JP5324226B2 - アルファ窒素基を有する活性ポリマーを調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ポリアルキレンオキシドなどの活性化ポリマーを調製する方法に関する。特に、本発明は、高純度でアルファ窒素基を含有する線状ポリマーを調製する方法に関する。

タンパク質およびポリペプチドなどの治療部位を持つ水溶性ポリアルキレンオキシドの共役が知られている。例えば、ここに引用する特許文献１を参照のこと。特許文献１には、ＰＥＧで修飾された生理学的活性ポリペプチドが、体内で長期間に亘り循環し、免疫原性および抗原性が低減していることが開示されている。

ポリアルキレンオキシドを共役させるために、最初に、このポリマーのヒドロキシル末端基を反応性官能基に転化しなければならない。このプロセスはしばしば「活性化」と称され、その生成物は「活性化ポリアルキレンオキシド」と呼ばれる。他のポリマーも同様に活性化される。

共に譲渡された特許文献２には、あるポリマー共役反応に関連する問題のいくつかに対処するための解決策の１つが記載されている。具体的に、ポリマー複合体は、未修飾のタンパク質、酵素などとは異なるｐＩを有すると判断された。例えば、ＰＥＧ付加（PEGylation）、すなわち、そのポリマーをリジン・エプシロンアミノ基に付着させることにより、等電点が減少し、ｐＨ最適値、すなわち、最大の生物活性が観察されるｐＨが変化する。特許文献２に報告されたように、生理学的ｐＨでの生物活性を最適化するために、元のｐＩ値を取り戻すこと、またはポリマーのｐＩ値を変えさえすることが有益であろう。

長年に亘り、特許文献２に記載された活性化ポリマーを調製する合成手法の改善が、特に高純度が要求される場合、望ましいであろうと判断された。特許文献２の実施例１０は、ＰＥＧ−Ｃｌおよびサルコシンを４日間に亘り７５℃で反応させると、Ｎ−メチルグリシンＰＥＧ中間体が得られ、これはたった８０％の純度であったことを示している。ＰＥＧ−Ｃｌの一部はＰＥＧ−ＯＨに戻り、それゆえ、高純度の活性化リンカーまたはそれにより生成されたＰＥＧ複合体を得ることが難しくなることも分かった。
米国特許第４１７９３３７号明細書 米国特許第５７３０９９０号明細書

上記に鑑みて、アルファ窒素基を有する活性化ポリマーを調製する改良方法を提供することが望ましいであろう。本発明はこの必要性に対処するものである。

本発明の好ましい態様の１つにおいて、孤立電子対含有部位をその上に有するポリマーを調製する方法が提供される。より詳しくは、本発明は、その上にアルファ窒素基を有する活性化ポリマーおよびポリマー複合体を提供する。本発明の方法は、化学式(I)

ここで、
Ｒ₁は実質的に非抗原性ポリマーであり、
Ｒ₂はキャッピング基、ＬＧまたはＬＧ−（Ｌ₁）_n−であり、
Ｌ₁は二官能性リンカーであり、
ＬＧは、トシレート基または以下に記載するような他の基などの脱離基であり、
ｎ＝０または正の整数である、
の実質的に非抗原性ポリマーを、塩基水溶液中のその上に孤立電子対含有基を有する化合物と、約２４時間未満の反応時間に亘り、約１０から約８０℃の温度で反応させる工程を有してなる。本発明のより好ましい態様において、Ｒ₁は、約２，０００から約１００，０００の分子量を有するＰＥＧである。

本発明のある好ましい態様において、化学式(I)のポリマーは、その上に孤立電子対含有基を含有する、化学式(III)：

ここで、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₇であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₈であり、
ｍは、正の整数、好ましくは１であり、
Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシからなる群より独立して選択され、
ＺがＮＲ₇であるときに、Ｒ₄およびＲ₇は両方ともＨではないとする、
の化合物と反応せしめられる。

化学式(III)の範囲内で、ＺはＮＲ₇であることが好ましく、ＸはＯであることが好ましい。化学式(III)のある特別に好ましい化合物は、Ｎ−メチル−グリシンまたはサルコシンである。先の反応により、化学式(IVa)および(IVb)に対応する化合物が得られる：

その上に孤立電子対含有部分を有するポリマーが一旦高純度で形成されたら、その上に活性化基を有するいくつの化合物と反応させて、その上にアルファ窒素または孤立電子対含有部分を有する活性化ポリマーを形成することができる。その上に活性化基を有するある特に好ましい化合物はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）であり、得られる活性化ポリマーは、

である。

幅広い生物学的活性求核体に付着し、ＰＥＧ−複合体を形成するのにその活性化ポリマーを使用できるように、従来技術で認識されている活性化基のいずれか１つを高純度の中間体に付着させても差し支えないことが分かるであろう。いくつかの特に好ましい生物学的活性求核体としては、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびアルギニンデイミナーゼが挙げられる。

本発明の好ましい態様に関連する主要な利点の１つは、そのポリアルキレンオキシド誘導体などの、得られるアルファ窒素含有ポリマーが高純度で調製されることである。それゆえ、生成物汚染物、すなわち、出発材料およびｍＰＥＧ−ＯＨは、感知できるほどの量では見つからない。実際に、本発明のほとんどの態様において、それらは、約５％未満、好ましくは約２％未満の量でしか見られない。好ましいアルファ窒素含有ＰＥＧ誘導体が高純度でより経済的に形成される場合、当業者は、ＰＥＧ誘導体を含む最終生成物をより効率的かつより低コストで製造できる。一部には、所望のアルファ窒素含有中間体（例えば、サルコシン）の分離が要求されず、ＰＥＧ−ＯＴのＰＥＴ−ＯＨへの戻りが実質的になくなるので、効率性が得られる。さらに、所望のポリマーを提供するために、退屈なイオン交換またはＲＰ ＨＰＬＣ技法が必要ない。それゆえ、本発明は、費用のかかるカラム精製を用いずに、高純度のアルファ窒素含有ＰＥＧ−アミンを提供する。

別の利点は、ここに記載された方法から製造されたアルファ窒素含有ポリマーにより、ＰＥＧの主鎖が全く変わらないという事実である。したがって、本発明のポリマーは、活性化ＰＥＧに関する現行と将来の全ての用途に適合するであろう。

本発明の方法は広く、その上に少なくとも１つのアルファ窒素基を含有するポリマーの形成に関する。本発明のほとんどの態様において、ここに記載した方法を用いて修飾できるポリマーは、実質的に非抗原性ポリマーである。この属のポリマーの範囲内で、ポリアルキレンオキシドが好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がより好ましい。制限というよりむしろ説明を容易にする目的のために、本発明の方法は、所々、原型的ポリマーとしてＰＥＧを使用して記載する。しかしながら、この方法は、線状、実質的に線状、分岐などであって差し支えない、幅広いポリマーに適用できることが理解されるであろう。しかしながら、要件の内の１つは、そのポリマーが、ここに記載する条件下で、その上に孤立電子対含有基を有する部分に共有結合するための手段を含有することである。

先の記載によれば、その上に孤立電子対含有部分を有するポリマーを調製するための本発明のある好ましい態様は、化学式(I)

ここで、
Ｒ₁は実質的に非抗原性ポリマーであり、
Ｒ₂はキャッピング基、ＬＧまたはＬＧ−（Ｌ₁）_n−であり、
ＬＧは脱離基であり、
Ｌ₁は二官能性リンカーであり、
ｎ＝０または好ましくは約１から約１０の正の整数、より好ましくは１である、
のポリマーを、塩基水溶液中のその上に孤立電子対含有基を有する化合物と、約２４時間未満の反応時間に亘り、約１０から約８０℃の温度で反応させる工程を有してなる。ある好ましい態様において、温度は約３０から約６０℃に及び、他の態様において、温度は約４５から約５０℃に及ぶ。好ましい反応時間は約１８時間未満であり、約１２時間以下がより好ましい。要求される最小時間は、反応が実質的に完了するのに十分な時間である。ほとんどの態様において、反応が少なくとも約４時間に亘り続くことが好ましい。

化学式(I)のある好ましいポリマーとしては、

ここで、
Ｒ₂はメトキシであり、
Ｒ₁はポリアルキレンオキシドである、
が挙げられる。

意外なことに、脱離基が、ここに挙げられた特別に記載された基に制限され、反応温度と反応時間の条件がここに記載されたように制御された場合、高純度のアルファ窒素含有ポリマーを形成できることが分かった。これらの生成物には、従来技術の方法を用いて製造されたものに関連する欠点が実質的にない。

キャッピング基
先に述べたように、Ｒ₂は、キャッピング基、別の脱離基（ＬＧ）または別の脱離基と二官能性リンカーであって差し支えない。本発明の目的に関して、キャッピング基は、ポリマーの末端に見られる基を意味すると理解すべきである。ほとんどの態様において、その基はメトキシであることが好ましい。当業者に理解されるように、他の末端基を代替基として使用して差し支えない。

脱離基
本発明のある好ましい態様において、脱離基（ここではＬＧ）は、

であり、ここで、Ｒ₃はメチルであることが好ましく、ＬＧはトシレートである。あるいは、Ｒ₃は、水素、ニトロ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、置換カルボキシ、または多ハロゲン置換ベンゼンスルホニルであって差し支えない。適切な代わりの脱離基の非限定的例としては、メシレート、ブロシレート、トレシレートおよびノシレートが挙げられる。ＰＥＧ−トシレートおよび化学式(IIa)および(IIb)に対応する他の化合物は、実質的に純粋な出発材料としての市販の供給源から得られるか、または過度の実験を行わずに標準技法を用いて製造できる。

二官能性リンカー
本発明のポリマーは、ＰＥＧ部分とＬＧとの間にスペーサまたは他の随意的基を挿入可能にすることを含む、当該技術分野で認識された目的のために使用される、二官能性連結基（Ｌ₁）も含んでよい。それゆえ、Ｌ₁部分は、以下の非限定化合物：

ここで、
Ｒ_9-13は、Ｃ_1-6アルキルなどと同じ基から独立して選択され、それぞれＨまたはＣＨ₃であることが好ましく、
Ｒ₁₄は、Ｒ_9-13を定義した基と同じ基、並びにＮＯ₂、Ｃ_1-6ハロアルキルおよび水素から選択され、
ｑ、ｔおよびｙは、１から約１２の、それぞれ独立して選択される正の整数である、
の内の１つなどの二官能性連結基から選択することができる。

Ｌ₁部分は、化学式(I)：

に関して示されている。ビス活性化ポリマーが望ましい場合、Ｌ₁基は、Ｒ₁とＬＧとの間の適切な配向を維持するように回転されると理解されよう。

Ｒ ₁ および実質的に非抗原性ポリマー
Ｒ₁も、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）などの室温で水溶性のポリマーであることが好ましく、ｍＰＥＧまたはビス活性化ＰＥＧなどのポリエチレングリコールがより好ましい。したがって、そのようなポリマーの非限定的リストとしては、ブロックコポリマーの水溶性が維持されるという条件で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーが挙げられる。

制限ではなく説明の目的のために、Ｒ₁のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残部は、−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_x−ＣＨ₂ＣＨ₂−であって差し支えなく、ｘは重合度、すなわち、約１０から約２，３００である。

ポリマーの重合度は、ポリマー鎖の繰返し単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存する。実質的に非抗原性ポリマーのＰＡＯおよびＰＥＧは、重量平均分子量が実質的に様々であり得るが、本発明のほとんどの態様において、Ｒ₁は約２００から約１００，０００ダルトンの重量平均分子量を有することが好ましい。実質的に非抗原性ポリマーは、約２，０００から約４８，０００ダルトンの重量平均分子量を有することがより好ましい。

Ｒ₁は、その開示をここに引用する、エヌ・オー・エフ社(NOF Corp.)の薬物送達システム(Drug Delivery System)カタログの２００５年版に記載されているものなどの「星形−ＰＥＧ」またはマルチアームＰＥＧであり得る。特に、Ｒ₁は、化学式：

のものであって差し支えなく、ここで、ｊは、好ましくは約１２，０００から約４０，０００の総分子量を有するポリマーを提供するために、約１０から約３４０の整数であり、
かつ残基の３つまでの末端部分が、メチルまたは他の低級アルキルでキャッピングされている。その内容をここに引用する、Ｎｅｋｔａｒ Ｃａｔａｌｏｇ ２００５〜２００６版、２６頁「４アームＰＥＧ」を参照のこと。化学式IIIまたはサルコシンの化合物との反応前のそのような化合物は：

を含むことが好ましく、ここで、ＬＧは、

またはここに記載された別の基であることが好ましい。

ここに引用する、共に譲渡された米国特許第５６０５９７６号、同第５６４３５７５号、同第５９１９４５５号および同第６１１３９０６号の各明細書に記載された分岐ポリマー残基を含む、その上に孤立電子対含有部分を有する他のＰＥＧ系化合物の形成も、本発明の範囲内で考えられる。化学式Ｉに対応するある特定のポリマーの代表的なリストとしては：

が挙げられ、ここで、
ＬＧ、ｘおよびＬ₁は、先に挙げたものと同じであり、Ｌ₂およびＬ₃は、Ｌ₁を定義したものと同じ基から独立して選択され、またはＬ₂は、その代わりに、ジアミノアルキルまたはリジン残基などの分岐連結基であって差し支えない。例えば、上述した米国特許第６１１３９０６号明細書を参照のこと。
ｚは１から約１２０の整数である。

さらに別の実施の形態において、ＰＡＯ系ポリマーの代替物として、Ｒ₁は、必要に応じて、デキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物系ポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキシド、および／またはそのコポリマーなどの、１つ以上の効果的に非抗原性の材料の中から選択される。その内容をここに引用する、共に譲渡された米国特許第６１５３６５５号明細書も参照のこと。ＰＥＧなどのＰＡＯに関して、ここに記載されたのと同じ種類の活性化が用いられることが当業者には理解されよう。当業者にはさらに、先のリストは単に説明であり、ここに記載された品質を有する全ての重合材料が考えられることが理解されよう。

本発明のある代わりの態様において、ビス活性化ポリマーが望ましい場合、Ｒ₂は、

であって差し支えなく、その結果得られる反応体は、ビスアルファ窒素含有ポリマー化合物の製造に用いられる。そのようなビス活性化ポリマーは、化学式(Ia)：

のものであって差し支えなく、ここで、ｘは上述したものと同じである。

孤立電子対またはアルファ窒素含有ポリマーの形成
本発明のある態様において、化学式(I)のポリマーは、塩基水溶液中でその上に孤立電子対含有基を有する化合物と反応せしめられる。その上に孤立電子対含有基を有するある好ましい化合物は、化学式

に対応し、ここで、ＺがＮＲ₇である場合、Ｒ₄およびＲ₇の両方ともＨではないという条件で、
Ｚは、Ｏ、ＳまたはＮＲ₇であり、
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＲ₈であり、
ｍは正の整数、好ましくは１であり、
Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシからなる群より独立して選択される。

本発明のこの態様において、(III)の化合物がより好ましく、ここで、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｒ₄はメチルであり、Ｒ₅およびＲ₆は各々Ｈである。化学式(III)のさらにより好ましい化合物はＮ−メチル−グリシン（サルコシン）である。

この反応の結果として、化学式(IVa)：

のポリマー、または好ましくは

などのその上に孤立電子対含有基を有するポリマーが形成される。他には、

が挙げられる。

実施例（後述）の化合物３は、化学式(IV)に対応する好ましいｍＰＥＧ−サルコシン化合物の一例である。

本発明の方法は、ＮａＯＨ（好ましい）、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）₂、Ｃａ（ＯＨ）₂などを含有する水溶液およびそれらの混合物などの塩基水溶液中で行われることが好ましい。所望であれば、補助溶媒と共に、Ｈ₂Ｏとテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の混合溶媒、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジオキサンを使用しても差し支えない。

次いで、高純度アルファ窒素含有ＰＥＧ誘導体を、当該技術分野で認識された任意の様式で用いても差し支えない。例えば、制限するものではなく、その誘導体を、当該技術分野で認識された任意の様式（以下の記載されるものを含む）で活性化し、次いで、酵素、タンパク質、ペプチドなどとの直接共役に用いても差し支えない。あるいは、ＣＯ₂Ｈ誘導体を、パクリタキセル、カンプトセシンなどの生物学的活性化合物上のＯＨ残基への解放可能な連結のために用いても差し支えない。

アルファ窒素含有ポリマーの活性化
実施例は、本発明の好ましい態様として、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）およびＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）による、ｍＰＥＧ−サルコシンの活性化を示している。末端ＣＯ₂Ｈの当該技術分野で認識されている任意の転化も、特定の求核体と反応できる所望の官能基を有することの理由で選択される化合物を用いて可能であることも理解されよう。ほとんどの場合、ポリマー共役のための標的上に見られる求核体は、アミン、カルボン酸基、反応性カルボニル基、ヒドロキシル基、メルカプト基などを有する。特定のものに制限することを意図するものではないが、アミンと反応できる適切な官能基は、
ａ） ｐ−ニトロフェニル、またはスクシンイミジルを含む、炭酸基、
ｂ） カルボニルイミダゾール、
ｃ） アズラクトン、
ｄ） 環状イミドチオネン、
ｅ） イソシアネートまたはイソチオシアネート、および
ｆ） Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを含む、他の活性エステル、
の中から選択される。

本発明のこの態様によるある活性化ポリマーの例としては

が挙げられる。

同様に、ｍＰＥＧ−サルコシンをヒドラジンと反応させることにより製造できる

などの、アシルヒドラジド、カルバザート、セミカルバザート、およびチオカルバザートを含む、ヒドラジンおよびヒドラジド官能基から選択して差し支えない。

共役のための生物学的活性部分
一旦活性化されたら、高純度アルファ窒素含有ポリマーは、任意のすなわち幅広い生物学的活性求核体と反応させることができる。本発明の関心のある生物学的活性求核体としては、以下に限られないが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、医薬品化学物質などの天然および合成起源の有機分子が挙げられる。

関心のある酵素としては、炭水化物特異的酵素、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼが挙げられる。特定の酵素に制限するものではなく、関心のある酵素の例としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、およびビリルビンオキシダーゼが挙げられる。関心のある炭水化物特異的酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラストシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼ(glucouronidases)などが挙げられる。

関心のあるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、以下に限られないが、ヘモグロビン、第VII、第VIII、および第IX因子を含む血液因子などの血清タンパク質；イムノグロブリン、インターロイキンなどのサイトカイン、α−，β−およびγ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、血小板由来成長因子およびホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）が挙げられる。一般的な生物学的または治療的関心のある他のタンパク質としては、インシュリン、レクチンおよびリシンなどの植物タンパク質、腫瘍壊死因子、成長因子、組織成長因子、ＴＧＦαまたはＴＧＦβおよび上皮成長因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン刺激因子などが挙げられる。関心のあるイムノグロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその断片が挙げられる。

インターロイキン、インターフェロンおよびコロニー刺激因子などのいくつかのタンパク質は、通常は組換え技法を用いた結果として、非グリコシル化形態でも存在する。非グリコシル化変形物も、本発明の生物学的活性求核体の中に含まれる。

本発明の生物学的活性求核体は、生体内生物活性を示すポリペプチドの任意の部分を含む。これは、アミノ酸配列、アンチセンス部分など、抗体断片、一本鎖抗原結合タンパク質（例えば、その開示をここに引用する、米国特許第４９４６７７８号明細書を参照のこと）、抗体または断片の融合を含む結合分子、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、触媒抗体、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む。

タンパク質またはその部分は、組織培養、動物源からの抽出などの当業者に公知の技法を用いて、または組換えＤＮＡ方法論により、調製または単離できる。タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列などの遺伝子導入源も考えられる。そのような物質は、遺伝子導入動物、すなわち、ネズミ、ブタ、ウシなどから得られ、ここで、タンパク質は、乳、血液または組織中で発現される。遺伝子導入昆虫およびバキュロウイルス発現系も供給源として考えられる。さらに、突然変異体ＴＨＦおよび突然変異体インターフェロンなどのタンパク質の突然変異体も本発明の範囲に含まれる。

関心のある他のタンパク質は、ブタクサ、抗原Ｅ、ミツバチ毒、ダニアケルゲンなどのアケルゲンタンパク質である。

有用な生物学的活性求核体は、タンパク質およびペプチドに限定されない。実質的に任意の生物学的活性化合物が本発明の範囲に含まれる。医薬化学物質、すなわち、抗癌剤、心・血管作動薬、抗感染薬、抗不安薬、胃腸薬、中枢神経系活性化剤、鎮痛薬、排卵促進剤や避妊薬、抗炎症薬、ステロイド剤、抗尿酸血症薬、血管拡張薬、血管収縮薬などの化学療法分子が含まれる。本発明の好ましい態様において、カルボン酸誘導体が、ポリマーと化学療法部分との間にエステル結合を生じる条件下で反応せしめられる。特に好ましい生物学的活性求核体の１つは、天然から、大腸菌発酵、すなわち、Ｅｌｓｐａｒ、または他の細菌、菌類、酵母などからであろうとなかろうと、アスパラギナーゼ、もしくは組換え発現源並びにＥＣＡＲ−ＬＡＮＳなどの、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａからの組換えＬ−アスパラギナーゼまたは他の人間化組換えＬ−アスパラギナーゼである。

上述したものは、本発明のポリマーとの共役に適した生物学的活性求核体の例である。それらの生物学的活性物質は、特別に挙げたのではなく、適切な求核基を有することが意図され、本発明の範囲に含まれることが理解されよう。

ＰＥＧ化(PEGylation)反応と称されることもある共役反応は一般に、共役すべきタンパク質に対する活性化ポリマーの約等モルから数倍過剰のモルで、溶液中で行われる。タンパク質に対して活性化ポリマーの過剰のモル数は、約１０倍以上であることが好ましい。タンパク質の生物活性を維持する方法の１つは、タンパク質の活性部位に関連するアミノ酸残基への結合を実質的に避けることである。例えば、タンパク質のアルギニンデイミナーゼに関して、ポリマーカップリングプロセスにおいて活性部位に関連するそれらアルギニンデイミナーゼリジンイプシロンアミノ基への結合を避けることが望ましい。カップリング反応の通常は非特異的性質を考えると、この理論的工程は、実際には実施するのがたいてい困難である。ある随意的な実施の形態において、共役すべきタンパク質は、例えば、操作されたシステインまたはオリゴリジン残基をタンパク質構造上の特定部位に挿入し、次いで、これらの操作された残基で共役することが好ましいアルファ窒素を含有する本発明の活性化ポリマーを用いることにより、任意の活性部位に対して末端の位置に特定の残基を含むように操作されている。

共役反応は、タンパク質の不活性化を避けるために比較的穏やかな条件下で行われる。穏やかな条件は、反応溶液のｐＨを６〜８の範囲内に維持し、反応温度を約１０℃〜２０℃の範囲内に維持することを含む。適切な緩衝剤は、共役反応に干渉せずに、６〜８の好ましいｐＨ範囲を維持できる緩衝溶液を含む。適切な緩衝剤の非限定的例としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液が挙げられる。

ここに記載した反応条件の結果としていくつかの未修飾タンパク質が生じるかもしれないが、この未修飾タンパク質は、容易に回収でき、追加の共役反応のために将来のバッチに再利用できる。

共役を行うための反応条件は、タンパク質または他の標的に対して活性化ポリマーがほぼ等モル数から過剰のモル数で、結合反応を行うことをさらに含む。例えば、そのプロセスは、ポリマーが約１〜６００倍過剰のモル数、好ましくはポリマーが約１〜１００倍過剰のモル数、最も好ましくはポリマーが約１．７５〜５倍過剰のモル数で行って差し支えない。当業者の好みに応じて、活性化ポリマーを固体としてまたは溶液中で標的タンパク質に加えてもよいことが理解されよう。共役反応は、約１０から約２０℃の温度範囲に亘り行われる。反応時間も、当業者の好みにしたがって様々であり、選択された活性化ポリマーに応じて、１時間未満から２４時間もしくはそれより長く及び得る。反応のクエンチングは随意的である。

以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供するように働くが、いかようにも本発明の効果的な範囲を制限することは意味していない。

実施例１
５ｋ ｍＰＥＧ−Ｔｓの調製：
５ｋ ＭＰＥＧ−ＯＨ（化合物１、５０ｇ、１０ミリモル）およびＤＭＡＰ（５．８９ｇ、４８ミリモル）を３００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させた。別に、塩化ｐ−トルエンスルホニル（９．３５ｇ、５０ミリモル）を２００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させた。次いで、調製した塩化ｐ−トルエンスルホニル溶液を、追加の漏斗で、２から３時間に亘り５ｋｍＰＥＧ−ＯＨ溶液に加えた。反応混合物を一晩室温で撹拌した。この反応混合物に２５０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂を加え、その後、反応混合物を０．１ＮのＨＣｌで２回洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂層を分離し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させた。溶媒をできるだけ多く除去した。残留物を７５ｍｌのＣＮＣＨ₃中に溶解させ、１５００ｍｌのＩＰＡの添加により生成物を沈殿させた。それらの固体を濾過し、ＩＰＡで２回、エーテルで２回洗浄した。最終生成物（化合物２）を４０℃で真空下で乾燥させた（４８．４ｇ、９６．８％の収率）。純度はＮＭＲにより＞９９％と判断された。
¹³C NMR (CDCl₃) δ 21.3 (-CH₃), 58.6 (-OCH₃), 68.2-71.4 (PEG中OCH₂CH₂O), 127.4, 129.3, 132.5, 144.1 (芳香族C).

実施例２
５ｋ ｍＰＥＧ−サルコシン（３）の調製：
ＮａＯＨ（３．４９ｇ、８７．３１ミリモル）およびサルコシン（７．７７ｇ、８７．３１ミリモル）を１８０ｍｌのＨ₂Ｏ中に溶解させた。５ｋ ｍＰＥＧ−Ｔｓ（化合物２、４５ｇ、８．７３ミリモル）を加えた。反応混合物を４５から５０℃に加熱し、１２時間に亘りこの温度に保持し、その後、室温まで冷却した。この反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で２回抽出した。混合ＣＨ₂Ｃｌ₂層をＨ₂Ｏで逆洗した。有機層をＭｇＳＯ₄で乾燥させた。溶媒を除去し、残留物を１１０ｍｌの０．２５ＮのＨＣｌ中に溶解させた。生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂で２回抽出した。混合ＣＨ₂Ｃｌ₂層をＭｇＳＯ₄で乾燥させた。溶媒を除去し、残留物を１３０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させ、９００ｍｌのエチルエーテルにより生成物を沈殿させた。最終生成物（化合物３）を濾過し、エーテルで洗浄し、４０℃で真空下で乾燥させた（３８．８ｇ、８６．２％の収率）。純度はＮＭＲにより＞９５％と判断された。
¹³C NMR (CDCl₃) δ 42.0 (-NCH₃), 54.2 (-CH₂NCH₂-), 58.6 (-OCH₃), 65.5-71.4 (PEG中OCH₂CH₂O), 166.0 (-C=O).

実施例３
５ｋ ｍＰＥＧ−サルコシンＮＨＳの調製：
５ｋ ｍＰＥＧ−サルコシン（化合物３、１５ｇ、２．９５８ミリモル）を１００ｍｌｍのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５１０ｍｇ、４．４３７ミリモル）、ジイソプロピルカルボジイミド（５５９ｍｇ、４．４３７ミリモル）および４−ジメチルアミノ−ピリジン（３６１ｍｇ、２．９５８ミリモル）を加えた。混合物を一晩室温で撹拌した。反応混合物を濾過した。溶媒をできるだけ多く除去した。残留固体を３０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させ、３５０ｍｌのエチルエーテルにより沈殿させた。固体を濾過し、エーテルで洗浄した。湿った固体を７５０ｍｌのＩＰＡから再結晶化させた。固体を濾過し、ＩＰＡで２回、エーテルで２回洗浄した。生成物（化合物４）を４０℃で真空下で乾燥させた（収量＝１３．５ｇ）。収率９０％。純度＞９５％。
¹³C NMR (CDCl3) δ 25.1 (-CH₂CH₂-), 42.0 (-NCH₃), 54.8-54.9 (-CH₂NCH₂-), 58.5 (-OCH₃), 68.8-71.4 (PEG中OCH₂CH₂O), 165.3 (-C=O), 168.5 (-O=CNC=O-).

実施例４
ＰＥＧ−サルコシン−ＡＳＮａｓｅ：
高速で撹拌しながら、１００：１のＰＥＧ対タンパク質の反応モル比でＰＥＧ粉末を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６中の５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌのアスパラギナーゼ（エルスパー・メルク(Elspar-Merck)）に加えた。反応を６０分間に亘るＮ₂雰囲気下で３０℃で行い、ｐＨを６．０に低下させさることにより停止したか、またはサイズ排除カラムで直ちに精製した。

反応混合物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で５０ｍｌに希釈し、０．４５μｍのフィルタに通して濾過し、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（アメルシャム(Amersham)、ニュージャージー州）上で分離した。このカラムを１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＰ、ｐＨ６．０中で平衡に到達させ、複合体を１０ｍｌ／分画／分で溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で特定されたピークの分画を収集し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ３０Ｋ（ミリポア社(Millipore Corp.)、マサチューセッツ州、ベッドフォード）を用いて濃縮して、ＰＥＧ−サルコシン−ＡＳＮａｓｅを得た。

実施例５
ＰＥＧ−サルコシン−オリゴヌクレオチド（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）
ＰＢＳ緩衝液（５ｍｌ、ｐＨ７．８）中のＧｅｎａｓｅｎｓｅ（２５ｍｇ、３．９μモル）（ゲンタ(Genta)、ニュージャージー州、バークリーハイツ）の溶液に、ｍＰＥＧ−サルコシンＮＨＳ４（１５０ｍｌ、３９μモル）を加え、５時間に亘り室温で撹拌した。反応溶液をＤＣＭ（３×１０ｍｌ）および塩水（１０ｍｌ）で抽出し、混合有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を二重希釈水（５ｍｌ）中に溶解させ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で予め平衡にしたＤＥＡＥ高速流の弱い陰イオン交換カラム（２７ｍｍ×２５０ｍｍ、床の体積は約５０ｍｌ）上に装填した。未反応のＰＥＧリンカーを水で溶出し（３から４のカラム体積）、次いで、生成物を、１０分間に亘り２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中の０から１００％の１ＭのＮａＣｌの勾配で溶出し、次いで、１０分間に亘り３ｍｌ／分の流量で２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中の０から１００％の１ＭのＮａＣｌの勾配で溶出した。純粋な生成物を含有する分画を収集し、分子量遮断が５０００のＵｌｔｒａｃｅｌｌ膜を用いて、Ａｍｉｃｏｎ撹拌集細胞装置により脱塩し、得られた溶液を凍結乾燥して、純粋なＰＥＧ−サルコシン−Ｇｅｎａｓｅｎｓｅを得た（１５．７ｍｇ、２．４２μモル、６０％）。ＥＳＩ−ＭＳにより、放出されたオリゴヌクレオチドの質量が５８７９．１であることが観察され、計算質量は５８７９．８であった。

比較例６〜７
本発明により提供される純度の改善を実証するために、米国特許第５７３０９９０号明細書の実施例１０〜１１で行われた合成を想起した。以下を参照のこと：
比較例６
ｍＰＥＧ−サルコシンの合成：
５ｋ ｍＰＥＧ−Ｃｌ（２５ｇ、４．９８ミリモル）を、ＮａＯＨ溶液（１５０ｍｌ、０．３３Ｍ）中のＮ−メチルグリシン（サルコシン）の溶液に加え、混合物を、密封したポリプロピレン製ボトル内に入れ、４日間に亘り７５℃で加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、ｐＨを希釈ＨＣｌにより６．０／６．５に調節した。この水溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出し、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた固体を２−プロパノールで再結晶化させて、７７％の収率で表題の化合物を得た。¹³C NMR: (CDCl₃) δ; 41.31 (NCH₃); 54.57 (CH₂N); 57.85 (CH₂C); 58.04 (OCH₃); 167.98 (CO). 純度は¹³C-NMRにより約80%であると判断された。

比較例７
５ｋ ｍＰＥＧ−サルコシンＮＨＳの調製：
５ｋ ｍＥＰＧ−サルコシン（１８ｇ、３．５５ミリモル）を無水塩化メチレン（９０ｍｌ）中に溶解させ、その後、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（６１２ｍｇ、５．３２ミリモル）およびジイソプロピルカルボジイミド（６７１ｍｇ、５．３２ミリモル）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。得られた固体を濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗製生成物を２−プロパノールで再結晶化して、９４％の収率で表題の化合物を得た。¹³C NMR: (CDCl₃) δ; 24.73 (CH₂ スクシンイミド); 41.60 (N-CH₃); 54.57 (NCH₂); 54.44 (CH₂C); 58.11 (OCH₃); 165.13 (CO) 168.48 (C スクシンイミド). 純度は約80%であると判断された。

前述から分かるように、ここに記載された手法を使用することにより、純度の著しい改善が実現され、Ｃ−ＧＭＰグレードの活性化ポリマーを効率的に調製できる。

Claims (24)

1. 孤立電子対含有部分を有するポリマーを調製する方法であって、
   下記化学式(I) で表されるポリマーを、塩基水溶液中、下記化学式（III）で表される化合物と、１８時間未満の反応時間に亘り、４５から５０℃の温度で反応させる工程を有してなる方法。
   

   

   （ここで、Ｒ₁はポリアルキレンオキシドであり、
   Ｒ₂はキャッピング基、ＬＧまたはＬＧ−（Ｌ₁）_n−であり、
   Ｌ₁は二官能性リンカーであり、
   ＬＧは、
   

   

   （ここで、Ｒ₃は、メチル、ハロゲン、ニトロ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチルまたは置換カルボキシルである）；多ハロゲン置換ベンゼンスルホニル；メシレート；ブロシレート；トレシレートおよびノシレートよりなる群から選択される脱離基であり；
   ｎ＝０または正の整数である。）
   

   

   （ここで、ＺがＮＲ₇である場合、Ｒ₄およびＲ₇が両方ともＨではないという条件で、
   Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₇であり、
   Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₈であり、
   ｍは、正の整数であり、
   Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ_1-6ヘテロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ_1-6ヘテロアルコキシからなる群より独立して選択される。）
2. 前記反応時間が１２時間未満であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ＬＧが、
   

   

   であることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. Ｒ₂がメトキシであることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. ＺはＮＲ₇であり、ＸはＮＲ₈であることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. ｍが１であり、Ｒ₄がメチルであり、Ｒ₅およびＲ₆の各々がＨであることを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 前記化学式(III)で表される化合物がＮ−メチル−グリシンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
8. Ｒ₂が、
   

   

   であることを特徴とする請求項１記載の方法。
9. 前記化学式(I)で表されるポリマーが、下記からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
   

   

   

   

   （ここで、ｊは１０から３４０の整数であり、
   ｘは１０から２，３００の整数であり、
   Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は二官能性リンカーであり、
   ｚは１から１２０の整数である。）
10. 前記ポリアルキレンオキシドが、化学式：−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_x−ＣＨ₂ＣＨ₂−で表されるポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
    （ここで、ｘは１０から２，３００の整数である。）
11. 前記ポリアルキレンオキシドが、２００から１００，０００ダルトンの重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
12. 前記ポリアルキレンオキシドが、２，０００から４８，０００ダルトンの重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 前記化学式(I)で表されるポリマーが、下記化学式を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
    

    

    （ここで、Ｒ₂はメトキシであり、Ｒ₁はポリアルキレンオキシドである。）
14. Ｒ₁がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
15. 前記塩基水溶液が、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）₂、Ｃａ（ＯＨ）₂およびそれらの混合物からなる群より選択されるものを含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
16. 前記塩基水溶液がＮａＯＨを含有することを特徴とする請求項１５記載の方法。
17. 前記孤立電子対含有部分を有するポリマーが、下記化学式を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
    

    

    （ＸはＯまたはＳであり；
    ｍは１であり；
    ｎは０または１であり：
    Ｒ_５およびＲ_６は、Ｈ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_1-6アルコキシおよびフェノキシからなる群より独立して選択され；
    Ｒ_７は、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_3-12分岐アルキル、Ｃ_3-8シクロアルキル、Ｃ_1-6置換アルキル、Ｃ_3-8置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールからなる群より独立して選択される。）
18. 前記孤立電子対含有部分を有するポリマーを、活性化基を有する化合物と反応させて、孤立電子対含有部分を有する活性化ポリマーを形成する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
19. 前記孤立電子対含有部分を有する活性化ポリマーが
    

    

    であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
20. 前記活性化基を有する化合物が、求核体と反応できる官能基を有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
21. 前記方法により形成された前記孤立電子対含有部分を有するポリマーの純度が９５％より大きいことを特徴とする請求項１記載の方法。
22. 前記方法により形成された前記孤立電子対含有部分を有するポリマーの純度が９８％より大きいことを特徴とする請求項１記載の方法。
23. 複合体を形成するのに十分な条件下で、下記化合物をアスパラギナーゼと反応させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
    

    
24. 前記アスパラギナーゼが組換え供給源由来であることを特徴とする請求項２３記載の方法。