CN113151342A - 一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，包括以下步骤；(1)制备质粒：优选人源蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用PCR技术将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的 25％-33％，广泛地存在于人体的骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中，是细胞外基质(ECM)的主要成分，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。在分子结构上，胶原蛋白是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成的一极强的右旋三重螺旋结构。每条α-肽链由多达300个以上的Gly-X-Y三联体重复构成，两端连接具有不同结构的其它小片段。组成胶原蛋白的氨基酸残基均为α-氨基酸，其中X、Y是Gly之外的任何氨基酸残基。
胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用于医药、保健品和化妆品行业中。在现有技术中，生产胶原蛋白传统的也是最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼等)，从中提取胶原蛋白；另外，还有酶法提取胶原蛋白；虽然这些方法具有较高的回收率，但是这些方法制取的胶原蛋白均为长度不等的混合胶原蛋白肽段，各肽段水溶性不一，难以分离到单独的肽段纯品，同时由于均为异源性胶原蛋白，在临床上表达出排异反应，使其作为生物医学材料或药物载体等方面的应用受到了很大限制。
随着现代生物技术的发展，利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研究开发重组胶原蛋白，杨霞等在2012 年通过重复III型胶原肽段并与II型胶原肽段融合在大肠杆菌中获得高表达；我国西北大学的范代娣等利用大肠杆菌通过高密度发酵培养生产类人胶原蛋白，得到高表达的类人胶原，并以此为原材料开发组织工程材料和化妆品，但其设计的部分氨基酸序列并非人源胶原蛋白序列，同时，细菌表达产生的致热源使表达产物难以应用于临床，而且目的蛋白常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难，另外原核表达系统的翻译后修饰加工体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点影响产品的品质。因此，在制备人源胶原蛋白的技术领域，亟需开发一种纯度高、安全性高、亲水性强、生物相容性好的人源胶原蛋白，并且可以实现不在细菌上进行表达的方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种纯度高，安全性好的人源化胶原蛋白制备工艺和方法。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，包括以下步骤；
(1)制备质粒：优选人源蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的 DNA片段，利用PCR技术将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4 DNA 连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，命名为为 pET32a-NTOD；
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；
(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
为了提高纯度，本发明改进有，所述纯化包括以下步骤；
(1)粗分离
将人源化胶原蛋白蛋白用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2 μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为4.5-6K的超滤膜进行超滤；
(2)精细分离纯化
向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.05～5.85mS/cm，再用NaOH调节pH至4.52～6.15，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为90∶5 的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90∶10～75∶30的混合液洗脱，洗脱流速均为130～260L/min；收集流动相A与流动相B体积比为 90∶10～75∶30时的洗脱液，得到纯度大于98％的人源化胶原蛋白蛋白。
为了提高纯化效果，本发明改进有，在步骤(1)中，所述截留分子量为 4.5～6K的超滤膜为中空纤维超滤膜，且超滤过程中控制超滤膜压力不高于 0.1MPa；步骤(2)中，所述弱阳离子交换层析柱的填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.045-0.06mmol/mL，线性流速不得高于7.5-10mL/cm。
为了提高转化效果，本发明改进有，步骤(2)中的转化；将经过筛分后得到的正确pET32a-NTOD质粒用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，并且在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中36.5～37.2℃之间培养至等电点为0.5～0.7之间，加入冰预冷的与毕赤酵母感受态细胞混匀，涂布在培养基板上，培养2.5～3.5天，长处菌落。
为了提高筛选以及发酵效果，本发明改进有，步骤(3)和(4)中的筛选以及发酵；将培养完成后的菌落采用无菌转移针转移至G418浓度分别为 0.45g/L、1.5g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.5g/L、5.5g/L的YPD平板上培养，筛选后获得转化子，将筛选获得的转化子接种于培养基中，对培养基中的转化子进行震荡培养24小时，将震荡后的转化子转接于FBS培养基的发酵罐中，将pH值调节至5～7之间，培养20～24小时，将培养后的转化子转接入FBS 培养基的大罐发酵，生长温度控制在28～30℃。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，具备以下有益效果：
该人源化胶原蛋白制备工艺和方法可以充分的体现重组人源胶原蛋白使用时的水溶性更好的质量，并且可以适应使用者的体温标准，提高使用者使用重组人源胶原蛋白与人体的相容性，应用于人体上时减少人体的免疫排斥和过敏现象，方便对医药医疗的应用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，包括以下步骤；
(1)制备质粒：优选人源蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的 DNA片段，利用PCR技术将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4DNA 连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，命名为为 pET32a-NTOD；
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；
(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
为了提高纯度，本发明改进有，所述纯化包括以下步骤；
(1)粗分离
将人源化胶原蛋白蛋白用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2 μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为4.5-6K的超滤膜进行超滤；
(2)精细分离纯化
向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.05～5.85mS/cm，再用NaOH调节pH至4.52～6.15，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为90∶5 的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90∶10～75∶30的混合液洗脱，洗脱流速均为130～260L/min；收集流动相A与流动相B体积比为 90∶10～75∶30时的洗脱液，得到纯度大于98％的人源化胶原蛋白蛋白。
为了提高纯化效果，本发明改进有，在步骤(1)中，所述截留分子量为 4.5～6K的超滤膜为中空纤维超滤膜，且超滤过程中控制超滤膜压力不高于 0.1MPa；步骤(2)中，所述弱阳离子交换层析柱的填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.045-0.06mmol/mL，线性流速不得高于7.5-10mL/cm。
为了提高转化效果，本发明改进有，步骤(2)中的转化；将经过筛分后得到的正确pET32a-NTOD质粒用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，并且在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中36.5～37.2℃之间培养至等电点为0.5～0.7之间，加入冰预冷的与毕赤酵母感受态细胞混匀，涂布在培养基板上，培养2.5～3.5天，长处菌落。
为了提高筛选以及发酵效果，本发明改进有，步骤(3)和(4)中的筛选以及发酵；将培养完成后的菌落采用无菌转移针转移至G418浓度分别为 0.45g/L、1.5g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.5g/L、5.5g/L的YPD平板上培养，筛选后获得转化子，将筛选获得的转化子接种于培养基中，对培养基中的转化子进行震荡培养24小时，将震荡后的转化子转接于FBS培养基的发酵罐中，将pH值调节至5～7之间，培养20～24小时，将培养后的转化子转接入FBS 培养基的大罐发酵，生长温度控制在28～30℃
综上所述，该人源化胶原蛋白制备工艺和方法，操作简单，成本低，适合大规模生产；采用4.5-6K超滤膜对滤出液进行超滤、浓缩、脱盐，此过程还可除去一些小分子物质，效率相比传统的凝胶层析脱盐，除小分子物质效率高，易操作；最后进行一步离子交换层析，得到的重组人源胶原蛋白纯度在98％以上，收率高达70％以上，本发明整工艺简单，工艺稳定，成本低廉，纯化度高，使用安全性好，可以充分的体现重组人源胶原蛋白使用时的水溶性更好的质量，并且可以适应使用者的体温标准，提高使用者使用重组人源胶原蛋白与人体的相容性，应用于人体上时减少人体的免疫排斥和过敏现象，方便对医药医疗的应用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，包括以下步骤；
(1)制备质粒：优选人源蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用PCR技术将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，命名为为pET32a-NTOD；
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；
(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
2.根据权利要求1所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤；
(1)粗分离
将人源化胶原蛋白蛋白用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为4.5-6K的超滤膜进行超滤；
(2)精细分离纯化
向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.05～5.85mS/cm，再用NaOH调节pH至4.52～6.15，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为90∶5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90∶10～75∶30的混合液洗脱，洗脱流速均为130～260L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90∶10～75∶30时的洗脱液，得到纯度大于98％的人源化胶原蛋白蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述截留分子量为4.5-6K的超滤膜为中空纤维超滤膜，且超滤过程中控制超滤膜压力不高于0.1MPa。
4.根据权利要求2所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述弱阳离子交换层析柱的填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.045-0.06mmol/mL，线性流速不得高于7.5-10mL/cm。
5.根据权利要求1所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，步骤(2)中的转化；将经过筛分后得到的正确pET32a-NTOD质粒用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，并且在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中36.5～37.2℃之间培养至等电点为0.5～0.7之间，加入冰预冷的与毕赤酵母感受态细胞混匀，涂布在培养基板上，培养2.5～3.5天，长处菌落。
6.根据权利要求1所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中的筛选以及发酵；将培养完成后的菌落采用无菌转移针转移至G418浓度分别为0.45g/L、1.5g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.5g/L、5.5g/L的YPD平板上培养，筛选后获得转化子，将筛选获得的转化子接种于培养基中，对培养基中的转化子进行震荡培养24小时，将震荡后的转化子转接于FBS培养基的发酵罐中，将pH值调节至5～7之间，培养20～24小时，将培养后的转化子转接入FBS培养基的大罐发酵，生长温度控制在28～30℃。
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|---|---|---|---|---|
| CN116179634A (zh) * | 2023-04-27 | 2023-05-30 | 北京盛美诺生物技术有限公司 | 一种iii型胶原蛋白肽及其制备方法 |
| CN117229390A (zh) * | 2023-09-20 | 2023-12-15 | 山东义才和锐生物技术有限公司 | 一种重组ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法 |
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2021
- 2021-03-09 CN CN202110252835.6A patent/CN113151342A/zh active Pending
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