KR20110099126A - 연장된 가용성 ｐｈ20 폴리펩티드 및 그의 용도 - Google Patents

연장된 가용성 ｐｈ20 폴리펩티드 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

연장된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한, 가용성 PH20 폴리펩티드 및 이들의 용도가 제공된다. 또한, 다른 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드 및 부분적으로 탈글리코실화된 PH20 폴리펩티드 및 이들의 용도가 제공된다.

Description

연장된 가용성 ＰＨ20 폴리펩티드 및 그의 용도{EXTENDED SOLUBLE PH20 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF}
연장된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하는, 가용성 PH20 폴리펩티드 및 이의 용도가 제공된다. 또한, 기타 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드 및 부분적으로 탈글리코실화된 PH20 폴리펩티드 및 이들의 용도가 제공된다.
히알루로난 (히알루론산: HA)은 많은 세포들의 세포외 기질, 특히, 연결합조직 내에서 발견되는 폴리펩티드이다. HA 는 또한 포유동물의 피부, 연골 및 윤활액(synovial fluid)에서 주로 발견된다. 히알루로난은 또한 눈의 유리체액의 주요한 구성요소이다. HA는 물과 혈장 단백질의 항상성에서와 같은 각종 생리적인 과정에서 역할을 한다(Laurent TC 등 (1992) FASEB J 6: 2397-2404). 특정 질환들은 히알루로난의 발현 및/또는 생산과 관련이 있다. 히알루로니다제는 히알루로난을 분해하는 효소이다. HA 를 촉매함으로써, 히알루로니다제는 HA 또는 다른 글리코사미노글리칸의 축적과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, HA 는 간극 장벽(interstitial barrier)의 주된 성분이기 때문에, 히알루로니다제는 조직 투과성을 증가시키고, 따라서, 치료 약제의 분산 및 전달을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 다양한 히알루로니다제들 (예컨대, 하이다제(Hydase)TM, 비트라제(Vitrase)TM, 및 와이다제(Wydase)TM) 이 다른 치료제와 병용하여, 치료적으로, 일반적으로 분산제 또는 산포제로써 사용되고 있다. 이들 중 다수는 양 또는 소 형태이며, 이는 인간의 치료에 대하여 면역원성일 수 있다. 치료용으로 사용될 수 있는 개선된 히알루로니다제 조성물이 요구되고 있다.
[관련 출원]
2009년 11월 13일에 제출된 "확장된 가용성 PH20 폴리펩티드 및 그의 용도"라는 명칭의 Ge Wei, Krishnasamy Panneerselvam, Louis Bookbinder 및 Gregory I. Frost 의 미국가출원번호 제61/281,240호; 및 2008년 12월 9일에 제출된 "확장된 가용성 PH20 폴리펩티드 및 그의 용도"라는 명칭의 Ge Wei, Krishnasamy Panneerselvam, Louis Bookbinder 및 Gregory I. Frost의 미국가출원번호 제61/201,384호에 대하여 우선권 이익이 주장된다. 허용된다면, 상기-언급된 관련 출원의 대상물은 그 전체가 참조로써 도입된다.
본 출원은 동일자로 제출된, 미국가출원번호 제61/281,240호 및 제61/201,384호에 대하여 우선권 주장된 "확장된 가용성 PH20 폴리펩티드 및 그의 용도"라는 명칭의 미국출원번호 제12/653,245호와 관련이 있다.
허용된다면, 상기-언급된 관련 출원의 대상물은 그 전체가 참조로써 도입된다.
[요약]
본원에서는 연장된 가용성 PH20 (esPH20) 폴리펩티드를 포함한, 가용성 PH20 폴리펩티드 및 조성물이 제공된다. 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 C-말단에서 절단된 가용성 단백질이고, GPI-앵커 부착 신호 서열의 전부를 결여한 것들을 포함한다 (예컨대, 아미노산 위치 450 내지 490 에서 절단됨). 가용성 PH20 폴리펩티드는 또한 상응하는 전장 야생형 PH20 폴리펩티드의 GPI-앵커 부착 신호 서열에 위치하는 하나 이상의 잔기를 보유하는 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한다. 또한, C-말단 절단들을 포함하는 다른 변형된 PH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 상기 폴리펩티드들 중 어느 것의 부분적으로 탈글리코실화된 형태가 또한 제공된다. 또한, 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드를 사용한 치료방법이 제공된다.
N-글리코실화 또는 N-부분 글리코실화될 수 있는, 분리되고 실질적으로 정제된 연장된 가용성 PH20 (esPH20) 히알루로니다제가 본원에서 제공된다. 일부 예에서, N-부분 글리코실화 esPH20 폴리펩티드는 2개 이상의 N-연결 잔기의 각각, 예컨대, 서열번호 107 의 아미노산 잔기 368 및 393, 또는 서열번호 107 의 아미노산 잔기 368 및 393 에 상응하는 잔기에 연결된 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 일부 국면에서, N-부분 글리코실화 esPH20 폴리펩티드는 2개 이상의 N-연결 잔기의 각각에 연결된 2개 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 본원에서 제공되는 N-부분 글리코실화 esPH20 폴리펩티드는 또한 분지된 당을 포함할 수 있다.
서열번호 60-63 및 102-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 esPH20 폴리펩티드 또는 이의 대립유전자 또는 종 변이체가 본원에서 제공된다. 서열번호 60-63 및 102-104 중 어느 하나와 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖고, 상응하는 비변형 형태 또는 서열번호 107의 아미노산 36-482 를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 히알루로니다제 활성의 30% 이상을 보유하는 esPH20 폴리펩티드 변이체가 또한 제공된다. 그러한 esPH20 폴리펩티드는 가용성이고, 중성 활성인 채로 유지된다. 한 예에서, esPH20 은 인간 esPH20, 예컨대 서열번호 60-63 및 102-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 침팬지 esPH20, 예컨대, 서열번호 197의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497 또는 36-498 로써 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이다.
또한 실질적으로 정제된 PH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 PH20 폴리펩티드는 서열번호 55-63 및 64-95 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 또는 종 변이체를 가질 수 있다. 다른 예에서, PH20 폴리펩티드는 서열번호 55-63 및 64-95 중 어느 하나와 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖고, 상응하는 비변형 형태 또는 서열번호 107의 아미노산 36-482 를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 히알루로니다제 활성의 30% 이상을 보유하는 변이체이다. 그러한 PH20 폴리펩티드는 중성 활성이다.
본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 N-글리코실화되거나, 또는 N-부분 글리코실화될 수 있다. 일부 예에서, N-부분 글리코실화 esPH20 폴리펩티드는 2개 이상의 N-연결 잔기의 각각, 예컨대, 서열번호 107 의 아미노산 잔기 368 및 393, 또는 서열번호 107 의 아미노산 잔기 368 및 393 에 상응하는 잔기에 연결된 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 일부 국면에서, N-부분 글리코실화 PH20 폴리펩티드는 2개 이상의 N-연결 잔기의 각각에 연결된 2개 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 본원에서 제공되는 N-부분 글리코실화 PH20 폴리펩티드는 또한 분지된 당을 포함할 수 있다. 일부 국면에서, 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 가용성이며, 인간, 침팬지, 뱅골원숭이 (rhesus monkey), 사이노몰거스 원숭이, 마우스, 토끼, 기니피그, 소 또는 양 PH20 중에서 선택될 수 있다.
본원에서 제공되는 esPH20 및 PH20 폴리펩티드는 예를 들어, 시알화, 알부민화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화 또는 인산화에 의하여 변형될 수 있다. 일부 국면에서, esPH20 및 PH20 폴리펩티드는 폴리머, 예컨대, 덱스트란 또는 PEG 에 의해 변형될 수 있다. esH20 또는 PH20 폴리펩티드를 포함하는 접합체가 또한 본원에서 제공된다. 접합체의 예는 esPH20 또는 PH20이 다량체화 도메인 (예컨대, Fc 도메인), 톡신, 탐지가능한 표지 또는 약물에 접합된 것들을 포함한다.
상기 기술되고, 본원에서 제공되는 esPH20 및 PH20 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 본원에서 제공된다. 이러한 핵산은 서열번호 107 의 아미노산 36-450, 36-451, 36-452, 36-453, 36-454, 36-455, 36-456, 36-457, 36-458, 36-459, 36-460, 36-461, 36-462, 36-463, 36-464, 36-465, 36-484, 36-485, 36-486, 36-487, 36-489, 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 또는 36-497 에 상응하는 아미노산을 갖는 esPH20 또는 PH20 폴리펩티드를 암호화하는 것들 및 서열번호 197의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497 또는 36-498 에 상응하는 아미노산을 갖는 esPH20 을 암호화하는 것들을 포함한다. 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포, 예컨대, CHO 세포가 또한 본원에서 제공된다.
본원에 기재된 esPH20 또는 PH20 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 예에서, 상기 조성물은 복수의 esPH20 또는 PH20 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 상기 조성물은 서열번호 107 의 아미노산 36-450, 36-451, 36-452, 36-453, 36-454, 36-455, 36-456, 36-457, 36-458, 36-459, 36-460, 36-461, 36-462, 36-463, 36-464, 36-465, 36-484, 36-485, 36-486, 36-487, 36-489, 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 또는 36-497 에 상응하는 아미노산을 암호화하는 핵산 분자 및 서열번호 197의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497 또는 36-498 에 상응하는 아미노산을 갖는 esPH20 을 암호화하는 것들에 의해 인코딩되는 복수의 esPH20 를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 조성물은 CHO 세포로부터 분비된 esPH20 또는 PH20 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 제공되는 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 일부 예에서, 상기 조성물은 추가의 치료제를 포함하며, 이는 그 조성물과 함께 또는 별개의 조성물 내에 제형화될 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물 내 포함될 수 있는 치료제의 예는 화학치료제, 진통제, 항염증제, 항균약, 아칸트아메바각막염 치료제 (amoebicidal agent), 살트로트코모노균제 (trichomonocidal agent), 항파킨슨제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 및 항관절염제, 항진균제, 혈압강하제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린성 작용제, 알파 블록커 제제, 마취제, 기관지확장제, 살생물제, 살균제, 정균제, 베타 아드레날린 차단제, 칼슘 채널 블록커, 심혈관 약제, 피임제, 충혈제거제, 이뇨제, 진정제, 진단약, 전해질 약제, 수면제, 호르몬제, 고혈당 약제, 근육이완제, 근육수축제, 안과용제, 부교감신경흥분제, 심리활력제, 진정-수면제, 교감신경흥분제, 신경안정제, 요로제, 질제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드계 항염증제, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 약물, 유기분자 및 수면 유도제이다. 특별한 예에서, 상기 치료제는 항체, 면역글로불린, 비스포스포네이트(예컨대, 졸렌트론산), 사이토카인, 화학치료제 또는 인슐린 (예컨대, 속효성 인슐린)이다.
본원에서 제공되는 조성물 내 포함될 수 있는 다른 치료제는, 이에 제한되지 아니하나, 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인 (9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈;모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르를 포함한다.
대상체에 본원에서 제공되고, 기술된 esPH20 또는 PH20, 또는 esPH20 또는 PH20 를 포함하는 조성물을 투여하는, 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 또한, 글리코사미노글리칸 과다를 치료하는 방법; 뇌 내 글리코사미노글리칸 축적을 치료하는 방법; 심혈관 장애를 치료하는 방법; 안질환을 치료하는 방법; 폐질환을 치료하는 방법; 고형 종양 내 화학치료제의 침투를 증가시키는 방법; 셀룰라이트를 치료하는 방법; 또는 약물 또는 다른 치료제의 생체이용률을 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 방법들은 본원에 기재된 esPH20 또는 PH20 폴리펩티드 중 어느 것을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 제공되는 esPH20 및 PH20 폴리펩티드는 PH20 히알루로니다제가 미국공개공보 US20040268425, US20050260186, 및 US20060104968; 및 미국출원번호 12/381,844, 12/386,249, 12/387,225 및 12/386,222 에서 사용된 어느 치료방법 또는 병용요법에서 단독 또는 병용으로 PH20 히알루로니다제 대신 사용될 수 있다.
도 1은 인간 (서열번호 107) 및 침팬지 (서열번호 197) PH20 폴리펩티드의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다 (ClustalW2 배열 프로그램을 이용하여 수행됨). 인간 PH20 GPI-앵커 부착 신호 서열의 아미노산 잔기들 및 침팬지 PH20 서열 내 상응하는 아미노산들은 굵은글씨체 및 밑줄로 표시되어 있다. "*"는 상기 잔기들이 배열 상 두 서열에서 동일한 것을 가리킨다. ":" 는 보존적 치환을 가리키고, "." 는 반보존적 치환을 가리킨다.
도 2는 고 만노스 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 복합체 글리칸을 포함한, 척추동물의 N-글리칸의 주된 형태를 묘사한다.
도 3은 엔도글리코시다제 절단 부위를 나타낸다. 도 3A 는 엔도글리코시다제 F1 및 펩티드 N 글리코시다제 F (PNGaseF) 의 절단 부위를 묘사한다. 도 3B 는 엔도글리코시다제 F2 및 PNGasesF 의 절단 부위를 묘사한다. 도 3C 는 엔도글리코시다제 F3 및 PNGasesF 의 절단 부위를 묘사한다. 도 3D 는 엔도글리코시다제 F4 및 PNGasesF 의 절단 부위를 묘사한다.
[상세한 설명]
개관
A. 정의
B. 개관
1. PH20
a. 글리코실화
b. GPI-앵커링
C. 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드
1. 인간 esPH20 폴리펩티드
2. 다른 종 esPH20 폴리펩티드
D. N-부분 글리코실화 PH20 폴리펩티드
1. PH20 폴리펩티드
2. C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드
3. 추가적 변형
폴리머에 접합
E. 연장된 가용성 PH20 및 다른 가용성 PH20 히알루로니다제를 암호화하는 핵산 및 이의 폴리펩티드의 제조방법
1. 벡터 및 세포
2. 발현
a. 원핵세포
b. 효모세포
c. 곤충세포
d. 포유동물 세포
e. 식물체
3. 정제 기술
F. 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드 및 다른 가용성 PH20 폴리펩티드의 제제, 제형화 및 투여
1. 주사가능물질, 용액 및 에멀젼
동결건조 분말
2. 국소 투여
3. 다른 투여 경로용 조성물
4. 용량 및 투여
5. 포장, 제조품 및 키트
G. 검정
1. 히알루로니다제 활성
2. 용해도
H. 연장된 가용성 PH20 및 다른 가용성 PH20 의 치료방법 및 용도 및 병용요법
1. 산포제 및 병용요법으로써 용도
2. 과다 글리코사미노글리카나제 제거를 위한 용도
a. 암치료에서 용도
b. 뇌 내 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서 용도
c. 심혈관 질환에서 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서 용도
d. 유리체절제술 및 안과 장애 및 상태에서 용도
e. 피하주입에서 용도
f. 유전자 치료에서 용도
g. 미용적 용도
h. 장기 이식에서 용도
i. 폐 질환에서 용도
3. 기타 용도
I. 실시예
A. 정의
달리 정의된 바 없다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 포함된다. 본원에서 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다. 여기의 참조는 그 이용가능성 및 상기 정보의 공중의 보급성을 증명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로니다제는 히알루로난을 분해하는 효소의 한 분류이다. 히알루로니다제는 박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1), 거머리, 다른 기생동물, 및 갑각류 동물 유래 히알루로니다제(EC 3.2.1.36), 및 포유동물-형 히알루로니다제(EC 3.2.1.35)를 포함한다. 히알루로니다제는 또한 쥣과(murine), 개, 고양이과, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, 개구리(ranine), 박테리아, 및 거머리, 다른 기생동물 및 갑각류 유래의 어느 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-인간 기원의 임의의 것을 포함한다. 인간 히알루로니다제의 예는 HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 PH20(서열번호 107)를 포함한다. 또한, 히알루로니다제 중에는 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20 을 포함한, 가용성 히알루로니다제가 포함된다. 시판되는 소 또는 양 가용성 히알루로니다제의 예는 비트라제(Vitrase)® 히알루로니다제 (양 히알루로니다제) 및 암파다제(Amphadase)® 히알루로니다제 (소 히알루로니다제)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, PH20 은 정자에서 생성되며, 중성-활성인 히알루로니다제의 한 종류를 나타낸다. PH-20은 정자 표면 및 리소좀-유래 아크로좀 내에서 생성되며, 여기서, 내부 아크로좀 막에 결합되어 있다. PH20 은 이에 제한되지 아니하나 인간, 침팬지, 사이노몰거스 원숭이, 뱅골원숭이, 설치류, 소, 양, 기니피그, 토끼 및 랫트 기원을 포함하는 임의의 기원의 것들을 포함한다. PH20 폴리펩티드의 예는 인간 (서열번호 107), 침팬지 (서열번호 197), 뱅골원숭이(Rhesus monkey) (서열번호 198), 사이노몰거스 원숭이 (서열번호 114), 소 (예컨대, 서열번호 111 및 119); 마우스 (서열번호 117); 랫트 (서열번호 116); 토끼 (서열번호 112); 양 (서열번호 113, 118 및 120) 및 기니피그 (서열번호 115) 유래의 것들을 포함한다. PH20 에 대한 언급은 전구체 PH20 폴리펩티드 및 성숙한PH20 폴리펩티드 (예컨대, 신호 서열이 제거된 것들), 활성을 갖는 이의 절단형을 포함하며, 서열번호 107 및 109 에 제시된 전구체 폴리펩티드 또는 이의 성숙한 형태와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한, 대립유전자 변이체, 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 인코딩되는 변이체 및 기타 변이체를 포함한다. PH20 폴리펩티드는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형들은 이에 제한되지 아니하나 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화, 인산화 및 기타 당 분야에 알려진 폴리펩티드 변형을 포함한다. 절단된 PH20 히알루로니다제는 그의 임의의 C-말단 단축 형태, 특히 말단절단되고 N-글리코실화된 경우 중성 활성인 형태이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 PH20은 생리 조건 하에서 가용성인 PH20 의 임의의 형태를 나타낸다. 가용성 PH20 은 예를 들어 37℃ 에서 트리톤® X-114 용액의 수성상 내로 분별하여 확인될 수 있다. (Bordier 등, (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). 막-앵커된 PH20, 예컨대, GPI-앵커된 PH20 을 포함한 지질-앵커된 PH20 은 세제-풍부상 내로 분별되나, 포스포리파제 C 처리 후 세제-부족 상 또는 수성 상으로 분별된다. 가용성 PH20 중에는 막에 PH20 의 앵커링과 관련된 하나 이상의 영역이 제거되거나 변형되고, 가용성 형태가 히알루로니다제 활성을 보유하는 막-앵커된 PH20 이 포함된다. 가용성 PH20 은 또한 재조합 가용성 PH20 및 천연 공급원, 예컨대, 양 또는 소 유래 고환 추출물에 포함되거나 그로부터 정제된 것들을 포함한다. 상기 가용성 PH20 의 예는 가용성 인간 PH20 이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20 은 발현시 폴리펩티드가 생리학적 조건 하에서 가용성이도록 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 서열의 전부 또는 일부를 결여한 PH20 폴리펩티드를 포함한다. 용해도는 생리학적 조건하에서 용해도를 나타내는 임의의 적절한 방법에 의하여 평가될 수 있다. 상기 방법의 예는 상기 및 실시예에 기재된 수성 상 내로 분별되는 것을 측정하는 트리톤® X-114 검정법이다. 또한, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는, CHO 세포, 예컨대 CHO-S 세포에서 생산된다면, 발현되어 세포 배양 배지 내로 분비되는 폴리펩티드이다. 그러나, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는 CHO 세포 내 생산되는 것들에 제한되지 아니하나, 재조합 발현 및 폴리펩티드 합성을 포함한, 임의의 세포 내에서 또는 임의의 방법에 의하여 생산될 수 있다. CHO 세포 내 분비라는 언급은 한정적이다. 따라서, 폴리펩티드가 CHO 세포 내에서 발현되고 분비될 수 있고, 가용성이라면, 즉 트리톤® X-114 로 추출시 수성상 내로 분별된다면, 그것이 그렇게 생산되었든지 아니든 가용성이다. sHuPH20 폴리펩티드에 대한 전구체 폴리펩티드는 신호서열, 예컨대 이종기원이거나 비-이종기원 (즉, 천연) 신호 서열을 포함할 수 있다. 전구체의 예는 신호서열, 예컨대 아미노산 위치 1-35의 천연 35 아미노산 신호 서열(예컨대, 서열번호 107의 아미노산 1-35)을 포함하는 것들이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "연장된 가용성 PH20" 또는 "esPH20"은 esPH20 이 생리학적 조건 하에서 가용성이도록 GPI 앵커-부착 신호 서열까지의 잔기들 및 GPI 앵커-부착 신호 서열로부터 하나 이상의 인접하는 잔기들을 포함하는 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한다. 생리학적 조건 하 용해도는 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 및 실시예에 기재된 트리톤® X-114 에 의해 검정될 수 있다. 또한, 상기 논의된 바와 같이, 가용성 PH20 은, CHO 세포에서 생산된다면, 발현되어 세포 배양 배지 내로 분비되는 폴리펩티드이다. 그러나, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는 CHO 세포 내 생산되는 것들에 제한되지 아니하나, 재조합 발현 및 폴리펩티드 합성을 포함한, 임의의 세포 내에서 또는 임의의 방법에 의하여 생산될 수 있다. CHO 세포 내 분비라는 언급은 한정적이다. 따라서, 폴리펩티드가 CHO 세포 내에서 발현되고 분비될 수 있고, 가용성이라면, 즉 트리톤® X-114 로 추출시 수성상 내로 분별된다면, 그것이 그렇게 생산되었든지 아니든 가용성이다. 인간 가용성 esPH20 폴리펩티드는 생성되는 폴리펩티드가 가용성이도록 36-490 잔기들에 추가로 서열번호 107 의 아미노산 위치 491 로부터 (이를 포함하여) 하나 이상의 인접한 아미노산을 포함한다. 인간 esPH20 가용성 폴리펩티드의 예는 서열번호 107 의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 및 36-497 에 상응하는 아미노산 잔기들을 갖는 것들이다. 이들의 예는 서열번호 60-63 및 102-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것들이다. 또한, 대립유전자 변이체 및 기타 변이체, 예컨대, 중성 활성을 보유하고, 가용성인, 서열번호 60-63 및 102-104 의 상응하는 폴리펩티드와 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 어느 것을 포함한다. 서열 동일성에 대한 언급은 아미노산 치환을 갖는 변이체를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, esPH20 에 대한 언급은 전구체 esPH20 폴리펩티드 및 성숙한 esPH20 폴리펩티드 (예컨대, 신호 서열이 제거된 것들), 효소 활성을 가지고 (전장 형태의 적어도 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상을 보유), 가용성인 절단형을 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 인코딩되는 변이체, 및 서열번호 107 및 109 에 제시된 전구체 폴리펩티드 또는 이들의 성숙한 형태에 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한 기타 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, esPH20 에 대한 언급은 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 그러한 변형은 이에 제한되지 아니하나 페길화 (PEG화), 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화, 인산화 및 기타 당 분야에 알려진 폴리펩티드 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary(CHO)) 세포에서 재조합적으로 발현되고 분비된 인간 PH20의 가용성 형태를 나타낸다. 가용성 rHuPH20는 신호 서열을 포함한 핵산에 의해 인코딩되며, 서열번호 109에 제시되어 있다. 또한 이의 대립유전자 변이체 및 다른 가용성 변이체인 DNA 분자가 포함된다. 가용성 rHuPH20를 암호화하는 핵산은 성숙한 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포 내에서 발현된다. 배양 배지에서 생산되는 것과 같이, C-말단에 불균일(heterogeneity)이 있기 때문에 산물은 서열번호 122 내지 서열번호 127 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있는 종들의 혼합물을 포함한다.
유사하게, 다른 PH20 의 형태, 예컨대, esPH20 에 대하여, 재조합적으로 발현된 폴리펩티드 및 이의 조성물은 C-말단이 불균질성을 나타내는 복수의 종들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 36-497 을 갖는 esPH20 을 암호화하는 서열번호 8의 폴리펩티드의 발현에 의하여 제조된 재조합적으로 발현된 esPH20 의 조성물은 더 적은 아미노산, 예컨대, 36-496, 36-495 를 갖는 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, N-연결 잔기는 폴리펩티드의 번역후 변형에 의해 글리코실화될 수 있는 폴리펩티드의 아스파라긴 (N) 아미노산 잔기를 나타낸다. 인간 PH20 의 N-연결 잔기의 예는 서열번호 107 에 제시된 인간 PH20 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, N-글리코실화 폴리펩티드는 3개 이상의 N-연결 아미노산 잔기, 예컨대, 서열번호 107의 아미노산 잔기 N235, N368 및 N393 에 상응하는 N-연결 잔기의 올리고당 연결을 포함하는 PH20 폴리펩티드 또는 이의 절단형을 나타낸다. N-글리코실화 폴리펩티드는 3, 4, 5 및 전부까지의 N-연결 잔기가 올리고당에 연결된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. N-연결 올리고당은 올리고만노스, 복합체, 하이브리드 또는 황산화 올리고당, 또는 기타 올리고당류 및 단당류를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, N-부분 글리코실화 폴리펩티드는 3개 이상의 N-연결 잔기들에 연결된 N-아세틸글루코사민 글리칸을 최소로 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 부분 글리코실화 폴리펩티드는 다양한 글리칸 형태, 예컨대, 단당류, 올리고당류 및 폴리펩티드와 EndoH, EndoF1, EndoF2 및/또는 EndoF3 의 처리에 의해 형성되는 것들을 포함한 분지형 당 형태를 포함할 수 있다. 효소에 의한 글리칸의 절단은 예를 들면 도 2에 묘사되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드는 모든 가능한 글리코실화 위치들이 거의 글리코실화되지 않은, 본원에서 제공하는 PH20 을 나타낸다. 탈글리코실화는 예를 들면 글리코실화의 제거, 그의 방지, 또는 글리코실화 위치를 제거하기 위한 폴리펩티드의 변형에 의하여 달성될 수 있다. 본원에서 나타난 바와 같이, 특정 N-글리코실화 위치들은 활성을 위하여 요구되지 않는 반면, 다른 것들은 그러하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로난-관련 질환, 장애 또는 상태는 히알루로난 수준이 원인, 결과로써 또는 그렇지아니하면 질환 또는 상태에서 관찰되는 바와 같이 상승된 임의의 질환 또는 상태를 나타낸다. 히알루로난-관련 질환 또는 상태는 조직 또는 세포 내에서 히알루로난 발현 증가, 간질액 압력 증가, 혈관 부피 증가 및/또는 조직 내의 수분 함량 증가와 관련이 있다. 히알루로난-관련 질환, 장애 또는 상태는 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물을 단독으로 또는 다른 치료 및/또는 작용제와 함께 병용하여 또는 그에 추가로 투여하여 치료될 수 있다. 질환 및 상태의 예는 히알루로난-풍부 암, 예를 들면, 말기암, 전이성 암, 미분화 암, 난소암, 상피내암(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 대장암 및 다른 암 등의 고형 종양을 포함하는 종양을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 히알루로난-관련 질환 및 상태의 예는 간질액 압력 증가와 연관된 질환, 예를 들면, 디스크 압박과 연관된 질환 및 부종, 예를 들면 장기 이식, 뇌졸중, 뇌외상 또는 다른 손상에 기인한 부종이다. 히알루로난-관련 질환 및 상태의 예는 간질액 압력 증가, 혈관 부피 감소 및/또는 암, 디스크 압박 및 부종을 포함한 조직내의 수분함량 증가를 포함한다. 일례에서, 히알루로난-관련 상태, 질환 또는 장애의 치료는 간질액 압력(IFP) 증가, 혈관부피 감소 및 조직내의 수분함량 증가 중 하나 이상에 대한 개선, 감소 또는 다른 유익한 효과를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 접합체는 하나 이상의 다른 폴리펩티드 또는 화학적 잔기에 직접 또는 간접적으로 연결된 가용성 PH20 폴리펩티드를 나타낸다. 상기 접합체는 융합 단백질, 화학적 접합체에 의해 생산된 것들, 및 접합체가 히알루로니다제 활성을 보유하는 한 다른 폴리펩티드 또는 화학적 잔기에 직접 또는 간접적으로 하나 이상의 가용성 PH20 폴리펩티드가 연결되는, 임의의 다른 방법을 포함한다. 본원에서 제공되는 접합체의 예는 다량체화 도메인, 예컨대 Fc 잔기, 톡신, 표지 또는 약물에 직접 또는 간접적으로 연결된 PH20 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 융합 단백질은 한 핵산 분자 유래 코딩 서열 및 다른 핵산 분자 유래 코딩 서열을 포함하고, 융합 구축물이 숙주 세포 내에서 전사되고 번역될 때 단백질이 상기 2개의 단백질을 포함하여 생산되도록 상기 코딩 서열들이 동일 판독 프레임 내에 존재하는, 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 나타난다. 상기 2개 분자는 구축물 내에 인접하거나, 1, 2, 3 이상, 그러나, 일반적으로 10, 9, 8, 7 또는 6 미만의 아미노산을 포함하는 링커 폴리펩티드에 의해 분리될 수 있다. 융합 구축물에 의해 인코딩된 단백질 산물은 융합 폴리펩티드로써 언급된다. 융합 단백질의 예는 Fc 융합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로니다제 등의 히알루로난 분해효소에 접합된 폴리머란 히알루로난 분해효소에 직접적으로 또는 링커를 통해 공유결합되거나 달리 안정하게 결합된 임의의 폴리머를 말한다. 이러한 폴리머는 일반적으로 혈청 반감기를 증가시키고, 시알산 잔기, 페길화 잔기, 덱스트란 및 당 및 다른 잔기들, 예를 들면 글리코실화를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 활성이란 전장(완전한) 단백질과 관련된 폴리펩티드 또는 그 부분의 기능적 활성 또는 활성들을 말한다. 기능적 활성은 생물학적 활성, 촉매 또는 효소 활성, 항원성 (항-폴리펩티드 항체에 결합하거나 폴리펩티드와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력 및 폴리펩티드의 수용체 또는 리간드에 특이하게 결합하는 능력을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로니다제 활성이란 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매작용하는 능력을 말한다. 히알루로니다제에 대한 미국약전(The United State Pharmacopeia; USP) XXII 분석법은 효소를 HA와 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 더 높은 분자량의 히알루론산 또는 잔류하는 히알루로난(HA) 기질의 양을 측정함으로써 간접적으로 히알루로니다제 활성을 결정한다 (USP XXII-NF XVII(1990), 644-645, United Strate Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). 참조 표준용액은 임의의 히알루로니다제의 유닛내에 상대적인 활성을 확인하기 위한 평가에 사용될 수 있다. 히알루로니다제, 예를 들면 가용성 PH20 또는 esPH20 을 포함한 PH20 의 히알루로니다제 활성을 분석하기 위한 시험관내 분석은 공지되어 있으며, 본원에 기재되어 있다. 분석법의 예는 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때에 형성된 불용성 침전물을 검출함으로써 히알루로니다제에 의한 히알루론산의 절단을 간접적으로 측정하는, 하기 기재된 미세탁도 분석을 들 수 있다 (예를 들면, 실시예 12 참조). 예를 들면 히알루로니다제의 유닛을 측정할 때에 활성을 결정하기 위한 표준곡선을 만들기 위해 참조표준을 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 중성 활성은 중성 pH 에서 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매하는 PH20 폴리펩티드의 능력을 나타낸다. 본원에서 제공하는 중성 활성 C-말단 절단 또는 N-부분 글리코실화 PH20 는 C-말단 절단 또는 N-부분 글리코실화가 없는 상응하는 중성 활성 PH20 의 히알루로니다제 활성과 비교하여 약 또는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상을 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, GPI-앵커 부착 신호 서열은 ER 의 내강에서 폴리펩티드에 미리형성된 GPI-앵커의 부가를 지시하는 아미노산의 C-말단 서열이다. GPI-앵커 부착 신호 서열은 GPI-앵커된 폴리펩티드, 예컨대, GPI-앵커된 PH20 폴리펩티드의 전구체 폴리펩티드 내에 존재한다. C-말단 GPI-앵커 부착 신호 서열은 일반적으로 8-20 아미노산의 대부분 소수성 영역, 그 앞의 8-12 아미노산의 친수성 스페이서 영역, GPI-앵커 부착의 ω-위치 또는 위치의 바로 하류를 포함한다. GPI-앵커 부착 신호 서열은 당 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이들은 생물정보 웹사이트, 예컨대, ExPASy 프로테오믹스 툴 사이트 (예컨대, 월드와이드웹 사이트 expasy.ch/tools/)에서 쉽게 이용할 수 있는 것들을 포함하여, 인실리코 방법 및 알고리즘을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (예컨대, Udenfriend 등 (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber 등, (1999) J. Biol . Chem. 292: 741-758, Kronegg 및 Buloz, (1999), "Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)", 예컨대, 웹사이트 129.194.185.165/dgpi/, Fankhauser 등, (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria 등, (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni 등, (2008) BMC Bioinformatics 9:392).
본원에서 사용된 바와 같이, 비푸코실화 폴리펩티드(bifucosylated polypeptide)는 폴리펩티드 사슬 내 아스파라긴 잔기에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 가지며, 동일한 코어 N-아세틸글루코사민 잔기에 연결된, 2개의 푸코스 잔기, α1,3-연결을 갖는 하나 및 α1,6-연결을 갖는 다른 하나를 가지는 폴리펩티드이다. 비푸코실화 폴리펩티드는 일반적으로 곤충세포에서 생산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA, 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함하는 이들의 유사체, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 예컨대, 형광 또는 방사성 동위원소와 같은 검출가능한 표지로 선택적으로 표지되어 있는 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 상기 분자는 일반적으로 그들의 표적이 통계적으로 고유한 길이이거나, 라이브러리 탐지 또는 프라이밍을 위하여 낮은 카피수 (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)이도록 하는 길이를 갖는다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 상보적이거나 동일한 서열의 14, 16 또는 30 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 펩티드는 2 아미노산 이상의 길이이고, 40 아미노산 이하의 길이인 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 제공되는 아미노산의 다양한 서열 내에 존재하는 아미노산은 그들의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어(표 1)에 의해 표시된다. 다양한 핵산 절편 내 존재하는 뉴클레오티드들은 당 분야에서 일상적으로 사용되는 표준 단일-문자 명명법으로 명명된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)시 형성되는 아미노산을 나타낸다. 본원에서 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성체 형태로 간주된다. "D" 이성체 형태의 잔기라 명명된 잔기들은 원하는 기능적 성질이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기를 대체할 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 나타낸다. COOH는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 나타낸다. J. Biol . Chem., 243:3557-3559(1968)에 기재되고, 37 C.F.R. §§1.821-1.822를 채택한 표준 폴리펩티드 명명법을 유지하면서, 아미노산 잔기들에 대한 약어를 표 1에 나타낸다:
대응표
기호
1-문자 3-문자 아미노산
Y Tyr 티로신
G Gly 글리신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ile 이소루이신
L Leu 루이신
T Thr 트레오닌
V Val 발린
P Pro 프롤린
K Lys 라이신
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
Z Glx Glu 및/또는 Gln
W Trp 트립토판
R Arg 아르기닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아스파라긴
B Asx Asn 및/또는 Asp
C Cys 시스테인
X Xaa 불명 또는 기타
본원에 식으로 나타난 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단부터 카르복시 말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 가진다. 또한, "아미노산 잔기"라는 어구는 대응 표(표 1)에 기재된 아미노산 및 변형된 아미노산 및 희귀 아미노산, 예컨대 37 C.F.R. §§1.821-1.822에 언급된 것들 및 참조로써 본원에 삽입된 것들을 포함하도록 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대쉬(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 아미노-말단기, 예컨대, NH2에, 또는 카르복실-말단기, 예컨대, COOH에 대한 펩티드 결합을 지시한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "천연적으로 발생하는 아미노산"은 인간 내 하전된 tRNA 분자와 그의 인식 mRNA 의 특이적 인식에 의하여 단백질 내에 도입되는 자연계에서 발견되는 상기 20 α-아미노산의 잔기들이다. 따라서, 비-천연적으로 발생하는 아미노산은 예를 들면 20개의 천연-발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산의 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-이소스테레오머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-천연 아미노산의 예는 본원에 기재되고, 당업계의 당업자에 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 분절을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로써 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 카피들을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, DNA 분절(segment)은 특이한 성질을 가지는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절은 더 큰 DNA 분자, 예컨대, 5'에서 3' 방향으로 해독시 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드 절편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 자연 출처로부터 분리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드(약어로 "nt") 또는 염기쌍(약어로 "bp")이라는 용어로 본원에서 주어진다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자를 위해 사용된다. 상기 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 전체 길이를 나타내기 위하여 사용되며, 상기 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥은 길이에 있어 약간 상이할 수 있으며, 이들의 말단이 엇갈려 있을 수 있고; 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드들이 짝을 이루지 않을 수 있다는 것이 당해 기술분야의 당업자에게 인식될 것이다. 상기 짝이 없는 말단은, 일반적으로, 20 뉴클레오티드의 길이를 초과하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그안에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초할 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법은 당해 기술분야에 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열 사이에 최고 수준의 동일성을 나타내는 방식으로 배열된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 다르지 않은 정도를 나타낸다. 아미노산 서열, 어느 정도에서 뉴클레오티드 서열에 대한 배열(alignment)시 또한 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보전적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보전적 차이는 관련된 잔기들의 물리-화학적 성질을 보존하는 것들이다. 배열은 전체적(서열의 전체 길이에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함하는, 비교되는 서열의 배열)이거나 지역적(가장 유사한 영역 또는 영역들 만을 포함하는 서열의 부분의 배열)일 수 있다.
"동일성(identity)"은 그 자체로 기술로-인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 사용하여 측정될 수 있다(예컨대, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 참조). 두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 수많은 방법들이 있지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 널리 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073(1988)).
본원에서 사용된 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 상동인(homologous)은 약 25% 이상의 서열 동일성, 전형적으로 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 의미하며; 필요하다면, 정확한 백분률이 특정될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 용어 "상동성" 및 "동일성"은 다르게 지시된바 없다면 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분률 상동성 또는 동일성의 결정을 위하여, 최고 수준 매칭이 얻어지도록 서열을 배열한다(예를 들어, computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data , Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조). 서열 동일성에 의하여, 보존된 아미노산의 수가 표준 배열 알고리즘 프로그램에 의하여 결정되어, 각 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(defualt gap penalties)를 가지고 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심있는 핵산의 길이 전부를 따라 전형적으로 보통의 엄격성(stringency)으로, 또는 높은 엄격성으로 혼성화된다. 또한 혼성화하는 핵산 분자 내 코돈 대신에 축퇴성 코돈(degenerate codon)을 포함하는 핵산 분자가 고려된다.
임의의 두개의 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일한" 또는 "상동인" 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 가지는지 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, Pearson 등(1988) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 85:2444(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., 등, J Molec Biol 215:403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)에서와 같은 디폴트 파라미터들을 사용한 "FASTA" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생물공학 정보를 위한 국립센터(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 상동성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 또는 대중적으로 이용가능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신대학 유전학 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)) "Gap" 프로그램(Madison WI)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분률 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용한 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다(예를 들면, Needleman 등 (1970) J. Mol. Biol. 48:443, Smith 및 Waterman에 의해 개정(1981) Adv. Appl. Math. 2:482). 요약하면, 상기 GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 총수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)들의 수로써 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값을, 비동일성에 대해 0 의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl . Acids Res . 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각각의 기호에 대하여 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음을 포함할 수 있다.
따라서 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "~에 90% 이상 동일한"은 참조 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 99.99 백분률의 동일성을 나타낸다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 100 아미노산의 시험 및 참조 폴리펩티드 길이를 비교한다고 상정하여 시험 폴리펩티드 내 아미노산의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 참조 폴리펩티드의 아미노산과 다르다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교를 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이에 행할 수 있다. 상기 차이는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 무작위적으로 분포된 점 돌연변이(point mutation)로서 나타날 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용가능한, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상기 약 85 내지 90% 초과의 상동성 또는 동일성의 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적이어야 하고; 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의지함이 없이 수동 배열에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 배열된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 내 상응하는 위치를 배열하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성으로 관련된 둘 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에서 배열되는 2 이상의 서열을 의미하며, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열하는 서열(aligning sequence)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "프라이머"는 적절한 조건 하(예컨대, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예컨대 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 평가될 수 있다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록시기를 가진다. 프라이머는 다양한 방법 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT) PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐 PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜에서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들면, PCR에 의해)증폭되는 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 분자(예를 들면, 올리고뉴클레오티드)가 표적 핵산 분자에 상보적 염기-쌍에 의하여 어닐링하는 것을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 시험관내 및 생체내 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. 시험관내 혼성화에 특히 관련된 파라미터는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄격성(stringency)에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은 0.1x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 보통 엄격성에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위하여 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위하여 상기 파라미터들을 용이하게 조정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 상보적인은 뉴클레오티드의 두 서열이 전형적으로 상대되는 뉴클레오티드 사이에 25%, 15% 또는 5% 미만의 불일치를 가지고 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 필요하다면, 상보성의 백분률은 특정될 것이다. 전형적으로 상기 2개의 분자는 이들이 높은 엄격성의 조건 하에서 혼성화하도록 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "산물에 실질적으로 동일한"은 관심있는 성질이 충분히 바뀌지 않아 실질적으로 동일한 산물이 본래 산물 대신 사용될 수 있을 정도로 충분히 유사하다는 의미이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"은 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 변경되는 것으로도 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대립유전자 변이체 또는 대립유전자 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 둘 이상의 임의의 선택적인 형태를 의미한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵적이거나(인코딩된 폴리펩티드에 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 용어 "대립유전자 변이체"는 또한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 인코딩되는 단백질을 지시하기 위하여 본원에서 사용된다. 일반적으로 유전자의 참조 형태는 군집 또는 한 종의 참조 구성원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 인코딩한다. 일반적으로, 대립유전자 변이체는 종 간 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자, 및 비교가 이종간인지 종내인지에 좌우된다. 일반적으로, 이종간 대립유전자 변이체는 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 포함하여, 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 그 이상을 가진다. 본원에서 대립유전자 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동일한 종의 구성원 간의 단백질 내 변이를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 "대립유전자 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립유전자"는 그들의 유전자 또는 일부의 대안적인 형태를 의미한다. 대립유전자는 상동 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 대상이 한 유전자의 2개의 동일한 대립유전자을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자 또는 대립유전자에 대해 동형접합성(homozygous)이라고 언급된다. 대상이 한 유전자의 2개의 상이한 대립유전자을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입과 같은 변형을 포함할 수 있다. 유전자의 대립유전자는 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 종 변이체는 다른 포유류 종들, 예컨대 마우스와 사람을 포함한 상이한 종 간 폴리펩티드의 변이체를 의미한다. 본원에서 제공되는 종 변이체의 예는 영장류 PH20, 이에 제한되지 아니하나 예컨대 인간, 침팬지, 머카크 및 사이노몰거스 원숭이이다. 일반적으로, 종 변이체는 70%, 75%. 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상의 서열 동일성을 가진다. 종 변이체들 사이의 상응하는 잔기들은 매칭되는 뉴클레오티드 또는 잔기들의 수를 최대화하기 위하여, 예컨대, 두 서열 간의 상동성이 95% 이상이거나, 96% 이상이거나, 97% 이상이거나, 98% 이상이거나, 99% 이상이도록 비교하고, 배열하여 결정될 수 있다. 이어서, 관심있는 위치에 기준 핵산 분자에서 할당된 숫자를 부여한다. 배열은 특히 서열 동일성이 80% 초과인 경우 수동으로 또는 눈으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 도 1의 배열은 인간 PH20 의 아미노산 잔기 491 이 침팬지 PH20 의 아미노산 잔기 491 에 상응하고, 인간 PH20 의 아미노산 잔기 497 이 침팬지 PH20 의 아미노산 잔기 498 에 상응하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 하나 초과의 mRNA 형태를 초래하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차별적 프로세싱에 의해 생성되는 변이체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 변형은, 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 변형에 관한 것이며, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것과 같이 당업자에게 통상적인 일이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나 일반적으로 유전자의 5' 비-코딩 지역에서 발견된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 생물학적으로 활성 부분은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예컨대, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대, 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 활성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 실질적으로 정제된 폴리펩티드, 예컨대 실질적으로 정제된 연장된 가용성 PH20 의 언급은 분리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포성 성분으로부터 분리된 단백질의 제제를 포함하는, 세포성 물질이 실질적으로 없는 PH20 단백질의 제제를 나타낸다. 한 구현예에서, 세포성 물질이 실질적으로 없는 이라는 용어는 약 30% 미만(건중량)의 비-효소 단백질(또한 본원에서 오염 단백질이라 언급됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 효소 단백질이 재조합적으로 제조시, 이는 또한 배양 배지가 실질적으로 없는 것이다. 즉, 배양 배지가 효소 단백질 제제의 부피의 약 또는 20%, 10% 또는 5% 미만인 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 은 단백질이 그 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30%(건중량) 미만, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 비-효소 화학물질 또는 성분을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의하여 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의하거나, 재조합 DNA 방법을 이용한 제조는 클로닝된 DNA에 의해 인코딩되는 단백질 발현을 위한 분자 생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종기원 (heterologous) 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위한 세포 내에 도입하기 위하여 사용되는 별개의 요소를 의미한다. 벡터는 일반적으로 에피좀(episome)으로 남지만, 유전자 또는 그의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합(integration)이 실행되도록 설계될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 DNA 절편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 영역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 부가적 분절은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있으며, 임의적으로는 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택마커, 인핸서, 폴리아데닐레이션 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vector)"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로써) 외래 유전자를 세포 내로 운반하도록 외래 유전자에 작동가능하게 연결된 제작된 바이러스이다.
본원에서 사용된 바와 같이, DNA 분절을 언급할 때의 "작동가능하게" 또는 "작동가능하게 연결된"은 상기 분절이 그들의 의도된 목적, 예컨대, 전사가 프로모터의 하류 및 임의의 전사될 서열의 상류에서 개시될 목적으로 일제히 기능하도록 배열된 것을 의미한다. 프로모터는 통상 전사 기구가 결합하여 전사를 개시하고 코딩 분절을 거쳐 터미네이터까지 진행하도록 하는 도메인이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 평가(assessing)는 시료 내 존재하는 프로테아제 또는 이의 도메인의 활성에 대한 절대값의 획득 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분률, 시각적 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것을 의도한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있으며, 실제 검출되는 화학 종은 물론 단백질 가수분해 산물 그 자체일 필요는 없으나, 그의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들면, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루를 이용한 단백질 염색에 의한 보체 단백질의 절단 산물의 검출.
본원에서 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물의 생체내 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체내 투여시 초래되는 생리학적 반응을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료적 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험하거나 사용하기 위해 설계된 시험관내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원의 목적을 위하여, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩티드를 가수분해하는 그의 촉매 활성이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열을 언급할 때의 "동등한"은 문제된 2개의 서열들이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 코딩하는 것을 의미한다. "동등한"이 2개의 단백질 또는 펩티드를 언급하는데 사용되는 경우, 이는 2개의 단백질 또는 펩티드가 상기 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 변형만을 가지는, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. "동등한"이 성질을 언급하는 경우, 상기 성질은 동일한 정도로 나타날 필요는 없으나(예컨대, 2개의 펩티드가 동일한 종류의 효소 활성을 다른 속도로 나타낼 수 있다), 상기 활성은 대개 실질적으로 동일하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조절하다(modulate)" 및 "조절(modulation)" 또는 "변경하다(alter)"는 분자, 예컨대 단백질의 활성의 변화를 의미한다. 예시적인 활성은 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달(signal transduction)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가(즉, 상향조절 또는 작용제 활성), 활성의 감소(즉, 하향조절 또는 억제) 또는 활성의 임의의 다른 변경(예컨대, 주기성, 빈도, 지속시간, 동역학 또는 다른 파라미터의 변화)를 포함한다. 조절은 문맥에 좌우되며, 전형적으로 조절은 지정된 상태, 예를 들어, 야생형 단백질, 구성적 상태의 단백질, 또는 지정된 세포 종류 또는 상태에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조합은 2개 이상의 항목 간의 임의의 연합을 의미한다. 조합은 2개 이상의 별개의 항목, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2개 이상의 항목의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 또는 관련되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고, 확인가능한 증상을 특징으로 하는 개체 내 병리학적 상태를 의미한다. 본원에서 관심 있는 질환 및 장애는 ECM 의 성분을 포함하는 것들이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 대상을 "치료하는 것"은 대상의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 치료 후 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 의미한다. 치료는 또한 본원에서 제공되는 변형된 히알루로니다제 및 조성물의 임의의 약학적 이용을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약학적으로 유효한 제제는 마취제, 혈관수축제, 분산제, 통상의 치료용 약물, 예컨대, 비스포스포네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 저분자 약물, 인슐린, IgG 분자 및 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 치료용 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 치료제 또는 생물활성 약제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 치료제는 마취제, 혈관수축제, 분산제, 통상의 치료용 약물, 예컨대, 비스포스포네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 저분자 약물, 인슐린, IgG 분자 및 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 치료용 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 약학적으로 유효한 제제 또는 생물활성 약제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 다른 적응증의 증상을 개선하거나 또는 그렇지 않다면 유리하게 변경하는 임의의 방식을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료 효과는 질환 또는 상태의 증상을 변경, 일반적으로는, 개선하거나 완화하는, 또는 질환 또는 상태를 치유하는, 대상의 치료로부터 얻어지는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상에 투여 후 치료 효과를 야기하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 포유동물, 예컨대 사람을 포함한 동물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 환자는 질환 또는 장애의 증상을 나타내는 인간 대상을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은 상기 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 관련할 수 있는 징후의 영구적 또는 일시적인, 지속적 또는 일시적인, 임의의 경감을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태를 발전시킬 위험을 감소시키는 방법을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 그와 관련될 수 있는 임의의 증상의, 영구적 또는 일시적, 지속적 또는 순간적 경감을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태의 발전 위험이 감소되는 방법을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 유효한 용량"은 치료 효과를 생성하기에 최소한 충분한 양으로 화합물을 포함하는 작용제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 의미한다. 따라서, 질환 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적 정지에 필요한 양을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단위 복용 형태(제형)는 인간 및 동물 대상에 적절하고, 당업계에 알려진 바와 같이 개별 포장된 물리적으로 분리된 단위를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일 복용 제형은 직접 투여를 위한 제형을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이,"제조품"은 제조되어 판매되는 제품을 의미한다. 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 동일 또는 개별 포장 물품 내 포함된, 가용성 PH20, 예컨대 esPH20과 치료제, 또는 esPH20 단독을 포괄하는 의도이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반-고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "키트"는 본원에서 제공되는 조성물과, 재구성, 활성화 및 전달용 기구/장치, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 포함하나 이에 국한되지 않는 목적의 다른 물품의 조합물을 의미한다. 키트는 선택적으로 사용 지침서를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)은 용해되거나 또는 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함한 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지 및 다른 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-인간 동물은 고려된 동물로서 인간을 배제한다. 본원에서 제공되는 효소는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵세포 및 진균 유래이다. 대부분 효소들은 포유동물 기원을 포함한 동물 기원이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대조군은 시험 파라미터로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 의미하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 그것은 관심 있는 상태로 감염되지 않은 정상적 지원자 유래일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 가지는 화합물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 또한 "5개의 염기"를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "임의적인(선택적인)" 또는 "임의적으로(선택적으로)"는 이어서 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환이거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 보호기, 아미노산, 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 통상적인 사용법에 따라서 공지된 약어 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법을 사용한다((1972), Biochem. 11:1726 참조).
B. 개관
히알루로니다제는 히알루론산의 가수분해를 촉매하여, 히알루론산의 점성을낮추고, 조직 투과성을 증가시키는 효소이다. PH20은 글리코실화되어 최적의 활성을 나타내는 중성-활성 및 산성-활성인 히알루로니다제이다. 인간 PH20은 단백질의 C-말단에 부착된 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 혈장 막의 세포외 소엽구조에 앵커되는 GPI-앵커된 단백질이다. GPI 앵커의 모든 GPI-앵커된 단백질에 첨가는 ω-위치(일반적으로 C-말단으로부터 약 20-30 아미노산에 위치)라고 불리는 특정 아미노산 위치에서 절단 및 ER 에서 C-말단 부분의 제거 후 발생한다. C-말단 부분은 GPI-앵커된 부착 신호 서열이다. 인간 PH20 의 GPI-앵커 부착 신호 서열은 서열번호 107 에 제시된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 491-509 에 위치하며, ω-위치는 아미노산 위치 490 이다. GPI-앵커된 PH20 폴리펩티드, 예컨대, 인간 PH20 은 막-결합되어 있고, 따라서 불용성이다. PH20 의 불용성 형태는 일반적으로 치료 목적에 적합하지 않다.
GPI 앵커를 결여한 PH20 폴리펩티드는 그 폴리펩티드를 막에 고정시키는 GPI-부착 신호 서열을 포함하고 있지 않기 때문에 일반적으로 발현시 세포에 의해 분비된다. PH20 의 가용성 형태는 또한 GPI-앵커 부착 신호 서열 내 잔기들을 포함하는 것들을 포함한다. 연장된 가용성 PH20 (esPH20) 폴리펩티드는 C-말단에서 절단되어 있으나, 상응하는 야생형 PH20 폴리펩티드의 GPI-앵커 부착 신호 서열 내 위치하는 하나 이상의 아미노산 잔기들을 보유하는 가용성 PH20 단백질이다. 그러한 esPH20 폴리펩티드는 가용성이며, 치료용 폴리펩티드, 예컨대 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 치료하기 위하여, 및/또는 다른 제제, 약물 및 단백질의 분산 및 전달을 개선하거나, 향상시키거나 증가시켜 함께 투여되는 제제, 약물 또는 단백질의 약동학 및 약력학적 프로파일을 개선하기 위한 산포제 또는 분산제로써 제공하기 위하여 이용될 수 있다.
1. PH20
정자 표면 단백질, 정자 부착 분자 1, SPAM1 또는 HYAL3 으로도 알려진 PH20 은 히알루로니다제이다. 히알루로니다제는 세포외 기질의 필수 성분이자 간극 장벽의 주된 구성요소인 히알루론산 (또한 히알루로난 또는 히알루로네이트 또는 HA 로 알려짐)을 분해하는 효소의 패밀리이다. 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다제는 히알루론산의 점도를 낮추어 조직 투과성을 증가시킨다. 따라서, 히알루로니다제는 예컨대 다른 제제, 약물 및 단백질과 관련하여 산포제 또는 분산제로써 사용되어 이들의 분산 및 전달을 향상시키고, 함께 투여되는 제제, 약물 또는 단백질의 약력학 및 약동학적 프로파일을 개선한다.
PH20 은, 기타 포유동물 히알루로니다제와 마찬가지로, 히알루론산의 β1→4 글리코시드 결합을 각종 길이의 다당류, 예컨대 사탄당 및 육탄당으로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다제이다. PH20 은 가수분해 활성 및 트랜스글리코시다제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S 를 분해할 수 있다. PH20 는 본래 정자-난자 결합에 수반되고, 히알루론산 소화에 의해, 정자에 의한 난구세포층의 침투를 보조한다. PH20 는 정자 표면 및 라이소좀-유도성 첨체에 위치해 있으며, 여기서 내첨체막에 결합되어 있다. 형질막 PH20 는 중성 pH 에서만 히알루로니다제 활성을 갖는 반면, 내첨체막 PH20 는 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 갖는다. 히알루로니다제에 추가하여, PH20 도 또한 HA-유도성 세포 신호전달에 대한 수용체, 및 난자를 둘러싼 투명층에 대한 수용체인 것으로 나타난다.
PH20 단백질의 예는, 이에 제한되지 않으나, 인간 (서열번호 107 에 제시된 전구체 폴리펩티드, 서열번호 108 에 기재된 성숙형 폴리펩티드), 소 (서열번호 111 및 119), 토끼 (서열번호 112), 양 (서열번호 113, 118 및 120), 사이노몰거스 원숭이 (서열번호 114), 기니피그 (서열번호 115), 랫트 (서열번호 116), 마우스 (서열번호 117), 침팬지 (서열번호 197) 및 뱅골원숭이 (서열번호 198) PH20 폴리펩티드를 포함한다. 인간 PH20 mRNA 전사물은 번역되어 일반적으로, N-말단에 35 개의 아미노산 신호 서열 (서열번호 107의 아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 를 포함하는 509 개의 아미노산 전구체 폴리펩티드 (서열번호 107) 를 생성한다. 따라서, ER 로의 이동 및 신호 펩티드의 제거 후, 서열번호 108 에 제시된 아미노산 서열을 갖는 474 아미노산 성숙형 폴리펩티드가 생성된다. 하기 논의되는 바와 같이, C-말단 펩티드는 그후 ER 내에서 절단되어 서열번호 107 에 제시된 전구체 폴리펩티드의 위치 490 에 상응하는 아미노산 위치에 새로 형성된 C-말단 아미노산에 GPI 앵커의 공유결합을 촉진한다.
인간 PH20 는 일반적으로 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 형질막에 고정되어 있는 프로토타입 중성-활성 히알루로니다제이다. 상기 주지된 바와 같이, PH20 은 또한 중성 및 산성 pH 의 모두에서 히알루로니다제 활성을 갖는 내첨체막 상에서 발현된다. 증거는, 서열번호 107 에 제시된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 142 내지 172에 해당하는 펩티드 1 영역이 중성 pH 에서의 효소 활성에 필요하다는 것을 시사한다. 펩티드 3 영역은, 서열번호 107 에 제시된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 277 내지 297 에 해당하는데, 산성 pH 에서의 효소 활성에 중요한 것으로 나타난다. (Cherr 등, (2001) Matrix Biology 20:515-525). 따라서, PH20 은 2개의 촉매 부위를 포함하는 것으로 보인다. 촉매 부위에 추가로, PH20 은 또한 히알루로난-결합 부위를 포함한다. 실험적 증거는 상기 부위가 서열번호 107 에 제시된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 205-235 에 상응하는 펩티드 2 영역에 위치한다는 것을 시사한다. 상기 영역은 히알루로니다제들 간에 매우 보존적이며, 헤파린 결합 부위와 유사하다.
a. 글리코실화
촉매활성 및 안정성을 위해, 히알루로니다제를 포함하는 일부의 히알루로난 분해효소의 N- 및 O-결합 글리코실화를 포함하는 글리코실화가 중요할 수 있다. N-결합 올리고당류는 여러 주요한 형태(올리고만노스, 복합체, 하이브리드)로 분류되고, 모두 -Asn-Xaa-Thr/Ser 서열(여기서 Xaa는 Pro가 아니다)내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 부착된 (Man)3-GlcNAc-GlcNAc 코어를 갖는다. -Asn-Xaa-Cys- 에서 추가의 글리코실화 부위가 응고 단백질 C 에 대하여 보고되었다. 일부 예에서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, PH20 은 서열번호 107 에 예시된 인간 PH20의, 아미노산 T475 에서 하나의 O-연결 올리고당 뿐 아니라 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 에서 6개의 N-연결 올리고당을 가진다. 아미노산 잔기 N82, N166 및 N254 은 복합체 형 글리칸에 의해 차지되는 반면, 아미노산 잔기 N368 및 N393 은 고 만노스 형 글리칸에 의해 차지된다 (예컨대, 하기 실시예 6 참조). 아미노산 잔기 N235 는 대략 80% 의 고 만노스 형 글리칸 및 20% 의 복합체 형 글리칸에 의해 차지된다.
당단백질을 변형하는 글리칸의 형태를 변경하여 단백질의 항원성, 구조적 접힘, 용해도 및 안정성에 대한 현저한 효과를 가질 수 있는 반면, 대부분의 효소는 최적의 효소활성에 대한 글리코실화가 필요하다고 생각되지 않는다. 일부 히알루로니다제에 대해, N-결합 글리코실화를 제거하여 히알루로니다제 활성의 거의 완전한 불활성화를 일으킬 수 있다. 따라서, 이러한 히알루로니다제에 대해, 활성 효소를 생성하기 위해 N-결합 글리칸의 존재가 중요하다. PH20 폴리펩티드 내 N-연결 글리칸의 존재가 활성 효소의 생성을 위하여 필요하다. 예를 들어, 엔도글리코시다제 PNGaseF 또는 GlcNAc 포스포트랜스퍼라제 (GPT) 억제제 투니카마이신의 처리에 의한 인간 PH20 의 완전한 탈글리코실화는 히알루로니다제 활성의 전부 상실을 초래한다 (하기 실시예 7-8 참조). 반대로, 엔도글리코시다제 EndoF1, EndoF2, EndoF3 또는 EndoFH 의 처리에 의한 인간 PH20 의 부분적 탈글리코실화는 인간 PH20 의 히알루로니다제 활성에 영향을 주지 않는다 (예컨대, 하기 실시예 7 참조).
b. GPI - 앵커링
인간 PH20 은 GPI-앵커된 단백질이다. 따라서, PH20 폴리펩티드는 단백질의 C-말단에 부착된 글리코실-포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 혈장 막의 세포외 소엽에 앵커되어 있다. GPI-앵커된 단백질, 예컨대, 인간 PH20은 단백질을 소포체(ER)로 지시하는 절단가능한 N-말단 신호 펩티드와 함께 번역된다. 이러한 단백질의 C-말단에, ER 의 내강 내에서 폴리펩티드에 미리형성된 GPI-앵커의 첨가를 지시하는 다른 신호 서열이 있다. GPI-앵커의 첨가는 ω-위치(일반적으로 C-말단으로부터 약 20-30 아미노산에 위치)라고 불리는 특정 아미노산 위치에서 C-말단 부분의 절단 후 발생한다. 비록 ω-위치의 위치를 확인하는 컨센서스 서열은 없는 것으로 보이지만, GPI 앵커된 단백질은 C-말단 GPI-앵커 부착 신호 서열 또는 ω-위치의 바로 하류 8-20 아미노산의 친수성 스페이서 지역에 앞서는, 8-20 아미노산의 소수성 지역을 우세하게 포함하는 도메인을 포함한다. 이러한 친수성 스페이서 지역은 종종 하전된 아미노산들 및 프롤린이 풍부하다 (White 등, (2000) J. Cell Sci . 113(Pt.4):721-727). 보다 상세한 분석은 낮은 양의 예측된 이차 구조를 특징으로 하는 ω-1 위치 앞의 약 11 아미노산 영역, 작은 측쇄 잔기의 존재를 특징으로 하는 ω-1부터 ω+2 의 절단 부위 (ω-위치) 주변 지역, 위치 ω+3 내지 ω+9 의 스페이서 지역, 및 ω+10 내지 C-말단 끝의 소수성 꼬리가 있는 것을 시사한다 (Pierleoni 등, (2008) BMC Bioinformatics 9:392).
비록 GPI-앵커 부착 신호 컨센서스 서열이 없지만, 생물정보 웹사이트에서 쉽게 입수할 수 있는 것들, 예컨대, ExPASy 프로테오믹스 툴 사이트 (expasy.ch/tools/) 을 포함한, 폴리펩티드 내 그러한 서열을 확인하는데 사용될 수 있는 다양한 인실리코 방법 및 알고리즘들이 개발되었다 (Udenfriend 등 (1995) Methods Enzymol . 250:571-582; Eisenhaber 등, (1999) J. Biol . Chem . 292: 741-758; Kronegg and Buloz, (1999), "Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)", 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser 등, (2005) Bioinformatics 21:1846-1852; Omaetxebarria 등, (2007) Proteomics 7:1951-1960; Pierleoni 등, (2008) BMC Bioinformatics 9:392). 따라서, 당업자는 PH20 폴리펩티드가 GPI-앵커 부착 신호 서열을 포함할 것이지, 따라서, PH20 폴리펩티드가 GPI-앵커된 단백질인지 결정할 수 있다.
인간 PH20의 GPI-앵커 부착 신호 서열은 서열번호 107 에 제시된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 491-509 에 위치하고 있으며, ω-위치는 아미노산 위치 490 이다. 따라서, 이러한 인간 PH20 의 모델링에서, 아미노산 491-509 는 ER 로 이동 후 절단되고, GPI 앵커는 위치 490 의 세린 잔기에 공유결합된다. GPI-앵커의 인간 PH20 의 C-말단에 공유결합 및 그로인한 PH20 의 막-결합 성질은 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C (PI-PLC) 가수분해 연구를 이용하여 확인되었다 (예컨대, Lin 등, (1994) J. Biol . Chem. 125:1157-1163 및 하기 실시예 3 참조). 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C (PI-PLC) 및 D (PI-PLD) 는 GPI 앵커를 가수분해하여, 세포막으로부터 PH20 폴리펩티드를 방출한다. 따라서, 생성된 방출형 PH20 폴리펩티드는 가용성이다. 가용성 PH20 은 당 분야에 공지된 방법, 이에 제한되지 아니하나 예컨대, 하기 및 실시예 4에 기재되는 것과 같은 트리톤® X-114 검정을 이용한 것들을 이용하여 검출되고, 불용성, 막-결합 PH20 과 구별될 수 있다. 이러한 분석에서, 가용성 PH20 은 37℃ 로 가온된 트리톤® X-114 용액의 수성상 내로 분별되는 반면, 막-앵커된 PH20 히알루로니다제는 세제 풍부 상으로 분별된다 (Bordier 등, (1981) J. Biol . Chem., 256:1604-7). 따라서, PH20 폴리펩티드가 자연적으로 GPI-앵커되어 있는지 평가하는 알고리즘을 이용하는 것에 추가로, 용해도 실험이 또한 실시될 수 있다.
C. 연장된 가용성 PG20 폴리펩티드
연장된 가용성 PH20 (esPH20) 폴리펩티드 및 조성물이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 esPH20 의 예는 인간 및 침팬지 esPH20 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 영장류 esPH20 폴리펩티드이다. 본원에서 제공되는 esPH20 은 가용성으로, 즉 분비되며, C-말단에서 절단되어 있으나, 상응하는 야생형 PH20 의 GPI-앵커 부착 신호 서열 내 위치하는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기들을 보유하는 PH20 단백질 (예컨대, 아미노산 위치 491-500 에서 말단 절단됨)이다. 생성되는 esPH20 폴리펩티드가 가용성인 것을 전제로, esPH20 폴리펩티드는 GPI-앵커 부착 신호 서열의 일부의 제거에 의한 것인 GPI-앵커된 폴리펩티드의 변형에 의한 임의의 GPI-앵커된 PH20 폴리펩티드로부터 생산될 수 있다. 용해도, 또는 세포 배양 배지 내 분비는 재조합 발현 및 폴리펩티드 합성을 포함한 당 업자에 알려진 임의의 방법에 의해 PH20 폴리펩티드가 생산될때 SDS-PAGE 및 발현시 웨스턴 블롯팅 분석, 또는 대안적으로 하기 및 실시예 4에 기재된 것과 같은 트리톤® X-114 검정에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 제공되는 esPH20 폴리펩티드는 예를 들어 치료용 폴리펩티드, 예컨대 다른 제제, 약물 및 단백질과의 관계에서 산포제 또는 분산제로 사용되어 이들의 분산 및 전달을 향상시키고, 함께 투여되는 제제, 약물 또는 단백질의 약동학 및 약력학적 프로파일을 개선시킬 수 있다.
본원에서 제공되는 esPH20 폴리펩티드는 esPH20 폴리펩티드가 가용성이라면, 즉, 하기 기재된 바와 같은 트리톤® X-114 용액의 수성상 내로 분별된다면 GPI-부착 신호 서열 유래 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상의 아미노산 잔기들을 포함한다. 본원에서 제공되는 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드는 임의의 천연적 GPI-앵커된 PH20 폴리펩티드에 C-말단 절단을 만듦으로써 생성될 수 있으며, 여기서 생성된 esPH20 폴리펩티드는 가용성이고, GPI-앵커 부착 신호 서열 유래 1 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 당업자는 당 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 PH20 폴리펩티드가 GPI-앵커되었는지를 결정할 수 있다. 그러한 방법들은 이에 제한되지 아니하나, GPI-앵커 부착 신호 서열 및 ω-부위의 존재 및 위치를 예측하기 위한 공지의 알고리즘을 이용하는 것, 및 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C (PI-PLC) 또는 D (PI-PLD) 로 소화 전/후 용해도 분석을 수행하는 것을 포함한다.
esPH20 폴리펩티드의 예는 이에 제한되지 아니하나 영장류의 esPH20 폴리펩티드, 예컨대, 인간 및 침팬지 esPH20 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 본원에서 제공되는 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 107, 108 또는 197 에 제시된 성숙형 또는 전구체 폴리펩티드, 또는 이들의 대립유전자 또는 이들의 활성 절편을 포함한 기타 변이체 중 어느 하나의 C-말단 절단에 의해 만들어질 수 있으며, 여기서 생성된 폴리펩티드는 가용성이고, GPI-앵커 부착 신호 서열 유래 1 이상 아미노산 잔기들을 보유한다. 대립유전자 변이체 및 기타 변이체는 당업자에게 공지되어 있으며, 서열번호 107, 108 및 197 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 생성되는 esPH20 폴리펩티드가 가용성이고, GPI-앵커 부착 신호 서열 유래 1 이상 아미노산 잔기들을 보유하는 것을 전제로, 야생형 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 107, 108 및 197 에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 아미노산이 C-말단 절단될 수 있다.
본원에서 제공되는 연장된 가용성 esPH20 폴리펩티드는 히알루로니다제 활성을 보유한다. 추가로, esPH20 폴리펩티드는 중성 활성, 즉, 중성 pH 에서 히알루로니다제 활성을 보유한다. 히알루로니다제 활성은 PH20 의 야생형 GPI-앵커된 형태와 비교하여 증가되거나 감소될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 제공되는 esPH20 은 야생형 GPI-앵커된 형태에 의해 나타나는 히알루로니다제 활성의 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낼 수 있다.
1. 인간 esPH20 폴리펩티드
본원에서 제공되는 esPH20 폴리펩티드의 예는 인간 esPH20 폴리펩티드이다. 본원에서 제공되는 esPH20 폴리펩티드는 가용성이며, GPI-앵커 부착 신호 서열 유래 1 이상 아미노산 잔기들을 포함한다. 따라서, GPI 가 GPI-앵커 부착 신호 서열을 완전히 결여하지 않은 인간 PH20 의 가용성 형태가 본원에서 제공된다.
본원에서 제공되는 전구체 인간 esPH20 폴리펩티드는 이에 제한되지 아니하나 서열번호 107 에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 을 포함하는 폴리펩티드를 생성하기 위한 C-말단 절단을 갖는 것들을 포함한다. 포유동물세포에서 발현시, 35 아미노산 N-말단 신호 서열은 프로세싱 동안 절단되어, 단백질의 성숙한 형태가 분비된다. 따라서, 성숙한 인간 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 107 의 아미노산 36 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 을 포함한다. 따라서, 본원에서 제공되는 성숙한 인간 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 59-63 및 100-104 에 제시된 것들 또는 이들의 대립유전자 또는 기타 변이체를 포함한다.
본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드는 CHO 세포에서 발현되거나, 대안적으로 이들이 가용성이고, GPI-앵커 부착 신호 서열 유래 하나 이상의 아미노산을 포함한다면 당 업자에게 공지된 임의의 세포 또는 임의의 방법으로 제조될 수 있다. CHO 세포에서 생산되는 가용성 인간 esPH20 폴리펩티드는 세포 배양 배지 내로 분비되는 것들이다. 분비된 esPH20 이 가용성, 즉 하기 기재된 바와 같은 트리톤® X-114 용액의 수성상 내로 분별되는 것을 전제로, 인간 esPH20 은 부분적으로 분비, 즉 발현되는 폴리펩티드의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이 배양 배지 내로 분비되는 것으로 당업자에게 이해된다. 아미노산 1-500 또는 36-500 을 포함하는, 본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드가 부분적으로 분비된다. 추가로, CHO 세포에서 발현시, 아미노산 1 내지 498, 499, 500 을 포함하는 전구체 인간 esPH20 폴리펩티드 또는 아미노산 36 내지 498, 499 또는 500 을 포함하는 성숙한 인간 esPH20 폴리펩티드는 약하게 발현된다 (예컨대, 하기 실시예 3 참조).
따라서, 전구체 인간 esPH20 폴리펩티드의 예는 이에 제한되지 아니하나 서열번호 107 에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 491, 492, 493, 494, 495, 496 또는 497 를 포함하는 폴리펩티드를 생성하기 위하여 C-말단 절단을 갖는 임의의 것을 포함한다. 포유동물세포에서 발현시, 프로세싱 동안 N-말단 신호 펩티드의 절단 후, 성숙한 인간 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 107 의 아미노산 36 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496 또는 497 를 포함한다. 따라서, 본원에서 제공되는 성숙한 인간 esPH20 폴리펩티드는 456, 457, 458, 459, 460, 461 또는 462 아미노산 길이의 것들, 예컨대 서열번호 60-63 및 102-104 중 어느 하나 또는 이들의 대립유전자 또는 기타 변이체를 포함한다. 대립유전자 변이체 및 기타 변이체는 당업자에게 공지되어 잇으며, 서열번호 107 또는 108 중 어느 하나에 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
아미노산-치환 인간 esPH20 폴리펩티드가 또한 본원에서 제공된다. 아미노산 치환된 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 60-63 및 102-104 에 제시된 것과 같은 본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 치환을 포함하도록 변형된 인간 esPH20 폴리펩티드이다. 따라서, 아미노산-치환 인간 esPH20 폴리펩티드는 C-말단 절단을 갖는 것들이다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 아미노산 치환 인간 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 107 에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496 또는 497, 또는 아미노산 36 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496 또는 497 으로써 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가진다. 다른 예에서, 아미노산 치환 인간 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 60-63 및 102-104 에 제시된 아미노산 서열과 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가진다.
본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드는 PH20의 야생형 GPI-앵커된 형태와 비교하여 증가되거나 감소된 히알루로니다제 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드는 야생형 GPI-앵커된 형태에 의해 나타나는 히알루로니다제 활성의 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 인간 esPH20 폴리펩티드는 야생형 GPI-앵커된 형태와 비교하여 증가된 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 인간 esPH20 폴리펩티드의 히알루로니다제 활성은 야생형 GPI-앵커된 형태의 히알루로니다제 활성과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상 증가될 수 있다.
본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드는 중성 pH 에서 측정시 PH20 의 야생형 GPI-앵커된 형태와 비교하여 증가되거나 감소된, 중성 활성인 히알루로니다제 활성 또는 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드는 야생형 GPI-앵커된 형태에 의해 나타나는 히알루로니다제 활성의 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 인간 esPH20 폴리펩티드는 야생형 GPI-앵커된 형태와 비교하여 감소된 중성 활성인 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 중성 활성인 히알루로니다제 활성은 야생형 GPI-앵커된 형태의 중성 활성인 히알루로니다제 활성과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 감소될 수 있다. 다른 예에서, 인간 esPH20 폴리펩티드는 야생형 GPI-앵커된 형태와 비교하여 증가된 중성 활성인 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 중성 활성인 히알루로니다제 활성은 야생형 GPI-앵커된 형태의 중성 활성인 히알루로니다제 활성과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상 증가될 수 있다.
일반적으로, 글리코실화가 이들 폴리펩티드의 촉매 활성 및 안정성에 중요하기 때문에, 인간 esPH20 폴리펩티드는 폴리펩티드가 활성을 보유하는 것을 보장하기 위하여 정확한 N-글리코실화를 촉진하는 단백질 발현 시스템을 이용하여 생산된다. esPH20 폴리펩티드의 재조합 발현에 유용한 세포의 예는 예를 들어 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포 (예컨대, DG44 CHO 또는 CHO-S 세포) 를 포함한다.
2. 다른 종 esPH20 폴리펩티드
비인간 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 당업자는 인간 PH20 의 아미노산 서열을 임의의 비인간 PH20 폴리펩티드와 배열하여 서열번호 107 에 제시된 인간 PH20 폴리펩티드의 위치 491-500 에 상응하고, C-말단 절단이 만들어져 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드를 생성하는 위치를 확인할 수 있다. 추가로, 본원의 다른 곳에 기재된 것과 같은 알고리즘을 이용하여 GPI-앵커 부착 신호 서열의 위치를 예측할 수 있다. C-말단 절단된 폴리펩티드의 용해도는 하기 및 실시예 4에 기재된 트리톤® X-114 평가를 포함한, 생성된 C-말단 절단된 폴리펩티드가 가용성이고, 따라서, esPH20 폴리펩티드인지를 결정하기 위한 당 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
비인간 영장류 종의 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 비인간 영장류 GPI-앵커된 PH20 폴리펩티드의 예는 이에 제한되지 아니하나 침팬지 PH20 (서열번호 197)을 포함한다. 따라서, 침팬지 esPH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 침팬지의 esPH20 폴리펩티드는 인간 esPH20 폴리펩티드에 대하여 상기 기재된 C-말단 절단에 상응하는 C-말단 절단을 포함한다. 따라서, 본원에서 제공되는 침팬지 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 107 에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 또는 501 에 상응하는 아미노산을 포함한다.
침팬지 PH20 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 인간 PH20 폴리펩티드에 배열될 수 있다. 상기 방법들은 일반적으로 매칭을 최대화하며, 수동 배열을 이용하는 것, 이용가능한 다수의 배열 프로그램(예컨대, BLAST)을 이용하는 것과 같은 방법들 및 당업자에게 알려진 다른 것들을 포함한다. 도 1은 인간 및 침팬지 PH20 의 전구체 폴리펩티드의 배열을 제공한다. 인간 PH20 의 아미노산 잔기 491 내지 500 (여기서, 본원에서 제공되는 인간 esPH20 폴리펩티드는 야생형 인간 PH20 폴리펩티드와 비교하여 말단절단됨)은 침팬지 PH20 의 아미노산 잔기 491 내지 501 에 상응한다. 따라서, 서열번호 197 에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 또는 501 을 포함하는 침팬지 esPH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 포유동물 발현계에서 발현시, 35 아미노산 신호 펩티드는 프로세싱 동안 절단되어, 단백질의 성숙한 형태가 분비된다. 따라서, 성숙한 침팬지 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 197 의 아미노산 36 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 또는 501 을 포함한다.
침팬지 esPH20 폴리펩티드의 예는 서열번호 197 에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 또는 498 을 포함하는 것들이다. 포유동물 발현계에서 발현시, 35 아미노산 신호 펩티드는 프로세싱 동안 절단되어, 단백질의 성숙한 형태가 분비된다. 따라서, 성숙한 침팬지 esPH20 폴리펩티드는 서열번호 197 의 아미노산 36 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 또는 498 를 포함한다.
D. N-부분 글리코실화 PH20 폴리펩티드
N-글리코실화 히알루로니다제의 히알루로니다제 활성의 전부 또는 일부를 보유하는 부분적 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드를 포함한, N-부분 글리코실화 히알루로니다제가 본원에서 제공된다. 부분적 탈글리코실화 히알루로니다제의 예는 임의의 종 유래 부분 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 중 어느 하나에 제시된 어느 것, 또는 이들의 대립유전자 변이체 또는 다른 변이체를 포함한다. 대립유전자 변이체 및 기타 변이체는 당업자에게 알려져 있으며, 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198, 또는 이의 절단형 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 히알루로니다제는 또한 하이브리드, 융합 및 키메라 부분 탈글리코실화 히알루로니다제 및 부분 탈글리코실화 히알루로니다제 접합체를 포함한다.
본원에서 제공되는 N-부분 글리코실화 히알루로니다제는 하나 이상의 글리코시다제로 소화에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 비록 모든 N-연결 글리코실화 위치 (예컨대, 서열번호 107 에 예시된 인간 PH20 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 에 것들)가 글리코실화될 수 있지만, 글리코실화의 정도는 하나 이상의 글리코시다제로 소화되지 않은 히알루로니다제와 비교하여 감소된다. 부분 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한, 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 히알루로니다제 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 을 가질 수 있다. 일부 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 N-글리코실화 위치는 이들이 고 만노스 또는 복합체 형 글리칸을 더이상 포함하지 아니하나, 오히려 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함하도록 부분 탈글리코실화된다. 일부 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166 및 N254 에 상응하는 1, 2 또는 3 개의 N-글리코실화 위치가 탈글리코실화되며, 즉, 이들은 당 잔기를 포함하지 않는다. 다른 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 3, 4, 5, 또는 6 개의 N-글리코실화 위치가 글리코실화된다. 글리코실화 아미노산 잔기들은 최소한 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다.
또한, N-부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 전장 PH20 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 에 제시된 것들 중 어느 하나의 C-말단 유래 하나 이상의 아미노산을 결여한다. 따라서, 본원에서 제공되는 N-부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 전장 야생형 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 에 제시된 서열을 갖는 전장 야생형 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상의 아미노산이 C-말단 절단될 수 있다. 일부 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 3, 4, 5 또는 6 개의 N-글리코실화 위치가 글리코실화되어 있다. 글리코실화된 아미노산 잔기들은 최소한 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 다른 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는, 1, 2 또는 3 개의 N-글리코실화 위치는 글리코실화되지 않는다. 추가의 예에서, 글리코실화 정도는 히알루로니다제 활성을 유지하는 한, 부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드가 고 만노스 및 복합체 형 글리칸은 포함하지 아니하나 오히려 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함하도록 감소될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 를 가질 수 있다.
본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드 및 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 히알루로니다제 활성을 보유한다. 추가로, 부분 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드 및 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 중성 활성이며, 즉 이들은 중성 pH 에서 히알루로니다제 활성을 보유한다. 히알루로니다제 활성은 글리코실화된 전장 및 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드와 비교하여 증가되거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드 및 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 글리코실화된 전장 및 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드에 의해 나타나는 히알루로니다제 활성의 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낼 수 있다.
따라서, 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 치료제 폴리펩티드로써 예컨대, 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 부분 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드 및 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 또한 예를 들어 병용요법에서 사용될 수 있다.
1. PH20 폴리펩티드
본원에서 제공되는 N-부분 글리코실화 히알루로니다제의 예는 임의의 종, 예컨대, 서열번호 107-109, 11-120, 197 및 198 중 어느 하나에 제시된 어느 것, 또는 이들의 대립유전자 변이체 또는 다른 변이체 유래 부분 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드를 포함한다. 대립유전자 변이체 및 기타 변이체는 당업자에게 알려져 있으며, 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 또는 이들의 절단된 형태 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 3, 4, 5 또는 6 개의 N-글리코실화 위치가 글리코실화된다. 다른 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166 및 N254 에 상응하는 1, 2 또는 3 개의 N-글리코실화 위치가 글리코실화되지 않는다. 일부 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 N-글리코실화 위치가 최소한 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다.
본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 히알루로니다제는 하나 이상의 글리코시다제를 이용한 소화에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 비록 모든 N-연결 글리코실화 위치 (예컨대, 서열번호 107 에 예시된 인간 PH20 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 에 것들)가 글리코실화될 수 있지만, 글리코실화의 정도는 하나 이상의 글리코시다제로 소화되지 않은 히알루로니다제와 비교하여 감소된다. 특히, 부분 글리코실화 히알루로니다제는 각각의 N-연결 글리코실화 위치에서 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 보유한다. 부분 글리코실화 히알루로니다제는 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 3, 4, 5 또는 6 의 N-글리코실화 위치에서 글리코실화될 수 있다. 일부 예에서, 히알루로니다제는 서열번호 107 의 아미노산 잔기 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 1, 2 또는 3 의 N-글리코실화 위치에서 탈글리코실화된다. 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화된 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 을 가질 수 있다.
글리코시다제 또는 글리코시드 가수분해효소는 글리코시드 결합의 가수분해를 촉매하여 2개의 더 작은 당류를 생성하는 효소이다. 도 2 에 나타난 바와 같이, 척추동물에서 주된 종류의 N-글리칸은 고 만노스 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 복합체 글리칸을 포함한다. 고 만노스 및 하이브리드 형 글리칸을 절단하는 EndoF1; 바이안테너리 복합체 형 글리칸을 절단하는 EndoF2; 바이안테너리 및 더욱 분지된 복합체 글리칸을 절단하는 EndoF3; 고 만노스 및 하이브리드 형 글리칸을 절단하는 EndoH 를 포함한, 단지 부분 단백질 탈글리코실화를 초래하는 다양한 글리코시다제들이 있다 (도 3). 히알루로니다제, 예컨대, 가용성 히알루로니다제, 예컨대, 가용성 PH20 과 상기 글리코시다제들 중 하나 또는 전부의 처리는 단지 부분적 탈글리코실화, 및 따라서, 히알루로니다제 활성의 보유를 초래할 수 있다.
예를 들어, rHuPH20 과 상기 글리코시다제들 중 하나 또는 전부의 처리는 부분 탈글리코실화을 초래한다. 이러한 부분 탈글리코실화 rHuPH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 폴리펩티드와 동등한 히알루로니다제 효소 활성을 나타낸다 (예컨대, 실시예 7 참조). 반대로, rHuPH20 (서열번호 122) 과 모든 N-글리칸들을 절단하는 글리코시다제인 PNGaseF (도 3 참조) 의 처리, 또는 GlcNAc 포스포트랜스퍼라제 (GPT) 억제제 투니카마이신의 처리는 모든 N-글리칸의 완전한 탈글리코실화를 초래하고, 이에 의해 PH20 이 효소적으로 비활성이도록 한다 (예컨대, 아래 실시예 7-8 참조).
부분 탈글리코실화 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한, 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 히알루로니다제 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 을 가질 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공되는, 부분 탈글리코실화 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한, 부분 탈글리코실화 히알루로니다제는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제에 의해 나타나는 히알루로니다제 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낸다.
본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화된 히알루로니다제는 또한 하이브리드, 융합 및 키메라 부분 탈글리코실화 히알루로니다제 및 부분 탈글리코실화 히알루로니다제 접합체를 포함한다.
2. C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드
본원에서 제공되는 N-부분 글리코실화 또는 부분 탈글리코실화된 PH20 폴리펩티드의 예는 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드이다. 본원에서 제공되는 부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 에 제시된 것과 같은 전장 PH20 폴리펩티드의 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 결하고 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 에 제시된 서열을 갖는 전장 야생형 폴리펩티드와 같은 전장 야생형 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상의 아미노산이 C-말단 절단될 수 있다. 일부 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 N-글리코실화 위치의 3, 4, 5 또는 6 개가 글리코실화된다. 다른 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166 및 N254 에 상응하는 N-글리코실화 위치의 1, 2 또는 3 개가 글리코실화되지 않는다.
본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 하나 이상의 글리코시다제를 이용한 소화에 의해 생산될 수 있다. 비록 모든 N-연결 글리코실화 위치 (예컨대, 서열번호 107 에 예시된, 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 것들)가 글리코실화될 수 있지만, 글리코실화 정도는 하나 이상의 글리코시다제로 소화되지 않은 히알루로니다제와 비교하여 감소된다. 따라서, 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 을 가질 수 있다. 특히, N-부분 글리코실화 히알루로니다제는 상기 N-연결 글리코실화 위치의 각각에서 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 보유한다. 일부 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 N-글리코실화 위치 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개가 최소한 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 다른 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 중 3, 4, 5, 또는 6 개가 그 3, 4, 5, 또는 6 개의 N-글리코실화 위치의 각각에서 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준으로 글리코실화된다. 추가 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 N-글리코실화 위치의 1, 2 또는 3 개는 완전히 탈글리코실화된다. 상기 예들에서, 일반적으로 아미노산 N82, N166 또는 N254 는 완전히 탈글리코실화된다.
N-부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드의 예는 임의의 종, 예컨대 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 에 제시된 어느 것, 또는 대립유전자 변이체 또는 이들의 기타 변이체 유래이다. 대립유전자 변이체 및 기타 변이체는 당업자에게 공지되어 있으며, 서열번호 107-120, 197 및 198 또는 이들의 절단형 중 어느 하나에 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공되는, N-부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 또한 하이브리드, 융합 및 키메라 PH20 폴리펩티드 및 PH20 접합체를 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 폴리머, 예컨대, 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜 (페길화 (PEG)) 또는 시알릴 잔기 또는 기타 다른 폴리머, 예컨대, 천연 또는 당 폴리머에 접합될 수 있다. 다른 예에서, N-부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 IgG 면역글로불린 유래 Fc 도메인과 같은 도메인에 연결 또는 융합될 수 있다.
본원에서 제공되는 글리코실화 또는 부분 글리코실화 C-말단 절단된 폴리펩티드 중에는 서열번호 107 (전구체 폴리펩티드) 또는 108 (성숙한 폴리펩티드)에 제시된 야생형 PH20, 또는 그의 대립유전자 또는 종 변이체와 비교하여 2 아미노산에서 44 아미노산 까지 C-말단에서 절단된 것들이 포함된다. 따라서, C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 서열번호 107 의 아미노산 82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는 N-글리코실화 위치의 2, 3, 4, 5, 또는 6 개가 글리코실화된, 서열번호 107 에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 또는 507, 또는 또는 이들의 대립유전자 또는 종 변이체의 상응하는 위치를 포함하는 폴리펩티드를 생성하기 위한 C-말단 절단을 갖는 임의의 것을 포함한다. 포유동물 세포에서 발현시, 35 아미노산 N-말단 신호 서열이 프로세싱 동안 절단되고, 단백질의 성숙한 형태가 분비된다. 따라서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 상응하는, N-글리코실화 위치의 3, 4, 5, 또는 6 개가 글리코실화된, 서열번호 107 에 제시된 아미노산 36 내지 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 또는 507 또는 그의 대립유전자 또는 종 변이체의 상응하는 위치를 포함하는 성숙한 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드가 본원에서 제공된다.
표 2는 글리코실화 또는 부분 글리코실화될 수 있는 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드의 예시들의 비제한적 예를 제공한다. 아래 표 2에서는, 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 (아미노산) 길이 및 C-말단 절단된 PH20 단백질의 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 아미노산 서열의 예가 제시된 서열 식별자 (서열번호)가 제공된다. 야생형 PH20 폴리펩티드가 또한 비교를 위하여 표 2에 포함된다.
C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드의 예
폴리펩티드 전구체
(아미노산) 		전구체
서열번호 		성숙형
(아미노산) 		성숙형
서열번호
SPAM1-VASL 509 1 474 108
SPAM1-SSVA 507 3 472 55
SPAM1-ISSV 506 45 471 97
SPAM1-IISS 505 4 470 56
SPAM1-LIIS 504 46 469 98
SPAM1-FLII 503 5 468 57
SPAM1-LFLI 502 47 467 99
SPAM1-ILFL 501 6 466 58
SPAM1-SILF 500 48 465 100
SPAM1-VSIL 499 7 464 59
SPAM1-IVSI 498 49 463 101
SPAM1-FIVS 497 8 462 60
SPAM1-MFIV 496 50 461 102
SPAM1-TMFI 495 9 460 61
SPAM1-ATMF 494 51 459 103
SPAM1-SATM 493 10 458 62
SPAM1-LSAT 492 52 457 104
SPAM1-TLSA 491 11 456 63
SPAM1-PSTL 489 12 454 64
SPAM1-STLS 490 13 455 65
SPAM1-SPST 488 53 453 105
SPAM1-ASPS 487 14 452 66
SPAM1-NASP 486 54 451 106
SPAM1-YNAS 485 15 450 67
SPAM1-FYNA 484 16 449 68
SPAM1-IFYN 483 17 448 69
SPAM1-QIFY 482 18 447 70
SPAM1-PQIF 481 19 446 71
SPAM1-EPQI 480 20 445 72
SPAM1-EEPQ 479 21 444 73
SPAM1-TEEP 478 22 443 74
SPAM1-ETEE 477 23 442 75
SPAM1-METE 476 24 441 76
SPAM1-PMET 475 25 440 77
SPAM1-PPME 474 26 439 78
SPAM1-KPPM 473 27 438 79
SPAM1-LKPP 472 28 437 80
SPAM1-FLKP 471 29 436 81
SPAM1-AFLK 470 30 435 82
SPAM1-DAFL 469 31 434 83
SPAM1-IDAF 468 32 433 84
SPAM1-CIDA 467 33 432 85
SPAM1-VCID 466 34 431 86
SPAM1-GVCI 465 35 430 87
SPAM1-GDVC 464 36 429 88
SPAM1-IADG 462 37 427 89
SPAM1-VCIA 460 38 425 90
SPAM1-VDVC 458 39 423 91
SPAM1-DAVD 456 40 421 92
SPAM1-DTDA 454 41 419 93
SPAM1-VKDT 452 42 417 94
SPAM1-ADVK 450 43 415 95
본원에서 제공하는 N-글리코실화되고 부분적으로 탈글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 가용성인 것, 즉 트리톤
Figure pct00001
X-114 용액의 수성상에 분별되는 것, 및 불용성인 것, 즉 트리톤
Figure pct00002
X-114 용액의 세제상 (detergent phase) 에 분별되는 것을 포함한다. 본원에서 제공되는 부분적으로 탈글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 를 가질 수 있다. 대안적으로, 부분적으로 탈글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는, 글리코실화되지 않은 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166 및 N254 에 해당하는 1, 2 또는 3 개의 N-글리코실화 부위를 가질 수 있다. 최소한, 글리코실화되기 위해서, N-글리코실화 부위는 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 N-부분적으로 글리코실화된 C-말단 절단된 폴리펩티드는 가용성이며, 즉 GPI-앵커에 고정되어 있지 않다. 이는, 예를 들어 하기 및 실시예 4 에 기재된 바와 같이 PI-PLC 또는 PI-PLD 와 인큐베이션한 후 트리톤
Figure pct00003
X-114 검정을 이용해 평가될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 107 로 제시된 PH20 폴리펩티드의 아미노산 잔기 위치 490 에 해당하는 아미노산 위치 또는 그의 5' 에서 C-말단이 절단되어 있는 PH20 폴리펩티드는 일반적으로 포유동물 발현계에서 발현시 가용성이다 (예를 들어, 실시예 3 참조). 상기 폴리펩티드는, GPI-앵커 부착 신호 서열이 완전히 결핍되어 있다는 사실로 인해 가용성이다. 다른 예에서, 본원에서 제공되는 부분적으로 글리코실화된 C-말단 절단된 폴리펩티드는 포유동물 발현계에서 발현시 불용성이며, 막에 결합되어 있다. 예를 들어, 서열번호 107 로 제시된 PH20 폴리펩티드의 아미노산 위치 500 에 해당하는 아미노산 위치 또는 그의 3' 에서 C-말단이 절단된 PH20 폴리펩티드는 일반적으로 포유동물 발현계에서 발현시 불용성이다 (예를 들어, 실시예 3 참조). 본원에서 제공되는 C-말단 절단된 폴리펩티드는, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 에 해당하는 N-글리코실화 부위의 3, 4, 5 또는 6 개가 글리코실화되어, 부분적으로 글리코실화될 수 있다.
본원에서 제공되는 가용성 부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드에는, 말단절단되었지만 GPI-앵커 부착 신호에 위치하는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를 보유하고 있는 것, 및 GPI-앵커 결합 신호 서열 및 ω-부위가 전혀 없는 것이 포함된다. 따라서, ER 내 단백질의 C-말단에 공유결합된 GPI-앵커를 갖고, 형질막의 세포외 소엽에 고정되어 있는 대신에, 상기 폴리펩티드는 분비된다. 이들 C-말단 절단된 가용성 PH20 폴리펩티드는 N-글리코실화 부위의 3, 4, 5 또는 6 개가 글리코실화되도록 부분적으로 글리코실화될 수 있다. GPI-앵커 부착 신호 서열이 없는 예시 가용성 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 임의 종 유래의 것인데, 예컨대 서열번호 107-109, 111-120, 197 및 198 중 임의의 셋트, 또는 이들의 대립유전자 변이체 또는 기타 변이체 유래이다. 이들 부분 글리코실화 가용성 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드에는 서열번호 107 로 제시되는 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 C-말단 절단을 가진다. 포유동물 세포에서의 발현 후 N-말단 신호 서열의 절단시, 성숙형 부분 글리코실화 가용성 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 서열번호 107 로 제시되는 아미노산 서열의 아미노산 36 내지 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 를 포함한다. 일부 예에서, 예를 들어 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 해당하는 N-글리코실화 부위의 3, 4, 5 또는 6 개에서 적어도 하나의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 C-말단 GPI-앵커 신호 서열 절단된 가용성 PH20 폴리펩티드가 부분적으로 글리코실화된다. 다른 예에서, C-말단 GPI-앵커 신호 서열 절단된 가용성 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 를 가진다.
본원에서 제공하는 GPI-앵커 부착 신호 서열 내에 적어도 하나의 아미노산을 보유하는 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 부분 탈글리코실화 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드이다. 일부 예에서, 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166 및 N254 에 해당하는 N-글리코실화 부위의 1, 2 또는 3 개에서 글리코실화되지 않는다. 이러한 부분 탈글리코실화 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드는 서열번호 107 로 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 을 포함한다. 포유동물 세포에서 발현되는 경우, 35 개 아미노산 N-말단 신호 서열은 프로세싱 동안 절단되며, 상기 단백질의 성숙형 형태가 분비된다. 따라서, 부분적으로 탈글리코실화된 esPH20 폴리펩티드의 성숙형 형태는 서열번호 107 로 제시되는 아미노산 서열의 아미노산 36 내지 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 를 포함한다. 본원에서 제공하는 부분적으로 글리코실화된 esPH20 폴리펩티드의 성숙형 인간 형태는, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393 에 해당하는 N-글리코실화 부위의 3, 4, 5 또는 6 개에서 적어도 하나의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 서열번호 59 내지 63, 및 100 내지 104 로 제시된 것을 포함한다. 일부 예에서, 글리코실화 정도는 엔도글리코시다제를 이용한 처리에 의해 감소된다. 따라서, 본원에서 제공되는 GPI-앵커 부착 신호 서열 내에 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 부분 탈글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 를 가질 수 있다.
본원에서는 또한 가용성이 아닌, 즉 세포막에 결합되어 있어서 발현시 배지로 분비되지 않는, 부분적으로 탈글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드가 제공된다. 가용성이 아닌 상기 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는, 히알루로니다제 활성을 보유하는 한, 부분적으로 탈글리코실화될 수 있다. 예시적인, 가용성이 아닌 부분적으로 글리코실화된 성숙형 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 서열번호 107 의 아미노산 위치 36 내지 501, 502, 503, 504, 505, 506 또는 507 에 해당하는 아미노산을 포함하는 것이다. 따라서, 본원에서 제공하는 부분적으로 글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드에는, 길이가 466, 467, 468, 469, 470, 471 또는 472 아미노산인 것, 예컨대 서열번호 55-58 및 97-99 로 제시되는 것으로서, 완전히 글리코실화된 히알루로니다제의 글리코실화 수준의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 를 보유하는 것이 포함된다. 일부 실시예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 에 해당하는 N-글리코실화 부위의 3, 4, 5 또는 6 개가 글리코실화된다. 다른 예에서, 서열번호 107 의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 에 해당하는 N-글리코실화 부위의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개는 적어도 하나의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다.
본원에서 제공되는 부분적으로 글리코실화된 C-말단 절단된 폴리펩티드는 PH20 의 야생형 GPI-앵커 고정 형태에 비교하여 증가되거나 또는 감소된 히알루로니다제 활성을 나타낼 수 있다. 추가적으로, 부분적으로 탈글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 중성 활성인데, 즉 이들은 중성 pH 에서 히알루로니다제 활성을 보유한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 야생형 GPI-앵커 고정 형태에 의해 나타내어지는 히알루로니다제 활성의 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 부분적으로 글리코실화된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 야생형 GPI-앵커 고정 형태에 비해 증가된 히알루로니다제 활성을 나타낸다.
본원에서 제공된 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 또한 N-글리코실화될 수 있다. 본원에서 제공되는 N-글리코실화 및 N-부분 글리코실화 히알루로니다제는 또한 하이브리드, 융합 및 키메라 N-글리코실화 및 부분 탈글리코실화 히알루로니다제, 및 N-글리코실화 및 부분 탈글리코실화 히알루로니다제 접합체를 포함한다.
3. 추가적 변형
인간 esPH20 폴리펩티드, N-글리코실화 및 N-부분 글리코실화 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드 및 부분 글리코실화 PH20 폴리펩티드를 포함하는, 본원에 포함되는 PH20 폴리펩티드는 또한, 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것을 포함한다. 그러한 변형에는, 이에 제한되지 않으나, 페길화, 시알화, 알부민화, 글리코실화, 파르니실화, 카르복실화, 히드록실화, 인산화 및 당업계에 공지된 기타 폴리펩티드 변형이 포함된다. 따라서, esPH20 폴리펩티드를 포함하는, 본원에서 제공되는 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는, 이에 제한되지 않으나, 탄수화물 잔기, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 잔기, 시알화 잔기, 면역글로불린 G 유래의 Fc 도메인 또는 임의의 기타 도메인 또는 잔기를 포함하는, 폴리펩티드의 1 차 서열에 존재하거나 또는 존재하지 않는 기타 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적인 변형은 단백질의 안정성 또는 혈청 반감기를 증가시키기 위해 수행될 수 있다. esPH20 폴리펩티드를 포함하는, 본원에서 제공되는 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는, 생성된 폴리펩티드가 히알루로니다제 활성을 보유하는 한, 화학물 및 재조합 방법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용해 임의의 잔기에 접합 또는 융합될 수 있다.
감소된 면역원성
인간 esPH20 폴리펩티드를 포함하는, 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 감소된 면역원성을 갖도록 제조될 수 있다. 감소된 면역원성은, 폴리펩티드로부터 항원성 에피토프를 제거하는 서열 변화에 의해 또는 번역 후 변형을 변경시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 해당 폴리펩티드가 최소한 서열번호 107 의 아미노산 잔기 N235, N368 및 N393 에서 적어도 N-아세틸글루코사민을 포함하는 한, 펩티드의 글리코실화 변경이 고려된다.
예를 들어, PH20 폴리펩티드는 그들이 푸코스가 결핍되도록 변형될 수 있고, 특히 비푸코실화 (bifucosylation) 될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 비푸코실화되지 않는다. 이는 비푸코실화를 수행하게 하지 않는 숙주 세포, 특히 곤충 숙주 세포에서의 PH20 폴리펩티드의 발현 및 제조에 의해 달성될 수 있다. 푸코스는 포유동물, 곤충 및 식물을 포함하는 광범위한 유기체에 존재하는 데옥시헥소오스이다. 푸코실화 글리칸은 푸코실-트랜스퍼라제에 의해 합성된다. 참고문헌은, 예를 들어 Ma 등, Glycobiology, 15(2):158R-184R, (2006); Nakayama 등, J. Biol . Chem., 276:16100-16106 (2001); 및 Sturla 등, Glycobiology, 15(10):924-935 (2005). 인간에서, 푸코스는 종종 글리칸 구조에 대한 말단 변형으로서 존재하며, N-아세틸글루코사민에 대한 푸코스 α1,6-연결된 N-아세틸글루코사민이 존재한다는 것은 당단백질 프로세싱 및 인식에서 중요한 것으로 나타났다. 곤충에서, N-글리칸 코어 구조는 α1,6- 및 α1,3-연결을 이용한 비푸코실화를 나타낸다. α1,3-연결이 있는 곤충 세포 코어 푸코실화는 인간에서 면역원성인 탄수화물 에피토프를 생성한다 (예를 들어, 미국출원번호 20070067855). 예를 들어, esPH20 폴리펩티드를 포함하는, 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드는 폴리펩티드를 비푸코실화할 수 없는 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 따라서, 비푸코실화하는 곤충 세포 또는 기타 세포가 상기 폴리펩티드의 발현에 이용될 수 있고, 일반적으로 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포가 이용된다.
일부 예에서, 탈푸코실화되거나 또는 푸코스가 결핍된 PH20 폴리펩티드는, 진핵세포 다당류 프로세싱 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터의 이용을 통해 "포유류화된" 곤충 세포 발현계를 만들어내는 변형된 글리코실화 경로를 가진 곤충 세포에서 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국특허 6,461,863 참조). 대안적으로, 항원성은 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제 (FT3) 가 결핍된 곤충 세포에서의 PH20 폴리펩티드의 발현에 의해 제거될 수 있다 (예를 들어, 미국출원번호 20070067855 참조). 다른 예에서, 탈푸코실화되거나 또는 푸코스가 결핍된 PH20 폴리펩티드는, 예를 들어 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포를 포함하는 탈푸코실화된 단백질을 생산하는 세포주 (Ripka 등 Arch . Biochem . Biophys. 249:533-545 (1986); 미국출원번호 2003/0157108; 및 WO 2004/056312), 및 넉아웃 (knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (Yamane-Ohnuki 등 Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004)) 에서 발현될 수 있다.
폴리머에 접합
일부 예에서, 본원에서 제공되는 부분 글리코실화 PH20 폴리펩티드를 포함하는, esPH20 폴리펩티드 및 기타 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 폴리머에 접합되어 있다. PH20 에 접합될 수 있는 폴리머의 예는 천연 및 합성 호모폴리머, 예를 들면 폴리올(즉, poly-OH), 폴리아민(즉, poly-NH2) 및 폴리카르복실산(즉, poly-COOH), 및 추가의 헤테로폴리머, 즉 하나 이상의 다른 커플링기, 예를 들면 하이드록실기 및 아민기를 포함하는 폴리머를 포함한다. 적당한 폴리머 분자의 예는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예컨대, 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜, PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG) 분지형 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-co-말레산 무수물, 폴리스티렌-co-말레산 무수물, 덱스트란 예컨대 카르복시메틸-덱스트란, 헤파린, 동종 알부민, 셀룰로오스 예컨대 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스 카르복시에틸셀룰로오스 및 히드록시프로필셀룰로오스, 키토산 가수분해산물, 전분, 예를 들면 히드록시에틸 전분 및 히드록시프로필 전분, 글리코겐, 아가로스 및 그 유도체, 구아검, 풀루란, 이눌린, 크산탄검, 카라기난, 펙틴, 알기닌산 가수분해물 및 생폴리머를 포함한다.
일반적으로, 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 옥사이드, 예를 들면 PEG, 일반적으로 mPEG이고 이것은 덱스트란 및 풀루란 등과 같은 다당류에 비해 가교결합할 수 있는 반응성기를 거의 갖고 있지 않다. 일반적으로, 폴리머는 비독성 폴리머 분자, 예를 들면 (메톡시)폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)이고, 이것은 상대적으로 단순화학을 이용하여 esPH20 폴리펩티드 및 다른 C-말단 절단된 PH 폴리펩티드 (예컨대, 단백질 표면 상의 부착기)에 공유결합될 수 있다.
esPH20 폴리펩티드 및 다른 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드에 부착을 위한 적당한 폴리머 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체, 예를 들면 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지형 PEG 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다 (예컨대, Roberts 등, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris 및 Zalipsky (eds.) "Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar 등, J. Pharm . Pharmaceut. Sci ., 3(1):125-136, 2000; Harris 및 Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21; 및 Tsubery, J Biol . Chem 279(37):38118-24, 2004 참조). 폴리머 분자는 일반적으로 약 3 kDa 내지 약 60 kDa의 범위의 분자량의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드에 접합되는 폴리머 분자는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60 kDa 이상의 분자량을 갖는다.
PEG 또는 PEG 유도체의 공유결합 (접합)에 의해 폴리펩티드를 변형하는 다양한 방법 (즉, "페길화(PEG화)")이 당 분야에 공지되어 있다 (예컨대 U.S. 2006/0104968; U.S. 5,672,662; U.S. 6,737,505; 및 U.S. 2004/0235734 참조). 페길화하는 기술은 특별한 링커 및 커플링 약물 (예컨대, Harris, Adv . Drug Deliv. Rev . 54:459-476, 2002 참조), 복수의 PEG 잔기의 단일 접합 부위에 부착 (예컨대, 분지형 PEG를 이용; 예컨대, Veronese 등, Bioorg . Med . Chem . Lett . 12:177-180, 2002 참조), 위치-특이적 페길화 및/또는 모노페길화 (예컨대, Chapman 등, Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조), 및 위치-지정 효소 페길화(예컨대, Sato, Adv . Drug Deliv . Rev ., 54:487-504, 2002 참조) (또한 예를 들어 Lu 및 Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu 및 Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix 등. (1995) Int . J. Peptide Res . 46:253-64; Benhar 등 (1994) J. Biol . Chem . 269:13398-404; Brumeanu 등 (1995) J Immunol. 154:3088-95 참조; 또한, Caliceti 등 (2003) Adv . Drug Deliv . Rev . 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S 참조)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 당 분야에 묘사된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생산할 수 있다(예컨대, U.S. 2006/0104968호 참조).
페길화용 수많은 시약은 당 분야에 묘사되어 있다. 이러한 시약은 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성화 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐-카르보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지형 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 술폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 디설피드, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐술폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; 미국특허 제5,672,662호; 미국특허 제5,932,462호; 미국특허 제6,495,659호; 미국특허 제6,737,505호; 미국특허 제4,002,531호; 미국특허 제4,179,337호; 미국특허 제5,122,614호; 미국특허 제5,183,550호; 미국특허 제5,324, 844호; 미국특허 제5,446,090호; 미국특허 제5,612,460호; 미국특허 제5,643,575호; 미국특허 제5,766,581호; 미국특허 제5,795, 569호; 미국특허 제5,808,096호; 미국특허 제5,900,461호; 미국특허 제5,919,455호; 미국특허 제5,985,263호; 미국특허 제5,990,237호; 미국특허 제6,113,906호; 미국특허 제6,214,966호; 미국특허 제6,258,351호; 미국특허 제6,340,742호; 미국특허 제6,413,507호; 미국특허 제6,420,339호; 미국특허 제6,437,025호; 미국특허 제6,448,369호; 미국특허 제6,461,802호; 미국특허 제6,828,401호; 미국특허 제6,858,736호; 미국공개 제 2001/0021763호; 미국공개 제2001/0044526호; 미국공개 제 2001/0046481호; 미국공개 제2002/0052430호; 미국공개 제2002/0072573호; 미국공개 제2002/0156047호; 미국공개 제2003/0114647호; 미국공개 제2003/0143596호; 미국공개 제2003/0158333호; 미국공개 제2003/0220447호; 미국공개 제2004/0013637호; 미국공개 제2004/0235734호; 미국공개 제2005/000360호; 미국공개 제2005/0114037호; 미국공개 제2005/0171328호; 미국공개 제2005/0209416호; 유럽특허 제01064951 호; 유럽특허 제0822199호; WO 00176640호; WO 0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; 및 WO 0187925)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
기타 변형들
본원에서 제공되는, esPH20 폴리펩티드 및 다른 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 또한 그의 융합 및 접합체를 포함한다.
E. 연장된 가용성 PH20 및 다른 가용성 PH20 히알루로니다제를 암호화하는 핵산 및 이의 폴리펩티드의 제조방법
본원에서 제시되는, 연장된 가용성 PH20, C-말단 절단된 PH20 히알루로니다제 및 부분 글리코실화 PH20 히알루로니다제의 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 재조합 단백질 발현 및 단백질 정제에 대하여 당 분야에 널리 알려진 방법에 의해서 수득될 수 있다. 예를 들어, DNA 는 클로닝된 DNA 로부터 (예컨대, DNA 라이브러리로부터), 화학적 합성에 의하거나, cDNA 클로닝에 의하거나, 또는 게놈 DNA 또는 이의 절편의 클로닝에 의하여 원하는 세포로부터 정제되어 수득될 수 있다. 폴리펩티드가 재조합 수단으로 생성시, 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산의 확인을 위하여 당업자에게 알려진 임의의 방법들이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 이용할 수 있는 임의의 방법을 사용하여, 예컨대 세포 또는 조직 원료로부터, 원하는 PH20 효소를 암호화하는, 전장(즉, 전체 코딩부위를 포함하는) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 획득할 수 있다. 본원에서 제공되는 것과 같은 절단형을 포함하여, 변형된 또는 변이체는, 표준 재조합 DNA 법에 의해 야생형 폴리펩티드로부터 제작될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산분자의 클로닝 및 분리에 대하여 당업자에서 알려진 임의의 이용가능한 방법들을 이용하여 클로닝되거나 분리될 수 있다. 그러한 방법들은 핵산분자의 PCR 증폭, 및 핵산분자 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함한, 라이브러리 스크리닝을 포함한다.
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함한, 핵산의 증폭방법은 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 분리하는데 사용될 수 있다. PCR 은 당 분야에 공지된 임의의 방법 또는 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 방법들의 예는 페르킨-엘머 세투스 열 순환기(Perkin-Elmer Cetus thermal cycler) 및 Taq 중합효소 (Gene Amp) 의 이용을 포함한다. 재료를 포함하는 핵산이 원하는 폴리펩티드를-암호화하는 핵산 분자가 분리되는 출발 물질로써 이용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포추출물, 적절한 출처 (예를 들어, 고환, 전립선, 유방) 유래 조직추출물, 조직추출물, 체액시료(예컨대, 혈액, 혈청, 침), 건강한 대상 및/또는 병에 걸린 대상의 시료가 증폭방법에서 사용될 수 있다. 상기 출처는 척추동물, 포유동물, 인간, 돼지, 소, 고양이, 조류, 말, 개 및 기타 영장류 공급원을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 진핵세포 종 유래일 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발 물질의 공급원으로써 이용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하기 위하여 설계될 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역에 기초하여 설계될 수 있다. 원한다면, 축퇴성 프라이머가 증폭을 위하여 이용될 수 있다. 원하는 서열의 3 및 5 말단에서 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 핵산 시료 유래 PCR 서열에 의한 증폭을 위하여 프라이머로써 이용될 수 있다. 프라이머는 완전한 전장 PH20 또는 그의 절단된 서열, 예컨대, 본원에서 제공되는 가용성 PH20 폴리펩티드 중 어느 것을 암호화하는 핵산을 증폭하기 위하여 이용될 수 있다. 증폭에 의하여 생성된 핵산 분자는 시퀀싱되어, 원하는 폴리펩티드를 암호화하는지 확인될 수 있다.
벡터, 예를 들어 단백질 발현벡터, 또는 DNA 서열을 인코딩하는 코어 단백질의 증폭을 위하여 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적으로 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커서열을 포함하는, 추가 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-인코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정화하는 추가 뉴클로오티드 서열이 폴리펩티드-인코딩 핵산분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 세포내 단백질 발현을 용이하게 하도록 고안된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하는 분비서열, 예를 들어 이종(heterologous) 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 서열은 당업자에 알려져 있다. 예를 들면, 이종성 신호 서열의 예는 각각 서열번호 144 및 145 에 제시된 인간 및 마우스 카파 IgG 이종성 신호 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합영역을 특정화하는 염기의 서열이 또한 효소-코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 상기 영역은 특정 표적세포 내로 효소 흡수(uptake)를 용이하게 하는 단백질을 촉진하거나 코딩하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자 산물의 약동학을 변화시키는 잔기서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제(affinity purification)를 돕기 위한 태그 또는 다른 잔기가 부가될 수 있다. 예를 들어, 추가 핵산 잔기서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 다른 검출가능한 마커를 특정화하는 염기서열이 또한 효소-인코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 His 태그(예컨대, 6xHis, HHHHHH; 서열번호 142) 또는 Flag 태그(DYKDDDDK; 서열번호 143)를 코딩하는 핵산서열을 포함한다.
그다음 확인되고 분리된 핵산이 적당한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 많은 벡터-숙주 시스템들이 이용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 아니하나, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포에 적합(compatible)해야만 한다. 그러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 발현벡터는 본원에서 예시된 HZ24 발현벡터 (서열번호 140 에 제시)를 포함한다. 클로닝 벡터 내 삽입은, 예를 들어 상보성 점착종단(cohesive termini)을 가지는 클로닝 벡터 내로 DNA 절편을 연결함으로써 달성될 수 있다. 만약 DNA를 자르기 위해 사용된 상보적 제한부위(restriction sites)가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열(링커)을 연결함으로써 원하는 임의의 부위가 제조될 수 있다; 이러한 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식서열을 인코딩하는, 특정한, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안적 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 단일폴리머 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(INVITROGEN, Carlsbad, CA)를 이용하여 행해질 수 있다.
재조합 분자는 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공(electroporation) 및 초음파천공(sonoporation)을 통해 숙주세포 내로 도입되어, 많은 카피의 유전자 서열을 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 분리된 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 도입한 재조합 DNA 분자로 숙주세포를 형질전환하는 것은 상기 유전자의 복수카피의 생성을 가능케 한다. 따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요한 경우 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써, 상기 유전자가 다량으로 획득될 수 있다.
재조합 생산에 추가로, 본원에서 제공하는 임의의 esPH20 를 포함한 가용성 PH20 은 고체상 기술을 이용한 직접적 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, Stewart 등 (1969) Solid - Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc., 85:2149-2154 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의하여 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들면 제조사에 의해 제공되는 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템스 431A 펩티드 합성기 (Perkin Elmer, Foster City CA)를 이용하여 달성될 수 있다. 다양한 폴리펩티드 절편이 화학적 방법을 이용하여 개별적 및 조합되어 화학적으로 합성될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 이상의 원하는 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 재조합 발현을 위하여, 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부를 함유하는 핵산이 적당한 발현벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 필수 전사 및 번역 신호가 또한 PH20 유전자용 본래 프로모터, 및/또는 이들의 인접부위에 의해 제공될 수 있다.
또한 효소를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵 및 원핵세포를 포함하며, 벡터는 그안에 사용하기 적합한 임의의 것이다.
상기 벡터를 함유하는, 내피세포를 포함하는 원핵 및 진핵세포가 제공된다. 그러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균세포, 고세포(Archea), 식물세포, 곤충세포 및 동물세포를 포함한다. 코딩된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기-기술된 세포를 성장시키고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 상기 세포를 이용하여 이들의 단백질을 생산한다. 본원의 목적을 위하여, 예를 들어, 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 가용성 PH20 폴리펩티드는 배지 내로 분비될 수 있다.
숙주 세포 주(strain)는 삽입된 서열의 발현을 조절하는 능력 또는 원하는 방식으로 발현된 단백질을 프로세싱하는 능력으로 선택될 수 있다. 폴리펩티드의 상기 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 리피드화 및 아실화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 번역-후 프로세싱은 폴리펩티드의 폴딩 및/또는 기능에 영향을 줄 수 있다. 상이한 숙주 세포들, 이에 제한되지 않는, 예컨대 CHO (DG44, DXB11, CHO-K1), HeLa, MCDK, 293 및 WI38 가 상기 번역-후 활성에 대한 특이적 세포 기구 및 특별한 기전을 가지며, 도입된 단백질의 변형 및 프로세싱을 보장하기 위하여 선택될 수 있다. 일반적으로, 선택되는 세포는 발현된 폴리펩티드 내로 N-연결 글리코실화를 도입할 수 있는 것이다. 따라서, 상기 벡터를 포함하는 진핵세포가 제공된다. 진핵세포의 예는 포유동물 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원효소 결핍된 CHO 세포 (예컨대, DG44 세포)가 본원에서 제공되는 폴리펩티드를 생산하기 위하여 이용된다. 본원에서 제공되는 연장된 가용성 PH20 또는 C-말단 절단된 PH20 의 박테리아 발현은 촉매 활성 폴리펩티드를 생성하지 않으나, 적절한 글리코실화 기구와 조합시 PH20 은 인위적으로 글리코실화될 수 있음을 인식해야 한다.
고유의 또는 이종의 신호 서열에 연결된, 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드 및 다른 C-말단 절단된 PH 폴리펩티드를 포함한, 히알루로니다제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 이들의 복수카피를 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 세포 내 효소 단백질의 발현을 위하여, 또는 상기 효소 단백질이 분비성 단백질로서 발현되도록 벡터를 선택할 수 있다.
다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 코딩 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예컨대, 백시니아바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 다른 바이러스)로 감염된 포유동물 세포계; 바이러스(예컨대, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충세포계; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 함유하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현요소는 그들의 강도 및 특이성에서 다르다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 번역요소 중에서 임의의 하나가 사용될 수 있다.
DNA 절편을 벡터 내로 삽입하기 위한 당업자에 알려진 임의의 방법들이 적당한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 코딩 서열을 함유하는 키메릭 유전자를 함유하는 발현벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기법, 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산서열, 또는 도메인, 유도체, 절편, 또는 이들의 동족체(homologs)의 발현이 제2 핵산서열에 의해 조절됨으로써, 이들의 유전자 및 절편이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현은 해당 기술분야에서 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 고유한 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(early promoter)(Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310(1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 장 말단반복(long terminal repeat) 내에 함유된 프로모터(Yamamoto 등 Cell 22:787-797(1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster 등, Nature 296:39-42(1982)); 원핵생물 발현벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay 등,(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983)); 또한 [Scientific American 242:79-94(1980)] 내 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" 참조; 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 프로모터를 함유하는 식물 발현벡터(Herrar-Estrella 등, Nature 303:209-213(1984)) 또는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner 등, Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)), 및 리불로스이인산 카르복실라제(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120(1984)); 효모 및 다른 진균 유래 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알콜탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 트랜스제닉 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절부위: 췌장 포상세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절부위(Swift 등, Cell 38:639-646(1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절부위(Hanahan 등, Nature 315:115-122(1985)), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절부위(Grosschedl 등, Cell 38:647-658(1984); Adams 등, Nature 318:533-538(1985); Alexander 등, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444(1987)), 고환, 유방, 림프계 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선암 바이러스 조절부위(Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절부위(Pinckert 등, Genes 및 Devel. 1:268-276(1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절부위(Krumlauf 등, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer 등, Science 235:53-58(1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절부위(Kelsey 등, Genes and Devel. 1:161-171(1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로불린 유전자 조절부위(Magram 등, Nature 315:338-340(1985); Kollias 등, Cell 46:89-94(1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절부위(Readhead 등, Cell 48:703-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절부위(Shani, Nature 314:283-286(1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극호르몬 분비호르몬(Mason 등, Science 234:1372-1378(1986)).
특정 구현예에서, PH20 단백질 또는 도메인, 이들의 절편, 유도체 또는 동족체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제기점 및 임의적으로 하나 이상의 선별마커(예컨대, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. 발현계에 따라, 특이적 개시 신호가 또한 PH20 서열의 효율적인 번역을 위하여 요구된다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. PH20 또는 그의 가용성 형태의 개시코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터 내로 삽입되는 경우, 어떤 부가적 번역 조절 신호도 필요하지 않다. 코딩 서열 또는 이의 일부만 삽입된 경우, ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 전사 조절 신호가 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 전사를 보장하기 위하여 정확한 판독 프레임 내에 있어야 한다. 외인성 전사 인자 및 개시 코돈은 다양한 기원, 천연 및 합성의 것일 수 있다. 발현 효율은 이용하는 세포계에 적절한 인핸서의 삽입에 의해 향상될 수 있다 (Scharf 등 (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner 등 (1987) Methods in Enzymol , 153:516-544).
E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 예는 예를 들어, pQE 발현벡터(Qiagen, Valencia, CA에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Qiagen에 의해 공개된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 E. coli에서 엄격하게 조절되는, 재조합 단백질의 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합부위(RBS II), 6XHis 태그 코딩서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, ColE1 복제기점, 및 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 가진다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 상기 플라스미드는 모든 세개의 판독프레임을 위한 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 제공하고, N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 제공하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31을 포함한다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 다른 예는, 예를 들어, pET 발현벡터(미국특허 4,952,496 참조; NOVAGEN, Madison, WI에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Novagen에서 공개된 문헌 참조)를 포함한다. 상기 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터 및 lac 억제유전자를 포함하는 pET11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 E. coli ompT 분비 신호를 함유하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼으로 정제에서 사용하기 위한 His-TagTM 리더서열, 및 컬럼을 통한 정제후 절단을 가능케 하는 트롬빈 절단부위, T7-lac 프로모터 부위 및 T7 터미네이터를 함유하는 pET 15b와 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
포유동물 세포 발현용 벡터의 예는 HZ24 발현벡터이다. HZ24 발현벡터는 pCI 벡터 백본(Promega)로부터 유래되었다. 이는 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, F1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 극-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐레이션 신호(SV40)을 포함한다. 상기 발현벡터는 또한 ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 가진다. 상기 벡터로 형질감염된 세포는 하이포잔틴 및 티미딘의 부재 하 화학적으로 한정된 배지 니에서 배양외더, 메토트렉세이트의 농도 증가와 함께 추가로 유전자 증폭될 수 있다. 상기 방법은 본원의 실시예 13 및 15에 기재되어 있다.
2. 발현
본원에서 제공되는, esPH20 폴리펩티드 및 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드를 포함하는 PH20 폴리펩티드는 생체내 및 시험관내 방법을 포함한 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하여 생성될 수 있다. 원하는 단백질은 예컨대 투여 및 치료에 필요한, 상기 단백질의 요구되는 양 및 형태를 생산하기에 적당한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현숙주는 진핵생물 및 원핵생물 유기체, 예컨대 E. coli, 효모, 식물, 곤충세포, 사람 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함한 포유동물 세포를 포함한다. 발현숙주는 그 단백질 생산 수준 뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역-후 변형의 형태에서 상이하다. 발현숙주는 상기 및 기타 요인들, 예컨대 규제 및 안전성 고려사항, 생산비용 및 정제 필요성과 방법에 기초하여 선택될 수 있다.
많은 발현벡터들이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있으며, 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 발현벡터의 선택은 숙주발현시스템의 선택에 의해 영향받을 것이다. 일반적으로, 발현벡터는 전사 프로모터와 임의적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사와 번역의 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현벡터는 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 가능케하는 선별마커를 전형적으로 가진다. 일부 경우, 벡터의 카피수를 증폭시키기 위해 복제기점이 이용될 수 있다.
esPH20 및 다른 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드를 포함한, 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드는 또한 단백질 융합으로써 활용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소융합은 효소에 추가 기능성을 부가하도록 생성될 수 있다. 효소융합 단백질의 예는 신호 서열, 예컨대 국재화용 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그, 예를 들어 GST 융합, 그리고 단백질 분비 및/또는 막 연합을 지시하는 서열, Fc 융합과 같은 반감기를 증가시키기 위한 기타 서열의 융합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위하여, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 가용성 PH20, 예컨대, esPH20 또는 다른 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드를 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택마커 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 형질전환될 수 있다. 벡터 도입 후, 세포를 풍부 배지에 1 내지 2 일 동안 성장시키고, 이를 선택 배지로 교체한다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고, 그 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 가능하게 한다. 안정하게 형질전환된 세포인 저항성 세포는 세포 종류에 적절한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
임의의 수의 선택 시스템이 형질전환된 세포주를 회수하기 위하여 이용될 수 있다. 이들은 각각 TK- 및 APRT- 세포에서 채택될 수 있는 단순포진바이러스 티미딘 키나제 (Wigler M 등 (1977) Cell, 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy I 등 (1980) Cell, 22:817-23) 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 항대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택용 기재로써 이용될 수 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 수여하는 DHFR (Wigler M 등 (1980) Proc . Natl . Acad . Sci , 77:3567-70); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418 에 대한 저항성을 수여하는 npt (Colbere-Garapin F 등 (1981) J. Mol . Biol., 150:1-14); 및 각각 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 저항성을 수여하는 als 또는 pat 가 이용될 수 있다. 추가 선택 유전자는 예를 들어 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용하도록 하는 trpB, 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용하도록 하는 hisD 가 기재되어 있다 (Hartman SC 및 RC Mulligan (1988) Proc . Natl . Acad . Sci , 85:8047-51). 가시적 마커, 예컨대, 그러나 이에 제한되지 않는, 안토시아닌, 베타 글루쿠로니다제 및 그 기질 GUS, 및 루시퍼라제 및 그 기질 루시페린이 또한 형질전환체를 확인하기 위하여, 또한 특정 벡터 시스템에 기인하는 일시적 또는 안정적 단백질 발현의 양을 정량하기 위하여 이용될 수 있다 (Rhodes CA 등 (1995) Methods Mol . Biol. 55:121-131).
esPH20 및 기타 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드를 포함한, 가용성 PH20 폴리펩티드의 존재 및 발현은 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 기능적 폴리펩티드의 검출은 적절한 조건 하 조건화 배지의 히알루로니다제 효소 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 하기 섹션 G 는 발현된 단백질의 용해도 및 활성을 평가하기 위한 측정법의 예를 제공한다.
a. 원핵세포
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기법이다. E. coli용 발현벡터는 유도성 프로모터를 함유할 수 있고, 그러한 프로모터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7과 SP6 RNA 프로모터 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.
단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 임의의 것은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경이고, 일부 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성화제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 우레아가 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 대안적 접근법은 산화성 환경 및 샤페로닌-유사의 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하여, 가용성 단백질의 생산을 야기할 수 있는, 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내 단백질 발현이다. 전형적으로, 주변세포질로 단백질을 지시하는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 이어서, 상기 리더는 주변세포질 내 신호 펩티다제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자의 pelB 리더 및 알카라인 포스파타제 유전자 유래 리더를 포함한다. 일부 경우, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우 단백질은 불용성이 되며, 재용해 및 리폴딩(refolding)을 촉진하기 위해 변성화제와 환원제를 사용할 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있으며, 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 아글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 글리코실화를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제후 시험관내에서 글리코시화가 부가될 수 있다.
b. 효모 세포
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 생산에 사용될 수 있는 잘 알려진 효모 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 그러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아(Pichia), 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현벡터는 대개 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 대개 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 다이설파이드 이소머라제와 공동-발현은 발현수준 및 용해도를 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 분비 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호, 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 유도될 수 있다. Kex-2 프로테아제와 같은 프로테아제 절단부위는 분비경로를 탈출시, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충세포
특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 폴리펩티드, 예컨대 히알루로니다제 폴리펩티드의 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고, 진핵발현의 규제 우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한성 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)에서 유래된 Sf9를 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 하류에 융합된다. 포유동물 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 발현된 단백질을 배양배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 세포주 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 곤주나비(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유동물 세포계와 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생산한다. 곤충의 예는 "포유동물화" 배큘로바이러스 발현 벡터를 갖는 것들, 효소 FT3 을 결한 것들을 포함하여, 면역원성의 감소를 위하여 변경된 것들이다.
곤충세포에서 대체 발현계는 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 Schneider 2(S2) 및 Kc 세포(Drosophila melanogaster) 및 C7 세포(Aedes albopictus)가 발현에 사용될 수 있다. 초파리 메탈로티오네인 프로모터를 이용하여 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재 하 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신을 사용하여 전형적으로 유지된다.
d. 포유동물 세포
포유동물 발현계는 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드를 포함하는, 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물(constructs)은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염, 또는 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 이동, 및 전기천공과 미세주입과 같은 물리적인 수단에 의해 포유동물 세포로 전달할 수 있다. 포유동물 세포용 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역개시서열(Kozak 공통서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 다른 유전자, 예컨대 선별마커를 이용한 바이시스트로닉(bicistronic) 발현을 가능케 하도록 부가될 수 있다. 상기 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스육종 바이러스(RSV)의 장 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-형 프로모터 및 인핸서 부위가 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터/인핸서 부위의 예는 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초염기성단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 메토트렉세이트 존재하에 발현을 수행하여 DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선별할 수 있다. 세포표면 신호링 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 많은 세포주가 포유류 발현에 이용가능하다. 세포주의 예는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유모세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 등,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)를 포함한다. 최대발현을 위해 최적화된 특정배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규명된, 동물 산물-부재 배지 내 현탁 배양물에서 성장하도록 적응되어 있다.
e. 식물체
트랜스제닉 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것을 발현하는데 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 이동과 같은 직접적 DNA 이동을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달될 수 있다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사종결요소 및 번역조절요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기법은 보통 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis)와 담배(tobacco), 및 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 사이에서 나뉜다. 발현에 이용되는 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스이인산 카르복실라제 프로모터, 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체식물로 재생될 수 있다. 트랜스제닉 식물세포는 또한 히알루로니다제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
3. 정제 기술
esPH20 및 기타 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드를 포함하는, 가용성 PH20 을 암호화하는 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양으로부터 암호화된 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산되는 단백질은 일반적으로 분비되나, 서열 및/또는 사용된 벡터에 따라 세포내로 포함될 수 있다. 당업자에게 인식되는 바와 같이, PH20 을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포막을 통한 PH20 의 직접적 분비를 촉진하는 신호 서열을 이용하여 설계될 수 있다.
따라서, 숙주세포로부터 폴리펩티드의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현계에 좌우될 것이다. 분비된 분자를 위하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 유기체, 예컨대 트랜스제닉 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발재료로써 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물 생산은 우유 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 상기 단백질이 추출되고, 당해 기술분야의 표준방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 esPH20 폴리펩티드 또는 기타 C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드를 포함한 가용성 PH20 폴리펩티드는 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 술페이트 침전, 및 이온교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온교환을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 알려진 표준 단백질 정제기술을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제기술 또한 제제의 효율 및 순도를 향상시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 수용체 및 PH20 히알루로니다제 효소에 결합하는 다른 분자가 친화성 정제에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 가용성 PH20 은 조건화 배지로부터 정제될 수 있다.
발현 구축물은 또한 단백질, 예컨대 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6에 친화성 태그를 부가하도록 조작되고, myc 항체, 글루타치온 레진 및 Ni-레진으로 각각 친화성 정제될 수 있다. 상기 태그들은 본원의 다른 곳에 기재된 가용성 PH20 을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있으며, 이는 가용성 단백질의 정제를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 가용성 PH20 은 단백질 정제를 촉진하기 위하여 부가된 하나 이상의 폴리펩티드 도메인을 갖는 재조합 단백질로써 발현될 수 있다. 상기 정제 촉진 도메인은 이에 제한되지 아니하나 금속 킬레이팅 펩티드 예컨대 고정된 금속 상에 정제되도록 하는 히스티딘-트립토판 모듈, 고정된 면역글로불린 상에 정제되도록 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 확장/친화력 정제 시스템 (Immunex Corp., Seattle Wash.)에서 이용되는 도메인을 포함한다. 정제 도메인과 발현되는 PH20 폴리펩티드 사이의 인자 XA 또는 엔테로키나제 (Invitrogen, San Diego, CA)와 같은 절단가능 링커 서열의 포함이 정제를 촉진하기 위해 유용하다. 상기 발현 벡터와 같은 것이 가용성 PH20 을 포함하는 융합 단백질의 발현을 제공하며, 6개 히스티딘 잔기를 암호화하는 핵산 뒤 티오레독신 및 엔테로키나제 절단 위치를 포함한다. 상기 히스티딘 잔기는 IMIAC (고정된 금속 이온 친화력 크로마토그래피) 상에 정제를 촉진하는 반면, 엔테로키나제 절단 위치는 융합 단백질로부터 상기 폴리펩티드를 정제하기 위한 수단을 제공한다.
순도는 겔 전기영동, 직교 HPLC 법, 염색 및 분광광도 기술을 포함한 당 분야에 공지된 임의의 방법으로 평가될 수 있다. 발현되고 정제된 단백질은 당업자에게 알려진 임의의 검정 또는 방법, 예컨대 섹션 G에 기재된 어느 것을 이용하여 분석될 수 있다. 이들은 겔 전기영동 분석, 면역검정 및 히알루로니다제 활성 측정을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질의 물리적 및/또는 기능적 성질에 기초한 측정법을 포함한다.
사용되는 발현계 및 숙주 세포에 따라, 생성되는 폴리펩티드는 생산 및 정제 시 배양 배지 내 존재하는 펩티다제에 기인하여 불균질일 수 있다. 예를 들어, CHO 세포 내 가용성 PH20 의 배양물은 불균질 폴리펩티드의 혼합물을 생성한다. 가용성 PH20 (예컨대, rHuPH20) 의 생성, 제조 및 정제를 위한 프로토콜의 예는 하기 실시예 13 내지 15에 기재되어 있다. 유사하게, 예를 들어 서열번호 60 에 제시된 아미노산 36-497 의 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현은 497, 496, 495, 494, 493, 492, 491, 490, 489 또는 그 미만에서 종결되는 폴리펩티드를 다양하게 포함하는 폴리펩티드의 불균질 혼합물을 생성할 수 있다.
F. 연장된 가용성 PH20 폴리펩티드 및 다른 가용성 PH20 폴리펩티드의 제제, 제형화 및 투여
투여를 위한 esPH20 을 포함한 가용성 PH20 의 약학적 조성물이 본원에서 제공된다. 가용성 PH20 폴리펩티드는 개별적으로 제형화되거나, 예컨대 섹션 G에기재된 것과 같은 다른 치료제의 약학적 제형과 함께 함께-제형화되거나 또는 함께-투여될 수 있다. 상기 화합물은 적절한 약학적 제제, 예컨대, 경구 투여를 위한, 용액, 현탁액, 정제, 분산정(dispersible tablet), 알약(pill), 캡슐, 분말, 지속방출 제형 또는 엘릭시르(elixir) 뿐만 아니라, 경피전달 패치 제제 및 건조분말 흡입기로 제형화될 수 있다. 전형적으로, 상기 화합물은 당해 기술분야에서 잘 알려진 기법 및 절차를 이용하여 약학적 조성물로 제형화될 수 있다(예컨대, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126 참조).
일반적으로, 치료적으로 효과적인 용량이 고려된다. 질환 또는 상태의 치료를 위하여 투여되도록 선택된 가용성 PH20 폴리펩티드의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 측정 및 동물 모델을 이용하여 최적 용량 범위를 확인하는 것을 도울 수 있다. 실험적으로 결정될 수 있는 정확한 용량은 특정 효소, 투여 경로, 치료될 질환의 종류 및 질환의 중증도에 의해 좌우될 수 있다.
따라서, 정확한 용량 및 치료 기간은 공지의 측정 프로토콜을 이용하여 또는 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 외삽하여 경험적으로 결정될 수 있다고 이해된다. 농도 및 용량 값은 또한 완화될 상태의 중증도와 함께 변할 수 있음이 알려져 있다. 어떤 특정 환자에 대하여, 특이적 약물투여계획은 개별적 요구와 조성물의 투여 또는 투여를 감독하는 자의 전문적 판단에 따라 시간 경과와 함께 조정되어야 하며, 본원에서 제시된 농도 범위는 단지 예시적이며, 조성물, 및 이를 포함하는 조합물의 범위 또는 이용을 제한하는 의도는 아니라는 것이 추가로 이해된다. 상기 조성물은 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년 또는 한번 투여될 수 있다. 일반적으로 복용요법은 독성을 제한하도록 선택된다. 담당 내과의는 독성 또는 척수, 간 또는 신장 또는 다른 조직 이상 때문에 용량을 낮추기 위하여 치료를 종결하거나, 중단하거나, 조정할 방법 및 시기를 알 것임을 명백하다. 역으로, 담당 내과의는 또한 임상 반응이 적절하지 않으면 (독성 부작용은 제외), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 방법 및 시기를 알 것이다.
약학적으로 허용되는 조성물은 동물 및 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는, 관리 기관 또는 기타 기관에 대한 승인을 고려하여 제조된다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말 및 지속방출 제형을 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세리드를 가지는 좌약으로써 제형화될 수 있다. 경구제형은 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 및 다른 기타 제제를 포함할 수 있다. 상기 제형은 투여방식에 적절해야 한다.
약학적 조성물은 가용성 PH20 과 같이 투여되는 담체, 예컨대 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 그러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 치료적 유효량의 화합물을, 일반적으로 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 포함할 것이다. 그러한 약학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유 및 참기름을 포함한, 물 및 오일과 같은 무균액체일 수 있다. 물은 상기 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용액을 위한 액체담체로써 활용될 수 있다. 조성물은 활성성분과 함께 다음을 함유할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토오스, 수크로스, 인산이칼슘, 또는 카르복시메틸셀룰로오스; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검(gums), 예컨대 아카시아 검, 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로오스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 알려진 다른 그와 같은 결합제. 적절한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크(chalk), 실리카겔, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 조성물은, 원한다면, 또한 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 소디움 시트레이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소디움 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 다른 그와 같은 제제를 포함할 수 있다.
약학적 치료적 활성 화합물 및 이의 유도체의 제형은 인간 및 동물에 투여를 위하여 단위 제형 또는 복수 제형으로 제공된다. 예를 들어, 화합물은 정제, 캡슐, 알약, 분말(산제), 과립, 무균 비경구 용액 또는 현탁액 및 경구용 용액 또는 현탁액, 및 적절한 양의 화합물 또는 그의 약학적 허용 유도체를 포함하는 오일 물 에멀젼으로써 제형화될 수 있다. 각 단위 용량은 원하는 치료효과를 생성하기에 충분한, 미리결정된 양의 치료적 활성 화합물을 필요한 약학적 담체, 비히클 또는 희석제와 연합하여 포함한다. 단위 제형의 예는 앰플 및 주사기, 및 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 단위 제형은 분획물 또는 이들의 복수로 투여될 수 있다. 복수 제형은 구분된 단위 제형에서 투여되는 단일 용기 내 패키징된 동일한 단위 제형의 복수이다. 복수 제형은 예는 바이알, 정제 또는 캡슐의 병 또는 파인트 또는 갤론 병을 포함한다. 따라서, 복수 제형의 포장에 있어 분리되지 않은 복수의 단위 제형이다. 일반적으로, 0.005% 내지 100% 의 범위의 활성 성분과 잔량의 비독성 담체를 포함하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있다.
비록 다른 투여 경로, 예컨대, 근육내, 복강내, 정맥내, 진피내, 병변내, 복강내 주사, 경막외, 질, 직장, 국부, 귀, 경피 투여 또는 임의의 경로를 포함한 당업자에게 알려진 임의의 경로가 고려되지만, 일반적으로 본원에서 제공되는 조성물은 피하 경로로 투여하기 위하여 제형화된다. 상기 경로에 적합한 제형은 당업자에게 공지되어 있다. 투여는 치료 부위에 따라 국부, 국소 또는 전신일 수 있다. 치료가 필요한 지역에 국소 투여는 예를 들면 수술 중 국부 주입, 국소적용, 예를 들어, 수술후 상처드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 다른 생물학적으로 활성인 제제와 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물 내에 투여될 수 있다.
임의의 주어진 경우의 가장 적절한 경로는 다양한 요인, 예컨대 질환의 성질, 특정 투여 경로에 대한 대상체의 허용성, 질환의 중증도, 및 사용되는 특정 조성물에 좌우된다. 일반적으로, 본원에서 제공하는 조성물은 비경구로 투여된다. 일부 예에서, 가용성 PH20 조성물은 투여되어, 피부 또는 조직의 간극에 도달하여, 치료용 작용제의 후속 전달을 위하여 간극 공간을 분해한다. 따라서, 일부 예에서, 예컨대 피하 투여법에 의한 피부 하 직접 투여가 고려된다. 따라서, 한 예에서, 국소 투여는 주사, 예컨대 주사기 또는 바늘과 같은 주사 장치를 포함하는 기타 제조품으로부터 주사에 의해 달성될 수 있다. 다른 예에서, 국소 투여는 주입에 의해 달성될 수 있으며, 이는 펌프 또는 기타 유사한 장치를 사용하여 촉진될 수 있다. 다른 투여 모드가 또한 고려된다. 약학적 조성물은 각 투여 경로에 적절한 제형 내에 제형화될 수 있다.
투여 방법은 선택된 가용성 PH20 폴리펩티드의 분해적 과정, 예컨대 단백질분해적 소화, 및 항원성 및 면역원성 반응을 통한 면역학적 개입에의 노출을 감소시키기 위하여 채택될 수 있다. 상기 방법의 예는 치료 부위에 국소 투여를 포함한다. 치료제의 페길화가 단백질 분해에 대한 저항성을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 보고되었다. 페길화 방법론의 예는 당 분야에 공지되어 있다 (예를 들면, Lu 및 Felix, Int . J. Peptide Protein Res ., 43: 127-138, 1994; Lu 및 Felix, Peptide Res ., 6: 142-6, 1993; Felix 등, Int . J. Peptide Res ., 46 : 253-64, 1995; Benhar 등, J. Biol . Chem ., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu 등, J Immunol ., 154: 3088-95, 1995 참조; 또한, Caliceti 등 (2003) Adv . Drug Deliv . Rev . 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S 참조). 페길화는 또한 생체내 핵산분자의 전달에 사용될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스의 페길화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다 (예컨대, Cheng 등 (2003) Pharm . Res . 20(9): 1444-51 참조).
1. 주사가능물질, 용액 및 에멀젼
일반적으로 주사 또는 주입을 특징으로 하는, 피하, 근육내, 정맥내 또는 진피내(intradermally) 중 어느 하나의 비경구 투여가 본원에서 고려된다. 주사가능물질(injectables)은 통상적인 형태, 액체 용액 또는 현탁액, 주사전에 액체내 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태로써, 또는 에멀젼으로써 제조될 수 있다. 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤 또는 에탄올이다. 약학적 조성물은 기타 적은 양의 비-독성 보조 성분 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 향상제 및 기타 그러한 제제, 예컨대, 소디움 아세테이트, 소디움 포스페이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 시클로덱스트린을 포함할 수 있다. 서방출 또는 용량의 일정한 수준이 유지되도록 하는 지속-방출계 (예컨대, 미국특허번호 3,710,795호 참조)의 주입이 또한 본원에서 고려된다. 상기 비경구용 조성물 내에 포함된 활성 화합물의 백분율은 그의 특정 성질 뿐 아니라 화합물의 활성 및 환자의 필요에 매우 종속한다.
주사가능물질은 국소 및 전신투여를 위하여 설계된다. 본원의 목적을 위해, 국소투여는 발병된 간극의 직접 투여가 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제는 주사용으로 준비된 멸균 용액; 주사정(hypodermic tablets)을 포함한, 사용직전 용매와 결합되도록 준비된 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 동결건조 분말; 주사용으로 준비된 멸균 현탁액; 사용직전에 비히클과 결합되도록 준비된 멸균 건조 불용성 제품; 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내로 투여된다면, 적절한 담체는 생리식염수 또는 인산완충식염수(PBS), 및 가용화제와 증점제(thickening agents), 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한 용액을 포함한다.
비경구 제제에서 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충액, 항산화제, 국소마취제, 현탁화제 및 분산제, 유화제, 봉쇄제(sequestering agents) 또는 킬레이트제, 및 다른 약학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장 덱스트로즈 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로즈 및 락테이티드(Lactated) 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물 기원의 고정유(fixed oils), 면실유, 옥수수기름, 참기름 및 낙화생유를 포함한다. 항미생물제는 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도로 복수-투여 용기로 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있고, 페놀 또는 크레솔, 수은제(mercurials), 벤질알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함한다. 등장화제는 염화나트륨 및 덱스트로즈를 포함한다. 완충액은 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨(sodium bisulfate)을 포함한다. 국소마취제는 염산프로카인을 포함한다. 현탁화제 및 분산제는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리솔베이트 80(TWEEN 80)을 포함한다. 금속이온의 봉쇄제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약학적 담체는 또한 수-혼화성(water miscible) 비히클로 에틸알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과, pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 포함한다.
약학적 활성 화합물의 농도는 주사 내지 주입이 원하는 약리학적 효과, 예컨대 혈당 조절을 생성하기 위한 유효량을 제공하도록 조정된다. 정확한 용량은 당 분야에 알려진 바와 같이 환자 또는 동물의 연령, 체중 및 상태에 종속한다. 단위-용량 비경구 제제는 예를 들면, 앰플, 카트리지, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 패키징될 수 있다. 약학적 활성 화합물을 포함하는, 액체 용액 또는 재구성 분말 제제의 부피는 치료될 질환 및 포장을 위해 선택된 특정 제품의 함수이다. 모든 비경구 투여용 제제는 당 분야에 알려지고 사용되는 바와 같이 무균 상태이어야 한다.
한 예에서, 약학적 제제는 액체 형태 예컨대 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있다. 액체 형태로 제공된다면, 약학적 제제는 사용전에 치료적 유효 농도로 희석되는 농축된 제제로써 제공될 수 있다. 그러한 액체 제제는 약학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대 현탁화제 (예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제 (예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예컨대, 아몬드 오일, 오일 에스테르, 또는 분획화 식물유); 및 보존제 (예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 함께 통상의 수단으로 제조될 수 있다. 다른 예에서, 약학적 제제는 사용전 물 또는 다른 적절한 비히클로 재구성하기 위한 동결건조 형태로 제공될 수 있다.
동결건조 분말
용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로써 투여를 위해 재구성될 수 있는 동결건조 분말이 본원의 관심이 된다. 이들은 또한 고체 또는 겔로써 재구성되고 제형화될 수 있다.
멸균되고 동결건조된 분말은 완충용액 내에 비활성 효소인 화합물을 용해시켜 조제될 수 있다. 완충용액은 안정성을 개선하는 부형제 또는 분말로부터 조제된, 분말 또는 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 그다음 용액의 멸균여과후, 당업자에게 알려진 표준 조건하에 동결건조하여 원하는 제형을 제공한다. 요약하면, 동결건조된 분말은 적절한 완충액, 예컨대 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 당업자에게 알려진 기타 상기 완충액에 부형제, 예컨대 덱스트로스, 소르비탈, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 또는 기타 적절한 제제를 용해시켜 조제된다. 그다음, 선택된 효소를 생성된 혼합물에 첨가하고, 용해될까지 교반한다. 생성된 혼합물을 멸균여과하거나, 미립자를 제거하고 무균성을 보장하기 위해 처리하여, 동결건조를 위한 바이알 내로 배분한다. 각각의 바이알은 화합물의 단일용량 또는 복수용량을 함유할 것이다. 동결건조된 분말은 적절한 조건, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다. 적절한 완충용액과 상기 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여로 사용하기 위한 제형을 제공한다.
2. 국소투여
국소 혼합물은 상기 국소 및 전신투여를 위해 기술된 바와 같이 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고, 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르(elixirs), 로션, 현탁액, 틴크제, 페이스트, 폼(foams), 에어로졸, 관주액(irrigations), 스프레이, 좌약, 붕대, 피부 패치 또는 국소투여에 적절한 임의의 다른 제형으로서 제형화된다.
화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체는 흡입과 같은, 국소적용을 위한 에어로졸로써 제형화될 수 있다(예를 들어, 미국특허번호 4,044,126; 4,414,209; 및 4,364,923 참조, 염증성 질환, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드 전달을 위한 에어로졸을 기술하고 있음). 기도로 투여를 위한 제형은 분무기용 에어로졸 또는 용액의 형태, 또는 흡입을 위한 초미립자(microfine) 분말로, 단독 또는 락토오스와 같은 불활성 담체와 조합될 수 있다. 그와 같은 경우에, 제형의 입자는 일반적으로 50 미크론 미만, 바람직하게는 10 미크론 미만의 직경일 것이다.
화합물은 국부(local) 또는 국소(topical) 적용을 위하여, 예컨대 피부 및 안내와 같은 점막으로의 국소적용을 위하여, 겔, 크림 및 로션의 형태로, 그리고 눈으로의 적용을 위하여, 또는 수조내(intracisternal) 또는 척수내 적용을 위하여 제형화될 수 있다. 경피전달용, 및 또한 눈 또는 점막 투여용, 또는 흡입요법용 국소투여가 고려된다. 활성 화합물 단독 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합한 비강용액이 또한 투여될 수 있다.
경피투여에 적절한 제형이 제공된다. 이들은 임의의 적절한 포맷, 예컨대 장기간의 시간 동안 수용자의 표피와 긴밀한 접촉을 유지하도록 적응된 별개의 패치로써 제공될 수 있다. 상기 패치는 활성 화합물과 관련하여, 예를 들어 0.1 내지 0.2M 농도의 임의적으로 완충화된 수성용액 내에 활성 화합물을 함유한다. 경피투여에 적절한 제형은 또한 이온영동법(iontophoresis)에 의해 전달될 수 있고(예를 들어, Pharmaceutical Research 3(6),318(1986) 참조), 일반적으로 활성 화합물의 임의적으로 완충화된 수성용액의 형태를 취한다.
3. 다른 투여경로를 위한 조성물
치료되는 상태에 따라, 다른 투여경로, 예컨대 국소적용, 경피패치, 경구 및 직장투여가 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어 직장투여를 위한 약학적 제형(dosage forms)은 전신작용을 위한 직장좌제, 캡슐 및 정제이다. 직장좌제는 체온에서 녹거나 부드러워지면서 하나 이상의 약리학적 또는 치료적 활성성분을 방출하는, 직장내로 삽입을 위한 고체 바디(body)를 포함한다. 직장좌제에 이용되는 약학적으로 허용가능한 물질은 기제(bases) 또는 비히클 및 녹는점을 높이는 제제이다. 기제의 예는 코코아 버터(테오브로마 오일), 글리세린-젤라틴, 카르보왁스(폴리옥시에틸렌 글리콜) 그리고 지방산의 모노-, 다이- 및 트리글리세리드의 적당한 혼합물을 포함한다. 다양한 기제의 조합물이 사용될 수 있다. 좌제의 녹는점을 높이는 제제는 경랍(spermaceti) 및 왁스를 포함한다. 직장좌제는 압축법 또는 몰딩 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 직장좌제의 일반적인 중량은 약 2 내지 3mg이다. 직장투여를 위한 정제 및 캡슐은 동일한 약학적으로 허용가능한 물질을 이용하여, 경구투여를 위한 제형화와 동일한 방법에 의해 제조된다.
직장투여에 적절한 제형은 단위 투여량 좌제로써 제공될 수 있다. 이들 제형은 활성 화합물을 하나 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들어 코코아 버터와 혼합한 다음, 생성된 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다.
경구투여를 위하여, 약학적 조성물은 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어, 결합제(예를 들어, 전젤라틴화된 옥수수 전분(pregelatinized maize starch), 폴리비닐 피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충진제(예를 들어, 락토오스, 미세결정성 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자전분 또는 전분글리콘산나트륨); 또는 습윤제(예를 들어, 소디움 라우릴 술페이트)를 이용하여 통상적인 수단으로 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업자에 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다.
구강(설하)투여에 적절한 제형은, 예를 들어 맛이 나는 기제, 보통 수크로스와 아카시아 또는 트래거캔스(tragacanth) 내에 활성 화합물을 함유한 로젠지(lozenges); 및 불활성 기제, 예컨대 젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아 내에 화합물을 함유하는 캔디(pastilles)를 포함한다.
약학적 조성물은 또한 제어방출 제형 및/또는 전달장치에 의해 투여될 수 있다(예를 들어 미국특허번호 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 및 5,733,566).
리포솜 내 캡슐화(encapsulation), 미립자, 미소캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스, 및 레트로바이러스 전달계와 같은 선택된 가용성 PH20 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산분자의 전달과 같은, 그러나 여기에 제한되지 않는, 다양한 전달시스템이 알려져 있으며, 선택된 가용성 PH20 폴리펩티드를 투여하는데 이용될 수 있다.
따라서, 어떤 구현예에서, 리포솜 및/또는 나노입자가 또한 가용성 PH20 폴리펩티드의 투여와 함께 이용될 수 있다. 리포솜은 수성 매질 내 분산된 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 다층 동심 이중층 소포(multilamellar concentric bilayer vesicles)(다층소포(MLV)로도 불림)를 형성한다. MLV 는 일반적으로 25nm 내지 4μm의 직경을 가진다. MLV 의 초음파처리는 중심에 수성용액을 함유하는 200 내지 500옹스트롬 범위의 직경을 갖는 작은 단층소포(SUV) 형성을 유발한다.
인지질은, 물에 분산됐을 때, 물에 대한 지질의 몰비에 따라 리포솜 외에 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서, 리포솜이 형성된다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온강도 및 이가(divalent) 양이온의 존재에 좌우된다. 리포솜은 이온 및 극성 물질에 낮은 투과성을 보일 수 있으나, 상승된 온도에서 이들의 투과성을 현저하게 변화시키는 상전이를 겪는다. 상전이는 겔 상태로 알려진 가깝게 뭉쳐진 정돈된(ordered) 구조로부터 유체(fluid) 상태로 알려진 느슨하게 뭉쳐진 덜 정돈된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특유의 상-전이 온도에서 일어나고, 이온, 당 및 약물에 대한 투과성 증가를 유발한다.
리포솜은 상이한 기전들: 세망내피계(reticuloendothelial system)의 포식세포(phagocytic cells), 예를 들어 대식세포 및 호중구에 의한 엔도시토시스; 비특이적이고 약한 소수성 또는 정전기적 힘, 또는 세포-표면 성분과의 특이적인 상호작용 중 어느 하나에 의한 세포표면에 흡착; 세포질 내 리포솜 내용물의 동시 방출을 수반하는, 원형질막 내로 리포솜의 지질이중층 삽입에 의한 원형질막과의 융합; 및 리포솜 내용물의 연계없이, 리포솜 지질의 세포 또는 세포하(subcellular) 막으로 이동, 또는 그 반대에 의하여 세포와 상호작용한다. 리포솜 제형을 달리함으로써 작동하는 기전을 바꿀 수 있으나, 하나 초과가 동시에 작동할 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방법으로 화합물을 포집할 수 있다. 세포내 폴리머의 과부하(overloading)로 인한 부작용을 피하기 위하여, 상기 초미립자(약 0.1μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 설계되어야 한다. 본원의 용도로 상기 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 고려되며, 상기 입자는 쉽게 제조될 수 있다.
4. 용량 및 투여
본원에서 제공되는 esPH20 을 포함한 가용성 PH20 폴리펩티드는 단일 용량 또는 복수 용량 투여를 위한 약학적 조성물로써 제형화될 수 있다. 선택된 히알루로난 분해 효소는 치료되는 환자에 원치않는 부작용 없이 치료적으로 유용한 효과를 달성하기에 충분한 양으로 포함된다. 치료적 유효 농도는 공지의 시험관내 및 생체내 시스템에서, 예컨대, 본원에서 제공되거나, 당 분야에 알려진 측정법을 이용하여 폴리펩티드를 시험하고, 이어서 인간에 대한 용량을 그로부터 외삽하여 실험적으로 결정될 수 있다 (예컨대, Taliani 등 (1996) Anal . Biochem., 240: 60-67; Filocamo 등 (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo 등 (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard 등 (1995) Virology , 209:52-59; Bianchi 등 (1996) Anal . Biochem., 237: 239-244; Hamatake 등 (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler 등 (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza 등 (1995) J Gen . Virol., 76:1729-1736; Takeshita 등 (1997) Anal . Biochem., 247:242-246 참조; 또한 예컨대 Shimizu 등 (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani 등 (1996) J. Virol . 70:7219-7223; Mizutani 등 (1996) Biochem . Biophys . Res . Commun., 227:822-826; Lu 등 (1996) Proc . Natl . Acad . Sci ( USA ), 93:1412-1417; Hahm 등, (1996) Virology, 226:318-326; Ito 등 (1996) J. Gen . Virol ., 77:1043-1054; Mizutani 등 (1995) Biochem . Biophys . Res . Commun., 212:906-911; Cho 등 (1997) J. Virol . Meth. 65:201-207 참조)
일반적으로, 가용성 PH20 효소의 치료적 유효 용량은 안정화된 용액 또는 현탁액 또는 동결건조 형태 내 약 또는 10 유닛 (U) 내지 500,000 유닛, 100 유닛 내지 100,000 유닛, 500 유닛 내지 50,000 유닛, 1000 유닛 내지 10,000 유닛, 5000 유닛 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 유닛 내지 10,000 유닛, 일반적으로 1,000 내지 50,000 유닛이다. 상기 제형은 단위-용량 형태(제형), 예컨대, 그러나 이에 제한되지 않는, 앰플, 주사기 및 개별적으로 패키징된 정제 또는 캡슐로 제공될 수 있다. 분산제가 단독 또는 다른 약리학적 유효 작용제 또는 치료제와 함께 총 부피 0.1-100 ml, 1-50 ml, 10-50 ml, 10-30 ml, 1-20 ml, 또는 1-10 ml, 전형적으로 10-50 ml 로 투여될 수 있다.
예를 들어, esPH20 을 포함한 가용성 PH20 은 약 또는 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 유닛, 5,000 U 또는 그 이상으로 피하 투여될 수 있다. 일부 예에서, 용량은 투여되는 가용성 PH20 대 치료제의 양의 비율로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 가용성 PH20 폴리펩티드는 1 히알루로니다제 U/ 치료제 U (1:1) 내지 50:1 이상, 예컨대, 약 또는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 이상으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 고려되는 가용성 PH20 의 주사 또는 주입 부피는 약 또는 0.01 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL, 0.4 mL, 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml 이상 부터이다. 가용성 PH20 은 직접 사용을 위하여 또는 사용전 유효농도로 희석하기 위하여 약 또는 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/mL, 600 U/mL, 800 U/mL 또는 1000 U/mL 로 스톡 용액으로써 제공되거나, 더욱 농축된 형태, 예컨대, 약 또는 2000 U/ml, 3000 유닛/ml, 4000 U/ml, 5000 U/ml, 8000 U/ml, 10,000 U/mL 또는 20,000 U/mL 로 제공될 수 있다. 가용성 PH20 은 액체 또는 동결건조 제형으로써 제공될 수 있다.
5. 포장, 제조품 및 키트
esPH20 을 포함하는 가용성 PH20 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 이의 유도체 또는 변이체인 약학적 화합물은 포장재료, 질환 또는 상태를 치료하기에 유효한 약학적 조성물, 및 가용성 PH20 또는 핵산 분자가 질환 또는 상태를 위하여 이용되는 것을 지시하는 라벨을 포함하는 제조품으로써 포장될 수 있다. 선택된 가용성 PH20 히알루로니다제 또는 이의 유도체 또는 변이체와 치료제의 조합물이 또한 제조품 내 포장될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재료를 함유한다. 약학적 제품을 포장하는데 사용되는 포장재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각이 본원에서 전체로 통합되는 미국특허번호 5,323,907, 5,052,558 및 5,033,252 참조. 약학적 포장재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병, 그리고 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료방식에 적절한 임의의 포장재료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제조품은 국소 주사 목적을 위한 투여 (예컨대, 표피 주사)를 용이하게 하기 위하여 바늘 또는 다른 주사 장치를 포함할 수 있다. 가용성 PH20, 예컨대 esPH20, 및 특정 질환 또는 장애를 치료하는 것으로 알려진 치료제를 포함한, 광범위한 어레이의 본원에서 제공되는 화합물 및 조성물의 제형이 고려된다. 포장의 선택은 가용성 PH20 및/또는 치료제, 및 상기 조성물이 함께 또는 별개로 포장될 것인지에 좌우된다. 한 예에서, 가용성 PH20 은 치료제와의 혼합물로써 패키징될 수 있다. 다른 예에서, 성분들은 별개의 조성물로써 패키징될 수 있다.
선택된 가용성 PH20 폴리펩티드, 예컨대, esPH20 폴리펩티드, 치료제 및/또는 그의 제조품은 또한 키트로써 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기재된 약학적 조성물 및 제조품으로써 제공되는 투여용 물품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가용성 PH20 폴리펩티드는 투여용 장치, 예컨대 주사기, 흡입기, 복용컵, 점적기, 또는 적용기와 함께 공급될 수 있다. 조성물은 투여용 물품 내에 포함되거나, 이후에 부가되기 위하여 별개로 제공될 수 있다. 선택적으로, 키트는 용량, 복용법 및 투여 모드를 위한 지시를 포함한 적용 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에서 제공되는 약학적 조성물 및 진단용 물품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 대상체 내 선택된 프로테아제의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 물품을 포함할 수 있다.
G. 검정
esPH20 폴리펩티드를 포함하는 본원에서 제공되는 가용성 PH20 폴리펩티드는 가용성이고, 히알루로니다제 효소 활성을 보유한다. 본원에서 제공되는 N-글리코실화 또는 N-부분 글리코실화 PH20 폴리펩티드는 히알루로니다제 효소 활성을 보유한다. 본원에서 제공되는 PH20 폴리펩티드의 활성은 C-말단 절단되거나, N-부분 글리코실화되지 않은 상응하는 PH20 의 활성과 비교하여 약 또는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이다. 가용성 PH20 히알루로니다제 폴리펩티드, 예컨대, esPH20 의 활성은 당 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들면 바이오틴화된 히알루론산을 이용한 미세탁도 분석법 및 미세적정 분석법을 포함한다. 활성 및 측정은 조건화 배지 또는 상층액 또는 정제된 단백질 상에서 수행될 수 있다. 단백질의 용해도는 또한 예를 들면 트리톤® X-114 분별 검정법으로 결정될 수 있다. 모든 측정법에서, 가용성 PH20 의 활성 또는 용해도는 대조군, 예를 들면 C-말단 절단이 없는 전장 PH20 와 비교될 수 있다.
1. 히알루로니다제 활성
가용성 PH20 폴리펩티드의 활성은 당분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제에 대한 USP XXII 검정은 효소를 30분 동안 37℃에서 HA와 반응시킨 후 남은 분해되지 않은 히알루론산 또는 히알루로난 (HA) 기질의 양을 측정함으로써 활성을 간접적으로 결정한다 (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 미국 약전 협회(United States Pharmacopeia Convention, Inc), 미국 메릴랜드주 락빌 소재). 히알루로니다제 표준품 (USP) 또는 국가 의약품집 (NF) 표준 히알루로니다제 용액이 임의의 히알루로니다제의 활성 (단위)을 확인하기 위한 검정에서 사용될 수 있다.
한 예에서, 활성은 실시예 12에 기재된 바와 같은 미세탁도 검정을 사용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 불용성 침전물의 형성을 기초로 한다. 상기 활성은 히알루로니다제를 나트륨 히알루로네이트 (히알루론산)와 설정된 기간 동안 (예를 들어, 10분) 인큐베이션한 후 소화되지 않은 나트륨 히알루로네이트를 산성화된 혈청 알부민의 첨가에 의해 침전시켜 측정된다. 생성된 시료의 탁도는 추가 현상 기간 후 640 nm에서 측정된다. 나트륨 히알루로네이트 기질에 대한 히알루로니다제 활성으로부터 생성된 탁도의 감소는 히알루로니다제 효소 활성의 척도이다.
다른 예에서, 히알루로니다제 활성은 히알루로니다제와의 인큐베이션 후 잔류 바이오티닐화된 히알루론산을 측정하는 마이크로타이터 검정을 이용하여 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269], 미국 특허 공개 제20050260186호 참조). 실시예 4에서, 절단된 인간 PH20 히알루로니다제의 히알루로니다제 활성은 바이오티닐화 히알루론산을 이용하여 결정된다. 히알루론산의 글루쿠론산 잔기 상의 유리 카르복실기를 바이오티닐화시키고, 바이오티닐화된 히알루론산 기질을 미세적정 플레이트에 공유결합으로 커플링시킨다. 히알루로니다제와의 인큐베이션 후, 잔류 바이오티닐화된 히알루론산 기질을 아비딘-퍼옥시다제 반응을 이용하여 검출하고, 공지된 활성의 히알루로니다제 표준과의 반응 후 얻어지는 것과 비교한다. 기질이 미세적정 플레이트에 공유결합되어 있기 때문에, 바이오티닐화 기질의 pH-의존적 이동과 같은 인공 결합은 발생하지 않는다. 민감도는 배양된 세포 및 생물학적 시료로부터 히알루로니다제 활성의 신속한 측정을 10% 미만의 측정간 편차로 허용한다.
히알루로니다제 활성을 측정하기 위한 다른 검정이 또한 당분야에 공지되어 있고, 본원의 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Delpech 등, (1995) Anal. Biochem. 229:35-41]; [Takahashi 등, (2003) Anal. Biochem. 322:257-263] 참조).
많은 히알루로니다제 측정법은 새로운 환원 N-아세틸아미노 그룹의 생성 (Bonner and Cantey, Clin . Chim . Acta 13:746-752, 1966) 또는 점도(De Salegui 등, Arch . Biochem . Biophys.121:548-554, 1967) 또는 탁도(Dorfman and Ott, J. Biol. Chem . 172:367, 1948)의 상실의 측정에 기초하고 있다. 정제된 기질이 있다면, 모든 이러한 방법들은 엔도글루코사미딕 활성의 존재 또는 부재의 결정에 충분하다.
실질적으로 정제된 글리코사미노글리칸 기질은 또한 겔 쉬프트 검정법에서 이용될 수 있다. 글리코사미노글리칸을 재조합 PH20, 예컨대 가용성 PH20 과 혼합하여 겔 내에서 기질 이동능의 쉬프트를 초래하는 엔도글루코시다제 활성을 측정한다. 상기 기질의 예는 시그마 화학으로부터 입수가능한, 콘드로이틴-4 및 6 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파란-설페이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 인간 제대 히알루로난은 ICN 에서 입수가능하다. 예를 들어, 각각의 시험 기질을 pH 3.5 내지 7.5 범위의 버퍼 내에 약 또는 0.1 mg/ml 로 희석할 수 있다. 상기 측정법의 예에서, 정제된 가용성 PH20 또는 PH20 발현 세포 유래 조건화 배지의 약 또는 10 ㎕ 시료를 원하는 버퍼 내에 시험 기질 약 또는 90 ㎕ 와 혼합하고, 37℃에서 3 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 시료를 시료 버퍼 (트리스 EDTA pH 8.0, 브로모페놀 블루 및 글리세롤)로 중화하고, 이어서 전기영동한다. 글리코사미노글리칸은 당 분야에 알려진 임의의 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 글리코사미노글리칸은 3% 빙초산 내 5% 알시안 블루를 이용하여 밤새 겔을 염색한 후, 7% 빙초산에서 탈색하여 검출될 수 있다. 분해는 효소의 존재 및 부재 하 기질 이동능의 비교에 의해 결정된다.
히알루로니다제 활성은 또한 기질 겔 자이모그래피에 의해 검출될 수 있다. (Guentenhoner 등, 1992, Matrix 388-396) 이 측정법에서, 시료는 히알루론산을 함유하는 SDS-PAGE 겔에 적용되고, 시료 내 단백질은 전기영동에 의해 분리된다. 겔은 이어서 효소 측정 버퍼 내에서 인큐베이션되고, 뒤이어 염색되어 겔 내 히알루론산을 검출한다. 히알루로니다제 활성은 기질 겔 내 명백한 지역으로써 시각화된다.
산포제 또는 확산제로서 작용하는 변형된 가용성 PH20 히알루로니다제의 능력을 또한 평가할 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 염료를 가용성 PH20 과 함께 또는 없이 예컨대 피하로 또는 피부내로 누드 마우스의 각 측면 상의 가측 피부 내로 피하 주사할 수 있다. 그 후, 염료 면적을 예컨대 마이크로캘리퍼스로 측정하여, 산포제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력을 결정한다 (예를 들어, 미국 공개 특허 제20060104968호 참조). 다른 작용제, 예를 들어 치료제의 약동학 및 약력학 특성에 대한, 작용제와 히알루로니다제의 공동투여의 효과는 또한 동물 모델 및/또는 인간 대상체를 사용하여, 예컨대 임상 시험의 세팅에서 생체내 평가될 수 있다.
가용성 PH20 폴리펩티드, 예를 들어 esPH20 의 기능적 활성은 임의의 상기 평가법을 이용하여 참조 표준품과 비교되거나 정규화될 수 있다. 이는 가용성 PH20 의 기능적 등가량이 얼마인가를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 산포제 또는 확산제로서 작용하는 가용성 PH20 의 능력은 이를 트립판 블루와 함께 마우스의 가측 피부로 주사하여 평가할 수 있고, 예를 들어 히알루로니다제 참조 표준품 100 유닛과 동일량의 확산을 달성하는데 필요한 양을 결정할 수 있다. 그러므로, 필요한 가용성 PH20 의 양은 100 히알루로니다제 유닛과 기능적으로 등가이다.
2. 용해도
히알루로니다제의 용해도는 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 결정될 수 있다. 용해도 결정을 위한 한 방법은 세제 분별이다. 예를 들어, 가용성 PH20 폴리펩티드는 예컨대 37℃에서 트리톤® X-114 의 수성상 내로 그것이 분별되어 구별될 수 있다 (Bordier 등, (1981) J. Biol . Chem ., 256:1604-1607). 예를 들어, 본원에 기재된 PH20 폴리펩티드의 용해도는 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 막-앵커 히알루로니다제, 예컨대, GPI-앵커 히알루로니다제를 포함한 지질-앵커 히알루로니다제는 세제-풍부 상으로 분별될 것이나, 포스포리파제 C 처리 후 세제-부족 또는 수성 상 내로 분별될 것이다. 포스포리파제 C 는 GPI-앵커 단백질 내에서 발견되는 포스포-글리세롤 결합을 절단하는 효소이다. PLC 로 처리는 외부 세포막으로부터 GPI-결합된 단백질의 방출을 야기할 것이다.
다른 용해도 측정법은 PH20 폴리펩티드가 GPI-앵커되었는지 결정하는 것이다. GPI-앵커된 PH20 폴리펩티드는 세포막에 결합되어 있으며, 따라서 불용성이다. PH20 폴리펩티드가 GPI-앵커되었는지 결정하기 위하여, PLC/PLD 가수분해 전 후 용해도를 평가할 수 있으며, 또한 GPI-앵커 부착 신호 서열을 확인하기 위하여 예측 알고리즘을 이용할 수 있다. GPI-앵커된 단백질은 세제 분별 (예컨대, 트리톤® X-114), 항체 인식 및 대사 방사성동위원소 표지법과 함께 특이적 효소 또는 화학 절단 후 그의 가용화에 의해 확인될 수 있다.
단백질이 GPI 앵커를 가진다는 것을 증명하기 위해 이용되는 일반적인 방법은 세포 표면으로부터의 방출 또는 박테리아 PI-PLC 또는 트리파노좀-유래 GPI-특이적 포스포리파제 C (GPI-PLC) 처리에 의한 가용화이다. 이러한 효소는 막 내 디아실글리세롤을 절단하고, 단백질 상에 면역반응성 글리칸 에피토프 (CRD)을 생성하며, 이는 트리파노좀의 GPI 에 대항하여 생성된 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 검출될 수 있다. 이러한 접근의 포유동물 세포에서 당면하는 한가지 공통의 문제는 리파아제가 이노시톨이 아실화된 GPI 앵커는 절단할 수 없다는 것이다. 이들은 이노시톨 고리상의 지방산을 제거하기 위하여 온화한 알칼리의 전처리를 필요로 한다. 대안적으로, 혈청-유래 GPI-특이적 포스포리파제 D 는 GPI 앵커를 절단하는데 이용될 수 있다. 이러한 효소는 이노시톨 고리와 포스파티드 산 잔기 사이를 절단하고, 이노시톨 아실화에 의해 억제되지 않는다. 플루오르화수소산은 이노시톨 고리와 포스파티드산 사이의 GPI 앵커를 절단하고, 또한 임의의 포스포에탄올아민과 만노실 잔기 사이의 포스포다이에스테르 연결을 절단한다. 묽은 질산은 아세틸화되지 않은 글루코사민과 이노시톨 고리 사이를 특이적으로 절단하여 단백질-결합 글리칸 (현재 진단용 무수만노스 잔기를 포함) 및 포스파티딜이노시톨을 방출하기 때문에 GPI 앵커의 연구에 특히 유용하다. CRD 항체, 조성물 분석, myo-이노시톨, 에탄올아민, 글루코사민, 만노스 또는 지방산의 방사성동위원소 표지 및 크로마토그래피 또는 세제 분별법들과 조합하여, 상기 분해법들은 단백질 상의 GPI 앵커를 연구하는데 강력한 세트의 도구를 대표한다.
생물정보 웹사이트, 예컨대 ExPASy 프로테오믹스 툴 사이트 (expasy.ch/tools/)에서 쉽게 이용할 수 있는 것들을 포함한, 폴리펩티드 내 GPI-앵커 부착 신호 컨센서스 서열을 확인하기 위하여 이용될 수 있는 다양한 인실리코 방법 및 알고리즘들이 개발되었다. (예컨대 Udenfriend 등 (1995) Methods Enzymol . 250:571-582; Eisenhaber 등, (1999) J. Biol . Chem . 292: 741-758, Kronegg and Buloz, (1999); "Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)", 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser 등, (2005) Bioinformatics 21:1846-1852; Omaetxebarria 등, (2007) Proteomics 7:1951-1960; Pierleoni 등, (2008) BMC Bioinformatics 9:392 참조). 따라서, 당업자는 PH20 폴리펩티드가 GPI-앵커 부착 신호 서열을 포함하는지, 따라서 PH20 폴리펩티드가 GPI-앵커된 단백질인지 결정할 수 있다.
H. 연장된 가용성 PH20 및 다른 가용성 PH20 의 치료 방법, 용도, 및 병용요법
다양한 형태의 PH20 히알루로니다제가 제조되고 인간에 치료 용도로 승인되었다. 예를 들어, 동물-유래 히알루로니다제 제제는 비트라제(Vitrase)® (ISTA 파마슈티칼스), 정제된 양 고환 히알루로니다제, 및 암파다제(Amphadase)® (Amphastar 파마슈티칼스), 소 고환 히알루로니다제를 포함한다. 하일레넥스(Hylenex)® (Halozyme 테라퓨틱스)는 가용성 rHuPH20 을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전적으로 조작된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 생산된 인간 재조합 히알루로니다제이다. 히알루로니다제에 대한 승인된 치료 용도는 다른 치료제의 흡수 및 분산을 증가시키기 위한 보조제로서 용도, 피하주입 (피하 유체 투여)를 위한 용도, 및 방사선불투과성 제제의 재흡수를 개선하기 위한 피하 요도 X선 촬영법에서 부가물로써 용도를 포함한다. 이러한 적응증에 추가로, 히알루로니다제는 추가의 질환 및 상태의 치료를 위한 치료제 또는 화장제로써 이용될 수 있다.
히알루로니다제는 또한 화학치료제의 활성 및/또는 화학치료제의 종양에 접근성을 향상시키기 위하여 이용되고 있다 (Schuller 등, 1991, Proc . Amer . Assoc . Cancer Res. 32:173, abstract no. 1034; Czejka 등, 1990, Pharmazie 45:H.9). 히알루로니다제와 병용화학요법은 다양한 암, 예컨대 방광암 (Horn 등, 1985, J. Surg. Oncol. 28:304-307), 편평세포암종 (Kohno 등, 94, J. Cancer Res . Oncol . 120:293-297), 유방암 (Beckenlehner 등, 1992, J. Cancer Res . Oncol . 118:591-596), 및 위장관 암 (Scheithauer 등, 1988, Anticancer Res. 8:391-396)의 치료에 효과적이다. 히알루로니다제는 뇌암 (신경교종)의 치료에서 단독 치료제로써 효과적이다 (PCT 공개번호 WO88/02261, 1988년 4월 7일 발행). 히알루로니다제의 투여는 또한 췌장, 위, 결장, 난소 및 유방의 이전 화학요법-저항성 종양의 응답성을 유도한다 (Baumgartner 등, 1988, Reg . Cancer Treat . 1:55-58; Zanker 등, 1986, Proc . Amer . Assoc . Cancer Res. 27:390). 불행히도, 상기 히알루로니다제의 오염물질 및 비인간 성질은 과민성 반응을 초래한다.
상기 간접적 항암효과에 추가로, 히알루로니다제는 또한 직접적 항발암 효과를 가진다. 히알루로니다제는 마우스 내에 이식된 종양의 성장을 방해하고 (De Maeyer 등, 1992, Int . J. Cancer 51:657-660), 발암물질에 노출시 종양 형성을 억제한다 (Pawlowski 등, 1979, Int . J. Cancer 23:105-109; Haberman 등, 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 22:105, 초록번호 415).
특히, PH20 히알루로니다제는 높은 간극 유액 압력과 관련된 히알루로난-관련 질환 또는 상태, 예컨대 디스크 압력, 증식성 장애, 예컨대 암 및 전립선 비대증, 및 부종을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 부종은 예를 들면 기관 이식, 뇌졸중 또는 뇌외상으로부터 기인하거나, 그에서 명백할 수 있다. 증식성 장애는 암, 평활근 세포 증식, 경피증, 간 경변증, 성인 호흡부전증, 특발성 심근증, 홍반루푸스, 망막병증, 예컨대 당뇨성 망막병증 또는 다른 망막병증, 심장비후, 생식계 관련 장애, 예컨대, 전립선 비대증 (BHP) 및 난소낭종, 폐섬유증, 자궁내막증, 섬유종증, 과오종, 림프관종증, 유육종증, 데스모이드 종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 암은 고형 및 림프성/혈액 암 및 전이성 질환 및 미분화 종양을 포함한다. 일반적으로, 치료에 우호적인 종양은 동일한 조직 종류의 비-암성 조직과 비교하거나, 동일한 종양-종류의 비-전이성 종양과 비교하여 히알루로난의 세포 및/또는 기질 발현을 나타낸다. 암은 난소암, 상피내암종 (ISC), 편평세포암종 (SCC), 전립선 암, 췌장 암, 기타 위암, 비-소세포성 폐암, 유방암, 뇌암 및 결정암 중 어느 하나 이상을 포함한다.
따라서, PH20 히알루로니다제는 산포제로써의 그의 용도를 포함하여, 및 그에 추가로 복수의 용도를 가진다. 히알루로니다제는 예를 들어 안과 수술 전 국소 마취에서 안구주위 차단을 위하여 통상 사용된다. 상기 효소의 존재는 추가의 차단에 대한 필요를 예방하고, 운동불능(안구 운동의 상실)의 개시까지 시간을 가속한다. 안구주위 및 테논하 차단은 안구 수술에 대한 히알루로니다제의 가장 일반적인 적용이다. 히알루로니다제는 또한 성형수술, 예컨대, 안검이용성형 및 페이스 리프트에서의 운동불능을 촉진할 수 있다. esPH20 히알루로니다제를 포함한, 본원에서 제공되는 가용성 PH20 히알루로니다제는 PH20 히알루로니다제가 사용되는 임의의 치료방법 또는 병용요법에서 이용될 수 있다 (예컨대, 그 전체가 참조로써 포함되는, 미국공개공보 US20040268425; US20050260186; US20060104968; 및 미국출원번호 12/381,844, 12/386,249, 12/387,225 및 12/386,222 참조). 히알루로니다제의 치료 및 미용적 용도의 예는 아래에 기재된다.
1. 산포제 및 병용요법으로써 용도
앞서 주지된 바와 같이, 히알루로니다제는 결합 조직 및 특정 특화 조직, 예컨대 제대 및 유리액의 세포내 기저 성분에서 발견되는 다당류인, 히알루론산의 가수분해를 통해 결합조직의 투과성을 변경하는 산포(퍼짐) 또는 확산 물질이다. 어떤 산포성 인자도 존재하지 않는 경우, 피하로 주사된 물질, 예컨대 약물, 단백질, 펩티드 및 핵산은 매우 느리게 퍼진다. 그러나, 히알루로니다제와 함께 주사되면 신속한 퍼짐을 야기할 수 있다. 확산 속도는 효소의 양에 비례하며, 확산 정도는 용액의 부피에 비례한다.
본원에서 제공되는, 가용성 PH20, 예컨대 esPH20 을 포함한 PH20는 생체내에서 다양한 포유동물 조직의 어느 것에 약제 및 분자의 전달을 개선하거나 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 이는 확산을 촉진하기 위하여 사용되며, 따라서, 저분자 생리학적 약제 뿐 아니라 더 고 분자 생리학적 약제, 예컨대, 단백질, 핵산 및 리보핵산, 및 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 지질-기재 분자 및 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는 성분들의 조합을 포함하는 거대분자 조성물의 전달을 촉진한다 (예컨대, 미국공개번호 US20040268425; US20050260186; 및 US20060104968 참조). 가용성 PH20, 예컨대 esPH20 을 포함한 PH20 은 치료제와 함께 투여되거나/되고, 함께 제형화되어, 함께 투여되거나 제형화된 제제의 생체이용률 뿐 아니라 약동학 (PK) 및/또는 약력학 (PD) 특성을 개선한다. 가용성 PH20, 예컨대 esPH20 을 이용하여 개선될 수 있는 PK/PD 파라미터는 Cmax (예컨대, 혈류에 흡수 후 달성된 약제의 최대 농도), Tmax (최대 농도를 달성하기 위한 필요 시간), T1 /2 (농도가 절반까지 감소하는데 필요한 시간), Cmin (대사 및 배출 후 약제의 최소 농도), AUC (농도 대 시간의 곡선하면적, 생체이용률의 전체량의 척도), 관심있는 다양한 조직 내 농도 (예컨대, 원하는 농도 달성 속도, 전체 수준, 및 원하는 수준을 유지하는 지속시간을 포함), 및 Emax (달성되는 최대 효과)와 같은 척도를 포함한다.
본원에서 제공되는 치료방법은 치료제가 치료하는 질환 또는 장애의 치료를 위한 치료제와의 병용요법을 포함한다. 질환 또는 상태를 개선하고/하거나 그렇지 않으면 질환 또는 상태의 중증도를 낮추는 임의의 치료제는 상기 치료제의 생체이용률을 증가시키기 위하여 본원에서 제공되는 가용성 PH20 과 조합될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 가용성 PH20 폴리펩티드, 예컨대, esPH20 은 출원, 예컨대 미국공개공보 US20040268425; US20050260186; US20060104968 및 미국출원번호 12/381,844, 12/386,249, 12/387,225 및 12/386,222 에 기재된 조합의 각각 및 모두에서 개시된 히알루로니다제 또는 히알루로난 분해 효소 대신 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 가용성 PH20 폴리펩티드, 특히 esPH20 폴리펩티드는 상기 치료제 제제에 앞서, 뒤이어, 간헐적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일반적으로, 가용성 PH20 은 치료제 제제 투여에 앞서 또는 그와 동시에 투여되어 가용성 PH20 이 간극 공간의 히알루론산을 분해하게 한다. 가용성 PH20 은 치료용 분자의 투여 부위와 다른 부위에서 투여될 수 있거나, 가용성 PH20 은 치료용 분자의 투여 부위와 동일한 부위에서 투여될 수 있다.
히알루로니다제와 함께 투여될 수 있는 약학적, 치료용 및 미용 제제 및 분자의 예는 화학치료제 또는 항암제, 진통제, 항생제, 항염증제, 항균약, 아칸트아메바각막염 치료제 (amoebicidal agent), 살트로트코모노균제 (trichomonocidal agent), 항파킨슨제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 항관절염제, 항진균제, 혈압강하제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린성 작용제, 알파 블록커 약제, 마취제, 기관지확장제, 살생물제, 살균제, 정균제, 베타 아드레날린 차단제, 칼슘 채널 블록커, 심혈관 약제, 피임제, 화장 또는 미용 제제, 충혈완화제, 이뇨제, 진정제, 진단약, 전해질 약제, 수면제, 호르몬제, 고혈당 약제, 근육이완제, 근육수축제, 안과용제, 부교감신경흥분제, 심리활력제, 진정-수면제, 수면 유도제, 교감신경흥분제, 신경안정제, 요로제, 질제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드계 항염증제, 또는 안지오텐신 전환 효소 억제제 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 치료제는 모노클론 항체를 포함하는 항체, 비스포스포네이트, 인슐린 및 면역글로불린을 포함한다.
예를 들어, 항생제의 예는 아미노글리코시드; 암페니콜; 안사마이신; 카르바세펨; 카르바페넴; 세팔로스포린 또는 세펨; 세파마이신; 클라밤; 시클릭 리포펩티드; 디아미노피리미딘; 케토리드; 린코사미드; 마크로리드; 모노박탐; 니트로푸란; 옥사세펨; 옥사졸리디논; 페넴, 티에나마이신 및 기타 베타락탐계 항생제; 페니실린; 폴리펩티드 항생제; 퀴놀론; 설폰아미드; 설폰; 테트라사이클린; 및 기타 항생제 (예컨대, 클로폭톨, 후시딘산, 헥세다인, 메텐아민, 니트로푸란토인 니트록솔린, 리티페넴, 타우로리딘, 지보몰(Xibomol)) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
치료제의 예에는 또한 혈액조절제, 예컨대, 항혈우병인자, 항-억제제 응고 복합체, 항트롬빈 III, 응고인자 V, 응고인자 VIII, 응고인자 IX, 혈장 단백질 분획, 본 빌레브란트 인자; 항혈전제제 (예를 들어, 앱시시맵, 아나그렐리드, 시로스타졸, 클로피도그렐 비설페이트, 디피리다몰, 에포프로스테놀, 에프티피바티드, 티로피반; 콜로니 자극 인자 (CSF), (예를 들어 과립구 CSF 및 과립구 대식세포 CSF 포함); 적혈구생성 자극제 (예컨대, 다르베포에틴 알파와 같은 에리트로포이에틴 포함) 및 에포에틴 알파; 지혈제 및 알부민 (예컨대, 아프로티닌, 항혈우병인자와 혈장의 조합, 데스모프레신 아세테이트 및 알부민을 포함); 면역 글로불린 뿐 아니라 간염 B 면역 글로불린; 트롬빈 억제제 (예를 들어 직접적인 트롬빈 억제제 및 레피루딘 포함), 및 드로테코긴 알파; 항응고제 (예를 들어, 달테파린, 에녹사페린 및 기타 헤파린 및 와파린 포함)이다.
가용성 PH20, 예컨대 esPH20 와 병용투여 및/또는 병용제형화될 수 있는 기타 예시 치료제에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: 아달리무마브 (Adalimumab), 아갈시다제 (Agalsidase) 베타, 알레파셉트 (Alefacept), 앰피실린 (Ampicillin), 아나킨라 (Anakinra), 소아마비 예방 백신, 항-흉선제 (Anti-Thymocytes), 아지트로마이신 (Azithromycin), 베카플레르민 (Becaplermin), 카스포풍긴 (Caspofungin), 세파졸린 (Cefazolin), 세페핌 (Cefepime), 세포테탄 (Cefotetan), 세프타지딤 (Ceftazidime), 세프트리악손 (Ceftriaxone), 세툭시마브 (Cetuximab), 실라스타틴 (Cilastatin), 클라불란산 (Clavulanic Acid), 클린다마이신 (Clindamycin), 다르베포에틴 알파 (Darbepoetin Alfa), 데아클리주마브 (Deaclizumab), 디프테리아, 디프테리아 항독소, 디프테리아 독소 (Diphtheria Toxoid), 에팔리주마브 (Efalizumab), 에피네프린 (Epinephrine), 조혈인자 알파, 에타네르셉트 (Etanercept), 필그라스팀 (Filgrastim), 플루코나졸 (Fluconazole), 여포 자극 호르몬, 폴리트로핀 (Follitropin) 알파, 폴리트로핀 베타, 포스페닐로인 (Fosphenyloin), 가도디아미드 (Gadodiamide), 가도펜테테이트 (Gadopentetate), 가티플록사신 (Gatifloxacin), 글라티라메르 (Glatiramer), GM-CSF, 고세렐린 (Goserelin), 고세렐린 아세테이트, 그라니세트론 (Granisetron), 해모필루스 인플루엔자 B (Haemophilus Influenza B), 할로페리돌 (Haloperidol), 간염 백신, A 형 간염 백신, B 형 간염 백신, 이브리투모마브 티욱세탄 (Ibritumomab Tiuxetan), 이브리투모마브 (Ibritumomab), 티욱세탄 (Tiuxetan), 면역글로불린, 헤모필루스 (Hemophilus) 인플루엔자 백신, 인플루엔자 바이러스 백신, 인플릭시마브 (Infliximab), 인슐린, 인슐린 글라르긴 (Insulin Glargine), 인터페론, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-1, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타, 인터페론 베타-1a, 인터페론 감마, 인터페론 알파-컨센서스, 요딕사놀 (Iodixanol), 요헥솔 (Iohexol), 요파미돌 (Iopamidol), 요베르솔 (Ioversol), 케토롤락 (Ketorolac), 라로니다제 (Laronidase), 레보플록사신 (Levofloxacin), 리도케인 (Lidocaine), 리네졸리드 (Linezolid), 로라제팜 (Lorazepam), 홍역 백신, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역-유행성이하선염-풍진 바이러스 백신, 풍진 백신, 메드록시프로게스테론 (Medroxyprogesterone), 메로페넴 (Meropenem), 메틸프레니솔론 (Methylprednisolone), 미다졸람 (Midazolam), 모르핀 (Morphine), 옥트레오타이드 (Octreotide), 오말리주마브 (Omalizumab), 온단세트론 (Ondansetron), 팔리비주마브 (Palivizumab), 판토프라졸 (Pantoprazole), 페가스파아제 (Pegaspargase), 페그필그라스팀 (Pegfilgrastim), 페그-인터페론 알파-2a, 페그-인터페론 알파-2b, 페그비소만트 (Pegvisomant), 백일해 백신, 피페라실린 (Piperacillin), 폐구균 백신 및 폐구균 복합 백신, 프로메타진 (Promethazine), 레테플라제 (Reteplase), 소마트로핀 (Somatropin), 술박탐 (Sulbactam), 수마트리프탄 (Sumatriptan), 타조박탐 (Tazobactam), 테넥테플라제 (Tenecteplase), 파상풍 정제 독소, 티카르실린 (Ticarcillin), 토시투모마브 (Tositumomab), 트리암시놀론 (Triamcinolone), 트리암시톨론 아세토나이드 (Triamcinolone Acetonide), 트리암시놀린 헥사세토나이드 (Triamcinolone hexacetonide), 반코마이신 (Vancomycin), 바리셀라 주스터 (Varicella Zoster) 면역글로불린, 수두 백신, 여타 백신, 알렘투주마브 (Alemtuzumab), 알리트레티노인 (Alitretinoin), 알로푸리놀 (Allopurinol), 알트레타민 (Altretamine), 아미포스틴 (Amifostine), 아나스트로졸 (Anastrozole), 비소 (Arsenic), 삼산화 비소 (Arsenic Trioxide), 아스파라기나아제 (Asparaginase), 결핵 예방 백신 (Bacillus Calmette-Guerin (BCG) vaccine), 생 BCG, 벡사로텐 (Bexarotene), 블레오마이신 (Bleomycin), 부술판 (Busulfan), 정맥내 투여용 부술판, 경구용 부술판, 칼루스테론 (Calusterone), 카페시타빈 (Capecitabine), 카르보플라틴 (Carboplatin), 카르무스틴 (Carmustine), 폴리페프로산 (Polifeprosan) 이 있는 카르무스틴 (Carmustines, 셀레콕시브 (Celecoxib), 클로람부실 (Chlorambucil), 시스플라틴 (Cisplatin), 클라드리빈 (Cladribine), 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 시타라빈 (Cytarabine), 시타라빈 리포좀제 (Cytarabine liposomal), 다카르바진 (Dacarbazine), 닥티노마이신 (Dactinomycin), 다우노루비신 리포좀제 (Daunorubicin liposomal), 다우노루비신 (Daunorubicin), 다우노마이신 (Daunomycin), 데니류킨 디프티톡스 (Denileukin Diftitox), 덱스라족산 (Dexrazoxane), 도세탁셀 (Docetaxel), 독소루비신 (Doxorubicin), 독소루비신 리포좀제 (Doxorubicin liposomal), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (Dromostanolone propionate), 엘리엇 B 용액 (Elliott's B Solution), 에피루비신 (Epirubicin), 에포에틴 알파 (Epoetin alfa), 에스트라무스틴 (Estramustine), 에토포시드 (Etoposide), 에토포시드 포스페이트, 에토포시드 VP-16, 엑세메스탄 (Exemestane), 플록수리딘 (Floxuridine), 플루다라빈 (Fludarabine), 플루오로우라실 (Fluorouracil), 5-플루오로우라실, 풀베스트란스 (Fulvestrant), 겜시타빈 (Gemcitabine), 겜투주마브 (Gemtuzumab), 오조가미신 (Ozogamicin), 겜투주마브 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin), 히드록시우레아, 이다루비신 (Idarubicin), 이포스파미드 (Ifosfamide), 이마티니브 메실레이트 (Imatinib mesylate), 이리노테칸 (Irinotecan), 레트로졸 (Letrozole), 류코보린 (Leucovorin), 레바미솔 (Levamisole), 로무스틴 (Lomustine), CCNU, 메클로레타민 (Mechlorethamine), 질소 머스타드 (Nitrogen mustard), 메게스트롤 (Megestrol), 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란 (Melphalan), L-PAM, 메르캅토퓨린, 6-메르캅토퓨린, 메스나 (Mesna), 메토트렉세이트 (Methotrexate), 메톡스살렌 (Methoxsalen), 미토마이신 (Mitomycin), 미토마이신 C, 미토탄 (Mitotane), 미톡산트론 (Mitoxantrone), 난드롤론 (Nandrolone), 난드롤론 펜프로피오네이트 (Nandrolone Phenpropionate), 노페투모마브 (Nofetumomab), 오프렐베킨 (Oprelvekin), 옥살리플라틴 (Oxaliplatin), 파클로탁셀 (Paclitaxel), 파미드로네이트 (Pamidronate), 페가데마제 (Pegademase), 펜토스타틴 (Pentostatin), 피포브로만 (Pipobroman), 플리카마이신 (Plicamycin), 미트라마이신 (Mithramycin), 포르피메르 (Porfimer), 포르피메르 소듐 (Porfimer sodium), 프로카르바진 (Procarbazine), 퀴나크린 (Quinacrine), 라스부리카아제 (Rasburicase), 리툭시마브 (Rituximab), 사르그라모스팀 (Sargramostim), 스트렙토조신 (Streptozocin), 탈크 (Talc), 타목시펜 (Tamoxifen), 테모졸로미드 (Temozolomide), 테니포시드 (Teniposide), 테스톨락톤 (Testolactone), 티오구아닌 (Thioguanine), 6-티오구아닌, 트리에틸렌티오포스포르아미드 (티오테파; Thiotepa), 토포테칸 (Topotecan), 토레미펜 (Toremifene), 트라스투주마브 (Trastuzumab), 트레티노인 (Tretinoin), 우라실 머스타드 (Uracil Mustard), 발루비신 (Valrubicin), 빈블라스틴 (Vinblastine), 빈크리스틴 (Vincristine), 비노렐빈 (Vinorelbine), 졸레드로네이트 (Zoledronate), 아시비신 (Acivicin), 아클라루비신 (Aclarubicin), 아코다졸 (Acodazole), 아크로닌 (Acronine), 아도젤레신 (Adozelesin), 알데스류킨 (Aldesleukin), 레티노산 (Retinoic Acid), 알리트레티노인 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공수병 예방 혈청, 파상풍 예방 면역글로불린, 파상풍 백신, 안티트롬빈 III (Antithrombin III), 뱀독 해독 혈청, 아르가트로반 (Argatroban), 아르기닌, 아스코르브산, 아테놀롤 (Atenolol), 아트라쿠리움 (Atracurium), 아트로핀 (Atropine), 아우로티오글루코오스 (Aurothioglucose), 아자티오프린 (Azathioprine), 아즈트레오남 (Aztreonam), 바시트라신 (Bacitracin), 바클로펜 (Baclofen), 바실릭시마브 (Basiliximab), 벤조산, 벤즈트로핀 (Benztropine), 베타메타손 (Betamethasone), 바이오틴 (Biotin), 비발리루딘 (Bivalirudin), 보툴리즘 항독소 (Botulism antitoxin), 브레틸리움 (Bretylium), 부메타나이드 (Bumetanide), 부피바케인 (Bupivacaine), 부프레노르핀 (Buprenorphine), 부토르파놀 (Butorphanol), 칼시토닌 (Calcitonin), 칼시트리올 (Calcitriol), 칼슘, 카프레오마이신 (Capreomycin), 카르보프로스트 (Carboprost), 카르니틴 (Carnitine), 세파니안돌 (Cefaniandole), 세포페라존 (Cefoperazone), 세포탁심 (Cefotaxime), 세폭시틴 (Cefoxitin), 세프티족심 (Ceftizoxime), 세푸록심 (Cefuroxime), 키오람페니콜 (Chioramphenicol), 키오로프로케인 (Chioroprocaine), 키오로퀸 (Chioroquine), 클로로티아자이드 (Chlorothiazide), 키오르프로마진 (Chiorpromazine), 콘드로이틴술푸르산 (Chondroitinsulfuric acid), 코리오고나도트로핀 알파 (Choriogonadotropin alfa), 크로미움 (Chromium), 시도포비르 (Cidofovir), 시메티딘 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(Nalbuphine), 날메펜 (Nalmefene), 날록손 (Naloxone), 네오스티그민 (Neostigmine), 니아시나마이드 (Niacinamide), 니카르디핀 (Nicardipine), 니트로글리세린 (Nitroglycerin), 니트로프루사이드 (Nitroprusside), 노에르피네프린 (Norepinephrine), 오르페나드린 (Orphenadrine), 옥사실린 (Oxacillin), 옥시모르폰 (Oxymorphone), 옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline), 옥시토신 (Oxytocin), 판쿠로늄 (Pancuronium), 판테놀 (Panthenol), 판토텐산 (Pantothenic acid), 파파베린 (Papaverine), 페그인터페론-알파 (Peginterferone-alpha) (예를 들어, 인터페론 알파 2a 또는 2b), 페니실린 G, 펜타미딘 (Pentamidine), 펜타조신 (Pentazocine), 펜토바르비탈 (Pentobarbital), 페르피우트렌 (Perfiutren), 페르페나진 (Perphenazine), 페노바르비탈 (Phenobarbital), 펜톨라민 (Phentolamine), 페닐레프린 (Phenylephrine), 페니토인 (Phenytoin), 피소스티그민 (Physostigmine), 피토나디온 (Phytonadione), 폴리믹신 비에스 (Polymyxin bs), 프랄리독심 (Pralidoxime), 프릴로케인 (Prilocaine), 프로카인아미드 (Procainamide), 프로케인 (Procaine), 프로키오르페라진 (Prochiorperazine), 프로게스테론 (Progesterone), 프로프라놀롤 (Propranolol), 피리도스티그민 히드록시드 (Pyridostigmine hydroxide), 피리독신 (Pyridoxine), 퀴니딘 (Quinidine), 퀴누프리스틴 (Quinupristin), 공수병 면역글로불린, 공수병 백신, 라니티딘 (Ranitidine), 레미펜타닐 (Remifentanil), 리보플라빈 (Riboflavin), 리팜핀 (Rifampin), 로피바케인 (Ropivacaine), 사마륨 (Samarium), 스코폴라민 (Scopolamine), 셀레늄 (Selenium), 세르모렐린 (Sermorelin), 신칼라이드 (Sincalide), 소마트렘 (Somatrem), 스펙티노마이신 (Spectinomycin), 스트렙토키나아제 (Streptokinase), 스트렙토마이신 (Streptomycin), 숙시닐콜린 (Succinylcholine), 술펜타닐 (Sufentanil), 술파메톡사졸 (Sulfamethoxazole), 타크롤리르누스 (Tacrolirnuss), 테르부탈린 (Terbutaline), 테리파라타이드 (Teriparatide), 테스토스테론 (Testosterone), 파상풍 항독소 (Tetanus antitoxin), 테트라케인 (Tetracaine), 테트라데실 설페이트, 테오필린 (Theophylline), 티아민 (Thiamine), 티에틸페라진 (Thiethylperazine), 티오펜탈 (Thiopental), 흉선 자극 호르몬, 틴자파린 (Tinzaparin), 티로피반 (Tirofiban), 토브라마이신 (Tobramycin), 톨라졸린 (Tolazoline), 톨부타미드 (Tolbutamide), 토르세미드 (Torsemide), 트라넥삼산 (Tranexamic acid), 트레프로스티닐 (Treprostinil), 트리플루오페라진 (Trifluoperazine), 트리메토벤즈아미드 (Trimethobenzamide), 트리메토프림 (Trimethoprim), 트로메타민 (Tromethamine), 투베르쿨린 (Tuberculin), 장티푸스 백신, 우로폴리트로핀 (Urofollitropin), 우로키나아제 (Urokinase), 바이프로산 (Vaiproic acid), 바소프레신 (Vasopressin), 베쿠로늄 (Vecuronium), 베라파밀 (Verapamil), 보리코나졸 (Voriconazole), 와파린 (Warfarin), 황열병 백신, 지도부딘 (Zidovudine), 아연, 지프라시돈 히드로클로라이드 (Ziprasidone hydrochioride), 아클라시노마이신 (Aclacinomycin), 악티노마이신 (Actinomycin), 아드리아마이신 (Adriamycin), 아자세린 (Azaserine), 6-아자우리딘 (6-Azauridine), 카르지노필린 (Carzinophilin), 크로모마이신 (Chromomycin), 데노프테린 (Denopterin), 6-디아자-5-옥소-L-노르류신, 엔도시타빈 (Enocitabine), 록수리딘 (Loxuridine), 올리보마이신 (Olivomycine), 피라루비신 (Pirarubicin), 피리트렉심 (Piritrexim), 프테로프테린 (Pteropterin), 타가푸르 (Tagafur), 투베르시딘 (Tubercidin), 알테플라스 (Alteplase), 아르시투모마브 (Arcitumomab), 베바시주마브 (bevacizumab), 보툴리눔 A 형 독소 (Botulinum Toxin Type A), 보툴리눔 B 형 독소, 카프로마브 펜데타이드 (Capromab Pendetide), 다클주마브 (Daclizumab), 도르나제 알파 (Dornase alfa), 드로트레코긴 알파 (Drotrecogin alfa), 임시로마브 펜테테이트 (Imciromab Pentetate) 및 요오드-131.
특히, 치료제에는, 이에 제한되지 않으나, 면역글로불린, 인터페론 베타, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-1, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1, 인터페론 베타-1a, 인터페론 감마-1b, 페그-인터페론 알파-2 및 페그인터페론 알파-2b, 인슐린, 비스포스페이트 (예를 들어, 파미드로네이트 또는 졸레드로네이트), 도세탁셀, 독소루비신, 독소루비신 리포조말 및 베바시주마브가 포함된다.
2. 과다 글리코사미노글리카나아제 제거를 위한 용도
본원에서는, 가용성 PH20, 일반적으로 가용성 히알루로니다제를 단독으로 또는 기타 치료법 및 약제에 병용 또는 추가하여 포함하는 조성물의 투여에 의한 히알루로난-관련 질환 및 병태 치료 방법이 제공된다. 히알루로난-관련 병태 및 질환은, 해당 질환 또는 병태로 인해 야기되거나, 그 결과로 인해 또는 그렇지 않으면 그 질환 또는 병태에서 관찰되는 바와 같이 히알루로난 수준이 상승되는 질환 및 병태이며, 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 를 단독으로 또는 기타 치료법 및/또는 약제에 병용 또는 추가하여 포함하는 조성물의 투여로 치료될 수 있다.
일반적으로, 히알루로난-관련 질환 및 병태는 해당 조직, 세포 또는 체액 (예를 들어, 종양 조직 또는 종양-관련 조직, 혈액 또는 조직간 공간) 에서 대조군, 예를 들어 여타 조직, 세포 또는 체액에 비해 상승된 히알루로난 발현과 관련되어 있다. 상승된 히알루로난 발현은 정상적인 조직, 세포 또는 체액, 예를 들어 시험하는 시료와 동종성이나, 상이한 대상체, 예컨대 정상적인 (즉, 질환 또는 병태를 갖고 있지 않거나, 시험 대상체가 가진 질환 또는 병태의 유형을 갖지 않음) 대상체, 예를 들어 히알루로난-관련 질환 또는 병태를 갖고 있지 않는 대상체로부터 분리한 조직, 세포 또는 체액에 비해 상승되어 있을 수 있다. 상승된 히알루로난 발현은, 질환이 심각하지 않고/않거나 히알루로난-관련성이 없거나 또는 히알루로난을 상대적으로 덜 발현하여 히알루로난-관련성이 덜한 유사한 질환 또는 병태를 가진 또다른 대상체 유래의 동종성 조직에 비해 상승되어 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 치료할 대상체는, 해당 조직, 세포 또는 체액 내 HA 양이 덜 심각한 암, 예컨대 초기이거나, 구별되거나 또는 다른 유형의 암을 가진 대상체에 비해 상대적으로 상승되어 있는, 히알루로난-관련 암을 가진 대상체일 수 있다. 또다른 실시예에서, 해당 세포, 조직 또는 체액은, 예를 들어 상대적으로 낮은 수준의 HA 를 발현하는 것으로 공지된 종양 세포주, 예컨대 낮은 수준의 HA 를 발현하는 본원에 기재된 예시 종양 세포주, 예를 들어 HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 상기 세포주를 이용해 생성된 종양 모델 유래의 종양과 같은, 알고 있는 양 또는 상대적인 양의 HA 를 가진 대조군 시료, 예컨대 체액, 조직, 추출물 (예를 들어, 세포 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제제, 세포주, 생검, 표준 및 기타 시료에 비해 상승된 수준의 히알루로난을 포함한다.
일부의 경우, 히알루로난-관련 질환 및 병태는 간질액 압력 증가, 혈관 부피 감소 및/또는 조직, 예컨대 종양 내 함수량 증가와 관련되어 있다. 한 실시예에서, 본원에 제공되는 조성물 및 화합물을 이용한 치료는 하나 이상의 상기 병후 또는 기타 병후를 개선시키는데, 예를 들어 경시적으로 대상체의 생존 또는 삶의 질을 개선시키거나 또는 종양 성장을 억제한다.
제공되는 효소, 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 예시 히알루로난-관련 질환 및 병태에는, 이에 제한되지 않으나, 히알루로난-풍부 암, 예를 들어 말기암, 전이성 암, 분류되지 않은 암, 난소암, 상피내 암종 (ISC), 편평세포암종 (SCC), 전립선암, 췌장암, 소세포폐암, 유방암, 대장암 및 기타 암과 같은 고형 종양을 포함하는 종양이 포함된다.
또한, 히알루로난-관련 질환 및 병태의 예시에는 간질액 압력 증가와 관련된 병태 및 질환, 예컨대 디스크 압력과 관련된 질환 및 부종, 예를 들어 장기 이식, 허혈, 뇌 외상 또는 기타 손상으로 인한 부종이 있다. 예시 히알루로난-관련 질환 및 병태에는 간질액 압력 상승, 혈관 부피 감소 및/또는 암, 디스크 압력 및 부종을 포함하는 조직에서의 함수량 증가와 관련된 질환 및 병태가 포함된다. 한 실시예에서, 히알루로난-관련 병태, 질환 또는 장애의 치료에는 상승된 간질액 압력 (IFP), 감소된 혈관 부피 및 조직 내 상승된 함수량 중 한가지 이상에 대한 개선, 감소 또는 기타 유리한 유효성을 포함한다.
일반적으로, 히알루로난-관련 질환 또는 병태는, 예를 들어 병든 조직, 예를 들어 종양에서의 HA 발현 증가와 연관되어 있다. 한 실시예에서, HALO (히알루로난을 포함하는 프로테오글리칸이 풍부한 세포주위 기질 영역) 는 대상체의 조직, 예를 들어 병든 조직에서 형성된다. 다른 실시예에서, HALO 의 존재성은 대상체의 조직, 예를 들어 병든 조직 유래의 시험관내 세포 배양에서 검출된다.
a. 암 치료에서 용도
히알루로니다제는 종양에서의 히알루론산 분해에 의한 직접적인 항암물질 유효성을 갖는다. 따라서, 가용성 PH20 히알루로니다제, 예컨대 esPH20 는 종양, 특히 히알루로난이 풍부한 종양 치료에 이용될 수 있다. 히알루로난-풍부 암은 암 세포가 HALO 를 생산하는 암, 히알루로난 발현이 상승되어 있는 암 (면역염색법, 예를 들어 해당 종양 유래의 일부분의 세포학적 염색으로 결정됨), HAS2 (히알루로난 합성효소 2) 가 상승되어 있는 암, 시험관 내에서 히알루로니다제 (HYAL1) 를 제공하지 않는 암일 수 있다. 히알루로난-풍부 암은 히알루로난 발현을 평가하는 임의의 방법, 및 단백질/mRNA 발현을 검정하기 위한 기타 공지된 방법으로 식별될 수 있다.
몇가지 히알루로난-풍부 암이 밝혀졌다. 일부의 경우, 히알루로난 발현은 열악한 예후, 예를 들어 생존율 및/또는 재발없는 생존율에 있어서의 감소, 전이, 혈관형성, 여타 조직/영역으로의 암세포 침입 및 열악한 예후의 기타 지표와 상관관계가 있다. 그러한 상관관계는, 예를 들어 난소암, SCC, ISC, 전립선암, 소세포 폐암 (NSCLC) 를 포함하는 폐암, 유방암, 대장암 및 췌장암을 포함하는 히알루로난-풍부 종양에서 관찰된 바 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Maarit et al., Cancer Research, 60:150-155 (2000); Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003); Lipponen et al., Eur . Journal of Cancer, 849-856 (2001); Pirinen et al., Int . J. Cancer: 95: 12-17 (2001); Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000); Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)). 따라서, 히알루로난-풍부 암은 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 의 투여로 치료되어 암의 하나 이상 이상의 병후를 치료할 수 있다. 히알루로난-풍부 종양에는, 이에 제한되지 않으나, 전립선, 유방, 대장, 난소, 위, 두경부 및 기타 종양 및 암이 포함된다.
히알루로니다제는 또한 통상적인 화학요법에 대해 내성을 가진 종양의 감작성 증가에 이용될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 는, 종양 부위 주변의 확산을 증가시키고 (예를 들어, 종양 부위 및 주변에서 화학치료제의 순환 및/또는 농축을 촉진), 예를 들어 히알루론산 분해에 의해 종양 세포 자동력을 억제하고/하거나 종양 세포 아폽토시스 역치를 낮추기에 유효한 양으로 HYAL1 결함과 연관된 종양을 가진 환자에게 투여될 수 있다. 이는 종양 세포(들)로 하여금 아노이키스 (anoikis) 병태가 되도록 해, 종양 세포가 화학치료제에 대해 더욱 수용적으로 되도록 한다. 히알루로니다제의 투여는 췌장, 위, 대장, 난소 및 유방의 기존 화학요법 내성 종양의 응답성을 유도할 수 있다 (Baumgartner et al. (1988) Reg . Cancer Treat . 1:55-58; Zanker et al. (1986) Proc . Amer . Assoc. Cancer Res. 27:390). 따라서, 가용성 PH20 만을 이용한 암 치료에 추가하여, 본원에서 제공하는 조성물 및 방법은 또한, 예를 들어, 화학요법에 또는 기타 항암제 또는 치료법과 동시에 또는 사전에 가용성 PH2O 를 병용하여 투여함으로써 히알루로난-관련 암을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 상기 실시예에서, 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 는 일반적으로 화학요법제 또는 기타 항암제의 고형 종양으로의 침투를 증강시킴으로써 질환을 치료한다.
가용성 PH20 를 함유하는 조성물은 항암제와 함께 종양내 투여될 수 있거나, 또는 파종성 암 또는 도달하기에 어려움이 있는 종양에 대해서는 정맥내로 투여될 수 있다. 항암제는 화학치료제, 항체, 펩티드 또는 유전자 요법 벡터, 바이러스 또는 DNA 일 수 있다. 추가적으로, 히알루로니다제는 종양 세포를, 후천적인 다중 약물 내성을 가진, 이미 화학요법이 듣지 않는 종양에서의 감작을 위한 싸이클링 풀 (cycling pool) 로 인도하기 위해 이용될 수 있다 (St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44).
가용성 PH20, 예컨대 esPH20 의 투여후, 투여와 동시에 또는 투여전 투여될 수 있는 항암제의 예로는 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인 (9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르, 예를 들어:
알데스류킨 (예를 들어, 프로류킨(PROLEUKIN)®); 알렘투주맙 (예를 들어, 캠패스(CAMPATH)®); 알리트레티노인 (예를 들어, 판레틴(PANRETIN)®); 알로퓨리놀 (예를 들어, 질로프림(ZYLOPRIM)®); 알트레타민 (예를 들어, 헥살렌(HEXALEN)®); 아미포스틴 (예를 들어, 에티올(ETHYOL)®); 아나스트로졸 (예를 들어, 아리미덱스(ARIMIDEX)®); 삼산화비소 (예를 들어, 트리세녹스(TRISENOX)®); 아스파라기나제 (예를 들어, 엘스파르(ELSPAR)®); BCG 라이브 (예를 들어, 타이스(TICE)® BCG); 벡사로텐 (예를 들어, 타그레틴(TARGRETIN)®); 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®); 블레오마이신 (예를 들어, 블레녹산(BLENOXANE)®); 부술판 정맥내 (예를 들어, 부술펙스(BUSULFEX)®); 부술판 경구 (예를 들어, 밀레란(MYLERAN)®); 칼루스테론 (예를 들어, 메토사르브(METHOSARB)®); 카페시타빈 (예를 들어, 젤로다(XELODA)®); 카보플라틴 (예를 들어, 파라플라틴(PARAPLATIN)®); 카르무스틴 (예를 들어, BCNU®, BiCNU®); 폴리페프로산과의 카르무스틴 (예를 들어, 글리아델(GLIADEL)® 웨이퍼); 셀레콕시브 (예를 들어, 셀레브렉스(CELEBREX)®); 클로람부실 (예를 들어, 류케란(LEUKERAN)®); 시스플라틴 (예를 들어, 플라티놀(PLATINOL)®); 클라드리빈 (예를 들어, 류스타틴(LEUSTATIN)®, 2-CdA®); 시클로포스파미드 (예를 들어, 사이톡산(CYTOXAN)®, 네오사르(NEOSAR)®); 시타라빈 (예를 들어, 사이토사르-U(CYTOSAR-U)®); 리포좀 시타라빈 (예를 들어, 디포사이트(DepoCyt)®); 다카르바진 (예를 들어, DTIC-Dome): 닥티노마이신 (예를 들어, 코스메겐(COSMEGEN)®); 다르베포에틴 알파 (예를 들어, 아라네스프(ARANESP)®); 리포좀 다우노루비신 (예를 들어, 다누옥솜(DANUOXOME)®); 다우노루비신/다우노마이신 (예를 들어, 세루비딘(CERUBIDINE)®); 데니류킨 디프티톡스 (예를 들어, 온타크(ONTAK)®); 덱스라족산 (예를 들어, 지네카드(ZINECARD)®); 도세탁셀 (예를 들어, 탁소테레(TAXOTERE)®); 독소루비신 (예를 들어, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 루벡스(RUBEX)®); 리포좀 독소루비신, 예를 들어 독소루비신 HCL 리포좀 주사 (예를 들어, 독실(DOXIL)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (예를 들어, 드로모스타놀론(DROMOSTANOLONE)® 및 마스터론(MASTERONE)® 주사); 엘리엇 B 용액 (예를 들어, 엘리엇 B 용액(Elliott's B Solution)®); 에피루비신 (예를 들어, 엘렌스(ELLENCE)®); 에포에틴 알파 (예를 들어, 에포겐(EPOGEN)®); 에스트라무스틴 (예를 들어, 엠사이트(EMCYT)®); 에토포시드 포스페이트 (예를 들어, 에토포포스(ETOPOPHOS)®); 에토포시드 VP-16 (예를 들어, 베페시드(VEPESID)®); 엑세메스탄 (예를 들어, 아로마신(AROMASIN)®); 필그라스팀 (예를 들어, 뉴포겐(NEUPOGEN)®); 플록수리딘 (예를 들어, 푸드르(FUDR)®); 플루다라빈 (예를 들어, 플루다라(FLUDARA)®); 플루오로우라실, 예를 들어 5-FU (예를 들어, 아드루실(ADRUCIL)®); 풀베스트란트 (예를 들어, 파슬로덱스(FASLODEX)®); 겜시타빈 (예를 들어, 젬자(GEMZAR)®); 겜투주맙/오조가미신 (예를 들어, 밀로타르그(MYLOTARG)®); 고세렐린 아세테이트 (예를 들어, 졸라덱스(ZOLADEX)®); 히드록시우레아 (예를 들어, 하이드레아(HYDREA)®); 이브리투모맙/티욱세탄 (예를 들어, 제발린(ZEVALIN)®); 이다루비신 (예를 들어, 이다마이신(IDAMYCIN)®); 이포스파미드 (예를 들어, 이펙스(IFEX)®); 이매티닙 메실레이트 (예를 들어, 글리벡(GLEEVEC)®); 인터페론 알파-2a (예를 들어, 로페론-A(ROFERON-A)®); 인터페론 알파-2b (예를 들어, 인트론 A(INTRON A)®); 이리노테칸 (예를 들어, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®); 레트로졸 (예를 들어, 페마라(FEMARA)®); 류코보린 (예를 들어, 웰코보린(WELLCOVORIN)®, 류코보린(LEUCOVORIN)®); 레바미솔 (예를 들어, 에르가미솔(ERGAMISOL)®); 로무스틴/CCNU (예를 들어, CeeBU®); 메클로레타민/질소 머스타드 (예를 들어, 머스타겐(MUSTARGEN)®); 메게스트롤 아세테이트 (예를 들어, 메가스(MEGACE)®); 멜팔란/L-PAM (예를 들어, 알케란(ALKERAN)®); 머캅토퓨린, 예를 들어 6-머캅토퓨린 (6-MP; 예를 들어 퓨리네톨(PURINETHOL)®); 메스나 (예를 들어, 메스넥스(MESNEX)®); 메토트렉세이트; 메톡살렌 (예를 들어, 우바덱스(UVADEX)®); 미토마이신 C (예를 들어, 뮤타마이신(MUTAMYCIN)®, 미토지트렉스(MITOZYTREX)®); 미토탄 (예를 들어, 리소드렌(LYSODREN)®); 미톡산트론 (예를 들어, 노반트론(NOVANTRONE)®); 난드롤론 펜프로피오네이트 (예를 들어, 듀라볼린-50(DURABOLIN-50)®); 노페투모맙 (예를 들어, 베르루마(VERLUMA)®); 오프렐베킨 (예를 들어, 뉴메가(NEUMEGA)®); 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®); 파클리탁셀 (예를 들어, 팍센(PAXENE)®, 탁솔(TAXOL)®); 파미드로네이트 (예를 들어, 아레디아(AREDIA)®); 페가데마제 (예를 들어, 아다겐(ADAGEN)®); 페가스파르가제 (예를 들어, 온카스파르(ONCASPAR)®); 페그필그라스팀 (예를 들어, 뉴라스타(NEULASTA)®); 펜토스타틴 (예를 들어, 니펜트(NIPENT)®); 피포브로만 (예를 들어, 베르사이트(VERCYTE)®); 플리카마이신/미트라마이신 (예를 들어, 미트라신(MITHRACIN)®); 포르피머 나트륨 (예를 들어, 포토프린(PHOTOFRIN)®); 프로카르바진 (예를 들어, 마튤란(MATULANE)®); 퀴나크린 (예를 들어, 아타브린(ATABRINE)®); 라스부리카제 (예를 들어, 엘리테크(ELITEK)®); 리툭시맙 (예를 들어, 리툭산(RITUXAN)®); 사르그라모스팀 (예를 들어, 프로카인(PROKINE)®); 스트렙토조신 (예를 들어, 자노사르(ZANOSAR)®); 수니티닙 말레이트 (예를 들어, 수텐트(SUTENT)®); 탈크 (예를 들어, 스클레로솔(SCLEROSOL)®); 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)®); 테모졸로미드 (예를 들어, 테모다르(TEMODAR)®); 테니포시드/VM-26 (예를 들어, 부몬(VUMON)®); 테스토락톤 (예를 들어, 테슬락(TESLAC)®); 티오구아닌, 예를 들어 6-티오구아닌 (6-TG); 티오테파 (예를 들어, 티오플렉스(THIOPLEX)®); 토포테칸 (예를 들어, 하이캄틴(HYCAMTIN)®); 토레미펜 (예를 들어, 파레스톤(FARESTON)®); 토시투모맙 (예를 들어, 벡사르(BEXXAR)®); 트라스투주맙 (예를 들어, 헤르셉틴(HERCEPTIN)®); 트레티노인/ATRA (예를 들어, 베사노이드(VESANOID)®); 우라실 머스타드; 발루비신 (예를 들어, 발스타르(VALSTAR)®); 빈블라스틴 (예를 들어, 벨반(VELBAN)®); 빈크리스틴 (예를 들어, 온코빈(ONCOVIN)®); 비노렐빈 (예를 들어, 나벨빈(NAVELBINE)®); 및 졸레드로네이트 (예를 들어, 조메타(ZOMETA)®)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 가용성 PH20, 예컨대 esPH20, 예를 들어 PEG화된 rHuPH20은 도세탁셀 (예를 들어, 탁소테레®), 리포좀 독소루비신 (예를 들어, 독실®), 수니티닙 말레이트 (예를 들어, 수텐트®) 또는 베바시주맙 (아바스틴®) 중 하나 이상의 투여후, 투여와 동시에 또는 투여전 대상체에게 투여된다.
따라서, 본원에서 제공되는 가용성 PH20 폴리펩티드는 비-암성 세포와 비교하여 감소된 내인성 히알루로니다제 활성을 가지는 것들을 포함하여, 전이성 및 비전이성 암의 치료에서 사용될 수 있다. 히알루로니다제는 단독으로 또는 다른 화학치료제와 병용으로 화학치료제로써 사용될 수 있다. 암의 예는 소 폐 세포 암종, 편평 폐 세포 암종, 및 유방, 난소, 머리 및 목의 암, 또는 억제된 수준의 히알루로니다제 활성 또는 감소된 히알루론산 이화작용과 관련된 임의의 다른 암을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
b. 뇌 내 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서 용도
히알루론산 수준은 수많은 뇌척수 병리적 상태에서 상승된다. 뇌척수 히알루론산의 수준은 정상적으로는 성인에서 200 ㎍/L 미만이나 (문헌 [Laurent 등 (1996) Acta Neurol Scand September 94(3):194-206]), 수막염, 척추관 협착증, 두부 손상 및 뇌경색과 같은 질병에서 8000 ㎍/L 초과의 수준으로 상승할 수 있다. 히알루니다제, 예를 들어 가용성 rHuPH20은 임계적으로 상승된 수준의 기질을 분해하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 뇌에서 효과적인 림프의 부족은 두부 외상 후 생명을 위협하는 부종을 초래할 수 있다. 히알루론산 축적은 히알루론산 신타제에 의한 증가된 합성 및 감소된 분해의 결과이다. 히알루론산의 축적은 초기에는 백혈구 혈관외유출을 용이하게 하기 위해 손상된 조직 내의 물 함량을 증가시키는 유익한 목적으로 기능할 수 있으나, 계속된 축적은 치명적일 수 있다. 두부 외상을 앓는 환자에게 예컨대 경막내로 또는 정맥내로 히알루로니다제를 투여하는 것은 조직 히알루론산 축적 및 이와 관련된 물을 제거하는 기능을 할 수 있다.
또한, 가용성 PH20 은 뇌 종양과 관련된 부종, 특히 다형성 교모세포종과 관련된 부종의 치료에서 사용될 수 있다. 뇌 종양과 관련된 부종은 종양에 인접한 뇌의 비암성 부분 내의 히알루론산의 축적으로부터 야기된다. 히알루론산 축적 부위로 가용성 PH20 히알루로니다제를 (예를 들어, 정맥내 주사에 의해 또는 단락을 통해) 투여하는 것은 이들 부위에서 과량의 히알루론산을 분해함으로써 이러한 악성종양과 관련된 부종을 완화시킬 수 있다.
c. 심혈관 질환에서 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서 용도
가용성 PH20 히알루로니다제는 몇몇 심혈관 질환의 치료에서 사용될 수 있다. 동물 모델에서 실험적 심근 경색 후 히알루로니다제의 투여는 경색 크기를 감소시킬 수 있다 (문헌 [Maclean, et al (1976) Science 194(4261):199-200]). 이를 발생시킬 수 있는 제안된 메카니즘 중 하나는 허혈 재관류 후 발생하는 히알루론산 축적의 감소에 의한 것이다. 경색 크기의 감소는 증가된 림프 배액 및 증가된 조직 산소첨가 및 심근 물 함량의 감소로부터 발생하는 것이라고 믿어진다.
또한, 가용성 PH20 히알루로니다제는 동맥경화증으로부터 관상동맥 판을 제한하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 판은 글리코사미노글리칸을 축적시키고, 대식세포 및 거품세포 접착을 매개한다 (문헌 [Kolodgie 등 (2002) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22(10):1642-8]).
d. 유리체절제술 및 안과 장애 및 상태에서 용도
히알루로니다제, 예컨대 가용성 esPH20 은 유리체절제술 동안 망막의 박리 또는 열상을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 유리체의 제거전 유리체가 망막으로부터 분리되거나 "해리되도록" 야기할 수 있다. 유리체의 이러한 해리 또는 분리는 유리체가 제거될 때 망막의 추가 열상 또는 박리가 일어날 가능성을 최소화할 수 있다.
히알루로니다제, 예컨대 가용성 esPH20 은 다양한 안과 적용, 예를 들어 미국 특허 제5,292,509호에 기재된 유리체절제술 보조 적용을 위해 사용될 수 있다. 고도로 정제된 히알루로니다제, 예컨대, 본원에서 제공되는 가용성 PH20 의 사용은 안구내 수술에서 면역원성 및 독성을 최소화하기에 바람직하다.
가용성 PH20 히알루로니다제는 예를 들어, 혈관신생을 예방하고 망막에 대해 독성인 물질의 유리체로부터의 제거율을 증가시킴으로써 안과 장애를 치료하고/거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 가용성 PH20 히알루로니다제는 눈에 독성 손상을 유발하지 않으면서 눈의 유리액을 액화시키는데 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 유리액의 액화는 유리체방으로부터의 액체 교환 속도를 증가시킨다. 이러한 교환 증가는 그 존재가 안과적 및 망막 손상을 유발할 수 있는 오염 물질을 제거한다.
가용성 PH20 히알루로니다제는 또한 수술후 압력을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 히알루론산은 백내장 및 안구내 렌즈 외과적 처치 동안 주로 스페이서로서 눈에서 사용되어 왔다. 또한, 이는 다른 안구 외과적 처치, 예컨대 녹내장, 유리체 및 망막 수술 및 각막 이식에서 사용된다. 수술후 백내장 환자에서 발생하는 흔한 부작용은 안압의 유의한 조기 및 때때로 연장된 상승이다. 이러한 상태는 때로는 심각하며, 특히 녹내장성 시신경 유두 변화를 갖는 환자에서 심각하다. 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 은 수술후 안압을 감소시키기 위해 수술 전에 히알루론산과 함께 눈에 공동투여될 수 있다. 히알루로니다제는 수술 동안 히알루론산의 유효성을 감소시키기 않고 환자에서 부작용을 발생시키지 않으면서 히알루론산을 분해시킴으로써 안압을 수술전 수준으로 감소시키기에 효과적인 양으로 투여될 수 있다 (미국 특허 제6,745,776호).
가용성 PH20 히알루로니다제는 또한 윤상 섬유주로부터 글리코사미노글리칸을 제거하고 안압을 감소시키기 위해 녹내장을 갖는 환자에게 투여될 수 있고, 당뇨성 망막병증, 망막 혈관신생, 망막 정맥 폐색, 후유리체 박리, 망막 열상 및 안구 외상 등과 같은 상태와 관련되어 발생할 수 있는 유리체 출혈 (즉, 유리체로의 혈액의 혈관외유출)의 용해를 촉진하기 위해 유리체에 적용될 수 있다. 일반적으로 느리게 용해하는 유리체 출혈의 존재는 진단 및/또는 치료 절차, 예컨대, 종종 증식성 당뇨성 망막병증과 같은 상태를 위한 일차 치료인 레이져 광응고를 위해 유리체를 통해 망막을 시각화하는 것을 필요로 하는 절차를 지연시키거나 복잡하게 하거나 방해할 수 있다.
e. 피하주입에서 용도
피부의 피하조직으로의 유체 및 전해질의 주입인 피하주입은 경증 내지 중간 탈수 성인 환자, 특히 노인에게 적합한 유용하고 간단한 수분공급 기술이다. 안전하고 효과적인 것으로 고려되나, 가장 빈번한 유해 효과는 국부 마사지 또는 전신 이뇨제에 의해 치료될 수 있는 경증 피하 부종이다. 대략 3 L를 24-시간 기간 내에 2개의 별개 부위에서 제공할 수 있다. 보통의 주입 부위에는 가슴, 복부, 대퇴부 및 상완이 포함된다. 피하주입에서 사용되는 용액에는 예를 들어, 생리식염수, 1/2-생리식염수, 염수와 글루코스 및 5% 글루코스가 포함된다. 염화칼륨이 또한 용액에 첨가될 수 있다. 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 의 용액으로의 첨가는 유체 흡수를 향상시키고 전체 투여 속도를 증가시킬 수 있다.
f. 유전자 치료에서 용도
대부분의 유전자 전달 비히클의 생체내 효능은 시험관내에서 관찰된 발견된 효능에 상응하지 않는다. 글리코사미노글리칸은 많은 세포 유형으로의 DNA 및 바이러스 벡터의 전이 및 확산을 방해할 수 있다. 이러한 세포외 기질 물질의 수준은 프로세스를 상당히 방해할 수 있다. 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 의 투여는 세포외 기질 내의 채널을 개방시키며, 따라서 유전자 요법의 전달을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 가용성 PH20 은 DNA의 생체내 형질도입을 용이하게 하기 위해 콜라게나제와 함께 투여될 수 있다 (문헌 [Dubinsky 등 (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81(23):7529-33]). 또한, 히알루로니다제는 아데노-관련 바이러스를 사용하는 유전자 요법을 향상시킬 수 있다 (문헌 [Favre et al, (2000) Gene Therapy 7(16):1417-20]). 히알루로니다제의 투여 후 개방된 채널은 전형적으로 더 작은 분자, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 DNA 복합체 (뿐만 아니라 관심있는 다른 치료제 및 약리학제)의 확산을 향상시키는 크기를 갖는다. 그러나, 구멍은 세포의 전위 및 이동을 촉진할 만큼 크지는 않다.
몇몇 예에서, 바이러스는 표적 조직 내에서 그의 복제 및 산포를 용이하게 하기 위해 하나 이상의 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 을 발현하도록 조작될 수 있다. 표적 조직은 예를 들어, 암성 조직일 수 있으며, 이에 의해 바이러스는 종양 내에서 선택적으로 복제할 수 있다. 바이러스는 또한 비용균 바이러스일 수 있으며, 여기서 바이러스는 조직 특이적 프로모터 하에 선택적으로 복제한다. 바이러스가 복제할 때, 바이러스 유전자와 히알루로니다제의 공동발현은 생체내에서 바이러스의 산포를 용이하게 할 수 있다.
g. 미용적 용도
히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 은 셀룰라이트의 축적에 관여되는 글리코사미노글리칸을 제거하고 림프 흐름을 촉진하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 가용성 PH20 은 셀룰라이트의 치료에서 사용된다. 히알루로니다제는 글리코사미노글리칸의 끊임없는 분해를 촉진하고 그의 복귀를 방지하기 위해 반복된 피하 주사를 통해, 연고 또는 크림 형태로 경피 전달을 통해, 또는 주사가능한 서방형 제형의 사용을 통해 투여될 수 있다.
히알루로니다제, 예컨대 PH20 은 또한 "돼지피부" 부종 또는 "오렌지 껍질" 부종과 같은 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 히알루로니다제는, 진피에 축적할 수 있고, 결합된 물의 체류 및 대사 노폐물을 제거하는 유기 액체의 확산의 모세관 압축에 의한 지체의 원인인 장쇄 무코다당류의 해중합을 수행할 수 있다. 지방세포의 지방 과부하와 관련된 물 및 노폐물의 이러한 체류는 전형적 "돼지피부" 부종 또는 "오렌지 껍질" 부종을 구성한다. 해중합은 무코다당류의 장쇄를 단쇄로 절단하여, 결합된 물 및 노폐물의 소실 및 정맥 및 림프 순환의 회복을 초래하며, 국소 부종의 소멸을 달성할 수 있다.
h. 장기 이식에서 용도
장기 내 히알루론산의 함량은 염증과 함께 증가할 수 있다. 히알루론산의 증가된 농도는 폐포염 (문헌 [Nettelbladt 등 (1991) Am. Rev. Resp. Dis. 139: 759-762]) 및 심근 경색 (문헌 [Waldenstrom 등 (1991) J. Clin. Invest. 88(5): 1622-1628])과 같은 염증-면역 손상을 특징으로 하는 상이한 장기로부터의 조직에서 관찰되었다. 다른 예로는 신장 (문헌 [Haellgren 등 (1990) J. Exp. Med. 171: 2063-2076]; [Wells 등 (1990) Transplantation 50: 240-243]), 소장 (문헌 [Wallander 등 (1993) Transplant. Int. 6: 133-137]) 또는 심장 (문헌 [Haellgren 등 (1990) J Clin Invest 185:668-673]) 이식 후 동종이계이식 거부반응; 또는 바이러스 기원의 심근 염증 (문헌 [Waldenstrom 등 (1993) Eur. J. Clin. Invest. 23: 277-282])이 포함된다. 장기 이식과 관련된 간질성 부종의 발생은 이식 수술 분야에서 심각한 문제점을 구성한다. 간질성 부종을 갖는 이식편은 기능이 일시적으로 상실될 정도로 팽윤할 수 있다. 몇몇 예에서, 종창은 신장의 파괴를 유발하여, 대량 출혈을 초래할 수 있다. 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20은 장기 이식에서 축적된 글리코사미노글리칸을 분해하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 글리코사미노글리칸의 제거는 이식편으로부터의 물의 제거를 촉진하고, 그러므로 장기 기능을 향상시킨다.
i. 폐 질환에서 용도
정상적인 개인으로부터 기관지폐포 세척액 (BAL) 내의 히알루론산의 수준은 일반적으로 15 ng/ml 미만이다. BAL 내의 히알루론산 수준은 호흡 곤란의 상태에서 극적으로 상승한다 (문헌 [Bjermer 등 (1987) Br Med J (Clin Res Ed) 295(6602):803-6]). 폐 내의 증가된 히알루론산은 산소 확산 및 기체 교환 뿐만 아니라 중성구 및 대식세포 반응의 활성화를 방지할 수 있다. 본원에 제공된 것과 같은 가용성 rHuPH20의 정제된 제제는 히알루로난 수준을 감소시키기 위해 이러한 상태를 나타내는 환자에게 폐 또는 정맥내 전달에 의해 전달될 수 있다. 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 은 또한 상승된 글리코사미노글리칸과 관련된 다른 폐 합병증을 앓는 환자에게 투여되거나, 또는 다른 공동전달된 분자의 폐로의 전달을 향상시키기 위해 투여될 수 있다.
3. 기타 용도
그 치료학적 사용의 추가 예에서, 히알루로니다제, 예컨대 본원에서 제공되는 esPH20 을 포함한 가용성 PH20 은 빈카 알칼로이드와 같은 괴사성 물질의 정맥주위 주사로부터의 국소 괴사에 대한 해독제와 같은 목적을 위해 (Few 등 (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12, 23-26), 결절종의 치료 (Paul 등 (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219-21) 및 정맥 부전으로 인한 조직 괴사의 치료 (Elder 등 (1980) Lancet 648-649)를 위해 사용될 수 있다. 가용성 PH20 은 또한 결절종 (또한, 손목종, 성경책종 또는 배후 힘줄종이라고 공지됨)을 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 손의 가장 흔한 연질 조직 덩어리이고 피부 아래에서 느껴질 수 있는 유체 충전된 낭이다.
히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 은 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (CSPG)을 분해함으로써 척수 손상의 치료에서 사용될 수 있다. 척수 손상 후, CSPG를 함유하는 신경교 상흔이 성상세포에 의해 생성된다. CSPG는 축삭 성장의 억제에서 중요한 역할을 한다. 또한, CSPG의 발현은 중추 신경계 (CNS)의 손상 후 증가하는 것으로 나타났다. 가용성 PH20 은 또한 화학적 수핵용해술이라고 공지된 방법에서 추간판 탈출증의 치료를 위해 사용될 수 있다. 히알루로니다제와 유사한 기질을 절단하는 효소인 콘드로이티나제 ABC는 요추 내의 추간판내 압력의 감소를 유도할 수 있다. 추간판 손상의 세가지 유형이 존재한다. 돌출된 추간판은 무손상이나 불룩한 추간판이다. 탈출된 추간판에서, 섬유성 싸개는 찢어지고 수핵 (NP)은 새어나왔으나 여전히 추간판에 연결되어 있다. 격리된 추간판에서, NP의 단편은 일부분 추간판으로부터 빠져나와 있고, 척추관에서 유리되어 있다. 화학적 수핵용해술은 전형적으로 돌출된 추간판 및 탈출된 추간판에 대해 효과적이나, 격리된 추간판 손상에 대해서는 효과적이 아니다.
I. 실시예
하기 실시예는 예시적 목적으로만 포함되며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이의 생성
본 실시예에서, 일련의 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이가 생성되었다. 성숙형 인간 PH20 히알루로니다제, 또는 정자 결합 분자 1 (SPAM1) 은 474 개의 아미노산을 포함하는 반면, 본 실시예에서 생성된 성숙형 카르복시-말단 결실 돌연변이체는 그 길이가 472 개 아미노산 내지 415 개 아미노산의 범위였다.
아미노산 A507 내지 아미노산 K450 의 절단된 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이체를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 표준 DNA 합성 프로토콜에 따라 합성되었다. 모 DNA 서열은 코돈-최적화된 인간 PH20 히알루로니다제였고, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2 에 제시된다. 상기 코돈-최적화된 인간 PH20 히알루로니다제는 서열번호 144 에 제시된 이종성 면역글로불린 카파 (IgK) 신호 서열을 포함했다. 추가적으로, 상기 서열은 5' NheI 및 3' BamHI 제한효소 부위를 포함하여, HZ24 플라스미드 (서열번호 140) 로의 클로닝을 가능케 한다. 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이 뉴클레오티드 서열은 서열번호 146-185 및 199-201 에 제시된다. 합성 DNA 서열은 NheI 및 BamHI 제한 효소로 소화시켰고, 유사하게 소화된 HZ24 플라스미드로 클로닝되어, 각 개별 클론에 대한 돌연변이 SPAM1-HZ24 플라스미드를 생성시켰다.
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이체를 표 3 에 제시한다. SPAM1 돌연변이는 단백질의 C-말단에서 4 개의 아미노산에 의해 식별된다. 또한, 전구체 및 성숙형 카르복시-말단 결실 돌연변이체의 아미노산의 길이를 제시한다.
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이체
돌연변이체 전구체
(아미노산)		 전구체
서열번호		 성숙형
(아미노산)		 성숙형
서열번호
SPAM1-VASL 509 1 474 108
SPAM1-SSVA 507 3 472 55
SPAM1-IISS 505 4 470 56
SPAM1-FLII 503 5 468 57
SPAM1-LFLI 502 47 467 99
SPAM1-ILFL 501 6 466 58
SPAM1-SILF 500 48 465 100
SPAM1-VSIL 499 7 464 59
SPAM1-IVSI 498 49 463 101
SPAM1-FIVS 497 8 462 60
SPAM1-TMFI 495 9 460 61
SPAM1-SATM 493 10 458 62
SPAM1-TLSA 491 11 456 63
SPAM1-PSTL 489 12 454 64
SPAM1-STLS 490 13 455 65
SPAM1-ASPS 487 14 452 66
SPAM1-YNAS 485 15 450 67
SPAM1-FYNA 484 16 449 68
SPAM1-IFYN 483 17 448 69
SPAM1-QIFY 482 18 447 70
SPAM1-PQIF 481 19 446 71
SPAM1-EPQI 480 20 445 72
SPAM1-EEPQ 479 21 444 73
SPAM1-TEEP 478 22 443 74
SPAM1-ETEE 477 23 442 75
SPAM1-METE 476 24 441 76
SPAM1-PMET 475 25 440 77
SPAM1-PPME 474 26 439 78
SPAM1-KPPM 473 27 438 79
SPAM1-LKPP 472 28 437 80
SPAM1-FLKP 471 29 436 81
SPAM1-AFLK 470 30 435 82
SPAM1-DAFL 469 31 434 83
SPAM1-IDAF 468 32 433 84
SPAM1-CIDA 467 33 432 85
SPAM1-VCID 466 34 431 86
SPAM1-GVCI 465 35 430 87
SPAM1-DGVC 464 36 429 88
SPAM1-IADG 462 37 427 89
SPAM1-VCIA 460 38 425 90
SPAM1-VDVC 458 39 423 91
SPAM1-DAVD 456 40 421 92
SPAM1-DTDA 454 41 419 93
SPAM1-VKDT 452 42 417 94
SPAM1-ADVK 450 43 415 95
실시예 2
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이체의 발현
본 실시예에서, 실시예 1 에서 생성된 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이체를 CHO-S 세포에서 발현시켰다. 추가적으로, rHuPH20 및 His-태그된 PH20 를 Lec1 (Cat No. CRL-1735, ATCC), Lec2 (Cat No. CRL-1736, ATCC), Lec8 (Cat No. CRL-1737, ATCC) 및 Pro-5 (Cat No. CRL-1781) 를 포함하는 렉틴 내성 CHO 돌연변체이의 4 개의 균주 각각에서 발현시켰다. Lec 돌연변이 세포에서의 PH2O 의 발현은 하기 실시예 9 에서 추가로 더 논의된다.
A. 6-웰 플레이트에서의 CHO -S 세포에서의 일시적 발현
실시예 1 에서 생성된 돌연변이 PH20-HZ24 플라스미드를, GeneJuice
Figure pct00004
(Novagen) 를 이용하여 제조사의 지시사항에 따라 CHO-S 세포 (중국 햄스터 난소 CHO K1 세포로부터 유도됨) 에 일시적으로 감염시켰다. 간략하게, CHO-S 세포를 L-글루타민을 보충한 CD CHO 배지에서 배양했다. 형질전환 전에, CHO-S 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 약 5x105 세포로 플레이팅하고, 밤새 37℃ 에서 5% CO2 로 하여 배양했다. 이어서, 배지를 제거하고, CHO-S 세포를 1 mL 무혈청 배지로 2 회 세척했다. GeneJuice
Figure pct00005
를 무혈청 배지와 혼합한 후, 2 ㎍ 돌연변이-HZ24 DNA 를 첨가했다. 실온에서 5 내지 15 분간 인큐베이션 후, GeneJuice
Figure pct00006
/DNA 혼합물을 세척한 CHO-S 세포를 포함하고 있는 개별 웰에 적가했다. 4 시간 후, 배지를 L-글루타민을 보충한 1 mL CD-CHO 배지로 교체하고, 세포를 72 시간 동안 37℃ 에서 5% CO2 로 하여 인큐베이션했다. 발현 후, 배지 및 세포를 따로 수합했다.
B. 10 cm 세포 배양 디쉬에서의 CHO 세포에서의 일시적 발현
실시예 1 에서 생성시킨 돌연변이 PH20-HZ24 플라스미드를 GeneJuice
Figure pct00007
(Novagen) 를 이용하여 제조사의 지시사항에 따라 CHO-S 세포에 일시적으로 감염시켰다. 대안적으로, HZ24-PH20 (서열번호 108, rHuPH20 를 인코딩함), PH20sHis (서열번호 187, His-태그된 PH20 를 인코딩함) 및 HZ24-mut(B/S) (서열번호 122, 아미노산 482 에서 절단된 PH20 를 인코딩함) 은, Lec1 (Cat No. CRL-1735, ATCC), Lec2 (Cat No. CRL-1736, ATCC), Lec8 (Cat No. CRL-1737, ATCC) 및 Pro-5 (Cat No. CRL-1781) 를 포함하는 렉틴 내성 CHO 돌연변이의 4 개의 균주에, GeneJuice
Figure pct00008
(Novagen) 를 이용하여 제조사의 지시사항에 따라 일시적으로 감염시켰다.
간략히, CHO-S 세포를 8 mM GlutaMax 를 보충한 CD-CHO 배지에서 유지했다. 렉틴 내성 CHO 돌연변이 세포를 10% FBS 를 보충한 DMEM 배지에서 배양했다. 형질전환 전에, CHO 세포를 10 cm 세포 배양 디쉬에 웰 당 약 3x106 세포로 플레이팅하고, 10% FBS 를 보충한 DMEM 배지에서 37℃ 에서 5% CO2 로 하여 밤새 배양했다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포 단층을 10 mL 무혈청 배지를 이용해 2 회 세척했다. 36 ㎕ GeneJuice
Figure pct00009
를 1.2 mL DMEM 와 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 12 ㎍ DNA 를 첨가하고 조심스럽게 혼합했다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션 후, GeneJuice
Figure pct00010
/DNA 혼합물을 CHO 세포의 단층에 적가하고, 세포 배양 디쉬를 조심스럽게 진탕하여 혼합되도록 했다. 플레이트를 4 시간 동안 37℃ 에서 5% CO2 로 인큐베이션했다. 4 시간 후, 배지를 Glutamax-1 를 보충한, 12 mL 무세제 CD DG44 배지로 교체하고, 세포를 48 시간 동안 37℃ 에서 5 % CO2 로 하여 인큐베이션했다. 발현 후, 배지 및 세포를 따로 수합했다.
실시예 3
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이의 용해도
본 실시예에서, 상기 실시예 2 에 기재된 바와 같이 일시적 발현 후, 배지 및 세포를 따로 수합하고, 웨스턴 블랏 분석으로 PH20 발현 및 가용성에 대해 분석했다. C-말단 절단 돌연변이의 가용성은, 발현된 단백질이 성장 배지 또는 세포에 존재하는지 여부를 검사하여 결정했다. 서열번호 55 내지 65 및 99 내지 101 에 해당하는, 길이가 455 내지 472 아미노산인 C-말단 결실 돌연변이체는, 단백질을 세포막에 결합시키기 위해 제공되는 GPI-앵커 유래의 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 돌연변이를 발현하는 세포를 포스포이노시톨-포스포리파아제 C (PI-PLC) 로 처리하는데, 이는 GPI-앵커를 절단하여 가용성 단백질이 배지로 방출되도록 하고, 생성된 배지 및 세포 내 PH20 의 존재 여부는 웨스턴 블랏 분석에 의해 결정했다.
A. 웨스턴 블랏 분석
비-환원 시료를 4 내지 20% Tris-Glycine 겔에서 전개했고, iBlot (Invitrogen) 를 이용해 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 웨스턴 블랏을 위해, 토끼 항-PH20 IgG (0.5 ㎍/mL) 를 1 차 항체로 이용했고, HRP-접합된 염소 항-토끼 IgG (0.1 ng/mL, Cat# DC03L, EMD) 를 2 차 항체로 이용했다. 발현의 증거는 재조합 인간 PH20 히알루로니다제에 해당하는 약 66 kDa 에서의 밴드로 결정된다.
B. PI - PLC 처리
1. 6-웰 플레이트에서의 일시적 발현
상기 실시예 2A 에 기재된 바와 같은 CHO-S 세포에서의 72 시간 동안의 rHuPH20 의 발현 후, 배지 및 세포를 따로 수합했다. 세포를 무혈청 배지로 세척한 후, 웰 당 2 mL 무혈청 배지를 첨가했다. PI-PLC (0.5 units/웰) 을 각 웰에 첨가하고, 세포를 PI-PLC 에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 결과로서 수득한 배지 및 세포를 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏 분석으로 분석했다.
2. 10 cm 조직 배양 디쉬에서의 일시적 발현
하나는 PI-PLC 처리를 위한 것이고, 하나는 PI-PLC 처리를 하지 않을 것인, rHuPH20 발현 CHO-S 세포의 두 플레이트를 각각 상기 실시예 2B 에 기재된 바와 같이 각 C-말단 돌연변이에 대해 준비했다. 48 시간 동안의 발현 후, PI-PLC 비처리 세포에 대해서는, 배지 및 세포를 따로 수합했다. 수합한 배지를 가볍게 원심분리하여 가라앉히고, 10 mL 의 부피로 농축하고, Amicon 30kD MWCO 컨센트레이터를 이용하여 PBS 로 완충액 교체를 했다. 세포를 차가운 PBS 로 헹구고, 긁어모으고, 프로테아제 저해제 Set III (Cat No. 539134, Calbiochem) 가 있는 1.2 mL PBS 에 재현탁시켰다. 재현탁시킨 세포를 가볍게 초음파처리하여 세포 전체 추출물을 제조했다. 세포의 PI-PLC 처리를 위해, 48 시간 동안의 발현에 후속하여, 상기 기재된 바와 같이 비처리 배지를 수합했다. 세포를 Glutamax-1 이 있는 새로운 CD DG44 배지로 1 회 헹구고, 배지를 디쉬 당 3.0 units PI-PLC 가 있고, Glutamax-1 를 보충한 12 mL 의 새로운 무세제 CD DG44 배지로 교체하고, 세포를 2 시간 동안 37℃ 에서 5% CO2 로 하여 인큐베이션했다. 2 시간 후, PI-PLC 배지 및 세포를 상기 기재된 바와 같이 따로 수합했다. 결과로서 수득한 비처리 배지 및 세포, 및 PI-PLC 처리 배지 및 세포를 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏 분석으로 분석했다.
C. 결과
결과는 하기 표 4 에 기재되었다. 4 가지 돌연변이, ILFL (서열번호 58), SILF (서열번호 100), VSIL (서열번호 59) 및 IVSI (서열번호 101) 은, PH20 의 낮은 발현을 나타냈다. 웨스턴 블랏 분석은, 약 66 kDa 에서의 단백질 밴드로 증명되는 바와 같이, F500 보다 더 짧은 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이 (서열번호 59 내지 95 및 100 내지 101) 가 배지 내에서 발현되어 있음을 보여준다. L501 내지 A507 사이 길이를 가진 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이 (서열번호 55 내지 58 및 99) 는 세포 내에서 발현된다. 상기 세포를 PI-PLC 로 처리시, 약 66 kDa 에서의 단백질 밴드로 증명되는 바와 같이 인간 PH20 히알루로니다제가 배지에 방출된다. 서열번호 59 내지 65 및 100 내지 101 에 해당하는 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이 유래 세포의 PI-PLC 를 이용한 처리는, 상기 단백질이 배지에서 초반에 발현되어 있기 때문에, 영향력이 없다.
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이체 발현
돌연변이체 성숙형
(AA)		 단백질
발현		 배지 내
발현		 PI-PLC 첨가 후
배지 내 발현
SPAM1-VASL
(서열번호 108)		 474 있음 없음 있음
SPAM1-SSVA
(서열번호 55)		 472 있음 없음 있음
SPAM1-IISS
(서열번호 56)		 470 있음 없음 있음
SPAM1-FLII
(서열번호 57)		 468 있음 없음 있음
SPAM1-LFLI
(서열번호 99)		 467 있음 없음 있음
SPAM1-ILFL
(서열번호 58)		 466 약함 없음 있음
SPAM1-SILF
(서열번호 100)		 465 약함 약함/있음 초기에 배지 내
SPAM1-VSIL
(서열번호 59)		 464 약함 있음 초기에 배지 내
SPAM1-IVSI
(서열번호 101)		 463 약함 있음 초기에 배지 내
SPAM1-FIVS
(서열번호 60)		 462 있음 있음 초기에 배지 내
SPAM1-TMFI
(서열번호 61)		 460 있음 있음 초기에 배지 내
SPAM1-SATM
(서열번호 62)		 458 있음 있음 초기에 배지 내
SPAM1-TLSA
(서열번호 63)		 456 있음 있음 초기에 배지 내
SPAM1-STLS
(서열번호 65)		 455 있음 있음 초기에 배지 내
SPAM1-PSTL
(서열번호 64)		 454 있음 있음 초기에 배지 내
SPAM1-ASPS
(서열번호 66)		 452 있음 있음 n/a
SPAM1-YNAS
(서열번호 67)		 450 있음 있음 n/a
SPAM1-FYNA
(서열번호 68)		 449 있음 있음 n/a
SPAM1-IFYN
(서열번호 69)		 448 있음 있음 n/a
SPAM1-QIFY
(서열번호 70)		 447 있음 있음 n/a
SPAM1-PQIF
(서열번호 71)		 446 있음 있음 n/a
SPAM1-EPQI
(서열번호 72)		 445 있음 있음 n/a
SPAM1-EEPQ
(서열번호 73)		 444 있음 있음 n/a
SPAM1-TEEP
(서열번호 74)		 443 있음 있음 n/a
SPAM1-ETEE
(서열번호 75)		 442 있음 있음 n/a
SPAM1-METE
(서열번호 76)		 441 있음 있음 n/a
SPAM1-PMET
(서열번호 77)		 440 있음 있음 n/a
SPAM1-PPME
(서열번호 78)		 439 있음 있음 n/a
SPAM1-KPPM
(서열번호 79)		 438 있음 있음 n/a
SPAM1-LKPP
(서열번호 80)		 437 있음 있음 n/a
SPAM1-FLKP
(서열번호 81)		 436 있음 있음 n/a
SPAM1-AFLK
(서열번호 82)		 435 있음 있음 n/a
SPAM1-DAFL
(서열번호 83)		 434 있음 있음 n/a
SPAM1-IDAF
(서열번호 84)		 433 있음 있음 n/a
SPAM1-CIDA
(서열번호 85)		 432 있음 있음 n/a
SPAM1-VCID
(서열번호 86)		 431 있음 있음 n/a
SPAM1-GVCI
(서열번호 87)		 430 있음 있음 n/a
SPAM1-DGVC
(서열번호 88)		 429 있음 있음 n/a
SPAM1-IADG
(서열번호 89)		 427 있음 있음 n/a
SPAM1-VCIA
(서열번호 90)		 425 있음 있음 n/a
SPAM1-VDVC
(서열번호 91)		 423 있음 있음 n/a
SPAM1-DAVD
(서열번호 92)		 421 있음 있음 n/a
SPAM1-DTDA
(서열번호 93)		 419 있음 있음 n/a
SPAM1-VKDT
(서열번호 94)		 417 있음 있음 n/a
SPAM1-ADVK
(서열번호 95)		 415 있음 있음 n/a
실시예 4
Triton
Figure pct00011
X-114 검정을 이용한 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이의 가용성
본 실시예에서, 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이의 가용성은 Triton
Figure pct00012
X-114 검정을 이용해 시험했다. 상기 검정에서, 가용성 PH20 히알루로니다제는 37℃ 로 데운 Triton
Figure pct00013
X-114 용액의 수상으로 분배될 것이며 (문헌 Bordier 등, (1981) J. Biol . Chem ., 256:1604-7 에 기재된 바와 같은 변형), 멤브레인-고정 PH20 히알루로니다제는 세제가 많은 상으로 분배가 될 것이다.
그러한 목적으로, PBS 중 2% (v/v) Triton
Figure pct00014
X-114 을 0℃ 에서 상기 실시예 3B 에서 제조한 200 ㎕ 의 조직 배양 배지 또는 세포 추출물에 첨가하고, 시료를 얼음에서 인큐베이션했다. 분리를 위해, 시료를 미세원심분리관 내 0.06% Triton
Figure pct00015
X-114 을 포함하는 30 ㎕ 수크로오스 완충액 (6% w/w) 에 4℃ 에서 제공했다. 시료를 37℃ 까지 3 분 동안 가열하여, 상 분리를 유도했고, 3 분간 4000g 에서 실온에서 원심분리했다. 수상 및 세제상을 SDS-PAGE 분리 및 웨스텃 블랏을 위해 떠 냈다. 토끼 항-PH20 IgG (0.5 ㎍/mL) 를 1 차 항체로 이용했고, HRP-접합된 염소 항-토끼 IgG (0.1 ng/mL, Cat# DC03L, EMD) 를 2 차 항체로 이용했다. 전장 인간 PH20 는, 세제상으로 분명하게 분배되어, 대조군으로 이용했다.
카르복시-말단 결실 돌연변이의 가용성 결과는 표 5 에 제시한다. F500 까지의 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이 (전구체 서열번호 7-13 및 48-49 또는 성숙형 서열번호 59-65 및 100-101) 는 수상으로 분배되었고, 따라서 가용성이다. F500 보다 더 긴 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이 (서열번호 55-58 및 99) 는 세제상으로 분배되어, 불용성이다. 전장 PH20 도 또한 불용성이다.
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이체의 용해도
돌연변이체 서열번호 성숙형 (AA) 가용성
SPAM1-VASL 108 474 없음
SPAM1-SSVA 55 472 없음
SPAM1-IISS 56 470 없음
SPAM1-FLII 57 468 없음
SPAM1-LFLI 99 467 없음
SPAM1-ILFL 58 466 없음
SPAM1-SILF 100 465 있음
SPAM1-VSIL 59 464 있음
SPAM1-IVSI 101 463 있음
SPAM1-FIVS 60 462 있음
SPAM1-TMFI 61 460 있음
SPAM1-SATM 62 458 있음
SPAM1-TLSA 63 456 있음
SPAM1-PSTL 64 454 있음
SPAM1-STLS 65 455 있음
실시예 5
인간 PH20 히알루로니다제 카르복시 -말단 결실 돌연변이의 히알루로니다제 활성
본 실시예에서, 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이를, 바이오틴화-히알루론산 (바이오틴화-HA 또는 bHA) 을 이용한 미세역가 검정을 이용해 그의 PH20 히알루로니다제 활성에 대해 시험했다. 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이는 pH 7.4 및 pH 5.5 의 두가지 모두에서 히알루로니다제 활성에 대해 시험했다.
간략하게, 4xBHX 96-웰 플레이트를 바이오틴화-HA (1.1 MDa) 로 코팅했다. 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이로 형질전환된 세포 유래의 형질전환 72 시간 후 상청액을 pH 7.4 또는 pH 5.5 의 완충액에 희석하고, 플레이트의 개별 웰에 첨가하고, 37℃ 에서 90 분간 인큐베이션시켰다. 반응은 4M 구아니딘 HCl 의 첨가로 종결했다. 웰은 Tween20 (PBST) 이 있는 인산염 완충 식염수로 4 회 세척하여, 임의의 소화된 바이오틴화-HA 를 제거하고, 이어서 스트렙타비딘-HRP 를 첨가해 1 시간 동안 실온에 두었다. 웰을 PBST 로 4 회 세척하고, 플레이트를 TMB 을 이용해 현상했다. 플레이트를 ELISA 플레이트 검독기를 이용해 450 nm 에서 검독했다. 히알루로니다제 활성 (단위는 Units/mL) 은 450 nm 에서 측정한 흡광도를 히알루로니다제 참고 표준 곡선을 이용해 내삽하여 결정했다. 전장 성숙형 인간 PH20 히알루로니다제 및 비-형질전환 CHO 세포를 양성 및 음성 대조군으로 이용했다.
결과는 하기의 표 6 및 6A 에 제시한다. SPAM1-GDVC 내지 SPAM1-ADVK (서열번호 88-95) 에 대응하는, I430 보다 더 짧은 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이체는 불활성이다. I498 (서열번호 101), L499 (서열번호 59), F500 (서열번호 100), L501 (서열번호 58) 및 I502 (서열번호 99) 에서 종결하는 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이들은 낮은 발현 수준 때문에 검출이 거의 안 되는 활성을 갖는다. 모든 나머지 인간 PH20 히알루로니다제 카르복시-말단 결실 돌연변이체들 (서열번호 55-57 및 60-87) 은 pH 7.4 및 pH 5.5 에서 모두 활성인 히알루로니다제이다.
히알루로니다제 활성
결실 돌연변이체 전구체
( AA ) 		성숙형
( AA ) 		pH 7.4
활성
(유닛/ ml ) 		pH 5.5
활성
(유닛/ ml )
SPAM1-SSVA
(서열번호 55)		 507 472 1.4715 1.125
SPAM1-IISS
(서열번호 56)		 505 470 1.458 0.837
SPAM1-FLII
(서열번호 57)		 503 468 0.9405 0.6345
SPAM1-ILFL
(서열번호 58)		 501 466 0.0405 0.0405
SPAM1-VSIL
(서열번호 59)		 499 464 0.02025 0.045
SPAM1-FIVS
(서열번호 60)		 497 462 0.1755 0.216
SPAM1-TMFI
(서열번호 61)		 495 460 0.45 0.612
SPAM1-SATM
(서열번호 62)		 493 458 0.5715 0.7335
SPAM1-TLSA
(서열번호 63)		 491 456 0.3645 0.5625
SPAM1-STLS
(서열번호 65)		 490 455 0.819 1.2375
SPAM1-PSTL
(서열번호 64)		 489 454 1.557 1.089
SPAM1-ASPS
(서열번호 66)		 487 452 1.017 0.9225
SPAM1-YNAS
(서열번호 67)		 485 450 1.8765 1.74825
SPAM1-FYNA
(서열번호 68)		 484 449 1.4985 1.26225
SPAM1-IFYN
(서열번호 69)		 483 448 2.45025 2.3085
SPAM1-QIFY
(서열번호 70)		 482 447 2.03175 1.647
SPAM1-PQIF
(서열번호 71)		 481 446 1.818 1.701
SPAM1-EPQI
(서열번호 72)		 480 445 2.1825 1.6425
SPAM1-EEPQ
(서열번호 73)		 479 444 1.917 2.0745
SPAM1-TEEP
(서열번호 74)		 478 443 1.764 1.584
SPAM1-ETEE
(서열번호 75)		 477 442 2.088 2.0475
SPAM1-METE
(서열번호 76)		 476 441 1.332 1.278
SPAM1-PMET
(서열번호 77)		 475 440 2.223 2.0925
SPAM1-PPME
(서열번호 78)		 474 439 1.2105 1.341
SPAM1-KPPM
(서열번호 79)		 473 438 0.8595 0.91575
SPAM1-LKPP
(서열번호 80)		 472 437 0.5445 0.9
SPAM1-FLKP
(서열번호 81)		 471 436 3.321 2.79
SPAM1-AFLK
(서열번호 82)		 470 435 3.204 2.925
SPAM1-DAFL
(서열번호 83)		 469 434 2.3895 2.2365
SPAM1-IDAF
(서열번호 84)		 468 433 0.5625 0.62775
SPAM1-CIDA
(서열번호 85)		 467 432 0.5535 0.4725
SPAM1-VCID
(서열번호 86)		 466 431 0 0.2115
SPAM1-GVCI
(서열번호 87)		 465 430 0.441 0.468
SPAM1-DGVC
(서열번호 88)		 464 429 0 0.045
SPAM1-IADG
(서열번호 89)		 462 427 0 0.00225
SPAM1-VCIA
(서열번호 90)		 460 425 0 0.0135
SPAM1-VDVC
(서열번호 91)		 458 423 0.0495 0.0585
SPAM1-DAVD
(서열번호 92)		 456 421 0 0.0675
SPAM1-DTDA
(서열번호 93)		 454 419 0 0.054
SPAM1-VKDT
(서열번호 94)		 452 417 0.054 0.0225
SPAM1-ADVK
(서열번호 95)		 450 415 0.063 0.0405
VASL
(서열번호 108)		 509 474 1.8045 0.891
VASL + PLC
(서열번호 108)		 509 474 3.96 2.313
HZ24-PH20
(서열번호 109)		 482 447 0.499 0.726188
CHO-S n/a n/a 0 0.012375

표 6A. 히알루로니다제 활성
결실 돌연변이체 전구체
( AA ) 		성숙형
( AA ) 		pH 7.4
활성
(유닛/ ml ) 		pH 5.5
활성
(유닛/ ml )
SPAM1-SSVA
(서열번호 55)		 507 472 1.782
 1.256
SPAM1-IISS
(서열번호 56)		 505 470 1.863 0.932
SPAM1-FLII
(서열번호 57)		 503 468 1.094 0.648
SPAM1-LFLI
(서열번호 99)		 502 467 0.608 0.324
SPAM1-ILFL
(서열번호 58)		 501 466 0.446 0.122
SPAM1-SILF
(서열번호 100)		 500 465 0.365 0.162
SPAM1-VSIL
(서열번호 59)		 499 464 0.486 0.122
SPAM1-IVSI
(서열번호 101)		 498 463 0.527 0.203
SPAM1-FIVS
(서열번호 60)		 497 462 0.365 0.162
SPAM1-TMFI
(서열번호 61)		 495 460 0.689 0.770
SPAM1-SATM
(서열번호 62)		 493 458 0.689 0.851
SPAM1-TLSA
(서열번호 63)		 491 456 0.851 0.729
SPAM1-PSTL
(서열번호 64)		 489 454 1.985 3.321
SPAM1-ASPS
(서열번호 66)		 487
 452
 1.134
 1.580
실시예 6
LC - MS 에 의한 rHuPH20 의 글리칸 분석
본 실시예에서, rHuPH20 (서열번호 122) 의 글리칸 분석 연구를 트립신 소화된 PH20 의 질량 분광계 분석으로 실시했다.
간략하게, rHuPH20 (실시예 15C 에서와 같이 제조) 를, 동결건조하고 6M 구아니딘 HCL, 0.002 M EDTA 및 0.02 M Tris, pH 8.28 를 함유하는 완충액에 최종 농도 0.5 mg/mL 가 되도록 재현탁시켰다. DTT (최종 농도는 10 mM) 를 첨가하고, 단백질/DTT 혼합물을 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 환원 후, 요오도아세트아미드를 최종 농도 20 mM 로 첨가했다. 최종적으로, 트립신 (1:25 w/w) 을 첨가하고, 혼합물을 20 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다.
트립신 소화물을 LC-MS 로 분석했다. 간략하게, 트립신 소화물을 하기 표 7 에 설정한 조건을 이용해 C18 역상 컬럼에 주입했다. 양이온 모드의 전자분사 이온화법 (ESI) 을 이용하는 Q-TOF Ultima 질량 분광계 상에서 MS 데이터를 수집했다. 데이터는 MS 모드 중인 m/z 200-1950 로부터 입수했다. 글리코펩티드를 GlycoMod 소프트웨어 (www.expasy.ch/tools/glycomod/) 를 이용해 분석해 글리칸 유형을 결정했다.
LC - MS 파라미터 및 설정
파라미터 설정
컬럼 Phenomenex Synergi Hydro-RP
컬럼 온도 30 ℃
이동상 A 0.2% 포름산을 함유하는 탈이온수
이동상 B 0.2% 포름산을 함유하는 아세토니트릴
구배 시간(분) %A %B
0.0 97.0 3.0
5.0 97.0 3.0
144.0 60.0 40.0
150.0 10.0 90.0
160.0 10.0 90.0
161.0 97.0 3.0
180.0 97.0 3.0
유속 0.2 mL/분
주입 부피 5 ㎕
전개 시간 (총합) 180 분
인간 PH20 히알루로니다제는 T475 에서 1 개의 O-글리코실화 부위를 갖는다. 상기 부위는 1 또는 2 개의 시알산을 갖는 코어 유형 1 글리칸에 의해 점유된다. rHuPH20 은 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 을 포함하는 6 개의 상이한 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된다. 상기 결과는 N254 가 약 75% 점유되고, N393 는 약 85% 점유되고, 4 개의 나머지 부위, N82, N166, N235 및 N368 은 99% 를 초과하여 점유된다는 것을 보여준다. 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 유형의 세 유형의 N-글리칸이 전부 rHuPH20 에 존재한다. 일반적으로, rHuPH20 은 약 45% 의 고 만노스 글리칸, 45% 의 복합체 글리칸 및 10% 의 하이브리드 글리칸을 함유한다. 전체 글리칸의 약 35% 이 음이온성이며, 이들 중 25% 는 시알산을 포함하고, 나머지 10% 는 포스페이트기일 수 있는 미지의 음이온성 기를 포함한다. 대부분의 복합체 글리칸은 푸코실화되어 있고, 음이온성 복합체 글리칸은 대부분 1 가지의 시알산을 포함하는 반면, 이들 중 일부는 두가지의 시알산을 포함한다. 각각의 아스파라긴 잔기는 약 90% 의 한가지 유형의 글리칸 및 적은 비율의 나머지 두 유형의 글리칸을 포함하는데, N235 은 예외로 한다. 각 잔기에 대한 주된 글리칸 유형은 하기 표 8 에 제시된다. 잔기 N82, N166 및 N254 는 복합체 글리칸에 의해 점유된다. 잔기 N368 및 N393 은 고 만노스 글리칸에 의해 점유된다. 잔기 N235 는 약 20% 의 복합체 글리칸과 함께, 약 80% 의 고 만노스 글리칸에 의해 점유된다.
rHuPH20 에서 아스파라긴 잔기에서의 N- 글리칸 유형
글리칸 부위 고 만노스 글리칸 복합체 글리칸
N82 X
N166 X
N235 ~ 80% ~ 20%
N254 X
N368 X
N393 X
실시예 7
엔도글리코시다제 처리에 의한 인간 PH20 히알루로니다제의 탈글리코실화
본 실시예에서, 인간 PH20 히알루로니다제는 다양한 글리코시다제를 이용해 정제된 rHuPH20 (서열번호 122)를 처리해 탈글리코실화되었고, 히알루로니다제 활성을 평가했다. 인간 PH20 히알루로니다제는 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393 을 포함하는 6 개의 상이한 아스파라긴 잔기에서 글리코실화된다. 하기를 포함하는 5 가지 글리코시다제가 탈글리코실화된 인간 PH20 히알루로니다제 생성에 이용되었다: 모든 N-글리칸을 절단하는 PNGaseF (New England Biolabs, Cat. No. P0704S, Lot #34); 고 만노스 및 하이브리드 유형 글리칸을 절단하는 EndoF1; 바이안테너리 (biantennary) 복합체 유형 글리칸을 절단하는 EndoF2; 바이안테너리 또는 더 많은 분지를 가진 복합체 글리칸을 절단하는 EndoF3; 및 고 만노스 및 하이브리드 유형 글리칸을 절단하는 EndoH (New England Biolabs, Cat. No. P0702S). 따라서, PNGaseF 를 이용한 처리는 완전한 탈글리코실화를 제공하는 반면, 엔도글리코시다제는 단지 부분적인 탈글리코실화를 제공한다.
완전한 탈글리코실화를 위해, 정제된 rHuPH20 (최종 농도는 0.1 mg/mL) 를PNGaseF (50,000 units/mL) 와 함께 50 mM 포스페이트 완충액 pH 7.2 내에서 밤새 37℃ 에서 인큐베이션했다. 부분적인 탈글리코실화를 위해, 정제된 rHuPH20 (최종 농도는 0.5 mg/mL) 를 0.3 units/mL 의 엔도글리코시다제 (EndoF1, EndoF2, EndoF3 또는 EndoH) 또는 모든 4 가지 엔도글리코시다제의 혼합물과 함께 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 5.0 에서 밤새 35℃ 에서 인큐베이션했다. rHuPH20 의 탈글리코실화는 SDS-PAGE 에 의해 PH2O 의 이동성에서의 변동에 의해 분석했다. 히알루로니다제 효소 활성은 실시예 5 에 기재된 바와 같이 결정했다.
인간 PH20 히알루로니다제의 분자량은 약 66 kDa 이다. EndoF1, EndoH 또는, EndoF1, EndoF2, EndoF3 및 EndoH 의 혼합물을 이용한 처리는 분자량 약 56 kDa 으로의 SDS-PAGE 이동성 변동으로 측정되는 바와 같은 부분적으로 탈글리코실화된 인간 PH2O 히알루로니다제를 제공한다. PNGaseF 를 이용한 처리는 인간 PH20 히알루로니다제의 완전한 탈글리코실화를 제공한다. rHuPH20 의 부분적인 탈글리코실화는 히알루로니다제 효소 활성의 불활성화를 제공하지 않는 반면, N-글리칸을 완전하게 제거하기 위한 PNGaseF 를 이용한 철저한 소화는 히알루로니다제 효소 활성의 전체적 소실을 제공한다 (하기 표 9 참조).
rHuPH20 활성에 대한 글리코시다제 처리의 유효성
rHuPH20 (U/ ml ) Control PH20 EndoF1 EndoF2 EndoF3 EndoH EndoF1 ,F2,F3,H PNGaseF
1.0000 0.3195 0.2983 0.2573 0.2965 0.2144 1.9315
0.2000 0.7910 0.7656 0.6048 0.5880 0.7435 0.5366 1.9173
0.0400 1.4299 1.3450 1.3117 1.2255 1.3584 1.3877 1.9926
0.0080 1.8397 1.7338 1.6900 1.6698 1.6998 1.8418 1.9172
실시예 8
글리코실화 저해제를 이용한 인간 PH20 히알루로니다제 의 처리
본 실시예에서, rHuPH20 (서열번호122) 는 각각의 두 글리코실화 저해제의 존재 하에 일시적으로 발현시켜, 히알루로니다제 분비 및 활성을 평가했다. 키푸넨신 (Kifunensine) 은 글리칸 프로세싱에 수반되는 효소로, 강력한 저해제 만노시다제 I 이다 (참고문헌은, 예를 들어 Elbein 등, Biol Chem, 265:15599-15605 (1990)). 투니카마이신은 효소 GlcNAc 포스포-트랜스퍼라아제 (GPT) 를 저해함으로써, 모든 N-글리칸의 합성을 차단하는 동종성 뉴클레오시드 항생제의 혼합물이다 (참고문헌은, 예를 들어 Boehme 등, Eur . J. Biochem. 269:977-988 (2002)).
간략하게, rHuPH20 를 발현하는 1x106 HZ24-2B2 세포 (하기 실시예 14 참조) 를 2 개의 125 ml 플라스크 중의 24 mL 완전 CD-CHO 배지에 시딩했다. 투니카마이신 (DMSO 에 용해) 또는 키푸넨신 (물에 새롭게 용해시킴) 을 최종 농도 5 ㎍/mL 로 첨가했다 (12 ㎕ DMSO 포함). 대조군으로서, 한 개의 플라스크에는 rHuPH20 를 발현하는 1x106 HZ24-2B2 를 시딩하고, 12 ㎕ DMSO 를 비히클 대조군으로서 첨가했다. 투니카마이신 또는 키푸넨신의 첨가에 후속하여, 세포를 4 내지 6 시간 동안 37℃ 에서 5% CO2 로 인큐베이션했다. 발현 후, 2 mL 배양물을 떠 내고, 5 분 동안 500g 에서 원심분리했다. 상청액을 4℃ 에서 저장하고, 세포 펠렛을 -20℃ 에서 저장했다. 남아있는 22 mL 배양물을 5 분 동안 500 g 에서 원심분리했다. 상청액을 4℃ 에서 저장했다. 세포를 본래의 두 125 ml 플라스크 내 22 mL 완전 CD-CHO 배지에 재현탁시켰다. 투니카마이신 또는 키푸넨신을 배양물에 최종 농도 5 ㎍/mL 로 첨가하고, 세포를 37℃ 에서 5% CO2 로 인큐베이션했다. 2 mL 배양물을 각각의 플라스크에서 배지 교체 후 대략 매 24 시간마다 떠 냈다. 각 시점에서, 상청액을 4℃ 에서 저장하고, 세포 펠렛을 -20℃ 에서 저장했다. rHuPH20 의 발현은 웨스턴 블랏 분석으로 분석했고, 히알루로니다제 활성은 바이오틴화된 HA 효소 검정 (상기 실시예 3 및 6 에 기재된 바와 같음) 을 이용해 측정했다.
결과는 하기 표 10 내지 13 에 나타냈는데, 이는 살아있는 세포의 갯수 및 PH20 활성을 제시한다. 표 10 내지 11 에 나타낸 바와 같이, 투니카마이신은 조직 배양 배지 및 세포 내부 모두에서 PH20 활성을 억제하고, 또한 세포 생활성의 완전한 소실을 결과로 제공한다. 추가적으로, 투니카마이신을 이용한 1 시간 동안의 처리는, 세포 펠렛 분획에서 분자량 약 56 kDa 로의 SDS-PAGE 이동성 변동으로 측정된 바와 같이, 세포 내부에서 탈글리코실화된 인간 PH20 히알루로니다제의 축적을 결과로 제공했다. 표 12 내지 13 에 제시된 바와 같이, 키푸넨신은 PH20 의 활성에 전혀 영향을 주지 않는 반면, 블랏 분석은 키푸넨신이 처리된 세포에서 rHuPH20 의 분비 및 발현을 억제한다는 것을 밝혀냈다.
조직 배양 배지에서 세포 생존성 및 PH20 활성에 대한 투니카마이신의 효과
경과시간
(시간) 		투니카마이신 처리 투니카마이신 미처리
생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL ) 		생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL )
0 1.04 0.50 1.04 0.00
1 1.04 2.80 1.04 1.50
2 1.04 5.00 1.04 3.00
4 0.910 8.80 1.30 7.00
25 1.08 5.80 1.32 82.50
49 0.200 6.80 2.72 171.30
73 0.080 7.80 3.80 331.00
91 0 7.50 6.25 313.30
세포 펠렛에서 세포 생존성 및 PH20 활성에 대한 투니카마이신의 효과
경과시간 (시간) 투니카마이신 처리 투니카마이신 미처리
생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL ) 		생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL )
0 1.04 34.50 1.04 35.00
1 1.04 38.00 1.04 38.10
2 1.04 34.00 1.04 36.60
4 0.910 18.00 1.30 31.90
25 1.08 1.00 1.32 14.40
49 0.200 0.80 2.72 33.10
73 0.080 0.30 3.80 67.50
91 0 0.30 6.25 79.40
조직 배양 배지에서 세포 생존성 및 PH20 활성에 대한 키푸넨신의 효과
경과시간 (시간) 키푸넨신 처리 키푸넨신 미처리
생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL ) 		생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL )
0 1 0.4 1 0.45
6 1 23.85 1 15.75
24 1.2 129.6 1.4 75.6
50 2.1 299.7 2.4 206.55
72 3 535.95 4.4 444.15
96 3.7 945 6.3 726.3
144 5.8 2968.65 8.5 2241
세포 펠렛에서 세포 생존성 및 PH20 활성에 대한 키푸넨신의 효과
경과시간 (시간) 키푸넨신 처리 키푸넨신 미처리
생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL ) 		생존 세포
(x10 6 ) 		PH20 활성
(U/ mL )
0 1 22.25 1 23
6 1 21.25 1 27
24 1.2 27.75 1.4 14.45
50 2.1 43 2.4 26
72 3 98.75 4.4 52.75
96 3.7 208.75 6.3 167.5
144 5.8 497.25 8.5 107
실시예 9
렉틴 내성 CHO 돌연변이에서의 rHuPH20 의 일시적 발현
본 실시예에서, rHuPH20 를 4 개의 렉틴 내성 CHO 돌연변이에서 일시적으로 발현시키고, 히알루로니다제 분비 및 활성을 평가했다. 렉틴 내성 CHO 돌연변이를 하기 표 14 에 요약했다. Pro-5 세포에는 갈락토실트랜스퍼라아제 β4galT-6 가 결핍되어 있어, 갈락토실화된 N-글리칸의 감소가 초래된다 (참고문헌은, 예를 들어, Lee 등 J. Biol . Chem. 276:13924-13934 (2001)). Lec1 에는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 I 활성이 결핍되어 있어, 복합체 또는 하이브리드 글리칸을 합성하지 않는다 (참고문헌은, 예를 들어, Chen and Stanley, Glycobiology, 13:43-50 (2003)). Lec2 및 Lec8 에는 ER 또는 골지 멤브레인을 통과하여 뉴클레오티드-당을 수송하는 뉴클레오티드-당 수송자가 결핍되어 있다. Lec2 세포는 CMP-시알산 (즉, CMP-NeuAc) 을 이동시킬 수 없고, 따라서 아시알로 (asialo) 세포 표면의 발현을 초래한다 (참고문헌은, 예를 들어 Eckhardt 등, J. Biol . Chem. 273:20189-20195 (1998)). Lec8 세포는 UDP-갈락토오스를 이동시킬 수 없고, 따라서 갈락토오스가 전혀 없는 글리칸을 제공한다 (참고문헌은, 예를 들어, Bakker 등, Glycobiology, 15:193-201 (2005)).
렉틴 내성 CHO 돌연변이체
CHO 주 생화학적 변화 유전자적 변화
Pro-5 (부모) N-글리칸 상에서 ↓Gal β4gal6 발현 없음
Lec1 ↓GlcNAc-TI Mgat1 에서 ORF삽입/결실
Lec2 ↓CMP-시알산 골지 수송자 Slc35a1 ORF 에서 돌연변이
Lec8 ↓UDP-Gal 골지 수송자 Slc35a2 ORF 에서 돌연변이
간략히, PH20sHis (His-태그된 PH20 를 인코딩, 서열번호 187) 를 상기 실시예 2A 에 기재된 바와 같이 Lec1 (Cat No. CRL-1735, ATCC), Lec2 (Cat No. CRL-1736, ATCC), Lec8 (Cat No. CRL-1737, ATCC) 및 Pro-5 (Cat No. CRL-1781) 를 포함하는 렉틴 내성 CHO 돌연변이의 각각의 4 가지 균주에서 일시적으로 발현시켰다. 추가적으로, HZ24-mut(B/S) (아미노산 482 에서 절단된 PH20 를 인코딩, 서열번호122) 를 Pro-5 세포에서 일시적으로 발현시키고, 음성 대조군으로서 Pro-5 세포를 mock 형질전환에 적용했다. 결과로서 수득한 세포 배양물 배지를 웨스턴 블랏으로 분석하고, 히알루로니다제 활성을 바이오틴화 HA 효소 검정 (상기 실시예 3 및 5 에 기재된 바와 같음) 을 이용해 측정했다.
결과는, Lec 돌연변이에서 발현된 rHuPH20 가, 약 66 kDa 에서의 단백질 밴드로 증명되는 바와 같이 배지로 분비된다는 것을 보여준다. bHA 효소 검정의 결과는 하기 표 15 에 제시되는데, 이는 렉틴 내성 CHO 돌연변이, 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 PH20 인코딩 플라스미드, 및 1:27 및 1:81 희석의 두 경우 모두에서의 pH 5.5 일 때 PH20 활성을 제시한다. Lec 돌연변이 세포에 의해 발현되는 rHuPH20 는 효소적으로 활성이다.
Lec 돌연변이 세포에서 일시적으로 발현되는 rHuPH20 의 PH20 활성 (U/ mL )
렉틴
돌연변이 		Pro -5 Pro -5 Lec1 Lec2 Lec8 Pro -5
플라스미드 HZ24 - mut (B/S) HZ24 - PH20sHis HZ24 - PH20sHis HZ24 - PH20sHis HZ24 - PH20sHis Mock 형질전환
PH20 활성 (1:27) 0.6615 0.297 0.54 0.675 0.2565 0.081
PH20 활성 (1:81) 1.1745 0.6075 0.7695 1.053 0.567 0.1215
실시예 10
인간 PH20 히알루로니다제 N- 글리코실화 부위의 부위-지정 돌연변이생성
본 실시예에서, N-글리칸 부위 특이적 인간 PH20 히알루로니다제 탈글리코실화 돌연변이를 생성하고, 그의 분비 패턴 및 히알루로니다제 효소 활성을 평가했다. N-글리칸 부위 특이적 탈글리코실화 돌연변이 및 글리칸 유형을 하기 표 6 에 제시한다.
PH20sHis (서열번호 210) 를 QuikChange
Figure pct00016
Site-Directed Mutagenesis Kit (Cat No. 200518, Stratagene) 를 이용해 각 아스파라긴 잔기를 알라닌으로 돌연변이화하기 위한 템플레이트로 이용했다. 템플레이트 DNA 에 의해 인코딩되는 단백질은 PH20sHis (서열번호 187) 에 해당하는데, 이는 아미노산 S490 뒤에 HexaHis 태그 (서열번호 142) 를 포함하는 인간 PH20 클론이다. 야생형 PH20sHis 및 탈글리코실화된 돌연변이는 표 16 에 제시한다. 6 개의 단일 돌연변이가 생성되었고, 이들은 각각 N-글리코실화 부위에 대한 것이다. 추가적으로, 3 개의 이중 돌연변이 및 삼중 돌연변이가 아스파라긴 N82, N166 및 N254 에 대해 생성되었고, 이들은 전부 복합체 유형 글리칸에 의해 점유된다. 최종적으로, 이중 돌연변이 N368A/N393A 가 생성되었는데, 이는 고 만노스 글리칸이 결핍되어 있다. 돌연변이들은 CHO-S 세포로 형질전환했고, 발현은 실시예 2A 에 기재된 바와 같이 수행했다. 배지로의 분비 및 히알루로니다제 활성은 상기 실시예 3 및 5 에 기재된 바와 같이 결정했다.
결과는 하기 표 16 에 제시하며, 이는 돌연변이, 글리칸 유형, 단백질이 배지로 분비되는지 여부 및, pH 5.5 및 pH 7.4 의 두가지 모두에서의 히알루로니다제 활성을 제시한다. 웨스턴 블랏 분석은 잔기 N82, N166, N235 및 N254 의 돌연변이가 rHuPH20 단백질의 배지로의 분비에 영향을 주지 않음을 보여줬다. 대안적으로, 잔기 N368A 및 N368A/N393A 에서의 돌연변이는 배지 내 약 66 kDa 단백질의 결손으로 증명되는 바와 같이 PH20 발현 및 분비를 막는다. 잔기 N393A 의 돌연변이는 단백질 발현 감소를 결과로 제공하나, 약 66 kDa 에서의 단백질 밴드로 증명되는 바와 같이 rHuPH20 이 배지에서 관찰되었다. 잔기 N82, N166 및/또는 N254 의 돌연변이는 rHuPH20 활성에 영향을 주지 않았다. 이들 잔기들은 복합체 글리칸에 의해 점유된다. 대조적으로, 잔기 N235, N368 및/또는 N393 의 돌연변이는, 고 만노스 글리칸을 포함하는데, 분비의 결손으로 인해 배지 내 검출가능한 활성이 완전히 소실되는 결과를 가져왔다.
인간 PH20 히알루로니다제 탈글리코실화 돌연변이체
돌연변이체 서열번호 글리칸 유형 분비 활성
pH 5.5 		활성
pH 7.4
PH20sHis (parent) 187 둘다 있음 있음 있음
N82A 202 복합체 있음 있음 있음
N166A 203 복합체 있음 있음 있음
N235A 204 고 만노스 (80%)
복합체 (20%)		 있음 없음 없음
N254A 205 복합체 있음 있음 있음
N368A 188 고 만노스 없음 없음 없음
N393A 189 고 만노스 있음
(약함)		 없음 없음
N82A/N166A 206 복합체 있음 있음 있음
N82A/N254A 207 복합체 있음 있음 있음
N166A/N254A 208 복합체 있음 있음 있음
N82A/N166A/N254A 209 복합체 있음 있음 있음
N368A/N393A 190 고 만노스 없음 없음 없음
항-PH20 항체를 이용한 CHO 세포의 면역형광 분석은 N-글리칸 부위 특이적 탈글리코실화 돌연변이 N368A, N393A 및 N368A/N393A 의 발현을 시각적으로 확인하기 위해 이용했다. CHO 세포는 단층 배양을 위해 10 % 우태아 혈청 (FBS) 을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 의 ml 당 2.5 x 104 세포 200 ㎕ 를 8-웰 챔버 슬라이드 상에 시딩해, 5 % CO2 의 가습 분위기에서 37℃ 에서 배양했다. 36 시간 후 80% 컨플루언시에서, LipofectamineTM2000 (Invitrogen) 을 이용해 다음과 같이 세포를 형질전환했다. DNA (혈청이 없는 DMEM 50 ㎕ 내 0.4 ㎍) 및 LipofectamineTM2000 (혈청이 없는 DMEM 내 1 ㎕) 를 조심스럽게 20 분 동안 실온에서 혼합한 후, 세포 및 100 ㎕ 무혈청 배지를 포함하는 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 앞뒤로 조심스럽게 흔들어 혼합했다. 이어서, 세포를 CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 로 4 내지 6 시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 10% FBS 를 포함하는 배지로 교체했다. 형질전환 48 시간 후, 챔버 슬라이드 상의 세포를 4% 파라포름알데히드를 이용해 15 분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS 로 3 회 세척하고, 200 ㎕ 의 1% NP-40/PBS 용액을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 세포를 PBS 로 3 회 세척하고, 면역표지하기 전에 4℃ 에서 저장했다.
세포를 면역표지하기 위해, 시료를 15 % 일반 염소 혈청을 이용해 30 분 동안 실온에서 블로킹했다. 세포를 PBS 중 5% 일반 염소 혈청 중의 항-PH20 토끼 IgG 의 1:20 용액과 인큐베이션했다. 최종적으로, 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, FITC-접합된 염소 항-토끼 IgG 와 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 보일 수 있게 처리했다. 추가로, 마운팅 용액 (mounting solution) 은 DAPI 를 포함하여, 핵 염색을 가능케 했다. 항-PH2O 항체를 이용한 면역형광 분석은 N368A 및 N393A 돌연변이가 PH20 로 하여금 세포 내부에 축적되게끔 한다는 것을 보여줬다.
N- 글리코실화 연구의 요약
상기 실시예 7 내지 10 에 제시한 바와 같이, N-연결된 글리코실화는 rHuPH20 의 적절한 폴딩 및 효소 활성을 위해 핵심적이다. PNGaseF 를 이용한 철저한 소화에 의해 또는 투니카마이신을 이용한 처리에 의한 생합성 동안의 글리코실화의 저해에 의해 유효하게 되는 rHuPH20 의 완전한 탈글리코실화는 검출가능한 효소 활성을 전부 없엔다. 추가로, 비-글리코실화된 rHuPH20 는 세포 내에 축적되는 것으로 나타났다. 대조적으로, 키푸넨신을 이용한 처리에 의해 또는 Lec 돌연변이에서의 발현에 의해 유효하게 되는 부분적으로 탈글리코실화된 rHuPH20 는 효소 활성을 보유한다. 최종적으로, 부위-지정 돌연변이생성을 이용한 상세한 돌연변이 분석은, 고 만노스 유형 글리칸이 가용성이고 효소적으로 활성인 rHuPH20 의 제조에 필수적임을 밝혀냈다.
실시예 11
가용성 rHuPH20 발현 세포주의 제조
HZ 플라스미드 (서열번호 140에 제시)는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들면, 미국출원번호 10,795,095, 11/065,716 및 11/238,171 참조)를 형질감염하기 위해 사용되었다. 가용성 rHuPH20을 발현하기 위한 HZ24 플라스미드는 pCI 벡터 골격(Promega), 인간 PH20 히알루로니다제(서열번호 110)의 아미노산 1-482를 암호화하는 DNA, ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 함유한다. 또한, pCI 벡터 골격은 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, f1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 극-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV), 키메라 인트론 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐레이션 신호(SV40)을 포함한다. 가용성 rHuPH20 구축물을 인코딩하는 DNA는 인간 PH20 의 고유의 35 아미노산 신호 서열의 아미노산 위치 1의 메티오닌을 인코딩하는 DNA 앞에 NheI 부위 및 코작 공통서열, 및 서열번호 107에 제시된 인간 PH20 히알루로니다제의 아미노산 위치 482에 상응하는 타이로신을 인코딩하는 DNA 뒤에 정지코돈, 이어서 BamHI 제한부위를 함유한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ-24)는 내부 리보솜성 부착부위(IRES)에 의해 분리된, 인간 PH20의 아마노산 1-482(서열번호 109에 제시) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제의 아마노산 1-186(서열번호 141에 제시)를 인코딩하는, CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA 종을 생성한다.
4mM 글루타민 및 18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장시킨 비-형질감염된 DG44 CHO 세포를 형질감염을 위해 준비된 진탕 플라스크에 0.5x106 세포/ml로 접종하였다. 세포들을 120rpm으로 진탕하면서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 대수적으로 성장한 비-형질감염된 DG44 CHO 세포의 생존력을 형질감염 이전에 측정하였다.
비-형질감염된 DG44 CHO 세포배양물의 6천만개 생존세포를 펠렛화하고, 2x 형질감염 완충액(2x HeBS: 40mM pH 7.0 Hepes, 274mM NaCl, 10mM KCl, 1.4mM Na2HPO4, 12mM 덱스트로즈) 0.7mL에 2×107 세포의 밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각 분액에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)으로 하룻밤 동안 소화시켜 선형화됨) 0.09mL(250μg)을 첨가하고, 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4cm gap BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳 내로 옮겼다. 음성대조군 전기천공을 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않고 수행하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF 또는 350V 및 960μF 의 캐패시터 방전으로 전기천공하였다.
전기천공 후에 큐벳으로부터 세포를 제거하고, 4mM 글루타민 및 18ml Plurionic F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 변형 CD-CHO 배지 5mL 내로 옮겨서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 선별하지 않고 6-웰 조직배양 플레이트의 웰에서 성장하도록 하였다.
전기천공 후 2일에, 조직배양 배지 0.5 mL을 각 웰로부터 제거하여, 실시예 12에 기재된 미세탁도 분석법을 이용하여 히알루로니다제 활성이 있는지를 측정하였다. 결과를 표 17에 나타내었다.
형질감염 40시간 후, HZ24 형질감염 DG44 CHO 세포의 초기 히알루로니다제 활성
희석 활성 유닛/ml
형질감염 1 330V 1 대 10 0.25
형질감염 2 350V 1 대 10 0.52
음성 대조군 1 대 10 0.015
형질감염 2(350V)로부터 세포를 조직배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104개의 생존세포로 희석하였다. 세포현탁액 0.1mL 분액을 5개의 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 하이포크산틴 및 티미딘 보충물 부재의 4mM GlutaMAX™-1 보충물(GIBCO™, Invitrogen Corporation)을 포함한 CD-CHO 배지(GIBCO) 100마이크로리터를 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다(최종부피 0.2mL).
10개의 클론이 메토트렉세이트 부재에서 성장된 5개의 플레이트로부터 확인되었다(표 18).
확인된 클론의 히알루로니다제 활성
플레이트/웰 ID 상대적 희알루로니다제
1C3 261
2C2 261
3D3 261
3E5 243
3C6 174
2G8 103
1B9 304
2D9 273
4D10 302
6개의 HZ24 클론을 배양물 내 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 진탕 플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰당 500개의 비-형질감염 DG44CHO 세포들의 백그라운드에서 성장시켜, 배양물내 초기 몇일 동안 필수적인 성장인자들을 제공하였다. 서브클론당 50nM 메토트렉세이트를 함유하는 5개 플레이트 및 메토트렉세이트 부재의 5개 플레이트의 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3은 24개의 가시적인 서브클론(메토트렉세이트 미처리의 13개 및 50nM 메토트렉세이트 처리의 11개)을 생산하였다. 24개의 서브클론 중 8개의 상청액에서 유의적인 히알루로니다제 활성이 측정되었고(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로부터 분리한 클론을 50nM 메토트렉세이트 존재 하에서 확장시켰다. 클론 3D35M 을 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 진탕 플라스크에서 1,000 유닛/ml 초과로 생산하는 클론을 생산하였다(클론 3D35M; 또는 Gen1 3D35M). 이어서, 3D35M 세포의 마스터 세포 은행(MCB)을 제조하였다.
실시예 12
가용성 rHuPH20 의 히알루로니다제 활성 측정
세포배양물, 정제 분획 및 정제된 용액과 같은 시료내 가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성을 탁도 분석법을 이용하여 측정하였고, 상기 분석은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 불용성 침천물을 형성하는 것에 기초한다. 가용성 rHuPH20을 정해진 기간의 시간(10분) 동안 히알루로네이트(히알루론산) 나트륨과 배양한 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 히알루로네이트 나트륨을 침전시킴으로써 활성을 측정하였다. 생성된 시료의 탁도를 30분의 발달 기간 후에 640nm에서 측정하였다. 히알루로네이트 나트륨 기질에 대한 효소활성에서 유래된 탁도감소는 가용성 rHuPH20 히알루로니다제 활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 분석 작용참조표준(working reference standard)의 희석물로 만들어진 검정곡선을 이용하여 수행하고, 검정곡선과 비교하여 시료활성을 측정하였다.
효소희석용액으로 시료 희석물을 조제하였다. 가수분해된 젤라틴 33.0±0.05mg을 50mM PIPES 반응 완충액(140mM NaCl, 50mM PIPES, pH 5.5) 25.0mL 및 SWFI 25.0mL에 용해하고, 25% 부미네이트 용액 0.2mL을 상기 혼합물 내로 희석하고 30초간 볼텍싱(vortexing)하여 효소희석용액을 준비하였다. 이를 사용하기 2시간 이내에 수행하고, 필요할 때까지 얼음위에서 보관하였다. 시료를 약 1-2U/mL로 희석하였다. 일반적으로, 각 단계당 최대희석은 1:100을 초과하지 않았으며, 초기 희석을 위한 초기 시료의 크기는 20μL 이상이었다. 분석을 수행하는데 필요한 최소 시료부피는: 공정 중 시료, FPLC 분획: 80μL; 조직배양 상청액: 1mL; 농축된 재료 80μL; 정제된 또는 최종단계의 재료: 80μL이었다. 저 단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에서 3반복적으로(triplicate)로 희석하고, 각각의 희석물 30μL를 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겼다.
2.5U/mL 농도의 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물을 효소희석용액으로 준비하여 검정곡선을 작성하고, Optilux 플레이트에 3반복적으로 첨가하였다. 희석물은 0U/mL, 0.25U/mL, 0.5U/mL, 1.0U/mL, 1.5U/mL, 2.0U/mL 및 2.5U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60μL를 포함한“공시약(Reagent blank)”웰을 음성대조군으로서 플레이트에 포함시켰다. 그리고 나서 플레이트를 덮고, 37℃에서 5분 동안 열블록(heat block)으로 가온하였다. 덮개를 제거하고 플레이트를 10초간 진탕하였다. 진탕후, 플레이트를 열블록에 되돌려 두고, MULTIDROP 384 액체 핸들링 장치를 SWFI 20.0mL내 가온한 0.25mg/mL 히알루로네이트 나트륨 용액(100mg 히알루로네이트 나트륨(LifeCore Biomedical)을 용해함으로써 제조됨)으로 프라이밍하였다. 이를 2 내지 4시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지, 2 내지 8℃에서 부드럽게 회전시키거나/시키고 흔들어 혼합하였다. 반응 플레이트를 MULTIDROP 384로 옮기고, 시작키를 눌러서 각 웰 내로 히알루로네이트 나트륨 30μL를 분주하여 반응을 개시하였다. 그 다음 플레이트를 MULTIDROP 384로부터 제거하고, 플레이트 덮개를 교체하고, 열블록으로 옮기기 전에 10초간 진탕하였다. 37℃에서 10분간 플레이트를 배양하였다.
혈청 작용용액(serum working solution)으로 기계를 프라이밍하고 240μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 MULTIDROP 384를 준비하였다(500mM 아세테이트 완충용액 75mL 내 혈청 저장용액 25mL[1부피의 말 혈청(Sigma)을 9부피의 500mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정]). 플레이트를 열블록으로부터 제거하여 MULTIDROP 384 위에 놓고, 혈청 작용용액 240μL를 웰로 분주하였다. 플레이트를 제거하고 10초간 플레이트 리더에서 진탕하였다. 추가 15분후에, 시료의 탁도를 640nm에서 측정하고, 각 시료의 효소활성(U/mL로)을 검정곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정하였다.
히알루로니다제 활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나누어 비활성도(U/mg)를 계산하였다.
실시예 13
Gen1 인간 sPH20 의 생산 및 정제
A. 5L 생물반응기 공정
3D35M 바이얼을 해동하고, 진탕 플라스크로부터 100nM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad Calif.)에서 1L 스피너 플라스크를 통하여 확장시켰다. 세포를 ml당 4×105개 생존세포의 접종밀도로 스피너 플라스크로부터 5L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 용존산소 설정점 25% 및 0 내지 100 cc/분의 공기오버레이와 온도설정점 37℃, pH 7.2(시작 설정점)이었다. 168시간에서, 피드#1 배지(50g/L 글루코스를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하였다. 216시간에서, 피드#2 배지(50g/L 글루코스 및 10mM 부티르산 나트륨를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하고, 264시간에서 피드#2 배지 250ml을 첨가하였다. 상기 공정은 6×106 세포/ml의 최대세포밀도와 ml당 1600유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 부티르산 나트륨의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20 생산을 크게 향상시키기 위한 것이었다.
3D35M 클론 유래 조건배지를 10mM pH 7.0 Hepes 내로 심층여과 및 접선유동여과에 의해 정화하였다. 그리고 나서 가용성 rHuPH20을 Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환, 페닐 세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피, 페닐 보로네이트(Prometics) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피(Biorad, Richmond, CA)에서 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Q 세파로즈에 결합된 가용성 rHuPH20을 동일한 완충액으로 400mM NaCl에서 용출시켰다. 용출물을 최종농도 500mM의 암모늄 술페이트가 되도록 2M 암모늄 술페이트로 희석하고, 페닐 세파로즈(low sub) 컬럼을 통과시킨 후, 페닐 보로네이트 레진에 동일한 조건하에 결합시켰다. 가용성 rHuPH20을 암모늄 술페이트 부재의 50mM 비신(bicine)으로 pH 9.0에서 세척한 후에, pH 6.9 Hepes로 페닐 세파로즈 레진으로부터 용출시켰다. 용출물을 5mM 포타슘 포스페이트 및 1mM CaCl2로 pH 6.9에서 세라믹 히드록시아파타이트 레진 상에 로딩하고, 0.1mM CaCl2 함유 80mM pH 7.4 포타슘 포스페이트로 용출시켰다.
생성된 정제된 가용성 rHuPH20은 USP 참조 표준(reference standard)을 이용한 미세탁도 분석방법(실시예 12)에 의해 65,000 USP 유닛/mg 단백질 초과의 비활성도(specific activity)를 보유하였다. 정제된 sPH20는 0.1% TFA/H2O 내지 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H20 사이의 구배를 가지는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 컬럼으로부터 24분 내지 26분까지 단일피크로서 용출되었고, SDS 전기영동에 의해 하나의 넓은 61kDa 밴드로서 나타났으며, 이는 PNGASE-F 처리시 선명한 51kDa 밴드로 감소되었다. N-말단 아미노산 서열분석은 리더 펩티드가 효율적으로 제거되었음을 보여주었다.
B. 100L 생물반응기 세포배양으로의 상류 세포배양 확장 공정
스케일-업(규모확대) 공정을 이용하여 3D35M 세포의 4개의 다른 바이알로부터 가용성 rHuPH20를 별개로 정제하여 sHuPH20의 4개의 분리된 배치를 생산하였다; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C 및 HUA0420C. 각각의 바이알을 별개로 확장시키고, 125L 생물반응기를 통하여 배양한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 전과정 동안 시료를 취하여 효소 수득률과 같은 파라미터를 평가하였다. 하기 제공되는 공정의 설명은 생물반응기 개시와 피드배지 부피, 이동 세포밀도, 및 세척과 용출부피와 같은 것들에 대한 대표적인 설명을 나타낸다. 정확한 수는 각 배치마다 약간씩 다르며, 표 24 내지 30 에 상세히 나와 있다.
3D35M 세포의 4개의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 40mL/L GlutaMAX가 함유된 CD CHO를 첨가하고, 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL을 함유한 125mL 진탕 플라스크에서 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 진탕 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 5L 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 20L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
125L 반응기를 121℃, 20PSI에서 증기로 멸균하고, CD CHO 배지 65L를 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 36L 스피너 플라스크 내 세포밀도가 1.8 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 20L 세포배양물을 36L 스피너 플라스크로부터 125L 생물반응기(Braun)로 옮겨, 최종부피는 85L, 파종밀도(seeding density)는 약 4×105 세포/mL를 얻었다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; pH:7.2; 용존산소:25%±10%; 임펠러(Impeller) 속도 50rpm; 용기압력 3psi; 공기분사 1L/분; 공기오버레이: 1L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류(retention)를 위해 매일 반응기를 샘플링하였다. 가동 동안에 영양분 피드(feeds)를 첨가하였다. 6일에, 피드#1 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1) 3.4L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 9일에, 피드#2 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.5L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 11일에, 피드#3 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.7L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 14일에서 또는 세포의 생존률이 50% 이하로 감소됐을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정 결과, 8백만 세포/mL의 최대세포밀도와 1600유닛/ml의 효소활성을 가지는 가용성 rHuPH20이 생산되었다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마(mycoplasma), 미생물부하도(bioburden), 내독소(endotoxin), 바이러스, 바이러스 입자를 위한 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
100리터 생물반응기 세포배양 수확물을 폴리에테르설폰 배지(Sartorius)를 가지는 일련의 일회용 캡슐필터를 통하여 먼저 8.0μm 심층캡슐, 0.65μm 심층캡슐, 0.22μm 캡슐을 통과, 그리고 최종적으로 0.22μm Sartopore 2000cm2 필터를 통과시켜 100L 멸균 저장백 내로 여과하였다. 배양물을 스피랄 폴리에테르설폰 30kDa MWCO 필터(Millipore)가 있는 2개의 TFF를 이용하여 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 20L 멸균 저장백 내로 10mM HEPES, 25mM Na2SO4, pH 7.0으로 6× 완충액-교환하였다. 표 19는 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
세포배양, 수확, 농축 및 완충액 -교환단계와 관련된 모니터링 데이타
파라미터 HUA0406C HUA04010C HUA0415C HUA0420C
해동부터 100 생물반응기 접종까지 시간(일) 21 19 17 18
100 L 접종 밀도 (×106 세포/mL) 0.45 0.33 0.44 0.46
대수적 성장에서 배가 시간 (hr) 29.8 27.3 29.2 23.5
최대 세포 밀도 (×106 세포/mL) 5.65 8.70 6.07 9.70
수확물 생존률 (%) 41 48 41 41
수확물 역가 (U/ml) 1964 1670 991 1319
100-L 생물반응기 내 시간
(일)		 13 13 12 13
정화된 수확물 부피 (mL) 81800 93300 91800 89100
정화된 수확물 효소 분석 (U/mL) 2385 1768 1039 1425
농축 효소 분석 (U/mL) 22954 17091 8561 17785
완충액 교환 농축 효소 분석 (U/mL) 15829 11649 9915 8679
여과된 완충액 교환 농축 효소 분석 (U/mL) 21550 10882 9471 8527
완충액 교환 농축 부피(mL) 10699 13578 12727 20500
비율 효소 유닛/수확물 0.87 0.96 1.32 1.4
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(3L 레진, 높이=20cm, 직경=14cm)을 준비하였다. pH, 전도도(conductivity) 및 내독소(LAL)를 측정하기 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 평형화하였다. 농축되고 정용여과(diafiltered)된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM Hepes, 50mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10mM Hepes, 400mM NaCl, pH 7.0으로 단백질을 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통하여 여과하였다.
다음에 페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(9.1L 레진, 높이=29cm, 직경=20cm)을 준비하였다. 컬럼 부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 상기 단백질 용출물을 2M 암모늄 술페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 저장용액으로, 최종농도가 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM이 되도록 보충하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트 및 0.1mM CaCl2 pH 7.0을 100cm/시간으로 첨가하였다. 상기 통과물(flow through)을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 거쳐 통과시켰다.
컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트로 평형화된 아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMedics)(6.3L 레진, 높이=20cm, 직경=20cm)상에 PS-정제된 단백질을 로딩하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 컬럼을 통과시키고, 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 그리고 나서 20mM 비신, 100mM NaCl, pH 9.0으로 컬럼을 세척하고, 단백질을 멸균필터를 통하여 20L 멸균백 내로 50mM Hepes, 100mM NaCl pH 6.9로 용출시켰다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)(1.6L 레진, 높이=10cm, 직경=14cm)을 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화하였다. 세척시료를 수확하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 포타슘 포스페이트 및 CaCl2를 보충하여 최종농도가 5mM 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2를 수득하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척한 다음, 10mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 5L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통하여 여과하였다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 압력탱크를 거쳐 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 펌핑하였다. 단백질을 DV20 압력탱크 및 필터(Pall Corporation)에 첨가하고, 멸균 20L 저장백 내로 20nm 구멍이 있는 Ultipor DV20 필터(Pall Corporation)를 통과시켰다. 여과물의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 시알산(sialic acid) 프로파일 및 공정-관련 불순물을 측정하였다. 그다음 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 1mg/mL로 농축하였다. Hepes/식염수 용액(10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0)으로 세척함으로써 먼저 필터를 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과액을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0으로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 거쳐 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프히드릴기, 올리고당 프로파일 및 삼투압을 측정하였다.
표 20 내지 26은 각각의 3D35M 세포 로트(lot)에 대한, 상기에서 기술된 각각의 정제단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
Q 세파로스 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로딩 부피 (mL) 10647 13524 12852 20418
로딩 부피/레진 부피 비 3.1 4.9 4.5 7.3
컬럼 부피 (mL) 2770 3840 2850 2880
용출물 부피 (mL) 6108 5923 5759 6284
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 2.8 3.05 2.80 2.86
용출물 효소 분석 (U/mL) 24493 26683 18321 21052
효소 수득율 (%) 65 107 87 76
페닐 세파로스 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
저장 용액 첨가 전 부피 (mL) 5670 5015 5694 6251
로딩 부피 (mL) 7599 6693 7631 8360
컬럼 부피 (mL) 9106 9420 9340 9420
로딩 부피/레진 부피 비율 0.8 0.71 0.82 0.89
용출물 부피 (mL) 16144 18010 16960 17328
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.4 0.33 0.33 0.38
용출물 효소 분석 (U/mL) 8806 6585 4472 7509
단백질 수득율 (%) 41 40 36 37
단백질 수득율 (%) 102 88 82 96
아미노페닐 보로네이트 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로딩 부피 (mL) 16136 17958 16931 17884
로딩 부피/레진 부피 비율 2.99 3.15 3.08 2.98
컬럼 부피 (mL) 5400 5700 5500 5300
용출물 부피 (mL) 17595 22084 20686 19145
용출물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.0 0.03 0.03 0.04
여과된 용출물의 단백w질 농도 (mg/mL) 시험되지 않음 0.03 0.00 0.04
용출물 효소 분석 (U/mL) 4050 2410 1523 4721
효소 수득율 (%) 0 11 11 12
효소 수득율 (%) 결정되지 않음 41 40 69
히드록시아파타이트 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
저장 용액 첨가 전 부피 (mL) 16345 20799 20640 19103
로딩 부피/레진 비율 10.95 13.58 14.19 12.81
컬럼 부피 (mL) 1500 1540 1462 1500
로딩 부피 (mL) 16429 20917 20746 19213
용출물 부피 (mL) 4100 2415 1936 2419
용출물 단백질 농도 (mg/mL) 시험되지 않음 0.24 0.17 0.23
여과된 용출물의 단백질 농도 (mg/mL) NA NA 0.17 NA
용출물 효소 분석 (U/mL) 14051 29089 20424 29826
단백질 수득율 (%) 시험되지 않음 93 53 73
효소 수득율 (%) 87 118 140 104
DV20 여과 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
시작 부피 (mL) 4077 2233 1917 2419
여과물 부피 (mL) 4602 3334 2963 3504
여과물 단백질 농도 (mg/mL) 0.1 NA 0.09 NA
여과된 용출물의 단백질 농도 (mg/mL) NA 0.15 0.09 0.16
단백질 수득율 (%) 시험되지 않음 93 82 101
최종 농도 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
시작 부피 (mL) 4575 3298 2963 3492
농축물 부피(mL) 562 407 237 316
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.9 1.24 1.16 1.73
단백질 수득율 (%) 111 102 103 98
최종 제형으로 완충액 교환 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
시작 부피 (mL) 562 407 237 316
완충액 교환 농축물 최종 부피 (mL) 594 516 310 554
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 1.00 0.97 0.98 1.00
여과된 농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.95 0.92 0.95 1.02
단백질 수득율 (%) 118 99 110 101
정제되고 농축된 가용성 rHuPH20 단백질을 5mL 및 1mL 충전부피(fill volume)의 멸균 바이알에 무균 충전하였다. 단백질을 조작자-제어 펌프로 0.22μm 필터를 거쳐 통과시키고, 상기 펌프는 중량판독(gravimetric readout)을 이용하여 바이알을 충전하는데 사용된다. 바이알의 마개를 닫고, 가열한 캡으로 고정하였다. 닫힌 바이알의 외부입자를 가시적으로 검사하고, 라벨을 붙였다. 라벨링 후, 바이알을 1분 이하 동안 액체질소에서 담가서 급속동결시켜 -15℃ 이하(-20±5℃)에 보관하였다.
실시예 14
가용성 인간 PH20 ( rHuPH20 )을 함유하는 Gen2 세포의 생산
실시예 13에 기술된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 세대 2(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-함유 배양물로부터 4mM GlutaMAX™-1 및 1.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0μM 메토트렉세이트를 갖는 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 약 4주후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4mM GlutaMAX™-1 및 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(master cell bank: MCB)을 만들고, 후속연구를 위해 동결해서 사용하였다.
4mM GlutaMAX™-1 및 4.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12번째 계대후, 세포를 연구세포은행(RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 배양하였다. 5일후, 배지내 메토트렉세이트 농도는 16.0μM로 증가시키고, 18일후에는 20.0μM로 증가시켰다. 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지내 8번째 계대세포를 4mM GlutaMAX™-1 및 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 5 내지 6주 후 클론을 확인하고, 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대후, 2B2 세포를 연구세포은행(research cell bank: RCB)로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 PH20은 약 206카피/세포의 카피수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈(genomic) 2B2 세포 DNA의 서던블롯 분석은 다음의 제한효소분해 프로파일을 나타내었다: Spe I으로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 네개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 두개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III으로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한개의 단일 혼성화밴드. mRNA 전사물의 서열분석은 상기 유도된 cDNA(서열변호 139)가 예상된 시토신(C) 대신 티미딘(T)인 것으로 관찰된 위치 1131에서 한개의 염기쌍 차이를 제외하고는 참조서열(서열번호 110)과 동일함을 나타냈다. 이는 아미노산 서열상에 영향이 없는 침묵 돌연변이이다.
실시예 15
A. 300L 생물반응기 세포배양에서 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산
HZ24-2B2 바이알을 해동하고, 20μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX-1™ (Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 36L 스피너 플라스크를 통하여 진탕 플라스크로부터 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL이 있는 125mL 진탕 플라스크에 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 진탕 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000mL 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 32L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
400L 반응기를 멸균하고, CD-CHO 배지 230mL을 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30L의 세포를 36L 스피너 플라스크로부터 접종밀도 mL당 4.0x105개 생존세포 및 총부피 260L로, 400L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; 임펠러속도 40 내지 55rpm; 용기압력 3psi; 공기분사 0.5 내지 1.5L/분; 공기오버레이: 3L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한, 가동 동안에 영양분 피드를 첨가하였다. 120시간(5일)에, 피드#1 배지(4×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 160mL/L GlutaMAX™-1 + 83mL/L 이스톨레이트 + 33mg/L rHuInsulin) 10.4L를 첨가하였다. 168시간(7일)에, 피드#2 배지(2×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 80mL/L GlutaMAX™-1 + 167mL/L 이스톨레이트 + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216시간(9일)에, 피드#3 배지(1×CD-CHO + 50g/L 글루코스 + 50mL/L GlutaMAX™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 1.80g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264시간(11일)에, 피드#4 배지(1×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 33mL/L GlutaMAX™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에서, 또는 세포의 생존률이 40% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 12백만 세포/mL의 최대세포밀도와 ml당 17,000 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도, 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경(TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4 내지 8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4 내지 1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 함유하는, 평행의 4개의 밀리스택 여과시스템 모듈 (Millistak filtration system module, Millipore)을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑한 다음, 셀룰로오스 막을, 그다음 0.4 내지 0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore)을 통과후, 그다음 셀룰로오스 막을, 그다음 350L 용량의 멸균 일회용 신축성 백 내로 0.22μm 최종필터를 거쳐 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10mM EDTA 및 10mM 트리스로 pH 7.5 까지 보충하였다. 4개의 Sartoslice TFF 30kDa 분자량 차단(MWCO) 폴리에테르 설폰(PES) 필터(Sartorious)를 이용하여 접선유동여과(TFF) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 50L 멸균 저장백 내로 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 정용여과된 수확물을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% 트리톤® X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP) 용액을 준비하였다. 농축되고 정용여과된 수확물을 Q 컬럼에서 정제하기 직전 36L 유리 반응용기에서 1시간 동안 1% 트리톤® X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
B. Gen2 가용성 rHuPH20 의 정제
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(9L 레진, H=29cm, D=20cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화후, 농축되고 정용여과된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM Hepes, 50mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10mM Hepes, 400mM NaCl, pH 7.0을 가지고 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도, 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 판독하였다.
페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 다음으로 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(19 내지 21L 레진, H=29cm, D=30cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, 0.1mM CaCl2, pH7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 컬럼으로부터 단백질 용출물을 2M 암모늄 술페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 저장용액으로 보충하여, 최종농도 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM 를 수득하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼 통과물(flow thru)을 수집하였다. 컬럼을 100cm/시간으로 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트 및 0.1mM CaCl2 pH7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과물에 첨가하였다. 컬럼 세척물과 합쳐진, 통과물을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 거쳐 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과물을 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼(Promtics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과물을 100cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, pH7.0으로 세척하였다. 컬럼을 20mM 비신, 0.5M 암모늄 술페이트, pH9.0으로 세척하였다. 컬럼을 20mM 비신, 100mM 염화나트륨, pH9.0으로 세척하였다. 단백질을 50mM Hepes, 100mM NaCl, pH6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 거쳐 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 최종농도 5mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2로 보충하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 5mM 포타슘 포스페이트 pH 7, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 다음에 10mM 포타슘 포스페이트 pH 7, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 거쳐 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 바이러스 제거필터를 통과시켰다. 멸균 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 70mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0 2L로 세척하여 준비하였다. 사용전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다. HAP-정제된 단백질을 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0 내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 거쳐 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일을 측정하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물을 측정하였다.
다음으로 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 10mg/mL로 농축시켰다. 필터를 먼저 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0으로 세척하여 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과물을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0 내로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 완충액-교환후, 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프하이드릴기, 올리고당 프로파일 및 삼투압을 측정하였다.
그리고 나서 멸균여과된 벌크 단백질을 30mL 멸균 테프론 바이알(Nalgene) 내로 20mL씩 무균적으로 분주하였다. 그다음 바이알을 급속동결시키고, -20±5℃에서 보관하였다.
C. Gen1 가용성 rHuPH20 및 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산과 정제의 비교
300L 생물반응기 세포배양물내 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제는 100L 생물반응기 세포배양물 내 Gen1 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제(실시예 13.B에 기술됨)와 비교하여 프로토콜상의 약간의 변화가 있다. 표 27은 상기 방법 간에 단순한 스케일업 변화뿐만 아니라 방법의 차이를 제시한다.
공정 차이 Gen1 가용성 rHuPH20 Gen2 가용성 rHuPH20
세포주 3D35M 2B2
세포 접종물 확장에 사용된 배지 0.10 μM 메토트렉세이트 (0.045 mg/L) 함유 20 μM 메토트렉세이트 (9 mg/L) 함유
6L 배양물 내 배지
계속		 0.10 μM 메토트렉세이트 함유 메토트렉세이트 함유
36 L 스피너 플라스크 기계 없음




20 L 조작 부피		 pH, 용존산소, 분사 및 오버레이 가스 유속을 모니터링하고 조절하는 기구 장착

32 L 조작 부피
생물반응기 내 최종 조작 부피 125 L 생물반응기 내 약 100 L
(초기 배양 부피 + 65 L)		 400L 생물반응기 내 약 300 L
(초기 배양 부피 + 260L)
최종 생물반응기 내 배양 배지 rHuInsulin 없음 5.0 mg/L rHuInsulin
배지 피드 부피 생물반응기 세포배양물 부피의 4%, 즉, 3.4, 3.5 및 3.7 L로 조정하여, ~92 L 의 표적 생물반응기 부피 생산 생물반응기 세포배양물 부피의 4%, 즉, 10.4, 10.8, 11.2 및 11.7 L로 조정하여, ~303L 의 표적 생물반응기 부피 생산
배지 피드 피드 #1 배지: CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 8mM GlutaMAXTM-1

피드 #2 (CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 8 mM GlutaMAX + 1.1 g/L 부티르산 나트류륨

피드 #3: CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 8 mM GlutaMAX + 1.1 g/L 부티르산 나트륨		 피드 #1 배지: 4×CD CHO + 33 g/L 글루코스 + 32 mM Glutamax + 16.6 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHuInsulin

피드 #2: 2×CD CHO + 33 g/L 글루코스 + 16 mM Glutamax + 33.4 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 부티르산 나트륨

피드 #3: 1×CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 10 mM Glutamax + 50 g/L Yeastolate + 1.80 g/L 부티르산 나트륨

피드 #4:1×CD CHO + 33 g/L 글루코스 + 6.6 mM Glutamax + 50 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 부티르산 나트륨
생물반응기 세포 배양물의 여과 일련의 4개의 폴리에테르설폰 필터 (8.0 ㎛, 0.65 ㎛, 0.22 ㎛ 및 0.22 ㎛)













100 L 저장 백		 1 단계 - 4-8 ㎛ 등급의 규조토층 및 1.4-1.1 ㎛ 등급의 규조토층을 각각 함유한, 평행의 4개의 모듈, 이어서 셀룰로오스막,
2 단계 - 0.4-0.11 ㎛ 등급의 규조토층 및 0.1 ㎛ 미만 등급의 단일 모듈, 이어서 셀룰로오스 막,
3 단계 - 0.22 ㎛ 폴리에테르설폰필터

300L 저장 백

수확된 세포 배양물을 10 mM EDTA, 10 mM 트리스로 pH 7.5 까지 보충
크로마토그래피 전 농축 및 완충액 교환 밀리포어 스피랄 폴리에테르설폰 30K MWCO 필터를 갖는 2 TFF 로 농축

10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 로 6× 농축물을 완충액 교환

20L 멸균 저장 백		 4개의 Sartorius Sartoslice TFF 30K MWCO 필터로 농축

10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 로 10× 농축물을 완충액 교환

50L 멸균 저장 백
크로마토그래피 전 바이러스 불활성화 없음 1% 트리톤® X-100, 0.3% 트리부틸 포스페이트, pH 7.5 의 첨가로 수행된 바이러스 불활성화
1차 정제 단계 (Q 세파로스) 흡광도 판독 안함 시작 및 끝에 A280 측정
크로마토그래피 후 바이러스 여과 Pall DV-20 필터 (20 nm) Sartorius Virosart 필터 (20 nm)
크로마토그래피 후 농축 및 완충액 교환 Hepes/염수 pH 7.0 버퍼

1 mg/ml로 단백질 농축		 히스티딘/염수, pH 6.0 버퍼

10 mg/ml로 단백질 농축
실시예 16
시알산 및 단당류 함량의 결정
가용성 rHuPH20의 시알산 및 단당류 함량을 트리플루오로아세트산에 의한 가수분해 후 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC)에 의해 평가할 수 있었다. 한 예에서, 정제된 히알루로니다제 로트 # HUB0701E (1.2 mg/mL; 본질적으로 실시예 15에 기재된 바와 같이 제조되고 정제됨)의 시알산 및 단당류 함량을 결정하였다. 간단히, 시료 100 ㎍을 100℃에서 4시간 동안 2벌로 40% (v/v) 트리플루오로아세트산으로 가수분해하였다. 가수분해 후, 시료를 건조시키고, 물 300 ㎕에서 재현탁하였다. 각 재현탁된 시료로부터의 분액 45 ㎕를 새로운 튜브로 이동시키고, 건조시키고, 10 mg/mL 아세트산나트륨 용액 10 ㎕를 각각에 첨가하였다. 메탄올 중 30 mg/mL 2-아미노벤조산, 20 mg/mL 나트륨 시아노보로히드라이드, 대략 40 mg/mL 아세트산나트륨 및 20 mg/mL 붕산을 함유하는 용액 50 ㎕를 첨가하여 방출된 단당류를 형광으로 표지하였다. 혼합물을 30분동안 80℃에서 암흑에서 인큐베이션하였다. 이동상 A (0.2% (v/v) n-부틸아민, 0.5% (v/v) 인산, 1% (v/v) 테트라히드로푸란) 440 ㎕를 첨가하여 유도체화 반응물을 켄칭하였다. 물의 매트릭스 블랭크를 또한 음성 대조군으로서 히알루로니다제 시료에 대해 기재된 바와 같이 가수분해하고 유도체화하였다. 옥타데실 (C18) 역상 컬럼 (4.6 x 250 mm, 5 ㎛ 입자 크기; 베이커(J.T. Baker))을 사용하여 RPLC에 의해 방출된 단당류를 분리하고, 형광 검출 (360 nm 여기, 425 nm 방출)에 의해 모니터링하였다. N-D-글루코사민 (GlcN), N-D-갈락토사민 (GalN), 갈락토스, 푸코스 및 만노스를 포함하는 단당류 표준의 크로마토그램과 히알루로니다제 시료로부터의 크로마토그램을 비교하여 단당류 함량을 정량하였다. 표 28은 히알루로니다제 분자 당 각 단당류의 몰비를 제공한다.
가용성 rHuPH20 의 단당류 함량
로트 복제물 GlcN GalN 갈락토스 만노스 푸코스
HUB0701E 1 14.28 0.07* 6.19 25.28 2.69
2 13.66 0.08* 6.00 24.34 2.61
평균 13.97 0.08* 6.10 24.81 2.65
실시예 17
3 D35M 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 의 C-말단 불균질성
100 L 생물반응기 부피의 3D35M 세포 (로트 HUA0505MA) 및 300 L 생물반응기 부피의 2B2 세포 (로트 HUB0701EB)로부터 제조되고 정제된 sHuPH20의 2개의 로트에 대해 C-말단 서열분석을 수행하였다. 아스파르트산 및 시스테인산에서 펩티드 결합을 N-말단에서 특이적으로 절단하는 엔도프로테이나제 Asp-N에 의해 로트들을 개별적으로 소화시켰다. 이는 서열번호 122의 위치 431의 아스파르트산에서 가용성 rHuPH20의 C-말단 부분을 방출시켰다. C-말단 단편을 분리하고, 특징화하여, 로트 HUA0505MA 및 로트 HUB0701EB의 각 집단의 서열 및 존재비를 결정하였다.
3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제가 불균질성을 나타내었고, C-말단 서열이 서로 상이한 폴리펩티드를 함유하였다는 것이 관찰되었다 (표 30 및 31). 이 불균질성은 제조 및 정제 공정 동안 세포 배양 배지 또는 다른 용액에 존재하는 펩티다제에 의한 발현된 447 아미노산 폴리펩티드 (서열번호 122)의 C-말단 절단의 결과일 가능성이 있다. 가용성 rHuPH20 제제 중 폴리펩티드는 서열번호 122에 제시된 가용성 rHuPH20 서열의 아미노산 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 및 1-443에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 이들 폴리펩티드 각각의 전장 아미노산 서열은 서열번호 122 내지 126에 각각 기재되어 있다. 표 29 및 30에서 인식되는 바와 같이, 3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제 중 각 폴리펩티드의 존재비는 상이하다.
로트 HUA0505MA 로부터의 C-말단 절편 분석
절편 아미노산 위치
(서열번호 122에 상대함) 		서열 이론
질량 		실험
질량 		오차 용출
시간 		존재비
D28a 431-447 DAFKLPPMETEEPQIFY
(서열번호 191)		 2053.97 2054.42 0.45 99.87 0.2%
D28b 431-446 DAFKLPPMETEEPQIF
(서열번호 192)		 1890.91 1891.28 0.37 97.02 18.4%
D28c 431-445 DAFKLPPMETEEPQI
(서열번호 193)		 1743.84 1744.17 0.33 86.4 11.8%
D28d 431-444 DAFKLPPMETEEPQ
(서열번호 194)		 1630.70 1631.07 0.32 74.15 56.1%
D28e 431-443 DAFKLPPMETEEP
(서열번호 195)		 1502.70 1502.98 0.28 77.36 13.6%
D28f 431-442 DAFKLPPMETEE
(서열번호 196)		 1405.64 ND N/A N/A 0.0%
로트 HUB0701EB 로부터의 C-말단 절편 분석
절편 아미노산 위치
(서열번호 122에 상대함) 		서열 이론
질량 		실험
질량 		오차 용출
시간 		존재비
D28a 431-447 DAFKLPPMETEEPQIFY
(서열번호 191)		 2053.97 2054.42 0.45 99.89 1.9%
D28b 431-446 DAFKLPPMETEEPQIF
(서열번호 192)		 1890.91 1891.36 0.45 96.92 46.7%
D28c 431-445 DAFKLPPMETEEPQI
(서열번호 193)		 1743.84 1744.24 0.40 85.98 16.7%
D28d 431-444 DAFKLPPMETEEPQ
(서열번호 194)		 1630.70 1631.14 0.39 73.9 27.8%
D28e 431-443 DAFKLPPMETEEP
(서열번호 195)		 1502.70 1503.03 0.33 77.02 6.9%
D28f 431-442 DAFKLPPMETEE
(서열번호 196)		 1405.64 ND N/A N/A 0.0%
변형이 당업자에게 명백할 것이므로, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. <120> Extended Soluble PH20 Polypeptides and Uses Thereof <130> P11-055-INP-MLA <150> US 61/201,384 <151> 2008-12-09 <150> US 61/281,240 <151> 2009-11-13 <160> 215 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1530 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human PH20 cDNA encoding amino acids 1-509 <400> 1 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctacaatg cttcaccctc cacactatct gccacaatgt tcattgttag tattttgttt 1500 cttatcattt cttctgtagc gagtttgtaa 1530 <210> 2 <211> 1506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Optimized PH20 with restriction sites <400> 2 gctagcatgg acatgagggt accagcccag ctgttgggcc ttcttctgct ttggctccct 60 ggggcaaggg gacttaactt cagagctccc cctgtaatcc caaacgtccc cttcctgtgg 120 gcatggaacg cccctagcga attctgtttg gggaaatttg acgaacctct ggacatgtct 180 ctgttttctt ttatcggtag ccctcgaatc aacgctaccg gacagggggt gacaatcttt 240 tacgtggatc gtctgggcta ttacccttac atcgacagca ttactggggt gaccgtgaac 300 ggaggcattc ctcagaaaat atcactgcag gaccacctgg acaaagctaa gaaggatatt 360 acattctaca tgccagtgga caatctcgga atggctgtga ttgactggga ggagtggaga 420 cctacttggg cccgaaattg gaagcccaag gatgtgtata agaaccgatc cattgagctg 480 gtgcagcagc agaacgtgca gctgtccctt acagaagcca ccgaaaaagc taagcaggaa 540 ttcgagaaag ctgggaagga tttcctggtt gagacaataa aacttgggaa actgcttaga 600 cctaaccacc tctggggcta ttatttgttc cccgattgct acaatcacca ctataagaag 660 cccggctaca acggatcttg tttcaacgtc gaaattaaaa gaaacgatga cctctcttgg 720 ttgtggaatg agtctactgc actctacccc tctatatatc tcaacacaca gcagtcccca 780 gtagccgcta ccctctacgt tcggaataga gtgagggaag ccatcagggt gtccaagatc 840 cccgatgcca aatctcccct cccagtgttt gcctacacca ggatcgtgtt taccgaccag 900 gtgttgaagt tcctgagcca ggacgagctc gtgtatactt ttggcgagac agttgctctg 960 ggagcctctg ggatcgtgat ctggggcact ctgagtatta tgcgatcaat gaagtcctgc 1020 ctgctgttgg ataactacat ggagacaatc ctgaacccat atatcattaa cgtgactttg 1080 gccgctaaga tgtgttcaca ggtgctgtgt caagagcagg gagtatgcat taggaagaac 1140 tggaactcaa gcgattatct ccatctgaac ccagataatt ttgcaatcca gctggaaaag 1200 ggtggtaaat tcactgtccg agggaagccc acactcgagg atctcgaaca gtttagtgaa 1260 aagttctact gtagctgcta tagcactctg agttgtaagg aaaaagccga tgtgaaagac 1320 actgatgccg ttgacgtttg catcgccgat ggggtgtgta ttgacgcctt tctcaagcca 1380 ccaatggaga ctgaggagcc ccagatcttt tacaacgcct ccccctccac cttgagtgct 1440 accatgttca tcgtatctat acttttcctg attatatcaa gcgtggcaag cctctgataa 1500 ggatcc 1506 <210> 3 <211> 507 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuPH20 precursor 1-507 <400> 3 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala 500 505 <210> 4 <211> 505 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuPH20 precursor 1-505 <400> 4 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser 500 505 <210> 5 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuPH20 precursor 1-503 <400> 5 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile 500 <210> 6 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuPH20 precursor 1-501 <400> 6 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile 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acaaagctaa gaaggatatt 360 acattctaca tgccagtgga caatctcgga atggctgtga ttgactggga ggagtggaga 420 cctacttggg cccgaaattg gaagcccaag gatgtgtata agaaccgatc cattgagctg 480 gtgcagcagc agaacgtgca gctgtccctt acagaagcca ccgaaaaagc taagcaggaa 540 ttcgagaaag ctgggaagga tttcctggtt gagacaataa aacttgggaa actgcttaga 600 cctaaccacc tctggggcta ttatttgttc cccgattgct acaatcacca ctataagaag 660 cccggctaca acggatcttg tttcaacgtc gaaattaaaa gaaacgatga cctctcttgg 720 ttgtggaatg agtctactgc actctacccc tctatatatc tcaacacaca gcagtcccca 780 gtagccgcta ccctctacgt tcggaataga gtgagggaag ccatcagggt gtccaagatc 840 cccgatgcca aatctcccct cccagtgttt gcctacacca ggatcgtgtt taccgaccag 900 gtgttgaagt tcctgagcca ggacgagctc gtgtatactt ttggcgagac agttgctctg 960 ggagcctctg ggatcgtgat ctggggcact ctgagtatta tgcgatcaat gaagtcctgc 1020 ctgctgttgg ataactacat ggagacaatc ctgaacccat atatcattaa cgtgactttg 1080 gccgctaaga tgtgttcaca ggtgctgtgt caagagcagg gagtatgcat taggaagaac 1140 tggaactcaa gcgattatct ccatctgaac ccagataatt ttgcaatcca gctggaaaag 1200 ggtggtaaat tcactgtccg agggaagccc acactcgagg atctcgaaca gtttagtgaa 1260 aagttctact gtagctgcta tagcactctg agttgtaagg aaaaagccga tgtgaaagac 1320 actgatgccg ttgacgtttg catcgccgat ggggtgtgta ttgacgcctt tctcaagcca 1380 ccaatggaga ctgaggagcc ccagatcttt tacaacgcct ccccctccac cttgagtgct 1440 accatgttca tcgtatgata aggatcc 1467 <210> 214 <211> 1461 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPAM1-ATMF <400> 214 gctagcatgg acatgagggt accagcccag ctgttgggcc ttcttctgct ttggctccct 60 ggggcaaggg gacttaactt cagagctccc cctgtaatcc caaacgtccc cttcctgtgg 120 gcatggaacg cccctagcga attctgtttg gggaaatttg acgaacctct ggacatgtct 180 ctgttttctt ttatcggtag ccctcgaatc aacgctaccg gacagggggt gacaatcttt 240 tacgtggatc gtctgggcta ttacccttac atcgacagca ttactggggt gaccgtgaac 300 ggaggcattc ctcagaaaat atcactgcag gaccacctgg acaaagctaa gaaggatatt 360 acattctaca tgccagtgga caatctcgga atggctgtga ttgactggga ggagtggaga 420 cctacttggg cccgaaattg gaagcccaag gatgtgtata agaaccgatc cattgagctg 480 gtgcagcagc agaacgtgca gctgtccctt acagaagcca ccgaaaaagc taagcaggaa 540 ttcgagaaag ctgggaagga tttcctggtt gagacaataa aacttgggaa actgcttaga 600 cctaaccacc tctggggcta ttatttgttc cccgattgct acaatcacca ctataagaag 660 cccggctaca acggatcttg tttcaacgtc gaaattaaaa gaaacgatga cctctcttgg 720 ttgtggaatg agtctactgc actctacccc tctatatatc tcaacacaca gcagtcccca 780 gtagccgcta ccctctacgt tcggaataga gtgagggaag ccatcagggt gtccaagatc 840 cccgatgcca aatctcccct cccagtgttt gcctacacca ggatcgtgtt taccgaccag 900 gtgttgaagt tcctgagcca ggacgagctc gtgtatactt ttggcgagac agttgctctg 960 ggagcctctg ggatcgtgat ctggggcact ctgagtatta tgcgatcaat gaagtcctgc 1020 ctgctgttgg ataactacat ggagacaatc ctgaacccat atatcattaa cgtgactttg 1080 gccgctaaga tgtgttcaca ggtgctgtgt caagagcagg gagtatgcat taggaagaac 1140 tggaactcaa gcgattatct ccatctgaac ccagataatt ttgcaatcca gctggaaaag 1200 ggtggtaaat tcactgtccg agggaagccc acactcgagg atctcgaaca gtttagtgaa 1260 aagttctact gtagctgcta tagcactctg agttgtaagg aaaaagccga tgtgaaagac 1320 actgatgccg ttgacgtttg catcgccgat ggggtgtgta ttgacgcctt tctcaagcca 1380 ccaatggaga ctgaggagcc ccagatcttt tacaacgcct ccccctccac cttgagtgct 1440 accatgttct gataaggatc c 1461 <210> 215 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPAM1-LSAT <400> 215 gctagcatgg acatgagggt accagcccag ctgttgggcc ttcttctgct ttggctccct 60 ggggcaaggg gacttaactt cagagctccc cctgtaatcc caaacgtccc cttcctgtgg 120 gcatggaacg cccctagcga attctgtttg gggaaatttg acgaacctct ggacatgtct 180 ctgttttctt ttatcggtag ccctcgaatc aacgctaccg gacagggggt gacaatcttt 240 tacgtggatc gtctgggcta ttacccttac atcgacagca ttactggggt gaccgtgaac 300 ggaggcattc ctcagaaaat atcactgcag gaccacctgg acaaagctaa gaaggatatt 360 acattctaca tgccagtgga caatctcgga atggctgtga ttgactggga ggagtggaga 420 cctacttggg cccgaaattg gaagcccaag gatgtgtata agaaccgatc cattgagctg 480 gtgcagcagc agaacgtgca gctgtccctt acagaagcca ccgaaaaagc taagcaggaa 540 ttcgagaaag ctgggaagga tttcctggtt gagacaataa aacttgggaa actgcttaga 600 cctaaccacc tctggggcta ttatttgttc cccgattgct acaatcacca ctataagaag 660 cccggctaca acggatcttg tttcaacgtc gaaattaaaa gaaacgatga cctctcttgg 720 ttgtggaatg agtctactgc actctacccc tctatatatc tcaacacaca gcagtcccca 780 gtagccgcta ccctctacgt tcggaataga gtgagggaag ccatcagggt gtccaagatc 840 cccgatgcca aatctcccct cccagtgttt gcctacacca ggatcgtgtt taccgaccag 900 gtgttgaagt tcctgagcca ggacgagctc gtgtatactt ttggcgagac agttgctctg 960 ggagcctctg ggatcgtgat ctggggcact ctgagtatta tgcgatcaat gaagtcctgc 1020 ctgctgttgg ataactacat ggagacaatc ctgaacccat atatcattaa cgtgactttg 1080 gccgctaaga tgtgttcaca ggtgctgtgt caagagcagg gagtatgcat taggaagaac 1140 tggaactcaa gcgattatct ccatctgaac ccagataatt ttgcaatcca gctggaaaag 1200 ggtggtaaat tcactgtccg agggaagccc acactcgagg atctcgaaca gtttagtgaa 1260 aagttctact gtagctgcta tagcactctg agttgtaagg aaaaagccga tgtgaaagac 1320 actgatgccg ttgacgtttg catcgccgat ggggtgtgta ttgacgcctt tctcaagcca 1380 ccaatggaga ctgaggagcc ccagatcttt tacaacgcct ccccctccac cttgagtgct 1440 acctgataag gatcc 1455

Claims (69)

  1. 연장된 가용성 PH20 히알루로니다제 (esPH20).
  2. 제1항에 있어서, N-글리코실화, N-부분 글리코실화 또는 탈글리코실화된 esPH20.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-부분 글리코실화 폴리펩티드는 3개 이상의 아스파라긴 (N) 잔기의 각각에 연결된 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함하는 esPH20.
  4. 제3항에 있어서, 상기 3개의 아스파라긴 잔기들은 서열번호 107의 아미노산 잔기 235, 368 및 393 이거나, 서열번호 107의 아미노산 잔기 235, 368 및 393 에 상응하는 잔기인 esPH20.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 60-63 및 102-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티트; 또는
    서열번호 60-63, 및 102-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 내 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드로써, 여기서 아미노산 치환된 폴리펩티드는 서열번호 60-63 및 102-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산의 상응하는 서열과 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드
    중에서 선택되는 esPH20.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 활성인 esPH20.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서 인간 esPH20 인 esPH20.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서 침팬지 esPH20 인 esPH20.
  9. 제5항에 있어서, 서열번호 60-63, 및 102-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 esPH20.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 107의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497, 36-498, 36-499 또는 36-500 로써 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 또는
    서열번호 107의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497, 36-498, 36-499 또는 36-500 로써 제시되는 아미노산 서열 내 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드로써, 여기서 아미노산 치환된 폴리펩티드가 서열번호 107의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497, 36-498, 36-499 또는 36-500 로써 제시되는 아미노산의 상응하는 서열과 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드
    중에서 선택되는 esPH20.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호 107의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497, 36-498, 36-499 또는 36-500 로써 제시된 아미노산 서열로 이루어진 esPH20.
  12. 서열번호 107의 아미노산 1-465, 1-491, 1-492, 1-493, 1-494, 1-495, 1-496, 1-497, 1-498, 1-499 또는 1-500 로써 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
    서열번호 107의 아미노산 1-465, 1-491, 1-492, 1-493, 1-494, 1-495, 1-496, 1-497, 1-498, 1-499 또는 1-500 로써 제시된 아미노산 서열 내 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 치환된 PH20 히알루로니다제가 서열번호 107의 아미노산 1-465, 1-491, 1-492, 1-493, 1-494, 1-495, 1-496, 1-497, 1-498, 1-499 또는 1-500 로써 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는,
    절단된 PH20 히알루로니다제.
  13. 서열번호 107의 아미노산 36-465, 36-484, 36-485, 36-486, 36-487, 36-488 또는 36-489 로써 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나,
    서열번호 107의 아미노산 36-465, 36-484, 36-485, 36-486, 36-487, 36-488 또는 36-489 로써 제시된 아미노산 서열 내 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 치환된 PH20 히알루로니다제가 서열번호 107의 아미노산 36-465, 36-484, 36-485, 36-486, 36-487, 36-488 또는 36-489 로써 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는,
    절단된 PH20 히알루로니다제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, N-글리코실화, N-부분 글리코실화 또는 탈글리코실화된 PH20.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 활성인 PH20.
  16. 서열번호 55-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나,
    서열번호 55-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 내 내 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 치환된 PH20 히알루로니다제가 서열번호 55-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는,
    절단된 PH20 히알루로니다제 당단백질로써,
    상기 PH20 히알루로니다제 당단백질은 N-글리코실화되어 있으나, 서열번호 107의 아미노산 잔기 82, 166 또는 254 에 상응하는 하나 이상의 잔기에서는 글리코실화되어 있지 않은 절단된 PH20 히알루로니다제 당단백질.
  17. 제16항에 있어서, 3개 이상의 아스파라긴 (N) 잔기의 각각에 연결된 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함하는 PH20.
  18. 제17항에 있어서, 상기 3개의 아스파라긴 잔기들은 서열번호 107의 아미노산 잔기 235, 368 및 393 이거나, 서열번호 107의 아미노산 잔기 235, 368 및 393 에 상응하는 잔기인 PH20.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 활성인 PH20.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성인 PH20.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PH20 은 인간, 침팬지, 뱅골원숭이 및 사이노몰거스 원숭이 중에서 선택되는 PH20.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 시알화, 알부민화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화 및 인산화 중에서 선택되는 변형에 의하여 변형된 esPH20 또는 PH20.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머에 의하여 변형된 esPH20 또는 PH20.
  24. 제23항에 있어서, 폴리머는 덱스트란 또는 PEG 인 esPH20 또는 PH20.
  25. 서열번호 107에 제시된 아미노산 서열, 또는 그의 절단된 중성 활성 형태, 또는 서열번호 107에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 절단형과 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PH20 히알루로니다제 당단백질로써,
    PH20 히알루로니다제 당단백질은 N-글리코실화되어 있으나, 서열번호 107의 아미노산 잔기 82, 166 또는 254 에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서는 글리코실화되어 있지 않은 PH20 히알루로니다제 당단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 변형되지 않은 폴리펩티드와 비교하여 인간에 있어 감소된 면역원성을 가지도록 변형된 esPH20 또는 PH20.
  27. 제26항에 있어서, 1차 서열이 항원성에 기여하는 에피토프가 제거되도록 변경된 esPH20 또는 PH20.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 비푸코실화하지(bifucosylate) 않는 숙주세포 내에서의 발현에 의하여 생산되는 esPH20 또는 PH20.
  29. 제28항에 있어서, 숙주세포는 포유동물 숙주세포 또는 포유동물화된 곤충 세포 발현계인 esPH20 또는 PH20.
  30. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 비푸코실화되지 않은 esPH20 또는 PH20.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 정제되거나 분리된 esPH20 또는 PH20.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20 를 포함하는 접합체.
  33. 제32항에 있어서, esPH20 또는 PH20 이 다량체화 도메인, 톡신, 검출용 표지 또는 약물 중에서 선택되는 잔기에 접합된 접합체.
  34. 제33항에 있어서, esPH20 또는 PH20 이 Fc 도메인에 접합된 접합체.
  35. 제32항에 있어서, esPH20 또는 PH20 이 폴리머에 접합된 접합체.
  36. 제35항에 있어서, 폴리머가 덱스트란 또는 PEG 인 접합체.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 접합된 잔기가 직접 또는 링커를 통해 esPH20 또는 PH20 의 C-말단 또는 N-말단에 연결된 접합체.
  38. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20 를 암호화하는 핵산 분자로써, 전장 PH20 은 암호화하지 아니하나, 절단된 PH20 을 암호화하거나 esPH20 을 암호화하는 핵산 분자.
  39. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20 을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각은 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20 의 발현 벡터 내에 작동가능하게 삽입된 정지 코돈을 포함하거나, 그에 의하여 즉시 이어지는 발현 벡터.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    서열번호 107의 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497, 36-498, 36-499 또는 36-500 의 아미노산으로 이루어진 esPH20 폴리펩티드; 또는
    서열번호 107의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497, 36-498, 36-499 또는 36-500 로써 제시된 아미노산 서열 내 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드로써, 여기서 아미노산 치환된 esPH20 폴리펩티드가 서열번호 107의 336-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497, 36-498, 36-499 또는 36-500 의 아미노산 서열로써 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 폴리펩티드
    를 암호화하는 핵산 분자.
  41. 서열번호 150-154, 200-201 및 213-215 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 그의 축퇴물을 포함하고, 서열번호 150-154, 200-201 및 213-215 중 어느 하나에 의해 암호화된 절단된 PH20 또는 esPH20 을 생산하기 위한 정지 코돈을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화된 절단된 PH20 또는 esPH20을 생산하는 발현을 위하여 작동가능하게 연결된 발현 벡터인 핵산 분자.
  42. 제38항에 있어서, 서열번호 107의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496, 36-497 또는 36-498 로 이루어진 esPH20 을 암호화하는 핵산 분자.
  43. 제38항, 제40항 및 제42항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  44. 제39항 또는 제43항의 벡터, 또는 제38항, 및 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 세포.
  45. 제44항에 있어서, CHO 세포인 세포.
  46. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  47. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20 폴리펩티드를 복수로 포함하는 조성물.
  48. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20 폴리펩티드를 복수로 포함하는 조성물.
  49. 제47항에 있어서, 복수의 esPH20 폴리펩티드는 제38항, 및 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제39항 또는 제43항의 벡터에 의하여 암호화되는 조성물.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, esPH20 또는 PH20 폴리펩티드는 CHO 세포로부터 분비되는 조성물.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 추가의 치료제를 포함하는 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 추가의 치료제가 상기 조성물과 함께 또는 별개의 조성물 내에 제형화된 조성물.
  54. 제52항 또는 제52항에 있어서, 치료제가 화학치료제, 진통제, 항염증제, 항균약, 아칸트아메바각막염 치료제 (amoebicidal agent), 살트로트코모노균제 (trichomonocidal agent), 항파킨슨제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 및 항관절염제, 항진균제, 혈압강하제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린성 작용제, 살생물제, 살균제, 정균제, 베타 아드레날린 차단제, 칼슘 채널 블록커, 심혈관 약제, 피임제, 충혈제거제, 이뇨제, 진정제, 진단약, 전해질 약제, 수면제, 호르몬제, 고혈당 약제, 근육이완제, 근육수축제, 안과용제, 부교감신경흥분제, 심리활력제, 진정-수면제, 교감신경흥분제, 신경안정제, 요로제, 질제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드계 항염증제, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 약물, 유기분자 또는 수면 유도제 중에서 선택되는 조성물.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 항체, 면역글로불린, 비스포스포네이트, 사이토카인, 화학치료제 및 인슐린 중에서 선택되는 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 인슐린은 속효성 인슐린이고, 비스포스포네이트는 졸레드론산인 조성물.
  57. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20, 또는 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 히알루로니다제-관련 질환 또는 상태의 치료 방법.
  58. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20, 또는 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 글리코시마노글리칸 과다를 치료하는; 뇌 내 글리코사미노글리칸 축적을 치료하는; 심혈관 장애를 치료하는; 안질환을 치료하는; 폐질환을 치료하는; 화학치료제의 고형 종양 내 침투를 증가시키는; 셀룰라이트를 치료하는; 증식성 장애를 치료하는; 또는 약물 또는 다른 치료제의 생체이용률을 증가시키는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 증식성 장애는 전립선 비대증인 방법.
  60. 제52항 내지 제56항 또는 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제는
    아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인 (9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르 중에서 선택되는 방법 또는 조성물.
  61. 제59항에 있어서, PH20 또는 esPH20은 페길화된 방법.
  62. 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제형화를 위한 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20, 또는 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  63. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는, 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료용 약학적 조성물.
  64. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료용 약학적 조성물.
  65. 글리코사미노글리칸 과다의 치료; 종양의 치료; 뇌 내 글리코사미노글리칸 축적의 치료; 심혈관 장애의 치료; 안질환의 치료; 폐질환의 치료; 고형 종양 내 화학치료제의 투과 증가; 셀룰라이트의 치료; 증식성 장애의 치료; 또는 약물 또는 다른 치료제의 생체이용률의 증가용 의약의 제형화를 위한 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 esPH20 또는 PH20, 또는 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  66. 제65항에 있어서, 증식성 장애가 전립선 비대증인 용도.
  67. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는, 글리코사미노글리칸 과다의 치료; 종양의 치료; 뇌 내 글리코사미노글리칸 축적의 치료; 심혈관 장애의 치료; 안질환의 치료; 폐질환의 치료; 고형 종양 내 화학치료제의 투과 증가; 셀룰라이트의 치료; 증식성 장애의 치료; 또는 약물 또는 다른 치료제의 생체이용률의 증가에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  68. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸 과다의 치료; 종양의 치료; 뇌 내 글리코사미노글리칸 축적의 치료; 심혈관 장애의 치료; 안질환의 치료; 폐질환의 치료; 고형 종양 내 화학치료제의 투과 증가; 셀룰라이트의 치료; 증식성 장애의 치료; 또는 약물 또는 다른 치료제의 생체이용률의 증가에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 증식성 장애는 전립선 비대증인 약학적 조성물.
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