KR102687341B1 - 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법 - Google Patents

온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102687341B1
KR102687341B1 KR1020240047958A KR20240047958A KR102687341B1 KR 102687341 B1 KR102687341 B1 KR 102687341B1 KR 1020240047958 A KR1020240047958 A KR 1020240047958A KR 20240047958 A KR20240047958 A KR 20240047958A KR 102687341 B1 KR102687341 B1 KR 102687341B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hyaluronidase
culture
intact
producing
paragraph
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020240047958A
Other languages
English (en)
Inventor
임채영
김동환
김경식
변주영
오철우
박보영
Original Assignee
주식회사 휴온스랩
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 휴온스랩 filed Critical 주식회사 휴온스랩
Priority to KR1020240047958A priority Critical patent/KR102687341B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102687341B1 publication Critical patent/KR102687341B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연형 인간 재조합 히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20을 발현하는 숙주세포의 배양온도 또는 배지성분 조절을 통하여 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 천연형 인간 재조합 히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20을 발현하는 숙주세포의 배양온도, 배지종류, 첨가피드배지 성분, 용존산소 농도, 글루코오스 농도 및 pH 등의 조절을 통해 절단된 형태의 히알루로니다제 PH20이 아닌 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20을 고순도로 생산하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 생산된 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20은 높은 비활성도를 가지고 있으므로, 다양한 분야에 효과적으로 적용할 수 있다.

Description

온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법{METHOD FOR PRODUCING ORIGINAL FORM HYALURONIDASE}
본 발명은 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연형 인간 재조합 히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20을 발현하는 숙주세포의 배양온도 또는 배지성분 조절을 통하여 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20을 생산하는 방법에 관한 것이다.
히알루로니다제(hyaluronidase, HAdase)는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 저분자화하는 효소의 총칭이다. 히알루로니다제는 히알루론산을 가수분해하는 기작에 따라 포유류 형 히알루로니다제(Mammalian type, EC 3.2.1.35, hyaluronoglucosaminidase), 거머리 형 히알루로니다제(Leeches type, EC 3.2.1.36, hyaluronoglucuronidase) 및 박테리아 형 히알루로니다제(Bacterial type, EC 4.2.2.1, hyaluronate lyase)로 구분된다.
포유류형 히알루로니다제는 인체 내의 고환, 피부, 간, 태반 체액 등에 존재하여 히알루론산의 구성성분인 글루쿠론산과 글루코사민 사이의 β-1, 4 배당체 결합을 가수분해하여 사당류(tetrasaccharide)를 생성하거나, 우리 몸의 관절에 있는 활액 및 연골의 성분인 콘드로이틴, 콘드로이틴-4-황산, 콘드로이틴-6-황산을 가수분해하는 특징이 있다. 특히, 고환에서의 히알루로니다제(PH-20)는 정자의 첨체 부분의 글리코실포스파티딜이노시톨 고정부위(Glycosylphosphatidylinositol, GPI anchor)에 부착되어 있어, 난자 외부의 두꺼운 외벽층을 분해하여 수정을 일으키는 중요한 효소이다.
1950년대부터 히알루로니다제의 광범위한 사용에 대하여 포괄적으로 검토되었는데, 최초의 사용은 수액제의 피하 주입이었으며, 그 외의 정형외과, 안과, 성형외과, 치과, 구강외과, 부인과 및 이비인후과의 수술에서 국소 마취제 및 스테로이드의 확산을 증가시키기 위하여 침윤 및 차단 마취에 사용, 혈종과 같이 체액이 모인 것을 분산, 복막 유착의 방지, 결석 생성 방지 및 불임의 치료 등에 사용되고 있다.
현재 시판되고 있는 히알루로니다제는 양(Ovine)이나 소(Bovine)의 고환에서 추출하여 사용하고 있다. 이러한 예로는 비트라제(Vitrase, ISTA Pharmaceuticals, Ovine source), 암파다제(Amphadase, Amphastar Pharmaceuticals, Bovine source)등이 있으며, 이러한 가공되지 않은 히알루로니다제를 적정농도로 녹여 바이알에 충전하여 동결건조하는 방법으로 제품화하고 있다. 제품화된 동물 유래의 히알루로니다제에는 이물 단백질이 포함되어 있으며 따라서, 알러지 반응을 일으키는 원인이 될 수 있고, 시간에 따른 안정성의 저하로 인하여 생리활성이 감소하여 다양한 방면에 적용하기에는 많은 문제를 남기고 있었다.
이러한 문제점을 개선하기 위하여 재조합 히알루로니다제에 대한 연구가 진행되었다. 재조합단백질은 대장균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등 다양한 종류의 세포에서 발현할 수 있다. 특히, 히알루로니다제의 경우 단백질 번역 후 변형과정에서 이루어지는 당화가 활성에 영향을 미친다. 이는 글리칸이 당단백질의 항원성, 구조적 폴딩, 가용성 및 안정성에 대한 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 이러한 관점에 볼 때, 당화가 이루어지는 효모나 곤충 세포의 경우, 단백질번역 후 변형과정에서의 양상이 포유류와 다르기 때문에 여러 종류의 발현 세포 중 동물세포가 적합하고, 특히 동물 세포 중에서는 안전성이 확보된 CHO(Chinese Hamster Ovary)세포가 가장 적합하다.
최초의 PH20에 대한 재조합 히알루로니다제는 Halozyme Therapeutic의 상품명 Hylenex로 판매하고 있으며, 피하주사, 유리체절제술 및 안과 장애 등 다양한 용도로 개발 중에 있다. 하지만, 히알루로니다제는 여전히 수율이나 안정성이 낮고 수요에 비하여 공급이 낮아, 수율 또는 안정성이 향상된 히알루로니다제가 필요한 실정이다 (대한민국공개특허 제10-2023-0168902호; 대한민국등록특허 제10-2528707호).
종래의 기술에서 재조합 히알루로니다제의 생산 수율을 높이기 위해, 글루코오스 농도 조절 또는 배양 온도 조절을 통해 재조합 히알루로니다제의 N-glycan의함량을 변화시키는 제조방법이 공지된 바 있으나(대한민국공개특허 제10-2022-0018943), 상기 방법은 온전한 형태가 아닌 절단된 형태의 히알루로니다제가 생산되는 문제점이 있다.
이에, 본 발명에서는 절단된 형태의 히알루로니다제가 아닌 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산성을 증가시키기 위해 노력한 결과, 천연형 인간 재조합 히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20을 발현하는 숙주세포의 배양온도, 배지성분, 첨가피드배지 성분 등의 조절을 통해 온전한 형태의 히알루로니다제로니다제 PH20의 제조가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20을 발현하는 숙주세포의 배양온도 또는 배지성분 조절을 통한 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20 생산방법을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (1) 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20을 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 33 ~ 35℃에서 배양하는 단계; 및
(2) 배양 온도를 31 ~ 33℃으로 유지하면서 7 ~ 11일 동안 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH20 생산방법에 관한 것으로,
상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포는 Cell Boost 6 피드 배지가 첨가된 CD OptiCHO 배양 배지에서 배양하며,
상기 생산된 히알루로니다제 PH20은 절단된 형태가 아닌 50 ~ 75 kDa 크기의 온전한 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20은 55 ~ 65 kDa, 바람직하게는 58 ~ 63 kDa 크기일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 방법으로 생산된 히알루로니다제 PH20의 배양액에서의 활성은 4,000 unit/㎖ 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 Cell Boost 6 피드 배지는 1%(v/v) ~ 20%(v/v), 바람직하게는 1%(v/v) ~ 15%(v/v) 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 L-글루타민(L-Glutamine)을 추가로 첨가하여 배양할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 펩틴, 식물유래 가수분해물, 효모 추출물(Yeast Extract), 및 효모 가수분해물(Yeastolate)로 구성된 군에선 선택된 어느 하나의 성분이 첨가되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양은 (a) 배양액 용존산소량을 30% ~ 79%로 유지하는 배양; (b) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 1.11 ~ 5.95 g/ℓ로 유지하는 배양; 및 (c) 배양액의 pH를 7.0 ~ 7.4로 유지하는 배양;하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법(batch culture), 반복 회분 배양법(repeated batch culture), 유가 배양법(fed-batch culture), 반복 유가 배양법(repeated fed-batch culture), 연속 배양법(continuous culture) 및 관류 배양법(perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 방법을 생산된 히알루로니다제 PH20은 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 동물 세포(animal cell), 효모(yeast), 방선균(Actinomycetes) 또는 곤충 세포(insect cell)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 생산방법은 (3) 생산된 히알루로니다제 PH20을 분리 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계의 분리 정제는 PH20과의 친화력 결합, 이온결합 특성 및/또는 소수성 상호작용 특성을 이용하여 히알루로니다제 PH20을 고순도로 정제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 PH20의 분리 정제는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피(ion exchange-mixed mode chromatography)와 소수성 작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제 PH20의 생산방법으로 생산된 50 ~ 75 kDa 크기의 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20을 제공한다.
본 발명에서는 천연형 인간 재조합 히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20을 발현하는 숙주세포의 배양온도, 배지종류, 첨가피드배지 성분, 용존산소 농도, 글루코오스 농도 및 pH 등의 조절을 통해 절단된 형태의 히알루로니다제 PH20이 아닌 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20을 고순도로 생산하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 생산된 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20은 높은 비활성도를 가지고 있으므로, 다양한 분야에 효과적으로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 주요 배양 조건인 배양 온도, 온도 변경일에 따라 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 절단된 형태(분자량 표준품 37 ~ 49 kDa 사이) 또는 온전한 형태(분자량 표준품 50 ~ 75 kDa 사이) 발현 유무를 확인한 웨스턴 블랏 데이터이다.
도 1A는 기본 배치를 HyCell 배지로 진행하였을 때, 배양 온도(34, 37℃ → 32, 34, 37℃), 온도 변경일(3, 5, 7, 9일) 및 추가 피드(Feed C+, GlycanTune C+)에 따른 분석 결과이다.
도 1B는 기본 배치를 CD OptiCHO 배지로 진행하였을 때, 배양 온도(34, 37℃ → 32, 34, 37℃), 온도 변경일(3, 5, 7, 9일) 및 추가 피드(Feed C+, Cell Boost 6)에 따른 분석 결과이다.
도 2는 배양 첨가제 종류 및 피드 함량에 따라 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 절단된 형태 또는 온전한 형태 발현 유무를 확인한 웨스턴 블랏 데이터이다.
도 2A는 L-글루타민(L-Glutamine) 첨가제 존재 하에 Cell Boost 6 함량(3.75, 5, 7.5, 15 mM) 및 첨가일(0, 3, 6, 9일)에 따른 분석 결과이다.
도 2B는 GlutaMAX(4 mM) 첨가제 존재 하에 Cell Boost 6 함량(3.75, 5, 7.5, 15 mM) 및 첨가일(0, 3, 6, 9일)에 따른 분석 결과이다.
도 3은 펩톤(Peptone)을 배양 첨가물로 첨가하였을 때, 첨가 함량(3, 9%) 및 펩톤 종류(Yeast Extract, Select Phytone, TC Yeastolate, Cotton 200)에 따른 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 절단된 형태 또는 온전한 형태 발현 유무를 확인한 웨스턴 블랏 데이터이다.
도 4는 본 발명의 기본 배양 조건 및 배양일에 따른 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 절단된 형태 또는 온전한 형태 발현 유무를 확인한 웨스턴 블랏 데이터이다. 기본 배양 조건은 [CD OptiCHO + Cell Boost 6 (15%)] 및 [CD OptiCHO + Cell Boost 6 (15%) + TC Yeastolate (9%)]으로, 배양일은 12, 14, 16, 18 및 20일으로 설정하였다.
도 5는 최종 배양 조건의 (A) 배양일, (B) 배양 교반(agitation) 속도 및 (C) 배지 제형 차이에 따른 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 절단된 형태 또는 온전한 형태 발현 유무를 확인한 웨스턴 블랏 데이터이다.
도 6은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 정제 유속에 따른 제 1차 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다.
도 7은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 정제 유속에 따른 제 2차 친화 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다.
도 8은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 정제 유속에 따른 제 3차 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다.
도 9은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 정제 유속에 따른 제 4차 믹스 모드 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다.
도 10은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 정제 유속에 따른 제 5차 소수성 작용 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다.
도 11은 최종 정제공정을 통하여 얻은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20 산물의 웨스턴 블랏의 분석 결과이다.
도 12는 최종 정제공정을 통하여 얻은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20 산물의 SDS-PAGE의 분석 결과이다.
도 13은 최종 정제공정을 통하여 얻은 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20 산물의 크기배제 크로마토그래피의 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일관점에서, (1) 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20을 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 33 ~ 35℃에서 배양하는 단계; 및
(2) 배양 온도를 31 ~ 33℃으로 유지하면서 7 ~ 11일 동안 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH20 생산방법에 관한 것으로,
상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포는 Cell Boost 6 피드 배지가 첨가된 CD OptiCHO 배양 배지에서 배양하며,
상기 생산된 히알루로니다제 PH20은 절단된 형태가 아닌 50 ~ 75 kDa 크기의 온전한 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계에서 배양은 누적생존세포농도(Integral viable cell density)를 기준으로 0.3 x 106 ~ 13.1 x 106 cells x day/㎖까지 되도록 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20은 50 ~ 75 kDa 크기로, 바람직하게는 55 ~ 65 kDa, 보다 바람직하게는 58 ~ 63 kDa 크기(약 60 kDa)일 수 있다. 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산은 90%　이상, 바람직하게 95% 이상, 보다 바람직하게 97% 이상인 것으로, 절단된 형태(37 ~ 49 kDa)의　히알루로니다제 PH20이 실질적으로 관찰되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 CD OptiCHO 배양 배지(Gibco, 미국)는 첨가제(Glucose, Sodium Pyruvate, Sodium Bicarbonate) 및 무기염류(Magnesium, Sodium Phosphate)로 구성되며, Cell Boost 6(HyClone, 미국)은 지질(lipids), 아미노산(amino acids), 비타민(vitamins), 성장인자(growth factors) 등으로 구성된다. Cell Boost 6 피드 배지는 CD OptiCHO 배양 배지에 1%(v/v) ~ 20%(v/v), 바람직하게는 1%(v/v) ~ 15%(v/v) 농도로 첨가하여 배양할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "피드 배지"는 아미노산, 비타민, 염, 미량 원소, 지질 및 포도당 등의 특정 영양소 또는 복수의 영양소로 구성된 배지로서 기본 배지의 농축 산물일 수 있으며, 배양하는 세포에 따라 피드 배지의 구성 성분과 농도를 다양하게 제작하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게 Cell Boost Series supplement 배지(HyClone사, 미국)를 피드 배지로서 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 L-글루타민(L-Glutamine)을 추가로 첨가하여 배양할 수 있으며, 글루타민은 CD OptiCHO 배지에 2 ~ 6 mM 농도로, 보다 바람직하게는 3 ~ 5 mM 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20를 생산하기 위해, 상업화 배지 종류 및 배양 온도에 따른 최적 조건을 확립하고자 하였다. 그 결과, CD OptiCHO 배지 조건에서 초기 배양 온도가 34℃로 설정하고, 추가 피드로 Cell Boost 6를 첨가하는 경우, 배양 온도 변경일에 상관없이 PH20의 절단된 형태가 거의 관찰되지 않았다 (도 1). 또한, L-글루타민(L-Glutamine) 첨가에 따른 PH20의 절단된 형태 발현 정도의 큰 차이는 관찰되지 않았다 (도 2).
본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 펩틴, 식물유래 가수분해물, 효모 추출물(Yeast Extract), 및 효모 가수분해물(Yeastolate)로 구성된 군에선 선택된 어느 하나의 성분이 첨가되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 식물 유래의 가수분해물은 가든피, 목화씨, 또는 밀글루텐, 대두 등에서 추출된 산물을 말하며, 상업적으로 이용가능한 식물 유래 가수분해물에는, 예를 들면, Hy-Pea™7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504, HyPep™(이상 Kerry, 미국), Cotton 100, Cotton 200, Phytone™Soy 100(이상 Gibco, 미국) 등이 있다.
상기 펩톤, 식물 유래 가수분해물, 효모 추출물 또는 효모 가수분해물 등은 아미노산, 펩타이드, 비타민, 탄수화물, 뉴클레오티드, 미네랄, 기타성분이 풍부하게 함유되어 있어, 세포 배양 보충제 또는 첨가물로 많이 사용되고 있으나, 본 발명에서는 이들에 의해 절단된 형태의 히알루로니다제 PH20의 발현이 증가하는 것을 확인하였으므로, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20 생산에는 적합하지 않다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 첨가물로 다양한 유래의 펩틴 또는 TC 이스톨레이트(TC Yeastolate)를 첨가하였을 때, 모든 배양 조건에서 절단된 형태의 히알루로니다제 PH20이 발현되는 것을 확인하였다 (도 3).
본 발명에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양은 (a) 배양액 용존산소량을 30% ~ 79%로 유지하는 배양; (b) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 1.11 ~ 5.95 g/ℓ로 유지하는 배양; 및 (c) 배양액의 pH를 7.0 ~ 7.4로 유지하는 배양;하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양할 수 있다.
온전한 형태의 히알루로니다제 PH20을 생산하기 위해, 상기 배양액 용존산소량은 30% ~ 79%로 유지하면서 배양할 수 있으며, 바람직하게 30% ~ 50%, 보다 바람직하게는 30% ~ 35%로 유지하면서 배양할 수 있다.
배양액 내의 잔류 글루코오스 농도는 1.11 g/ℓ ~ 5.95 g/ℓ로, 바람직하게는 3.5 g/ℓ ~ 5.95 g/ℓ로 유지하면서 배양할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액의 용존산소량, 글루코오스 농도, 또는 pH를 유지하면서 배양한다는 의미는 배양 기간 동안 배양액 내의 용존산소량, 글루코오스 농도, 또는 pH를 매 1 ~ 36 시간, 바람직하게는 매 3 ~ 30 시간, 더욱 바람직하게는 매 6 ~ 24 시간으로 간격, 또는 실시간으로 측정하고, 설정된 기준 농도 이하일 경우 해당 기준 농도가 되도록 조절하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법(batch culture), 반복 회분 배양법(repeated batch culture), 유가 배양법(fed-batch culture), 반복 유가 배양법(repeated fed-batch culture), 연속 배양법(continuous culture) 및 관류 배양법(perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 "히알루로니다제 PH20" 또는 "PH20"은 천연형 PH20과 이의 성숙된 형태를 모두 포함하는 의미로 해석될 수 있으며, 상기 방법으로 생산된 히알루로니다제 PH20은 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 것일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 인간 유래의 "히알루로니다제 PH20" 또는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 당업계에 공지된 인간 유래의 히알루로니다제 PH20을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포는 동물 세포(animal cell), 효모(yeast), 방선균(Actinomycetes) 또는 곤충 세포(insect cell), 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
동물 세포는 포유동물 세포가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 CHO 세포, HEK 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 등 일반적으로 사용되고 있는 동물 배양 세포를 사용하고, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 또한, 원하는 단백질을 제조하기 위해서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr-CHO 세포(Proc Natl Acad Sci USA, 77:4216-4220, 1980)나 CHO K-1 세포(Proc Natl Acad Sci USA, 60:1275, 1968) 등 원하는 유전자를 도입하는 데에 적합한 세포인 것이 바람직하다. 상기 CHO 세포로는 특히, DG44 주, DXB-11 주, K-1 주 또는 CHO-S 주가 바람직하고, 숙주 세포로의 벡터의 도입은 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로 포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.
효모로는 사카로마이세스(Sacchromyces sp), 한세눌라(Hansenula sp), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 피키아(Pichia sp) 등이 예시될 수 있으며, 방선균으로는 스테렙토마이세스(Streptomyces) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생산방법은 (3) 생산된 히알루로니다제 PH20을 분리 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계의 분리 정제 단계를 통해 절단된 형태의 히알루로니다제 PH20이 완전히 제거될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계의 분리 정제는 히알루로니다제 PH20과의 친화력 결합, 이온결합 특성 및/또는 소수성 상호작용 특성을 이용하여 히알루로니다제 PH20을 고순도로 정제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PH20의 분리 정제는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피(ion exchange-mixed mode chromatography)와 소수성 작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 1 단계: 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피 -> 2단계: 친화크로마토그래피 -> 3 단계: 바이러스 불활성화 -> 4 단계: 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피 -> 5 단계: 믹스 모드 크로마토그래피 -> 6 단계: 소수성 작용 크로마토그래피 -> 7 단계: UF/DF 및 바이러스 여과를 통해 생산된 히알루로니다제 PH20을 정제하였으며, 정제된 히알루로니다제 PH20을 분석한 결과, 절단된 형태가 아닌 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20이 정제된 것을 확인하였다 (도 11 ~ 도 13).
본 발명은 다른 관점에서, 상기 히알루로니다제 PH20의 생산방법으로 생산된 50 ~ 75 kDa 크기의 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20에 관한 것이다.
본 발명에서는 절단된 형태가 아닌 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20을 고순도로 생산하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 생산된 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20은 높은 비활성도(≥85,000 unit/mg)를 가지고 있으므로, 다양한 분야에 효과적으로 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
상업화 배지, 첨가물 및 배양온도 탐색
천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20(서열번호 1)을 발현하는 숙주세포(DG44 CHO cell, SBA002)을 이용하여 최적 상업화 배지 및 배양온도를 탐색하였다.
상업화 배지는 CDM4CHO(GE Healthcare), HyCell CHO(GE Healthcare), EX-CELL CD CHO(Merck), PowerCHO-2 CD(Lonza), CD OptiCHO(Thermo Fisher Scientific), 및 CD CHO 022(JS Biosciences)를 사용하였으며, 배양온도는 34 ~ 37℃사이에서 숙주세포를 배양하였다.
첨가물은 Feed A+(Thermo Fisher Scientific), Feed B+(Thermo Fisher Scientific), Feed C+(Thermo Fisher Scientific), GlycanTune C+(Thermo Fisher Scientific), Cell Boost 6(HyClone), 및 CD Feed 002(Irvine Scientific)를 사용하였다.
배지 종류, 첨가물 및 배양 온도에 따른 세포 생존율
No. 배지 첨가물 배양 온도
(℃)		 배양일
(일)		 세포농도
(x 106 cell/㎖)
1 CDM4CHO Feed A+ 34 14 14.58
2 CDM4CHO Feed B+ 34 13 12.43
3 CDM4CHO Feed C+ 34 16 9.63
4 CDM4CHO GlycanTune C+ 34 16 8.21
5 HyCell CHO Feed A+ 34 16 29.76
6 HyCell CHO Feed B+ 34 16 27.72
7 HyCell CHO Feed C+ 34 16 25.08
8 HyCell CHO GlycanTune C+ 34 16 22.91
9 EX-CELL CD CHO Feed A+ 34 16 17.16
10 EX-CELL CD CHO Feed B+ 34 15 16.66
11 EX-CELL CD CHO Feed C+ 34 16 11.37
12 EX-CELL CD CHO GlycanTune C+ 34 16 10.74
13 PowerCHO-2 CD Cell Boost 6 34 12 18.87
14 CD OptiCHO Cell Boost 6 34 15 15.18
15 CD CHO 022 CD Feed 002 34 16 2.82
16 CDM4CHO Feed A+ 37 14 11.07
17 CDM4CHO Feed B+ 37 12 8.41
18 CDM4CHO Feed C+ 37 14 10.40
19 CDM4CHO GlycanTune C+ 37 16 5.46
20 HyCell CHO Feed A+ 37 14 24.99
21 HyCell CHO Feed B+ 37 14 26.28
22 HyCell CHO Feed C+ 37 14 21.40
23 HyCell CHO GlycanTune C+ 37 15 19.73
24 EX-CELL CD CHO Feed A+ 37 15 12.44
25 EX-CELL CD CHO Feed B+ 37 14 11.37
26 EX-CELL CD CHO Feed C+ 37 16 8.66
27 EX-CELL CD CHO GlycanTune C+ 37 14 7.01
28 PowerCHO-2 CD Cell Boost 6 37 11 25.24
29 CD OptiCHO Cell Boost 6 37 12 12.87
30 CD CHO 022 CD Feed 002 37 14 4.46
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 온도 조건에 따른 세포성장은 37℃보다 34℃에서 높은 것으로 확인되었으며, 배지 및 첨가물 조건에 따른 세포성장은 HyCell CHO(Feed C+ 또는 GlycanTune C+) 조건 및 CD OptiCHO(Cell Boost 6) 조건에서 가장 효과적인 것으로 나타났다.
상기 결과를 바탕으로 히알루로니다제 PH20 생산을 위한 배양 조합 후보 3종을 도출하였다:
1) CD OptiCHO + Cell Boost 6, 배양 시작 온도: 34℃
2) HyCell CHO + Feed C+, 배양 시작 온도: 34℃
3) HyCell CHO + GlycanTune C+, 배양 시작 온도: 34℃
최적 배지 및 배양 온도 변경 시기에 따른 히알루로니다제 PH20 생산
상기 <실시예 1>에서 도출한 배양 조합 후보 3종을 기반으로 도 1의 표와 같이 배양 온도 변경(shift) 시기에 따른 히알루로니다제 PH20 생산 정도를 확인하였다.
초기 세포접종 농도는 1.0 x 106 cell/㎖, 배양 규모는 50 ㎖ / 125 ㎖ 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)에서 진행하였으며, 세포 접종 방식은 288 x g에서 5분간 원심분리하여 모인 세포를 재부유 시켰다. 배양은 16일까지 진행하였으며, pH는 6.8 미만 시, 7.5% 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate) 스탁(stock)을 1% 첨가하여 보정하였다. 글루코오스(Glucose)는 함량이 20 mmol/ℓ 이하 일 때, 45% D-(+)-glucose stock을 1% 첨가하였다.
그 결과, 전반적으로 배양 온도 변경을 진행하지 않은 대조군(Control) 조건에 비하여 배양 온도 변경을 진행한 경우 세포 성장이 빠르게 유도되어 생산성이 증가함을 확인하였다.
히알루로니다제 PH20 확인을 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 시료에 샘플 버퍼(sample buffer)를 첨가한 뒤, 100도에서 10분간 끓인 후, 5분간 빙냉 시켰다. 10% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 로딩하여 전기영동을 수행하고 NC 멤브레인(membrance)에 350 mA 조건으로 2시간 동안 블로팅(blotting)하였다. 5% 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹(blocking)한 멤브레인에 1:2000으로 희석한 1차 항체를 냉장에서 처리한 후, 1:5000으로 희석한 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. NBT/BCIP를 처리하여 발색 시켜 히알루로니다제 PH20을 확인하였다.
배양 조건별 발현된 히알루로니다제 PH20을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, HyCell CHO + GlycanTune C+ 조건에서는 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20의 절단된 형태(분자량 표준품 37 ~ 49 kDa 사이)가 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다.
HyCell CHO + Feed C+ 조건에서는 32℃로 배양 온도 변경을 늦게 할수록 PH20의 절단된 형태가 낮아지는 경향을 보였다.
CD OptiCHO 배지 조건에서는 초기 배양온도가 37℃인 경우 PH20의 절단된 형태가 다소 관찰되었으나, 초기 배양온도가 34℃인 경우에는 배양 온도 변경일과 상관없이 PH20의 절단된 형태가 거의 관찰되지 않았다.
상기 결과를 바탕으로 기본 배지 CD OptiCHO, 피드배지 Cell Boost 6(15%(v/v)) 및 배양 시작 온도 34℃조건을 히알루로니다제 PH20 생산을 위한 최적 조건으로 선정하였다.
첨가물 조합에 따른 히알루로니다제 PH20 생산
상기 <실시예 2>의 결과를 바탕으로, 도 2의 표와 같이 기본 배지 CD OptiCHO, 배양 6일차에 최적 첨가물로 선정된 Cell Boost 6 피드를 1, 3, 5% 첨가하는 조건과 최적 함량인 15%를 2 ~ 5회 분으로 나누어 3일 간격으로 첨가하는 조건을 실험하였다.
추가로 L-글루타민(L-Glutamine)과 GlutaMAX를 각각 4 mM씩 첨가하여 시험을 진행하였으며, 조건별 발현 단백질의 품질을 비교하기 위해 배양액 시료를 웨스턴 블랏을 수행하여 분석하였다.
초기 세포접종 농도는 1.0 x 106 cell/㎖, 배양 규모는 50 ㎖ / 125 ㎖ 삼각플라스크에서 진행하였으며, 세포 접종 방식은 288 x g에서 5분간 원심분리하여 모인 세포를 재부유 시켰다. 배양은 20일까지 진행하였으며, pH는 6.8 미만 시, 7.5% 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate) 스탁(stock)을 1% 첨가하여 보정하였다. 글루코오스(Glucose)는 함량이 20 mmol/ℓ 이하 일 때, 45% D-(+)-glucose stock을 1% 첨가하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Cell Boost 6 피드 첨가량 및 첨가일 조건에 따른 PH20의 절단된 형태 발현 정도의 큰 차이는 관찰되지 않았으며, L-글루타민(L-Glutamine), GlutaMAX 추가에 따른 PH20의 절단된 형태 발현 정도의 차이도 관찰되지 않았다.
기타 첨가물 조합에 따른 히알루로니다제 PH20 생산
최적 첨가물로 선정된 Cell Boost 6 피드가 아닌 기타 첨가물인 펩톤(Peptone)을 첨가하였을 때, PH20 생산 정도를 확인하였다.
펩톤은 효모 추출물(Yeast Extract), 대두 가수분해물(Select Phytone), 효모 가수분해물(TC Yeastolate), 목화씨 가수분해물(Cotton 200 UF)을 이용하여 도 3의 표와 같이 1, 3, 9, 15%로 각각 첨가하여 PH20을 생산하였다.
초기 세포접종 농도는 1.0 x 106 cell/㎖, 배양 규모는 50 ㎖ / 125 ㎖ 삼각플라스크에서 진행하였으며, 세포 접종 방식은 288 x g에서 5분간 원심분리하여 모인 세포를 재부유 시켰다. 배양은 20일까지 진행하였으며, pH는 6.8 미만 시, 7.5% 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate) 스탁(stock)을 1% 첨가하여 보정하였다. 글루코오스(Glucose)는 함량이 20 mmol/ℓ 이하 일 때, 45% D-(+)-glucose stock을 1% 첨가하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 펩톤 종류에 상관없이 전반적으로 PH20의 절단된 형태 발현이 높은 경향을 보였다. 특히 TC Yeastolate 9% 첨가 조건에서 절단된 형태의 PH20 발현이 가장 높은 것으로 나타났다.
첨가물 및 배양일에 따른 히알루로니다제 PH20 생산
상기 <실시예 4>의 TC Yeastolate 9% 첨가 조건에서 배양일 별 PH20의 절단된 형태 발현 정도와 <실시예 3>에서 선정한 CD OptiCHO + Cell Boost 6 조건에서의 배양일 별 PH20의 절단된 형태 발현 정도를 확인하기 위하여 도 4의 표와 같이 실험을 진행하였다.
초기 세포접종 농도는 1.0 x 106 cell/㎖, 배양 규모는 50 ㎖ / 125 ㎖ 삼각플라스크에서 진행하였으며, 세포 접종 방식은 288 x g에서 5분간 원심분리하여 모인 세포를 재부유 시켰다. 배양은 20일까지 진행하였으며, pH는 6.8 미만 시, 7.5% 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate) 스탁(stock)을 1% 첨가하여 보정하였다. 글루코오스(Glucose)는 함량이 20 mmol/ℓ 이하 일 때, 45% D-(+)-glucose stock을 1% 첨가하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, CD OptiCHO + Cell Boost 6 조건에서는 배양일별 차이 없이 절단된 형태의 PH20 발현이 확인되지 않았으나, TC Yeastolate 9% 첨가 조건에서는 모든 배양 일에 절단된 형태의 PH20 발현이 확인되었다.
7.5ℓ 바이오리액터에서의 배양일 및 교반(agitation) 속도에 따른 비교
상기 <실시예 2> 또는 <실시예 3>에서 선정된 배양 조건을 적용하여 7.5ℓ 바이오리액터(bioreactor)에서 배양을 진행하였고, 도 5A 및 도 5B의 표와 같이 배양일, 및 교반(agitation) 속도(150 rpm 및 200 rpm)에 따른 비교 실험을 진행하였다.
초기 세포접종 농도는 0.3 x 106 cell/㎖, 배양 규모는 4 ℓ로 진행하였으며, 세포 접종 방식은 목표 초기 세포접종 농도에 맞게 필요한 부피만큼 종배양 시료를 혼합하였다. 배양은 14일까지 진행하였으며, pH는 6.8 미만 시, 0.1N 수산화나트륨(sodium hydroxide) 스탁(stock)을 pH 6.8이 될 때까지 첨가하여 보정하였다. 글루코오스(Glucose)는 함량이 3.5 g/ℓ 이하 일 때, 45% D-(+)-glucose stock을 초기 배양 규모의 3.5 g/ℓ만큼 첨가하였다. 바이오리액터의 pH 범위는 배양 0일차에 pH 7.10 ± 0.30, 배양 1일차에 pH 7.05 ± 0.25, 배양 2일 ~ 14일차는 7.00 ± 0.20으로 조절하였다. 용존산소(DO)는 30%로 유지하였으며, 가스 조절은 3 Gas mix로 진행하였다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 배양일에 상관없이 PH20이 절단된 형태가 아닌 완전한 형태로 발현되는 것을 확인하였다.
또한, 도 5B에 나타난 바와 같이, 두 조건에서 모두 PH20의 절단된 형태 발현이 확인되지 않았다. 하지만, 200 rpm 가동 시에는 DO가 안정적으로 유지되지 않아 생산성이 낮게 확인되었고 150 rpm 가동 시에는 기존 flask와 유사한 생산성이 확인되었다.
상업화 배지의 액상 제형과 파우더 제형 성능 비교
선정된 기본 배지 CD OptiCHO는 액상 형태로 판매되는 배지(Thermo Fisher Scientific / Cat# 12681-011)와 파우더 형태(Thermo Fisher Scientific / Cat# A11222-05)의 배지가 존재하여 두 형태간의 배양 차이를 확인하는 실험을 도 5C의 표와 같이 진행하였다.
초기 세포접종 농도는 0.3 x 106 cell/㎖, 배양 규모는 100 ㎖로 진행하였으며, 세포 접종 방식은 목표 초기 세포접종 농도에 맞게 필요한 부피만큼 종배양 시료를 혼합하였다. 배양은 14일까지 진행하였으며, pH는 6.8 미만 시, 0.1N 수산화나트륨 스탁(stock)을 pH 6.8이 될 때까지 첨가하여 보정하였다. 글루코오스(Glucose)는 함량이 3.5 g/ℓ 이하 일 때, 45% D-(+)-glucose stock을 초기 배양 규모의 3.5 g/ℓ만큼 첨가하였다.
그 결과, 도 5C에 나타난 바와 같이, 기본 배지의 제형에 상관 없이 모두 온전한 형태의 PH20이 발현되었으며, 배양 최종 생존 세포 농도와 최종 생산성에서도 차이는 확인되지 않았다.
동물 세포 배양 상층액을 이용한 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20 정제
단계 1: 제 1차 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피에 의한 정제
상기 <실시예 2> 또는 <실시예 3>에서 선정된 배양 조건을 적용하여 배양 완료된 상층액에 pH 조정을 진행하였고, 여과를 진행하였다. 아세트산 나트륨 평행 용액으로 이온교환 믹스 모드 컬럼을 평형화 하였으며, 상기 여과액을 이온교환 믹스 모드 컬럼에 로딩하여 일부 불순물은 제거하고 히알루로니다제 PH20을 포획하였다. 아세트산 나트륨 평행 용액을 다시 흘려 컬럼에 결합되지 않은 불순물을 제거하였고 인산 나트륨 세척 용액으로 비특이적으로 결합한 불순물을 제거하였다. 인산 나트륨에 아르기닌이 포함된 용출 용액을 통하여 히알루로니다제 PH20을 용출하였으며, 수산화 나트륨 재생 용액을 이용하여 컬럼의 세척을 진행하였다 (도 6).
단계 2: 제 2차 친화 크로마토그래피에 의한 정제
단계 1의 용출액에 주사용수를 넣어 전도도를 낮춘 후, pH 조정을 진행하였고, 여과를 진행하였다. 아세트산 나트륨 평행 용액으로 친화 모드 컬럼을 평형화 하였으며, 상기 여과액을 친화 컬럼에 로딩하여 일부 불순물은 제거하고 히알루로니다제 PH20을 결합하였다. 아세트산 나트륨 평행 용액을 다시 흘려 컬럼에 결합되지 않은 불순물을 제거하였고 인산 나트륨 세척 용액으로 비특이적으로 결합한 불순물을 제거하였다. 인산 나트륨에 250 mM 염화나트륨이 포함된 용출 용액을 통하여 히알루로니다제 PH20을 용출하였으며, 수산화 나트륨 재생 용액을 이용하여 컬럼의 세척을 진행하였다 (도 7).
단계 3: 바이러스 불활성화
단계 2의 용출액에 폴리소르베이트 80과 트리-N-부틸 인산염(Tri-N-butyl phosphate)을 추가한 후, 상온에서 방치하여 바이러스 불활성화를 진행하였다.
단계 4: 제 3차 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피 의한 정제
인산 나트륨 평행 용액으로 이온교환 믹스 모드 컬럼을 평형화 하였으며, 단계 3의 반응액을 여과한 후, 이온교환 믹스 모드 컬럼에 로딩하여 남아있는 불순물은 제거하고 히알루로니다제 PH20을 결합하였다. 인산 나트륨 평행 용액을 다시 흘려 컬럼에 결합되지 않은 불순물을 제거하였고 아세트산 나트륨에 120 mM 염화나트륨이 포함되어 있는 세척 용액으로 비특이적으로 결합한 불순물을 제거하였다. 아세트산 나트륨에 750 mM 염화나트륨이 포함된 용출 용액을 통하여 히알루로니다제 PH20을 용출하였으며, 수산화 나트륨 재생 용액을 이용하여 컬럼의 세척을 진행하였다 (도 8).
단계 5: 제 4차 믹스 모드 크로마토그래피 의한 정제
단계 4의 용출액에 평행 용액과 유사한 조성이 되도록 희석 용액을 추가하고 2 ~ 8℃에서 16시간 방치한다. 상기 반응액을 여과한 후, 믹스 모드 컬럼에 로딩하여 세포유래 단백질을 제거하고 히알루로니다제 PH20을 결합하였다. 인산 나트륨 평행 용액을 다시 흘려 컬럼에 결합되지 않은 불순물을 제거하였고, 40 mM 인산 나트륨 용출 용액을 통하여 히알루로니다제 PH20을 용출하였다. 수산화 나트륨 재생 용액을 이용하여 컬럼의 세척을 진행하였다 (도 9).
단계 6: 제 5차 소수성 작용 크로마토그래피 의한 정제
단계 5의 용출액에 평행 용액과 유사한 조성이 되도록 희석 용액을 추가하고 여과한 후, 소수성 작용 컬럼에 로딩하여 세포유래 DNA는 결합하고 히알루로니다제 PH20은 미결합으로 획득하였다. 인산 나트륨 평행 용액을 다시 흘려 남아있는 히알루로니다제 PH20을 추가 획득하였으며, 수산화 나트륨 재생 용액을 이용하여 컬럼의 세척을 진행하였다 (도 10).
단계 7: UF/DF 및 바이러스 여과
단계 6 이후에 인산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼슘 등이 포함되어 있는 제형 용액으로 30 kDa MWCO 막 필터를 사용하여 용액을 변경하였다. 그 후, 바이러스 필터를 이용하여 히알루로니다제 PH20을 포함하는 단백질 용액을 여과하였다.
정제된 히알루로니다제 PH20의 웨스턴 블랏 분석
히알루로니다제 PH20의 웨스턴 블랏 분석을 위하여 도 11의 표와 같이 non-reducing과 reducing 2가지 조건으로 시료를 준비하였다.
Non-reducing 조건은 0.2, 0.5, 1 ㎍의 시료를 준비한 뒤, non-reducing 샘플 버퍼를 첨가하였다. Reducing 조건은 0.2, 0.5, 1 ㎍의 시료에 reducing 샘플 버퍼를 첨가한 뒤, 100℃에서 10분간 끓인 후, 5분간 빙냉 시켰다.
그 다음, 시료를 10% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에 로딩하여 80V ~ 30분, 120V ~ 100분 조건으로 전기영동을 진행하였다. 전기영동이 완료된 젤은 NC 멤브레인에 250 mA 조건으로 2시간 동안 블로팅(blotting) 하였다. 1차 항체는 polyclonal rabbit anti-Human SPAM1을 사용하였으며, 2차 항체는 goat anti-rabbit IgG(H+L)-AP conjugated를 사용하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, non-reducing과 reducing 조건에서 모두 PH20의 절단된 형태가 아닌 온전한 형태 PH20(약 60 kDa 위치)가 확인되었다.
정제된 히알루로니다제 PH20의 SDS-PAGE 분석
히알루로니다제 PH20의 N-glycan 탈당화에 따른 분자량 차이를 확인하기 위하여, 도 12의 표와 같이, 10x 당단백질 변성 버퍼(glycoprotein denaturing buffer)를 첨가하여 100℃에서 10분간 끓이고, NP-40과 PNGase F를 첨가하여 하룻밤 동안(overnight)으로 반응하였다.
Non-reducing과 reducing 2가지 조건으로 시료를 준비하여 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하여 80V ~ 30분, 120V ~ 100분 조건으로 전기영동을 진행하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 탈당 시 약 54 kDa의 탈당된 밴드가 확인되었다.
정제된 히알루로니다제 PH20의 크기배제 크로마토그래피 분석
히알루로니다제 PH20의 순도 분석을 위하여 인산화 나트륨, 염화 나트륨이 포함된 pH 7.2 용액을 이동상으로하여 G2000SWXL 컬럼을 이용하여 분석을 진행하였다.
Waters사의 Alliance HPLC 장비를 사용하였으며 이동상 버퍼는 200 mM KPi, 50 mM NaCl, pH 7.2의 조성으로 제조하였으며, 분석양은 100 ㎍을 로딩하였다. 유속은 0.5 ㎖/min으로 컬럼 온도는 25℃로 진행하였으며, 검출파장(Detection wavelength)은 280 nm였다. 그래디언트(Gradient) 조건은 아이소크라틱(Isocratic)으로 40분간 분석하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, PH20의 절단된 형태가 아닌 온전한 형태 PH20의 순도가 99%인 것으로 확인되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. (1) 천연형 인간 재조합 히알루로니다제 PH20을 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 33 ~ 35℃에서 배양하는 단계; 및
    (2) 배양 온도를 31 ~ 33℃으로 유지하면서 7 ~ 11일 동안 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH20 생산방법에 관한 것으로,
    상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포는 Cell Boost 6 피드 배지가 첨가된 CD OptiCHO 배양 배지에서 배양하며,
    상기 생산된 히알루로니다제 PH20은 절단된 형태가 아닌 50 ~ 75 kDa 크기의 온전한 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20은 55 ~ 65 kDa 크기인 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 방법으로 생산된 히알루로니다제 PH20의 배양액에서의 활성은 4,000 unit/㎖ 이상인 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 Cell Boost 6 피드 배지는 1%(v/v) ~ 20%(v/v) 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 L-글루타민(L-Glutamine)을 추가로 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양 배지에 펩틴, 식물 유래 가수분해물, 효모 추출물(Yeast Extract), 및 효모 가수분해물(Yeastolate)로 구성된 군에선 선택된 어느 하나의 성분이 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (2) 단계의 배양은 (a) 배양액 용존산소량을 30% ~ 79%로 유지하는 배양;
    (b) 배지 내의 잔류 글루코오스(Glucose) 농도를 배양 기간 동안 1.11 ~ 5.95 g/ℓ로 유지하는 배양; 및
    (c) 배양액의 pH를 7.0 ~ 7.4로 유지하는 배양;하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법(batch culture), 반복 회분 배양법(repeated batch culture), 유가 배양법(fed-batch culture), 반복 유가 배양법(repeated fed-batch culture), 연속 배양법(continuous culture) 및 관류 배양법(perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 방법을 생산된 히알루로니다제 PH20는 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 동물 세포(animal cell), 효모(yeast), 방선균(Actinomycetes) 또는 곤충 세포(insect cell)인 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 (3) 생산된 히알루로니다제 PH20을 분리 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 분리 정제는 PH20과의 친화력 결합, 이온결합 특성 및/또는 소수성 상호작용 특성을 이용하여 히알루로니다제 PH20을 고순도로 정제하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 분리 정제 단계는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 믹스 모드 크로마토그래피(ion exchange-mixed mode chromatography), 및 소수성 작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 온전한 형태의 히알루로니다제 PH20의 생산방법.
  14. 삭제
KR1020240047958A 2024-04-09 2024-04-09 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법 Active KR102687341B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020240047958A KR102687341B1 (ko) 2024-04-09 2024-04-09 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020240047958A KR102687341B1 (ko) 2024-04-09 2024-04-09 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102687341B1 true KR102687341B1 (ko) 2024-07-23

Family

ID=92172305

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020240047958A Active KR102687341B1 (ko) 2024-04-09 2024-04-09 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102687341B1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110016899A (ko) * 2008-04-23 2011-02-18 심포젠 에이/에스 폴리클로날 단백질을 제조하는 방법
KR101233457B1 (ko) * 2003-03-05 2013-02-15 할로자임, 아이엔씨 가용성 하이알우로니다제 당단백질 (ｓＨＡＳＥＧＰ), 이를 제조하는 방법, 용도 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR20140021046A (ko) * 2008-12-09 2014-02-19 할로자임, 아이엔씨 연장된 가용성 ｐｈ20 폴리펩티드 및 그의 용도
KR20220018943A (ko) * 2020-08-07 2022-02-15 (주)알테오젠 재조합 히알루로니다제의 생산 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101233457B1 (ko) * 2003-03-05 2013-02-15 할로자임, 아이엔씨 가용성 하이알우로니다제 당단백질 (ｓＨＡＳＥＧＰ), 이를 제조하는 방법, 용도 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR20110016899A (ko) * 2008-04-23 2011-02-18 심포젠 에이/에스 폴리클로날 단백질을 제조하는 방법
KR20140021046A (ko) * 2008-12-09 2014-02-19 할로자임, 아이엔씨 연장된 가용성 ｐｈ20 폴리펩티드 및 그의 용도
KR20220018943A (ko) * 2020-08-07 2022-02-15 (주)알테오젠 재조합 히알루로니다제의 생산 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102649603B1 (ko) 재조합 히알루로니다제의 생산 방법
HU226420B1 (en) Process for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cell culture
JP2024059641A (ja) 糖タンパク質の製造
Gawlitzek et al. Effect of different cell culture conditions on the polypeptide integrity and N‐glycosylation of a recombinant model glycoprotein
JP2005509403A (ja) ＩｇＧにおけるグリコフォームの制御
CN113151342A (zh) 一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法
KR102687341B1 (ko) 온전한 형태의 히알루로니다제의 생산방법
US20250122492A1 (en) N-terminal and/or C-terminal Cleaved Soluble PH20 Polypeptide and Use Thereof
DE3486023T2 (de) Verfahren zur herstellung von urokinase zymogen.
WO2016095326A1 (zh) 一种och1缺陷型抗cd20四价抗体表达毕赤酵母的构建方法
TWI803946B (zh) 製造重組玻尿酸酶的方法
RU2822202C1 (ru) Способ получения рекомбинантной гиалуронидазы
KR102134571B1 (ko) 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질의 제조 방법
EP3221448B1 (en) Process for producing recombinant trypsin
TW201910511A (zh) C3融合蛋白以及其製備及使用方法
Zhurina In vitro glycoengineering of a monoclonal antibody produced in insect cells
KR20230088811A (ko) 알칼리성 포스파타제의 제조 동안 총 시알산 함량(tsac)을 제어하는 방법
EP3221449B1 (en) Process for refolding recombinant chymotrypsin
KR20210148288A (ko) 생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20240409

PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02011R01I

Patent event date: 20240409

Comment text: Patent Application

PA0302 Request for accelerated examination

Patent event date: 20240412

Patent event code: PA03022R01D

Comment text: Request for Accelerated Examination

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20240620

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20240715

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20240717

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20240717

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration