲁卡因胺、普鲁卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛尔、吡啶斯的明氢氧化物、维生素B6、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁、瑞芬太尼、核黄素、利福平、罗哌卡因、钐、东莨菪碱、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人蛋氨生长素、壮观霉素、链激酶、链霉素、琥珀酰胆碱、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他罗利姆、特布他林、特立帕肽、睾酮、破伤风抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸盐/酯、茶碱、硫胺素、硫乙拉嗪、硫喷妥、促甲状腺激素、亭扎肝素、替罗非班、妥布霉素、妥拉唑啉、甲苯磺丁脲、托拉塞米、氨甲环酸、曲罗尼尔、三氟拉嗪、曲美苄胺、甲氧苄啶、氨丁三醇、结核菌素、伤寒疫苗、尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸、加压素、维库溴铵、维拉帕米、伏立康唑、华法林、黄热病疫苗、齐多夫定、锌、盐酸齐拉西酮、阿克拉霉素、放线菌素、阿霉素、偶氮丝氨酸、6-氮尿苷、嗜癌素、色霉素、二甲叶酸、6-叠氮-5-氧-L-正亮氨酸、依诺他滨、氟尿苷、橄榄霉素、吡柔比星、吡曲克辛、蝶罗呤、替加氟、杀结核菌素、阿替普酶、阿西莫单抗、贝伐珠单抗、A型肉毒菌毒素、B型肉毒菌毒素、卡罗单抗喷地肽、达克珠单抗、阿法链道酶、替加色罗α、戊酸印西洛马、碘-131；抗生素物质；血管发生抑制剂；抗白内障和抗糖尿病视网膜病变药物；碳酸酐酶抑制剂；瞳孔放大剂；光动力治疗剂；前列腺素类似物；生长因子；抗肿瘤药物；抗代谢物；抗病毒药物；杀阿米巴剂和抗原生动物剂；抗结核药和抗麻风药；抗毒素和抗蛇毒素；抗血友病因子，抗抑制剂凝血复合物，抗凝血酶III，凝血因子V，凝血因子IX，血浆蛋白级分，von Willebrand因子；抗血小板制剂，集落刺激因子(CSF)；红细胞生成刺激物；止血剂和白蛋白；免疫球蛋白；凝血酶抑制剂；抗凝血剂；类固醇抗炎药物，选自阿氯米松、阿尔孕酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼缩松、肤轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟泼尼龙、丙酮缩氟氢羟龙、氟替卡松、福莫可他、氯氟舒松、卤倍他索、卤米松、卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、氯替泼诺碳酸乙酯、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、利美索龙、替可的松和曲安西龙；docosenoid，前列腺素类药物，前列腺素类似物，抗前列腺素和前列腺素前体；缩瞳剂，胆碱能药和抗胆碱酯酶；及抗变态反应药。
103.权利要求71-102任一项的药物组合物，其是液体组合物。
104.一种共配制物，其包含：
治疗有效量的权利要求1-56任一项的修饰的PH20多肽；及
治疗有效量的速效胰岛素。
105.一种共配制物，其包含治疗有效量的权利要求1-20任一项的修饰的PH20多肽；及
治疗有效量的速效胰岛素。
106.权利要求104或105的共配制物，其中所述配制物中修饰的PH20多肽在或在大约2℃-8℃且包括端点的温度稳定至少1个月，或者在或在大约30℃-42℃且包括端点的温度稳定至少3天。
107.权利要求104-106任一项的共配制物，其中所述修饰的PH20多肽的量是或是大约100U/mL-1000U/mL、200U/mL-800U/mL或者400U/mL-800U/mL。
108.权利要求104-107任一项的共配制物，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素或者胰岛素类似物。
109.权利要求104-108任一项的共配制物，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素，其是人胰岛素或猪胰岛素。
110.权利要求104-109任一项的共配制物，其中：
所述速效胰岛素包含具有SEQ ID NO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:863所示氨基酸序列的B链；或者
所述速效胰岛素包含具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基位置88-108所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基位置25-54所示氨基酸序列的B链。
111.权利要求104-108任一项的共配制物，其中所述速效胰岛素是选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素和赖谷胰岛素的胰岛素类似物。
112.权利要求111的共配制物，其中所述胰岛素类似物选自具有SEQID NO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ NO:865-867任一所示氨基酸序列的B链的胰岛素。
113.权利要求104-112任一项的共配制物，其中速效胰岛素的量是或是大约10U/mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-1000U/mL或者500U/mL-1000U/mL，包括端点。
114.权利要求104-113任一项的共配制物，其pH为或为大约7.0-7.6。
115.权利要求104-114任一项的共配制物，其包含浓度为或为大约0.1mM-200mM、0.1mM-100mM、120mM-200mM、10mM-50mM、10mM-90mM、80mM-200mM、80mM-140mM、50mM-100mM、80mM-100mM、50mM-80mM、100mM-140mM或120mM-140mM的NaCl。
116.权利要求104-115任一项的共配制物，其包含抗微生物有效量的至少一种防腐剂。
117.权利要求116的共配制物，其中所述抗微生物有效量是一或多种防腐剂的总量，以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，为0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％，包括端点。
118.权利要求116或117的共配制物，其中所述防腐剂是酚类防腐剂、非酚类防腐剂或者酚类防腐剂及非酚类防腐剂。
119.权利要求116-118任一项的共配制物，其中所述防腐剂选自苯酚、m-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、氯己定二盐酸盐、氯己定二葡糖酸盐、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、溴棕三甲铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯及其任意组合。
120.权利要求116-119任一项的共配制物，其中所述组合物含有仅一种防腐剂。
121.权利要求116-119任一项的共配制物，其中所述组合物含有2、3或4种不同防腐剂的防腐剂混合物。
122.权利要求104-121任一项的共配制物，其包含至少一种酚类防腐剂。
123.权利要求122的共配制物，其中所述防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯。
124.权利要求123的共配制物，其中所述防腐剂是对羟基苯甲酸酯，其是对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
125.权利要求104-124任一项的共配制物，其包含表面活性剂，所述表面活性剂的量以配制物中质量浓度(w/v)百分比％表示，为至少或至少大约0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％.0.08％或0.9％。
126.权利要求125的共配制物，其中所述表面活性剂选自聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨糖醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。
127.权利要求126的共配制物，其中所述表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨酯20和聚山梨酯80。
128.权利要求104-127任一项的共配制物，其包含缓冲剂，所述缓冲剂是非金属结合剂或者是金属结合剂。
129.权利要求128的共配制物，其中所述缓冲剂选自Tris、组氨酸、磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。
130.权利要求128或129的共配制物，其中所述缓冲剂的浓度是或大约是1mM-100mM、10mM-50mM或者20mM-40mM。
131.权利要求104-130任一项的共配制物，其包含浓度低于60mM、低于55mM、低于50mM、低于45mM、低于40mM、低于35mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、低于15mM、低于10mM的甘油。
132.权利要求104-131任一项的共配制物，其包含抗氧化剂。
133.权利要求132的共配制物，其中所述抗氧化剂选自半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
134.权利要求132或133的共配制物，其中所述抗氧化剂的浓度是或大约是2mM-50mM、5mM-40mM、5mM-20mM或者10mM-20mM，包括端点。
135.权利要求104-134任一项的共配制物，其包含锌。
136.权利要求135的共配制物，其中锌的浓度是或大约是0.001-0.1mg/100单位胰岛素(mg/100U)、0.001-0.05mg/100U或者0.01-0.05mg/100U。
137.闭环系统，其包含权利要求105-136任一项的共配制物。
138.胰岛素泵，其包含权利要求105-136任一项的共配制物。
139.胰岛素笔，其包含权利要求105-136任一项的共配制物。
140.一种治疗乙酰透明质酸相关疾病或病症的方法，所述方法包括给予对象权利要求1-56任一项的修饰的PH20多肽或者权利要求71-103任一项的药物组合物。
141.权利要求140的方法，其中所述乙酰透明质酸相关疾病或病症是炎性疾病或者肿瘤或癌症。
142.权利要求141的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
143.权利要求140-142任一项的方法，其中所述乙酰透明质酸相关疾病或病症选自晚期癌症、转移癌症和未分化癌症。
144.权利要求140-143任一项的方法，其中所述乙酰透明质酸相关疾病或病症选自卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和结肠癌。
145.治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予对象权利要求95-101任一项的药物组合物或者权利要求104-136任一项的共配制物。
146.权利要求145的方法，其中所述糖尿病选自1型糖尿病、2型糖尿病或者妊娠糖尿病。
147.一种增加治疗剂输送至对象的方法，包括：
给予对象权利要求1-56任一项的修饰的PH20多肽、权利要求71-103任一项的药物组合物或者权利要求104-136任一项的共配制物；及
给予治疗剂。
148.权利要求147的方法，其中所述给予是皮下给予。
149.权利要求147或148的方法，其中所述修饰的PH20多肽或包含修饰的PH20多肽的组合物是在给予所述治疗剂之前、同时、间歇或随后给予的。
150.权利要求147-149任一项的方法，其中所述治疗剂是多肽、蛋白质、核酸、药物、小分子或有机分子。
151.权利要求147-150任一项的方法，其中所述治疗剂选自化疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀阿米巴虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟疾剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、及抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、生物杀灭剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药物、避孕药、减充血剂、利尿剂、抑郁剂、诊断剂、电解剂、催眠药、激素制剂、高血糖制剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼科用药、拟副交感神经剂、精神兴奋剂、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、尿路用药、阴道制剂、杀病毒剂、维生素制剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转换酶抑制剂、或者睡眠诱导剂。
152.权利要求147-151任一项的方法，其中所述治疗剂选自抗体、免疫球蛋白、二膦酸盐、细胞因子、化疗剂、凝血因子和胰岛素。
153.权利要求152的方法，其中所述治疗剂是胰岛素，其是速效胰岛素。
154.权利要求153的方法，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素或者胰岛素类似物。
155.权利要求153或154的方法，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素，其是人胰岛素或者猪胰岛素。
156.权利要求153-155任一项的方法，其中：
所述速效胰岛素包含具有SEQ ID NO:862所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:863所示氨基酸序列的B链；或者
所述速效胰岛素包含具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基位置88-108所示氨基酸序列的A链和具有SEQ ID NO:864的氨基酸残基位置25-54所示氨基酸序列的B链。
157.权利要求153或154的方法，其中所述速效胰岛素是选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素的胰岛素类似物。
158.权利要求157的方法，其中所述胰岛素类似物包含具有SEQ IDNO:862所示氨基酸序列的A链和选自SEQ NO:865-867任一所示氨基酸序列的B链。
159.权利要求147-151任一项的方法，其中所述治疗剂选自阿达木单抗、阿加糖酶β、阿莱法塞、氨苄青霉素、阿那白滞素、抗脊髓灰质炎疫苗、抗胸腺细胞、阿奇霉素、贝卡普勒明、卡泊芬净、头孢唑林、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、西妥昔单抗、西司他丁、克拉维酸、克林霉素、达依泊汀α、达克珠单抗、白喉、白喉抗毒素、白喉类毒素、依法珠单抗、肾上腺素、促红细胞生成素α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促卵泡素α、促卵泡素β、磷苯妥英、钆双胺、Gadopentetates、加替沙星、格拉默、GM-CSF's、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司琼、流感嗜血杆菌B、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、替伊莫单抗、Tiuxetans、免疫球蛋白、流感嗜血杆菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔单抗、赖脯胰岛素、75％中性赖脯鱼精蛋白(NPL)/25％赖脯胰岛素、50％中性鱼精蛋白Hagedorn(NPH)/50％普通胰岛素、70％NPH/30％普通胰岛素；普通胰岛素、NPH胰岛素、超级胰岛素、特慢胰岛素、和甘精胰岛素、干扰素、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素α-2a、干扰素α2-b、干扰素Alphacon、干扰素α-n、干扰素β、干扰素β-1a、干扰素γ、干扰素α-con、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉罗尼酶、左氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、劳拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹-腮腺炎-风疹病毒疫苗、风疹疫苗、甲羟孕酮、美罗培南、甲泼尼龙、咪达唑仑、吗啡、奥曲肽、奥马珠单抗、昂丹司琼、帕利珠单抗、泮托拉唑、培门冬酶、培非司亭、Peg-干扰素α-2a、Peg-干扰素α-2b、培维索孟、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗和肺炎球菌缀合物疫苗、异丙嗪、瑞替普酶、生长激素、舒巴坦、舒马普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破伤风纯化类毒素、替卡西林、托西莫单抗、曲安西龙、曲安奈德、己曲安奈德、万古霉素、水痘带状疱疹免疫球蛋白、水痘疫苗、其它疫苗、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、砒霜、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、BCG Live、贝沙罗汀、博来霉素、白消安、静脉内白消安、口服白消安、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀与聚苯丙生、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素脂质体、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素2、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、丙酸屈他雄酮、Elliott's B溶液、表柔比星、阿法依泊汀、雌氮芥、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16s、依西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉妥珠单抗、奥佐米星、吉妥珠单抗奥佐米星、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNUs、氮芥(Mechlorethamines)、氮芥(Nitrogen mustards)、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、L-PAMs、巯嘌呤、6-巯嘌呤、美司钠、氨甲喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素类、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、苯丙酸诺龙、若莫单抗、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕玛二磷酸、培加酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、光辉霉素、卟菲尔钠、卟吩姆钠、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥普单抗、沙格司亭、链脲菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、三亚乙基硫代磷酰胺(噻替派)、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、唑来膦酸、阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、视黄酸、阿利维A酸、9-顺式-视黄酸、Alvocidibs、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那昔酮、安西他滨、氨茴霉素、Apaziquones、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、Banoxantrones、Batabulins、巴马司他、贝那昔滨、苯达莫司汀、苯佐替派、比卡鲁胺、比他舍平、比立考达、比生群、Bisnafide Dimesylates、比折来新、硼替佐米、布喹那、溴匹立明、布度钛、放线菌素C、Canertinibs、卡醋胺、卡贝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、西马多丁、苯丁酸氮芥、塞奥罗奈、西罗霉素、克兰氟脲、氯法拉滨、克立那托、地西他滨、右尼古地平、右奥马铂、地扎胍宁、地吖醌、Dibrospidiums、地诺孕素、地那林、Disermolides、Dofequidars、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、达佐霉素、依考莫司汀、依达曲沙、Edotecarins、依氟鸟氨酸、依拉克达、依利奈法德、依沙芦星、乙嘧替氟、恩洛铂、恩普氨酯、Enzastaurins、依匹哌啶、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依托格鲁、氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟甲睾酮、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他滨、吉罗酚、Gimatecans、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷酰胺、伊莫福新、伊洛马司他、伊美克、英丙舒凡、Indisulams、双丙氧亚胺醌、白介素、白介素-2s、重组白介素、茚托利辛、碘苄胍、异丙铂、伊索拉定、Ixabepilones、酮曲沙、L-阿拉诺新、兰瑞肽、Lapatinibs、来多蒽琼、亮丙瑞林、亮丙瑞林、来沙骨化醇、利阿唑、洛铂、洛美曲索、法尼醇蛋白转移酶抑制剂、洛索蒽醌、勒托替康、马磷酰胺、甘露舒凡、马立马司他、马索罗酚、美坦辛、氮芥、美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯氨啶、美妥替哌、米帕、米泼昔芬、米索硝唑、米丁度胺、Mitocarcins、丝裂红素、米托拉酮、米托洁林、米托胍腙、米托马星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立宾、莫法罗汀、莫哌达醇、Mubritinibs、霉酚酸、奈达铂、Neizarabines、奈莫柔比星、硝氨丙吖啶、诺考达唑、诺拉霉素、诺拉曲塞、Nortopixantrones、奥马铂、Ortataxels、奥替拉西、奥昔舒仑、氧芬胂、Patupilones、培得星、培利霉素、Pelitrexols、培美曲塞、溴新斯的明、培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、Picoplatins、吡奈非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡罗蒽醌、Pixantrones、Plevitrexeds、普洛美坦、泊非霉素、波尼莫司汀、普罗帕脒、螺丙醇、嘌嘧替派、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、罗谷亚胺、罗喹美克、链黑霉素、Sabarubicins、沙芬戈、沙铂、司铂、司莫司汀、辛曲秦、西左非兰、索布佐生、索拉非尼、Sparfosates、磷乙天冬氨酸、司帕霉素、锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、角鲨胺、链黑霉素、链伐立星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、Tacedinalines、他利霉素、他莫司汀、Tariquidars、牛磺莫司汀、Tecogalans、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替罗昔隆、硫咪嘌呤、硫咪嘌呤、噻唑羧胺核苷、噻氯咪索、替洛隆、汀考达、噻莫西酸、替拉扎明、Topixantrones、曲贝替定、海鞘素743、曲托龙、曲西立滨、曲洛司坦、三甲曲沙、Triplatin Tetranitrates、曲普瑞林、曲磷胺、妥布氯唑、乌苯美司、乌瑞替派、伐司朴达、伐普肽、维替泊芬、长春碱、长春地辛、长春匹定、长春氟宁、长春米特、长春甘酯、长春西醇、长春罗新、长春罗定、长春曲醇、长春利定、伏氯唑、黄链霉素A、胍甲环素、折尼铂、亚苄维C(2H)、净司他丁、佐柔比星、Zosuquidars、乙酰唑胺、阿昔洛韦、胆影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、变应原浸出物、α1-蛋白酶抑制剂、前列地尔、阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶碱、阿米替林、异戊巴比妥、氨力农、镇痛药、抗-脊髓灰质炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破伤风免疫球蛋白、破伤风疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精氨酸、抗坏血酸、阿替洛尔、阿曲库铵、阿托品、金硫葡糖、硫唑嘌呤、氨曲南、杆菌肽、巴氯芬、巴利昔单抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、比伐卢定、肉毒抗毒素、溴苄铵、布美他尼、布比卡因、丁丙诺啡、布托啡诺、降钙素、骨化三醇、钙、卷曲霉素、卡波前列素、肉碱、头孢孟多、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑肟、头孢呋辛、氯霉素、氯普鲁卡因、氯喹、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸软骨素、绒毛膜促性腺激素α、铬、西多福韦、西咪替丁、环丙沙星、顺阿曲库铵、可乐定、可待因、秋水仙碱、粘菌素、胶原、Corticorelin ovine triflutates、促皮质素、二十四肽促皮质素、氰钴胺、环孢菌素、半胱氨酸、达昔单抗、达福普汀、达肝素、达那肝素、丹曲林、去铁胺、去氨加压素、地塞米松、右美托咪定、右泛醇、右旋糖酐、右旋糖酐铁、泛影酸、地西泮、二氮嗪、双环维林、Digibinds、地高辛、双氢麦角胺、地尔硫卓、苯海拉明、双嘧达莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯铵、多沙普仑、度骨化醇、多西环素、氟哌利多、二羟丙茶碱、依地酸、依酚氯铵、依那普利拉、麻黄碱、依前列醇、麦角钙化醇、麦角新碱、厄他培南、红霉素、艾司洛尔、雌二醇、Estrogenics、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、羟乙磷酸、依托咪酯、法莫替丁、非诺多泮、芬太尼、氟马西尼、荧光素、氟奋乃静、叶酸、甲吡唑、福米韦生、磺达肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、钆特醇、钆弗塞胺、更昔洛韦、庆大霉素、胰高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆溴铵、戈那瑞林、绒毛膜促性腺激素、嗜血杆菌B多糖、氯化血红素、Herbals、组胺、肼苯哒嗪、氢化可的松、氢吗啡酮、羟钴胺、羟嗪、莨菪碱、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺、碘拉酸、碘克沙酸、碘昔兰、异烟肼、异丙肾上腺素、日本脑炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉贝洛尔、来匹卢定、左布比卡因、左甲状腺素、林可霉素、碘塞罗宁、促黄体激素、莱姆病疫苗、锰福地吡、Manthtols、脑膜炎球菌多糖疫苗、哌替啶、甲哌卡因、美索达嗪、间羟胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲基多巴类、甲基麦角新碱、甲氧氯普胺、美托洛尔、甲硝唑、米诺环素、米伐克龙、鱼肝油酸、莫西沙星、莫罗单抗-CD3、麦考酚酸吗乙酯、萘夫西林、纳布啡、纳美芬、纳洛酮、新斯的明、烟酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普钠、去甲肾上腺素、奥芬那君、苯唑西林、羟吗啡酮、土霉素、缩宫素、潘可龙、泛醇、泛酸、罂粟碱、PEG干扰素α2A、青霉素G、喷他脒、喷他佐辛、戊巴比妥、全氟丙烷、奋乃静、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧肾上腺素、苯妥英、毒扁豆碱、植物甲萘醌、多粘菌素、解磷定、丙胺卡因、普鲁卡因胺、普鲁卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛尔、吡啶斯的明氢氧化物、维生素B6、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁、瑞芬太尼、核黄素、利福平、罗哌卡因、钐、东莨菪碱、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人蛋氨生长素、壮观霉素、链激酶、链霉素、琥珀酰胆碱、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他罗利姆、特布他林、特立帕肽、睾酮、破伤风抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸盐/酯、茶碱、硫胺素、硫乙拉嗪、硫喷妥、促甲状腺激素、亭扎肝素、替罗非班、妥布霉素、妥拉唑啉、甲苯磺丁脲、托拉塞米、氨甲环酸、曲罗尼尔、三氟拉嗪、曲美苄胺、甲氧苄啶、氨丁三醇、结核菌素、伤寒疫苗、尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸、加压素、维库溴铵、维拉帕米、伏立康唑、华法林、黄热病疫苗、齐多夫定、锌、盐酸齐拉西酮、阿克拉霉素、放线菌素、阿霉素、偶氮丝氨酸、6-氮尿苷、嗜癌素、色霉素、二甲叶酸、6-叠氮-5-氧-L-正亮氨酸、依诺他滨、氟尿苷、橄榄霉素、吡柔比星、吡曲克辛、蝶罗呤、替加氟、杀结核菌素、阿替普酶、阿西莫单抗、贝伐珠单抗、A型肉毒菌毒素、B型肉毒菌毒素、卡罗单抗喷地肽、达克珠单抗、阿法链道酶、替加色罗α、戊酸印西洛马、碘-131；抗生素物质；血管发生抑制剂；抗白内障和抗糖尿病视网膜病变药物；碳酸酐酶抑制剂；瞳孔放大剂；光动力治疗剂；前列腺素类似物；生长因子；抗肿瘤药物；抗代谢物；抗病毒药物；杀阿米巴剂和抗原生动物剂；抗结核药和抗麻风药；抗毒素和抗蛇毒素；抗血友病因子，抗抑制剂凝血复合物，抗凝血酶III，凝血因子V，凝血因子IX，血浆蛋白级分，von Willebrand因子；抗血小板制剂，集落刺激因子(CSF)；红细胞生成刺激物；止血剂和白蛋白；免疫球蛋白；凝血酶抑制剂；抗凝血剂；类固醇抗炎药物，选自阿氯米松、阿尔孕酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼缩松、肤轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、氟泼尼龙、丙酮缩氟氢羟龙、氟替卡松、福莫可他、氯氟舒松、卤倍他索、卤米松、卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、氯替泼诺碳酸乙酯、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、利美索龙、替可的松和曲安西龙；docosenoid，前列腺素类药物，前列腺素类似物，抗前列腺素和前列腺素前体；缩瞳剂，胆碱能药和抗胆碱酯酶；及抗变态反应药。
160.治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗糖胺聚糖在脑中积聚、治疗心血管疾病、治疗眼科病症、治疗肺部疾病、增加化疗剂渗透进实体肿瘤中、治疗蜂窝组织、治疗增生性病症、或者增加药物和其它治疗剂的生物利用度的方法，包括给予对象权利要求1-56任一项的修饰的PH20多肽或者权利要求71-103任一项的药物组合物。
161.权利要求71-103任一项的药物组合物，其用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或病症。
162.权利要求95-101任一项的药物组合物或权利要求104-136任一项的共配制物，其用于治疗糖尿病。
163.权利要求71-103任一项的药物组合物，其用于将治疗剂输送至对象。
164.权利要求71-103任一项的药物组合物，其用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗糖胺聚糖在脑中积聚、治疗心血管病症、治疗眼科病症、治疗肺部疾病、增加化疗剂渗透至实体肿瘤中、治疗蜂窝组织、治疗增生性病症、或者增加药物及其它治疗剂的生物利用度。
165.鉴别或选择在变性条件下呈现稳定性的修饰的乙酰透明质酸降解酶的方法，其中：
所述方法包括：
a)检测修饰的乙酰透明质酸降解酶在包含变性剂的组合物中和/或在变性条件下的活性；
b)检测所述修饰的乙酰透明质酸降解酶在除了不存在所述变性剂或变性条件之外的与a)相同的组合物中和/或在相同条件下的活性；及
c)选择或鉴别在a)中呈现活性是在b)中活性的至少5％的修饰的乙酰透明质酸降解酶；和/或
所述方法包括：
a)检测修饰的乙酰透明质酸降解酶在包含变性剂的组合物中和/或在变性条件下的活性；
b)检测相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶在含有与a)相同的变性剂的组合物中和/或在相同变性条件下的活性，其中在与a)相同的条件下检测所述活性；及
c)选择或鉴别呈现更高活性的修饰的乙酰透明质酸降解酶，所述活性与所述未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比是其活性的至少120％。
166.权利要求165的方法，其中所述活性是透明质酸酶活性。
167.权利要求165或166的方法，包括：
d)对比在相同条件下在a)中选择或鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性与所述未修饰的乙酰透明质酸降解酶的活性；及
e)鉴别或选择与所述未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比呈现至少120％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％或更多的透明质酸酶活性的修饰的乙酰透明质酸-降解酶。
168.权利要求165-167任一项的方法，其中所述变性剂或条件是由温度、搅拌、无盐或低盐或者存在赋形剂所致的。
169.权利要求165-167任一项的方法，其中所述变性剂或条件是变性赋形剂，其选自抗粘附剂、结合剂、涂覆剂、充填剂和稀释剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂和甜味剂。
170.权利要求169的方法，其中所述变性剂或条件是防腐剂。
171.权利要求170的方法，其中所述防腐剂是酚类防腐剂。
172.权利要求171的方法，其中所述酚类防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯。
173.权利要求172的方法，其中所述防腐剂是苯酚和/或m-甲酚。
174.权利要求171-173任一项的方法，其中所述组合物中以质量浓度(w/v)百分比(％)表示的酚类防腐剂的总量是或者是大约0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％，包括端点。
175.权利要求165-174任一项的方法，其中在a)和b)中检测乙酰透明质酸降解酶组合物的活性之前，将所述乙酰透明质酸降解酶暴露于所述变性条件或变性剂预定时间。
176.权利要求175的方法，其中所述预定时间是或是大约1分钟至1个月，1分钟至3周，1分钟至2周，1分钟至1周，1分钟至24小时，1分钟至12小时，30分钟至6小时或者1小时至4小时。
177.权利要求165-176任一项的方法，其中所述修饰的乙酰透明质酸降解酶与未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比包含氨基酸置换、氨基酸插入或缺失。
178.权利要求177的方法，其中所述修饰的乙酰透明质酸降解酶与所述未修饰形式的乙酰透明质酸降解酶相比含有仅一个氨基酸置换或者2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸置换。
179.权利要求165-178任一项的方法，其中检测在a)和/或b)中的多个修饰的乙酰透明质酸降解酶。
180.权利要求179的方法，其中：
与相应未修饰的乙酰透明质酸降解酶相比，所述多个修饰的乙酰透明质酸降解酶被修饰，产生修饰的乙酰透明质酸降解酶集合，其中在a)和/或b)中检测所述集合中每个修饰的蛋白质，其中
所述集合中每个修饰的乙酰透明质酸降解酶与所述未修饰形式的乙酰透明质酸降解酶相比含有仅一个氨基酸置换；
在所述集合中，在每个修饰的位置的氨基酸由除了在该位置的原始氨基酸之外的至多1-19个其它氨基酸置换，其中每个修饰的乙酰透明质酸降解酶含有不同的氨基酸置换；及
在所述集合中，沿着所述乙酰透明质酸降解酶的长度或者其选择的一部分的每个氨基酸被置换。
181.权利要求165-180任一项的方法，其中所述未修饰的乙酰透明质酸降解酶是软骨素酶或者是透明质酸酶。
182.权利要求181的方法，其中所述未修饰的乙酰透明质酸降解酶是透明质酸酶，其是PH20透明质酸酶或者其缺少C-末端糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚附着位点或者GPI锚附着位点的一部分的截短形式，其中所述截短形式呈现透明质酸酶活性。
183.权利要求182的方法，其中所述未修饰的乙酰透明质酸降解酶是PH20透明质酸酶，其选自人、猴、牛、羊、大鼠、狐狸、小鼠或豚鼠PH20。
184.权利要求183的方法，其中所述未修饰的透明质酸酶是人PH20或者其C末端截短形式。
185.权利要求165-184任一项的方法，其中所述未修饰的乙酰透明质酸降解酶具有SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、870任一所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、870任一是至少80％序列相同性的氨基酸序列。
186.权利要求165-185任一项的方法，其在体外进行。
187.权利要求165-186任一项的方法，进一步包括重复多次所述步骤，其中在每次重复中，产生并检测选择的修饰的乙酰透明质酸降解酶的进一步修饰的乙酰透明质酸降解酶，其中所述修饰的乙酰透明质酸降解酶被进化为在变性条件下呈现增加的稳定性。
188.通过权利要求165-187任一项的方法鉴别的修饰的乙酰透明质酸降解酶。
189.在存在酚类防腐剂条件下呈现增加的稳定性的修饰的PH20多肽，其在PH20多肽中包含氨基酸置换，其中：
所述氨基酸置换赋予所述增加的稳定性；
与无所述氨基酸置换的未修饰的多肽相比稳定性是增加的；及
所述未修饰的PH20多肽由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成或者是其C-末端截短片段，其为可溶的PH20多肽，或者与其具有至少85％序列相同性。
190.权利要求189的修饰的PH20多肽，其中所述未修饰的PH20多肽是可溶的PH20多肽，其由SEQ ID NO:3或32-66任一所示任何氨基酸序列组成。
191.权利要求189或190的修饰的PH20多肽，其与SEQ ID NO:3具有至少85％序列相同性。
192.权利要求189-191任一项的修饰的PH20多肽，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48,49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75或更多个氨基酸置换。
193.权利要求189-192任一项的修饰的PH20多肽，其是人PH20。
194.权利要求189-193任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽在存在防腐剂条件下与不存在所述酚类防腐剂条件下的透明质酸酶活性相比呈现至少15％的透明质酸酶活性至少4小时，其中所述活性是在除了存在酚类防腐剂之外相同的条件下对比的。
195.权利要求189-194任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽在存在抗微生物有效量的一或多种酚类防腐剂的条件下是稳定的。
196.权利要求195的修饰的PH20多肽，其中所述抗微生物有效量是一或多种酚类防腐剂的总量，以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，是或者是大约0.05％-0.6％、0.1％-0.4％、0.1％-0.3％、0.15％-0.325％、0.15％-0.25％、0.1％-0.2％、0.2％-0.3％或者0.3％-0.4％，包括端点。
197.权利要求189-196任一项的修饰的PH20多肽，其中所述酚类防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯中的一或多种。
198.权利要求189-197任一项的修饰的PH20多肽，其中所述防腐剂是酚类防腐剂，其是m-甲酚、苯酚或者m-甲酚和苯酚。
199.权利要求189-198任一项的修饰的PH20多肽，其在相应于选自如下参考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置包含至少一个氨基酸置换：204、58、10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443或445，其中相应氨基酸位置是通过排列对比所述PH20多肽与SEQ ID NO:3所示多肽而鉴别的。
200.权利要求189-199任一项的修饰的PH20多肽，其包含选自如下置换的至少一个氨基酸置换，所述如下置换的位置相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置：
在相应于位置10的位置的G；在相应于位置12的位置的K；在相应于位置20的位置的S；在相应于位置22的位置的T；在相应于位置26的位置的M；在相应于位置34的位置的W；在相应于位置36的位置的N；在相应于位置46的位置的L；在相应于位置50的位置的M；在相应于位置52的位置的T；在相应于位置52的位置的S；在相应于位置58的位置的C；在相应于位置58的位置的K；在相应于位置58的位置的R；在相应于位置58的位置的N；在相应于位置58的位置的Y；在相应于位置58的位置的P；在相应于位置58的位置的H；在相应于位置68的位置的P；在相应于位置70的位置的V；在相应于位置74的位置的E；在相应于位置82的位置的L；在相应于位置82的位置的N；在相应于位置83的位置的V；在相应于位置83的位置的Q；在相应于位置83的位置的S；在相应于位置83的位置的G；在相应于位置84的位置的N；在相应于位置86的位置的A；在相应于位置86的位置的K；在相应于位置97的位置的E；在相应于位置97的位置的L；在相应于位置127的位置的R；在相应于位置131的位置的R；在相应于位置138的位置的L；在相应于位置142的位置的K；在相应于位置142的位置的N；在相应于位置142的位置的P；在相应于位置142的位置的S；在相应于位置142的位置的T；在相应于位置143的位置的G；在相应于位置143的位置的K；在相应于位置144的位置的T；在相应于位置166的位置的Q；在相应于位置166的位置的T；在相应于位置169的位置的L；在相应于位置174的位置的G；在相应于位置174的位置的N；在相应于位置193的位置的Q；在相应于位置195的位置的T；在相应于位置195的位置的N；在相应于位置196的位置的E；在相应于位置196的位置的R；在相应于位置204的位置的P；在相应于位置205的位置的A；在相应于位置205的位置的E；在相应于位置206的位置的I；在相应于位置213的位置的A；在相应于位置219的位置的I；在相应于位置234的位置的M；在相应于位置237的位置的T；在相应于位置238的位置的H；在相应于位置240的位置的Q；在相应于位置249的位置的V；在相应于位置261的位置的A；在相应于位置261的位置的K；在相应于位置267的位置的T；在相应于位置277的位置的K；在相应于位置279的位置的H；在相应于位置279的位置的V；在相应于位置291的位置的V；在相应于位置309的位置的E；在相应于位置310的位置的Q；在相应于位置314的位置的Y；在相应于位置315的位置的Y；在相应于位置317的位置的N；在相应于位置317的位置的W；在相应于位置318的位置的D；在相应于位置347的位置的G；在相应于位置367的位置的A；在相应于位置375的位置的R；在相应于位置376的位置的R；在相应于位置399的位置的V；在相应于位置401的位置的E；在相应于位置407的位置的A；在相应于位置416的位置的L；在相应于位置419的位置的K；在相应于位置421的位置的H；在相应于位置431的位置的E；在相应于位置433的位置的T；在相应于位置433的位置的V；在相应于位置439的位置的C；在相应于位置440的位置的P；在相应于位置443的位置的G；及在相应于位置445的位置的N。
201.权利要求189-200任一项的修饰的PH20多肽，其包含选自如下置换的至少一个氨基酸置换，所述如下置换的位置相应于参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置：
在相应于位置52的位置的T、在相应于位置58的位置的K、在相应于位置58的位置的R、在相应于位置68的位置的P、在相应于位置83的位置的V、在相应于位置204的位置的P、在相应于位置261的位置的A、在相应于位置267的位置的T、在相应于位置277的位置的K及在相应于位置421的位置的H。
202.权利要求189-201任一项的修饰的PH20多肽，其包含在相应于在PH20多肽中参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置204的位置用P的置换。
203.权利要求189-202任一项的修饰的PH20多肽，其包含在相应于PH20多肽中参考SEQ ID NO:3所示氨基酸残基位置的位置58的位置用R的置换。
204.权利要求189-203任一项的修饰的PH20多肽，其是基本上纯化的或分离的。
205.权利要求189-204任一项的修饰的PH20多肽，其是通过选自如下的修饰方式修饰的：糖基化、唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟化和磷酸化。
206.权利要求189-205任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽是糖基化的，其中所述多肽包含与至少三个天冬酰胺(N)残基的每个均连接的至少一个N-乙酰葡糖胺部分。
207.权利要求206的修饰的PH20多肽，其中所述三个天冬酰胺残基相应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基200、333和358。
208.权利要求189-207任一项的修饰的PH20多肽，其通过与聚合物缀合而修饰。
209.权利要求208的修饰的PH20多肽，其中所述聚合物是葡聚糖或PEG。
210.权利要求189-209任一项的修饰的PH20多肽，其中所述修饰的PH20多肽与选自多聚化结构域、毒素、可检测标记或药物的部分缀合。
211.核酸分子，其编码权利要求189-203任一项的修饰的PH20多肽。
212.载体，其包含权利要求211的核酸分子。
213.权利要求212的载体，其是真核或原核载体。
214.权利要求213的载体，其是哺乳动物载体或病毒载体。
215.细胞，其包含权利要求212-214任一项的载体。
216.产生修饰的PH20多肽的方法，包括：
将权利要求211的核酸导入能将N-连接的糖部分掺入所述多肽中的细胞中；
将所述细胞在一定条件下培养，其中所述细胞产生和分泌编码的修饰的PH20多肽；及
回收表达的多肽。
217.药物组合物，其包含权利要求189-210任一项的修饰的PH20多肽。
218.权利要求217的药物组合物，其包含治疗活性剂。
219.权利要求218的药物组合物，其中所述治疗剂是胰岛素，其是速效胰岛素。
220.权利要求219的药物组合物，其中：
修饰的PH20多肽的量是或者是大约100U/mL-1000U/mL；及
速效胰岛素的量是或是大约10U/mL-1000U/mL。
221.权利要求220的药物组合物，其中：
所述pH是或是大约7.0-7.6；及
进一步包含：
浓度是或是大约0.1mM-200mM的NaCl；及
抗微生物有效量的至少一种防腐剂，其中所述组合物含有至少一种酚类防腐剂。
222.权利要求221的药物组合物，其中所述抗微生物有效量是一或多种防腐剂的总量，以质量浓度(w/v)百分比(％)表示，其是0.05％-0.6％。
223.权利要求221或222的药物组合物，其中所述防腐剂选自苯酚、间甲酚(m-甲酚)、苯甲醇及对羟基苯甲酸酯。
224.权利要求220-223任一项的药物组合物，进一步包含：
表面活性剂，其在所述配制物中质量浓度(w/v)％的量为至少或至少大约0.001％；
缓冲剂，其是非金属结合剂或者是金属结合剂，其中所述缓冲剂的浓度是或是大约1mM-100mM；
甘油，浓度低于60mM；
抗氧化剂，浓度为或者为大约2mM-50mM，包括端点；和/或
锌，浓度为或为大约0.001-0.1mg/100单位胰岛素(mg/100U)。
225.权利要求224的药物组合物，其中所述表面活性剂选自聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨糖醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。
226.权利要求224的药物组合物，其中所述缓冲剂选自Tris、组氨酸、磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。
227.权利要求224的药物组合物，其中所述抗氧化剂选自半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
228.闭环系统、胰岛素泵或胰岛素针，其包含权利要求219-227任一项的药物组合物。
229.一种治疗乙酰透明质酸相关疾病或病症、治疗与糖胺聚糖过量相关的病症、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖聚集、治疗心血管疾病、治疗眼科病症、治疗肺部疾病、增加化疗剂渗透进实体肿瘤中、治疗蜂窝组织、治疗增生性疾病、增加治疗剂输送至对象或者增加药物及其它治疗剂的生物利用度的方法，包括给予对象权利要求189-210任一项的修饰的PH20多肽或者权利要求217-227任一项的药物组合物。
230.权利要求217-227任一项的药物组合物，其用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或病症、治疗与糖胺聚糖过量相关的病症、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖聚集、治疗心血管疾病、治疗眼科病症、治疗肺部疾病、增加化疗剂渗透进实体肿瘤中、治疗蜂窝组织、治疗增生性疾病、增加治疗剂输送至对象或者增加药物及其它治疗剂的生物利用度。
231.治疗糖尿病的方法，包括给予对象权利要求219-227任一项的药物组合物。
232.权利要求219-227任一项的药物组合物，其用于治疗糖尿病。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105727267A (zh) * 2016-02-05 2016-07-06 苏州康聚生物科技有限公司 一种重组人透明质酸酶冻干制剂及其制备方法和应用
WO2017201635A1 (zh) * 2016-05-23 2017-11-30 蔡胜和 透明质酸酶的细胞表达及其在实体瘤细胞治疗中的应用
WO2020119048A1 (zh) * 2017-12-13 2020-06-18 苏州康聚生物科技有限公司 一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用
CN111971387A (zh) * 2018-07-25 2020-11-20 阿特根公司 新型透明质酸水解酶突变体和包含其的药物组合物
CN112203642A (zh) * 2019-03-25 2021-01-08 阿特根公司 用于皮下注射的包含人透明质酸酶ph20变体和药物的药物组合物
CN114624366A (zh) * 2022-05-16 2022-06-14 南京瑞克卫生物医药有限公司 一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法
WO2023001264A1 (zh) 2021-07-23 2023-01-26 上海宝济药业有限公司 一种能皮下给药的抗生素药物组合物

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2405015B1 (en) 2003-03-05 2016-01-06 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
KR101647932B1 (ko) 2008-04-14 2016-08-11 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
PT3037529T (pt) 2008-12-09 2019-05-31 Halozyme Inc Polipéptidos ph20 estendidos solúveis e suas utilizações
DK2477603T3 (en) 2009-09-17 2016-06-13 Baxalta Inc STABLE CO-DEVELOPMENT OF hyaluronidase and Immunoglobulin, AND METHODS OF USE THEREOF
ES2661089T3 (es) 2010-07-20 2018-03-27 Halozyme Inc. Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano
MX340172B (es) * 2011-06-17 2016-06-28 Halozyme Inc Formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano.
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
BR112014009797A2 (pt) 2011-10-24 2020-10-27 Halozyme, Inc. diagnóstico de companhia para terapia de agente anti-hialuronano e métodos de uso do mesmo
PT3130347T (pt) 2011-12-30 2019-12-10 Halozyme Inc Variantes de polipéptidos de ph20, suas formulações e utilizações
CA2986512C (en) 2012-04-04 2022-05-17 Halozyme, Inc. Combination therapy with an anti-hyaluronan agent and a tumor-targeted taxane
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
JP6322642B2 (ja) 2012-11-13 2018-05-09 アドシア 置換されたアニオン性化合物を含有する速効型インスリン製剤
TW201534726A (zh) * 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
HUP1300646A2 (en) * 2013-11-12 2015-05-28 Druggability Technologies Ip Holdco Jersey Ltd Complexes of fulvestrant and its derivatives, process for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them
CN103819578B (zh) * 2013-11-22 2016-05-11 青岛九龙生物医药有限公司 一种加氢氧化钠法提高硫酸软骨素收率的方法
US9480731B2 (en) * 2013-12-12 2016-11-01 Medy-Tox, Inc. Long lasting effect of new botulinum toxin formulations
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US20150328317A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Eagle Pharmaceuticals, Inc. Aqueous buffer-free bivalirudin compositions
WO2016033555A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Halozyme, Inc. Combination therapy with a hyaluronan-degrading enzyme and an immune checkpoint inhibitor
JP6625627B2 (ja) 2014-10-14 2019-12-25 ハロザイム インコーポレイテッド アデノシンデアミナーゼ−２（ａｄａ２）、その変異体の組成物およびそれを使用する方法
TW201630622A (zh) 2014-12-16 2016-09-01 美國禮來大藥廠 速效胰島素組合物
WO2016197009A1 (en) 2015-06-05 2016-12-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of demyelinating diseases
JO3749B1 (ar) 2015-08-27 2021-01-31 Lilly Co Eli تركيبات إنسولين سريعة المفعول
CN108472369A (zh) 2015-11-03 2018-08-31 詹森生物科技公司 抗cd38抗体的皮下制剂及其用途
GB201607918D0 (en) * 2016-05-06 2016-06-22 Arecor Ltd Novel formulations
WO2018001430A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Science Ventures Denmark A/S A supercapacitor and a method for expanding the voltage range of an aqueous electrolyte supercapacitor
SI3436054T2 (sl) 2016-09-13 2022-09-30 Allergan, Inc. Stabilizirani neproteinski sestavki klostridijskih toksinov
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
MX2019014195A (es) 2017-06-01 2020-01-27 Lilly Co Eli Composiciones de insulina de rapida accion.
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
WO2021150079A1 (ko) * 2020-01-23 2021-07-29 (주)알테오젠 안정성이 향상된 신규 히알루론산 가수분해 효소 변이체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
TWI788188B (zh) * 2020-06-09 2022-12-21 南韓商阿特根公司 用於皮下注射之包含人類玻尿酸酶ph20變異體及藥物的醫藥組合物
TWI781415B (zh) * 2020-06-09 2022-10-21 南韓商阿特根公司 用於皮下注射之包含人類玻尿酸酶ph20變異體及藥物的醫藥組合物
CN115776909A (zh) * 2020-07-17 2023-03-10 美国杰龙生物医药公司 皮下端粒酶抑制剂组合物及其使用方法
EP4194551A1 (en) 2020-08-07 2023-06-14 Alteogen, Inc. Method for producing recombinant hyaluronidase
KR20230069956A (ko) 2020-09-14 2023-05-19 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 이종 프라임 부스트 백신
CN112763610B (zh) * 2020-12-28 2022-04-01 浙江大学 土壤中抗生素的检测方法
AU2021411486A1 (en) 2020-12-28 2023-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
US20220233689A1 (en) 2020-12-28 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumors
CN113444708B (zh) * 2021-07-19 2024-02-13 河南赛培生物科技有限公司 一种用于药物皮下注射制剂的透明质酸酶突变体
TW202320849A (zh) 2021-08-02 2023-06-01 比利時商阿根思公司 皮下用單位劑型
WO2023042096A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Facilitated delivery of concentrated antibody formulations using hyaluronidase
WO2023067008A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 Pharmact Holding Ag A production of a purified modified bacterial hyaluronidase polypeptide, pharmaceutical compositions and their uses
WO2023075506A1 (ko) * 2021-10-29 2023-05-04 (주)알테오젠 인간 히알루로니다제 ph20과 약물을 포함하는 약학 조성물
CN114634920B (zh) * 2022-03-24 2024-02-27 江南大学 一种产人源透明质酸酶ph20的重组毕赤酵母及其构建方法
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
KR20230168902A (ko) * 2022-06-08 2023-12-15 (주)한국비엠아이 히알루로니다제 폴리펩티드 및 이의 용도
CN116272708B (zh) * 2023-03-16 2023-11-14 海南医学院 一种量子点-抗体复合物微球及其制备方法、应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010077297A1 (en) * 2008-12-09 2010-07-08 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
CN102065886A (zh) * 2008-04-14 2011-05-18 哈洛齐梅公司 修饰的透明质酸酶及其在治疗透明质酸相关疾病和病症中的应用

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
AU546785B2 (en) * 1980-07-23 1985-09-19 Commonwealth Of Australia, The Open-loop controlled infusion of diabetics
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4769027A (en) 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE69026306T2 (de) 1989-05-27 1996-10-17 Sumitomo Pharma Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5721348A (en) 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
AU668505B2 (en) 1991-03-18 1996-05-09 Scripps Research Institute, The Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compositions
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
WO1995026746A1 (en) 1994-03-31 1995-10-12 Amgen Inc. Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
US5795569A (en) 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US20010055563A1 (en) 1999-09-09 2001-12-27 Rhomed Incorporated Post-labeling stabilization of radiolabeled proteins and peptides
US5958750A (en) 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
US6461863B1 (en) 1996-08-16 2002-10-08 University Of Wyoming Modifying insect cell gylcosylation pathways with baculovirus expression vectors
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6193963B1 (en) 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
EP1061954B1 (en) 1998-03-12 2004-06-09 Nektar Therapeutics Al, Corporation Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
EP1095243A2 (en) 1998-07-03 2001-05-02 Neles Field Controls Oy Method and arrangement for measuring fluid
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
DK1259562T3 (da) 1999-12-22 2006-04-18 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisk hindrede derivater af vandoplöselige polymerer
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
ATE367398T1 (de) 2000-05-16 2007-08-15 Bolder Biotechnology Inc Verfahren zur rückfaltung von proteinen mit freien cysteinresten
US6615063B1 (en) * 2000-11-27 2003-09-02 The General Hospital Corporation Fluorescence-mediated molecular tomography
EP1345628B1 (en) 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
JP4758608B2 (ja) 2001-11-07 2011-08-31 ネクター セラピューティックス 分枝ポリマーおよびそれらの結合体
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
EP1944320A1 (en) 2002-12-16 2008-07-16 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
EP2572732A1 (en) 2003-02-26 2013-03-27 Nektar Therapeutics Polymer-factor VIII moiety conjugates
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
EP2405015B1 (en) 2003-03-05 2016-01-06 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
US20090123367A1 (en) 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
CA2525784C (en) * 2003-05-16 2019-04-09 Acorda Therapeutics, Inc. Proteoglycan degrading mutants for treatment of cns
NZ541374A (en) 2003-05-23 2008-09-26 Nektar Therapeutics Al Corp PEG derivatives having an amidocarbonate linkage
CA2534077A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
WO2005042753A1 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Chesapeake Perl, Inc. Production of human glycosylated proteins in transgenic insects
ES2343965T3 (es) 2003-11-25 2010-08-13 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Anticuerpos anti-cd22 e inmunocongujados mutados.
PT2319500E (pt) 2004-03-12 2013-01-23 Biodel Inc Composições de distribuição de fármacos de actuação rápida
US7112687B2 (en) 2004-07-15 2006-09-26 Indena, S.P.A. Methods for obtaining paclitaxel from taxus plants
WO2006056464A2 (en) 2004-11-26 2006-06-01 Pieris Ag Compound with affinity for the cytotoxic t lymphocyte-associated antigen (ctla-4)
CN101203549B (zh) 2005-06-09 2011-04-13 那野伽利阿株式会社 铂络合物的聚合配位化合物的制造方法
JP2007153797A (ja) * 2005-12-05 2007-06-21 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 自己免疫疾患、炎症及び神経疾患の治療剤及び予防剤
KR101516023B1 (ko) 2006-08-01 2015-04-30 피어이스 에이지 눈물 리포칼린 돌연변이 단백질 및 이를 얻는 방법
RU2471867C2 (ru) 2007-06-19 2013-01-10 Тамара П. Уваркина Гиалуронидаза и способ ее применения
EP2674487A3 (en) 2008-03-06 2014-02-26 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
WO2009128918A1 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Combination therapy using a soluble hyaluronidase and a bisphosphonate
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
DK2340033T3 (da) 2009-06-26 2014-01-20 Novo Nordisk As Præparat, der omfatter insulin, nicotinamid og arginin
DK2477603T3 (en) * 2009-09-17 2016-06-13 Baxalta Inc STABLE CO-DEVELOPMENT OF hyaluronidase and Immunoglobulin, AND METHODS OF USE THEREOF
ES2661089T3 (es) 2010-07-20 2018-03-27 Halozyme Inc. Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano
US8401194B2 (en) * 2010-10-15 2013-03-19 Roche Diagnostics Operations, Inc. Diabetes care kit that is preconfigured to establish a secure bidirectional communication link between a blood glucose meter and insulin pump
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
WO2012136768A1 (en) * 2011-04-08 2012-10-11 Hans-Dieter Haubeck Use of mutants of human hyaluronidase ph-20 with increased chondroitinase activity for axonal regrowth
MX340172B (es) 2011-06-17 2016-06-28 Halozyme Inc Formulaciones estables de una enzima degradadora de hialuronano.
WO2012174480A2 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Halozyme, Inc. Continuous subcutaneous insulin infusion methods with a hyaluronan degrading enzyme
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
WO2013040501A1 (en) * 2011-09-16 2013-03-21 Pharmathene, Inc. Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and uses thereof
BR112014009797A2 (pt) 2011-10-24 2020-10-27 Halozyme, Inc. diagnóstico de companhia para terapia de agente anti-hialuronano e métodos de uso do mesmo
PT3130347T (pt) 2011-12-30 2019-12-10 Halozyme Inc Variantes de polipéptidos de ph20, suas formulações e utilizações
CA2986512C (en) 2012-04-04 2022-05-17 Halozyme, Inc. Combination therapy with an anti-hyaluronan agent and a tumor-targeted taxane
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
CN111971387A (zh) 2018-07-25 2020-11-20 阿特根公司 新型透明质酸水解酶突变体和包含其的药物组合物
PE20220283A1 (es) 2019-03-25 2022-02-25 Alteogen Inc Composicion farmaceutica para inyeccion subcutanea que comprende una variante de hialuronidasa humana ph20 y un medicamento

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102065886A (zh) * 2008-04-14 2011-05-18 哈洛齐梅公司 修饰的透明质酸酶及其在治疗透明质酸相关疾病和病症中的应用
WO2010077297A1 (en) * 2008-12-09 2010-07-08 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIGRID ARMING ET AL.: "In vitro mutagenesis of PH-20 hyaluronidase from human sperm", 《EUR. J. BIOCHEM.》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105727267A (zh) * 2016-02-05 2016-07-06 苏州康聚生物科技有限公司 一种重组人透明质酸酶冻干制剂及其制备方法和应用
WO2017201635A1 (zh) * 2016-05-23 2017-11-30 蔡胜和 透明质酸酶的细胞表达及其在实体瘤细胞治疗中的应用
WO2020119048A1 (zh) * 2017-12-13 2020-06-18 苏州康聚生物科技有限公司 一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用
CN111971387A (zh) * 2018-07-25 2020-11-20 阿特根公司 新型透明质酸水解酶突变体和包含其的药物组合物
CN112203642A (zh) * 2019-03-25 2021-01-08 阿特根公司 用于皮下注射的包含人透明质酸酶ph20变体和药物的药物组合物
CN116870164A (zh) * 2019-03-25 2023-10-13 阿特根公司 用于皮下注射的包含人透明质酸酶ph20变体和药物的药物组合物
WO2023001264A1 (zh) 2021-07-23 2023-01-26 上海宝济药业有限公司 一种能皮下给药的抗生素药物组合物
CN114624366A (zh) * 2022-05-16 2022-06-14 南京瑞克卫生物医药有限公司 一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法
CN114624366B (zh) * 2022-05-16 2022-07-26 南京瑞克卫生物医药有限公司 一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法

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