WO2024058648A1 - 신규한 히알루로니다제 ph-20 변이체 및 그 용도 - Google Patents

신규한 히알루로니다제 ph-20 변이체 및 그 용도 Download PDF

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WO2024058648A1
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hyaluronidase
variant
receptor
interleukin
group
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PCT/KR2023/095052
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신항철
이주영
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(주)피앤피바이오팜
(주)굿인텔리전스
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    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase

Definitions

  • the present invention relates to a novel hyaluronidase PH-20 variant and its use, and more specifically, to any one hyaluronidase PH- selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4.
  • 20 variant a polynucleotide encoding the variant, an expression vector comprising the polypeptide, a host cell line comprising the expression vector, a method for producing a hyaluronidase PH-20 variant comprising culturing the host cell line, And it relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases containing the hyaluronidase PH-20 variant.
  • Hyaluronidase is an enzyme that decomposes hyaluronic acid.
  • Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4, and Hyal5 also known as PH-20 or SPAM1
  • Hyal6P Hyalp1
  • Hyal1, Hyal2, and Hyal3 genes exist on chromosome 3
  • Hyal4, Hyal5, and Hyal6P genes exist on chromosome 7.
  • Hyal1 and Hyal2 are hyaluronidases expressed in most tissues and show optimal activity at pH 3-4.
  • PH-20 is expressed in the cell membrane and acrosome membrane of sperm and is active in a wide pH range of 3 to 8.
  • PH-20 was first identified in guinea pig sperm by Lathrop et al., and is known to be expressed in sperm of many other species.
  • the human PH-20 gene is encoded from the SPAM1 (sperm ahdesion molecule 1) gene, and exists in the form of Ser490 of PH-20 bound to glycosylphophatidylinositol (GPI) on the surface of the sperm cell membrane and inside the acrosome membrane.
  • SPAM1 sperm ahdesion molecule 1
  • GPI glycosylphophatidylinositol
  • PH-20 of sperm plays a role in hydrolyzing hyaluronic acid when it passes through the cumulus layer of an egg rich in hyaluronic acid and penetrates into the egg.
  • PH-20 is sometimes administered together with therapeutic drugs due to its unique property of being active even at neutral pH.
  • drugs that require high or large doses especially antibody drugs, are generally administered through intravenous injection.
  • the injection time alone takes about 90 minutes or more, and additional preparation work for intravenous injection is involved.
  • additional preparation work for intravenous injection is involved.
  • subcutaneous injection has the advantage of allowing immediate administration, but has a lower absorption rate compared to intravenous injection, and absorption occurs slowly, so if the injection amount is more than 3 to 5 mL, it may cause swelling and pain at the injection site. For this reason, subcutaneous injection of protein therapeutics was usually limited to small amounts of 2 mL or less.
  • PH-20 a hyaluronidase
  • a therapeutic drug hyaluronic acid distributed in the skin extracellular matrix is hydrolyzed by the action of hyaluronidase, reducing the viscosity of the subcutaneous area and increasing substance permeability. Medicines can be easily delivered into the body.
  • PH-20 which is currently widely used commercially, is extracted from the testicles of cows or sheep.
  • animal-derived hyaluronidase is repeatedly administered to the human body in high doses, neutralizing antibodies may be generated, and in addition to PH-20, it may contain impurities.
  • impurities There is also a risk that other substances of animal origin may cause allergies.
  • human PH-20 protein is in progress, but since the stability of human PH-20 itself is low, it is necessary to overcome this first.
  • the present inventors minimized the immunogenicity problem by minimizing mutations introduced into the human-derived wild-type PH-20 protein, and increased protein stability and maximized enzyme activity through mutations and covalent bonds of amino acids located inside the protein.
  • the present invention was completed by developing a novel PH-20 variant.
  • the object of the present invention is to provide a hyaluronidase PH-20 variant selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, and in which 0 to 3 mutations are additionally introduced.
  • Another object of the present invention is a polynucleotide encoding the hyaluronidase PH-20 variant, an expression vector comprising the polynucleotide, a host cell line comprising the expression vector, and culturing the host cell line.
  • Another object of the present invention is a) drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant; to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, comprising:
  • Another object of the present invention is a) drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant; to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, characterized in that it consists of the above.
  • Another object of the present invention is a) drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant.
  • Another object of the present invention is to prepare a pharmaceutical composition for the treatment of diseases, comprising: a) a drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant;
  • Another object of the present invention is a) drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant; to provide a method of treating a disease comprising administering an effective amount of a composition containing as an active ingredient to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a hyaluronidase PH-20 variant selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, and in which 0 to 3 mutations are additionally introduced. provides.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the hyaluronidase PH-20 variant, an expression vector containing the polynucleotide, a host cell line containing the expression vector, and the host cell line.
  • a method for producing a hyaluronidase PH-20 variant comprising the step of culturing.
  • the present invention provides a) a drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases, comprising:
  • the present invention provides a) a drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant.
  • the present invention provides a) a drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant.
  • the present invention provides a) a drug for preparing a pharmaceutical composition for treating diseases; and b) the hyaluronidase PH-20 variant;
  • the present invention provides a) a drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant as an active ingredient. It provides a method of treating a disease comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition.
  • the present invention provides any one hyaluronidase PH-20 variant selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4.
  • the human wild-type PH-20 protein is a protein with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the protein structure has not yet been revealed.
  • the protein structure for which the protein structure was revealed is Hyal1
  • the amino acid sequences of Hyal1 and PH-20 are 35.1% identical.
  • LGKFDEPLDM SLFSFIGSPR INATGQGVTI FYVDRLGYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL
  • the present inventor first produced the Hy1 protein of SEQ ID NO: 2, in which amino acid residues 1 to 35, which are the signal peptide, and part of the C-terminal sequence were cut from the amino acid sequence of human wild-type PH-20, and N- It was determined that modification of the terminal and C-terminus may affect enzyme activity, so Hy2 (SEQ ID NO: 3) with asparagine added to the C-terminus in the Hy1 amino acid sequence and 2 to the N-terminus in the Hy2 amino acid sequence.
  • Hy3 (SEQ ID NO: 4) protein with the amino acid residues leucine and asparagine deleted was additionally produced.
  • amino acid residue position of each variant follows the amino acid position of Hy1 according to SEQ ID NO: 2.
  • the protein tertiary structure was modeled using DeepMind's AlphaFold 2 and Good Intelligence's CSA (conformational space annealing) modeling technique. Energy minimization was performed using the GROMACS package for local energy minimization and CHARMM36 force field. Chimera and PyMOL software were used to create several variants from the PH-20 modeling structure. In addition, several types of prediction programs were used to predict the protein-ligand binding ability of each variant.
  • candidates with possible disulfide bonds were selected using the structure of the protein registered in the PDB, and then using a protein contact map visualization program, the distance between the C-alpha carbons of the two amino acids was 6 ⁇ or less, and the C-beta carbon was 6 ⁇ or less. Residues with a carbon distance of 5 ⁇ were analyzed using a plot. Afterwards, the presence or absence of disulfide bonds was analyzed using YASARA Web Energy Minimization Server, and then energy minimization was performed using Chimera's AMBER force filed FF99. Afterwards, the structure of the produced protein was aligned with the wild type PH-20, and mutations that had an RMSD measurement value of 0.5 or less were selected.
  • an expression such as "Y57” written together with a one-letter amino acid residue name and a number refers to the amino acid residue at each position in the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • “Y57” means that the amino acid residue at position 57 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is tyrosine.
  • Y57H means that the 57th tyrosine in SEQ ID NO: 2 is replaced with histidine.
  • PH-20 variants according to the present invention are interpreted to include variants in which amino acid residues are conservatively substituted at specific amino acid residue positions.
  • 'conservative substitution' refers to a modification of a PH-20 variant that includes substituting one or more amino acids with an amino acid having similar biochemical properties that does not cause loss of biological or biochemical functions of the PH-20 variant.
  • Constant amino acid substitution' is a substitution in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Classes of amino acid residues with similar side chains are well known in the art. These classes include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), and amino acids with uncharged polar side chains (e.g., glycine).
  • amino acids with non-polar side chains e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acids with beta-branched side chains Includes amino acids (e.g., threonine, valine, isoleucine) and amino acids with aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • the PH-20 variant may still retain activity even if it has conservative amino acid substitutions.
  • the PH-20 variant according to the present invention has substantially the same function and/or effect as the PH-20 variant according to the present invention, and is preferably 80% or 85% or more, preferably 90% or more, and more preferably 90% or more. It is interpreted to include PH-20 variants having amino acid sequence homology of 95% or more, most preferably 99% or more.
  • the hyaluronidase PH-20 variant according to the present invention may be any one selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 109.
  • the amino acid sequence of the hyaluronidase PH-20 variant produced in the examples according to the present invention is as shown in Table 1 below.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the hyaluronidase PH-20 variant according to the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention may be present in cells, cell lysates, or in partially purified or substantially pure form. Polynucleotides can be separated from other cellular components or other contaminants by standard techniques including alkali/SDS treatment, CsCl banding, column chromatography, agarose gel electrophoresis and others well known in the art. , is ‘isolated’ or ‘substantially pure’ when it is purified from a polynucleotide or protein from another cell.
  • the base combination of the polynucleotide is not particularly limited as long as it can encode the PH-20 variant of the present invention.
  • the polynucleotide may be provided as a nucleic acid molecule in the form of a single strand or a double strand, including all DNA, cDNA, and RNA sequences.
  • the PH-20 variant of the present invention can be provided by operably linking the nucleic acid sequence encoding the PH-20 variant of the present invention to a vector capable of expressing it. Accordingly, the present invention provides an expression vector or recombinant vector containing the above polynucleotide.
  • the term 'expression vector' or 'recombinant vector' refers to a vector capable of expressing a target protein or target RNA in a suitable host cell, and refers to a gene construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. .
  • 'operably linked' refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a desired protein or RNA to perform a general function.
  • a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA can be operably linked to affect expression of the encoding nucleic acid sequence.
  • Operational linkage with a recombinant vector can be made using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cutting and ligation can be done using enzymes generally known in the art.
  • the vectors include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, etc.
  • a suitable expression vector includes expression control elements such as a promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal, and enhancer, as well as a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion, and can be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector may also include a selection marker for selecting host cells containing the vector, and, if it is a replicable expression vector, may include an origin of replication.
  • the signal sequence includes the PhoA signal sequence and OmpA signal sequence when the host is a genus Escherichia ( Escherichia sp.), and the ⁇ -amylase signal sequence and subtilisin signal sequence when the host is a bacterium of the genus Bacillus.
  • the MF ⁇ signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. can be used, and if the host is an animal cell, the insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a host cell line containing the expression vector. That is, the present invention provides a transformant (host cell) transformed with the expression vector (recombinant vector).
  • the transformation can be performed by any method known to be capable of introducing nucleic acids into an organism, cell, tissue or organ, and can be performed by selecting an appropriate standard technique depending on the host cell, as known in the art. . These methods include microprojectile bombardment, electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation using silicon carbide fibers, and agrobacteria-mediated transformation. Conversion, PEG-mediated fusion, microinjection, liposome-mediated method, dextran sulfate, lipofectamine, heat shock method, etc. are included, but are not limited to these.
  • 'transformant' can be used interchangeably with 'host cell', etc., and can be introduced into a cell by any means (e.g. electric shock method, calcium phosphatase precipitation method, microinjection method, transformation method, virus infection, etc.). refers to a prokaryotic or eukaryotic cell containing heterologous DNA.
  • the transformant includes all types of single-celled organisms commonly used in the cloning field, such as prokaryotic microorganisms such as various bacteria (e.g., Clostridia genus, Escherichia coli, etc.), lower eukaryotic microorganisms such as yeast, and insect cells. , cells derived from higher eukaryotes, including plant cells, mammals, etc., can be used as host cells, but are not limited thereto. Since the expression level and modification of proteins varies depending on the host cell, a person skilled in the art can select and use the host cell most suitable for the purpose.
  • the transformant of the present invention may preferably refer to a transformed microorganism.
  • host cells include, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis , Streptomyces , Pseudomonas , and Proteus mirabili. It may be a prokaryotic host cell such as Proteus mirabilis or Staphylococcus . Additionally, fungi (e.g., Aspergillus ), yeast (e.g., Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces ), lower eukaryotic cells such as Neurospora crassa , etc., cells derived from higher eukaryotes including insect cells, plant cells, mammals, etc. can be used as host cells.
  • fungi e.g., Aspergillus
  • yeast e.g., Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae
  • Schizosaccharomyces eukaryotic cells
  • lower eukaryotic cells such as Neurospora
  • monkey kidney cells7 monkey kidney cells
  • NSO cells monkey kidney cells
  • SP2/0 Chinese hamster ovary (CHO) cells
  • W138 baby hamster kidney (BHK) cells
  • MDCK myeloma cell line
  • HuT 78 cells HuT 78 cells
  • HEK293 cells and the like can be used, and CHO cells can be particularly preferably used, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a method for producing a hyaluronidase PH-20 variant comprising culturing the host cell line.
  • the PH-20 variant When a recombinant expression vector capable of expressing the PH-20 variant or a fragment thereof is introduced into a host cell, the PH-20 variant is expressed for a period sufficient to be expressed in the host cell, more preferably in a culture medium in which the host cell is cultured. It can be prepared by culturing the host cell for a period sufficient to cause secretion of the PH-20 variant into the cell.
  • the medium composition, culture conditions, culture time, etc. for culturing the host cells can be appropriately selected according to methods commonly used in the art.
  • PH-20 variants produced in host cells can accumulate in the cell cytoplasm, be secreted outside the cell or into the culture medium by an appropriate signal sequence, or be targeted to periplasm, etc.
  • the expressed PH-20 variant can be isolated from the host cell and purified to uniformity. Separation or purification of the PH-20 variant can be performed by separation and purification methods used for conventional proteins, for example, chromatography.
  • the chromatography may be, for example, a combination of one or more selected from affinity chromatography, ion exchange chromatography, or hydrophobic chromatography, but is not limited thereto.
  • filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. can be used in combination.
  • the present invention relates to a) a drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases, comprising:
  • the drug is protein drugs, antibody drugs, small molecules, aptamers, RNAi, antisence, CAR-T cells (chimeric antigen receptor T cell) ) or cell therapy such as CAR-NK cells (CAR natural killer cell), but are not limited to this, and not only drugs that are currently commercialized and used, but also drugs that are in clinical trials and development can be used.
  • protein drugs or antibody drugs can be used as the drug.
  • the 'protein drug' refers to a drug composed of amino acids and showing a disease prevention or treatment effect through the activity of protein, and refers to a drug composed of proteins other than antibody drugs, and cytokines.
  • cytokines therapeutic enzymes, hormones, soluble receptors and their fusion proteins, insulin or its analogs, BMP (bone morphogenetic protein), EPO (erythropoietin) and plasma derived It may be selected from the group consisting of proteins (serum derived proteins), etc., but is not limited thereto.
  • the 'cytokine' may be selected from the group consisting of interferon, interleukin, CSF (colony stimulating factor), TNF (tumor necrosis factor), and TGF (tissue growth factor), but is not limited thereto.
  • the 'therapeutic enzyme' may include, but is not limited to, beta-glucocerebrosidase and agalsidase beta.
  • the 'soluble receptor' refers to the extracellular domain of the receptor, and its fusion protein refers to a protein in which the Fc region of an antibody, etc. is fused to the soluble receptor.
  • the water-soluble receptor is a water-soluble form of the receptor to which the disease-related ligand binds, and is a form in which the Fc region is fused to the TNF- ⁇ water-soluble receptor (for example, a product with the ingredient name etanercept and similar forms) and VEGF water-soluble receptor.
  • a form in which the Fc region is fused to a receptor e.g., a product with the ingredient name Aflibercept and similar forms
  • CTLA-4 e.g., Abatacept or Bellacept
  • Belatacept and similar forms a form in which the Fc region is fused to the interleukin 1 soluble receptor (e.g., a product with the ingredient name Rilonacept and similar forms)
  • LFA3 soluble receptor Examples include a form in which the Fc region is fused (for example, a product with the ingredient name Alefacept and similar forms), but it is not limited thereto.
  • the term 'hormone' refers to a hormone or its analogue injected from outside the body for the treatment or prevention of diseases caused by hormone deficiency, etc., such as human growth hormone, estrogen, progesterone, etc. This may be exemplified, but is not limited to this.
  • the 'plasma-derived protein' refers to a protein present in plasma, both extracted from plasma and recombinantly produced, including fibrinogen, von Willebrand Factor, albumin, and thrombin. (thrombin), FII (Factor II), FV (Factor V), FVII (Factor VII), FVIII (Factor VIII), FIX (Factor IX), FX (Factor However, it is not limited to this.
  • the 'antibody drug' may be a monoclonal antibody drug or a polyclonal antibody drug.
  • the ‘monoclonal antibody drug’ refers to a protein containing monoclonal antibodies and monoclonal antibody fragments that can specifically bind to antigens associated with specific diseases.
  • Monoclonal antibodies also include double antibodies, and proteins containing monoclonal antibodies or fragments thereof are used to include ADC (antibody-drug conjugate).
  • Antigens associated with specific diseases include 4-1BB, integrin, amyloid beta, angiopoietin (angiopoietin 1 or 2), angiopoietin-like substance 3, and B-cell activating factor.
  • Antibodies against integrins include Natalizumab, Etrolizumab, Vedolizumab, and Bimagrumab;
  • Antibodies against amyloid beta include Bapineuzumab, Crenezumab, Solanezumab, Aducanumab, and Gantenerumab;
  • Antibodies to angiopoietin include AMG 780 against angiopoietin 1 and 2, MEDI 3617 against angiopoietin 2, Nesvacumab, and Vanucizumab, a double antibody against angiopoietin 2 and VEGF. ;
  • Evinacumab an antibody against angiopoietin-like substance 3;
  • Antibodies against B-cell activating factor include Tabalumab, Lanalumab, and Belimumab;
  • Antibodies against complement 5 include Ravulizumab and Eculizumab;
  • Mogamulizumab as an antibody against CCR4
  • Otelixizumab, Teplizumab, and Muromonab are antibodies against CD3, and Tebentafusp, a double antibody against GP100 and CD3, is a double antibody against CD19 and CD3.
  • Antibodies against CD4 include Ibalizumab and Zanolimumab;
  • Itolizumab an antibody against CD6
  • Efalizumab an antibody against CD11a
  • Antibodies against CD19 include Inebilizumab and Tafasitamab and Loncastuximab tesirine, an ADC;
  • Antibodies against CD20 include Ocrelizumab, Ublituximab, Obinutuzumab, Ofatumumab, Rituximab, and Tositumomab. Ibritumomab tiuxetan, an ADC;
  • Epratuzumab an antibody against CD22, and ADCs Inotuzumab ozogamicin and Moxetumomab pasudotox;
  • ADCs for CD30 include brentuximab vedotin
  • ADCs for CD33 include Vadastuximab talirine, Gemtuzumab ozogamicin;
  • Antibodies against CD38 include Daratumumab and Isatuximab;
  • Crizanlizumab an antibody against CD62
  • ADCs for CD79b include Polatuzumab vedotin
  • Galiximab an antibody against CD80
  • Antibodies against CGRP include Eptinezumab, Fremanezumab, Galcanezumab, and Erenumab;
  • Lampalizumab an antibody against complement factor D
  • Antibodies against CTLA4 include Tremelimumab, Zaliprelimab, and Ipilimumab;
  • ADCs for DLL3 include Rovalpituzumab tesirine
  • Antibodies to the EGF receptor include Cetuximab, Depatuxizumab, Zalutumumab, Necitumumab, and Panitumumab;
  • Emicizumab a dual antibody against the hemophilia factors coagulation factor IX and factor X;
  • Antibodies against Fc receptors include Nipocalimab and Rozanolixizumab;
  • Farletuzumab an antibody against the folate receptor, and Mirvetuximab soravtansine, an ADC;
  • Antibodies against GD2 include dinutuximab and naxitamab;
  • Otilimab an antibody against GM-CSF
  • Antibodies against HER2 include Margetuximab, Pertuzumab, and Trastuzumab, and ADCs include Trastuzumab deruxtecan, Trastuzumab emtansine, and Trastuzumab. Trastuzumab duocarmazine;
  • Anifrolumab an antibody against the interferon receptor
  • Emapalumab an antibody against interferon gamma
  • Antibodies to IgE include Ligelizumab and Omalizumab;
  • Antibodies to the IGF-1 receptor include Dalotuzumab, Figitumumab, and Teprotumumab;
  • Antibodies against interleukin 1 include Gebokizumab and Canakinumab;
  • Antibodies to the interleukin 2 receptor include Daclizumab and Basiliximab;
  • Dupilumab an antibody against the interleukin 4 receptor
  • Antibodies against interleukin 5 include Mepolizumab and Reslizumab;
  • Benralizumab an antibody against the interleukin 5 receptor
  • Antibodies to interleukin 6 include Clazakizumab, Olokizumab, Sirukumab, and Siltuximab;
  • Antibodies to the interleukin 6 receptor include Sarilumab, Satralizumab, Tocilizumab, and REGN88;
  • Antibodies against interleukin 12/23 include Ustekinumab and Briakinumab;
  • Antibodies against interleukin 13 include Lebrikizumab and Tralokinumab;
  • Antibodies against interleukin 17A include Ixekizumab and Bimekizumab;
  • Antibodies to interleukin 23 include Brazikumab, Guselkumab, Risankizumab, Tildrakizumab, and Mirikizumab;
  • Nemolizumab an antibody against the interleukin 31 receptor
  • Spesolimab an antibody against the interleukin 36 receptor
  • Relatlimab an antibody against LAG3
  • Antibodies to NGF include Fasinumab and Tanezumab;
  • Antibodies against PVSK9 include Alirocumab, Evolocumab, and Bococizumab;
  • Antibodies to PD-1 include Lambrolizumab, Balstilimab, Camrelizumab, Cemiplimab, Dostarlimab, Prolgolimab, and renal Sintilimab, Spartalizumab, Tislelizumab, Pembrolizumab, Nivolumab;
  • Antibodies against PD-L1 include Atezolizumab, Avelumab, Envafolimab, and Durvalumab, and bintrafusp alfa (a double antibody against TGF beta and PD-L1). Bintrafusp alpha);
  • Denosumab an antibody against RANK-L
  • Elotuzumab as an antibody against SLAMF7;
  • Antibodies against tissue factor include Concizumab and Marstacimab;
  • Infliximab, Adalimumab, and Golimumab are antibodies against TNF, especially TNF ⁇ ; Certolizumab pegol, an antibody fragment; and Ozo, a double antibody against TNF and albumin. Ozoralizumab;
  • Antibodies against VEGF include Brolucizumab, Ranibizumab, and Bevacizumab, and Faricimab, a double antibody against VEGF and Ang2;
  • Ramucirumab an antibody against the VEGF receptor
  • Caplacizumab an antibody against vWF.
  • the 'polyclonal antibody drug' is preferably a plasma antibody extracted from plasma such as immune globulin, but is not limited thereto.
  • the content of the antibody drug in the pharmaceutical composition according to the present invention is 5 to 500 mg/mL, preferably 20 to 200 mg/mL, more preferably 100 to 150 mg/mL, and most preferably 120 ⁇ 18 mg/mL. mL, for example about 110 mg/mL, about 120 mg/mL or about 130 mg/mL.
  • the 'small molecule compound' can be used without limitation as long as it is a drug that requires a rapid effect for the purpose of prevention or treatment.
  • a morphine-type painkiller may be used.
  • when used as a treatment for tissue necrosis caused by anticancer drugs it can be used alone or in combination with antidote drugs Vinca Alkaloids and Taxanes.
  • composition according to the present invention may further include one or more selected from the group consisting of buffering agents, stabilizers, and surfactants.
  • the 'buffer' can be used without limitation as long as it provides a pH of 4 to 8, preferably 5 to 7, and is preferably malate or formate. ), citrate, acetate, propionate, pyridine, piperazine, cacodylate, succinate, 2-(N-morpholy) 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), histidine, Tris, bis-Tris, phosphate, ethanolamine, carbonate (carbonate), 2-ethanesulfonic acid (piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid), PIPES), imidazole, BIS-Tris propane, BES (N,N- A group consisting of bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid), HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid),
  • a histidine buffer for example, L-histidine/HCl, is more preferred, but is not limited thereto.
  • the concentration of the buffer may be 0.001 to 200mM, preferably 1 to 50mM, more preferably 5 to 40mM, and most preferably 10 to 30mM.
  • the 'stabilizer' can be used without limitation as long as it is a substance commonly used in the art for the purpose of stabilizing proteins, and preferred examples include carbohydrates, sugars or their hydrates, and sugar alcohols. Or, it may be one or more selected from the group consisting of hydrates thereof, and amino acids.
  • sugars or sugar alcohols' used as the stabilizer include trehalose or its hydrate, sucrose, saccharin, glycerol, erythol, threitol, xylitol, arabitol, ribitol, mannitol, sorbitol, galactitol, and fusitol. , iditol, inositol, volemitol, isomalt, maltitol, polyglycitol, cyclodextrin, hydroxypropyl cyclodextrin (Hydroxypropyl Beta-cyclodextrin), and glucose.
  • the concentration of the sugars or sugar alcohols used as a stabilizer in the pharmaceutical composition according to the present invention is 0.001 to 500mM, preferably 100 to 300mM, more preferably 150 to 250mM, most preferably 150 to 250mM. Preferably it may be 180 to 230 mM.
  • the 'amino acids' include glutamine, glutamic acid, glycine, lysine, lysyllysine, leucine, methionine, valine, serine, selenomethionine, citroline, arginine, asparagine, aspartic acid, ornithine, isoleucine, taurine, theanine, It may be one or more selected from the group consisting of threonine, tryptophan, tyrosine, phenylalanine, proline, pyrrolysine, histidine and alanine, but is not limited thereto, and the concentration of the amino acid used as a stabilizer in the pharmaceutical composition according to the present invention is It may be 1 to 100mM, preferably 3 to 30mM, more preferably 5 to 25mM, and most preferably 7 to 20mM.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may additionally contain a surfactant.
  • the surfactant is polyoxyethylene-sorbitan fatty acid ester (polysorbate or tween), polyethylene-polypropylene glycol, polyoxyethylene-stearate, polyoxyethylene alkyl ether, for example, poly Oxyethylene monolauryl ether, alkylphenylpolyoxyethylene ether [triton-X], polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer [poloxamer, pluronic] and sodium dodecyl sulfate.
  • Nonionic surfactants such as (SDS) are preferred, and more preferably polysorbate can be used.
  • the polysorbate may be polysorbate 20 or polysorbate 80.
  • the concentration of nonionic surfactant in the pharmaceutical composition according to the present invention is 0.0000001% to 0.5% (w/v), preferably 0.000001% to 0.4% (w/v), more preferably 0.00001% to 0.3% ( w/v), most preferably 0.001% to 0.2% (w/v).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered by methods such as intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration, and through subcutaneous administration. It is preferred to be administered, and it is more preferred to be used in the form of an injectable formulation for subcutaneous injection administration. Accordingly, in one aspect of the present invention, a formulation for subcutaneous administration containing the pharmaceutical composition according to the present invention is provided.
  • the formulation for subcutaneous administration may be provided in a ready-to-injection form without additional dilution, and may be provided in a pre-filled syringe, glass ampoule, or plastic container. .
  • the disease may include cancer, autoimmune disease, etc., but is not limited thereto.
  • cancer or ‘carcinoma’ is not particularly limited and includes both solid cancer and blood cancer.
  • examples of the above cancer include skin cancer such as melanoma, liver cancer, hepatocellular carcinoma, stomach cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, and brain cancer.
  • prostate cancer prostate cancer, bone cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, testicular cancer, rectal cancer, head and neck cancer, cervical cancer, ureteral cancer, osteosarcoma, neuroblastoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, astrocytoma, neuroblastoma and nerve. It may be selected from the group consisting of glioma, and preferably may be selected from the group consisting of stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, and kidney cancer, but is not limited thereto.
  • the 'autoimmune disease' includes rheumatoid arthritis, asthma, psoriasis, multiple sclerosis, allergic rhinitis, Crohn's disease, and ulcerative colitis ( ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, type I diabetes, inflammatory bowel disease (IBD), and atopic dermatitis. .
  • the present invention provides a) drug for preparing a pharmaceutical composition for treating diseases; and b) the hyaluronidase PH-20 variant;
  • the present invention relates to a) a drug; and b) the hyaluronidase PH-20 variant as an active ingredient. It provides a method of treating a disease comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to a disease that can be treated with a drug that can be used in combination with the PH-20 variant according to the present invention, or an improvement, treatment, detection, diagnosis, or inhibition or reduction effect of the disease, when administered to an individual.
  • the 'individual' may be an animal, preferably a mammal, especially an animal including a human, and may also be a cell, tissue, organ, etc. derived from an animal.
  • the subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention comprehensively refers to a disease treatable with a drug that can be used in combination with the PH-20 variant according to the present invention or to improving the symptoms caused by the disease, which cures, substantially prevents, or , or improving the condition, including relieving, curing, or preventing one or most symptoms resulting from the disease, but is not limited thereto.
  • the term “comprising” is used in the same sense as “including” or “characterized by,” and specifically refers to the composition or method according to the present invention. It does not exclude additional components or method steps that have not been used. Additionally, the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or ingredients that are not separately stated.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it may include substances or steps that do not substantially affect its basic characteristics in addition to the described substances or steps.
  • the present invention provides a novel hyaluronidase PH-20 variant selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, a polynucleotide encoding the variant, and an expression comprising the polypeptide.
  • a vector, a host cell line containing the expression vector, a method for producing a hyaluronidase PH-20 variant comprising culturing the host cell line, and prevention of diseases containing the hyaluronidase PH-20 variant, or A pharmaceutical composition for therapeutic use is provided.
  • the novel hyaluronidase PH-20 variant according to the present invention has high stability and excellent activity compared to wild-type human hyaluronidase PH-20, and thus can maximize the therapeutic effect of drugs used together with it.
  • Figure 1 schematically illustrates the substitution positions of amino acid residues Y57H, W304H, T306R, L307K, and T306A in the hyaluronidase PH-20 variant Hy1 of the present invention.
  • Figure 2 schematically shows the position of the disulfide bond in the hyaluronidase PH-20 variant Hy1 of the present invention.
  • Figure 3 shows TM data of hyaluronidase PH-20 variants Hy1, Hy1-M1, and Hy2 using the Protein Thermal ShiftTM Dye Kit from Biosystem. Data for all variants are listed in Table 4.
  • Figure 4 shows the results of evaluating enzyme stability at 37°C for some of the hyaluronidase PH-20 variants. Data for all variants are listed in Table 5.
  • Figure 5 shows the results of evaluating enzyme stability at 50°C for some of the hyaluronidase PH-20 variants. Data for all variants are listed in Table 6.
  • Disulfide bond prediction was performed using the YASARA Web server. Afterwards, in order to select valid variants from the proposed list, disulfide bond modeling was performed using Protein contact map visualization (Andreas Viklund.), which measures the distance between possible disulfide bonds.
  • a general mammalian cell protein expression vector and a general mammalian cell strain for expression were used, and Top10 E. coli strains for cloning were used.
  • Cosmogenetech Co., Ltd. conducted gene synthesis and custom-made primers.
  • the restriction enzymes used during genetic recombination are all from Enzynomics, and the ligase is Enzynomics' EZ-Fusion HT Cloning Kit.
  • the DNA polymerase used for insert PCR and point mutation is Takara's PrimeSTAR HS.
  • the DNA gel extraction kit and plasmid mini prep kit used are products of Cosmogenetech Co., Ltd. DNA sequencing was performed by requesting Macrogen Co., Ltd.
  • the primers used are shown in Table 2.
  • Turbidimetric assay to measure hyaluronidase enzyme activity is a method of measuring the degree to which hyaluronic acid remaining in the reaction solution combines with acidified albumin (BSA) to form aggregates using absorbance.
  • BSA acidified albumin
  • Hyaluronic acid is absorbed by hyaluronidase.
  • Activity was measured using the principle that when ronic acid is hydrolyzed, the amount bound to albumin decreases and the absorbance decreases.
  • Wild-type hyaluronidase was diluted to an appropriate concentration (unit/mL) using cold enzyme diluent buffer and prepared in each tube.
  • the purified hyaluronidase sample was diluted to an appropriate concentration using cold enzyme diluent buffer and prepared in each tube.
  • the 3 mg/mL hyaluronic acid solution was diluted 10 times to a concentration of 0.3 mg/mL, so that the volume of each tube was 180 ⁇ l.
  • Hy1-M5 S36C D426C 1.637
  • Hy1-A1 Y57H 1.049
  • Hy1-A1-M1 Y57H, P80C A160C 2.916
  • Hy1-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 1.078 13 Hy1-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 2.793
  • Hy1-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 1.050 15 Hy1-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 1.717 16 Hy1-A2
  • Tm data of hyaluronidase PH-20 variant was obtained using Biosystem's Protein Thermal ShiftTM Dye Kit. Specifically, to monitor the thermal stability of the variants, a dye that binds to exposed hydrophobic residues was used and measured using a real-time PCR device.
  • Hy1-M1 P80C sequence number designation mutation TM 2 Hy1 62.0 3 Hy2 61.5 4 Hy3 62.6 5 Hy1-M1 P80C, A160C 62.4 6 Hy1-M2 G291C, Y362C 61.5 7 Hy1-M3 L180C, A223C 62.4 8 Hy1-M4 P6C, Y403C 61.5 9 Hy1-M5 S36C, D426C 61.9 10 Hy1-A1 Y57H 62.5 11 Hy1-A1-M1 Y57H, P80C, A160C 62.4 12 Hy1-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 61.5 13 Hy1-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 62.4 14 Hy1-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 61.5 15 Hy1-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 62.0 16 Hy1-A2 W304H
  • the novel hyaluronidase PH-20 variant according to the present invention has high stability and excellent activity compared to wild-type human hyaluronidase PH-20, thereby improving the therapeutic effect of drugs used together with it. Since it can be maximized, it has high industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 신규한 히알루로니다제 PH-20 변이체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체, 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주, 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제조 방법, 및 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체를 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 히알루로니다제 PH-20 변이체 및 그 용도
본 출원은 2022년 09월 16일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2022-0117475호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 신규한 히알루로니다제 PH-20 변이체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체, 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주, 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제조 방법, 및 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체를 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
히알루로니다제(hyaluronidase)는 히알루론산(hyaluronic acid)을 분해하는 효소이다. 인간에게는 Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4, 및 Hyal5 (PH-20 또는 SPAM1으로도 알려짐) 5 종류의 히알루로니다제가 있으며, 여기에 더하여 pseudogene으로서 발현되지 않는 Hyal6P (Hyalp1)가 있는 것으로 알려져 있다. Hyal1, Hyal2, 및 Hyal3 유전자는 3번 염색체에 존재하며, Hyal4, Hyal5, 및 Hyal6P 유전자는 7번 염색체에 존재하고 있다. 인간에서 Hyal1 및 Hyal2는 대부분의 조직에서 발현되는 히알루로니다제이며 pH 3~4 에서 최적의 활성을 나타낸다. 이와 달리, PH-20은 정자의 세포막과 첨체막에서 발현되며, pH 3~8의 넓은 구간에서 활성을 갖는다.
PH-20은 Lathrop 등에 의해 기니피그의 정자에서 처음 동정되었고, 다른 많은 종의 정자에도 발현됨이 알려져있다. 인간의 PH-20 유전자는 SPAM1 (sperm ahdesion molecule 1) 유전자로부터 코딩되며 정자의 세포막 표면과 첨체의 막 안쪽에 PH-20의 Ser490이 glycosylphophatidylinositol (GPI)과 결합한 형태로 존재한다. 정자의 PH-20은 히알루론산이 많은 난자의 cumulus layer를 통과하여 난자 안으로 침투할 때, 히알루론산을 가수분해하는 역할을 한다.
또한, PH-20은 중성 pH에서도 활성을 갖는다는 그 특수성 때문에 치료 약물과 함께 투여되기도 한다. 즉, 고용량 또는 다량 투여가 필요한 약물들, 특히 항체 의약품 등은 일반적으로 정맥 주사를 통하여 투여되는 것이 일반적인데, 이 경우 주사 시간만 약 90분 이상 소요되고, 정맥 주사를 위한 추가적인 조제 작업이 수반되어 환자와 의료진 모두에게 불편함을 발생시키며, 추가적인 비용이 수반되는 문제점이 있다. 이에 반하여 피하주사는 즉각적인 투여가 가능하다는 장점이 있으나, 정맥 주사 대비 흡수율이 낮고, 흡수가 느리게 일어나므로 주사량이 3~5mL 이상일 경우 주사 부위에 팽윤과 통증을 유발할 수 있다. 이러한 이유로 단백질 치료제의 피하주사는 통상 2mL 이하의 소량으로 한정하여 사용되었다. 그러나 히알루로니다제인 PH-20을 치료 약물과 함께 피하 투여하면 히알루로니다제의 작용에 의해 피부 세포외 기질에 분포하는 히알루론산이 가수분해되어 피하부의 점성이 감소하고 물질 투과성이 증가하므로, 고용량의 의약품을 체내에 용이하게 전달할 수 있다.
따라서, PH-20을 이용하여 다양한 치료용 의약품을 피하주사의 제형으로 개발하려는 연구가 진행되고 있다. 현재 상업적으로 많이 이용되는 PH-20은 소나 양의 고환에서 추출한 것이나, 동물 유래 히알루로니다제를 인체에 고용량으로 반복 투여할 경우, 중화 항체가 생성될 수 있으며, PH-20 이외에 불순물로 포함된 동물 유래의 다른 물질이 알러지를 유발할 위험도 있다. 이러한 문제를 개선하기 위해 인간 PH-20 단백질을 이용한 연구가 진행되고 있는데, 다만, 인간 PH-20 자체의 안정성이 낮기 때문에 이를 먼저 극복할 필요가 있다.
따라서 야생형 PH-20에 도입되는 돌연변이는 최소화 하면서도 단백질 안정성과 히알루로니다제 활성은 극대화한 인간 유래 PH-20 변이체 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 인간 유래 야생형 PH-20 단백질에 도입되는 돌연변이를 최소한으로 줄여서 면역원성 문제를 최소화하였으며, 단백질의 내부에 위치하는 아미노산들의 돌연변이와 공유결합을 통해 단백질의 안정성은 높이고 효소 활성은 극대화한 신규한 PH-20 변이체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4으로 이루어진 군에서 선택되며, 추가로 변이가 0 개 내지 3 개 도입된 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주, 및 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;를 포함하는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;로 이루어진 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;로 필수적으로 이루어진 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 질환의 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4으로 이루어진 군에서 선택되며, 추가로 변이가 0 개 내지 3 개 도입된 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주, 및 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;를 포함하는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;로 이루어진 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;로 필수적으로 이루어진 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 질환의 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공한다.
인간 야생형 PH-20 단백질은 하기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 아직 단백질 구조가 밝혀지지 않았다. 인간 히알루로니다제 중에서 단백질 구조가 밝혀진 것은 Hyal1으로, Hyal1과 PH-20의 아미노산 서열은 35.1% 일치한다.
서열번호 1. 인간 야생형 PH-20 아미노산 서열
MGVLKFKHIF FRSFVKSSGV SQIVFTFLLI PCCLTLNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSEFC
LGKFDEPLDM SLFSFIGSPR INATGQGVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL
QDHLDKAKKD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLS
LTEATEKAKQ EFEKAGKDFL VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN
VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVREAIRVSK IPDAKSPLPV
FAYTRIVFTD QVLKFLSQDE LVYTFGETVA LGASGIVIWG TLSIMRSMKS CLLLDNYMET
ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK NWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK
PTLEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPMETEEPQI
FYNASPSTLS ATMFIVSILF LIISSVASL
본 발명자는 상기 인간 야생형 PH-20의 아미노산 서열에서, 신호 서열(signal peptide)인 1 내지 35번째 아미노산 잔기와, C-말단의 일부 서열이 잘린 서열번호 2의 Hy1 단백질을 먼저 제작하였으며, N-말단 및 C-말단의 변형이 효소 활성에 영향을 줄 수 있다고 판단하여, Hy1 아미노산 서열에서 C-말단에 아스파라긴(asparagine)이 추가된 Hy2 (서열번호 3) 및 Hy2 아미노산 서열에서 N-말단에 2개의 아미노산 잔기, 류신(leucine)과 아스파라긴(asparagine)이 삭제된 Hy3 (서열번호 4) 단백질을 추가로 제작하였다.
본 발명에 있어, 각 변이체의 아미노산 잔기 위치는 서열번호 2에 따른 Hy1의 아미노산 위치에 따른다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 바탕으로 active site 모델링과 이황화 결합(disulfide bond) 모델링 과정을 거쳐 추가적인 돌연변이를 도입하였다.
Active site 모델링을 위하여 단백질 3차 구조 모델링은 DeepMind 社의 알파폴드2 (AlphaFold 2)와 (주)굿인텔리전스의 CSA (conformational space annealing) 모델링 기법을 사용하여 3차 구조를 모델링 하였다. Energy minimization은 GROMACS package를 사용하여 local energy minimization을 하였고, CHARMM36 force field를 하였다. PH-20 모델링 구조로부터 여러 변이체를 만들기 위해 Chimera, PyMOL software를 사용하였다. 또한 각 변이체의 단백질-리간드 결합력 예측을 위해 여러 종류의 예측 프로그램을 사용하였다.
이황화 결합 모델링을 위하여, PDB에 등록된 단백질의 구조를 이용하여 이황화 결합이 가능한 후보군을 선정한 뒤, protein contact map visualization 프로그램을 이용하여 2개의 아미노산의 C-alpha 탄소의 거리가 6Å 이하, C-beta 탄소의 거리가 5Å인 잔기를 plot을 이용하여 분석하였다. 이후 YASARA Web Energy Minimization Server를 이용하여 이황화 결합의 생성 유무를 분석한 뒤 Chimera의 AMBER force filed FF99를 이용하여 energy minimization을 진행하였다. 이후 생성된 단백질의 구조를 야생형의 PH-20과 align 하여 RMSD 측정 값이 0.5 이하를 갖도록 하는 돌연변이를 선별하였다.
이에 따라 본 발명의 일 실시 양태에서는, 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체에서, ⅰ) Y57H, ⅱ) W304H, ⅲ) T306R, ⅵ) L307K, 및 ⅴ) T306A로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시 양태에서는, 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체에서, ⅰ) Y57H, ⅱ) W304H, ⅲ) T306R, 및 ⅵ) L307K로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 실시 양태에서는, 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체에서, ⅰ) P80C 및 A160C, ⅱ) G291C 및 Y362C, ⅲ) L180C 및 A223C, ⅵ) P6C 및 Y403C, 및 ⅴ) S36C 및 D426C로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 실시 양태에서는, 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체에서, ⅰ) G291C 및 Y362C, ⅱ) L180C 및 A223C, ⅲ) P6C 및 Y403C, 및 ⅵ) S36C 및 D426C로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 실시 양태에서는, 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체, 또는 ⅰ) Y57H, ⅱ) W304H, ⅲ) T306R, ⅵ) L307K, 및 ⅴ) T306A로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체에서, ⅰ) P80C 및 A160C, ⅱ) G291C 및 Y362C, ⅲ) L180C 및 A223C, ⅵ) P6C 및 Y403C, 및 ⅴ) S36C 및 D426C로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제공한다.
본 발명에 있어서, "Y57"과 같이 1 글자 아미노산 잔기 명과 숫자가 함께 기재된 표현은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열에서의 각 위치에서 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들어 "Y57"은 서열번호 2의 아미노산 서열에서의 57번째 위치의 아미노산 잔기가 티로신임을 의미한다.
또한, "Y57H"는 서열번호 2의 57번째 티로신이 히스티딘으로 치환된 것임을 의미한다.
본 발명에 따른 PH-20 변이체는 특정 아미노산 잔기 위치에서 아미노산 잔기가 보존적으로 치환된 변이체를 포함하는 의미로 해석된다.
상기 '보존적 치환'이란 1개 이상의 아미노산을 PH-20 변이체의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 PH-20 변이체의 변형을 의미한다.
'보존적 아미노산 치환'은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
본 발명에 있어서 PH-20 변이체는 보존적 아미노산 치환을 갖더라도 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다. 또한, 본 발명에 따른 PH-20 변이체는, 본 발명에 따른 PH-20 변이체와 실질적으로 동일한 기능 및/또는 효과를 가지며, 80% 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 PH-20 변이체도 포함하는 의미로 해석된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH-20 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 109의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 본 발명에 따른 실시예에서 제작한 히알루로니다제 PH-20 변이체의 아미노산 서열은 하기의 표 1에 기재된 바와 같다.
서열
번호		 명칭 돌연변이 아미노산 서열
2 Hy1 　 LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
3 Hy2 　 LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
4 Hy3 　 FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
5 Hy1-M1 P80C, A160C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGICQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKCGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
6 Hy1-M2 G291C, Y362C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFCETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDCLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
7 Hy1-M3 L180C, A223C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHCWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTCLYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
8 Hy1-M4 P6C, Y403C LNFRACPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCCSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
9 Hy1-M5 S36C, D426C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMCLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIACGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
10 Hy1-A1 Y57H LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
11 Hy1-A1-M1 Y57H, P80C, A160C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGICQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKCGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
12 Hy1-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFCETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDCLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
13 Hy1-A1-M3 Y57H, L180C, A223C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHCWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTCLYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
14 Hy1-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C LNFRACPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCCSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
15 Hy1-A1-M5 Y57H, S36C, D426C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMCLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIACGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
16 Hy1-A2 W304H LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIHGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
17 Hy1-A2-M1 W304H, P80C, A160C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGICQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKCGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIHGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
18 Hy1-A2-M2 W304H, G291C, Y362C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFCETVALGASGIVIHGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDCLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
19 Hy1-A2-M3 W304H, L180C, A223C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHCWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTCLYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIHGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
20 Hy1-A2-M4 W304H, P6C, Y403C LNFRACPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIHGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCCSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
21 Hy1-A2-M5 W304H, S36C, D426C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMCLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIHGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIACGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
22 Hy1-A3 T306R LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGRLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
23 Hy1-A3-M1 T306R, P80C, A160C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGICQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKCGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGRLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
24 Hy1-A3-M2 T306R, G291C, Y362C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFCETVALGASGIVIWGRLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDCLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
25 Hy1-A3-M3 T306R, L180C, A223C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHCWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTCLYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGRLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY
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66 Hy2-A4-M3 L307K, L180C, A223C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHCWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTCLYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTKSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
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68 Hy2-A4-M5 L307K, S36C, D426C LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMCLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTKSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIACGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
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77 Hy3-M3 L180C, A223C FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHCWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTCLYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
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82 Hy3-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFCETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDCLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
83 Hy3-A1-M3 Y57H, L180C, A223C FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHCWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTCLYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
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85 Hy3-A1-M5 Y57H, S36C, D426C FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMCLFSFIGSPRINATGQGVTIFHVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIACGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN
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또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH-20 변이체를 암호화(코딩)하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 당업계에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어, 다른 세포의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 '단리'되거나 '실질적으로 순수하게 된' 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 PH-20 변이체를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오타이드의 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산 분자로서 제공될 수 있다.
본 발명의 PH-20 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 상기 본 발명의 PH-20 변이체를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 또는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 '발현 벡터' 또는 '재조합 벡터'란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
상기 용어 '작동 가능하게 연결된(operably linked)'는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
하나의 실시 양태에서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등과 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
시그널 서열에는 숙주가 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주를 제공한다. 즉, 본 발명은 상기 발현 벡터(재조합 벡터)로 형질전환된 형질전환체(숙주 세포)를 제공한다.
상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입할 수 있는 것으로 공지된 것이라면 어떤 방법이라도 사용 가능하며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
상기 용어 '형질전환체'는 '숙주 세포' 등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.
본 발명에서 상기 형질전환체는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia 속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 형질전환체는 바람직하게 형질전환 미생물을 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포일 수 있다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용 가능하며, 특히 바람직하게는 CHO 세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제조 방법을 제공한다.
상기 PH-20 변이체 또는 이의 절편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 경우, PH-20 변이체는 숙주 세포에서 발현되기에 충분한 기간 동안, 더 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배양 배지 내로 PH-20 변이체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
상기 숙주 세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 숙주 세포에서 생산되는 PH-20 변이체는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화 되도록 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 PH-20 변이체가 그 효소 활성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질을 리폴딩(refolding)시키고, 기능성 구조(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다.
경우에 따라서, 발현된 PH-20 변이체는 숙주 세포로부터 분리하여 균일하도록 정제할 수 있다. 상기 PH-20 변이체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어, 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 또는 소수성 크로마토그래피에서 선택된 하나 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 크로마토그래피 이외에 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;를 포함하는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어, 상기 약물은 단백질 의약품(protein drugs), 항체 의약품, 소분자 화합물(small molecules), 앱타머(aptamer), RNAi, antisence, CAR-T 세포 (chimeric antigen receptor T cell) 또는 CAR-NK 세포 (CAR natural killer cell) 등의 세포 치료제 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 현재 상용화되어 사용되고 있는 약물 뿐만 아니라, 임상 및 개발이 진행 중에 있는 약물이 모두 사용 가능하다. 상기 약물로는 바람직하게는 단백질 의약품이나 항체 의약품이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어, 상기 '단백질 의약품'은 아미노산으로 구성되어 단백질의 활성을 통해 질병의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 약물로서, 항체 의약품 이외의 단백질로 이루어진 의약품을 의미하며, 사이토카인(cytokines), 치료용 효소(therapeutic enzyme), 호르몬(hormone), 수용성 수용체(soluble receptor) 및 이의 융합 단백질, 인슐린(insulin) 또는 이의 유사체, BMP(bone morphogenetic protein), EPO (erythropoietin) 및 혈장 유래 단백질(serum derived protein) 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 '사이토카인'은 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukin), CSF (colony stimulating factor), TNF (tumor necrosis factor) 및 TGF (tissue growth factor) 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 '치료용 효소'는 베타-글루코세레브로시다제(β-glucocerebrosidase) 및 아갈시다제 베타(agalsidase β) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 '수용성 수용체'는 수용체의 세포 외 도메인(extracellular domain)을 의미하고, 이의 융합 단백질은 상기 수용성 수용체에 항체의 Fc 영역 등이 융합된 단백질을 의미한다. 상기 수용성 수용체는 질병과 관련된 리간드가 결합하는 수용체의 수용성 형태로서, TNF-α 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태(예를 들어, 에타너셉트(etanercept)라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태) 및 VEGF 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태(예를 들어, 아플리버셉트(Aflibercept)라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), CTLA-4에 Fc 영역이 융합된 형태(예를 들어, 아바타셉트(Abatacept) 또는 벨라다셉트(Belatacept)라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), 인터루킨1 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태(예를 들어, 릴로나셉트(Rilonacept)라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), LFA3 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태(예를 들어, 알레파셉트(Alefacept) 라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태) 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 '호르몬'은 호르몬 결핍 등으로 인해 발생하는 질환의 치료 또는 예방을 위해 체외에서 주입하는 호르몬 또는 이의 유사체를 의미하며, 사람 성장호르몬(human growth hormone), 에스트로겐(estrogen), 프로게스테론(progesterone) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 '혈장 유래 단백질'은 혈장에 존재하는 단백질로, 혈장에서 추출한 것과 재조합으로 생산된 것들 모두를 의미하며, 피브리노겐(fibrinogen), 본 빌레블란트 인자(von Willebrand Factor), 알부민(albumin), 트롬빈(thrombin), FII (Factor II), FV (Factor V), FVII (Factor VII), FVIII (Factor VIII), FIX (Factor IX), FX (Factor X) 및 FXI (Factor XI) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어, 상기 '항체 의약품'은 단클론 항체 의약품(monoclonal antibody drug) 또는 다클론 항체 의약품(polyclonal antibody drug)일 수 있다.
상기 '단클론 항체 의약품'은 특정 질병과 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체 및 단클론 항체 단편을 포함한 단백질을 의미한다. 단클론 항체에는 이중 항체도 포함되며, 단클론 항체 또는 이의 단편을 포함하는 단백질은 ADC (antibody-drug conjugate)를 포함하는 의미로 사용된다. 특정 질병과 관련된 항원은 4-1BB, 인테그린(integrin), 아밀로이드 베타(amyloid beta), 안지오포에틴(안지오포에틴 1 또는 2), 안지오포에틴 유사물질3, B세포 활성인자(B-cell activating factor, BAFF), B7-H3, 보체5 (complement 5), CCR4, CD3, CD4, CD6, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD62, CD79b, CD80, CGRP, 클라우딘18 (Claudin-18), 보체요소 D (complement factor D), CTLA4, DLL3, EGF 수용체, 혈우병인자, Fc 수용체, FGF23, 폴레이트 (folate) 수용체, GD2, GM-CSF, HER2, HER3, 인터페론 수용체, 인터페론 감마, IgE, IGF-1 수용체, 인터루킨1, 인터루킨2 수용체, 인터루킨4 수용체, 인터루킨5, 인터루킨5 수용체, 인터루킨6, 인터루킨6 수용체, 인터루킨7, 인터루킨12/23, 인터루킨13, 인터루킨17A, 인터루킨17수용체A, 인터루킨31 수용체, 인터루킨36 수용체, LAG3, LFA3, NGF, PVSK9, PD-1, PD-L1, RANK-L, SLAMF7, 조직인자 (tissue factor), TNF, VEGF, VEGF 수용체 및 vWF (von Willebrand Factor)이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 이하는 상기 특정 질병과 관련된 항원에 대한 단클론 항체 및 단클론 항체 단편을 포함하는 단백질이다;
4-1BB에 대한 항체로 유토밀루맙(Utomilumab);
인테그린에 대한 항체로 나탈리주맙(Natalizumab), 에트롤리주맙(Etrolizumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 비마그루맙(Bimagrumab);
아밀로이드 베타에 대한 항체로 바피네우주맙(Bapineuzumab), 크레네주맙(Crenezumab), 솔라네주맙(Solanezumab), 아두카누맙(Aducanumab), 간테네루맙(Gantenerumab);
안지오포에틴에 대한 항체로 안지오포에틴 1과 2에 대한 AMG 780, 안지오포에틴 2에 대한 MEDI 3617, 네스바쿠맙(Nesvacumab)과 안지오포에틴 2와 VEGF의 이중항체인 바누씨주맙(Vanucizumab);
안지오포에틴 유사물질3에 대한 항체로 에비나쿠맙(Evinacumab);
B세포 활성인자(B-cell activating factor, BAFF)에 대한 항체로 타발루맙(Tabalumab), 라나루맙(Lanalumab), 베리무맙(Belimumab);
B7-H3에 대한 항체로 옴부르타맙(omburtamab);
보체5(complement 5)에 대한 항체로 라불리주맙(Ravulizumab), 에쿨리주맙(Eculizumab);
CCR4에 대한 항체로 모가물리주맙(Mogamulizumab);
CD3에 대한 항체로 오텔릭시주맙(Otelixizumab), 테플리주맙(Teplizumab), 무로모납(Muromonab)과 GP100과 CD3에 대한 이중 항체인 테벤타프스프(Tebentafusp), CD19와 CD3에 대한 이중항체인 블리나투모맙(Blinatumomab); CD20과 CD3에 대한 이중 항체인 REGN1979;
CD4에 대한 항체로 이발리주맙(Ibalizumab), 자놀리무맙(Zanolimumab);
CD6에 대한 항체로 이톨리주맙(Itolizumab);
CD11a에 대한 항체로 에팔리주맙(Efalizumab);
CD19에 대한 항체로 이네빌리주맙(Inebilizumab), 타파시타맙(Tafasitamab) 과 ADC인 론카스툭시맙 테시린(Loncastuximab tesirine);
CD20에 대한 항체로 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 우블리툭시맙(Ublituximab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투모맙(Tositumomab)과 ADC인 이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan);
CD22에 대한 항체로 에프라투주맙(Epratuzumab)과 ADC인 이노투주맙 오조가마이신(Inotuzumab ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스(Moxetumomab pasudotox);
CD30에 대한 ADC는 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin);
CD33에 대한 ADC는 바다스툭시맙 탈리닌(Vadastuximab talirine), 젬투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin);
CD38에 대한 항체로 다라투무맙(Daratumumab), 이사툭시맙(Isatuximab);
CD52에 대한 항체로 알렘투주맙(Alemtuxumab);
CD62에 대한 항체로 크리잔리주맙(Crizanlizumab);
CD79b에 대한 ADC는 폴라투주맙 베도틴(Polatuzumab vedotin);
CD80에 대한 항체로 갈릭시맙(Galiximab);
CGRP에 대한 항체로 엪티네주맙(Eptinezumab), 프레마네주맙(Fremanezumab), 갈카네주맙(Galcanezumab), 에레누맙(Erenumab);
클라우딘18(Claudin-18) 에 대한 항체로 졸베툭시맙(Zolbetuximab);
보체요소 D(complement factor D)에 대한 항체로 람팔리주맙(Lampalizumab);
CTLA4에 대한 항체로 트레멜리무맙(Tremelimumab), 잘리프렐리맙(Zalifrelimab), 이플리무맙(Ipilimumab);
DLL3에 대한 ADC는 로발피투주맙 테시린(Rovalpituzumab tesirine);
EGF 수용체에 대한 항체로 세툭시맙(Cetuximab), 데파툭시주맙(Depatuxizumab), 잘루투무맙(Zalutumumab), 네시투무맙(Necitumumab), 파니투무맙(Panitumumab);
혈우병 인자인 coagulation factor IX 및 Factor X에 대한 이중 항체로 에미시주맙(Emicizumab);
Fc 수용체에 대한 항체로 니포칼리맙(Nipocalimab), 로잔놀릭시주맙(Rozanolixizumab);
FGF23에 대한 항체로 부로스맙(Burosumab);
폴레이트(folate) 수용체에 대한 항체로 팔레투주맙(Farletuzumab)과 ADC인 미르베툭시맙 소랍탄신(Mirvetuximab soravtansine);
GD2에 대한 항체로 디누툭시맙(Dinutuximab), 낙시타맙(Naxitamab);
GM-CSF에 대한 항체로 오틸리맙(Otilimab);
HER2에 대한 항체로 마르게툭시맙(Margetuximab), 페르투주맙(Pertuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab)과 ADC는 트라수투주맙 데룩테칸(Trastuzumab deruxtecan), 트라수투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine), 트라수투주맙 두오카르마진(Trastuzumab duocarmazine);
HER3에 대한 항체로 파트리투맙(Patritumab);
인터페론 수용체에 대한 항체로 아니프롤루맙(Anifrolumab);
인터페론 감마에 대한 항체로 에마팔루맙(Emapalumab);
IgE에 대한 항체로 리겔리주맙(Ligelizumab), 오말리주맙(Omalizumab);
IGF-1 수용체에 대한 항체로 달로투주맙(Dalotuzumab), 피기투무맙(Figitumumab), 테프로투무맙(Teprotumumab);
인터루킨1에 대한 항체로 게보키주맙(Gebokizumab), 카나키누맙(Canakinumab);
인터루킨2 수용체에 대한 항체로 다클리주맙(Daclizumab), 바실릭시맙(Basiliximab);
인터루킨4 수용체에 대한 항체로 두필루맙(Dupilumab);
인터루킨5에 대한 항체로 메폴리주맙(Mepolizumab), 레슬리주맙(Reslizumab);
인터루킨5 수용체에 대한 항체로 벤랄리주맙(Benralizumab);
인터루킨6에 대한 항체로 클라자키주맙(Clazakizumab), 올로키주맙(Olokizumab), 시루쿠맙(Sirukumab), 실툭시맙(Siltuximab);
인터루킨6 수용체에 대한 항체로 사릴루맙(Sarilumab), 사트랄리주맙(Satralizumab), 토실리주맙(Tocilizumab), REGN88;
인터루킨7에 대한 항체로 세쿠키누맙(Secukinumab);
인터루킨12/23에 대한 항체로 우스테키누맙(Ustekinumab), 브리아키누맙(Briakinumab);
인터루킨13에 대한 항체로 레브리키주맙(Lebrikizumab), 트랄로키누맙(Tralokinumab);
인터루킨17A에 대한 항체로 익세키주맙(Ixekizumab), 비메키주맙(Bimekizumab);
인터루킨17 수용체A에 대한 항체로 브로달루맙(Brodalumab);
인터루킨23에 대한 항체로 브라지쿠맙(Brazikumab), 구셀쿠맙(Guselkumab), 리산키주맙(Risankizumab), 틸드라키주맙(Tildrakizumab), 미리키주맙(Mirikizumab);
인터루킨31 수용체에 대한 항체로 네몰리주맙(Nemolizumab);
인터루킨36 수용체에 대한 항체로 스페솔리맙(Spesolimab);
LAG3에 대한 항체로 렐라틀리맙(Relatlimab);
NASP2에 대한 항체로 나르소플리맙(Narsoplimab);
NGF에 대한 항체로 파시누맙(Fasinumab), 타네주맙(Tanezumab);
PVSK9에 대한 항체로 알리로쿠맙(Alirocumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 보코시주맙(Bococizumab);
PD-1에 대한 항체로 람브롤리주맙(Lambrolizumab), 발스틸리맙(Balstilimab), 캄렐리주맙(Camrelizumab), 쎄미플리맙(Cemiplimab), 도스탈리맙(Dostarlimab), 프롤골리맙(Prolgolimab), 신틸리맙(Sintilimab), 스파르탈리주맙(Spartalizumab), 티슬레리주맙(Tislelizumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab);
PD-L1에 대한 항체로 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 엔바폴리맙(Envafolimab), 둘발루맙(Durvalumab)과 TGF beta와 PD-L1의 이중 항체인 빈트라푸스프 알파(Bintrafusp alpha);
RANK-L에 대한 항체로 데노수맙(Denosumab);
SLAMF7에 대한 항체로 엘로투주맙(Elotuzumab);
조직인자(Tissue factor)에 대한 항체로 콘시주맙(Concizumab), 말스타시맙(Marstacimab);
TNF, 특히 TNFα 에 대한 항체로 인플릭시맙(Infliximab), 아달리무맙(Adalimumab), 골리무맙(Golimumab)과 항체 단편인 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol), TNF와 알부민에 대한 이중항체인 오조랄리주맙(Ozoralizumab);
VEGF에 대한 항체로 브롤루시주맙(Brolucizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 베바시주맙(Bevacizumab)과 VEGF와 Ang2의 이중 항체인 파리시맙(Faricimab);
VEGF 수용체에 대한 항체로 라무시루맙(Ramucirumab); 및
vWF에 대한 항체로 카플라시주맙(Caplacizumab).
상기 '다클론 항체 의약품'은 면역글로불린(immune globulin) 등의 혈장 등에서 추출한 혈장 항체(serum antibody) 등이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에서 항체 의약품의 함량은 5 내지 500 mg/mL, 바람직하게는 20 내지 200 mg/mL, 더욱 바람직하게는 100 내지 150 mg/mL, 가장 바람직하게는 120±18 mg/mL 일 수 있으며, 예를 들어 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL 또는 약 130 mg/mL일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 '소분자 화합물'은 예방이나 치료의 목적으로 빠른 효과가 요구되는 약물이라면 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 모르핀(morphine) 계열의 진통제가 사용될 수 있다. 또한, 항암제에 의한 조직 괴사의 치료제로 사용하는 경우에 단독으로 사용하거나 antidote 약물인 Vinca Alkaloids 계통, Taxane 계통의 약물과 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 완충제, 안정화제, 및 계면활성제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 '완충제'는 4 내지 8, 바람직하게는 5 내지 7의 pH를 제공하는 것이면 제한 없이 사용 가능하며, 바람직하게는 말산염(malate), 폼산염(formate), 시트르산염(citrate), 아세테이트(acetate), 프로피오네이트(propionate), 피리딘(pyridine), 피페라진(piperazine), 카코딜산(cacodylate), 석신산(succinate), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES), 히스티딘(histidine), 트리스(Tris), 비스-트리스(bis-Tris), 인산염(phosphate), 에탄올아민(ethanolamine), 탄산염(carbonate), 2-에테인술폰산(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid), PIPES), 이미다졸(imidazole), 비스-트리스 프로판(BIS-Tris propane), BES (N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid), HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid), 피로인산염(pyrophosphate), 및 트리에탄올아민(triethanolamine)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이 바람직하고, 히스티딘 완충제, 예를 들면 L-히스티딘/HCl인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 완충제의 농도는 0.001 내지 200 mM, 바람직하게는 1 내지 50 mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 40 mM, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mM일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 '안정화제'는 단백질의 안정화 목적으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질이라면 제한 없이 사용 가능하며, 바람직한 예로서 탄수화물, 당류 또는 이들의 수화물, 당 알코올류 또는 이들의 수화물, 및 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 안정화제로 사용되는 '탄수화물, 당류 또는 당알코올류'는 트레할로스 또는 그의 수화물, 수크로스, 사카린, 글리세롤, 에리스톨, 트레이톨, 자일리톨, 아라비톨, 리비톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨, 푸시톨, 아이디톨, 이노시톨, 볼레미톨, 이소말트, 말티톨, 폴리글리시톨, 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 하이드로옥실프로필 사이클로덱스트린(Hydroxypropyl Beta-cyclodextrin) 및 글루코스로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 약학적 조성물에서 안정화제로 사용되는 상기 당류 또는 당알코올류의 농도는 0.001 내지 500 mM, 바람직하게는 100 내지 300 mM, 더욱 바람직하게는 150 내지 250 mM, 가장 바람직하게는 180 내지 230 mM일 수 있다.
상기 '아미노산'은 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 라이신, 라이실라이신, 류신 메티오닌, 발린, 세린, 셀레노메티오닌, 시트롤린, 아르기닌, 아스파라진, 아스파트산, 오르니틴, 아이소류신, 타우린, 테아닌, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 프롤린, 피롤라이신, 히스티딘 및 알라닌으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 약학적 조성물에서 안정화제로 사용되는 아미노산의 농도는 1 내지 100 mM, 바람직하게는 3 내지 30 mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 7 내지 20 mM일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에는 추가적으로 계면활성제가 포함될 수 있다. 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산 에스테르 [폴리소르베이트(polysorbate) 또는 트윈(tween)], 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌-스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 모노라우릴 에테르, 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르 [트리톤(triton)-X], 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 [폴록사머(poloxamer), 플루로닉(pluronic)] 및 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 등의 비이온성 계면활성제가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트(polysorbate)가 사용될 수 있다. 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80일 수 있다. 그러나, 그에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에서 비이온성 계면활성제의 농도는 0.0000001% 내지 0.5%(w/v), 바람직하게는 0.000001% 내지 0.4%(w/v), 더욱 바람직하게는 0.00001% 내지 0.3%(w/v), 가장 바람직하게는 0.001% 내지 0.2% (w/v)일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 정맥내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 투여, 내피 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등의 방법으로 투여할 수 있으며, 피하 투여를 통해 투여되는 것이 바람직하고, 피하 주사 투여를 위한 주사 제형의 형태로 사용되는 것이 더욱 바람직하다. 이에 따라 본 발명의 일 양태에서는, 본 발명에 따른 약학적 조성물을 포함하는 피하 투여용 제형을 제공한다.
상기 피하 투여용 제형은 추가적인 희석 과정 없이 즉시 투여 가능한 형태(ready-to-injection) 형태로 제공될 수 있으며, 프리필드 시린지(pre-filled syringe) 또는 유리 앰플이나 플라스틱 용기에 포함되어 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 예방 또는 치료 대상이 되는 질환에는 특별한 제한은 없으며, 본 발명에 따른 PH-20 변이체와 병용 가능한 약물로 치료 가능한 질환이면 아무런 제한이 없다. 구체적으로 상기 질환은 암, 자가면역질환 등이 예시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 '암' 또는 '암종'은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 상기 암의 예로는 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 위암, 대장암, 유방암, 폐암 및 신장암으로 구성된 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 '자가면역질환'은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 천식(asthma), 건선(psoriasis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 전신성 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병(type I diabetes), 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD) 및 아토피성 피부염(Atopic dermatitis)으로 구성된 군에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 질환의 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 약물; 및 b) 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체;를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 본 발명에 따른 PH-20 변이체와 병용 가능한 약물로 치료 가능한 질환 또는 상기 질환의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 상기 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 본 발명에 따른 PH-20 변이체와 병용 가능한 약물로 치료 가능한 질환 또는 상기 질환으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “을 포함하는(comprising)”이란 “함유하는(including)” 또는 “특징으로 하는(characterized by)”과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 “로 이루어지는(consisting of)”이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 “필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)”이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 신규한 히알루로니다제 PH-20 변이체, 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주, 상기 숙주 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제조 방법, 및 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체를 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 신규한 히알루로니다제 PH-20 변이체는 야생형의 인간 히알루로니다제 PH-20와 비교하여 안정성이 높고 활성이 뛰어나므로, 이와 함께 사용되는 약물의 치료 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 히알루로니다제 PH-20 변이체 Hy1에 있어서, Y57H, W304H, T306R, L307K, 및 T306A 아미노산 잔기의 치환 위치를 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 히알루로니다제 PH-20 변이체 Hy1에 있어서 이황화결합의 위치를 도식화한 것이다.
도 3은 바이오시스템 사의 Protein Thermal Shift™ Dye Kit를 사용하여 히알루로니다제 PH-20 변이체 Hy1, Hy1-M1, 및 Hy2의 TM 데이터를 나타낸 것이다. 전체 변이체에 대한 자료는 표 4에 기재되었다.
도 4는 히알루로니다제 PH-20 변이체들 중 일부에 대하여 37℃에서 효소 안정성을 평가한 결과를 나타낸 것이다. 전체 변이체에 대한 자료는 표 5에 기재되어 있다.
도 5는 히알루로니다제 PH-20 변이체 중 일부에 대하여 50℃에서 효소 안정성을 평가한 결과를 나타낸 것이다. 전체 변이체에 대한 자료는 표 6에 기재되어 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루로니다제 PH-20 구조의 3D 모델링
1-1. Active site 모델링
단백질 구조가 밝혀지지 않은 히알루로니다제 PH-20 에 대해 DeepMind 사의 알파폴드2 모델링 프로그램을 이용하여 초기 모델 구조 5개를 제조하였다. 이후, 5개의 모델을 주형(template) 구조로 사용하고, ㈜굿인텔리전스의 단백질 구조 모델링 기법을 통해 최종 3차 구조를 완성하였다.
Active site의 아미노산 잔기들에 대해서는 19개의 다른 아미노산으로의 치환을 통해 여러 변이체를 만들고 각각의 변이체들에 대해 단백질과 리간드에 대한 결합력 예측을 위해 다양한 예측 프로그램을 사용하였다. 최종적으로 이 중 결합력이 높을 것으로 예측되는 변이체 5개를 선별하여 제작하였다.
1-2. 이황화결합 모델링
Active site 모델링을 진행한 후 효소의 안정도를 증가시키기 위하여 내부 이황화결합을 도입하는 작업을 수행하였다. 이황화 결합 예측(disulfide predict)은 YASARA Web server를 이용하였다. 이후 제안된 목록들 중에서 유효한 변이체를 선정하기 위하여 이황화결합이 가능한 거리를 측정해주는 Protein contact map visualization (Andreas Viklund.)을 이용하여 이황화결합 모델링을 수행하였다.
실시예 2. 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제작
상기 모델링 및 시뮬레이션 결과를 바탕으로 히알루로니다제 PH-20 변이체를 제작하였다.
2-1. Cloning vector 제작
일반적인 mammalian cell 단백질 발현 벡터와 일반적인 발현용 mammalian cell 균주를 사용하였으며, Cloning용 E. coli 균주는 Top10을 사용하였다. ㈜코스모진텍에서 유전자 합성, primer 주문 제작을 진행하였다. 유전자 재조합 시 사용된 제한효소는 모두 enzynomics의 제품이며, ligase는 enzynomics의 EZ-Fusion HT Cloning Kit이다. Insert PCR, point mutation에 사용된 DNA polymerase는 Takara의 PrimeSTAR HS이다. 사용된 DNA gel extraction kit, plasmid mini prep kit는 ㈜코스모진텍의 제품이다. DNA sequencing은 ㈜마크로젠에 의뢰하여 수행하였다.
사용된 primer는 표 2과 같다.
Mutation
Name		 primer (F) primer (R)
SEQ ID SEQ SEQ ID SEQ
Hy1, Hy2, Hy3 110 taccgagctcggatccgccaccat 111 gggccctctagactcgagtcagtgatg
Y57H 112 ggtgttacaatatttcacgttgatagacttggctac 113 gtagccaagtctatcaacgtgaaatattgtaacacc
W304H 114 tctggaattgtaatacacggaaccctcagtataatg 115 cattatactgagggttccgtgtattacaattccaga
T306R 116 ggaattgtaatatggggaagactcagtataatgcga 117 tcgcattatactgagtcttccccatattacaattcc
L307K 118 ggaattgtaatatggggaaccaagagtataatgcgaa 119 ttcgcattatactcttggttccccatattacaattcc
T306A 120 attgtaatatggggagccctcagtataatgcga 121 tcgcattatactgagggctccccatattacaat
P80C 122 gtgaatggaggaatctgccagaagatttcctta 123 aaggaaatcttctggcagattcctccattcac
A160C 124 caagaatttgaaaagtgcgggaaggatttcctg 125 caggaaatccttcccgcacttttcaaattcttg
G291C 126 cttgtgtatacattttgcgaaactgttgctctgg 127 ccagagcaacagtttcgcaaaatgtatacacaag
Y362C 128 tggaattcaagtgactgccttcacctcaa 129 gaaggcagtcacttgaattccagtttttcc
L180C 130 cttcggccaaatcactgctggggttattat 131 ataataaccccagcagtgatttggccgaag
A223C 132 tggaatgaaagcacttgcctttacccatccatt 133 ggatgggtaaaggcaagtgctttcattcc
P6C 134 ctgaatttcagagcatgccctgttattccaaatgt 135 acatttggaataacagggcatgctctgaaattcag
Y403C 136 ttttattgcagctgttgcagcaccttgagttgt 137 acaactcaaggtgctgcaacagctgcaataaaa
S36C 138 gagccactagatatgtgcctcttctctttcata 139 atgaaagagaagaggcacatatctagtggctc
D426C 140 gatgtgtgtattgcttgcggtgtctgtatagat 141 atctatacagacaccgcaagcaatacacacatc
2-2. 단백질 발현
ExpiFectamine CHO reagent를 이용하여 Cricetulus griseus(CHO)에 유전자를 형질전환 시킨 후 습도 80%, 5~8% CO2 의 37℃ 궤도형 쉐이커에서 33~38 ml 세포를 9~13일간 배양하였다. 발현된 단백질은 SDS-page와 western blot을 이용하여 확인 한 후 0.22㎛ 필터로 여과하여 정제에 사용하였다.
2-3. 단백질 정제
정제는 HisTrap HP 컬럼을 이용하였다. 컬럼은 사용 전 binding buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4)를 이용하여 평형을 맞춰주었다. 준비된 컬럼에 준비한 배양액을 흘려주어 목적 단백질을 컬럼에 결합시킨 뒤 binding buffer로 다시 한번 세척해주었다. 이후 컬럼에 결합 된 목적 단백질을 용출하기 위해 elution buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 0.5 M imidazole를 이용, linear gradient 방법으로 목적 단백질을 선별하였다. 모든 과정은 3 ml/min 속도로 진행되었다. 선별한 목적 단백질은 0.2 ㎛ 필터로 여과 후 활성을 측정하였다. FPLC는 GE UPC-800을 사용하였다.
실시예 3. 히알루로니다제 PH-20 변이체의 활성 평가
히알루로니다제 효소 활성을 측정하는 Turbidimetric assay 방법은 반응 용액에 잔존하는 히알루론산이 산성화된 알부민(BSA)과 결합하여 응집체를 형성하는 정도를 흡광도로 측정하는 방법으로, 히알루로니다제에 의해 히알루론산이 가수분해되면 알부민과 결합하는 양이 감소하여 흡광도가 감소하는 원리를 이용하여 활성을 측정하였다. 야생형 히알루로니다제를 cold enzyme diluent buffer를 이용하여 적합한 농도(unit/mL)가 되도록 희석하여 각 튜브에 준비하였다. 정제된 히알루로니다제 시료를 cold enzyme diluent buffer를 이용, 적합한 농도로 희석하여 각 튜브에 준비하였다. 새로운 튜브에 3 mg/mL인 히알루론산 용액을 농도가 0.3 mg/mL 되게 10배 희석하여 각 튜브의 부피가 180 ㎕가 되게 하였다. 희석한 히알루론산 용액에 히알루로니다제가 포함된 시료를 60 ㎕ 넣고 혼합(hyaluronic acid : hyaluronidase=3:1)하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 96-well plate에 반응시킨 히알루로니다제 50 ㎕와 acidic albumin solution 250 ㎕를 각 well에 넣고 실온에서 10분간 진탕한 후 600 nm에서 분광 광도계로 흡광도를 측정하였다. 야생형 히알루로니다제로부터 얻은 흡광도를 이용하여 standard curve를 만들었다. Standard curve를 이용하여 히알루로니다제 시료의 활성(units/mL)을 구하였다. 각 히알루로니다제 활성은 3회 반복으로부터 얻은 값과 오차값을 표기하였다.
그 결과, 각 히알루로니다제 PH-20 변이체의 활성은 하기 표 3과 같았다.
서열번호 명칭 돌연변이 Exp. Act
2 Hy1 　 1.000
3 Hy2 　 2.105
4 Hy3 　 3.442
5 Hy1-M1 P80C, A160C 2.780
6 Hy1-M2 G291C, Y362C 1.028
7 Hy1-M3 L180C, A223C 2.663
8 Hy1-M4 P6C, Y403C 1.001
9 Hy1-M5 S36C, D426C 1.637
10 Hy1-A1 Y57H 1.049
11 Hy1-A1-M1 Y57H, P80C, A160C 2.916
12 Hy1-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 1.078
13 Hy1-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 2.793
14 Hy1-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 1.050
15 Hy1-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 1.717
16 Hy1-A2 W304H 1.013
17 Hy1-A2-M1 W304H, P80C, A160C 2.816
18 Hy1-A2-M2 W304H, G291C, Y362C 1.042
19 Hy1-A2-M3 W304H, L180C, A223C 2.698
20 Hy1-A2-M4 W304H, P6C, Y403C 1.014
21 Hy1-A2-M5 W304H, S36C, D426C 1.658
22 Hy1-A3 T306R 1.464
23 Hy1-A3-M1 T306R, P80C, A160C 4.070
24 Hy1-A3-M2 T306R, G291C, Y362C 1.505
25 Hy1-A3-M3 T306R, L180C, A223C 3.898
26 Hy1-A3-M4 T306R, P6C, Y403C 1.465
27 Hy1-A3-M5 T306R, S36C, D426C 2.396
28 Hy1-A4 L307K 0.405
29 Hy1-A4-M1 L307K, P80C, A160C 1.125
30 Hy1-A4-M2 L307K, G291C, Y362C 0.416
31 Hy1-A4-M3 L307K, L180C, A223C 1.077
32 Hy1-A4-M4 L307K, P6C, Y403C 0.405
33 Hy1-A4-M5 L307K, S36C, D426C 0.662
34 Hy1-A5 T306A 1.144
35 Hy1-A5-M1 T306A, P80C, A160C 3.180
36 Hy1-A5-M2 T306A, G291C, Y362C 1.176
37 Hy1-A5-M3 T306A, L180C, A223C 3.045
38 Hy1-A5-M4 T306A, P6C, Y403C 1.145
39 Hy1-A5-M5 T306A, S36C, D426C 1.872
40 Hy2-M1 P80C, A160C 5.851
41 Hy2-M2 G291C, Y362C 2.164
42 Hy2-M3 L180C, A223C 5.604
43 Hy2-M4 P6C, Y403C 2.107
44 Hy2-M5 S36C, D426C 3.445
45 Hy2-A1 Y57H 2.207
46 Hy2-A1-M1 Y57H, P80C, A160C 6.137
47 Hy2-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 2.270
48 Hy2-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 5.878
49 Hy2-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 2.210
50 Hy2-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 3.614
51 Hy2-A2 W304H 2.132
52 Hy2-A2-M1 W304H, P80C, A160C 5.928
53 Hy2-A2-M2 W304H, G291C, Y362C 2.192
54 Hy2-A2-M3 W304H, L180C, A223C 5.677
55 Hy2-A2-M4 W304H, P6C, Y403C 2.134
56 Hy2-A2-M5 W304H, S36C, D426C 3.490
57 Hy2-A3 T306R 3.081
58 Hy2-A3-M1 T306R, P80C, A160C 8.565
59 Hy2-A3-M2 T306R, G291C, Y362C 3.167
60 Hy2-A3-M3 T306R, L180C, A223C 8.203
61 Hy2-A3-M4 T306R, P6C, Y403C 3.084
62 Hy2-A3-M5 T306R, S36C, D426C 5.043
63 Hy2-A4 L307K 0.852
64 Hy2-A4-M1 L307K, P80C, A160C 2.367
65 Hy2-A4-M2 L307K, G291C, Y362C 0.876
66 Hy2-A4-M3 L307K, L180C, A223C 2.268
67 Hy2-A4-M4 L307K, P6C, Y403C 0.852
68 Hy2-A4-M5 L307K, S36C, D426C 1.394
69 Hy2-A5 T306A 2.407
70 Hy2-A5-M1 T306A, P80C, A160C 6.692
71 Hy2-A5-M2 T306A, G291C, Y362C 2.475
72 Hy2-A5-M3 T306A, L180C, A223C 6.409
73 Hy2-A5-M4 T306A, P6C, Y403C 2.409
74 Hy2-A5-M5 T306A, S36C, D426C 3.940
75 Hy3-M1 P80C, A160C 9.568
76 Hy3-M2 G291C, Y362C 3.539
77 Hy3-M3 L180C, A223C 9.165
78 Hy3-M4 P6C, Y403C 3.445
79 Hy3-M5 S36C, D426C 5.634
80 Hy3-A1 Y57H 3.610
81 Hy3-A1-M1 Y57H, P80C, A160C 10.036
82 Hy3-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 3.712
83 Hy3-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 9.613
84 Hy3-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 3.613
85 Hy3-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 5.909
86 Hy3-A2 W304H 3.486
87 Hy3-A2-M1 W304H, P80C, A160C 9.693
88 Hy3-A2-M2 W304H, G291C, Y362C 3.585
89 Hy3-A2-M3 W304H, L180C, A223C 9.284
90 Hy3-A2-M4 W304H, P6C, Y403C 3.490
91 Hy3-A2-M5 W304H, S36C, D426C 5.707
92 Hy3-A3 T306R 5.038
93 Hy3-A3-M1 T306R, P80C, A160C 14.006
94 Hy3-A3-M2 T306R, G291C, Y362C 5.180
95 Hy3-A3-M3 T306R, L180C, A223C 13.415
96 Hy3-A3-M4 T306R, P6C, Y403C 5.043
97 Hy3-A3-M5 T306R, S36C, D426C 8.247
98 Hy3-A4 L307K 1.392
99 Hy3-A4-M1 L307K, P80C, A160C 3.871
100 Hy3-A4-M2 L307K, G291C, Y362C 1.432
101 Hy3-A4-M3 L307K, L180C, A223C 3.708
102 Hy3-A4-M4 L307K, P6C, Y403C 1.394
103 Hy3-A4-M5 L307K, S36C, D426C 2.280
104 Hy3-A5 T306A 3.936
105 Hy3-A5-M1 T306A, P80C, A160C 10.943
106 Hy3-A5-M2 T306A, G291C, Y362C 4.047
107 Hy3-A5-M3 T306A, L180C, A223C 10.481
108 Hy3-A5-M4 T306A, P6C, Y403C 3.940
109 Hy3-A5-M5 T306A, S36C, D426C 6.443
실시예 4. 히알루로니다제 PH-20 변이체의 Tm 분석
바이오시스템 社의 Protein Thermal Shift™ Dye Kit를 사용하여 히알루로니다제 PH-20 변이체의 Tm 데이터를 확보하였다. 구체적으로는 변이체들의 열안정성을 모니터링하기 위하여 노출된 소수성 잔류물에 결합하는 염료를 이용하였고 real-time PCR 기기로 측정하였다.
그 결과, 측정된 각 히알루로니다제 PH-20 변이체의 Tm 데이터는 하기의 표 4에 기재된 바와 같았으며, 그 중 Hy1, Hy1-M1 및 Hy2에 대하여 도 3에 도시하였다.
서열번호 명칭 돌연변이 TM
2 Hy1 62.0
3 Hy2 61.5
4 Hy3 62.6
5 Hy1-M1 P80C, A160C 62.4
6 Hy1-M2 G291C, Y362C 61.5
7 Hy1-M3 L180C, A223C 62.4
8 Hy1-M4 P6C, Y403C 61.5
9 Hy1-M5 S36C, D426C 61.9
10 Hy1-A1 Y57H 62.5
11 Hy1-A1-M1 Y57H, P80C, A160C 62.4
12 Hy1-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 61.5
13 Hy1-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 62.4
14 Hy1-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 61.5
15 Hy1-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 62.0
16 Hy1-A2 W304H 61.5
17 Hy1-A2-M1 W304H, P80C, A160C 62.4
18 Hy1-A2-M2 W304H, G291C, Y362C 61.5
19 Hy1-A2-M3 W304H, L180C, A223C 62.4
20 Hy1-A2-M4 W304H, P6C, Y403C 61.5
21 Hy1-A2-M5 W304H, S36C, D426C 61.9
22 Hy1-A3 T306R 61.8
23 Hy1-A3-M1 T306R, P80C, A160C 62.7
24 Hy1-A3-M2 T306R, G291C, Y362C 61.8
25 Hy1-A3-M3 T306R, L180C, A223C 62.7
26 Hy1-A3-M4 T306R, P6C, Y403C 61.8
27 Hy1-A3-M5 T306R, S36C, D426C 62.3
28 Hy1-A4 L307K 60.6
29 Hy1-A4-M1 L307K, P80C, A160C 61.6
30 Hy1-A4-M2 L307K, G291C, Y362C 60.7
31 Hy1-A4-M3 L307K, L180C, A223C 61.5
32 Hy1-A4-M4 L307K, P6C, Y403C 60.6
33 Hy1-A4-M5 L307K, S36C, D426C 61.1
34 Hy1-A5 T306A 61.6
35 Hy1-A5-M1 T306A, P80C, A160C 62.5
36 Hy1-A5-M2 T306A, G291C, Y362C 61.6
37 Hy1-A5-M3 T306A, L180C, A223C 62.5
38 Hy1-A5-M4 T306A, P6C, Y403C 61.6
39 Hy1-A5-M5 T306A, S36C, D426C 62.0
40 Hy2-M1 P80C, A160C 63.1
41 Hy2-M2 G291C, Y362C 62.2
42 Hy2-M3 L180C, A223C 63.0
43 Hy2-M4 P6C, Y403C 62.1
44 Hy2-M5 S36C, D426C 62.6
45 Hy2-A1 Y57H 62.2
46 Hy2-A1-M1 Y57H, P80C, A160C 63.1
47 Hy2-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 62.2
48 Hy2-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 63.1
49 Hy2-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 62.2
50 Hy2-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 62.6
51 Hy2-A2 W304H 62.2
52 Hy2-A2-M1 W304H, P80C, A160C 63.1
53 Hy2-A2-M2 W304H, G291C, Y362C 62.2
54 Hy2-A2-M3 W304H, L180C, A223C 63.0
55 Hy2-A2-M4 W304H, P6C, Y403C 62.2
56 Hy2-A2-M5 W304H, S36C, D426C 62.6
57 Hy2-A3 T306R 62.5
58 Hy2-A3-M1 T306R, P80C, A160C 63.4
59 Hy2-A3-M2 T306R, G291C, Y362C 62.5
60 Hy2-A3-M3 T306R, L180C, A223C 63.4
61 Hy2-A3-M4 T306R, P6C, Y403C 62.5
62 Hy2-A3-M5 T306R, S36C, D426C 62.9
63 Hy2-A4 L307K 61.3
64 Hy2-A4-M1 L307K, P80C, A160C 62.2
65 Hy2-A4-M2 L307K, G291C, Y362C 61.3
66 Hy2-A4-M3 L307K, L180C, A223C 62.2
67 Hy2-A4-M4 L307K, P6C, Y403C 61.3
68 Hy2-A4-M5 L307K, S36C, D426C 61.8
69 Hy2-A5 T306A 62.3
70 Hy2-A5-M1 T306A, P80C, A160C 63.2
71 Hy2-A5-M2 T306A, G291C, Y362C 62.3
72 Hy2-A5-M3 T306A, L180C, A223C 63.2
73 Hy2-A5-M4 T306A, P6C, Y403C 62.3
74 Hy2-A5-M5 T306A, S36C, D426C 62.7
75 Hy3-M1 P80C, A160C 63.5
76 Hy3-M2 G291C, Y362C 62.6
77 Hy3-M3 L180C, A223C 63.5
78 Hy3-M4 P6C, Y403C 62.6
79 Hy3-M5 S36C, D426C 63.0
80 Hy3-A1 Y57H 62.6
81 Hy3-A1-M1 Y57H, P80C, A160C 63.6
82 Hy3-A1-M2 Y57H, G291C, Y362C 62.7
83 Hy3-A1-M3 Y57H, L180C, A223C 63.5
84 Hy3-A1-M4 Y57H, P6C, Y403C 62.6
85 Hy3-A1-M5 Y57H, S36C, D426C 63.1
86 Hy3-A2 W304H 62.6
87 Hy3-A2-M1 W304H, P80C, A160C 63.5
88 Hy3-A2-M2 W304H, G291C, Y362C 62.6
89 Hy3-A2-M3 W304H, L180C, A223C 63.5
90 Hy3-A2-M4 W304H, P6C, Y403C 62.6
91 Hy3-A2-M5 W304H, S36C, D426C 63.0
92 Hy3-A3 T306R 62.9
93 Hy3-A3-M1 T306R, P80C, A160C 63.9
94 Hy3-A3-M2 T306R, G291C, Y362C 63.0
95 Hy3-A3-M3 T306R, L180C, A223C 63.8
96 Hy3-A3-M4 T306R, P6C, Y403C 62.9
97 Hy3-A3-M5 T306R, S36C, D426C 63.4
98 Hy3-A4 L307K 61.8
99 Hy3-A4-M1 L307K, P80C, A160C 62.7
100 Hy3-A4-M2 L307K, G291C, Y362C 61.8
101 Hy3-A4-M3 L307K, L180C, A223C 62.7
102 Hy3-A4-M4 L307K, P6C, Y403C 61.8
103 Hy3-A4-M5 L307K, S36C, D426C 62.2
104 Hy3-A5 T306A 62.7
105 Hy3-A5-M1 T306A, P80C, A160C 63.6
106 Hy3-A5-M2 T306A, G291C, Y362C 62.7
107 Hy3-A5-M3 T306A, L180C, A223C 63.6
108 Hy3-A5-M4 T306A, P6C, Y403C 62.7
109 Hy3-A5-M5 T306A, S36C, D426C 63.2
실시예 5. 히알루로니다제 PH-20 변이체 안정성 평가 (37℃, 3 days)
Active site의 변이 또는 시스테인을 도입하여 내부에 신규한 이황화결합을 유도한 히알루로니다제 PH-20 변이체의 수용액 안정성을 확인하기 위하여, 37℃ incubation test를 진행하였다. 인체의 상태와 가장 유사한 PBS (phosphate buffer saline) 상태에서 야생형 PH-20과 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37℃ water bath에서 incubation을 한 다음, 1일 단위로 sampling 하여 13000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 효소활성평가를 수행하였다.
그 결과, 히알루로니다제의 37℃에서 안정성은 하기의 표 5와 같았으며, 그 중 일부에 대하여 도 4에 도시하였다.
안정성 평가 (37℃, days)
서열번호 명칭 0 1 2 3
2 Hy1 100 80.48 50.81 25.21
3 Hy2 100 87.69 61.01 36.50
4 Hy3 100 89.28 62.51 41.65
5 Hy1-M1 100 85.61 72.65 39.66
6 Hy1-M2 100 85.28 56.51 25.76
7 Hy1-M3 100 82.68 68.07 39.42
8 Hy1-M4 100 83.44 56.87 24.84
9 Hy1-M5 100 83.69 68.72 34.75
10 Hy1-A1 100 82.09 54.31 27.31
11 Hy1-A1-M1 100 83.67 55.39 40.47
12 Hy1-A1-M2 100 87.34 61.00 27.82
13 Hy1-A1-M3 100 86.78 76.53 40.01
14 Hy1-A1-M4 100 80.41 53.70 27.14
15 Hy1-A1-M5 100 80.73 54.07 35.10
16 Hy1-A2 100 83.91 57.15 25.73
17 Hy1-A2-M1 100 86.52 64.76 40.21
18 Hy1-A2-M2 100 89.05 66.32 26.77
19 Hy1-A2-M3 100 84.45 66.25 39.60
20 Hy1-A2-M4 100 85.06 58.87 25.42
21 Hy1-A2-M5 100 86.07 66.77 35.06
22 Hy1-A3 100 87.22 69.50 34.07
23 Hy1-A3-M1 100 88.97 67.84 45.61
24 Hy1-A3-M2 100 85.63 70.25 34.46
25 Hy1-A3-M3 100 87.69 73.88 44.04
26 Hy1-A3-M4 100 84.31 62.70 34.00
27 Hy1-A3-M5 100 80.85 58.26 38.49
28 Hy1-A4 100 80.55 54.98 21.12
29 Hy1-A4-M1 100 89.50 65.61 28.09
30 Hy1-A4-M2 100 86.39 61.56 22.78
31 Hy1-A4-M3 100 83.87 58.75 27.55
32 Hy1-A4-M4 100 83.57 56.08 18.10
33 Hy1-A4-M5 100 80.35 52.70 23.35
34 Hy1-A5 100 81.89 68.89 29.36
35 Hy1-A5-M1 100 88.41 69.82 41.55
36 Hy1-A5-M2 100 81.89 54.50 30.06
37 Hy1-A5-M3 100 82.43 66.50 40.51
38 Hy1-A5-M4 100 85.37 64.83 29.07
39 Hy1-A5-M5 100 82.01 52.85 35.14
40 Hy2-M1 100 88.00 58.89 48.21
41 Hy2-M2 100 82.78 66.80 36.81
42 Hy2-M3 100 86.39 68.61 46.78
43 Hy2-M4 100 82.53 71.40 36.45
44 Hy2-M5 100 83.83 70.48 41.78
45 Hy2-A1 100 81.61 67.57 37.12
46 Hy2-A1-M1 100 81.58 68.28 49.46
47 Hy2-A1-M2 100 86.53 67.23 37.44
48 Hy2-A1-M3 100 83.60 73.36 49.20
49 Hy2-A1-M4 100 80.07 65.75 37.27
50 Hy2-A1-M5 100 86.67 67.02 43.43
51 Hy2-A2 100 86.07 61.65 36.68
52 Hy2-A2-M1 100 87.04 65.50 49.12
53 Hy2-A2-M2 100 84.50 74.03 36.91
54 Hy2-A2-M3 100 80.42 70.07 47.42
55 Hy2-A2-M4 100 86.10 59.63 36.55
56 Hy2-A2-M5 100 86.42 72.89 42.75
57 Hy2-A3 100 88.00 58.81 41.13
58 Hy2-A3-M1 100 85.91 71.99 54.37
59 Hy2-A3-M2 100 81.01 65.97 41.52
60 Hy2-A3-M3 100 83.05 72.61 53.45
61 Hy2-A3-M4 100 86.88 57.86 40.83
62 Hy2-A3-M5 100 83.75 58.07 46.67
63 Hy2-A4 100 81.17 57.26 24.21
64 Hy2-A4-M1 100 81.67 56.20 37.49
65 Hy2-A4-M2 100 88.80 61.01 24.32
66 Hy2-A4-M3 100 87.52 70.61 37.38
67 Hy2-A4-M4 100 84.99 62.12 24.05
68 Hy2-A4-M5 100 83.86 71.26 32.08
69 Hy2-A5 100 84.60 63.21 37.75
70 Hy2-A5-M1 100 88.25 75.68 50.71
71 Hy2-A5-M2 100 88.25 60.25 39.04
72 Hy2-A5-M3 100 80.75 65.90 50.49
73 Hy2-A5-M4 100 80.72 60.27 37.60
74 Hy2-A5-M5 100 85.64 60.32 44.95
75 Hy3-M1 100 89.73 67.50 56.24
76 Hy3-M2 100 86.22 67.80 42.90
77 Hy3-M3 100 84.18 71.08 55.60
78 Hy3-M4 100 85.24 68.65 41.65
79 Hy3-M5 100 81.90 59.14 47.07
80 Hy3-A1 100 84.82 56.67 43.36
81 Hy3-A1-M1 100 85.43 74.09 57.92
82 Hy3-A1-M2 100 86.13 75.37 43.86
83 Hy3-A1-M3 100 87.19 73.18 56.56
84 Hy3-A1-M4 100 81.06 69.62 43.30
85 Hy3-A1-M5 100 85.61 67.05 48.64
86 Hy3-A2 100 83.77 73.28 42.50
87 Hy3-A2-M1 100 84.73 68.04 57.56
88 Hy3-A2-M2 100 81.95 56.93 43.13
89 Hy3-A2-M3 100 84.28 71.49 56.11
90 Hy3-A2-M4 100 81.88 63.12 41.90
91 Hy3-A2-M5 100 80.84 59.79 47.80
92 Hy3-A3 100 86.68 74.11 46.55
93 Hy3-A3-M1 100 84.75 74.23 62.19
94 Hy3-A3-M2 100 81.89 58.04 46.69
95 Hy3-A3-M3 100 84.70 72.61 60.98
96 Hy3-A3-M4 100 89.17 70.94 45.83
97 Hy3-A3-M5 100 83.26 70.39 53.02
98 Hy3-A4 100 81.35 53.16 31.96
99 Hy3-A4-M1 100 88.81 72.76 43.92
100 Hy3-A4-M2 100 80.85 67.87 33.12
101 Hy3-A4-M3 100 83.60 70.64 43.70
102 Hy3-A4-M4 100 82.35 54.63 30.68
103 Hy3-A4-M5 100 89.32 72.54 37.34
104 Hy3-A5 100 88.53 59.91 44.82
105 Hy3-A5-M1 100 84.09 72.30 59.21
106 Hy3-A5-M2 100 83.28 66.25 45.53
107 Hy3-A5-M3 100 80.52 70.10 58.95
108 Hy3-A5-M4 100 82.64 72.10 44.33
109 Hy3-A5-M5 100 84.20 60.88 50.36
실시예 6. 히알루로니다제 PH-20 변이체 안정성 평가 (50℃, 3 hours)
Active site의 변이 또는 시스테인을 도입하여 내부에 신규한 이황화결합을 유도한 히알루로니다제 PH-20 변이체의 수용액 안정성을 확인하기 위하여, 50℃ incubation test를 진행하였다. 인체의 상태와 가장 유사한 PBS (phosphate buffer saline) 상태에서 야생형 PH-20과 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 50℃ water bath에서 incubation을 한 다음, 1시간 단위로 sampling 하여 13000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 효소활성평가를 수행하였다.
그 결과, 히알루로니다제의 50℃에서 안정성은 하기의 표 6과 같았으며, 그 중 일부에 대하여 도 5에 도시하였다.
안정성 평가 (50℃, hours)
서열번호 명칭 0 1 2 3
2 Hy1 100 77.19 22.46 1.02
3 Hy2 100 75.68 31.29 5.16
4 Hy3 100 78.62 34.87 10.91
5 Hy1-M1 100 68.31 17.33 9.44
6 Hy1-M2 100 69.79 22.45 2.15
7 Hy1-M3 100 64.28 35.29 8.87
8 Hy1-M4 100 63.25 28.83 1.01
9 Hy1-M5 100 75.06 26.31 4.32
10 Hy1-A1 100 60.72 28.39 2.29
11 Hy1-A1-M1 100 78.99 30.71 9.82
12 Hy1-A1-M2 100 77.48 28.31 2.32
13 Hy1-A1-M3 100 72.58 29.59 9.57
14 Hy1-A1-M4 100 75.31 27.48 2.28
15 Hy1-A1-M5 100 72.74 21.16 4.65
16 Hy1-A2 100 75.11 22.42 1.78
17 Hy1-A2-M1 100 67.24 32.88 9.59
18 Hy1-A2-M2 100 79.85 29.75 2.22
19 Hy1-A2-M3 100 79.36 33.90 9.05
20 Hy1-A2-M4 100 62.48 26.64 1.68
21 Hy1-A2-M5 100 62.77 29.09 4.56
22 Hy1-A3 100 73.19 30.79 4.21
23 Hy1-A3-M1 100 64.28 10.55 6.12
24 Hy1-A3-M2 100 74.95 17.14 4.24
25 Hy1-A3-M3 100 65.10 36.72 14.61
26 Hy1-A3-M4 100 69.82 30.18 4.18
27 Hy1-A3-M5 100 64.47 20.42 7.47
28 Hy1-A4 100 68.02 28.88 0.24
29 Hy1-A4-M1 100 69.68 29.11 2.45
30 Hy1-A4-M2 100 78.41 26.11 0.27
31 Hy1-A4-M3 100 73.93 20.83 2.29
32 Hy1-A4-M4 100 66.42 22.06 0.09
33 Hy1-A4-M5 100 62.05 29.87 0.42
34 Hy1-A5 100 70.59 22.35 3.04
35 Hy1-A5-M1 100 76.68 33.66 10.84
36 Hy1-A5-M2 100 64.69 20.52 3.16
37 Hy1-A5-M3 100 78.78 30.00 9.86
38 Hy1-A5-M4 100 60.24 24.30 3.01
39 Hy1-A5-M5 100 69.53 27.08 4.88
40 Hy2-M1 100 71.40 39.45 18.63
41 Hy2-M2 100 65.09 20.49 5.96
42 Hy2-M3 100 72.04 43.99 17.84
43 Hy2-M4 100 74.50 17.36 5.13
44 Hy2-M5 100 63.60 12.62 11.09
45 Hy2-A1 100 60.84 28.70 6.02
46 Hy2-A1-M1 100 79.55 50.09 21.00
47 Hy2-A1-M2 100 68.23 35.99 6.41
48 Hy2-A1-M3 100 66.87 9.50 0.02
49 Hy2-A1-M4 100 63.06 28.91 6.22
50 Hy2-A1-M5 100 71.71 43.95 14.01
51 Hy2-A2 100 71.18 31.19 5.61
52 Hy2-A2-M1 100 76.82 48.00 19.83
53 Hy2-A2-M2 100 70.03 20.93 5.97
54 Hy2-A2-M3 100 63.47 41.05 18.26
55 Hy2-A2-M4 100 70.24 22.03 5.59
56 Hy2-A2-M5 100 63.16 16.61 11.91
57 Hy2-A3 100 60.35 36.71 9.97
58 Hy2-A3-M1 100 76.20 44.99 24.85
59 Hy2-A3-M2 100 76.62 18.79 10.81
60 Hy2-A3-M3 100 69.41 44.93 24.68
61 Hy2-A3-M4 100 60.50 11.31 9.88
62 Hy2-A3-M5 100 70.39 11.80 7.28
63 Hy2-A4 100 74.70 24.30 0.61
64 Hy2-A4-M1 100 64.63 33.23 6.51
65 Hy2-A4-M2 100 62.39 25.42 0.72
66 Hy2-A4-M3 100 74.54 36.09 6.38
67 Hy2-A4-M4 100 74.33 19.80 0.56
68 Hy2-A4-M5 100 60.47 19.97 4.11
69 Hy2-A5 100 62.63 19.95 7.38
70 Hy2-A5-M1 100 76.30 46.34 23.28
71 Hy2-A5-M2 100 62.64 30.89 8.06
72 Hy2-A5-M3 100 78.29 45.37 21.45
73 Hy2-A5-M4 100 64.71 34.17 7.03
74 Hy2-A5-M5 100 65.37 41.20 15.76
75 Hy3-M1 100 68.08 46.46 25.20
76 Hy3-M2 100 68.42 12.18 11.99
77 Hy3-M3 100 74.80 51.42 24.88
78 Hy3-M4 100 63.52 16.94 10.90
79 Hy3-M5 100 61.29 5.53 0.07
80 Hy3-A1 100 60.70 38.16 13.60
81 Hy3-A1-M1 100 75.75 54.52 29.60
82 Hy3-A1-M2 100 79.92 34.68 14.17
83 Hy3-A1-M3 100 75.59 46.67 26.46
84 Hy3-A1-M4 100 71.15 35.47 12.77
85 Hy3-A1-M5 100 69.77 45.68 19.32
86 Hy3-A2 100 70.96 34.45 11.47
87 Hy3-A2-M1 100 71.80 49.67 26.54
88 Hy3-A2-M2 100 77.51 34.66 12.03
89 Hy3-A2-M3 100 66.46 45.77 25.11
90 Hy3-A2-M4 100 76.30 34.99 11.25
91 Hy3-A2-M5 100 78.47 41.82 18.61
92 Hy3-A3 100 75.38 38.86 17.17
93 Hy3-A3-M1 100 79.30 57.77 36.75
94 Hy3-A3-M2 100 70.96 43.37 17.53
95 Hy3-A3-M3 100 79.68 57.52 34.75
96 Hy3-A3-M4 100 79.08 44.42 17.11
97 Hy3-A3-M5 100 74.59 47.77 23.48
98 Hy3-A4 100 74.86 18.99 3.74
99 Hy3-A4-M1 100 73.79 15.18 14.34
100 Hy3-A4-M2 100 60.70 30.19 4.12
101 Hy3-A4-M3 100 63.06 40.08 14.05
102 Hy3-A4-M4 100 72.83 23.33 3.32
103 Hy3-A4-M5 100 79.10 29.74 6.31
104 Hy3-A5 100 68.82 9.58 4.95
105 Hy3-A5-M1 100 78.27 53.86 33.03
106 Hy3-A5-M2 100 79.88 45.17 15.96
107 Hy3-A5-M3 100 77.69 55.85 30.37
108 Hy3-A5-M4 100 64.52 42.35 14.65
109 Hy3-A5-M5 100 62.76 6.59 1.06
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 신규한 히알루로니다제 PH-20 변이체는 야생형의 인간 히알루로니다제 PH-20와 비교하여 안정성이 높고 활성이 뛰어나므로, 이와 함께 사용되는 약물의 치료 효과를 극대화할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (24)

  1. 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 히알루로니다제 PH-20 변이체.
  2. 제1항에 있어서 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체는, ⅰ) Y57H, ⅱ) W304H, ⅲ) T306R, ⅵ) L307K, 및 ⅴ) T306A로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체.
  3. 제1항에 있어서 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체는, ⅰ) Y57H, ⅱ) W304H, ⅲ) T306R, 및 ⅵ) L307K로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체.
  4. 제1항에 있어서 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체는 ⅰ) P80C 및 A160C, ⅱ) G291C 및 Y362C, ⅲ) L180C 및 A223C, ⅵ) P6C 및 Y403C, 및 ⅴ) S36C 및 D426C로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체.
  5. 제1항에 있어서 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체는 ⅰ) G291C 및 Y362C, ⅱ) L180C 및 A223C, ⅲ) P6C 및 Y403C, 및 ⅵ) S36C 및 D426C로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체.
  6. 제2항에 있어서 상기 히알루로니다제 PH-20 변이체는 ⅰ) P80C 및 A160C, ⅱ) G291C 및 Y362C, ⅲ) L180C 및 A223C, ⅵ) P6C 및 Y403C, 및 ⅴ) S36C 및 D426C로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 잔기의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH-20 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 히알루로니다제 PH-20 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  9. 제8항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포주.
  10. 제9항에 따른 숙주 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 PH-20 변이체의 제조 방법.
  11. a) 약물; 및
    b) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 히알루로니다제 PH-20 변이체;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약물은 단백질 의약품(protein drugs), 소분자 화합물(small molecules), 앱타머(aptamer), RNAi, antisense 또는 세포 치료제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 약물은 화학요법제, 진통제, 항염증제, 항미생물제, 살구균제, 살트리코모나스제, 항파킨슨제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 항관졀염제, 항진균제, 항고혈압제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린 작용제, 알파 차단제, 마취제, 기관지 확장제, 살균제, 정균제, 베타-아드레날린성 차단제, 칼슘 통로 차단제, 심혈관계 약물, 피임제, 충혈 완화제, 이뇨제, 진정제, 진단제, 전해질제, 최면제, 호르몬제, 혈당 강하제, 근육이완제, 근육수축제, 안과제, 부교감신경 흥분제, 교감신경 흥분제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드성 소염제, 안지오텐신 전환효소 억제제, 및 수면유도제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 약물은 항체, 수용성 수용체, 또는 수용성 수용체와 Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체는 4-1BB, 인테그린 (integrin), 아밀로이드 베타 (amyloid beta), 안지오포에틴, 안지오포에틴 유사물질3, B세포활성인자 (B-cell activating factor, BAFF), B7-H3, 보체5 (complement 5), CCR4, CD3, CD4, CD6, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD62, CD79b, CD80, CGRP, 클라우딘18 (Claudin-18), 보체요소 D (complement factor D), CTLA4, DLL3, EGF 수용체, 혈우병인자, Fc 수용체, FGF23, 폴레이트 (folate) 수용체, GD2, GM-CSF, HER2, HER3, 인터페론 수용체, 인터페론 감마, IgE, IGF-1 수용체, 인터루킨1, 인터루킨2 수용체, 인터루킨4 수용체, 인터루킨5, 인터루킨5 수용체, 인터루킨6, 인터루킨6 수용체, 인터루킨7, 인터루킨12/23, 인터루킨13, 인터루킨17A, 인터루킨17 수용체A, 인터루킨31 수용체, 인터루킨36 수용체, LAG3, LFA3, NGF, PVSK9, PD-1, PD-L1, RANK-L, SLAMF7, 조직인자 (Tissue factor), TNF, VEGF, 및 vWF로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 항체는 유토밀루맙 (Utomilumab), 나탈리주맙 (Natalizumab), 에트롤리주맙 (Etrolizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 비마그루맙 (Bimagrumab), 바피네우주맙 (Bapineuzumab), 크레네주맙(Crenezumab), 솔라네주맙 (Solanezumab), 아두카누맙 (Aducanumab), 간테네루맙 (Gantenerumab), AMG 780, MEDI 3617, 네스바쿠맙 (Nesvacumab), 바누씨주맙 (Vanucizumab), 에비나쿠맙 (Evinacumab), 타발루맙 (Tabalumab), 라나루맙 (Lanalumab), 베리무맙 (Belimumab), 옴부르타맙 (omburtamab), 라불리주맙 (Ravulizumab), 에쿨리주맙 (Eculizumab), 모가물리주맙 (Mogamulizumab), 오텔릭시주맙 (Otelixizumab), 테플리주맙 (Teplizumab), 무로모납 (Muromonab), 테벤타프스프 (Tebentafusp), 블리나두모맙 (Blinatumoma), REGN1979, 이발리주맙 (Ibalizumab), 자놀리무맙 (Zanolimumab), 이톨리주맙 (Itolizumab), 에팔리주맙 (Efalizumab), 이네빌리주맙 (Inebilizumab), 타파시타맙 (Tafasitamab), 론카스툭시맙 테시린 (Loncastuximab tesirine), 오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 우블리툭시맙 (Ublituximab), 오비누투주맙 (Obinutuzumab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 리툭시맙 (Rituximab), 토시투모맙 (Tositumomab), 이브리투모맙 티욱세탄 (Ibritumomab tiuxetan), 에프라투주맙 (Epratuzumab), 이노투주맙 오조가마이신 (Inotuzumab ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox), 브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin), 바다스툭시맙 탈리닌 (Vadastuximab talirine), 젬투주맙 오조가마이신 (Gemtuzumab ozogamicin), 다라투무맙 (Daratumumab), 이사툭시맙 (Isatuximab), 알렘투주맙 (Alemtuxumab), 크리잔리주맙 (Crizanlizumab), 폴라투주맙 베도틴 (Polatuzumab vedotin), 갈릭시맙 (Galiximab), 엪티네주맙 (Eptinezumab), 프레마네주맙 (Fremanezumab), 갈카네주맙 (Galcanezumab), 에레누맙 (Erenumab), 졸베툭시맙 (Zolbetuximab), 람팔리주맙 (Lampalizumab), 트레멜리무맙 (Tremelimumab), 잘리프렐리맙 (Zalifrelimab), 이플리무맙 (Ipilimumab), 로발피투주맙 테시린 (Rovalpituzumab tesirine), 세툭시맙 (Cetuximab), 데파툭시주맙 (Depatuxizumab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), 네시투무맙 (Necitumumab), 파니투무맙 (Panitumumab), 에미시주맙 (Emicizumab), 니포칼리맙 (Nipocalimab), 로잔놀릭시주맙 (Rozanolixizumab), 부로스맙 (Burosumab), 팔레투주맙 (Farletuzumab), 미르베툭시맙 소랍탄신 (Mirvetuximab soravtansine), 디누툭시맙 (Dinutuximab), 낙시타맙 (Naxitamab), 오틸리맙 (Otilimab), 마르게툭시맙 (Margetuximab), 페르투주맙 (Pertuzumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab), 트라수투주맙 데룩테칸 (Trastuzumab deruxtecan), 트라수투주맙 엠탄신 (Trastuzumab emtansine), 트라수투주맙 두오카르마진 (Trastuzumab duocarmazine), 파트리투맙 (Patritumab), 아니프롤루맙 (Anifrolumab), 에마팔루맙 (Emapalumab), 리겔리주맙 (Ligelizumab), 오말리주맙 (Omalizumab), 달로투주맙 (Dalotuzumab), 피기투무맙 (Figitumumab), 테프로투무맙 (Teprotumumab), 게보키주맙 (Gebokizumab), 카나키누맙(Canakinumab), 다클리주맙 (Daclizumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 두필루맙 (Dupilumab), 메폴리주맙 (Mepolizumab), 레슬리주맙 (Reslizumab), 벤랄리주맙 (Benralizumab), 클라자키주맙 (Clazakizumab), 올로키주맙 (Olokizumab), 시루쿠맙 (Sirukumab), 실툭시맙 (Siltuximab), 사릴루맙 (Sarilumab), 사트랄리주맙 (Satralizumab), 토실리주맙 (Tocilizumab), REGN88, 세쿠키누맙 (Secukinumab), 우스테키누맙 (Ustekinumab), 브리아키누맙 (Briakinumab), 레브리키주맙 (Lebrikizumab), 트랄로키누맙 (Tralokinumab), 익세키주맙 (Ixekizumab), 비메키주맙 (Bimekizumab), 브로달루맙 (Brodalumab), 브라지쿠맙 (Brazikumab), 구셀쿠맙 (Guselkumab), 리산키주맙 (Risankizumab), 틸드라키주맙 (Tildrakizumab), 미리키주맙 (Mirikizumab), 네몰리주맙 (Nemolizumab), 스페솔리맙 (Spesolimab), 렐라틀리맙 (Relatlimab), 나르소플리맙 (Narsoplimab), 파시누맙 (Fasinumab), 타네주맙 (Tanezumab), 알리로쿠맙 (Alirocumab), 에볼로쿠맙 (Evolocumab), 보코시주맙 (Bococizumab), 람브롤리주맙 (Lambrolizumab), 발스틸리맙 (Balstilimab), 캄렐리주맙 (Camrelizumab), 쎄미플리맙 (Cemiplimab), 도스탈리맙 (Dostarlimab), 프롤골리맙 (Prolgolimab ), 신틸리맙 (Sintilimab), 스파르탈리주맙 (Spartalizumab), 티슬레리주맙 (Tislelizumab), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab), 니볼루맙 (Nivolumab), 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 아벨루맙 (Avelumab), 엔바폴리맙 (Envafolimab), 둘발루맙 (Durvalumab), 빈트라푸스프 알파 (Bintrafusp alpha), 데노수맙 (Denosumab), 엘로투주맙 (Elotuzumab), 콘시주맙 (Concizumab), 말스타시맙 (Marstacimab), 인플릭시맙 (Infliximab), 아달리무맙 (Adalimumab), 골리무맙 (Golimumab), 세르톨리주맙 페골 (Certolizumab pegol), 오조랄리주맙 (Ozoralizumab), 브롤루시주맙 (Brolucizumab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 베바시주맙 (Bevacizumab), 파리시맙 (Faricimab), 라무시루맙 (Ramucirumab), 및 카플라시주맙 (Caplacizumab)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 수용성 수용체 또는 수용성 수용체와 Fc 융합 단백질에 포함되는 수용성 수용체는 TNF-α 수용성 수용체, VEGF 수용성 수용체, CTLA-4, 인터루킨1 수용성 수용체, 및 LFA3 수용성 수용체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 수용성 수용체와 Fc의 융합 단백질은 에타너셉트(Etanercept), 아플리버셉트 (Aflibercept), 아바타셉트 (Abatacept), 벨라다셉트(Belatacept), 릴로나셉트 (Rilonacept), 및 알레파셉트 (Alefacept)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제11항에 있어서, 완충제, 안정화제, 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 완충제는 말산염 (malate), 폼산염 (formate), 시트르산염 (citrate), 아세테이트 (acetate), 프로피오네이트 (propionate), 피리딘 (pyridine), 피페라진 (piperazine), 카코딜산 (cacodylate), 석신산 (succinate), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES), 히스티딘 (histidine), 트리스 (Tris), 비스-트리스 (bis-Tris), 인산염 (phosphate), 에탄올아민 (ethanolamine), 탄산염 (carbonate), 2-에테인술폰산 (piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid), PIPES), 이미다졸 (imidazole), 비스-트리스 프로판 (BIS-TRIS propane), BES (N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid), HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid), 피로인산염(pyrophosphate), 및 트리에탄올아민 (triethanolamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 완충제이고;
    상기 안정화제는 탄수화물, 당류 또는 이들의 수화물, 당알콜류 또는 이들의 수화물, 및 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며;
    상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌-스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비이온성 계면활성제인 것;
    을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 탄수화물, 당류 또는 당알콜류는 트레할로스 또는 그의 수화물, 수크로스, 사카린, 글리세롤, 에리스톨, 트레이톨, 자일리톨, 아라비톨, 리비톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨, 푸시톨, 아이디톨, 이노시톨, 볼레미톨, 이소말트, 말티톨, 폴리글리시톨, 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 하이드로옥실프로필 사이클로덱스트린(Hydroxypropyl Beta-cyclodextrin), 및 글루코스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고;
    상기 아미노산은 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 라이신, 라이실라이신, 류신, 메치오닌, 발린, 세린, 셀레노메치오닌, 시트룰린, 아르지닌, 아스파라진, 아스파트산, 오르니틴, 아이소류신, 타우린, 테아닌, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 프롤린, 피롤라이신, 히스티딘, 및 알라닌으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것;
    을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 제11항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피하 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 질환의 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한
    a) 약물; 및
    b) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 히알루로니다제 PH-20 변이체;의 용도
  24. a) 약물; 및
    b) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 히알루로니다제 PH-20 변이체;
    를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 방법.
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