CN101405018A - 制备活化的具有α氮基团的聚合物的方法 - Google Patents

制备活化的具有α氮基团的聚合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了以高纯度制备基本上非抗原性的聚合物的方法，该聚合物具有含孤电子对的部分。所述聚合物用作合成胺－基的聚合物和对于与亲核物质轭合形成活化聚合物的中间体。本发明公开了轭合物和制备方法以及用这些轭合物的治疗。得到的聚合物－胺足够纯使得避免了药物级别聚合物所需的昂贵的和费时的纯化步骤。

Description

制备活化的具有α氮基团的聚合物的方法
发明领域
本发明涉及制备活化的聚合物，如聚环氧烷的方法。尤其是，本发明涉及以高纯度制备直链的含α氮基团的聚合物的方法。
发明背景
水溶性聚环氧烷(polyalkylene oxide)与治疗部分，如蛋白质和多肽的轭合物(conjugation)是已知的。参见，例如，美国专利4,179,337，其公开内容在此引入作为参考。′337专利公开了被PEG修饰的生理学活性的多肽在体内循环延长的时期，且具有降低的免疫原性和抗原性。
为了轭合聚环氧烷，聚合物的羟基末端必须首先转化为反应性的官能团。该方法通常称为“活化”，且产物称为“活化的聚环氧烷”。其它聚合物被相似地活化。
共同转让的(commonly assigned)美国专利5,730,990描述了一种用于解决一些聚合物轭合反应伴随的一些问题的方案。具体而言，确定聚合物轭合物具有与未修饰的蛋白质、酶等不同的pI。例如，PEG化，即聚合物与赖氨酸ξ氨基的连接导致等电点的降低和最适pH(即在观察到最大生物活性的pH)的改变。如′990专利中的报导，恢复原始的pI或甚至改变聚合物轭合的pI值以使在生理pH下的生物活性最佳化是有利的。
经过几年，确定在′990专利中描述的用于制备活化的聚合物的合成方法需要改进的，尤其是当需要高纯度时。′990专利的实施例10表明在75°下，使PEG-Cl与肌氨酸反应4天仅得到80％纯的N-甲基甘氨酸PEG中间体。也发现部分PEG-Cl转化为PEG-OH，因此难于得到高纯度的活化的连接基或用其制得的PEG轭合物。
综上所述，需要提供活化的具有α氮基团聚合物的改进的制备方法。本发明解决了该需要。
发明简述
在本发明的一个优选方面中，提供了制备在其上具有含孤电子对部分的聚合物的方法。更优选地，本发明提供了活化的在其上具有α氮基团的聚合物和聚合物轭合物。该方法包括在碱的水溶液中，在温度约10至约80℃下，使式(I)的基本上非抗原性的聚合物与在其上具有含孤电子对基团的化合物反应，反应时间小于约24小时，
R2——R1——(L1)n——LG
            (I)
式(I)中
R1为基本上非抗原性的聚合物；
R2为封端基团，LG或LG-(L1)n-；
L1为双功能连接基；
LG为离去基团，如甲苯磺酸基团或下述的其它基团；且
n＝0或正整数。
在本发明的更优选的方面中，R1为分子量为约2,000至约100,000的PEG。
在本发明的一些优选的方面中，式(I)的聚合物与在其上具有含孤电子对基团的式(III)化合物反应：
Figure A20078000949900091
式(III)中
Z为O、S或NR7；
X为O、S或NR8；
m为正整数，优选1；且
R4、R5、R6、R7和R8独立地选自H、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；条件是，当Z为NR7时，R4和R7不都是H。
在式(III)中，Z优选为NR7，且X优选为O。一个尤其优选的式(III)化合物为N-甲基-甘氨酸或肌氨酸。反应导致形成相应于式IV(a)和IV(b)的化合物：
Figure A20078000949900101
一旦在其上具有含孤电子对部分的聚合物以高纯度形成，它可以与任何量的在其上具有活化基团的化合物反应形成活化的在其上具有含α氮或孤电子对部分的聚合物。一个尤其优选的在其上具有活化基团的化合物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，且所得的活化的聚合物为
Figure A20078000949900102
将被理解的是任何一个本领域认可的活化基团可以与高纯度的中间体相连，使得活化的聚合物可以用于与多种生物学活性的亲核物质相连，并形成PEG-轭合物。一些尤其优选的生物学活性的亲核物质包括天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶和精氨酸脱亚氨酶。
伴随本发明优选方面的一个主要优点为以高纯度制备所得含α氮-的聚合物，如其聚环氧烷衍生物。因此，产物污染物(contaminants)，即起始物料和mPEG-OH，不以可识别的量存在。事实上，在本发明的大多数方面中，发现污染物的量少于约5％，优选少于约2％。当优选的含α氮的PEG衍生物以高纯度更经济的形成时，技术人员能够更有效并以较低成本制备终产物，该中产物中引入了PEG衍生物。该效果结果，部分由于含所需α氮中间体(如肌氨酸)的分离，是不需要的，且基本上消除了PEG-OTs向PEG-OH的转化。而且，不需要冗长的离子交换或RP HPLC技术来提供所需的聚合物。因此，本发明提供了高纯度的含α氮的PEG-胺，而不需要昂贵的柱色谱。
另一个优点是下述事实，从本文描述的方法制备的含α氮的聚合物将完全不改变PEG的骨架。因此，将与现在和将来对于活化的PEG′s的应用是兼容的。
发明详述
本发明的方法大体上涉及形成在其上含有至少一个α氮基团的聚合物。在本发明的大多数方面中，使用本文描述的方法修饰的聚合物为基本上非抗原性的聚合物。在该类的聚合物中，优选聚环氧烷，且更优选聚乙二醇(PEG)。为了便于描述的目的而不是为了限制，该方法有时描述为使用PEG作为原始类型的(prototypical)聚合物。然而应该理解，该方法可用于许多聚合物，所述聚合物可以是直链、基本上直链、支链等。然而一个要求是在本文所述的条件下，该聚合物含有用于共价连接在其上具有含孤电子对基团的部分的方式。
根据上述内容，本发明用于制备在其上具有含孤电子对部分聚合物的一个优选方面包括在碱的水溶液(aqueous base)中，温度约10至约80℃下，使式(I)聚合物与在其上具有含孤电子对基团的化合物反应，反应时间小于约24小时，
R2——R1——(L1)n——LG
                 (I)
式(I)中
R1为基本上非抗原性的聚合物；
R2为封端基团，LG或LG-(L1)n-
LG为离去基团；
L1为双功能连接基；且
n＝0或正整数，优选约1至约10，且更优选1。
在一些优选方面中，温度范围为约30至约60℃，而在其它方面中，温度范围为约45至约50℃。优选的反应时间小于约18小时，且更优选约12小时或更少。所需的最少时间为足以基本上完成反应的时间。在大多数方面中，优选的反应过程为至少约4小时。
一些优选的式I聚合物包括
Figure A20078000949900121
其中
R2为甲氧基；且
R1为聚环氧烷。
令人惊奇的发现，当离去基团限定为本发明具体描述的基团，且反应温度和反应时间条件如本文所述控制时，可以形成高纯度的含α氮的聚合物。这些产物基本上无使用现有技术方法产生的那些缺点。
封端基团
如上所述，R2可以为封端基团、另外的(another)离去基团(LG)、或另外的离去基团和双功能连接基。对于本发明的目的，封端基团应该理解为指聚合物末端出现的基团。在大多数方面中，优选甲氧基。也可以使用其它本领域普通技术人员理解的末端基团。
离去基团
在本发明的一些优选的方面中，所述离去基团(本文中为LG)为
Figure A20078000949900122
其中R3优选为甲基，且所述LG为甲苯磺酸基(tosylate)。或者，R3可以为卤素、硝基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、被取代的羧基、或多卤素取代的苯磺酰基。适合的可替换的离去基团的非限制性例示包括甲磺酸基(mesylate)、对溴苯磺酸基(brosylate)、三氟乙磺酸基(tresylate)和对硝基苯磺酸基(nosylate)。PEG-甲苯磺酸酯(PEG-tosylate)和其它相应于式(IIa)和(IIb)的化合物可以从市售源得到作为基本上纯的起始物料或可以使用标准技术制得而不用过度的实验。
双功能连接基
本发明的聚合物还可以包括双功能连接基团(L1)，所述双功能连接基团用于本领域认可的目的，包括在PEG部分和LG中间插入间隔基或其它任选基团。因此，L1部分可以选自双功能连接基团，如下述非限制化合物中的一种：
-NH(CH2CH2O)y(CH2)q-，
-NH(CH2CH2O)yCH2CH2-，
-NH(CR10R11)qCH2CH2-，
-C(O)(CR10R11)qNHC(O)(CR13R12)q-，
-C(O)O(CH2)q-，
-C(O)(CR10R11)q-
-C(O)NH(CH2CH2O)y(CH2)q-，
-C(O)O-(CH2CH2O)yCH2CH2-，
-C(O)NH(CR10R11)q-，
-C(O)O(CR10R11)q-，
-C(O)NH(CH2CH2O)yCH2CH2-，
Figure A20078000949900131
其中
R9-13独立地选自C1-6烷基等，且优选各自为H或CH3；
R14选自与R9-13定义相同的基团，以及NO2、C1-6卤代-烷基和卤素；
q、t和y各自独立地选自正整数，1至约12。
L1部分如对于式(I)所示：
R2——R1——(L1)n——LG
可以理解，当需要双活化的(bis-activated)聚合物时，旋转L1基团以便在R1和LG之间保持合适的方向。
R 1 和基本上非抗原性的聚合物
R1还优选为在室温下可溶于水的聚合物，如聚环氧烷(PAO)，且更优选为聚乙二醇，如mPEG或双-活化的PEG。因此这些聚合物的非限制性的实例包括聚环氧烷均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化的多元醇，其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物在水中的溶解度。
为了说明而不是限制，R1的聚乙二醇(PEG)残基部分可以为-CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2-
其中x为聚合度，即约10至约2,300。
聚合物的聚合度表示在聚合物链中重复单元的数量，且依赖于聚合物的分子量。虽然基本上非抗原性的聚合物，PAO和PEG的重均分子量可以有很大变化，但在本发明的大多数方面中优选的R1的重均分子量为约200至约100,000道尔顿。更优选地，基本上非抗原性的聚合物的重均分子量为2,000至约48,000道尔顿。
R1还可以为“星状-PEG”或多臂PEG，如NOF Corp.Drug DeliverySystem catalog，2005中所述，其公开内容在此引入作为参考。尤其是，R1可以为下式：
Figure A20078000949900141
其中：
j为约10至约340的整数，使得优选提供具有约12,000至约40,000总分子量的聚合物；该残基的最多3个末端部分被甲基或其它低级烷基封端。也参见Nektar Catalog 2005-2006，26页″4-arm PEG″，其内容在此引入作为参考。在与式III化合物或肌氨酸反应前，这些化合物优选包括：
Figure A20078000949900151
Figure A20078000949900161
其中LG优选为
Figure A20078000949900162
或本文描述的其它基团。
同样在本发明考虑范围内的是形成其它在其上具有含孤电子对部分的PEG-基的化合物，包括共同转让的美国专利5,605,976，5,643,575，5,919,455和6,113,906所述的支链聚合物残基，这些公开内容在此引入作为参考。这些对应于式I的具体聚合物的代表性的示例包括：
Figure A20078000949900171
和
(2c)
LG-(CH2CH2O)x——L1——L2——L3——(CH2CH2O)z——CH2CH2——LG
其中
LG、x和L1与上述相同，且L2和L3独立地选自与L1定义相同的基团，
或L2可以为支链连接基团，如二氨基烷基或赖氨酸残基。参见，例如上述美国专利6,113,906；且
z为1至约120的整数。
在另一实施方案中，作为PAO-基的聚合物，R1任选选自一个或多个有效的非抗原性物料，如葡聚糖、聚乙烯醇、糖-基的聚合物、羟基丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚环氧烷、和/或其共聚物。也参见共同转让的美国专利6,153,655，其内容在此引入作为参考。本领域普通技术人员将理解本文所述的相同类型的活化用于PAO′s，如PEG。本领域技术人员还将知道上述列表仅为示例性的，且本发明考虑了所有具有本文所述的性质的聚合物料。
在本发明的另一方面中，当需要双-活化的聚合物时，R2可以为
Figure A20078000949900172
且反应物用于制备含双-α氮的聚合化合物。这些双-活化的聚合物可以为式(Ia)：
Figure A20078000949900181
其中x与上述相同。
孤电子对或含α-氮的聚合物的生成
在本发明的一些方面中，在碱的水溶液中，式(I)的聚合物与在其上含有孤电子对基团的化合物反应。一些在其上含有孤电子对基团的优选的化合物对应于下式：
Figure A20078000949900182
其中
Z为O、S或NR7；
X为O、S或NR8；
m为正整数，优选1；且
R4、R5、R6、R7和R8独立地选自H、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
条件是当Z为NR7时，R4和R7不都是H。
在本发明该方面中更优选式(III)化合物，其中X为O，m为1，R4为甲基，且R5和R6每个为H。更优选的式(III)化合物为N-甲基-甘氨酸(肌氨酸)。
形成在其上含有孤电子对部分的聚合物中的反应结果，如式(IVa)化合物：
Figure A20078000949900191
或优选
Figure A20078000949900192
其它化合物包括
在实施例(下述)中化合物3为优选的对应于式(IV)的mPEG-肌氨酸化合物的实例。
本发明的方法优选在碱的水溶液中进行，所述碱的水溶液如包含NaOH(优选)、KOH、LiOH、Mg(OH)2、Ca(OH)2等或其混合物的水溶液。视需要，H2O和四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)和二噁烷的混合溶剂可以连同辅助溶剂一起使用。
在任何本领域承认的方法中可以使用高纯度的含α-氮的PEG-衍生物。例如，没有限制，其可以用任何本领域承认的方法(包括下述讨论的那些)活化，然后用于直接与酶、蛋白质、肽等缀合(conjugation)。或者，CO2H衍生物可用于可释放地连接生物学活性化合物(紫杉醇、喜树碱等)上的OH残基。
含α-氮聚合物的活化
如本发明的优选方面，实例表示用NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和DIPC(二异丙基碳二亚胺)活化mPEG-肌氨酸。也将被理解的是，使用根据具有所需能够与特定亲核物质反应的官能团选择的化合物，进行任何本领域承认的末端CO2H的转化是可能的。在大多数情况中，对于聚合物轭合物(conjugation)的靶点上的亲核基团将具有胺、羧酸基团、反应性羰基、羟基、巯基等。不是为了具体限制，适合的能与胺反应的官能团选自
a)碳酸酯(carbonates)，包含对硝基苯基或琥珀酰亚胺基；
b)羰基咪唑；
c)二氢噁唑酮(azlactones)；
d)环状亚胺硫酮；
e)异氰酸酯(isocyanates)或异硫氰酸酯(isothiocyanates)；和
f)其它活性酯，包含N-羟基琥珀酰亚胺基。
根据本发明的这个方面，一些活化的聚合物包括
Figure A20078000949900201
相似的，能够与羧酸基团和反应性羰基基团反应的适合的官能团可以选自肼和酰肼官能团，包括酰基酰肼(acyl hydrazide)、肼基甲酸酯(carbazates)、肼基半甲酸酯(semicarbazates)和肼基硫代甲酸酯(thiocarbazates)，如
Figure A20078000949900211
其可以通过mPEG-肌氨酸与肼反应制备。
用于轭合的生物学活性部分
一旦活化，高纯度的含α氮的聚合物可以与任何或多种生物学活性的亲核物质反应。本发明所关注的生物学活性的亲核物质包括，但不限于，蛋白质、肽、多肽、酶、天然的有机分子和合成的有机分子，如药物化学物质等。
关注的酶包括糖-特异性的酶、蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。没有限制为具体的酶，所关注的酶的实例包括天门冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱亚氨酶、腺苷脱氨酶、超氧化物歧化酶、内毒素酶(endotoxinases)、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。所关注的糖-特异性的酶包括葡萄糖氧化酶、糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖糖脑苷脂酶(glucocerebrosidases)、葡萄糖醛酸酶等。
所关注的蛋白质、多肽和肽包括，但不限于，血红蛋白、血清蛋白，如血液因子，包括因子VII、VIII和IX；免疫球蛋白、细胞因子如白介素、α-、β-和γ-干扰素、集落刺激因子包括粒细胞集落刺激因子、血小板衍生的生长因子和磷脂酶-活化蛋白(PLAP)。其它通常的生物学或治疗感兴趣的蛋白质包括胰岛素、植物蛋白如凝集素和蓖麻毒素、肿瘤坏死因子、生长因子、组织生长因子、TGFα′s或TGFβ′s和表皮生长因子、激素、生长介素、促红细胞生成素、色素激素(pigmentary hormones)、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡成熟激素、促甲状腺激素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂等。所关注的免疫球蛋白包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段。
一些蛋白质，如白介素、干扰素和集落刺激因子，也以非糖基化形式存在，通常是由于使用重组技术。非糖基化物质也包括在本发明的生物学活性的亲核物质中。
本发明的生物学活性的亲核物质还包括表现出体内生物活性的多肽的任何部分。其包括氨基酸序列、反义部分等，抗体片段、单链抗原结合蛋白(参见，例如美国专利4,946,778，其公开内容在此引入作为参考)、结合分子包括抗体或片段的融合、多克隆抗体、单克隆抗体、催化抗体、核苷酸和寡核苷酸。
可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术，如组织培养、从动物源中提取、或通过重组DNA方法，制备或分离蛋白质或其部分(portions)。转基因源的蛋白质、多肽、氨基酸序列等也在本发明的考虑范围内。这些物质从转基因的动物即小鼠、猪、牛等得到，其中所述蛋白质在奶、血液和组织中表达。转基因的昆虫和杆状病毒表达体系也作为来源考虑。而且，突变的(mutant)蛋白质，如突变的TNF′s和突变的干扰素也在本发明的范围中。
其它关注的蛋白质为变应原性蛋白质，如豕草、抗原E、蜜蜂毒液、螨变应原等。
有用的生物学活性的亲核物质不限于蛋白质和肽。基本上任何生物学活性的化合物包括在本发明的范围中。包括化疗分子，如药物化学物质，即抗肿瘤药、心血管药、抗瘤形成药、抗感染药、抗焦虑药、胃肠药、活化中枢神经系统药、镇痛药、生育或避孕药、消炎药、甾体药、anti-urecemic agents、心血管药、血管扩张剂、血管收缩剂等。在本发明优选的方面中，在进行聚合物和化疗部分之间的酯连接的条件下，进行羧酸衍生物的反应。一个尤其优选的生物学活性的亲核基团为天门冬酰胺酶，其来自天然的大肠杆菌(E.coli)发酵，即左旋门冬酰胺酶(Elspar)，或其它细菌、真菌、酵母等，或重组表达源，如ECAR-LANS，其来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的重组L-天门冬酰胺酶或其它人重组L-天门冬酰胺酶。
上述为示例性的适合于本发明的聚合物轭合的生物学活性的亲核物质。将被理解的是那些没有具体涉及但是具有适合的亲核基团的生物学活性物质也包括在本发明的范围内。
轭合反应(conjugation reaction)，有时称作PEG化反应，通常在溶液中，用相对于要被轭合的蛋白质从大约等摩尔至约过量几倍摩尔量的活化聚合物进行。优选地，对于蛋白质过量的活化的聚合物的摩尔量为约10-倍或更大。一种保持蛋白质生物活性的方法是基本上避免连接到与与蛋白质活性位点相关的氨基酸残基上。例如，对于精氨酸脱亚氨酶蛋白，，在聚合物偶连过程中需要避免连接到那些与活性位点相关的精氨酸脱亚氨酶赖氨酸ξ氨基上。由于偶连反应的通常的非特异性，该理论的步骤通常难以实际实现。在一些任选的实施方案中，将轭合的蛋白质被设计为在远离任何活性位点的位置包括特定残基，如，通过在蛋白质结构的特异性位点插入设计的半胱氨酸或寡赖氨酸残基，然后使用含有α氮(优选在那些设计的残基轭合)的本发明的活化的聚合物。
在相对温和的条件下进行轭合反应以避免使蛋白质失活。温和的条件包括维持反应溶液的pH为6-8，且反应温度为约10°-20℃。适合的缓冲剂包括能够维持pH范围6-8，而不干扰轭合反应的缓冲溶液。适合的缓冲剂的非限制性列表包括，如磷酸盐缓冲剂、柠檬盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂。
虽然本文所述的反应条件可以产生一些未修饰的蛋白质，但该未修饰的蛋白质可以被迅速回收并循环进入用于其它轭合反应的以后批次。
影响轭合的反应条件还包括对于蛋白质或其它靶标使约等摩尔至约过量的大摩尔量的活化的聚合物进行连接反应。例如，该方法可以以过量约1-600-倍摩尔量的聚合物进行；优选以过量约1-100-倍摩尔量的聚合物，且最优选以过量约1.75-5-倍摩尔量的聚合物。将被理解，依赖于技术人员的选择，活化的聚合物可以作为固体或以溶液形式加入到目标蛋白中。在温度范围约10至约20℃下进行轭合反应。反应时间还将根据技术人员的选择改变，且范围可以从小于1小时至24小时或甚至更长，这依赖于所选择的活化的聚合物。任选进行反应淬灭。
实施例
下述实施例进一步提供了对本发明的理解，但不是为了将本发明的有效范围限制在任何方式中。
Figure A20078000949900231
实施例1
制备5k mPEG-Ts：
将5k mPEG-OH(化合物1，50g，10mmol)和DMAP(5.89g，48mmol)溶解于300ml的CH2Cl2中。将对甲苯磺酰氯(9.35g，50mmol)单独溶于200ml的CH2Cl2中。然后用加料漏斗经2至3小时将制备的对甲苯磺酰氯溶液加入到5k mPEG-OH溶液中。在室温下，搅拌反应混合物过夜。将250ml的CH2Cl2加入到反应混合物中，然后用0.1N的HCl洗涤反应混合物2次。分离CH2Cl2层并用MgSO4干燥。尽可能除去溶剂。将残余物溶于75ml的CNCH3中，且通过加入1500ml的IPA沉淀产物。过滤固体，然后用IPA洗涤两次，并用乙醚洗涤两次。在40℃下真空干燥终产物(化合物2)(48.4g，产率96.8％)。通过NMR检测，纯度＞99％。
13C NMR(CDCl3)δ21.3(-CH3)，58.6(-OCH3)，68.2-71.4(OCH2CH2O在PEG中)，127.4，129.3，132.5，144.1(芳香C).
实施例2
制备5k mPEG-肌氨酸(3)：
将NaOH(3.49g，87.31mmol)和肌氨酸(7.77g，87.31mmol)溶于180ml的H2O中。加入5k mPEG-Ts(化合物2，45g，8.73mmol)。将反应混合物加热至45-50℃，并在此温度下保持12小时，然后冷却至室温。用CH2Cl2萃取反应混合物2次。用H2O反洗涤合并的CH2Cl2层。用MgSO4干燥有机层。除去溶剂，且残余物溶于110ml的0.25N HCl中。用CH2Cl2萃取产物2次。合并的CH2Cl2层用MgSO4干燥。除去溶剂，且残余物溶于130ml的CH2Cl2，然后产物用900ml乙醚沉淀。过滤终产物(化合物3)，用乙醚洗涤，然后在40℃下真空干燥(38.8g，产率86.2％)。通过NMR检测，纯度＞95％。
13C NMR(CDCl3)δ42.0(-NCH3)，54.2(-CH2NCH2-)，58.6(-OCH3)，65.5-71.4(OCH2CH2O在PEG中)，166.0(-C＝O).
实施例3
制备5k mPEG-肌氨酸NHS：
将5k mPEG-肌氨酸(化合物3，15g，2.958mmol)溶于100ml的CH2Cl2。加入N-羟基琥珀酰亚胺(510mg，4.437mmol)、二异丙基碳二亚胺(559mg，4.437mmol)和4-二甲基氨基-吡啶(361mg，2.958mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。过滤反应混合物。尽可能移除溶剂。将残余固体溶于30ml的CH2Cl2，然后用350ml乙醚沉淀。过滤固体并用乙醚洗涤。湿的固体从750ml的IPA中重结晶。过滤固体，用IPA洗涤2次，乙醚洗涤2次。在40℃下真空干燥产物(化合物4)(产量＝13.5g)。产率90％。纯度＞95％。
13C NMR(CDCl3)δ25.1(-CH2CH2-)，42.0(-NCH3)，54.8-54.9(-CH2NCH2-)，58.5(-OCH3)，68.8-71.4(OCH2CH2O在PEG中)，165.3(-C＝O)，168.5(-O＝CNC＝O-).
实施例4
PEG-肌氨酸-ASN-酶：
伴随快速搅拌，将PEG与蛋白质的反应摩尔比为100∶1的PEG粉末加入到在0.1M磷酸钠中的5ml的5mg/ml天门冬酰胺酶(Elspar-Merck)中，pH 7.6。反应在N2下，在30℃下进行60分钟，通过降低pH至6.0停止反应，或立即在空间排阻柱色谱(size exclusion column)上纯化。
反应混合物用20mM磷酸钠，pH 6.0稀释至50ml，通过0.45μm过滤器过滤，并在HiLoad Superdex 200柱(Amersham，NJ)上分离。该柱在140mM的NaCl，20mM的NaP，pH 6.0中平衡，且轭合物以10ml/级分/分钟洗脱出来。在SDS-PAGE上收集被鉴定的峰的级分，并使用Ultrafree 30K(Millipore Corp.，Bedford，MA)浓缩得到PEG-肌氨酸-ASN酶。
实施例5
PEG-肌氨酸-寡核苷酸(Genasense)
向Genasense(25mg，3.9μmol)(Genta，Berekeley Heights，New Jersey)在PBS缓冲剂(5mL，pH 7.8)中的溶液中加入mPEG-肌氨酸NHS 4(150mg，39μmol)，并在室温搅拌5小时。反应溶液用DCM(3×10mL)和盐水(10mL)萃取，然后干燥合并的有机层(MgSO4)，过滤，然后减压下蒸发溶剂。将残余物溶于2倍的蒸馏水(5mL)中，并负载到DEAE快速流动的，弱离子交换柱(27mm×250mm，柱床体积～50mL)上，该柱用20mM的Tris-HCl缓冲液，pH 7.4预平衡。未反应的PEG连接基用水(3至4倍柱体积)洗脱，然后产物被梯度洗脱，洗脱条件为经10分钟，0-100％的1M NaCl在20mM Tris-HCl缓冲液中的溶液，pH 7.4；然后100％的1M NaCl在20mM Tris-HCl缓冲液中的溶液，pH 7.4，以3mL/分钟的流速维持10分钟。收集含有纯产物的馏分，并用Amicon搅拌的细胞浓缩器(stirred cell concentrator)，使用分子量截止为5000的Ultracell膜脱盐，然后冻干所得溶液以得到纯PEG-肌氨酸-Genasense(15.7mg，2.42μmol，60％)。ESI-MS测得释放的寡核苷酸的质量为5879.1，计算质量为5879.8。
比较例6-7
为了证明本发明提供了提高的纯度，检索到美国专利5,730,990的实施例10-11中所述的合成方法。如下所示：
实施例6
合成mPEG-肌氨酸：
将5k mPEG-Cl(25g，4.98mmol)加入到N-甲基甘氨酸(肌氨酸)在NaOH溶液(150ml，0.33M)中的溶液中，然后将混合物置于密封的聚丙烯瓶中，并在75℃下加热4天。将反应混合物冷却至室温，并用稀HCl将pH调节至6.0/6.5。该水溶液用CH2Cl2萃取，并在减压下除去溶剂。所得固体从2-丙醇中重结晶以得到标题化合物，产率77％。13C NMR：(CDCl3)δ；41.31(NCH3)；54.57(CH2N)；57.85(CH2C)；58.04(OCH3)；167.98(CO)。通过13C-NMR检测，纯度为～80％。
实施例7
制备5k mPEG-肌氨酸NHS：
将5k mPEG-肌氨酸(18g，3.55mmol)溶于无水二氯甲烷(90ml)中，然后加入N-羟基-琥珀酰亚胺(612mg，5.32mmol)和二异丙基碳二亚胺(671mg，5.32mmol)。该混合物在室温下搅拌过夜。过滤所得固体，并在真空中除去溶剂。粗产物从2-丙醇中重结晶以得到标题化合物，产率94％。13C NMR：(CDCl3)δ；24.73(CH2琥珀酰亚胺)；41.60(N-CH3)；54.57(NCH2)；54.44(CH2C)；58.11(OCH3)；165.13(CO)168.48(C琥珀酰亚胺)。检测纯度为约80％。
从上述内容可见，通过使用本文描述的方法明显提高了纯度，且可以有效制备C-GMP级活化的聚合物。

Claims (27)

1.制备在其上含有孤电子对部分的聚合物的方法，该方法包括：
在碱的水溶液中，温度约10至约80℃下，使式(I)的聚合物与在其上具有含孤电子对基团的化合物反应，反应时间少于约24小时，
R2-R1-(L1)n-LG
(I)
式(I)中
R1为基本上非抗原性的聚合物；
R2为封端基团，LG或LG-(L1)n-；
L1为双功能连接基；
LG为离去基团；和
n＝0或正整数。
2.权利要求1的方法，其中所述温度为约30至约60℃。
3.权利要求1的方法，其中所述反应时间少于约18小时。
4.权利要求1的方法，其中LG选自
Figure A2007800094990002C1
其中R3为甲基、卤素、硝基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、被取代的羧基、或多卤素取代的苯磺酰基；
甲磺酸基、对溴苯磺酸基、三氟乙磺酸基和对硝基苯磺酸基。
5.权利要求6的方法，其中LG为
Figure A2007800094990002C2
6.权利要求1的方法，其中R2为甲氧基。
7.权利要求1的方法，其中所述在其上含有孤电子对基团的化合物为
Figure A2007800094990003C1
其中
Z为O、S或NR7；
X为O、S或NR8；
m为正整数；且
R4、R5、R6、R7和R8独立地选自H、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基，C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
条件是当Z为NR7时，R4和R7不都为H。
8.权利要求7的方法，其中X为O，m为1，R4为甲基，且R5和R6每个为H。
9.权利要求7的方法，其中所述式(III)化合物为N-甲基-甘氨酸(肌氨酸)。
10.权利要求1的方法，其中R2为
Figure A2007800094990003C2
或
Figure A2007800094990003C3
11.权利要求1的方法，其中R1为聚环氧烷。
12.权利要求1的方法，其中所述式(I)的聚合物选自
Figure A2007800094990003C4
Figure A2007800094990004C1
Figure A2007800094990005C1
和
LG-(CH2CH2O)x-L1-L2-L3-(CH2CH2O)z-CH2CH2-LG
其中
j为约10至约340的整数；
x为约10至约2,300的整数；
L1、L2和L3为双功能连接基；且
z为1至约120的整数。
13.权利要求12的方法，其中所述聚环氧烷为下式的聚乙二醇：-CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2-
其中x为约10至约2,300的整数。
14.权利要求1的方法，其中所述基本上非抗原性的聚合物具有约200至约100,000道尔顿的重均分子量。
15.权利要求14的方法，其中所述基本上非抗原性的聚合物具有约2,000至约48,000道尔顿的重均分子量。
16.权利要求1的方法，其中所述式(I)的聚合物为：
(IIa)
或
(IIb)
Figure A2007800094990006C2
其中
R2为甲氧基；且
R1为聚环氧烷。
17.权利要求16的方法，其中R1为聚乙二醇。
18.权利要求1的方法，其中所述碱的水溶液选自：NaOH、KOH、LiOH、Mg(OH)2、Ca(OH)2及其混合物。
19.权利要求18的方法，其中所述碱的水溶液包括NaOH。
20.权利要求7的方法，其中所述在其上含有孤电子对部分的聚合物选自
(IVa)
Figure A2007800094990006C3
和
(IVb)
Figure A2007800094990006C4
21.权利要求1的方法，该方法还包括使在其上含有孤电子对部分的聚合物与在其上具有活化基团的化合物反应形成活化的在其上含有孤电子对部分的聚合物。
22.权利要求21的方法，其中所述活化的在其上含有孤电子对部分的聚合物为
Figure A2007800094990007C1
23.权利要求21的方法，其中所述在其上具有活化基团的化合物具有能与亲核基团反应的官能团。
24.权利要求1的方法，其中通过所述方法形成的在其上含有孤电子对部分的聚合物的纯度大于95％。
25.权利要求1的方法，其中通过所述方法形成的在其上含有孤电子对部分的聚合物的纯度大于98％。
26.权利要求22的方法，该方法还包括在足以形成轭合物的条件下使
Figure A2007800094990007C2
与天门冬酰胺酶反应。
27.权利要求26的方法，其中所述天门冬酰胺酶来自重组的来源。
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