CN117229390A - 一种重组ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法。该方法包括步骤S1、从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列；步骤S2、从培养完成的酵母菌培养皿中将菌落用移液器吸取以初步筛选，筛选完成时收集培养液中的长宽比合格酵母菌细胞，转移到无菌的离心管中；步骤S3、使用蛋白质纯化技术凝胶色谱层析技术和离子交换层析技术对蛋白质进行过滤，以对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行纯化和富集；步骤S4、对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行功能性评估。本发明克服了制备过程控制不精准导致对胶原蛋白制备过程效率低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是皮肤的重要组成部分，能够保持皮肤的弹性和紧致度，随着年龄的增长，胶原蛋白的含量逐渐减少，导致皮肤松弛和皱纹的出现，因此，胶原蛋白的补充和保护对于维持皮肤健康非常重要，促进骨骼健康：胶原蛋白是骨骼的重要组成部分，能够增加骨骼的密度和强度，它参与骨骼的形成和修复过程，对于预防骨质疏松症和骨折具有重要作用，支持关节功能：胶原蛋白存在于关节软骨中，能够提供关节的润滑和缓冲作用，减少关节疼痛和炎症，胶原蛋白的补充可以改善关节功能，减轻关节疾病的症状。
中国专利公开号：CN102351954B公开了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，胶原蛋白液中包含防腐剂，防腐剂选自咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯或尼泊金丁酯中的一种或几种，且其重量为所述胶原蛋白液总重量的十万分之一至万分之五，其中，所述胶原蛋白液中包含具有防腐作用的非防腐剂类物质，所述具有防腐作用的非防腐剂类物质为选自丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇或辛二醇中的一种或几种，且其重量为所述胶原蛋白液总重量的千分之一至百分之八。
目前，业内一直期望实现大分子人源化胶原蛋白或者全人胶原蛋白的生产，但是受限于现有的重组表达技术，一直都是一个难以完全突破的点，
现有技术已经开发研究了许多针对性的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，但是对于重组基因的表达和重组Ⅲ型人源化胶原蛋白制备过程的精准性的控制，依然并不乐观，由此可见，现有技术的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白在制备过程中对制备过程控制不精准导致对胶原蛋白制备过程效率低的问题
发明内容
为此，本发明提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，用以克服现有技术中对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白制备过程控制不精准导致对胶原蛋白制备过程效率低的问题。
为实现上述目的，本发明一方面提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，包括：
步骤S1、从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列；
步骤S2、从培养完成的酵母菌培养皿中将菌落用移液器吸取以初步筛选，筛选完成时收集培养液中的长宽比合格酵母菌细胞，转移到无菌的离心管中；
步骤S3、使用蛋白质纯化技术凝胶色谱层析技术和离子交换层析技术对蛋白质进行过滤，以对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行纯化和富集；
步骤S4、对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行功能性评估。
进一步地，在所述步骤S1中，步骤S1包括：
步骤S11、通过基因组DNA提取方法从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列；
步骤S12、准备酵母菌表达载体，选择酵母菌表达载体；
步骤S13、使用限制性内切酶对酵母菌表达载体和胶原基因序列进行酶切，选择酶切位点以确保插入的胶原基因序列与载体正确配对；
步骤S14、酶切后将提取的胶原蛋白基因序列插入到5μg的pPICZ质粒DNA中，将混合物在室温下静置15～30min，使质粒与酵母菌细胞发生转化；
步骤S15、将转化后的酵母菌细胞在30℃下通过离心将细胞沉淀下来，将细胞重悬于含有聚乙二醇(PEG)和锂离子的转化缓冲液中，随后在MM培养基的培养皿中恢复培养。
进一步地，步骤S2包括：
步骤S21、取一片载玻片，并用移液器滴取一滴无菌蒸馏水在载玻片上以保持湿润，将培养皿中的酵母菌悬浮液吸取一滴，滴在预先湿润的载玻片上；
步骤S22、将盖玻片放在酵母菌悬浮液上，将制备好的样品放在光学显微镜的载物台上，调整镜头和焦距，放大倍数为100倍，通过目镜观察酵母菌的形态和大小，并根据酵母菌的形态和大小进行初步筛选。
进一步地，步骤S3包括：
步骤S31、将培养液中长宽比合格的酵母菌细胞通过离心方法进行收集，离心条件为以转速为3000rpm且离心温度为4℃离心10min后，将上清液去除，保留细胞沉淀；
步骤S32、将收集到的留细胞沉淀使用超声波破碎器进行破碎，以释放重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，其中设置超声功率为30％额定功率超声10s，超声间歇时间为10s，重复处理3次；
步骤S33、将破碎后的细胞悬浮液离心，以去除细胞碎片和细胞膜等杂质，离心条件为以转速为12000rpm且离心温度为4℃离心20min，将上清液转移到新的离心管中；
步骤S34、选择分子量截留为10kDa的凝胶色谱柱，将上清液加载到柱上，流速为0.5ml/min，收集流出液；
步骤S35、使用阴离子交换树脂，将流出液加载到离子交换层析柱上，使用缓冲液进行洗脱，设置流速为0.5ml/min，收集重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。
进一步地，在所述步骤S13中，首先选取若干酶切点位，使用限制性内切酶对若干所述酶切点位进行酶切，将酶切后的DNA片段与胶原蛋白的基因序列连接起来，对于每个酶切点位；
若连接失败，即无法将DNA片段与胶原蛋白的基因序列连接起来，则判定该酶切点位不合格；
若连接成功，即DNA片段与胶原蛋白的基因序列成功连接，则判定该酶切点位合格。
在所述步骤S13中，当连接成功时，对连接长度不合格的酶切点位，后续的酶切过程中将后续序列具有与上述合格的酶切点位的序列相同的特征(x，d)的点位作为酶切点位，其中x为酶切点位的位置，d为相邻两个酶切点位之间的距离；
统计对应分子量内的基因序列上合格的酶切点位数量M，并将该酶切点位数量M与预设酶切点位数量M0进行比对，以判定对应分子量的基因序列是否可用以酶切；
当M≤M0时，则判定对应分子量的基因序列可用以酶切；
当M＞M0时，则判定对应分子量的基因序列不可酶切。
进一步地，当判定对应分子量的基因序列不能酶切时，对酶切点位数量进行调节，并根据酶切的合格率是否发生变化判定酶切方式；
若酶切的合格率发生变化，判定扩大酶切判定的(x，d)确定的范围值；
若酶切的合格率几乎不变，判定按照上述的酶切点位值进行基因设计。
进一步地，在所述步骤S23中，当用光学显微镜观察酵母菌时，所述数据分析模块中的尺寸分析单元选择预设区域建立直角坐标系并测量酵母菌的长度和宽度，根据酵母菌长宽比S和预设长宽比S0的比对结果判定培养的酵母菌是否合格；
当S≤S0时，判定培养的为合格酵母菌；
当S＞S0时，则判定培养的为不合格酵母菌。
进一步地，在所述步骤S32中，将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液加载到凝胶色谱柱上，收集流出液，根据该纯度C和预设纯度C0的比对结果确定所述凝胶色谱柱的层析速率；
当C≤C0时，确定以第一层析速率提纯所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白；
当C＞C0时，确定以第二层析速率提纯所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。
进一步地，在所述步骤S4中，使用核磁共振对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行结构分析和模型构建，并将纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶解在缓冲液中，对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性D和预设生物活性D0进行比对，以根据比对结果对步骤中的酶切点位进行选择，
当D≥D0时，确定所述酶切点位不合适并扩大对酶切点位的选取范围；
当D＜C0时，确定所述酶切点位合适并不对酶切点位的选取范围进行扩大。
进一步地，在所述步骤S15中，所述酵母菌的品种为：Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母)；
在所述步骤S15中，选择摇床培养进行氧气供应，速度在150～250r/min，摇床角度略微倾斜30°；
在所述步骤S15中，为了使得对酵母菌提供更好的氧气，培养瓶容量为250ml，装酵母菌液体的体积为30ml。
本发明实施例中，对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白样品进行样品制备，使用核磁共振对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行结构分析和模型构建，确定重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的三维结构特征，并将纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶解在缓冲液中，进行生物活性测试实验，观察和记录实验结果，评估重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性更加准确地对制备的胶原蛋白进行活性控制，以使得能够更好地满足抵抗细胞衰老，体外修复的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明通过步骤S1、从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列；步骤S2、将培养皿中的菌落用移液器吸取并转移到无菌的离心管中；步骤S3、收集培养液中的长宽比合格酵母菌细胞，并通过细胞破碎和离心将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白从细胞中提取出来，使用凝胶色谱层析技术和离子交换技术对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行过滤，以对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行纯化和富集；步骤S4、对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行功能性评估，克服了重组Ⅲ型人源化胶原蛋白制备过程控制不精准导致对胶原蛋白制备过程效率低的问题。
进一步地，本发明在所述步骤S23中，当使用光学显微镜将酵母菌观察时，所述数据分析模块中的尺寸分析单元选择预设区域建立直角坐标系并测量酵母菌的长度和宽度，将所述酵母菌的长宽比和预设长宽比进行比对，以根据比对结果，确定培养的酵母菌是否合格，选择大小形状合适的酵母菌作为载体可以提高基因表达蛋白质的效率，从而提供稳定的基因表达环境，有助于降低重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的异常折叠和降解的可能性，从而增加重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的稳定性和产量，方便后续的操作和分析，使酵母菌细胞在培养、转染和分离过程中更易于处理，并且可以方便地进行重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的纯化和分析。
进一步地，本发明在所述步骤S32中，将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液加载到柱上，收集流出液，根据该纯度和预设纯度的比对结果确定所述凝胶柱的层析速率，在纯度达小于等于预设纯度时，采用较低的层析速率可以增加重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的停留时间，从而提高重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的产量，高纯度的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白对于后续的功能性评估和应用具有重要意义。
进一步地，在步骤S4中，对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白样品进行样品制备，使用核磁共振对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行结构分析和模型构建，确定重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的三维结构特征，并将纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶解在缓冲液中，进行生物活性测试实验，观察和记录实验结果，评估重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性更加准确地对制备的胶原蛋白进行活性控制，以使得能够更好地满足抵抗细胞衰老，体外修复的作用。
附图说明
图1为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的流程图；
图2本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的重组胶原蛋白-Trypsin的质谱图；
图3为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的重组胶原蛋白-重组胶原蛋白-Glu-C的质谱图；
图4为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的HACAT细胞体外细胞迁移试验可以较为直观的评估Recollagen的屏障修复效果图；
图5为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的HACAT细胞体外细胞迁移试验可以较为直观的评估Recollagen的屏障修复效果柱形图；
图6为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的体外重建人表皮天狼猩红染色实验过程模型对照图；
图7为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的体外重建人表皮天狼猩红染色实验过程对照图；
图8为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的No.23受试者和No.14受试者在D0、D14、D28后面部使用效果图；
图9为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法在胶原蛋白原料抗衰老评价实验中受试者的整体皱纹严重程度评分时间点对比折线图；
图10为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法在胶原蛋白原料抗衰老评价实验中受试者的皮肤弹性皮肤弹性Cutometer_R2时间点对比折线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1所示，其为本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的流程图；具体请参照下图2和图3所示，图2本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的重组胶原蛋白-Trypsin的质谱图，图3为重组胶原蛋白-Glu-C的质谱图；
本发明实施例重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，包括：
步骤S1、从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列，将胶原基因序列插入到酵母菌表达载体中，使用限制性内切酶进行酶切和连接，确保插入的胶原基因序列与载体正确配对；
步骤S11、通过基因组DNA提取方法从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列；
步骤S12、准备酵母菌表达载体，选择酵母菌表达载体；
步骤S13、用限制性内切酶对酵母菌表达载体和胶原基因序列进行酶切，选择酶切位点以确保插入的胶原基因序列与载体正确配对；
步骤S2、从培养完成的酵母菌培养皿中将菌落用移液器吸取以初步筛选，筛选完成时收集培养液中的长宽比合格酵母菌细胞，转移到无菌的离心管中；
步骤S21、取一片载玻片，并用移液器滴取一滴无菌蒸馏水在载玻片上以保持湿润，将培养皿中的酵母菌悬浮液吸取一滴，滴在预先湿润的载玻片上；
步骤S22、将盖玻片放在酵母菌悬浮液上，将制备好的样品放在光学显微镜的载物台上，调整镜头和焦距，放大倍数为100倍，通过目镜观察酵母菌的形态和大小，并根据酵母菌的形态和大小进行初步筛选。
步骤S3、使用蛋白质纯化技术凝胶色谱层析技术和离子交换层析技术对蛋白质进行过滤，以对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行纯化和富集；
步骤S31、将培养液中长宽比合格的酵母菌细胞通过离心方法进行收集，离心条件为以转速为3000rpm且离心温度为4℃离心10min后，将上清液去除，保留细胞沉淀；
步骤S32、将收集到的留细胞沉淀使用超声波破碎器进行破碎，以释放重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，其中设置超声功率为30％额定功率超声10s，超声间歇时间为10s，重复处理3次；
步骤S33、将破碎后的细胞悬浮液离心，以去除细胞碎片和细胞膜等杂质，离心条件为以转速为12000rpm且离心温度为4℃离心20min，将上清液转移到新的离心管中；
步骤S34、选择分子量截留为10kDa的凝胶色谱柱，将上清液加载到柱上，流速为0.5ml/min，收集流出液；
步骤S35、使用阴离子交换树脂，将流出液加载到离子交换层析柱上，使用缓冲液进行洗脱，设置流速为0.5ml/min，收集重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。
步骤S4、对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行功能性评估。
具体而言，在所述步骤S13中，首先随机选取10个酶切点位，再使用限制性内切酶对若干所述酶切点位进行酶切，将酶切后的DNA片段与胶原蛋白的基因序列连接起来，对于每个酶切点位；
若连接失败，即无法将DNA片段与胶原蛋白的基因序列连接起来，则判定该酶切点位不合格；
若连接成功，即DNA片段与胶原蛋白的基因序列成功连接，则判定该酶切点位合格。
具体而言，在所述步骤S13中，若基因序列连接成功，对基因序列连接后的长度进行判定；
当基因序列长度不达标时，则判定该酶切点位不合格；
当基因序列长度达标时，则判定该酶切点位合格。
具体而言，在所述步骤S13中，针对基因序列连接成功后，但基因序列连接长度不合格的酶切点位，后续的酶切过程中将基因序列具有与上述合格的酶切点位的基因序列相同的特征(x，d)的点位作为酶切点位。
其中，x为酶切点位的位置，d为相邻两个酶切点位之间的距离；
具体而言，统计对应分子量内的基因序列上合格的酶切点位数量M与预设酶切点位数量M0进行比对；
当M≤M0时，则判定对应分子量的基因序列可用以酶切；
当M＞M0时，则判定对应分子量的基因序列不可酶切。
其中预设酶切点位数量M0取值为20。
具体而言，判定对应分子量的基因序列不能酶切时，对酶切点位数量进行调节，并根据酶切的合格率是否发生变化判定酶切方式；
若酶切的合格率发生变化，判定扩大酶切判定的(x，d)确定的范围值；
若酶切的合格率几乎不变，判定按照上述的酶切点位值进行基因设计。
具体而言，在所述步骤S14中，将上述提取的胶原蛋白基因序列插入到5μg的pPICZ质粒DNA中，利用0.1mM钙离子和5％聚乙烯醇增加酵母菌细胞膜的通透性，促进质粒进入细胞，将混合物在室温下静置15～30min，使质粒与酵母菌细胞发生转化，加入培养基，将转化后的细胞进行恢复培养，通常在30℃下进行。
具体而言，在所述步骤S15中，将转化后的酵母菌细胞在30℃下通过离心将细胞沉淀下来，将细胞重悬于含有聚乙二醇(PEG)和锂离子的转化缓冲液中，随后在MM培养基的培养皿中恢复培养，MM培养基的组成包括1.34％酵母氮基酸缺乏基础培养基(YNB)，4×10-5％的生物素和G418抗生素的浓度为200μg/mL，为确认是否成功转化，进行进一步酶切检测，验证目标基因的插入和表达，培养温度为30℃下进行24～72h的培养和观察，其中所述生物素包括2％葡萄糖，0.1mol醋酸钠缓冲液(pH＝5)，0.4％氨基酸混合物。
其中，所述酵母菌的品种为：Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母)，选择摇床培养进行氧气供应时，所述摇床的速度控制在250r/min，所述摇床倾斜角度为30°，培养瓶容量为250ml，装酵母菌液体的体积为30ml；
具体而言，在所述步骤S2中，从培养完成的培养皿中用移液器吸取酵母菌并转移到无菌的离心管中，离心管中的菌液用于进一步的实验或保存；取一块无菌的载玻片，并用移液器滴取一滴无菌蒸馏水在玻璃片上，以保持湿润；将培养皿中的酵母菌悬浮液吸取一滴，滴在预先湿润的载玻片上；将另一块无菌的盖玻片放在酵母菌悬浮液上，使其与底片紧密接触，将制备好的样品放在光学显微镜的载物台上，调整镜头和焦距，放大倍数为100倍，通过目镜观察酵母菌的形态和大小，并根据酵母菌的形态和大小进行初步筛选；
当用光学显微镜将酵母菌观察时，所述数据分析模块中的尺寸分析单元选择预设区域建立直角坐标系并测量酵母菌的长度和宽度，根据酵母菌长宽比S和预设长宽比S0的比对结果判定培养的酵母菌是否合格；
当S≤S0时，则判定培养的为合格酵母菌；
当S＞S0时，则判定培养的为不合格酵母菌。
其中酵母菌的预设长宽比S0的取值为1.5。
具体而言，所述步骤S23，当使用光学显微镜将酵母菌观察时，所述数据分析模块中的尺寸分析单元选择预设区域建立直角坐标系并测量酵母菌的长度和宽度，将所述酵母菌的长宽比和预设长宽比进行比对，以根据比对结果，确定培养的酵母菌是否合格，选择大小形状合适的酵母菌作为载体可以提高基因表达蛋白质的效率，从而提供稳定的基因表达环境，有助于降低重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的异常折叠和降解的可能性，从而增加重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的稳定性和产量，方便后续的操作和分析，使酵母菌细胞在培养、转染和分离过程中更易于处理，并且可以方便地进行重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的纯化和分析。
具体而言，在所述步骤S23中，根据细胞形状是否合格，调整步骤1.3的酶切点位；
当S≤S0时，则判定培养的为合格酵母菌；
当S＞S0时，则判定培养的为不合格酵母菌。
具体而言，在所述步骤S3中，收集培养液中的长宽比合格酵母菌细胞，并通过细胞破碎和离心将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白从细胞中提取出来，使用凝胶色谱层析技术和离子交换技术对蛋白质进行过滤，以对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行纯化和富集。在所述步骤S31中，将培养液中的长宽比合格的酵母菌细胞通过离心方法进行收集，离心条件为以转速为3000rpm且离心温度为4℃离心10min后，将上清液去除，保留细胞沉淀；在所述步骤S32中，将收集到的留细胞沉淀使用超声波破碎器进行破碎，以释放重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，其中设置超声功率为30％额定功率超声10s，超声间歇时间为10s，重复处理3次；在所述步骤S33中将破碎后的细胞悬浮液离心，以去除细胞碎片和细胞膜等杂质，离心条件为以转速为12000rpm且离心温度为4℃离心20min，将上清液转移到新的离心管中；在所述步骤S34中，选择分子量截留为10kDa的凝胶色谱柱，将上清液加载到柱上，流速为0.5ml/min，收集流出液；在所述步骤S35中使用阴离子交换树脂，将流出液加载到离子交换层析柱上，使用缓冲液进行洗脱，设置流速为0.5ml/min，收集重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。
具体而言，在所述步骤S32中，将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液加载到柱上，收集流出液，根据该纯度C和预设纯度C0的比对结果确定所述凝胶柱的层析速率；
当C≤C0时，确定以第一层析速率提纯所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白；
当C＞C0时，确定以第二层析速率提纯所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。
其中，预设纯度C0的取值为98％，第一层析速率0.2ml/min，第二层析速率0.5ml/min。
具体而言，在所述步骤S32中，将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液加载到柱上，收集流出液，根据该纯度和预设纯度的比对结果确定所述凝胶柱的层析速率，在纯度达小于等于预设纯度时，采用较低的层析速率可以增加重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的停留时间，从而提高重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的产量，高纯度的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白对于后续的功能性评估和应用具有重要意义。
具体而言，在所述步骤S4中，对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白样品进行样品制备，使用核磁共振(对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行结构分析和模型构建，确定重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的三维结构特征，并将纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶解在缓冲液中，进行生物活性测试实验，观察和记录实验结果，评估重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性。并对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性D和预设生物活性D0进行比对，以根据该比对结果，对酶切点位的选取范围进行选择；
当D≥D0时，确定所述酶切点位不合适并扩大对酶切点位的选取范围；
当D＜C0时，确定所述酶切点位合适并不对酶切点位的选取范围进行扩大。
其中，重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的预设生物活性D0取值为98％。
具体而言，在所述步骤S4中，使用核磁共振对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行结构分析和模型构建，确定重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的三维结构特征，并将纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶解在缓冲液中，进行生物活性测试实验，观察和记录实验结果，评估重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性更加准确地对制备的胶原蛋白进行活性控制，以使得能够更好地满足抵抗细胞衰老，体外修复的作用。
表1
表1表示，鉴定到的该蛋白所有肽段的数量为561；蛋白鉴定所有肽段的覆盖度为83.47％，蛋白理论氨基酸总数为599个，蛋白的丰度为9071166856.3。
请参阅图2-10所示，图2为重组胶原蛋白-Trypsin的质谱图，图3为重组胶原蛋白-Glu-c的质谱图；图4为HACAT细胞体外细胞迁移试验可以较为直观的评估Recollagen的屏障修复效果图；图5为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的HACAT细胞体外细胞迁移试验可以较为直观的评估Recollagen的屏障修复效果柱形图；图6为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的体外重建人表皮天狼猩红染色实验过程模型对照图；图7为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的体外重建人表皮天狼猩红染色实验过程对照图；图8为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法的No.23受试者和No.14受试者在D0、D14、D28后面部使用效果图；
图9为胶原蛋白原料抗衰老评价实验中受试者的皮肤弹性图的整体皱纹严重程度评分时间点对比折线图；图10为胶原蛋白原料抗衰老评价实验中受试者的皮肤弹性图的皮肤弹性Cutometer_R2时间点对比折线图。
实施例1：胶原蛋白原料体外修复实验中的细胞修复愈合率
将上述实施例制备得到的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白配以不同浓度和空白组以及使用EGF10001U/mI的实验组进行对照，修复2d后，通过HACAT细胞体外细胞迁移试验可以较为直观的评估Recollagen的屏障修复效果，具体请参照下图4和图5及表2：
将Recollagen溶液稀释至2mg/mL，在Transwell孔板的上室孔中加入200μL的Recollagen溶液，使其均匀覆盖孔底，将Recollagen溶液在室温下静置20～30min，使其凝胶化，将HACAT细胞培养至80～90％，用细胞培养基洗涤细胞，以去除培养基中的血清成分，使用细胞培养基将细胞重新悬浮，并将其转移到Recollagen基质中，在Transwell孔板的上室孔中加入1～2x105个HACAT细胞，在Transwell孔板的下室孔中加入600μL的培养基，以提供细胞迁移的趋化物质，将Transwell孔板放置在培养箱中，以37℃、5％CO2的条件培养24～48小时，以促进细胞迁移，结束培养后，将Transwell孔板取出，用洗涤液洗涤孔底的细胞，以去除未迁移的细胞，使用0.1％CrystalViolet染色迁移的细胞，并使用显微镜观察和计数迁移的细胞数量，并统计愈合率。
表2
由表2可见，空白对照组的愈合率为48.7％，与使用胶原蛋白修复剂的实验组相比，空白对照组的愈合效果较差，使用EGF10001U/mI的胶原蛋白修复剂，愈合率为59.8％，表明该修复剂在体外修复实验中具有一定的愈合效果，使用0.001％Recollagen的胶原蛋白修复剂，愈合率为42.2％，该修复剂的愈合效果最差，使用0.01％Recollagen的胶原蛋白修复剂，愈合率为78.3％，其提供了更多的胶原蛋白支架和生物活性物质，效果远远优于EGF10001U/mI的胶原蛋白修复剂，从而更好地促进了愈合过程，相比于EGF10001U/mI和0.001％Recollagen的修复剂，该修复剂的愈合效果更好，这是由于EGF10001U/mI是一种含有表皮生长因子(EGF)的胶原蛋白修复剂，具有促进细胞增殖和愈合的作用，而较高浓度的Recollagen对愈合效果更佳。
实施例2：胶原蛋白原料受损皮肤模型修复实验
通过化学诱导3D皮肤模型模拟受损皮肤模型，检测重组胶原蛋白在受损3D皮肤模型的渗透情况，模拟受损皮肤活性物是否能渗透起效，在体外重建人表皮天狼猩红染色实验，构建过程为：3D皮肤模型培养→SLS损伤模型造模→重组胶原的孵育→收集皮肤模型，组织切片及天狼猩红染色，对照组和Recollagen使用后的图片见图6和图7，实验表明:SLS受损皮肤模型加入重组胶原蛋白后，胶原蛋白有明显渗透进入的现象，说明Recollagen可以进人皮肤表皮角质层内，会继续渗透进人组织对皮肤的屏障进行修复。
实施例3：胶原蛋白原料抗衰老评价实验
共筛选人组360名年龄为25-50周岁健康女性受试者，评价Recollagen在通过标准化使用来比对使用前后之间的差异，实验过程中最终有340名受试者完成了整个测试，实验产品为0.2％Recollagen面霜产品，使用时间为连续使用4周，使用剂量为每天早晚全脸使用，每次0.6g，最后通过临床评价、图像追踪对使用前后的面部状态(脸部肌肤整体皱纹严重程度，皮肤的弹性度)进行综合评价。No.23受试者和No.14受试者在D0、D14、D28后面部使用效果图见图8，整体皱纹严重程度评分时间点对比折线图见图9，皮肤弹性Cutometer_R2时间点对比折线图见图10。实验结果表明，与使用前相比，整体皱纹严重等级在连续使用测试产品2周及4周后得到显著改善(P<0.05)，2周改善7.14％、4周改善23.5％，与使用前相比，皮肤毛估总弹性R2在连续使用测试产品2周及4周后得到显著改善(P<0.05)，2周改善6.15％、4周改善13.85％。
实施例4：胶原蛋白原料安全性实验
对340名实验人员，按照实验要求进行重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的应用，按照实验方案和剂量要求，将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白应用于实验人员的特定部位，并进行多项安全性实验，包括遗传毒性、生殖毒性、体外细胞毒性、迟发型超敏反应、刺激性实验、皮内反应、眼睛刺激、口腔刺激、直肠刺激、阴茎阴道刺激、全身毒性和亚慢毒性试验，在应用过程中，严格遵守实验室安全规范和伦理要求，确保实验的可靠性和实验人员的安全。
实验结果显示，重组Ⅲ型人源化胶原蛋白在这些实验中均表现为无毒性、无刺激性和无超敏反应，根据实验结果，可以得出以下结论：重组Ⅲ型人源化胶原蛋白在安全性实验中表现为无毒性、无刺激性和无超敏反应，重组Ⅲ型人源化胶原蛋白在临床实验中具有良好的安全性，不会对人体产生不良反应，具体检测结果见表2
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1、从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列；
步骤S2、从培养完成的酵母菌培养皿中将菌落用移液器吸取以初步筛选，筛选完成时收集培养液中的长宽比合格酵母菌细胞，转移到无菌的离心管中；
步骤S3、使用蛋白质纯化技术凝胶色谱层析技术和离子交换层析技术对蛋白质进行过滤，以对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行纯化和富集；
步骤S4、对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行功能性评估。
2.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：
步骤S11、通过基因组DNA提取方法从重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的源头中提取胶原基因序列；
步骤S12、准备酵母菌表达载体，选择酵母菌表达载体；
步骤S13、使用限制性内切酶对酵母菌表达载体和胶原基因序列进行酶切，选择酶切位点以确保插入的胶原基因序列与载体正确配对；
步骤S14、酶切后将提取的胶原蛋白基因序列插入到5μg的pPICZ质粒DNA中，将混合物在室温下静置15～30min，使质粒与酵母菌细胞发生转化；
步骤S15、将转化后的酵母菌细胞在30℃下通过离心将细胞沉淀下来，将细胞重悬于含有聚乙二醇(PEG)和锂离子的转化缓冲液中，随后在MM培养基的培养皿中恢复培养。
3.根据权利要求2所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：
步骤S21、取一片载玻片，并用移液器滴取一滴无菌蒸馏水在载玻片上以保持湿润，将培养皿中的酵母菌悬浮液吸取一滴，滴在预先湿润的载玻片上；
步骤S22、将盖玻片放在酵母菌悬浮液上，将制备好的样品放在光学显微镜的载物台上，调整镜头和焦距，放大倍数为100倍，通过目镜观察酵母菌的形态和大小，并根据酵母菌的形态和大小进行初步筛选。
4.根据权利要求3所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S3包括：
步骤S31、将培养液中长宽比合格的酵母菌细胞通过离心方法进行收集，离心条件为以转速为3000rpm且离心温度为4℃离心10min后，将上清液去除，保留细胞沉淀；
步骤S32、将收集到的留细胞沉淀使用超声波破碎器进行破碎，以释放重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，其中设置超声功率为30％额定功率超声10s，超声间歇时间为10s，重复处理3次；
步骤S33、将破碎后的细胞悬浮液离心，以去除细胞碎片和细胞膜等杂质，离心条件为以转速为12000rpm且离心温度为4℃离心20min，将上清液转移到新的离心管中；
步骤S34、选择分子量截留为10kDa的凝胶色谱柱，将上清液加载到柱上，流速为0.5ml/min，收集流出液；
步骤S35、使用阴离子交换树脂，将流出液加载到离子交换层析柱上，使用缓冲液进行洗脱，设置流速为0.5ml/min，收集重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。
5.根据权利要求4所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，在所述步骤S13中，首先选取若干酶切点位，使用限制性内切酶对若干所述酶切点位进行酶切，将酶切后的DNA片段与胶原蛋白的基因序列连接起来，对于每个酶切点位；
若连接失败，即无法将DNA片段与胶原蛋白的基因序列连接起来，则判定该酶切点位不合格；
若连接成功，即DNA片段与胶原蛋白的基因序列成功连接，则判定该酶切点位合格。
在所述步骤S13中，当连接成功时，对连接长度不合格的酶切点位，后续的酶切过程中将后续序列具有与上述合格的酶切点位的序列相同的特征(x，d)的点位作为酶切点位，其中x为酶切点位的位置，d为相邻两个酶切点位之间的距离；
统计对应分子量内的基因序列上合格的酶切点位数量M，并将该酶切点位数量M与预设酶切点位数量M0进行比对，以判定对应分子量的基因序列是否可用以酶切；
当M≤M0时，则判定对应分子量的基因序列可用以酶切；
当M＞M0时，则判定对应分子量的基因序列不可酶切。
6.根据权利要求5所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，当判定对应分子量的基因序列不能酶切时，对酶切点位数量进行调节，并根据酶切的合格率是否发生变化判定酶切方式；
若酶切的合格率发生变化，判定扩大酶切判定的(x，d)确定的范围值；
若酶切的合格率几乎不变，判定按照上述的酶切点位值进行基因设计。
7.根据权利要求6所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，在所述步骤S23中，当用光学显微镜观察酵母菌时，所述数据分析模块中的尺寸分析单元选择预设区域建立直角坐标系并测量酵母菌的长度和宽度，根据酵母菌长宽比S和预设长宽比S0的比对结果判定培养的酵母菌是否合格；
当S≤S0时，判定培养的为合格酵母菌；
当S＞S0时，则判定培养的为不合格酵母菌。
8.根据权利要求7所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，在所述步骤S32中，将重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液加载到凝胶色谱柱上，收集流出液，根据该流出液的纯度C和预设纯度C0的比对结果确定所述凝胶色谱柱的层析速率；
当C≤C0时，确定以第一层析速率提纯所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白；
当C＞C0时，确定以第二层析速率提纯所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。
9.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，在所述步骤S4中，使用核磁共振对纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白进行结构分析和模型构建，并将纯化的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶解在缓冲液中，对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性D和预设生物活性D0进行比对，以根据比对结果对步骤中的酶切点位进行选择，
当D≥D0时，确定所述酶切点位不合适并扩大对酶切点位的选取范围；
当D＜C0时，确定所述酶切点位合适并不对酶切点位的选取范围进行扩大。
10.根据权利要求9所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，在所述步骤S15中，所述酵母菌的品种为：Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母)；
在所述步骤S15中，选择摇床培养进行氧气供应，速度在150～250r/min，摇床角度略微倾斜30°；
在所述步骤S15中，为了使得对酵母菌提供更好的氧气，培养瓶容量为250ml，装酵母菌液体的体积为30ml。
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