MXPA04004336A - Polimeros ramificados y sus conjugados. - Google Patents

Polimeros ramificados y sus conjugados.

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Abstract

La presente invencion se dirige a polimeros solubles en agua, reactivos, ramificados, que comprenden al menos dos ramificaciones polimericas, tales como por ejemplo, poli (etilenglicol), unidas a una molecula nucleo de hidrocarburo alifatico, central, a traves de enlaces heteroatomicos. Os polimeros ramificados portan al menos un grupo funcional para que reaccione con un agente biologicamente activo y asi formar un conjugado biologicamente activo. El grupo funcional del polimero ramificado se puede unir directamente al nucleo de hidrocarburo alifatico o via un enlace intermediario, tal como por ejemplo, un enlace heteroatomicos de -alquileno-, -O-alquileno-O-, -alquileno-O-alquileno-, -arilo-O-, -O-arilo-, (-O-alquileno-)m, o (-alquileno-O-)m en donde m es 1-10.

Description

POLÍMEROS RAMIFICADOS Y SUS CONJUGADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con polímeros solubles en agua, reactivos, ramificados, útiles para conjugarse a moléculas biológicamente activas y con los métodos para elaborar y utilizar estos polímeros .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La unión covalente del polímero poli (etilenglicol) hidrofílico, abreviado PEG, es un método bastante ventajoso para aumentar la solubilidad en agua y la biodisponibilidad, y prolongar el tiempo de circulación de muchas moléculas biológicamente activas, en particular moléculas hidrofóbicas . Por ejemplo, se ha mostrado que el fármaco insoluble en agua, paclitaxel, cuando se acopla a PEG, se hace soluble en agua. Greenwald, et al., J. Org . Chem . , 60:331-336 (1395). El peso molecular total del polímero o los polímeros unidos a la molécula biológicamente activa debe ser suficientemente alto para impartir las características ventajosas típicamente asociadas con la unión del polímero PEG, tal como por ejemplo, la solubilidad en agua aumentada y la vida media en circulación, mientras que no impacte adversamente la bioactividad de la molécula precursora. Las proteínas y otras moléculas con frecuencia tienen un número limitado de sitios reactivos disponibles para la unión de polímeros. Con frecuencia, los sitios más adecuados para la modificación vía la unión de polímeros desempeña una función significativa en la unión del receptor, y son necesarios para la retención de la actividad biológica de la molécula. Como resultado, la unión indiscriminada de cadenas poliméricas a estos sitios reactivos sobre una molécula biológicamente activa con frecuencia conduce a una reducción significativa o incluso a una pérdida total de la actividad biológica de la molécula modificada con polímeros. Para formar conjugados que tengan suficiente peso molecular polimérico para impartir las ventajas deseadas a una molécula blanco, los procedimientos de la técnica anterior típicamente han incluido ya sea (i) la unión aleatoria de muchas ramificaciones poliméricas hacia la molécula, aumentando con esto el riesgo de una reducción o incluso la pérdida total de bioactividad de la molécula precursora, o (ii) la unión de una o dos cadenas poliméricas muy largas. Desafortunadamente, el uso de cadenas poliméricas lineales de alto peso molecular es problemático debido a la dificultad y gasto asociados con su preparación, purificación e inestabilidad asociada. Los polímeros ramificados que comprenden una pluralidad de ramificaciones poliméricas unidas a un núcleo central y que tienen un grupo reactivo individual para la conjugación a una molécula biológicamente activa se han descrito en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,643,575 y 5,932,462. Las dos patentes describen polímeros ramificados formados mediante la unión covalente de un polímero soluble en agua tal como por ejemplo, un PEG rematado en el extremo hacia una molécula de núcleo central que porta grupos amino, tales como por ejemplo, lisina o 1 , 3 - diamino- 2 -propanol . Aunque estos polímeros ramificados son útiles para unir a un polímero de alto peso molecular a una molécula en un sitio de unión individual sin utilizar una cadena polimérica extremadamente larga, los métodos para formar las moléculas de PEG ramificado de la técnica anterior son difíciles y requieren de la purificación extensiva de los polímeros PEG antes de la unión a la molécula núcleo y también la purificación/eliminación de los intermediarios de polímero parcialmente pegilados. Sigue habiendo una necesidad en la técnica por reactivos poliméricos ramificados novedosos que proporcionen los beneficios asociados con los polímeros ramificados (es decir, peso molecular total alto en una molécula polimérica no lineal individual), pero que sean más fáciles de sintetizar o proporcionen mayor flexibilidad en su diseño que los reactivos de la técnica anterior.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el desarrollo de polímeros solubles en agua reactivos, ramificados, útiles para la conjugación a moléculas biológicamente activas de una forma que tienda a evitar una reducción significativa de la actividad biológica de la molécula mientras que proporcionen los beneficios de la conjugación de polímeros solubles en agua. Los polímeros ramificados de la invención se pueden sintetizar fácilmente a partir de diversas estructuras de núcleo alifático que no requieren la presencia de grupos activantes adecuados para acoplamiento a un polímero lineal activado, tal como por ejemplo, poli (etilenglicol ) rematado en el extremo con carbonato de succinimidilo o lo semejante, para constituir el polímero soluble en agua ramificado. Es decir, la preparación de los polímeros de la invención no se dificulta por la necesidad de utilizar estructuras nucleares que tengan grupos funcionales reactivos necesarios para el acoplamiento con las ramificaciones poliméricas, debido a que las porciones poliméricas de la molécula en general se construyen directamente sobre el núcleo mediante la polimerización de unidades monoméricas adecuadas. En un aspecto, la presente invención proporciona un polímero soluble en agua reactivo, ramificado, que comprende al menos dos ramificaciones poliméricas, tales como por ejemplo, poli ( et i lenglicol ) , unidas a una molécula núcleo central a través de enlaces heteroatómicos tales como por ejemplo, enlaces éter. La molécula de núcleo central es un hidrocarburo alifático que tiene una longitud de al menos tres átomos de carbono. Los polímeros ramificados de la invención de preferencia aunque no necesariamente son monofuncionales (es decir, tienen un solo grupo funcional reactivo adecuado para la unión covalente a un agente biológicamente activo) , y el grupo funcional individual de preferencia unido, opcionalmente vía un enlace intermediario, a la molécula núcleo de hidrocarburo alifático. Los polímeros adecuados para utilizarse en la preparación de las estructuras de polímeros ramificados de la invención incluyen poli (alquilenglícoles ) , poli(poliol oxietilado) , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacri lato) , poli (sacáridos) , poli (a-hidroxiácido) , poli (alcohol vinílico) , polifosfaceno , polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , poli (ácido acrílico) , carboximetilcelulosa , ácido hialurónico, hidroxipropilmetilcelulosa, y copolímeros, terpol ímeros , y mezclas de los mismos. En una modalidad de la invención, el polímero es un poli (etilenglicol) . En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado biológicamente activo que comprende una molécula biológicamente activa, tal como por ejemplo, una proteína, unida covalentemente a un polímero ramificado según se describió anteriormente. La molécula biológicamente activa de preferencia está unida al polímero ramificado vía un enlace formado mediante la reacción de un grupo funcional reactivo sobre el polímero ramificado con un grupo funcional adecuado sobre la molécula biológicamente activa. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar polímeros reactivos ramificados que comprenden ramificaciones poliméricas de poli (alquilenglicol) . El método incluye la polimerización de unidades monoméricas de óxido de alquileno, tales como por ejemplo, óxido de etileno, sobre una estructura núcleo de hidrocarburo alifático que porta al menos dos grupos nucleofílieos (por ejemplo, grupos tiol, amino o hidróxilo) . De preferencia, los grupos nucleofílieos son idénticos como en propano sustituido con grupos hidróxilo en las posiciones 1 y 3 ( 1 , 3 -propandiol ) para, por ejemplo, favorecer las velocidades de polimerización que son comparables en cada una de las ramificaciones poliméricas. Al menos un grupo reactivo adecuado para modificación adicional, típicamente en forma protegida tal como por ejemplo, un grupo hidróxilo protegido, también se une al núcleo de hidrocarburo alifático, opcionalmente vía un enlace intermediario. Después de la polimerización de las unidades monoméricas con óxido de alquileno sobre la molécula núcleo, y el remate en el extremo opcional de las ramificaciones poliméricas de poli (alquilenglicol) , el grupo protector del hidróxilo protegido u otro grupo funcional se elimina para proporcionar un grupo reactivo adecuado para modificación adicional, por ejemplo, para formar un polímero ramificado adecuado para la unión covalente directa a una molécula biológicamente activa para formar un conjugado de polímero ramificado .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ahora se describirá con mayor detalle en lo sucesivo. Esta invención puede, sin embargo, ser incluida en formas muy diferentes y no se debe interpretar como limitante de las modalidades establecidas en la presente; sino que más bien, estas modalidades se proporcionan de tal forma que esta exposición será minuciosa y completa, y expresará completamente el alcance de la invención para aquellos expertos en la técnica.
I . Definiciones Los siguientes términos que se utilizan en la presente tienen los significados indicados. Según se utiliza en la especificación, y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno", "el", incluyen las referencias al plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa . Los términos "grupo funcional" , "entidad activa", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo", y "entidad químicamente reactiva" se utilizan en la técnica y en la presente para hacer referencia a distintas porciones o unidades de una molécula que se pueden definir. De alguna forma los términos son sinónimos en las técnicas químicas y se utilizan en la presente para indicar las porciones de las moléculas que realizan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas. El término "activo", cuando se utiliza junto con un grupo funcional, pretende incluir aquellos grupos funcionales que reaccionan fácilmente con grupos electrof ílieos o nucleofílieos sobre otras moléculas, un contraste con aquellos grupos que requieren fuertes catalizadores o condiciones de reacción muy poco prácticas para reaccionar (es decir, grupos "no reactivos" o "inertes") . Por ejemplo, según se podría entender en la técnica, el término "éster activo" podría incluir aquellos ésteres que reaccionan fácilmente con grupos nucleofílieos tales como por ejemplo, aminas. Los ésteres activos de ejemplo incluyen ésteres de N-hidroxisuccinimidilo o ésteres de 1-benzotriazolilo . Típicamente, un éster activo reaccionará con una amina en medio acuoso en cuestión de minutos, mientras que ciertos ésteres, tales como por ejemplo, metil o etilésteres, requieren de un fuerte catalizador para reaccionar con un grupo nucleofílico . En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "grupo funcional" incluye grupos funcionales protegidos . El término "grupo funcional protegido" o "grupo de protección" o "grupo protector" se refiere a la presencia de una entidad (es decir, el grupo protector) que evita o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se está protegiendo así como también las condiciones de reacción que serán empleadas y la presencia de grupos reactivos o protectores adicionales en la molécula, en su caso. Los grupos protectores conocidos en la técnica se pueden encontrar en Greene, . W., et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHES I S , 3a ed . , John Wiley & Sons, New York, NY (1999) . El término "enlace" o "enlazante" (L) se utiliza en la presente para hacer referencia a un átomo o una colección de átomos utilizados para unir, de preferencia mediante uno o más enlaces covalentes, entidades interconectadas tales como por ejemplo, dos segmentos poliméricos o un término de un polímero y un grupo funcional reactivo presente en un agente bioactivo. Un enlazante de la invención puede ser hidrolí ticamente estable o puede incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable. Un enlace "fisiológicamente hidrolizable" o "hidrolí icamente degradable" es un enlace débil que reacciona con agua (es decir, se hidroliza) bajo condiciones fisiológicas. Los enlaces preferidos son aquellos que tienen una vida media de hidrólisis a pH 8 , 25°C o menos de aproximadamente 30 minutos. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no sólo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales sino que también de los sustituyentes unidos a estos átomos centrales . Los enlaces hidrolíticamente inestables o degradables adecuados incluyen de manera enunciativa: carboxilatoéster , fosfatoéster , anhídridos, acétales, quetales, aciloxialquiléter , iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos . Un enlace "liidrolíticamente estable" o unión se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es prácticamente estable en agua, es decir, no experimenta hidrólisis bajo condiciones fisiológicas a ningún grado apreciable durante un periodo prolongado de tiempo. Los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen de manera enunciativa los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos y lo semejante. En general, un enlace hidrolíticamente estable es aquel que exhibe una velocidad de hidrólisis menor a aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas. Las velocidades de hidrólisis de los enlaces químicos representativos se pueden encontrar en la mayoría de los libros de texto normales de química. Un enlace "enzimáticamente inestable" o degradable es un enlace que se puede degradar mediante una o más enzimas . El término "estructura polimérica" se refiere a la cadena unida covalentemente de unidades monoméricas de repetición que forman el polímero. Los términos polímero y estructura polimérica se utilizan en la presente de manera indistinta. Por ejemplo, la estructura polimérica de PEG es -CH2CH20- (CH2CH20) n~CH2CH2 en donde n típicamente varía de aproximadamente 2 hasta 4000. Según se podría entender, la estructura polimérica puede estar unida covalentemente a grupos funcionales terminales o cadenas laterales con grupos funcionales colgantes separadas a lo largo de la estructura polimérica. El término "polímero reactivo" se refiere a un polímero que porta al menos un grupo funcional reactivo. A menos que se observe de otra manera, el peso molecular se expresa en la presente como peso molecular promedio numérico ( n) , que se define como , en donde Ni es el número de moléculas poliméricas (o el número de moles de aquellas moléculas) que tienen el peso molecular Mi. El término "alquilo", "alquenilo" , "alquinilo" y "alquileno" se refieren a cadenas de hidrocarburo típicamente que varían de aproximadamente 1 hasta 12 átomos de carbono de longitud, de preferencia 1 hasta 6 átomos, e incluye cadenas rectas y ramificadas . A menos que se observe de otra manera, la modalidad preferida de cualquier alquilo o alquileno al que se hace referencia en la presente es C1-C6 alquilo (por ejemplo, metilo o etilo) . "Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico saturado o insaturado, que incluye compuestos de puente, fusionados, o espirocí clicos , de preferencia que comprenden de 3 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono, de mayor preferencia de 3 hasta aproximadamente 8. "Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono en el núcleo. Múltiples anillos de arilo pueden estar fusionados, como en naftilo o sin fusionar, como en bifenilo. Los anillos de arilo pueden estar fusionados o sin fusionar con uno o más anillos cíclicos de hidrocarburo, heteroarilo, o heterocíclicos. "Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos , de preferencia N, O, o S, o una combinación de los mismos, el grupo heteroarilo está sustituido opcionalment e en los átomos de carbono o nitrógeno con Cl-6 alquilo, -CF3, fenilo, bencilo, o tienilo, o átomo de carbono en el grupo heteroarilo junto con un átomo de oxigeno forman un grupo carbonilo, o el grupo heteroarilo está fusionado opcxonalmente con un anillo de fenilo. Los anillos de heteroarilo también pueden estar fusionados con uno o más anillos de hidrocarburo cíclico, heterocíclicos , arilo o heteroarilo. Heteroarilo incluye, de manea enunciativa: heteroarilos de 5 miembros que tiene un heteroátomo (por ejemplo, tiofenos, pirróles, furanos) ; heteroarilos de 5 miembros que tienen dos heteroátomos en las posiciones 1,2 ó 1,3 (por ejemplo, oxazoles, pirazoles, imidazoles, tiazoles, purinas) ; heteroarilos de 5 miembros que tienen tres heteroátomos (por ejemplo, triazoles, tiadiazoles) ; heteroarilos de 5 miembros que tienen tres heteroátomos; heteroarilos de 6 miembros con un heteroátomo (por ejemplo, piridina, quinolina, isoquinol ina , fenantrina, 5 , 6-cicloheptenopiridina) ; heteroarilos de 6 miembros con dos heteroátomos (por ejemplo, piridazinas, cinnolinas, ftalazinas, pirazinas, pirimidinas, quinazolinas) ; heteroarilos de 6 miembros con tres heteroátomos (por ejemplo, 1 , 3 , 5 - triazina) ; y heteroarilos de 6 miembros con cuatro heteroátomos . "Heterocíclo" o "heterocíclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, de preferencia 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y al menos un átomo en el anillo que no es carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno, y nitrógeno. Pueden estar fusionados múltiples anillos, como en quinolina o benzofurano. "Heteroátomo" significa cualquier átomo que no sea de carbono en un compuesto análogo de hidrocarburo. Los ejemplos incluyen oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo, arsénico, silicio, selenio, telurio, estaño y boro. El término "fármaco", "molécula biológicamente activa" , "entidad biológicamente activa" o "agente biológicamente activo", cuando se utiliza en la presente significa cualquier sustancia que pueda afectar cualesquiera propiedades físicas o bioquímicas de un organismo biológico, incluyendo de manera enunciativa: virus, bacterias, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, en el sentido en el que se utiliza en la presente, molécula biológicamente activas incluyen cualquier sustancia destinada para diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad en seres humanos u otros animales, o para mejorar de otra manera el bienestar típico o mental de seres humanos o animales. Los ejemplos de moléculas biológicamente activas, incluyen de manera enunciativa, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequeña, tintes, lípidos, nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos , ácidos nucleicos, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuados para utilizarse con la invención incluyen de manera enunciativa: antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes anti- in lamatorios , agentes anti-tumorales , agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esferoidales y lo semejante. "Alcohol poliolefínico" se refiere a un polímero que comprende una estructura de poliolefina, tal como por ejemplo, polietileno, que tenga múltiples grupos hidróxilo colgantes unidos a la estructura polimérica. Un alcohol poliolefínico de ejemplo es un alcohol polivinílico . En el sentido en el que se utiliza en la presente, "no peptídico" se refiere a una estructura polimérica prácticamente libre de enlaces peptídicos. Sin embargo, la estructura polimérica puede incluir un número menor de enlaces peptídicos separados a lo largo de la longitud de la estructura, tal como por ejemplo, no m s de aproximadamente 1 enlace peptídico por aproximadamente 50 unidades monoméricas . Por "residuo" se debe entender la porción de una molécula que queda después de la reacción con una o más moléculas. Por ejemplo, un residuo molecular biológicamente activo en un conjugado de polímero ramificado de la invención es la porción de una molécula biológicamente activa que queda después del enlace covalente a un polímero ramificado de la invención . "Oligómero" se refiere a cadenas monoméricas cortas que comprenden de 2 hasta aproximadamente 10 unidades monoméricas, de preferencia de 2 hasta aproximadamente 5 unidades monoméricas . El término "conjugado" pretende hacer referencia a la entidad formada como resultado de la unión covalente de una molécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa, a una molécula de polímero reactivo, de preferencia un polímero reactivo ramificado de la invención. " onofuncional" en el contexto de un polímero de la invención se refiere a un polímero que posee un grupo funcional reactivo individual . "Bifuncional" en el contexto de un polímero de la invención se refiere a un polímero que posee dos grupos funcionales reactivos que pueden ser iguales o diferentes. "Multifuncional" en el contexto de un polímero de la invención significa un polímero que tiene 3 o más grupos funcionales unidos al mismo, en donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los polímeros multifuncionales de la invención típicamente comprenderán 3-100 grupos funcionales, o 3-50 grupos funcionales, o 3-25 grupos funcionales, o 3-15 grupos funcionales, o de 3 hasta 10 grupos funcionales, o contendrán 3,4, 5,6, 7,8, 9 ó 10 grupos funcionales unidos a la estructura polimérica.
II. Polímeros reactivos ramificados En un aspecto, la presente invención proporciona polímeros reactivos ramificados que comprenden al menos dos ramificaciones poliméricas, tales como por ejemplo, ramificaciones PEG, unidas a un núcleo central a través de enlaces heteroatomicos tales como por ejemplo, enlaces éter. La molécula de núcleo central es un hidrocarburo alifático que tiene una longitud de cadena de carbono de al menos tres átomos de carbono (es decir, propano, butano, pentano, y lo semejante) . Debido a que los polímeros ramificados de la invención combinan al menos dos ramificaciones poliméricas en una molécula individual, un polímero con suficiente peso molecular para impartir propiedades benéficas a una molécula biológicamente activa, tal como por ejemplo, solubilidad en agua aumentada, se puede formar utilizando más corta, más fácil para preparar cadenas poliméricas. Los polímeros ramificados de la invención de preferencia son monofuncionales , lo que significa que la molécula polimérica contiene únicamente un sitio reactivo individual para conjugación a una molécula biológicamente activa. El uso de un polímero monofuncional elimina la posibilidad de degradación con una molécula biológicamente activa, tal como por ejemplo, una proteína, que puede conducir a la pérdida de actividad . Según se describirá con mayor detalle más adelante, para los polímeros ramificados de la invención que comprenden ramificaciones poliméricas de poli (alquilenglicol) , tales como por ejemplo, ramificaciones PEG; los polímeros ramificados se sintetizan ventajosamente al pol imerizar unidades monoméricas de óxido de alquileno, tales como por ejemplo, unidades de óxido de etileno, directamente sobre una molécula núcleo de hidrocarburo alifático sustituida con dos o más grupos nucleofílicos (por ejemplo, grupos tiol, amino o hidróxilo) . De esta forma, se evitan los pasos de purificación polimérica que consumen tiempo y son caros asociados con la técnica anterior. Típicamente, el peso molecular promedio numérico total de los polímeros reactivos ramificados de la invención será de aproximadamente 500 hasta 100,000 daltons (Da), de preferencia de aproximadamente 5,000 hasta 60,000 Da, con la máxima preferencia de aproximadamente 8,000 hasta 40,000 Da. Cada ramificación polimérica del polímero ramificado típicamente tendrá un peso molecular de aproximadamente 250 Da hasta 50 , 000 Da, de mayor preferencia de aproximadamente 2,500 hasta 30,000 Da, y con la máxima preferencia de aproximadamente 4,000 hasta 20,000 Da. Se prefieren particularmente los polímeros ramificados que tienen un peso molecular promedio numérico total de aproximadamente 500 Da, aproximadamente 1,000 Da, aproximadamente 2,000 Da, aproximadamente 4,000 Da, aproximadamente 5,000 Da, aproximadamente 8,000 Da, aproximadamente 10,000 Da, aproximadamente 12,000 Da, aproximadamente 15,000 Da, aproximadamente 20,000, aproximadamente 25,000 Da, y aproximadamente 30,000 Da . Un polímero reactivo ramificado de la invención típicamente comprenderá al menos dos ramificaciones poliméricas solubles en agua y no peptídicas. Tales como por ejemplo, ramificaciones de poli (etilenglicol) , unidas covalentemente a una estructura núcleo de hidrocarburo alifático que porta un grupo funcional individual . Una estructura generalizada de los polímeros reactivos ramificados de la invención se muestra enseguida: (X)p-R(-X' -POLY) Fórmula I en donde : R es un hidrocarburo alifático que tiene una longitud de al menos tres átomos de carbono; cada POLY es un polímero soluble en agua y no peptídico, tal como por ejemplo PEG; X' es un enlace heteroatómico, de preferencia -NH- , -O-, o -S-; X es un enlazante; p es 0 ó 1 ; q es 2 hasta aproximadamente 10, de preferencia 2 hasta aproximadamente 5 (por ejemplo, 2,3, 4 , ó 5 ) ; y Y es un grupo funcional. El núcleo de hidrocarburo alif tico, R, de preferencia comprende de 3 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono, de mayor preferencia de 3 hasta 7 átomos de carbono, con la máxima preferencia de 3 hasta aproximadamente 5 átomos de carbono. Se prefieren particularmente as estructuras núcleo de 3, 4, y 5 átomos de carbono de longitud. El hidrocarburo alifático puede ser lineal o ramificado y puede incluir uno o más heteroátomos en la cadena de hidrocarburos. En una modalidad preferida, las ramificaciones poliméricas, POLY, y el grupo funcional, Y, cada uno está unido a diferentes átomos de carbono de la molécula núcleo. Por ejemplo, en una modalidad de núcleo de tres carbonos, las ramificaciones poliméricas POLY de preferencia están unidas en la posición 1 y 3 y el grupo funcional Y de preferencia está unido en la posición 2. Los polímeros ramificados de la invención de preferencia son simétricos, lo que significa que las ramificaciones poliméricas están ubicadas simétricamente sobre el núcleo central, R (por ejemplo, en la posición 1 y 3 de un núcleo alifático de tres carbonos) . Un arreglo simétrico conduce por sí mismo a la formación preferencial de únicamente un producto polimérico que tiene ramificaciones poliméricas de aproximadamente el mismo número de sub-unidades , debido a que el inicio del proceso de polimerización se debe presentar a velocidades aproximadamente iguales en posiciones de ramificación equivalentes que se extienden desde un núcleo simétrico.
A. Ramificaciones poliméricas En general, la porción polimérica soluble en agua y no peptídica de la estructura de polímero ramificado (es decir, POLY en la Fórmula I anterior) puede ser no tóxica y biocompatible , lo que significa que el polímero es capaz de coexistir con tejidos vivos u organismos sin provocar daño. Cuando se hace referencia a un polímero reactivo ramificado, se debe entender que el polímero puede ser cualquiera de diversos polímeros solubles en agua y no peptídicos, tales como por ejemplo, aquellos descritos en la presente como adecuados para utilizarse en la presente invención. De preferencia, POLY según se designa en la Fórmula I anterior es poli (etilenglicol) (PEG) . El término PEG incluye poli (etilenglicol) en cualquiera de diversas geometrías o formas, incluyendo las formas lineales (por ejemplo, alcoxi PEG o PEG bifuncional) , formas ramificadas o de múltiples ramificaciones (por ejemplo, PEG bifurcado o PEG unido a un núcleo de poliol) , PEG colgante, o PEG con enlaces degradables en el mismo, que se describirán con mayor detalle más adelante. Para formar los polímeros ramificados de la invención se prefieren polímeros lineales tales como por ejemplo, las formas lineales de PEG. En su forma más simple, PEG tiene la fórmula : -CH2CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2- Fórmula II en donde n es de aproximadamente 5 hasta 1,200, típicamente de aproximadamente 50 hasta 700.
Los polímeros rematados en el extremo, lo que significa polímeros que tienen al menos un término rematado con un grupo relativamente inerte, (por ejemplo, un grupo alcoxi) , se pueden utilizar como un polímero de la invención. Por ejemplo, metoxi - PEG-OH , o mPEG en breve, es una forma de PEG en donde un término del polímero es un grupo metoxi, mientras que el otro término es un grupo hidróxilo que se somete para facilitar la modificación química. La estructura de mPEG se determina enseguida . CH30- (CH2CH20)n-CH2CH2-OH Fórmula III en donde n es como se describió anteriormente . Las moléculas de PEG multi-ramificadas o ramificadas, tales como por ejemplo, aquellas descritas en la patente de los Estados Unidos No. 5,932,462, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad, aunque menos preferida, también se pueden utilizar como el polímero PEG en los polímeros reactivos ramificados de la invención. Por ejemplo, un polímero PEG ramificado de ejemplo puede tener la estructura: polya — R"—C I polyb—Q Fórmula IV en donde : polya y polyb son estructuras PEG, tales como por ejemplo, metoxi poli (etilenglicol) ; R" es una entidad no reactiva, tal como por ejemplo, H, metilo o una estructura PEG; y P y Q son enlaces no reactivos. En una modalidad preferida, el polímero PEG ramificado de glicina disustituida con metoxi poli (etilenglicol) . Como se podría observar por alguien con experiencia en la técnica, el uso de polímeros ramificados como las ramificaciones del polímero POLY en los polímeros reactivos ramificados de la invención podría dar por resultado en un polímero que tenga múltiples puntos de ramificación dentro de la molécula. Estos polímeros, si se utilizan para preparar las estructuras ramificadas de la invención, se unen a las estructuras de núcleo alifático proporcionadas en la presente no mediante polimerización sino mediante unión covalente . Aunque menos preferido debido a su naturaleza multifuncional , el polímero PEG alternativamente puede comprender un PEG bifurcado. Generalmente hablando, un polímero que tiene una estructura bifurcada se caracteriza por tener una cadena polimérica unida a dos o más agentes activos vía enlaces covalentes que se extienden desde un punto de ramificaciones hidrolíticamente estable en el polímero. Un ejemplo de un PEG bifurcado se representa por -PEG-YCHZ2, en donde Y es un grupo enlazante y cada Z es un grupo terminal activado para la unión covalente a un agente biológicamente activo. El grupo Z se une a CH mediante una cadena de átomos de longitud definida. La solicitud internacional No. PCT/US99/05333 , el contenido de la misma que se incorpora como referencia en la presente, expone diversas estructuras PEG bifurcadas capaces de utilizarse en la presente invención. La cadena de átomos que enlazan los grupos funcionales Z al átomo de carbono de ramificación sirven como un grupo de atadura y pueden comprender, por ejemplo, una cadena de alquilo, enlace éter, enlace éster, enlace amida o combinaciones de los mismos . En esta modalidad de la invención, el polímero ramificado resultante es multifuncional , es decir, tiene sitios reactivos adecuados para la unión a una molécula biológicamente activa no sólo que se extiende desde el núcleo alifático, sino que también se extiende desde las ramificaciones poliméricas bifurcadas. Como en el caso anterior, estos polímeros bifurcados, que se utilizan para preparar las estructuras ramificadas de la invención, están unidos a las estructuras de núcleo alifático proporcionadas en la presente no mediante polimerización sino que típicamente mediante unión covalente. Nuevamente, aunque menos favorecido debido a su naturaleza multifuncional , el polímero PEG puede comprender una molécula PEG colgante que tiene grupos reactivos, tales como por ejemplo, carbóxilo, unido covalentemente a lo largo de la longitud de la estructura PEG en lugar del extremo de la cadena PEG. Los grupos reactivos colgantes se pueden unir a la estructura PEG directamente o a través de una entidad enlazante, tal como por ejemplo, un grupo alquileno. Además, de las formas de PEG descritas anteriormente, las ramificaciones poliméricas (POLY) también se pueden preparar con uno o más enlaces débiles o degradables en la estructura polimérica, incluyendo cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, PEG se puede preparar con enlaces éster en la estructura polimerica que se someten a hidrólisis. Como se mostrará mas adelante, esta hidrólisis da por resultado en la escisión del polímero en fragmentos de menor peso molecular : -PEG-CO2-PEG- + H20 -PEG-C02H + HO-PEG- Otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como un enlace degradable dentro de una estructura polimérica, incluyen enlaces de carbonato; enlaces imina que resultan, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehido (véase, por ejemplo, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38 (1) -.582-3 (1997), que se incorpora en la presente como referencia); enlaces de fosfatoéster formados, por ejemplo, al hacer reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona que típicamente se forman por la reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces de acetal que típicamente se forman por la reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoéster que se forman, por ejemplo, por la reacción entre un formiato y un alcohol; enlaces peptídicos formados por un grupo amina, por ejemplo, en un extremo de un polímero tal como por ejemplo, PEG, y un grupo carbóxilo de un péptido; y enlaces oligonucleotídicos formados por ejemplo, por un grupo fosforamidita , por ejemplo, en el extremo de un polímero, y un grupo hidróxilo 5' de un oligonucleótido . En un caso, las ramificaciones poliméricas que tienen uno o más enlaces hidrolizables contenidos en las mismas se preparan en un proceso de polimerización de dos pasos que incluye un paso intermedio para la inclusión den enlace hidrolizable deseado. Es decir, la polimerización de, por ejemplo, sub-unidades de óxido de etileno, sobre el núcleo centra se lleva a cabo a una cierta longitud de cadena deseada y los términos de polímero reactivo que se extienden desde el núcleo central luego se acoplan a cortas cadenas poliméricas con grupos funcionales adecuados en un extremo para reaccionar con los grupos hidróxilo de las ramificaciones poliméricas intermedias que se extienden del núcleo para introducir loas enlaces hidrolizables. La polimerización adicional de sub-unidades de óxido de etileno sobre las ramificaciones poliméricas, ahora que contienen uno o más enlaces hidrolizables, luego se lleva a cabo para prepara ramificaciones poliméricas de una longitud de cadena deseada. Se debe entender por aquellos expertos en la técnica que el término poli (etilenglicol) o PEG representa o incluye todas las formas anteriores de PEG . Cualquiera de una variedad de polímeros monofuncionales , bif ncionales o multifuncionales que no sean peptídicos y que sean solubles en agua también se pueden utilizar para formar los polímeros ramificados de acuerdo con la presente invención. La estructura polimérica puede ser lineal, o puede ser cualquiera de las formas descritas anteriormente (por ejemplo, ramificada, bifurcada y lo semejante) . Ejemplos de polímeros adecuados incluyen de manera enunciativa: otros poli (alquilenglicoles) , copolímeros de etilenglicol y propilengicol , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli ( sacáridos ) , poli ( cc-hidroxiácido) , poli (ácido acrílico) , poli (alcohol vinílico) , pol ifosfaceno , polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,629,384, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad, y copolímeros , terpolímeros , y mezclas de los mismos. Típicamente, las dos o más ramificaciones poliméricas de un polímero ramificado de la invención son las mismas. Es decir, de mayor preferencia, las ramificaciones poliméricas son cada una un poli (etilenglicol) o cada una un alcohol poliolef ínico , etc. En general, no sólo son las ramificaciones poliméricas compuestas del mismo tiempo de sub-unidades , sino que también tienen idénticas geometrías y pesos moleculares similares. Es decir, en una modalidad más preferida de la invención, las ramificaciones poliméricas que se extienden desde el núcleo alif tico son idénticas.
B. Enlazante (X) Los polímeros ramificados de la invención opcionalmente incluyen un enlace (es decir, X en la Fórmula 1) que une un carbono de ramificación de la molécula núcleo central de hidrocarburo alifático con el grupo funcional, Y. La estructura del enlace X típicamente se determina por la estructura del núcleo de hidrocarburo alifático utilizado para formar los polímeros de la invención y tiene una longitud total de 1 hasta aproximadamente 40 átomos, de preferencia 1 hasta aproximadamente 10 átomos, y con la máxima preferencia 1 hasta 5 átomos. Los enlaces preferidos incluyen heteroátomos tales como por ejemplo, -O- o -S-, -alquileno- , -O-alquileno-0- , -alquileno-O-alquileno- , -arilo-0- (por ejemplo, -fenileno-0- ) , -0-arilo- (por ejemplo, -O-fenileno) , ( -O-alquileno- ) ra, y ( -alquileno-O- ) m, en donde m es 1-10, de preferencia 1-5 (por ejemplo, 1, 2,3, 4, ó 5) . Los grupos alquileno del enlace X de preferencia son Cl - C6alquileno , de mayor preferencia Cl-C3alquileno, que incluyen metileno y etileno. En algunos casos, puede ser ventajoso tener un enlazante (es decir, X en la Fórmula I) que se extiende al punto de unión covalente del agente biológicamente activo lejos del núcleo alifático central. En estas modalidades particulares de la invención, el término para la activación y posterior unión a un agente activo luego se realiza en una posición en carbono primario en lugar de uno secundario, aumentando con esto la facilidad y de modificaciones posteriores debido a la reactividad aumentada de un carbono primario en las reacciones de desplazamiento nucleofílico .
C. Grupo funcional (Y) El grupo funcional Y puede ser cualquier grupo funcional adecuado para reacción con un grupo funcional sobre una molécula biológicamente activa o un grupo funcional que sea un precursor de la misma. Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen idróxilo éster activo (por ejemplo, N-hidroxisuccinimidiléster y 1-benzotriazoliloéster) , carbonato activo (por ejemplo, carbonato de N-hidroxisuccinimidilo , carbonato de 1-benzotriazolilo , carbonato de p-nitrofenilo) , acetal, aldehido que tiene una longitud de carbono de 1 a 25 átomos de carbono (por ejemplo, acetaldehído , propionaldehído, y butiraldehído) , aldehido hidratado, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácidos alcanoicos, que tienen una longitud de átomos de carbono (incluyendo el carbonilcarbono) de 1 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono (por ejemplo, ácido carboxílico, carboximetilo , ácido propanoico, ácido butanoico) , haluro ácido, isocianato, isotiocianato , maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina , vinilpiridina , iodoacetamida, epoxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato.
Los grupos funcionales de ejemplo también se describen en las siguientes referencias, todas se incorporan como referencia en la presente: carbonato de N- succinimidi lo (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,281,698, 5,468,478), amina (véase, por ejemplo, Buckmann et al. Makromol . Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polim. J. 19:1177 (1983)), idrazida (véase, por ejemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), propionato de succinimidilo y butanoato de succinimidilo (véase, por ejemplo, Olson et al. in Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds . , ACS , Washington, DC , 1997; también véase la patente de los Estados Unidos No. 5,672, 662), succinato de succinimidilo (véase, por ejemplo, Abuchowski et al. Cáncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) and Joppich et al., Makromol. Chem. 180:1381 (1979), succinimidiléster (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,670,417), carbonato de benzotriazol (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,650,234), glicidiléter (véase, por ejemplo, Pitha et al. Eur. J. Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl . Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (véase, por ejemplo, Bea champ, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondellí et al. J. Controlléd Reléase 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (véase, por ejemplo, Veronese, et al., . Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (véase, por ejemplo, Harris et al. J. Polim. Sci . Chem . Ed. 22:341 (1984), patente de los Estados Unidos No. 5,824,784, patente de los Estados .Unidos No. 5,252,714), maleimida (véase, por ejemplo. Gcodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfuro (véase, por ejemplo, Woghiren, et al. Bioconj . Chem. 4:314 (1993)), acrilol (véase, por ejemplo, Sawhney et al., Macromol ecules , 26:581 (1993)), vinilsulfona (véase, por ejemplo, ia patente de los Estados Unidos No. 5, 900,461) . En una modalidad de la invención, el grupo funcional Y es un grupo funcional protegido, tal como por ejéniplo, un grupo hidróxilo protegido de la fórmula -O-Gp, en donde Gp es un grupo protector. El grupo protector Gp puede ser cualqiiera de diversos grupos protectores hidróxilo conocidos en la técnica, tales como por ejemplo, grupos bencilo u otros alquilarilo (por ejemplo, los grupos que tienen la fórmula -CH2-Ar, en donde Ar es cualquier grupo arilo) acetal, y dihidropiranilo. Oros grupos protectores adecuados se describen en Greene, T. ., et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3a ed., John Wiley & Sons, New York, NY (1999). Como se podría entender fácilmente, el grupo protector, Gp, se puede desplazar fácilmente de la molécula para formar un grupo hidróxilo, que se puede modificar adicionalmente par formar otros grupos funcionales que utilizan técnicas bien conocidas en este campo.
D. Estructuras núcleo Los polímeros ramificados de la invención se componen de un núcleo con base en hidrocarburo alifático (es decir, R en la Fórmula I anterior) que tiene una longitud de al menos tres átomos de carbono, de preferencia de 3 hasta 7 átomos de carbono. Es decir, una estructura núcleo central típicamente contendrá en su núcleo un número de átomos de carbono seleccionado de lo siguiente: 3, 4, 5, 6, 7 o más átomos de carbono. Las estructuras núcleo preferidas son las que contienen 3, 5 ó 7 carbonos en el núcleo. Aunque los átomos de carbono del núcleo central pueden tener ramificaciones poliméricas que se extienden desde cualquiera de los carbonos mencionados anteriormente, de preferencia aunque no necesariamente, el polímero ramificado total es simétrico. Es decir, para un núcleo de tres carbonos, las ramificaciones poliméricas de preferencia se extienden desde las posiciones 1 y 3, con un sitio adecuado para la unión covalente a una molécula biológicamente activa que se extiende desde el carbono central o el carbono en la posición 2.
Similarmente , para un núcleo de cinco carbonos, las ramificaciones poliméricas se extienden desde las posiciones 1 y 5, con un sitio adecuado para la unión covalente a una molécula biológicamente activa que se extiende desde la posición 3, o las ramificaciones poliméricas que se extienden desde las posiciones 2 y 4, o, si se desea una estructura bastante ramificada, con las ramificaciones poliméricas que se extienden desde cada una de las posiciones 1, 2, 4, y 5. Las estructuras núcleo de tres carbonos de ejemplo que poseen como el nucleófilo un átomo unido directamente a los carbonos 1 y 3 se proporcionan en los ejemplos. Estos ejemplos demuestran los procedimientos sintéticos para constituir las estructuras núcleo que tienen una variedad de grupos (X)p- De preferencia, los nucleófilos (heteroátomos ) unidos al núcleo central son iguales, por ejemplo, oxígeno total, nitrógeno total, etc. Aunque menos preferidas, adecuadas para utilizarse, en la formación de polímeros ramificados de la invención, están las estructuras núcleo asimétricas tales como por ejemplo aquellas derivadas de ácido 2 - aminopentandioico (ácido glutámico) ácido 2 -aminosuccínico (ácido asp'arfico) , y lo semejante. Al utilizar estructuras núcleo como estas, ios grupos ácido terminal típicamente se activan par el acoplamiento con un polímero reactivo para formar el núcleo polimérico ramificado. Alternativamente, los grupos de ácido carboxílico se reducen con un agente reductor para formar el diol correspondiente, que luego posee los sitios adecuados para constituir las cadenas poliméricas , por ejemplo, mediante una reacción catalizada del diol N-protegido con una sub-unidad mcnomérica adecuada y la posterior polimerización de la misma directamente sobre el núcleo central.
E. Estructuras de polímero reactivo ramificado de ejemplo Ahora se describirán las modalidades estructurales más específicas de los polímeros ramificados de la invención, todos pretenden estar abarcados por la estructura de la fórmula I anterior. Las estructuras específicas mostradas más adelante se presentan como estructuras de ejemplo únicamente, y no pretenden limitar el alcance de la invención . Una modalidad de la invención que tiene un núcleo de tres carbonos tiene la estructura: Fórmula la en donde POLY, X, p, e Y se describieron anteriormente . En una modalidad preferida de la Fórmula la, el polímero ramificado de la invención tiene la estructura : Fórmula Iai en donde : Z es un grupo de remate o un grupo funcional ; y POLY, X, p, e Y se describieron anteriormente . El grupo Z de preferencia es un grupo remate relativamente inerte, tal como por ejemplo, alcoxi (por ejemplo, metoxi o etoxi) , alquilo, bencilo, arilo, o ariloxi (por ejemplo, benciloxi) . Alternativamente, el grupo Z es un grupo funcional capaz de r'eaccionar fácilmente con un grupo funcional sobre una molécula biológicamente activa, tal como por ejemplo, cualquiera de los grupos funcionales analizados anteriormente para el grupo funcional Y. En otra modalidad de la Fórmula la, cada POLY es PEG rematado en el extremo con metoxi como se muestra enseguida: H3CO-PEG—0-CH2 CH-(X)p-Y H3CO-PEG—0-CH2 Fórmula Ia2 Todavía en otra modalidad de la Fórmula la, el enlace X está ausente según se muestra enseguida: Z-POLY-0-CH2 HC—Y I Z~POLY-0-CH2 Fórmula Ia3 en donde : Z, POLY, e Y se definieron anteriormente. De preferencia, Z es metoxi y POLY es PEG . En una modalidad adicional de la Fórmula la, el enlace X es uno de los enlaces específicos mostrados enseguida: Z-POLY-O-CH, I 2 CH—X—Y I Z-POLY-0-CH2 Fórmula Ia4 en donde · X es -CH2CH2-0-CH2CH2- o ~0-CH2CH2-; y Z, POLY e Y se definieron anteriormente. De preferencia, Z es metoxi y POLY es PEG. Come se describió anteriormente, se podrían utilizar otros heteroatoraos tales como por ejemplo, -NH- o -S- en lugar de los enlaces -O- ilustrados en las Fórmulas la, Iai, Ia2, Ia3 y Ia4 anteriores.
F. Método para formar polímeros reactivos ramificados Los polímeros ramificados de la invención se forman mediante la unión de ramificaciones poliméricas a una molécula núcleo de hidrocarburo alifático sustituido con heteroátomos que tiene al menos tres átomos de carbono, tales como por ejemplo, propano, vía enlaces heteroátomicos (por ej emplo, -NH- , -0- o -S-). Aunque las ramificaciones poliméricas pueden estar unidas a la estructura de hidrocarburo alifático al hacer reaccionar simplemente los grupos funcionales terminales sobre polímeros purificados preformados con nucleófilos reactivos sobre el núcleo de hidrocarburo alifático sin apartarse de la invención, para los polímeros de poli (alquilenglicol) , se prefiere en muchos casos polimerizar directamente las unidades monoméricas de óxido de alquileno, tales como por ejemplo, sub-unidades de óxido de etileno, óxido de propileno, u óxido de butileno, sobre un núcleo de hidrocarburo alifático que porta al menos dos grupos hidróxilo disponibles (u otros grupos nucleofílieos tales como por ejemplo, grupos amino o tiol) . Según se ilustra en los ejemplos, las unidades de óxido de alquileno se pueden polimerizar sobre, por ejemplo, una molécula de alcohol utilizando una reacción catalizada para formar ramificaciones poliméricas enlazadas por éter, utilizando de preferencia catálisis básica aunque también se pueden emplear otros catalizadores tales como por ejemplo, catalizadores metálicos o ácidos. Al polimerizar el óxido de alquileno directamente sobre una estructura núcleo de hidrocarburo alifático con grupo funcional adecuado, se puede formar el polímero ramificado sin la primera formación y purificar los polímeros de alto peso molecular, lo cual es técnicamente difícil, caro y consumidor de tiempo. La molécula núcleo de hidrocarburo alifático comprende dos o más grupos nucleofílicos disponibles, tales como por ejemplo, grupos hidróxilo, que dependen del número de ramificaciones poliméricas que estarán unidas a la molécula núcleo. En una modalidad particular, el hidrocarburo alifático tiene dos grupos hidróxilo. L molécula núcleo también porta al menos un grupo funcional protegido, tal como por ejemplo, un grupo hidróxilo protegido (es decir, -O-Gp, en donde Gp se describió anteriormente) . De preferencia, el hidrocarburo alifático es propano 1 , 3 -dihidroxi- 2 - sust ituido , en donde el grupo hidróxilo protegido está unido en la posición 2, opcionalmente vía un enlace intermediario (es decir, X en la Fórmula I anterior) . La presencia del grupo protector evita la polimerización en esa posición, asegurando con esto que al menos una cadena lateral del núcleo de hidrocarburo alifático estará disponible para una modificación adicional, por ejemplo, para una forma adecuada para la unión covalente a una molécula biológicamente activa. La estructura generalizada para la molécula núcleo de hidrocarburo alifático de la invención se muestra enseguida: Y' - (X)p-R(-NU)q Fórmula V en donde : Y' es un grupo funcional protegido, tal como por ejemplo, un grupo hidróxilo protegido, en donde en donde la presencia del grupo protector evita a polimerización en la posición Y ' del núcleo alifático, R; Nu es un nucleófilo, tal como por ejemplo, amino, tiol o hidróxilo; y R, X, p y q se definieron anteriormente.
A diferencia de ciertas aplicaciones de la técnica anterior que utilizan un poliol o una molécula núcleo de poliaminas para formar un hidrogel bastante reticulado, la presente invención utiliza una molécula núcleo de hidrocarburo alifático sustituido con nucleófilos para formar un polímero ramificado adecuado para el acoplamiento covalente a una molécula biológicamente activa. La estructura generalizada para una estructura núcleo de hidrocarburo alifático de tres carbonos sustituido con hidróxilo se muestra enseguida: Fórmula Va en donde : X, p, y Gp se definieron anteriormente. Las estructuras núcleo de ejemplo de la Fórmula Va incluyen 2 -benciloxi - 1 , 3 -propandiol , 2-benciloxietoxi-1 , 3 -propandiol , y 2-benciloxietoxietilo-1 , 3-propandiol . Las estructuras núcleo de la Fórmula V están ya sea disponibles comercialmente (véanse los Ejemplos 1-2) o se pueden preparar a partir de reactivos disponibles comercialmente (véanse los Ejemplos 3-4) . La polimerización base-iniciada de óxido de etileno sobre un hidrocarburo alifático sustituido con hidróxilo de la Fórmula Va da por resultado en un polímero ramificado de la Fórmula la en donde Y es -O-Gp y POLY es-PEG-OH. Después de esto, con el fin de formar un polímero ramificado monofuncional , los grupos hidróxilo terminales de las cadenas del polímero PEG de preferencia se alquilan (por ejemplo, se metilan para formar mPEG) mediante la reacción con un agente alquilante, tal como por ejemplo, toluensulfonato de metilo. Después de la alquilación del término de las cadenas PEG, el grupo protector, Gp , se puede desplazar mediante hidrólisis o hidrógenolisis para producir un grupo hidróxilo. Como se debe entender, el grupo hidróxilo luego se puede modificar convertir a otro grupo reactivo según se desee, tales como por ejemplo, los grupos reactivos listados anteriormente para la entidad Y de la Fórmula I .
III. Conjugados biológicamente activos de polímeros reactivos ramificados La presente invención también incluye conjugados biológicamente activos que comprenden una molécula biológicamente activa unida covalentemente a un polímero ramificado de la invención. Como se observó anteriormente, los polímeros ramificados de la invención de preferencia aunque no necesariamente son monofuncionales (por ejemplo, también pueden ser bifuncionales o de menor preferencia multifuncionales ) , y el agente biológicamente activo de preferencia unido al polímero ramificado vía un enlace formado a partir de la reacción del grupo funcional sobre el polímero ramificado y un grupo funcional sobre el agente biológicamente activo. El enlace específico dependerá de la estructura de los grupos funcionales utilizados, y típicamente estará regulado por los grupos funcionales contenidos en la molécula biológicamente activa. Por ejemplo, el enlace amida se puede formar mediante la reacción de un polímero ramificado que porta un grupo ácido carboxílico, o un éster activo del mismo, en presencia de un agente de acoplamiento, tal como por ejemplo DCC, DMAP, o HOBT, con un agente biológicamente activo que tiene un grupo amina. Alternativamente, un enlace sulfuro se puede formar mediante la reacción de un polímero ramificado que porta un grupo tiol con un agente biológicamente activo que porta un grupo hidróxilo. En otra modalidad, un enlace amina se forma mediante la reacción de un polímero ramificado que porta un grupo amino con una molécula biológicamente activa que porta un grupo hidróxilo. Todavía en otra modalidad, un polímero ramificado que porta un ácido carboxílico se hace reaccionar con una molécula biológicamente activa que porta un grupo hidróxilo en presencia de un agente de acoplamiento para formar un enlace éster. La química de acoplamiento particular empleada dependerá de la estructura del agente biológicamente activo, la presencia potencial de múltiples grupos funcionales dentro de la molécula biológicamente activa, la necesidad por pasos de protección/desprotección, la estabilidad química de la molécula y lo semejante, y se determinará fácilmente por alguien con experiencia en la técnica. La química de enlazamiento ilustrativo útil para preparar los conjugados poliméricos ramificados de la invención se puede encontrar, por ejemplo, en Wong, S.H., (1991), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslínking" , CRC Press, Boca Ratón, FL y en Brinkley, . (1992) "A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Oyes, Haptens, and Crosslinking Reagents", in Bioconjug. Chem., 3, 2013. El enlace (es decir, Lx en la Fórmula VI más adelante) puede ser hidrolíticamente degradable de tal forma que el agente biológicamente activo se libere en la circulación durante un tiempo después de la administración a un paciente. Los enlaces hidrol íticamente degradables de ejemplo incluyen carboxilatoéster fosfatoéster, anhídridos, acétales, quetales, aciloxialquiléter , iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Si se desea, un enlace hidrolíticamente estable, tal como por ejemplo, enlaces de amida, uretano (también conocidos como carbamata) , de amina, tioéter (también conocidos como sulfuro) , y urea (también conocidos como carbamida) , también se pueden utilizar sin apartarse de la invención. Una estructura generalizada para un conjugado biológicamente activo de la invención que comprende un polímero ramificado de la Fórmula I se puede representar como se muestra enseguida .- D-Ll- (X)p-R(-X' -POLY) q Fórmula VI en donde : D es una molécula biológicamente activa, tal como por ejemplo, un péptido, proteína, enzima, fármaco de molécula pequeña, tinte, lipido, nucleósido, nucleótido, oligonucleótido, polinucleótido , ácido nucleico, polisacárido , esteroide, célula, virus, liposoma, micropart ícula , micela, grasa, electrolito y lo semejante; Li es un enlace que resulta de la reacción del grupo funcional del polímero ramificado (es decir, Y en la Fórmula I) , y un grupo funcional sobre la molécula biológicamente activa; y POLY, X, X' , q y p se definieron anteriormente . En una modalidad preferida, el conjugado biológicamente activo tiene la estructura: POLY-0-CH2 CH-(X)p~-L D I POLY-0-C¾ Fórmula Vía en donde : D, Li, POLY, X y p se definieron an eriormente . Un agente biológicamente activo para utilizarse en el acoplamiento con un polímero ramificado de la invención puede ser cualquiera de uno o más de los siguientes. Los agentes adecuados se pueden seleccionar de, por ejemplo, hipnóticos y sedantes, energizantes psíquicos, tranquilizantes, fármacos respiratorios, anti-convulsionantes , relajantes musculares, agentes anti -parkinson (antagonistas de dopamina) , analgésicos, antiinflamatorios, fármacos anti-ansiedad (anxiolíticos ) , supresores del apetito, agentes anti-migraña, agentes para contracción muscular, anti-infectivos (antibióticos, antivirales, ant imicóticos , vacunas) antiartríticos, antimalaría, antieméticos, anepilépticos , broncodilatores , citosinas, factores de crecimiento, agentes anticáncer, agentes antitrombóticos, antihipertensivos , fármacos cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes anti-asma, agentes hormonales entre los que se incluyen anticonceptivos, simpatomiméticos , diuréticos, agentes reguladores de lípidos, agentes antiandrogénicos , antiparásitos, anticoagulantes, neoplásticos, antineoplasticos , hipoglucémicos , agentes nutricionales y suplementos, suplementos para el crecimiento, agentes antienteritis, vacunas, anticuerpos, agentes para diagnóstico y agentes contrastantes . Ejemplos de agentes activos adecuados para utilizarse en la unión covalente a un polímero ramificado de la invención incluyen de manera enunciativa: calcitonina, eritropoyetina (EPO) , Factor VIII, Factor IX, ceredase, cerezime, ciclosporina , factor para estimulación de colonias de granulocitos (GCSF) , trombopoyetina (TPO) , inhibidor de alfa- Iproteinasa , elcatonina, factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos (GMCSF) , hormona de crecimiento, hormona de crecimiento humano (HGH) , hormona para la liberación de la hormona de crecimiento (GHRH) , heparina, heparina con bajo peso molecular (LMWH) , interferon alfa, interferon beta, interferon gamma, receptor de interleucina-1 , interleucina- 2 , antagonista del receptor de interleucina-1, interleucina-3 , interleucina- 4 , interleucina- 6 , hormona para liberar la hormona luteinizante (LHRH) , factor IX insulina, pro- insulina, análogos de insulina (por ejemplo, insulina mono-acilada según se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,922,675), amilina, C-péptido, somatostatina , análogos de somatostatina entre los que se incluyen octreotide, vasopressin, hormona estimuladora de folículos (FSH) , factor del crecimiento similar a insulina (IGF), insulintropina , factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF) , factor del crecimiento nervioso (NGF) , factores de crecimiento de tejidos, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , factor de crecimiento glial (GGF) , factor de necrosis tumoral (TNF) , factores de crecimiento endotelial, hormona paratiroides (PTH) , timosin alfa-1 del péptido similar a glucagon, inhibidor Ilb/lIIa, alfa-1 antitripsina, compuestos de fosfhodiesterasae (PDE) , inhibidores VLA-4, bisfosfonatos , anticuerpo del virus sincitial respiratorio, gen regulador transmembrana de fibrosis cística (CFTR) , desoxirreibonucleasa (Dnase) , protelna bactericida/para aumento de permeabilidad (BPI) , anticuerpo anti-C V, ácido 13-cis retinoico, macrólidos tales como por ejemplo, eritromicina, oleandomicina , troleandomicina, roxitromicina, claritromicina , davercina, azitromicina , fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina , midecamicina , leucomicina, miocamicina, roquitamicina, andazitromicina , y swinolide A; fluoroquinolonas tales como por ejemplo, ciprofloxacina , ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina , alatrofloxacina , moxifloxicina, norfloxacina , enoxacina, grepafloxacina , gat ifloxacina , lomefloxacina , esparfloxacina, temafloxacina , pefloxacina, amifloxacina , fleroxacina, tosufloxacina , prulifloxacina , irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina , y sitafloxacina, aminoglucósidos tales como por ejemplo, gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amicacina, canamicina, neomicina, y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina , rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato, polimixinas tales como por ejemplo, polimixina B, capreomicina , bacitracina, peñeras ; penicilinas entre las que se incluyen agentes sensibles a penisilinasa similares a penicilina G, penicilina V, agentes resistentes a peniclinasa similares a meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina , floxacilina, nafcilina; agentes activos de microorganismos gram negativos similares a ampicilina, amoxicilina, y hetacilina, cilina, y galampicilina ; penicilinas anti-pseudomonal similares a carbenicilina , ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, y piperacilina ; cefalosporinas similares a cefpodoxima, cefprozil, ceftbuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandol , cefazolina, cefaloridina , cefaclor, cefadroxilo, cefaloglicina , cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetril , cefepime, cefixime, cefonicide, cefoperazona , cefotetano, cefmetazol, ceftazidime, loracarbef, y moxalactama, monobactamas similares a aztreonam; y carbapenems tales como por ejemplo, imipenem, meropenem, isetiouato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaina, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona , acetamida de triamcinolona, acetonide de budesonide, fluticasona, bromuro de ipratropium, flunisolide, sodio de cromolin, tartrato de ergotamina y cuando sea aplicable, análogos agonistas, antagonistas , inhibidores y formas salinas farmacéuticamente aceptables de los anteriores. Haciendo referencia a péptidos y proteínas, la invención pretende abarcar las formas sintéticas naturales glucosadas, sin glucosar, pegiladas, y los fragmentos biológicamente activos y análogos de los mismos.
IV. Ejemplos Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, aunque no se deben consideran como limitantes de la invención. Por ejemplo, aunque PEG se utiliza en los ejemplos para ilustrar la invención, otros polímeros que son útiles en la práctica de la invención se abarcan por la invención según se analizó anteriormente. Todos los reactivos PEG a los que se hace referencia en los ejemplos anexos están disponibles de Shearwater Corporation de Huntsville, AL. Todos los otros reactivos están disponibles comercialmente . Todos los datos 1HN R se generaron mediante un espectrómetro NMR de 300 ó 400 MHz fabricado por Bruker . Los Ejemplos 1-2 ilustran un método para formar un polímero reactivo ramificado de la invención utilizando una molécula núcleo de hidrocarburo alifático sustituido con hidróxilo disponible comercialmente (2-benciloxi - 1 , 3 -propandiol) . En el Ejemplo 1, el polímero ramificado es un grupo funcional con un acetaldehído dietilacetal . En el Ejemplo 2, el polímero ramificado es un grupo funcional con un succinimidiléster o ácido butírico. Los Ejemplos 3-4 ilustran un método para sintetizar dos moléculas núcleo adicionales que tienen enlaces intermediarios entre la molécula núcleo de hidrocarburo alifático y la cadena lateral de hidróxilo protegido. Los Ejemplos 5-6 ilustran la PEGilación de una enzima con un polímero ramificado de la invención para formar un conjugado.
Ejemplo 1 Síntesis de 2 - (1 , 3 -di -mPEGoxi -2 -propanoxi ) acetaldehído dietilacetal A. Síntesis de 1 , 3 - diPEGoxi - 2 -benciloxipropano [P poli (etilenqlicol) (PEG) = 9 kDa] ] Un matraz de fondo redondo de 500 mi se cargó con 250 mi de THF seco, destilado recientemente, que contenía 2 -benciloxi- 1 , 3 -propandiol (.84g, 4.59 mmol) . Se agregó naftalenida de potasio (0.28 M, 16.4 mi) con agitación continua bajo una atmósfera inerte. El matraz luego se enfrío a 0°C en un baño con hielo. Se agregó óxido de etileno (50.0 mi, 1.02 mole) vía una jeringa enfriada. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 72 horas. La reacción se inactivo mediante la adición de 5 mi de ácido acético 2M. Los solventes se retiraron mediante evaporación giratoria y el material crudo se volvió a disolver en 100 mi de cloruro de metileno. El producto se precipitó mediante la adición de 400 ral de dietiléter y se recolectó mediante filtración. El producto se secó bajo vacío . Rendimiento: 42 g. (93%) . XH nmr (400 MHz DMSO-dg) , d 7.25-7.34, (m, 5H), 4.6 (s, 2H) , 3.2-3.8 (m, 826H) .
B. Metilación de 1 , 3 -diPEGoxi -2 -bencipropano 1 , 3 -diPEGoxi-2 -benciloxipropano [PM poli (etilenglicol) (PEG) = 9 kDa] (5.0g, 0.55 mmol) del paso A se colocaron en un matraz de fondo redondo de dos cuellos y se disolvieron en 150 mi de tolueno. El matraz se dotó con un septum y una trampa Dean-Stark y el compuesto se secó azeotrópicamente bajo una atmósfera inerte. La trampa se reemplazó con un condensador a reflujo y la temperatura del matraz se mantuvo a 45°C al colocar el matraz en un baño de aceite a temperatura constante . Se agregaron toluensulfonato de metilo (1.62 mi, 5.4 mmoles) y 2.8 mi de solución de t-butóxido de potasio (1.0 M en THF) y la reacción se agitó durante 3 horas. Luego se agregaron toluensulfonato de metilo (0.81 mi) y 1.4 mi de solución de t-butóxido de potasio y la reacción se agitó durante unas 3 horas adicionales . El matraz se retiró del baño de aceite y se enfrió a temperatura ambiente. La solución se transfirió a un matraz de fondo redondo de un solo cuello y el solvente se eliminó mediante evaporación giratoria. El residuo se disolvió en 5 mi de cloruro de metileno y se precipitó mediante la adición de 50 mi de dietiléter. El producto se recolectó mediante filtración y se secó bajo vacío. Rendimiento: 4.2 g. ? Nmr (400 MHz DMSO-ds) , d 7.25-7.34 (m, 5H) 4.6 (s, 2H) , 3.3-3.8 (m, 826H) , 3.24 (s, 6H) .
C. Desbencilación de 1 , 3-di-mPEGoxi-2- benciloxipropano 1 , 3 -di-mPEGoxi-2 -benciloxipropano [PM poli (etilenglicol) (PEG) = 9 kDa] (2.9 g, 0.32 mmoles) del paso B se disolvieron en 100 mi de etanol . Se agregaron Pd(OH)2/C (0.5 g) y ciclohexeno (10 mi) y la mezcla se llevó a reflujo durante 4 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y el solvente filtrado se eliminó mediante evaporación giratoria. El material residual crudo se disolvió en 5 mi de cloruro de metileno y se precipitó mediante la adición de 50 mi de dietiléter. El producto se recolectó mediante filtración y se secó bajo vacío. 1H Nmr (300 MHz , D S0-d6) , d 4.76 (d, 1H) , 3.3-3.8 (m, 826H) , 3.24 (s, 6H) .
D. Síntesis de 2- ( 1 , 3 -di -mPEGoxi - 2 -propanoxi ) acetaldehído dietilacetal A 2 -hidroxi- 1 , 3 -di-mPEGoxipropano proveniente del paso C (P.M. 9000 Da, 4.5 g, 0.0005 moles) en dioxano (250 mi) se agregó hidróxido de sodio (0.20 g, 0.005 moles) y cloroacetaldehído dietilacetal (0.38 g, 0.0025 moles) y la mezcla se llevó a reflujo 24 horas con agitación vigorosa. La solución se concentró a aproximadamente 150 mi, se enfrió, y se filtró. El filtrado se evaporó a sequedad, se disolvió en 100 mi de agua, y se extrajo con cloruro de metileno (3 x 75 mi) . Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se concentraron, y el producto se precipitó mediante la adición de 300 mi de éter. El producto precipitado se recolectó mediante filtración y se secó bajo vacío. Esta reacción demuestra la conversión del grupo protector de 2-benciloxipropano a una forma protegida de un aldehido (acetaldehído dietilacetal) adecuado para el acoplamiento covalente con grupos amino en una proteína u otro agente biológicamente activo .
Ej emplo 2 Síntesis de butirato de 2 - ( 1 , 3 -di -mPEGoxi- 2 - propanoxi ) succinimidilo (mPBG2 - SBA) (20 kDa) -O-PEG-OCH3 H3C0-PEG-O-i ?- HO— { ^ J-OCHzCH2CH2COOH -O-PEG-OCH3 H3CO-PEG-O-' A. Metilación de 1 , 3 -diPEGoxi-2-benciloxipropano 20 g de 1 , 3 -diPEGoxi -2 -benciloxipropano (20 kDa) preparado según se describió en el Paso A del Ejemplo 1 y 0.01 g de BHT ( 2 , 6 -Di - ter-butil -4 -metilfenol) se disolvieron en 400 mi de tolueno. La solución resultante se secó azeotrópicamente mediante destilación o presión reducida. El residuo se volvió a disolver en 700 mL de tolueno anhidro y 14 mL de solución de ter-butóxido de potasio (solución 1.0 M en ter-butanol) y se agregaron por separado 3.0 mi de metil-toluensulfonato . La mezcla de reacción se agitó durante la noche a 45°C bajo nitrógeno. El material insoluble se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad bajo presión reducida. El residuo se disolvió en 700 mi de agua desionizada y se saturó con NaCl . El pH de la solución se ajustó a 7.5 y luego se extrajo con diclorometano (300 mi x 2). El diclorometano extraído se secó sobre Na2S04, se filtró, se evaporó y se precipitó con Et20 (500 mL) . El producto metilado se recolectó mediante filtración al vacío y se secó bajo vacío durante la noche. Rendimiento: 18.5 g a? nmr (DMSO-ds) : d 7.33 ppm (mult. -0CH2C6H5) , d 4.61 ppm (s. -OCH2CeHs) , d 4.31 ppm (t, -OCH2CH2OMs) , 3.5 ppm (br. mult., PEG) , d 3.24 ppm (s, CH3OPEG-) .
B. Desbencilación de 1 , 3 - di-mPEGoxi - 2 - benciloxipropano 18.0 g de 1 , 3 -di-mPEGoxi -2 -benciloxipropano (20kDa) del paso A se disolvieron en 225 mi de amortiguador de fosfato 5m (pH 7.2) y se agregaron 1.13 g de Pd al 10% sobre carbón vegetal. La suspensión se hidrogenó 20 horas bajo 40 psi de hidrógeno . La suspensión se filtró para eliminar el catalizador y el filtrado se saturó con NaCl y el pH de la solución se ajustó a 3.0. La solución se extrajo con diclorometano (300 mi x 2) y los extractos combinados se secaron sobre Na2S04, se filtraron, se evaporaron y se precipitaron con Et20 (500 mL) . El producto se recolectó mediante filtración al vacío y se secó al vacio durante la noche . Rendimiento: 13.2 g; 1H nmr (D SO-d6) : d 4.76 ppm (d. HO-CH-); d 3.5 ppm (br. mult. , PEG) , d 3.24 ppm (s, CH3OPEG-) .
C. Síntesis de ácido 2- (1 , 3 -di-mPEGoxi-2- propanoxi) butírico 2.5 g de 2 -hidroxi - 1 , 3 -di-mPEGoxipropano (20 kDa) del paso B se disolvieron en 30 mi de tolueno y la solución resultante se secó azeotrópicamente mediante destilación bajo presión reducida. El residuo se volvió a disolver en 30 mL de tolueno anhidro y se agregaron 1 mL de solución de ter-butóxido de potasio (solución 1.0M en ter-butanol) , 2.5 mg de BHT, y 0.25 g de l-(3-bromopropil) -4-metil-2,6, 7-trioxabiciclo [2,2,2,] octano. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a 65°C bajo nitrógeno. El solvente se evaporó a sequedad bao presión reducida. El residuo se secó bajo vacío durante 2 horas, y por último se volvió a disolver en 60 mi de agua desionizada. El pH de la solución se ajustó a 2.0 con H3P04 al 10%. Después de agitar a un pH 2.0 durante 15 minutos, el pH de la solución se ajustó a 12.0 con NaOH 1.0 N y se agitó a pH 12.0 durante 2 horas. La solución hidrolizada se saturó con NaCl y el pH se ajustó a 3.0 con H3P04 al 10%. La solución se extrajo con diclorometano (100 mi x 2) y los extractos combinados se secaron sobre Na2S04, se filtraron, se evaporaron y se precipitaron con Et20 (100 mL) . El producto se recolectó mediante filtración al vacío y se secó al vacío durante la noche . Rendimiento: 2.3 g GPC: 79 %.
D. Purificación de ácido 2 - ( 1 , 3 - di -mPEGoxi - 2 - propanoxi ) butírico El ácido 2- (1, 3-di-mPEGoxi-2-propanoxi ) butírico crudo del paso C se purificó mediante una columna de intercambio iónico FF con DEAE sefarosa (100 mL) . Después de la purificación, el rendimiento fue 1.55 g. 1H nmr (DMSO-d6): d 3.5 ppm (br. mult . , PEG) , d 3.24 ppm (s, Cí^OPEG-), d 2.23 ppm (t,-OCH2CH2CH2COOH) , d 1.70 ppm (mult. -OCH2CH2CH2COOH) .
E. Síntesis de 2- ( 1 , 3 -di -mPEGoxi - 2 - propanoxi ) succinimidilbutirato (20 kDa) 1.5 g de ácido 2 - (1 , 3 -di -mPEGoxi -2 -propanoxi ) butírico del paso D se disolvieron en 20 mi de diclorometano anhidro bajo nitrógeno. Primero se agregó N-hidroxisuccinimida (0. 0132 g) a la solución seguida por 0.0234 g de diciclohexilcarbodiimida . La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo nitrógeno. El producto se filtró, se concentró bajo vacío, se precipitó en una mezcla de IPA y Et20 (1:1) , se recolectó mediante filtración y se secó bajo vacío. Rendimiento: 1.2 g ; ¾ nmr (D S0-d6): d 3.5 ppm (br. mult., PEG) , d 3.24 ppm (s, CH30PEG-), d 2.80 ppm (s, -NHS) , d 2.70 ppm (t.
-OCH2CH2CH2COONHS) , d 1.81 ppm (mult. -OCH2CH2CH2COONHS) .
Ejemplo 3 Síntesis de ( 2 ' -benciloxietoxi ) etil - 1 , 3 -propandiol (BBBP) - una molécula núcleo de hidrocarburo alifático ilustrativa adecuada para utilizarse en la preparación de un polímero ramificado ^~^-CH2-0-CH2GH20-CH2CH2OH ^^~CH2-0-CH2CH20-CH2CH20-S-CH3 O A. Síntesis de monobenciléter metansulfonato de di (etilen licol) Se secó monobenciléter de di (etilenglicol) (15 g) en 200 mi de tolueno mediante destilación azeotrópica y el residuo se volvió a disolver en 400 mi de tolueno anhidro y 100 mi de diclorometano anhidro. A la solución se agregaron 11.5 mi de trietilamina seca y 6.23 mi de cloruro de metansulfonilo gota a gota a 0-5°G. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante la noche y la reacción se inactivo al agregar 5 mi de etanol puro. El material insoluble se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. El residuo se volvió a disolver en 200 mi de tolueno anhidro y el material insoluble se filtró. El filtrado se evaporó a sequedad y el residuo se secó bajo vacío durante la noche. Rendimiento: 22 g 1H nmr (DMSO-d6) : d 7.33 ppm (mult. -OCH2CsHs), d 4.49 ppm (s. -OCH2C6H5) , d 4.31 ppm (t, OCH2 CH20S02-CH3) , d 3.69 ppm (t, OCH2 CH2 OS 02-CH3) , d 3.59 ppm (mult., - OCH2.CH2 O - ) , d 3.24 ppm (s, OCH2CH2OS02-CH3 ) · B . Síntesis de CfiHs - CHzO - CHa CHaOCHgCHa - CH ( COOC2Hs ) ¾ Se agregó malonato de dietilo (17.5 g) en 100 mi de 1,4-dioxano gota a gota de NaH (3.6 g) en 150 mi de 1,4-dioxano bajo nitrógeno. Se agregó monobenciléter metansulfonato de di (etilenglicol) (10 g) del paso A en 600 mi de 1,4-dioxano a la solución de malonato de dietilo anterior. Después de llevar a reflujo la mezcla durante 4 horas, la solución de reacción se filtró y se evaporó a sequedad. El residuo se secó al vacío durante la noche . El malonato de dietilo restante se destiló bajo presión reducida. Después de la destilación, el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea sobre una columna de gel de sílice eluido con hexano seguido por diclorometano . Los extractos de diclorometano combinados se evaporaron a sequedad y el producto se secó bajo vacío durante la noche. Rendimiento: 6 g. XH nmr (DMSO-d6) : d 7.33 ppm (mult. -OCH2C6Hs) , d 4.48 ppm (s. -OCH2C6H5) , d 4.10 ppm (mult. OCH2CH3) , d 3.51 ppm (mult., - O CH2 CH2O - CH2 CH2 - , -CH (C02-C2H5) 2) , d 2.01 ppm (mult. -0CH2CH¿-CH (C02-C2H5) 2) , d 1.16 ppm ( t , -OCH2CH3) .
C. Síntesis de CgHs - CHaO-CH^CHaOCHa CHa-CH (CH20H) 2 Se disolvió CsH5-CH20-CH2CH2OCH2CH2- CH (COOC2Hs) 2 (5 g) del paso B en 200 mi de tolueno y 29.5 mi de LiAlH4 (1 M en THF) se agregó a 0-5°C. Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, se agregó 1 mi de agua seguida por 1.0 mi de NaOH al 15% NaOH y 3.0 mi de agua. El material insoluble se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. El producto se purificó mediante cromatografía instantánea sobre una columna de gel de sílice eluida con acetato de etilo. Las fracciones combinadas se evaporaron a sequedad. El producto final se secó bajo vacío durante la noche. Rendimiento: 1.5 g 2H nmm (CDC13) : d 7.29 ppm (mult. -OCH2CsH5) , d 4.55 ppm (s. -OCH2C6H5) , d 3.61 ppm (mult., CfiHsCH¾-OC¾C¾0- CH¾CH2 - , -CH(CH2OH)2, d 1.81 ppm (mult. -OCH2CH2-CH (CH2OH) 2) , d 1.65 ppm (mult. -OCH2CH2-CH (CH2OH) 2) .
Ejemplo 4 Síntesis de ( 2 ' -benciloxietoxi) - 1 , 3 -propandiol - una molécula núcleo de hidrocarburo alif tico de ejemplo útil para preparar un polímero ramificado Una mezcla de 2 g de cis-1,3-0-benciloidenglicerol , 3.51 mi de 2 -bromoetiléter de bencilo, 1.25 g de KOH en polvo y 30 mi de tolueno se agitó bajo reflujo durante aproximadamente 20 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, el material insoluble se eliminó mediante filtración y el filtrado se concentró. El residuo se destiló a 140°C bajo presión reducida para eliminar el 2-bromoetiléter de bencilo. Después de la destilación, el residuo se disolvió en 20 mi de metanol que contenía 2 mi de HC1 concentrado y se llevó a reflujo durante 4 horas. Se agregaron 100 mi de agua y el pH se ajustó a 5-6 con NaOH sólido. Se agregó NaCl a -10 % y el producto se extrajo con diclorometano (50 mi x 3) . Los extractos de diclorometano combinados se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron. El residuo se secó bajo vacío y el producto se purificó mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice (80 g) eluido con acetato de etilo. Las fracciones combinadas se evaporaron y se secaron bajo vacío. Rendimiento: -0.9 g 1H nmr (DMSO-d6) : d 7.31 ppm (mult. OCH2C¿H5) , d 4.48 ppm (s. -OCH2CsH5) , d 4.43 ppm (s. br . -CH (CH2OH) 2) . ) , d 3.67 ppm (t., -OCH2CH2O-CH (CH20H) 2) , d 3.54 ppm (t . , -OCHgCHaO-CH(CH2OH)2), d 3.41 ppm (mult. -OCH2CH20- CH (CH2OH) 2 ) , d 3.29 ppra (mult . -OCH2CH20-CH (CH2OH) 2) .
Ejemplo 5 PEGilación de Lysozyme con un polímero PEG ramificado Se disolvió Lysozyme (0.0021g, Sigma) ) en 1 mi de amortiguador de fosfato de sodio 50 mM (pH 7.5) en un vial de 2 mi. Se agregó MPEG2 (20 kDa) -SBA (0.006 g, exceso molar al doble con el lysozyme) del Ejemplo 2 y el vial de reacción se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 18 horas . El espectro MALDI-TOF de la mezcla de reacción cruda mostró lysozyme, PEG2 (20 kDa) -ácido butanoico, y lysozyme di-pegilado a masas de 14,028 Da, 21, 810 Da, 35,612 Da y 57,783 Da, respectivamente para estar presentes. SDS-PAGE (gel Tris-HCL al 10%) exhibió seis bandas que indican lysozyme tetra, tri, di, monopegilado (lo que significa que las formas modificadas con polímero de la enzima que tienen 4, 3, 2 y 1 de los polímeros ramificados de la invención se unen covalentemente al mismo, respectivamente) PEG2 (20K) -ácido butanoico, y lysozyme sin pegilar.
El Ejemplo 5 demuestra la utilidad de los polímeros de la presente invención para formar conjugados que tienen un acoplamiento de enlace amida de la estructura de polímeros ramificados con un agente biológico.
Ejemplo 6 PEGylación de lysozyme con polímero PEG ramificado Se disolvieron 2.2 mg, 1.9 mg y 2.1 mg de lysozyme (Sigma) en 1 mi de amortiguador de fosfato de sodio 50 mM de pH 5.5, 6.5 y 7.6, respectivamente. Se agregaron 1.5 mg de di-mPEG 2kDa-butiraldehído (exceso molar de 5 veces con relación al lysozyme) y 0.1 mg de NaCNBH3 (exceso molar de 10 veces con relación al lysozyme) a la solución de lysozyme de pH 5.5. Se agregaron 1.3 mg y 1.5 mg de MPEG 2kDa-butiralde ído a la solución de lysozyme de pH 6.5 y 7.5, respectivamente, seguido por la adición de 0.08 mg y 0.09 mg de NaCNBH3 , respectivamente. Los tres viales de redacción se agitaron vigorosamente a temperatura ambiente durante 6 horas . Las muestras de las reacciones de pH 5.5 y 6.5 mostraron la presencia de lysozyme, lysozyme mono, y di-pegilado por MALDI-TOF. Las muestras proveniente de la reacción conducida a 7.5 indicaron la presencia de únicamente lysozyme di-pegilado por MALDI-TOF. Después de 24 horas, todas las mezclas del producto de reacción contuvieron lysozyme, lysozyme mono, y di-pegilado, y lysozyme tri-peg lado . Tres muestras extraídas de las reacciones a pH 5.5, 6.5 y 7.5 después de 6 horas se mancharon sobre un gel Tris-HCl al 15%. Cada muestra exhibió tres bandas visibles que corresponden a lysozyme di, mono y natural. Las tres muestras extraídas de las reacciones a pH 5.5, 6.5 y 7.5 después de 24 horas mostraron cuatro bandas visibles, que indicaron lysozyme tri, di, mono y sin pegilar. El Ejemplo 6 demuestra la utilidad de los polímeros de la invención par formar conjugados en donde un agente biológicamente activo está acoplado covalentemente al polímero ramificado vía un enlace de amina secundaria generado por la aminación reductiva de la base Schiff correspondiente.

Claims (36)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un polímero reactivo ramificado que tiene la estructura:
  2. Y- (X) -R ( -X' -POLY) q caracterizado porque: R es un hidrocarburo alifático que tiene una longitud de al menos tres átomos de carbono ,- Cada POLY es un polímero soluble en agua y no peptídico; X' es un enlace heteroatomico; X es un enlazante; p es 0 ó 1 ; q es 2 hasta 10; y Y es un grupo funcional. 2. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque X' es -NH-, -O- o -S-.
  3. 3. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque q es 2 hasta 5.
  4. 4. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque las ramificaciones del polímero POLY están ubicadas simétricamente sobre el hidrocarburo alifático.
  5. 5. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque R comprende de 3 hasta 7 átomos de carbono.
  6. 6. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque R comprende tres átomos de carbono.
  7. 7. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque cada ramificación del polímero POLY el grupo funcional Y están unidos a diferentes átomos de carbono de R.
  8. 8. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque cada POLY tiene la estructura Z-POLY-, en donde Z es un grupo de remate o un grupo funcional.
  9. 9. El polímero ramificado según la reivindicación 8, caracterizado porque cada Z es un grupo de remate seleccionado independientemente del grupo que consiste de alcoxi, alquilo, bencilo, arilo y ariloxi .
  10. 10. El polímero ramificado según la reivindicación 8, caracterizado porque Z es metoxi .
  11. 11. El polímero ramificado según la reivindicación 8, caracterizado porque Z es un grupo funcional seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidroxilo, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, aldehido hidratado, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácido alcanoico, haluro ácido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona , ditiopiridina , vinilpiridina , iodoacetamida , epoxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato.
  12. 12. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste de hidroxilo, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, aldehido hidratado, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácido alcanoico, haluro ácido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinil sulfon , ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epoxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato .
  13. 13. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque cada POLY se selecciona independientemente del grupo que consiste de poli (alquilenglicol ) , poli (poliol oxietilado) , poli (alcohol olefínico) , pol i (vinilpirrolidona) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli (sacáridos) , poli (a-hidroxiácido) , poli (alcohol vinílico) , polifosfaceno, polioxazolina , poli (N-acriloilmorfolina) y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos.
  14. 14. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque cada POLY es poli (etilenglicol) .
  15. 15. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque cada POLY es lineal o ramificado.
  16. 16. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque p es 1 y X se selecciona del grupo que consiste de un heteroátomo, -alquileno-, -0- alquileno-O- , -alquileno-O-alquileno-, -arilo-0-, -O-arilo-, ( -O-alquileno- ) m, y ( -alquileno-O- ) m( en donde m es 1-10.
  17. 17. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque p es 0 e Y es hidróxilo.
  18. 18. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque Y es idróxílo protegido que tiene la estructura -O-Gp, en donde Gp es un grupo protector.
  19. 19. El polímero ramificado según la reivindicación 18, caracterizado porque Gp se selecciona del grupo que consiste de bencilo, acetal y dihidropiranilo .
  20. 20. El polímero ramificado según la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la estructura : POLY-0-CH2 CH-(X)p—Y I p POLY-0-CH2
  21. 21. ün conjugado biológicamente activo, caracterizado porque comprende una molécula biológicamente activa unida covalentemente a un polímero reactivo ramificado según la reivindicación 1. 22. Un conjugado biológicamente activo que comprende un polímero ramificado unido covalentemente a una molécula biológicamente activa, caracterizado porque el conjugado tiene la estructura :
  22. D-Li- (X) p-R (-X' -POLY) q caracterizado porque: D es la molécula biológicamente activa; Li es un enlace que resulta de la reacción de un grupo funcional del polímero ramificado y un grupo funcional de la molécula biológicamente activa ; R es un hidrocarburo alifático que tiene una longitud de al menos tres átomos de carbono; cada POLY es un polímero soluble en agua y no peptldico; X' es un enlace heteroatómico ; X es un enlazante; p es 0 ó 1 ; y q es 2 hasta 10.
  23. 23. El conjugado biológicamente activo según la reivindicación 22, caracterizado porque D se selecciona del grupo que consiste de péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequeña, tintes, lípidos, nucleósidos, nucleótidos, ol igonucl eótidos , pol inucleót idos , ácidos nucleicos, polisacáridos , esteroides, células, virus, liposomas, micropartículas , micelas, grasas y electrolitos .
  24. 24. El conjugado biológicamente activo según la reivindicación 22, caracterizado porque tiene la estructura: POLY-0-CH2 CH-(X)p-L D I POLY-0-CH2
  25. 25. Una molécula núcleo de hidrocarburo alifático sustituido con nucleófilos tiene la estructura:
  26. Y ' - (X)p-R(-NU)q caracterizado porque.- Y' es un grupo funcional protegido; cada Nu es un nucleófilo; R es un hidrocarburo alifático que tiene una longitud de al menos tres átomos de carbono ; X es un enlazante; p es 0 ó 1; y q es 2 hasta 10. 26. El hidrocarburo alifático según la reivindicación 25, caracterizado porque cada Nu es amino, tiol, o hidróxilo.
  27. 27. El hidrocarburo alifático según la reivindicación 25, caracterizado porque hidróxilo protegido.
  28. 28. El hidrocarburo alif tico reivindicación 25, que tiene la estructura caracterizado porque Gp es un grupo protector.
  29. 29. un método para preparar un polímero de poli (alquilenglicol) ramificado, caracterizado porque comprende: proporcionar un hidrocarburo alifático sustituido con al menos dos grupos nucleofílieos y al menos un grupo funcional protegido; polimerizar las unidades monoméricas de óxido de alquileno sobre el hidrocarburo alifático en el sitio de los grupos nucleofílieos para formar al menos dos polímeros de poli (alquilenglicol ) unidos al hidrocarburo alifático vía enlaces heteroatómicos ; rematar los extremos de los polímeros de poli (alquilenglicol) con un grupo alquilo para formar polímeros alcoxi terminados; y desproteger el grupo funcional protegido para formar un grupo idróxilo.
  30. 30. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque el hidrocarburo alifático tiene la estructura: HO-CH, I 1 CH-(X)F"0-Gp HO-CH2 caracterizado porque: X es un enlazante; p es 0 ó 1 ; y Gp es un grupo protector.
  31. 31. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque las unidades monoméricas de óxido de alquileno son unidades de óxido de etileno.
  32. 32. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque el grupo funcional protegido es un grupo hidróxilo protegido y el paso de desprotección comprende la hidrólisis o hidrogenolisis del grupo hidróxilo protegido.
  33. 33. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque el paso de remate en los extremos comprende rematar los extremos de los polímeros con metoxi .
  34. 34. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque el hidrocarburo alifático se selecciona del grupo que consiste de 2 -benciloxi-1 , 3 -propandiol , 2 -benciloxietoxi - 1 , 3 -propandiol y 2-benciloxietoxietil -1,3 -propandiol .
  35. 35. El método según la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende modificar el grupo funcional desprotegido para formar un segundo grupo funcional .
  36. 36. El método según la reivindicación 35, caracterizado porque el segundo grupo funcional se selecciona del grupo que consiste de éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, aldehido hidratado, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácido alcanoico, haluro ácido, isocianato, isotiocianato , maleimida, vinilsulfona , ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epoxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato.
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