ES2342294T3 - Metodo de preparacion de polimeros funcionalizados con acido carboxilico. - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar un derivado de ácido carboxílico activado de un polímero no peptídico, soluble en agua, que comprende: i) hacer reaccionar un reactivo de éster R(C=O)OR'', donde R'' es un grupo terciario y R comprende un grupo funcional X, con un polímero no peptídico no soluble en agua POLI-Y, donde Y es un grupo funcional que reacciona con X para formar un enlace covalente, para formar un éster terciario del polímero; ii) tratar el éster terciario del polímero con una base fuerte en solución acuosa para formar una sal carboxilato del polímero; iii) tratar la sal carboxilato del polímero con un ácido inorgánico en solución acuosa, para convertir la sal carboxilato en un ácido carboxílico, formando de esta manera un polímero funcionalizado con ácido carboxílico; y iv) derivatizar adicionalmente el polímero funcionalizado con ácido carboxílico para dar como resultado un polímero derivatizado que tenga un haluro de acilo, pseudohaluro de acilo, sal de metal alcalino/alcalinotérreo, éster, anhídrido, amida, imida o hidrazida.

Description

Método de preparación de polímeros funcionalizados con ácido carboxílico.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a métodos para preparar polímeros no peptídicos, solubles en agua, que llevan grupos funcionales carboxilo, particularmente polímeros de poli(etilenglicol) (PEG) funcionalizados con ácido carboxílico. El alcance de protección de la patente está determinado por la reivindicaciones 1-35 adjuntas.
Antecedentes de la invención
Los derivados de poli(etilenglicol) (PEG) activados con grupos electrófilos son útiles para acoplarse a grupos nucleófilos, tales como grupos amino de moléculas biológicamente activas. En particular, los ésteres activos y otros derivados de ácido carboxílico de PEG se han usado para fijar el PEG a las proteínas que llevan grupos amino.
Las moléculas de PEG que tienen grupos carboximetilo terminales se han descrito, por ejemplo, por Martinez et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.681.567, Veronese et al., Journal of Controller Release 10:145-154 (1989), y Bückmann et al., Makromol. Chem. 182(5):1379-1384 (1981). La Patente de Estados Unidos Nº 5.672.622 (Harris et al.), describe derivados de PEG que tienen un resto ácido propiónico o butanoico terminal. Dichos PEG terminados en carboxilo se usan para preparar ésteres activos adecuados para conjugación a proteínas y otras moléculas que llevan grupos amino.
Sin embargo, un problema persistente asociado con la preparación de polímeros funcionalizados con carboxilo ha sido la dificultad para obtener el producto polimérico deseado con un nivel de pureza suficientemente alto. Por ejemplo, Veronese et al. y Bückmann et al., citados anteriormente, emplean un método para sintetizar ácidos mPEG carboxílicos que comprende convertir mPEG-OH en un éster etílico del ácido mPEG carboxílico, mediante una reacción catalizada por bases de mPEG-OH con un \alpha-halo etil éster, seguido de la hidrólisis del éster promovida por bases. Sin embargo, este enfoque proporciona ácidos mPEG de solo aproximadamente un 85% de pureza, siendo el principal contaminante mPEG-H, que no puede separarse del ácido mPEG carboxílico usando métodos de purificación típicos tales como precipitación, cristalización o extracción. La retirada de mPEG-OH requiere el uso de cromatografía en columna de intercambio iónico preparativa, que consume tiempo y es cara. Los ácidos PEG carboxílicos obtenidos comercialmente frecuentemente contienen cantidades residuales de PEG-OH que complican la preparación de derivados o bioconjugados basados en estos materiales.
Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.278.303, 5.605.976 y 5.681.567 informan sobre la preparación de ácidos PEG carboxílicos que contienen poco o ningún material de partida (alcohol PEG) empleando un haloacetato de alquilo terciario para preparar un PEG funcionalizado con éster de alquilo terciario, que se hidroliza después con ácido, preferiblemente ácido trifluoroacético (TFA).
Diversos tratados sobre el uso de grupos protectores indican que los ésteres de alquilo terciarios, tales como t-butil ésteres, son estables a hidrólisis con las bases suaves usadas típicamente para hidrolizar ésteres de alquilo primarios, tales como ésteres de etilo. La hidrólisis con base fuerte podría provocar la escisión de grupos ácido carboxílico. Véase, por ejemplo, T. W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, 3ª edición, 1999, pág. 406; o P. J. Kocienski, Protecting Groups, 1994, pág. 125. Por consiguiente, estos ésteres de alquilo terciario se escinden convencionalmente con ácido, típicamente con TFA.
Sin embargo, el uso de ácido trifluoroacético puede dar como resultado problemas de purificación y estabilidad del producto. El ácido trifluoroacético es difícil de retirar completamente del polímero funcionalizado con carboxilo final, particularmente la cantidad de TFA sugerida en las patentes mencionadas anteriormente. La presencia de ácido trifluoroacético residual da como resultado una mala estabilidad del producto, debido a la degradación del polímero provocada por la auto-oxidación promovida por ácido. Véase, como por ejemplo, M. Donbrow, "Stability of the Polyoxiethylene Chain", en Nonionic Surfactants: Physical Chemistry, M. J. Schick, ed., Marcel Dekker, 1987, pág. 1011 ff. Este artículo informa que los ácidos catalizan la formación de hidroperóxidos y rompen el hidroperóxido, conduciendo a la escisión de las cadenas de polioxietileno.
Aunque la Patente de Estados Unidos Nº 5.605.976 sugiere la destilación como un medio para separar los materiales orgánicos del producto polimérico, incluso los compuestos con puntos de ebullición muy bajos son difíciles de retirar de los polímeros de alto peso molecular usando un proceso de destilación, y la dificultad aumenta a medida que el peso molecular del polímero aumenta. Hay necesidad en la técnica de procedimientos alternativos para preparar polímeros funcionalizados con ácido carboxílico con un alto rendimiento y libres de cantidades significativas de contaminantes poliméricos, particularmente cantidades significativas del material de partida polimérico. También hay una necesidad en la técnica de métodos de síntesis alternativos que no utilizan reactivos que son difíciles de retirar del producto polimérico final o que provocan problemas de estabilidad del producto.
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Sumario de la invención
La invención proporciona un método para preparar un derivado de ácido carboxílico activado de un polímero no peptídico, soluble en agua, que comprende:
i) hacer reaccionar un reactivo de éster R(C=O)OR' donde R' es un grupo terciario y R comprende un grupo funcional X, con un polímero no peptídico, soluble en agua, POLI-Y, donde Y es un grupo funcional que reacciona con X para formar un enlace covalente, para formar un éster terciario del polímero;
ii) tratar el éster terciario del polímero con una base fuerte en solución acuosa para formar una sal carboxilato del polímero;
iii) tratar la sal carboxilato del polímero con un ácido inorgánico en una solución acuosa para convertir la sal carboxilato en un ácido carboxílico, formando de esta manera un polímero funcionalizado con ácido carboxílico;
iv) derivatizar adicionalmente el polímero funcionalizado con ácido carboxílico para dar como resultado un polímero derivatizado para que tenga un haluro de acilo, pseudohaluro de acilo, sal de metal alcalino o alcalinotérreo, éster, anhídrido, amida, imida o hidrazida. El polímero funcionalizado con ácido carboxílico puede extraerse después de la solución acusa con un disolvente adecuado, preferiblemente un disolvente clorado.
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En una realización, X es un grupo saliente, tal como un haluro o un sulfonato éster, e Y es un grupo hidroxilo. Cuando Y es un grupo hidroxilo, la reacción (i) se realiza preferiblemente en presencia de una base, por ejemplo, una base de la forma R'O-M^{+}, donde M^{+} es un catión.
El tratamiento con una base fuerte en la reacción (ii) es preferiblemente eficaz para producir un pH de reacción de aproximadamente 11 a 13. El ácido inorgánico, por ejemplo, un ácido de mineral, en la etapa (iii), es preferiblemente un ácido que produce aniones no nucleófilos en solución acuosa. Los ácidos preferidos incluyen ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y ácido clorhídrico. El tratamiento con ácido de (iii) es preferiblemente eficaz para producir un pH de reacción de aproximadamente 1 a 3.
El reactivo de éster terciario empleado en la reacción (i) preferiblemente tiene la estructura (I):
1
En la estructura (I), X es un grupo saliente; y cada R^{1} y R^{2} se selecciona independientemente entre hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, arilo, aralquilo y heterociclo. Preferiblemente el grupo (CR^{1}R^{2})_{n} no incluye dos heteroátomos unidos al mismo átomo de carbono; por ejemplo, R^{1} y R^{2} en el mismo átomo de carbono preferiblemente no son ambos alcoxi. El conjunto de R^{3}-R^{5} se selecciona independientemente entre alquilo inferior, arilo, aralquilo y cicloalquilo, donde cualquiera de R^{3}-R^{5} puede estar unido para formar un anillo o sistema de anillo, tal como adamantilo. Cualquiera de R^{1} a R^{5}, exceptuando hidrógeno, puede estar sustituido con un grupo seleccionado entre alquilo inferior, alcoxi inferior, cicloalquilo C3-C6, halo, ciano, oxo (ceto), nitro y fenilo. La variable n es de 1 a aproximadamente 24, preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4, mas preferiblemente de 1 ó 2. En una realización n es 1.
En las realizaciones seleccionadas de la estructura (I), cada R^{1} y R^{2} es independientemente hidrógeno o alquilo inferior no sustituido, preferiblemente hidrógeno o metilo y cada uno de R^{3} a R^{5} es independientemente alquilo inferior no sustituido o fenilo, preferiblemente metilo, etilo o fenilo. En algunas realizaciones cada uno de R^{1} y R^{2} es H y n es 1.
El grupo saliente X en la estructura (I) es preferiblemente un haluro o un sulfonato éster. En una realización, el reactivo de éster terciario es un haloacetato de alquilo terciario, tal como haloacetato de t-butilo.
El polímero no peptídico, soluble en agua, se selecciona preferiblemente entre el grupo que consiste en poli(alquilenglicoles), poli(alcohol olefínico), poli(polivinilpirrolidona), poli(hidroxialquimetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ácido \alpha-hidroxiacético), poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolinas, poli(N-acriloilmorfolina), y copolímeros o terpolímeros de los mismos. En una realización preferida, el polímero es un poli(etilenglicol). El poli(etilenglicol) puede ser lineal y terminar en un extremo con el grupo funcional Y y en el otro extremo con otro grupo funcional Y' o un grupo de protección terminal tal como un grupo metoxi. Como alternativa, el poli(etilenglicol) puede ser ramificado, de horquilla o multi-brazo.
El método puede comprender adicionalmente convertir el ácido carboxílico del polímero funcionalizado con ácido carboxílico en un derivado de ácido carboxílico activado, por ejemplo, un éster activado, tal como por ejemplo, N-succinimidil éster, o-, m-, o p-nitrofenil éster, 1-benzotriazolil éster, imidazolil éster, N-sulfosuccinimidil éster. El polímero puede conjugarse entonces con una molécula biológicamente activa, haciendo reaccionar el derivado de ácido carboxílico con un grupo funcional, preferiblemente un grupo nucleófilo tal como un grupo hidroxilo, tiol, o amino, en la molécula biológicamente activa. Preferiblemente, el grupo nucleófilo es un grupo amino.
En una realización preferida del método, como se ha indicado anteriormente, el polímero es un polímero de PEG. En este aspecto, la invención proporciona un método para preparar un derivado de ácido carboxílico activado de un poli(etilenglicol) (PEG), que comprende:
(i) hacer reaccionar un reactivo de éster terciario R(C=O)OR', donde R' es un grupo alquilo terciario y R comprende un grupo funcional X, con un polímero PBG-Y, donde Y es un grupo funcional que reacciona con X para formar un enlace covalente, para formar un éster terciario de PEG, y
(ii) tratar el éster terciario de PEG con una base fuerte, tal como un hidróxido de metal alcalino, en solución acuosa, para formar una sal carboxilato de PEG. El método comprende, adicionalmente, (iii) tratar la sal carboxilato de PEG con un ácido inorgánico en solución acuosa, para convertir la sal carboxilato en un ácido carboxílico, formando de esta manera un ácido carboxílico de PEG seguido de derivatización adicional como se ha descrito anteriormente. El método puede comprender adicionalmente conjugar el polímero con una molécula biológicamente activa, haciendo reaccionar el derivado de ácido carboxílico con un grupo funcional en la molécula, como se ha descrito anteriormente.
En una realización, el poli(etilenglicol) es lineal y está terminado en un extremo con el grupo funcional Y y en el otro extremo con otro grupo funcional Y o con un grupo de protección terminal, tal como un grupo metoxi. El peso molecular del PEG está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 100 kDa, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 300 Da a aproximadamente 40, 50, o 60 kDa. En otras realizaciones, el PEG está ramificado, en forma de horquilla o multi-brazo, como se describe adicionalmente más adelante.
La invención proporciona adicionalmente una mejora en un método de preparación de un derivado de ácido carboxílico activado de un poli(etilenglicol) (PEG), por reacción con un reactivo de éster terciario R(C=O)OR', donde R' es un grupo alquilo terciario y R comprende un grupo funcional X, con un polímero PEG-Y, donde Y es un grupo funcional que reacciona con X para formar un enlace covalente, para formar un éster terciario de PEG. La mejora comprende tratar el éster terciario de PEG con una base fuerte, preferiblemente un hidróxido de metal alcalino, en solución acuosa, para formar una sal carboxilato de PEG. La base fuerte es preferiblemente una que es eficaz para producir un pH de reacción de aproximadamente 11 a 13 en la solución acuosa.
El método mejorado comprende adicionalmente tratar la sal carboxilato de PEG con un ácido inorgánico en solución acuosa, para convertir la sal carboxilato en un ácido carboxílico, formando de esta manera un ácido PEG carboxílico. El ácido inorgánico es preferiblemente un ácido mineral seleccionado entre el grupo que consiste en ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y ácido clorhídrico. La derivatizacion adicional se realiza como se ha descrito anteriormente.
Estos y otros objetos y características de la invención resultarán totalmente evidentes cuando la siguiente descripción detallada de la invención se lea junto con los dibujos incluidos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora más completamente. Esta invención, sin embargo, puede realizarse de muchas formas diferentes y no debe considerarse limitada a las realizaciones expuestas en este documento; en lugar de ello, estas realizaciones se proporcionan para que esta descripción sea minuciosa y completa, y transmitirá totalmente el alcance de la invención a aquellos expertos en la materia. La invención no se limita a los polímeros, técnicas sintéticas, agentes activos particulares y similares expuestos en esa descripción, puesto que pueden variar dentro del alcance de la invención como se realiza mediante las reivindicaciones adjuntas. La terminología usada en este documento es para describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante.
I. Definiciones
Para describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones descritas a continuación.
Como se usa en esta memoria descriptiva, las formas singulares "un", "una", y "el", "la", incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto claramente dicte otra cosa.
Como se usa en este documento, "no peptídico" se refiere a un polímero sustancialmente libre de uniones peptídicas. Sin embargo, el polímero puede incluir un número minoritario de uniones peptídicas espaciadas a lo largo de la longitud de la estructura básica, tal como por ejemplo, no más de aproximadamente una unión peptídica por aproximadamente 50 unidades monoméricas.
"PEG" o "polietilenglicol", como se usa en este documento, pretende abarcar cualquier poli(óxido de etileno) soluble en agua. Típicamente, los PEG para uso en la presente invención comprenderán una de las dos estructuras siguientes: -O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}- o -CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-CH_{2}CH_{2}-, donde m es generalmente de 3 a aproximadamente 3000. En un sentido más amplio, "PEG" puede referirse a un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50% de subunidades que son -CH_{2}CH_{2}O-.
Los grupos terminales y la arquitectura del PEG global pueden variar. El PEG puede contener un grupo de protección terminal en un oxígeno terminal que generalmente es un grupo que contiene carbono, típicamente compuesto por 1-20 carbonos y preferiblemente seleccionado entre alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, heterociclo, y forma sustituidas de cualquiera de los anteriores. El grupo de protección terminal puede ser también un silano. Los grupos de protección terminal más preferidos son alquilo (alcoxi) o aralquilo(aralcoxi), tales como metilo, etilo o bencilo.
El grupo de protección terminal puede comprender también ventajosamente un marcador detectable. Dichos marcadores incluyen, sin limitación, fluorescentes, quimioluminiscentes, restos usados en marcado enzimático, colorimétricos (por ejemplo, tintes), iones metálicos, restos radiactivos y similares.
El otro extremo ("no protegido terminalmente") es típicamente un grupo hidroxilo, amina o grupo activado que puede estar sometido a modificación química adicional.
Las formas de PEG específicas para uso en la invención incluyen PEG que tienen diversos pesos moleculares, estructuras o geometrías (por ejemplo, ramificada, lineal, en horquilla o multi-brazo).
Un polímero "multifuncional" tiene 3 o más grupos funcionales, que pueden ser iguales o diferentes. Los polímeros multifuncionales típicamente contendrán aproximadamente 3-100 grupos funcionales o 3-50 grupos funcionales o 3-25 grupos funcionales o 3-15 grupos funcionales o de 3 a 10 grupos funcionales o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales.
Un polímero "difuncional" tiene dos grupos funcionales contenidos en su interior, que pueden ser iguales (es decir, homodifuncional) o diferentes (es decir, heterodifuncional).
"Masa molecular" o "peso molecular" se refiere a la masa molecular promedio de un polímero, determinada típicamente por cromatografía de exclusión de tamaño, técnicas de dispersión de luz o determinación de la velocidad intrínseca en 1,2,4-triclorobenceno. A menos que se indique otra cosa, el peso molecular se expresa en este documento como peso molecular promedio en número (M_{n}), que se defina, como \SigmaNiMi/\SigmaNi, en la que Ni es el número de moléculas de polímero (o el número de moles de estas moléculas) que tienen un peso molecular Mi.
Los polímeros de la invención, o empleados en la invención, son típicamente polidispersos, es decir, el peso molecular promedio en número y el peso molecular promedio en peso de los polímeros no es igual. Los valores de polidispersidad, expresados como una proporción del peso molecular promedio en peso (Pm) al peso molecular promedio en número (Mn), (Pm/Mn), son generalmente bajos; es decir, menos de aproximadamente 1,2, preferiblemente menos de aproximadamente 1,15, más preferiblemente menor de aproximadamente 1,10, aún más preferiblemente menor de aproximadamente 1,05, aún todavía más preferiblemente menor de aproximadamente 1,03 y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 1,025.
Un "ácido carboxílico activado" se refiere a un derivado funcional de un ácido carboxílico que es más reactivo que el ácido carboxílico precursor, particularmente con respecto al ataque nucleófilo. Los ácidos carboxílicos activados incluyen, aunque sin limitación, haluros de ácido (tales como cloruros de ácido), anhídridos y ésteres.
Más generalmente, el término "activado" o "reactivo", cuando se usa junto con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula, en contraste con los grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción poco prácticas para reaccionar (es decir, grupos "no reactivos" o "inertes").
La expresión "grupo de protección" o "grupo protector" se refiere a un resto que evita o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula en ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege, así como de las condiciones de reacción a emplear y la presencia de grupos reactivos o protectores adicionales en la molécula, si los hubiera. Los grupos protectores conocidos en la técnica pueden encontrarse en Green, T. W., et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3ª ed., John Wiley & Sons, Nueva York, NY (1999). Como se usa en este documento, la expresión "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo pretende abarcar formas protegidas de los mismos.
El término "espaciador" o "resto espaciador" se usa en este documento para hacer referencia a un átomo o grupo de átomos usados para unir restos interconectados tales como un extremo de una parte del polímero soluble en agua y un electrófilo. Un espaciador típico incluye enlaces seleccionados entre alquileno (carbono-carbono), éter, amino, amida, éster, carbamato, urea y ceto, y combinaciones de los mismos. Un espaciador puede incluir restos alquileno cortos que alternan con o están flanqueados por uno o más tipos de las uniones que contienen heteroátomos listadas anteriormente. Diversos ejemplos incluyen: -CH_{2}OCH_{2}CH_{2}CH_{2}- -CH_{2}C(O)NHCH_{2,}, -C(O)OCH_{2}-, -OC(O)NHCH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH_{2}NHCH_{2}, -CH_{2}CH_{2}C(O)CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH_{2}CH_{2}C(O)NHCH_{2}CH_{2}NH-, y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}C(O)NHCH_{2}CH_{2}NHC(O)CH_{2}CH_{2}-. Los restos espaciadores de la invención pueden ser hidrolíticamente estables o pueden incluir una unión fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable (por ejemplo, una unión éster).
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que típicamente variará de aproximadamente 1 a 20 átomos de longitud. Dichas cadenas de hidrocarburo preferiblemente, aunque no necesariamente, son saturadas y pueden estar ramificadas o preferiblemente ser lineales (no ramificadas). Los grupos alquilo ejemplares incluyen etilo, propilo, butilo, pentilo, 2-metilbutilo, 2-metilpropilo (isobutilo), 3-metilpentilo, y similares. Como se usa en este documento, "alquilo" incluye cicloalquilo cuando hace referencia a tres o más átomos de carbono.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, como se ejemplifica mediante metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclica, saturada o insaturada, que incluye compuestos enlazados, condensados o espirocíclicos, preferiblemente constituidos por 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente de 3 a aproximadamente 8.
Como se usa en este documento, "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado que tiene de 2 a 15 átomos de carbono y que contiene al menos un doble enlace, tal como etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-butenilo, isobutenilo, octenilo, decenilo, tetradecenilo, y similares.
El término "alquinilo" como se usa en este documento, se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado que tiene de 2 a 15 átomos y que contiene al menos un triple enlace, tal como etinilo, n-propinilo, isopentinilo, n-butinilo, octinilo, decinilo, y similares.
"Alcoxi" se refiere a un grupo -OR, en el que R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo C1-C20 (pro ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, etc.), más preferiblemente alquilo inferior (es decir, C1-C6).
"Arilo" se refiere a un radical aromático monovalente, sustituido o no sustituido, que tiene un solo anillo (por ejemplo, fenilo) o dos anillos condensados o fundidos (por ejemplo, naftilo). Múltiples anillos de arilo pueden estar no condensados (por ejemplo, bifenilo). El término incluye grupos heteroarilo que son grupos de anillo aromático que tienen uno o más átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre en el anillo, tales como furilo, pirrol, piridilo e indol.
"Aralquilo" se refiere a un alquilo, preferiblemente alquilo inferior (C_{1}-C_{4}, más preferiblemente C_{1}-C_{2}), sustituyente que está sustituido adicionalmente con un grupo arilo; los ejemplos son bencilo y fenetilo. "Aralcoxi" se refiere a un grupo de forma -OR donde R es aralquilo; un ejemplo es benciloxi.
Un "heterociclo" se refiere a un anillo, preferiblemente un anillo de 5 a 7 miembros, cuyos átomos del anillo se seleccionan entre el grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre. Preferiblemente, los átomos del anillo incluyen de 3 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos de heterociclos aromáticos (heteroarilo) se han dado anteriormente; los heterociclos no aromáticos incluyen, por ejemplo, pirrolidina, piperidina, piperazina y morfolina.
Un grupo o resto "sustituido" es uno en el que un átomo de hidrógeno se ha sustituido por un átomo o grupo distinto de hidrógeno, que es preferiblemente un sustituyente no interferente.
"Los sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, típicamente no son reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula. Estos incluyen, aunque sin limitación, alquilo inferior, alquenilo o alquinilo; alcoxi inferior; cicloalquilo C3-C6; halo, por ejemplo, flúor, cromo, bromo o yodo; ciano; oxo (ceto); nitro y fenilo.
Un "grupo terciario" es un grupo de la forma -CR_{3}, donde cada R es un resto orgánico unido a C mediante un átomo de carbono. Cada R puede ser, por ejemplo, alquilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo sustituido o no sustituido. Los ejemplos de grupos terciarios incluyen t-butilo, donde cada R es metilo; trifenilmetilo (tritilo), donde cada R es fenilo; y dimetoxitritilo (DMT), donde dos R son p-metoxifenilo y uno es fenilo. Se incluyen también grupos donde uno o más R forman un anillo o sistema de anillos, tal como adamantilo.
Un "éster terciario" es un éster que tiene un grupo terciario como su parte alcohol, es decir, R'-(C=O)-OCR_{3}, donde CR_{3} es un "grupo terciario" como se ha definido anteriormente, y R' es la parte ácido del éster.
Un "grupo carboxilo", como se usa en este documento, se refiere al grupo -C(=O)OH (ácido carboxílico) o -C(=O)O^{-}M^{+}, donde M^{+} es un ión cargado positivamente, tal como un ión de metal alcalino (grupo carboxilato).
Un ácido orgánico "de bajo peso molecular" se refiere a un compuesto orgánico ácido que tiene un peso molecular menor de aproximadamente 400, preferiblemente menor de aproximadamente 300, y más preferiblemente menor de aproximadamente 200. El término se refiere típicamente a un ácido no polimérico y no oligomérico y, generalmente, se refiere a un ácido usado como un reactivo. Los ejemplos incluyen ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético (TFA), y ácido p-toluenosulfónico.
Un "electrófilo" es un átomo o grupo de átomos que tienen un centro electrófilo, es decir, un centro que busca electrones o es capaz de reaccionar con un nucleófilo.
Un "nucleófilo" se refiere a un átomo o un grupo de átomos que tiene un centro nucleófilo, es decir, un centro que busca un centro electrófilo o que es capaz de reaccionar con un electrófilo.
Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace relativamente débil que reacciona con agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiológicas.
La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no sólo del tipo general de unión que conecta dos átomos centrales sino también de los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Las uniones hidrolíticamente inestables o débiles apropiadas incluyen, aunque sin limitación, carboxilato éster, fosfato éster, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquilo éter, iminas y ortoésteres.
Una "unión enzimáticamente degradable" es una unión que está sometida a degradación por una o más enzimas.
Una unión o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua; es decir, no experimenta hidrólisis en condiciones fisiológicas en ninguna extensión apreciable durante un periodo de tiempo prolongado. Generalmente, una unión hidrolíticamente estable es una que presenta una velocidad de hidrólisis de menos de aproximadamente un 1-2% por día en condiciones fisiológicas. Los ejemplos de uniones hidrolíticamente estables incluyen enlaces carbono-carbono, éteres, aminas y amidas. Las velocidades de hidrólisis de los enlaces químicos representativos pueden encontrarse en la mayoría de libros de texto de química convencionales.
Un producto que contiene "prácticamente ninguna cantidad" de un componente especificado no contiene ninguna cantidad del componente especificado o contiene una cantidad que es indetectable por métodos convencionales de análisis del producto, y/o tiene un efecto no detectable sobre las propiedades o estabilidad del producto. Por ejemplo, un producto que nunca se ha expuesto de forma conocida o deliberada o se ha puesto en contacto con una sustancia particular se considerará que no contiene prácticamente ninguna cantidad de la sustancia.
Cada uno de los términos "fármaco", "molécula biológicamente activa", "resto biológicamente activo" y "agente biológicamente activo", cuando se usan en este documento, se refieren a cualquier sustancia que puede afectar a cualquier propiedad física o bioquímica de un organismo biológico, donde el organismo puede seleccionarse entre virus, bacterias, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, como se usa en este documento, las moléculas biológicamente activas incluyen cualquier sustancia pretendida para diagnóstico, curación, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad en seres humanos u otros animales, o para potenciar de otra manera el bienestar físico o mental de seres humanos o animales. Los ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, aunque sin limitación, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, tintes, lípidos, nucleósidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuadas para usar con la invención incluyen, aunque sin limitación, antibióticos, fungicidas, agentes anti-víricos, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-tumorales, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroideos y similares. También se incluyen alimentos, complementos alimentarios, nutrientes, nutracéuticos, fármacos, vacunas, anticuerpos, vitaminas y otros agentes beneficiosos.
El término conjugado se refiere a una entidad formada como resultado de una unión covalente de una molécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa a una molécula de polímero reactivo, preferiblemente un poli(etilengilcol).
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede incluirse en las composiciones de la invención y que no provoca efectos toxicológicos adversos significativos a un paciente.
"Cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad fisiológicamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se usan en este documento para hacer referencia a la cantidad de conjugado de agente polimérico activo presente en una preparación farmacéutica que es necesaria para proporcionar un nivel deseado de agente activo y/o conjugado a la corriente sanguínea o en el tejido diana. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el agente activo particular, los componentes y las característica físicas de la preparación farmacéutica, la población de pacientes pretendida, las consideraciones del paciente y similares y puede determinarla fácilmente un experto en la materia, basándose en la información proporcionada en este documento y disponible en la bibliografía pertinente.
El término "paciente" se refiere a un organismo vivo que padece o es susceptible de padecer una afección que puede evitarse o tratarse por administración de un agente biológicamente activo o conjugado del mismo e incluye tanto seres humanos como animales.
II. Método de Preparación de Polímeros Funcionalizados con Ácido Carboxílico A. Visión de conjunto
La presente invención proporciona, en un aspecto, un método de preparación de un derivado de ácido carboxílico activado de un polímero no peptídico, soluble en agua. El método implica hacer reaccionar un reactivo de éster terciario R(C=O)OR', donde R' es un grupo terciario, como se ha definido anteriormente, R incluye un grupo funcional X, con un polímero no peptídico, soluble en agua, POLI-Y, donde Y es un grupo funcional que reacciona con X para formar un enlace covalente, para formar un éster terciario del polímero, que puede representarse como POLI-R(C=O) OR'. La naturaleza de la unión entre POLI y R depende de los grupos funcionales Y y X.
El material de partida de la reacción, representado por POLI-Y o PBG-Y cuando el polímero es un polietilenglicol, puede incluir más de un grupo funcional Y en diversas configuraciones. Los ejemplos incluyen PEG lineales, ramificados y multi-brazo, que contienen múltiples grupos hidroxilo, como se analiza más adelante adicionalmente. El producto de la reacción, es decir, el polímero funcionalizado con carboxilo contiene un número de grupos carboxilo que es igual al número de grupos funcionales Y en el material de partida (o mayor que Y, si el material de partida tiene grupos carboxilo existentes).
Preferiblemente, el grupo funcional Y del polímero es un grupo hidroxilo o el grupo nucleófilo y el grupo funcional X del reactivo de éster terciario es un grupo saliente capaz de ser desplazado por Y. Otras posibles combinaciones de grupos funcionales se describen más adelante.
Una vez que el grupo éster terciario se fija al polímero, se convierte en un carboxilato por hidrólisis con base en solución acuosa, que va seguido preferiblemente de acidificación para producir el ácido carboxílico. Sorprendentemente, se ha encontrado que el éster terciario, aunque es estable en presencia de la base usada en la reacción de sustitución nucleófila inicial puede retirarse mediante hidrólisis promovida con base. Como se ha indicado anteriormente, los ésteres de alquilo terciario tales como t-butil ésteres, convencionalmente son resistentes a hidrólisis con base.
El esquema de reacción general a continuación representa una realización preferida del método de la invención, donde Y es hidroxilo y X es el grupo saliente, y el reactivo de éster tiene la estructura mostrada como (I).
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B. Componentes de Reacción
En el reactivo de éster preferido (I), cada uno de R^{1} y R^{2} se selecciona independientemente entre H, alquilo inferior, cicloalquilo, alcoxi, arilo, aralquilo, y heterociclo; y cada uno de R^{3}-R^{5} se selecciona independientemente entre alquilo inferior, arilo, y aralquilo, cada uno como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, el grupo
(CR^{1}R^{2})_{n} no incluye dos heteroátomos unidos al mismo átomo de carbono; por ejemplo, R^{1} y R^{2} en el mismo átomo de carbono preferiblemente no son ambos alcoxi. Cualquiera de R^{1} a R^{5}, excepto hidrógeno, puede estar sustituido con un sustituyente no interferente, como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente, cada uno de R^{1} y R^{2} es independientemente hidrógeno o alquilo inferior no sustituido y cada uno R^{3} a R^{5} es independientemente alquilo inferior no sustituido o fenilo. En las realizaciones seleccionadas, cada R^{1} y R^{2} es independientemente hidrógeno o metilo, más preferiblemente hidrógeno y cada uno de R^{3} a R^{5} es independientemente metilo, etilo o fenilo.
La variable n es de 1 a aproximadamente 24, preferiblemente de 1 a aproximadamente 12. En las realizaciones seleccionadas n es 1 ó 2, de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 1 a 6, de 1 a 7, de 1 a 8, de 1 a 9, de 1 a 11, de 1 a 12, de 1 a 13, de 1 a 14, de 1 a 15, de 1 a 16, de 1 a 17, de 1 a 18, de 1 a 19, de 1 a 20, de 1 a 21, de 1 a 22, de 1 a 23, o de 1 a 24. En otras realizaciones seleccionadas, n es de 1 a 6; preferiblemente, n es de 1 a 4; y más preferiblemente, n es 1 ó 2. Cuando n es mayor de 1, el resto -(CR^{1}R_{2})_{n}- preferiblemente incluye como máximo dos y, más preferiblemente, como máximo una, realización distinta de hidrógeno de R^{1} y R^{2.}
En realizaciones adicionales, n es 1 y R^{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno o metilo. En una de dichas realizaciones, cuando R^{1} y R^{2} son hidrógeno, el producto (IV) contiene un grupo carboximetilo.
Preferiblemente, el grupo funcional X en el reactivo de éster (II) es un grupo saliente, tal como halo, por ejemplo, cloro o bromo, o un sulfonato éster, tal como p-toluenosulfonilo (tosilo), metanosulfonilo (mesilo), trifluorosulfonilo, o trifluoroetilsulfonilo (tresilo). Sin embargo, podrían usarse también otros grupos funcionales capaces de reaccionar con un grupo funcional en el polímero, para formar una unión covalente. Preferiblemente, el grupo funcional en el polímero es un grupo nucleófilo, tal como amina, hidrazida (-C(=O)NHNH_{2}), o tiol, y el grupo funcional X en el reactivo de éster es un grupo electrófilo. Además de los grupos salientes tales como aquellos descritos anteriormente, los grupos electrófilos incluyen éster carboxílico, incluyendo éster de imida, ortoéster, carbonato, isocianato, isotiocianato, aldehído, cetona, tiona, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, maleimida, disulfuro, yodo, epoxi, tiosulfonato, silano, alcoxisilano, halosilano, y fosforamidato. Los ejemplos más específicos de estos grupos incluyen succinimidil éster o carbonato, imidazolil éster o carbonato, benzotriazol éster o carbonato, p-nitrofenil carbonato, vinil sulfona, cloroetilsulfona, vinilpiridina, piridil disulfuro, yodoacetamida, glioxal y diona. También se incluyen otros derivados de ácido carboxílico activados, así como hidratos o derivados protegidos de cualquiera de los restos anteriores (por ejemplo, aldehído hidrato, hemiacetal, acetal, cetona hidrato, hemicetal, cetal, tiocetal, tioacetal). Los grupos electrófilos preferidos incluyen succinimidil carbonato, succinimidil éster, maleimida, benzotriazol carbonato, glicidil éter, imidazolil éster, p-nitrofenil carbonato, acrilato, aldehído y ortopiridil disulfuro.
En general, el grupo funcional X en el reactivo se elige de manera que reacciona con el grupo funcional Y en el polímero mucho más fácilmente que el grupo funcional Y reaccionaría con la parte t-butil éster del reactivo. Cuando el grupo funcional polimérico Y es un nucleófilo, tal como hidroxilo, X es más adecuadamente un buen grupo saliente tal como halo o sulfonato éster.
Los reactivos de éster particularmente preferidos incluyen haloacetatos de t-butilo, tales como bromoacetato de t-butilo, cloroacetato de t-butilo y yodoacetato de t-butilo. Dichos haloacetatos de t-butilo están disponibles, por ejemplo, en Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.
En el esquema I, POLI-OH es un polímero no peptídico, soluble en agua, tal como por ejemplo, mPEG-OH. En general, el polímero puede ser cualquier polímero no peptídico, soluble en agua que tiene cualquier configuración geométrica disponible (por ejemplo, lineal, ramificada, en horquilla, etc.), como se analiza adicionalmente más adelante. Por simplicidad, el esquema de reacción dado anteriormente utiliza un polímero con un solo grupo hidroxilo. Sin embargo, como apreciará un experto habitual en la materia, el polímero puede comprender más de un grupo hidroxilo, tal como de 1 a aproximadamente 25 grupos hidroxilos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más grupos hidroxilo). También, el grupo hidroxilo podría sustituirse por cualquier grupo funcional nucleófilo reactivo con el grupo funcional X en el reactivo de éster terciario. Dichos grupos funcionales nucleófilos incluyen tioles, aminas y carbaniones estabilizados.
C. Proceso de Reacción
Para la primera fase del proceso, mostrada en la línea superior del esquema ejemplar I anterior, los componentes se disuelven preferiblemente en un disolvente orgánico adecuado, tal como el t-butanol, benceno, tolueno, xilenos, tetrahidrofurano (THF), dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) y similares.
Como se muestra en la realización de la invención representada por el esquema I, la reacción de un grupo hidroxilo polimérico con el reactivo de éster terciario típicamente se realiza en presencia de una base. Las bases ejemplares incluyen t-butóxido potásico, butillitio, amida sódica e hidruro sódico. Pueden usarse también otras bases fuertes.
La reacción típicamente se realiza a una temperatura de aproximadamente 0-120ºC, preferiblemente aproximadamente 20-80ºC, más preferiblemente aproximadamente 25-50ºC aunque las condiciones de reacción variarán basándose en el polímero y los grupos funcionales que reaccionan. Como se muestra en los ejemplos proporcionados más adelante, las reacciones de los PEG que contienen hidroxi con bromoacetato de t-butilo se realizaron eficazmente a temperaturas entre temperatura ambiente y aproximadamente 45ºC.
El tiempo de reacción es típicamente de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 24 horas; por ejemplo, de aproximadamente 1 a 20, de 3 a 18, de 4 a 12 ó de 6 a 8 horas. Los tiempos de reacción típicos para la reacción de un polímero hidroxilado con bromoacetato de t-butilo, como se muestra en los ejemplos a continuación, están en el intervalo de 12 a 20 horas. La reacción puede controlarse para saber si se ha completado de acuerdo con métodos convencionales. Preferiblemente, la reacción se realiza en una atmósfera inerte, tal como nitrógeno o argón.
La reacción preferiblemente emplea un exceso molar de reactivo de éster (por ejemplo, un exceso molar de dos veces, tres veces, 6 veces, 10 veces ó 20 veces, hasta aproximadamente 30 veces), para asegurar que se ha conseguido la conversión completa del material de partida polimérico. Después de esta fase de la reacción, el disolvente orgánico se retira, típicamente por evaporación o destilación.
El producto que contiene éster (III) se disuelve en agua, preferiblemente agua destilada o desionizada, para la segunda fase del proceso, en la que el polímero que contiene éster se somete a hidrólisis promovida por base por tratamiento con una base fuerte, tal como hidróxido, en solución acusa. La hidrólisis con base típicamente se realiza a un pH de aproximadamente 9 o superior, preferiblemente de aproximadamente 10 o superior, y más preferiblemente de aproximadamente 11 o superior (por ejemplo, aproximadamente 11 a aproximadamente 13). Por consiguiente, la base es una que es suficientemente fuerte para producir un pH en este intervalo en solución acuosa. En una realización, el pH se ajusta para que esté en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 12,5. Preferiblemente, la base se añade según sea necesario a lo largo de la reacción para mantener el pH en este intervalo. La base también es eficaz para hidrolizar cualquier reactivo de éster restante.
La base debería producir una sal altamente soluble en agua cuando se neutraliza con ácido en la etapa posterior a la hidrólisis. Se prefieren hidróxidos de metal alcalino, tales como hidróxido sódico (NaOH) o hidróxido potásico (KOH).
El uso de agua destilada o desionizada o agua que no tiene niveles detectable de cationes divalentes tales como iones calcio y magnesio se prefiere también. La etapa de hidrólisis básica se realiza típicamente a una temperatura de aproximadamente 0-50ºC, preferiblemente aproximadamente 10-30ºC. El tiempo de reacción es típicamente de aproximadamente 12 a 36 horas, por ejemplo, aproximadamente 18 a 24 horas.
La sal carboxilato del polímero producida mediante la hidrólisis básica puede aislarse y almacenarse en forma de sal o, preferiblemente, se convierte directamente en el ácido carboxílico por tratamiento con ácido como se describe más adelante. Generalmente, el ácido carboxílico es más adecuado para derivatización adicional que la sal carboxilato.
El polímero que contiene carboxilato se trata con ácido acuso para convertir la sal en la forma ácido libre. El ácido es preferiblemente uno que produce un anión no nucleófilo en solución acuosa. Se prefieren los ácidos minerales (es decir, ácidos inorgánicos) tales como ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido clorhídrico y similares. Típicamente, se añade suficiente ácido para ajustar el pH de la solución a aproximadamente 1-3, más preferiblemente aproximadamente 2-3, que es eficaz para convertir la sal carboxilato del polímero en una forma ácido libre, así como para neutralizar (convertir en una sal soluble en agua libremente) cualquier base restante en solución. La etapa de acidificación se realiza típicamente a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, preferiblemente de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 30ºC.
El polímero que contiene el ácido carboxílico se separa después usando una etapa de extracción orgánica convencional, preferiblemente empleando un disolvente halogenado tal como diclorometano o cloroformo. El producto polimérico se extrae en la fase orgánica, mientras que cualquier reactivo hidrolizado y exceso de ácido mineral o su sal permanece en la fase acuosa. De esta manera, la separación del ácido mineral del producto polimérico es relativamente sencilla.
El extracto orgánico se seca y se concentra, y el producto polimérico se purifica después usando métodos convencionales. Por ejemplo, el polímero puede aislarse por precipitación, seguido de filtración y secado. La elección del disolvente de precipitación dependerá de la naturaleza del polímero; para polímeros de PEG, como se describe en los ejemplos a continuación, el éter etílico es un disolvente de precipitación adecuado. Puede usarse también la recristalización en disolventes tales como acetato de etilo o etanol para la purificación.
D. Productos de Reacción
Usando el método de la invención, se producen polímeros funcionalizados con carboxilo con una alta pureza, típicamente con una pureza de al menos aproximadamente el 95%, preferiblemente al menos aproximadamente el 96%, 97% ó 98%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 99,5% en peso. En realizaciones seleccionadas, el producto polimérico contiene al menos aproximadamente el 99,6%, 99,7%, 99,8% ó 99,9% en peso del polímero funcionalizado con carboxilo deseado. Por consiguiente, el producto del método sintético descrito en este documento contiene menos del 5%, preferiblemente menos del 4%, 3%, 2%, más preferiblemente menos del 1% y aun más preferiblemente menos del 0,5% en peso del polímero de partida (por ejemplo, mPEG-OH, PEG diol, o PEG poliol multifuncional) o cualquier impureza polimérica. En realizaciones seleccionadas, el producto contiene menos del 0,4%, 0,3%, 0,2% o 0,1% en peso del material de partida polimérico (por ejemplo, mPEG-OH) u otras impurezas poliméricas.
Por "producto" o "producto polimérico" se entiende el material obtenido al realizar el proceso sintético descrito anteriormente, que incluye procedimientos de tratamiento rutinario tales como extracción, precipitación y retirada de disolvente. Como se muestra en los Ejemplos a continuación, las mezclas de reacción que contienen los productos de los métodos descritos en este documento se trataron por extracción con un disolvente clorado, seguido de precipitación del producto en éter etílico. El análisis cromatográfico de intercambio de iones de estos productos mostraba básicamente un 100% del producto de ácido PEG-carboxílico deseado, sin una cantidad detectable de material de partida y otra impureza polimérica presente. Por consiguiente, los productos poliméricos que tienen las purezas descritas anteriormente se obtienen sin necesidad de retirar las impurezas poliméricas tales como el material de partida. Estos productos pueden usarse a menudo directamente para derivatización adicional y/o conjugación, como se describe más adelante. Una ventaja adicional de este proceso es que proporciona una alta pureza de los ácidos carboxílicos poliméricos, tales como ácidos mPEG-carboxílicos, partiendo de materiales de partida baratos tales como mPEG-OH en contraste con el uso de ácidos carboxílicos poliméricos disponibles en el mercado, que tienden a ser caros y frecuentemente contienen también cantidades residuales del compuesto de hidroxilo polimérico.
Como se ha descrito anteriormente, los reactivos empleados en el proceso sintético descrito en este documento se retiran fácilmente del producto polimérico. En particular, no se usan ácidos orgánicos de bajo peso molecular tales como TFA en el proceso. Por consiguiente, los productos poliméricos contienen carboxilo de esta invención no contienen cantidades traza de ácidos orgánicos de bajo peso molecular, tales como TFA, como ocurriría habitualmente en los ácidos carboxílicos poliméricos preparados usando un proceso de hidrólisis que emplea dicho reactivo. Los presentes productos, por lo tanto, no sufren la desventaja de una estabilidad reducida asociada con la presencia de ácidos residuales como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el polímero descrito en el Ejemplo 4 a continuación no mostraba signos de degradación (por análisis GPC) después de 8 meses de almacenamiento a -20ºC.
III. Polímeros no Peptídicos, Solubles en Agua, Adecuados
Cualquiera de una diversidad de polímeros solubles en agua, no peptídicos, puede usarse en la presente invención. El polímero debería ser no toxico y biocompatible, lo que significa que es capaz de coexistir con tejidos y organismos vivos sin provocarles daño. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, aunque sin limitación, poli(alquilenglicoles), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ácido \alpha-hidroxiacético), poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolinas, poli(N-acriloilmorfolina), tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.629.384, y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos.
El peso molecular del polímero variará dependiendo de la aplicación deseada, la configuración de la estructura de los polímeros, el grado de ramificación y similares. Generalmente, los polímeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 100.000 Da son útiles en la presente invención, preferiblemente de aproximadamente 200 Da a aproximadamente 60.000 Da y, más preferiblemente, de aproximadamente 300 Da a aproximadamente 40.000 Da. Las realizaciones de polímeros ejemplares tienen un peso molecular de aproximadamente 200 Da, 350 Da, 550 Da, 750 Da, 1.000 Da, 2.000 Da, 3.000 Da, 4.000 Da, 5.000 Da, 7.500 Da, 10.000 Da, 15.000 Da, 20.000 Da, 25.000 Da, 30.000 Da, 35.000 Da, 40.000 Da, 50.000 Da, 55.000 Da y 60.000 Da.
El polímero preferiblemente comprende al menos un grupo hidroxilo, capaz de reaccionar con un reactivo de éster terciario que lleva un grupo saliente, como se ha descrito en este documento, en una reacción de sustitución nucleófila. Sin embargo, podrían usarse también otros grupos funcionales capaces de reaccionar con un grupo funcional del reactivo de éster terciario. Estos incluyen otros grupos nucleófilos, tales como amina, hidrazida (-C(=O)NHNH_{2}), y tiol; y grupos electrófilos tales como éster carboxílico, y éster de imida, ortoéster, carbonato, isocianato, isotiocianato, aldehído, cetona, tiona, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, maleimida, disulfuro, yodo, epoxi, sulfonato, tiosulfonato, silano, alcoxisilano, halosilano y fosforamidato. Los ejemplos más específicos de estos grupos incluyen succinimidil éster o carbonato, imidazolil éster o carbonato, benzotriazol éster o carbonato, p-nitrofenil carbonato, vinil sulfona, cloroetil sulfona, vinilpiridina, piridil disulfuro, yodoacetamida, glioxal, diona, mesilato, tosilato y tresilato. Se incluyen también otros derivados de ácido carboxílico activados, así como hidratos o derivados protegidos de cualquiera de los restos anteriores (por ejemplo, aldehído hidrato, hemiacetal, acetal, cetona hidrato, hemicetal, cetal, tiocetal, tioacetal). Los grupos electrófilos preferidos incluyen succinimidil carbonato, succinimidil éster, maleimida, benzotriazol carbonato, glicidil éter, imidazolil éster, p-nitrofenil carbonato, acrilato, tresilato, aldehído y ortopiridil disulfuro.
Los grupos funcionales se seleccionan de manera que un grupo nucleófilo en el polímero reacciona con un grupo electrófilo en el reactivo de éster terciario o viceversa. La reacción entre los dos grupos funcionales es preferiblemente una reacción de desplazamiento de un grupo saliente mediante un nucleófilo, aunque también puede ser una reacción de condensación o adición.
El polímero preferiblemente comprende al menos un grupo nucleófilo, tal como un grupo hidroxilo. Para facilitar la referencia, los grupos hidroxilo se analizan más adelante, aunque podrían usarse otros grupos funcionales. Un polímero puede incluir también diferentes grupos funcionales dentro de la misma molécula. Preferiblemente, estos tienen una funcionalidad similar, por ejemplo, tanto nucleófila, tal como un grupo hidroxilo y un grupo amino.
Preferiblemente, el polímero es un polímero de poli(etilenglicol) (es decir, PEG). Como se ha indicado anteriormente, el término PEG incluye poli(etilenglicol) en cualquiera de sus numerosas geometrías o formas, incluyendo formas lineales, formas ramificadas o multi-brazo (por ejemplo, PEG de horquilla o PEG unido a un núcleo de poliol), PEG colgante o PEG con uniones degradables en su interior.
El número y posición de los grupos hidroxilo (y/o otros grupos funcionales) llevados por el polímero puede variar. Típicamente, el polímero comprende de 1 a aproximadamente grupo 25 grupos hidroxilo, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos hidroxilo. Los polímeros lineales, tales como polímeros de PEG lineales, típicamente comprenden uno o dos grupos hidroxilo, cada uno situado en un extremo de la cadena de polímero. El polímero de PEG es monofuncional (es decir, mPEG), el polímero incluye un solo grupo hidroxilo. Si el polímero de PEG es difuncional, el polímero contiene dos grupos hidroxilo, uno en cada extremo de la cadena polimérica, o contiene un solo grupo hidroxilo y un grupo funcional diferente en el extremo opuesto. Los polímeros multi-brazo o ramificados pueden comprender un mayor número de grupos hidroxilo.
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Las moléculas de PEG multi-brazo o ramificadas se describen por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.932.462, que se incorpora por referencia a este documento en su totalidad. En términos generales, un polímero multi-brazo o ramificado posee dos o más brazos de polímero que se extienden desde un punto de ramificación central, que preferiblemente comprende una estructura de unión hidrolíticamente estable. Un polímero de PEG ramificado ejemplar es lisina disustituida con metoxi poli(etilenglicol).
En otra realización multi-brazo, el polímero comprende una molécula de núcleo central derivada de un poliol o una poliamina, proporcionando la molécula de núcleo central una pluralidad de sitios de unión adecuados para unir covalentemente los brazos del polímero a la molécula de núcleo para formar una estructura de polímero multi-brazo. Dependiendo del número deseado de brazos del polímero, el poliol o poliamina típicamente comprenderá de 3 a aproximadamente 25 grupos hidroxilo o amino, preferiblemente de 3 a aproximadamente 10, más preferiblemente de 3 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, u 8).
Los polímeros multi-brazo se describen adicionalmente, por ejemplo, en las solicitudes de Patente de Estados Unidos de cesión común Nº 2002/0156047 y 2002/0156047.
El polímero de PEG puede comprender, como alternativa, un PEG de horquilla. En términos generales, un polímero que tiene una estructura de horquilla se caracteriza por tener una cadena polimérica fijada a dos o más grupos funcionales a través de uniones covalentes que se extienden desde un punto de ramificación hidrolíticamente estable en el polímero. La Patente de Estados Unidos 6.362.254, describe diversas estructuras de PEG de horquilla que pueden usarse en la presente invención.
El polímero de PEG puede ser también una molécula de PEG colgante, que tiene grupos reactivos (por ejemplo, grupos hidroxilo) fijados covalentemente a lo largo de la longitud de la estructura básica de PEG en lugar de en el extremo de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes pueden fijarse a la estructura básica de PEG directamente o a través de un resto de unión, tal como un grupo alquileno.
Pueden incorporarse diferentes polímeros en la misma estructura básica de polímero. Por ejemplo, una o más de las moléculas de PEG en las estructuras ramificadas descritas anteriormente pueden sustituirse con un tipo de polímero diferente.
El polímero puede prepararse también con una o más uniones hidrolíticamente estables o degradables en la estructura básica del polímero. Por ejemplo, el PEG puede prepararse con uniones éster en la estructura básica del polímero que se someten a hidrólisis. Otras uniones hidrolíticamente degradables que pueden incorporarse incluyen carbonato, imina, fosfato, éster, hidrazona, acetal, ortoéster, y uniones fosforamidato.
El término poli(etilenglicol) o PEG incluye cualquiera o todas las variaciones descritas anteriormente. Generalmente, las estructuras de PEG preferidas incluyen PEG multifuncionales lineales, multifuncionales ramificados y difuncionales o trifuncionales lineales, ramificados o en horquilla.
Debido a que los materiales de partida de polietilenglicol protegidos terminalmente, tales como mPEG (metoxi-PEG) o bPEG (benciloxi-PEG), pueden contener cantidades detectables de impureza de PEG diol, que conduce a productos secundarios que a menudo son difíciles de analizar o separar, el material de partida de PEG es, en una realización preferida, un benciloxi-PEG sin diol, como se describe en la Patente de Estados Unidos de cesión común Nº 6.448.369.
IV. Derivatización y Conjugación Adicional de Polímeros Funcionalizados con Ácido Carboxílico A. Visión de conjunto
El polímero funcionalizado con ácido carboxílico preparado por el método descrito anteriormente se ha modificado adicionalmente para formar derivados reactivos útiles de ácidos carboxílicos usando metodología conocida en la técnica. La preparación de dichos derivados se facilita por la alta pureza de los polímeros funcionalizados con ácido carboxílico de la invención, comparado con los productos de la técnica anterior que contienen, por ejemplo, un polímero de material de partida residual y/o reactivos residuales tales como TFA. Esto es un beneficio significativo, particularmente para un producto farmacéutico, ya que la presencia y las cantidades de dichos contaminantes pueden ser altamente variables, conduciendo de esta manera a la irreproducibilidad del producto.
Por consiguiente, el método de la invención en el que se prepara el polímero derivatizado de ácido carboxílico, puede comprender adicionalmente la etapa de conjugar el derivado reactivo con una molécula farmacológicamente pertinente que tiene un grupo funcional reactivo correspondiente. Las etapas pueden realizarse in situ, de manera que el ácido carboxílico se convierte en un derivado activado usando uno de los muchos reactivos activantes conocidos en la técnica, reaccionando después inmediatamente con la molécula a conjugar. El ácido carboxílico se derivatiza para formar, por ejemplo, haluros de acilo, pseudohaluros de acilo, tales como cianuro de acilo, isocianato de acilo y azida de acilo, sales neutras, tales como sales de metal alcalino o metal alcalinotérreo (por ejemplo, sales de calcio, sodio o bario), ésteres, anhídridos, amidas, imidas, hidrazidas, y similares. En una realización preferida, el ácido se esterifica para formar un éster activo, tal como un N-succinimidil éster, o-, m-, o p-nitrofenil éster, 1-benzotriazolil éster, imidazolil éster, o N-sulfosuccinimidil éster.
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En una realización, el polímero derivatizado adicionalmente es un polímero de PEG que tiene la estructura:
(V)mPEG-O-(CR^{1}R^{2})_{n}-C(=O)-Z
en la que R^{1}, R^{2} y n son como se han descrito anteriormente. El resto Z se selecciona preferiblemente entre el grupo que consiste en halo, amino, amino sustituido, -NCO, -NCS, N_{3}, -CN, y -OR',
en la que R' se selecciona entre N-succinimidilo, nitrofenilo, benzotriazolilo, imidazolilo, N-sulfosuccinimidilo, N-ftalimidilo, N-glutarimidilo, N-tetrahidroftalimidilo, N-norborneno-2,3-dicarboximidilo, e hidroxi-7-azabenzotriazolilo.
El derivado reactivo del polímero que contiene carboxilo producido por el método de la invención puede usarse para formar conjugados con moléculas biológicamente activas, particularmente moléculas biológicamente activas que llevan grupos funcionales nucleófilos, tales como grupos amino, hidroxilo, o mercapto (tiol).
Frecuentemente, la molécula a conjugar es una proteína. Las proteínas se conjugan mediante aminoácidos reactivos, tales como lisina, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, tirosina, cisteína, el grupo amino N-terminal y los restos carbohidrato de ácido carboxílico C-terminales en proteínas glucosiladas pueden emplearse también como sitios de conjugación. Para reacción con un ácido carboxílico activado, la mayoría de grupos adecuados son el grupo amino N-terminal, cadenas laterales que contienen amina en lisina, histidina y arginina, cadenas laterales que contienen hidroxilo en serina, treonina, y tirosina, y cadenas laterales tiol en cisteína.
B. Métodos de Conjugación Ejemplares
Dichos conjugados poliméricos pueden formarse usando técnicas conocidas para unión covalente de un polímero activado, tal como un PEG activado a un agente biológicamente activo. Véase, por ejemplo, Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications, J. M. Harris and S. Zalipsky, editores, American Chemical Society, Washington, DC (1997) o Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson, Academic Press (1996). En general, las reacciones de conjugación se realizan típicamente en un tampón, tal como un tampón fosfato o acetato, en o cerca de temperatura ambiente, aunque las condiciones dependerán de la reacción particular realizada. Un exceso del reactivo polimérico típicamente se combina con el agente activo. En algunos casos, sin embargo, se prefiere tener cantidades estequiométricas de los grupos reactivos en el reactivo polimérico y en el agente activo.
El progreso de una reacción de conjugación puede controlarse por SDS-PAGE, espectrometría de masas MALDI-TOF o cualquier otro método analítico adecuado. Una vez que se alcanza una meseta con respecto a la cantidad de conjugado formado o la cantidad de polímero no conjugado restante, se supone que la reacción se ha completado. La mezcla de productos se purifica, si fuera necesario, para separar el exceso de reactivos, los reactantes no conjugados (es decir, agente activo), especies multi-conjugadas no deseadas, y/o el polímero no reaccionado, usando métodos conocidos.
Por ejemplo, los conjugados que tienen diferentes pesos moleculares pueden separarse usando cromatografía de filtración. Las fracciones pueden analizarse mediante numerosos métodos diferentes, por ejemplo, (i) OD a 280 nm para el contenido de proteína, (ii) análisis de proteína BSA, (iii) ensayo de yodo para contenido de PEG (Sims et al., Anal. Biochem. 107: 60-63, 1980), o (iv) SDS-PAGE seguido de tinción con yoduro de bario.
La separación de isómeros posicionales (es decir, conjugados del mismo o prácticamente el mismo peso molecular, que tienen un polímero fijado en diferentes posiciones en una molécula) puede realizarse por HPLC en fase inversa o cromatografía de intercambio de iones.
El producto conjugado puede liofilizarse para almacenamiento con o sin un tampón residual. En algunos casos, es preferible cambiar un tampón usado para conjugación tal como acetato sódico, por un tampón volátil tal como carbonato de amonio o acetato de amonio, que puede retirarse fácilmente durante la liofilización. Como alternativa, una etapa de intercambio de tampón puede usarse usando un tampón de formulación, de manera que el conjugado liofilizado está en una forma adecuada para reconstitución en un tampón de formulación y, finalmente, para administración a un mamífero.
C. Agentes Ejemplares para Conjugación
Un agente biológicamente activo para usarlo en el acoplamiento a un polímero formado por el método de la invención puede ser uno o más cualquiera de los siguientes. Los agentes adecuados pueden seleccionarse por ejemplo, entre hipnóticos y sedantes, activadores psíquicos, tranquilizantes, fármacos respiratorios, anticonvulsivos, relajantes musculares, agentes anti-parkinsonianos (antagonistas de dopaminas), analgésicos, anti-inflamatorios, fármacos anti-ansiedad (ansiolíticos), supresores del apetito, agentes anti-migraña, contractores musculares, anti-infecciosos (antibióticos, antivirales, anti fúngicos, vacunas), antiartríticos, antimalaria, antieméticos, antiepilépticos, broncodilatadores, citoquinas, factores de crecimiento, agentes anticancerosos, agentes antitrombóticos, antihipertensores, fármacos cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes antiasmáticos, agentes hormonales, incluyendo anticonceptivos, simpaticomiméticos, diuréticos, agentes de regulación de lípidos, agentes antiandrogénicos, antiparasitarios, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglucémicos, agentes nutricionales y complementos, complementos de crecimiento, agentes anti-enteritis, vacunas, anticuerpos, agentes de diagnóstico y agentes de contraste.
Más particularmente, el agente activo puede estar en una de sus numerosas clases estructurales incluyendo, aunque sin limitación, pequeñas moléculas, péptidos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, polisacáridos, esteroides, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, grasas, electrolitos y similares. Preferiblemente, un agente activo para el acoplamiento a un polímero que contiene carboxilo de la invención posee un grupo nativo amino, hidroxilo o tiol o está modificado para que contenga al menos uno de estos grupos.
Los ejemplos específicos de agentes activos incluyen, aunque sin limitación, aspariginasa, amdoxovir (DAPD), antida, becaplermin, calcitoninas, cianovirina, denileucina diftitox, eritropoyetina (EPO), agonistas de EPO (por ejemplo, péptidos de aproximadamente 10-40 aminoácidos de longitud y que comprenden una secuencia de núcleo particular, como se describe en el documento WO 96/40749), dornasa alfa, proteína estimulante de eritropoyesis (NESP), factores de coagulación tales como Factor V, Factor VII, Factor VIIa, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor XIII, factor de von Willebrand; ceredasa, cerezima, alfa-glucosidasa, colágeno, ciclosporina, alfa-defensinas, beta-defensinas, exedina-4, factor estimulante de colonia de granulocitos (GCSF), trombopoyetina (TPO), inhibidor de alfa-1 proteinasa, elcatonina, factor estimulante de colonia de macrófagos de granulocitos (GMCSF), fibrinógeno, filgrastim, hormonas del crecimiento, hormonas del crecimiento humanas (hGH), hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH), GRO-beta, anticuerpo GRO-beta, proteínas morfogénicas óseas tales como proteína morfogénica ósea-2, proteína morfogénica ósea-6, OP-1, factor de crecimiento de fibroblasto ácido, factor de crecimiento de fibroblasto básico, ligando CD-40 heparina, albúmina de suero humano, heparina de bajo peso molecular (LMVH), interferones tales como interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, interferón consenso; interleucinas y receptores de interleucinas tales como receptor de interleucina-1, interleucina-2, proteínas de fusión de interleucina-2, antagonista del receptor de interleucina-1, interleucina-3, interleucina-4, receptor de interleucina-4, interleucina-6, interleucina-8, interleucina-12, receptor de interleucina-13, receptor de interleucina-17, lactoferrina y fragmentos de lactoferrina, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), insulina, pro-insulina, análogos de insulina (por ejemplo, insulina monoacilada como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.922.675), amilina, péptido-C, somatostatina, análogos de somatostatina incluyendo octreotida, vasopresina, hormona estimulante del folículo (FSH), vacuna de la gripe, factor de crecimiento similar a insulina (IGF), insulinotropina, factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF), activadores de plasminógeno de alteplasa, uroquinasa, reteplasa, estreptoquinasa, pamiteplasa, lanoteplasa, y teneteplasa; factor de crecimiento nervioso (NGF), osteoprotegerina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento tisular, factor de crecimiento transformante 1, factor de crecimiento endotelial vascular, inhibidor de leucemia, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento glial (GGF), receptores de células T, moléculas de CD/antígenos, factor de necrosis tumoral (TNF), proteína quimioatractora de monocitos 1, factores de crecimiento endoteliales, hormona paratiroidea (PTH), péptido similar a glucagón, somatotropina, timosina alfa 1, inhibidor IIb/IIIa de timosina alfa 1, timosina beta 10, timosina beta 9, timosina beta 4, alfa-1 antitripsina, compuestos de fosfodiesterasa (PDE), VLA-4 (antígeno muy tardío 4), inhibidores de VLS-4, biofosfonatos, anticuerpo del virus sincitial respiratorio, gen regulador transmembrana de fibrosis quística (CFTR), desoxirribonucleasa (ADNasa), proteína bactericida/de aumento de pearmeabilidad (BPI) y anticuerpo anti-CMV. Los anticuerpos monoclonales ejemplares incluyen etanercept (una proteína de fusión que consiste en una parte de unión a ligando extracelular del receptor de TNF humano de 75 kD unido a la parte Fc de IgG1), abciximab, afeliomomab, basiliximab, daclizumab, infliximab, ibritumomab tiuexetano, mitumomab, muromonab-CD3, conjugado yodo 131 tositumomab, olizumab, rituximab, y trastuzumab (herceptina).
Los agentes adicionales adecuados para unión covalente a un polímero incluyen amifostina, amiodarona, ácido aminocaproico, aminohipurato sódico, aminoglutetimida, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, amsacrina, anagrelida, anastrozol, asparaginasa, antraciclinas, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfano, cabergolina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucina, cilastatino sódico, cisplatino, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecinas, ácido 13-cis retinoico, ácido todo trans retinoico; dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, deferoxamina, dexametasona, diclofenaco, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina, estramustina, etopósido, exemestano, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximasterona, flutamida, gemcitabina, epinefrina, L-Dopa, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecan, itraconazol, goserelina, letrozol, leucovorina, levamisol, lisinopril, lovotiroxina sódica, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalan, mercaptopurina, metaraminol bitartrato, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, naloxona, nicotina, nilutamida, octreotida, oxaliplatino, pamidronato, pentostatina, pilcamicina, porfímero, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetron, raltitrexed, sirolimus, estreptozocina, tacrolimus, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testosterona, tetrahidrocannabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, topotecan, tretinoína, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, dolasetron, granisetron; formoterol, fluticasona, leuprolida, midazolam, alprazolam, amfotericina B, podofilotoxinas, nucleósidos antivirales, aroil hidrazonas, sumatriptano; macrólidos tales como as eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiramicina, midecamicina, leucomicina, miocamicina, roquitamicina, andazitromicina, y swinolida A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxacina, grepafloxacina, gatifloxacina, lomefloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina, y sitafloxacina; aminoglucósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amicacina, canamicina, neomicina, y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penems; penicilinas incluyendo agentes sensibles a penicilinasa como penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a penicilinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agentes activos para microorganismos gram negativos como ampicilina, amoxicilina, y hetacilina, cilina, y galampicilina; penicilinas antipseudomonas como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozil, ceftbuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotin, cefapirin, cefalexin, cepradrin, cefoxitin, cefamandol, cefazolin, cefaloridin, cefaclor, cefadroxil, cefaloglicina, cefuroxim, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetril, cefepime, cefixime, cefonicid, cefoperazona, cefotetan, cefmetazol, ceftazidime, loracarbef, y moxalactama, monobactamas como aztreonam; y carbapenems tales como imipenem, meropenem, isetiouato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona, triamcinolona acetamida, budesonida acetonida, fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolin sódico, y tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel; SN-38, y tirfostinas.
Los agentes biológicamente activos ejemplares anteriores pretenden abarcar, cuando sea aplicable, análogos, agonistas, antagonistas, inhibidores, isómeros y formas de sal farmacéuticamente aceptables de los mismos. Con referencia a péptidos y proteínas, la invención pretende abarcar formas sintéticas, recombinantes, nativas, glucosiladas y no glucosiladas, así como fragmentos biológicamente activos de las mismas. Las proteínas biológicamente activas anteriores pretenden abarcar adicionalmente variantes que tienen uno ó más aminoácidos sustituidos (por ejemplo, cisteína), suprimidos, o similares, siempre y cuando la proteína variante resultante posea al menos un cierto grado de actividad de la proteína precursora (nativa).
V. Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Administración
La presente invención también incluye preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado como se proporciona en este documento en combinación con un excipiente farmacéutico. Los excipientes ejemplares incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados entre el grupo que consiste en carbohidratos, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones y combinaciones de los mimos, un carbohidrato tal como un azúcar, azúcar derivatizado tal como alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar puede estar presente como un excipiente. Los excipientes de carbohidratos específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextrinas, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol, y similares.
El excipiente puede incluir también una sal inorgánica o tampón, tal como ácido cítrico, cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, nitrato potásico, fosfato sódico monobásico, fosfato sódico dibásico, y combinaciones de los mismos.
La preparación puede incluir también un agente antimicrobiano para evitar o impedir el crecimiento microbiano. Los ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol, y combinaciones de los mismos.
También puede estar presente un antioxidante en la preparación. Los antioxidantes se usan para evitar la oxidación, evitando de esa manera el deterioro del conjugado y otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito sódico, formaldehído sulfoxilato sódico, metabisulfito sódico, y combinaciones de los mismos.
Un tensioactivo puede estar presente como un excipiente. Los tensioactivos ejemplares incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 80," y pluronics tales como F68 y F88 (ambos de los cuales están disponibles en BASF, Mount Olive, New Jersey); ésteres de sorbitano; lípidos, tales como fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma liposomal), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, cinc y otros cationes adecuados.
Los ácidos o bases pueden estar presentes en un excipiente en la preparación. Los ejemplos no limitantes de ácidos que pueden usarse incluyen aquellos ácidos seleccionados entre el grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas entre el grupo que consiste en hidróxido sódico, acetato sódico, hidróxido de amonio, hidróxido potásico, acetato de amonio, acetato potásico, fosfato sódico, fosfato potásico, citrato sódico, formiato sódico, sulfato sódico, sulfato potásico, fumarato potásico, y combinaciones de los mismos.
Las preparaciones farmacéuticas abarcan todos los tipos de formulaciones y, en particular, aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos que pueden reconstituirse, así como suspensiones y soluciones. La cantidad del conjugado, (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero descrito en este documento) en la composición variará dependiendo de numerosos factores, aunque óptimamente es una dosis terapéutica eficaz cuando la composición se almacena en un recipiente de dosis unitaria (por ejemplo, un vial). Además, la preparación farmacéutica puede alojarse en una jeringuilla. Una dosis terapéuticamente eficaz puede determinarse experimentalmente por administración repetida de cantidades en aumento del conjugado para determinar qué cantidad produce un punto final clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina por experimentación rutinaria, es decir, preparando composiciones que contienen diversas cantidades de excipientes (que varían de baja a alta), examinando la estabilidad y otros parámetros y después determinando el intervalo al que se consigue el rendimiento óptimo, sin efectos adversos significativos. Generalmente, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 99% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 5-98% en peso, más preferiblemente de aproximadamente el 15-95% en peso del excipiente, siendo las más preferidas las concentraciones menores del 30% en peso.
Los excipientes farmacéuticos anteriores y otros se describen en Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19ª ed., Williams & Williams, (1995), the Physician's Desk Reference, 52ª ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se administran típicamente, aunque no necesariamente, por inyección y, por lo tanto, generalmente son soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La preparación farmacéutica puede tomar también otras formas tales como jarabes, cremas, pomadas, comprimidos, polvos y similares. Se incluyen también otros modos de administración, tales como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosa, oral, intratecal, subcutánea, intraarterial y similares. Los tipos de formulación adecuados para administración parenteral incluyen soluciones listas para inyección, polvos secos para combinación con un disolvente antes del uso, suspensiones listas para inyección, composiciones insolubles secas para combinación con un vehículo antes de su uso y emulsiones y concentrados líquidos para dilución antes de la administración, entre otras.
La invención proporciona también un método para administrar un conjugado como se proporciona en este documento a un paciente que padece una afección que es sensible al tratamiento con el conjugado, como determinan los expertos en la materia. El método comprende administrar, generalmente por inyección, una cantidad del conjugado, proporcionada preferiblemente como parte de una preparación farmacéutica.
La dosis real a administrar variará dependiendo de la edad, peso y estado general del sujeto, así como la gravedad de la afección a tratar, el juicio del profesional sanitario y el conjugado a administrar. Las cantidades terapéuticamente eficaces de fármacos particulares son conocidas para los expertos en la materia y/o se describen en los textos de referencia pertinentes y en la bibliografía. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado variará de aproximadamente 0,001 mg a 100 mg, preferiblemente en dosis de 0,01 mg/día a 75 mg/día, y más preferiblemente en dosis de 0,10 mg/día a 50 mg/día. La dosificación unitaria de cualquier conjugado dado (de nuevo, preferiblemente proporcionado como parte de una preparación farmacéutica) puede administrarse en una diversidad de programas de dosificación dependiendo del juicio del médico, las necesidades del paciente y similares.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, aunque no deben considerarse limitantes de la invención. Por ejemplo, aunque se usa PEG en los ejemplos, el uso de otros polímeros no peptídicos, solubles en agua, está abarcado por la invención, como se ha analizado anteriormente.
Todos los reactivos de PEG mencionados en estos ejemplos están disponibles en Nektar AL, Huntsville, AL. Todos los datos de RMN se generaron mediante un espectrómetro de RMN de 300 o 400 MHz fabricado por Bruker.
El Ejemplo 1 ilustra la reacción mPEG-OH con bromoacetato de terc-butilo en presencia de una base para formar un polímero terminado en terc-butil éster. Posteriormente, el polímero se somete a hidrólisis promovida por base usando NaOH como la base, seguido de acidificación usando ácido fosfórico, para formar el polímero terminado en ácido carboxílico final.
Los Ejemplos 2 y 3 ejemplifican una reacción similar de un material de partida de PEG (PEG diol; HO-PEG-OH). El Ejemplo 4 ilustra la reacción de un material de partida de PEG de 4 brazos multifuncional, basado en un núcleo de pentaeritritol y que tiene cuatro hidroxilos reactivos, uno en el extremo de cada "brazo de PEG".
Ejemplo 1 Ácido mPEG (30.000)-carboxílico
Una solución de mPEG-30.000 (50 g, 0,00167 moles) (NOF Corporation) en tolueno (600 ml) se secó azeotrópicamente retirando por destilación 300 ml de tolueno. Se añadieron t-butanol (70 ml), terc-butóxido potásico (95%, 1,75 g. 0,0148 moles, exceso de 8,9 veces) y bromoacetato terc-butilo (3,3 g. 0,0169 moles, exceso de 10,1 veces), y la mezcla se agitó durante una noche a 45ºC en atmósfera de argón. El disolvente se retiró por destilación a presión reducida, y el residuo se disolvió en agua destilada (1000 ml).
El pH de la solución acuosa se ajustó a 12 con hidróxido sódico 1 M y la solución se agitó durante 18 h, manteniendo el pH a 12 mediante adición periódica de hidróxido sódico 1 M.
El pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico al 5%, y el producto se extrajo con diclorometano. El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y se añadió a éter etílico. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida, dando un rendimiento 46,6 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 3,24 ppm (s, -OCH_{3}), 3,51 ppm (s, estructura básica de PEG), 4,01 ppm (s, -CH_{2}-COO-).
Análisis cromatográfico por intercambio de aniones: ácido mPEG(30,000)-carboxílico al 100%. Este análisis mostró que prácticamente no había presente material de partida u otra impureza polimérica en el producto precipitado con éter.
Ejemplo 2 Ácido PEG(10.000)-dicarboxílico
Se disolvió PEG-10.000 (35,25 g, 0,00705 eq.) (NOF Corporation) (terminado en ambos extremos con hidroxilo) en tolueno (600ml) y se secó azeotrópicamente retirando por destilación el tolueno. El residuo se redisolvió en tolueno anhidro (500 ml). Se combinaron terc-butanol (40 ml), terc-butóxido potásico (4 g, 0,0356 moles, exceso de 5,1 veces) y tolueno anhidro (40 ml) y añadió a la mezcla de reacción anterior, seguido de agitación durante aproximadamente 3,5 horas. Se añadió bromoacetato de t-butilo (7 ml, 0,0474 moles, exceso de 6,7 veces), y la mezcla se agitó durante una noche a 40ºC en una atmósfera de argón. El disolvente se retiro por destilación a presión reducida y el residuo se disolvió en agua destilada (1000 ml).
El pH de la solución acuosa se ajustó a 12,1 con hidróxido sódico 1 M, y la solución se agitó durante una noche, manteniendo el pH a 12,1 mediante adición periódica de hidróxido sódico 1 M.
El pH se ajustó a 1,0 con ácido clorhídrico 1 M, y el producto se extrajo con diclorometano. El extracto se secó con sulfato sódico anhidro, se concentró y se le añadió éter etílico. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida para producir 33 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 3,51 ppm (s, estructura básica de PEG), 4,01 ppm (s, -CH_{2}-COO-).
Análisis cromatográfico por intercambio de aniones: ácido PEG(10.000)-dicarboxílico al 100%.
Ejemplo 3 Ácido PEG(5.000)-dicarboxílico
Una solución de PEG-5.000 (35 g, 0,01400 equivalentes) (NOF Corporation) en acetonitrilo (800 ml) se secó azeotrópicamente retirando por destilación el acetonitrilo, y el residuo se redisolvió de nuevo en tolueno anhidro (300 ml). Se combinaron t-butanol (50 ml), terc-butóxido potásico (4,7 g, 0,0419 moles, exceso de 2,99 veces), y tolueno anhidro (50 ml) y se añadieron a la mezcla de reacción anterior seguido de aproximadamente 3,5 horas de agitación. Se añadió bromoacetato de t-butilo (7,2 ml, 0,0488 moles, exceso de 3,48 veces), y la mezcla se agitó 20 horas a temperatura ambiente en una atmósfera de argón. El disolvente se retiró por destilación a presión reducida y el residuo se disolvió en agua destilada (1.000 ml).
El pH de la solución acuosa se ajustó a 12,0 con hidróxido sódico 1 M, y la solución se agitó durante una noche, manteniendo el pH a 12,0 mediante adición periódica de hidróxido sódico 1 M.
El pH se ajustó a 2,0 con ácido clorhídrico 1 M y el producto se extrajo con diclorometano. El extracto se secó con sulfato sódico anhidro, se concentró y se añadió a éter etílico. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida para producir 32 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 3,51 ppm (s, estructura básica de PEG), 4,01 ppm (s, -CH_{2}-COO-).
Análisis cromatográfico de intercambio de aniones: ácido PEG(5.000)-dicarboxílico al 100%.
Ejemplo 4 Ácido PEG(10.000)-tetracarboxílico de 4 brazos
Una solución de PEG multi-brazo (4 brazos), PM 10 kDa (Nektar, Huntsville AL) (160 g, 0,064 equivalentes) en tolueno (2.300 ml) se secó azeotrópicamente retirando por destilación 1.000 ml de tolueno a 80ºC a presión reducida. En otro recipiente, se mezclaron terc-butanol (17,3 ml) y terc-butóxido potásico (7,18 g, 0,128 moles, exceso molar de 2,00 veces) y después se añadió a la solución de de tolueno secado anterior. La solución resultante se agitó durante aproximadamente 3,5 horas a 45ºC. Se añadió bromoacetato de t-butilo (20,8 ml, 0,141 moles, exceso de 2,20 veces) y la mezcla se agitó 12 horas a 45ºC en una atmósfera de argón. El disolvente se retiró por destilación a presión reducida y el residuo se disolvió en agua destilada (1.600 ml).
El pH de la solución acuosa se ajustó a 12,0 con hidróxido sódico 1 M, y la solución se agitó durante 17 horas manteniendo el pH a 12,0 mediante adición periódica de hidróxido sódico 1 M.
El pH se ajusto después a 1,5 con ácido fosfórico 1 M y el producto se extrajo con diclorometano. El extracto se secó con sulfato sódico anhidro, se concentró y se añadió a éter etílico. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida produciendo 15,5 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 3,51 ppm (s, estructura básica de PEG), 4,01 ppm (s, -CH_{2}-COO-), sustitución 100%.
Después de 8 meses de almacenamiento a -20ºC, el análisis GPC era idéntico al del producto original. Por lo tanto, no ocurrió una degradación detectable durante el almacenamiento.
Muchas modificaciones y otras realizaciones de la invención se le ocurrirán a un experto en la técnica a la que pertenece esta invención, que tiene el beneficio de las enseñanzas presentadas en la descripción anterior. Por lo tanto, la invención no está limitada a las realizaciones específicas descritas, y se pretende que las modificaciones y otras realizaciones estén incluidas, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (35)

1. Un método para preparar un derivado de ácido carboxílico activado de un polímero no peptídico, soluble en agua, que comprende:
i) hacer reaccionar un reactivo de éster R(C=O)OR', donde R' es un grupo terciario y R comprende un grupo funcional X, con un polímero no peptídico no soluble en agua POLI-Y, donde Y es un grupo funcional que reacciona con X para formar un enlace covalente, para formar un éster terciario del polímero;
ii) tratar el éster terciario del polímero con una base fuerte en solución acuosa para formar una sal carboxilato del polímero;
iii) tratar la sal carboxilato del polímero con un ácido inorgánico en solución acuosa, para convertir la sal carboxilato en un ácido carboxílico, formando de esta manera un polímero funcionalizado con ácido carboxílico; y
iv) derivatizar adicionalmente el polímero funcionalizado con ácido carboxílico para dar como resultado un polímero derivatizado que tenga un haluro de acilo, pseudohaluro de acilo, sal de metal alcalino/alcalinotérreo, éster, anhídrido, amida, imida o hidrazida.
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2. El método de la reivindicación 1, en el que X es un grupo saliente e Y es un grupo hidroxilo.
3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha base fuerte es un hidróxido de metal alcalino.
4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento con base fuerte es eficaz para producir un pH de reacción de aproximadamente 11 a 13.
5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho ácido inorgánico es un ácido que produce aniones no nucleófilos en solución acuosa.
6. El método de la reivindicación 5, en el que el ácido se selecciona entre el grupo que consiste en ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y ácido clorhídrico.
7. El método de la reivindicación 1, en el que el reactivo de éster terciario tiene la estructura:
3
en la que:
X es un grupo saliente;
cada uno de R^{1} y R^{2} se selecciona independientemente entre hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, arilo, aralquilo y heterociclo;
cada uno de R^{3} y R^{5} se selecciona independientemente entre alquilo inferior, arilo, aralquilo y cicloalquilo, donde cualquiera de R^{3} y R^{7} puede estar unido para formar un anillo o sistema de anillo;
donde cualquiera de R^{1} a R^{5},exceptuando hidrógeno, puede estar sustituido con un grupo seleccionado entre alquilo inferior, alcoxi inferior, cicloalquilo C3-C6, halo, ciano, oxo (ceto), nitro y fenilo; y
n es de 1 a aproximadamente 24.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El método de la reivindicación 7, en el que n es de 1 a 6.
9. El método de la reivindicación 8, en el que n es 1 ó 2.
10. El método de la reivindicación 9, en el que cada uno de R^{1} y R^{2} es independientemente hidrógeno o alquilo inferior no sustituido y cada uno de R^{3} a R^{5} es independientemente alquilo inferior no sustituido o fenilo.
11. El método de la reivindicación 10, en el que cada uno de R^{1} y R^{2} es independientemente hidrógeno o metilo y cada uno de R^{3} a R^{5} es independientemente metilo, etilo o fenilo.
12. El método de la reivindicación 11, en el que cada uno de R^{1} y R^{2} es H y n es 1.
13. El método de la reivindicación 12, en el que recibo de éster terciario es haloacetato de t-butilo.
14. El método de la reivindicación 1, en el que el polímero se selecciona entre el grupo que consiste en poli(alquilenglicoles), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ácido \alpha-hidroxiacético), poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolinas, poli(N-acriloilmorfolina) y copolímeros o terpolímeros de los mismos.
15. El método de la reivindicación 14, en el que el polímero es un poli(etilenglicol).
16. El método de la reivindicación 15, en el que el poli(etilenglicol) es lineal y está terminado en un extremo con dicho grupo funcional Y y en el otro extremo con otro grupo funcional Y' o un grupo de protección terminal.
17. El método de la reivindicación 1, en el que dicho derivado es un éster.
18. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente conjugar dicho polímero con una molécula biológicamente activa, haciendo reaccionar dicho polímero con un grupo funcional en dicha molécula.
19. El método de la reivindicación 18, en el que el polímero se derivatiza para que tenga un éster, y el grupo funcional en dicha molécula es un grupo nucleófilo.
20. El método de la reivindicación 19, en el que dicho grupo nucleófilo es un grupo amino, un grupo hidroxilo o un tiol.
21. Un método para preparar un derivado de ácido carboxílico activado de un PEG que comprende;
i) hacer reaccionar un reactivo de éster terciario R(C=O)OR', donde R' es un grupo alquilo terciario y R comprende un grupo funcional X, con un polímero de PEG-Y, donde Y es un grupo funcional que reacciona con X para formar un enlace covalente, para formar un éster terciario de PEG;
ii) tratar el éster terciario de PEG con una base fuerte en solución acuosa para formar una sal carboxilato de PEG;
iii) tratar la sal carboxilato de PEG con un ácido inorgánico en solución acuosa, para convertir la sal carboxilato en un ácido carboxílico, formando de esta manera un ácido PEG carboxílico; y
iv) derivatizar adicionalmente el ácido PEG carboxílico para dar como resultado un PEG derivatizado que tenga un haluro de acilo, pseudo haluro de acilo, sal de metal alcalino/alcalinotérreo, éster, anhídrido, amida, imida o hidrazida.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El método de la reivindicación 21, en el que X es un grupo saliente e Y es un grupo hidroxilo.
23. El método de la reivindicación 21, en el que dicha base fuerte es un hidróxido de metal alcalino.
24. El método de la reivindicación 21, en el que el ácido se selecciona entre el grupo constituido por ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y ácido clorhídrico.
25. El método de la reivindicación 21, en el que es reactivo de éster terciario tiene la estructura
4
en la que:
X es un grupo saliente;
cada uno de R^{1} y R^{2} se selecciona independientemente entre hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, arilo, aralquilo y heterociclo;
cada uno de R^{3}-R^{5} se selecciona independientemente entre alquilo inferior, arilo, aralquilo y cicloalquilo, donde cualquiera de R^{3}-R^{5} puede estar unido para formar un anillo o sistema de anillo; donde cualquiera de R^{1} a R^{5}, exceptuando hidrógeno, puede estar sustituido con un grupo seleccionado entre alquilo inferior, alcoxi inferior, cicloalquilo C3-C6, halo, ciano, oxo (ceto), nitro y fenilo; y
n es de 1 a aproximadamente 24.
\vskip1.000000\baselineskip
26. El método de la reivindicación 25, en el que n es de 1 a 6.
27. El método de la reivindicación 26, en el que n es 1 ó 2.
28. El método de la reivindicación 25, en el que cada uno de R^{1} y R^{2} es independientemente hidrógeno o alquilo inferior no sustituido y cada uno de R^{3} a R^{5} es independientemente alquilo inferior no sustituido o fenilo.
29. El método de la reivindicación 25, en el que cada uno de R^{1} y R^{2} es H y n es 1.
30. El método de la reivindicación 29, en el que el reactivo de éster terciario es un haloacetato de t-butilo.
31. El método de la reivindicación 21 ó 30, en el que el poli(etilenglicol) es lineal y está terminado en un extremo con dicho grupo funcional Y y en el otro extremo con otro grupo funcional Y' o un grupo de protección terminal.
32. El método de la reivindicación 21 ó 30, en el que el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 Da.
33. El método de la reivindicación 32, en el que el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 60.000 Da.
34. El método de la reivindicación 21, en el que dicho derivado es un éster.
35. El método de la reivindicación 21, que comprende adicionalmente conjugar dicho PEG con una molécula biológicamente activa, haciendo reaccionar dicho PEG con un grupo funcional en dicha molécula.
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