JP2005508421A - 分枝ポリマーおよびそれらの結合体 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、分枝した反応性水溶性ポリマー(これらは、生物活性分子と抱合するのに有用である)およびこのようなポリマーを製造し利用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
親水性ポリマーであるポリ(エチレングリコール)(PEGと略す)の共有結合は、多くの生物活性分子(特に、疎水性分子)の水溶性およびバイオアベイラビリティを高めて循環時間を延長する非常に有利な方法である。例えば、水不溶性薬剤であるパクリタキセルは、PEGにカップリングしたとき、水溶性になることが示されている。Greenwaldら、J.Org.Chem.,60:331−336(1995)。この生物活性分子に結合したポリマーの全分子量は、その親分子の生物活性に悪影響を与えることなく、PEGポリマーの結合に典型的に関連した有利な特徴(例えば、高い水溶性および循環半減期)を与えるのに十分に高くなければならない。
【0003】
タンパク質および他の分子はしばしば、ポリマーの結合に利用できる反応部位が限られている。しばしば、ポリマーの結合によって改変するのに最も適当な部位は、レセプタ結合で重要な役割を果たし、その分子の生物活性を保持するのに必要である。結果として、生物活性分子上のこのような反応部位にポリマー鎖を無差別に結合すると、しばしば、そのポリマー改変分子の生物活性が著しく低下したり、全て喪失したりさえする。標的分子に所望の利点を与えるのに十分なポリマー分子量を有する結合体を形成するには、従来技術のアプローチは、典型的には、以下のいずれかが関与している:(i)その分子に多数のポリマーアームをランダムに結合するので、それにより、その親分子の生物活性が低下するか全て喪失しさえするリスクが高くなる;または(ii)1個または2個の非常に長いポリマー鎖の結合。残念なことに、非常に高分子量の直鎖ポリマー鎖を使用することは、それらの調製、精製に関連した難点および費用、ならびにそれに付随した不安定性があるために、問題がある。
【0004】
中心コアに結合した複数ポリマーアームを含み生物活性分子に抱合する単一の反応性基を有する分枝ポリマーは、米国特許第5,643,575号および同第5,932,462号で記述されている。両方の特許は、水溶性ポリマー(例えば、アミノ基を有する中心コア(例えば、リジンまたは1,3−ジアミノ−2−プロパノール)に対する末端キャッピングPEG)を共有結合することにより形成された分枝ポリマーを記述している。これらの分枝ポリマーは、極端に長いポリマー鎖を使用することなく、単一の結合部位で、分子に高分子量ポリマーを結合するのに有用であるものの、従来技術の分枝PEG分子を形成する方法は、困難であり、コア分子に結合する前にPEGポリマーを十分に精製する必要があるだけでなく、部分的にペグ化した中間体ポリマーの精製/除去も必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
当該技術分野において、分枝ポリマーに関連した利点(すなわち、単一の非直鎖ポリマー分子内での高い全分子量)を生じるが、合成が簡単であるか、従来の試薬よりも設計に融通性がある新しい分枝ポリマー試薬に対する必要性が依然として残っている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
(発明の要旨)
本発明は、水溶性ポリマーを共役する利点を与えつつ、分子の生物活性の著しい低下を避ける傾向がある様式で、生物活性分子を抱合するのに有用な分枝した反応性水溶性ポリマーを開発することに基づいている。本発明の分枝ポリマーは、分枝水溶性ポリマーを構築するために、活性化直鎖ポリマー(例えば、スクシンイミジルカーボネート末端キャッピングポリ(エチレングリコール)など)にカップリングするのに適当な活性化基の存在を必要としない多数の脂肪族コア構造から、容易に合成できる。すなわち、本発明のポリマーの調製は、その分子のポリマー部分が一般に適当なモノマー単位の重合によりコア上に直接構築されるので、ポリマーアームとカップリングする必要がある反応性官能基を有するコア構造を使用する必要性によって妨害されない。
【0007】
1局面では、本発明は、分枝した反応性水溶性ポリマーを提供し、該ポリマーは、少なくとも2個のポリマーアーム(例えば、ポリ(エチレングリコール))を含有し、該ポリマーアームは、ヘテロ原子結合(例えば、エーテル結合)を介して中心コア分子に結合される。この中心コア分子は、少なくとも3個の炭素原子の長さを有する脂肪族炭化水素である。本発明の分枝ポリマーは、好ましくは(必須ではないものの)、単官能性(すなわち、生物活性剤に共有結合するのに適当な1個の反応性官能基を有する)であり、その単一の官能基は、好ましくは、必要に応じて、介在結合を介して、その脂肪族炭化水素コア分子に結合される。
【0008】
本発明の分枝ポリマー構造を調製する際に使用するのに適当なポリマーには、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン性アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカライド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N−アクリロイルモルホリン)、ポリ(アクリル酸)、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにこれらのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が挙げられる。本発明の1実施態様において、このポリマーはポリ(エチレングリコール)である。
【0009】
他の局面では、本発明は、生物活性結合体を提供し、該生物活性分子は、上記分枝ポリマーに共有結合した生物活性分子(例えば、タンパク質)を含有する。該生物活性分子は、好ましくは、該分枝ポリマー上の反応性官能基と該生物活性分子上の適当な官能基との反応により形成される結合を介して、該分枝ポリマーに結合される。
【0010】
さらに他の局面では、本発明は、ポリ(アルキレングリコール)ポリマーアームを含有する分枝反応性ポリマーを調製する方法を提供する。該方法は、アルキレンオキシドモノマー単位(例えば、エチレンオキシド)を脂肪族炭化水素コア構造(これは、少なくとも2個の求核基(例えば、チオール基、アミノ基またはヒドロキシル基)を有する)に重合する工程を包含する。好ましくは、これらの求核基は、例えば、それらのポリマーアームの各々での同程度の重合速度を助けるために、その1−および3−位置にてヒドロキシル基で置換されたプロパン(1,3−プロパンジオール)のように、同一である。典型的には、保護形状(例えば、保護ヒドロキシル基)でさらに改変するのに適当な少なくとも1個の反応性基もまた、必要に応じて、介在結合を介して、この脂肪族炭化水素コアに結合される。これらのアルキレンオキシドモノマー単位のコア分子への重合、および必要に応じたポリ(アルキレンオキシド)ポリマーアームの末端キャッピングに続いて、保護したヒドロキシル基または他の官能基の保護基は、除去されて、さらに改変するのに適当な反応性基を提供し、例えば、生物活性分子に直接共有結合して分枝ポリマー結合体を形成するのに適当な分枝ポリマーを形成する。
【0011】
(発明の詳細な説明)
さて、本発明は、以下でさらに詳細に記述する。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書中で述べた実施態様に限定されるとは解釈すべきではない;むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的で完全であり本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように、提供されている。
I.定義
本明細書中で使用する以下の用語は、指示した意味を有する。
【0012】
本明細書および添付の請求の範囲で使用する単数形「a」、「an」、「the」は、特に明記しない限り、複数の指示物を含む。
【0013】
「官能基」、「活性部分」、「反応部位」、「化学反応基」および「化学反応部分」との用語は、当該技術分野で使用され、本明細書中では、ある分子の別個の限定できる部分または単位を意味する。これらの用語は、化学分野において、ある程度、同義であり、本明細書中では、ある機能または活性を果たし他の分子と反応性である分子部分を意味するように使用される。「活性」との用語は、官能基と併用する場合、反応するのに強力な触媒または非常に非実用的な反応条件を必要とする基(すなわち、「非反応性」基または「不活性」基)とは対照的に、他の分子上の求電子基または求核基と容易に反応する官能基を含むと解釈される。例えば、当該技術分野で理解できるように、「活性エステル」との用語なら、求核基(例えば、アミン)と容易に反応するエステルを含む。代表的な活性エステルには、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたは1−ベンゾトリアゾリルエステルが挙げられる。典型的には、活性エステルは、水性媒体中にて、数分足らずで、アミンと反応するのに対して、ある種のエステル(例えば、メチルエステルまたはエチルエステル)は、求核基と反応するのに、強力な触媒が必要である。本明細書中で使用する「官能基」との用語は、保護官能基を含む。
【0014】
「保護官能基」、「保護基(protecting group)」または「保護基(protective group)」との用語は、ある反応条件下にて分子内の特定の化学的に反応性の官能基の反応を防止または阻止する部分(すなわち、保護基)の存在を意味する。この保護基は、保護する化学反応基の型だけでなく使用する反応条件および分子内の追加反応基または保護基(もしあれば)の存在に依存して、変わる。当該技術分野で公知の保護基は、Greene,T.W.ら、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,3版、John Wiley & Sons,New York,NY(1999)で見出すことができる。
【0015】
「結合」または「リンカー」(L)との用語は、本明細書中にて、好ましくは、生物活性剤上に存在している1個またはそれ以上の共有結合、相互接続部分(例えば、2個のポリマーセグメントまたはポリマー末端)および反応性官能基により、連結するのに使用される原子または原子の集合体を意味するために使用される。本発明のリンカーは、加水分解安定性の結合であり得るか、または生理学的に加水分解可能または酵素分解可能な結合を含み得る。
【0016】
「生理学的に加水分解可能」または「加水分解的に分解可能」な結合とは、生理学的条件下にて水と反応する(すなわち、加水分解される)弱い結合である。pH8、25℃で、約30分間未満の加水分解半減期を有する結合が好ましい。ある結合が水中で加水分解する傾向は、2個の中心原子を接続する結合の一般的な形式だけでなく、これらの中心原子に結合する置換基に依存している。適当な加水分解不安定または分解性の結合には、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0017】
「加水分解安定性」結合(linkage)または結合(bond)とは、水中で実質的に安定な(すなわち、生理学的条件下にて、長時間にわたって、任意の適当な範囲まで、加水分解を受けない)化学結合(典型的には、共有結合)を意味する。加水分解安定性結合の例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:炭素−炭素結合(例えば、脂肪族鎖にあるもの)、エーテル、アミド、ウレタンなど。一般に、加水分解安定性結合は、生理学的条件下にて、1日あたり、約1〜2%の加水分解速度を示すものである。代表的な化学結合の加水分解速度は、殆どの標準的な化学教本で見出だすことができる。
【0018】
「酵素的に不安定性」または分解性の結合とは、1種またはそれ以上の酵素により分解できる結合である。
【0019】
「ポリマー骨格」との用語は、そのポリマーを形成する繰り返しモノマー単位の共有結合鎖を意味する。ポリマーおよびポリマー骨格との用語は、本明細書中にて、交換可能に使用される。例えば、PEGの重合骨格は、−CH2CH2O−(CH2CH2O)n−CH2CH2であり、ここで、nは、典型的には、約2〜約4000の範囲である。理解できるように、このポリマー骨格は、そのポリマー骨格に沿って間隔を開けて配置された末端官能基またはペンダント官能化側鎖に共有結合され得る。
【0020】
「反応性ポリマー」との用語は、少なくとも1個の反応性官能基を有するポリマーを意味する。
【0021】
特に明記しない限り、分子量は、本明細書中では、数平均分子量(Mn)として表わされ、これは、以下で定義される:
【0022】
【化8】
ここで、Niは、分子量Miを有するポリマー分子の数(またはこれらの分子のモル数)である。
【0023】
「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」および「アルキレン」との用語は、鎖長が典型的には約1個〜約12個の炭素原子(好ましくは、1個〜約6個の炭素原子)の範囲である炭化水素鎖を意味し、これには、直鎖および分枝鎖が含まれる。特に明記しない限り、本明細書中で言及する任意のアルキルまたはアルキレンの好ましい実施態様は、C1〜C6アルキル(例えば、メチルまたはエチル)である。
【0024】
「シクロアルキル」とは、飽和または不飽和の環状炭化水素鎖を意味し、これには、架橋、縮合またはスピロ環式化合物が含まれ、これらは、好ましくは、3個〜約12個の炭素原子、さらに好ましくは、3個〜約8個の炭素原子を含有する。
【0025】
「アリール」とは、1個またはそれ以上の芳香環を意味し、これらは、それぞれ、5個または6個の核炭素原子を有する。複数のアリール環は、ナフチルのように縮合され得るか、またはビフェニルのように非縮合であり得る。アリール環はまた、1個またはそれ以上の環状炭化水素、ヘテロアリール環または複素環で縮合され得るか、非縮合であり得る。
【0026】
「ヘテロアリール」とは、1個〜4個のヘテロ原子(好ましくは、N、OまたはSまたはそれらの組合せ)を含有するアリール基であり、そのヘテロアリール基は、必要に応じて、炭素原子または窒素原子において、C1〜6アルキル、−CF3、フェニル、ベンジルまたはチエニルで置換されるか、そのヘテロアリール基にある炭素原子は、酸素原子と一緒になって、カルボニル基を形成するか、そのヘテロアリール基は、必要に応じて、フェニル環で縮合される。ヘテロアリール環はまた、1個またはそれ以上の環状炭化水素、複素環、アリールまたはヘテロアリール環と縮合され得る。ヘテロアリールには、1個のヘテロ原子を有する5員ヘテロアリール(例えば、チオフェン、ピロール、フラン);1,2−位置または1,3−位置に2個のヘテロ原子を有する5員ヘテロアリール(例えば、オキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、チアアゾール、プリン);3個のヘテロ原子を有する5員ヘテロアリール(例えば、トリアゾール、チアジアゾール);3個のヘテロ原子を有する5員ヘテロアリール;1個のヘテロ原子を有する6員ヘテロアリール(例えば、ピリジン、キノリン、イソキノリン、フェナントリン、5,6−シクロヘプテノピリジン);2個のヘテロ原子を有する6員ヘテロアリール(例えば、ピリダジン、シンノリン、フタラジン、ピラジン、ピリミジン、キナゾリン);3個のヘテロ原子を有する6員ヘテロアリール(例えば、1,3,5−トリアジン);および4個のヘテロ原子を有する6員ヘテロアリールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0027】
「複素環」または「複素環式」とは、5〜12個の原子(好ましくは、5〜7個の原子)を有する1個またはそれ以上の環であって、これは、不飽和特性または芳香族特性を備えているか備えておらず、その少なくとも1個の環原子は、炭素ではない。好ましいヘテロ原子には、イオウ、酸素および窒素が挙げられる。複数の環は、キノリンまたはベンゾフランのように縮合され得る。
【0028】
「ヘテロ原子」とは、炭化水素類似化合物中の任意の非炭素原子を意味する。例には、酸素、イオウ、窒素、リン、砒素、ケイ素、セレン、テルル、スズおよびホウ素が挙げられる
「薬物」、「生物活性分子」、「生物活性部分」または「生物活性剤」との用語は、本明細書中で使用するとき、生物有機体のいずれかの物理的特性または生化学的特性に影響を与えることができる任意の物質を意味し、これらには、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特に、本明細書中で使用する生物活性分子には、ヒトまたは他の動物における病気の診断、治療改善、治療または予防を目的としている任意の物質であるか、そうでなければ、ヒトまたは動物の物理的または精神的健康を高める任意の物質を含む。生物活性分子の例には、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するのに適当な生物活性剤には、抗生物質、殺真菌剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管剤、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
「ポリオレフィン性アルコール」とは、ポリオレフィン骨格を含むポリマー(例えば、ポリエチレン)であって、そのポリマー骨格には、複数のペンダントヒドロキシル基が結合しているものを意味する。例示的なポリオレフィン性アルコールは、ポリビニルアルコールである。
【0030】
本明細書中で使用する「非ペプチド性」との用語は、ペプチド結合を実質的に含まないポリマー骨格を意味する。しかしながら、このポリマー骨格は、その骨格の長さに沿って間隔を開けて配置された少数のペプチド結合(例えば、約50個のモノマー単位あたり、約1個以下のペプチド結合)を含み得る。
【0031】
「残基」とは、1個またはそれ以上の分子と反応した後に残留している分子の一部を意味する。例えば、本発明の分枝ポリマー結合体中の生物活性分子残基は、本発明の分枝ポリマーとの共有結合に続いて残留している生物活性分子の一部である。
【0032】
「オリゴマー」とは、2個〜約10個のモノマー単位、好ましくは、2個〜約5個のモノマー単位を含む短いモノマー鎖を意味する。
【0033】
「結合体」との用語は、分子(例えば、生物活性分子)が反応性ポリマー分子(好ましくは、本発明の分枝反応性ポリマー)と共有結合した結果として形成された要素を意味すると解釈される。
【0034】
本発明のポリマーに関連した「単官能性」とは、単一の反応性官能基を有するポリマーを意味する。
【0035】
本発明のポリマーに関連した「二官能性」とは、同一または異なり得る2個の反応性官能基を有するポリマーを意味する。
【0036】
本発明のポリマーに関連した「多官能性」とは、そこに3個またはそれ以上の官能基を有するポリマーを意味し、この場合、それらの官能基は、同一または異なり得る。本発明の多官能性ポリマーは、典型的には、約3〜100個の官能基、または3〜50個の官能基、または3〜25個の官能基、または3〜15個の官能基、または3〜10個の官能基を含むか、またはそのポリマー骨格に結合した3、4、5、6、7、8、9または10個の官能基を含有する。
【0037】
(II.分枝反応性ポリマー)
1局面では、本発明は、分枝反応性ポリマーを提供し、これは、ヘテロ原子結合(例えば、エーテル結合)を介して中心コアに結合した少なくとも2個のポリマーアーム(例えば、PEGアーム)を含む。この中心コア分子は、少なくとも3個の炭素原子の長さを有する脂肪族炭化水素(すなわち、プロパン、ブタン、ペンタンなど)である。本発明の分枝ポリマーは、単一分子内にて、少なくとも2個のポリマーアームと結合するので、生物活性分子に有益な特性(例えば、高い水溶性)を与えるのに十分な分子量を備えたポリマーは、簡単に調製できる短いポリマー鎖を使用して、形成できる。本発明の分枝ポリマーは、好ましくは、単官能性であり、このことは、そのポリマー分子が生物活性分子と共役する反応部位を1個だけ含有することを意味する。単官能性ポリマーを使用すると、生物活性分子(例えば、タンパク質)と架橋する(それにより、活性が失われ得る)可能性がなくなる。
【0038】
ポリ(アルキレングリコール)ポリマーアーム(例えば、PEGアーム)を含有する本発明の分枝ポリマーについて、以下でさらに詳細に記述するように、これらの分枝ポリマーは、有利なことに、アルキレンオキシドモノマー単位(例えば、エチレンオキシド単位)を、2個またはそれ以上の求核基(例えば、チオール基、アミノ基またはヒドロキシル基)で置換した脂肪族炭化水素コア分子に直接重合することにより、合成される。このようにして、従来の方法に付随した高価で時間のかかるポリマー精製工程は、回避される。
【0039】
典型的には、本発明の分枝反応性ポリマーの全数平均分子量は、約500〜約100,000ダルトン(Da)、好ましくは、約5,000〜約60,000Da、最も好ましくは、約8,000〜約40,000Daである。この分枝ポリマーの各ポリマーアームは、典型的には、約250Da〜約50,000Da、さらに好ましくは、約2,500〜約30,000Da、最も好ましくは、約4,000〜約20,000Daの分子量を有する。約500Da、約1,000Da、約2,000Da、約4,000Da、約5,000Da、約8,000Da、約10,000Da、約12,000Da、約15,000Da、約20,000,約25,000Daおよび約30,000Daの全数平均分子量を有する分枝ポリマーは、特に好ましい。
【0040】
本発明の分枝反応性ポリマーは、典型的には、少なくとも2個の水溶性で非ペプチド性のポリマーアーム(例えば、ポリ(エチレングリコール)アーム)を含有し、これは、単一官能基を有する脂肪族炭化水素コア構造に共有結合されている。本発明の分枝反応性ポリマーの一般化構造は、以下で示す:
【0041】
【化9】
ここで:
Rは、少なくとも3個の炭素原子の長さを有する脂肪族炭化水素である;
各POLYは、水溶性で非ペプチド性のポリマー(例えば、PEG)である;
X’は、ヘテロ原子結合(好ましくは、−NH−、−O−または−S−)である;
Xは、リンカーである;
pは、0または1である;
qは、2〜約10、好ましくは、2〜約5(例えば、2、3、4または5)である;そして
Yは、官能基である。
【0042】
脂肪族炭化水素コアRは、好ましくは、3個〜約12個の炭素原子、さらに好ましくは、3個〜約7個の炭素原子、最も好ましくは、3個〜約5個の炭素原子を含有する。長さが3個、4個および5個の炭素原子のコア構造は、特に好ましい。この脂肪族炭化水素は、直鎖または分枝であり得、その炭化水素鎖に、1個またはそれ以上のヘテロ原子を含有し得る。好ましい実施態様では、ポリマーアームPOLYおよび官能基Yは、それぞれ、そのコア分子の異なる炭素原子に結合している。例えば、3炭素コア実施態様では、POLYポリマーアームは、好ましくは、その1位および3位で結合され、そしてY官能基は、好ましくは、その2位で結合される。
【0043】
本発明の分枝ポリマーは、好ましくは、対称的であり、このことは、それらのポリマーアームが中心コアR(例えば、3炭素脂肪族コアの1位および3位)上で対称的に位置していることを意味する。対称的な配置により、その重合プロセスの開始が対称的コアから伸長している同じアーム位置でほぼ同じ速度で起こるはずであるので、ほぼ同じ数のサブユニットのポリマーアームを有する1つのポリマー生成物のみが優先的に形成される。
【0044】
A.ポリマーアーム
一般に、この分枝ポリマー構造の水溶性非ペプチドポリマー部分(すなわち、上記式IのPOLY)は、非毒性で生体適合性であるべきであり、このことは、そのポリマーが害を引き起こすことなく生体組織または生物と共存できることを意味する。分枝反応性ポリマーと呼ぶとき、そのポリマーは、多数の水溶性非ペプチドポリマー(例えば、本発明で使用するのに適当であるとして本明細書中で記述したもの)のいずれかであり得ることが理解されるべきである。好ましくは、上記式Iで示すPOLYは、ポリ(エチレングリコール)(PEG)である。PEGとの用語は、多数の外形または形状のいずれかのポリ(エチレングリコール)を含み、これには、直鎖形状(例えば、アルコキシPEGまたは二官能性PEG)、分枝またはマルチアーム形状(例えば、フォーク形PEGまたはポリオールコアに結合したPEG)、ペンダントPEG、その中に分解性結合を備えたPEGが挙げられ、これらは、以下でさらに詳細に記述する。本発明の分枝ポリマーを形成するには、直鎖ポリマー(例えば、直鎖形状のPEG)が好ましい。
【0045】
その最も簡単な形態では、PEGは、次式を有する:
【0046】
【化10】
ここで、nは、約5〜約1,200、典型的には、約50〜約700である。
【0047】
末端キャッピング(capped)ポリマーは、少なくとも1個の末端を比較的に不活性の基(例えば、アルコキシ基)でキャッピング化したポリマーを意味し、本発明のポリマーとして、使用できる。例えば、メトキシ−PEG−OHまたはmPEGは、要約すると、そのポリマーの1末端がメトキシ基であるのに対して他の末端はヒドロキシル基(これは、即座の化学改変を受ける)の形状のPEGである。mPEGの構造は、以下で示す。
【0048】
【化11】
ここで、nは上記の通りである。
【0049】
このPEGポリマーとしては、マルチアームまたは分枝PEG分子(例えば、米国特許第5,932,462号(その全体が、本明細書中で参考として援用されている)で記述されたもの)もまた、それ程好ましくはないものの、本発明の分枝反応性ポリマーとして、使用できる。例えば、代表的な分枝PEGポリマーは、以下の構造を有することができる:
【0050】
【化12】
ここで、
polyaおよびpolybは、PEG骨格(例えば、メトキシポリ(エチレングリコール))である;
R”は、非反応性部分(例えば、H、メチルまたはPEG骨格)である;そして
PおよびQは、非反応性結合である。好ましい実施態様では、この分枝PEGポリマーは、メトキシポリ(エチレングリコール)二置換リジンを含有する。当業者に理解できるように、本発明の分枝反応性ポリマーにおいてPOLYポリマーアームとして分枝ポリマーを使用すると、その分子内に複数の分枝点を有するポリマーが得られる。このようなポリマーは、もし、本発明の分枝構造を調製するのに使用されるなら、重合ではなく共有結合により、本明細書中で提供した脂肪族コア構造に結合される。
【0051】
このPEGポリマーは、その多官能性のためにそれ程好ましくないものの、フォーク形PEGを代替的に含有し得る。一般的に言えば、フォーク形構造を有するポリマーは、そのポリマー内の加水分解安定性分枝点から伸長している共有結合を介して2個またはそれ以上の活性剤に結合したポリマー鎖を有することにより、特徴付けられる。フォーク形PEGの一例は、PEG−YCHZ2で表わされ、ここで、Yは、連結基であり、そして各Zは、生物活性剤に共有結合するための活性化末端基である。このZ基は、規定長の原子鎖により、CHに連結される。国際出願番号PCT/US99/05333(その内容は、本明細書中で参考として援用されている)は、本発明で使用できる種々のフォーク形PEG構造を開示している。そのZ官能基を分枝炭素原子に連結する原子鎖は、テザー基として働き、例えば、アルキル鎖、エーテル結合、エステル結合、アミド結合またはそれらの組合せを含有し得る。本発明のこの実施態様では、得られた分枝ポリマーは、多可能性であり、すなわち、生物活性分子(これは、この脂肪族コアから伸長しているだけでなく、このフォーク形ポリマーアームからも伸長している)に結合するのに適当な反応性部位を有する。上記の場合と同様に、このようなフォーク形ポリマーは、もし、本発明の分枝構造を調製するのに使用されるなら、重合ではなく代表的に共有結合により、本明細書中で提供した脂肪族コア構造に結合される。
【0052】
このPEGポリマーは、再度、その多官能性のためにそれ程好ましくないものの、反応基(例えば、カルボキシル)を有するペンダントPEG分子を含有し得、これは、そのPEG鎖の末端ではなくむしろPEG骨格の長さに沿って共有結合されている。これらのペンダント反応基は、直接または結合部分(例えば、アルキレン基)を介して、このPEG骨格に結合できる。
【0053】
上記形状のPEGに加えて、このポリマーアーム(POLY)はまた、そのポリマー骨格内の1個またはそれ以上の弱いまたは分解性結合で調製でき、これには、上記ポリマーのいずれかが挙げられる。例えば、PEGは、加水分解を受けるポリマー骨格内のエステル結合で調製できる。以下で示すように、この加水分解により、このポリマーは、低分子量の断片に開裂する:
【0054】
【化13】
他の加水分解的に分解性の結合(これらは、ポリマー骨格内の分解性結合として有用である)には、カーボネート結合;イミン結合(これらは、例えば、アミンおよびアルデヒドの反応から生じる(例えば、Ouchiら、Polymer Preprints,38(1):582−3(1997)(その内容は、本明細書中で参考として援用されている)を参照));リン酸エステル結合(これは、例えば、アルコールとホスフェート基とを反応させることにより、形成される);ヒドラゾン結合(これらは、典型的には、ヒドラジドとアルデヒドとを反応させることにより、形成される);アセタール結合(これには、典型的には、アルデヒドとアルコールとの間の反応により、形成される);オルトエステル結合(これらは、例えば、ホルメートとアルコールとの間の反応により、形成される);ペプチド結合(これらは、アミン基(これは、例えば、ポリマー(例えば、PEG)の末端にある)とペプチドのカルボキシル基とにより、形成される);およびオリゴヌクレオチド結合(これは、例えば、ホスホラミダイト基(これは、例えば、ポリマーの末端にある)とオリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシル基とにより、形成される)が挙げられる。
【0055】
ある場合には、ポリマーアーム中に1個またはそれ以上の加水分解可能結合を含有するポリマーアームは、2段階重合プロセスで調製され、これは、所望の加水分解可能結合を取り込む中間工程を包含する。すなわち、例えば、この中心コアへのエチレンオキシドサブユニットの重合は、特定の望ましい鎖長まで実行され、その中心コアから伸長している反応性ポリマー末端は、次いで、一端で、適当に官能化された短いポリマー鎖にカップリングされて、そのコアから伸長している中間体ポリマーアームのヒドロキシル基に反応して、この加水分解可能結合を導入する。このポリマーアーム(これは、ここで、1個またはそれ以上の加水分解可能結合を含有する)へのエチレンオキシドサブユニットのさらなる重合は、次いで、所望の鎖長のポリマーアームを調製するために、実行される。
【0056】
ポリ(エチレングリコール)またはPEGとの用語は、PEGの上式の全てを表わすか含むことは、当業者に理解できるはずである。
【0057】
本発明に従って分枝ポリマーを形成するのに、水溶性非ペプチドポリマーである種々の単官能性、二官能性または多官能性ポリマーのいずれもまた、使用できる。そのポリマー骨格は、直鎖であり得るか、または上記形状(例えば、分枝、フォーク形など)のいずれかであり得る。適当なポリマーの例には、他のポリ(アルキレングリコール)、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリ(オレフィン性アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカライド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N−アクリロイルモルホリン)(例えば、米国特許第5,629,384号(その全体は、本明細書中で参考として援用されている)で記述されたもの)、およびそれらのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0058】
典型的には、本発明の分枝ポリマーの2個またはそれ以上のポリマーアームは、同じである。すなわち、最も好ましくは、これらのポリマーアームは、それぞれ、ポリ(エチレングリコール)であるか、それぞれ、ポリオレフィン性アルコールなどである。一般に、これらのポリマーアームは、同じ種類のサブユニットから構成されているだけでなく、同一の外形および類似の分子量を有する。すなわち、本発明の最も好ましい実施態様では、この脂肪族コアから伸長しているポリマーアームは、同一である。
【0059】
(B.リンカー(X))
本発明の分枝ポリマーは、必要に応じて、結合(すなわち、式IのX)を含有し、これは、この脂肪族炭化水素中心コア分子の分枝炭素を官能基Yと接合する。X結合の構造は、典型的には、本発明のポリマーを形成するのに使用される脂肪族炭化水素コアの構造により決定され、そして全長で、1個〜約40個の原子、好ましくは、1個〜約10個の原子、最も好ましくは、1個〜約5個の原子を有する。好ましい結合には、ヘテロ原子(例えば、−O−または−S−)、−アルキレン−、−O−アルキレン−O−、−アルキレン−O−アルキレン−、−アリール−O−(例えば、−フェニレン−O−)、−O−アリール−(例えば、−O−フェニレン)、(−O−アルキレン−)mおよび(−アルキレン−O−)mが挙げられ、ここで、mは、1〜10、好ましくは、1〜5(例えば、1、2、3、4または5)である。X結合のアルキレン基は、好ましくは、C1〜C6アルキレン、さらに好ましくは、C1〜C3アルキレン(メチレンおよびエチレンを含めて)である。
【0060】
ある場合には、この中心脂肪族コアから離れて生物活性剤の共有結合点を伸長するリンカー(すなわち、式IのX)を有することが、有利であり得る。本発明のこのような特定の実施態様では、活性剤の活性化および引き続いた結合のための末端は、次いで、第二級炭素位置ではなく、第一級炭素位置にあり、それにより、求核置換反応での第一級炭素の反応性が高いために、引き続いた改変が容易になる。
【0061】
(C.官能基(Y))
Y官能基は、生物活性分子上の官能基またはその前駆体である官能基と反応するのに適切な任意の官能基であり得る。適切な官能基の例には、ヒドロキシル、活性エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたは1−ベンゾトリアゾールエステル)、活性カーボネート(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、1−ベンゾトリアゾールカーボネート、p−ニトロフェニルカーボネート)、アセタール、1個〜25個の炭素長を有するアルデヒド(例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒドおよびブチルアルデヒド)、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、ヒドラジン、チオール、1個〜25個の炭素原子鎖長(カルボニル炭素を含む)を有するアルカン酸(例えば、カルボン酸、カルボキシメチル、プロパン酸およびブタン酸)、酸ハロゲン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートが挙げられる。
【0062】
代表的な官能基はまた、以下の参考文献で記述されており、それらの全ての内容は、本明細書中で参考として援用されている:N−スクシンイミジルカーボネート(例えば、米国特許第5,281,698号、第5,468,478号を参照)、アミン(例えば、Buckmannら、Makromol.Chem.182:1379(1981),Zaplipskyら、Eur.Polym.J.19:1177(1983)を参照)、ヒドラジン(例えば、Andreszら、Makromol.Chem.179:301(1978)を参照)、スクシンイミジルプロピオネートおよびスクシンイミジルブタノエート(例えば、Olsonら、in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications,pp 170〜181,Harris & Zaplipsky編、ACS,Washington,DC,1997を参照;また、米国特許第5,672,662号を参照)、スクシンイミジルスクシネート(例えば、Abuchowskiら、Cancer Biochem.Biophys.7:175(1984)およびJoppichら、Makromol.Chem.180:1381(1979)を参照)、スクシンイミジルエステル(例えば、米国特許第4,670,417号を参照)、ベンゾトリアゾールカーボネート(例えば、米国特許第5,650,234号を参照)、グリシジルエーテル(例えば、Pithaら、Eur.J.Biochem.94:11(1979)、Ellingら、Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991)を参照)、オキシカルボニルイミダゾール(例えば、Beauchampら、Anal.Biochem.131:25(1983)、Tondelliら、J.Controlled Release 1:251(1985)を参照)、p−ニトロフェニルカーボネート(例えば、Veroneseら、Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985);およびSartoreら、Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991)を参照)、アルデヒド(例えば、Harrisら、J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)、米国特許第5,824,784号、米国特許第5,252,714号を参照)、マレイミド(例えば、Goodsonら、Bio/Technology 8:343(1990)、Romaniら、Chemistry of Peptides and Proteins 2:29(1984)、およびKogan, Synthetic Comm.22:2417(1992)を参照)、またはオルトピリジル−ジスルフィド(例えば、Woghirenら、Bioconj.Chem.4:314(1993)を参照)、アクリロイル(例えば、Sawhneyら、Macromolecules,26:581(1993)を参照)、ビニルスルホン(例えば、米国特許第5,900,461号を参照)。
【0063】
本発明の1実施形態では、Y官能基は、保護官能基(例えば、式−O−Gpの保護ヒドロキシル基であり、ここで、Gpは、保護基である)である。このGp保護基は、当該技術分野で公知の種々のヒドロキシル保護基のいずれか(例えば、ベンジル基または他のアルキルアリール基(例えば、式−CH2−Arを有する基であって、ここで、Arは、任意のアリール基である)、アセタールおよびジヒドロピラニル)であり得る。他の適切な保護基は、Greene,T.W.ら、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,3版、John Wiley & Sons,New York,NY(1999)で記述されている。容易に理解できるように、この保護基Gpは、ヒドロキシル基を形成するようにその分子から容易に置換でき、これは、さらに、当該技術分野で公知の技術を使用して、改変されて、他の官能基を形成できる。
【0064】
(D.コア構造)
本発明の分枝ポリマーは、脂肪族炭化水素ベースのコア(すなわち、上記式IのR)から構成され、これは、少なくとも3個の炭素原子、好ましくは、3個〜7個の炭素原子の長さを有する。すなわち、中心コア構造は、代表的には、そのコアにて、以下から選択される多数の炭素原子を含有する:3個、4個、5個、6個、7個またはそれ以上の炭素原子。3個、5個または7個のコア炭素を含有するコア構造が好ましい。この中心コアの炭素原子は、前記炭素のいずれかから伸長しているポリマーアームを有し得るものの、好ましくは(必須ではないが)、その分枝ポリマー全体は、対称的である。すなわち、3炭素コアについて、そのポリマーアームは、好ましくは、1位置および3位置から伸長しており、生物活性分子に共有結合するのに適切な部位は、この中心炭素または2位置の炭素から伸長している。同様に、5炭素コアについては、そのポリマーアームは、1位置および5位置から伸長しており、生物活性分子に共有結合するのに適切な部位は、3位置から伸長しているか、またはポリマーアームは、2位置および4位置から伸長しているか、またはもし非常に分枝した構造が望ましいなら、ポリマーアームは、1位置、2位置、4位置および5位置の各々から伸長している。求核剤として、炭素1および3に直接結合した酸素原子を有する例示的な3炭素コア構造は、実施例で提供されている。これらの実施例は、種々の(X)p基を有するコア構造を構築する合成アプローチを示している。好ましくは、この中心コアに結合した求核剤(ヘテロ原子)は、同じである(例えば、全て酸素、全て窒素など)。
【0065】
それ程好ましくはないものの、本発明の分枝ポリマーを形成するのに使用するには、非対称コア構造(例えば、2−アミノペンタンジオン酸(グルタミン酸)、2−アミノコハク酸(アスパラギン酸)などから誘導したもの)が適切である。これらのようなコア構造を使用する際には、その末端酸基は、代表的には、反応性ポリマーとカップリングするために活性化されて、分枝ポリマーコアを形成する。あるいは、これらのカルボン酸基は、還元剤で還元されて、対応するジオールを形成し、これは、次いで、例えば、N−保護ジオールを適切なモノマーサブユニットと触媒で反応することに続いてそれらを中心コアに直接重合することにより、これらのポリマー鎖を構築するのに適切な部位を有する。
【0066】
E.代表的な分枝反応性ポリマー構造
本発明の分枝ポリマーのさらに特定の構造実施形態を今ここで記述するが、これらの全ては、上記式Iの構造に包含されると解釈される。以下で示した特定の構造は、代表的な構造としてのみ提示されており、本発明の範囲を限定するとは解釈されない。
【0067】
3炭素コアを有する本発明の1実施形態は、以下の構造を有する:
【0068】
【化14】
ここで、POLY、X、pおよびYは、上記のとおりである。
【0069】
式Iaの好ましい実施形態では、本発明の分枝ポリマーは、以下の構造を有する:
【0070】
【化15】
ここで:
Zは、キャッピング基または官能基である;そして
POLY、X、pおよびYは、上記のとおりである。
【0071】
Z基は、好ましくは、比較的に不活性のキャッピング基、例えば、アルコキシ(例えば、メトキシまたはエトキシ)、アルキル、ベンジル、アリールまたはアリールオキシ(例えば、ベンジルオキシ)である。あるいは、Z基は、生物活性分子上の官能基と容易に反応できる官能基(例えば、Y官能基について上で述べた官能基のいずれか)である。
【0072】
式Iaの他の実施形態では、各POLYは、以下で示すように、メトキシで末端キャッピングPEGである:
【0073】
【化16】
式Iaのさらに他の実施形態では、X結合は、以下で示すように、存在しない:
【0074】
【化17】
ここで:
Z、POLYおよびYは、上で定義したとおりである。好ましくは、Zは、メトキシであり、そしてPOLYは、PEGである。
【0075】
式Iaのさらに他の実施形態では、X結合は、以下で示した特定の結合の1つである:
【0076】
【化18】
ここで:
Xは、−CH2CH2−O−CH2CH2−または−O−CH2CH2−である;そして
Z、POLYおよびYは、上で定義したとおりである。好ましくは、Zは、メトキシであり、そしてPOLYは、PEGである。
【0077】
上記のように、上記Ia、Ia1、Ia2、Ia3およびIa4で図示した−O−結合に代えて、他のヘテロ原子(例えば、−NH−または−S−)が使用できる。
【0078】
F.分枝反応性ポリマーを形成する方法
本発明の分枝ポリマーは、ヘテロ原子結合(例えば、−NH−、−O−または−S−)を介して、少なくとも3個の炭素原子を有するヘテロ原子置換脂肪族炭化水素コア分子(例えば、プロパン)にポリマーアームを結合することにより、形成される。これらのポリマーアームは、ポリ(アルキレングリコール)ポリマーについて、本発明から逸脱することなく、予め形成し精製したポリマー上の末端官能基を、脂肪族炭化水素コア上の反応性求核剤と単に反応させることにより、この脂肪族炭化水素構造に結合され得るものの、多くの点で、アルキレンオキシドモノマー単位(例えば、エチレンオキシド、プロピレンオキシドまたはブチレンオキシドサブユニット)を、少なくとも2個の利用可能なヒドロキシル基(または他の求核基(例えば、アミノ基またはチオール基))を有する脂肪族炭化水素コアに直接重合することが好ましい。実施例で説明しているように、アルキレンオキシド単位は、例えば、エーテル結合ポリマーアームを形成する触媒反応を使用して、好ましくは、塩基性触媒を使用して、アルコール分子に重合できるが、他の触媒(例えば、金属触媒または酸触媒)もまた、使用できる。このアルキレンオキシドを適切に官能化した脂肪族炭化水素コア構造に直接重合することにより、この分枝ポリマーは、まず高分子量ポリマーを形成して精製する(これは、技術的に困難で、高価であり、そして時間がかかる)ことなく、形成できる。
【0079】
この脂肪族炭化水素コア分子は、そのコア分子に結合するポリマーアームの数に依存して、2個以上の利用可能な求核基(例えば、ヒドロキシル基)を含有する。特定の1実施形態では、この脂肪族炭化水素は、2個のヒドロキシル基を有する。このコア分子はまた、少なくとも1個の保護官能基(例えば、保護ヒドロキシル基(すなわち、−O−Gpであり、ここで、Gpは、上で記述されている))を有する。好ましくは、この脂肪族炭化水素は、1,3−ジヒドロキシ−2−置換プロパンであり、ここで、この保護ヒドロキシル基は、その2位で、必要に応じて、介在結合(例えば、上記式IのX)を介して、結合される。この保護基が存在していることで、その位置での重合が阻止されて、それにより、この脂肪族炭化水素コアの少なくとも1個の側鎖が、例えば、生物活性分子に共有結合するのに適切に形状にさらに改変するのに利用可能となることを保証する。
【0080】
本発明の脂肪族炭化水素コア分子の一般化構造は、以下で示す:
【0081】
【化19】
ここで:
Y’は、保護官能基(例えば、保護ヒドロキシル基)であり、ここで、この保護基の存在により、脂肪族コアR上のY’位置での重合が阻止される;
Nuは、求核剤(例えば、アミノ、チオールまたはヒドロキシル)である;そして
R、X、pおよびqは、上で定義したとおりである。
【0082】
ポリオールまたはポリアミンコア分子を使用して高度に架橋したヒドロゲルを形成する一部の先行技術とは異なり、本発明は、求核置換脂肪族炭化水素コア分子を使用して、生物活性分子に共有結合するのに適切な分枝ポリマーを形成する。
【0083】
好ましいヒドロキシル置換3炭素脂肪族炭化水素コア構造の一般化構造は、以下で示す:
【0084】
【化20】
ここで:
X、pおよびGpは、上で定義したとおりである。
【0085】
式Vaの代表的なコア構造には、2−ベンジルオキシ−1,3−プロパンジオール、2−ベンジルオキシエトキシ−1,3−プロパンジオール、および2−ベンジルオキシエトキシエチル−1,3−プロパンジオールが挙げられる。式Vのコア構造は、市販されているか(実施例1〜2を参照)、市販の試薬から調製できるか(実施例3〜4を参照)、いずれかである。
【0086】
式Vaのヒドロキシル置換脂肪族炭化水素へのエチレンオキシドの塩基開始重合により、式Iaの分枝ポリマーが得られ、ここで、Yは、−O−Gpであり、そしてPOLYは、−PEG−OHである。その後、単官能性分枝ポリマーを形成するために、このPEGポリマー鎖の末端ヒドロキシル基は、好ましくは、アルキル化剤(例えば、トルエンスルホン酸メチル)と反応させることにより、アルキル化(例えば、PEGを形成するためのメチル化)される。
【0087】
PEG鎖の末端のアルキル化に続いて、保護基Gpは、加水分解または水素化分解により置換でき、ヒドロキシル基が生成する。理解できるように、このヒドロキシル基は、次いで、望ましい他の反応性基(例えば、式IのY部分について上で列挙した反応性基)に変性または変換できる。
【0088】
(III.分枝反応性ポリマーの生物活性結合体)
本発明はまた、本発明の分枝ポリマーに共有結合した生物活性分子を含有する生物活性結合体を包含する。上述のように、本発明の分枝ポリマーは、好ましくは(必須ではないものの)、単官能性であり(それらはまた、二官能性であり得、またはそれ程好ましくはないが、多官能性であり得る)、その生物活性剤は、好ましくは、この分枝ポリマー上の反応性官能基と生物活性分子上の適切な官能基との反応により形成される結合を介して、この分枝ポリマーに結合される。
【0089】
この特定の結合は、使用される官能基の構造に依存しており、典型的には、この生物活性分子内に含有されている官能基に支配される。例えば、アミド結合は、カップリング剤(例えば、DCC、DMAPまたはHOBT)の存在下にて、カルボン酸またはその活性エステルを有する分枝ポリマーとアミン基を有する生物活性剤との反応により、形成できる。あるいは、スルフィド結合は、チオール基を有する分枝ポリマーとヒドロキシル基を有する生物活性剤との反応により、形成できる。他の実施形態では、アミン結合は、アミン基を有する分枝ポリマーとヒドロキシル基を有する生物活性分子との反応により、形成できる。さらに他の実施形態では、カルボン酸を有する分枝ポリマーは、カップリング剤の存在下にて、ヒドロキシル基を有する生物活性分子と反応されて、エステル結合を形成する。使用される特定のカップリング化学反応は、その生物活性剤の構造、その生物活性分子内で複数の官能基が存在している可能性、保護/脱保護工程の必要性、その分子の化学的安定性などに依存しており、そして当業者により、容易に決定される。本発明の分枝ポリマー結合体を調製するのに有用な例証的な連結化学反応は、例えば、Wong,S.H.,(1991),「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」、CRC Press,Boca Raton,FLおよびBrinkley,M.(1992),「A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes,Haptens,and Crosslinking Reagents」、in Bioconjug.Chem.,3,2013で見られる。
【0090】
この結合(すなわち、以下の式VIのL1)は、この生物活性剤が患者に投与された後に時間の経過と共に血液循環に放出されるように、加水分解的に分解可能であり得る。代表的な加水分解的に分解可能な結合には、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが挙げられる。もし望ましいなら、加水分解的に安定な結合(例えば、アミド、ウレタン(これはまた、カーバメートとしても知られている)、アミン、チオエーテル(これはまた、スルフィドとしても知られている)および尿素(これはまた、カルバミドとしても知られている)結合)もまた、本発明から逸脱することなく、使用できる。
【0091】
式Iの分枝ポリマーを含有する本発明の生物活性結合体の一般構造は、以下で示すようにして、表わすことができる:
【0092】
【化21】
ここで:
Dは、生物活性分子(例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬剤、色素、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、多糖類、ステロイド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、ミセル、脂肪、電解質など)である;
L1は、この分枝ポリマーの官能基(すなわち、式IのY)と生物活性分子上の官能基との反応から得られる結合である;そして
POLY、X、X’、qおよびpは、上で定義したとおりである。
【0093】
好ましい1実施形態では、この生物活性結合体は、以下の構造を有する:
【0094】
【化22】
ここで:
D、L1、POLY、Xおよびpは、上で定義したとおりである。
【0095】
本発明の分枝ポリマーとのカップリングで使用する生物活性剤は、以下の任意の1種またはそれ以上であり得る。適当な薬剤は、例えば、催眠薬および鎮静薬、精神賦活剤、精神安定薬、呼吸器薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬(ドーパミンアンタゴニスト)、鎮痛薬、抗炎症薬、抗不安薬(不安緩解剤)、食欲抑制薬、抗片頭痛薬、筋収縮薬、抗感染薬(抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、ワクチン)抗関節炎薬、、抗マラリア薬、制吐薬、抗癲癇薬、気管支拡張薬、サイトカイン、成長因子、抗癌剤、抗血栓薬、降圧薬、心血管薬、抗不整脈薬、抗酸化薬、抗喘息薬、ホルモン剤(避妊薬を含めて)、交感神経興奮剤、利尿薬、脂質調整薬、抗アンドロゲン薬、駆虫薬、抗凝血薬、新生物薬、抗悪性腫瘍薬、血糖降下薬、栄養剤および補助剤、成長補助剤、抗腸炎薬、ワクチン、抗体、診断薬および造影剤から選択され得る。
【0096】
本発明の分枝ポリマーと共有結合する際に使用するのに適当な活性剤の例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:カルシトニン、エリスロポエチン(EPO)、V第III因子、第IX因子、セレダーゼ、セレザイム、シクロスポリン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、トロンボポエチン(TPO)、α−1タンパク質分解酵素阻害薬、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン(HGH)、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、ヘパリン、低分子量ヘパリン(LMWH)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−1受容体、インターロイキン−2、インターロイキン−1受容体アンタゴニスト、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−6、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、第IX因子インシュリン、プロインシュリン、インシュリンアナログ(例えば、米国特許第5,922,675号で記述されているモノアシル化インシュリン)、アミリン、C−ペプチド、ソマトスタチン、ソマトスタチンアナログ(オクトレオチドを含めて)、バソプレッシン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、インシュリン様成長因子(IGF)、インシュリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、神経成長因子(NGF)、組織成長因子、ケラチノサイト成長因子(KGF)、グリア成長因子(GGF)、腫瘍壊死因子(TNF)、内皮成長因子、副甲状腺ホルモン(PTH)、グルカゴン様ペプチドチモシンα1、IIb/IIIa阻害薬、α−1アンチトリプシン、ホスホジエステラーゼ(PDE)化合物、VLA−4阻害薬、ビスホスホネート、呼吸器合胞体ウイルス抗体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子(CFTR)遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ(Dnase)、殺菌/透過性増大タンパク質(BPI)、抗CMV抗体、13−シスレチノイン酸、マクロライド(例えば、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベルシン、アジスロマイシン、フルリスロマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシンおよびアジスロマイシン、およびスウィンノリドA;フルオロキノロン(例えば、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキシシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イルロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシンおよびシタフロキサシン;アミノグルコシド(例えば、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびストレプトマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ランポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメタン);ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム);ペニシリン(ペニシリンG、ペニシリンVのようなペニシリナーゼ感受性薬剤、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、ナフシリンのようなペニシリン抵抗性薬剤);グラム陰性微生物活性剤(アンピシリン、アモキシシリンおよびヘタシリン、シリン(cillin)およびガルアンピシリン(galampicillin)のような);抗シュードモナス(antipseudomal)ペニシリン(カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリンおよびピペラシリンのような);セファロスポリン(セフポドキシム、セフプロジル、セフトブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロル、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラニド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフメタゾール、セフタジジム、ロラカルベフ(loracarbef)およびモキサラクタム、モノバクタム(アズトレオナム);ならびにカルバペネム、例えば、イミペネム、メロペネム、ペンタミジンイセチオネート(isethiouate)、アルブテロールスルフェート、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ベクロメタゾンジプレピオネート、トリアムシノロンアセトアミド、ブデソニドアセトニド、フルチカゾン、臭化イプラトロピウム、フルニソリド、クロモリンナトリウム、酒石酸エルゴタミン、および適当な場合、上記のもののアナログ、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤および薬学的に受容可能な塩形態。ペプチドおよびタンパク質に関連して、本発明は、それらの合成、天然、グリコシル化、非グリコシル化、ペグ化形態、および生物活性フラグメントおよびアナログを包含すると解釈される。
【実施例】
【0097】
(IV.実施例)
以下の実施例は、本発明を例示するために示されているが、本発明を限定するものと見なすべきではない。例えば、実施例では、本発明を例示するために、PEGが使用されているものの、本発明を実施する際に有用な他のポリマーは、上述の発明に包含される。
【0098】
添付の実施例で引用された全てのPEG試薬は、Shearwater Corporation of Huntsville,ALから入手できる。全ての他の試薬は、市販されている。全ての1H NMRデータは、Bruker製の300MHzまたは400MHzのNMR分光器により、作成した。
【0099】
実施例1〜2は、市販のヒドロキシル置換脂肪族炭化水素コア分子(2−ベンジルオキシ−1,3−プロパンジオール)を使用して本発明の分枝反応性ポリマーを形成する方法を説明している。実施例1では、この分枝ポリマーは、アセトアルデヒドジエチルアセタールで官能化される。実施例2では、この分枝ポリマーは、酪酸のスクシンイミジルエステルで官能化される。実施例3〜4は、脂肪族炭化水素コア分子と保護ヒドロキシル側鎖との間に介在している結合を有する2個の追加コア分子を合成する方法を説明している。実施例5〜6は、本発明の分枝ポリマーで酵素をPEG化して結合体を形成することを説明している。
【0100】
(実施例1)
(2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2−プロパノキシ)アセトアルデヒドジエチルアセタールの合成)
(A.1,3−ジPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパン[MWポリ(エチレングリコール)(PEG)=9kD]の合成)
500ml丸底フラスコに、新たに蒸留した無水THF(これは、2−ベンジルオキシ−1,3−プロパンジオール(0.84g、4.59mmol)を含有する)を充填した。不活性雰囲気下にて連続的に攪拌しつつ、カリウムナフタレニド(0.28M、16.4ml)を加えた。次いで、このフラスコを、氷浴中にて、0℃まで冷却した。冷却した注射器を経由して、エチレンオキシド(50.0ml、1.02mol)を加えた。その反応物を室温まで温め、そして72時間攪拌した。この反応を、2M酢酸5mlを加えることにより、クエンチした。ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去し、その粗製物質を、塩化メチレン100mlに再溶解した。その生成物を、ジエチルエーテル400mlを加えることにより沈殿し、そして濾過により集めた。この生成物を減圧下にて乾燥した。収量:42g(93%)。
【0101】
【化23】
(B.1,3−ジPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパンのメチル化)
工程Aから得た1,3−ジPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパン[MWポリ(エチレングリコール)(PEG)=9kDa](5.0g、0.55mmol)を二口丸底フラスコに入れ、そしてトルエン150mlに溶解した。このフラスコにセプタムおよびディーン−スタークトラップを取り付け、その化合物を、不活性雰囲気下にて、共沸乾燥した。そのトラップを還流冷却器で置き換え、このフラスコの温度を、そのフラスコを一定温度の油浴に入れることにより、45℃で保持した。トルエンスルホン酸メチル(1.62ml、5.4mmol)およびカリウムt−ブトキシド溶液2.8ml(THF中で1.0M)を加え、その反応物を、3時間攪拌した。次いで、トルエンスルホン酸メチル(0.81ml)およびカリウムt−ブトキシド溶液1.4mlを加え、その反応物を、さらに3時間攪拌した。このフラスコを油浴から取り除き、そして室温まで冷却した。この溶液を一口丸底フラスコに移し、そしてロータリーエバポレーションにより、溶媒を除去した。その残留物を塩化メチレン5mlに溶解し、そしてジエチルエーテル50mlを加えることにより、沈殿させた。その生成物を濾過により集め、そして減圧下にて乾燥した。収量:4.2g。
【0102】
【化24】
(C.1,3−ジmPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパンの脱ベンジル化)
工程Bから得た1,3−ジ−mPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパン[MWポリ(エチレングリコール)(PEG)=9kDa](2.9g、0.32mmol)を、エタノール100mlに溶解した。Pd(OH)2/C(0.5g)およびシクロヘキセン(10mL)を加え、その混合物を、4時間還流した。室温まで冷却した後、この混合物を濾過し、その濾液溶媒をロータリーエバポレーションにより、除去した。その粗残留物質を塩化メチレン5mlに溶解し、そしてジエチルエーテル50mlを加えることにより、沈殿させた。その生成物を濾過により集め、そして減圧下にて乾燥した。
【0103】
【化25】
(D.2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2−プロパノキシ)アセトアルデヒドジエチルアセタールの合成)
ジオキサン(250mL)中の工程Cから得た2−ヒドロキシ−1,3−ジ−mPEGオキシプロパン(M.W.9000 Da、4.5g、0.0005mol)に、水酸化ナトリウム(0.20g、0.005mol)およびクロロアセトアルデヒドジエチルアセタール(0.38g、0.0025mol)を加え、その混合物を、激しく攪拌しつつ、24時間還流した。その溶液を約150mlまで濃縮し、冷却し、そして濾過した。その濾液を乾燥状態まで蒸発させ、水100mlに溶解し、そして塩化メチレン(3×75mL)で抽出した。合わせた抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、その生成物を、エーテル300mlを加えることにより、沈殿させた。沈殿した生成物を濾過により集め、そして減圧下にて乾燥した。
【0104】
この反応は、タンパク質または他の生物活性剤上のアミノ基と共有結合するのに適当なアルデヒド(アセトアルデヒドジエチルエーテル)への保護形態との2−ベンジルオキシプロパン保護基の変換を示す。
【0105】
(実施例2)
(2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2−プロパノキシ)スクシンイミジルブチレート(mPEG2−SBA)(20kDa)の合成)
【0106】
【化26】
(A.1,3−ジPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパンのメチル化)
実施例1の工程Aで記述したようにして調製した1,3−ジPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパン(20kDa)20gおよびBHT(2,6−ジ−tert−ブチル−4−メチルフェノール)0.01gを、トルエン400mlに溶解した。得られた溶液を、減圧下にて蒸留することにより、共沸乾燥した。その残留物を無水トルエン700mLに再溶解し、そしてカリウムt−ブトキシド溶液14mL(1.0Mtert−ブタノール溶液)およびトルエンスルホン酸メチル3.0mlを別々に加えた。その反応混合物を、45℃で、窒素下にて、一晩攪拌した。
【0107】
不溶物質を濾過し、その濾液を、減圧下にて、乾燥状態まで蒸発させた。その残留物を脱イオン水700mlに溶解し、そしてNaClで飽和した。この溶液のpHを7.5に調節し、次いで、ジクロロメタン(300ml×2)で抽出した。抽出したジクロロメタンをNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させ、そしてEt2O(500mL)で沈殿させた。そのメチル化生成物を減圧濾過により集め、そして減圧下にて、一晩乾燥した。
【0108】
収量:18.5g
【0109】
【化27】
(B.1,3−ジ−mPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパンの脱ベンジル化)
工程Aから得た1,3−ジ−mPEGオキシ−2−ベンジルオキシプロパン(20kDa)18.0gを5mMリン酸緩衝液(pH7.2)225mlに溶解し、そして木炭担持10%Pd(1.13g)を加えた。その懸濁液を、40psiの水素下にて、20時間水素化した。
【0110】
この懸濁液を濾過して、触媒を除去し、その濾液をNaClで飽和し、この溶液のpHを3.0に調節した。この溶液をジクロロメタン(300ml×2)で抽出し、合わせた抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させ、そしてEt2O(500mL)で沈殿させた。その生成物を減圧濾過により集め、そして減圧中で、一晩乾燥した。
【0111】
収量:13.2g;
【0112】
【化28】
(C.2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2−プロパノキシ)酪酸の合成)
工程Bから得た2−ヒドロキシ−1,3−ジ−mPEGオキシプロパン(20kDa)2.5gをトルエン30mlに溶解し、得られた溶液を、減圧下にて蒸留することにより、共沸乾燥した。その残留物を無水トルエン30mLに再溶解し、そしてカリウムtert−ブトキシド溶液(tert−ブタノール中で1.0M)1mL、BHT(2.5mg)および1−(3−ブロモプロピル)−4−メチル−2,6,7−トリオキサビシクロ[2,2,2,]オクタン0.25gを加えた。その反応混合物を、65℃で、窒素下にて、一晩攪拌した。
【0113】
溶媒を、減圧下にて、乾燥状態まで溶媒を蒸発させ、その残留物を、減圧下にて、2時間乾燥し、最後に、脱イオン水60mlに再溶解した。この溶液のpHを、10%H3PO4で、2.0に調節した。pH2.0で15分間攪拌した後、その溶液のpHを、1.0N NaOHで、12.0に調節し、そしてpH12.0で、2時間攪拌した。加水分解した溶液をNaClで飽和し、そのpHを、10%H3PO4で、3.0に調節した。この溶液をジクロロメタン(100ml×2)で抽出し、合わせた抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させ、そしてEt2O(100mL)で沈殿させた。その生成物を減圧濾過により集め、そして減圧中で、一晩乾燥した。
【0114】
収量:2.3g;GPC:79%。
【0115】
(D.2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2−プロパノキシ)酪酸の精製)
工程Cから得た粗2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2プロパノキシ)酪酸を、DEAEセファロースFFイオン交換カラム(100mL)で精製した。精製後、その収量は、1.55gであった。
【0116】
【化29】
(E.2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2−プロパノキシ)スクシンイミジルブチレート(20kDa)の合成)
工程Dから得た2−(1,3−ジ−mPEGオキシ−2−プロパノキシ)酪酸1.5gを、窒素下にて、無水ジクロロメタン20mlに溶解した。その溶液に、まず、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.0132g)を加え、続いて、ジシクロヘキシルカルボジイミド0.0234gを加えた。この溶液を、窒素下にて、室温で、一晩攪拌した。その生成物を濾過し、減圧下にて濃縮し、IPAおよびEt2O(1:1)の混合物に沈殿させ、濾過により集め、そして減圧下にて乾燥した。収量:1.2g;
【0117】
【化30】
(実施例3)
((2’−ベンジルオキシエトキシ)エチル−1,3−プロパンジオール(BEEP)の合成−分枝ポリマーを調製する際に使用するのに適当な例示的な脂肪族炭化水素コア分子)
【0118】
【化31】
(A.ジ(エチレングリコール)モノベンジルエーテルメタンスルホネートの合成)
トルエン200ml中のジ(エチレングリコール)モノベンジルエーテル(15g)を共沸蒸留により乾燥し、その残留物を、無水トルエン400mlおよび無水ジクロロメタン100mlに再溶解した。この溶液に、0〜5℃で、無水トリエチルアミン11.5mlおよび塩化メタンスルホニル6.23mlを滴下した。その反応混合物を、室温で、窒素下にて、一晩攪拌し、この反応を、無水エタノール5mlを加えることにより、クエンチした。不溶性物質を濾過により除き、濾液を乾燥状態まで蒸発させた。その残留物を無水トルエン200mlに再溶解し、不溶物質を濾過により除いた。その濾液を乾燥状態まで蒸発させ、残留物を減圧下にて乾燥した。収量:22g。
【0119】
【化32】
(B.C6H5−CH2O−CH2CH2OCH2CH2−CH(COOC2H5)2の合成)
1,4−ジオキサン100ml中のマロン酸ジエチル(17.5 g)に、窒素下にて、1,4−ジオキサン150ml中のNaH(3.6g)を滴下した。上記マロン酸ジエチル溶液に、1,4−ジオキサン600ml中の工程Aから得たジ(エチレングリコール)モノベンジルエーテルメタンスルホネート(10g)を加えた。その混合物を4時間還流した後、この反応溶液を濾過し、そして乾燥状態まで蒸発させた。その残留物を、減圧下にて、一晩乾燥した。
【0120】
残留しているマロン酸ジエチルを、減圧下にて、留去した。蒸留後、その残留物をシリカゲルカラムのフラッシュクロマトグラフィー(これは、ヘキサンに続いてジクロロメタンで溶出する)で精製した。合わせたジクロロメタン抽出物を乾燥状態まで蒸発させ、その生成物を、減圧下にて、一晩乾燥した。収量:6g。
【0121】
【化33】
(C.C6H5−CH2O−CH2CH2OCH2CH2−CH(CH2OH)2の合成)
工程Bから得たC6H5−CH2O−CH2CH2OCH2CH2−CH(COOC2H5)2(5g)をトルエン200mlに溶解し、そして0〜5℃で、LiAlH4(THF中で1M)を加えた。室温で一晩攪拌した後、水1mlを加え、続いて、15%NaOH(1.0ml)および水3.0mlを加えた。不溶物質を濾過し、その濾液を乾燥状態まで蒸発させた。その生成物をシリカゲルカラムのフラッシュクロマトグラフィー(これは、酢酸エチルで溶出する)で精製した。合わせた画分を乾燥状態まで蒸発させた。その最終生成物を、減圧下にて、一晩乾燥した。収量:1.5g。
【0122】
【化34】
(実施例4)
((2’−ベンジルオキシエトキシ)−1,3−プロパンジオールの合成−分枝ポリマーを調製するのに有用な代表的な脂肪族炭化水素コア分子)
【0123】
【化35】
シス−1,3−O−ベンジリデングリセロール2g、ベンジル2−ブロモエチルエーテル3.51ml、KOH粉末1.25gおよびトルエン30mlの混合物を、還流下にて、約20時間攪拌した。室温まで冷却した後、不溶物質を濾過により除去し、その濾液を濃縮した。その残留物を、140℃で、減圧下にて、蒸留して、ベンジル2−ブロモエチルエーテルを除去した。蒸留後、その残留物をメタノール(これは、2mlの濃HClを含有する)に溶解し、そして4時間還流した。水100mlを加え、そのpHを、固形NaOHで、5〜6に調節した。約10%までNaClを加え、その生成物をジクロロメタン(50ml×3)で抽出した。合わせたジクロロメタン抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過し、そして蒸発させた。その残留物を減圧下にて乾燥し、その生成物をシリカゲルカラム(80g)のクロマトグラフィー(これは、酢酸エチルで溶出する)で精製した。合わせた画分を蒸発させ、そして減圧下にて乾燥した。収量:約0.9g。
【0124】
【化36】
(実施例5)
(分枝PEGポリマーでのリゾチームのPEG化)
リゾチーム(0.0021g、Sigma)を、2mlバイアル中にて、50mMリン酸ナトリウム緩衝液1ml(pH7.5)に溶解した。実施例2から得たMPEG2(20kDa)−SBA(0.006g、リゾチームに対して2倍モル過剰)を加え、その反応バイアルを、室温で、18時間振盪した。
【0125】
その粗反応混合物のMALDI−TOFスペクトルにより、リゾチーム、PEG2(20kDa)−ブタン酸、およびモノペグ化リゾチームおよびジペグ化リゾチームが、それぞれ、14,028Da、21,810Da、35,612Daおよび57,783Daで存在していることが明らかとなった。SDS−PAGE(10%トリス−HCLゲル)により、6個のバンドが表示され、これらは、テトラ−、トリ−、ジ−、モノ−ペグ化リゾチーム(このことは、この酵素のポリマー変性形態を意味し、これは、それぞれ、そこに共有結合した本発明の分枝ポリマーの4個、3個、2個および1個を有する)、PEG2(20K)−ブタン酸および非ペグ化リゾチームを示している。
【0126】
実施例5は、分枝ポリマー構造を生物活性剤にカップリングするアミド結合を有する結合体を形成する際の本発明のポリマーの有用性を証明している。
【0127】
(実施例6)
(分枝PEGポリマーでのリゾチームのPEG化)
2.2mg、1.9mgおよび2.lmgのリゾチーム(Sigma)を、それぞれ、pH5.5、6.5および7.6の50Mリン酸ナトリウム緩衝液1mlに溶解した。pH5.5のリゾチーム溶液に、ジ−mPEG 2kDa−ブチルアルデヒド(リゾチームに対して、5倍モル過剰)1.5mgおよびNaCNBH3(リゾチームに対して、10倍モル過剰)0.1mgを加えた。pH6.5および7.5のリゾチーム溶液に、それぞれ、1.3mgおよび1.5mgのMPEG 2kDa−ブチルアルデヒドを加え、続いて、それぞれ、0.08mgおよび0.09mgのNaCNBH3を加えた。これらの3個の反応バイアルを、室温で、6時間振盪した。
【0128】
pH5.5および6.5の反応物から得た試料により、MALDI−TOFによって、リゾチーム、モノペグ化リゾチームおよびジペグ化リゾチームの存在が明らかとなった。pH7.5で行った反応から得た試料により、MALDI−TOFによって、ジ−ペグ化リゾチームの存在が明らかとなった。24時間後、全ての反応生成物混合物は、リゾチーム、モノ−およびジ−ペグ化リゾチーム、およびトリ−ペグ化リゾチームを含有していた。
【0129】
6時間後、pH5.5、6.5および7.5の反応から引き出した3個の試料を、15%トリス−HClゲルにスポットした。各試料により、ジ−、モノ−および天然リゾチームに対応する3個の可視バンドが明らかとなった。24時間後、pH5.5、6.5および7.5の反応から引き出した3個の試料により、4個の可視バンドが明らかとなり、これらは、トリ−、ジ−、モノ−および非ペグ化リゾチームを示した。
【0130】
実施例6は、結合体を形成する際の本発明のポリマーの有用性を示しており、ここで、生物活性剤は、対応するシッフ塩基の還元アミノ化により生成した第二級アミン結合を介して、この分枝ポリマーに共有結合される。
Claims (36)
- X’が、−NH−、−O−または−S−である、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- qが、2〜約5である、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- 前記POLYポリマーアームが、前記脂肪族炭化水素において、対称的に位置している、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- Rが、3個〜約7個の炭素原子を含有する、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- Rが、3個の炭素原子を含有する、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- 各POLYポリマーアームおよび前記Y官能基が、Rの異なる炭素原子に結合している、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- 各POLYが、構造Z−POLY−を有し、ここで、Zが、キャッピング基または官能基である、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- 各Zが、アルコキシ、アルキル、ベンジル、アリールおよびアリールオキシからなる群から別個に選択されるキャッピング基である、請求項8に記載の分枝ポリマー。
- 各Zが、メトキシである、請求項8に記載の分枝ポリマー。
- 各Zが、ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、ヒドラジン、チオール、アルカン酸、酸ハロゲン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から別個に選択される官能基である、請求項8に記載の分枝ポリマー。
- Yが、ヒドロキシル、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、ヒドラジド、チオール、アルカン酸、酸ハロゲン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- 各POLYが、別個に、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン性アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカライド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N−アクリロイルモルホリン)、ならびにそれらのコポリマー、それらのターポリマーおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- 各POLYが、ポリ(エチレングリコール)である、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- 各POLYが、直鎖または分枝である、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- pが、1であり、そしてXが、ヘテロ原子、−アルキレン−、−O−アルキレン−O−、−アルキレン−O−アルキレン−、−アリール−O−、−O−アリール−、(−O−アルキレン−)mおよび(−アルキレン−O−)mからなる群より選択され、ここで、mが、1〜10である、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- pが、0であり、そしてYが、ヒドロキシルである、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- Yが、構造−O−Gpを有する保護ヒドロキシルであり、ここで、Gpが、保護基である、請求項1に記載の分枝ポリマー。
- Gpが、ベンジル、アセタールおよびジヒドロピラニルからなる群から選択される、請求項18に記載の分枝ポリマー。
- 請求項1に記載の分枝反応性ポリマーに共有結合した生物活性分子を含有する、生物活性結合体。
- Dが、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬剤、染料、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、多糖類、ステロイド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、ミセル、脂肪および電解質からなる群から選択される、請求項22に記載の生物活性結合体。
- 各Nuが、アミノ、チオールまたはヒドロキシルである、請求項25に記載の脂肪族炭化水素。
- Y’が、保護ヒドロキシルである、請求項25に記載の脂肪族炭化水素。
- 分枝ポリ(アルキレングリコール)ポリマーを調製する方法であって、該方法は、
脂肪族炭化水素を提供する工程であって、該脂肪族炭化水素は、少なくとも2個の求核基および少なくとも1個の保護官能基で置換されている、工程;
アルキレンオキシドモノマー単位を該求核基の部位にて該脂肪族炭化水素に重合して、ヘテロ原子結合を介して該脂肪族炭化水素に結合した少なくとも2種のポリ(アルキレングリコール)ポリマーを形成する工程;
該ポリ(アルキレングリコール)ポリマーをアルキル基で末端キャッピングしてアルコキシ末端ポリマーを形成する工程;そして
該保護官能基を脱保護して、ヒドロキシル基を形成する工程、
を包含する、方法。 - 前記アルキレンオキシドモノマー単位が、エチレンオキシド単位である、請求項29に記載の方法。
- 前記保護官能基が、保護ヒドロキシル基であり、そして前記脱保護工程が、該保護ヒドロキシル基の加水分解または水素化分解を包含する、請求項29に記載の方法。
- 前記末端キャッピング工程が、前記ポリマーをメトキシで末端キャッピングする工程を包含する、請求項29に記載の方法。
- 前記脂肪族炭化水素が、2−ベンジルオキシ−1,3−プロパンジオール、2−ベンジルオキシエトキシ−1,3−プロパンジオールおよび2−ベンジルオキシエトキシエチル−1,3−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記脱保護官能基を改変して第二官能基を形成する工程をさらに包含する、請求項29に記載の方法。
- 前記第二官能基が、活性エステル、活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、ヒドラジド、チオール、アルカン酸、酸ハロゲン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレートおよびトレシレートからなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
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