CN102307993A - 延长的可溶性ph20多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括延长的可溶性PH20多肽在内的可溶性PH20多肽及其用途。本发明还提供了其他C端截短的PH20多肽和部分去糖基化的PH20多肽以及它们的用途。

Description

延长的可溶性PH20多肽及其用途
相关申请
本申请要求以下美国临时申请的优选权：Ge Wei、KrishnasamyPanneerselvam、Louis Bookbinder和Gregory I.Frost于2009年11月13日提交的美国临时申请系列号61/281,240，其题目为“延长的可溶性PH20多肽及其用途”；以及Ge Wei、Krishnasamy Panneerselvam、Louis Bookbinder和Gregory I.Frost于2008年12月9日提交的美国临时申请系列号61/201,384，其题目为“延长的可溶性PH20多肽及其用途”。当允许时，上述相关申请的主题整体援引加入本文。
本申请涉及同一天提交的题目为“延长的可溶性PH20多肽及其用途”的美国专利申请系列号12/653,245，其要求美国临时申请系列号61/281,240和61/201,384的优先权。
当允许时，上述相关申请的主题通过引用整体加入本文。
发明领域
本发明提供了包括延长的可溶性PH20多肽在内的可溶性PH20多肽及其用途。本发明还提供了其他C端截短的PH20多肽和部分去糖基化的PH20多肽以及它们的用途。
发明背景
乙酰透明质酸(透明质酸；HA)是在许多细胞的胞外基质中，特别是在软结缔组织中发现的多肽。HA还主要在哺乳动物的皮肤、软骨和滑液中发现。乙酰透明质酸还是眼睛玻璃体的主要成分。HA在各种生理过程中发挥作用，如水和血浆蛋白稳态(Laurent TC et al(1992)FASEB J 6：2397-2404)。某些疾病与乙酰透明质酸的表达和/或产生有关。透明质酸酶是降解乙酰透明质酸的酶。通过催化HA，透明质酸酶可以用于治疗与HA或其他糖胺聚糖的积累相关的疾病或病症。而且，因为HA是间质屏障的主要组分，所以透明质酸酶增加了组织通透性并因此可以用于增加治疗剂的分散和递送。各种透明质酸酶在治疗上使用(例如HydaseTM、VitraseTM和WydaseTM)，通常作为分散和铺展剂与其他治疗剂组合。许多这样的透明质酸酶是绵羊或牛形式，对于人治疗可能具有免疫原性。亟需可以用于治疗的改进的透明质酸酶组合物。
发明概述
本文提供了包括延长的可溶性PH20(esPH20)多肽在内的可溶性PH20多肽和组合物。本文提供的PH20多肽为C端截短的可溶性蛋白，并且包括缺少所有GPI-锚附着信号(anchor attachment signal)序列的那些PH20多肽(例如在氨基酸位置450-490处截短的)。可溶性PH20多肽还包括延长的可溶性PH20多肽，其保留了一个或多个位于相应全长野生型PH20多肽的GPI-锚附着信号序列的残基。本文还提供了含有C端截短的其他修饰的PH20多肽。本文还提供了任何多肽的部分去糖基化形式。本文还提供了利用本文提供的PH20多肽的治疗方法。
本文提供了分离且基本上纯化的延长的可溶性PH20(esPH20)透明质酸酶，其可以为N-糖基化或N-部分糖基化的。在一些实例中，N-部分糖基化的esPH20多肽含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个，例如SEQ ID NO：107的氨基酸残基368和393或者与SEQ ID NO：107的氨基酸残基368和393对应的残基。在一些方面，N-部分糖基化的esPH20多肽含有至少两个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个。本文提供的N-部分糖基化的esPH20多肽还可以含有支化的糖。
本文提供了esPH20多肽，其具有SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列或者其等位基因或物种变体。本文还提供了esPH20多肽变体，其与SEQ ID NO：60-63和102-104的任一个具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性，并且保留了至少30％的相应的未修饰形式或由核酸编码的多肽的透明质酸酶活性，所述核酸编码具有SEQ ID NO：107的氨基酸36-482的多肽。这样的esPH20多肽保持可溶并且在中性条件下是有活性的。在一实例中，esPH20为人esPH20，如具有SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列的esPH20；或者黑猩猩esPH20，如具有SEQ ID NO：197的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497或36-498所示的氨基酸序列的esPH20。
本文还提供了基本上纯化的PH20多肽。这些PH20多肽可以具有SEQID NO：55-63和64-95中任一个所示的氨基酸序列或者其等位基因或物种变体。在其他实例中，PH20多肽为与SEQ ID NO：55-63和64-95的任一个具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性的变体，其保留了至少30％的相应的未修饰形式或由核酸编码的多肽的透明质酸酶活性，所述核酸编码具有SEQ ID NO：107的氨基酸36-482的多肽。这样的PH20多肽在中性条件下是有活性的。
本文提供的PH20多肽可以是N-糖基化或N-部分糖基化的。在一些实例中，N-部分糖基化的esPH20多肽含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个，例如SEQ IDNO：107的氨基酸残基368和393或者与SEQ ID NO：107的氨基酸残基368和393对应的残基。在一些方面，N-部分糖基化的PH20多肽含有至少两个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少两个N-联部分的每一个。本文提供的N-部分糖基化的PH20多肽还可以含有支化的糖。在一些方面，本文提供的PH20多肽是可溶的，并且可以选自人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴(cynomolgus monkey)、小鼠、兔、豚鼠、奶牛或绵羊PH20。
本文提供的esPH20和PH20多肽可以被修饰，例如唾液酸化(sialation)、白蛋白化(albumination)、法尼基化、羧基化、羟基化或磷酸化。在一些方面，esPH20和PH20多肽被诸如葡聚糖或PEG的聚合物修饰。本文还提供了含有esPH20或PH20多肽的缀合物。示例性缀合物包括esPH20或PH20缀合至多聚化结构域(如Fc结构域)、毒素、可检测标记或药物的缀合物。
本文提供了编码上述和本文提供的esPH20和PH20多肽的核酸。这些核酸包括编码具有以下氨基酸的esPH20或PH20多肽的核酸：与SEQ IDNO：107的氨基酸36-450、36-451、36-452、36-453、36-454、36-455、36-456、36-457、36-458、36-459、36-460、36-461、36-462、36-463、36-464、36-465、36-484、36-485、36-486、36-487、36-489、36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496或36-497对应的氨基酸；以及包括编码具有以下氨基酸的esPH20的核酸：与SEQ ID NO：197的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497或36-498对应的氨基酸。本文还提供了含有这些核酸的载体以及含有所述载体的细胞，如CHO细胞。
本文提供了含有任意一种或多种本文所述的esPH20或PH20多肽的组合物。在一些实例中，所述组合物含有多种esPH20或PH20多肽。例如，所述组合物可以含有多种esPH20多肽，其由编码以下氨基酸的核酸分子编码：与SEQ ID NO：107的氨基酸36-450、36-451、36-452、36-453、36-454、36-455、36-456、36-457、36-458、36-459、36-460、36-461、36-462、36-463、36-464、36-465、36-484、36-485、36-486、36-487、36-489、36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496或36-497对应的氨基酸；以及由编码具有以下氨基酸的esPH20的核酸分子编码：与SEQ ID NO：197的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497或36-498对应的氨基酸。在一些实例中，所述组合物含有从CHO细胞分泌的esPH20或PH20多肽。
本文提供的组合物可以为药物组合物。在一些实例中，所述组合物含有额外的治疗剂，所述治疗剂可以与所述组合物一起配制或配制在单独的组合物中。可以包括在本文提供的组合物中的治疗剂的实例为化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀变形虫剂(amoebicidal agent)、杀毛滴虫剂(trichomonocidal agent)、抗帕金森剂、抗疟剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂(alpha-adrenergic agonist agent)、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀细菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕剂、减充血剂、利尿剂、抑制剂(depressant agent)、诊断剂、电解质剂、催眠剂、激素剂、升血糖剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂(muscle contractant agent)、眼科剂(ophthalmic agent)、拟副交感神经剂、心力加强剂(psychic energizer agent)、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、泌尿剂(urinary agent)、阴道剂、杀病毒剂、维生素剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白、核酸、药物、有机分子和睡眠诱导剂(sleep inducer)。在特定的实例中，治疗剂为抗体、免疫球蛋白、二膦酸盐(如唑来膦酸(zolentronic acid))、细胞因子、化疗剂或胰岛素(如速效胰岛素)。
可以包含在本文提供的组合物中的其他治疗剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式维生素A酸)；别嘌醇；六甲蜜胺；阿伏西地；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；安曲霉素；阿帕奇醌；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴诺蒽醌；巴他布林；巴马司他；活卡介苗(BCG Live)；贝那昔滨；莱达莫司汀；莱佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；比生群；甲磺酸双奈法德；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡纳替尼；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀与聚苯丙生(Carmustines with Polifeprosans)；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；施铂锭；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体(Cytarabine liposomal)；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；达贝泊汀α；柔红霉素脂质体(Daunorubicin liposomal)；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素-毒素连接物；右尼古地平；右奥马铂(Dexonnaplatin)；右雷佐生；地扎呱宁；地吖醌；二溴螺氯铵(Dibrospidium)；地诺孕素；地那林(Dinalin)；地舍莫来；多西他赛；多非喹达；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal)；盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射液(Docorubicin HCL liposome injection)；多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；艾特咔林；依氟鸟氨酸；依拉克达(Elacridar)；依利奈法德；Elliott′s B Solution；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；恩扎啕林；依匹哌啶；表柔比星；阿法依泊汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；加柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/奥佐米星；吉罗酚；吉马替康；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；醋酸戈舍瑞林；羟基脲；替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；吲地磺胺；英丙醌；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2和其他白介素(包括重组白介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；异丙铂；伊立替康；伊索拉定；伊沙匹隆；酮曲沙；L-阿拉诺新；兰瑞肽；拉帕替尼；来多蒽琼；来曲唑；亚叶酸；亮丙立德；亮丙瑞林(亮丙立德)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNU；洛莫司汀；氯那法尼(Lonafarnib)；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美登素；氮芥(Mechlorethamine)；氮芥/氮芥(Nitrogen mustard)；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；MelphalanslL-PAM；美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6-巯嘌呤(Mecaptopurine)；美司钠；美替辛德；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨啶；美妥替哌；米铂；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；莫立替尼；麦考酚酸；苯丙酸南诺龙；奈达铂；奈拉滨(Nelzarabine)；奈莫柔比星；尼曲吖啶；诺考达唑；诺莫单抗；诺拉霉素；诺拉曲塞；诺托生琼；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；奥他赛；奥替拉西；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；帕米膦酸(Pamidronate)；帕土匹龙(Patubilone)；培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；吡利曲索；培美曲塞；奈莫司汀；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；吡铂(Picoplatin)；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；匹蒽醌；普来曲塞；普卡霉素(Plicamycid)光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟吩姆(Porfimer)；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；丙螺氯铵(Prospidium)；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡唑呋林；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素(Rufocromomycin)；沙柔比星；沙芬戈；沙格司亭；沙铂；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；磷乙酰天冬氨酸(Sparfosate)；膦门冬酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；角鲨胺；链黑霉素(Streptonigrin)；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；6-TG；他地那兰；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；他立喹达；牛磺莫司汀；替可加兰；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤(Thiamiprine)；硫鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；噻唑呋林(Tiazofurin)；噻氯咪索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；托匹生琼；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743)；曲妥珠单抗；曲托龙(Trestolone)；维A酸/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；四硝酸三铂(Triplatin Tetranitrate)；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达(Valspodar)；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗辛；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄链霉素A(Xanthomycin A′s)(胍甲环素)；折尼铂；亚苄维C[2-H]；净司他丁；唑来膦酸(Zoledronate)；佐柔比星；和佐舒喹达。
本文提供了治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的方法，其中向个体给予本文提供和描述的esPH20或PH20，或者含有esPH20或PH20的组合物。本文还提供了这样的方法，其用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团(cellulite)、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度。这样的方法包括向个体给予任何本文所述的esPH20或PH20多肽或者组合物。
本文提供的esPH20和PH20多肽可以用于代替PH20透明质酸酶，单独或组合地用于以下公开中所用的PH20透明质酸酶的任何治疗方法或联合治疗：美国公开第US20040268425号、第US20050260186号和第US20060104968号以及美国申请系列号12/381,844、12/386,249、12/387,225和12/386,222。
附图说明
图1描述了人(SEQ ID NO：107)和黑猩猩(SEQ ID NO：197)PH20多肽的氨基酸序列的比对(利用ClustalW2比对程序进行)。人PH20 GPI-锚附着信号序列的氨基酸残基和黑猩猩PH20序列中的相应氨基酸为黑体和下划线。“*”表示在比对中上面的残基在两个序列中是相同的。“:”表示保守性取代，而“.”表示半保守性取代。
图2描述了脊椎动物中N-聚糖的主要类型，包括高甘露糖聚糖、杂合(hybrid)聚糖和复杂(complex)聚糖。
图3描述了内切糖苷酶切割位点。图3A示出内切糖苷酶F1和肽N糖苷酶F(PNGaseF)的切割位点。图3B示出内切糖苷酶F2和PNGaseF的切割位点。图3C示出内切糖苷酶F3和PNGaseF的切割位点。图3D示出内切糖苷酶F4和PNGaseF的切割位点。
发明详述
综述
A.定义
B.综述
1.PH20
a.糖基化
b.GPI-锚定
C.延长的可溶性PH20多肽
1.人esPH20多肽
2.其他物种esPH20多肽
D.N-部分糖基化的PH20多肽
1.PH20多肽
2.C端截短的PH20多肽
3.额外修饰
缀合至聚合物
E.产生编码延长的可溶性PH20和其他可溶性PH20透明质酸酶及其多肽的核酸的方法
1.载体和细胞
2.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化技术
F.延长的可溶性PH20多肽和其他可溶性PH20多肽的制备、制剂和给药
1.注射剂、溶液和乳剂
冻干粉
2.体表(topical)给药
3.用于其他给药途径的组合物
4.剂量和给药
5.包装、制品和试剂盒
G.测定
1.透明质酸酶活性
2.溶解性
H.治疗方法及延长的可溶性PH20和其他可溶性PH20的用途及联合治疗
1.用作铺展剂和联合治疗
2.用于去除过量的糖胺聚糖(Glycosaminoglycanase)
a.在癌症治疗中的用途
b.在治疗脑中的糖胺聚糖积累中的用途
c.在治疗心血管疾病中的糖胺聚糖积累中的用途
d.在玻璃体切开术以及眼病症和疾病状况中的用途
e.在皮下输液中的用途
f.在基因治疗中的用途
g.美容用途
h.在器官移植中的用途
i.在肺疾病中的用途
3.其他用途
I.实施例
A.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。整个公开中提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站和其他公开的材料，除非另有说明，整体援引加入本文。如果本文的术语有多种定义，则以本节中的为准。当提及URL或者其他这样的标识符或地址时，应当理解这些标识符可以改变，并且在网络上特定的信息可以交流，但是通过搜索网络可以找到等同的信息。对其引用证明了这些信息的可得性和公开传播。
如本文所用，透明质酸酶指降解乙酰透明质酸的一类酶。透明质酸酶包括但不限于细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)，来源于水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，以及哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶包括任何非人来源的透明质酸酶，包括但不限于鼠、犬、猫、兔、鸟、牛、绵羊、猪、马、鱼、蛙、细菌，以及来源于水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的任何透明质酸酶。示例性人透明质酸酶包括HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和PH20(SEQ ID NO：107)。透明质酸酶还包括可溶性透明质酸酶，包括绵羊和牛PH20、可溶性人PH20及rHuPH20。可商购的牛或绵羊可溶性透明质酸酶的实例为Vitrase透明质酸酶(绵羊透明质酸酶)和Amphadase
Figure BPA00001417846500102
透明质酸酶(牛透明质酸酶)。
如本文所用，PH20指存在于精子中并且在中性条件下是有活性的一类透明质酸酶。PH-20存在于精子表面和溶酶体衍生的顶体，其中PH-20结合至顶体内膜。PH20包括任何来源的PH20，包括但不限于人、黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、鼠、牛、绵羊、豚鼠、兔和大鼠来源。示例性PH20多肽包括来自人(SEQ ID NO：107)、黑猩猩(SEQ ID NO：197)、恒河猴(SEQ IDNO：198)、食蟹猴(SEQ ID NO：114)、奶牛(例如SEQ ID NO：111和119)、小鼠(SEQ ID NO：117)、大鼠(SEQ ID NO：116)、兔(SEQ ID NO：112)、绵羊(SEQID NO：113、118和120)和豚鼠(SEQ ID NO：115)的PH20多肽。所指的PH20包括前体PH20多肽和成熟PH20多肽(如其中信号序列已被去除的PH20多肽)，具有活性的其截短形式；并且包括等位基因变体和物种变体，剪接变体编码的变体，以及其他变体，其包括与SEQ ID NO：107和109所示的前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的多肽。PH20多肽还包括含有化学或翻译后修饰的PH20多肽以及不含有化学或翻译后修饰的PH20多肽。这样的修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化(farnysylation)、羧基化、羟基化、磷酸化和其他本领域已知的多肽修饰。截短的PH20透明质酸酶是其任何C端缩短的形式，特别是当N-糖基化时截短和在中性条件下是有活性的形式。
如本文所用，可溶性PH20指在生理条件下可溶的任何形式的PH20。例如，可溶性PH20可以通过在37℃下其分配入Triton
Figure BPA00001417846500111
 X-114溶液的水相来鉴定(Bordier et al.，(1981)J.Biol.Chem.，256：1604-7)。膜锚定PH20，如包括GPI-锚定的PH20在内的脂质锚定PH20，会分配入去污剂丰富相，但是用磷脂酶-C处理后会分配入去污剂贫乏相或水相。可溶性PH20包括膜锚定PH20，其中与PH20锚定至膜相关的一个或多个区域已被去除或修饰，其中可溶性形式保留透明质酸酶活性。可溶性PH20还包括重组可溶性PH20，以及包含在天然来源中或从天然来源纯化的可溶性PH20，例如来自绵羊或奶牛的睾丸提取物。这样的可溶性PH20的实例为可溶性人PH20。
如本文所用，可溶性人PH20或sHuPH20包括在C端缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚序列的PH20多肽，从而在表达时，多肽在生理条件下是可溶的。溶解性可以通过任何在生理条件下证明溶解性的合适方法来评价。这样的方法的实例为Triton
Figure BPA00001417846500112
 X-114测定，其评价分配入水相并且如上文和实施例中所述。此外，如果在诸如CHO-S细胞的CHO细胞中产生，则可溶性人PH20多肽为表达并分泌入细胞培养基中的多肽。然而，可溶性人PH20多肽不限于在CHO细胞中产生的可溶性人PH20多肽，其可以在任何细胞中或通过任何方法产生，包括重组表达和多肽合成。所指的在CHO细胞中的分泌是定义性的。因此，如果多肽可以在CHO细胞中表达和分泌并且是可溶的，即当用Triton
Figure BPA00001417846500113
 X-114提取时分配入水相，则无论是否是这样产生的，其都为可溶性PH20多肽。sHuPH20多肽的前体多肽可以包括信号序列，如异源或非异源(即天然)信号序列。前体的实例为包括信号序列的前体，如在氨基酸位置1-35处的天然35氨基酸信号序列(参见，例如SEQ ID NO：107的氨基酸1-35)。
如本文所用，“延长的可溶性PH20”或“esPH20”包括可溶性PH20多肽，其含有直至GPI锚附着信号序列的残基以及来自GPI-锚附着信号序列的一个或多个连续残基，从而esPH20在生理条件下是可溶的。生理条件下的溶解性可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测定。例如，其可以通过如上文和实施例中所述的Triton
Figure BPA00001417846500121
 X-114测定来评价。此外，如上文所述，如果在诸如CHO-S细胞的CHO细胞中产生，则可溶性PH20为表达并分泌入细胞培养基中的多肽。然而，可溶性人PH20多肽不限于在CHO细胞中产生的多肽，其可以在任何细胞中或通过任何方法产生，包括重组表达和多肽合成。所指的在CHO细胞中的分泌是定义性的。因此，如果多肽可以在CHO细胞中表达和纯化并且是可溶的，即当用Triton
Figure BPA00001417846500122
 X-114抽提时分配入水相，则无论是否是这样产生的，其为可溶性PH20多肽。除残基36-490之外，人可溶性esPH20多肽还包括从SEQ ID NO：107的氨基酸残基位置491开始的一个或多个连续氨基酸，从而所得的多肽是可溶的。示例性人esPH20可溶性多肽为具有与SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496和36-497对应的氨基酸残基的多肽。其实例为具有SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列的人esPH20可溶性多肽。还包括等位基因变体和其他变体，如任何与SEQ ID NO：60-63和102-104的相应多肽具有40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列相同性的变体，其保持在中性条件下是有活性的并且是可溶的。所指的序列相同性指具有氨基酸取代的变体。
如本文所用，所指的esPH20包括前体esPH20多肽和成熟esPH20多肽(如其中信号序列已被去除的esPH20多肽)；具有酶活性(保留全长形式的至少1％、10％、20％、30％、40％、50％或更多)并且可溶的其截短形式；还包括等位基因变体和物种变体；剪接变体编码的变体；以及其他变体，包括与SEQ ID NO：107和109所示的前体多肽或其成熟形式具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的多肽。
如本文所用，所指的esPH20还包括含有化学或翻译后修饰的esPH20以及不含有化学或翻译后修饰的esPH20。这些修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化和其他本领域已知的多肽修饰。
如本文所用，可溶性重组人PH20(rHuPH20)指在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达和分泌的人PH20的可溶形式。可溶性rHuPH20由包括信号序列的核酸编码，并且如SEQ ID NO：109所示。还包括其等位基因变体和其他可溶性变体的DNA分子。将编码可溶性rHuPH20的核酸在分泌成熟多肽的CHO细胞中表达。当在培养基中产生时，在C端具有异质性，从而产物包括多种物质(species)的混合物，其可以包括各种丰度的SEQ IDNO：122至SEQ ID NO：127的任一种或多种。
相似地，对于诸如esPH20的其他形式的PH20，重组表达的多肽及其组合物可以包括在C端表现出异质性的多种物质。例如，通过表达SEQ IDNO：8的多肽而产生的重组表达的esPH20的组合物可以包括含有较少氨基酸的形式，如36-496、36-495，该SEQ ID NO：8编码具有氨基酸36-497的esPH20。
如本文所用，N-联部分指多肽的天冬酰胺(N)氨基酸残基，其能够被多肽的翻译后修饰糖基化。人PH20的示例性N-联部分包括SEQ ID NO：107所示的人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393。
如本文所用，N-糖基化的多肽指含有至少3个N-联氨基酸残基的寡糖键的PH20多肽或其截短形式，例如与SEQ ID NO：107的氨基酸残基N235、N368和N393对应的N-联部分。N-糖基化的多肽可以包括3、4、5个和高达所有N-联部分连接至寡糖的多肽。N-联寡糖可以包括甘露低聚糖，复杂、杂合或硫酸化的寡糖，或者其他寡糖和单糖。
如本文所用，N-部分糖基化的多肽指最少含有一个N-乙酰葡糖胺聚糖的多肽，所述N-乙酰葡糖胺聚糖连接至至少3个N-联部分。部分糖基化的多肽可以包括各种聚糖形式，包括单糖、寡糖和支化的糖形式，包括那些通过用EndoH、EndoF1、EndoF2和/或EndoF3处理多肽形成的形式。例如，这样的酶对聚糖的切割在图2中描述。
如本文所用，去糖基化的PH20多肽指本文提供的PH20多肽，其中少于所有可能的糖基化位点是糖基化的。可以影响去糖基化，例如通过去除糖基化、通过阻止糖基化或修饰多肽以消除糖基化位点。如本文所示，特定的N-糖基化位点不是活性所需要的，而其余的是。
如本文所用，乙酰透明质酸相关疾病、病症或疾病状况指任何疾病或疾病状况，其中乙酰透明质酸水平作为起因、结果或者在疾病或疾病状况中观察到的其他方式而升高。乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况与组织或细胞中升高的乙酰透明质酸表达、增加的组织液压力、减少的血管容积和/或组织中增加的水含量相关。乙酰透明质酸相关疾病、病症或疾病状况可以通过给予含有乙酰透明质酸降解酶例如透明质酸酶如可溶性透明质酸酶的组合物来治疗，单独或者与另一疗法和/或物质组合或者除另一疗法和/或物质之外给予。示例性疾病和疾病状况包括但不限于乙酰透明质酸丰富的癌症，例如肿瘤，包括实体瘤，如晚期癌症、转移癌、未分化癌、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和其他癌症。此外，乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况的实例为与升高的组织液压力相关的疾病，如与椎间盘压力(disc pressure)相关的疾病和水肿，例如器官移植、中风、脑外伤或其他损伤引起的水肿。示例性乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况包括与升高的组织液压力、减少的血管容积和/或组织中增加的水含量相关的疾病和疾病状况，包括癌症、椎间盘压力和水肿。在一实例中，乙酰透明质酸相关疾病状况、疾病或病症的治疗包括对于增加的组织液压力(IFP)、减少的血管容积和组织中增加的水含量的一个或多个的改善、减轻或其他有益效果。
如本文所用，缀合物指直接或间接连接至一个或多个其他多肽或化学部分的可溶性PH20多肽。这样的缀合物包括融合蛋白、通过化学缀合产生的缀合物和通过任何其他方法产生的缀合物，由此至少一个可溶性PH20多肽直接或间接连接至其他多肽或化学部分，只要缀合物保留透明质酸酶活性。本文提供的缀合物的实例包括直接或间接连接至诸如Fc部分的多聚化结构域、毒素、标记或药物的PH20多肽。
如本文所用，融合蛋白指核酸序列编码的多肽，所述核酸序列含有来自一个核酸分子的编码序列和来自另一个核酸分子的编码序列，其中所述编码序列在相同的阅读框中，从而当融合构建体在宿主细胞中转录和翻译时，产生含有两个蛋白的蛋白。两个分子可以在构建体中相邻或被接头(linker)多肽分开，所述接头多肽含有1、2、3个或更多，但通常少于10、9、8、7或6个氨基酸。融合构建体编码的蛋白产物称为融合多肽。融合多肽的实例包括Fc融合。
如本文所用，缀合至诸如透明质酸酶的乙酰透明质酸降解酶的聚合物指直接或通过接头来共价或其他方式稳定连接至乙酰透明质酸降解酶的任何聚合物。这样的聚合物通常增加血清半衰期，并且包括但不限于唾液酸部分、聚乙二醇化部分、葡聚糖和糖以及其他部分，如糖基化部分。
如本文所用，活性指多肽或其部分与全长(完整)蛋白相关的功能活性或多种活性。功能活性包括但不限于生物学活性、催化或酶促活性、抗原性(结合或与多肽竞争结合至抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力和特异性结合至多肽的受体或配体的能力。
如本文所用，透明质酸酶活性指酶促催化切割透明质酸的能力。用于透明质酸酶的美国药典(USP)XXII测定通过测量较高分子量的透明质酸或乙酰透明质酸的量来间接测定透明质酸酶活性，将酶切(enzyme)后剩余的(HA)底物与HA在37℃下反应30min(USP XXII-NF XVII(1990)644-645United States Pharmacopeia Convention，Inc，Rockville，MD)。在测定中可以使用参考标准溶液以确定任何透明质酸酶的相对活性单位。确定透明质酸酶的透明质酸酶活性的体外测定为本领域已知并且本文所述，所述透明质酸酶例如PH20，包括可溶性PH20和esPH20。示例性测定包括如下所述的微浊度测定(参见例如实施例12)，其通过检测未切割的透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀物来间接测量透明质酸酶对透明质酸的切割。例如，可以使用参考标准以产生标准曲线来确定测试的透明质酸酶的活性单位。
如本文所用，在中性条件下是有活性的(neutral active)指PH20多肽在中性pH下酶促催化透明质酸的切割的能力。与非C端截短或N-部分糖基化的相应在中性条件下是有活性的PH20的透明质酸酶活性相比，本文提供的在中性条件下是有活性的C端截短或N-部分糖基化的PH20具有或具有约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多的活性。
如本文所用，GPI-锚附着信号序列是在ER腔内指导预形成的GPI-锚添加到多肽的C端氨基酸序列。GPI-锚附着信号序列存在于GPI-锚定的多肽的前体多肽中，如GPI-锚定的PH20多肽。C端GPI-锚附着信号序列通常含有8-20个氨基酸的主要疏水区域，其前面为紧接ω-位点或GPI-锚附着位点下游的8-12个氨基酸的亲水间隔区域。GPI-锚附着信号序列可以利用本领域众所周知的方法来鉴定。这些方法包括但不限于计算机方法和算法(参见，例如Udenfriend et al.(1995)Methods Enzymol.250：571-582，Eisenhaber et al.，(1999)J.Biol.Chem.292：741-758，Kronegg and Buloz，(1999)，″Detection/prediction of GPI cleavage site(GPI-anchor)in a protein(DGPI)″，例如网站129.194.185.165/dgpi/，Fankhauser et al.，(2005)Bioinformatics 21：1846-1852，Omaetxebarria et al.，(2007)Proteomics7：1951-1960，Pierleoni et al.，(2008)BMC Bioinformatics 9：392)，包括在诸如ExPASy蛋白质组学工具站点(例如万维网站点expasy.ch/tools/)的生物信息网站上容易获得的方法和算法。
如本文所用，双岩藻糖基化的多肽指具有两个岩藻糖残基的多肽，所述岩藻糖残基一个具有α1，3-键而另一个具有α1，6-键，连接至相同的核心N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至多肽链中的天冬酰胺残基。双岩藻糖基化的多肽一般在昆虫细胞中产生。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以为单链或双链。当提到探针或引物时，单链分子为预期的，所述探针或引物任选地被标记，例如用诸如荧光或放射性标记的可检测标记来标记。这样的分子通常具有使其靶标在统计学上独特的长度或者具有用于检测或吸出文库的低拷贝数(通常少于5，一般少于3)。一般探针或引物含有至少14、16或30个连续的核苷酸，其序列与所关注的基因互补或相同。探针和引物的长度可以为10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文所用，肽指长度大于或等于2个氨基酸，并且长度少于或等于40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在各种本文提供的氨基酸序列中出现的氨基酸根据它们已知的三字母或单字母的缩写(表1)来鉴定。在各种核酸片段中出现的核苷酸用本领域常用的标准单字母名称来命名。
如本文所用，“氨基酸”为含有氨基和羧酸的有机化合物。多肽含有两个或更多个氨基酸。为了本文的目的，氨基酸包括20种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文所用，“氨基酸残基”指通过多肽在其肽键处的化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基推定为“L”异构形式。命名为“D”异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保留期望的功能特性。NH2指多肽的氨基端存在的游离氨基。COOH指多肽的羧基端存在的游离羧基。根据J.Biol.Chem.，243：3557-3559(1968)中所述的标准多肽命名，并且采用37C.F.R.§§1.821-1.822，氨基酸残基的缩写在表1中示出。
表1-对应表
Figure BPA00001417846500171
本文通过通式来表示的所有氨基酸残基序列具有从左至右的氨基端至羧基端的常规方向的方向。此外，短语“氨基酸残基”定义为包括对应表(表1)中列出的氨基酸以及修饰和稀有的氨基酸，如在援引加入本文的37 C.F.R.§§1.821-1.822中提到的氨基酸。此外，应当注意，氨基酸残基序列的开始或末尾的破折号表示肽键，其连接至一个或多个氨基酸残基的另一序列，连接至诸如NH2的氨基端基团，或者连接至诸如COOH的羧基端基团。
如本文所用，“天然存在的α-氨基酸”是在自然界中发现的20种α-氨基酸的残基，其通过装载的tRNA分子与其在人中的同源mRNA密码子的特异性识别来并入蛋白。因此，非天然存在的氨基酸包括，例如除20种天然存在的氨基酸以外的氨基酸或氨基酸类似物，并且包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸如本文所述并且为本领域技术人员已知。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链、线性或环状DNA分子，其含有以自然中不存在的方式结合和并列的DNA片段。DNA构建体作为人为操纵的结果存在，并且包括克隆和其他操纵分子的拷贝。
如本文所用，DNA片段是具有特定属性的较大的DNA分子的部分。例如，编码特定多肽的DNA片段是诸如质粒或质粒片段的较长DNA分子的部分，当从5’至3’方向阅读时，其编码所述特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸表示从5’至3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源分离，体外合成或者从天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文中用核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)来表示。当上下文允许时，术语核苷酸用于单链和双链分子。当术语用于双链分子时，其用于表示全长并且会理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员会认识到双链多核苷酸的两条链的长度可以略有不同，并且其末端可以错开；因此在双链多核苷酸分子内不是所有的核苷酸是配对的。一般这样不配对的末端长度不会超过20个核苷酸。
如本文所用，两个蛋白或核酸之间的“相似性”指所述蛋白的氨基酸序列或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可以基于所含残基序列和残基的相同性和/或同源性程度。用于评价蛋白或核酸之间相似度的方法为本领域技术人员已知。例如，在一种评价序列相似性的方法中，用产生序列之间最大水平相同性的方式来比对两个氨基酸或核苷酸序列。“相同性”指氨基酸或核苷酸序列不变的程度。氨基酸序列以及某种程度上核苷酸序列的比对还可以考虑到氨基酸(或核苷酸)中的保守性差异和/或常见取代。保守性差异是保留所涉及的残基的物理化学特性的差异。比对可以为整体的(在序列的整个长度比较序列并且包括所有残基的比对)或局部的(仅包括最相似区域或多个区域的部分序列的比对)。
“相同性”本身具有本领域公认的含义并且可以利用公开的技术来计算。(参见，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。当存在许多测量两种多核苷酸或多肽之间的相同性的方法时，术语“相同性”是技术人员众所周知的(Carillo，H.& Lipton，D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
如本文所用，同源(关于核酸和/或氨基酸序列)表示约大于或等于25％的序列同源性，通常大于或等于25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列同源性；如有必要，可以具体说明精确的百分率。为了本文的目的，除非另有说明，术语“同源性”和“相同性”经常可交换使用。总的来说，为了确定同源性或相同性百分比，将序列比对以获得最高等级的匹配(参见，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。通过序列同源性，保守氨基酸的数目通过标准比对算法程序来确定，并且可以与各个供应者(supplier)建立的默认空位罚分一起使用。基本上同源的核酸分子通常在中等严紧性或高度严紧性下与所关注的核酸在整个长度上杂交。还考虑到含有代替杂交核酸分子中的密码子的简并密码子的核酸分子。
任何两个分子是否具有是至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或“同源”核苷酸序列或氨基酸序列可以利用已知的诸如“FASTA”程序的计算机算法来确定，例如在Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中利用默认参数(其他程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，et al.，J Mol Biol 215：403(1990))；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，and Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，国家生物技术信息中心数据库的BLAST功能可以用于确定相同性。其他可商购或公开的程序包括DNAStar“MegAlign”程序(Madison，WI)和威斯康辛大学遗传学计算机集团(UWG)“Gap”程序(Madison WI)。例如，蛋白和/或核酸分子的同源性或相同性百分数可以通过利用GAP计算机程序比较序列信息来确定(例如Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48：443，由Smith andWaterman((1981)Adv.Appl.Math.2：482修订)。简单地说，GAP程序将相似性定义为用比对的相似的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列的总符号数目。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(1表示相同，0表示不同)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds.，ATLAS OF PROTEINSEQUENCE AND STRUCTURE，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)每个空位罚分3.0并且每个空位中的每个符号另外罚分0.1；以及(3)末端空位不罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”或“同源性”表示测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较。如本文所用，术语至少“90％相同”指相对于参考核酸或多肽的氨基酸序列同源性百分数为90至99.99。90％或更高水平的相同性表明，假设为了例证目的，比较了长度为100个氨基酸的测试和参考多肽。在测试多肽中不超过10％(即100中的10)的氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。相似的比较可以在测试和参考多核苷酸之间进行。这样的差异可以表示为随机分布在多肽的整个长度的点突变，或者它们可以集中在一个或多个位置，其具有不同长度至到高达最大允许例如10/100氨基酸差异(约90％相同性)。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在大于约85-90％的同源性或相同性水平，结果应当独立于程序和空位参数设置；从而高水平的相同性经常可以容易地通过手动比对而不依赖于软件来评价。
如本文所用，比对的序列指使用同源性(相似性和/或相同性)来比对核苷酸或氨基酸序列中的相应位置。通常，比对50％或更多相同性相关的2个或更多个序列。一组比对的序列指在相应位置比对的2个或更多个序列，并且可以包括比对与基因组DNA序列比对的来自诸如EST和其他cDNA的RNA的序列。
如本文所用，“引物”指在合适的条件下(例如在4种不同核苷三磷酸以及诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的聚合试剂的存在下)，在合适的缓冲液中及适当的温度下可以作为模板指导的DNA合成的起始点的核酸分子。应当理解某些核酸分子可以作为“探针”和“引物”。然而，引物具有用于延伸的3’羟基。引物可以用于多种方法，包括例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄PCR、捕获PCR、表达PCR、3′和5′RACE、原位PCR、连接介导PCR和其他扩增方案。
如本文所用，“引物对”指一组引物，其包括与待扩增序列的5′端杂交的5′(上游)引物和与待扩增序列3′端的互补物(complement)杂交的3′(下游)引物。
如本文所用，“特异性杂交”指通过互补碱基配对，核酸分子(例如寡核苷酸)退火至靶核酸分子。本领域技术人员熟悉影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。特别是关于体外杂交的参数还包括退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。用于去除非特异性结合的核酸分子的示例性洗涤条件在高严紧性下为0.1x SSPE、0.1％SDS、65℃，而在中等严紧性下为0.2x SSPE、0.1％SDS、50℃。等同的严紧性条件为本领域已知。技术人员可以轻易调整这些参数以实现适合特定应用的核酸分子与靶核酸分子的特异性杂交。当提到两个核苷酸序列时，互补表示这两个核苷酸的序列能够杂交，通常在相反的核苷酸之间具有少于25％、15％或5％的错配。如有必要，应当具体说明互补性的百分率。通常选择在高严紧性条件下杂交的两个分子。
如本文所用，与产物基本上相同表示足够相似从而所关注的特性充分不变，因而基本上相同的产物可以用于代替所述产物。
如本文所用，还应当理解，如本领域技术人员所理解的，术语“基本上相同”或“相似”随上下文变化。
如本文所用，等位基因变体或等位基因变异指占据相同染色体位点的基因的任何两个或更多种可选形式。等位基因变异通过突变自然产生，并且可以导致种群内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)，或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文中还用于表示基因的等位基因变体编码的蛋白。通常基因的参考形式编码来自种群或物种的单个参考成员的多肽的野生型形式和/或优势形式。通常，包括物种之间的变体在内的等位基因变体与来自相同物种的野生型和/或优势形式具有至少80％、90％或更大的氨基酸相同性；相同性的程度取决于基因以及比较是种间或种内的。通常，种内等位基因变体与野生型和/或优势形式具有至少约80％、85％、90％或95％或更大的相同性，这包括与多肽的野生型和/或优势形式的96％、97％、98％、99％或更大的相同性。本文所指的等位基因变体一般指相同物种的成员之间的蛋白变异。
如本文所用，在本文中与“等位基因变体”可交换使用的“等位基因”指基因或其部分的可选形式。等位基因在同源染色体上占据相同位点或位置。当个体具有基因的两个相同等位基因时，则认为该个体对于该基因或等位基因纯合的。当个体具有基因的两个不同等位基因时，则认为该个体对于该基因杂合的。特定基因的等位基因可以单个核苷酸或几个核苷酸各不相同，并且可以包括诸如核苷酸取代、缺失和插入的修饰。基因的等位基因还可以为含有突变的基因形式。
如本文所用，物种变体指不同物种之间多肽的变体，包括不同哺乳动物物种，如小鼠和人。本文提供的物种变体的实例为灵长类PH20，例如但不限于人、黑猩猩、猕猴和食蟹猴。通常，物种变体具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更大的序列相同性。例如，物种变体之间的相应残基可以通过比较和比对序列以最大化匹配的核苷酸或残基的数目来确定，从而序列之间的相同性等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％或者等于或大于99％。然后给出所关注的位置在参考核酸分子中的指定编号。比对可以手动或通过目视来完成，特别是当序列相同性大于80％时。例如，图1中的比对表明人PH20的氨基酸残基491对应于黑猩猩PH20的氨基酸残基491，并且人PH20的氨基酸残基497对应于黑猩猩PH20的氨基酸残基498。
如本文所用，剪接变体指通过基因组DNA的初级转录物的差别加工来产生的变体，所述差别加工导致了多于一类mRNA。
如本文所用，修饰分别指对于多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，并且包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，如通过利用重组DNA方法。
如本文所用，术语启动子表示含有提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因部分。启动子序列通常但不总是在基因的5’非编码区中发现。
如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白或其生物学活性部分基本上不含细胞物质或来自蛋白所源自的细胞或组织的其他污染蛋白，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。如果通过标准分析方法测定制品看起来不含容易检出的杂质，则可以确定其基本上不含杂质，所述分析方法例如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)，本领域技术人员将这些方法用于评价这样的纯度或者足够纯从而进一步纯化不会可检测地改变物质的物理和化学性质，如酶促和生物学活性。制备基本上化学纯的化合物的化合物纯化方法为本领域技术人员已知。然而，基本上化学纯的化合物可以为立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可以增加化合物的特定活性。
因此，所指的诸如基本上纯化的延长的可溶性PH20的基本上纯化的多肽指基本上不含细胞物质的PH20蛋白的制品，包括蛋白的制品，其中所述蛋白是从其分离或重组产生的细胞的细胞组分分离的。在一实施方案中，该术语基本上不含细胞物质包括酶蛋白的制品，其具有少于约30％(按干重)的非酶蛋白(在本文中还称为污染蛋白)，通常少于约20％非酶蛋白或10％非酶蛋白或者少于约5％非酶蛋白。当酶蛋白为重组产生时，其还基本上不含培养基，即培养基为酶蛋白制品体积的少于约20％、10％或5％或者为20％、10％或5％。
如本文所用，术语基本上不含化学前体或其他化学成分包括酶蛋白的制品，其中所述蛋白是从蛋白合成中所涉及的化学前体或其他化学成分分离的。该术语包括酶蛋白的制品，其具有少于约30％(按干重)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非酶化学成分或组分。
如本文所用，对于合成，例如合成核酸分子或合成基因或合成肽，指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用，通过重组方法或利用重组DNA方法产生表示使用分子生物学众所周知的方法来表达克隆的DNA编码的蛋白。
如本文所用，载体(或质粒)指用于将异源核酸引入细胞以表达或复制的离散单元。载体通常保持游离，但可以设计为影响基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑了人工染色体的载体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载体的选择和用途为本领域技术人员众所周知。
如本文所用，表达载体包括能够表达DNA的载体，所述DNA可操作地连接至诸如启动区的能够影响此类DNA片段表达的调节序列。这样的额外片段可以包括启动和终止序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、加A信号等。表达载体通常源自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体为本领域技术人员众所周知，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体和保持游离的表达载体或整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体为改造的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，当涉及DNA片段时，“可操作地”或“可操作地连接”表示片段被排列从而它们发挥与其预期目的一致的功能，例如转录从启动子的下游和任何转录序列的上游起始。启动子通常是转录体系结合以起始转录并通过编码片段至终止子的结构域。
本文所用的术语“评价”旨在包括在某种意义上获得样品中存在的蛋白酶或其结构域的活性的绝对值的定量和定性测定，并且还获得指示活性水平的指数、比值、百分率、视觉或其他值。评价可以是直接或间接的，并且实际检测的化合物当然不需要是蛋白水解产物本身，但例如可以为其衍生物或某些其他物质。例如，补体蛋白切割产物的检测，如通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色的蛋白。
如本文所用，生物学活性指化合物的体内活性或者体内给予化合物、组合物或其他混合物所导致的生理反应。因此，生物学活性包括这样的化合物、组合物和混合物的疗效和药物活性。生物学活性可以在设计为测试或使用此类活性的体外系统中观察。因此，对于本文的目的，蛋白酶的生物学活性为其催化活性，其中多肽被水解。
当涉及两个核酸序列时，本文所用的等同表示所关注的两个序列编码相同的氨基酸序列或等同的蛋白。当等同用于指两个蛋白或肽时，其表示这两个蛋白或肽具有基本上相同的氨基酸序列，仅有基本上不改变蛋白或肽的活性或功能的氨基酸取代。当等同指性质时，该性质不需要表现为相同的程度(例如，两个肽可以表现出相同类型酶促活性的不同速率)，但是活性通常基本上相同。
如本文所用，“调节(modulate)”和“调节(modulation)”或“改变”指诸如蛋白的分子活性的改变。示例性活性包括但不限于生物学活性，如信号转导。调节可以包括活性的增加(即上调或激动活性)、活性的降低(即下调或抑制)或活性的任何其他改变(如周期性、频率、持续时间、动力学或其他参数的变化)。调节可以取决于上下文，并且通常调节是与指定状态比较，例如野生型蛋白、组成型状态的蛋白或者在指定细胞类型或条件下表达的蛋白。
如本文所用，组合物指任何混合物。其可以为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，组合指两个或更多项之间的任何联系。组合可以为两个或更多个独立项，如两个组合物或两个集合；可以为其混合物，如两个或更多项的单一混合物，或其任何变体。组合的元素通常功能上关联或相关。
如本文所用，“疾病或病症”指在有机体中由原因或条件导致的病理状况，并且通过可识别的症状来表征，所述原因或条件包括但不限于感染、后天条件、遗传条件。本文所关注的疾病和病症为涉及ECM组分的疾病和病症。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防范潜在疾病和/或防范症状恶化或疾病发展。治疗还包括修饰的干扰素和本文提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，药学有效的物质包括任何治疗剂或生物活性剂，其包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、传统治疗药物，包括小分子药物和治疗性蛋白，小分子药物包括但不限于二膦酸盐，治疗性蛋白包括但不限于胰岛素、IgG分子和抗体。
如本文所用，治疗剂包括任何药学有效的物质或生物活性剂，其包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、传统治疗药物，包括小分子药物和治疗性蛋白，小分子药物包括但不限于二膦酸盐，治疗性蛋白包括但不限于胰岛素、IgG分子和抗体。
如本文所用，治疗表示任何方式，其中疾病状况、病症或疾病的症状或者其他指征被改善或以其他方式有益改变。
如本文所用，疗效表示由个体的治疗导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。治疗有效量指给予个体后引起疗效的组合物、分子或化合物的量。
如本文所用，术语“个体”指动物，包括哺乳动物，如人。
如本文所用，患者指表现出疾病或病症的症状的人个体。
如本文所用，通过治疗改善特定疾病或病症的症状，如通过给予药物组合物或其他治疗，指可以归因于或关联于给予组合物或治疗的症状的任何减轻，无论永久或暂时的，持续或短暂的。
如本文所用，防范或预防指方法，其中降低了发展疾病或疾病状况的风险。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或含有化合物的组合物的量。因此，其为用于预防、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症症状的必要量。
如本文所用，单位剂型指适合人和动物个体并且如本领域已知的独立包装的物理上分离的单位。
如本文所用，单剂量制剂指用于直接给药的制剂。
如本文所用，“制成品(article of manufacture)”指制造和销售的产品。如整个本申请所用，该术语旨在包括含有诸如esPH20的可溶性PH20的治疗剂或单独的esPH20，其包含在相同或独立包装的物品中。
如本文所用，液体指可以流动的任何组合物。因此液体包括半固体形式的组合物、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳膏剂和其他这样的组合物。
如本文所用，“试剂盒”指本文提供的组合物和用于包括但不限于还原、活化目的的另一个物品以及用于递送、给药、诊断和评价生物学活性或性质的仪器/设备的组合。
如本文所用，细胞提取物或裂解物指由裂解或破裂的细胞制成的制品或组分。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类，包括人、大猩猩和猴；啮齿类，如小鼠和大鼠；家禽，如鸡；反刍动物，如山羊、奶牛、鹿、绵羊；猪和其他动物。非人动物排除预期为人的动物。本文提供的酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数酶为动物来源，包括哺乳动物来源。
如本文所用，对照指与测试样品基本上相同的样品，除了其不用测试参数处理，或者如果其为血浆样品，则其可以来自不受所关注的疾病状况影响的正常志愿者。对照还可以为内参。
如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。因此，例如提到的包含“胞外结构域”的化合物包括具有一个或多个胞外结构域的化合物。
如本文所用，范围或量可以表达为“约”特定值或范围。约还包括确切的量。因此“约5个碱基”表示“约5个碱基”，并且还表示“5个碱基”。
如本文所用，“任选”或“任选地”表示随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或条件发生的情况和不发生的情况。例如，任选取代的基团表示该基团未取代或被取代。
如本文所用，除非另有说明，任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写与其常见用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(参见(1972)Biochem.11：1726)一致。
B.综述
透明质酸酶为催化透明质酸水解的酶，从而降低透明质酸的粘度并且增加组织通透性。PH20为在中性条件下是有活性的和在酸性条件下是有活性的透明质酸酶，当糖基化时表现出最佳活性。人PH20为GPI锚定蛋白，其通过附着至蛋白C端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚来锚定至质膜的外片。将GPI锚添加至所有GPI锚定蛋白发生在称为ω-位点的特定氨基酸位置(通常位于距C端约20-30个氨基酸)处的切割和在ER中去除C端部分之后。该C端部分为GPI-锚附着信号序列。人PH20的GPI-锚附着信号序列位于SEQID NO：107所示的前体多肽的氨基酸位置491-509，并且ω-位点为氨基酸位置490。GPI-锚定的诸如人PH20的PH20多肽是膜结合的，并且因此是不溶的。PH20的不溶形式通常不适合治疗目的。
缺少GPI锚的PH20多肽通常通过细胞表达分泌，因为它们不含有将多肽锁定至膜的GPI-附着信号序列。本文发现PH20的可溶形式还包括含有GPI-锚附着信号序列内的残基的PH20。延长的可溶性PH20(esPH20)多肽为C端截短的可溶性PH20蛋白，但是保留了位于相应野生型PH20多肽的GPI-锚附着信号序列内的一个或多个氨基酸残基。这样的esPH20多肽是可溶的，并且可用作治疗性多肽，如用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况和/或作为铺展或分散剂以促进、增强或增加其他物质、药物或蛋白的分散和递送，从而改善共给予的物质、药物或蛋白的药物动力学和药效学谱(profile)。
1.PH20
PH20为透明质酸酶，也称为精子表面蛋白、精子粘附分子1、SPAM1或HYAL3。透明质酸酶是降解透明质酸(也称为乙酰透明质酸或透明质酸盐或HA)的酶家族，透明质酸是胞外基质的重要组分和间质屏障的主要成分。通过催化透明质酸的水解，透明质酸酶降低透明质酸的粘度，从而增加组织通透性。因此，透明质酸酶已用作例如铺展或分散剂来联合其他物质、药物和蛋白以增强它们的分散和递送，并且改善共给予的物质、药物或蛋白的药物动力学和药效学谱。
像其他哺乳动物透明质酸酶，PH20为内-β-N-乙酰-氨基己糖苷酶，将透明质酸的β1→4糖苷键水解为各种寡糖长度，如四糖和己糖。PH20具有水解和转糖苷酶活性，并且可以降解透明质酸和硫酸软骨素，如C4-S和C6-S。PH20天然参与精-卵粘附，并且通过消化透明质酸来帮助精子穿透卵丘细胞层。PH20位于精子表面和溶酶体衍生的顶体，其中PH-20结合至顶体内膜。质膜PH20仅在中性pH下具有透明质酸酶活性，而顶体内膜PH20在中性和酸性pH下均具有活性。除了作为透明质酸酶，PH20看来还是HA诱导的细胞信号传导的受体和卵母细胞周围的透明带的受体。
示例性PH20蛋白包括但不限于人(SEQ ID NO：107所示的前体多肽，SEQ ID NO：108所示的成熟多肽)、牛(SEQ ID NO：111和119)、兔(SEQ IDNO：112)、绵羊(SEQ ID NO：113、118和120)、食蟹猴(SEQ ID NO：114)、豚鼠(SEQ ID NO：115)、大鼠(SEQ ID NO：116)、小鼠(SEQ ID NO：117)、黑猩猩(SEQ ID NO：197)和恒河猴(SEQ ID NO：198)PH20多肽。人PH20 mRNA转录物通常被翻译以产生509个氨基酸的前体蛋白(SEQ ID NO：107)，其在N-端含有35个氨基酸的信号序列(SEQ ID NO：107的氨基酸残基位置1-35)。因此，在转运至ER并去除信号肽后产生了具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的474个氨基酸的成熟多肽。如下文所讨论，然后在ER中切割C端肽，以促进GPI锚在与SEQ ID NO：107所示的前体多肽的位置490对应的氨基酸位置处共价结合至新形成的C端氨基酸。
人PH20为原型在中性条件下是有活性的透明质酸酶，其一般通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚锁定至质膜。如上所述，PH20还在顶体内膜上表达，其中PH20在中性和酸性pH下均具有透明质酸酶活性。证据表明与SEQ IDNO：107所示的前体多肽的氨基酸142-172对应的PH20肽1区域是中性pH下的酶活性所必需的。与SEQ ID NO：107所示的前体多肽的氨基酸277-297对应的肽3区域看来对于酸性pH下的酶活性非常重要(Cherr et al.，(2001)Matrix Biology 20：515-525)。因此，看来PH20含有两个催化位点。除了催化位点，PH20还含有乙酰透明质酸结合位点。实验证据表明该位点位于肽2区域，其对应于SEQ ID NO：107所示的前体多肽的氨基酸位置205-235。该区域在透明质酸酶中高度保守，并且与肝素结合基序类似。
a.糖基化
包括透明质酸酶在内的一些乙酰透明质酸降解酶的糖基化对其催化活性和稳定性可以是非常重要的，所述糖基化包括N-和O-联糖基化。N-联寡糖分为几个主要类型(甘露低聚糖、复杂、杂合)，所有均具有通过属于-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)的Asn残基的酰胺氮来结合的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。对于凝血蛋白C已报道了-Asn-Xaa-Cys-的额外的糖基化位点。在某些情况下，诸如透明质酸酶的乙酰透明质酸降解酶可以含有N-糖苷键和O-糖苷键。例如，PH20在氨基酸T475处具有一个O-联寡糖，并且在人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393处具有6个N-联寡糖，在SEQ ID NO：107中举例说明。氨基酸残基N82、N166和N254被复杂型聚糖占据，而氨基酸残基N368和N393被高甘露糖型聚糖占据(参见，例如下文的实施例6)。氨基酸残基N235约80％被高甘露糖型聚糖并且20％被复杂型聚糖占据。
尽管改变修饰糖蛋白的聚糖类型可以对蛋白的抗原性、结构折叠、溶解性和稳定性产生明显影响，但是并不认为大多数酶为了最佳酶活性而需要糖基化。对于一些透明质酸酶，去除N-联糖基化可以导致透明质酸酶活性的几乎完全失活。因此，对于这样的透明质酸酶，N-联聚糖的存在对于产生活性酶是必需的。PH20多肽中N-联聚糖的存在对于产生活性酶是必需的。例如，本文发现通过用内切糖苷酶PNGaseF或GlcNAc磷酸转移酶(GPT)抑制剂衣霉素处理的人PH20的完全去糖基化导致透明质酸酶活性完全丧失(参见，例如下文的实施例7-8)。相比之下，通过用内切糖苷酶EndoF1、EndoF2、EndoF3或EndoH处理的人PH20的部分去糖基化不影响人PH20的透明质酸酶活性(参见，例如下文的实施例7)。
b.GPI-锚定
人PH20为GPI-锚定蛋白。因此，PH20多肽通过附着至蛋白C端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚来锚定至质膜的外片。诸如人PH20的GPI-锚定蛋白被翻译为具有可切割的N-端信号肽，其将蛋白引导至内质网(ER)。在这些蛋白的C端是另一个信号序列，其在ER腔内指引预形成的GPI-锚添加到多肽。GPI锚的添加发生在称为ω-位点的特定氨基酸位置(通常位于距C端约20-30个氨基酸)处的C端部分切割之后。虽然看来没有鉴定ω-位点的位置的共有序列，但是GPI锚定蛋白含有C端GPI-锚附着信号序列或结构域，其通常含有8-20个氨基酸的主要疏水区域，前面为紧接ω-位点下游的8-12个氨基酸的亲水间隔区域。该亲水间隔区域经常富含带电氨基酸和脯氨酸(White et al.，(2000)J.Cell Sci.113(Pt.4)：721-727)。更详细的分析表明存在特征为少量预测的二级结构的在ω-1位置前的约11个氨基酸的区域、特征为存在小侧链残基的从ω-1至ω+2的围绕切割位点(ω-位点)的区域、在位置ω+3和ω+9之间的间隔区域以及从ω+10至C-末端的疏水尾(Pierleoni et al.，(2008)BMC Bioinformatics 9：392)。
虽然没有GPI-锚附着信号共有序列，但是已开发了可以用于鉴定多肽中的此类序列的各种计算机方法和算法(参见，例如Udenfriend et al.(1995)Methods Enzymol.250：571-582；Eisenhaber et al.，(1999)J.Biol.Chem.292：741-758；Kronegg and Buloz，(1999)，“Detection/prediction of GPI cleavagesite(GPI-anchor)in a protein(DGPI)，”129.194.185.165/dgpi/；Fankhauser etal.，(2005)Bioinformatics 21：1846-1852；Omaetxebarria et al.，(2007)Proteomics 7：1951-1960；Pierleoni et al.，(2008)BMC Bioinformatics 9：392)，包括在诸如ExPASy蛋白质组学工具站点(expasy.ch/tools/)的生物信息网站上容易获得的方法和算法。因此，本领域技术人员可以确定PH20多肽是否可能含有GPI-锚附着信号序列，并因此确定PH20多肽是否为GPI-锚定蛋白。
人PH20的GPI-锚附着信号序列位于SEQ ID NO：107所示的前体多肽的氨基酸位置491-509，并且ω-位点为氨基酸位置490。因此，在这个人PH20的模型中，在转运至ER后氨基酸491-509被切割，并且GPI锚共价结合至位置490处的丝氨酸残基。GPI-锚与人PH20的C端的共价结合以及由此的PH20的膜结合性质已经利用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)水解研究来证实(参见，例如Lin et al.，(1994)J.Biol.Chem.125：1157-1163和下文的实施例3)。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)和D(PI-PLD)水解GPI锚，将PH20多肽从细胞膜释放。因此，所得的释放的PH20多肽是可溶的。可溶性PH20可以利用本领域众所周知的方法来检测和与不溶性膜结合PH20区分，这些方法包括但不限于利用下文所述和实施例4中所述的Triton
Figure BPA00001417846500321
 X-114测定。在该测定中，可溶性PH20透明质酸酶分配入加热至37℃的Triton
Figure BPA00001417846500322
 X-114溶液的水相(Bordier et al.，(1981)J.Biol.Chem.，256：1604-7)，而膜锚定的PH20透明质酸酶则分配入去污剂丰富的相。因此，除了利用算法来评价PH20多肽是否为天然GPI-锚定的，还可以进行溶解性实验。
C.延长的可溶性PH20多肽
本文提供了延长的可溶性PH20(esPH20)多肽和组合物。本文提供的esPH20多肽的实例为灵长类esPH20多肽，其包括但不限于人和黑猩猩esPH20多肽。本文提供的esPH20多肽是可溶的，即在C端截短但保留至少一个或多个位于相应野生型PH20多肽的GPI-锚附着信号序列中的氨基酸残基的分泌的PH20蛋白(例如在氨基酸位置491-500处截短)。EsPH20多肽可以通过GPI-锚定的PH20多肽的修饰从任何GPI-锚定的PH20多肽产生，即通过去除部分GPI-锚附着信号序列，条件是所得的esPH20多肽是可溶的。当PH20多肽通过本领域技术人员已知的包括重组表达和多肽合成在内的任何方法产生时，溶解性或分泌入细胞培养基可以通过表达时的SDS-PAGE和蛋白印迹分析来确定，或者可选地在如下文和实施例4中所述的Triton
Figure BPA00001417846500323
 X-114测定中确定。本文提供的esPH20多肽可以用作例如治疗性多肽，如与其他物质、药物和蛋白联合的铺展或分散剂以增强它们的分散和递送，并且改善共给予的物质、药物或蛋白的药物动力学和药效学谱。
本文提供的esPH20多肽含有来自GPI-锚附着信号序列的1、2、3、4、5、6、7个或更多个氨基酸残基，条件是esPH20多肽是可溶的，即如下文所述分配入Triton X-114溶液的水相。本文提供的延长的可溶性PH20多肽可以通过使任何天然GPI-锚定的PH20多肽C端截短来产生，其中所得的esPH20多肽是可溶的，并且含有来自GPI-锚附着信号序列的一个或多个氨基酸残基。本领域技术人员可以利用本领域众所周知的方法来确定PH20多肽是否为GPI-锚定的。这些方法包括但不限于利用已知的算法来预测GPI-锚附着信号序列和ω-位点的存在和定位，以及在用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或D(PI-PLD)消化之前和之后进行溶解性分析。
示例性esPH20多肽包括但不限于灵长类的esPH20多肽，例如人和黑猩猩esPH20多肽。例如，本文提供的esPH20多肽可以通过SEQ ID NO：107、108或197所示的任何成熟或前体多肽或者包括其活性片段的其等位基因或其他变异的C端截短来产生，其中所得的多肽是可溶的，并且保留了来自GPI-锚附着信号序列的一个或多个氨基酸残基。等位基因变体和其他变体为本领域技术人员已知，并且包括与SEQ ID NO：107、108和197的任一个具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多序列相同性的多肽。本文提供的esPH20多肽与野生型多肽相比可以为C端截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸，所述野生型多肽如具有SEQ ID NO：107、108和197所示序列的多肽，条件是所得的esPH20多肽是可溶的，并且保留了来自GPI-锚附着信号序列的一个或多个氨基酸残基。
本文提供的延长的可溶性PH20多肽保留透明质酸酶活性。此外，esPH20多肽为在中性条件下是有活性的，即它们在中性pH下保留透明质酸酶活性。与野生型GPI-锚定形式的PH20相比，透明质酸酶活性可以增加或减少。例如，本文提供的esPH20多肽可以表现出野生型GPI-锚定形式所表现的透明质酸酶活性的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多的透明质酸酶活性。
1.人esPH20多肽
本文提供的esPH20多肽的实例为人esPH20多肽。本文提供的人esPH20多肽是可溶的，并且含有来自GPI-锚附着信号序列的一个或多个氨基酸残基。因此，本文提供了人PH20的可溶形式，其中GPI不完全缺少GPI-锚附着信号序列。
本文提供的前体人esPH20多肽包括但不限于具有C端截短的前体人esPH20多肽以产生含有SEQ ID NO：107所示氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸491、492、493、494、495、496、497、498、499或500的多肽。当在哺乳动物细胞中表达时，35个氨基酸的N端信号序列在加工时被切割，并且蛋白的成熟形式被分泌。因此，成熟人esPH20多肽含有SEQ ID NO：107的氨基酸36至491、492、493、494、495、496、497、498、499或500。因此，本文提供的成熟人esPH20多肽包括SEQ ID NO：59-63和100-104所示的多肽，或者其等位基因或其他变体。
本文提供的人esPH20多肽可以在CHO细胞中表达，或者可选地在任何细胞中或通过本领域技术人员已知的任何方法产生，条件是它们是可溶的，并且含有至少一个来自GPI-锚附着信号序列的氨基酸。在CHO细胞中产生的可溶性人esPH20多肽为分泌入细胞培养基的可溶性人esPH20多肽。本领域技术人员应当理解，人esPH20可以是部分分泌的，即表达的多肽的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多分泌入培养基，条件是分泌的esPH20是可溶的，即如下文所述分配入Triton
Figure BPA00001417846500341
 X-114溶液的水相。本文提供的含有氨基酸1-500或36-500的人esPH20多肽为部分分泌的。此外，当在CHO细胞中表达时，含有氨基酸1至498、499或500的前体人esPH20多肽或者含有氨基酸36至498、499或500的成熟人esPH20多肽是弱表达的(参见，例如下文的实施例3)。
因此，示例性前体人esPH20多肽包括但不限于任何具有C端截短的前体人esPH20多肽以产生含有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸491、492、493、494、495、496或497的多肽。当在哺乳动物细胞中表达时，在加工时N端信号肽的切割之后，成熟人esPH20多肽含有SEQ ID NO：107的氨基酸36至491、492、493、494、495、496或497。因此，本文提供的示例性成熟人esPH20多肽包括长度为456、457、458、459、460、461或462个氨基酸的成熟人esPH20多肽，如SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示，或者其等位基因或其他变体。等位基因变体和其他变体为本领域技术人员已知，并且包括与SEQ ID NO：107或108的任一个具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多序列相同性的多肽。
本文还提供了氨基酸取代的人esPH20多肽。氨基酸取代的esPH20多肽为这样修饰的人esPH20多肽：与本文提供的诸如SEQ ID NO：60-63和102-104所示的人esPH20多肽相比它们含有氨基酸取代。因此，氨基酸取代的人esPH20多肽为具有C端截短的氨基酸取代的人esPH20多肽。在一些实例中，本文提供的氨基酸取代的人esPH20多肽与SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸1至491、492、493、494、495、496或497或者氨基酸36至491、492、493、494、495、496或497所示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。在其他实例中，氨基酸取代的人esPH20多肽与SEQ ID NO：60-63和102-104所示的氨基酸序列具有85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。
本文提供的人esPH20多肽可以表现出与PH20的野生型GPI-锚定形式相比增加或减少的透明质酸酶活性。例如，本文提供的人esPH20多肽可以表现出野生型GPI-锚定形式所表现的透明质酸酶活性的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多的透明质酸酶活性。在一些实例中，人esPH20多肽表现出与野生型GPI-锚定形式相比增加的透明质酸酶活性。人esPH20多肽的透明质酸酶活性与野生型GPI-锚定形式的透明质酸酶活性相比可以增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。
本文提供的人esPH20多肽表现出在中性条件下是有活性的透明质酸酶活性，或者在中性pH下测量时与PH20的野生型GPI-锚定形式相比增加或减少的透明质酸酶活性。例如，本文提供的人esPH20多肽可以表现出野生型GPI-锚定形式所表现的透明质酸酶活性的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多的透明质酸酶活性。在一些实例中，人esPH20多肽表现出与野生型GPI-锚定形式相比减少的在中性条件下是有活性的透明质酸酶活性。与野生型GPI-锚定形式的在中性条件下是有活性的透明质酸酶活性相比，在中性条件下是有活性的透明质酸酶活性可以减少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在其他实例中，人esPH20多肽表现出与野生型GPI-锚定形式相比增加的在中性条件下是有活性的透明质酸酶活性。与野生型GPI-锚定形式的在中性条件下是有活性的透明质酸酶活性相比，在中性条件下是有活性的透明质酸酶活性可以增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。
通常，利用蛋白表达系统来产生人esPH20多肽，所述蛋白表达系统促进正确的N-糖基化以确保多肽保持活性，因为糖基化对于这些多肽的催化活性和稳定性非常重要。用于esPH20多肽重组表达的示例性细胞包括，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44CHO或CHO-S细胞)。
2.其他物种esPH20多肽
本文提供了非人的延长的可溶性PH20多肽。本领域技术人员可以将人PH20的氨基酸序列与任何非人PH20多肽比对以鉴定与SEQ ID NO：107所示的人PH20多肽的位置491-500对应的位置，并且可以使C端截短以产生延长的可溶性PH20多肽。此外，如本文其他地方所述的算法可以用于预测GPI-锚附着信号序列的定位。C端截短的多肽的溶解性可以利用本领域众所周知的方法来评价以确定产生的C端截短的多肽是否是可溶的以及因此是否为esPH20多肽，所述方法包括下文和实施例4中所述的TritonX-114测定。
本文提供了非人灵长类物种的延长的可溶性PH20多肽。示例性非人灵长类GPI-锚定的PH20多肽包括但不限于黑猩猩PH20(SEQ ID NO：197)。因此，本文提供了黑猩猩esPH20多肽。本文提供的黑猩猩的esPH20多肽含有与上述人esPH20多肽的C端截短对应的C端截短。因此，本文提供的黑猩猩esPH20多肽含有与SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸残基1至491、492、493、494、495、496、497、498、499、500或501对应的氨基酸。
黑猩猩PH20多肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法与人PH20多肽比对。这样的方法通常最大化匹配，并且包括诸如利用手动比对和通过利用许多可用的比对程序(例如，BLASTP)的方法以及其他本领域技术人员已知的方法。图1提供了人和黑猩猩PH20的前体多肽的比对。人PH20(本文提供的人esPH20多肽与野生型人PH20多肽相比为截短的)的氨基酸残基491-500对应于黑猩猩PH20的氨基酸残基491-501。因此，本文提供了黑猩猩esPH20多肽，其含有SEQ ID NO：197所示的氨基酸序列的氨基酸残基1至491、492、493、494、495、496、497、498、499、500或501。当在哺乳动物表达系统中表达时，35个氨基酸的信号肽在加工时被切割，并且蛋白的成熟形式被分泌。因此，成熟黑猩猩esPH20多肽含有SEQ IDNO：197的氨基酸36至491、492、493、494、495、496、497、498、499、500或501。
示例性黑猩猩esPH20多肽为含有SEQ ID NO：197所示的氨基酸序列的氨基酸残基1至491、492、493、494、495、496、497或498的多肽。当在哺乳动物表达系统中表达时，35个氨基酸的信号肽在加工时被切割，并且蛋白的成熟形式被分泌。因此，成熟黑猩猩esPH20多肽含有SEQ IDNO：197的氨基酸36至491、492、493、494、495、496、497或498。
D.N-部分糖基化的PH20多肽
包括部分去糖基化的PH20多肽在内的本文提供的N-部分糖基化的透明质酸酶保留了N-糖基化的透明质酸酶的全部或部分透明质酸酶活性。示例性部分去糖基化的透明质酸酶包括来自任何物种的部分去糖基化的PH20多肽，如SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198中任一个所示的任何PH20多肽，或者其等位基因变体或其他变体。等位基因变体和其他变体为本领域技术人员已知，并且包括与SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198的任一个具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多序列相同性的多肽，或其截短形式。本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶还包括杂合、融合和嵌合的部分去糖基化的透明质酸酶，以及部分去糖基化的透明质酸酶缀合物。
本文提供的N-部分糖基化的透明质酸酶可以通过用一种或多种糖苷酶消化来产生。因此，虽然所有N-联糖基化位点(例如，人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393处的位点，在SEQ ID NO：107中举例说明)可以是糖基化的，但是糖基化程度与没有用一种或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比降低了。包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽在内的本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶多肽可以具有完全糖基化的透明质酸酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。在一实例中，1、2、3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是部分去糖基化的，从而它们不再含有高甘露糖或复杂型聚糖，而是含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分。在一些实例中，1、2或3个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166和N254的N-糖基化位点是去糖基化的，即它们不含有糖部分。在其他实例中，3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。糖基化的氨基酸残基最低限度含有一个N-乙酰葡糖胺部分。
本文还提供了N-部分糖基化的C端截短的PH20多肽。本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽缺少来自全长PH20多肽的C端的一个或多个氨基酸，全长PH20多肽如SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198所示的任一个。因此，本文提供的N-部分糖基化的C端截短的PH20多肽与全长野生型多肽相比可以在C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60个或更多个氨基酸，全长野生型多肽如具有SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198所示的序列的全长野生型多肽。在一些实例中，3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。糖基化的氨基酸残基最低限度含有一个N-乙酰葡糖胺部分。在其他实例中，1、2或3个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是未糖基化的。在其他实例中，糖基化程度可以降低，从而部分糖基化的C端截短的PH20多肽不含有高甘露糖和复杂型聚糖，相反它们含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分，只要它们保留透明质酸酶活性。因此，本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽可以具有完全糖基化的C端截短的PH20多肽的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。
本文提供的部分去糖基化的PH20多肽和C端截短的PH20多肽保留透明质酸酶活性。此外，部分去糖基化的PH20多肽和C端截短的PH20多肽在中性条件下是有活性的，即它们在中性pH下保留透明质酸酶活性。与糖基化的全长和C端截短的PH20多肽相比，透明质酸酶活性可以增加或减少。例如，本文提供的部分去糖基化的PH20多肽和C端截短的PH20多肽可以表现出糖基化的全长和C端截短的PH20多肽所表现的透明质酸酶活性的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多的透明质酸酶活性。
因此，本文提供的PH20多肽可以用作治疗性多肽，如用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况。例如，部分去糖基化的PH20多肽和C端截短的PH20多肽还可以用于联合治疗。
1.PH20多肽
本文提供的示例性N-部分糖基化的透明质酸酶包括来自任何物种的部分去糖基化的PH20多肽，如SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198中任一个所示的任何多肽，或者其等位基因变体或其他变体。等位基因变体和其他变体为本领域技术人员已知，并且包括与SEQ ID NO：NO：107-109、111-120、197和198的任一个具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多序列相同性的多肽，或者其截短形式。在一些实例中，3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。在其他实例中，1、2或3个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166和N254的N-糖基化位点是未糖基化的。在一些实例中，1、2、3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点最低限度含有一个N-乙酰葡糖胺部分。
本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶可以通过用一种或多种糖苷酶消化来产生。因此，虽然所有N-联糖基化位点(例如，人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393处的位点，在SEQ ID NO：107中举例说明)可以是糖基化的，但是糖基化程度与没有用一种或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比降低了。特别地，部分糖基化的透明质酸酶在每个N-联糖基化位点处保留了至少一个N-乙酰葡糖胺部分。部分糖基化的透明质酸酶可以在3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。在一些实例中，透明质酸酶在1、2或3个对应SEQ ID NO：107的氨基酸残基N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是去糖基化的。本文提供的部分去糖基化的PH20多肽可以具有完全糖基化的透明质酸酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。
糖苷酶或糖苷水解酶为催化糖苷键水解以产生两个较小的糖的酶。如图2所示，脊椎动物中N-聚糖的主要类型包括高甘露糖聚糖、杂合聚糖和复杂聚糖。有几种导致仅部分蛋白去糖基化的糖苷酶，包括：EndoF1，其切割高甘露糖和杂合型聚糖；EndoF2，其切割二分支的复杂型聚糖；EndoF3，其切割二分支和更多分支的复杂聚糖；以及EndoH，其切割高甘露糖和杂合型聚糖(图3)。用这些糖苷酶的一种或全部来处理诸如可溶性透明质酸酶如可溶性PH20的透明质酸酶可以导致仅部分去糖基化并因此保留透明质酸酶活性。
例如，用这些糖苷酶的一种或全部处理rHuPH20导致部分去糖基化。这些部分去糖基化的rHuPH20多肽表现出与完全糖基化的多肽相当的透明质酸酶酶促活性(参见例如实施例7)。相比之下，用切割所有N-聚糖的糖苷酶PNGaseF(参见图3)处理rHuPH20(SEQ ID NO：122)，或者用GlcNAc磷酸转移酶(GPT)抑制剂衣霉素进行处理导致所有N-聚糖的完全去糖基化，从而使PH20酶促失活(参见例如下文的实施例7-8)。
包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽在内的本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶多肽可以具有完全糖基化的透明质酸酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。通常，包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽在内的本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶表现出完全糖基化的透明质酸酶所表现的透明质酸酶活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多的透明质酸酶活性。
本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶还包括杂合、融合和嵌合的部分去糖基化的透明质酸酶，以及部分去糖基化的透明质酸酶缀合物。
2.C端截短的PH20多肽
本文提供的N-部分糖基化或部分去糖基化的PH20肽的实例为C端截短的PH20多肽。本文提供的部分糖基化的C端截短的PH20多肽缺少来自如SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198所示的全长PH20多肽的C端的一个或多个氨基酸。因此，本文提供的部分糖基化的C端截短的PH20多肽与全长野生型多肽相比可以在C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸，全长野生型多肽如具有SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198所示的序列的全长野生型多肽。在一些实例中，3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。在其他实例中，1、2或3个对应SEQID NO：107的氨基酸N82、N166和N254的N-糖基化位点是未糖基化的。
本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽可以通过用一种或多种糖苷酶消化来产生。虽然所有N-联糖基化位点(例如，人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393处的位点，在SEQ ID NO：107在举例说明)可以糖基化，但是糖基化程度与没有用一种或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比降低了。因此，本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽可以具有完全糖基化的透明质酸酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。特别地，N-部分糖基化的透明质酸酶在每个N-联糖基化位点处保留了至少一个N-乙酰葡糖胺部分。在一些实例中，1、2、3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点最低限度含有一个N-乙酰葡糖胺部分。在其他实例中，3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的，糖基化水平为在3、4、5或6个N-糖基化位点的每一个处完全糖基化的透明质酸酶的糖基化水平。在其他实例中，1、2或3个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是完全去糖基化的。在这些实例中，通常氨基酸N82、N166或N254是完全去糖基化的。
示例性N-部分糖基化的C端截短的PH20多肽来自任何物种，如SEQID NO：107-109、111-120、197和198中任一个所示的任何多肽，或者其等位基因变体或其他变体。等位基因变体或其他变体为本领域技术人员已知，并且包括与SEQ ID NO：107-120、197和198的任一个具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多序列相同性的多肽，或者其截短形式。本文提供的N-部分糖基化的C端截短的PH20多肽还包括杂合、融合和嵌合的PH20多肽，以及PH20缀合物。例如，本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽可以缀合至聚合物，如葡聚糖、聚乙二醇(聚乙二醇化(PEG))或唾液酸部分，或者其他这样的聚合物，如天然或糖聚合物。在其他实例中，N-部分糖基化的C端截短的PH20多肽连接或融合至结构域，如来自IgG免疫球蛋白的Fc结构域。
本文提供的糖基化或部分糖基化的C端截短的多肽包括与SEQ IDNO：107(前体多肽)或108(成熟多肽)所示的野生型PH20相比在C端截短2个氨基酸至高达44个氨基酸的多肽，或者其等位基因或物种变体。因此，C端截短的PH20多肽包括任何具有C端截短的PH20多肽以产生含有SEQID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506或507，或者其等位基因或物种变体的相应位置的多肽，并且2、3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。当在哺乳动物细胞中表达时，35个氨基酸的N端信号序列在加工时被切割，并且蛋白的成熟形式被分泌。因此，本文提供了成熟的C端截短的PH20多肽，其含有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸36至450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506或507，或者其等位基因或物种变体的相应位置，并且3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。
表2提供了可以糖基化或部分去糖基化的示例性C端截短的PH20多肽的非限制性实例。下文的表2提供了前体和成熟多肽的长度(氨基酸)，并且示出了C端截短的PH20蛋白的前体和成熟多肽的示例性氨基酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。表2中还包括用于比较的野生型PH20多肽。
表2.示例性C端截短的PH200多肽
Figure BPA00001417846500431
本文提供的N-糖基化和部分去糖基化的C端截短的PH20多肽包括可溶性多肽，即分配入Triton
Figure BPA00001417846500442
 X-114溶液的水相；以及不可溶性多肽，即分配入Triton
Figure BPA00001417846500443
 X-114溶液的去污剂相。本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽可以具有完全糖基化的透明质酸酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。可选地，部分去糖基化的C端截短的PH20多肽可以具有1、2或3个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166和N254的未糖基化的N-糖基化位点。为了糖基化，N-糖基化位点最低限度含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分。
在一些实例中，本文提供的N-部分糖基化的C端截短的多肽是可溶的，即不是GPI-锚定的。例如，如下文和实施例4所述，这可以利用使用PI-PLC或PI-PLD孵育后的Triton
Figure BPA00001417846500451
 X-114测定来评价。例如，当在哺乳动物表达系统中表达时，在与SEQ ID NO：107所示的PH20多肽的氨基酸残基位置490对应的氨基酸位置处或其5’处C端截短的PH20多肽通常是可溶的(参见，例如实施例3)。由于完全缺少GPI-锚附着信号序列的事实，这些多肽是可溶的。在其他实例中，当在哺乳动物表达系统中表达时，本文提供的部分糖基化的C端截短的多肽是不可溶的并且是膜结合的。例如，当在哺乳动物表达系统中表达时，在与SEQ ID NO：107所示的PH20多肽的氨基酸位置500对应的氨基酸位置处或其3’处C端截短的PH20多肽通常是不可溶的(参见，例如实施例3)。本文提供的C端截短的多肽可以是部分糖基化的，因为3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。
本文提供的可溶性部分糖基化的C端截短的PH20多肽包括截短但保留至少一个或多个位于GPI-锚附着信号的氨基酸残基的PH20多肽，以及完全缺少GPI-锚附着信号序列和ω-位点的PH20多肽。因此，这些多肽被分泌，而不是在ER中具有共价结合至蛋白C端的GPI-锚并锚定至质膜的外片。这些C端截短的可溶性PH20多肽可以是部分糖基化的，从而3、4、5或6个N-糖基化位点是糖基化的。缺少GPI-锚附着信号序列的示例性可溶性C端截短的PH20多肽来自任何物种，如SEQ ID NO：107-109、111-120、197和198中任一个所示的任何多肽，或者其等位基因变体或其他变体。这些部分糖基化的可溶性C端截短的PH20多肽具有C端截短以产生含有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸1至450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500的多肽。通过在哺乳动物中表达之后的N端信号序列的切割，成熟的部分糖基化的可溶性C端截短的PH20多肽含有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸36至450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500。在一些实例中，C端GPI-锚信号序列截短的可溶性PH20多肽是部分糖基化的，例如在3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点处含有至少一个N-乙酰葡糖胺。在其他实例中，C端GPI-锚信号序列截短的可溶性PH20多肽具有完全糖基化的透明质酸酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。
本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽为部分去糖基化的延长的可溶性PH20多肽，所述部分去糖基化的C端截短的PH20多肽保留至少一个GPI-锚附着信号序列中的氨基酸。在一些实例中，部分去糖基化的C端截短的PH20多肽在1、2或3个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166和N254的N-糖基化位点处是未糖基化的。这些部分去糖基化的延长的可溶性PH20多肽含有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的氨基酸1至491、492、493、494、495、496、497、498、499或500。当在哺乳动物细胞中表达时，35个氨基酸的N端信号序列在加工时被切割，并且蛋白的成熟形式被分泌。因此，部分去糖基化的esPH20多肽的成熟形式含有SEQ IDNO：107所示的氨基酸序列的氨基酸36至491、492、493、494、495、496、497、498、499或500。本文提供的部分糖基化的esPH20多肽的成熟的人形式包括SEQ ID NO：59-63和100-104所示的多肽，其在3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点处含有至少一个N-乙酰葡糖胺。在一些实例中，通过用内切糖苷酶处理降低了糖基化程度。因此，本文提供的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽可以具有完全糖基化的透明质酸酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平，所述部分去糖基化的C端截短的PH20多肽含有至少一个GPI-锚附着信号序列中的氨基酸。
本文还提供了不可溶的部分去糖基化的C端截短的PH20多肽，即它们附着至细胞膜并因此在表达时不分泌入培养基。不可溶的C端截短的PH20多肽可以是部分去糖基化的，只要它们保留透明质酸酶活性。示例性的不可溶的部分糖基化的成熟C端截短的PH20多肽为含有对应SEQ IDNO：107的氨基酸位置36至501、502、503、504、505、506或507的氨基酸的多肽。因此，本文提供的不可溶的部分糖基化的C端截短的PH20多肽包括长度为466、467、468、469、470、471或472个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：55-58和97-99所示的多肽，其保留完全糖基化的透明质酸酶的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的糖基化水平。在一些实例中，3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点是糖基化的。在其他实例中，1、2、3、4、5或6个对应SEQ ID NO：107的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点含有至少一个N-乙酰葡糖胺部分。
本文提供的部分糖基化的C端截短的多肽可以表现出与PH20的野生型GPI-锚定形式相比增加或减少的透明质酸酶活性。此外，部分去糖基化的C端截短的PH20多肽在中性条件下是有活性的，即它们在中性pH下保留透明质酸酶活性。例如，本文提供的C端截短的PH20多肽可以表现出野生型GPI-锚定形式所表现的透明质酸酶活性的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多的透明质酸酶活性。在一些实例中，部分糖基化的C端截短的PH20多肽表现出与野生型GPI-锚定形式相比增加的透明质酸酶活性。
本文提供的C端截短的PH20多肽还可以是N-糖基化的。本文提供的N-糖基化和N-部分糖基化的透明质酸酶还包括杂合、融合和嵌合的N-糖基化和部分去糖基化的透明质酸酶，以及N-糖基化和部分去糖基化的透明质酸酶缀合物。
3.额外修饰
本文包括的PH20多肽包括人esPH20多肽、N-糖基化和N-部分糖基化的C端截短的PH20多肽以及部分糖基化的PH20多肽，还包括含有化学或翻译后修饰的PH20多肽以及不含有化学或翻译后修饰的PH20多肽。这样的修饰包括但不限于聚乙二醇化、唾液酸化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化和其他本领域已知的多肽修饰。因此，包括esPH20多在内的本文提供的C端截短的PH20多肽可以含有在或不在多肽的一级序列中的其他修饰，包括但不限于碳水化合物部分、聚乙二醇(PEG)部分、唾液酸(silation)部分、来自免疫球蛋白G的Fc结构域或者任何其他结构域或部分的修饰。例如，这样的额外修饰可以增加蛋白的稳定性或血清半衰期。利用包括化学和重组方法在内的本领域已知的任何方法，包括esPH20多肽在内的本文提供的C端截短的PH20多肽可以缀合或融合至任何部分，条件是所得的多肽保留透明质酸酶活性。
降低的免疫原性
可以使包括人esPH20多肽在内的本文提供的PH20多肽具有降低的免疫原性。通过消除来自多肽的抗原表位的序列变化或者通过改变翻译后修饰可以产生降低的免疫原性。例如，考虑了改变肽的糖基化，只要多肽在SEQ ID NO：107的氨基酸残基N235、N368和N393处最低限度含有至少N-乙酰葡糖胺。
例如，可以这样修饰PH20多肽：其缺少岩藻糖，特别是双岩藻糖基化。特别地，本文提供的PH20多肽是未双岩藻糖基化的。这可以通过在不产生双岩藻糖基化的宿主细胞通常为昆虫宿主细胞中表达和产生PH20多肽来实现。岩藻糖是在包括哺乳动物、昆虫和植物在内的大量有机体中存在的脱氧己糖。岩藻糖基化的聚糖通过岩藻糖基转移酶来合成。参见，例如Ma et al.，Glycobiology，15(2)：158R-184R，(2006)；Nakayama et al.，J.Biol.Chem.，276：16100-16106(2001)；和Sturla et al.，Glycobiology，15(10)：924-935(2005)。在人中，岩藻糖经常作为聚糖结构的末端修饰存在，并且α1，6-连接至N-乙酰葡糖胺的岩藻糖的存在已证实为在糖蛋白加工和识别中是重要的。在昆虫中，N-聚糖核心结构表现出具有α1，6-和α1，3-键的双岩藻糖基化。具有α1，3-键的昆虫细胞核心岩藻糖基化产生了在人中具有免疫原性的碳水化合物表位(参见，例如美国专利申请第20070067855号)。例如，包括esPH20多肽在内的本文提供的PH20多肽可以在不能双岩藻糖基化多肽的宿主细胞中产生。因此，尽管双岩藻糖基化的昆虫细胞或其他细胞可以用于表达多肽，但是通常使用哺乳动物细胞，如CHO细胞。
在一些实例中，去岩藻糖基化或岩藻糖缺失的PH20多肽可以在具有修饰的糖基化途径的昆虫细胞中产生，这使用了含有真核寡糖加工基因的杆状病毒表达载体，从而创造了“哺乳动物化(mammalianized)”的昆虫细胞表达系统(参见，例如美国专利第6,461,863号)。可选地，抗原性可以通过在缺少α1，3-岩藻糖基转移酶(FT3)的昆虫细胞中表达PH20多肽来消除(参见，例如美国专利申请第20070067855号)。在其他实例中，去岩藻糖基化或岩藻糖缺失的PH20多肽可以例如在以下细胞系中产生：产生去岩藻糖基化蛋白的细胞系，其包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；U.S.Pat.Appl.No.2003/0157108；和WO 2004/056312)；和敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004))。
缀合至聚合物
在一些实例中，包括部分糖基化的PH20多肽在内的本文提供的esPH20多肽和其他C端截短的PH20多肽缀合至聚合物。可以缀合至PH20多肽的示例性聚合物包括天然和合成的均聚物，如多元醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)；以及其他杂聚物，即包含诸如羟基和氨基的一种或多种不同偶联基团的聚合物。合适的聚合分子的实例包括选自以下分子的聚合分子：聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇；PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)；PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)；支化聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(PVA)；聚羧酸酯；聚乙烯吡咯烷酮；聚-D，L-氨基酸；聚乙烯-共-马来酸酐(polyethylene-co-maleic acid anhydride)；聚苯乙烯-共-马来酸酐(polystyrene-co-maleic acid anhydride)；葡聚糖，包括羧甲基-葡聚糖；肝素；同源白蛋白；纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素；壳聚糖的水解产物；淀粉，如羟乙基-淀粉和羟丙基-淀粉；糖原；琼脂糖及其衍生物；瓜耳胶；支链淀粉；菊粉；黄原胶；鹿角菜胶；果胶；海藻酸水解产物；以及生物聚合物。
通常，聚合物为聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚环氧乙烷，如PEG，典型为mPEG；与诸如葡聚糖、支链淀粉等的多糖相比，其具有很少的能够交联的反应基。通常，聚合物为无毒的聚合分子，如(甲氧基)聚乙二醇(mPEG)，其可以利用较简单的化学共价缀合至esPH20多肽和其他C端截短的PH20多肽(例如缀合至蛋白表面的附着基团)。
适合于附着至esPH20多肽和其他C端截短的PH20多肽的聚合分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物，如甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支化PEG和聚环氧乙烷(PEO)(参见，例如Roberts et al.，Advanced Drug Delivery Review2002，54：459-476；Harris and Zalipsky(eds.)“Poly(ethylene glycol)，Chemistry and Biological Applications”ACS Symposium Series 680，1997；Mehvar et al.，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，3(1)：125-136，2000；Harris andChess(2003)Nat Rev Drug Discov.2(3)：214-21；and Tsubery，J Biol.Chem279(37)：38118-24，2004)。聚合分子的分子量通常可以为约3kDa至约60kDa。在一些实施方案中，本文提供的缀合至PH20多肽的聚合分子的分子量为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kDa。
通过共价结合(缀合)PEG或PEG衍生物(即“聚乙二醇化”)来修饰多肽的各种方法为本领域已知(参见，例如U.S.2006/0104968；U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；和U.S.2004/0235734)。用于聚乙二醇化的技术包括但不限于专门的接头和偶联化学(参见例如Harris，Adv.Drug Deliv.Rev.54：459-476，2002)、多个PEG部分附着至单个缀合位点(如通过使用支化PEG；参见例如Veronese et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180，2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见，例如Chapman et al.，Nature Biotech.17：780-783，1999)以及定点酶促聚乙二醇化(参见例如Sato，Adv.Drug Deliv.Rev.，54：487-504，2002)(还参见，例如Lu and Felix(1994)Int.J.PeptideProtein Res.43：127-138；Lu and Felix(1993)Peptide Res.6：142-6，1993；Felixet al.(1995)Int.J.Peptide Res.46：253-64；Benhar et al.(1994)J.Biol.Chem.269：13398-404；Brumeanu et al.(1995)J Immunol.154：3088-95；还参见，Caliceti et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。本领域所述的方法和技术可以产生这样的蛋白，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个结合至单个蛋白分子的PEG或PEG衍生物(参见，例如U.S.2006/0104968)。
本领域已描述了多种用于聚乙二醇化的试剂。这样的试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(hydroxysuccinimidyl，NHS)激活的PEG、琥珀酰亚胺基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚胺基α-丁酸甲酯、mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚胺酯、双同官能团PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、双同官能团PEG丙醛、双同官能团PEG丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、对硝基苯碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支化mPEG2丁醛、乙酰mPEG、mPEG哌啶酮、mPEG甲酮、mPEG“无接头”马来酰亚胺、mPEG乙烯砜、mPEG硫醇、mPEG邻吡啶硫酯、mPEG邻吡啶二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(参见，例如Monfardini et al.，Bioconjugate Chem.6：62-69，1995；Veronese et al.，J.Bioactive Compatible Polymers 12：197-207，1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,183,550；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；U.S.2005/000360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 01064951；EP 0822199；WO00176640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；和WO 0187925)。
其他修饰
本文提供的esPH20多肽和其他C端截短的PH20多肽还包括其融合和缀合物。
E.产生编码延长的可溶性PH20和其他可溶性PH20透明质酸酶及其多肽的核酸的方法
本文所示的延长的可溶性PH20多肽、C端截短的PH20透明质酸酶和部分糖基化的PH20透明质酸酶，以及编码此类多肽的核酸分子可以通过本领域关于重组蛋白表达和蛋白纯化的众所周知的方法来获得。例如，DNA可以从克隆的DNA(例如从DNA文库)获得，通过化学合成、通过cDNA克隆或通过从期望细胞纯化的基因组DNA或其片段的克隆而获得。当多肽通过重组方法产生时，可以使用本领域技术人员已知的任何方法鉴定编码期望基因的核酸。本领域可用的任何方法可以用于获得编码期望PH20酶的全长(即包含整个编码区)cDNA或基因组DNA，如来自细胞或组织来源。包括如本文提供的截短形式在内的修饰或变异可以利用标准重组DNA方法从野生型多肽改造。
利用本领域已知的用于克隆和分离核酸分子的任何可用方法可以克隆或分离多肽。这样的方法包括核酸的PCR扩增和文库的筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。
用于核酸扩增的方法可以用于分离编码期望多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链式反应(PCR)方法。可以利用本领域已知的任何方法或步骤来进行PCR。这样的方法的实例包括使用Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(Gene Amp)。含有原料的核酸可以用作起始原料，可以从其分离编码期望多肽的核酸分子。例如，DNA和mRNA制品、细胞提取物、来自适当来源(例如睾丸、前列腺、乳房)的组织提取物、液体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病个体的样品可以用于扩增方法。来源可以来自任何真核物种，其包括但不限于脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、犬和其他灵长类来源。核酸文库也可以用作起始原料的来源。引物可以设计为扩增期望多肽。例如，引物可以基于产生期望多肽的表达序列来设计。引物可以基于多肽氨基酸序列的回译来设计。如果需要，简并引物可以用于扩增。在期望序列的3’和5’端杂交至序列的寡核苷酸引物可以用作引物以通过PCR扩增来自核酸样品的序列。引物可以用于扩增整个全长PH20或其截短序列，如编码本文提供的任何可溶性PH20多肽的核酸。通过扩增产生的核酸分子可以进行测序并确认编码期望多肽。
可以将额外的核苷酸序列加入编码多肽的核酸分子，包括为了将合成基因克隆至载体的含有限制性内切核酸酶位点的接头序列，所述载体例如蛋白表达载体或为编码核心蛋白的DNA序列的扩增而设计的载体。此外，可以将指定功能的DNA原件的额外核苷酸序列可操作地连接至编码多肽的核酸分子。这样的序列的实例包括但不限于设计为促进细胞内蛋白表达的启动子序列和设计为促进蛋白分泌的分泌序列，例如异源信号序列。这样的序列为本领域技术人员已知。例如，示例性异源信号序列包括但不限于SEQ ID NO：144和145分别所示的人和小鼠κIgG异源信号序列。诸如指定蛋白结合区域的碱基序列的额外核苷酸残基序列也可以连接至编码酶的核酸分子。这样的区域包括但不限于促进或编码蛋白的残基序列，所述蛋白促进酶吸收入特定靶细胞或者另外地改变合成基因的产物的药物动力学。
此外，可以添加标签或其他部分，例如以帮助多肽的检测或亲和纯化。例如，额外的核苷酸残基序列，如指定表位标签或其他可检测标记的碱基序列也可以连接至编码酶的核酸分子。这样的序列的实例包括编码His标签(例如，6xHis，HHHHHH；SEQ ID NO：142)或Flag标签(DYKDDDDK；SEQID NO：143)的核酸序列。
鉴定和分离的核酸然后可以插入适当的克隆载体。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰的病毒，但是载体系统必须与所用的宿主细胞相容。这样的载体包括但不限于诸如λ衍生物的噬菌体，或者诸如pCMV4、pBR322或pUC质粒衍生物的质粒，或者Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。其他表达载体包括本文例示的HZ24表达载体(SEQ ID NO：140所示)。例如，插入克隆载体可以通过将DNA片段连接至具有互补粘性末端的克隆载体来完成。如果用于片段化(fragment)DNA的互补限制位点在克隆载体中不存在，则DNA分子的末端可以进行酶促修饰。可选地，通过将核苷酸序列(接头)连接至DNA末端可以产生任何期望位点；这些连接的接头可以包括编码限制性内切核酸酶识别序列的特异性化学合成寡核苷酸。在可选的方法中，切割的载体和蛋白基因可以通过同聚物加尾来修饰。利用TOPO克隆载体(INVITROGEN，Carlsbad，CA)可以产生插入。
重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和声穿孔(sonoporation)来引入宿主细胞，从而产生基因序列的许多拷贝。在具体实施方案中，用并入分离的蛋白基因的重组DNA分子、cDNA或合成DNA序列转化宿主细胞允许产生基因的多个拷贝。因此，通过使转化子生长、从转化子分离重组DNA分子以及必要时从分离的重组DNA回收插入的基因可以获得大量基因。
除了重组产生，包括本文提供的任何esPH20在内的可溶性PH20可以通过利用固相技术的直接肽合成来产生(参见，例如Stewart et al.(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc.，85：2149-2154)。体外蛋白合成可以利用手动技术或通过自动装置来进行。例如，利用Applied Biosystems 431A肽合成仪(PerkinElmer，Foster City CA)按照制造商提供的说明可以实现自动合成。利用化学方法，可以分别化学合成和组合多肽的各种片段。
1.载体和细胞
为了重组表达诸如本文所述的任何蛋白的一种或多种期望蛋白，可以将含有所有或部分编码蛋白的核苷酸序列的核酸插入适当的表达载体，即含有对插入的蛋白编码序列的转录和翻译必需的元件的载体。必需的转录和翻译信号也可以通过PH20基因和/或其侧翼区的天然启动子来提供。
本文还提供了含有编码酶的核酸的载体。还提供了含有所述载体的细胞。细胞包括真核和原核细胞，并且载体为适合在其中使用的任何载体。
本文提供了含有载体的原核和真核细胞，包括内皮细胞。这样的细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌(Archea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过使上述细胞在细胞表达编码的蛋白的条件下生长并且回收表达的蛋白来使细胞用于产生其蛋白。为了本文的目的，例如，包括延长的可溶性PH20多肽在内的可溶性PH20多肽可以分泌入培养基。
可以根据调节插入序列的表达或以期望方式加工表达的蛋白的能力来选择宿主细胞株。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化(lipidation)和酰化。翻译后加工可以影响多肽的折叠和/或功能。不同的宿主细胞，例如但不限于CHO(DG44、DXB11、CHO-K1)、HeLa、MCDK、293和WI38具有用于这样的翻译后活性的特异性细胞体系和特征性机理，并且可以进行选择以保证引入蛋白的正确修饰和加工。通常，细胞的选择是能够将N-联糖基化引入表达的多肽的选择。因此，提供了含有载体的真核细胞。真核细胞的实例为哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。例如，二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞(例如DG44细胞)用于产生本文提供的多肽。应当注意，本文提供的延长的可溶性PH20或C端截短的PH20的细菌表达不会导致催化活性多肽，但是当与适当的糖基化体系组合时，可以将PH20人工糖基化。
本文提供了载体及其多个拷贝，所述载体包含偶联至天然或异源信号序列的编码透明质酸酶多肽的核苷酸序列，所述透明质酸酶多肽包括延长的可溶性PH20多肽和其他C端截短的PH20多肽。可以选择载体以用于在细胞中表达酶蛋白或者从而酶蛋白作为分泌蛋白表达。
各种宿主-载体系统可以用于表达蛋白编码序列。这些系统包括但不限于病毒(例如痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)感染的哺乳动物细胞系统；病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，如含有酵母载体的酵母；或转化了噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA的细菌。载体的表达元件的长度和特异性可以变化。根据使用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件的任一种。
本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体的任何方法可以用于构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有适当的转录/翻译调控信号和蛋白编码序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。编码蛋白或者其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可以通过第二核酸序列来调节，从而基因或其片段在转化了重组DNA分子的宿主中表达。例如，蛋白的表达可以通过本领域已知的任何启动子/增强子控制。在具体实施方案中，启动子对于期望蛋白的基因不是天然的。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist andChambon，Nature 290：304-310(1981))，劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复序列所含的启动子(Yamamoto et al.Cell 22：787-797(1980))，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42(1982))；原核表达载体如b-内酰胺酶启动子(Jay et al.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或tac启动子(DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983))；还参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”：in Scientific American242：79-94(1980))；含有胭脂氨酸合酶启动子(Herrara-Estrella et al.，Nature303：209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner et al.，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))的植物表达载体，和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 310：115-120(1984))；诸如Gal4启动子的来自酵母和其他真菌的启动子元件，乙醇脱氢酶启动子，磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，以及以下表现出组织特异性并已用于转基因动物的动物转录调控区：在胰腺腺泡细胞中活跃的弹性蛋白酶I基因调控区(Swift et al.，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz et al.，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，Hepatology7：425-515(1987))；在胰腺β细胞中活跃的胰岛素基因调控区(Hanahan et al.，Nature 315：115-122(1985))，在淋巴样细胞中活跃的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl et al.，Cell 38：647-658(1984)；Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander et al.，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))，在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中活跃的小鼠乳癌病毒调控区(Leder et al.，Cell 45：485-495(1986))，在肝中活跃的白蛋白基因调控区(Pinckert et al.，Genes and Devel.1：268-276(1987))，在肝中活跃的甲胎蛋白基因调控区(Krumlauf et al.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer et al.，Science235：53-58 1987))，在肝中活跃的α-1抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey et al.，Genes and Devel.1：161-171(1987))，在髓样细胞中活跃的β珠蛋白基因调控区(Magram et al.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et al.，Cell 46：89-94(1986))，在脑的少突胶质细胞中活跃的髓鞘碱性蛋白基因调控区(Readheadet al.，Cell 48：703-712(1987))，在骨骼肌中活跃的肌球蛋白轻链-2基因调控区(Shani，Nature 314：283-286(1985))，以及在下丘脑的促性腺激素细胞中活跃的促性腺激素释放激素基因调控区(Mason et al.，Science 234：1372-1378(1986))。
在一具体实施方案中，所用的载体含有可操作地连接至编码PH20蛋白或者其结构域、片段、衍生物或同系物的核酸的启动子，一个或多个复制起点，以及任选存在的一个或多个选择标记(例如，抗生素抗性基因)。根据表达系统，PH20序列的有效翻译还需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在PH20或其可溶性形式的起始密码子和上游序列被插入适当的表达载体的情况下，不需要额外的翻译调控信号。在仅编码序列或其部分被插入的情况下，必须提供包含ATG起始密码子的外源转录调控信号。此外，起始密码子必须在正确的阅读框内以保证整个插入片段的转录。外源转录元件和起始密码子可以是各种来源的，天然和合成均可以。表达效率可以通过包含适合于所用的细胞系统的增强子来增强(Scharf et al.(1994)Results Probl Cell Differ 20：125-62；Bittner et al.(1987)Methods in Enzymol，153：516-544)。
用于大肠杆菌细胞转化的示例性质粒载体包括例如pQE表达载体(可从Qiagen，Valencia，CA获得；还参见Qiagen公开的描述该系统的文献)。pQE载体具有噬菌体T5启动子(被大肠杆菌RNA聚合酶识别)和双lac操纵基因阻遏组件以提供大肠杆菌中重组蛋白的紧密调控、高水平的表达，用于有效翻译的合成核糖体结合位点(RBS II)，6XHis标签编码序列，t0和T1转录终止子，ColE1复制起点，以及用于赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。pQE载体允许在重组蛋白的N-或C-端放置6xHis标签。这样的质粒包括pQE 32、pQE 30和pQE 31，其提供了用于所有三个阅读框的多克隆位点，并提供了N端6xHis-标记的蛋白的表达。其他用于大肠杆菌细胞转化的示例性质粒载体包括例如pET表达载体(参见，美国专利4,952,496；可从NOVAGEN，Madison，WI获得；还参见Novagen公开的描述该系统的文献)。这样的质粒包括pET 11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵基因和lac阻遏基因；pET 12a-c，其含有T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b(NOVAGEN，Madison，WI)，其含有在His柱纯化中使用的His-TagTM前导序列和允许用柱纯化之后切割的凝血酶切割位点、T7-lac启动区和T7终止子。
用于哺乳动物细胞表达的载体的实例为HZ24表达载体。HZ24表达载体源自pCI载体骨架(Promega)。其含有编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、F1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动区(CMV)和SV40晚期加A信号(SV40)。表达载体还具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。转染了这样的载体的细胞可以在无次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的化学成分确定的培养基中培养，然后随着甲氨蝶呤浓度的增加进一步扩增基因。这样的方法在本文的实施例13和15中描述。
2.表达
包括本文提供的esPH20多肽和C端截短的PH20多肽在内的PH20多肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，包括体内和体外方法。期望蛋白可以在适合产生蛋白所需的量和形式的任何有机体中表达，例如给药和治疗所需的量和形式。表达宿主包括原核和真核有机体，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白生产水平以及对表达蛋白的翻译后修饰的类型可以不同。表达宿主的选择可以基于这些和其他因素，如监管和安全考虑、生产成本以及纯化的需要和方法。
许多表达载体是可得的并为本领域技术人员已知，并且可以用于蛋白的表达。表达载体的选择会受到宿主表达系统的选择的影响。通常，表达载体可以包含转录启动子和任选存在的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有选择标记，其允许转化的细胞的选择和维持。在一些情况下，复制起点可以用于扩增载体的拷贝数。
包括esPH20在内的可溶性透明质酸酶多肽和其他C端截短的PH20多肽还可以作为蛋白融合来利用或表达。例如，可以产生酶融合以将额外的功能性加入酶。酶融合蛋白的实例包括但不限于信号序列融合；标签融合，如用于定位，例如his6标签或myc标签，或者用于纯化的标签，例如GST融合；用于指导蛋白分泌和/或膜关联的序列融合以及用于增加半衰期的其他序列融合，如Fc融合。
重组蛋白的长期高产率生产需要稳定表达。例如，可以用表达载体转化稳定表达诸如esPH20或其他C端截短的PH20多肽的可溶性PH20的细胞系，所述表达载体含有病毒复制起点或内源表达元件以及选择标记基因。在引入载体之后，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换至选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且它的存在允许成功表达引入序列的细胞的生长和回收。稳定转化的细胞的抗性细胞可以用适合细胞类型的组织培养技术来增殖。
任何选择系统可以用于回收转化的细胞系。这些系统包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M et al.(1977)Cell，11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy I et al.(1980)Cell，22：817-23)基因，其可以分别用于TK-细胞或APRT-细胞。此外，抗代谢物、抗生素或除草剂抗性可以用作选择的基础。例如，可以使用DHFR，其赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler M et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，77：3567-70)；npt，其赋予氨基糖苷类新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin F et al.(1981)J.Mol.Biol.，150：1-14)；以及als或pat，其分别赋予氯磺隆和草胺膦(phosphinotricin)乙酰转移酶抗性。已描述了额外的选择性基因，例如trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸(typtophan)，或者hisD，其允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman SC and RCMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci，85：8047-51)。可见标记也可以用于鉴定转化子，并且也可以用于定量归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白表达的量，所述可见标记例如但不限于花色素苷、β葡糖醛酸糖苷酶及其底物、GUS和萤光素酶及其底物萤光素(Rhodes CA et al.(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131)。
可以监测包括esPH20和其他C端截短的PH20多肽在内的可溶性PH20多肽的存在和表达。例如，功能多肽的检测可以通过在适当的条件下测试条件培养基的透明质酸酶活性来确定。以下G部分提供了评价表达蛋白的溶解性和活性的示例性测定。
a.原核细胞
原核生物，特别是大肠杆菌提供了产生大量蛋白的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员众所周知的简单而快速的技术。用于大肠杆菌的表达载体可以含有诱导型启动子，这样的启动子用于诱导高水平的蛋白表达和表达对宿主细胞表现出一些毒性的蛋白。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温控型λPL启动子。
诸如本文提供的任何蛋白的蛋白可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质为还原环境，并且对于一些分子这可以导致不可溶性包含体的形成。诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇的还原剂以及诸如胍-HCl和尿素的变性剂可以用于重溶解蛋白。可选的方法是在细菌的周质间隙中表达蛋白，细菌的周质间隙提供氧化环境以及伴侣蛋白样蛋白(chaperonin-like)和二硫键异构酶，并且可以导致可溶性蛋白的产生。通常，前导序列融合至待表达的蛋白，其将蛋白引导至周质。然后前导序列被周质中的信号肽酶去除。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酸裂合酶基因的pelB前导序列和源自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况下，周质表达允许表达蛋白渗漏至培养基。蛋白的分泌允许从培养上清快速而简单的纯化。不分泌的蛋白可以通过渗透裂解从周质获得。与细胞质表达相似，在一些情况下蛋白可以变为不可溶的，并且变性剂和还原剂可以用于促进溶解和重折叠。诱导和生长的温度也可以影响表达水平和溶解性，通常使用25℃-37℃的温度。通常，细菌产生非糖基化(aglycosylated)的蛋白。因此，如果蛋白的功能需要糖基化，则可以在从宿主细胞纯化后在体外加入糖基化。
b.酵母细胞
酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和毕赤酵母(Pichia pastoris)为众所周知的酵母表达宿主，可以用于蛋白的产生，如本文所述的任何蛋白。酵母可以用游离型复制载体转化或通过同源重组来进行稳定的染色体整合。通常，诱导型启动子用于调控基因表达。这样的启动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，如CUP1、AOX1，或者其他毕赤酵母(Pichia)或其他酵母启动子。表达载体常包含用于转化DNA的选择和维持的选择标记，如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。在酵母中表达的蛋白通常是可溶的。与诸如Bip和蛋白二硫键异构酶的伴侣蛋白的共表达可以提高表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白可以被引导分泌，利用诸如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号的分泌信号肽融合以及与诸如Aga2p交配粘着受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的酵母细胞表面蛋白融合。可以设计诸如Kex-2蛋白酶的蛋白酶切割位点以在表达多肽离开分泌途径时从表达多肽去除融合序列。酵母还能够在Asn-X-Ser/Thr基序处糖基化。
c.昆虫细胞
昆虫细胞，特别是利用杆状病毒表达有利于表达诸如透明质酸酶多肽的多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白，并且能够进行高等真核生物所用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限的宿主范围，这提高了安全性并且减少了真核表达的监管问题。典型的表达载体为了高水平表达使用启动子，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒和昆虫细胞系，杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)，昆虫细胞系如源自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippys)(DpN1)。为了高水平表达，将待表达的分子的核苷酸序列直接融合至病毒多角体蛋白起始密码子的下游。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中被准确加工并且可以用于将表达蛋白分泌入培养基。此外，细胞系美洲粘虫(A7S)和黑脉金斑蝶(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白。示例性昆虫细胞为已被改变以降低免疫原性的昆虫细胞，包括具有“哺乳动物化”的杆状病毒表达载体的昆虫细胞和缺少酶FT3的昆虫细胞。
昆虫细胞中可选的表达系统为使用稳定转化的细胞。诸如Schnieder 2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))以及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))的细胞系可以用于表达。果蝇(Drosophila)金属硫蛋白启动子可以用于在镉或铜的重金属诱导的存在下诱导高水平表达。表达载体通常通过使用诸如新霉素和潮霉素的选择标记来保持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可以用于表达包括可溶性透明质酸酶多肽在内的蛋白。表达构建体可以通过诸如腺病毒的病毒感染或通过直接DNA转移来转移至哺乳动物细胞，所述直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过诸如电穿孔和显微注射的物理方法。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包含mRNA帽位点、TATA框、翻译起始序列(Kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。还可以加入IRES元件以允许与诸如选择标记的另一基因双顺反子表达。这样的载体常包含用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列。这些启动子-增强子在许多细胞类型中活跃。组织和细胞类型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自诸如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳癌病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素基因调控的基因的启动子/增强子区。选择标记可以用于选择和保持具有表达构建体的细胞。选择标记的实例包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，表达可以在甲氨蝶呤的存在下进行以仅选择表达DHFR基因的细胞。与诸如TCR-ζ和FcεRI-γ的细胞表面信号分子融合可以引导蛋白在细胞表面以活性状态表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异种杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和HKB细胞。还可以使细胞系适应于无血清培养基，其促进从细胞培养基纯化分泌蛋白。实例包括CHO-S细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat # 11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42.)。还可以使细胞系适应于在优化最大表达的特殊培养基中生长。例如，DG44CHO细胞适应于在化学成分确定、无动物产物的培养基中悬浮培养生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可以用于表达如本文所述的任何蛋白。表达构建体通常利用诸如微粒轰击和PEG-介导的转移至原生质体的直接DNA转移以及用农杆菌-介导的转化来转移至植物。表达载体可以包含启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译调控元件。在诸如拟南芥(Arabidopsis)和烟草的双子叶植物宿主以及诸如玉米和水稻的双子叶植物宿主之间通常划分表达载体和转化技术。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及泛素和UBQ3启动子。诸如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶的选择标记常用于促进转化细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以在培养中保持为细胞、团聚体(愈伤组织)或再生为整个植物。转基因植物细胞还可以包括改造以产生透明质酸酶多肽的藻类。因为植物具有比哺乳动物细胞不同的糖基化模式，所以这可以影响这些宿主中产生的蛋白的选择。
3.纯化技术
转化了编码可溶性PH20的核酸序列的宿主细胞可以在适合表达和从细胞培养物回收编码蛋白的条件下培养，所述可溶性PH20包括esPH20和其他C端截短的PH20多肽。通过重组细胞产生的蛋白一般是分泌的，但是根据所用的序列和/或载体可以包含在细胞内。本领域技术人员应当理解，含有编码PH20的核酸的表达载体可以设计为具有促进PH20直接分泌通过原核或真核细胞膜的信号序列。
因此，从宿主细胞纯化多肽的方法取决于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌分子，蛋白一般在去除细胞后从培养基纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞并且从提取物纯化蛋白。当诸如转基因植物和动物的转基因有机体用于表达时，组织或器官可以用作起始原料以产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物产品可以包括乳汁或卵中的多肽产品，其可以被收集，并且如有必要可以利用本领域的标准方法提取和进一步纯化蛋白。
蛋白，如包括esPH20多肽或其他C端截短的PH20多肽在内的可溶性PH20多肽可以利用本领域已知的标准蛋白纯化技术来纯化，所述标准蛋白纯化技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级和大小排阻层析、硫酸铵沉淀以及诸如阴离子交换的离子交换层析。还可以利用亲和纯化技术来提高制备的效率和纯度。例如，结合PH20透明质酸酶的抗体、受体和其他分子可以用于亲和纯化。例如，可溶性PH20可以从条件培养基纯化。
表达构建体还可以改造为将诸如myc表位、GST融合或His6的亲和标签加入蛋白，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和纯化。这样的标签可以加入编码本文其他地方所述的可溶性PH20的核苷酸序列，这可以促进可溶性蛋白的纯化。例如，可溶性PH20可以表达为具有一个或多个额外的多肽结构域的重组蛋白，加入所述结构域以促进蛋白纯化。这样的纯化促进结构域包括但不限于诸如组氨酸-色氨酸模块的金属螯合肽，其允许在固定的金属上进行纯化；蛋白A结构域，其允许在固定的免疫球蛋白上进行纯化；和FLAGS延伸/亲和纯化系统所用的结构域(Immunex Corp.，Seattle Wash.)。在纯化结构域与表达的PH20多肽之间包括诸如因子XA或肠激酶(Invitrogen，San Diego，CA)的可切割的接头序列有利于促进纯化。一种这样的表达载体提供了含有可溶性PH20的融合蛋白的表达，并且含有编码6个组氨酸残基的核酸，其后为硫氧还蛋白和肠激酶切割位点。组氨酸残基促进在IMIAC(固定化金属离子亲和层析)上进行纯化，而肠激酶切割位点提供了用于从融合蛋白纯化多肽的方法。
可以通过本领域已知的任何方法来评价纯度，包括凝胶电泳、正交HPLC法、染色和分光光度技术。表达和纯化的蛋白可以利用本领域技术人员已知的任何测定或方法来分析，例如G部分所述的任何测定或方法。这些测定或方法包括基于蛋白的物理和/或功能特性的测定，包括但不限于通过凝胶电泳分析、免疫测定和透明质酸酶活性的测定。
根据所用的表达系统和宿主细胞，所得的多肽由于产生和纯化时培养基中存在的肽酶而可以是异质的。例如，CHO细胞中可溶性PH20的培养物可以导致异质多肽的混合物。用于可溶性PH20(例如rHuPH20)的产生、生产和纯化的示例性方案在以下实施例13-15中描述。相似地，例如编码具有SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列36-497的多肽的核酸的表达可以导致多肽的异质混合物，其可变地包括在497、496、495、494、493、492、491、490、489处结束或更短的多肽。
F.延长的可溶性PH20多肽和其他可溶性PH20多肽的制备、制剂和给药
本文提供了包括esPH20在内的可溶性PH20多肽的药物组合物以用于给药。可溶性PH20多肽可以单独配制，或者可以与其他治疗剂的药物制剂共配制或共给予，例如G部分所述。化合物可以配制为合适的药物剂型，如用于口服给药的溶液、混悬剂、片剂、分散片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂，以及透皮贴剂和干粉吸入器。通常，利用本领域众所周知的技术和步骤将化合物配制为药物组合物(参见，例如Ansel Introductionto Pharmaceutical Dosage Forms，Fourth Edition，1985，126)。
通常，会考虑治疗有效剂量。为了疾病或疾病状况的治疗而给予的所选可溶性PH20的量可以通过标准临床技术来确定。此外，体外测定和动物模型可以用于帮助确定最佳剂量范围。可以凭经验决定的精确剂量可以取决于特定的酶、给药途径、待治疗疾病的类型和疾病的严重性。
因此，应当理解精确剂量和治疗持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以利用已知的测试方案或者通过从体内或体外测试数据外推来凭经验确定。值得注意的是浓度和剂量值还可以随待缓解的疾病状况的严重程度而变化。还应当理解对于任何特定个体，具体剂量方案应当根据个体需要和管理或监督给予组合物的人的职业判断来随时间调整，并且本文所示的浓度范围仅为示例性并意图限制组合物和含有所述组合物的组合的范围和用途。组合物可以每小时、每日、每周、每月、每年或一次性给予。通常，选择剂量方案以限制毒性。应当注意主治医师会知道因为毒性或者骨髓、肝或肾或其他组织功能异常而怎样和何时终止、中断或调整治疗以降低剂量。相反地，主治医师还会知道如果临床应答不充分时怎样和何时调整治疗至较高水平(排除毒副作用)。
药学可接受的组合物根据管理机构或其他机构的批准来制备，按照动物和人中使用普遍认可的药典来制备。组合物可以采用溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂和缓释制剂的形式。组合物可以用传统的粘合剂和诸如甘油三酯的载体配制为栓剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和其他这样的物质。制剂应当适合给药方式。
药物组合物可以包含与可溶性PH20一起给予的载体，如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适的药物载体的实例在″Remington′s PharmaceuticalSciences″by E.W.Martin中描述。这样的组合物含有通常为纯化形式的治疗有效量的化合物以及适量的载体以便提供适合给予患者的形式。这样的药物载体可以为无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油和芝麻油。当药物组合物静脉内给予时水是典型的载体。盐水溶液及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。除活性成分以外，组合物可以含有：稀释剂，如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；以及粘合剂，如淀粉、诸如阿拉伯树胶的天然树胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和本领域技术人员已知的其他此类粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酰酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇(propylene，glycol)、水和乙醇。如果需要，组合物还可以含有少量湿润或乳化剂或者pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯和其他此类物质。
提供了用于给予人和动物的单位剂型或多剂型的药学治疗活性化合物及其衍生物的制剂。例如，化合物可以配制为片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、无菌注射液或混悬剂、和口服溶液或混悬剂、和含有适量化合物或其药学可接受衍生物的油水乳剂。每个单位剂量含有足以产生期望疗效的预定量的治疗活性化合物，并联合需要的药物载体、媒介物或稀释剂。单位剂型(dose form)的实例包括安瓿和注射器以及独立包装的片剂或胶囊。单位剂型可以其分数或倍数给予。多剂型是以分开的单剂型形式给予的包装在单个容器中的多个相同单位剂型。多剂型的实例包括片剂或胶囊的小瓶、瓶，或者品脱或加仑的瓶。因此，多剂型是包装中未分开的多个单位剂量。通常，可以制备含有0.005％-100％范围内的活性成分的剂型或组合物，剩余部分为无毒载体。
本文提供的组合物通常配制为用于通过皮下途径给药，尽管也考虑其他给药途径，如本领域技术人员已知的任何途径，包括肌肉内、腹膜内(intraperitineal)、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳、透皮给药或任何途径。适合此类途径的制剂为本领域技术人员已知。根据治疗部位可以局部、体表或全身给药。向需要治疗的区域局部给药可以通过以下方式实现，例如但不限于手术时局部输液，体表施用如在手术后联合创伤敷料，通过注射，通过导管，通过栓剂或通过植入物。组合物还可以与其他生物活性剂顺序、间歇或在相同组合物中给予。
任何特定情况下最合适的途径取决于多种因素，如疾病的性质、个体对特定给药途径的耐受性、疾病的严重程度和所用的特定组合物。通常，胃肠外给予本文提供的组合物。在一些实例中，给予可溶性PH20组合物以便它们到达皮肤或组织的间质，从而为随后治疗剂的递送降解胞间隙。因此，在一些实例中，考虑了在皮肤下直接给药，如通过皮下给药方法。因此，在一实例中，局部给药可以通过注射实现，如从注射器或其他含有诸如针头的注射装置的制成品来注射。在另一实例中，局部给药可以通过输液来实现，其可以通过使用泵或其他类似装置来促进。还可以考虑其他给药模式。药物组合物可以配制为适合每种给药途径的剂型。
给药方法可以用于减少所选可溶性PH20多肽暴露于降解过程，如蛋白水解降解和通过抗原和免疫原性应答的免疫干预。这样的方法的实例包括在治疗部位局部给药。已报道治疗剂(therapeutics)的聚乙二醇化增加对蛋白水解的抵抗力，增加血浆半衰期，并降低抗原性和免疫原性。聚乙二醇化方法的实例为本领域已知(参见，例如Lu and Felix，Int.J.Peptide ProteinRes.，43：127-138，1994；Lu and Felix，Peptide Res.，6：142-6，1993；Felix et al.，Int.J.Peptide Res.，46：253-64，1995；Benhar et al.，J.Biol.Chem.，269：13398-404，1994；Brumeanu et al.，J.Immunol.，154：3088-95，1995；还参见Caliceti et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77 and Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。聚乙二醇化还可以用于体内核酸分子的递送。例如，腺病毒的聚乙二醇化可以增加稳定性和基因转移(参见，例如Cheng et al.(2003)Pharm.Res.20(9)：1444-51)。
1.注射剂、溶液和乳剂
本文考虑一般特征为通过皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射或输液的胃肠外给药。注射剂(injectable)可以制备为液体溶液或混悬剂的常规形式，适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者乳剂。合适的赋形剂例如水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。药物组合物可以含有其他少量无毒的辅助物质如湿润或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂和其他这样的物质，例如乙酸钠、磷酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。本文还考虑了缓释和持续释放系统的植入，从而可以维持恒定水平的剂量(参见，例如美国专利第3,710,795号)。包含在此类胃肠外组合物中的活性化合物的百分比高度取决于其特定的性质以及化合物的活性和个体的需求。
注射剂设计为用于局部和全身给药。为了本文的目的，期望局部给药，直接给予至受影响的间质。用于胃肠外给药的剂型包括直接用于注射的无菌溶液、诸如冻干粉的无菌干可溶性产品、包括皮下片剂在内的在使用前与溶剂直接组合的剂型、直接用于注射的无菌混悬剂、在使用前与媒介物直接组合的无菌干不可溶性产品以及无菌乳剂。溶液可以为水性或非水性。如果静脉内给予，合适的载体包括生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
用于胃肠外剂型的药学可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化剂、多价螯合或螯合剂以及其他药学可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸盐林格氏注射液。非水性胃肠外媒介物包括植物来源的固定油、棉子油、玉米油、芝麻油和花生油。包装在多剂量容器中的胃肠外剂型中可以加入抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂，包括酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯(TWEEN 80)。金属离子的多价螯合或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水可溶混媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用于pH调整的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
调整药学活性化合物的浓度从而注射或输液提供有效量以产生期望的药理作用，如血糖控制。如本领域已知，确切剂量取决于患者或动物的年龄、体重和疾病状况。单位剂量胃肠外剂型可以包装于例如安瓿、药筒、小瓶或有针头的注射器。含有药学活性化合物的液体溶液或还原粉末剂型的体积是待治疗疾病的函数，并且选择特定制成品用于包装。如本领域已知和所实践的，所有用于胃肠外给药的剂型必须是无菌的。
在一实例中，药物剂型可以为液体形式，例如溶液、糖浆剂或混悬剂。如果以液体形式提供，药物剂型可以提供为浓缩剂型，在使用前稀释至治疗有效浓度。这样的液体剂型可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油酯或分馏植物油)；和防腐剂(例如，甲基或丙基对羟基苯甲酸酯或山梨酸)。在另一实例中，药学剂型可以为冻干形式，在使用前用水或其他合适的媒介物还原。
冻干粉
本文所关注的有冻干粉，为了给药其可以还原为溶液、乳剂或其他混合物。它们还可以还原和配制为固体或凝胶。
无菌冻干粉通过将无活性酶的化合物溶于缓冲溶液中来制备。缓冲溶液可以含有增加稳定性的赋形剂，或者粉末或从粉末制备的还原溶液的其他药理组分。随后溶液的无菌过滤及之后在本领域技术人员已知的标准条件下冷冻干燥提供了期望的制剂。简单的说，冻干粉通过将赋形剂溶于合适的缓冲液中来制备，所述赋形剂如葡萄糖(dextrose)、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的物质，所述缓冲液如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或者本领域技术人员已知的其他此类缓冲液。然后，将所选的酶加入所得的混合物，并且搅拌至其溶解。将所得混合物无菌过滤或处理以去除颗粒并保证无菌，然后分装至小瓶用于以冷冻干燥。每个小瓶含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉可以在适当的条件下存储，如约4℃至室温。这样的冻干粉用适当缓冲溶液的还原提供了用于胃肠外给药的制剂。
2.体表给药
体表混合物如局部和全身给药所述来制备。所得混合物可以为溶液、混悬剂、乳剂等，并且配制为乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、乳剂、溶液、酏剂、洗剂、混悬剂、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或任何其他适合体表给药的制剂。
化合物或其药学可接受的衍生物可以配制为气雾剂以用于诸如通过吸入的体表施用(参见，例如美国专利第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号，其描述了用于递送类固醇的气雾剂以用于治疗炎性疾病，特别是哮喘)。这些用于给药至呼吸道的制剂可以为用于喷雾器的气雾剂或溶液形式，或者用于吹入法的超细粉末，单独或与诸如乳糖的惰性载体组合。在这样的情况下，制剂的颗粒通常直径小于50微米，或者小于10微米。
化合物可以配制为用于局部或体表施用，如用于体表施用至皮肤和粘膜，如眼中，以凝胶剂、乳膏剂和洗剂的形式；以及用于施用至眼或者用于脑池内或脊柱内施用。考虑了体表给药以用于透皮递送，以及还用于给药至眼或粘膜，或者用于吸入疗法。也可以给予单独或与其他药学可接受的赋形剂组合的活性化合物的鼻溶液
提供了适合透皮给药的制剂。它们可以任何合适的形式提供，如适于在长时间与受者的表皮保持密切接触的分离贴剂。这样的贴剂含有任选缓冲的水溶液中的活性化合物，活性化合物的浓度例如0.1-0.2M。适合透皮给药的制剂还可以通过离子电渗疗法来递送(参见，例如PharmaceuticalResearch 3(6)：318(1986))，并且通常采用活性化合物的任选缓冲的水溶液的形式。
3.用于其他给药途径的组合物
根据治疗的疾病状况，本文还考虑了其他给药途径，如体表施用、透皮贴剂、口服和直肠给药。例如，为了全身效应，用于直肠给药的剂型为直肠栓剂、胶囊剂和片剂。直肠栓剂包括用于插入直肠的固体，其在体温下熔化或软化，从而释放一种或多种药理或治疗活性成分。用于直肠栓剂的药学可接受的物质为提高熔点的基质或媒介物和物质。基质的实例包括可可脂(可可油)、甘油-明胶、聚乙二醇(carbowax)(聚乙二醇)以及脂肪酸的单、二和三甘油酯的适当混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的物质包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过成型来制备。直肠栓剂的典型重量为约2-3gm。利用与口服制剂相同的药学可接受的物质和通过相同的方法制造用于直肠给药的片剂和胶囊剂。
适合直肠给药的制剂可以提供为单位计量栓剂。这些单位计量栓剂可以通过将活性化合物与诸如可可脂的一种或多种常规固体载体混合，然后将所得混合物成形来制备。
对于口服给药，药物组合物可以采用例如片剂或胶囊剂的形式，其通过常规方法与药学可接受的赋形剂一起制备，所述赋形剂如结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)；或者湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法来包衣。
适合口腔(舌下)给药的制剂包括例如调味基质中含有活性化合物的锭剂，所述调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或者黄芪胶；以及惰性基质中含有化合物的软锭剂，所述惰性基质如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶。
药物组合物还可以通过控释制剂和/或递送装置来给予(参见，例如美国专利第3,536,809号；第3,598,123号；第3,630,200号；第3,845,770号；第3,847,770号；第3,916,899号；第4,008,719号；第4,687,610号；第4,769,027号；第5,059,595号；第5,073,543号；第5,120,548号；第5,354,566号；第5,591,767号；第5,639,476号；第5,674,533号和第5,733,566号)。
已知各种递送系统并且可以用于给予所选可溶性PH20多肽，例如但不限于脂质体封装、微粒、微胶囊、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用和编码所选可溶性PH20多肽的核酸分子的递送，如逆转录病毒递送系统。
因此，在某些实施方案中，脂质体和/或纳米颗粒也可以用于给予可溶性PH20多肽。脂质体是从分散在水性介质中并且自发形成多层同心双层小泡(也称为多层脂质体(MLV))的磷脂形成的。MLV通常直径为25nm-4μm。超声处理MLV导致单层小脂泡(SUV)的形成，其直径范围为200-500埃，并且在核心中含有水溶液。
当分散在水中时，根据脂质比水的摩尔比，磷脂可以形成不同于脂质体的多种结构。在低比例下，形成脂质体。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可以对离子和极性物质表现出低通透性，但是在高温下经历相变，这显著改变了脂质体的通透性。相变涉及这样的变化，即从称为凝胶状态的紧密堆积的有序结构变为称为流态的松散堆积的较少有序结构。这发生在特征相变温度下，并且导致对离子、糖和药物的通透性增加。
脂质体通过不同机理与细胞相互作用：内吞作用，通过网状内皮系统的吞噬细胞，如巨噬细胞和嗜中性粒细胞；吸附至细胞表面，通过非特异性的弱疏水或静电力，或者通过与细胞表面组分的特异性相互作用；与浆细胞膜融合，通过将脂质体的脂质双层插入质膜，同时将脂质体内含物释放入细胞质；以及通过将脂质体脂质转移至细胞或亚细胞膜，或者反之亦然，与脂质体内含物没有任何联系。改变脂质体制剂可以改变使用的机理，虽然多于一种的机理可以同时发挥作用。纳米囊通常可以使化合物进入稳定和可再生的方式。为了避免细胞内聚合物过多(overloading)引起的副作用，应当设计这样的超细颗粒(大小约0.1μm)，其利用能够在体内降解的聚合物。考虑将满足这些要求的生物可降解的聚烷基氰基丙烯酸酯纳米颗粒用于本文，并且这样的颗粒可以很容易制备。
4.剂量和给药
本文提供的包括esPH20在内的可溶性PH20多肽可以配制为用于单剂量或多剂量给予的药物组合物。包含了所选乙酰透明质酸降解酶，其量足以发挥治疗有用效果而对所治疗的患者没有不良副作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统中测试多肽来凭经验决定，如通过利用本文提供或本领域已知的测定(参见，例如Taliani et al.(1996)Anal.Biochem.，240：60-67；Filocamo et al.(1997)J Virology，71：1417-1427；Sudo et al.(1996)Antiviral Res.32：9-18；Buffard et al.(1995)Virology，209：52-59；Bianchi et al.(1996)Anal.Biochem.，237：239-244；Hamatake et al.(1996)Intervirology39：249-258；Steinkuhler et al.(1998)Biochem.，37：8899-8905；D’Souza et al.(1995)J Gen.Virol.，76：1729-1736；Takeshita et al.(1997)Anal.Biochem.，247：242-246；还参见，例如Shimizu et al.(1994)J.Virol.68：8406-8408；Mizutani et al.(1996)J.Virol.70：7219-7223；Mizutani et al.(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.，227：822-826；Lu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)，93：1412-1417；Hahm et al.，(1996)Virology，226：318-326；Ito et al.(1996)J.Gen.Virol.，77：1043-1054；Mizutani et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.，212：906-911；Cho et al.(1997)J.Virol.Meth.65：201-207)，然后从此外推用于人的剂量。
通常，在稳定溶液或混悬剂或者冻干形式中，可溶性PH20酶的治疗有效剂量为或约为10单位(U)-500,000单位、100单位-100,000单位、500单位-50,000单位、1000单位-10,000单位、5000单位-7500单位、5000单位-50,000单位或1,000单位-10,000单位，通常1,000-50,000单位。可以提供单位剂型的制剂，例如但不限于安瓿剂、注射器以及独立包装的片剂或胶囊剂。分散剂可以单独给予，或者与其他药理有效物质或治疗剂一起给予，总体积为0.1-100ml、1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml或1-10ml，通常10-50ml。
例如，包括esPH20在内的可溶性PH20可以皮下给予，剂量为或约为10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000单位、5,000U或更多。在一些实例中，剂量可以提供为给予的可溶性PH20的量比治疗剂的比例。例如，可以给予的可溶性PH20多肽为1透明质酸酶U/治疗剂U(1∶1)至50∶1或更多，例如为或约为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1或更多。通常，本文考虑的可溶性PH20的注射或输液体积为或约为0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9ml、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml或更多。可溶性PH20可以提供为贮存液，浓度为或约为100U/ml、150U/ml、200U/ml、300U/ml、400U/ml、500U/mL、600U/mL、800U/mL或1000U/mL；或者可以提供为更浓的形式，例如为或约为2000U/ml、3000单位/ml、4000U/ml、5000U/ml、8000U/ml、10,000U/mL或20,000U/mL，其直接使用或在使用前稀释至有效浓度。可溶性PH20可以提供为液体或冻干制剂。
5.包装、制成品和试剂盒
包括esPH20在内的可溶性PH20多肽或者编码此类多肽或其衍生物或变体的核酸的药物化合物可以包装为制成品，其含有包装材料、对治疗疾病或病症有效的药物组合物以及表明可溶性PH20或核酸分子是用于治疗所述疾病或病症的标签。所选可溶性PH20透明质酸酶或者其衍生物或变体与治疗剂的组合也可以包装在制成品中。
本文提供的制成品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员众所周知。参见，例如美国专利第5,323,907号、第5,052,558号和第5,033,252号，每个专利整体援引加入本文。药物包装材料的实例包括但不限于吸塑包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合所选制剂和给药和治疗的预期模式的任何包装材料。制成品可以包括针头或其他注射装置以促进为了局部注射目的的给药(例如表皮下给药)。考虑了本文提供的化合物和组合物的各种制剂，其包括诸如esPH20的可溶性PH20和已知治疗特定疾病或病症的治疗剂。包装的选择取决于可溶性PH20和/或治疗剂，以及这样的组合物是否会一起或分别包装。在一实例中，可溶性PH20可以包装为与治疗剂的混合物。在另一实例中，组分可以包装为分离的组合物。
所选的诸如esPH20多肽的可溶性PH20多肽、治疗剂和/或其制成品也可以提供为试剂盒。试剂盒可以包括本文所述的药物组合物和作为制成品提供的用于给药的物品。例如可溶性PH20多肽可以与用于给药的装置一起供应，如注射器、吸入器、剂量杯、滴管或涂药器。组合物可以包含在用于给药的物品中，或者可以单独提供以便后来加入。试剂盒可以任选地包括施用说明，其包括剂量、给药方案和给药模式的说明。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。例如，这样的剂盒可以包括用于测量个体中所选蛋白酶的浓度、量或活性的物品。
G.测定
包括esPH20多肽在内的本文提供的可溶性PH20多肽是可溶的，并且保留透明质酸酶酶促活性。本文提供的N-糖基化或N-部分糖基化PH20多肽保留透明质酸酶酶促活性。本文提供的PH20的活性与相应未C端截短或N-部分糖基化的PH20的活性相比为或约为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。诸如esPH20的可溶性PH20透明质酸酶多肽的活性可以利用本领域众所周知的方法来评价。这些方法包括，例如微浊度法(microturbidity assay)和利用生物素化透明质酸的微量滴定测定。活性和评价可以在条件培养基或上清或纯化的蛋白上进行。蛋白的溶解性还可以通过例如Triton
Figure BPA00001417846500741
 X-114分配测定来确定。在所有测定中，可溶性PH20的活性或溶解性可以与对照进行比较，例如缺少C端截短的全长PH20。
1.透明质酸酶活性
可溶性PH20多肽的活性可以利用本领域众所周知的方法来评价。例如，用于透明质酸酶的USP XXII测定通过测量在酶与HA在37℃下反应30min后剩余的未降解的透明质酸或乙酰透明质酸(HA)底物的量来间接测定活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United States PharmacopeiaConvention，Inc，Rockville，MD)。透明质酸酶参考标准(USP)或国家处方集(NF)标准透明质酸酶溶液可以用于测定以确定任何透明质酸酶的活性单位。
在一实例中，如实施例12中所述利用微浊度法来测量活性。这是基于当透明质酸结合血清白蛋白时不溶性沉淀物的形成。通过将透明质酸酶用透明质酸钠(透明质酸)孵育设定的时间(例如，10分钟)然后通过加入酸化的血清白蛋白来沉淀未消化的透明质酸钠以测量活性。在另一发展期后在640nm下测量所得样品的浊度。对透明质酸钠底物的透明质酸酶活性所导致的浊度减少是透明质酸酶酶促活性的度量。
在另一实例中，利用微量滴定测定来测量透明质酸酶活性，其中在用透明质酸酶孵育后测量残余的生物素化透明质酸(参见，例如Frost and Stern(1997)Anal.Biochem.251：263-269，美国专利公开第20050260186号)。在实施例4中，利用生物素化透明质酸来测定截短的人PH20透明质酸酶的透明质酸酶活性。透明质酸的葡糖醛酸残基上的自由羧基被生物素化，并且将生物素化透明质酸底物共价偶联至微量滴定板。在用透明质酸酶孵育后，利用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应来检测残余的生物素化透明质酸底物，并且比较用已知活性的透明质酸酶标准品反应后所获得的结果。因为底物共价结合至微量滴定板，所以诸如pH依赖性生物素化底物的置换的人为产物不会出现。灵敏度允许快速测量来自培养细胞和生物学样品的透明质酸酶活性，测定间变异少于10％。
测量透明质酸酶活性的其他测定也为本领域已知并且可以用于本文的方法(参见，例如Delpech et al.，(1995)Anal.Biochem.229：35-41；Takahashi etal.，(2003)Anal.Biochem.322：257-263)。
许多透明质酸酶测定基于测量生成的新还原N-乙酰基氨基(Bonner andCantey，Clin.Chim.Acta 13：746-752，1966)，或者粘度的损失(De Salegui et al.，Arch.Biochem.Biophys.121：548-554，1967)或浊度的损失(Dorfman and Ott，J.Biol.Chem.172：367，1948)。用纯化的底物所有这些方法足以满足存在或不存在内葡糖胺(endoglucosamidic)活性的条件下的测定。
基本上纯化的糖胺聚糖底物也可以用于凝胶移位测定。将糖胺聚糖与诸如可溶性PH20的重组PH20混合以测试导致凝胶内底物迁移率转变的内切糖苷酶活性。这样的底物的实例包括但不限于4-和6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素，其可以从Sigma Chemical获得。人脐带乙酰透明质酸可以从ICN获得。例如，每种测试底物可以在pH为3.5-7.5的缓冲液中稀释为或约为0.1mg/ml。在这样的示例性测定中，可以将为或约为10μl纯化的可溶性PH20或来自表达PH20的细胞的条件培养基的样品与为或约为90μl测试底物在期望缓冲液中混合，并在37℃下孵育3小时。孵育后，用样品缓冲液(Tris EDTA pH 8.0、溴酚蓝和甘油)中和样品，然后进行电泳。可以利用本领域已知的任何方法检测糖胺聚糖，例如，可以通过用3％冰醋酸中的0.5％爱茜蓝将凝胶染色过夜，然后在7％冰醋酸中脱色来检测糖胺聚糖。通过比较在酶的存在和不存在时底物迁移率来测定降解。
透明质酸酶活性还可以通过底物凝胶酶谱法(substrate gel zymography)来检测(Guentenhoner et al.，1992，Matrix 388-396)。在该测定中，将样品应用于含有透明质酸的SDS-PAGE凝胶，并且样品中的蛋白通过电泳分离。然后将凝胶在酶测定缓冲液中孵育，随后染色以检测凝胶中的透明质酸。底物凝胶中的透明区域可视为透明质酸酶活性。
也可以评价可溶性PH20多肽作为铺展或扩散剂的能力。例如，可以将台盼蓝染料与或不与可溶性PH20皮下注射至裸鼠每一侧的外侧皮肤。然后测量染料区域，如用测微计，以测定乙酰透明质酸降解酶作为铺展剂的能力(美国专利第20060104968号)。透明质酸酶与诸如治疗剂的另一物质的共给药对该物质的药物动力学和药效学特性的影响以可以利用动物模型和/或人个体体内评价，如在临床试验的环境中。
诸如esPH20的可溶性PH20的功能活性可以利用任何这些测定与参考标准比较和/或标准化为参考标准。这可以确定可溶性PH20的功能上等同量。例如，可溶性PH20作为铺展或扩散剂的能力可以通过将其与台盼蓝注射至小鼠的外侧皮肤来评价，并且可以确定实现例如100单位透明质酸酶参考标准的相同扩散量所需要的量。因此，需要的可溶性PH20的量功能上等同于100透明质酸酶单位。
2.溶解性
透明质酸酶的溶解性可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测定。用于测定溶解性的一种方法是去污剂分配。例如，可溶性PH20多肽可以通过例如其在37℃下分配入Triton
Figure BPA00001417846500771
 X-114溶液的水相来区分(Bordieret al.，(1981)J.Biol.Chem.，256：1604-1607)。例如，本文所述的PH20多肽的溶解性如实施例4所述来评价。膜锚定透明质酸酶，如脂质锚定透明质酸酶，包括GPI-锚定透明质酸酶会分配入去污剂丰富相，但是在用磷脂酶C处理后会分配入去污剂贫乏或水相。磷脂酶C是切割在GPI-锚定蛋白中发现的磷酸甘油键的酶。用PLC处理会引起GPI-连接的蛋白从外细胞膜释放。
用于评价溶解性的另一种方法是测定PH20多肽是否为GPI-锚定的。GPI-锚定的PH20多肽结合至细胞膜并因此是不可溶的。为了确定PH20多肽是否为GPI-锚定的，可以在PLC/PLD水解之前和之后评价溶解性，并且还可以用预测算法来鉴定GPI-锚附着信号序列。GPI-锚定蛋白可以通过它们在特异性酶促或化学切割后的溶解来鉴定，并且联合去污剂分配(例如，在Triton X-114中)、抗体识别和代谢放射性标记。
用于证实蛋白具有GPI锚的常用方法是通过用细菌PI-PLC或锥虫来源的GPI-特异性磷脂酶C(GPI-PLC)处理的蛋白从细胞表面释放或溶解。这些酶切割膜中的甘油二酯并在蛋白上产生免疫反应性聚糖表位(CRD)，其可以通过蛋白印迹用抗锥虫GPI的抗体来检测。该方法的一个常见问题，特别是在哺乳动物细胞中遇到的问题是脂肪酶不能切割肌醇被酰化的GPI锚。这些需要用弱碱预处理以去除肌醇环上的脂肪酸。可选地，血清来源的GPI-特异性磷脂酶D可以用于切割GPI锚。该酶在肌醇环和磷脂酸部分之间切割，并且不受肌醇酰化抑制。氢氟酸在肌醇环和磷脂酸之间切割GPI锚，并且还切割任何磷酸乙醇胺和甘露糖残基(mannosyl residue)之间的磷酸二酯键。稀硝酸特别地用于GPI锚的研究，因为其在非乙酰化葡糖胺和肌醇环之间特异性切割，释放蛋白结合聚糖(现在含有诊断性脱水甘露糖(anhydromannose)部分)和磷脂酰肌醇。结合CRD抗体，组成分析，放射性标记肌醇(myo-inositol)、乙醇胺、葡糖胺、甘露糖或脂肪酸以及层析或去污剂分配方法，这些降解方法代表了研究蛋白上的GPI锚的一组有力的工具。
已开发了可以用于鉴定多肽中GPI-锚附着信号共有序列的各种计算机方法和算法(参见，例如Udenfriend et al.(1995)Methods Enzymol.250：571-582；Eisenhaber et al.，(1999)J.Biol.Chem.292：741-758，Kroneggand Buloz，(1999)；″Detection/prediction of GPI cleavage site(GPI-anchor)in aprotein(DGPI)″，129.194.185.165/dgpi/；Fankhauser et al.，(2005)Bioinformatics 21：1846-1852；Omaetxebarria et al.，(2007)Proteomics7：1951-1960；Pierleoni et al.，(2008)BMC Bioinformatics 9：392)；包括在诸如ExPASy蛋白质组学工具站点(expasy.ch/tools/)的生物信息网站上容易获得的方法和算法。因此，本领域技术人员可以确定PH20多肽是否含有GPI-锚附着信号序列，并因此确定PH20多肽是否为GPI-锚定蛋白。
H.延长的可溶性PH20和其他可溶性PH20的治疗方法和用途及联合治疗
已制备了各种形式的PH20透明质酸酶，并批准了人的治疗用途。例如，动物来源的透明质酸酶制品包括纯化的绵羊睾丸透明质酸酶Vitrase
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(ISTA Pharmaceuticals)和牛睾丸透明质酸酶Amphadase
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(AmphastarPharmaceuticals)。Hylenex
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(Halozyme Therapeutics)是含有编码可溶性rHuPH20的核酸的基因工程中国仓鼠卵巢(CHO)细胞所产生的人重组透明质酸酶。批准的透明质酸酶的治疗用途包括用作皮下输液(皮下流体给药)的佐剂以增加其他治疗剂的吸收和分散，以及用作皮下尿路造影的助剂以提高X射线造影剂的吸收。除了这些适应症之外，透明质酸酶可以用作治疗或美容剂以用于其他疾病和疾病状况的治疗。
透明质酸酶还已经用于增强化疗药物的活性和/或肿瘤对化疗药物的可接近性(Schuller et al.，1991，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.32：173，abstractno.1034；Czejka et al.，1990，Pharmazie 45：H.9)。化疗与透明质酸酶的组合在各种癌症的治疗中是有效的，包括膀胱癌(Horn et al.，1985，J.Surg.Oncol.28：304-307)、鳞状细胞癌(Kohno et al.，94，J.Cancer Res.Oncol.120：293-297)、乳腺癌(Beckenlehner et al.，1992，J.Cancer Res.Oncol.118：591-596)和胃肠癌(Scheithauer et al.，1988，Anticancer Res.8：391-396)。透明质酸酶在脑癌(神经胶质瘤)的治疗中是唯一有效的治疗剂(PCT公开申请WO88/02261，1988年4月7日公开)。透明质酸酶的给药还诱导了先前抗化疗的胰、胃、结肠、卵巢和乳腺肿瘤的应答(Baumgartner et al.，1988，Reg.Cancer Treat.1：55-58；Zanker et al.，1986，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27：390)。不幸的是，污染物和这些透明质酸酶的非人性质导致了过敏反应。
除了其间接的抗癌效果，透明质酸酶还具有直接的抗癌效果。透明质酸酶阻止移植入小鼠的肿瘤的生长(De Maeyer et al.，1992，Int.J.Cancer51：657-660)，并且当暴露于致癌剂时抑制肿瘤的形成(Pawlowski et al.，1979，Int.J.Cancer 23：105-109；Haberman et al.，1981，Proceedings of the 17thAnnual Meeting of the American Society of Clinical Oncology，Washington，D.C.，22：105，abstract no.415)。
特别地，PH20透明质酸酶可以用于治疗与高组织液压力有关的乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况，如椎间盘压力、诸如癌症和良性前列腺增生的增殖性病症以及水肿。水肿可以源自或表现为例如器官移植、中风或脑外伤。增殖性病症包括但不限于癌症、平滑肌细胞增殖、系统性硬化症、肝硬化、成人呼吸窘迫综合征、特发性心肌炎、红斑狼疮、诸如糖尿病视网膜病或其他视网膜病的视网膜病、心脏肥大、诸如良性前列腺增生(BPH)和卵巢囊肿的生殖系统相关病症、肺纤维化、子宫内膜异位、纤维瘤病、错构瘤(harmatomas)、淋巴管瘤病、结节病、带形纤维瘤。癌症包括实体和淋巴/血液肿瘤和转移性疾病，以及未分化的肿瘤。与相同组织类型的非癌组织相比或与相同肿瘤类型的非转移瘤相比，易于治疗的肿瘤通常表现出乙酰透明质酸的细胞和/或基质表达。癌症包括卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、其他胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌，、脑癌和结肠癌的任一种或多种。
因此，PH20透明质酸酶具有包括和除了作为铺展剂的用途之外的多种用途。例如，透明质酸酶在眼科手术前的局部麻醉中常用于眼周阻滞。酶的存在防止了对额外阻滞的需要，并且加快了运动不能(丧失眼球运动)开始的时间。眼周和眼球囊下(sub-Tenon′s)阻滞是透明质酸酶用于眼科操作的最常见应用。透明质酸酶还可以在诸如眼睑成形术和拉皮的美容手术中促进运动不能。应当理解，包括esPH20透明质酸酶在内的本文提供的可溶性PH20透明质酸酶可以用于治疗或使用PH20透明质酸酶的联合治疗的任何方法(参见，例如美国公开第US20040268425号；第US20050260186号；第US20060104968号；和美国申请系列号12/381,844、12/386,249、12/387,225和12/386,222，这些公开和申请整体援引加入本文)。透明质酸酶的示例性治疗和美容用途如下所述。
1.用作铺展剂和联合治疗
如上所述，透明质酸酶为铺展或扩散物质，其通过透明质酸的水解来改变结缔组织的通透性，透明质酸是在结缔组织的细胞间基质以及诸如脐带和玻璃体液的某些特化组织中发现的多糖。当没有扩散因子存在时，皮下注射的诸如药物、蛋白、肽和核酸的物质扩散非常缓慢。然而，与透明质酸酶的共注射可以导致快速扩散。扩散速率与酶量成比例，并且扩散程度与溶液体积成比例。
PH20包括可溶性PH20如本文提供的esPH20可以用于在体内促进或增强递送物质或分子至各种哺乳动物组织的任一种。其可以用于促进小分子药理物质和较大分子药理物质的扩散，并且因此促进所述药理物质的递送，所述药理物质如蛋白、核酸和核糖核酸以及可以含有组分的组合的大分子组合物，所述组分包括但不限于核酸、蛋白、碳水化合物、脂质、基于脂质的分子和药物(参见，例如美国公开第US20040268425号；第US20050260186号和第US20060104968号)。PH20包括可溶性PH20如esPH20可以与治疗剂共给药和/或共配制以改善共配制或共给予的物质的生物利用度以及药物动力学(PK)和/或药效学(PD)特征。可以通过利用诸如esPH20的可溶性PH20改善的PK/PD参数包括这样的测量：Cmax(在例如血流中吸收之后达到的物质最大浓度)、Tmax(达到最大浓度所需的时间)、T1/2(浓度下降一半所需的时间)、Cmin(代谢和排泄之后物质的最低浓度)、AUC(浓度时间曲线下面积，生物利用度总量的测量)、在各种所关注的组织中的浓度(包括，例如达到期望浓度的速率、总水平和保持期望水平的持续时间)和Emax(达到的最大效果)。
本文提供的治疗方法包括与治疗剂的联合治疗以用于治疗该治疗剂所针对的疾病或病症。改善和或以其他方式减轻疾病或疾病状况的严重程度的任何治疗剂可以与本文提供的可溶性PH20组合以增加该治疗剂的生物利用度。特别地，诸如esPH20的本文提供的可溶性PH20多肽可以代替公开的透明质酸酶或透明质酸酶降解酶以用于以下申请中所述的每个和所有组合，参见，例如美国公开第US20040268425号；第US20050260186号；第US20060104968号和美国申请系列号12/381,844、12/386,249、12/387,225和12/386,222。
本文提供的可溶性PH20多肽，特别是esPH20多肽可以在治疗剂制品之前、之后、间歇或同时给予。通常，可溶性PH20在给予治疗剂制品之前给予或与治疗剂制品同时给予以允许可溶性PH20降解胞间隙中的透明质酸。可溶性PH20可以在与给予治疗分子的位点不同的位点给予，或者可溶性PH20可以在与给予治疗分子的位点相同的位点给予。
可以与透明质酸酶一起给予的药剂、治疗剂和美容剂及分子的实例包括但不限于化疗或抗癌剂、镇痛剂、抗生素剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀变形虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀细菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕剂、美容或美学剂、减充血剂、利尿剂、抑制剂、诊断剂、电解质剂、催眠剂、激素剂、升血糖剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼科剂、拟副交感神经剂、心力加强剂、镇静剂、睡眠诱导剂、拟交感神经剂、安定剂、泌尿剂、阴道剂、杀病毒剂、维生素剂、非类固醇抗炎剂或血管紧张素转化酶抑制剂及其任何组合。特别地，治疗剂包括抗体，其包括单克隆抗体；二膦酸盐；胰岛素和免疫球蛋白。
例如，示例性抗生素剂包括但不限于氨基糖苷类；酰胺醇类(Amphenicols)；安莎霉素；碳头孢烯类(Carbacephems)；卡巴培南；头孢菌素或头孢烯；头孢霉素；棒烷；环脂肽；二氨基嘧啶；酮内酯类；林可酰胺类抗生素；大环内酯；单环内酰胺；硝基呋喃类；氧头孢烯类；噁唑烷酮(Oxazolidinone)；青霉烯类、噻烯霉素和各种β-内酰胺；青霉素；多肽类抗生素；喹诺酮类；磺胺类药；砜；四环素和其他抗生素(如氯福克酚、夫西地酸、海克西定、乌洛托品、呋喃妥因、硝羟喹啉、利替培南、牛磺罗定、希波酚(Xibomol))。
示例性治疗剂还包括血液调节剂，如抗血友病因子、抗抑制剂凝血复合物、抗凝血酶III、凝血因子Vh、凝血因子VIII、凝血因子IX、血浆蛋白组分、血管假性血友病因子；抗血小板剂(包括，例如阿昔单抗、阿那格雷、西洛他唑、硫酸氢氯吡格雷(clopidogrel bisulfate)、双嘧达莫、依前列醇、依替巴肽、替罗非班；集落刺激因子(CSF)(包括，例如粒细胞CSF和粒细胞巨噬细胞CSF)；红细胞生成刺激物(包括，例如红细胞生成素，如达贝泊汀α)和阿法依泊汀；止血药和白蛋白(包括，例如抑肽酶、抗血友病因子和血浆的组合、醋酸去氨加压素和白蛋白)；免疫球蛋白和乙型肝炎免疫球蛋白；凝血酶抑制剂(包括例如直接凝血酶抑制剂和来匹卢定)和屈曲克凝(drotecogin)α；抗凝药(包括，例如达肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaperin)和其他肝素以及华法林)。
可以通过共给予和/或共配制与诸如esPH20的可溶性PH20组合的其他示例性治疗剂包括但不限于阿达木单抗、β-阿加西酶、阿来西普、氨苄西林、阿那白滞素、抗脊髓灰质炎疫苗(Antipoliomyelitic Vaccine)、抗胸腺细胞(Anti-Thymocyte)、阿奇霉素、贝卡普勒明、卡泊芬净、头孢唑林、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、西妥昔单抗、西司他丁、克拉维酸、克林霉素、达贝泊汀α、达克珠单抗(Deaclizumab)、白喉、白喉抗毒素、白喉类毒素、依法珠单抗、肾上腺素、红细胞生成素α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促滤泡素α、促滤泡素β、磷苯妥英(Fosphenyloin)、钆双胺、钆喷葡胺(Gadopentetate)、加替沙星、格拉默、GM-CSF、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司琼、B型流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza B)、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、替伊莫单抗、替伊莫单抗免疫球蛋白(Ibritumomabs，Tiuxetans，Immunoglobulins)、流感嗜血杆菌疫苗、流感疫苗、英利昔单抗、胰岛素、甘精胰岛素、干扰素、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-1、干扰素α-n3、干扰素β、干扰素β-1a、干扰素γ、复合干扰素α(Interferon alpha-consensus)、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉罗尼酶、左氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、劳拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹-流行性腮腺炎-风疹病毒疫苗(Measles-Mumps-Rubella Virus Vaccine)、风疹疫苗、甲羟孕酮、美罗培南、甲泼尼龙、咪达唑仑、吗啡、奥曲肽、奥马珠单抗、昂丹司琼、帕利珠单抗、泮托拉唑、培门冬酶、培非司亭、聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、培维索孟、百日咳菌苗、哌拉西林、肺炎球菌菌苗和肺炎球菌结合疫苗、异丙嗪、瑞替普酶、生长激素、舒巴坦、舒马曲坦、三唑巴坦、替奈普酶、精制破伤风类毒素(Tetanus Purified Toxoid)、替卡西林、托西莫单抗、曲安西龙、曲安奈德、己曲安奈德、万古霉素、水痘带状疱疹病毒免疫球蛋白、水痘疫苗、其他疫苗、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、砷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、活卡介苗、贝沙罗汀、博来霉素、白消安、静脉剂型白消安(Busulfan intravenous)、口服白消安、卡鲁睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀与聚苯丙生、塞来考昔、苯丁酸氮芥、施铂锭、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素脂质体、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素-毒素连接物、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、丙酸屈他雄酮、Elliott′s B Solution、表柔比星、阿法依泊汀、雌莫司汀、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16、依西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉妥珠单抗、奥佐米星、吉妥珠单抗奥佐米星、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、伊立替康、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNU、氮芥、氮芥、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、L-PAM、巯嘌呤、6-巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、苯丙酸南诺龙、诺莫单抗、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培加酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、光神霉素、卟吩姆、卟吩姆钠、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链佐星、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、三乙烯硫代磷酸胺(塞替派)、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维A酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、唑来膦酸、阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、维甲酸、阿利维A酸、9-顺式维生素A酸、阿伏西地、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那昔酮、安西他滨、安曲霉素、阿帕奇醌、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴诺蒽醌、巴他布林、巴马司他、贝那昔滨、莱达莫司汀、莱佐替派、比卡鲁胺、比他舍平、比立考达、比生群、甲磺酸双奈法德、比折来新、硼替佐米、布喹那、溴匹立明、布度钛、放线菌素C、卡纳替尼、卡醋胺、卡贝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、西马多丁、苯甲酸氮芥(Chiorambucil)、塞奥罗奈、西罗霉素、克兰氟脲、氯法拉滨、克立那托、地西他滨、右尼古地平、右奥马铂、地扎呱宁、地吖醌、二溴螺氯铵、地诺孕素、地那林、地舍莫来、多非喹达、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、达佐霉素、依考莫司汀、依达曲沙、艾特咔林、依氟鸟氨酸(Eflomithine)、依拉克达、依利奈法德、依沙芦星、乙嘧替氟、恩洛铂、恩普氨酯、恩扎啕林、依匹哌啶、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依托格鲁、氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟甲睾酮、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他滨、吉罗酚、吉马替康、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷酰胺、伊莫福新、伊洛马司他、伊美克、英丙舒凡、吲地磺胺、英丙醌、白介素、白介素-2、重组白介素、茚托利辛、碘苄胍(lobenguane)、异丙铂、伊索拉定、伊沙匹隆、酮曲沙、L-阿拉诺新、兰瑞肽、拉帕替尼、来多蒽琼、亮丙立德、亮丙瑞林、来沙骨化醇、利阿唑、洛铂、洛美曲索、氯那法尼、洛索蒽醌、勒托替康、马磷酰胺、甘露舒凡、马立马司他、马索罗酚、美登素、氮芥(Mechiorethamine)、美仑孕酮、美法仑(Meiphalan)、美诺立尔、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯氨啶、美妥替哌、米铂、米泼昔芬、米索硝唑、米丁度胺、米托卡星、丝裂红素、米托拉酮、米托洁林、米托胍腙、米托马星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立宾、莫法罗汀、莫哌达醇、莫立替尼、麦考酚酸、奈达铂、奈拉滨(Neizarabine)、奈莫柔比星、尼曲吖啶、诺考达唑、诺拉霉素、诺拉曲塞、诺托生琼、奥马铂、奥他赛、奥替拉西、奥昔舒仑、氧芬胂、帕土匹龙、培得星、培利霉素、吡利曲索、培美曲塞、奈莫司汀、培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、吡铂、吡萘非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡罗蒽醌、匹蒽醌、普来曲塞、普洛美坦、紫菜霉素、泼尼莫司汀、普罗帕脒、丙螺氯铵、嘌嘧替派、嘌呤霉素、吡唑呋林、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、罗谷亚胺、罗喹美克、链黑霉素、沙柔比星、沙芬戈、沙铂、司铂、司莫司汀、辛曲秦、西佐喃、索布佐生、索拉非尼、磷乙酰天冬氨酸、膦门冬酸、司帕霉素、锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、角鲨胺、链黑霉素、链伐立星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、他地那兰、他利霉素、他莫司汀、他立喹达、牛磺莫司汀、替可加兰、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替罗昔隆、硫咪嘌呤、硫米嘌呤、噻唑呋林、噻氯咪索、替洛隆、汀考达、噻莫西酸、替拉扎明、托匹生琼、曲贝替定、海鞘素743、曲托龙、曲西立滨、曲洛司坦、三甲曲沙、四硝酸三铂、曲普瑞林、曲磷胺(Trofosfarnide)、妥布氯唑、乌苯美司、乌瑞替派、伐司朴达(Vaispodar)、伐普肽、维替泊芬、长春碱(Vinbiastine)、长春地辛、长春匹定、长春氟宁、长春米特、长春甘酯、长春西醇、长春罗辛、长春罗定、长春曲醇、长春利定、伏氯唑、黄链霉素A、胍甲环素、折尼铂、亚苄维C[2-H]、净司他丁、佐柔比星、佐舒喹达、乙酰唑胺、阿昔洛韦、胆影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、变应原浸出物、α1-蛋白酶抑制药、前列地尔(Aiprostadil)、阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶碱、阿米替林、异戊巴比妥、氨力农、镇痛药、抗脊髓灰质炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破伤风免疫球蛋白、破伤风疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精氨酸、维生素C、阿替洛尔、阿曲库铵(Atracurium)、阿托品、金硫葡糖、硫唑嘌呤、氨曲南、杆菌肽、巴氯芬、巴利昔单抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、比伐卢定、肉毒抗毒素(Botulismantitoxin)、溴苄胺、布美他尼、布比卡因、丁丙诺啡、布托啡诺、降钙素、骨化三醇、钙、卷曲霉素、卡前列素、卡尼汀、头孢孟多(Cefaniandole)、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑肟、头孢呋辛、氯霉素(Chioramphenicol)、氯普鲁卡因(Chioroprocaine)、氯喹(Chioroquine)、氯噻嗪、氯丙嗪(Chiorpromazine)、硫酸软骨素(Chondroitinsulfuric acid)、绒促性素α、铬、西多福韦、西咪替丁、环丙沙星、顺式阿曲库铵(Cisatracurium)、可乐定、可待因、秋水仙碱(Coichicine)、多粘菌素E、胶原、三氟醋酸绵羊可的瑞林(Corticorelin ovine triflutate)、促皮质素、二十四肽促皮质素、维生素B12、环胞素、半胱氨酸、达昔单抗、达福普汀、达肝素、达那肝素、丹曲林、去铁胺、去氨加压素、地塞米松、右美托咪定、右泛醇、葡聚糖、右旋糖酐铁、泛影酸、地西泮、二氮嗪、双环胺、地高辛抗体、地高辛、双氢麦角胺、地尔硫
Figure BPA00001417846500861
苯海拉明、双嘧达莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多库氯铵(Doxacurium)、多沙普仑、度骨化醇、多西环素、氟哌利多、二羟丙茶碱、依地酸、依酚氯铵(Edrophonium)、依那普利拉、麻黄碱、依前列醇、维生素D2、麦角新碱、厄他培南、红霉素、艾司洛尔、雌二醇、雌激素(Estrogenic)、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、依替膦酸、依托咪酯、因子VIII、法莫替丁、非诺多泮、芬太尼、氟马西尼、荧光素、氟奋乃静、叶酸、甲吡唑、福米韦生、磺达肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、钆特醇、钆弗塞胺、更昔洛韦、庆大霉素、胰高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆铵(Glycopyrrolate)、戈那瑞林、绒毛膜促性腺激素(Gonadotropinchorionic)、B型嗜血杆菌多糖(Haemophilus B polysaccaride)、氯化高铁血红素、草药(Herbal)、组胺、肼屈嗪、氢化可的松、氢吗啡酮、羟钴胺、羟嗪、莨菪碱、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺(lopromide)、碘拉他酸、碘克沙酸(loxaglic acid)、碘昔兰(loxilan)、异烟肼、异丙肾上腺素、流行性乙型脑炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉贝洛尔、来匹卢定、左布比卡因、左甲状腺素、林可霉素、碘塞罗宁、促黄体激素(Luteinising hormone)、莱姆病疫苗、锰福地吡、Manthtol、流行性脑膜炎多糖疫苗、麦啶、甲哌卡因、美索达嗪、间羟胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲基多巴乙酯(Methyldopate)、甲基麦角新碱、甲氧氯普胺、美托洛尔、甲硝唑、米诺环素、美维库铵(Mivacurium)、鳘肝油酸、莫西沙星、莫罗单抗-CD3、麦考酚酸酯、萘夫西林、纳布啡、纳美芬、纳洛酮、新斯的明、烟酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普盐(Nitroprusside)、去甲肾上腺素、奥芬那君、苯唑西林、羟吗啡酮、土霉素、缩宫素、泮库溴铵、泛醇、泛酸、罂粟碱、聚乙二醇化干扰素-α(例如干扰素α2a或2b)、青霉素G、喷他脒、喷他佐辛、戊巴比妥、全氟丙烷(Perfiutren)、奋乃静、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧肾上腺素、苯妥英、毒扁豆碱、维生素K1、多粘菌素b、解磷定(Pralidoxime)、丙胺卡因、普鲁卡因胺、普鲁卡因、丙氯拉嗪(Prochiorperazine)、黄体酮、普萘洛尔、羟化吡啶斯的明(Pyridostigminehydroxide)、吡哆醇、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁、瑞芬太尼、核黄素、利福平、罗哌卡因、钐、东莨菪碱、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人蛋氨生长素、大观霉素、链激酶、链霉素、琥珀酰胆碱、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他克莫司(Tacrolirnus)、特布他林、特立帕肽、睾酮、破伤风抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸盐(Tetradecyl sulfate)、茶碱、硫胺、硫乙拉嗪、硫喷妥、促甲状腺激素、亭扎肝素(Tinzaparin)、替罗非班、妥布霉素、妥拉唑林、甲苯磺丁脲、托塞米、氨甲环酸、曲前列尼、三氟拉嗪、曲美苄胺、甲氧苄啶、氨丁三醇、结核菌素、伤寒菌苗、尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸(Vaiproic acid)、加压素、维库溴铵(Vecuronium)、维拉帕米、伏立康唑、华法林、黄热病疫苗、齐多夫定、锌、盐酸齐普西酮、阿克拉霉素、放线菌素、阿霉素、偶氮丝氨酸、6-氮尿苷、嗜癌霉素、色霉素、二甲叶酸、6-重氮-5-氧-正亮氨酸、依诺他滨、Loxuridine、橄榄霉素、吡柔比星、吡曲克辛、蝶罗呤、替加氟(Tagafur)、杀结核菌素、阿替普酶、阿西莫单抗、贝伐珠单抗、A型肉毒毒素、B型肉毒毒素、卡罗单抗喷地肽、达克珠单抗、阿法链道酶、屈曲克凝α、喷替酸英西单抗(Imciromab Pentetate)和碘-131。
特别地，治疗剂包括但不限于免疫球蛋白、干扰素β、干扰素α-2a、干扰素α-1、干扰素α-n3、干扰素β-1、干扰素β-1a、干扰素γ-lb、聚乙二醇化干扰素α-2和聚乙二醇化干扰素α-2b、胰岛素、二磷酸(例如帕米膦酸或唑来膦酸)、多西他赛、多柔比星(Doxorubincin)、多柔比星脂质体和贝伐珠单抗。
2.用于去除过量的糖胺聚糖
本文提供了通过给予组合物来治疗乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况的方法，所述组合物含有可溶性PH20，通常为单独的可溶性透明质酸酶，或者与另一治疗和/或物质组合，或者除另一治疗和/或物质外额外给予。乙酰透明质酸相关疾病状况和疾病为乙酰透明质酸水平升高作为起因、结果或在疾病或疾病状况中以其他方式观察到乙酰透明质酸水平升高的疾病和疾病状况，并且可以通过单独，或者与另一治疗和/或物质组合，或者除另一治疗和/或物质外额外给予诸如可溶性PH20的透明质酸酶组合物来进行治疗。
通常，乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况与组织、细胞或体液(例如肿瘤组织或肿瘤相关组织、血液或胞间隙)中与诸如另一组织、细胞或体液的对照相比升高的乙酰透明质酸表达有关。升高的乙酰透明质酸表达可以与正常组织、细胞或体液相比提高，例如与测试样品类似的组织、细胞或体液，但是从不同个体分离，如正常个体(即不患有疾病或疾病状况，或不患有测试个体所患有的疾病或疾病状况类型)，例如不患有乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的个体。升高的乙酰透明质酸表达可以是与来自另一个体的类似组织相比升高，所述另一个体患有相似疾病或疾病状况，但其疾病没有那么严重和/或不是乙酰透明质酸相关，或者表达相对较少乙酰透明质酸因而乙酰透明质酸关联程度较低。例如，测试个体可以为患有乙酰透明质酸相关癌症的个体，其中与患有诸如早期、分化或其他类型癌症的严重程度较低的癌症的个体相比，组织、细胞或流体中的HA量相对升高。在另一实例中，细胞、组织或流体含有与对照样品相比升高水平的乙酰透明质酸，所述对照样品如具有已知量或相对量HA的流体、组织、提取物(细胞或核提取物)、核酸或肽制品、细胞系、活组织检查、标准品或其他样品，如已知表达较低水平HA的诸如肿瘤细胞系的样品，如本文所述表达低水平HA的示例性肿瘤细胞系，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCI H460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系和来自用这样的细胞系产生的肿瘤模型的肿瘤。
在一些情况下，乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况与诸如肿瘤的组织中增加的组织液压力、减少的血管容积和/或增加的含水量相关。在一实例中，用本文提供的组合物和化合物进行治疗改善了一种或多种这些症状或者与疾病或疾病状况相关的其他症状，例如，随时间提高个体的存活或生活质量，或者抑制肿瘤生长。
可以利用提供的酶、组合物和方法治疗的示例性乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况包括但不限于富含乙酰透明质酸(hyaluronan-rich)的癌症，例如肿瘤，包括实体瘤，如晚期癌症、转移癌、未分化癌、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和其他癌症。
乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况的实例还有与升高的组织液压力相关的疾病，如与椎间盘压力相关的疾病和水肿，例如器官移植、中风、脑外伤或其他损伤引起的水肿。示例性乙酰透明质酸相关疾病和疾病状况包括与组织中升高的组织液压力、减少的血管容积和/或增加的含水量相关的疾病和疾病状况，包括癌症、椎间盘压力和水肿。在一实例中，乙酰透明质酸相关疾病状况、疾病或病症的治疗包括对组织中增加的组织液压力(IFP)、减少的血管容积和增加的含水量的一种或多种的改善、减少或其他有益效果。
通常，乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况与诸如肿瘤的患病组织中增加的HA表达相关。在一实例中，在诸如患病组织的个体组织中形成了HALO(富含包括乙酰透明质酸的蛋白聚糖的细胞周基质区域)。在另一实例中，在来自诸如患病组织的个体组织的细胞的体外培养物中检测到HALO的存在。
a.在癌症治疗中的用途
透明质酸酶通过在肿瘤中降解透明质酸而具有直接的抗癌效果。因此，诸如esPH20的可溶性PH20透明质酸酶可以用于治疗肿瘤，特别是富含乙酰透明质酸的肿瘤。富含乙酰透明质酸的癌症可以为其中癌细胞产生HALO的癌症，具有升高的乙酰透明质酸表达(通过免疫染色来测定，例如来自肿瘤切片的组织学染色)的癌症，具有升高的HAS2(乙酰透明质酸合成酶2)的癌症，在体外不产生透明质酸酶(HYAL1)的癌症。富含乙酰透明质酸的癌症可以通过用于评价乙酰透明质酸表达的任何方法和用于测定蛋白/mRNA表达的其他已知方法来鉴定。
已经鉴定了一些富含乙酰透明质酸的癌症。在一些情况下，乙酰透明质酸表达与不良预后相关，例如减少的存活率和/或无复发存活率、转移、血管发生、癌细胞侵入其他组织/区域以及其他不良预后的指示物。例如，已在包括以下肿瘤的富含乙酰透明质酸的肿瘤中观察到这样的相关性：卵巢癌；SCC；ISC；前列腺癌；肺癌，包括非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌；结肠癌和胰腺癌(参见，例如Maarit et al.，Cancer Research，60：150-155(2000)；Karvinen et al.，British Journal of Dermatology，148：86-94(2003)；Lipponen etal.，Eur.Journal of Cancer，849-856(2001)；Pirinen et al.，Int.J.Cancer：95：12-17(2001)；Auvinen et al.，American Journal of Pathology，156(2)：529-536(2000)；Ropponen et al.，Cancer Research，58：342-347(1998))。因此，富含乙酰透明质酸的癌症可以通过给予诸如可溶性PH20的透明质酸酶来治疗，以治疗癌症的一种或多种症状。富含乙酰透明质酸的肿瘤包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌、头颈癌以及其他肿瘤和癌症。
透明质酸酶还可以用于增加抗常规化疗的肿瘤的敏感性。例如，可以向患有与HYAL1缺陷相关肿瘤的患者给予诸可溶性PH20的透明质酸酶，给予的量有效地增加肿瘤部位周围的扩散(例如，促进肿瘤部位中和周围化疗剂的循环和/或浓度)、如通过透明质酸降解抑制肿瘤细胞移动性和/或降低肿瘤细胞凋亡阈值。这可以使肿瘤细胞处于失巢凋亡状态，其使得肿瘤细胞对化疗剂的作用更敏感。透明质酸酶的给药可以诱导先前抗化疗的胰、胃、结肠、卵巢和乳腺肿瘤的应答(Baumgartner et al.(1988)Reg.Cancer Treat.1：55-58；Zanker et al.(1986)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27：390)。因此，除了用可溶性PH20单独治疗癌症之外，本文提供的组合物和方法还可以通过给予与化疗剂或其他抗癌剂或治疗组合的可溶性PH20来用于治疗乙酰透明质酸相关癌症，例如可溶性PH20可以同时或在所述化疗剂或其他抗癌剂或治疗之前给予。在这个实例中，诸如可溶性PH20的透明质酸酶通常增强化疗剂或其他抗癌剂对实体瘤的渗透，从而治疗疾病。
含有可溶性PH20的组合物可以与抗癌剂瘤内注射，或者对于弥散性癌症或难以到达的肿瘤进行静脉内注射。抗癌剂可以为化疗药物、抗体、肽或基因治疗载体，病毒或DNA。此外，为了使先前已获得多种抗药性的耐药性(chemorefractory)肿瘤敏感，透明质酸酶可以用于将肿瘤细胞募集至循环库(St Croix et al.，(1998)Cancer Lett September 131(1)：35-44)。
可以在给予诸如esPH20的可溶性PH20之后、同时或之前给予的示例性抗癌剂包括但不限于阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式维生素A酸)；别嘌醇；六甲蜜胺；阿伏西地；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；安曲霉素；阿帕奇醌；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴诺蒽醌；巴他布林；巴马司他；活卡介苗；贝那昔滨；莱达莫司汀；莱佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；比生群；甲磺酸双奈法德；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡纳替尼；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀与聚苯丙生；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；施铂锭；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；达贝泊汀α；柔红霉素脂质体；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素-毒素连接物；右尼古地平；右奥马铂；右雷佐生；地扎呱宁；地吖醌；二溴螺氯铵；地诺孕素；地那林；地舍莫来；多西他赛；多非喹达；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射液；多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；艾特咔林；依氟鸟氨酸；依拉克达；依利奈法德；Elliott′s B Solution；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；恩扎啕林；依匹哌啶；表柔比星；阿法依泊汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；加柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/奥佐米星；吉罗酚；吉马替康；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；醋酸戈舍瑞林；羟基脲；替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；吲地磺胺；英丙醌；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2和其他白介素(包括重组白介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；异丙铂；伊立替康；伊索拉定；伊沙匹隆；酮曲沙；L-阿拉诺新；兰瑞肽；拉帕替尼；来多蒽琼；来曲唑；亚叶酸；亮丙立德；亮丙瑞林(亮丙立德)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNU；洛莫司汀；氯那法尼；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美登素；氮芥；氮芥/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；MelphalanslL-PAM；美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6-巯嘌呤；美司钠；美替辛德；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨啶；美妥替哌；米铂；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；莫立替尼；麦考酚酸；苯丙酸南诺龙；奈达铂；奈拉滨；奈莫柔比星；尼曲吖啶；诺考达唑；诺莫单抗；诺拉霉素；诺拉曲塞；诺托生琼；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；奥他赛；奥替拉西；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；帕米膦酸；帕土匹龙；培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；吡利曲索；培美曲塞；奈莫司汀；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；吡铂；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；匹蒽醌；普来曲塞；普卡霉素光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟吩姆；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；丙螺氯铵；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡唑呋林；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素；沙柔比星；沙芬戈；沙格司亭；沙铂；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；磷乙酰天冬氨酸；膦门冬酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；角鲨胺；链黑霉素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；6-TG；他地那兰；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；他立喹达；牛磺莫司汀；替可加兰；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；噻唑呋林；噻氯咪索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；托匹生琼；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743)；曲妥珠单抗；曲托龙；维A酸/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；四硝酸三铂；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗辛；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄链霉素A(胍甲环素)；折尼铂；亚苄维C[2-H]；净司他丁；唑来膦酸；佐柔比星和佐舒喹达，例如：
阿地白介素(例如PROLEUKIN
Figure BPA00001417846500931
)；阿仑珠单抗(例如CAMPATH
Figure BPA00001417846500932
)；阿利维A酸(例如PANRETIN
Figure BPA00001417846500933
)；别嘌醇(例如ZYLOPRIM
Figure BPA00001417846500934
)；六甲蜜胺(例如HEXALEN
Figure BPA00001417846500935
)；氨磷汀(例如ETHYOL
Figure BPA00001417846500936
)；阿那曲唑(例如ARIMIDEX
Figure BPA00001417846500937
)；三氧化二砷(例如TRISENOX
Figure BPA00001417846500938
)；天冬酰胺酶(例如ELSPAR
Figure BPA00001417846500939
)；活卡介苗(例如TICE
Figure BPA000014178465009310
BCG)；贝沙罗汀(例如TARGRETIN
Figure BPA000014178465009311
)；贝伐珠单抗(AVASTIN
Figure BPA000014178465009312
)；博来霉素(例如BLENOXANE
Figure BPA000014178465009313
)；静脉剂型白消安(例如BUSULFEX
Figure BPA000014178465009314
)；口服白消安(例如MYLERANTM)；卡鲁睾酮(例如METHOSARB
Figure BPA000014178465009315
)；卡培他滨(例如XELODA
Figure BPA000014178465009316
)；卡铂(例如PARAPLATIN
Figure BPA000014178465009317
)；卡莫司汀(例如BCNUBiCNU
Figure BPA000014178465009319
)；卡莫司汀与聚苯丙生(例如GLIADEL
Figure BPA000014178465009320
 Wafer)；塞来考昔(例如CELEBREX
Figure BPA000014178465009321
)；苯丁酸氮芥(例如LEUKERAN)；施铂锭(例如PLATINOL
Figure BPA000014178465009323
)；克拉屈滨(例如LEUSTATIN
Figure BPA000014178465009324
2-CdA)；环磷酰胺(例如CYTOXAN
Figure BPA000014178465009326
NEOSAR
Figure BPA000014178465009327
)；阿糖胞苷(例如CYTOSAR-U
Figure BPA000014178465009328
)；阿糖胞苷脂质体(例如DepoCyt
Figure BPA000014178465009329
)；达卡巴嗪(例如DTIC-Domeυ)；放线菌素D(例如COSMEGEN
Figure BPA000014178465009330
)；达贝泊汀α(例如ARANESP
Figure BPA000014178465009331
)；柔红霉素脂质体(例如DANUOXOME
Figure BPA000014178465009332
)；柔红霉素/道诺霉素(例如CERUBIDINE
Figure BPA000014178465009333
)；地尼白介素-毒素连接物(例如ONTAK
Figure BPA000014178465009334
)；右雷佐生(例如ZINECARD
Figure BPA000014178465009335
)；多西他赛(例如TAXOTERE
Figure BPA000014178465009336
)；多柔比星(例如阿霉素
Figure BPA000014178465009337
RUBEX
Figure BPA000014178465009338
)；多柔比星脂质体，包括盐酸多柔比星脂质体注射液(例如DOXIL
Figure BPA000014178465009339
)；丙酸屈他雄酮(例如DROMOSTANOLONE
Figure BPA000014178465009340
和MASTERONE注射液)；Elliott′s B Solution(例如Elliott′s B Solution
Figure BPA000014178465009342
)；表柔比星(例如ELLENCE
Figure BPA000014178465009343
)；阿法依泊汀(例如EPOGEN
Figure BPA000014178465009344
)；雌莫司汀(例如EMCYT
Figure BPA000014178465009345
)；磷酸依托泊苷(例如ETOPOPHOS
Figure BPA000014178465009346
)；依托泊苷VP-16(例如VEPESID
Figure BPA000014178465009347
)；依西美坦(例如AROMASIN
Figure BPA000014178465009348
)；非格司亭(例如NEUPOGEN
Figure BPA000014178465009349
)；氟尿苷(例如FUDR)；氟达拉滨(例如FLUDARA
Figure BPA000014178465009351
)；氟尿嘧啶，包括5-FU(例如ADRUCIL)；氟维司群(例如FASLODEX
Figure BPA000014178465009353
)；吉西他滨(例如GEMZAR
Figure BPA000014178465009354
)；吉妥珠单抗/奥佐米星(例如MYLOTARG
Figure BPA000014178465009355
)；醋酸戈舍瑞林(例如ZOLADEX
Figure BPA000014178465009356
)；羟基脲(例如HYDREA
Figure BPA000014178465009357
)；替伊莫单抗(例如ZEVALIN
Figure BPA000014178465009358
)；伊达比星(例如IDAMYCIN
Figure BPA000014178465009359
)；异环磷酰胺(例如IFEX
Figure BPA000014178465009360
)；甲磺酸伊马替尼(例如GLEEVEC
Figure BPA00001417846500941
)；干扰素α-2a(例如ROFERON-A
Figure BPA00001417846500942
)；干扰素α-2b(例如INTRONA
Figure BPA00001417846500943
)；伊立替康(例如CAMPTOSAR
Figure BPA00001417846500944
)；来曲唑(例如FEMARA
Figure BPA00001417846500945
)；亚叶酸(例如WELLCOVORIN
Figure BPA00001417846500946
LEUCOVORIN
Figure BPA00001417846500947
)；左旋咪唑(例如ERGAMISOL
Figure BPA00001417846500948
)；洛莫司汀/CCNU(例如CeeBU
Figure BPA00001417846500949
)；氮芥/氮芥(例如MUSTARGEN
Figure BPA000014178465009410
)；醋酸甲地孕酮(例如MEGACE
Figure BPA000014178465009411
)；美法仑/L-PAM(例如ALKERAN
Figure BPA000014178465009412
)；巯嘌呤，包括6-MP(例如PURINETHOL
Figure BPA000014178465009413
)；美司钠(例如MESNEX
Figure BPA000014178465009414
)；甲氨蝶呤；甲氧沙林(例如UVADEX
Figure BPA000014178465009415
)；丝裂霉素C(例如MUTAMYCIN
Figure BPA000014178465009416
MITOZYTREX
Figure BPA000014178465009417
)；米托坦(例如LYSODREN
Figure BPA000014178465009418
)；米托蒽醌(例如NOVANTRONE)；苯丙酸南诺龙(例如DURABOLIN-50
Figure BPA000014178465009420
)；诺莫单抗(例如VERLUMA
Figure BPA000014178465009421
)；奥普瑞白介素(例如NEUMEGA
Figure BPA000014178465009422
)；奥沙利铂(例如ELOXATIN
Figure BPA000014178465009423
)；紫杉醇(例如PAXENE
Figure BPA000014178465009424
TAXOL
Figure BPA000014178465009425
)；帕米膦酸(例如AREDIA
Figure BPA000014178465009426
)；培加酶(例如ADAGEN
Figure BPA000014178465009427
)；培门冬酶(例如ONCASPAR
Figure BPA000014178465009428
)；培非司亭(例如NEULASTA
Figure BPA000014178465009429
)；喷司他丁(例如NIPENT
Figure BPA000014178465009430
)；哌泊溴烷(例如VERCYTE
Figure BPA000014178465009431
)；普卡霉素/光神霉素(例如MITHRACIN
Figure BPA000014178465009432
)；卟吩姆钠(例如PHOTOFRIN
Figure BPA000014178465009433
)；丙卡巴肼(例如MATULANE)；奎纳克林(例如ATABRINE
Figure BPA000014178465009435
)；拉布立酶(例如ELITEK)；利妥昔单抗(例如RITUXAN
Figure BPA000014178465009437
)；沙格司亭(例如PROKINE
Figure BPA000014178465009438
)；链佐星(例如ZANOSAR
Figure BPA000014178465009439
)；苹果酸舒尼替尼(例如SUTENT
Figure BPA000014178465009440
)；滑石(例如SCLEROSOL
Figure BPA000014178465009441
)；他莫昔芬(例如NOLVADEX)；替莫唑胺(例如TEMODAR
Figure BPA000014178465009443
)；替尼泊苷/VM-26(例如VUMON
Figure BPA000014178465009444
)；睾内酯(例如TESLAC
Figure BPA000014178465009445
)；硫鸟嘌呤，包括6-TG；塞替派(例如THIOPLEX
Figure BPA000014178465009446
)；托泊替康(例如HYCAMTIN
Figure BPA000014178465009447
)；托瑞米芬(例如FARESTON
Figure BPA000014178465009448
)；托西莫单抗(例如BEXXAR
Figure BPA000014178465009449
)；曲妥珠单抗(例如HERCEPTIN
Figure BPA000014178465009450
)；维A酸/ATRA(例如VESANOID
Figure BPA000014178465009451
)；尿嘧啶氮芥；戊柔比星(例如VALSTAR
Figure BPA000014178465009452
)；长春碱(例如VELBAN)；长春新碱(例如ONCOVIN
Figure BPA000014178465009454
)；长春瑞滨(例如NAVELBINE
Figure BPA000014178465009455
)和唑来膦酸(例如ZOMETA
Figure BPA000014178465009456
)。
在一实例中，在给予多西他赛(例如TAXOTERE
Figure BPA000014178465009457
)、多柔比星脂质体(例如DOXIL
Figure BPA000014178465009458
)、苹果酸舒尼替尼(例如SUTENT
Figure BPA000014178465009459
)或贝伐珠单抗(AVASTIN
Figure BPA000014178465009460
)的一种或多种之后、同时或之前向个体给予可溶性PH20，如esPH20，例如聚乙二醇化rHuPH20。
因此，本文提供的可溶性PH20多肽可以用于治疗转移和非转移癌症，包括相对于非癌细胞具有减少的内源透明质酸酶活性的癌症。透明质酸酶可以用作单独的化疗剂，或者与其他化疗药物组合。示例性癌症包括但不限于小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌以及乳腺癌、卵巢癌、头颈癌，或者与降低的透明质酸酶活性水平或减少的透明质酸分解代谢相关的任何其他癌症。
b.在治疗脑中的糖胺聚糖积累中的用途
透明质酸水平在许多脑脊髓病理状况中升高。成人的脑脊髓透明质酸的水平通常低于200μg/L(Laurent et al.(1996)Acta Neurol Scand September94(3)：194-206)，但是在诸如脑膜炎、椎管狭窄、头部损伤和脑梗塞的疾病中可以升高至大于8000μg/L的水平。诸如可溶性rHuPH20的透明质酸酶可以用于降解水平严重升高的底物。
脑中缺少有效的淋巴管(lymphatics)还可以导致头部外伤之后危及生命的水肿。透明质酸积累是透明质酸合成酶合成增加和降解减少的结果。透明质酸的积累最初可以满足增加受损组织中的含水量以促进白细胞外渗的有益目的，但是持续积累可以是致死的。向患有头部损伤的患者给予透明质酸酶，如鞘内或静脉内给予，可以用于去除组织透明质酸积累和与之相关的水。
可溶性PH20还可以用于治疗与脑肿瘤相关的水肿，特别是与多形性成胶质细胞瘤相关的水肿。与脑肿瘤相关的水肿由与肿瘤邻近的脑非癌部分中透明质酸的积累所导致。向透明质酸积累部位给予可溶性PH20透明质酸酶(例如通过静脉内注射或通过分流器)可以通过降解这些部位过量的透明质酸来缓解与这样的恶性肿瘤相关的水肿。
c.在治疗心血管疾病中的糖胺聚糖积累中的用途
可溶性PH20透明质酸酶可以用于治疗一些心血管疾病。在动物模型中实验性心肌梗死之后给予透明质酸酶可以减少梗死大小(Maclean，et al(1976)Science 194(4261)：199-200)。一种提出的机理认为这是通过减少缺血再灌注之后发生的透明质酸积累。梗死大小的减少据认为是由淋巴引流增加和组织氧合增加以及心肌含水量减少而发生的。
可溶性PH20透明质酸酶还可以用于限制动脉硬化的冠状动脉斑块。这样的斑块积累糖胺聚糖并且介导巨噬细胞和泡沫细胞粘连(Kolodgie et al.(2002)Arterioscler Thromb Vasc Biol.22(10)：1642-8)。
d.在玻璃体切开术以及眼病症和疾病状况中的用途
诸如可溶性PH20的透明质酸酶可以在玻璃体切开术(vitrectomy)中减少视网膜的脱离和撕裂(tearing)。例如，在玻璃体去除之前，这可以使玻璃体变为从视网膜解离或“非插入(disinserted)”。这样的玻璃体的非插入或解离可以减小当去除玻璃体时视网膜进一步撕裂或脱离的可能性。
诸如可溶性PH20的透明质酸酶可以用于各种眼科应用，包括美国专利第5,292,509号中所述的玻璃体切开术助剂应用。对于眼内操作，优选使用高度纯化的透明质酸酶，例如本文提供的可溶性PH20，以降低免疫原性和毒性。
可溶性PH20透明质酸酶可以用于治疗和/或预防眼病症，例如通过预防新血管生成和增加从玻璃体清除对视网膜有毒的物质的速率。可以给予可溶性PH20透明质酸酶的量有效地液化眼的玻璃体液而不会引起对眼的有毒损伤。玻璃体液的液化增加了玻璃体(vitreal chamber)的液体交换速率。这种交换增加去除了污染物质，其存在可能引起眼和视网膜损伤。
可溶性PH20透明质酸酶还可以用于降低手术后压力。在眼中透明质酸主要在白内障和人工晶状体外科手术中用作间隔物。透明质酸还用于诸如青光眼、玻璃体和视网膜手术的其它眼科手术以及角膜移植。手术后白内障患者中发生的常见副作用为明显早期并且偶尔延长的眼内压的升高。这样的疾病状况有时很严重，特别是在患有青光眼视盘改变的患者中。诸如可溶性PH20的透明质酸酶可以在手术前与透明质酸共给予至眼以降低眼中的手术后压力。通过降解透明质酸但不降低其在手术中的有效性也不在患者中引起副作用，以有效地将眼内压降低至术前水平的量给予透明质酸酶(美国专利第6,745,776号)。
还可以向患有青光眼的患者给予可溶性PH20透明质酸酶以从小梁网去除糖胺聚糖和降低眼内压，并且可以向玻璃体施用可溶性PH20透明质酸酶以促进玻璃体出血(即血液外渗至玻璃体)的消退，所述玻璃体出血的发生可以与疾病状况相关，如糖尿病视网膜病、视网膜新血管生成、视网膜静脉阻塞、玻璃体后脱离、视网膜撕裂、眼外伤等。通常缓慢消退的玻璃体出血的存在可以延迟、复杂化或阻止为了诊断和/或为了诸如激光凝固等的治疗程序而需要通过玻璃体观察视网膜的程序，这常是诸如增殖性糖尿病视网膜病的疾病状况的初步治疗。
e.在皮下输液中的用途
皮下输液，即将液体和电解质输液至皮肤的皮下组织，是适合轻度至中度脱水的成人患者，特别是老人的有用和简单的水合技术。虽然被认为是安全和有效的，但是最常见的副作用是轻微皮下水肿，这可以通过局部按摩或全身性利尿剂来治疗。在24小时内可以在两个不同部位给予约3L。常见输液部位包括胸、腹、大腿和上臂。用于皮下输液的溶液包括，例如生理盐水、半生理盐水、葡萄糖与盐水和5％葡萄糖。氯化钾也可以加入溶液中。将诸如可溶性PH20的透明质酸酶加入溶液可以提高液体吸收并且增加给药的总体速率。
f.在基因治疗中的用途
大部分体内基因递送媒介物的效力与体外观察到的效力不一致。糖胺聚糖可以阻碍DNA和病毒载体转移和扩散入许多细胞类型。这样的胞外基质物质的水平可以大大阻碍该过程。给予诸如可溶性PH20的透明质酸酶可以在胞外基质中打开通道，因而增强基因治疗的递送。例如，可以与胶原酶一起给予可溶性PH20以在体内促进DNA的转导(Dubensky et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81(23)：7529-33)。透明质酸酶还可以增强利用腺伴随病毒的基因治疗(Favre et al，(2000)Gene Therapy 7(16)：1417-20)。给予透明质酸酶之后打开的通道的大小通常增强了诸如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和DNA复合物的较小分子(和所关注的其他治疗剂和药理物质)的扩散。然而，孔隙没有那么大来促进细胞的移位和迁移。
在一些实例中，病毒可以改造为表达诸如可溶性PH20的透明质酸酶，以促进它们在靶组织中的复制和扩散。靶组织可以为例如癌组织，由此病毒能够在肿瘤中选择性复制。病毒还可以为非裂解病毒，其中病毒在组织特异性启动子下的控制下选择性复制。当病毒复制时，透明质酸酶与病毒基因的共表达可以促进体内病毒扩散。
g.美容用途
可以通过给予诸如可溶性PH20的透明质酸酶以去除涉及皮下脂肪团堆积的糖胺聚糖并促进淋巴流。例如，可溶性PH20可以用于治疗皮下脂肪团。透明质酸酶可以通过反复的皮下注射来给予，通过软膏剂或乳膏剂形式的透皮递送或者通过使用可注射的缓释制剂以促进糖胺聚糖的持续降解并防止其回归。
诸如可溶性PH20的透明质酸酶还可以用于治疗疾病状况，如“猪皮”水肿或“橘皮”水肿。透明质酸酶可以影响长糖胺聚糖链的解聚，所述长糖胺聚糖链可以在真皮中积累并引起结合水和通过毛细血管加压的缓慢扩散的有机液体的滞留，所述有机液体的缓慢扩散消除代谢废物。水和废物这样的滞留与脂肪细胞的脂肪超载相关，构成了经典的“猪皮”水肿或“橘皮”水肿。解聚可以将糖胺聚糖的长链切成较短的链，从而导致结合水和废物的消除以及静脉和淋巴循环的恢复，以局部水肿的消失而告终。
h.在器官移植中的用途
器官中透明质酸的含量可以随炎症而增加。在来自特征为炎性免疫损伤的不同器官的组织中已观察到透明质酸浓度增加，所述炎性免疫损伤如肺泡炎(alveolitis)(Nettelbladt et al.(1991)Am.Rev.Resp.Dis.139：759-762)和心肌梗死(Waldenstrom et al.(1991)J.Clin.Invest.88(5)：1622-1628)。其他实例包括肾(Hallgren et al.(1990)J.Exp.Med.171：2063-2076；Wells et al.(1990)Transplantation 50：240-243)、小肠(Wallander et al.(1993)Transplant.Int.6：133-137)或心脏(Hallgren et al.(1990)J Clin Invest 85：668-673)移植后的同种异体移植排斥；或者病毒来源的心肌炎症(Waldenstrom et al.(1993)Eur.J.Clin.Invest.23：277-282)。与器官移植相关的间质水肿的出现在移植手术领域构成了严重问题。具有间质水肿的移植物可以肿胀至功能暂时丧失的程度。在某些情况下，肿胀可以引起肾破裂，导致大出血。诸如可溶性PH20的透明质酸酶可以在器官移植中用于降解积累的糖胺聚糖。去除这样的糖胺聚糖促进了从移植物去除水，因而增强器官功能。
i.在肺疾病中的用途
来自正常个体的支气管肺泡灌洗(BAL)中的透明质酸水平通常低于15ng/ml。BAL中透明质酸水平在呼吸窘迫的疾病状况中显著上升(Bjermer etal.(1987)Br Med J(Clin Res Ed)295(6602)：803-6)。肺中增加的透明质酸可以阻止氧扩散和气体交换以及激活嗜中性粒细胞和巨噬细胞应答。诸如本文提供的任何制品的可溶性PH20的纯化制品可以通过肺或静脉内递送来递送至呈现出这样的疾病状况的患者以降低乙酰透明质酸水平。还可以向患有与糖胺聚糖升高相关的其他肺并发症的患者给予诸如可溶性PH20的透明质酸酶，或者促进其他共递送的分子递送至肺。
3.其他用途
在治疗用途的其他实例中，透明质酸酶如本文提供的包括esPH20在内的可溶性PH20可以用作这样的目的，如静脉旁注射诸如长春花生物碱(vinka alkaloid)的坏死物质所引起的局部坏死的解毒剂(Few et al.(1987)Amer.J.Matern.Child Nurs.12，23-26)，治疗腱鞘囊肿(Paul et al.(1997)JHand Surg.22(2)：219-21)和治疗由静脉功能不全引起的组织坏死(Elder etal.(1980)Lancet 648-649)。可溶性PH20还可以用于治疗腱鞘囊肿(也称为腕囊肿、圣经囊肿(Bible cyst)或背肌腱囊肿)，这是最常见的手部软组织块，并且是在皮肤下可以感觉到的充满液体的囊。
诸如可溶性PH20的透明质酸酶还可以通过降解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)来治疗脊髓损伤。在脊髓损伤后，星形胶质细胞产生了含有CSPG的胶质瘢痕。CSPG在抑制轴突生长中起着至关重要的作用。此外，CSPG的表达据证实增加中枢神经系统(CNS)随后的损伤。可溶性PH20还可以用于在称为化学髓核溶解术(chemonucleolysis)的过程中治疗椎间盘突出。软骨素酶ABC是切割与透明质酸酶相似底物的酶，可以诱导腰脊柱中椎间盘压力的减少。存在三类椎间盘损伤。突出的椎间盘是完整但膨胀的椎间盘。在挤压的椎间盘中，纤维包装已撕裂并且NP已渗出，但是仍然连接至椎间盘。在隔离的椎间盘中，NP片段已从椎间盘破裂释放并游离在椎管中。化学髓核溶解术通常对突出和挤压的椎间盘有效，但是对隔离的椎间盘损伤无效。
I.实施例
以下实施例仅作说明用途而不是为了限制本发明的范围。
实施例1 人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的产生
在本实施例中，产生了一系列人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体。成熟人PH20透明质酸酶或精子粘附分子1(SPAM1)含有474个氨基酸，而本实施例中产生的成熟羧基端缺失突变体长度为472个氨基酸至415个氨基酸。
编码从氨基酸A507至氨基酸K450截短的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的DNA寡核苷酸根据标准DNA合成方案来合成。亲本DNA序列为密码子优化的人PH20透明质酸酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该密码子优化的人PH20透明质酸酶含有异源免疫球蛋白κ(IgK)信号序列，如SEQ ID NO：144所示。此外，该序列含有5’NheI和3’BamHI限制位点以允许克隆至HZ24质粒(SEQ ID NO：140)。人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体核苷酸序列如SEQ ID NO：146-185和199-201所示。用NheI和BamHI限制性内切酶消化合成的DNA序列，并将其克隆至类似消化的HZ24质粒以产生每个单独克隆的突变体SPAM1-HZ24质粒。
人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体如表3所示。通过蛋白C端的4个氨基酸来鉴定SPAM1突变体。还示出了前体和成熟羧基端缺失突变体的氨基酸长度。
Figure BPA00001417846501001
Figure BPA00001417846501011
实施例2 人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的表达
在本实施例中，在CHO-S细胞中表达实施例1中产生的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体。此外，在4株抗凝集素的CHO突变株的每一株中表达rHuPH20和His-标记的PH20，所述抗凝集素的CHO突变株包括Lec1(Cat No.CRL-1735，ATCC)、Lec2(Cat No.CRL-1736，ATCC)、Lec8(CatNo.CRL-1737，ATCC)和Pro-5(Cat No.CRL-1781)。Lec突变细胞中PH20的表达在以下实施例9中进一步讨论。
A.在6孔板中在CHO-S细胞中瞬时表达
利用GeneJuice
Figure BPA00001417846501021
(Novagen)根据制造商的说明，将实施例1中产生的突变体PH20-HZ24质粒瞬时感染入CHO-S细胞(源自中国仓鼠卵巢CHO K1细胞)。简而言之，使CHO-S细胞在补充了L-谷氨酰胺的CD CHO培养基中生长。在转染前，将CHO-S细胞以约5x105个细胞/孔接种至6孔板，并且在37℃与5％CO2下生长过夜。然后去除培养基，并且用1mL无血清培养基将CHO-S细胞洗涤2次。将GeneJuice
Figure BPA00001417846501022
与无血清培养基混合，然后加入2μg突变体-HZ24DNA。在室温下孵育5-15分钟后，将GeneJuice
Figure BPA00001417846501023
/DNA混合物逐滴加入含有洗过的CHO-S细胞的单独孔中。4小时后，用1mL补充了L-谷氨酰胺的CD-CHO培养基替换培养基，并且将细胞在37℃与5％CO2下培养72小时。表达之后，分别收获培养基和细胞。
B.在10cm细胞培养皿中在CHO细胞中瞬时表达
利用GeneJuice
Figure BPA00001417846501024
(Novagen)根据制造商的说明，将实施例1中产生的突变体PH20-HZ24质粒瞬时感染入CHO-S细胞。可选地，利用GeneJuice
Figure BPA00001417846501025
(Novagen)根据制造商的说明，将HZ24-PH20(SEQ ID NO：108，编码rHuPH20)、PH20sHis(SEQ ID NO：187，编码his-标记的PH20)和HZ24-mut(B/S)(SEQ ID NO：122，编码在氨基酸482处截短的PH20)瞬时感染入4株抗凝集素的CHO突变株，其包括Lec1(Cat No.CRL-1735，ATCC)、Lec2(Cat No.CRL-1736，ATCC)、Lec8(Cat No.CRL-1737，ATCC)和Pro-5(Cat No.CRL-1781)
简而言之，将CHO-S细胞维持在补充了8mM GlutaMax的CD-CHO培养基中。使抗凝集素的CHO突变细胞在补充了10％FBS的DMEM培养基中生长。在转染前，将CHO细胞以约3x106个细胞/孔接种至10cm细胞培养皿，并且在补充了10％FBS的DMEM培养基中在37℃与5％CO2下生长过夜。然后去除培养基，并且用10mL无血清培养基将单层细胞洗涤2次。将36μL GeneJuice
Figure BPA00001417846501031
与1.2mL DMEM混合，并且在室温下孵育5分钟。孵育之后，加入12μg DNA并且轻轻混合。在室温下孵育15分钟之后，将GeneJuice
Figure BPA00001417846501032
/DNA混合物逐滴加入单层CHO细胞，并且轻轻摇动细胞培养皿以允许混合。将平板在37℃与5％CO2下培养4小时。4小时后，用12mL补充了Glutamax-1的无去污剂CD DG44培养基替换培养基，并且将细胞在37℃与5％CO2下培养48小时。表达之后，分别收获培养基和细胞。
实施例3 人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的溶解性
在本实施例中，在如以上实施例2中所述的瞬时表达之后，分别收获培养基和细胞，并且通过蛋白印迹分析来分析PH20表达和溶解性。通过检查表达的蛋白是否存在于生长培养基或细胞中来确定C端截短突变体的溶解性。对应SEQ ID NO：55-65和99-101的长度为455-472个氨基酸的C端缺失突变体含有来自GPI-锚的氨基酸残基，其用于使蛋白附着至细胞膜。用磷酸肌醇-磷脂酶C(PI-PLC)处理表达这些突变体的细胞，磷酸肌醇-磷脂酶C切割GPI-锚而允许可溶性蛋白释放至培养基，然后通过蛋白印迹分析来确定所得培养基和细胞中PH20的存在。
A.蛋白印迹分析
在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上跑非还原样品，并且利用iBlot(Invitrogen)转移至PVDF膜。对于蛋白印迹，用兔抗PH20 IgG(0.5μg/mL)作为一抗，并且用HRP-缀合的山羊抗兔IgG(0.1ng/mL，Cat#DC03L，EMD)作为二抗。通过约66kDa的对应重组人PH20透明质酸酶的条带来证实表达。
B.PI-PLC处理
1.在6孔板中瞬时表达
如以上实施例2A中所述，在CHO-S细胞中表达rHuPH20 72小时之后，分别收获培养基和细胞。用无血清培养基洗涤细胞，然后每孔加入2mL无血清培养基。向每孔加入PI-PLC(0.5单位/孔)，并且将细胞在PI-PLC中培养2小时。如上所述通过蛋白印迹分析来分析所得的培养基和细胞。
2.在10cm组织培养皿中瞬时表达
如以上实施例2B所述，对于每个C端突变体均准备了两块表达rHuPH20的CHO-S细胞板，一块用PI-PLC处理，而一块不用PI-PLC处理。表达48小时之后，对于未用PI-PLC处理的细胞，分别收获培养基和细胞。利用Amicon 30kD MWCO浓缩器，将收获的培养基离心，浓缩至体积为10mL并且缓冲液交换至PBS。用冷PBS漂洗细胞，然后将细胞刮下并重悬于1.2mL含有蛋白酶抑制剂Set III(Cat No.539134，Calbiochem)的PBS中。将重悬的细胞短暂超声处理以制备全细胞提取物。对于PI-PLC处理的细胞，在表达48小时之后，如上所述收获未处理的培养基。用含有Glutamax-1的新鲜CD DG44培养基将细胞漂洗一次，并且每皿用12mL含有3.0单位PI-PLC的补充了Glutamax-1的新鲜无去污剂CD DG44培养基替换培养基，然后将细胞在37℃与5％CO2下培养2小时。2小时后，如上所述分别收获PI-PLC培养基和细胞。如上所述通过蛋白印迹分析来分析所得的未处理的培养基和细胞以及PI-PLC处理的培养基和细胞。
C.结果
结果如下文的表4所述。4个突变体ILFL(SEQ ID NO：58)、SILF(SEQID NO：100)、VSIL(SEQ ID NO：59)和IVSI(SEQ ID NO：101)表现出PH20低表达。如约66kDa的蛋白条带所证实，蛋白印迹分析表明短于F500的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体(SEQ ID NO：59-95和100-101)在培养基中表达。长度在L501和A507之间的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体(SEQ ID NO：55-58和99)在细胞中表达。如约66kDa的蛋白条带所证实，当用PI-PLC处理这些细胞时，人PH20透明质酸酶释放入培养基。用PI-PLC处理来自对应SEQ ID NO：59-65和100-101的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的细胞没有效果，因为这些蛋白最初表达入培养基。
Figure BPA00001417846501051
Figure BPA00001417846501061
实施例4利用Triton X-114测定的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的溶解性
在本实施例中，利用Triton
Figure BPA00001417846501063
 X-114测定来测试人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的溶解性。在这个测定中，可溶性PH20透明质酸酶会分配入加热至37℃的Triton
Figure BPA00001417846501064
X-114溶液的水相(如Bordier et al.，(1981)J.Biol.Chem.，256：1604-7所述的改良)，而膜锚定的PH20透明质酸酶会分配入去污剂丰富相。
为了这个目的，将0℃的PBS中的2％(v/v)Triton
Figure BPA00001417846501065
 X-114加入如以上实施例3B中制备的200μL组织培养基或细胞提取物，并且将样品在冰上孵育。为了分离，在4℃下在微离心管中将样品覆盖在30μL含有0.06％Triton
Figure BPA00001417846501066
 X-114的蔗糖垫层(6％w/v)上。将样品加热至37℃保持3分钟以诱导相分离，并且在室温下以4000g离心3min。取出水相和去污剂相用于SDS-PAGE分析和蛋白印迹。用兔抗PH20 IgG(0.5μg/mL)作为一抗，并且用HRP-缀合的山羊抗兔IgG(0.1ng/mL，Cat# DC03L，EMD)作为二抗。用强烈分配入去污剂相的全长人PH20作为对照。
羧基端缺失突变体的溶解性结果如表5所示。直至F500的人PH20透明质酸酶羧基端缺失(前体SEQ ID NO：7-13和48-49或成熟SEQ IDNO：59-65和100-101)分配入水相，并因此是可溶的。长于F500的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体(SEQ ID NO：55-58和99)分配入去污剂相并且是不可溶的。全长PH20也是不可溶的。
Figure BPA00001417846501071
实施例5 人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的透明质酸酶活性
在本实施例中，用生物素化透明质酸(生物素化HA或bHA)，通过微量滴定测定来测试人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的PH20透明质酸酶活性。在pH 7.4和pH 5.5下测试人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体的透明质酸酶活性。
简单地说，用生物素化HA(1.1MDa)包被4xBHX 96孔板。将来自用人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体转染的细胞的转染后72小时的上清用pH 7.4或pH 5.5的缓冲液稀释，然后加入板的单独孔并在37℃下孵育90分钟。通过加入4M盐酸胍来终止反应。用含有Tween20的磷酸缓冲盐水(PBST)将孔洗涤4x以去除任何消化的生物素化-HA，然后加入链霉亲和素-HRP在室温下保持1小时。用PBST将孔洗涤4x，并且用TMB将板显色。用ELISA酶标仪在450nm下读板。通过将在450nm下测得的吸光度插入透明质酸酶参考标准曲线来确定透明质酸酶活性(单位/mL)。用全长成熟人PH20透明质酸酶和未转染的CHO细胞作为阳性和阴性对照。
结果如以下表6和6A所示。对应SPAM1-GDVC至SPAM1-ADVK(SEQID NO：88-95)的短于I430的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体是无活性的。因为表达水平低，终止于I498(SEQ ID NO：101)、L499(SEQ IDNO：59)、F500(SEQ ID NO：100)、L501(SEQ ID NO：58)和I502(SEQ IDNO：99)处的人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体具有很少可检测的活性。所有其他人PH20透明质酸酶羧基端缺失突变体(SEQ ID NO：55-57和60-87)在pH 7.4和pH 5.5下均为活性透明质酸酶。
Figure BPA00001417846501081
Figure BPA00001417846501091
实施例6 通过LC-MS的rHuPH20的聚糖分析
在本实施例中，通过胰蛋白酶消化的PH20的质谱分析来进行rHuPH20(SEQ ID NO：122)的聚糖分析研究。
简单地说，将rHuPH20(如实施例15C中所产生的)冻干并重悬于含有6M盐酸胍、0.002M EDTA和0.02M Tris的pH 8.28缓冲液中至终浓度为0.5mg/mL。加入DTT(终浓度10mM)，并且将蛋白/DTT混合物在37℃下孵育1小时。还原作用之后，加入碘乙酰胺至终浓度为20mM。最后，加入胰蛋白酶(1∶25w/w)并且将混合物在37℃下孵育20小时。
通过LC-MS来分析胰蛋白酶消化物。简单地说，用以下表7中所示的条件将胰蛋白酶消化物加入C18反相柱。利用电喷射离子化(ESI)在阳离子模式下在Q-TOF Ultima质谱仪上收集MS数据。在MS模式中从m/z200-1950获得数据。利用GlycoMod软件(www.expasy.ch/tools/glycomod/)来分析糖肽以确定聚糖类型。
Figure BPA00001417846501101
人PH20透明质酸酶在T475处具有一个O-糖基化位点。该位点被具有一个或两个唾液酸的核心类型1聚糖占据。rHuPH20在6个不同的天冬酰胺残基处是糖基化的，包括N82、N166、N235、N254、N368和N393。结果显示N254为约75％被占据，N393为约85％被占据，而剩余4个位点N82、N166、N235和N368则为大于99％被占据。所有三种类型的N-聚糖高甘露糖、杂合和复杂型都在rHuPH20中存在。总的来说，rHuPH20含有约45％高甘露糖聚糖、45％复杂聚糖和10％杂合聚糖。总聚糖的约35％为阴离子型，其中25％含有唾液酸并且剩余10％含有未知阴离子基团，可能为磷酸基团。大部分复杂聚糖为岩藻糖基化的，并且阴离子型复杂聚糖大部分含有1个唾液酸，而一些含有2个唾液酸。每个天冬酰胺残基具有约90％的一种类型聚糖，以及小比例的其他两种类型聚糖，N235除外。每个残基的主要聚糖类型如以下表8所示。残基N82、N166和N254被复杂聚糖占据。残基N368和N393被高甘露糖聚糖占据。残基N235约80％被高甘露糖聚糖占据，约20％被复杂聚糖占据。
Figure BPA00001417846501111
实施例7 通过用内切糖苷酶处理的人PH20透明质酸酶的去糖基化
在本实施例中，通过用各种糖苷酶处理纯化的rHuPH20(SEQ IDNO：122)来使人PH20透明质酸酶去糖基化，并且评价透明质酸酶活性。人PH20透明质酸酶在6个不同的天冬酰胺残基处是糖基化的，包括N82、N166、N235、N254、N368和N393。5种糖苷酶被用于产生去糖基化的人PH20透明质酸酶，包括：PNGaseF(New England Biolabs，Cat.No.P0704S，Lot#34)，其切割所有N-聚糖；EndoF1，其切割高甘露糖和杂合型聚糖；EndoF2，其切割二分支的复杂型聚糖；EndoF3，其切割二分支和更多分支的复杂聚糖；以及EndoH(New England Biolabs，Cat.No.P0702S)，其切割高甘露糖和杂合型聚糖。因此，用PNGaseF处理导致完全去糖基化，而用内切糖苷酶处理仅导致部分去糖基化。
对于完全去糖基化，将纯化的rHuPH20(终浓度0.1mg/mL)用PNGaseF(50,000单位/mL)在50mM、pH 7.2磷酸盐缓冲液中于37℃下孵育过夜。对于部分去糖基化，将纯化的rHuPH20(终浓度0.5mg/mL)用0.3单位/mL内切糖苷酶(EndoF1、EndoF2、EndoF3或EndoH)或所有4种内切糖苷酶的混合物在50mM、pH 5.0乙酸钠缓冲液中于35℃下孵育过夜。通过SDS-PAGE中PH20迁移率的转变来分析rHuPH20的去糖基化。如实施例5所述测定透明质酸酶酶促活性。
人PH20透明质酸酶的分子量为约66kDa。如通过SDS-PAGE迁移率转变至分子量约56kDa所确定的，用EndoF1、EndoH或者EndoF1、EndoF2、EndoF3和EndoH的混合物处理导致部分去糖基化的人PH20透明质酸酶。用PNGaseF处理导致人PH20透明质酸酶的完全去糖基化。rHuPH20的部分去糖基化不会导致透明质酸酶酶促活性的失活，而用PNGaseF彻底消化以完全去除N-聚糖会导致透明质酸酶酶促活性完全丧失(参见下文的表9)。
实施例8 用糖基化抑制剂处理人PH20透明质酸酶
在本实施例中，在两种糖基化抑制剂的每一种的存在下瞬时表达rHuPH20(SEQ ID NO：122)，并且评价透明质酸酶的分泌和活性。几夫碱是涉及聚糖加工的甘露糖苷酶I的强效抑制剂(参见，例如Elbein et al.，J BiolChem，265：15599-15605(1990))。衣霉素是同源核苷抗生素的混合物，其抑制GlcNAc磷酸转移酶(GPT)，从而阻断所有N-聚糖的合成(参见，例如
Figure BPA00001417846501122
 et al.，Eur.J.Biochem.269：977-988(2002))。
简单地说，将1x106个表达rHuPH20的HZ24-2B2细胞(参见以下实施例14)接种至两个125mL瓶中的24mL完全CD-CHO培养基中。加入衣霉素(溶于DMSO)或几夫碱(新鲜溶于水)至终浓度为5μg/mL(含有12μLDMSO)。作为对照，向一瓶接种1x106个表达rHuPH20的HZ24-2B2细胞，并且加入12μL DMSO作为媒介物对照。加入衣霉素或几夫碱后，将细胞在37℃与5％CO2下培养4-6小时。表达之后，取出2mL培养物并且以500g离心5分钟。将上清在4℃下保存，并且将细胞沉淀在-20℃下保存。将剩余的22mL培养物以500g离心5分钟。将上清在4℃下保存。在原来的两个125mL瓶中将细胞重悬于22mL完全CD-CHO培养基中。将衣霉素或几夫碱加入培养物，终浓度为5μg/mL，并且将细胞在37℃与5％CO2下培养。更换培养基后约每24小时从每瓶取出2mL(2mL)培养物。对于每个时间点，将上清在4℃下保存，并且将细胞沉淀在-20℃下保存。通过蛋白印迹分析来分析rHuPH20的表达，并且利用生物素化HA酶促测定来测量透明质酸酶活性(如以上实施例3和5所述)。
结果如下文表10-13中所示，其示出了活细胞的数目和PH20活性。如表10-11所示，衣霉素在组织培养基中和细胞内均抑制PH20活性，并且还导致细胞成活力完全丧失。此外，如细胞沉淀部分中通过SDS-PAGE迁移率转变至分子量约56kDa所确定的，用衣霉素处理1小时导致细胞内去糖基化的人PH20透明质酸酶的积累。如表12-13所示，几夫碱不影响PH20活性，而蛋白印迹分析显示，在处理的细胞中几夫碱抑制rHuPH20的表达和分泌。
Figure BPA00001417846501131
Figure BPA00001417846501141
实施例9 在抗凝集素的CHO突变株中瞬时表达rHuPH20
在本实施例中，在4株抗凝集素的CHO突变株中瞬时表达rHuPH20，并且评价透明质酸酶的分泌和活性。抗凝集素的CHO突变株总结在以下表14中。Pro-5细胞缺少半乳糖基转移酶β4galT-6，导致半乳糖基化N-聚糖的还原(参见，例如Lee et al.J.Biol.Chem.276：13924-13934(2001))。Lec1细胞缺少N-乙酰葡糖胺转移酶I活性，因此不合成复杂或杂合聚糖(参见，例如Chen and Stanley，Glycobiology，13：43-50(2003))。Lec2和Lec8为转运核苷酸-糖穿越ER或高尔基体膜的核苷酸-糖转运蛋白缺陷。Lec2细胞不能转运CMP-唾液酸(即CMP-NeuAc)，因此导致脱唾液酸(asialo)细胞表面的表达(参见，例如Eckhardt et al.，J.Biol.Chem.273：20189-20195(1998))。Lec8细胞不能转运UDP-半乳糖，因此导致缺乏半乳糖的聚糖(参见，例如Bakkeret al.，Glycobiology，15：193-201(2005))。
Figure BPA00001417846501142
简单地说，如以上实施例2A所述，在包括Lec1(Cat No.CRL-1735，ATCC)、Lec2(Cat No.CRL-1736，ATCC)、Lec8(Cat No.CRL-1737，ATCC)和Pro-5(Cat No.CRL-1781)在内的4株抗凝集素的CHO突变株的每株中瞬时表达PH20sHis(编码his-标记的PH20，SEQ ID NO：187)。此外，在Pro-5细胞中瞬时表达HZ24-mut(B/S)(编码在氨基酸482处截短的PH20，SEQ IDNO：122)，并且使Pro-5细胞模拟转染作为阴性对照。通过蛋白印迹分析来分析所得的细胞培养基，并且利用生物素化HA酶促测定来测量透明质酸酶活性(如以上实施例3和5所述)。
如约66kDa的蛋白条带所证实的，结果显示Lec突变株中表达的rHuPH20分泌入培养基。bHA酶促测定结果如下文表15所示，其示出了抗凝集素的CHO突变株、用于转染细胞的编码PH20的质粒以及在pH5.5下以1∶27和1∶81稀释的PH20活性。Lec突变细胞表达的rHuPH20具有酶促活性。
Figure BPA00001417846501151
实施例10 人PH20透明质酸酶N-糖基化位点的定点诱变
在本实施例中，产生了N-聚糖位点特异性人PH20透明质酸酶去糖基化突变体，并且评价了它们的分泌模式和透明质酸酶酶促活性。N-聚糖位点特异性去糖基化突变体和聚糖类型如下文表16所示。
利用QuikChange
Figure BPA00001417846501152
定点诱变试剂盒(Cat No.200518，Stratagene)，用PH20sHis(SEQ ID NO：210)作为模板将每个天冬酰胺残基诱变为丙氨酸。模板DNA编码的蛋白对应于PH20sHis(SEQ ID NO：187)，其是在氨基酸S490后含有HexaHis标签的人PH20克隆(SEQ ID NO：142)。野生型PH20sHis和去糖基化突变体如表16所示。产生了6个单突变体，每个N-糖基化位点一个。此外，对于被杂合型聚糖占据的天冬酰胺N82、N166和N254，产生了3个双突变体和一个三突变体。最后，产生了缺少高甘露糖聚糖的双突变体N368A/N393A。将突变体转染入CHO-S细胞，并且如实施例2A所述进行表达。如以上实施例3和5所述来确定分泌入培养基和透明质酸酶活性。
结果如下文表16所示，其示出了突变、聚糖类型、蛋白是否分泌入培养基以及在pH 5.5和pH 7.4下的透明质酸酶活性。蛋白印迹分析显示残基N82、N166、N235和N254的突变对rHuPH20蛋白分泌入培养基没有影响。可选地，如培养基中缺少约66kDa的蛋白所证实的，残基N368A和N368A/N393A的突变阻止PH20的表达和分泌。如约66kDa的蛋白条带所证实的，残基N393A的突变导致蛋白表达减少，但是在培养基中观察到rHuPH20。残基N82、N166和/或N254的突变对rHuPH20活性没有影响。这些残基被复杂聚糖占据。相比之下，因为缺少分泌，含有高甘露糖聚糖的残基N235、N368和/或N393的突变导致在培养基中可检测的活性完全丧失。
Figure BPA00001417846501161
使用抗PH20抗体的CHO细胞的免疫荧光分析用于观察N-聚糖位点特异性去糖基化突变体N368A、N393A和N368A/N393A的表达。为了单层培养，将2.5x104个细胞/ml含有10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)的200μL CHO细胞接种至8孔腔式载玻片上，使细胞在37℃下在5％CO2的加湿空气中生长。36小时后在80％汇合时，利用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)如下转染细胞。将DNA(0.4μg，50μL无血清DMEM中)和LipofectamineTM 2000(1μL，无血清DMEM中)在室温下轻轻混合20分钟，然后加入含有细胞和100μL无血清培养基的每孔中。来回轻轻摇板来混合。然后将细胞于37℃下在CO2培养箱中培养4-6小时，之后用含有10％FBS的培养基来替换培养基。转染后48小时，用4％多聚甲醛将腔式载玻片上的细胞固定15分钟。用PBS将细胞洗涤3x，然后加入200μL的1％NP-40/PBS溶液，并且在室温下孵育30分钟。用PBS将细胞洗涤3x，在免疫标记之前在4℃下保存。
为了免疫标记细胞，用15％正常山羊血清将样品在室温下封闭30分钟。将细胞用在PBS中的5％正常山羊血清中1∶20稀释的抗PH20兔IgG溶液孵育2小时。最后，用PBS将细胞洗涤3x，然后用FITC-缀合的山羊抗兔IgG孵育1小时，然后观察。此外，封固液含有允许核染色的DAPI。利用抗PH20抗体的免疫荧光分析显示N368A和N393A突变导致PH20在细胞内积累。
N-糖基化研究的总结
如以上实施例7-10所示，N-联糖基化对于rHuPH20的正确折叠和酶促活性是重要的。用PNGaseF彻底消化或者在生物合成中通过用衣霉素处理来抑制糖基化所引起的rHuPH20完全去糖基化消除了所有可检测的酶促活性。此外，证实未糖基化的rHuPH20在细胞中积累。相比之下，用几夫碱处理或者在Lec突变株中表达所引起的部分去糖基化的rHuPH20保留了酶促活性。最后，利用定点诱变的详细突变分析显示高甘露糖型聚糖的存在对于产生可溶性、酶促活性rHuPH20是必需的。
实施例11 表达可溶性rHuPH20的细胞系的产生
用HZ24质粒(SEQ ID NO：140所示)转染中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见，例如美国专利申请第10,795,095号、第11/065,716号和第11/238,171号)。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体含有pCI载体骨架(Promega)、编码人PH20透明质酸酶氨基酸1-482的DNA(SEQ ID NO：110)、来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架还包括编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动区(CMV)、嵌合内含子和SV40晚期加A信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA在编码位于人PH20的天然35个氨基酸信号序列的氨基酸位置1的甲硫氨酸的DNA之前含有NheI位点和Kozak共有序列，并且在编码对应SEQ IDNO：107所示的人PH20透明质酸酶的氨基酸位置482的酪氨酸的DNA之后含有终止密码子，随后为BamHI限制位点。因此构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)导致了一种由CMV启动子驱动的mRNA类型，其编码人PH20的氨基酸1-482(SEQ ID NO：109所示)和小鼠二氢叶酸还原酶的氨基酸1-186(SEQ ID NO：141所示)，通过内部核糖体进入位点(IRES)来分隔。
将在用于DHFR(-)细胞的补充了4mM谷氨酰胺和18ml/L PlurionicF68/L(Gibco)的GIBCO改良CD-CHO培养基中生长的未转染的DG44 CHO细胞以0.5x106个细胞/ml接种至摇瓶中以准备转染。使细胞于37℃下在5％CO2的加湿培养箱中生长，以120rpm震荡。在转染前测试指数生长的未转染的DG44 CHO细胞的成活力。
将未转染的DG44 CHO细胞培养物的6×107个活细胞沉淀，并且重悬至0.7mL 2x转染缓冲液(2x HeBS：40mM Hepes，pH 7.0，274mM NaCl，10mM KCl，1.4mM Na2HPO4，12mM葡萄糖)中，密度为2×107个细胞。向每等份重悬细胞加入0.09mL(250μg)线性HZ24质粒(通过用Cla I(NewEngland Biolabs)消化过夜来线性化)，并且在室温下将细胞/DNA溶液转移至0.4cm间距的BTX(Gentronics)电穿孔小槽中。用没有与质粒DNA混合的细胞进行阴性对照电穿孔。用330V和960μF或者350V和960μF的电容放电来电穿孔细胞/质粒混合物。
电穿孔后将细胞从小槽中取出，并转移至5mL用于DHFR(-)细胞的补充了4mM谷氨酰胺和18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)的GIBCO改良CD-CHO培养基中，并且使细胞在6孔组织培养板的孔中于37℃下在5％CO2的加湿培养箱中无选择地生长2天。
电穿孔2天后，从每孔取出0.5mL组织培养基，并且利用实施例12所述的微浊度法来测试透明质酸酶活性的存在。结果如表17所示。
Figure BPA00001417846501181
从组织培养孔中收集来自转染2(350V)的细胞，计数并稀释至1×104-2×104活细胞/mL。将0.1mL等份的细胞悬浮液转移至5块96孔圆底组织培养板的每个孔。将100μL含有4mM GlutaMAXTM-1补充物(GIBCOTM，Invitrogen Corporation)并且没有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷补充物的CD-CHO培养基(GIBCO)加入含有细胞的孔(终体积0.2mL)。
从在没有甲氨蝶呤的条件下生长的5块板鉴定了10个克隆(表18)。
将6个HZ24克隆扩大培养，并转移至摇瓶作为单细胞悬浮液。利用二维无限稀释策略将克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10接种至96孔圆底组织培养板，其中细胞沿板向下1∶2稀释，并且沿板向右1∶3稀释，在顶端左手边孔中从5000个细胞开始。使稀释的克隆在500个未转染的DG44CHO细胞/孔的背景中生长，以便为培养的最初几天提供必需的生长因子。每个亚克隆用10块板，5块板含有50nM甲氨蝶呤，而5块板没有甲氨蝶呤。
克隆3D3产生了24个可见的亚克隆(13个来自无甲氨蝶呤处理，而11个来自50nM甲氨蝶呤处理)。在来自24个亚克隆中的8个的上清中测量到显著的透明质酸酶活性(＞50单位/mL)，并且将这8个亚克隆扩大至T-25组织培养瓶。将从甲氨蝶呤处理方案分离的克隆在50nM甲氨蝶呤的存在下扩大。将克隆3D35M在500nM甲氨蝶呤中进一步扩大，从而使得在摇瓶中产生超过1,000单位/ml的克隆(克隆3D35M；或Gen1 3D35M)。然后制备3D35M细胞的主细胞库(MCB)。
实施例12 可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的测定
利用基于当透明质酸与血清白蛋白结合时形成不溶性沉淀物的浊度测定来测定诸如细胞培养物、纯化组分和纯化的溶液的样品中可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性。通过将可溶性rHuPH20用透明质酸钠(透明质酸)孵育设定的时间(10分钟)，然后加入酸化的血清白蛋白以沉淀未消化的透明质酸钠来测量活性。在30分钟发展期之后在640nm下测量所得样品的浊度。对透明质酸钠底物的酶活性所导致的浊度减少是可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的量度。利用可溶性rHuPH20测定工作参考标准的稀释所产生的校准曲线来进行所述方法，并且与该校准曲线相比来进行样品活性测量。
在酶稀释剂溶液中制备样品的稀释。通过将33.0±0.05mg水解明胶溶于25.0mL的50mM PIPES反应缓冲液(140mM NaCl，50mM PIPES，pH5.5)和25.0mL SWFI中，然后将0.2mL的25％正常人血清白蛋白(Buminate)溶液稀释于混合物中并涡旋30秒来制备酶稀释剂溶液。这在使用前2小时之内进行，并且在冰上保存直至需要。将样品稀释至估计的1-2U/mL。通常，每步的最大稀释不超过1∶100，并且第一稀释的初始样品大小不少于20μL。进行测定所需的最小样品体积为：过程中样品，FPLC组分：80μL；组织培养上清：1mL；浓缩物质80μL；纯化或最终步骤物质：80μL。在低蛋白结合的96孔板中一式三份进行稀释，并且将30μL每种稀释物转移至Optilux黑色/透明底板(BD BioSciences)。
在酶稀释剂溶液中制备浓度为2.5U/mL的已知可溶性rHuPH20的稀释物以产生标准曲线，并且一式三份加入Optilux板。稀释物包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL和2.5U/mL。在板中包括含有60μL酶稀释剂溶液的“试剂空白”孔作为阴性对照。然后盖上板并且在加热块上于37℃下加热5分钟。去除盖并且将板摇动10秒。摇动之后，将板放回加热块，并且向MULTIDROP 384液体处理装置注入热的0.25mg/mL透明质酸钠溶液(通过将100mg透明质酸钠(LifeCoreBiomedical)溶于20.0mL SWFI来制备。通过在2-8℃下轻轻旋转和/或摆动2-4小时来混合，或者直至完全溶解)。将反应板转移至MULTIDROP 384并且通过按下启动键将30μL透明质酸钠分入每孔来启动反应。然后将板从MULTIDROP 384取出并摇动10秒，再转移至加热块并更换板盖。将板在37℃下孵育10分钟。
通过向机器注入血清工作液并将体积设置变为240μL来使MULTIDROP 384终止反应。(75mL的500mM乙酸缓冲液中的25mL血清贮存液[用9体积500mM乙酸缓冲液稀释1体积马血清(Sigma)并用盐酸将pH调至3.1])。将板从加热块取出并放置在MULTIDROP 384上，然后将240μL血清工作液分入孔中。将板取出并且在酶标仪上摇动10秒。在另外的15分钟后，在640nm下测量样品的浊度，并且通过拟合至标准曲线来确定每个样品的透明质酸酶活性(U/mL)。
通过用透明质酸酶活性(U/ml)除以蛋白浓度(mg/mL)来计算特异性活性(单位/mg)。
实施例13 Gen1人sPH20的生产和纯化
A.5L生物反应器方法
将小瓶的3D35M解冻并且在补充了100nM甲氨蝶呤和GlutaMAXTM-1(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad Calif.)中从摇瓶扩大至1L转瓶。将细胞从转瓶转移至5L生物反应器(Braun)，接种密度为4×105活细胞/ml。参数为温度设定值37℃、pH 7.2(起始设定值)与溶解氧设定值25％和0-100cc/min的空气覆盖。在168hr，加入250ml补料(Feed)#1培养基(含有50g/L葡萄糖的CD CHO)。在216小时，加入250ml补料#2培养基(含有50g/L葡萄糖和10mM丁酸钠的CD CHO)，并且在264小时加入250ml补料#2培养基。该方法导致1600单位/ml的最终生产力与6×106个细胞/ml的最大细胞密度。丁酸钠的加入是为了在生产的最后阶段显著提高可溶性rHuPH20的产生。
通过深层过滤和切向流渗滤至10mM Hepes pH 7.0来净化3D35M克隆的条件培养基。然后通过在Q琼脂糖(Pharmacia)离子交换、苯基琼脂糖(Pharmacia)疏水相互作用层析、苯基硼酸酯(Prometics)和羟基磷灰石(Hydroxapatite)层析(Biorad，Richmond，CA)上顺序层析来纯化可溶性rHuPH20。
可溶性rHuPH20结合至Q琼脂糖，并且在相同缓冲液中以400mMNaCl洗脱。将洗脱物用2M硫酸铵稀释至终浓度为500mM硫酸铵，并且通过苯基琼脂糖(低取代)柱，然后在相同条件下结合至苯基硼酸酯树脂。于pH 9.0下在无硫酸铵的50mM N-二甘氨酸中洗涤之后，在Hepes pH 6.9中将可溶性rHuPH20从苯基琼脂糖树脂洗脱。于pH 6.9下在5mM磷酸钾和1mM CaCl2中将洗脱物装入陶瓷羟基磷灰石树脂，并且用80mM磷酸钾，pH 7.4与0.1mM CaCl2洗脱。
通过利用USP参考标准品的微浊度法(实施例12)，所得的纯化的可溶性rHuPH20具有超过65,000USP单位/mg蛋白的特异性活性。用0.1％TFA/H2O和0.1％TFA/90％乙腈/10％H20之间的梯度使纯化的sPH20从Pharmacia 5RPC苯乙烯二乙烯苯柱作为24-26分钟的单峰洗脱，并且通过SDS电泳分辨为单个宽的61kDa条带，用PNGASE-F处理后减少为细的51kDa条带。N端氨基酸测序显示前导肽已被有效去除。
B.上游细胞培养扩大至100L生物反应器细胞培养的方法
将放大方法分别用于从4个不同小瓶的3D35M细胞纯化可溶性rHuPH20以产生4个单独批次的sHuPH20：HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C和HUA0420C。将每个小瓶分别扩大和培养至125L生物反应器，然后利用柱层析纯化。在整个过程中采集样品以评价诸如酶收率这样的参数。以下提供的方法的描述显示了这样的事物的代表性规格，如生物反应器起始和补料培养基体积，转移细胞密度以及洗涤和洗脱体积。确切数字随每批次略有不同，并且在表24-30中详细说明。
将4个小瓶的3D35M细胞在37℃水浴中解冻，加入含有100nM甲氨蝶呤和40mL/L GlutaMAX的CD CHO并且将细胞离心。用20mL新鲜培养基将细胞重悬在125mL摇瓶中，并且放置在37℃、7％CO2培养箱中。在125mL摇瓶中将细胞放大至40mL。当细胞密度达到1.5-2.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至125mL转瓶，培养体积为100mL。将瓶在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到1.5-2.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至250mL转瓶，培养体积为200mL，并且将瓶在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到1.5-2.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至1L转瓶，培养体积为800mL，并且在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到1.5-2.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至6L转瓶，培养体积为5L，并且在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到1.5-2.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至36L转瓶，培养体积为20L，并且在37℃、7％CO2下培养。
用121℃、20PSI的蒸汽将125L反应器灭菌，并加入65L CD CHO培养基。使用之前，检查反应器的污染。当36L转瓶中的细胞密度达到1.8-2.5x106个细胞/mL时，将20L细胞培养物从36L转瓶转移至125L生物反应器(Braun)，结果是终体积为85L并且接种密度为约4×105个细胞/mL。参数为温度设定值，37℃；pH：7.2；溶解氧：25％±10％；叶轮转速50rpm；容器压力3psi；空气喷雾1L/min；空气覆盖：1L/min。反应器每天取样用于细胞计数、pH校准、培养基分析、蛋白生产和保留。在运行中加入营养补料。在第6天，加入3.4L补料#1培养基(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1)，并且将培养温度变为36.5℃。在第9天，加入3.5L补料#2(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为36℃。在第11天，加入3.7L补料#3(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为35.5℃。在第14天或者当细胞成活力降至低于50％时收获反应器。所述方法导致产生酶促活性为1600单位/ml与最大细胞密度为8×106个细胞/mL的可溶性rHuPH20。在收获时，将培养物取样以用于体外和体内支原体、生物负荷(bioburden)、内毒素和病毒，病毒颗粒的透射电镜术(TEM)以及酶活性。
通过连续的具有聚醚砜培养基的一次性囊式滤器(Sartorius)来过滤100升生物反应器细胞培养收获物：首先通过8.0μm深囊、0.65μm深囊、0.22μm囊，然后最终通过0.22μm Sartopore 2000cm2滤器并进入100L无菌储存袋。用2个有螺旋聚醚砜30kDa MWCO滤器的TFF(Millipore)将培养物浓缩10×，然后用10mM HEPES、25mM Na2SO4，pH 7.0进行6×缓冲液交换至0.22μm最终滤器，并进入20L无菌储存袋。表19提供了与细胞培养、收获、浓缩和缓冲液交换步骤有关的监测数据。
Figure BPA00001417846501241
准备Q琼脂糖(Pharmacia)离子交换柱(3L树脂，高＝20cm，直径＝14cm)。收集洗涤样品用于pH测定、电导率和内毒素(LAL)测定。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4，pH 7.5平衡柱。将浓缩、渗滤的收获物以100cm/hr的流速装至Q柱。用5个柱体积的10mM Tris、20mMNa2SO4，pH 7.5和10mM Hepes、50mM NaCl，pH 7.0洗涤柱。用10mMHepes、400mM NaCl，pH 7.0洗脱蛋白，并且通过0.22μm最终滤器过滤至无菌袋。
然后进行苯基-琼脂糖(Pharmacia)疏水相互作用层析。准备苯基-琼脂糖(PS)柱(9.1L树脂，高＝29cm，直径＝20cm)。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2，pH 7.0平衡柱。向来自以上的蛋白洗脱物补充2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl2贮存液至终浓度分别为5mM、0.5M和0.1mM。将蛋白以100cm/hr的流速装至PS柱。以100cm/hr加入5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2pH 7.0。使流穿液通过0.22μm最终滤器至无菌袋。
将PS纯化的蛋白装入已用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡的氨基苯基硼酸酯柱(ProMedics)(6.3L树脂，高＝20cm，直径＝20cm)。使蛋白以100cm/hr的流速通过柱，并且用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤柱。然后用20mM N-二甘氨酸、100mM NaCl，pH 9.0洗涤柱，并且使用50mM Hepes、100mM NaCl pH 6.9洗脱的蛋白通过无菌滤器并进入20L无菌袋。测试洗脱物的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl2pH 7.0平衡羟基磷灰石(HAP)柱(BioRad)(1.6L树脂，高＝10cm，直径＝14cm)。收集洗涤样品并测试pH、电导率和内毒素(LAL测定)。向氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白补充磷酸钾和CaCl2以获得终浓度5mM磷酸钾和0.1mM CaCl2，并且以100cm/hr的流速装入HAP柱。用5mM磷酸钾pH 7.0、100mM NaCl、0.1mMCaCl2然后用10mM磷酸钾pH 7.0、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 pH洗涤柱。用70mM磷酸钾pH 7.0洗脱蛋白，并且通过0.22μm滤器过滤至5L无菌储存袋。测试洗脱物的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
然后通过压力罐将HAP-纯化的蛋白泵过20nM病毒去除滤器。将蛋白加入DV20压力罐和滤器(Pall Corporation)，通过具有20nm孔的UltiporDV20滤器(Pall Corporation)至无菌的20L储存袋。测试滤液的蛋白浓度，酶活性，寡糖、单糖和唾液酸谱以及方法相关杂质。然后利用10kD分子量截止(MWCO)Sartocon Slice切向流过过滤(TFF)系统(Sartorius)将滤液中的蛋白浓缩至1mg/mL。首先通过用Hepes/盐水溶液(10mM Hepes、130mMNaCl，pH 7.0)洗涤来准备膜，并且采样渗透物的pH和电导率。在浓缩之后，将浓缩的蛋白采样并测试蛋白浓度和酶活性。对浓缩的蛋白进行6×缓冲液交换至最终缓冲液：10mM Hepes、130mM NaCl，pH 7.0。使浓缩的蛋白通过0.22μm滤器至20L无菌储存袋。将蛋白采样并测试蛋白浓度、酶活性、游离巯基、寡糖谱和摩尔渗透压浓度。
表20-26提供了每个3D35M细胞批的上述每个纯化步骤的相关监测数据。
Figure BPA00001417846501251
Figure BPA00001417846501261
在无菌条件下将纯化和浓缩的可溶性rHuPH20蛋白装入填充体积为5mL和1mL的无菌小瓶。使蛋白通过0.22μm滤器至利用重量读数来填充小瓶的操作员控制的泵。用瓶塞盖上小瓶，并且用卷边盖(crimped cap)密封。视觉检查盖上的小瓶的外来颗粒然后标记。标记之后，通过在液氮中浸没不超过1分钟来速冻小瓶并保存在≤-15℃(-20±5℃)。
实施例14 产生含有可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞
使实施例13所述的Gen1 3D35M细胞系适应更高的甲氨蝶呤水平以产生世代2(Gen2)克隆。将3D35M细胞从建立的含有甲氨蝶呤的培养物接种至含有4mM GlutaMAX-1TM和1.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基。通过使细胞在37℃、7％CO2的加湿培养箱中生长，并且在46天的时间内传代9次来适应更高的甲氨蝶呤水平。在含有具有2.0μM甲氨蝶呤的培养基的96孔组织培养板中通过有限稀释来克隆出扩增的细胞群。在约4周后，鉴定克隆并选择克隆3E10B用于扩大。使3E10B细胞在含有4mMGlutaMAX-1TM和2.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中生长20代。生成了3E10B细胞系的主细胞库(MCB)并冻存，并且用于后续研究。
通过在含有4mM GlutaMAX-1TM和4.0μM甲氨蝶呤的CD CHO细胞中培养3E10B细胞来继续扩增细胞系。在第12代后，将细胞冻存在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。将一小瓶RCB解冻，并在含有8.0μM甲氨蝶呤的培养基中培养。5天之后，将培养基中的甲氨蝶呤浓度增加至16.0μM，然后在18天后增加至20.0μM。在含有CD CHO培养基的96孔组织培养板中，通过有限稀释来克隆出含有20.0μM甲氨蝶呤的培养基中的第8代细胞，所述CD CHO培养基含有4mM GlutaMAX-1TM和20.0μM甲氨蝶呤。5-6周后鉴定克隆并选择克隆2B2在含有20.0μM甲氨蝶呤的培养基中扩大。在第11代后，将2B2细胞冻存在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。
所得的2B2细胞为表达可溶性重组人PH20(rHuPH20)的二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr-)DG44 CHO细胞。可溶性PH20在2B2细胞中以约206拷贝/细胞的拷贝数存在。利用rHuPH20特异性探针的Spe I-、Xba I-和BamHI/Hind III-消化的2B2细胞基因组DNA的DNA印迹分析显示以下限制酶切消化谱：用Spe I消化的DNA具有1条～7.7kb的主要杂交带和4条次要杂交带(～13.9、～6.6、～5.7和～4.6kb)；用Xba I消化的DNA具有1条～5.0kb的主要杂交带和2条次要杂交带(～13.9和～6.5kb)；并且用BamH I/Hind III消化的2B2 DNA观察到单独1条～1.4kb的杂交带。mRNA转录物的序列分析显示衍生的cDNA(SEQ ID NO：139)与参考序列(SEQ ID NO：110)相同，除了在位置1131处观察到的胸腺嘧啶核苷(T)代替预期的胞嘧啶(C)的一个碱基对不同。这是沉默突变，对氨基酸序列没有影响。
实施例15
A.在300L生物反应器细胞培养中生产Gen2可溶性rHuPH20
将小瓶的HZ24-2B2解冻并且在补充了20μM甲氨蝶呤和GlutaMAX-1TM(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中从摇瓶扩大至36L转瓶。简单地说，将小瓶细胞在37℃水浴中解冻，加入培养基并将细胞离心。用20mL新鲜培养基将细胞重悬在125mL摇瓶中并放置在37℃、7％CO2的培养箱中。在125mL摇瓶中将细胞扩大至40mL。当细胞密度达到大于1.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至125mL转瓶，培养体积为100mL。将瓶在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到大于1.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至250mL转瓶，培养体积为200mL，并且将瓶在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到大于1.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至1L转瓶，培养体积为800mL，并且在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到大于1.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至6L转瓶，培养体积为5000mL，并且在37℃、7％CO2下培养。当细胞密度达到大于1.5x106个细胞/mL时，将培养物扩大至36L转瓶，培养体积为32L，并且在37℃、7％CO2下培养。
将400L反应器灭菌并加入230mL CD-CHO培养基。使用之前，检查反应器的污染。将约30L细胞从36L转瓶转移至400L生物反应器(Braun)，接种密度为4.0×105个活细胞/ml，并且总体积为260L。参数为温度设定值，37℃；叶轮转速40-55RPM；容器压力：3psi；空气喷雾0.5-1.5L/Min；空气覆盖：3L/min。反应器每天取样用于细胞计数、pH校准、培养基分析、蛋白生产和保留。此外，在运行期间加入营养补料。在120hr(第5天)，加入10.4L补料#1培养基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/LGlutamax-1TM+83mL/L酵母粉(Yeastolate)+33mg/L重组人胰岛素(rHuInsulin))。在168小时(第7天)，加入10.8L补料#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L Glutamax-1TM+167mL/L酵母粉+0.92g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为36.5℃。在216小时(第9天)，加入10.8L补料#3(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母粉+1.80g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为36℃。在264小时(第11天)，加入10.8L补料#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母粉+0.92g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为35.5℃。观察到补料培养基的加入在生产的最后阶段显著增加了可溶性rHuPH20的生产。在第14或15天或者当细胞成活力降至低于40％时收获反应器。所述方法导致17,000单位/ml的最终生产力与1.2×107个细胞/mL的最大细胞密度。在收获时，将培养物取样以用于体外和体内支原体、生物负荷、内毒素和病毒，透射电镜术(TEM)以及酶活性。
通过蠕动泵将培养物泵过4个平行的Millistak过滤系统模块(Millipore)，每个含有一层分级至4-8μm的硅藻土和一层分级至1.4-1.1μm的硅藻土，随后为纤维素膜；然后通过第二单一Millistak过滤系统(Millipore)，其含有一层分级至0.4-0.11μm的硅藻土和一层分级至＜0.1μm的硅藻土，随后为纤维素膜；然后通过0.22μm最终滤器至容量为350L的单次使用无菌软袋。向收获的细胞培养液补充10mM EDTA和10mMTris至pH为7.5。利用4个Sartoslice TFF 30kDa分子量截止(MWCO)聚醚砜(PES)滤器(Sartorious)，用切向流过过滤(TFF)装置，将培养物浓缩10×，然后与10mM Tris、20mM Na2SO4，pH 7.5进行10×缓冲液交换至0.22μm最终滤器并进入50L无菌储存袋。
将浓缩、渗滤的收获物灭活病毒。在病毒灭活之前，准备10％Triton
Figure BPA00001417846501301
X-100、3％磷酸三(正丁)酯(TNBP)的溶液。就在Q柱上的纯化之前，将浓缩、渗滤的收获物在36L玻璃反应容器中暴露于1％Triton
Figure BPA00001417846501302
 X-100、0.3％TNBP 1小时。
B.Gen2可溶性rHuPH20的纯化
准备Q琼脂糖(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂，H＝29cm，D＝20cm)。收集洗涤样品用于pH、电导率的测定和内毒素(LAL)测定。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4，pH 7.5平衡柱。病毒灭活之后，将浓缩、渗滤的收获物以100cm/hr的流速装至Q柱。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4，pH 7.5和10mM Hepes、50mM NaCl，pH7.0洗涤柱。用10mM Hepes、400mM NaCl，pH 7.0将蛋白洗脱至0.22μm最终滤器并进入无菌袋。测试洗脱物样品的生物负荷、蛋白浓度和透明质酸酶活性。在交换的开始和结束读取A280吸光度读数。
然后进行苯基-琼脂糖(Pharmacia)疏水相互作用层析。准备苯基-琼脂糖(PS)柱(19-21L树脂，H＝29cm，D＝30cm)。收集洗涤液并采样pH、电导率和内毒素(LAL测定)。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2，pH 7.0平衡柱。向来自Q琼脂糖柱的蛋白洗脱物补充2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl2贮存液以分别获得5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。将蛋白以100cm/hr的流速装至PS柱并收集柱流穿液(flow thru)。用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2 pH 7.0以100cm/hr洗涤柱，然后将洗涤液加入收集的流穿液。使与柱洗涤液合并的流穿液通过0.22μm最终滤器至无菌袋。采样流穿液的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
准备氨基苯基硼酸酯柱(Prometics)。收集洗涤液并采样pH、电导率和内毒素(LAL测定)。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡柱。将含有纯化的蛋白的PS流穿液以100cm/hr的流速装至氨基苯基硼酸酯柱。用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤柱。用20mM N-二甘氨酸、0.5M硫酸铵，pH 9.0洗涤柱。用20mM N-二甘氨酸、100mM氯化钠，pH9.0洗涤柱。用50mM Hepes、100mM NaCl，pH 6.9洗脱蛋白并通过无菌滤器至无菌袋。测试洗脱样品的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
准备羟基磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液并测试pH、电导率和内毒素(LAL测定)。用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl2，pH 7.0平衡柱。向氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白补充至终浓度为5mM磷酸钾和0.1mM CaCl2，并且以100cm/hr的流速装至HAP柱。用5mM磷酸钾，pH 7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗涤柱。然后用10mM磷酸钾，pH 7、100mMNaCl、0.1mM CaCl2洗涤柱。用70mM磷酸钾，pH 7.0洗脱蛋白并通过0.22μm无菌滤器至无菌袋。测试洗脱样品的生物负荷、蛋白浓度和酶活性。
然后使HAP纯化的蛋白通过病毒去除滤器。首先通过用2L的70mM磷酸钾，pH 7.0洗涤来准备无菌的Viosart滤器(Sartorius)。使用之前，采样过滤的缓冲液的pH和电导率。通过蠕动泵将HAP纯化的蛋白泵过20nM病毒去除滤器。使70mM磷酸钾，pH 7.0中的过滤的蛋白通过0.22μm最终滤器至无菌袋。测试病毒过滤的样品的蛋白浓度，酶活性，寡糖、单糖和唾液酸谱。还测试样品的方法相关杂质。
然后利用10kD分子量截止(MWCO)Sartocon Slice切向流过过滤(TFF)系统(Sartorius)，将滤液中的蛋白浓缩至10mg/mL。首先通过用10mM组氨酸、130mM NaCl，pH 6.0洗涤来准备滤器，并且采样渗透物的pH和电导率。浓缩之后，将浓缩的蛋白采样并测试蛋白浓度和酶活性。对浓缩的蛋白进行6×缓冲液交换至最终缓冲液：10mM组氨酸、130mM NaCl，pH6.0。缓冲液交换之后，使浓缩的蛋白通过0.22μm最终滤器至20L无菌储存袋。将蛋白采样并测试蛋白浓度、酶活性、游离巯基、寡糖谱和摩尔渗透压浓度。
然后在无菌条件下将大量无菌过滤的蛋白以20mL分装至30mL无菌特氟隆小瓶(Nalgene)中。然后将小瓶速冻并储存在-20±5℃。
C.Gen1可溶性rHuPH20和Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化的比较
300L生物反应器细胞培养中的Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化与100L生物反应器细胞培养中的Gen1可溶性rHuPH20的生产和纯化(实施例13B所述)相比在方案中有一些变化。表27示出了方法之间除了简单的规模扩大变化之外的示例性差异。
Figure BPA00001417846501321
Figure BPA00001417846501331
实施例16 唾液酸和单糖含量的测定
可以通过用三氟乙酸水解之后的反相液相层析(RPLC)来评价可溶性rHuPH20的唾液酸和单糖含量。在一实例中，测定了纯化的透明质酸酶批#HUB0701E(1.2mg/mL；基本上如实施例15所述生产和纯化)的唾液酸和单糖含量。简单地说，用40％(v/v)三氟乙酸在100℃下将100μg样品水解4小时，一式两份。水解之后，将样品干燥并重悬于300μL水中。将来自每个重悬样品的45μL等份转移至新管并干燥，并且每管加入10μL的10mg/mL乙酸钠溶液。通过加入50μL甲醇中的含有30mg/mL 2-氨基苯甲酸、20mg/mL氰基硼氢化钠、约40mg/mL乙酸钠和20mg/mL硼酸的溶液来荧光标记释放的单糖。将混合物在80℃下避光孵育30分钟。通过加入440μL流动相A(0.2％(v/v)正丁胺、0.5％(v/v)磷酸、1％(v/v)四氢呋喃)来终止衍生反应。还将水的基质空白如对透明质酸酶样品所述进行水解和衍生作为阴性对照。利用十八烷基(C18)反相柱(4.6x250mm，5μm粒径；J.T.Baker)，通过RPLC将释放的单糖分离并通过荧光检测(360nm激发，425nm发射)来监测。通过将透明质酸酶样品的层析谱与包括N-D-葡糖胺(GlcN)、N-D-半乳糖胺(GalN)、半乳糖、岩藻糖和甘露糖的单糖标准品的层析谱比较来定量单糖含量。表28示出了每透明质酸酶分子的每种单糖的摩尔比。
*GalN结果低于检测限制。
实施例17 来自3D35M和2B2细胞的可溶性rHuPH20的C端异质性
对从100L生物反应器体积中的3D35M细胞(批HUA0505MA)和300L生物反应器体积中的2B2细胞(批HUB0701EB)生产和纯化的两批sHuPH20进行C端测序。用特异性切割天冬氨酸和半胱磺酸N端肽键的内切蛋白酶(endoproteinase)Asp-N分别消化两批蛋白。这在位于SEQ ID NO：122的位置431处的天冬氨酸释放了可溶性rHuPH20的C端部分。分离C端片段并进行表征以确定批HUA0505MA和批HUB0701EB中每个群的序列和丰度。
观察到来自3D35M细胞和2B2细胞的可溶性rHuPH20制品表现出异质性，并且在它们的C端序列中含有各不相同的多肽(表30和31)。这种异质性可能是在生产和纯化过程中细胞培养基或其他溶液中所存在的肽酶C端切割表达的447个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：122)的结果。可溶性rHuPH20制品中的多肽具有对应SEQ ID NO：122所示的可溶性rHuPH20序列的氨基酸1-447、1-446、1-445、1-444和1-443的氨基酸序列。这些多肽中每个的完整氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：122-126。如表29和30所示，来自3D35M细胞和2B2细胞的可溶性rHuPH20制品中每种多肽的丰度是不同的。
Figure BPA00001417846501351
因为修饰对于本领域技术人员是显而易见的，所以本发明仅受所附权利要求范围的限制。
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Claims (69)

1.一种延长的可溶性PH20透明质酸酶(esPH20)。
2.如权利要求1所述的esPH20，其是N-糖基化、N-部分糖基化或去糖基化的。
3.如权利要求1或2所述的esPH20，其中所述N-部分糖基化的多肽包含至少一个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少3个天冬酰胺(N)残基的每一个。
4.如权利要求3所述的esPH20，其中所述3个天冬酰胺残基为SEQ IDNO：107的氨基酸残基235、368和393或对应SEQ ID NO：107的氨基酸残基235、368和393的残基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的esPH20，其选自：
多肽，其由SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列组成；或者
多肽，其在SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的多肽由与SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示的相应氨基酸序列具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列组成。
6.如权利要求1-5中任一项所述的esPH20，其在中性条件下是有活性的。
7.如权利要求1-5中任一项所述的esPH20，其为人esPH20。
8.如权利要求1-4中任一项所述的esPH20，其为黑猩猩esPH20。
9.如权利要求5所述的esPH20，其由SEQ ID NO：60-63和102-104中任一个所示的氨基酸序列组成。
10.如权利要求1-4中任一项所述的esPH20，其选自：
多肽，其由SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499或36-500所示的氨基酸序列组成；或者
多肽，其在SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499或36-500所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的多肽由与SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499或36-500所示的相应氨基酸序列具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列组成。
11.如权利要求10所述的esPH20，其由SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499或36-500所示的氨基酸序列组成。
12.一种截短的PH20透明质酸酶，其由SEQ ID NO：107的氨基酸1-465、1-491、1-492、1-493、1-494、1-495、1-496、1-497、1-498、1-499或1-500所示的氨基酸序列组成；或者
在SEQ ID NO：107的氨基酸1-465、1-491、1-492、1-493、1-494、1-495、1-496、1-497、1-498、1-499或1-500所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的PH20透明质酸酶由与SEQ ID NO：107的氨基酸1-465、1-491、1-492、1-493、1-494、1-495、1-496、1-497、1-498、1-499或1-500所示的氨基酸序列具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列组成。
13.一种截短的PH20透明质酸酶，其由SEQ ID NO：107的氨基酸36-465、36-484、36-485、36-486、36-487、36-488或36-489所示的氨基酸序列组成；或者在SEQ ID NO：107的氨基酸36-465、36-484、36-485、36-486、36-487、36-488或36-489所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的PH20透明质酸酶由与SEQ ID NO：107的氨基酸36-465、36-484、36-485、36-486、36-487、36-488或36-489所示的氨基酸序列具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列组成。
14.如权利要求12或13所述的PH20，其是N-糖基化、N-部分糖基化或去糖基化的。
15.如权利要求12-14中任一项所述的PH20，其在中性条件下是有活性的。
16.一种截短的PH20透明质酸酶糖蛋白，其由SEQ ID NO：55-106中任一个所示的氨基酸序列组成；或者在SEQ ID NO：55-106中任一个所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的PH20透明质酸酶由与SEQ ID NO：55-106中任一个所示的氨基酸序列具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列组成，其中所述PH20透明质酸酶糖蛋白是N-糖基化的，但是在对应SEQ ID NO：107的氨基酸残基82、166或254的一个或多个氨基酸残基处是未糖基化的。
17.如权利要求16所述的PH20，其包含至少一个N-乙酰葡糖胺部分，所述N-乙酰葡糖胺部分连接至至少3个天冬酰胺(N)残基的每一个。
18.如权利要求17所述的PH20，其中所述3个天冬酰胺残基为SEQ IDNO：107的氨基酸残基235、368和393或对应SEQ ID NO：107的氨基酸残基235、368和393的残基。
19.如权利要求16-18中任一项所述的PH20，其在中性条件下是有活性的。
20.如权利要求16-19中任一项所述的PH20，其是可溶的。
21.如权利要求16-20中任一项所述的PH20，其中所述PH20选自人、黑猩猩、恒河猴和食蟹猴。
22.如权利要求1-21中任一项所述的esPH20或PH20，其被选自唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧基化、羟基化和磷酸化的修饰作用修饰。
23.如权利要求1-21中任一项所述的esPH20或PH20，其被聚合物修饰。
24.如权利要求23所述的esPH20或PH20，其中所述聚合物为葡聚糖或PEG。
25.一种PH20透明质酸酶糖蛋白，其包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列或其截短的在中性条件下是有活性的形式，或者包含与SEQ IDNO：107所示的氨基酸序列具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列或其截短形式，其中所述PH20透明质酸酶糖蛋白是N-糖基化的，但是在对应SEQ ID NO：107的氨基酸残基82、166或254的一个或多个氨基酸残基处是未糖基化的。
26.如权利要求1-25中任一项所述的esPH20或PH20，其中所述多肽被修饰以在人中具有与未修饰的多肽相比降低的免疫原性。
27.如权利要求26所述的esPH20或PH20，其中一级序列被改变以消除促成抗原性的表位。
28.如权利要求1-25中任一项所述的esPH20或PH20，其中所述多肽通过在不双岩藻糖基化所述多肽的宿主细胞中表达来产生。
29.如权利要求28所述的esPH20或PH20，其中所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞或哺乳动物化的昆虫细胞表达系统。
30.如权利要求1-25中任一项所述的esPH20或PH20，其是未双岩藻糖基化的。
31.如权利要求1-30中任一项所述的esPH20或PH20，其是基本上纯化或分离的。
32.一种缀合物，其包含权利要求1-31中任一项所述的esPH20或PH20。
33.如权利要求32所述的缀合物，其中所述esPH20或PH20缀合至选自多聚化结构域、毒素、可检测标记或药物的部分。
34.如权利要求33所述的缀合物，其中所述esPH20或PH20缀合至Fc结构域。
35.如权利要求32所述的缀合物，其中所述esPH20或PH20缀合至聚合物。
36.如权利要求35所述的缀合物，其中所述聚合物为葡聚糖或PEG。
37.如权利要求32-36中任一项所述的缀合物，其中所述缀合的部分直接或通过接头连接至所述esPH20或PH20的C端或N端。
38.一种编码权利要求1-21中任一项所述的esPH20或PH20的核酸分子，其中所述核酸分子不编码全长PH20，但编码截短的PH20或编码esPH20。
39.一种表达载体，其包含由核苷酸序列组成的多核苷酸，所述核苷酸序列编码权利要求1-21中任一项所述的PH20或esPH20，并且每个核苷酸序列包含终止密码子或者终止密码子紧接在其后，可操作地插入所述载体以用于权利要求1-21中任一项所述的PH20或esPH20的表达。
40.如权利要求38或39所述的核酸分子，其编码esPH20多肽，所述esPH20多肽由SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499或36-500组成；或者编码多肽，所述多肽在SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499或36-500所示的氨基酸序列中含有氨基酸取代，由此所述氨基酸取代的esPH20多肽由与SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497、36-498、36-499或36-500所示的氨基酸序列具有至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列组成。
41.一种核酸分子，其为表达载体，所述核酸分子包含由SEQ ID NO：150-154、200-201和213-215中任一个所示的核苷酸序列或其简并序列组成的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含终止密码子以产生由SEQ ID NO：150-154、200-201和213-215中任一个所编码的截短的PH20或esPH20，其中所述多核苷酸可操作地连接用于表达以产生所述编码的截短的PH20或esPH20。
42.如权利要求38所述的核酸，其编码由SEQ ID NO：107的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496、36-497或36-498组成的esPH20。
43.一种载体，其包含权利要求38、40和42中任一项所述的核酸。
44.一种细胞，其包含权利要求39或43所述的载体或者权利要求38和40-42中任一项所述的核酸分子。
45.如权利要求44所述的细胞，其为CHO细胞。
46.一种组合物，其包含权利要求1-31中任一项所述的esPH20或PH20多肽。
47.一种组合物，其包含多种权利要求1-21中任一项所述的esPH20或PH20多肽。
48.一种组合物，其包含多种权利要求22-31中任一项所述的esPH20或PH20多肽。
49.如权利要求47所述的组合物，其中所述多种esPH20多肽由权利要求38和40-42中任一项所述的核酸分子或者权利要求39或43所述的载体编码。
50.如权利要求46-49中任一项所述的组合物，其中所述esPH20或PH20多肽从CHO细胞分泌。
51.如权利要求46-50中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
52.如权利要求51所述的组合物，其包含额外的治疗剂。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述治疗剂与所述组合物一起配制或配制在单独的组合物中。
54.如权利要求52或53所述的组合物，其中所述治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、杀变形虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗疟剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、和抗关节炎剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素能激动剂、α阻断剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀细菌剂、抑菌剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、心血管药剂、避孕剂、减充血剂、利尿剂、抑制剂、诊断剂、电解质剂、催眠剂、激素剂、升血糖剂、肌肉松弛剂、肌肉收缩剂、眼科剂、拟副交感神经剂、心力加强剂、镇静剂、拟交感神经剂、安定剂、泌尿剂、阴道剂、杀病毒剂、维生素剂、非类固醇抗炎剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白、核酸、药物、有机分子或睡眠诱导剂。
55.如权利要求52-54中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂选自抗体、免疫球蛋白、二膦酸盐、细胞因子、化疗剂和胰岛素。
56.如权利要求55所述的组合物，其中所述胰岛素为速效胰岛素，并且所述二膦酸盐为唑来膦酸。
57.一种用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的方法，其包括向个体给予权利要求1-31中任一项所述的esPH20或PH20或者权利要求46-56中任一项所述的组合物。
58.一种方法，其用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团、治疗增殖性病症、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度，所述方法包括向个体给予权利要求1-31中任一项所述的esPH20或PH20或者权利要求46-56中任一项所述的组合物。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述增殖性病症为良性前列腺增生。
60.如权利要求58所述的方法，或者如权利要求52-56中任一项所述的组合物，其中所述额外的治疗剂选自阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维A酸(9-顺式维生素A酸)；别嘌醇；六甲蜜胺；阿伏西地；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；安曲霉素；阿帕奇醌；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴诺蒽醌；巴他布林；巴马司他；活卡介苗；贝那昔滨；莱达莫司汀；莱佐替派；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；比生群；甲磺酸双奈法德；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡纳替尼；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀与聚苯丙生；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；施铂锭；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；达贝泊汀α；柔红霉素脂质体；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素-毒素连接物；右尼古地平；右奥马铂；右雷佐生；地扎呱宁；地吖醌；二溴螺氯铵；地诺孕素；地那林；地舍莫来；多西他赛；多非喹达；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射液；多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；艾特咔林；依氟鸟氨酸；依拉克达；依利奈法德；Elliott′s B Solution；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；恩扎啕林；依匹哌啶；表柔比星；阿法依泊汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福曲他明；氟维司群；加柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/奥佐米星；吉罗酚；吉马替康；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；醋酸戈舍瑞林；羟基脲；替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；吲地磺胺；英丙醌；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2和其他白介素(包括重组白介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；异丙铂；伊立替康；伊索拉定；伊沙匹隆；酮曲沙；L-阿拉诺新；兰瑞肽；拉帕替尼；来多蒽琼；来曲唑；亚叶酸；亮丙立德；亮丙瑞林(亮丙立德)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNU；洛莫司汀；氯那法尼；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美登素；氮芥；氮芥/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；MelphalanslL-PAM；美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6-巯嘌呤；美司钠；美替辛德；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨啶；美妥替哌；米铂；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；莫立替尼；麦考酚酸；苯丙酸南诺龙；奈达铂；奈拉滨；奈莫柔比星；尼曲吖啶；诺考达唑；诺莫单抗；诺拉霉素；诺拉曲塞；诺托生琼；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；奥他赛；奥替拉西；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；帕米膦酸；帕土匹龙；培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；吡利曲索；培美曲塞；奈莫司汀；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；吡铂；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；匹蒽醌；普来曲塞；普卡霉素光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟吩姆；紫菜霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；丙螺氯铵；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡唑呋林；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素；沙柔比星；沙芬戈；沙格司亭；沙铂；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；磷乙酰天冬氨酸；膦门冬酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；角鲨胺；链黑霉素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；6-TG；他地那兰；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；他立喹达；牛磺莫司汀；替可加兰；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；噻唑呋林；噻氯咪索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；托匹生琼；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743)；曲妥珠单抗；曲托龙；维A酸/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；四硝酸三铂；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗辛；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄链霉素A(胍甲环素)；折尼铂；亚苄维C[2-H]；净司他丁；唑来膦酸；佐柔比星和佐舒喹达。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述PH20或esPH20是聚乙二醇化的。
62.权利要求1-31中任一项所述的esPH20或PH20或者权利要求46-56中任一项所述的组合物在制备用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的药物中的用途。
63.一种药物组合物，其包含用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况的权利要求1-30中任一项所述的多肽。
64.如权利要求46-56中任一项所述的药物组合物，其用于治疗乙酰透明质酸相关疾病或疾病状况。
65.权利要求1-31中任一项所述的esPH20或PH20或者权利要求46-56中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团、治疗增殖性病症、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度。
66.如权利要求65所述的用途，其中所述增殖性病症为良性前列腺增生。
67.一种药物组合物，其包含权利要求1-31中任一项所述的多肽，所述药物组合物用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团、治疗增殖性病症、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度。
68.如权利要求46-56中任一项所述的药物组合物，其用于治疗糖胺聚糖过量、治疗肿瘤、治疗脑中糖胺聚糖积累、治疗心血管病症、治疗眼病症、治疗肺疾病、增加化疗剂对实体瘤的渗透、治疗皮下脂肪团、治疗增殖性病症、或者增加药物和其他治疗剂的生物利用度。
69.如权利要求67或68所述的药物组合物，其中所述增殖性病症为良性前列腺增生。
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