MX2014007966A - Variantes de polipeptido ph20, formulaciones y usos de las mismas. - Google Patents

Variantes de polipeptido ph20, formulaciones y usos de las mismas.

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Abstract

Se proporcionan polipéptidos de hialuronidasa PH20 modificados, incluyendo polipéptidos modificados que muestran estabilidad incrementada y/o actividad incrementada. También se proporcionan composiciones y formulaciones y usos de las mismas.

Description

VARIANTES DE POLIPEPTIDO PH20, FORMULACIONES Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan polipéptidos de hialuronidasa PH20 modificados, incluyendo polipéptidos modificados que muestran estabilidad incrementada y/o actividad incrementada. También se proporcionan composiciones y formulaciones y usos de las mismas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hialuronano (ácido hialurónico; HA) es un polipéptido que se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en los ¦ tejidos conjuntivos blandos. El HA también se encuentra predominantemente en la piel, cartílago y en el fluido sinovial en mamíferos. El hialuronano también es el constituyente principal del humor vitreo del ojo. El HA tiene una función en varios procesos fisiológicos, tales como homeostasis del agua y proteína plasmática (Laurent TC y colaboradores (1992) FASEB J 6: 2397-2404) . Ciertas enfermedades se asocian con la expresión y/o producción de hialuronano. Las enzimas . degradadoras de hialuronano, tales como hialuronídasas, son enzimas que degradan el hialuronano. Al catalizar la degradación de HA, las enzimas degradadoras de hialuronano (por ejemplo, ' hialuronidasas) se pueden utilizar para tratar enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de HA u otros glicosaminoglicanos . También, puesto que el HA es un componente principal de la barrera intersticial, las enzimas degradadoras de hialuronano (por ejemplo, hialuronidasas) incrementan la permeabilidad del tejido y por lo tanto se pueden utilizar para incrementar la dispersión y suministro de agentes terapéuticos. Varias hialuronidasas se han usado terapéuticamente (por ejemplo, HydaseMR, VitraseMR y WydaseMR) , típicamente como agentes de dispersión y propagación en combinación con otros agentes terapéuticos. Muchos de estos son formas de ovino o bovino, que pueden ser inmunogénicas para el tratamiento de humanos. Son necesarias enzimas degradadoras de hialuronano mejoradas, tales como hialuronidasas, y composiciones de las mismas que se puedan utilizar para el tratamiento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que tienen una propiedad o propiedades alteradas comparados con el polipéptido PH20 que no tiene la modificación (es) . Las modificaciones incluyen reemplazo, supresión y/o inserciones de aminoácidos. La estructura/función detallada de virtualmente cada aminoácido en un polipéptido PH20 se proporciona en la presente, asi como la identificación de residuos y sitios que contribuyen a la alteración de una propiedad, tal como estabilidad en condiciones particulares. Por consiguiente, se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos que dan por resultado un polipéptido PH20 que retiene la actividad y/o muestra estabilidad incrementada o alterada bajo una variedad de condiciones. La actividad retenida puede ser, por ejemplo, actividad de hialuronidasa que es por lo menos aproximadamente 40% o más del polipéptido PH20 que no incluye el reemplazo. Las modificaciones ejemplares son reemplazos de aminoácidos. Para propósitos en la presente, los reemplazos de aminoácidos se indican por la letra de aminoácido individual seguido por la posición de aminoácidos correspondiente en SEQ' ID NO: 3 en la cual se presenta el reemplazo. Las abreviaturas de aminoácido individuales para los residuos de aminoácidos son bien conocidas por un artífice experto (véase por ejemplo Tabla 1), y se utilizan en la presente por toda la descripción y ejemplos. Por ejemplo, el reemplazo con P en una posición que corresponde a la posición 204 en un polipéptido PH20 con referencia a las posiciones del residuo de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3 significa que el reemplazo abarca F204P en un polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID .NO:3, o el mismo reemplazo en la posición correspondiente en otro polipéptido PH20.
Se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en un polipéptido PH20, mediante . lo cual el polipéptido PH20 modificado muestra estabilidad incrementada comparada con el polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. La estabilidad incrementada se puede manifestar como resistencia incrementada a una o más condiciones de proteínas que desnaturalizan las proteínas. La estabilidad de la PH20 modificado y no modificado se comparar bajo las mismas condiciones. Las condiciones de desnaturalización de proteínas ejemplares (o desnaturalización, utilizada intercambiablemente en la presente) incluyen, pero no se limitan a, temperatura elevada mayor que 30 °C o aproximadamente 30°C, agitación, bajo contenido de sal, incluyendo esencial o sustancialmente o nada de sal, y presencia de excipientes que tienden a desnaturalizar las proteínas. Ejemplares de tales excipientes son antiadherente (s ) , aglutinante ( s ) , recubrimiento ( s) , rellenador (es ) y diluyente ( s ) , sabor (es), color (es), lubricante (s) , mej orador (es ) de flujo, conservador (es) , detergente ( s ) sorbente (s) y combinaciones de los mismos.
El polipéptido PH20 modificado puede ser uno en el cual la forma no modificada del mismo tiene por lo menos aproximadamente 68% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 3 y contiene además modificaciones que alteran la estabilidad y/o pueden ser un polipéptido PH20 que incluye tanto como aproximadamente hasta 100, 110, 120, 130, 150 diferencias de aminoácidos de PH20 pero retiene la actividad enzimática, particularmente, por lo menos aproximadamente 40% de la actividad del polipéptido PH20 no modificado y muestra estabilidad incrementada, tal como estabilidad bajo condiciones de desnaturalización. De esta manera, se incluyen polipéptidos PH20 modificados que tienen por lo menos 68% o aproximadamente 68% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Se incluyen polipéptidos PH20 modificados que tienen por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Ejemplares, de tales polipéptidos PH20 modificados son los polipéptidos que contienen el reemplazo (s) de aminoácidos en un polipéptido PH20 que contiene la secuencia de residuos de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870 o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72., 857., 859, 861, o 870.
Por ejemplo, . se proporciona en la presente un polipeptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada que contiene un reemplazo de aminoácidos en un polipéptido PH20 que confiere la estabilidad incrementada, en donde la estabilidad incrementada se manifiesta como resistencia incrementada a la . desnaturalización en presencia de una o más condiciones de desnaturalización de proteínas, la estabilidad se incrementa comparada con el polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos, y el polipéptido PH20 no modificado consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 7 o es un fragmento truncado C-terminal del mismo que es un polipéptido PH20 soluble o tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia al mismo. Como en lo anterior, el polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada muestra estabilidad incrementada a una condición de desnaturalización que es de temperatura mayor que o aproximadamente 30°C; agitación; bajo contenido de o sin sal; o presencia de un excipiente o agente de desnaturalización, tal como un antiadherente ( s ) , aglutinante ( s ) , recubrimiento ( s ) , rellenador ( es ) y diluyente (s) , sabor (s), color (es), lubricante ( s ) , mejorador (es) de flujo, conservador (es ) , detergente ( s ) , sorbente(s) o edulcorante ( s ) y una combinación de los mismos, y en particular un conservador. En algunos ejemplos de tales polipéptidos PH20 modificados que muestran estabilidad incrementada, la condición de desnaturalización es la temperatura mayor que 30°C, y el polipéptido PH20 modificado muestra mayor actividad de hialuronidasa en la temperatura comparado con el polipéptido PH20 no modificado que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos donde las actividades se compararan bajo las mismas condiciones. En otros ejemplos, la condición de desnaturalización de proteínas es la presencia de bajas concentraciones de sal de menos que 100 mM, y el polipéptido PH20 modificado muestra actividad de hialuronidasa incrementada en presencia de bajas concentraciones de sal comparado con el polipéptido PH20 no modificado que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos donde las actividades se comparan bajo las mismas condiciones.
En cualquiera de los ejemplos anteriores de un polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada, la estabilidad se puede evaluar basada en una variedad de parámetros incluyendo actividad de hialuronidasa, solubilidad, agregación y/o cristalización. La estabilidad se puede evaluar en presencia de una condición de desnaturalización. Cuando la estabilidad de dos o más polipéptidos se compara, la estabilidad se evalúa bajo las mismas condiciones. En algunos casos, entre los polipéptidos PH20 proporcionados en la presente, el polipéptido PH20 modificado muestra por lo menos 120%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% o más de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo(s) de aminoácidos.
En cualquiera de los ejemplos anteriores de un polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada, las condiciones de desnaturalización incluyen la presencia de excipientes que desnaturalizan las proteínas. Ejemplar de tales condiciones es la presencia de un conservador, tal como un conservador fenólico. Se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que muestra estabilidad incrementada en presencia de una cantidad efectiva antimicrobiana de uno o más conservadores fenólicos. Una cantidad efectiva antimicrobiana es la cantidad total de uno o más agentes conservadores fenólicos, que se pueden expresar como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) que es o está entre (o por lo menos aproximadamente o en aproximadamente) 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% . a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0,4%, inclusive. Los conservadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fenol, metacresol (m-cresol) , alcohol bencílico, y un parabeno, tal como metilparabeno, propilparabeno, m-cresol, fenol o m-cresol y fenol. Ejemplares de la estabilidad lograda por los polipéptidos PH20 modificados proporcionados son aquellos que muestran por lo menos 1.5% o aproximadamente 15% de la actividad de hialuronidasa durante por lo menos 4 horas en presencia de conservador (s ) comparado con el polipéptido PH20 modificado en ausencia de un conservador. La actividad se compara bajo las mismas condiciones excepto por la presencia de conservador (es) . Por ejemplo, se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que muestran por lo menos (o por lo menos aproximadamente) 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad de hialuronidasa en presencia de un conservador ( es ) fenólico comparados con la ausencia del mismo conservador (es) . De esta manera, se proporciona, entre los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente, son polipéptidos PH20 que, en virtud del reemplazo(s) de aminoácidos, son fenólicos comparados con los polipéptidos PH20 sin tal reemplazo. Se incluyen polipéptidos PH20 modificados donde la actividad de hialuronidasa se muestra después de por lo menos 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 1 días, 3 semanas, 4 semanas o más en presencia del conservador (es ) comparado con la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 modificado en ausencia de un conservador para el mismo período de tiempo y bajo las mismas condiciones excepto para la presencia del conservador (es ) .
En ejemplos de un polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada a un conservador fenólico, la estabilidad incrementada en un conservador fenólico se puede mostrar bajo condiciones de temperatura que incluyen cualquier temperatura entre, por ejemplo, 0°C y 40°C, tal como entre o aproximadamente entre 0°C a 40 °C, 2°C a 6°C, 24°C a 32°C y 35°C a 40°C. los polipéptidos ejemplares muestran estabilidad incrementada en temperaturas entre aproximadamente entre 30°C a 45°C, 35°C a 45°C, 30°C a 37°C, 35°C a 37°C o 37°C a 42°C, cada uno inclusive. El polipéptido PH20 modificado particular y las condiciones dependen de la formulación y propuesta, las condiciones a las cuales la formulación se expondrá y/o la aplicación propuesta.
Los polipéptidos PH20 modificados particulares ejemplares que muestran estabilidad incrementada, tal como estabilidad incrementada a un conservador fenólico, incluyen aquellos que contienen . una sola modificación de aminoácidos, tal como un reemplazo, y combinaciones de modificaciones, tal como por lo menos o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y más modificaciones. Estas incluyen polipéptidos PH20 modificados que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos, donde por lo menos un reemplazo está en una posición de aminoácidos que corresponde (es decir, por alineación) a una posición seleccionada de entre 10, 12, 20, 22, 26, 34, 36, 46, 50, 52, 58, 68, 70, 74, 82, 83, 84, 86, 97, 127, 131, 138, 142, 143, 144, 166, 169, 174, 193, 195, 196, 204, 205, 206, 213, 219, 234, 237, 238, 240, 249, 261, 267, 277, 279, 291, 309, 310, 314, 315, 317, 318, 347, 367, 375, 376, 399, 401, 407, 416, 419, 421, 431, 433, 439, 440, 443 o 445 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. Ejemplares de tales modificaciones son por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: glicina (G) en una posición que corresponde a la posición 10; K en una posición que corresponde a la posición 12; S en una posición que corresponde a la posición 20; T en una posición que corresponde a la posición 22; en una posición que corresponde a la posición 26; W en una posición que corresponde a la posición 34; N en una posición que corresponde a la posición 36; L en una posición que corresponde a la posición 46; M en una posición que corresponde a la posición 50; T en una posición que corresponde a la posición. 52; S en una posición que corresponde a la posición 52; C en una posición que corresponde a la posición 58; K en una posición que corresponde a la posición 58 ; R en una posición que corresponde a la posición 58; N en una posición que corresponde a la posición 58; V en una posición que corresponde a la posición .58; P en una posición que corresponde a la posición 58; H en una posición que corresponde a la posición 58; P en una posición que corresponde a la posición 68; V en una posición que corresponde a la posición. 70; E en una posición que corresponde a la posición 74; L en una posición que corresponde a la posición 82; N en una posición que corresponde a la posición 82; V en una posición que corresponde a la posición 83; Q en una posición que corresponde a la posición 83; S en una posición que corresponde a la posición .83; G en una posición que corresponde a la posición 83; N en una posición que corresponde a la posición 84; A en una posición que corresponde a la posición 86; K en una posición que corresponde a la posición . 86; E en una posición que corresponde a la posición 97; en una posición que corresponde a la posición 97; R en una posición que corresponde a la posición 127 R en una posición que corresponde a la posición 131; L en una posición que corresponde a la posición 138 K en una posición que corresponde a la posición 142; N en una posición que corresponde a la posición 142 P en una posición que corresponde a la posición 142; S en una posición que corresponde a la posición 142 . T en una posición que corresponde a la posición 142; G en una posición que corresponde a la posición 143 K en una posición que corresponde a la posición 143; T en una posición que corresponde a la posición 144 Q en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166 L en una posición que corresponde a la ' posición 169; G en una posición que corresponde a la . posición 174 N en una posición que corresponde a la posición 174; Q en una posición que corresponde a la posición 193 T en una posición que corresponde a la posición 195; N en una posición que corresponde a la posición 195 E en una posición que corresponde a la posición 196; R en una posición que corresponde a la posición 196 P en una posición que corresponde a la posición 204; A en una posición que corresponde a la posición 205 E en una posición que corresponde a la posición 205; I en una posición que corresponde a la posición 206 A en una posición que corresponde a la posición 213; I en una posición que corresponde a la posición 219 M en una posición que corresponde a la posición 234; T en una posición que corresponde a la posición 237 H en una posición que corresponde a la posición 238; Q en una posición que corresponde a la posición 240 V en una posición que corresponde a la posición . 249; A en una posición que corresponde a la posición 261 K en una posición que corresponde a la posición 261; T en una posición que corresponde a la posición 267 K en una posición que corresponde a la posición 277; H en una posición que corresponde a la posición 279 V en una posición que corresponde a la posición 279; V en una posición que corresponde a la posición 291 E en una posición que corresponde a la posición 309; Q en una posición que corresponde a la posición 310 V en una posición que corresponde a la posición · 314; Y en una posición que corresponde a la posición 315 N en una posición que corresponde a la posición 317; en una posición que corresponde a la posición 317 D en una posición que corresponde a la posición 318; G en una posición que corresponde a la posición 347; A en una posición que corresponde a la .posición 367; R en una posición que corresponde a la posición 375; R en una posición que corresponde a la posición 376; . V en una posición que corresponde a la posición 399; E en una posición que corresponde a la posición 401; A en una posición que corresponde a la posición 407; L en una posición que corresponde a la posición 416; K en una posición que corresponde a la posición 419; H en una posición que corresponde a la posición 421; E en una posición que corresponde a la posición 431; T en una posición que corresponde a la .posición 433; V en una posición que corresponde a la posición 433; C en una posición que corresponde a la posición 439; P en una posición que corresponde a la posición 440; G en una posición que corresponde a la posición 443; N en una posición que corresponde a la posición 445, con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el polipéptido PH20 modificado puede contener por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: T en una posición que corresponde a la posición 52, K en una posición que corresponde a la posición 58, R en una posición que corresponde a la posición 58, P en una posición que corresponde a la posición 68, V en una posición que corresponde a la posición 83, P en una posición que corresponde a la posición 204, A en una posición que corresponde a la posición 261, T en una posición que corresponde a la posición 267, . K en una posición que corresponde a la¦ posición 277 H en una posición que corresponde a la posición 421, con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Un polipéptido PH20 modificado ejemplares es uno que incluye P (o un aminoácido conservador al mismo) en una posición que corresponde a la posición 204 en un polipéptido PH20 con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
De esta manera, se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 modificados que muestran estabilidad incrementada en presencia de un conservador fenolico que contiene un reemplazo de .aminoácidos en un polipéptido PH20 que confiere la estabilidad incrementada, en donde la estabilidad se incrementa comparada con el polipéptido PH20 no modificado sin el reemplazo de aminoácidos, y el polipéptido PH20. no _ modificado tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o es un fragmento truncado C-terminal del mismo que es un polipéptido PH20 soluble o tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, el polipéptido PH20 no modificado es un polipéptido PH20 soluble que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 o 32-66. En ejemplos particulares, el polipéptido PH20 modificado tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 3. En cualquiera de tales ejemplos de un polipéptido PH20 modificado, el polipéptido contiene, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,. 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, .52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 o más de reemplazos de aminoácidos. En ejemplos en la presente, el polipéptido PH20 modificado es un PH20 humano. El polipéptido PH20 modificado muestra estabilidad en presencia de de conservadores fenólicos si muestra por lo menos 5% de la actividad de hialuronidasa en presencia de un conservador (es) durante por lo menos 4 horas comparado con la actividad de hialuronidasa en ausencia de un conservador (es) fenólico, en donde la actividad se comparar bajo las mismas condiciones excepto para la presencia de un conservador (es) fenólico. En cualquiera de los ejemplos anteriores, el polipéptido PH20 modificado es estable en presencia de una cantidad efectiva anti-microbiana de uno o más conservadores fenólicos, tal como una cantidad total de uno o más agentes conservadores fenólicos como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) que es de o de aproximadamente 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4%, inclusive. El conservador fenólico puede ser un fenol, metacresol (m-cresol), . alcohol bencílico o un parabeno, tal como m-cresol, fenol, o m-cresol y fenol. El reemplazo de aminoácidos puede estar en el residuo de aminoácidos 204, 58, 10, 12, 20, 22, 26,. 34, 36, 46, 50, 52, 68, 70, 74, 82, 83, 84, 86, 97, 127, 131,. 138, 142, 143, 44, 166, 169, 74, 93, 195, 196, 05, 206, 213, 219, 234, 237, 238, 240, .249, 261, 267, 277, 279, 291, 309, 310, 314, 315, 17, 318, 347, 367, 375, 376, 399, 401, 407, 416, 419, 421, 431, 33, 439, 440, 443 o 445 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el reemplazo de aminoácidos es G en una posición que corresponde a la posición 10; K en una posición que corresponde a la posición 12; S en una posición que corresponde a la posición 20 ; T en una posición que corresponde a la posición 22 ; M en una posición que corresponde a la posición 26 ; W en una posición que corresponde a la posición 34 ; N en una posición que corresponde a la posición 36 ; L en una posición que corresponde a la posición una posición que corresponde a la posición 50; T en una posición que corresponde a la posición 52; S en una posición que corresponde a la posición 52; C en una posición que corresponde a la posición 58; K en una posición que corresponde a la posición 58; R en una posición que corresponde a la posición 58; N en una posición que corresponde a la posición 58; ? en una posición que corresponde a la posición 58; P en una posición que corresponde a la posición 58; H en una posición que corresponde a la posición 58; P en una posición que corresponde a la posición 68; V en una posición que corresponde a la posición 70; E en una posición que corresponde a la posición 74; L en una posición que corresponde a la posición 82; N en una posición que corresponde a la posición 82; V en una posición que corresponde a la posición 83; Q en una posición que corresponde a la posición 83; S en una posición que corresponde a la posición 83; G en una posición que corresponde a la posición 83; N en una posición que corresponde a la posición 84; A en una posición que corresponde a la posición 86; K en una posición que corresponde a la posición 86; E en una posición que corresponde a la posición 97; L en una posición que corresponde a la posición 97; R en una posición que corresponde a la posición 127; R en una posición que corresponde a la ¦posición 131; L en una posición que corresponde a la posición 138; K en una posición que corresponde a la posición 142; N en una posición que corresponde a la posición 142; P en una posición que corresponde a la posición 1 2; S en una posición que corresponde a la posición 142; T en una posición que corresponde a la posición 142; G en una posición que corresponde a la posición 143; K en una posición que corresponde a la posición 143; T en una posición que corresponde a la posición 144; Q en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 169; G en una posición que corresponde a la posición 174; N en una posición que corresponde a la posición 174; Q en una posición que corresponde a la posición 193; T en una posición que corresponde a la posición 195; N en una posición que corresponde a la posición 195; E en una posición que corresponde a la posición 196; R en una posición que corresponde a la posición 196; P en una posición que corresponde a la posición 204; A en una posición que corresponde a la posición 205; E en una posición que corresponde a la posición 205 I en una posición que corresponde a la posición 206 A en una posición que corresponde a la posición 213 I en una posición que corresponde a la posición 219 M en una posición que corresponde a la posición 234 T en una posición que corresponde a la posición ' 237 H en una posición que corresponde a la posición 238 Q en una posición que corresponde a la posición 240 V en una posición que corresponde a la posición 249 A en una posición que corresponde a la posición 261 K en una posición que corresponde a la posición 261 T en una posición que corresponde a la posición 267 K en una posición que corresponde a la posición 277 H en una posición que corresponde a la posición 279 V en una posición que corresponde a la posición 279 V en una posición que corresponde a la posición 291 E en una posición que corresponde a la posición 309 Q en una posición que corresponde a la posición 310 V en una posición que corresponde a la posición 314 V en una posición que corresponde a la posición 315 N en una posición que corresponde a la posición 317 W en una posición que corresponde a la. posición 317 D en una posición que corresponde a la posición 318 G en una posición que corresponde a la posición 347 A en una posición que corresponde a la posición 367; ¦ R en una posición que corresponde a la posición 375; R en una posición que corresponde a la posición 376; V en una posición que corresponde a la posición 399; E en una posición que corresponde a la posición 401; A en una posición que corresponde a la posición 407; L en una posición que corresponde a la posición 416; K en una posición que corresponde a la posición 419;. H en una posición que corresponde a la posición 421; E en una posición que corresponde a la posición 431; T en una posición que corresponde a la posición--433; V en una posición que corresponde a la posición 433; C en una posición que corresponde a la posición 439; P en una posición que corresponde a la posición 440; G en una posición que corresponde a la posición 443; o N en una posición que corresponde a la posición 445, con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuestas en SEQ ID N0:3. En particular, el reemplazo de aminoácidos es T en una posición que corresponde a la posición 52, K en una posición que corresponde a la posición 58, R en una posición que corresponde a la posición 58, P en una posición que corresponde a la posición 68, V en una posición que corresponde a la posición 83, P en una posición que corresponde a la posición 204, A en una posición que corresponde a la posición 261, . T en una posición que corresponde a la posición 267., K en una posición que corresponde a la posición 277 o H en una posición que corresponde a la posición 421, con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, tal como el reemplazo con P en una posición que corresponde a la posición 204 o R en una posición que corresponde a la posición 58. El polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada a los conservadores fenólicos se puede purificar o aislar sustancialmente . El polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada a conservadores fenólicos se puede modificar por glicosilación, sialación, albuminación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación y fosforilación, y generalmente se glicosila, mediante lo cual el polipéptido comprende por lo menos una porción de N-acetilglucosamina ligada a cada uno de por lo menos tres residuos de asparagina (N) , tal como los residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos 200, 333 y 358 de SEQ ID NO: 3. El polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada a los conservadores fenólicos se puede conjugar a un polímero, tal como PEG o dextrano y/o se puede conjugar a una porción que es un dominio de multimerización, una toxina, una etiqueta detectable o un fármaco.
Entre los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada son aquellos que muestran actividad de hialuronidasa incrementada en la temperatura elevada comparados con el polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos, tal como por lo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de actividad de hialuronidasa durante por lo menos 4 horas comparado con el polipéptido PH20 . que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos. También entre los polipéptidos son aquellos que muestran actividad, pero también muestran típicamente estabilidad incrementada u otra propiedad a temperaturas elevadas, tal como un polipéptido PH20 modificado que muestra por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%., 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% de la actividad de hialuronidasa durante por lo menos 4 horas en una temperatura de entre o aproximadamente entre 32°C a 37°C comparada con la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 modificado en una temperatura entre o aproximadamente entre 2°C a 8°C, donde la actividad se compara bajo las mismas condiciones excepto para las diferencias en la temperatura. La actividad de hialuronidasa se puede mostrar después de por lo menos 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, H horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 3 semanas, 4 semanas o más a temperaturas elevadas de entre o aproximadamente entre 32 °C a 37 °C comparada con la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 modificado en una temperatura entre o aproximadamente entre 2°C a 8°C, donde la actividad se compara para el mismo período de tiempo y bajo las mismas condiciones excepto para la diferencia en la temperatura. Ejemplares de tales polipéptidos modificados son aquellos que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 1, 11, 12, 14, 20, 26, 29, 34, 50, 58, 70, 82, 83, 84, 86, 87, 140, 142, 143, 147, 152, 166, 167, 172, 174, 178, 193, 195, 206, 212, 213, 219, 233, 237, 240, 267, 277, - 291, 292, 309, 313, 314, 317, 318, 347, 367, 368, 371, 374, 389, 392, 395, 396, 406, 419, 421, 439 y 443 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO : 3. Las mutaciones ejemplares incluyen, por ejemplo, el reemplazo con R en una posición 'que corresponde a la posición 1; S en una posición que corresponde a la posición 11; I en una posición que corresponde a la posición 12; V en una posición que corresponde a la ¦ posición 14 ; S en una posición que corresponde a la posición 20; M en una posición que corresponde a la posición 26 ; con R en una posición que corresponde a la posición 29; en una posición que corresponde a la posición 34 ; M en una posición que corresponde a la posición 50; K en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición 58; V en una posición que corresponde a la posición 70; L en una posición que corresponde a la posición 82; Q en una posición que corresponde a la posición 83; R en una posición que corresponde a la posición 84; A en una posición que corresponde a la posición 86; S en una posición que corresponde a la posición 87; K en una posición que corresponde a la posición 140; S en una posición que corresponde a la posición 142; T en una posición que corresponde a la posición 142; K en una posición que corresponde a la posición 143; S en una posición que corresponde a la posición 147; T en una posición que corresponde a la posición 152; T en una posición que corresponde a la posición 166; D en una posición que corresponde a la posición 167; A en una posición que corresponde a la. posición 172; G en una posición que corresponde a la posición 174; N en una posición que corresponde a la .posición 174; R en una posición que corresponde a la posición 178; Q en una posición que corresponde a la posición 193; T en una posición que corresponde a la posición 195; I en una posición que corresponde a la posición 206; S en una posición que corresponda a la posición 212; A en una posición que corresponde a la posición 213; I en una posición que corresponde a la posición 219; G en una posición que corresponde a la posición 233; T en una posición que corresponde a la posición 237; A en una posición que corresponde a la posición 240; Q en una posición que corresponde a la posición 240; T en una posición que corresponde a la posición 267'; E en una posición que corresponde a la posición 277; S en una posición que corresponde a la posición 291; H en una posición que corresponde a la posición 292; V en una posición que corresponde a la posición 292; S en una posición que corresponde a la- posición 309; H en una posición que corresponde a la posición 313; S en una posición que corresponde a la posición 314; I en una posición que corresponde a la ¦posición 317; T en una posición que corresponde a la posición 317; w en una posición que corresponde a la posición 317; R en una posición que corresponde a la posición 318; G en una posición que corresponde a la posición 347; A en una posición que corresponde a la posición 367; R en una posición que corresponde a la posición 368; S en una posición que corresponde a la posición 371; P en una posición que corresponde a la posición 374; A en una posición que corresponde a la posición 389; V en una posición que corresponde a la posición 392; A en una posición que corresponde a la posición 395; H en una posición que corresponde a la posición 396; N en una posición que corresponde a la posición 406; H en una posición que corresponde a la . posición 419; K en una posición que corresponde a la posición 419; R en una posición que corresponde a la posición 421; S en una posición que corresponde a la posición . 421; A en una posición que corresponde a la posición 439; C en una posición que corresponde a la posición 439; y G en una posición que corresponde a la posición 443, con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. En ejemplos particulares proporcionados en la presente, cualquiera de tales polipéptidos PH20 modificados contienen una sola modificación de aminoácidos, tal como un reemplazo, y combinaciones de modificaciones, tal como por lo menos o, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y más modificaciones . La modificación, tal como el reemplazo, puede estar en un polipéptido PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o es un fragmento truncado C-terminal del mismo que es un polipéptido PH20 soluble, tal como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 o 32-66, o tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, cualquiera de tales polipéptidos PH20 modificados tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:3.
También se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que muestran estabilidad incrementada en condiciones de bajo contenido sal, tal como, por ejemplo, concentraciones de NaCl de menos que 100 mM, tal como, pero no limitado a concentraciones de NaCl menor que 90 mM, 80 mM, 70 nM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 nM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o menos. Entre los polipéptidos PH20 modificados son aquellos que muestran actividad de hialuronidasa incrementada en concentraciones más bajas de sal comparada con el polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos. Tal actividad incluye, por ejemplo, por lo menos más de 100%, o por lo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% o. más actividad de hialuronidasa comparada con el polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo (s) de aminoácido. Ejemplares de tales polipéptidos PH20 modificados son aquellos que muestran por lo menos 60% de la actividad de hialuronidasa en bajas concentraciones de sal, tal como entre o aproximadamente entre NaCl 10 mM y NaCl 100 mM, inclusive (o concentraciones comparables de otras sales o mezclas de sales) , comparada con la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 modificado en NaCl 150 mM, donde las actividades se comparan bajo las mismas condiciones excepto para la diferencia en la concentración de sal. En ejemplos particulares proporcionados en la presente, cualquiera de tales polipéptidos PH20 modificados contienen una sola modificación de aminoácidos, tal como un reemplazo, y combinaciones de modificaciones, tales como por lo menos o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 1.2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 0, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y más modificaciones. La modificación, tal como reemplazo, puede estar en un polipéptido PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o un fragmento truncado C-terminal del mismo que es un polipéptido PH20 soluble, tal como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 o 32-66, o tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, cualquiera de tales polipéptidos PH20 modificados tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 3.
También se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en un polipéptido PH20, en donde el polipéptido PH20 modificado muestra actividad de hialüronidasa incrementada comparada con el polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Cuando se compara la actividad entre los polipéptidos, la actividad se compara bajo las mismas condiciones. Entre estos son los polipéptidos, donde el PH20 no modificado muestra por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, o el PH20 modificado resultante muestra tal identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Ejemplares de tales polipéptidos PH20 modificados son cualquiera que contenga un reemplazo (s) . de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3,7, 10, 12, 14,-24, 32-66, 69,' o 72, o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, o 72. El reemplazo (s) de aminoácidos también se puede hacer en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 857, 859, 861 o 870, o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOS: 857, 859, 861 o 870. En particular, se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que contienen un reemplazo de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72. Entre los polipéptidos PH20 modificados son aquellos que muestran por lo menos 120%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% o más de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. La actividad se puede evaluar en cualquier temperatura, en particular tal actividad está presente cuando la hialuronidasa se expone a una temperatura que está en una temperatura entre o aproximadamente entre 2°C a 8°C. Estos polipéptidos PH20 modificados contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 1, 12, 15, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 39, 46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97, 118, 120, 127, 131, 135, 141, 142, 147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263, 269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 291, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359., 371, 377, . 380, 389, 392, 395, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 y 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por alineación de polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3. Las modificaciones ejemplares incluyen por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: histidina (H) en una posición que corresponde a la posición 1; Q en una posición que corresponde a la posición 1; E en una posición que corresponde a la posición 12; T en una posición que corresponde a la posición 12; V en una posición que corresponde a la posición 15; E en una posición que corresponde a la posición¦ 24; H en una posición que corresponde a la posición 24; E en una posición que corresponde a la posición 26; K en una posición que corresponde a la posición 26; K en una posición que corresponde a la posición 27; R en una posición que corresponde a la posición 27; E en una posición que corresponde a la posición 29; I en una posición que corresponde a la posición 29; L en una posición que corresponde a la posición 29; M en una posición que corresponde la posición 29 P en una posición que corresponde la posición 29 S en una posición que corresponde la posición 29 V en una posición que corresponde la posición 29 G en una posición que corresponde la posición 30 H en una posición que corresponde la posición 30 K en una posición que corresponde la posición 30 M en una posición que corresponde la posición 30 R en una posición que corresponde la posición 30 S en una posición que corresponde la posición 30 A en una posición que corresponde la posición 31 C en una posición que corresponde la posición 31 H en una posición que corresponde la posición 31 I en una posición que corresponde la posición 31 K en una posición que corresponde la posición 31 L en una posición que corresponde la posición 31 P en una posición que corresponde la posición 31 R en una posición que corresponde la posición . 31 S en una posición que corresponde la posición 31 T en una posición que corresponde la posición 31 V en una posición que corresponde la posición 31 F en una posición que corresponde la posición 32 G en una posición que corresponde la posición 32 H en una posición que corresponde la posición .32 W en una posición que corresponde a la posición 33 F en una posición que corresponde a la posición 37 N en una posición que corresponde a la posición 39 T en una posición que corresponde a la posición 39 R en una posición que corresponde a la ¦ posición 46 F en una posición que corresponde a la posición 48 H en una posición que corresponde a la posición 48 N en una posición que corresponde a la posición 48 Q en una posición que corresponde a la posición 52 K en una posición que corresponde a la ¦ posición 58 Q en una posición que corresponde a la posición 58 W en una posición que corresponde a la posición 63 V en una posición que corresponde a la posición 67 H en una posición que corresponde a la posición 68 Q en una posición que corresponde a la posición 68 A en una posición que corresponde a la posición 69 C en una posición que corresponde a la posición 69 F en una posición que corresponde a la posición 69 G en una posición que corresponde a la posición 69 I en una posición que corresponde a la- posición 69 L en una posición que corresponde a la posición 69 M en una posición que corresponde a la posición 69 P en una posición que corresponde a la posición 69 R en una posición que corresponde a la posición 69 W en una posición que corresponde a la posición 69; Y en una posición que corresponde a la . posición 69; A en una posición que corresponde a la posición 70; C en una posición que corresponde a la posición 70; F en una posición que corresponde a la posición 70; G en una posición que corresponde a la posición 70; H en una posición que corresponde a la posición 70; K en una posición que corresponde a la posición 70; L en una posición que corresponde a la posición 70; N en una posición que corresponde a la posición 70; P en una posición que corresponde a la posición 70; R en una posición que corresponde a la . posición 70; S en una posición que corresponde a la posición 70; ¦ T en una posición que corresponde a la posición 70; ;v en una posición que corresponde a la posición 70; R en una posición que corresponde a la posición 71; S en una posición que corresponde a la posición 71; M en una posición que corresponde a la posición 72; Q en una posición que corresponde a la posición 72; H en una posición que corresponde a la posición 73; L en una posición que corresponde a la posición 73; W en una posición que corresponde a la . posición 73; A en una posición que corresponde a la posición 74; C en una posición que corresponde a la posición 74; G en una posición que corresponde a la posición 74; N en una posición que corresponde a la posición 74; P en una posición que corresponde a la posición 74; R en una posición que corresponde a la posición 74; S en una posición que corresponde a la posición¦ 74; V en una posición que corresponde a la posición 74; W en una posición que corresponde a la posición 74; F en una posición que corresponde a la posición 75; L en una posición que corresponde a la posición 75; R en una posición que corresponde a la posición 75; T en una posición que corresponde a la posición 75; G en una posición que corresponde a la posición 84; R en una posición que corresponde a la posición 84; A en una posición que corresponde a la posición 86; C en una posición que corresponde a la posición ' 87; T en una posición que corresponde a la posición 87; Y en una posición que corresponde a la posición 87; C en una posición que corresponde a la posición 92; I en una posición que corresponde a la posición 93; L en una posición que corresponde a la posición 93; R en una posición que corresponde a la posición 93; T en una posición que corresponde a la posición 93; R en una pos ición que corresponde a la posición 94; G en una posición que corresponde a la posición 97; Q en una posición que corresponde a la posición 118; F en una posición que corresponde a la posición 120; V en una posición que corresponde a la posición 120; Y en . una posición que corresponde a la posición 120; H en una posición que corresponde a la posición 127; N en una posición que corresponde a la posición 127; G en una posición que corresponde a la posición 131; R en una posición que corresponde a la posición 131; V en una posición que corresponde a la posición 131; D en una posición que corresponde a la posición 135; . G en una posición que corresponde a la posición 135; R en una posición que corresponde a la posición : L35, con H en una posición que corresponde a la posición 141; Y en una posición que corresponde a la posición 141; R en una posición que corresponde a la posición 142; R en una posición que corresponde a la posición 147; V en una posición que corresponde a la posición 147; K en ; una posición que corresponde a la posición 148; G en una posición que corresponde a la posición 150; K en una posición que corresponde a la posición 151; L en una posición que corresponde a la posición 151; M en una posición que corresponde a la posición 151; Q en una posición que corresponde a la posición 152; R en una posición que corresponde a la posición 155; D en una posición que corresponde la posición 156 A en una posición que corresponde la posición 163 E en una posición que corresponde la posición 163 K en una posición que corresponde la posición 163 R en una posición que corresponde la posición 163 M en una posición que corresponde la posición 164 D en una posición que corresponde la posición 165 N en una posición que corresponde la posición 165 A en una posición que corresponde la posición 166 F en una posición que corresponde la posición 166 H en una posición que corresponde la posición 166 L en una posición que corresponde la posición 166 Q en una posición que corresponde la posición 166 R en una posición que corresponde la posición 166 T en una posición que corresponde la posición 166 Y en una posición que corresponde la posición 166 L en una posición que corresponde la posición 169 R en una posición que corresponde la posición 170 K en una posición que corresponde la posición 174 D en una posición que corresponde la posición 198 K en una posición que corresponde la posición 206 L en una posición que corresponde la posición 206 N en una posición que corresponde la . posición 212 M en una posición que corresponde la posición 213 N en una posición que corresponde la posición 213 M en una posición que corresponde la posición ¦ 215 S en una posición que corresponde la posición 219 K en una posición que corresponde la posición 233 R en una posición que corresponde la posición 233 M en una posición que corresponde la posición 234 R en una posición que corresponde la posición 236 E en una posición que corresponde la posición 237 S en una posición que corresponde la posición 238 I en una posición que corresponde la posición 247 T en una posición que corresponde la posición 257 P en una posición que corresponde la posición ' 259 Y en una posición que corresponde la posición 260. K en una posición que corresponde la posición 261 N en una posición que corresponde la posición 261 K en una posición que corresponde la posición 263 R en una posición que corresponde la posición 263 A en una posición que corresponde la posición 269 L en una posición que corresponde la posición 271 M en una posición que corresponde la posición 271 T en una posición que corresponde la posición 272 D en una posición que corresponde la posición 276 S en una posición que corresponde la posición 276 Y en una posición que corresponde la posición 276 K en una posición que corresponde la posición 277; R en una posición que corresponde la posición 277; T en una posición que corresponde la posición 277; H en una posición que corresponde la posición 278; K en una posición que corresponde la posición 278; N en una posición que corresponde la posición 278; R en una posición que corresponde la posición 278; S en una posición que corresponde la posición 278; T en una posición que corresponde la posición 278; Y en una posición que corresponde la posición 278; M en una posición que corresponde la posición 282; V en una posición que corresponde la posición 291; A en una posición que corresponde la posición 293; C en una posición que corresponde la posición 293; F en una posición que corresponde la posición 293; M en una posición que corresponde la posición 293; P en una posición que corresponde la posición 293; Q en una posición que corresponde la posición 293; V en una posición que corresponde la posición 293; E en una posición que corresponde la posición 305; G en una posición que corresponde la posición 308; N en una posición que corresponde la posición 308; E en una posición que corresponde la posición 309; L en una posición que corresponde la posición 309; N en una posición que corresponde a la posición 309; Q en una posición que corresponde a la posición 309; R en una posición que corresponde a la. posición 309; T en una posición que corresponde a la posición 309; A en una posición que corresponde a la posición 310; G en una posición que corresponde a la posición 310; K en una posición que corresponde a la posición 313; R en una posición que corresponde a la posición 313; H en una posición que corresponde a la posición 315; I en una posición que corresponde a la posición 317; K en una posición que corresponde a la posición 317; R en una posición que corresponde a la posición 317; M en una posición que corresponde a la posición 318; H en una posición que corresponde a la posición 320; K en una posición que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 324; A en una posición que corresponde a la posición 325; D en una posición que corresponde a la posición 325; E en una posición que corresponde a la posición 325; G en una posición que corresponde a la posición 325; H en una posición que corresponde a la posición 325; K en una posición que corresponde a la posición 325; M en una posición que corresponde a la posición 325; N en una posición que corresponde a la posición 325; Q en una posición que corresponde a la posición 325; S en una posición que corresponde a la posición 325; V en una posición que corresponde a la posición 326; I en una posición que corresponde a la, posición 328; K en una posición que corresponde a la posición 328; L en una posición que corresponde a la posición 328; S en una posición que corresponde a la posición 328; Y en una posición que corresponde a la posición . 328; G en una posición que corresponde a la posición 347; S en una posición que corresponde a la posición 347; V en una posición que corresponde a la posición 353; con T en una posición que corresponde a la posición 359; R en una posición que corresponde a la posición 371; P en una posición que corresponde a la posición 377; T en una posición que corresponde a la posición 377 W en una posición que corresponde a la posición 380; Y en una posición que corresponde a la posición 380 K en una posición que corresponde a la posición · 389; M en una posición que corresponde a la posición 392 R en una posición que corresponde a la posición 395; M en una posición que corresponde a la posición 399 T en una posición que corresponde a la posición 399; W en una posición que corresponde a la posición 399; G en una posición que corresponde a la posición 405/ D en una posición que corresponde a la posición 407 Q en una posición que corresponde a la posición 407; A en una posición que corresponde a la posición 409 Q en una posición que corresponde a la posición 409; T en una posición que corresponde a la posición 410 P en una posición que corresponde a la posición 418; F en una posición que corresponde a 1.a posición 419 I en una posición que corresponde a la posición 419; K en una posición que corresponde a la posición 419 R en una posición que corresponde a la posición 419; S en una posición que corresponde a la posición 419 H en una posición que corresponde a la posición 421; K en una posición que corresponde a la posición 421 N en una posición que corresponde a la posición 421; Q en una posición que corresponde a la posición 421 R en una posición que corresponde a la posición 421; S en una posición que corresponde a la posición 421 K en una posición que corresponde a la posición 425; A en una posición que corresponde a la posición 431 H en una posición que corresponde a la posición 431; K en una posición que corresponde a la posición 431 Q en una posición que corresponde a la posición 431; R en una posición que corresponde a la posición 431 S en una posición que corresponde a la posición 431; V en una posición que corresponde a la posición 431 L en una posición que corresponde a la posición 433; R en una posición que corresponde a la posición 433 T en una posición que corresponde a la posición 433; V en una posición que corresponde a la posición 433 K en una posición que corresponde a la posición 436; I en una posición que corresponde a la posición 437 M en una posición que corresponde a la posición 437; T en una posición que corresponde a la posición 438 V en una posición que corresponde a la posición 439; H en una posición que corresponde a la posición 440 R en una posición que corresponde a la posición 440; F en una posición que corresponde a la posición 441 R en una posición que corresponde a la posición 442·; A en una posición que corresponde a la posición 443 M en una posición que corresponde a la posición 443; M en una posición que corresponde a la posición 445 P en una posición que corresponde a la posición 445; A en una posición que corresponde a la posición 446 D en una posición que corresponde a la posición 447; N en una posición que corresponde a la posición 447 y/o con Q en una posición que corresponde a la posición 447, con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
Entre los polipéptidos que muestran actividad de hialuronidasa incrementada son aquellos que muestran por lo menos 2.0 veces la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Por ejemplo, entre estos son los polipéptidos PH20 modificados que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 24, 29, 31, 48, 58, 69, 70, 75, 84, 97, 165, 166, 71, 278, 317, 320, 325 y 326 con referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO:3, tal como los polipéptidos ??2? modificados que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: E en una posición que corresponde a la posición , 24; E en una posición que corresponde a la posición 29; V en una posición que corresponde a la posición 33; N en una posición que corresponde a la posición 48; en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición 58; A en una posición que corresponde a la. posición .69; F en una posición que corresponde a la posición 69; G en una posición que corresponde a la posición 69; P en una posición que corresponde a la posición 69; R en una posición que corresponde a la posición 69; A en una posición que corresponde a la posición 70; F en una posición que corresponde a la¦ posición 70; G en una posición que corresponde a la posición 70; H en una posición que corresponde a la posición 70; H en una posición que corresponde a la posición 70; N en una posición que corresponde a la. . posición 70; R en una posición que corresponde a la posición 70; T en una posición que corresponde a la posición 70; V en una posición que corresponde a la posición 70; L en una posición que corresponde a la posición 75; T en una posición que corresponde a la posición 75; G en una posición que corresponde a la posición 84; G en una posición que corresponde a la posición 97; D en una posición que corresponde a la posición 165 L en una posición que corresponde a la posición 166 R en una posición que corresponde a la posición 166 T en una posición que corresponde a la posición 166 L en una posición que corresponde a la posición 271 H en una posición que corresponde a la posición 278 R en una posición que corresponde a la posición 278 K en una posición que corresponde a la posición 317 K en una posición que corresponde a la posición 320 en una posición que corresponde a la posición 325, con G en una posición que corresponde a la posición 325; K en una posición que corresponde a la posición 325; N en una posición que corresponde a la posición 325; Q en una posición que corresponde a la posición 325; y V en una posición que corresponde a la posición 326; con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ DD NO: 3.
Entre cualquiera de¦ los polipéptidos proporcionados en la presente que muestran actividad de hialuronidasa incrementada, cualquiera de tales polipéptidos PH20 modificados contienen una sola modificación de aminoácidos, tal como un reemplazo, y combinaciones de modificaciones, tal como por lo menos o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y más modificaciones. La modificación, tal como el reemplazo, puede estar en un polipéptido PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o es un fragmento truncado C-terminal de la misma que es un polipéptido PH20 soluble,, tal como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 o 32-66, o tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, cualquiera de tales polipéptidos PH20 modificados tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 3.
También se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en el polipéptido PH20 cuyas' secuencias se expone en SEQ ID NO: 7, un fragmento truncado C-t'erminal de la misma, un fragmento soluble de la misma, o en un polipéptido PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 91% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ?) NO: 7, donde por lo menos un reemplazo (s) de aminoácidos está en un aposición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,20, 22, 23, 24, 26, 27, 8, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, .50, 51, 52, 54, 58, .59, 60, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 110, 114, 117, 118, 119, 120, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, . 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 71, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178,. 179, 180, 181, 182, ¦ 183, 184, 186, 192, 193, 195, 196, 197, 198, 200, 202, 204, 205, 206, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 224, 226, 230, 231, 32, 233, 234, 235, 236, 37, 238, 239, 240, 242, 245, 247, 248, 251, 253, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 297, 298, 300, 301, 302, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 31:5, 31, 317, 318, 320, 21, 23, 3.24, 325, 326, 327, 328, 331, 334, 335, 338, 339, 342, 43, 347, 48,349, 351, 353, 356, 357, 358, 359, 360, 3 1, 367, 368, 369, 371, 373, 374, 75, 376,377, 78, 379, 380, 381, 383, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 401, 403, 404, 405, 406, 407, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 425, 426, 427, 428, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444,445, 446 y 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO.3 o 7, donde las posiciones ¦ de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3; y con la condición de que si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 13, 47, 131, o 219 el reemplazos no es el reemplazo con una Alanina (A) . Entre estos polipéptidos PH20 modificados son aquellos que muestran por lo menos 40% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos, donde, como en todos los casos en la presente la actividad se compara bajo las mismas condiciones.
Incluidos entre estos polipéptidos son aquellos que contienen un reemplazo de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 y 72, o en. una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 91% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69, o 72. En particular, el polipéptido PH20 modificado contiene reemplazos de aminoácidos in SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69, o 72, que son polipéptidos que son un fragmento truncado C-terminal de SEQ ID NO: 7, o un polipéptido PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo. menos 91% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. En particular, entre cualquiera de tales polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente son cualquiera que incluya aquellos en los cuales el reemplazo de aminoácidos es un reemplazo de aminoácidos expuesto en la Tabla 3 posterior. Por ejemplo, tales polipéptidos PH20 modificados incluyen aquellos que tienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 1, 6, 8, 9,- 10, 11, 12, 14, 15, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 58, 59, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 82, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 94, 97, 102, 104, 107, 114, 118, 120, 127, 128, 130, 131, 132, 135 , 138 139, 140, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 148, 149, 150 r 151, 152, 155, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167 , 169 170, 172, 173, 174, 175, 178, 179, 193, 195, 196, 198 , 204, 205, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 220, 221, 222, 232 233, 234, 235, 236, 237, 238, 240, 247, 248, 249, 257, 258 , 259, 260, 261, .263, 267, 269, 271, 272, 273, 274, 276, 277 278, 279, 282, 283, 285, 287, 289, 291, 292, 293, 298, 305 , 307, 308, 30*9, 310, 313, 314, 315, 317, 318, 320, 321, 324 , 325, 326, 328, 335, 347, 349, 351, 353, 356, 359, 367, 368 r 369, 371, 373, 374, 375, 376, 377, 380, 381, 383, 385, 389 t 392, 393, 395, 396, 399, 401, 404, 405, 406, 407 , 409, 410 , 412, 416, 418, 419, 421, 425, 427, 428, 431, 433, 436, 437 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446 o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Ejemplares de tales reemplazos son aquellos que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: histidina (H) en una posición que corresponde a la posición 1; A en una posición que corresponde a la posición 1; E en una posición que corresponde a la posición G en una posición que corresponde a la ' posición K en una posición que corresponde a la posición Q en una posición que corresponde a la posición R en una posición que corresponde a la posición 1; A en una posición que corresponde a la posición 6; M en una posición que corresponde a la posición Q en una posición que corresponde a la posición 9; G en una posición que corresponde a la posición 10; H en una posición que corresponde a la posición 10; S en una posición que corresponde a la posición 11; E en una posición que corresponde a la posición 12; I en una posición que corresponde a la posición 12; K en una posición que corresponde a la posición 12; T en una posición que corresponde a la posición 12; V en una posición que corresponde a la posición 14; V en una posición que corresponde a la posición 15; M en una posición que corresponde a la posición 15; S en una posición que corresponde a la posición 20; T en una posición que corresponde a la posición 22; E en una posición que corresponde a la posición 24; H en una posición que corresponde a la posición 24; R en una posición que corresponde a la posición 24; A en una posición que corresponde a la posición 26; E en una posición que corresponde a la posición 26; K en una posición que corresponde a la posición 26; M en una posición que corresponde a la posición 26; Q en una posición que corresponde a la posición 26; R en una posición que corresponde a la posición 26; D en una posición que corresponde a la posición 27; K en una posición que corresponde a la posición 27; R en una posición que corresponde a la posición 27; R en una posición que corresponde a la posición 28; E en una posición que corresponde a la posición 29; I en una posición que corresponde a la posición . 29; K en una posición que corresponde a la posición 29; L en una posición que corresponde a la posición 29; M en una posición que corresponde a la posición 29; P en una posición que corresponde a la posición 29; R en una posición que corresponde a la posición 29; S en una posición que corresponde a la posición 29; T en una posición que corresponde a la posición 29; V en una posición que corresponde a la posición 29; G en una posición que corresponde a la posición 30; H en una posición que corresponde a la posición . 30; K en una posición que corresponde a la posición 30; L en una posición que corresponde a la posición 30; M en una posición que corresponde a la posición 30; R en una posición que corresponde a la posición 30; S en una posición que corresponde a la posición 30; A en una posición que corresponde a la posición 31; C en una posición que corresponde a la posición 31; G en una posición que corresponde la posición 31 H en una posición que corresponde la posición 31 I en una posición que corresponde la posición 31 K en una posición que corresponde la posición 31 L en una posición que corresponde la posición 31 P en una posición que corresponde la posición 31 R en una posición que corresponde la posición 31 S en una posición que corresponde la posición 31 T en una posición que corresponde la posición 31 V en una posición que corresponde la posición 31 W en una posición que corresponde la posición 31 C en una posición que corresponde la posición 32 F en una posición que corresponde la posición 32 G en una posición que corresponde la posición 32 H en una posición que corresponde la posición 32 W en una posición que corresponde la posición 33 G en una posición que corresponde la posición 33 W en una posición que corresponde la posición 34 Q en una posición que corresponde la posición 35 V en una posición que corresponde la posición 35 H en una posición que corresponde la posición 36 N en una posición que corresponde la posición 36 F en una posición que corresponde la posición 37 M en una posición que corresponde la posición 37 V en una posición que corresponde a la posición 38; A en una posición que corresponde a la posición 39; L en una posición que corresponde a la posición 39; N en una posición que corresponde a la posición 39; T en una posición que corresponde a la posición 39; L en una posición que corresponde a la posición 40; T en una posición que corresponde a la posición 41; L en una posición que corresponde a la posición 46; R en una posición que corresponde a la posición 46; D en una posición que corresponde a la posición 47; F en una posición que corresponde a la posición 47; T en una posición que corresponde a la posición' 47; . W en una posición que corresponde a la posición 47, .con F en una posición que corresponde a la posición 48; H en una posición que corresponde a la posición 48; K en una posición que corresponde a la posición 48; N en una posición que corresponde a la posición 48; R en una posición que corresponde a la posición 49; D en una posición que corresponde a la posición 50; S en una posición que corresponde a la posición 50; M en una posición que corresponde a la posición 50; N en una posición que corresponde a la posición 52; Q en una posición que corresponde a la posición 52; R en una posición que corresponde a la posición 52; S en una posición que corresponde la posición 52; T en una posición que corresponde la posición 52; C en una posición que corresponde la posición 58; K en una posición que corresponde la posición 58; L en una posición que corresponde la posición 58; P en una posición que corresponde la posición 58; Q en una posición que corresponde la posición 58; R en una posición que corresponde la posición 58; H en una posición que corresponde la posición 58; N en una posición que corresponde la posición 58; Y en una posición que corresponde la posición 58; N en una posición que corresponde la posición 59; K en una posición que corresponde la posición 63; L en una posición que corresponde la posición 63; M en una posición que corresponde la posición 63; R en una posición que corresponde la posición 63; W en una posición que corresponde la posición 63; V en una posición que corresponde la posición 67; H en una posición que corresponde la posición 68; P en una posición que corresponde la posición 68; Q en una posición que corresponde la posición 68; A en una posición que corresponde la posición 69; C en una posición que corresponde la posición 69; E en una posición que corresponde la posición 69; F en una posición que corresponde la posición 69 G en una posición que corresponde la posición 69 I en una posición que corresponde la posición 69 L en una posición que corresponde la posición 69 M en una posición que corresponde la posición 69 P en una posición que corresponde la posición 69 R en una posición que corresponde la posición¦ 69 T en una posición que corresponde la posición 69 W en una posición que corresponde la posición 69 Y en una posición que corresponde la posición 69 A en una posición que corresponde la posición 70 C en una posición que corresponde la posición 70 F en una posición que corresponde la posición 70 G en una posición que corresponde la posición 70 H en una posición que corresponde la posición 70 K en una posición ' que corresponde la posición 70 L en una posición que corresponde la posición¦ 70 N en una posición que corresponde la posición 70 P en una posición que corresponde la posición 70 R en una posición que corresponde la posición 70 S en una posición que corresponde la posición 70 T en una posición que corresponde la posición 70 Y en una posición que corresponde la posición 70 Y en una posición que corresponde la posición 70 G en una posición que corresponde a la posición 71 N en una posición que corresponde a la posición 71 R en una posición que corresponde a la posición 71 S en una posición que corresponde a la posición 71 K en una posición que corresponde a la posición 72 M en una posición que corresponde a la posición 72 Q en una posición que corresponde a la posición 72 A en una posición que corresponde a la posición 73 H en una posición que corresponde a la posición' 73 K en una posición que corresponde a la posición 73 L en . una posición que corresponde a la posición 73 Q en una posición que corresponde a la posición 73 R en una posición que corresponde a la posición 73 T en una posición que corresponde a la posición ¦ 73 W en una posición que corresponde a la posición 73 A en una posición que corresponde a la posición 74 C en una posición que corresponde a la posición 74 E en una posición que corresponde a la posición 74 F en una posición que corresponde a la posición ' 74 G en una posición que corresponde a la posición 74 H en una posición que corresponde a la posición 74 K en una posición que corresponde a la posición 74 L en una posición que corresponde a la posición 74 M en una posición que corresponde a la posición 74 N en una posición que corresponde la posición 74 P en una posición que corresponde la posición 74 R en una posición que corresponde la posición 74 S en una posición que corresponde la posición 74 V en una posición que corresponde la posición 74 W en una posición que corresponde la posición 74 F en una posición que corresponde la posición 75 L en una posición que corresponde la posición 75 M en una posición que corresponde la posición 75 R en una posición que corresponde la posición 75 T en una posición que corresponde la posición 75 L en una posición que corresponde la posición 79 L en una posición que corresponde la posición 82 N en una posición que corresponde la posición 82 V en una posición que corresponde la posición 83 Q en una posición que corresponde la posición 83 S en una posición que corresponde la posición 83 G en una posición que corresponde la posición 83 E en una posición que corresponde la posición 84 F en una posición que corresponde la posición 84 G en una posición que corresponde la posición 84 N en una posición que corresponde la posición 84 R en una posición que corresponde la posición 84 A en una posición que corresponde la posición 86 H en una posición que corresponde a la posición 86; K en una posición que corresponde a la posición 86; N en una posición que corresponde a la posición 86; S en una posición que corresponde a la posición 86; T en una posición que corresponde a la posición 86; W en una posición que corresponde a la posición 86; C en una posición que corresponde a la posición 87; G en una pos ic i ón que corresponde a la posición 87; L en una posición que corresponde a la posición 87; M en una posición que corresponde a la posición 87; R en una posición que corresponde a la posición 87; S en una posición que corresponde a la posición 87; T en una posición que corresponde a la posición 87; V en una posición que corresponde a la posición 87; Y en una posición que corresponde a la posición 87; C en una posición que corresponde a la posición 89; A en una posición que corresponde a la posición 90; E en una posición que corresponde a la posición 90; H en una posición que corresponde a la posición 90; K en una posición que corresponde a la posición 90; N en una posición que corresponde a la posición 90; R en una posición que corresponde a la posición 90; C en una posición que corresponde a la posición 92; L en una posición que corresponde a la posición 92; I en una posición que corresponde a la posición 93; L en una posición que corresponde a la posición 93; Q en una posición que corresponde a la posición 93; R en una posición que corresponde a la posición 93; S en una posición que corresponde a la posición 93; T en una posición que corresponde a la posición 93; D en una posición que corresponde a la posición 94; Q en una posición que corresponde a la posición 94; R en una posición que corresponde a la posición 94; A en una posición que corresponde a la posición 97; C en un residuo de aminoácidos que corresponde a la .posición 97; D en una posición que corresponde a la posición 97; E en una posición que corresponde a la posición 97; G en una posición que corresponde a la posición 97; L en una posición que corresponde a la posición 97; S en una posición que corresponde a la posición 97; S en una posición que corresponde a la posición 102; T en una posición que corresponde a la posición 102; R en una posición que corresponde a la posición 104; L en una posición que corresponde a la posición 107; A en una posición que corresponde a la posición 114; Q en una posición que corresponde a la posición 118; H en una posición que corresponde a la posición 120; F en una posición que corresponde a la .posición 120; I en una posición que corresponde a la posición 120, S en una posición que corresponde a la posición 120, V en una posición que corresponde a la posición 120, Y en una posición que corresponde a la posición 120, E en. una posición que corresponde a la posición 127. H en una posición que corresponde a la posición 127 N en una posición que corresponde 127; Q en una posición que corresponde a la posición 127; R en una posición que corresponde a la posición 127; I en una posición que corresponde a la posición 128; R en una posición que corresponde a la posición 130; G en una posición que corresponde a la posición 131; I en una posición que corresponde a la posición 131; M en una posición que corresponde a la posición 131 Q en una posición que corresponde a la posición 131 V en una posición que corresponde a la posición 131 N en una posición que corresponde a la posición 132 L en una posición que corresponde a la posición 132 D en una posición que corresponde a la posición 135. G en una posición que corresponde a la posición 135 R en una posición que corresponde a la posición 135, con L en una posición que corresponde a la posición 138 K en una posición que corresponde a la posición 140 R en una posición que corresponde a la posición 141 VÍ en una posición que corresponde a la posición 141 D en una posición que corresponde a la posición 142;; K en una posición que corresponde a la posición 142;; P en una posición que corresponde a la posición 142;; Q en una posición que corresponde a la posición 142; R en una posición que corresponde a la posición 142; S en una posición que corresponde a la posición 142; T; en una posición que corresponde a la posición 142; G en una posición que corresponde a la posición 143; K en una posición que corresponde a la posición 143; R en una posición que corresponde a la posición 144; T en una posición que corresponde a la posición 144; P en una posición que corresponde a la posición 146; . R en una posición que corresponde a la posición 146; A en una posición que corresponde a la posición 147; F en una posición que corresponde a la posición 147; L en una posición que corresponde a la posición 147; R en una posición que corresponde a la posición 147; S en una posición que corresponde a la posición 147; V en una posición que corresponde a la posición 147; K en una posición que corresponde a la posición 148; T en una posición que corresponde a la posición 149; V en una posición que corresponde a la posición 149; A en una posición que corresponde a la posición 150; D en una posición que corresponde a la posición 150; G en una posición que corresponde a la posición 150; N en una posición que corresponde a la posición 150; S en una posición que corresponde a la posición 150; en una posición que corresponde a la posición 150; Y en una posición que corresponde a la posición 150; A en una posición que corresponde a la posición 151; H en una posición que corresponde a la posición 151; K en una posición que corresponde a la posición 151; L en una posición que corresponde a la posición 151; M en una posición que corresponde a la posición 151; Q en una posición que corresponde a la posición 151; R en una posición que corresponde a la posición 151; S en una posición que corresponde a la posición 151; T en una posición que corresponde a la posición 151; V en una posición que corresponde a la posición 151; w en una posición que corresponde a la posición 151; Y en una posición que corresponde a la posición 151; R en una posición que corresponde a la posición 152; T en una posición que corresponde a la posición 152; W en una posición que corresponde a la posición 152; D en una posición que corresponde a la posición 155; G en una posición que corresponde a la posición 155; K en · una posición que corresponde a la posición 155; R en una posición que corresponde a la posición 155; D en una posición que corresponde a la posición 156; Q en una posición que corresponde a la posición 158; S en una posición que corresponde a la posición 158; S en una posición que corresponde a la posición 160; E en una posición que corresponde a la posición 162; A en una posición que corresponde a la posición 163; E en una posición que corresponde a la posición 163; K en una posición que corresponde a la posición 163; Q en una posición que corresponde a la posición 163; R en una pos ición que corresponde a la posición 163; S en una posición que corresponde a la posición 163; M en una posición que corresponde a la posición 164; V en una posición que corresponde a la posición 164; D en una posición que corresponde a la posición 165; F en una posición que corresponde a la posición 165; N en una posición que corresponde a la posición 165; S en una posición que corresponde a la posición 165; V en una posición que corresponde a la posición 165; A en una posición que corresponde a la posición 166; E en una posición que corresponde a la posición 166; F en una posición que corresponde a la posición 166; H en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 166; Q en una posición que corresponde a la posición 166; R en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166; W en una posición que corresponde a la posición 166; Y en una posición que corresponde a la posición 166; D en una posición que corresponde a la posición 167; L en una posición que corresponde a la posición 169; R en una posición que corresponde a la posición 170;. A en una posición que corresponde a la posición 172; R en una posición que corresponde a la posición 173; G en una posición que corresponde a la posición 174; K en una posición que corresponde a la posición 174; N en una posición que corresponde a la posición 174; R en una posición que corresponde a la posición 174; T en una posición que corresponde a la posición 174; T en una posición q e corresponde a la posición 175; K en una posición que corresponde a la posición 178; R en una posición que corresponde a la posición 178; K en una ¦ posición que corresponde a la posición 179; Q en una posición que corresponde a la posición 193; T en una posición que corresponde a la posición 195; N en una posición que corresponde a la posición '. L95; con E en una posición que corresponde a l posición 196; R en una posición que corresponde a la posición '. L96; con D en una posición que corresponde a la posición 198; P en una posición que corresponde a la posición ¦ 204 A en una posición que corresponde a la posición 205 E en una posición que corresponde a la posición 205 L en una posición que corresponde a la posición 205 T en una posición que corresponde a la posición 205 I en una posición que corresponde a la posición 206 K en una posición que corresponde a la posición 206 L e . una posición que corresponde a la posición 206 R en una posición que corresponde a la posición 206 R en una posición que corresponde a la posición 209 N en una posición que corresponde a la posición 212 S en una posición que corresponde a la posición 212 A en una posición que corresponde a la posición 213 M en una posición que corresponde a la posición 213 N en una posición que corresponde a la posición 213 H en una posición que corresponde a la posición 215 M en una posición que corresponde a la posición 215 I en una posición que corresponde a la posición 219 K en una posición que corresponde a la posición 219 S en una posición que corresponde a la posición 219 H en una posición que corresponde a la posición ¦ 220 I en una posición que corresponde a la posición 220 L en una posición que corresponde a la posición 220 V en una posición que corresponde a la posición 220 Q en una posición que corresponde a la posición 221; G en una posición que corresponde a la posición 222; F en una posición que corresponde a la posición 232; G en una posición que corresponde a la posición 233; K en una posición que corresponde a la posición 233; R en una posición que corresponde a la posición 233; M en una posición que corresponde a la posición 234; A en una posición que corresponde a la posición 235; R en una posición que corresponde a la posición 236; C en una posición que corresponde a la posición 237; E en una posición que corresponde a la posición 237; H en una posición que corresponde a la posición 237; Q en una posición que corresponde a la posición 237; T en una posición que corresponde a la posición 237; E en una posición que corresponde a la .posición 238; H en una posición que corresponde a la posición de aminoácidos 23 8; S en una posición que corresponde a la posición 238; A en una posición que corresponde a la posición 240; Q en una posición que corresponde a la posición 240; I en una posición que corresponde a la posición 247; A en una posición que corresponde a la posición 248; V en una posición que corresponde a la posición 249; G en una posición que corresponde a la posición 257; T en una posición que corresponde a la posición 257; R en una posición que corresponde a la posición 257; N en una posición que corresponde a la posición 258; S en una posición que corresponde a la ¦ posición 258; P en una posición que corresponde a la posición 259; M en una posición que corresponde a la posición 260; Y en una posición que corresponde a la posición 260; ? en una posición que corresponde a la. posición 261; K en una posición que corresponde a la posición 261; N en una posición que corresponde a la posición 261; K en una posición que corresponde a la posición 263; R en una posición que corresponde a la . posición 263; T en una posición que corresponde a la posición 267; A en una posición que corresponde a la posición 269; L en una posición que corresponde a la posición 271; M en una posición que corresponde a la posición 271; D en una posición que corresponde a la posición 272; T en una posición que corresponde a la .posición 272; H en una posición que corresponde a la posición 273; Y en una posición que corresponde a la posición 273'; F en una posición que corresponde a la posición 274; D en una posición que corresponde a la posición 276; H en una posición que corresponde a la posición 276; M en una posición que corresponde a la posición 276; R en una posición que corresponde a la posición 276; S en una posición que corresponde a la posición 276; . Y en una posición que corresponde a la posición 276; A en una posición que corresponde a la posición 277; E en una posición que corresponde a la posición 277; H en una posición que corresponde a la ' posición 277; K en una posición que corresponde a la posición 277; M en una posición que corresponde a la posición 277; N en una posición que corresponde a la posición 277; Q en una posición que corresponde a la .posición 277; R en una posición que corresponde a la posición 277; S en una posición que corresponde a la posición 277; T en una posición que corresponde a la posición 277; E en una posición que corresponde a la posición 278; F en una posición que corresponde a la posición 278; G en una posición que corresponde a la posición 278; H en una posición que corresponde a la posición 278; K en una posición que corresponde a la posición 278; N en una posición que corresponde a la posición 278; R en una posición que corresponde a la posición 278; S en una posición que corresponde a la posición 278; T en una posición que corresponde a la posición 278; Y en una posición que corresponde a la posición 278; H en una posición que corresponde a la posición 279; M en una posición que corresponde a la posición 282; S en una posición que corresponde a la posición 283 H en una posición que corresponde a la posición 285 T en una posición que corresponde a la posición 287 S en una posición que corresponde a la posición 289 S en una posición que corresponde a la posición 291 V en una posición que corresponde a la posición 291 C en una posición que corresponde a la posición 292 F en una posición que corresponde a la posición 292 H en una posición que corresponde a la posición 292 K en una posición que corresponde a la posición 292 R en una posición que corresponde a la posición 292 V en una posición que corresponde a la posición 292 A en una posición que corresponde a la posición 293 C en una posición que corresponde a la posición 293 D en una posición que corresponde a la posición 293 F en una posición que corresponde a la posición 293 K en una posición que corresponde a la posición 293 M en una posición que corresponde a la posición 293 P en una posición que corresponde a la posición 293 Q en una posición que corresponde a la posición 293 V en una posición que corresponde a la posición 293 Y en una posición que corresponde a la posición 293 G en una posición que corresponde a la posición 298 E en una posición que corresponde a la posición 305 G en una posición que corresponde a la posición 307 D en una posición que corresponde a la posición 308 G en una posición que corresponde a la posición 308 K en una posición que corresponde a la posición 308 N en una posición que corresponde a la posición 308 R en una posición que corresponde a la posición 308 E en una posición que corresponde a la posición 309 G en una posición que corresponde a la posición 309 H en una posición que corresponde a la posición 309 L en una posición que corresponde a la posición 309 M en una posición que corresponde a la posición 309 N en una posición que corresponde a la posición 309 Q en una posición que corresponde a la posición 309 R en una posición que corresponde a la posición 309 S en una posición que corresponde a la posición 309 T en una posición que corresponde a la posición 309 V en una posición que corresponde a la posición 309 A en una posición que corresponde a la posición 310 G en una posición que corresponde a la posición 310 Q en una posición que corresponde a la posición 310 S en una posición que corresponde a la posición 310 A en una posición que corresponde a la posición 313 G en una posición que corresponde a la posición 313 H en una posición que corresponde a la posición 313 K en una posición que corresponde a la posición 313; P en una posición que corresponde a la posición 313; R en una posición que corresponde a la posición 313; T en una posición que corresponde a la posición 313; Y en una posición que corresponde a la posición 313; con S en una posición que corresponde a la posición 314; Y en una posición que corresponde a la posición 314; A en una posición que corresponde a la posición 315; H en una posición que corresponde a la posición 315; Y en una posición que corresponde a la posición 315; A en una posición que corresponde a la posición 317; I en una posición que corresponde a la pos.ición 317; K en una posición que corresponde a la posición 317; N en una posición que corresponde a la posición 317; Q en una posición que corresponde a la posición 317; R en una posición que corresponde a la posición 317; S en una posición que corresponde a la posición 317; T en una posición que corresponde a la posición 317; W en una posición que corresponde a la posición 317; D en una posición que corresponde a la posición 318; H en una posición que corresponde a la posición 318; K en una posición que corresponde a la posición 318; M en una posición que corresponde a la posición 318; R en una posición que corresponde a la posición 318; H en una posición que corresponde a la posición 320; K en una posición que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 321; S en una posición que corresponde a la posición 321; N en una posición que corresponde a la posición 324; R en una posición que corresponde a la posición 324; A en una posición que corresponde a la posición 325; D en una posición que corresponde a la posición 325; E en una posición que corresponde a la posición 325; G en una posición que corresponde a la posición 325; H en una posición que corresponde a la posición 325; K en una posición que corresponde a la posición 325; M en una posición que corresponde a l posición 325; N en una posición que corresponde a la posición 325; Q en una posición que corresponde a la posición 325; S en una posición que corresponde a la posición 325; V en una posición que corresponde a la posición 325; L en una posición que corresponde a la posición 326; . V en una posición que corresponde a la posición 326; C en una posición que corresponde a la posición 328; G en una posición que corresponde a la posición 328; I en una posición que corresponde a la posición 328; K en una posición que corresponde a la posición 328; L en una posición que corresponde a la posición 328'; S en una posición que corresponde a la posición 328; Y en una posición que corresponde a la posición 328; S en una posición que corresponde a la posición 335; A en una posición que corresponde a la posición 347; G en una posición que corresponde a la posición 347; S en una posición que corresponde a la posición 347; M en una posición que corresponde a la posición 349; R en una posición que corresponde a la posición 349; S en una posición que corresponde a la posición 351; V en una posición que corresponde a la posición 353; con H en una posición que corresponde a la posición 356; S en una posición que corresponde a la . posición 356; E en una posición que corresponde a la posición 359; H en una posición que corresponde a la posición 359; T en una posición que corresponde a la posición 359; A en una posición que corresponde a la posición 367; G en una posición que corresponde a la posición 367; K en una posición que corresponde a la ¦posición 367; S en una posición que corresponde a la posición 367; A en una posición que corresponde a la posición 368; E en una posición que corresponde a la posición 368; K en una posición que corresponde a la posición 368; L en una posición que corresponde a una posición de aminoácidos 368; M en una posición que corresponde a una posición de aminoácidos 368; R en una posición que corresponde a la posición 368; T en una posición que corresponde a una posición de aminoácidos 368; H en una posición que corresponde a la posición 369; R en una posición que corresponde a la posición 369; F en una posición que corresponde a la posición 371; H en una posición que corresponde a la posición 371; K en una posición que corresponde a la posición 371; L en una posición que corresponde a la posición 371; R en una posición que corresponde a la posición 371; S en una posición que corresponde a la posición 371; M en una posición que corresponde a la posición . 373; H en una posición que corresponde a la posición 374; P en una posición que corresponde a la posición 374; A en una posición que corresponde a la posición 375; G en una posición que corresponde a la posición 375; K en una posición que corresponde a la posición 375; R en una posición que corresponde a la posición 375; D en una posición que corresponde a la posición 376; E en una posición que corresponde a la posición 376; Q en una posición que corresponde a la posición 376; R en una posición que corresponde a la posición . 376; T en una posición que corresponde a la posición 376; V en una posición que corresponde a la posición 376; Y en una posición que corresponde la posición 376 D en una posición que corresponde la posición 377 E en una posición que corresponde la posición 377 H en una posición que corresponde la posición 377 K en una posición que corresponde la posición · 377 P en una posición que corresponde la posición 377 R en una . posición que corresponde la posición 377 S en una posición que corresponde la posición 377 T en una posición que corresponde la posición 377 en una posición que corresponde la posición 380 Y en una posición que corresponde la posición 380 S en una posición que corresponde la posición 381 I en una posición que corresponde la posición 383 K en una posición que corresponde la posición 383 L en una posición que corresponde la posición ¦ 383 S en una posición que corresponde la posición 383 A en una posición que corresponde la posición 385 Q en una posición que corresponde la posición 385 V en una posición que corresponde la posición 385 A en una posición que corresponde la posición 389 G en una posición que corresponde la posición 389 L en una posición que corresponde la . posición 389 K en una posición que corresponde la posición 389 Q en una posición que corresponde la posición 389 S en una posición que corresponde a la posición 389; A en una posición que corresponde a la posición 392; F en una posición que corresponde a la posición 392; M en una posición que corresponde a la posición 392; Q en una posición que corresponde a la posición 392; R en una posición que corresponde a la posición 392; V en una posición que corresponde a la posición 392; F en una posición que corresponde a la posición 393; M en una posición que corresponde a la posición 393; A en una posición que corresponde a la posición 395; H en una posición que corresponde a la posición 395; R en una posición que corresponde a la posición 395; A en una posición que corresponde a la posición 396; H en una posición que corresponde a la posición 396; Q en una posición que corresponde a la posición 396; s en una posición que corresponde a la posición 396; K en una posición que corresponde a la posición 399; M en una posición que corresponde a la posición 399; T en una posición que corresponde a la posición 399; V en una posición que corresponde a la posición 399; w en una posición que corresponde a la posición 399; A en una posición que corresponde a la posición 401; E en una posición que corresponde a la posición 401; A en una posición que corresponde a la posición 404; G en una posición que corresponde a la posición 405; F en una posición que corresponde a la •posición 406; N en una posición que corresponde a la posición 406; A en una posición que corresponde a la posición 407; D en una posición que corresponde a la posición 407; E en una posición que corresponde a la posición 407; F en una posición que corresponde a la posición 407; H en una posición que corresponde a la posición 407; Q en una posición que corresponde a la posición 407; P en una posición que corresponde a la posición 407; A en una posición que corresponde a la posición 409; Q en una posición que corresponde a la posición 409; T en una posición que corresponde a la posición 410; Q en una posición que corresponde a la posición 412; R en una posición que corresponde a la posición 412; V en una posición que corresponde a la posición 412; L en una posición que corresponde a la posición 416; E en una posición que corresponde a la posición 18; L en una posición que corresponde a la posición 418; P en una posición que corresponde a la posición 418; R en una posición que corresponde a la posición 418; V en una posición que corresponde a la •posición 18; F en una posición que corresponde a la posición 419; H en una . posición que corresponde a la posición 419; I en una posición que corresponde a la posición 419 en una posición que corresponde a la posición 419 R en una posición que corresponde a la posición 419 S en una posición que corresponde a la posición 419 Y en una posición que corresponde a la posición 419 A en una posición que corresponde a la posición 421 H en una posición que corresponde a la posición 421 K en una posición que corresponde a la posición 421 N en una posición que corresponde a la posición 421 Q en una posición que corresponde a la posición 421 R en una posición que corresponde a la posición 421 S en una posición que corresponde a la posición 421 G en una posición que corresponde a la posición 425 K en una posición que corresponde a la posición 425 Q en una posición que corresponde a la posición 427 T en una posición que corresponde a la posición . 427 L en una posición que corresponde a la posición 428 A en una posición que corresponde a la posición 431 G en una posición que corresponde a la posición 431 E en una posición que corresponde a la posición 431 H en una posición que corresponde a la posición 431 K en una posición que corresponde a la posición 431 L en una posición que corresponde a la posición 431 N en una posición que corresponde a la posición 431 Q en una posición que corresponde a la posición 431; R en una posición que corresponde a la posición 431; S en una posición que corresponde a la posición 431; V en una posición que corresponde a la posición 431; A en una posición que corresponde a la posición 433; H en una posición que corresponde a la posición 433; I en una posición que corresponde a la posición 433; en una posición que corresponde a la posición 433; L en una posición que corresponde a la posición 433; R en una posición que corresponde a la posición ' 433; T en una posición que corresponde a la posición 433; V en una posición que corresponde a la posición 433; W en una posición que corresponde a la posición 433; K en una posición que corresponde a la posición 436; I en una posición que corresponde a la posición 437; M en una posición que corresponde a la posición 437; A en una posición que corresponde a la posición 438; D en una posición que corresponde a la posición 438; E en una posición que corresponde a la posición 438; L en una posición que corresponde a la posición ' 438; N en una posición que corresponde a la posición 438.; T en una posición que corresponde a la posición 438; A en una posición que corresponde a la posición 439; C en una posición que corresponde a la posición 439; K en una posición que corresponde la posición 439 P en una posición que corresponde la posición 439 Q en una posición que corresponde la posición 439 T en una posición que corresponde la posición 439 V en una posición que corresponde la posición 439 D en una posición que corresponde la posición 440 H en una posición que corresponde la posición 440 M en una posición que corresponde la posición 440 P en una posición que corresponde la posición 440 R en una posición que corresponde la posición 440 S en una posición que corresponde la posición 440 A en una posición que corresponde la posición 441 F en una posición que corresponde la posición 441 C en una posición que corresponde la posición 442 G en una posición que corresponde la posición 442 R en una posición que corresponde la posición 442 A en una posición que corresponde la posición 443 E en una posición que corresponde la posición 443 F en una posición que corresponde la posición 443 G en una posición que corresponde la posición 443 M en una posición que corresponde la posición 443 N en una posición que corresponde la posición 443 E en una posición que corresponde la posición 444 H en una posición que corresponde la posición 444 V en una posición que corresponde a la posición 444; H en una posición que corresponde a la posición 445; M en una posición que corresponde a la posición 445; N en una posición que corresponde a la posición 445; P en una posición que corresponde a la posición 445; Q en una posición que corresponde a la posición 445; S en una posición que corresponde a la posición 445; T en una pos ición que corresponde a la posición 445; V en una posición que corresponde a la posición 445; W en la posición que corresponde a la posición 445; A en una posición que corresponde a la posición 446; M en una posición que corresponde a la posición 446; W en una posición que corresponde a la posición 446; D en una posición que corresponde a la posición 447; E en una posición que corresponde a la posición 447; G en una posición que corresponde a la posición 447; I en una posición que corresponde a la posición 447 ; N en una posición que corresponde a la posición 447 ; P en una posición que corresponde a la posición 447; Q en una posición que corresponde a la posición 447; T en una posición que corresponde a la posición 447,r y/o el reemplazo con V en una posición que corresponde a la posición 447, cada uno con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Entre estos polipéptidos PH20 modificados son aquellos que muestran por lo menos 40% de la actividad del PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos particular. La actividad puede variar entre, por ejemplo, 40% a 5000%, 40% a 2000%, 40% a 1000%, 40% a 500%, 40% a 100%, 80% a 2000%, 80% a 600%, 8.0% a 200%, 80% a 300%, de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Tal actividad incluye por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%', 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000% o más de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos, donde, como en todos los casos en la presente, las actividades se comparan bajo las mismas condiciones.
En particular, se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que contienen por lo menos un reemplazo de aminoácidos en un polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 7, un fragmento truncado C-terminal del mismo, o en un polipéptido PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 91% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o un fragmento truncado correspondiente, donde-: los polipéptidos ??2? modificados muestran menor que 20% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos, donde las actividades se comparan . bajo las mismas condiciones; el reemplazo ( s ) de aminoácidos está en una posición de aminoácidos, que corresponde a una posición seleccionada de entre 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19·, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115 , 116,. 117, 118, 119 , 121, 122, 123, 124 , 125, 126, 127, 128 , 129, 130, 131, 132 , 133, 134, 135, 136 , 137, 138, 139, .143 , 144, 145, 149, 150 , 152, 153, 154, 155 , 156, 157, 158, 159 , 161, 163, 164, 165 , 166, 167, 168, 169 , 170, 171, 17'2, 173 , 174, 175, 176, 178 , 179, 180, 181, 182 , 183, 184, 185, 186 , 187, 188, 189, 190 , 191, 192, 193, 194 , 195, 197, 198, 199 , 200, 201, 202, 203 , 204, 206, 207, 208 , 209, 210, 211, 212 , 213, 214, 215, 216 , 217, 218, 219, 220 , 221, 222, 223, 224 , 225, 226, 227, 228 , 229, 230, 231, 232 , 233, 234, 235, 236 , 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245 , 246, 247, 248, 249 , 250,. 251, 252, 253 , 254, 255, 256, 257 , 258, 260, 261, 262 , 263, 264, 265, 266 , 267, 268, 269, 270 , 271, 272, 273, ¦ 274 , 275, 276, 278, 279 , 280, 282, 283, 284 , 285, 286, 287, 288 , 289, 290, 291, 292 , 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300', 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 310, 311, ' 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 331, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347 , 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 408, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 419, 420, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 434, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444 , o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos . expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7; la posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3; y con la condición de que: (i) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 200, 333, 358 o 393 el reemplazo no es el reemplazo con una Alanina (A) . (ii) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 111 o 249 el reemplazo no es el reemplazo con una asparagina (N) ; (iii) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 113 el reemplazo no es el reemplazo con una glutamina (Q) ; (iv) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 176 el reemplazo no es el reemplazo con una glicina (G) ; y (v) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 252 el reemplazo no es el reemplazo con una treonina (T) .
Ejemplares de tales polipéptidos PH20 modificados son cualquiera que contenga reemplazo (s) de aminoácidos en un polipéptido PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69, o 72, o en una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 91% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69, o 72.· Por ejemplo, el polipéptido PH20 modificado contiene el reemplazo (s) de aminoácidos en SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69, o 72, que son los polipéptidos que son un fragmento truncado C-terminal de SEQ ID NO: 7, o un polipéptido PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 91% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N0;7. En ejemplos de tales polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente, los polipéptidos PH20 modificados pueden mostrar actividad similar o la misma como el PH20 sin la modificación, o pueden mostrar actividad incrementada o actividad que es menor que 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05% o menor de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Ejemplares de tales polipéptidos PH20 modificados son cualquiera expuesta en Tabla 5. Entre cualquiera y todos los polipéptido PH20 modificados proporcionados en la presente y en lo anterior, el polipéptido PH20 modificado es uno que no consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 6-66, 69-72, 856-861, 869 o 870. En particular, entre cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente en lo anterior o en cualquier lugar en la presente son cualquiera que contenga un reemplazo (s) de aminoácidos en un polipéptido PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 3, 7, 69 o 72 con la condición de que: (i) donde el polipéptido PH20 modificado incluya solo un reemplazo de aminoácidos individual el reemplazo no corresponde a los reemplazos de aminoácidos V12A, N47A, D111N, E113Q, N131A, R176G, N200A, N219A, E249Q, R252T, N333A o N358A, con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; (ii) donde el polipéptido PH20 modificado incluya solamente dos reemplazos, de aminoácidos los reemplazos no corresponden a los reemplazos de aminoácidos P13A L464W, N47A/N131A, N47A/N219A, N131A/N219A o N333A/N358A con referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO : 3 ; y (iii) donde el polipéptido PH20 modificado incluye solo tres reemplazos de aminoácidos los reemplazos no corresponden a los reemplazos de aminoácidos N47A/N131A N219A, con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
Cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados anteriores y cualquiera, proporcionado en la presente y descrito en lo anterior y posteriormente pueden contener 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,74, 75,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, o más de los reemplazos de aminoácidos. Los polipéptidos PH20 modificados pueden incluir una secuencia señal, incluyendo la secuencia nativa o una secuencia meteoróloga o una secuencia modificada, y también incluye un polipéptido PH20 maduro que carece de la secuencia señal.
Entre cualquiera de los polipéptido PH20 modificados proporcionados en la presente en lo anterior o descritos posteriormente son polipéptidos pH20 modificados que contienen la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 73-855 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 73-855 y que contenga por lo menos un reemplazo de aminoácidos, tal como cualquiera descrito en lo anterior en cualquiera lugar en la presente, con referencia a las posiciones comparadas con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. En cualquiera de los ejemplos de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente, el polipéptido PH20 modificado no tiene o no contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-31, 69-72, 856-861, 869 o 870.
Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se puede purificar o aislar sustancialmente, pueden mostrar actividad catalítica en pH neutro, se pueden secretar en expresión de células y son solubles en el sobrenadante, y/o pueden incluir aminoácidos modificados, tal como una modificación seleccionada de entre glicosilación, sialación, albuminación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación, conjugación a un polímero, tal como PEGilación o conjugación a dextrano, conjugación a otra porción, tal como dominio de multimerización, toxina etiqueta detectable o fármaco, y fosforilación el polipéptido PH20 modificado se puede glicosilar, tal como al contener por lo menos una porción de N-acetilglucosamina ligado a cada uno de por lo menos tres residuos de asparagina (N) , donde, por ejemplo, los tres residuos de asparagina corresponden a los residuos de aminoácidos 200, 333 y 358 de SEQ ID NO: 3. Los dominios de multimerización incluyen los dominios Fe, También se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente. Se proporcionan vectores, eucarióticos o procarióticos , que contienen las moléculas de ácidos nucleicos. Los vectores incluyen vectores de expresión e incluyen vectores de mamífero, incluyendo vectores virales. Los vectores virales incluyen vectores de adenovirus, vectores de retrovirus, vectores de vaccinia, vectores de virus de herpes simple y citomegalovirus , y otros tales vectores virales. De interés son los vectores oncolíticos que se acumulan en o se orientan a los tumores. También se proporcionan células que contienen las moléculas de ácidos nucleicos y células que contienen los vectores. Las células pueden ser procarióticas o eucarióticas, particularmente células de mamífero, tales como células de Ovario de Hámster Chino (-CHO) .
También se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que se produce mediante cualquiera de las células proporcionadas. De esta manera, se proporcionan en la presente métodos para producir un polipéptido PH20 modificado al cultivar cualquiera de las células proporcionadas en la presente bajo condiciones mediante las cuales un polipéptido PH20 modificado codificado se produce y se secreta por la célula, y al recuperar el polipéptido expresado. También se proporciona en la presente un método para producir un polipéptido PH20 modificado al introducir cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la presente o cualquiera de los vectores proporcionados en la presente en una célula capaz de incorporar porciones de azúcar ligadas a N en el polipéptido, cultivar la célula bajo condiciones mediante las cuales un polipéptido PH20 modificado codificado se produce y se secreta por la célula, y al recuperar el polipéptido expresado. En tales ejemplos, el ácido nucleico se liga operablemente a un promotor. La célula cultivada puede ser una célula eucariótica, tal como una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) .
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente o cualquiera de los ácidos nucleicos o vectores proporcionados en la presente. Las composiciones se pueden formular con otros agentes y/o con otros componentes, tal como conservadores. Las composiciones se pueden formular de modo que los componentes, particularmente el PH20 y cualquier otro agente activo, permanecen activos o son estables bajo condiciones preseleccionadas . Además, . como se describe en la presente, los polipéptidos PH20 se modifican de modo que muestran estabilidad incrementada bajo varias condiciones. Por ejemplo, se proporcionan composiciones en las cuales el polipéptido PH20 modificado es estable (es decir, retiene la actividad como se describe en la presente) en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive, durante por lo menos 1 mes o es estable en una temperatura de o de aproximadamente 30°C a 42°C, inclusive, durante por lo menos 3 días. Se proporcionan composiciones en las cuales el polipéptido PH20 modificado en la composición es estable en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive, durante por lo menos 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, por lo menos 8 meses, por lo menos 9 meses, por lo menos 10 meses, .por lo menos 11 meses, por lo menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, 26 meses, 27 meses, 28 meses, 29 meses o 30 meses. También se proporcionan composiciones en las cuales el polipéptido PH20 modificado en la composición es estable en una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, inclusive, durante por lo menos 3 días, por lo menos 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días o más. Las composiciones farmacéuticas pueden contener un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las condiciones, formulaciones, componentes, y polipéptido PH20 modificado se eligen para lograr una estabilidad deseada. 'Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para administración directa o pueden requerir dilución. Se pueden formular para múltiple o una sola administración de dosificación. Las composiciones ejemplares incluyen concentraciones de PH20 modificado entre o aproximadamente entre 0.1 \iq/ a 100 g/mL, 1 ^g/mL a 50 g/mL o 1 g/mL a 20 g/mL, o 10 U/mL a 5000 U/mL, 50 U/mL a 4000 U/mL, 100 U/mL a 2000 U/mL, 300 U/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, o 100 U/mL a 1000 U/mL. Las sales ejemplares incluyen . NaCl en una concentración, por ejemplo, de menos que o aproximadamente o 200 mM, 180 mM, 150 m , 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 M, 10 mM, 5 mM o menos, o entre o aproximadamente entre 0.1 mM a 200 mM, 0.1 mM a 100 mM, 120 mM a 200 mM, 10 mM a 50 mM, 10 mM a 90 mM, 80 mM a 200 mM, 80 mM a 140 mM, 50 mM a 100 mM, 80 mM a 100 mM, 50 mM a 80 mM, 100 -mM a 140 mM o 120 mM a 140 mM.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener una cantidad antimicrobianamente efectiva de un conservador o mezcla de conservadores, tales como uno, dos, tres, cuatro o más de un conservador ( es ) fenólico, un conservador (es ) no fenólico o un conservador (es) fenólico y un conservador (es ) no fenólico, tal como, pero no limitado a, fenol, m-cresol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol, diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina , EDTA, bronopol, acetato fenilmercúrico, glicerol, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, o-cresol, p-cresol, clorocresol, cetrimida, cloruro de benzetonio, etil-parabeno, propilparabeno, butilparabeno y cualquier combinación de los mismos. Los fenoles incluyen, por ejemplo, fenol, metacresol (m-cresol) , alcohol bencílico, y parabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno. Las concentraciones efectivas anti-microbianas de uno o más agentes conservadores (como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) ) pueden estar entre 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive. Ejemplos de los mismos son composiciones farmacéuticas donde los conservadores son fenol, m-cresol o fenol y m-cresol y la cantidad como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación es entre o aproximadamente entre 0.1% a 0.25% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.2% de m-cresol, es entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.2% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.6% a 01.8% m-cresol, entre o aproximadamente entre 0.1% a 0.15% de fenol y 0.8% 10.15% de m-cresol, es entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.15% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.06 a 0.09% de m-cresol o es entre o aproximadamente entre 0.12% a 0.18% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.14 a 0.22% de m-cresol.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener un agente terapéuticamente activo adicional. El agente activo se puede formular en la . composición o proporcionar como una combinación con la composición que contiene PH20, pero en una composición separada para la administración separada, secuencial, intermitente, o conjunta. Los agentes terapéuticamente activos incluyen, por ejemplo, un agente seleccionado de entre un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente anti-inflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida , un agente anti-parkinson, un agente anti-malaria, un agente anti-convulsionante, un agente antidepresivo, y agente antiartríticos, un agente ariti-fúngico, un agente anti-hipertensivo, un agente antipirético, un agente antiparásitos, un agente anti-histamina, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador de canal de calcio, un agente de fármaco cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestionante, un agente diurético, un agente depresor, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción de músculos, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante físico, un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizador, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente antiinflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de enzima convertidora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un. fármaco, una molécula orgánica y un inductor de sueño. Ejemplares de tales agentes son los anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales , una preparación de Globulina Inmunitario, un bifosfonato, una citoquina, un agente quimioterapéutico, un factor de coagulación y una insulina. Las insulinas incluyen, por ejemplo, insulinas básales e insulinas de acción rápida, tal como insulina regular, insulina humana particularmente recombinante, y análogos de insulina, tal como insulina lispro, insulina aspar o insulina glulisina. Las insulinas de acción rápida particulares son aquellas con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 863 o una insulina con una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO: 864 y una B con una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 864 o un análogo de insulina que se selecciona de .entre una insulina que tiene una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 865-867. La cantidad de insulina de acción rápida en las composiciones se puede determinar empíricamente, pero típicamente puede ser 10 U/mL a 1000 U/mL, 50 U/mL a 500 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL o 500 U/mL a 1000 U/mL, inclusive.
En ejemplos particulares, se proporciona en la presente una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada a un conservador fenólico y a una insulina, tal como una insulina de acción rápida. Los polipéptidos PH20 modificados y la insulina se pueden proporcionar en cantidades terapéuticamente efectivas. Por ejemplo, se proporciona · en la presente una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestra estabilidad incrementada a un conservador fenólico en una cantidad que es de o aproximadamente 100 U/mL a 1000 U/mL y una insulina de acción rápida en una cantidad que es de o de aproximadamente 10 U/mL a 1000 U/mL. Por ejemplo, la insulina de acción rápida puede ser un análogo de insulina, tal como insulina lispro, insulina aspart o insulina glulisina u otro análogo. Cualquiera de tales composiciones farmacéuticas se puede formular en un pH que es de o de aproximadamente 7.0 a 7.6. Cualquiera de tales composiciones farmacéuticas también se pueden formular para contener sal, tal como NaCl, en una concentración que es de o de aproximadamente 0.1 mM a 200 mM y/o una cantidad efectiva anti-microbiana de por lo menos un conservador donde la composición contiene generalmente por lo menos un conservador fenólico. La cantidad efectiva antimicrobiana es una cantidad total de uno o más agentes conservadores como un porcentaje ·(%) de concentración de masa (p/v) que es o está entre 0.05% a 0.6%. El conservador ( es ) fenólico puede ser un fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico, o un parabeno. En cualquiera de los ejemplos anteriores, una composición farmacéutica, la composición también puede contener un tensoactivo, tal como un polipropilenglicol , polietilenglicol, glicerina, sorbitol, poloxámero o polisorbato, en una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación que es por lo menos o por lo menos aproximadamente 0.001%; un agente amortiguador que es un agente de ligación no de metal o es un agente de ligación de metal, tal como Tris, histidina, fosfato o citrato, en donde la concentración del agente amortiguador es entre o entre aproximadamente 1 mM a 100 mM; glicerina en una concentración menor que 60 mM; un antioxidante, tal . como, cisteína, triptófano o metionina, en una concentración entre o de aproximadamente entre 2 mM a 50 mM, inclusive; y/o zinc en una concentración de entre o aproximadamente entre 0.001 a 0.1 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U) . También se proporcionan en el presente sistema de bucle cerrado, bombas de insulina que incluyen bombas de insulina de infusión subcutánea continua (CSII) y plumas de insulina que contienen cualquiera de las composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas se pueden usar en los métodos o usos para tratar diabetes, tales como diabetes mellitus tipo 1, 2 diabetes mellitus tipo 2 o diabetes gestacional.
Otros agentes terapéuticos en cualquiera de las composiciones farmacéuticas proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a Adalimumabs, Agalsidasas Beta, Alefacepts, Ampicilinas, Anaquinras, Vacunas Anti-poliomielíticas , Anti-Timocitos , Azitromicinas , Becaplermins , Caspofungins , Cefazolinas, Cefepimas, Cefotetanos, Ceftazidimas , Ceftriáxonas , Cetuximabs, Cilastatinas , Ácidos Clavulánicos , Clindamicinas , Darbepoetinas Alfa, Daclizumabs, Difteria, antitoxinas de Difteria, Toxoides de Difteria, Efalizumabs, Epinefrinas, Eritropoyetinas Alfa, Etanercepts, Filgrastims, Fluconazoles , Hormonas Estimuladoras de Folículos, Folitropinas Alfa, Folitropina Betas, Fosfenitoinas , Gadodiamidas , Gadopentetatos , Gatifloxacinas , Glatirameros, GM-CSF's, Goserelinas, acetatos de Goserelina, Granisetronas, Influenza Hemofílica B, Haloperidoles , Vacunas de Hepatitis, Vacunas de Hepatitis A, Vacunas de Hepatitis B, Tiuxetanos de Ibritumomab, Ibritumomabs , Tiuxetanos, Inmunoglobulinas, vacunas de influenza hemofílica, Vacunas de Virus de Influenza, Infliximabs, Insulina lispro, 75% de protamina lispro enutro (NPL) /25% de insulina lispro, 50% de protamina neutra Hagedorn (NPH) / 50% de insulina regular, 70% de NPH/30% de insulina regular; Insulina Regular, insulina NPH, Ultra insulina, insulina ultralenta, e Insulina Glarginas, Interferones, Interferón alfa, Interferones Beta, Interferón Gammas, Interferón alfa-2a, Interferón alfa 2-b, Interferón Alfacon, Interferón alfa-n, Interferones Beta, Interferones Beta-la, Interferón Gammas, Interferón alfa-con, Iodixanoles, Iohexoles, Iopamidoles, . Ioversoles, Ketorolacos, Laronidasas, Levofloxacina, Lidocainas, Linezolidos, Lorazepams, Vacunas de sarampión, Virus de sarampión, virus de paperas, Vacunas de Virus de sarampión, Paperas-Rubéola, Vacunas de Rubéola,- Medroxiprogesteronas, Meropenems, Metilprednisolonas , Midazolams, Morfinas, Octreotidos, Omalizumabs, Ondansetroñas , Palivizumabs , Pantoprazoles , Pegaspargasas , Pegfilgrastims, Peg-Interferones Alfa-2a, Peg-Interferones Alfa-2b, Pegvisomants , vacunas de Pertussis, Piperacilinas , Vacunas de Pneumococo y Vacunas de. Conjugado de Pneumococo, Prometazinas , Reteplasas, Somatropinas , Sulbactams, Sumatriptans, Tazobactams, Tenecteplasas , Toxoides Purificados del Tétanos, Ticarcilinas , Tositumomabs , Triamcinolonas, Acetonidos de Triamcinolona, Hexacetonidos de Triamcinolona, Vancomicinas , inmunoglobulinas de Varicela Zoster, Vacunas de Varicela, otras vacunas, Alemtuzumabs , Alitretinoinas, Allopurinoles, Altretaminas , Amifostinas , Anastrozoles, Arsénicos, Trióxidos Arsénicos, Asparaginasas, Vacunas de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) , BCG Vivo, Bexarotenos, Bleomicinas, Busulfanos, Busulfano intravenoso, Busulfan orales, Calusteronas, Capecitabinas, Carboplatinas , Carmustinas, Carmustinas con Polifeprosanos, Celecoxibs, Clorambucilos , Cisplatinas, Cladribinas, Ciclofosfamidas , Citarabinas, Citarabina liposomals, Dacarbazinas , Dactinomicinas , Daunorubicina liposomales, Daunorubicinas , Daunomicinas , Diftitoxes de ¦ Denileukina, Dexrazoxanos , Docetaxels, Doxorubicinas , Doxorubicina liposomal, propionatos de Dromostanolona, Soluciones B de Elliott, Epirubicinas , Epoyetina-alfas , Estramustinas, Etoposidos, Fosfato de Etoposido, VP-16s de Etoposide, Exemestanos, Floxuridinas, . Fludarabinas , Fluorouraciloos , 5- Fluorouraciloos, Fulvestrantes , Gemcitabinas , Gemtuzumabs, Ozogamicins , ozogamicinas de Gemtuzumab, Hidroxiureas , Idarubicinas, Ifosfamidas , mesilatos de Imatinib, Irinotecanos, Letrozoles, Leucovorinas , Levamisoles, Lomustinas, CCNUs, ecloretaminas, mostazas de Nitrógeno, Megestroles, acetatos de Megestrol, Melfalanos, L-PAMs, Mercaptopurinas, 6-Mercaptopurinas, Mesnas, Metotrexatos , Metoxsalenos, Mitomicinas, Mitomicinas C, itotanos, Mitoxantronas, Nandrolonas, Fenpropionatos de Nandrolona, Nofetumomabs, Oprelvequinas, Oxaliplatinas , Paclitaxels, Pamidronatos , Pegademasos, Pentostatinas , Pipobromanos , Plicamicinas, Mitramicinas, Porfimeros , Porfimero sódico, Procarbazinas , Quinacrinas, Rasburicass, Rituximabs, Sargramostims, Estreptozocinos , Talcos, Tamoxi enos , Temozolomidas , Teniposidas, Testolactonas, Tioguaninas , 6-Tioguaninas, Trietilentiofosforamidas (Tiotepas), Topotecanos, Toremifenos, Trastuzumabs , Tretinoinas, Mostaza de Uracilo, Valrubicinas , Vinblastinas , Vincristinas , Vinorelbinas, Zoledronatos, Acivicinas, Aclarubicinas , Acodazoles, Acroninas, Adozelesinas , Aldesleucinas , Áciros Retinoicos, Alitretinoinas , Ácidos 9-Cis-Retinoico , Alvocidibs, Ambazonas, Ambomicinas, Ametantronaes , Aminoglutetimidas , Amsacrinaes, Anaxironas, Ancitabinas, Antramiinas, Apaziquomn, Argimesnas , Asperlinas, Atrimusti nas, Azacitidinas , Azetepas, Azotomicinas , Banoxantronas , Batabulinas, Batimastatas , Benaxibinas, Bendamustinds, Benzodepas, Bicalutamidas , Bietaserpinas , Biricodars, Bisantrenes, Dimesilatos Bisnafida, Bizelesinas, Bortezomibs, Brequinars, Bropiriminas , Budotitanos, Cactinomicinas, Canertinibs, Caracemides, Carbetimeros , Carboquonas, Carmofurs, Carubicinas, Carzelesinas , Cedefingoles, Cemadotinas, Clorambucilos, Cioteronelos , Cirolemicinas, Clanfénuros, Clofarabinas, Crisnatoles , Decitabinas, ] Dexniguldipinas , Dexormaplatinas , Dezaguaninas , Diaziquonas , Dibrospidio, Dienogests, Dinalinas , Disermolidas, Dofequidars, Doxifluridinas, Droloxifenos , Duazomicinas, Ecomustinas, Edatrexatos , Edotecarinas , Eflornitinas, Elacridars , Elinafidas, Elsamitrucinas , Emitefurs , Enloplatinas , Enpromatos , Enzastaurinas , Epipropidinas, Eptaloprosts , Erbulozolas, Esorabicinas , Etanidazoles , Etoglucidos , Etoprinas , Exisulindas , Fadrozoles , Fazarabinas, Fenretinidas, Fluoximesteronas , Flurocitabinas , Fosquidonas, Fostriecinas, Fotretaminas , Galarubicinas , Galocitabinas , Geroquinoles , Gimatecanos , Gimeracilos , Gloxazonas , Glufosfamidas , Ilmofosinas , Ilomastatos , Imexonas , Improsulfanos , Indisulamas , Inproquonas , Interleucinas , Interleucinas-2 , Interleucinas recombinantes , Intoplicinas , lobenguanos, Iproplatinas , Irsogladinas , Ixabe ilonas , Cetotrexatos , L-Alanosinas , Lanreotidos , Lapatinibs, Ledoxantronas , Leuprolidos , Leuprorelinas , Lexacalcitoles , Liarozoles, Lobaplatinas , Lometrexoles , Lonafamibs , Losoxantronas , Lurtotecanos , Mafosfamidas, Mannosulfanos, Marimastatos, Masoprocoles , Maitansinas , ecloretaminas , Melengestroles , Melfalanos , Menogarilos, Mepitiostanos, Metesinds , Metomidatos , Metoprinas, Meturedepas, Miboplatinas, Miproxifenos , Misonidazoles, Mitindomidas, Mitocarcinas, Mitocrominas, Mitoflaxonas, Mitogilinas, Mitoguazonas , Mitomalcinas , Mitonafidas, Mitoquidonas , Mitospers, Mitozolomidas , Mivobulins, Mizoribinas, Mofarotenos , Mopidamoles, Mubritinibs, Ácidos Micofenólicos, Nedaplatinas , Neizarabinas , Nemorubicinas, itracrinas, Nocodazoles, Nogalamicinas , Nolatrexeds, Nortopixantronas , Ormap] atinas , Ortataxels, Oteracilos, Oxisuranos, Oxofenarsinas , Patupilonas, Peldesinas, Peliomicinas, Pelitrexoles , Pemetrexeds , Pentamustinas , Peplomicinas , Perfosfamidas , Perifosinas, Picoplatinas , Pinafidas, Piposulfanos , Pirfenidonas , Piroxantronas, Pixantronas, Plevitrexeds , Plomestanos, Porfiromicinas , Prednimustinas , Propamidinas , Prospidiums , Pumitepas, Puromicinas, Pirazofurinas , Ranimustinas , Riboprinas, Ritrosulfanos , Rogletimidas , Roquinimexs, Rufocromomicinas , Sabarubicinas, Safingoles, Satraplatinas , Sebriplatinas , Semustinas, Simtrazenos , Sizofiranos, Sobuzoxanos, Sorafenibs, Esparfosatos , Ácidos Esparfósicos, Eparsomicínas , Espirogermanio, Espiromustinas , Espiroplatinas, Esqualaminas , streptonigrinas , Estreptovaricinas, Sufosfamidas, Sulofenuros, Tacedinalinas , Talisomicinas, Talimustinas , Tariquidares , Tauromustinas , Tecogalanos, Tegafuros, Teloxantronas , Temoporfinas , Teroxironas, Tiamiprinas , Tiamiprinas, Tiazofurinas , Tilomisoles, Tiloronas, Timcodares, Timonacics, Tirapazaminas, Topixantronas , Trabectedinas , Ecteinascidina 743, Trestolonas, Triciribinas, Trilostanas, Trimetrexatos , Tetranitratos de Triplatina, Triptorelinas, Trofosfamidas , Tubulozoles, Ubenimexs, Uredepas, Valspodares, Vapreotidos, Verteporfinas , Vinblastinas , Vindesinas, Vinepidinas, Vinfluninas, Vinformidas , Vinglicinatos , Vinleucinoles , Vinleurosinas , Vinrosidinas, Vintriptoles, Vinzolidinas , Vorozoles, Xantomicinas A, Guameciclinas, Zeniplatinas , Zilascorbs [2-H] , Zinostatinas , Zorubicinas, Zosuquidares , Aeetazolamidas , Aciclovires, Adipiodonas, Alatrofloxacinas , Alfentaniles , Ectractos Alergénicos, Inhibidores de Alfa 1-proteinasa, Alprostadilos, Amicacinas, Aminoácidos, Ácidos aminocaproicos, Aminofilinas , Amitriptilinas , Amobarbitales , Ararinonas, Analgésicos, Vacunas anti-poliomieliticas, Sueros anti-rábicos , inmunoglobulinas anti-tétanos , vacunas de tétanos, enfermedades Antitrombina, sueros anti-veneno, Argatrobanos, Argininas, ácidos ascórbicos, Atenololes, Atracurio, Atropinas, Aurotioglucosas, Azatioprinas , Aztreonams, Bacitracinas , Baclofenos, Basiliximabs , ácidos bezoicos, Benztropinas, Betametasonas , Biotinas, Bivalirudinas , Antitoxinas de botulismo, Bretilio, Bumetanidas, Bupivacainas , Buprenorfinas, Butorfanoles , Calcitoninas, Calcitrioles , Calcio, Gapreomicinas , Carboprosts, Carnitinas, Cefamándoles , Cefoperazonas , Cefotaximas, Cefoxitinas, Ceftizoximas, Cefuroximas , Cloranfenicoles , Cloroprocainas , Cloroquinas, Clorotiazidas , Clorpromazinas, Ácidos condroitinsulfúricos , Coriogonadotropina-alfas , Cromo, Cidofovires, Cimetidinas, Ciprofloxacinas , Cisatracurio, Clonidinas, Codeinas, Colquicinas, Colistinas, Colágenos, Triflutatos de ovino de corticorelina, Corticotrofinas, Cosintropinas , Cianocobalaminas , Ciclosporinas , Cisteinas, Dacliximabs, Dalfopristinas, Dalteparinas, Danaparoides, Dantrolenos, Deferoxaminas , Desmopresinas , Dexametasonas , Dexmedetomidinas , Dexpantenoles, Dextranos, Dextranos de hierro, Ácidos Diatrizoicos , Diazepams, Diazoxidas, Diciclominas , Digibindas, Digoxinas, Dihidroergotaminas , Diltiazems, Difenhidraminas , Dipiridamoles , Dobutaminas, Dopaminas, Doxacurio, Doxapramos, Doxercalciferóles , Doxiciclinas , Droperidoles , Difilinas, Ácidos edéticos, Edrofonio, Enalaprilatos , Efedrinas, Epoprostenoles , Ergocalciferóles , Ergonovinas, Ertapenemos, Eritromicinas , Esmololes, Estradioles, Estrogénicos , Ácidos etacrínicos, Etanolaminas, Etanoles, Aceite etiodizados, Ácidos etidrónicos, Etomidatos, Famotidinas, Fenoldopamos , Fentanilo, Flumazenilos, Fluoresceinas, Flufenazinas , Ácidos folíeos, Fomepizoles, Fomivirsenos, Fondaparinuxs , Foscarnets, Fosfenitoinas, Furosemidas, Gadoteridoles , Gadoversetamidas, Ganciclovires, Gentamicinas, Glucagonas, Glucosas, Glicinas, Glicopirrolatos , Gonadorelinas , Gonadotropina coriónica, polisacáridos Hemofilus B, Heminas, Herbales, Histaminas, · Hidralazinas , Hidrocortisonas , Hidromorfonas, Hidroxocobalaminas, Hidroxizinas , Hiosciaminas , Ibutilidos, Tmiglucerasas , carmines Índigo, Indometacinas , Yoduros, Yopromidas, ácido Iotalámicos, ácidos ioxáglicos, Ioxilanos, ¦ Isoniazidos, Isoproterenoles , Vacunas de encefalitis Japonesa, Canamicinas, Cetaminas, Labetaloles, Lepirudinas, Levobupivacainas , Levotiroxinas , Lincomicinas , Liotironinas , Hormonas Luteinizantes, Vacunas de enfermedad de Lyme, Mangafodipires , Manttoles, Vacunas de polisacárido eningocócico, Meperidínas, Mepivacainas , Mesoridazinas , Metaraminoles, Metadonas, Metocarbamoles , Metohexitales , etildopatos, Metilergonovinas, Metoclopramidas , Metoprololes , Metronidazoles , Minociclinas, Mivacurio, Ácidos morruicos, Moxifloxacinas, Muromonab-CD3s, Mofetilos de micofenolato, Nafcilinas, Nalbufinas, Nalmefenos, Naloxonas, Neostigminas, Niacinamidas , Nicardipinas , Nitroglicerinas, Nitroprassidos, Norepinefriñas , Orfenadrinas, Oxacilinas, Oximorfonas, Oxitetraciclinas , Oxitocinas, Pancuronio, Pantenoles, Ácidos pantoténicos, Papaverinas, Peginterferones-alfa 2A, Penicilinas G, Pentamidinas, Pentazocinas, Pentobarbitales , Perflutrenos , Perfenazinas , Fenobarbitales, Fentolaminas , Fenilefrinas , Fenitoinas, Fisostigminas , Fitonadionas, Polimixina, Pralidoximas , Prilocainas, Procainamidas, Procainas, Proclorperazinas , Progesteronas , Propranololes , Hidróxidos de piridostigmina , Piridoxinas, Quinidinas, Quinupristinas , Inmunoglobulinas de rabia, Vacunas de Rabia, Ranitidinas, Remifentanilos , Riboflavinas, Rifampinas, Ropivacainas, Samario, Escopolaminas , Eselenio, Esermorelinas , Sincalidos, Somatremos, Espectinomicinas, Estreptocinasas, Estreptomicinas, Succinilcolinas , Sufentanilos , Sulfametoxazoles, Tacrolimusas, Terbutalinas, Teriparatidos , Testosteronas , antitoxinas de tétano, Tetracainas, Sulfatos de tetradecilo, Teofilinas, Tiaminas, Tietilperazinas , Tiopentalos, Hormonas estimuladoras de la tiroides, Tinzaparinas , Tirofibanos, Tobramicinas, Tolazolinas, Tolbutamidas, Torsemidas, Ácidos tranoxámicos , Treprostinilos, Trifluoperazinas, Trimetobenzamidas , Trimethoprimas, Trometaminas , Tuberculinas , Vacunas de tifoidea, UroFolitropinas , Urocinasas, ácidos Valproicos, Vasopressinas , Vecuronio, Verapamilos, Voriconazoles , Warfarinas, Vacunas de fiebre amarilla, Zidovudinas, Zincs, clorhidratos de Ziprasidona, Aclacinomicinas , Actinomicinas , Adriamicinas, Azaserinas, 6-Azauridinas , Carzinofilinas , Cromomiciñas, Denopterinas, 6-Diazo-5-Oxo-L-No.rleucinas , Enocitabinas, Floxuridinas , Olivomicinas , Pirarubicinas , Piritreximas, Pteropterinas , Tegafuros, Tubercidinas , Alteplasas, Arcitumomabs, bevaci zumabs , Toxinas de Botulinio tipo A, Toxinas de Botulinio Tipo B, Capromab Pendetidos, Daclizumabs, Dornasas-alfa, Drotrecoginas-alfa, Pentetatos e Imcirornab, Yodos 131, un agente antibiótico; un inhibidor de angiogénesis ; sustancias de ret.inopatia anti-cataratas y anti-diabéticas ; inhibidores de anhidrasa carbónicos; midriáticos ; agentes de terapia fotodinámica; análogos de prostaglandina; factor de crecimiento; anti-neoplásicos ; anti-metabolitos ; anti-virales ; amebicidas y anti-protozoarios ; anti-tuberculosis y anti-lepróticos ; antitoxinas y anti-veninas ; factor anti-hemofílico, complejo coagulante anti-inhibidor, antitrombina III, factor de coagulación V, Factor de coagulación IX, fracción de proteína plasmática, factor de von Willebrand; agente anti-plaquetas , un factor de estimulador de colonia (CSF) ; un estimulador de eritropoyesis ; hemostáticos y albúminas; Globulinas Inmunitarias ; inhibidores de trombina; anticoagulantes; un fármaco anti-inflamatorio esteroidal seleccionado de entre alclometasonas, algestonas, beclometasonas, betametasonas , budesonidós, clobetasoles, clobetasonas, clocortolonas , cloprednoles, corticosteronas , cortisonas, cortivazoles , deflazacortes , desonidos, desoximetasonas , dexametasonas , diflorasonas , diflucortolonas, difluprednatos, enoxolonas, fluazacortes , flucloronidas , flumetasonas, flunisolidos , fluocinolonas , fluocinonidos , fluocortinas , fluocortolonas , fluorometolonas , fluperolonas , fluprednidenos , fluprednisolonas , flurandrenolidos , fluticasonas , formocortales, halcinonidos , halobetasoles , halometasonas , halopredonas, hidrocortamatos, hidrocortisonas, etabonato de loteprednol, mazipredonas , medrisonas, meprednisonas , metilprednisolonas, furoato de mometasona, parametasonas , prednicarbatos, prednisolonas , prednisonas, prednivales, prednilidenos , riraexolonas, ' tixocortolesi triamcinolonas ; Docosanoles, prostaglandinas, análogos de prostaglandina , antiprostaglandinas y precursores de prostaglandina; mitóticos, colinérgicos y anti-colinesterasa ; y anti-alergénicos.
Las composiciones y polipéptidos PH20 modificados se pueden utilizar para tratar cualquier condición normalmente tratada por el polipéptido PH20 o el agente terapéuticamente activo. Estas incluyen, por ejemplo, condiciones en las cuales el hialuronano desempeña una función o se asocia con la etiología de la enfermedad . debido a, por ejemplo, acumulación o sobreproducción de hialuronano. Por consiguiente se proporcionan métodos, usos de las composiciones y polipéptidos PH20 modificados para tratar una enfermedad o afección asociada a hialuronano al administrar cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados o composiciones proporcionadas en la presente. Las enfermedades y condiciones asociadas a hialuronano incluyen, por ejemplo, enfermedad inflamatoria y tumores o cánceres, incluyendo un cáncer de etapa tardía, cánceres metastásicos y cánceres no diferenciados, tales como cáncer de ovario, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (SCC) , cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama y cáncer de colon. El polipéptido PH20 se puede modificar para mostrar vida media incrementada para tales tratamientos. Por ejemplo, el polipéptido PH20 se puede modificar con un polímero tal como una porción de PEG para tales tratamientos.
También se proporcionan métodos para incrementar la administración de un agente terapéutico a un sujeto al: administrar a un sujeto cualquiera del polipéptido PH20 modificados o composiciones proporcionadas en la presente, y al administrar el agente terapéutico. El agente terapéutico se puede administrar en la misma composición o separadamente, y se puede administrar antes o después, simultáneamente, o intermitentemente, con la administración del polipéptido ( s ) PH20. La administración incluye cualquier vía, incluyendo la administración intravenosa y subcutánea tal como simultáneamente con, intermitentemente con, o subsecuente a la administración del agente terapéutico. Los agentes terapéuticos incluyen cualquiera de aquellos expuestos en lo anterior, en cualquier lugar en la presente y/o conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica.
También se proporcionan métodos para tratar un exceso de glicosaminoglicanos ; para tratar un tumor; para tratar acumulación de glicosaminoglicano en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular; para tratar un trastorno oftálmico; para tratar una enfermedad pulmonar; para incrementar la penetración de los agentes quimioterapéuticos en los tumores. sólidos; para tratar un trastorno proliferativo; o para implementar la biodisponibilidad de fármacos y otros agentes terapéuticos al administrar los polipéptidos PH20 modificados o composiciones proporcionados en la presente.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con hialuronano; para el uso en la administración de un agente terapéutico a un sujeto; para tratar un exceso de glicosaminoglicanos,- para tratar un tumor; para tratar una acumulación de glicosaminoglicano en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular ; para tratar un trastorno oftálmico; para tratar una enfermedad pulmonar; para incrementar la penetración de los agentes quimioterapéuticos en los tumores sólidos; para tratar celulitis; para tratar un trastorno proliferativo; o para incrementar la biodisponibilidad de fármacos y otros agentes terapéuticos; y para cualquier otro uso de composiciones que contienen polipéptidos PH20.
Se proporciona en la presente un método para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra estabilidad bajo una condición de desnaturalización que incluye las etapas de: a) someter a prueba la actividad de una enzima degradadora de hialuronano modificada en una composición que contiene un agente de desnaturalización y/o bajo una condición de desnaturalización; b) someter a prueba la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada en la misma composición y/o bajo las mismas condiciones como a) excepto ausente del agente de desnaturalización o condición; y c) seleccionar o identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra actividad en a) que es por lo menos 5% de la actividad en b) . En tal ejemplo, la actividad es la actividad de hialuronidasa . En algunos ejemplos de los métodos, una enzima degradadora de hialuronano modificada se selecciona o se identifica si la actividad en a) es por lo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad en b) , por ejemplo, una enzima degradadora de hialuronano modificada se selecciona o se identifica si la actividad en a) es por lo menos 40% o más de la actividad en b) . El método también puede incluir las etapas de: d) comparar la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada en a) a la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada sometida a prueba bajo condiciones; y e) identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra por lo menos 120%), 130%), 135%), 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, . 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% o más de la actividad de hialuronidasa comparada con la enzima degradadora de hialuronano no modificada.
También se proporciona en la presente un método para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra estabilidad, tal como estabilidad incrementada, bajo una condición de desnaturalización, que incluye las etapas de: a) someter a prueba la actividad de una enzima degradadora de hialuronano modificada en una composición que contiene un agente de desnaturalización y/o bajo una condición de desnaturalización; b) someter a prueba la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente en una composición que contiene el mismo agente de desnaturalización y/o .bajo la misma condición de desnaturalización como a) , mediante lo cual la actividad se somete a prueba bajo las mismas condiciones como a); y c) seleccionar o identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra mayor actividad que la enzima degradadora de hialuronano no modificada, identificando o seleccionado de esta manera una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra estabilidad incrementada bajo una condición de desnaturalización. En tal ejemplo, la actividad püede ser una actividad de hialuronidasa . En ejemplos del método, una enzima degradadora de hialuronano modificada se selecciona o se identifica si la actividad es la por lo menos 120%, 130%, 135%, 1.40%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% o más de la actividad comparada con la enzima degradadora de hialuronano no modificada. En tal ejemplo, el método también puede incluir etapas adicionales de: d) someter a prueba la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada seleccionada o identificada en una composición que contiene un agente de desnaturalización y/o bajo una condición de desnaturalización; e) someter a prueba la actividad de la misma enzima degradadora de hialuronano modificada seleccionada o identificada en la misma composición y/o bajo las mismas condiciones como d) excepto ausente del agente o condición de desnaturalización; y f ) seleccionar o identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra actividad en d) que es por lo menos 5% de la actividad en e) . En tal ejemplo, la actividad es la actividad de hialuronidasa . En algunos ejemplos de los métodos, una enzima degradadora de hialuronano modificada se selecciona o se identifica si la actividad en d) . es por lo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad en e), por ejemplo, una enzima degradadora de hialuronano modificada se selecciona o se identifica si la actividad en d) es por lo menos 40% o más de la actividad en e) .
En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada, el agente o condición de desnaturalización es provocada por la temperatura, agitación, o bajo contenido de sal o la presencia de un excipiente. Por ejemplo, el agente o condición de desnaturalización o provocada por temperatura elevada que es de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, tal como mayor que o mayor que aproximadamente 30°C, 31°C, 32 °C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C o 42°C. En otros ejemplos, el agente o condición de desnaturalización es la ausencia de sal o bajo contenido de sal menor que 100 mM, tal como bajo contenido de sal menor que 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM. En ejemplos adicionales, el agente o condición de desnaturalización es un excipiente de desnaturalización seleccionado de entre antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, rellenadores y diluyentes, sabores, colores, lubricantes, deslizantes, conservadores, sorbentes y edulcorantes.
En ejemplos particulares de cualquiera de los métodos proporcionados en la presente para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada, el agente o condición de desnaturalización es un conservador ( es ) , por ejemplo, un conservador (es ) fenólico. El conservador ( es ) fenólico puede ser un fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico, o un parabeno. Por ejemplo, el agente o condición de desnaturalización es un conservador (es) que es fenol y/o m-cresol. En tales ejemplos, la cantidad total de conservador fenólico en la composición, como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) , es de o de aproximadamente 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%., 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive.
En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada, antes de someter a prueba la actividad de una composición de enzima degradadora de hialuronano en a) y/o b) , la enzima degradadora de hialuronano se expone a la condición de desnaturalización o agente de desnaturalización durante un tiempo predeterminado. El tiempo predeterminado es un periodo de tiempo que se selecciona por el usuario dependiendo de la enzima degradadora de hialuronano- particular que está siendo evolucionado seleccionada, la condición de desnaturalización particular o agente de desnaturalización, la cantidad o grado de la condición de desnaturalización o agente de desnaturalización, la aplicación o uso de la enzima degradadora de hialuronano y otros factores similares. Por ejemplo, el tiempo predeterminado puede ser de o de aproximadamente 1 minuto a 1 mes, 1 minuto a 3 semanas, 1 minuto a 2 semanas, 1 minuto a 1 semana, 1 minuto a 24 horas, 1 minuto a 12 horas, 30 minutos a 6 horas o 1 hora a 4 horas, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, dos días, tres, días, cuatro días, cinco días, seis días, 7 días, dos semanas o un mes.
En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada, la enzima degradadora de hialuronano modificada es una que contiene un reemplazo, inserción o supresión de aminoácidos de los aminoácidos comparados con una enzima degradadora de hialuronano no modificada. Por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano modificada contiene un reemplazo de aminoácidos, tal como un solo reemplazo de aminoácidos o dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más de reemplazos de aminoácidos comparados con una forma no modificada de la enzima degradadora de hialuronano. En aspectos particulares del método, una biblioteca o recolección de enzimas degradadoras de hialuronano modificada se clasifican a fin de desarrollar o identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra estabilidad tal como estabilidad incrementada, bajo una condición de desnaturalización. De esta manera, en ejemplos de los métodos en la presente, una pluralidad de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas se someten a prueba en a) y/o b) . En tales ejemplos, la pluralidad de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas se modifican comparadas con la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente para generar una colección de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas, mediante lo cual cada proteina modificada en la colección se somete a prueba en cada uno de a) y/o b) . En la colección o biblioteca, cada enzima degradadora de hialuronano modificada contiene un solo reemplazo de aminoácidos comparada con la forma no modificada de la enzima degradadora de hialuronano, tal que la pluralidad de enzimas modificadas son tales que el aminoácido en cada posición modificada se reemplaza por hasta 1-19 de otros aminoácidos diferentes al aminoácido original en la posición, mediante lo cual cada enzima degradadora de hialuronano modificada contiene un reemplazo de aminoácidos diferente, y cada aminoácido a lo largo de la longitud de la enzima degradadora de hialuronano, o una porción seleccionada de la misma, se reemplaza .
En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente, la enzima degradadora de hialuronano modificada se modifica comparada con una enzima degradadora de hialuronano no modificada por inserción, supresión o reemplazo de un aminoácido (s ) la enzima degradadora de hialuronano no modificada puede ser una condroitinasa o puede ser una hialuronidasa . En ejemplos en la presente, la hialuronidasa modificada es una hialuronidasa PH20 o forma truncada de la misma que carece un sitio de unión de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) o una porción de sitio de unión de anclaje a GPI, mediante lo cual la forma truncada muestra actividad de hialuronidasa . La hialuronidasa PH20 puede ser una PH20 humana, de mono, bovina, de ovino, de rata, de zorro, de ratón o de conejillo de indias. Ejemplos particulares, la hialuronidasa PH20 es una PH20 humana o una forma truncada C-terminal de la misma. Por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano no modificada es una que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870 o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870, tal como por lo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,· 99% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, o 870. En ejemplos particulares, la enzima degradadora de hialuronano no modificada es una hialuronidasa PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o una secuencia de aminoácidos ' que muestra por lo menos 85% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72, tal como una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72.
En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra estabilidad, el método se lleva a cabo in vitro. También se proporcionan cualquiera de los métodos que son iterativos, mediante lo cual las etapas del método se repiten una pluralidad de veces, en donde en cada repetición, las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas adicionales de una enzima degradadora de hialuronano modificada seleccionada se generan y se someten a prueba, mediante lo cual la enzima degradadora de hialuronano modificada se desarrolla para mostrar estabilidad incrementada bajo una condición de desnaturalización. También se proporciona en la presente una enzima degradadora de hialuronano modificada identificada por cualquiera de los métodos proporcionados en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de la PH20 humana de longitud completa (expuesta en SEQ ID NO: 7) y variantes truncadas C-terminales solubles de la misma. El residuo de aminoácidos C-terminal de las variantes truncadas C-terminales ejemplares de la PH20 de longitud completa se identifican en negritas. Las secuencias de aminoácidos completas de las variantes truncadas C-terminales ejemplares de la PH20 de longitud completa, también se proporcionan en SEQ ID NOS: 3 y 32-66. El residuo de aminoácidos C-terminal de una PH20 soluble ejemplar, cuya secuencia completa se expone en SEQ ID N0:3, también se indica por subrayado. Las posiciones no limitantes, ejemplares para los reemplazos de aminoácidos se indican por resaltado. Las posiciones correspondientes se pueden identificar por la alineación de una secuencia de interés con cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66, y en particular con SEQ ID NO:3.
La Figura 2A hasta ' 2L representan alineaciones ejemplares de la PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO:3 con otros polipéptidos PH20. Un "*" significa gue los residuos alineados son idénticos, un ":" significa que los residuos alineados no son idénticos, pero son similares y contienen residuos de aminoácido conservadores en la posición alineada, y un Significa que los residuos alineados son similares y contienen residuos de aminoácidos semi-conservadores en la posición alineada. Las posiciones correspondientes, no limitantes, ejemplares para reemplazos de aminoácidos se indican por resaltado. Por ejemplo, la Figura 2A representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ . ID NO: 3 con PH20 de chimpancé expuesta en SEQ ID NO: 10. La Figura 2B representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de mono Rhesus expuesta en SEQ ID NO: 12. La Figura 2C representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con PH20 de mono Cynomolgus expuesta en SEQ ID NO: 14. La Figura 2D representa la alineación de la PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con la PH20 de bovino expuesta en SEQ ID NO: 16. La Figura 2E representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con la PH20 de ratón expuesta en SEQ ID NO: 20. La Figura 2F representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con una PH20 de rata expuesta en SEQ ID NO:22. La Figura 2G representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con una PH20 de conejo expuesta en SEQ ID NO:'24. La Figura 2H representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con una PH20 de conejillo de indias expuesta en SEQ ID NO: 29. La Figura 21 representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con una PH20 de Zorro expuesta en SEQ ID NO: 31. La Figura 2J representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO:3 con una PH20 de gibón expuesta en SEQ ID NO:857. La Figura 2K representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con una PH20 de mono titi expuesta en SEQ ID NO:859. La Figura 2L representa la alineación de una PH20 soluble humana expuesta en SEQ ID NO: 3 con una PH20 de orangután expuesta en SEQ ID NO: 861.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esquema A. Definiciones B. Hialuronidasa PH20 1. Estructura 2. Función 3. Polipéptidos PH'20 solubles C. Polipéptidos PH20 modificados 1. Mutantes Activos a. Actividad Incrementada b. Estabilidad Incrementadas 1. Fenófilos ii. Termófilos iii. Ausencia de Sal 2. Mutantes Inactivos 3. Modificaciones Adicionales a. Inmunogenicidad Disminuida b. Conjugación a polímeros D. Métodos para Identificar Enzimas Degradadoras de Hialuronano Modificadas con propiedades o Actividades Alteradas 1. Enzimas degradadoras de hialuronano y Bibliotecas de Enzimas Degradadoras dé Hialuronano Modificadas 2. Clasificación o Prueba para una Actividad o Propiedad Deseada 3. Selección o Identificación 4. Métodos Iterativos E. Producción de Polipéptidos Modificados y Moléculas de Ácidos Nucleicos de Codificación 1. Aislamiento o Preparación de Ácidos Nucleicos que codifican polipéptidos PH20 2. Generación de Ácido Nucleico Mutante o Modificado y polipéptidos de codificación 3. Vectores y Células 4. Expresión a. Células Procarióticas b. Células de Levadura c. Insectos y Células de Insecto d. Expresión de mamífero e. Plantas y células de planta 5. Purificación 6. Modificación de Polipéptidos por PEGilación F. Composiciones farmacéuticas y Formulaciones, Dosificaciones y Administración 1. Formulaciones (liquidas, inyectables, soluciones y emulsiones) a. Liofilizada b. Formulaciones Ejemplares 1. NaCl · ii. pH y solución amortiguadora iii. Conservadores iv. Estabilizantes 2. Composiciones para Otras Vías de Administ ación 3. Dosificaciones y Administración 4. Co-Formulaciones de PH20-Insulina Ejemplares 5. Empaquetado, Artículos de Fabricación y Kits G. Métodos para evaluar la Actividad de hialuronidasa 1. Actividad de hialuronidasa 2. Solubilidad 3. Pureza, Cristalización o Agregación 4. Farmacodinámica/Farmacocinética H. Métodos de Tratamiento y Terapia de Combinación I. Métodos para Administrar Agentes Terapéuticos Administración de Insulina 2. Métodos para Tratar una Enfermedad Asociada con Hialuronano y Condiciones 3. Otros Usos 4. Contracepción I. Ejemplos A. DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como · es entendido comúnmente por una persona experta en la técnica a la cual la invención (es ) pertenece. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias de GenBank, base de datos, sitios de la red y otros materiales publicados referidos por toda la descripción completa en la presente, a menos que se indique de otra manera, se incorporan a manera de referencia en su totalidad. En caso de que exista una pluralidad de definiciones para los términos en la presente, aquellos en esta sección prevalecerán. Donde la referencia se hace a una URL u otro tal identificador o dirección, se entiende , que tales identificadores pueden cambiar y la información particular en el internet puede aparecer y desaparecer, pero la información equivalente se puede encontrar al buscar en el internet. La referencia a los mismos prueba la disponibilidad y diseminación pública de tal información.
Como se utiliza en la presente, una enzima degradadora de hialuronano se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un polímero de hialuronano (también referido como ácido hialurónico o HA) en fragmentos de peso molecular más pequeños. Las enzimas degradadoras e hialuronano ejemplares son hialuronidasas, y en particular condroitinasas y liasas particulares que tienen la capacidad de despolimerizar el hialuronano. Condroitinasas- ejemplares que son enzimas degradadoras e hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina-ABC-liasa (también conocida como condroitinasa ABC) , condroitina-AC-liasa (también conocida como condroitina-sulfato-liasa o condroitina-sulfato-eliminasa) y condroitina-C-liasa . La condroitina-ABC-liasa contiene dos enzimas, condroitina-sulfato-ABC-endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitina-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Unas condroitina-sulfato-ABC-endoliasas ejemplares y condroitina-sulfato-ABC-exoliasas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Proteus vulgarls y Pedobacter heparinus (la condroitina-sulfato-ABC-endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 922; Sato y colaboradores (1994) Appl . Microbiol. Biotechnol. 41 ( 1 ) : 39-46) . Las enzimas condroitinasa AC ejemplares de bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Pedobacter heparinus, expuestas en SEQ ID NO: 923, Victívallis vadensis, expuesta en SEQ ID NO: 924, y Arthrobacter aurescens (Tkalec y colaboradores (2000) Applied and Environmental Microbiology 66 (1) : 29-35; Ernst y colaboradores (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30 ( 5 ): 387-444 ) . Las enzimas condroitinasa C ejemplares de bacterias .incluyen, pero no se limitan a, a aquellas de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi y colaboradores (1989) ' FEMS-Microbiol-Lett . 48(2): 121-4; ichelacci y colaboradores (1976) J. Biol. Chem. 251: 1154-8; Tsuda y colaboradores (1999) Eur. J. Biochem. 262: 127-133) .
Como se utiliza' en la presente, hialuronidasa s refiere a una clase de enzimas que degradan el hialuronano. Las hialuronidasas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sangui uelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidasas de tipo . de mamífero (EC 3.2.1.35) . Las hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitado a, de murino, canino, felino, leporino, aviar, bovino, ovino, porcino, equino, pisiforme, de rana, bacteriano, y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas humanas ejemplares incluyen HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, y PH20. También se incluyen entre las hialuronidasas, hialuronidasas solubles, incluyendo, PH20 de ovino y bovino, y PH20 soluble. Las hialuronidasas ejemplares incluyen cualquiera expuesta en SEQ ID NOS: 6, 7-31, 69, 70, 71, 72, 856-861, 869-921, formas maduras de las mismas (que carecen de la secuencia señal) , o variantes alélicas o' de especies de las mismas. Las hialuronidasas también incluyen formas truncadas de las mismas que muestran la actividad de hialuronidasa, incluyendo variantes truncadas C-terminales que son solubles.
Como se utiliza en la presente, el PH20 se refiere a un tipo de hialuronidasa que se presenta en los espermatozoides y es activa neutra. La.PH20 se presenta en la superficie del espermatozoide, y en el acrosoma derivado de un lisosoma, donde se liga a la membrana acrosomal interior. La PH20 incluye aquellas de cualquier origen incluyendo, pero no limitado a, origen de humano, chimpancé, mono Cynomolgus, monos Rhesus, murino, bovino, ovino, conejillo de indias, conejo y rata. Los polipéptidos PH20 ejemplares, incluyendo formas precursoras y maduras, incluyen aquellas de humano (SEQ ID NO: 6 y 7), chimpancé (SEQ ID NO:8, 9, 10, 869 y 870), mono Rhesus (SEQ ID NO: 11 y 12), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 13 y 14), vaca (por ejemplo, SEQ ID NOS: 15-18); ratón (SEQ ID NO: 19 y 20); rata (SEQ ID NO:21 y 22); conejo (SEQ ID NO:23 y 24); oveja (SEQ ID NOS:25-27), conejillo de indias (SEQ ID NO:28 y 29); zorro (SEQ ID NO: 30 y 31); Gibón (SEQ ID NO:856 y 857), mono titi (SEQ ID NO:858 y 859) y orangután (SEQ ID NO:860 y 861). La referencia a PH20 incluye polipéptidos PH20 precursores y polipéptidos PH20 maduros (tales como aquellos en los cuales una secuencia señal se ha removido) , formas truncadas de las mismas que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especies, variantes codificadas por variantes de empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NO: 7, o las formas maduras de los mismos. Los polipéptidos PH20 también incluyen aquellos que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellos que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales . Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, PEGilación, albuminación , glicosilación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica. Ejemplos de hialuronidasas solubles de bovino u ovino comercialmente disponibles son hialuronidasa VitraseMR (hialuronidasa de ovino) e hialuronidasa AmphadaseMR (hialuronidasa de bovino).
Como se utiliza en la presente, una PH20 soluble se refiere a un polipéptido caracterizado por su solubilidad bajo condiciones fisiológicas. Generalmente, una PH20 soluble carece de todo o una porción de una secuencia de unión de anclaje a glicofosfatidilo (GPI) , o de otra manera no se ancla suficientemente a la membrana celular. Por ejemplo, una PH20 puede ser una variante C-terminalmente truncada de una PH20 que carece de una secuencia contigua de aminoácidos que corresponde a todo o una porción de una secuencia de unión de un anclaje a glicofosfatidilo (GPI) . Por consiguiente, en la expresión de una célula, una PH20 soluble se secreta en medio. Las proteínas PH20 solubles se pueden distinguir, por ejemplo, pos su particionamiento en la fase acuosa de una solución de Tritón X-114 calentada a 37 °C (Bordier y colaboradores, (1981) J. Biol. Chem. , 256: 1604-7). Ancladas a la membrana, tales como hialuronidasas ancladas a lípidos, se particionarán en la fase, rica en detergente, pero se particionará en la fase deficiente de detergente o acuosa después del tratamiento con fosfolipasa-C. Se incluyen entre las hialuronidasas PH20 solubles hialuronidasas ancladas a la membrana en las cuales una o más regiones asociadas con el anclaje de la hialuronidasa a la membrana se ha removido o modificado, donde la forma soluble retiene la actividad de hialuronidasa. Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas solubles recombinantes que aquellas contenidas en o purificadas de fuentes naturales tales como aquellas, por ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. Ejemplares de tales hialuronidasas solubles son las PH20 humana solubles (SEQ ID NO: 3 o 32-66) . Otras hialuronidasas solubles incluyen PH20 de ovino (SEQ ID NO : 25-27 ) y de bovino (SEQ ID NO: 16 o 18) .
Como se utiliza en. la presente, PH20 humana soluble (sHuPH20) incluye polipéptidos PH20 humanos que carecen de una secuencia contigua ' de aminoácidos de la C-terminal de la PH20 humana que incluye todo o una porción de la secuencia de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) (polipéptidos PH2Q C-terminalmente truncados) tal que en la expresión, los polipéptidos son solubles bajo condiciones fisiológicas. Por ejemplos, los polipéptidos PH20 humanos solubles son polipéptidos C-terminalmente truncados de PH20 expuesta como SEQ ID NO: 6 en su forma precursora o en SEQ ID NO: 7 en su forma madura que carece de la secuencia señal, o variantes alélicas de la misma (por ejemplo expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 68-72) . La solubilidad se puede evaluar por cualquier método adecuado que muestre solubilidad bajo condiciones fisiológicas. Ejemplar de tales métodos es el ensayo.de TritonMR X-114, que evalúa el particionamiento en la fase acuosa y que se describe en lo anterior. Además, un polipéptido PH20 humano soluble es, si se produce en células CHO, tales como células CHO-S, un polipéptido que se expresa y se secreta en el medio de cultivo celular. Los polipéptidos PH20 humanos solubles, sin embargo, no se limitan a aquellos producidos en las células CHO, pero se pueden producir en cualquier célula o por 'cualquier método, incluyendo expresión recombinante y síntesis de polipéptidos. La referencia a la secreción en la célula CHO es definitoria . Por consiguiente, si un polipéptido se podría expresar y secretar en las células CHO y es soluble en el medio, es decir, las particiones en la fase acuosa cuando se extrae con TritonMR X-114, es un polipéptido PH20 soluble si se produce o no de esta manera. Los polipéptidos precursores para los polipéptidos PH20 pueden incluir una secuencia señal, tal como una secuencia señal heteróloga o no heteróloga (es decir, nativa). Ejemplares de los precursores son aquellos que incluyen una secuencia señal, tal como la secuencia señal de 35 aminoácidos nativos en las posiciones de aminoácidos 1-35 (véase,- por ejemplo, aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 6) .
Como se utiliza en la presente, "nativo" o "tipo natural" con referencia a. un polipéptido PH20 se refiere a un polipéptido PH20 codificado por un gen PH20 nativo o de origen natural, que incluye variantes alélicas, que está presente en un organismo, incluyendo un humano y otros animales, en la naturaleza. La referencia a PH20 de tipo natural sin referencia a una especie se propone para abarcar cualquier especie de un PH2C de tipo natural. Se incluyen entre los polipéptidos PH20 de tipo natural el polipéptido precursor codificado, fragmentos del mismo, y formas procesadas del mismo, tal como forma madura que carece del péptido señal asi como cualquiera de las formas postraduccionalmente. procesadas o modificadas del mismo. También se incluyen entre los polipéptidos PH20 nativos a aquellos que se modifican traduccionalmente, incluyendo, pero no limitado a, aquellos que se modifican por glicosilación, carboxilación y/o hidroxilación . Las secuencias de aminoácidos de la PH20 humana de tipo natural ejemplar se exponen en SEQ ID NOS: 6 y 7 y aquellos de variantes alélicas, que incluyen formas maduras, de las mismas, se exponen en SEQ ID NOS: 68-72. Otros animales producen PH20 nativa, incluyendo, pero no limitado a, secuencias nativas o de tipo natural expuestas en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-31, 856-861, 869 o 870.
Como se utiliza en la presente, la modificación es en referencia a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o secuencia de nucleótidos en una molécula de ácidos nucleicos e incluye supresiones, inserciones, y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones postraduccionales u otros cambios a la molécula que pueden presentarse debido a la conjugación o ligación, directa o indirectamente, a otra porción. Los métodos para modificar un polipéptido son de rutina para aquellas personas de experiencia en la técnica, tal como al utilizar metodologías de ADN recombinante .
Como se usa en la presente, "enzima degradadora de hialuronano modificada" se refiere a una enzima degradadora de hialuronano que contiene una modificación comparada con una enzima degradadora de hialuronano de referencia o no modificada. La modificación puede ser un reemplazo (sustitución), inserción (adición) o supresión de aminoácidos de uno o más residuos de aminoácidos. El residuo de aminoácidos puede ser un aminoácido natural o natural. En algunos casos, la modificación puede ser una modificación pos-traduccional . Una enzima degradadora de hialuronano modificada puede tener hasta 150 diferencias de aminoácidos comparada con una enzima degradadora de hialuronano de referencia o no modificada, siempre y cuando la enzima degradadora de hialuronano modificada resultante muestre actividad de hialuronidasa . Típicamente, una enzima degradadora de hialuronano modificada contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 de modificaciones de aminoácidos.
Como se utiliza en la presente, una enzima degradadora de hialuronano no modificada- se refiere a un polipéptido de inicio que se selecciona para modificación como se proporciona en la presente. El polipéptido de inicio puede ser una forma de origen natural, de tipo natural de un polipéptido. Además, el polipéptido de inicio se puede alterar o mutar, tal que difiere de una isoforma de tipo natural nativa pero no obstante se refiere en la presente como un polipéptido no modificado de inicio relativo con los polipéptidos subsecuentemente modificados producidos en la presente. De esta manera, las proteínas existentes conocidas en la técnica que se han modificado para tener un incremento o disminución deseada en una actividad o propiedad particular comparada con una proteína de referencia no modificada se puede seleccionar y utilizar como el polipéptido no modificado de inicio. Por ejemplo, una proteína que se ha modificado de su forma nativa por uno o más cambios de aminoácidos individuales y posee ya sea un incremento o disminución en una propiedad des.eada, tal como un cambio en un residuo o residuos de aminoácidos para alterar la glicosilación, se puede seleccionar para modificación, y por consiguiente es referido en la presente como no modificado, para modificación adicional. Una enzima degradadora de hialuronano no modificada incluye enzimas degradadoras de hialuronano humanas y no humanas, incluyendo enzimas degradadoras de hialuronano no de mamíferos no humanos y de bacterias. La enzima degradadora de hialuronano no modificada ejemplar es cualquiera expuesta en SEQ ID NOS: 2, 3, 6, 7-66, 68-72, 856-861, 869-924 o formas C-terminalmente truncadas, maduras de las. mismas que muestran actividad de hialuronidasa, o una enzima degradadora de hialuronano que muestra por lo menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6, 7-66, 68-72, 856-861, 869-924. Se entiende que una enzima degradadora de hialuronano no modificada es generalmente una que no contiene la modificación ( s ) , tal como el reemplazo (s) de aminoácidos de una enzima degradadora de hialuronano modificada.
Como se utiliza en la presente, "polipéptido PH20 modificado" o "polipéptido PH20 variante" se refiere a un polipéptido PH20 que contiene por lo menos una modificación de aminoácidos, tal como p por lo menos un reemplazo de aminoácidos como se describe en la presente, en su secuencia de aminoácidos comparado con un polipéptido PH20 no modificado de referencia. Un polipéptido PH20 modificado puede tener hasta 150 de reemplazos de aminoácidos, siempre y cuando el polipéptido. PH20 modificado resultante muestre actividad de hialuronidasa. Típicamente, un polipéptido PH20 modificado contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 de reemplazos de aminoácidos. Se entiende que un polipéptido PH20 modificado también puede incluir cualquiera de una o más de otras modificaciones, además de por lo menos un reemplazo de aminoácidos como se describe en la presente.
Como se utiliza en la presente, un polipéptido PH20 no modificado se refiere a un polipéptido PH20 de inicio que se selecciona para modificación como se proporciona en la presente. El polipéptido de inicio puede ser una forma de origen natural, de tipo natural de un polipéptido. Además, el polipéptido de inicio se puede alterar o mutar, tal que difiere de una isoforma de tipo natural nativa pero no obstantes es referida en la presente como un polipéptido no modificado de inicio relativo con los polipéptidos subsecuentemente modificados producidos en la presente. De esta manera, las proteínas existentes conocidas en la técnica que se han modificado tienen un incremento o disminución deseado en una actividad o propiedad particular comparada con una proteína de referencia no modificada que se puede seleccionar y utilizar como el polipéptido no modificado de inicio. Por ejemplo, una proteína que se ha modificado de su forma nativa por uno o más cambios de aminoácidos individuales y posee ya sea un incremento de disminución en una propiedad deseada, tal como un cambio en un residuo o residuos de aminoácidos para alterar la glicosilación, se pueden seleccionar para modificación, y por consiguiente es referido en la presente como una modificación adicional, no modificada. Los polipéptidos PH20 no modificados ejemplares es un polipéptido PH20 humano o variantes alélicas o de especies de los mismo. u otras variantes, incluyendo polipéptidos maduros y precursores. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 de réferencia ejemplares son un polipéptido PH20 en longitud completa madura expuesto en SEQ ID NOS: 7, 69 o 72, o formas C-terminalmente truncadas de los mismos tal como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 y 32-66, o en un polipéptido PH20 que muestra por lo menos 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72. Un polipéptido PH20 de referencia también puede incluir la forma precursora correspondiente tal como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 68, 70, 71 u otras formas precursoras, o en un polipéptido PH20 que muestra por lo menos 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 68, 70, 71. Se entiende que una enzima degradadora de hialuronano no modificada es generalmente una que no contiene la . modificación (s) , tal como el reemplazo (s) de aminoácidos de una enzima degradadora de hialuronano modificada.
Como se utiliza en la presente, una porción N-ligada se refiere a un residuo de aminoácidos asparagina (N) de un polipéptido que es capaz de · ser glicosilado mediante modificación pos-traduccional de un polipéptido. Porciones N-ligadas ejemplares de ' PH20 humana incluyen los aminoácidos N47, NI 31, N200, N219, N333, N358 y N365 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (que corresponde a los residuos de aminoácidos N82, N166, N235, N2S4, N368, N393 y N490 de la PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 6) .
Como se utiliza en la presente, polipéptido N-glicosilado se refiere a un polipéptido PH20 que contiene una ligación de oligosacáridos de por lo menos tres residuos de aminoácidos N-ligados, por ejemplo, porciones N-ligadas que corresponden a los residuos de aminoácidos N200, N333 y N358 de SEQ ID NO: 3 o 7. Un polipéptido N-glicosilado puede incluir un polipéptido donde tres, cuatro, cinco y hasta todas las porciones N-ligadas se ligan a un pligosacárido. Los oligosacáridos N-ligados pueden incluir oligomanosa, oligosacáridos complejos, híbridos o sulfatados, u otros oligosacáridos y monosacáridos .
Como se utiliza en la presente, un polipéptido N-parcialmente glicosilado se refiere a un polipéptido que contiene mínimamente un N-acetilglucosamin glicano ligado a por lo menos tres porciones N-ligadas. Un polipéptido parcialmente glicosilado puede incluir varias formas de glicano, incluyendo monosacáridos, ol igosacáridos , y formas de azúcar ramificadas, incluyendo aquellas formadas por el tratamiento de un polipéptido con EndoH, EndoFl, EndoF2 y/o EndoF3.
Como se utiliza en la presente, "condiciones" se refiere a cualquier parámetro que puede influir en la actividad o propiedades de una proteina o agente. Para propósitos en la presente, condiciones se refiere generalmente a la presencia, incluyendo cantidad, de excipientes, portadores u otros componentes en una formulación diferente al agente activo (por ejemplo, Hialuronidasa PH20 modificada); temperatura; tiempo (por ejemplo, tiempo de almacenamiento o exposición) ; recipiente de almacenamiento-; propiedades de almacenamiento (por ejemplo, agitación) y/u otras condiciones asociadas con la exposición o uso.
Como se utiliza en la presente, "desnaturalización" o "desnaturalizar" o variaciones gramáticas de las mismas con referencia a las proteínas se refiere a un cambio bioquímico en una proteína de modo que una propiedad o actividad de la proteína se disminuye o elimina. El cambio bioquímico puede ser un cambio en la estructura terciaria de la proteína a desplegarse. La propiedad o actividad se puede anular completamente o se puede reducir por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más.
Como se utiliza en la presente, propiedad se refiere a una propiedad física ?· estructural, tal como la estructura tridimensional, pi, vida media, conformación y otras tales características físicas. Por ejemplo, un cambio en una propiedad se puede manifestar como la solubilidad, agregación o cristalización en una proteína.
Como se utiliza en la presente, actividad se refiere a una actividad funcional o actividades de un polipéptido o porción del mismo asociada con una proteína de longitud completa (completa) . Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad del ligarse o competir con un polipéptido para ligarse a un anticuerpo anti-polipéptido ) , inmunogenicidad, capacidad para formar multímeros, y la capacidad para ligarse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido.
Como se utiliza en la presente, actividad de hialuronidasa se refiere a la capacidad de catalizar enzimáticamente la escisión de ácido hialurónico. El ensayo de Farmacopea de los Estados Unidos (USP) XXII para la hialuronidasa determina la actividad de hialuronidasa indirectamente al medir la cantidad de ácido hialurónico de peso molecular más alto, o sustrato de hialuronano (HA) que permanece después de que la enzima se deja reaccionar con le HA durante 30 minutos a 3?°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD) . Una Solución Estándar de Referencia se puede utilizar en un ensayo para evaluar la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Los ensayos in vitro para determinar la actividad de hialuronidasa de las hialuronidasas , tal como PH20, incluyendo polipéptidos PH20 modificados, se conocen en la técnica y se describen en la presente. Ensayos ejemplares incluyen el ensayo de micro-turbiedad descrito en la presente que mide la escisión del ácido hialurónico. por la hialuronidasa indirectamente al detectar el precipitado insoluble deformado cuando el ácido hialurónico no escindido se liga con la albúmina de suero. Los Estándares de Referencia se pueden utilizar, por ejemplo, para generar una curva estándar para determinar la actividad en unidades de la hialuronidasa que se somete a prueba.
Como se utiliza en la presente, activo neutro se refiere a la capacidad de un polipéptido PH20 para catalizar enzimáticamente la escisión del ácido hialurónico en pH neutro, tal como en un pH entre o aproximadamente entre pH 6.0 a pH 7.8.
Como se utiliza en la presente, "actividad incrementada" con referencia a una Hialuronidasa PH20 modificada significa que, cuando se somete a prueba bajo las mismas condiciones, la Hialuronidasa PH20 modificada muestra mayor actividad de hialuronidasa comparada con una Hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos. Por ejemplo, una Hialuronidasa PH20 modificada muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% o más de la actividad de la Hialuronidasa PH20 no modificada o de referencia.
Como se utiliza en la presente, "solubilidad" con referencia a una proteina se refiere a una proteina que es homoqénea en una solución ¦ acuosa, mediante lo cual las moléculas de proteina se dif nden y no se sedimentan espontáneamente. Por consiguiente una solución de proteínas soluble es una en la cual existe una ausencia de una partícula visible discreta en una solución que contiene la proteína, tal que las partículas no se pueden filtrar fácilmente. Generalmente, una proteína es soluble si no hay partículas visibles o discretas en la solución. Por ejemplo, una proteína es soluble si contiene nada o pocas partículas que se pueden remover por un filtro con un tamaño de poro de 0.22 ym.
Como se utiliza en la. presente, agregación o cristalización con referencia a una proteina se refiere a la presencia de partículas visibles o discretas en una solución que contiene la proteina. Típicamente, las partículas son mayores que 10 µp? en tamaño, tal como mayor que 15 µt , 20 µp?, 25 µp?, 30 µ?t?, 40 µp?, 50 µ?? o mayor. La agregación o cristalización pueden surgir debido a la solubilidad reducida, desnaturalización incrementada de una proteína o la formación de ligaciones co'valentes.
Como se utiliza en la presente, "condición de desnaturalización" o "condición de desnaturalización" se refiere a cualquier condición o agente que, cuando se expone a una proteína, afecta o influye en la degradación o desnaturalización de la proteína, generalmente como resultado de una pérdida o pérdida parcial de la estructura terciaria o secundaria de la proteína. Las condiciones de desnaturalización pueden dar por resultados efectos tales como pérdida o reducción en la actividad, pérdida o reducción de la solubilidad, agregación y/o cristalización. La condición de desnaturalización no necesita ser una que sea completamente letal a la. proteína, sino no obstante es una que conduce a una reducción en la actividad de la proteína a través del tiempo. De esta manera, una condición es la desnaturalización si la actividad de la proteína se reduce por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más en presencia de¦ la condición que en su ausencia. Una condición de desnaturalización puede ser debido a un estrés externo o condición física (por ejemplo, agitación, temperatura, tiempo de almacenamiento, ausencia de un estabilizante) , o puede ser debido a la presencia de un agente desnaturalizante. Por ejemplo, la condición de desnaturalización se puede provocar por calor, ácido o un desnaturalizante químico. Condiciones de desnaturalización ejemplares incluyen, pero no se limitan a, la presencia de un ácido potente o base, una sal inorgánica concentrada, un solvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo), urea, pH alto o bajo (extremos de pH) , temperatura elevada {por ejemplo, calor) , la presencia de excipientes que pueden estar desnaturalizándose, (por ejemplo, conservadores fenólicos o detergentes), y bajo o sustancialmente nada de agentes estabilizantes que de otra manera es requerido para la estabilidad de la proteína (por ejemplo, NaCl) .
Como se utiliza en la presente, "agente de * desnaturalización" o "desnaturalizante" se refiere a cualquier sustancia, molécula, o compuesto que provoca la desnaturalización. Por ejemplo, el agente de desnaturalización puede incluir un ácido base potente, una sal inorgánica concentrada, un solvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo) , un conservador, detergente u otro excipiente.
Como se utiliza en la presente, "resistencia a una condición de desnaturalización" se refiere a cualquier cantidad de reducción o eliminación disminuida de una propiedad o actividad.de la proteina asociada con o provocada por la desnaturalización. Por ejemplo, la desnaturalización se asocia con o provoca cristalización o agregación incrementada, solubilidad reducida o actividad disminuida. Por consiguiente, la resistencia a la desnaturalización significa que la proteína muestra agregación disminuida o cristalización, solubilidad incrementada o actividad incrementada o mayor (por ejempJo, actividad de hialuronidasa) cuando se expone a una condición de desnaturalización comparada con una proteína de referencia (por ejemplo enzima no modificada) . La resistencia a una condición de desnaturalización no necesita ser absoluta o permanente, sino se¦ puede lograr debido a que la desnaturalización de la enzima degradadora de hialuronano modifica se presenta más lentamente que la enzima no modificada en la condición de desnaturalización tal que una actividad o propiedad de la enzima degradadora de hialuronano modificada se logra por más tiempo. Por¦ ejemplo,. ' una enzima degradadora de hialuronano modificada, tal como una Hialuronidasa PH20 modificada, muestra resistencia a una condición de desnaturalización si muestra, por ejemplo, 1%, 2 % , 3% , 4 % , 5%, 6%, 7 % , 8 % , 9% , 10%, ... 20%, ... 30%, ... 40%, ... 50%, ... 60%, 70%, ... 80%, ... 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% o más de resistencia a la desnaturalización en presencia de una condición de desnaturalización o agente de desnaturalización que un polipéptido no modificado. En algunos casos, un polipéptido modificado muestra 105%·, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más de resistencia incrementada a la desnaturalización comparado con un polipéptido no modificado.
Como se utiliza en la presente, estabilidad de una Hialuronidasa PH20 modificada significa que muestra resistencia a la desnaturalización provocada por una condición de desnaturalización o agente de desnaturalización. Un polipéptido PH20 modificado muestra estabilidad si retiene alguna actividad en la presencia de una condición de desnaturalización o agente de desnaturalización, tal como por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de la actividad de hialuronidasa original o inicial antes de la exposición a la condición(s) de desnaturalización. Generalmente, una Hialuronidasa PH20 modificada es estable si retiene por lo menos 50% o más de la actividad de hialuronidasa bajo una condición de desnaturalización comparada con la ausencia de la condición de desnaturalización. Los ensayos para evaluar la actividad de hialuronidasa son conocidos por una persona de experiencia en la técnica y se describen en la presente. Se entiende que la estabilidad de la enzima no necesita ser permanente o a largo plazo, sino se manifiesta por una duración de tiempo en la cual la actividad se desea.- Por ejemplo, una Hialuronidasa PH20 modificada es estable si muestra una actividad durante por lo menos 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, un mes, seis meses o un año en la exposición, o durante la exposición, a una o más condición (s) o agente (s) de desnaturalización (por ejemplo, presencia de un excipiente de desnaturalización tal como un conservador) . Por ejemplo, una Hialuronidasa PH20 modificada es estable si muestra una actividad en o durante la exposición a una o más condición (s) o agente (s) de desnaturalización (por ejemplo, presencia de un excipiente de desnaturalización tal como un conservador) durante por lo menos 1 mes a temperaturas de o de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive o durante por lo menos 3 dias a una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42°C, inclusive.
Por consiguiente, "estable" o "estabilidad" con referencia a una formulación o una co-formulación proporcionada en la presen-te, se refiere a una en la cual una enzima degradadora de hialuronano modificada, tal como una hialuronidasa PH20 modificada, es estable en exposición a una o más condición (s) o agente (s) de desnaturalización en la misma (por ejemplo, , presencia de un excipiente de desnaturalización tal como un conservador) durante por lo menos 1 mes a temperaturas de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive o durante .por lo menos 3 días en una temperatura de o de aproximadamente 30°C a 42°C, inclusive.
Como se utiliza en la presente, "estabilidad incrementada" con referencia a una hialuronidasa PH20 modificada significa que, en presencia de la misma condición (s) desnaturalizante o desnaturalización (por ejemplo, presencia de un excipiente de desnaturalización tal como un conservador) , la hialuronidasa PH20 modificada muestra mayor actividad de hialuronidasa comparada con una hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada muestra estabilidad incrementada si muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% o más de la actividad de la hialuronidasa PH20 no modificada de referencia en la presencia de una condición (s) de desnaturalización o desnaturalizante {por ejemplo, en presencia de un excipiente de desnaturalización tal como un as a conservador) .
Como se utiliza en la presente, "temperaturas elevadas" se refiere a temperaturas que son mayores que temperatura ambiente. Generalmente, una temperatura elevada es una temperatura que es por lo menos, mayor que, o aproximadamente 30°C, tal como 30°C a 42°C, y generalmente 32°C.a 37°C o 35°C a 37°C, inclusive.
Como se utiliza en la presente, temperatura ambiente se refiere a un intervalo generalmente de aproximadamente o en a 18 °C a aproximadamente o a 32°C. Aquellas personas de experiencia en la técnica apreciaran que la temperatura ambiente varia por ubicación y condiciones prevalentes. Por ejemplo, las temperaturas ambientes pueden ser más altas en climas más calientes tales como Italia o Texas.
Como se utiliza en la presente, la citación de que las proteínas se "comparan bajo las mismas condiciones" significa que las diferentes proteínas se tratan idénticamente o sustancialmente de manera idéntica tal que cualquiera de una o más condiciones que pueden influir en la actividad o propiedades de una proteína o agente no son variadas o no son variadas sustancialmente entre los agentes de prueba. Por ejemplo, cuando la actividad de hialuronidasa de un polipéptido PH20 modificado se compara con un polipéptido PH20 no modificado cualquiera de una o más condiciones tal como la cantidad de concentración del polipéptido; presencia; incluyendo cantidad, de excipientes, portadores u otros componentes en una formulación diferente al agente activo (por ejemplo, hialuronidasa PH20 modificada) ; temperatura, tiempo de almacenamiento; recipiente de almacenamiento; propiedades de almacenamiento (por ejemplo, agitación) y/u otras condiciones asociadas con la exposición o uso son idénticas o sustancialmente idénticas entre los polipéptidos comparados.
Como se utiliza en la presente, "tiempo predeterminado" se refiere a un tiempo que estable o decide con anticipación. Por ejemplo, el tiempo predeterminado puede ser un tiempo elegido con anticipación que se asocia con la duración deseada de la actividad de una enzima degradadora de hialuronano dependiendo de la aplicación deseada o uso de la proteina. Un tiempo predeterminado pueden ser horas, dias, meses o años. Por ejemplo., un tiempo predeterminado puede ser por lo menos aproximadamente 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, tres dias, cuatro dias, cinco dias, seis dias, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, seis meses, un año o más.
Como se utiliza en la presente, "almacenamiento" significa que una formulación no se administra inmediatamente a un sujeto una vez preparada, sino se mantiene durante un periodo de tiempo bajo condiciones particulares (por ejemplo, temperatura particular; tiempo, y/o forma (por ejemplo, forma liquida o liofilizada) ) antes del uso. Por ejemplo, una formulación liquida se mantener durante días, semanas, meses o años, antes de la administración de un sujeto bajo temperaturas variadas tales como refrigeradas (0°C a 10°C, tal como 2° a 8°C), temperatura ambiente (por ejemplo, temperatura hasta de 32 °C, tal como 18 °C a aproximadamente o en 32°C), o temperatura elevada (por ejemplo, 30°C a 42°C, tal como 32°C a 37°C o 35°C a 37°C).
Como se utiliza en la presente, un "excipiente" se refiere a un compuesto en una formulación de un agente activo que no proporciona el efecto biológico del agente activo cuando se administra en ausencia del agente activo. Excipientes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, sales, soluciones amortiguadoras, estabilizantes, modificadores de tonicidad, metales, polímeros, tensoactivos , conservadores, aminoácidos y azucares.
Como se utiliza en la presente, un agente estabilizante se refiere a un compuesto agregado a la formulación para proteger el polipéptido PH20 modificado u otro agente activo de la degradación, si es necesario, tal como debido a las condiciones de desnaturalización a las cuales una formulación en la presente se expone cuando se maneja, se almacena o se utiliza. De esta manera, se incluyen agentes que previenen las proteínas de la degradación de otros componentes en las composiciones. Ejemplares de tales agentes son los aminoácidos, derivados de aminoácidos, aminas, azucares, polioles, sales y soluciones amortiguadoras, tensoactivos , inhibidores o sustratos u otros agentes como se describe en la presente.
Como se utiliza en la presente, una prueba de efectividad antimicrobiana o prueba de efectividad conservadora (PET) muestra la efectividad del sistema conservador en un producto. Un producto se inocula con una cantidad contralada de organismos específicos. La prueba luego compara el nivel de microorganismos encontrados en una muestra de control versus la muestra de prueba durante un período de 28 días. . Generalmente, los mercados objetivos tienen diferentes requisitos de. PET. Por ejemplo, los requisitos de PET de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) y la Farmacopea Europea (EP) difieren. Los parámetros para llevar a cabo una prueba de efectividad antimicrobiana, incluyendo en diferentes mercados, se conocen por una persona de experiencia en la técnica como se describe en la presente.
Como se utiliza en la presente, Una cantidad antimicrobianamente o anti-microbiana efectiva de un conservador se refiere a una cantidad de conservador que extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos en una muestra que se puede introducir de almacenamiento o uso. Por ejemplo, los recipientes de dosis múltiples, una cantidad antimicrobianamente efectiva de un conservador inhibe el crecimiento de microorganismos que se pueden introducir de dosis individuales que se retiran repetidamente. USP y EP (EPA ' y EPB) tienen requisitos antimicrobianos que determinan la actividad conservadora, y que puede variar en la astringencia. Por ejemplo, una cantidad efectiva antimicrobiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio en los organismos . bacterianos se presenta 7 dias después de la inoculación en una prueba de efectividad conservadora antimicrobiana (APET) . En un ejemplos particular, una cantidad efectiva anti-microbiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio en organismos bacterianos sé presenta 7 dias después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 3.0 logio de organismos bacterianos se presentan a 14 dias después de la inoculación, por lo menos ningún incremento adicional en los organismos bacterianos se presenta después de 28 dias después de la inoculación, y por lo menos ningún incremento en los organismos fúngicos se presenta después de 7 días después de la inoculación. ' En un ejemplo adicional, una cantidad efectiva anti-microbian.a de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio de organismos bacterianos se presenta 24 horas después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 3.0 logio de organismos bacterianos se presenta 7 dias después de la inoculación, ningún incremento adicional en los organismos bacterianos se presentas después de 28 días después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio de organismo fúngicos se presenta a 14 días después de la inoculación, y por lo menos' ningún incremento adicional en los organismos fúngicos se presenta después 28 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad efectiva anti-microbiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 2.0 logio de organismos bacterianos se presenta 6 horas después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 3.0 logio de organismos bacterianos se presenta 24 horas después de la inoculación, ninguna recuperación de los organismos bacterianos se presenta después de 28 días después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano, por lo menos una reducción unitaria- de 2.0 logio.de organismos fúngicos se presenta 7 días después de la inoculación, y por lo menos ningún incremento adicional en los organismos fúngicos se presenta después 28 días después de la inoculación.
Como se utiliza, en la presente, "conservador" se refiere a una sustancia de origen natural o sintético o recombinantemente producida que, cuando se agrega a una molécula o composición de proteína, previene el crecimiento microbiano, incluyendo crecimiento bactriano fúngico, en la composición.
Como se utiliza en la presente, un "conservador fenólico" se refiere a un conservador que contiene un grupo hidroxilo unido a un anillo de carbono aromático, tal como un anillo de benceno. Los conservadores fenólicos ejemplares, incluyen pero no se limitan a, fenol, m-cresol, ácido p-hidroxibenzóico, metilparabeno, etilparabeno, y propilparabeno . Por ejemplo, los cresoles, incluyendo meta-cresol (m-cresol), tiene un grupo metilo sustituido en el anillo de benceno de una molécula de fenol.
Como se utiliza en la presente, un "fenófilo" se refiere a una proteina, tal como un polipéptido PH20 modificado, que muestra estabilidad en presencia de una cantidad antimicrobianamente efectiva de un conservador (es) . El término "fenólfilo" se puede, utilizar intercambiablemente en la presente con "fenófilo" y tiene el mismo significado. Por ejemplo, un polipéptido PH20 modificado que es un fenófilo o fenólfilo muestra típicamente estabilidad incrementada comparado con una hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos cuando se somete a prueba bajo la misma condición (es) de desnaturalización que contiene un conservador (es) fenólico. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%) o más de la actividad de la hialuronidasa PH20 no modificada de referencia en presencia de un conservador (es) fenólico.
- Como se utiliza en la presente, un "termófilo" se refiere a una proteína, tal como un polipéptido PH20 modificado, que muestra estabilidad bajo temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente 30 °C, tal como 30 °C a 42°C, y generalmente 32°C a 37°C o 35°C a 37°C. Por ejemplo, un polipéptido PH20 modificado que es un termófilo muestra típicamente estabilidad incrementada comparada con una hialuronidasa PH20 no modificada que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos cuando se somete a prueba bajo la misma condición (es) de desnaturalización de temperatura elevada. Por ejemplo, una hialuronidasa PH20 modificada muestra por lo menos o aproximadamente por lo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% o más de la actividad de la hialuronidasa PH20 no modificada de referencia bajo temperaturas elevadas.
Como se utiliza en la presente, el término "detergente" se utiliza intercambiablemente con el término "tensoactivo" o "agente de acción superficial". Los tensoactivos son típicamente compuestos orgánicos que son anfifílicos, es decir, que contienen tanto grupos hidrofóbicos ("colas") y grupos hidrofílicos ("cabezas"), que hacen los tensoactivos solubles en tanto solventes orgánicos como agua. Un tensoactivo se puede clasificar por la presencia de grupos formalmente cargados en su cabeza. Un tensoactivo no iónico no tiene grupos de carga en su cabeza, mientras que un tensoactivo iónico lleva una carga neta en su cabeza. Un tensoactivo zwitteriónico contiene una cabeza con dos grupos opuestamente cargados. Algunos ejemplos de tensoactivos comunes incluyen: Aniónico (basado en sulfato, sulfonato o aniones de carboxilato) : perfluorooctanoato (PFOA o PFO) , sulfonato de perfluorooctano (PFOS) , dodecilsulfato de sodio (SDS) , lauril sulfato de amonio, y otras sales de sulfato de alquilo, lauret-sulfato (también conocido como lauril éter-sulfato de sodio, o ' SLES) , sulfonato de alquil-benceno; catiónico (basado en cationes de amonio cuaternario) : bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) también conocido como bromuro de hexadecil-trimetil-amonio, y otras sales de alquiltrimentil-amonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC) , sebo-amina polietoxilada (POEA), cloruro de benzalconio (BAC) , cloruro de benzetonio (BZT) ; Zwitteriónico (anfotérico) : dodecil-betaina; cocamidopropil-betaína; coco anfo-glicinato; no iónico: poli.(óxido de etileno) alquilo, poli (óxido de etileno) alquilfenol, copolimeros de poli (óxido de etileno) y poli (óxido de propileno) (comercialmente conocidos como Poloxámeros o Poloxaminas ) , poliglucósidos de alquilo, incluyendo glucósido de octilo, maltósido de decilo, alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetilico y alcohol oleico) , cocamida MEA, cocamida DEA, polisorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes Tritón, y óxido de dodecil-dimetilamina .
Como se utiliza en la presente, una "solución amortiguadora" se refiere a una sustancia, generalmente una solución, que puede mantener su pH constante, a pesar de la adición de ácidos potentes o bases potentes e influencias externas de temperatura, presión, volumen o potencial de redución oxidación. Una solución amortiguadora previene el cambio en la concentración de otra sustancia química, por ejemplo, sistemas donadores y aceptores de protones que previenen los cambios marcados en la concentración de ión de hidrógeno (pH) . Los valores de pH de todas las soluciones amortiguadoras son dependientes de temperatura y concentración. La elección de la solución amortiguadora para mantener un valor de pH o intervalo se puede determinar empíricamente por una persona de experiencia en la técnica basado en la capacidad amortiguadora conocida de las soluciones amortiguadoras conocidas. Soluciones amortiguadoras ejemplares incluyen pero no se limitan a, solución amortiguadora de bicarbonato, solución amortiguadora de cacodilato, solución amortiguadora de fosfato o solución amortiguadora de Tris. Por ejemplo, la solución amortiguadora Tris (trometamina) es una solución amortiguadora basada en amina que tiene una pKa de 8.06 y tiene un intervalo de pH efectivo entre 7.9 y 9.2. Para las soluciones amortiguadoras Tris, el pH se incrementa aproximadamente 0.03 unidades por disminución de temperatura °C, y disminuye 0.03 a 0.05 unidades por dilución de diez veces.
Como se utiliza en la presente, los residuos de a-aminoácidos de origen natural son los residuos de aquellos 20 a-aminoácidos encontrados en . la naturaleza que se incorporan en la proteína por el reconocimiento específico de la molécula de ARNt cargada con su codón de ARNm cognado en humano.
Como se utiliza en la presente, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptidicos (ANP) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra individual o doble. Cuando se refieren a sondas o cebadores, que se etiquetan opcionalmente, tal como con una etiqueta detectable, tal como fluorescente o radioetiqueta, se contemplan moléculas de hebra individual. Tales ' moléculas son típicamente de una longitud tal que su objetivo es estadísticamente único o de bajo número de copias (típicamente menor que 5, generalmente menor que 3) para sondear o cebar una biblioteca. Generalmente una sonda o cebador contiene por lo menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de complementariedad de secuencia a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de largo.
Como se utiliza en la presente, un péptido se refiere a un polipéptido que es de 2 a 40 aminoácidos en longitud.
Como se utiliza en la presente, los aminoácidos que se presentan en los diversos esquemas de aminoácidos proporcionados en la presente se identifican de acuerdo con sus abreviaturas de tres letras o una letra conocida (Tabla 1). Los nucleótidos que se presentan en los diversos fragmentos de ácidos nucleicos se designan con las designaciones de una letra estándar utilizadas rutinariamente en la técnica.
Como se utiliza en la presente, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un . grupo ácido carboxilico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para propósitos en la presente, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, los aminoácidos no naturales y los análogos de aminoácido (es decir, aminoácidos en donde el a-carbono tiene una cadena lateral ) .
Como se utiliza en la presente, "residuo de aminoácidos" se refiere a un aminoácido formado en la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus ligaciones de péptido. Los residuos de aminoácidos descritos en la presente se presumen que están en la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D", que también se designan de esta manera, se sustituyen por cualquier residuo de L-aminoácido siempre y cuando la propiedad funcional deseada se retenga por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en la amino-terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en la terminal carboxilo de un polipéptido. Al mantenerse con la nomenclatura de polipéptido estándar descrita en J. Biol. Chem. , 243: 3557-3559 (1968), y adoptada 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se muestran en la Tabla 1: Tabla 1 - Tabla de Correspondencia Cabe destacar que todas las secuencias de residuos de aminoácido representadas en la presente por las formulaciones tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del amino-terminal a la carboxilo-terminal . Además, la frase "residuo de aminoácidos" se define ampliamente para incluir los aminoácidos listados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, tales como, aquellos referidos en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en la presente a manera de referencia. Cabe destacar que un quión en el inicio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un péptido ligado a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos, a un grupo amino-terminal tal como NH2 o a un grupo carboxilo-terminal tal como COOH.
Como se utiliza en la presente, "aminoácidos de origen natural" se refieren a los 20 L-aminoácidos que se presentan en los polipéptidos .
Como se utiliza en la presente, "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido pero que sea modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos no de origen natural incluyen de esta manera, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos diferente a los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero no se limitan a, los D-estereoisómeros de aminoácidos. Los aminoácidos no naturales ejemplares se describen en la presente y se conocen por aquellas personas de experiencia en la técnica.
Como se utiliza en la presente, una mezcla isocinética es una en la cual las relaciones molares de los aminoácidos se ha ajustado basado en sus velocidades de reacción reportadas {véase, por ejemplo, Ostresh y colaboradores, (1994) Biopolymers 34: 1681).
Como se utiliza en la presente, las sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos se conocen por aquellas personas expertas en esta técnica y se pueden hacer generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Aquellas personas de experiencia en a técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en las regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica [véase, por ejemplo, Watson y colaboradores Molecular Biology of the Gene, 4a Edición, 1987, The Benj amin/Cummings Pu . co . , p.224). Tales sustituciones se pueden hacer de acuerdo con aquellas expuestas en la Tabla 2 como sigue: TABLA 2 Otras sustituciones también son permisibles y se pueden determinar empíricamente o estar de acuerdo con las sustituciones conservadoras conocidas.
Como se utiliza en la presente, un constructo de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, de hebra individual o doble hebra que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuesto en una manera no encontrada en la naturaleza. Los constructos de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
Como se utiliza en la presente, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido que, cuando .se lee de la dirección 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado .
Como se utiliza en la presente, el término polinucleótido significa un polímero de hebra individual o doble hebra de desoxirribonucleótidos o bases de ribonucleótidos leídos del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizar in vitro, o preparar de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótidos se proporciona en la presente en términos de nucleótidos (abreviados "nt") o pares bases (abreviados "pb") . El término nucleótidos se utiliza para moléculas de hebra individual y doble hebra donde el contexto lo permita. Cuando el término s aplica a moléculas de doble hebra se utiliza para indicar la longitud completa y se entenderá que es equivalente al término pares base. Se reconocerá por aquellas personas expertas en la técnica que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las mismas se puede escalonar; de esta manera todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra no se puede parear. Tales extremos no pareados, en general, no excederán 20 nucleótidos en longitud.
Como se utiliza en la presente, "en una posición que corresponde a" o la citación de que los nucleótidos o posiciones de aminoácidos "que corresponden a" los nucleótidos o posiciones de aminoácidos en una secuencia descrita, tal como se expone en el listado e Secuencias, se refiere a nucleótidos o posiciones de aminoácidos identificados en alineación con la secuencia descrita para maximizar la identidad utilizando un algoritmo de lineas en estándar, tal como el algoritmo GAP. Para propósitos en la presente, la alineación de una secuencia PH20 es la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66, y en particular SEQ ID NO: 3. Por consiguiente, la referencia en la presente que una posición o reemplazo de aminoácidos corresponde a la posiciones con referencia a SEQ ID NO: 3 también significa que la posición o reemplazo de aminoácidos corresponde a las posiciones con referencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 7 o 32-66, puesto que las secuencias en la presente son idénticas a los residuos correspondientes como se expone en SEQ ID NO: 3. Al alinear las secuencias, una persona experta en la técnica puede identificar residuos correspondientes, por ejemplo, utilizando residuos o guias de aminoácidos conservadas e idénticas. En general, para identificar las posiciones correspondientes, las .secuencias de aminoácidos se alinean para que la coincidencia de orden más alta se obtenga (véase, por ejemplo,: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Bíocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H.G., eds . , Humana Press, New. Jersey, 1994; Sequence- Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, .1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo y colaboradores (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). La Figura 2 ejemplifica las alineaciones ejemplares y la identificación de los residuos correspondientes ejemplares para el reemplazo.
Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" se refiere al número de aminoácidos idénticos o similares o bases de nucleótidos en una comparación entre una prueba y un polipéptido de referencia o polinucleótido . La identidad de secuencia se puede determinar por la alineación de secuencia de secuencias de ácidos nucleicos o proteínas para identificar las regiones de similitud o identidad. Para propósitos en la presente, la identidad de secuencia se determina generalmente por la alineación para identificar los residuos idénticos. La alineación puede ser local o global, pero para propósitos en la presente la alineación es generalmente una alineación global donde la longitud completa de cada secuencia se compara. Las coincidencias, falta de coincidencias, y espacios se puede identificar entre las secuencias comparadas. Los espacios son aminoácidos nulos o nucleótidos insertados . entre los residuos de las secuencias alineadas de modo que se alinean los caracteres idénticos o similares. Generalmente, puede haber espacios internos y terminales. La identidad de secuencia se puede determinar al tomar en cuenta los . espacios como el número de residuos idénticos/longitud de la secuencia más larga x 100. Cuando se utilizan penalizaciones de espacio, la identidad de secuencia se puede determinar, sin penalización para los espacios de extremo (por ejemplo, no se penalizan los espacios terminales) . Alternativamente, la identidad de secuencia se puede determinar sin tomar en cuenta los espacios como el número de posiciones idénticas/longitud de la secuencia alineada total x 100.
Como se utiliza en la presente, una "alineación global" es una alineación que alinea dos secuencias del inicio al final, alineando cada letra en cada secuencia solamente una vez. Una alineación se produce, sin considerar si hay o no similitud o identidad entre las secuencias. Por ejemplo, 50% de identidad de secuencia basado en "alineación global" significa que en una alineación de la secuencia completa de dos secuencias comparadas cada una de 100 nucleótidos en longitud, 50% de los residuos son los mismos. Se entiende que la alineación global támbién se puede utilizar en la determinación de la identidad de secuencia aún cuando la longitud de las secuencias alineadas no es la misma. Las diferencias en los extremos terminales de las secuencias se tomará en cuenta al determinar la identidad de secuencia, a menos que se seleccione "sin penalización para los espacios de extremo". Generalmente, una alineación global se utiliza en las secuencias que comparten similitud significativa sobre la mayoría de su longitud. Algoritmos ejemplares para llevar a cabo la alineación global incluyen el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y colaboradores J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) . Los programas ejemplares para llevar a cabo la alineación global son públicamente disponibles e incluyen la Herramienta de Alineación Global Sequence disponible en el sitio de la red National Center for Biotechnology Information (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov/), y el programa disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/ align . html .
Como se utiliza en la presente, una "alineación local" es una alineación gue alinea dos secuencias, pero solamente alinea aquellas porciones de las secuencias que comparten similitud o identidad. 'Por consiguiente, una alineación local determina si sus segmentos de una secuencia están presentes en otra secuencia. Si no existe similitud, no se regresará la alineación. Los algoritmos de alineación locales incluyen algoritmo BLAST o Smith-Waterman (Adv. Appl . Math. 2: 482 (1981)). Por ejemplo, 50% de identidad de secuencia basado en la "alineación local" significa que en una alineación de la secuencia completa de dos secuencias comparadas de cualquier longitud, región de similitud o identidad de 100 nucleótidos en longitud tiene 50% de los residuos qüe son los mismos en la región de similitud ? identidad.
Para propósitos en la presente, la identidad se puede determinar por programas de algoritmo de alineación estándares utilizados con penalizaciones de espacio por omisión establecidas por cada proveedor. Los parámetros por omisión por el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y colaboradores Nucí, ñcids Res. 14: 6745 (1986), como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds . , Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353- 358 (1979); (2) un penalización de 3.0 para cada espacio y una penalización de 0.10 adicional para cada símbolo en cada espacio; y (3) sin penalizaciones para los espacios finales. Si cualquiera de dos moléculas de ácidos nucleicos tiene secuencias de nucleótidos o cualquiera de dos polipéptidos tiene secuencias de aminoácidos que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas", u otras variaciones similares que citan un porcentaje de identidad, se pueden determinar usando algoritmos de computadora conocidos basados en la alineación local o global {véase por ejemplo, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software, que proporciona ligaciones a docenas de bases de datos y programas de alineación conocidos y públicamente disponibles) . Generalmente, para propósitos en la presente, la identidad de secuencia se determina utilizando algoritmos de computadora basados en alineación global, tal como la herramienta de Alineación de Secuencia de Needleman-Wunsch Global disponible de NCBI/BLAST (blast . ncbi . nlm. nih . gov/Blast . cgi?CMD= eb&Page_TYPE=BlastHome ) ; algoritmo LAlign ( illiam Pearson implementing the Huang y Miller (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)); y programa de Xiaoqui Huang disponible en deepc2.psi.iastate. edu/aat/align/align . html . Generalmente , cuando se comparan las secuencias de nucleótidos en la presente, se utiliza una alineación con penalización para los espacios final de extremo. La alineación local también se puede utilizar cuando ' las secuencias que se comparan son sustancialmente de la misma longitud.
Por lo tanto, como se utiliza en la presente, el término "identidad" representa una comparación o alineación entre una prueba y un polipéptido o polinucleótido de referencia. En un ejemplo no limitante, "por lo menos 90% idéntica a" se refiere a un porcentaje de identidades de 90 a 100% relativa a un polipéptido o polinucleótido de referencia. La identidad en un nivel de 90% o más es indicativa del hecho de que, asumiendo los propósitos de ej emplificación de una prueba y el polipéptido de referencia o la longitud del polinucleótido de 100 aminoácidos o los nucleótidos son comparados, no más de 10% (es decir, 10 de 100) de aminoácidos o nucleótidos en el polipéptido o polinucleotido de prueba difiere de aquel de los polipéptidos de referencia. Las comparaciones similares se pueden hacer entre polinucleótidos de prueba y referencia. Tales diferentes se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente sobre la longitud completa de una secuencia de aminoácido o se pueden agrupar en una o más ubicaciones de longitud variante hasta el máximo permisible, por ejemplo, una diferencia de 10/100 aminoácido (aproximadamente 90% de identidad) . Las diferencias también pueden ser debido a las supresiones o truncamientos de los residuos de aminoácido. Las diferencias se definen como sustituciones de ácidos nucleicos o aminoácidos, inserciones o supresiones. Dependiendo de la longitud de las secuencias comparadas, en el nivel de homologías o identidades por arriba de aproximadamente 85-90%, el resultado puede ser independiente del programa y los parámetros de espacio ajustados; tales altos -niveles de identidad se pueden evaluar fácilmente, frecuentemente sin depender de un software.
Como se utiliza en la presente, una variante alélica o variación alélica se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar por resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. El término "variante alélica" también se utiliza en la presente para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo natural y/o forma predominante de un polipéptido de una población o miembro de referencia individual de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre y dentro de las especies tienen típicamente por lo menos 80%, 90% o mayor de identidad de aminoácidos con una forma de tipo natural y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es interespecie o interespecie . Generalmente, las variantes alélicas interespecie tiene por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90% o 95% de identidad o mayor que una forma de tipo natural y/o predominante, incluyendo 96%, 97%, 98%, 99% o mayor de identidad con una forma de tipo natural y/o predominante de un polipéptido. La referencia de una variante alélica en la presente se refiere generalmente a variaciones en las proteínas entre los miembros de la misma especie.
Como se utiliza en la presente, "alelo", que se utiliza intercambiablemente en la presente con "variante alélica" se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo sitio o posición en los cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, el sujeto se dice que es homocigoto para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos diferentes alelos de un gen, el sujeto se dice .que es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen especifico pueden diferir entre si en un nucleótido individual o varios nucleótidos y pueden incluir modificaciones tales como sustituciones, supresiones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Como se utiliza en la. presente, las variantes de especies se refieren a variantes en los polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo especies de mamífero diferentes, tales como ratón y humano. Ejemplarse de variantes de especies proporcionadas en la presente son el PH20 de primate, tal como, pero no limitado a, humano, chimpancé, macaco, mono cynomolgus, gibón, orangután, o mono tití. Generalmente, las variantes de especies tiene 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o 98%) de identidad de secuencia. Los residuos correspondiente entre variantes de especies se puede determinar comparar y alinearlas secuencias para maximizar el número de nucleótidos o residuos de coincidencia, por ejemplo, tal que la identidad de entre las secuencias sea igual a o mayor que 95%, igual a o mayor que 96%, igual a o mayor que 97%, igual a o. mayor que 98% o igual a o mayor que- 99%. La posición de interés después se le da el número asignado en la molécula de ácido nucleico de referencia. La alineación se puede llevar a cabo manualmente o a simple vista, particularmente cuando la identidad de secuencia es mayor que 80%.
Como se utiliza en la presente, sustancialmente puro significa suficientemente homogéneo para parecer libre de impurezas fácilmente detectables, como es determinado por los métodos estándares de análisis, tal como cromatografía de capa delgada (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , utilizada por aquellas personas de experiencia, en la técnica para evaluar tal pureza, o suficientemente pura tal que la purificación adicional no alteraría detectablemente las propiedades físicas y químicas, tales como las actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los métodos para purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente de manera química puros son conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica. Un compuesto sustancialmente de manera químicamente puros puede sin embargo, ser una mezcla de estereoisómeros o isómeros. En tales casos, la purificación adicional . podría incrementar la actividad específica del compuesto.
Como se utiliza en la presente, el polipéptido aislado y purificado o proteína o porción biológicamente activa de los mismos está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido de la cual la proteína se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Las preparaciones se pueden determinar para ser sustancialmente libres y parecen libres de impurezas fácilmente detectables como es determinado por los métodos estándares de análisis, tal como cromatografía de capa delgada (TLC) , electroforesis en gel cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , utilizadas por aquellas personas de experiencia en la técnica para evaluar tal pureza, o suficientemente pura tal. que la purificación adicional no alteraría detectablemente las propiedades físicas y químicas, tal como las actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancial. Los métodos para purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente de manera química puros son conocidos- por aquellas personas de experiencia en la técnica. Un compuesto sustancialmente de manera química puro sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, la purificación adicional podría incrementar la actividad específica del compuesto.
Por consiguiente, la referencia a un polipéptido sustancialmente purificado, tal como un polipéptido PH20 sustancialmente purificado se refiere a preparaciones de proteínas PH20 que están sustancialmente libres de material celular, incluye preparaciones de proteínas en las cuales la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las cuales se aisla o se produce recombinantemente . En una modalidad, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tiene menor que aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también referidas en la presente como proteínas contaminantes) , generalmente -menor que aproximadamente 20% de las proteínas no enzimáticas o 10% de las proteínas no enzimáticas o menor que aproximadamente 5% de las proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce recombinantemente, también está sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menor que aproximadamente o a 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de la proteína enzimática.
Como se utiliza en la . presente, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos incluyen preparaciones de proteínas enzimáticas en las cuales la proteína se separa de los precursores químicos u otros químicos que se implican en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen .menor que aproximadamente 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5% o menor de precursores químicos o químicos o componentes no enzimáticos.
Como se utiliza en la presente, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce por métodos recombinantes y/o o por métodos de síntesis química.
Como se utiliza en la presente, la producción por medios recombinantes o utilizando métodos de ADN recombinante significa el uso de los métodos bien conocidos de la biología molecular para expresar proteínas codificadas por el ADN clonado.
Como se utiliza en la presente, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos qué se utilizan para introducir un ácido nucleico heterólogo en las células para cualquier expresión o replicación del mismo. Los vectores permanecen típicamente episomales, pero se pueden diseñar para llevar a cabo la integración de un gel o porción del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y uso de tales vehículos son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica.
Como se utiliza en la presente, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que se ligan operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de llevar a cabo la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras , y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables , un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente de ADN plásmido o viral, o pueden contener elementos de ambos. De esta manera, un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, en la introducción en una célula hospedera apropiada, da por resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica e incluyen aquellos que son . replicables en células eucarióticas y/o células procarióticas y aquellas que permanecen episomales o aquellos que se integran en el genoma de la célula hospedera.
Como se utiliza en la presente, vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Los vectores virales so virus diseñados que se ligan operativamente a genes exógeno.s para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos en las células los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales , vectores retrovirales y vectores de virus de vaccinia.
Como se utiliza en la presente, "operablemente" u "operativamente ligado" cuando se refiere a segmentos de ADN significa que los segmentos se arreglan de modo que funcionen al unísono para sus propósitos propuestos, por ejemplo, la transcripción se inicia cadena abajo del promotor y cadena arriba de cualquiera de las secuencias transcriptas. El promotor es usualmente el dominio al cual la maquinaria transcripcional se liga para inicial la transcripción y procede a través del segmento de codificación al terminador.
Como se utiliza en la presente, un conjugado se refiere a un polipéptido PH20 modificado ligado directamente o indirectamente a uno o más de otros polipéptidos o porciones químicas. Tales conjugados incluyen proteínas de fusión, aquellas producidas por conjugados químicos y aquellas producidas por cualquier otro método mediante el cual por lo menos un polipéptido . PH20 modificado se liga, directa o indirectamente a otro polipéptido o porción química siempre y cuando el conjugado, retenga la actividad de hialuronidasa . Ejemplares de conjugados proporcionados en la presente incluyen polipéptidos PH20 ligados directa o indirectamente a un dominio de multimerización (por ejemplo una porción Fe) , una toxina, una etiqueta o un fármaco.
Como se utiliza en la presente, una proteína de fusión se refiere a un polipéptido codificado con una secuencia de ácidos nucleicos que contienen una secuencia de codificación de una molécula de ácido nucleico y la secuencia de codificación de otra molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de codificación están en el mismo marco de lectura tal que cuando el constructo de fusión se transcribe y se traduce en una célula hospedera, la proteina se produce conteniendo las dos proteínas. Las dos moléculas pueden estar adyacentes en el constructo o separadas por un polipéptido ligador que contiene, 1, 2, 3, o más, per típicamente pocos más de 10, 9, 8, 7, o 6 aminoácidos. El producto de proteína codificado por un constructo de fusión es referido como un polipéptido de fusión. Ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen fusiones Fe.
Como se utiliza en la presente, un polímero que se conjuga a un polipéptido PH20 modificado se refiere a cualquier polímero que se liga covalentemente o de otra manera establemente, directamente a través de un ligador, a tal polipéptido. Tales polímeros, incrementan típicamente la vida media en suero, e incluyen, pero no se limitan a, porciones siálicas, porciones de, polietilenglicol (PEG) , dextrano, y azúcar y otras porciones, tal como para glicosilación .
Como se utiliza en la presente, el término evaluar o determinar se propone que para incluir determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de un producto, y también para obtener un índice, relación, porcentaje, valor visual u otro indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta.
Como se utiliza en la presente, una "composición" se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o compuestos. Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, una pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de los mismos.
. Como se utiliza en la presente, una formulación se refiere a una composición que contiene por lo menos un agente farmacéutico terapéutico activo y uno o más excipientes.
Como se utiliza en la presente, una co-formulación se refiere a una composición que contiene o dos o más agentes activos o farmacéuticos o terapéuticos y uno o más excipientes. Por ejemplo, una co-formulación de una insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano contiene una insulina de acción rápida, una enzima degradadora de hialuronano y uno más excipientes.
Como se utiliza en la presente, "una combinación" se refiere a cualquier asociación entre dos o entre más artículos o elementos. Combinaciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, dos o más composiciones farmacéuticas, una composición que contiene dos o más ingredientes activos, tales como dos polipéptidos PH20 modificados; un polipéptido PH20 modificado y un agente anti-cáncer, tal como un compuesto quimioterapéutico; un polipéptido PH20 modificado y un agente terapéutico (por ejemplo una insulina) ; un polipéptido PH20 modificado y una pluralidad de agentes terapéuticos y/o de formación de imágenes, o cualquiera asociación de los mismos. Tales combinaciones se pueden empacar como kits.
Como se utiliza en la presente, un kit es una combinación empaquetada, opcionalmente , que incluye instrucciones para el uso de la combinación y/u otras reacciones y componentes para tal uso.
Como se utiliza en la presente, "enfermedad o trastorno" se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta de la causa o afección que incluye, pero no se limita, a afecciones adquiridas, afecciones genéticas, y caracterizadas por síntomas identificables .
Como se utiliza en la presente, una enfermedad, trastorno o afección asociada con hialuronano se refiere a cualquier enfermedad o afección en la cual los niveles de hialuronano se elevan como causa, consecuencia o de otra manera observada en la enfermedad o afección. Las enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano se asocian con la expresión de hialuronano elevadas en un tejido o célula, presión de fluido intersticial incrementada, volumen vascular disminuido y/o contenido de agua incrementado en un tejido. Las enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con hialuronano se pueden tratar por la administración de. una. composición que contiene una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo, una hialuronidasa soluble, ya sea sola o en combinación con o además de otro tratamiento y/o agente. Las enfermedades y afecciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cánceres ricos en ' hialuronano, por ejemplo, tumores, incluyendo tumores sólidos tales como cánceres de etapa tardía, cánceres metastásicos , cánceres no diferenciados, cáncer de ovario, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (SCC) , cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer colon y otros cánceres. Las enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano ejemplares también son enfermedades que se asocian con la presión de fluido intersticial elevada, tales como enfermedades asociadas con presión de disco, y edema, por ejemplo, edema provocado por trasplante de órganos, apoplejía, trauma cerebral u otra lesión. Las enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano ejemplares incluyen enfermedades y afecciones asociadas con presión de fluido intersticial elevada, volumen vascular disminuido, y/o contenido de agua incrementado en un tejido, incluyendo cánceres, presión de disco y edema. En un ejemplo, el tratamiento de la afección asociada con hialuronano, enfermedad o trastorno incluye la mejora, reducción u otro efecto benéfico en uno o más de presión de fluido intersticial incrementada (IFP), volumen vascular disminuido, y contenido de agua incrementado en un tejido.
Como se utiliza en la presente, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o afección significa que los síntomas del sujeto se mejoran parcial o totalmente, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por consiguiente, el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o una prevención del empeoramiento de síntomas o progresión de una enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de un interferón modificado y composiciones proporcionadas en la presente.
Como se utiliza en la . presente, un agente farmacéuticamente efectivo o agente terapéutico incluye cualquier agente bioactivo que pueda mostrar un agente terapéutico para tratar una enfermedad o trastorno. Agentes terapéuticos ejemplares se describen en la presente. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, anestésicos, vasoconstrictores, agentes de dispersión, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de molécula pequeña, incluyendo, pero no limitado a, bifosfonatos , y proteínas terapéuticas, incluyendo, pero no limitado a, insulina, moléculas de IgG, anticuerpos, citoquinas y factores de coagulación.
Como se utiliza en la presente, "insulina" se refiere a una hormona, precursor o un análogo sintético recombinante del mismo que actúa para incrementar la captación de glucosa y el almacenamiento y/o disminución de la producción de glucosa endógena. La insulina y análogos de la misma son bien conocidos por una persona de experiencia en la técnica, incluyendo en variantes humanas y alélicas y de especies de la misma. La insulina se traduce como un polipéptido precursor designado preproinsulina (110 aminoácidos para la insulina humana) , que contiene un péptido señal que dirige la proteina al retículo endoplásmico (ER) en donde la secuencia señal se escinde, dando por resultado la proinsulina. La proinsulina es procesada adicionalmente para liberar un péptido de cadena C o de conexión (una cadena C de 31 aminoácidos en la insulina humana) . La insulina resultante contiene una cadena A (21 aminoácido en longitud de la insulina humana; expuesta en SEQ ID NO: 862) y una cadena B (30 aminoácido en longitud en la insulina humana; expuesta en SEQ ID NO: 863) que se reticulan por ligaciones de disulfuro. Una insulina humana completamente reticulada contiene tres puentes de disulfuro: uno entre la posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B, un segundo entre la posición 20 de la cadena A y la posición 19 de la cadena B, y una tercera posición entre 6 y 11 de la cadena A. La referencia a una insulina incluye insulinas monoméricas y multiméricas , incluyendo insulinas hexaméricas, así como insulinas humanizadas. Los polipéptidos de insulina ejemplares son aquellos de origen de mamífero incluyendo humano. La referencia a la insulina incluye preproinsulina, proinsulina y polipéptidos de insulina en formas de cadena individual o dos cadenas, formas truncadas de las mismas que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especies de insulina humana, variantes codificadas por variantes de empalme, y otras variantes, tales como análogos de insulina. Una insulina ejemplar es una insulina humana que tiene una secuencia de aminoácidos de las cadenas A y B de la insulina humana expuesta en SEQ ID NOS: 862 y 863, respectivamente, y las variantes o análogos de las mismas que muestran por lo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la misma a uno o ambas de la cadena ? o cadena R y que actúa para incrementar la captación de glucosa y almacenamiento y/o disminución de la producción de glucosa endógena. Una insulina ejemplar adicional es insulina de porcino que tiene una secuencia de aminoácidos para la preproinsulina como se expone en SEQ ID NO:864, mediante . lo cual la cadena A corresponde a las posiciones de residuos de aminoácidos 88-108 y la cadena B corresponde al aminoácido, y variantes o análogos de los mismos que muestran por lo menos -80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a los mismos a uno o ambos de la cadena A o cadena B y que actúa para incrementar la captación de glucosa y almacenamiento y/o disminución de la producción de glucosa endógena.
Como se utiliza en la presente, "insulina de acción rápida" se refiere a cualquier insulina que muestra niveles de insulina pico en o aproximadamente no más de cuatro horas después de la administración subcutánea a un sujeto. Las insulinas de acción rápida incluyen cualquier composición de insulina de acción rápida para agudizar la administración a un sujeto diabético en respuesta a una afección hiperglicémica actual, percibida o anticipada en el sujeto que surge en el momento de, o dentro de aproximadamente cuatro horas después de la administración de insulina de acción rápida (tal como una afección hiperglicémica prandial que resulta o se anticipa para resultar de, el consumo de una comida) , mediante lo cual la insulina de acción rápida es capaz de prevenir, controlar- o mejorar la afección hiperglicémica aguda. Las insulinas de acción rápida incluyen insulinas recombinantés e insulinas aisladas (también referidas como insulinas "regulares") tal como la insulina vendida como insulina humana, insulinas porciones e insulinas bovinas, asi como análogos de insulina de acción rápida (también llamados análogos de insulina de acción rápida en la presente) diseñados para ser de acción rápida en virtud de los cambios de aminoácidos. Las preparaciones de insulina regulares ejemplares incluyen, pero no se limitan a, insulinas regulares humanas, tales como aquellas vendidas bajo las marcas comerciales HumulinMR R, NovolinMR R VelosulinMR, Insulina Humana, USP e Inyección Humana de Insulina, USP, asi como formulaciones ácidas de insulina, tales como, por ejemplo, Insulina Toronto, Insulina Oíd, e Insulina Clear, e insulinas de cerdo regulares, tales como Iletin IIMR (insulina porcina). Las insulinas regulares tienen típicamente un inicio de ¦ acción de entre 30 minutos a una hora, y un nivel de insulina pico de 2-5 horas post-administración.
Como se utiliza en la presente, los análogos de insulina de acción rápida (también llamados análogos de insulina de acción rápida) son insulinas que tienen un rápido inicio de acción. Las insulinas rápidas son típicamente análogos de insulina que se han diseñado, tal como por la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos, para ser de acción más rápida que las insulinas regulares. Los análogos de insulina de acción rápida tienen típicamente un inicio de acción de 10-30 minutos post-inyección, con niveles de insulina pico observados 30-90 minutos post-inyección. Los análogos de insulina de acción rápida ejemplares son análogos de insulina humana que contiene uno o más cambios de aminoácidos en la cadena A y/o B de la insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 862 o 863, respectivamente, y que muestra un inicio de acción 10-30 minutos post-inyección con los niveles de insulina pico observados 30-90 minutos postinyección. Los análogos de insulina de acción rápida ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, insulina lispro (por ejemplo, insulina HumalogMR) , insulina aspart (por ejemplo, insulina NovoLogMR) , e insulina glulisina (por ejemplo, insulina ApidraMR) la composición de insulina de acción rápida vendida como VIAjectMR y VIAtabMR (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 7,279,457). La secuencia de aminoácidos de los análogos de insulina de acción rápida ejemplares tienen una cadena A con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 u una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 865-867. También se incluyen cualquier de otras insulinas que tienen un inicio de acción de 30 minutos o menos y un nivel pico antes de 90 minutos, típicamente 30-90 minutos, post-inyección .
Como se utiliza en la presente, una insulina humana se refiere a una insulina que es sintética o recombinantemente producida basada en el polipéptido humano, incluyendo variantes alélicas y análogos de las mismas.
Como se utiliza en la presente, las insulinas humanas de acción rápida o composiciones de insulina de acción rápida humanas incluyen cualquier insulina humana o composición de una insulina humana, que es de acción rápida, pero excluye insulinas no humanas, tal como insulina de cerdo regular.
Como se utiliza en la presente, los términos "insulinas de acción basal", o "insulinas básales" se refieren a insulinas administradas para mantener un nivel de insulina basal como parte de un régimen de tratamiento general para tratar una afección crónica tal como diabetes. Típicamente, una insulina de acción basal se. formula para mantener un nivel de insulina de aproximadamente estado permanente por la liberación controlada de insulina cuando se administra periódicamente (por ejemplo, una vez o dos veces al día) . Las insulinas de acción básales incluyen insulinas cristalinas {por ejemplo, NPH y LenteMR, insulina protamina, insulina surfen) , análogos de insulina básales (insulina glargine, HOE 901, NovoSol Basal) y otras formulaciones químicas de insulina (por ejemplo,¦ goma arábiga lecitina o suspensiones de aceite) que retardan la velocidad de absorción de la insulina regular Como se utiliza en la presente, las insulinas de acción- basal pueden incluir insulinas que son típicamente entendidas como de acción prolongada (típicamente alcanzan una concentración pico relativamente baja, mientras que tienen una duración máxima de acción durante aproximadamente 20-30 horas) o acción intermedia que provocan (típicamente concentraciones de insulina pico a aproximadamente 4-12 horas después de la administración) .
Como se utiliza ert la presente, tratamiento significa de cualquier manera en la cual los síntomas de una afección, trastorno o de enfermedad u otra indicación, se mejoran o de otra manera se alteran benéficamente.
Como se utiliza en la presente, efecto terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento de un sujeto que altera, mejora o alivia típicamente los síntomas de una enfermedad o afección o que cura una enfermedad o afección. Una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto que resulta en el efecto terapéutico después de la administración a un sujeto.
Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano .
Como se utiliza en la presente, un paciente se refiere a un sujeto .humano que muestra síntomas de una enfermedad o trastorno.
Como se utiliza en la presente, mejora de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular por un tratamiento, tal como por la administración de una composición farmacéutica u otro agente terapéutico, se refiere a cualquier reducción, ya sea permanente o temporal, de larga duración o transcientes , de los síntomas que se pueden atribuir a o asociar con la administración de la composición o producto terapéutico.
Como se utiliza en la presente, prevención o profilaxis se refiere a métodos en los cuales el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección se reduce.
Como se utiliza en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "dosis terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un agente, compuestos, material, o composición que contiene un compuesto que es por lo menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por consiguiente, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.
Como se utiliza en la presente, forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos o animales y empacadas individualmente como es conocido en la técnica.
Como se utiliza en la presente, una formulación de dosificación individual se refiere a una formulación que contiene una sola dosis de un agente terapéutico para administración directa. Las formulaciones de dosificación individual no contienen generalmente ningún conservador.
Como se utiliza en la presente, una formulación de dosis múltiples se refiere a una formulación que contiene dosis múltiples de un agente terapéutico y que se puede administrar directamente para proporcionar varias dosis individuales del agente terapéutico. Las dosis se pueden administrar durante el curso de minutos, horas, semanas, días o meses. Las formulaciones de dosis múltiples pueden permitir el ajuste de la dosis, agrupamiento de la dosis y/o división de la dosis. Debido a que las formulaciones de dosis múltiples se utilizan a través del tiempo,. contienen generalmente uno o más conservadores para prevenir el crecimiento microbiano.
Como se utiliza en la presente un "articulo de fabricación" es un producto que se fabrica y se vende. Como se utiliza por toda esta solicitud, el término se propone para abarcar un agente terapéutico con una PH20 soluble, tal como esPH20, o una esPH20 sola, contenido en los mismos o artículos separados del empaquetado.
Como se utiliza en la presente, fluido se refiere a cualquier composición que puede fluir. Los fluidos de esta manera abarcan composiciones que están en la forma de semi-sólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras tales composiciones.
Como se utiliza en la presente, un "control" o "estándar" se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba, o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal ' no afectado con la afección de interés. Un control también puede ser un control interno. Por ejemplo, un control puede ser una muestra, tal como un virus, que tiene una propiedad o actividad conocida.
Como se utiliza en la presente, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen diferentes plurales a menos que el contexto lo indiqué claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un" agente incluye uno o más agentes.
Como se utiliza en la presente, el término "o" se utiliza para proponer "y/o" a menos que se indiqué explícitamente para referirse a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente exclusivas.
Como se utiliza en la presente, intervalos y cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por consiguiente "aproximadamente 5 bases" "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases".
Como se utiliza .en la presente, "opcional" o "opcionalmente" significa el . evento o circunstancias subsecuentemente descritos se presenta o no, y que la descripción incluye casos donde el evento o circunstancia se presenta y casos donde no. por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo está sin sustituir o esta sustituido.
Como se utiliza en la presente, las abreviaturas para cualquier grupos protectores, aminoácidos y otros compuestos, están, a menos que se indiqué de' otra manera, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Nomenclatura de Comisión en la Bioquímica IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11 : 1726) .
Para claridad de la descripción, y no a manera de limitación, la descripción detallada se divide en las subsecciones que siguen: B. Hialuronidasa PH20 Se proporcionan en la presente polipéptidos PII20 modificados. La PH20 (también conocida como proteína de superficie de espermatozoides, molécula 1 de adhesión a espermatozoides o SPAM1) es una hialuronidasa que hidroliza el hialuronano (también llamado ácido hialurónico, hialuronato o HA) encontrado en los tejidos conjuntivos tal como la matriz extrácelular . Los polímeros de hialuronano se componen de unidad de disacárido de repetición, ácido D-glucurónico (GlcA) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) , ligadas conjuntamente a través de ligaciones ß-1?4 y ß-1?3 glicosídicas alternantes. Las cadenas de hialuronano alcanzan cada una aproximadamente 25,000 repeticiones de disacáridos o más en longitud, y los polímeros de hialuronano puede variar en tamaño de aproximadamente 5,000 a 20,000,000 Da ín vivo. El hialuronano, también llamado ácido hialurónico o hialuronato, es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye ampliamente por todos los tejidos conjuntivos, epiteliales y neurales. El hialuronano es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. La PH20 es una endo-ß-N-acetil-hexosaminidasa que hidroliza la ligació ß1?4 glicosidica de las ácido hialurónico en varias longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos . La PH20 tiene actividades tanto hidroliticas como transglicosidasa . Además de degradar el ácido hialurónico, la PH20 también puede degradar los sulfatos de condroitina, tales como C4-S y C6-S. La PH20 puede mostrar actividad de hialuronidasa en pH ácido y pH neutro. 1. Estructura El PH20 ADNc se ha clonado de numerosas especies de mamíferos. Los polipéptidos precursores PH20 ejemplares incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos PH20 de humano (SEQ ID NO: 6), bovino (SEQ ID NOS: 15 o 17), conejo (SEQ ID NO: 23), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 13), conejillo de indias (SEQ ID NO:28), rata (SEQ ID NO:21), ratón (SEQ ID NO: 19), chimpancé (SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:869) mono Rhesus (SEQ ID NO:ll), Zorro (SEQ¦ ID¦ NO: 30) , Gibón (SEQ ID NO: 856), mono Tití (SEQ ID NO: 858) u orangután (SEQ ID NO: 860). El transcripto de ARNm se traduce típicamente para generar una proteína precursora que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en la N-terminal . Después de transportar el ER, el péptido señal, se remueve para producir un polipéptido PH20 maduro. Los polipéptidos PH20 maduro ejemplares incluyen, pero, no se limitan a, polipéptidos PH20 de humano (SEQ ID NO: 7), bovino (SEQ ID NOS: 16 o 18), conejo (SEQ ID NO:24), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 14), conejillo de indias ( SEQ ID NO:29), rata (SEQ ID NO:22), ratón (SEQ ID N0:20), chimpancé (SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 870), mono Rhesus (SEQ ID NO:12), Zorro (SEQ ID NO:31), Gibón (SEQ ID NO:857), mono Titi (SEQ ID NO:859) u orangután (SEQ ID NO:861). Por ejemplo, el transcripto de PH20 ARNm humano se traduce generalmente para generar una proteina precursora de 509 aminoácido (SEQ ID NO: 6) gue contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en la N-terminal (posiciones de residuos de aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 6). De esta manera, después del transporte al ER y remoción del péptido señal, se produce un polipéptido maduro de 474 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. También son conocidas secuencias de PH20 de ovino {véase por ejemplo, SEQ ID NOS: 25-27).
En particular, la PH20 humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: - 6. La PH20 humana madura que carece de una secuencia señal se expone en SEQ ID NO: 7. Son conocidas variantes alélicas y otras variantes de PH20. Se han reportado otras secuencias de PH20. Por ejemplo, es conocida una variante PH20 como se expone en la secuencia precursora expuesta en SEQ ID NO: 68 que contiene un Ala en la posición 48 y un Trp . en la posición 499, o la secuencia madura de los mismos se expone en SEQ ID NO: 69 que contiene las diferencias correspondientes en las posiciones 13 y 464, respectivamente, comparada con la secuencia expuesta en SEQ ID NO:7 (véase por ejemplo, Gmachl y colaboradores (1993) FEBS Lett, 336:545-548; Acceso de GenBank No. AAC60607) . Además, se ha identificado una variante natural de PH20 que contiene una Glutamina (Gin; Q) en la posición 5 como es comparada con la secuencia precursora de los aminoácidos expuestos en SEQ ID NO: 6 {véase por ejemplo, SEQ ID NO: 70, véase también Várela y- colaboradores (2011) Nature, 469:539-542). Otra variante natural contiene una Alanina (Ala; A) en la posición 47 comparada con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 (como se expone' en SEQ ID NO: 71) y corresponde a la posición 12 comparada con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (como se expone en SEQ ID NO: 72) .
La secuencia y estructura de los polipéptidos PH20 es altamente conservada. La identidad de secuencia entre las proteínas PH20 de varias especies es de aproximadamente 50% a 90%. La secuencia señal N-terminal hidrofóbica de 35 aminoácidos en longitud se conserva generalmente entre los polipéptidos de hialuronidasa PH20. Las hialuronidasas PH20 contiene una región de dominio de hialuronidasa de núcleo común de aproximadamente 340 aminoácidos en longitud que corresponde a los residuos de aminoácidos 38-374 de la secuencia de PH20 humana precursora expuesta en SEQ ID NO: 6. Un polipéptido PH20 maduro que crece de la secuencia señal que contiene una secuencia contigua de aminoácidos que tiene un residuo de aminoácidos C-terminal que corresponde al residuo de aminoácidos 464 de SEQ ID NO : 6 (por ejemplo, residuos de aminoácidos que corresponden a las posiciones 36-464 de la secuencia .de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6) es la secuencia mínima requerida para la actividad de hialuronidasa (véase por ejemplo, Solicitud de Patente de E.U.A. No. 10/795,095, que se expide como Patente de E.U.A. No. 7,767,429; véase también Publicación de E.U.A. No. US20100143457) .
Dentro de la región de dominio de hialuronidasa común, por lo menos 57 aminoácidos se conservan entre y dentro de las especies (véase por ejemplo, Arming y colaboradores (1997) Eur. J. Biochem. , 247:810-814; ten Have y colaboradores (1998) Reprod. Fértil. Dev. , 10: 165-72; Chowpongpang y colaboradores (2004) Biotechnology Letters, 26: 1247-1252). Por ejemplo,' las hialuronidasas PH20 contienen 12 residuos ' de cisteína conservados que corresponden a los residuos de aminoácidos 25, 189, 203, 316, 341, 346, 352, 400, 402, 408, 423 y 429 de la secuencia de aminoácidos de una PH20 madura que carece de la secuencia señal tal como se expone en SEQ ID NO: 3 o 7 (que corresponde a los residuos de aminoácidos 60, 224, 238, 351, 376, 381, 387, 435, 437, 443, 458 o- 464 de la PH20 humana de longitud completa expuesta en SEQ ID NO: 6). Los residuos de cisteina que corresponden a 25 y 316 y los residuos de cisteina que corresponden a 189 y 203 forman puentes de disulfuro. Los otros residuos de cisteina que también forman puentes de disulfuro, se implican en la maduración de la proteina pos-traduccional y/o o en la modulación de la actividad. Por ejemplo, las cuatro ligaciones de disulfuro adicionales se remueven entre los residuos de cisteina C376 y C387; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y. C464 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID NO: 6 (que corresponde a las posiciones C341 y C352; entre C346 y C400; entre C402 y C408; y entre C423 y C429 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7, respectivamente).
Los residuos de · aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos Dlll, E113 y E249 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 son residuos acidicos parte del sitio activo de la enzima y se conservan entre y dentro de la especies de PH20. Los residuos de aminoácidos R176, R246, R252 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 también se conservan entre y dentro de las especies si contribuyen a la ligación del sustrato y/o actividad de hialuronidasa . Las mutaciones de aminoácidos D11IN, E113Q, R176G, E249N y R252T dan por resultado que las enzimas no tengan actividad enzimática detectable o actividad enzimática residual (véase por ejemplo, Arming y colaboradores (1997) Eur. J. Biochem. , 247:810-814) .
Los resultados en la presente confirman el requisito de los residuos de aminoácidos PH20 que corresponden a las posiciones 25, 111, 113, 176, 189, 203, 246, 249, 252, 316, 341, 346, 352, 400, 402, 408,. 423 y 429 de la secuencia de aminoácidos expuesta en una PH20 madura que carece de la secuencia señal, tal como se expone en SEQ ID NO: 3 o 7 para la actividad de hialuronidasa, puesto que la mutagénesis de estos residuos da por resultado una enzima que no es activa (por ejemplo, no se expresa o está inactiva cuando se expresa, véase por ejemplo, Tablas 5 y 10) . La excepción es que el reemplazo de aminoácidos que corresponde a R176K y C316D dio por resultado mutantes que generaron alguna actividad de hialuronidasa residual.
La glicosilación también es requerida para la actividad de hialuronidasa PH20 basada en el motivo de reconocimiento NxS o xT. Hay seis oligosacáridos N-ligados en los residuos de aminoácidos que corresponden a las posiciones N47, N131, N200, N219, N333 y N358 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (que corresponde a los residuos de aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de la PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 6). En particular, por lo menos los sitios de glicosilación N-ligados que corresponden a los residuos de aminoácidos N200, N333 y N358 son requeridos para la secreción y/o actividad de la enzima (véase por ejemplo, Publicación de E.U.A. No. US20100143457 ) . Por ejemplo, un polipéptido PH20 que contiene mutaciones de aminoácidos N200A, N333A, N358A o N333A/N393A da por resultado proteínas inactivas. Las mutaciones individuales de los sitios de glicosilación N47A, N131A, N219A, N47A/N131A, N47A/N219A, N131A/N291A retienen la actividad. El sitio de glicosilación N-ligado que corresponde al residuo de aminoácidos N368 de la PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 6 se conserva entre y dentro de las especies (véase por ejemplo, Chowpongpang y colaboradores (2004) Biotechnology. Letters, 26: 1247-1252) . Las hialuronidasas PH20 también contienen sitios de glicosilación O-ligados. Por ejemplo, la PH20 humana tiene un oligosacárido O-ligado en el residuo de aminoácidos que corresponde al aminoácido T440 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 (que corresponde al residuo de aminoácidos T475 en SEQ ID NO: 6) .
Además de los sitios catalíticos, la PH20 también contiene un sitio de ligación a hialuronano. Este sitio se sitúa en la región péptido 2, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 205-235 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 6 y las posiciones 170-200 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7. Esta región es altamente conservada entre las hialuronidasas y es similar al motivo de ligación a heparina. La mutación del residuo de arginina en la posición 176 (que corresponde al polipéptido PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7) a una glicina, da por resultado un polipéptido con solo aproximadamente 1% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido de tipo natural (Arming y colaboradores, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814) .
Los polipéptidos PH20 contienen un anclaje de glicosil fosfatidilinositol (GPI) unido a la C-terminal de la proteína que ancla la proteína a la cara extracelular de la membrana plasmática de las células. Por lo menos la PH20 de humano, mono, ratón, y conejillo de indias se unen firmemente a la membrana plasmática a través del ancla GPI, que se puede liberar al tratar con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC; véase por ejemplo, Lin y colaboradores (1994) Journal of Cell Biology, 125: 1157-1163; Lin y colaboradores, (1993) Proc. Nati. Acad. Sel., 90: 10071-10075) . Otras · enzimas PH20, tale como PH20 de bovino, se une débilmente a la membrana plasmática y no se anclan a través de un ancla sensible al a fosfolipasa. Como se plantea posteriormente, las formas activas, solubles que, cuando se expresan, no se unen a la membrana pero se secretan se pueden generar por la remoción de todo o una porción del sitio de señal de unión de ancla GPI (véase también Patente de E.U.A. No. 7, 767, 429; Publicación de E.U.A. No. US20100143457 ) . Estos incluyen, por ejemplo, polipéptidos PH20 solubles expuestos en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 o 32-66, o formas precursoras de los mismos que contienen una secuencia señal.
Las proteínas ancladas a GPI, por ejemplo PH20 humana, se traducen con un péptido señal N-terminal escindible que dirige la proteína al retículo endoplásmico (ER) . En la C-terminal de estas proteínas esta otra secuencia señal que dirige la adición de un ancla GPI preformada al polipéptido dentro del lumen de ER. Además de que se presenta el ancla GPI después de la escisión de la porción C-terminal en una posición de aminoácidos específica, llamado el sitio ? (situado típicamente de manera aproximada a 20-30 aminoácidos de la C-terminal) . Aunque aprese que no hay una secuencia consenso que identifiqué la ubicación del sitio ?, las proteínas ancladas a GPI contienen una secuencia señal de unión de ancla GPI ' C-terminal o dominio que contiene típicamente una región predominantemente hidrofóbica de 8-20 aminoácidos, precedida por una región espadadora hidrofilica 8-12 aminoácidos inmediatamente cadena abajo del sitio ?. Esta región espaciadora hidrofilica es frecuentemente rica en aminoácidos cargados y prolina (White y colaboradores (2000) J. Cell Sci. 113(Pt.4) .721-727).. Existe generalmente una región de aproximadamente 11 aminoácidos antes de la posición ?-l que se caracteriza por una cantidad baja de estructura secundaria predicha, una región alrededor del sitio de escisión (sitio ?) , de' ?-1 a ?+2 que se caracteriza por la presencia de residuos de cadena lateral pequeños, la región espaciadora entre las posiciones ?+3 y ?+9, y una cola hidrofóbica de ?+1? al extremo C-terminal (Pierleoni y colaboradores, (2008) BMC Bioinformatics 9:392).
Aunque no existe una secuencia consenso señal de unión al ancla GPI, se han desarrollado varios métodos y algoritmos in silico que se pueden utilizar para identificar tales secuencias en los polipéptidos (véase, por ejemplo, üdenfriend y colaboradores (1995) Methods Enzymol. 250:571-582; Eisenhaber y colaboradores (1999) J. Mol. Chem. 292: 741-758; Kronegg y Buloz, (1999), "Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)", 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser y colaboradores (2005) Bioinformatics 21: 1846-1852; Omaetxebarria y colaboradores (2007) Proteomics 7: 1951-1960; Pierleoni y colaboradores (2008) BMC Bioinformatics 9:392), incluyendo aquellos que son sitios de la red fácilmente disponibles o bioinformáticas , tales como los sitios de herramientas Proteomicas ExPASy (expasy. ch/tools/) . De esta manera, una persona de experiencia en la técnica puede determinar si un polipéptido. PH20 contiene probablemente una secuencia señal de unión a ancla GPI, y, por lo tanto, si el polipéptido PH20 es una proteina anclada GPI.
La unión covalente de una ancla GPI a la C-terminal del PH20 humana y, por lo tanto, la naturaleza ligada a la membrana de la PH20, -se ha confirmado usando estudios de hidrólisis de fosfolipasa C especifica de fosfatidilinositol (PI-PLC) (véase por ejemplo, Lin y colaboradores, (1994) J. Biol. Chem. 125: 1157-1163). La fosfolipasa C especifica de fosfatidilinositol (PI-PLC) y D (PI-PLD) hidrolizan el ancla GPI, liberando el polipéptido PH20 de la membrana celular. La literatura de la técnica' previa reporta que un sitio que escinde el sitio ? de la PH20 humana se identifica entre Ser-490 y Ala-491 y para la PH20 de mono se identifica entre Ser491 y Thr492 (Lin y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci, (1993) 90: 10071-10075). De esta manera, la literatura reporta que una secuencia señal de unión a ancla GPI de la PH20 humana se sitúa en las posiciones de aminoácidos 491-509 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 6, y el sitio ? es la posición de- aminoácidos 490. De esta manera, en esta modelación de la PH20 humana, los aminoácidos 491 - 509 se escinden después del transporte al ER y un ancla GPI se une covalentemente al residuo de serina en la posición 490. 2. Función La PH20 se expresa normalmente en los espermatozoides de un gen específico de testículos individuales. La PH20 es una proteína asociada a espermatozoides implicada en la fertilización. La PH20 se sitúa normalmente en la superficie del espermatozoide, y el acrosoma derivado de lisosoma, donde se liga a la membrana' acrosómica interior. La PH20 es multifuncional y muestra actividad de hialuronidasa , actividad de señalización de células medidas por hialuronano (HA) , y actúa como un receptor de espermatozoides para la zona pelúcida que circunda el óvulo cuando está presente en el espermatozoide con acrosoma reaccionado (AR) . Por ejemplo, la PH20 se implica naturalmente en la adhesión del espermatozoide-óvulo y ayuda a la penetración por el espermatozoide de la capa de las células del cumulo al digerir el ácido hialurónico. Además de ser una hialuronidasa, la PH20 también parece que es un receptor para la señalización de células inducidas por HA, y un receptor para la zona pelúcida que circunda el ovocito. Debido a la función de la PH20 en la fertilización, la pH20 se puede utilizar como un antigeno para la inmunoanticoncepción .
La PH20 es una hialuronidasa activa neutra, aunque puede mostrar actividad de ácido activa en algunos casos. La actividad de hialuronidasa de la PH20 se muestra por la membrana plasmática y la PH20 asociada a membrana acrosómica interior. La PH20 de membrana plasmática muestra actividad de hialuronidasa solo en pH neutro, mientras que la PH20 asociada a la membrana acrosómica interior muestra actividad enzimática de ácido activa. La base estructural para estas diferencias es debido a la presencia de dos sitios catalíticos en PH20. Un primer sitio catalítico se designa a la región de péptido 1, que corresponden a los residuos de aminoácidos 142-172 de SEQ ID NO: 6, que se implica en actividad enzimática de la PH20 en pH neutro. Un segundo sitio catalítico se designa a la región péptido 3, que corresponden a los residuos de aminoácidos 277-297 de SEQ ID NO: 6, que se implica en la actividad enzimática en pH más bajo. Un cambio en la estructura del PH20 asociado a membrana acrosómica interior se presenta · después de la reacción del acrosoma, mediante lo. cual la PH20 se escinde endoproteolíticamente pero se mantiene junta por las ligaciones de disulfuro. El resultado de la endoproteolisis es que la región de péptido 3 se activa y de esta manera puede llevar a cabo la actividad neutra y ácida al PH20 (véase por ejemplo, Cherr y colaboradores (2001) Matrix Biology, 20:515-525) . También, después de la reacción acrosómica, las formas ' de peso molecular más bajo se generan por la liberación de la membrana acrosómica interior (por o, una forma soluble de 53 kDa de PH20 se genera en el mono) . La forma (s) de, peso molecular más bajo también es activa de ácido.
La actividad de hialuronidasa de PH20 toma en cuenta la actividad de propagación observada en los extractos de testículos animales que se han utilizado clínicamente por décadas para incrementar la dispersión y absorción de fármacos (véase por ejemplo, Bookaglutinante y colaboradores (2006) J Controlled Reléase, 114:230-2 1) . Por ejemplo, las preparaciones farmacéuticas que contienen hialuronidasa se desarrollaron como extractos fraccionados de testículos de bovino para uso terapéutico como agentes de propagación y en otras aplicaciones (Schwartzman (1951) J. Pediat., 39:491-502) . Las preparaciones de extracto testicular de bovino originales incluyeron, por ejemplo, extractos vendidos bajo las marcas comerciales WydaseMR, HylaseMR, "Dessau", NeopermeaseMR, AlidaseMR y HyazymeMR. Ahora se sabe que la actividad de propagación · de las preparaciones de extracto . testicular es debido a la actividad de hialuronidasa PK20. Por ejemplo, en el 2001 una hialuronidasa de espermatozoide del toro se identificó como la PH20 de hialuronidasa (Lalancette y colaboradores (2001) Biol. Reprod. , 65:628-36). Al catalizar la hidrólisis del ácido hialurónico, la hialuronidasa PH20 reduce la viscosidad del ácido hialurónico, incrementando de esta manera la permeabilidad del tejido. Por consiguiente, las formas solubles de PH20 se utilizan como un agente de propagación o dispensación en conjunción con otros .agentes, fármacos y proteínas para mejorar su dispersión y suministro, y para mejorar el perfil farmacocinético y farmacodinámico del agente co-administrado, fármaco o proteína (véase por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 7,767,429; Bookaglutinante y colaboradores (2006) J Controlled Reléase, 114:230-241). 3. Polipéptidos PH20 solubles La PH20 puede existir en la forma ligada a membrana o asociada a membrana, o se puede secretar en el medio cuando se expresa en las células, y puede existir de esta manera en la forma soluble. La. PH20 soluble se puede detectar y discriminar de la PH20 ligada a membrana, insoluble utilizando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a aquellos que utilizan un ensayo TritonMR X-114. En este ensayo, las hialuronidasas PH20 solubles se particionan en la fase acuosa de una solución de TritonR X-114 calentada a 37°C (Bordier y colaboradores, (1981) J. Biol. Chem . , 256: 1604-7) mientras que las hialuronidasas PH20 ancladas a membrana se particionan en la fase rica en detergente. De esta manera, además de utilizar algoritmos para evaluar si un polipéptido PH20 está naturalmente anclado a GPI y por consiguiente ligado a membrana, también se pueden llevar a cabo experimentos de solubilidad.
Las enzimas PH20 solubles incluyen hialuronidasas que contiene una secuencia señal de unión de ancla a GPI, pero que se une débilmente a la membrana tal que no contienen un ancla sensible a la fosfolipasa. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 solubles incluyen PH20 de ovino o bovino. Varias formas de tales hialuronidasas PH20 solubles se han preparado y aprobado- para uso terapéutico en sujetos, incluyendo humanos. Por ejemplo, las preparaciones de hialuronidasa derivadas de animales incluyen VitraseMR (ISTA Pharmaceuticals ) , una hialuronidasa testicular de ovino purificada, y AmphadaseMR (Amphastar Pharmaceuticals) , una hialuronidasa testicular de bovino. Las enzimas PH20 solubles también incluyen formas truncadas de hialuronidasas PH20 asociadas a membranas no humanas o humanas que carecen de una o más residuos de aminoácidos de una secuencia señal de unión de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) y que retienen la actividad de hialuronidasa (véase por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 7,767,429; Publicación de E.U.A. No. US20100143457 ) . De esta manera, en lugar de tener un anclaje GPI covalentemente unido a la C-terminal de la proteína en el ER que se ancla a la cara extracelular de la membrana plasmática, estos polipéptidos se secretan cuando se expresan de células y son solubles. En casos donde la enzima degradadora de hialuronano retiene una porción de la secuencia señal de unión de anclaje GPI, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos aminoácido en la secuencia señal de unión de anclaje GPI es puede retener, con la condición de que el polipéptido sea soluble {es decir, secretado cuando se expresa de las células) y activo.
Las hialuronidasas solubles ejemplares que están C-terminalmente truncadas y' carecen de todo o una porción de la secuencia señal de unión de anclaje GPI incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos PH20 de origen primate, tal como, por ejemplo, polipéptidos PH20 de humano y chimpancé. Por ejemplo, polipéptidos PH20 solubles se pueden fabricar por el truncamiento C-terminal de un polipéptido expuesto en SEQ ID NOS:7, 10, 12, 14, 6.9, 72, 857, 859, 861 o 870 o variantes de los mismos que muestran por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NO: 7, 10, 12, 14, 69, 72, 857, 859, 861 o 870, en donde el polipéptido resultante es activo, soluble y carece de todo o una porción de los residuos de aminoácidos de la secuencia señal de unión de anclaje GPI.
Los polipéptidos PH20 solubles ejemplares son polipéptidos PH20 humanos truncados C-terminal que son maduros (que carecen de una secuencia señal) , solubles y muestran actividad neutra, y que contiene una secuencia contigua de aminoácidos expuestos en SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 que tiene mínimamente un residuo de aminoácidos truncado C-terminal en o después délo residuo de aminoácidos 464 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 solubles incluyen polipéptidos truncados C-terminales que contienen mínimamente una secuencia contigua de aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 6, o incluye una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85%, por ejemplo por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,. 98% de identidad de secuencia a una secuencia contigua de aminoácidos que tiene un residuo de aminoácidos de C-terminal después del aminoácido 464 de SEQ ID NO: 6 y retiene loa actividad de hialuronidasa . Los polipéptidos PH20 humanos C-truncados ejemplares son polipéptidos maduros (que carecen de una secuencia señal) que incluyen una secuencia contigua de aminoácidos expuestos en SEQ ID NO: 6 con un residuo C-terminal después de 464 tal como después de la posición de aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 48.4, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, o una variante de los mismos que muestran por lo menos 85% de identidad de secuencia, tal como por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,' 97%, 98% de identidad de secuencia a los mismos y retiene la actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 C-terminales ejemplares tienen una secuencia de aminoácidos 36 a 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, .493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, o una variante de los mismos que muestra por lo menos 85% de identidad de secuencia, tal como por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de. identidad de secuencia a los mismo y retiene la actividad de hialuronidasa. Los polipéptidos PH20 solubles incluyen cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 3 o 32-66 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 85% de identidad de secuencia, tal como por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%), 97%), 98%) de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 o 32-66.
En particular, un polipéptido PH20 humano soluble es un polipéptido que se trunca después del aminoácido 482 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6. Tal polipéptido se puede generar de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia señal y que codifica los aminoácidos 36-482, por ejemplo, como se expone en SEQ ID NO: 1 (que contiene una secuencia señal Ig.G kappa) o SEQ ID NO: 67 (que contiene la secuencia señal nativa). El procesamiento pos-traduccional remueve la secuencia señal, dejando una PH20 humana recombinante soluble de 447 aminoácidos (SEQ ID N0:3). Un producto producido en la expresión de un vector expuesto en SEQ ID NO: 4 o 5, y que contiene una molécula de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 67, da por resultado un producto secretado, designado rHuPH20, en el medio de cultivo que muestra heterogeneidad en la C-terminal tal que el producto incluye una mezcla de especies que pueden incluir cualquiera de uno o más de SEQ ID NOS: 3 y 44-48 en abundancia diversa. Típicamente, rHuPH20 se produce en las células que facilitan la N-glicosilación correcta para retener la actividad, tal como células de mamífero, por ejemplo células CHO (por ejemplo, células DG44 CHO) . La HylenexMR (Halozyme) es' una hialuronidasa recombinante humana producida por células de Ovario de Hámster Chino genéticamente diseñadas (CHO) que contiene ácido nucleico que codifica un polipéptido PH20 humano truncado (designado rHuPH20) .
C. POLIPÉPTIDOS PH20 MODIFICADOS Se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 modificados o variantes. Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran actividades o propiedades alteradas comparadas con un polipéptido PH20 nativo o de referencia, de tipo natural. Incluidos entre los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente son los polipéptidos PH20 que son mutantes activos, mediante los cuales los polipéptidos muestran por lo menos 40% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 correspondiente que no contiene la modificación de aminoácido (por ejemplo, reemplazo de aminoácidos). En particular, se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 que muestran actividad de hialuronidasa y que muestran estabilidad incrementada comparada con el PH20 que no contiene la modificación de aminoácidos. También se proporcionan polipéptidos PH20 modificados que son inactivos, y que se pueden utilizar, por ejemplo, como antigenos en vacunas anticonceptivas. , Las modificaciones pueden ser una sola modificación de aminoácido, tal como reemplazos (sustituciones), inserciones o supresiones de aminoácidos individuales, o múltiples modificaciones de aminoácido, tal como múltiples reemplazos de aminoácidos, inserciones o supresiones. Las modificaciones ejemplares son reemplazos de aminoácidos, incluyendo reemplazos de aminoácidos individuales o múltiples. El reemplazo de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora, tal como se expone en la Tabla 2, o una sustitución no conservadora, tal como cualquiera descrito en la presente. Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente pueden contener por lo menos o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más posiciones modificadas comparadas con el polipéptido PH20 que no contiene la modificación.
Las modificaciones descritas en la presente pueden estar en cualquier polipéptido PH20, incluyendo, formas truncadas C-terminales o, maduras, precursoras, siempre y cuando la forma modificada muestre actividad de hialuronidasa . Por ejemplo, los polipéptidos PH20 contienen modificaciones comparadas con un polipéptido PH20 nativo de referencia, de tipo natural expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 o 870, o en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos .65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%,· 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 6-66, 68- 72, 856-861, 869 o 870. Por ejemplo, las modificaciones se hacen en un polipéptido PH20 humano que tiene la secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 72; un polipéptido PH20 bovino que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NOS: 16 o 18; un polipéptido PH20 de conejo que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 24; un polipéptido PH20 de mono Cynomolgus que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 14; un polipéptido PH20 de conejillo de indias que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 29; un polipéptido PH20 de rata que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO:22; un polipéptido PH20 de ratón que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO:20; un polipéptido PH20 de chimpancé que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 10 o 870; un polipéptido PH20 de mono Rhesus que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 12; un polipéptido PH20 de zorro que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 31; un polipéptido PK2Ó de gibón que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 857 ; un polipéptido PH20 de mono titi que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 859; un polipéptido PH20 de Orangután que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en SEQ ID NO: 861; o un polipéptido PH20 de oveja que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye o se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 25-27; o en variantes de secuencia o variantes truncadas que muestran por lo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24-27, 29, 31, 69, 72, 857, 859, 861 o 870.
En particular, se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 que contienen modificaciones comparados con un polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72. Por ejemplo, las modificaciones proporcionadas en la presente también se pueden hacer en un polipéptido PH20 expuesto como SEQ ID NO: 10, 12, 14, 24, 857, 859, 861 o 870.
En particular, se proporcionan en l presente polipéptidos PH20 solubles modificados que son polipéptidos PH20 que contienen una modificación proporcionada en la presente, y que cuando se expresan de las células se secretan en un medio como una proteina soluble. Por ejemplo, las modificaciones se hacen en un polipéptido PH20 soluble que está C-terminalmente truncado o dentro o cerca de la porción C-terminal que contiene la secuencia señal de anclaje GPI de un polipéptido PH20 que contiene una secuencia señal de anclaje GPI. El truncamiento C-terminal puede ser un truncamiento o supresión de 8 aminoácidos contiquos en la C-terminal, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos en la C-terminal, siempre y cuando el polipéptido C-terminalmente truncado resultante muestre actividad de hialuronidasa y se secrete de las células (por ejemplo, en el medio) cuando se exprese. En algunos ejemplos, las modificaciones proporcionadas en la presente se hacen en un polipéptido PH20 que es un polipéptido C-terminalmente truncado de SEQ ID NO: 7, 10, 12, 14, 69, 72, 857, 859, 861 o 870 o una variante del mismo que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 7, 10, 12, 14, 69, 72, 857, 859, 861 o 870. En particular, las modificaciones proporcionadas en la presente se hacen en un polipéptido PH20 humano C-terminalmente truncado, o soluble que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 3 o 32-66 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 o 32-66. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente contienen reemplazos o sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos con referencia al polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3. ¦ .
Las modificaciones también se pueden hacer en la forma precursora correspondiente que contiene un péptido señal de cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24-27, 29, 31, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861 o 870. Por ejemplo, las modificaciones proporcionadas en la presente se pueden hacer en una forma precursora expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 28, 30, 856, 858, 860 o 869 o en una variante de la misma que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de. SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,' 23, 28, 30, 856, 858, 860 o 869.
En ejemplos de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente, el polipéptido PH20 modificado no contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3- 66, 68-72, 856-861, 869 o 870. Típicamente, el polipéptido PH20 modificado es un polipéptido PH20, y no contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-31, 856-861, 869 o 870.
Generalmente, cualquier modificación, tal como un reemplazo, supresión o sustitución de aminoácidos, se puede hacer en un polipéptido' PH20, que la condición de que modificación no esté en un reemplazo de aminoácidos donde la única modificación es un reemplazo de aminoácidos que es V12A, ?47?, DlllN, E113Q, N131A, R176G, N200A, N219A, E249Q, R252T, N333A o ?358?.· También, donde el polipéptido PH20 modificado contiene solamente dos reemplazos de aminoácidos, los reemplazos de aminoácidos no son P13A/L464W, N47A/N131A, N47A/N219A, N131A/N219A o N333A/N358A. En un ejemplo adicional, donde el polipéptido PH20 modificado contiene solamente tres reemplazos de aminoácidos, los reemplazos de aminoácidos no son N47A/N131A/N219A. Las modificaciones ejemplares proporcionadas en la presente se describen con detalle a continuación.
Para propósitos en la presente, la. referencia a las posiciones y aminoácidos para modificación en la presente, incluyendo reemplazo o reemplazos de aminoácidos, son con referencia al polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3. Está dentro del nivel de un apersona experta en la técnica hacer cualquiera de las modificaciones proporcionadas en la presente en otro polipéptido PH20 al identificar el residuos de aminoácido correspondiente en otro polipéptido PH20, tal como cualquiera expuesto en SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24-27, 28, 29, 30, 31, 32-66, 68-72, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 869 o 870 o una variante del mismo que muestra por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24-27, 28, 29, 30, 31, 32-66, 68-72, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 869 o 870. Las posiciones correspondientes en otro polipéptido PH20 se pueden identificar por la alineación del polipéptido PH20 con referencia al polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la Figura 2 representa la alineación de polipéptidos PH20 ejemplares con SEQ ID NO: 3, y la identificación de posiciones correspondientes ejemplares. También, puesto que las SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 y 72 todas son formas de una PH20 humana madura con un residuo de aminoácidos C-terminal diferente, la numeración de los residuos de aminoácidos en cualquiera de SEQ ID NOS: 7, '32-66, 69 y 72 es la misma como SEQ ID NO: 3, y por consiguiente, los residuos correspondientes de cada uno son idénticos a aquellos expuestos en SEQ ID N0:3 (véase por ejemplo, la Figura 1). Además, las SEQ ID NOS expuestas en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 70 o 71 son formas precursoras de los mismos que difieren por solo la presencia de una secuencia señal. Para propósitos de modificación (por ejemplo, reemplazo de aminoácidos), el residuo de aminoácidos correspondiente puede ser cualquier residuo de aminoácidos, y no necesita ser idéntico al residuo expuesto en SEQ ID NO: 3. Típicamente, el residuo de aminoácidos correspondiente identificado por la alineación con los residuos en SEQ ID NO: 3 es un residuo de aminoácidos que es idéntico a SEQ ID NO: 3, o es un residuo de aminoácidos conservador o semi-conservador al mismo (véase por ejemplo, Figura 2) . También se entiende que los reemplazos ejemplares proporcionados en la presente se pueden hacer en el residuo correspondiente en un polipéptido PH20, siempre y cuando el reemplazo sea diferente que el que existe en la forma no modificada del polipéptido PH20. Basado en esta descripción y la descripción en cualquier lugar en la presente, está dentro del nivel de una persona de experiencia en la técnica generar un polipéptido PH20 modificado que contenga cualquiera o una o más de las mutaciones descritas, y probar cada uno para una propiedad o actividad como se describe en la presente.
Las modificaciones en un polipéptido PH20 también se pueden hacer a un polipéptido ??2? que también contiene otras modificaciones, incluyendo modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones no en la secuencia primaria del polipéptido. Por ejemplo, las modificaciones descritas en la presente pueden estar en un polipéptido PH20 que es un polipéptido de fusión o un polipéptido quimérico. Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente también incluyen polipéptidos que se conjugan a un polímero, tal como un reactivo, de PEG.
También se proporcionan en la presente moléculas de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente. En ejemplos particulares, la secuencia de ácido nucleico se puede optimizar por codón, por ejemplo, para incrementar los niveles de expresión de la secuencia codificada. El uso de codones particulares dependiente del organismo hospedero en el cual el polipéptido modificado se expresa. Una persona de experiencia en la técnica está familiarizado con los codones óptimos para la expresión en células de mamífero o humanas, bacterias o levadura, incluyen por ejemplo, E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, la información del uso de codones está disponible de la Base de Datos de Uso de Codones disponible como kazusa . or . jp . codon (véase Richmond (2000) Genome Biology, 1: reportes 241 para una descripción de la base de datos) . Véase también, Forsburg (1994) Yeast, 10: 1045-1047; Brown y colaboradoras (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp y colaboradores (1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211; Sharp . y colaboradores (1991) Yeast, 657-78). En algunos ejemplos, Las moléculas de ácidos nucleicos de codificación también se pueden modificar para contener una secuencia señal heteróloga para alterar la expresión (por ejemplo, incrementada) y secreción del polipéptido. Ejemplar de una secuencia señal heteróloga es un ácido nucleico que codifica la secuencia señal IgG kappa (expuesta en SEQ ID NO: 868) .
Los polipéptidos modificados y moléculas de ácidos nucleicos de codificación proporcionadas en la presente se pueden producir por técnicas de ADN recombinante estándares reconocidas por una persona de experiencia en la técnica. Cualquier método conocido en la técnica para llevar a cabo la mutación de cualquiera de uno o más aminoácidos en una proteina objetivo se pueden emplear. Los métodos incluyen mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria estándar de moléculas de ácidos nucleicos de codificación, o métodos de síntesis de polipéptidos de fase sólida. Por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PH20 se pueden someter a mutagénesis, tal como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico de codificación, PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida al sitio, PCR de solapamiento , transposición génica, u otros métodos recombinantes . El ácido nucleico que codifica los polipéptidos luego se puede introducir en una célula hospedera para ser expresados heterólogamente . Por consiguiente, también se proporcionan en la presente moléculas de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos modificados proporcionados en la presente. En algunos ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados se producen sintéticamente, tal como utilizando una fase sólida o soluciones de síntesis de péptido de fase.
En las subsecciones posteriores, se describen polipéptidos PH20 modificados ejemplares que muestran actividades y propiedades alteradas, y moléculas de ácidos nucleicos de codificación, proporcionadas en la presente. 1. Mutantes Activos Se proporcionan en. la presente polipéptidos PH20 modificados que contienen uno o más de reemplazos de aminoácidos en un polipéptido PH20 y que muestran actividad de hialuronidasa. Los polipéptidos PH20 modificados pueden mostrar 40% a 500.0% de la actividad de hialuronidasa de un polipéptido PH20 de tipo natural o de referencia, tal como el polipéptido expuesto en SEQ ID NOS: 3 o 7. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en l presente muestran por lo menos 40% de la actividad de hialuronidasa , tal como por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 130%, 140%, 150%, , 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000% o más de la actividad de hialuronidasa de un polipéptido PH20 de tipo natural o de referencia, tal como el polipéptido correspondiente que no contiene la modificación de aminoácido (por ejemplo, reemplazo de aminoácidos), por ejemplo, un polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7. Por ejemplo, Las posiciones ejemplares que se pueden modificar, por ejemplo por el reemplazo o sustitución de aminoácidos, incluyen pero no se limitan a, cualquiera de las posiciones que corresponden al a . posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 58, 59, 60, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96,· 97, 98, 99, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 110, 114, 117, 118, 119, 120, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 446 o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Típicamente, el residuo de aminoácidos que se modifica (por ejemplo, reemplazado con otro aminoácido) en la posición que corresponde a cualquiera de la posiciones anteriores en un polipéptido PH20 es un residuo idéntico, un residuo conservador o un residuo de aminoácidos semi-conservador al residuo de aminoácidos expuesto en SEQ ID NO: 3.
Para retener la actividad de hialuronidasa, las modificaciones no se hacen típicamente en aquellas posiciones que son menos tolerantes al cambio o requeridas para la actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, generalmente las modificaciones no se hacen en una posición que corresponde a la posición 7, 16, 17, 18, 19, 21, 25, 53, 55, 56, 57, 62, 64, 76, 78, 80, 88, 95, 100, 101, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 121, 123, 126, 129, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 194, 199, 201, 203, 207, 210, 223, 225, 227, 228, 229, 241, 243, 244, 246, 249, 250, 252, 254, 262, 268, 282, 295, 296, 298, 299, 303, 319, 322, 329, 330, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 346, 350, 352, 354, 355, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 372, 382, 384, 386, 390, 400,. 402, 408, 423, 424, 429, 430, 431, con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:.3. También, en ejemplos donde las modificaciones se hacen en cuáquera de las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11,' 12, 13, 14, 15, 20, 22, 23, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 58, 59, 60, 61, 63, 65, 66,. 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74/ 75, 77, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 99, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 110, 114, 117, 118, 119, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 13.5, 136, 137, 138, 139, 143, 144, 145, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, . 180, 181, 182, 183, 184, 186, 192, 193, 195, 197, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 224, .226, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 242, 245, 247, 248, 251, 253, 255 , 256, 257, 258, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 297, 298, 30·0, 301, 302, 304, 305, 306, 307, 308, 310, 311, 312, 313, .314, 315, 316, 317, 318, 320, 321, 323, 324, 325, 326, 327, 331, 334, 335, 338, 339, 342, 343, 347, 348, 349, 351, 353, . 356, 357, 358, 359, 360, 361, 367, 368, 369, 371, 373, 374, 375 , 376, 377, 378, 379, 380, 381, 383, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 394, 395, 396, .397, 398, 399, 401, 403, 404, 405, '406, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 419, 420, 422, 425, 426, 427, 428, 431, 432, 434, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3, la modificación (es) está/están no en el reemplazo(s) de aminoácidos correspondientes expuesto en la Tabla 5 o 10 en la presente, que son reemplazos de aminoácidos que dan por resultado un polipéptido inactivo. Por ejemplo, si la modificación es una modificación en una posición que corresponde a la posición 2 con referencia a SEQ ID NO: 3, la modificación no es el reemplazo a una histidina (H) , lisina (K) , triptófano (W) o tirosina (Y) .
Los reemplazos . de aminoácidos ejemplares en cualquiera de las posiciones correspondientes anteriores se exponen en la Tabla 3. La referencia a la posición de aminoácidos correspondiente en la Tabla 3 es con referencia a las posiciones expuestas en SEQ. ID NO: 3. Se entiende que los reemplazos se pueden hacer en la posición correspondiente en otro polipéptido PH20 por la alineación con los mismos, con la secuencia expuesta en SEQ ID NO : 3 (véase por ejemplo, Figura 1 y 2), mediante lo cual la posición correspondiente es la posición alineada. En ejemplos particulares, el reemplazo(s) de aminoácidos puede estar en la posición correspondiente en un polipéptido PH20 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 o 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%., 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia al mismo, siempre y cuando el polipéptido PH20 modificado resultante muestra por lo menos 40%> de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos. En particular, El reemplazo (s) puede estar en una posición correspondiente en un polipéptido PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o una variante del mismo que muestre por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72. En un ejemplo, cualquiera de uno o más de los reemplazos están en SEQ ID NO: 3, siempre y cuando el polipéptido PH20 modificado resultante muestre por lo menos 40% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO:3.
En ejemplos particulares, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo o reemplazos de aminoácidos en una posición o posiciones que corresponden a 1, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30 31, 32, 33, 34, 35 36, 37, 38, 39, 40, 41, 46, 47, 48, 49 50, 52, 58, 59, 63 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79 82, 83, 84, '86, 87 89, 90, 92, 93, 94, 97, 102, 104, 107, 114, 118, 120, 127, 128, 130, 131, 132, 135, 138, 139, 140 141, 142, 143, 144 146, 147, 148, 149, 151, 152, 155 156, 158, 160, 162 163, 164, 165, 166, 169, 170, 172 173, 174, 175, 178 179, 193, 195, 196, 204, 205, 206 20.9, 212, 213, 215 219, 220, 221, 222, 233, 234, 235 236, 237, 238, 240 247, 248, 249, 257, 259, 260, 261 263, 267, 269, 271 272, 273, 274, 276, 278, 279, 282 283, 285, 287, 289 291, 292, 293, 298, 307, 308, 309 310, 313, 314, 315 317, 318, 320, 321, 325, 326, 328 335, 347, 349, 351 353, 356, .359, 367, 369, 371, 373 374, '375, 376, 377 380, 381, 383, 385, 392, 393, 395 396, 399, 401, 404 405, 406, 407, 409, 412, 416, 418 419, 421, 425, 427 428, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446 o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden ser reemplazos en las posiciones que corresponden a un reemplazo de Leucina (L) en la posición 1 (Ll), P6, V8, 19, PIO, Nll, V12, F14, L15, A20, S22, F24, L26, G27, K28, F29, D30, E31, P32, L33, D34, M35, S36, L37, F38, S39, F40, 141, 146, N47, A48, T49, G50, G52, V58, D59, Y63, 167, D68, S69, 170, T71, G72, V73, T74, V75, 179, K82, 183, SS 4, G86, D87, L89, D90, A92, K93, K94, T97, V102, N104 , M107, E114, T118, A120, D127 , V128, K130, N131, R132, E135 , Q138, Q139, Q140, N141, V142 , Q143, L144, L146, T147, E148 , A149, T150, E151, K152, Q155 , E156, E158, A160, K162, D163 , F164, L1.65, V166, E167, 1169 , K170, G172, K173, L174, L175 , N178, H179, H193, K195, K196 , G198, F204-, N205, V206, K209 , D212, D213, S215, N219, E220 , S221, T222, T232, Q233, Q234 , S235, P236, V237, A238, T240 , V247, R248, E249, P257, D258 , A259, K260, S261, L263, A267 , T269, 1271, V272, F273, T274 , Q276, V277, L278, K27.9, S282 , Q283, E285, V287, T289, G291 , E292, T293, A298, G305, L307 , S308, 1309, M310, M313, K314 , S315, L317, L318, D320, N321 , E324, T325, 1326, N328, T335 , Q347, Q349, V351, 1353, N356 , S359, P367, D368, N369, A371 , Q373, L374, E375, K376, G377 , F380, T381, R383, K385, E389 , E392, Q393, S395, E396, Y399 , S401, S404, T405, L406, S407 , K409, E410, A412, D416, D418, A419, D421, A425, G427, A428, D431, F433, P436, P'437, M438, E439, T440, E441, E442, P443, Q444, 1445, F446 o Y447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID N0:3.
Los reemplazos de aminoácidos ejemplares en los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, el reemplazo con: histidina (H) en una posición que corresponde a la posición 1; A en una posición que corresponde a la posición 1; E en una posición que corresponde a la posición 1; G en una posición que corresponde a la posición 1; K en una posición que corresponde a la posición 1; Q en una posición que corresponde a la posición 1; R en una posición que corresponde a la posición 1; A en una posición que corresponde a la posición 6; en una posición que corresponde a la posición 8; Q en una posición que corresponde a la posición 9; G en una posición que corresponde a la posición 10; H en una posición que corresponde a la posición 10; S en una posición que corresponde a la posición 11; E en una posición que corresponde a la posición 12; I en una posición que corresponde a la posición 12; K en una posición que corresponde a la posición 12; T en una posición que corresponde a la posición 12; V en una posición que corresponde la posición 14 V en una posición que corresponde la posición 15 M en una posición que corresponde la posición 15 S en una posición que corresponde la posición 20 T en una posición que corresponde la posición 22 E en una posición que corresponde la posición 24 H en una posición que corresponde la posición 24 R en una posición que corresponde la posición 24 A en una posición que corresponde la posición 26 E en una posición que corresponde la posición 26 K en una posición que corresponde la posición 26 en una posición que corresponde la posición 26 Q en una posición que corresponde la posición 26 R en una posición que corresponde la posición 26 D en una posición que corresponde la posición 27 K en una posición que corresponde la posición 27 R en una posición que corresponde la posición 27 R en una posición que corresponde la posición 28 E en una posición que corresponde la posición 29 I en una posición que corresponde la posición 29 K en una posición que corresponde la posición 29 L en una posición que corresponde la posición 29 M en una posición que corresponde la posición 29 P en una posición que corresponde la posición 29 R en una posición que corresponde la posición 29 S en una posición que corresponde la posición 29 T en una posición que corresponde la posición 29 V en una posición que corresponde la posición 29 G en una posición que corresponde la posición 30 H en una posición que corresponde la posición 30 K en una posición que corresponde la posición 30 L en una posición que corresponde la posición 30 M en una posición que corresponde la posición 30 R en una posición que corresponde la .posición 30 S en una posición que corresponde la posición 30 A en una posición que corresponde la posición 31 C en una posición que corresponde la posición 31 G en una posición que corresponde la . posición 31 H en una posición que corresponde la posición 31 I en una posición que corresponde la posición 31 K en una posición que corresponde la posición 31 L en una posición que corresponde la posición 31 P en una posición que corresponde la posición 31 R en una posición que corresponde la. posición 31 S en una posición que corresponde la posición 31 T en una posición que corresponde la posición 31 V en una posición que corresponde la posición 31 W en una posición que corresponde la posición 31 C en una posición que corresponde a la posición 32 F en una posición que corresponde a la posición 32 G en una posición que corresponde a la posición 32 H en una posición que corresponde a la posición 32 W en una posición que corresponde a la posición 33 G en una posición que corresponde a la posición 33 en una posición que corresponde a la posición 34 Q en una posición que corresponde a la posición 35 V en una posición que corresponde a la posición 35 H en una posición que corresponde a la posición 36 N en una posición que corresponde a la posición 36 F en una posición que corresponde a la posición 37 M en una posición que corresponde a la posición 37 Y en una posición que corresponde a la posición 38 A en una posición que corresponde a la posición 39 L en una posición que corresponde a la posición 39 N en una posición que corresponde a la posición 39 T en una posición que corresponde a la posición 39 L en una posición que corresponde a la posición 40 T en una posición que corresponde a la posición 41 L en una posición que corresponde a la posición 46 R en una posición que corresponde a la posición 46 D en una posición que corresponde a la posición 47 F en una posición que corresponde a la posición 47 T en una posición que corresponde a la posición 47, W en una posición que corresponde a la posición 47; con una posición que corresponde a la posición 48; H en una posición que corresponde a la posición 48; K en una posición que corresponde a la posición 48; N en una posición que corresponde a la posición 48; R en una posición que corresponde l posición 49; D en una posición que corresponde a la posición 50; S en una posición que corresponde a la posición 50; M en una posición que corresponde a la posición 50; N en una posición que corresponde a la posición 52; Q en una posición que corresponde a la posición 52; R en una posición que corresponde a la posición 52; S en una posición que corresponde a la posición 52; T en una posición que corresponde a la posición 52; C en una posición que corresponde a la posición 58; K en una posición que corresponde a la posición 58; L en una posición que corresponde a la posición 58; P en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición .58; R en una posición que corresponde a la posición 58; H en una posición que corresponde a la posición 58; N en una posición que corresponde a la posición 58; Y en una posición que corresponde a la posición. 58; N en una posición que corresponde la posición 59; K en una posición que corresponde la posición 63; L en una posición que corresponde la posición 63; M en una posición que corresponde la posición 63; R en una posición que corresponde la posición 63; en una posición que corresponde la posición 63; V en una posición que corresponde la posición 67; H en una posición que corresponde la posición 68; P en una posición que corresponde la posición 68; Q en una posición que corresponde la posición 68; A en una posición que corresponde la posición 69; C en una posición que corresponde la posición 69; E en una posición que corresponde la posición 69; F en una posición que corresponde la posición 69; G en una posición que corresponde la posición 69; I en una posición que corresponde la posición 69; L en una posición que corresponde la posición 69; M en una posición que corresponde a la posición 69; P en una posición que corresponde a la posición 69; R en una posición que corresponde a la posición 69; T en una posición que corresponde a la posición 69; en una posición que corresponde a la posición 69; Y en una posición que corresponde a la posición 69; A en una posición que corresponde a la posición 70; C en una posición que corresponde a la posición 70; F . en una posición que corresponde a la posición 70; G en una posición que corresponde a la posición 70; H en una posición que corresponde a la posición 70; K en una posición que corresponde a la posición 70; L en una posición que corresponde a la posición 70; N en una posición que corresponde a la posición 70; P en una posición que corresponde a la posición 70; R en una posición que corresponde a la posición 70; S en una posición que corresponde a la posición 70; T en una posición que corresponde a la posición 70; V en una posición que corresponde a la posición 70; Y en una posición que corresponde a la posición 70; G en una posición que corresponde a la posición 71; N en una posición que corresponde a la posición 71; R en una posición que corresponde a la posición 71; S en una posición que corresponde a la posición 71; K en una posición que corresponde a la posición . 72; M en una posición que corresponde a la posición 72; Q en una posición que corresponde a la posición 72; A en una posición que corresponde a la posición 73; ? en una posición que corresponde a la posición 73; en una posición que corresponde a la posición 73; L en una posición que corresponde a la posición .73; Q en una posición que corresponde a la posición 73; R en una posición que corresponde a la posición 73; T en una posición que corresponde a la posición 73; W en una posición que corresponde a la posición 73; A en una posición que corresponde a !a posición 74; C en una posición que corresponde a la posición 74; E en una posición que corresponde a la posición 74; F en una posición que corresponde a la posición 74; G en una posición que corresponde a la posición 74; H en una posición que corresponde a la posición ' 74; K en una posición que corresponde a la posición 74; L en una posición que corresponde a la' posición 74; M en una posición que corresponde a la posición 74; N en una posición que corresponde a la posición 74; P en una posición que corresponde a la posición 74; R en una posición que corresponde a la posición 74; S en una posición que corresponde a la posición 74; V en una posición que corresponde a la posición 74; W en una posición que corresponde a la posición 74; F en una posición que corresponde a la posición 75; . L en una posición que corresponde a la posición 75; M en una posición que corresponde a la posición 75; R en una posición que corresponde a la posición 75; T en una posición que corresponde a la posición 75; L en una posición que corresponde a la posición 79 L en una posición que corresponde a la posición 82 N en una posición que corresponde a la posición 82 V en una posición que corresponde a la posición 83 Q en una posición que corresponde a la posición 83 S en una posición que corresponde a la posición 83 G en una posición que cor esponde a la posición 83 E en una posición que corresponde a la posición 84 F en una posición que corresponde a la posición 84 G en una posición que corresponde a la posición 84 N en una posición que corresponde a la posición 84 R en una posición que corresponde a la posición 84 A en una posición que corresponde a la posición 86 H en una posición que corresponde a la posición 86 K en una posición que corresponde a la posición 86 N en una posición que corresponde a la posición 86 S en una posición que corresponde a la posición 86 T en una posición que corresponde a la posición 86 en una posición que corresponde a la posición 86 C en una posición que corresponde a la posición 87 G en una posición que corresponde a la posición 87 L en una posición que corresponde a la posición 87 M en una posición que corresponde ; c la posición 87; R en una posición que corresponde a la posición 87; S en una posición que corresponde a la posición 87; T en una posición que corresponde a la posición 87; V en una posición que corresponde a la posición 87; Y en una posición que corresponde a la posición 87; C en una posición que corresponde a la posición 89; A en .· una posición que corresponde a la posición 90; E en una posición que corresponde a la posición 90; H en una posición que corresponde a la posición 90; K en una posición que corresponde a la posición 90; N en una posición que corresponde a la posición 90; R en una posición que corresponde a la posición 90; C en una posición que corresponde a la posición 92; L en una posición que corresponde a la posición 92; I en una posición que corresponde a la posición 93; L en una posición que corresponde a la posición 93; Q en una posición que corresponde a la posición 93 R en una posición que corresponde a la posición 93; S en una posición que corresponde a la posición 33; T en una posición que corresponde a la posición 93; D en una posición que corresponde a la posición 94; Q en una posición que corresponde a la posición 94; R en una posición que corresponde a la posición 94; A en una posición que corresponde a lai posición 97; C en un residuo de aminoácidos que corresponde a la posición 97 D en una posición que corresponde a la posición 97; E en una posición que corresponde a la posición 97; G en una posición que corresponde a la posición 97; L en una posición que corresponde a la posición 97; S en una posición que corresponde a la posición 97; S en una posición que corresponde a la posición 102; T en una posición que corresponde a la posición 102; R en una posición que corresponde a la posición 104; L en una posición que corresponde a la posición 107; A en una posición que corresponde a la posición 114; Q en una posición que corresponde a la posición 118; H en una posición que corresponde a la posición 120 F en una posición que corresponde a la posición 120; I en una posición que corresponde a la posición 120 S en una posición que corresponde a la posición . 120; V en una posición que corresponde a la posición 120 Y en una posición que corresponde a la posición 120; E en una posición que corresponde a la posición 127 H en una posición que corresponde a la posición 127; N en una posición que corresponde a la posición 127 Q en una posición que corresponde a la posición 127; R en una posición que corresponde a la posición 127 I en una posición que corresponde a la posición 128; R en una posición que corresponde a la posición 130 G en una posición que corresponde a la posición 131, I en una posición que corresponde a la posición 131, M en una posición que corresponde a la posición 131, Q en una posición que corresponde a la posición 131, R en una posición que corresponde a la posición 131, V en una ¦ posición que corresponde a la posición 131, N en una posición que corresponde a la posición 132, L en una posición que corresponde a la posición 132, D en una posición que corresponde a la posición 135, G en una posición que corresponde a la posición 135, R en una posición que corresponde a la posición 135, con L en una posición que corresponde a la posición 138, T en una posición que corresponde a la posición 139, K en una posición que corresponde a la posición 140, H en una posición que corresponde a la posición 141, R en una posición que corresponde a la posición 141, S en una posición que corresponde a la posición 141, ¦ en una posición que corresponde a la posición 141 Y en una posición que corresponde a la posición 141, D en una posición que corresponde a la posición 142 • G en una posición que corresponde a la posición 142 K en una posición que corresponde a la posición 142 ¦ N en una posición que corresponde a la posición 142 P en una posición que corresponde a la posición 142 • Q en una posición que corresponde a la posición 142; . R en una posición que corresponde a la posición 142; S en una posición que corresponde a la posición 142; T en una posición que corresponde a la posición 142; G en . una posición que corresponde a la posición 143; K en una posición que corresponde a la posición 143; R en una posición que corresponde a la posición 144; T en una posición que corresponde a la posición 144; T en una posición que corresponde a la posición 146; R en una posición que corresponde a la posición 146; A en una posición que corresponde a la posición 147; F en una posición que corresponde a la posición 147; L en una posición que corresponde a la posición 147; R en una posición que corresponde a la posición 147; S en una posición que corresponde a la posición 147; V en una posición que corresponde a la posición 147; H en una posición que corresponde a la posición 148; K en una posición que corresponde a la posición 148; Q en una posición que corresponde a la posición 148; T en una posición que corresponde a la posición 149 V en una posición que corresponde a la posición 149; A en una posición que corresponde a la posición 150; D en una posición que corresponde a la posición 150; G en una posición que corresponde a la posición 150; N en una posición que corresponde a la posición 150; S en una posición que corresponde a la posición 150; W en una posición que corresponde a la posición 150; Y en una posición que corresponde a la posición 150; A en una posición que corresponde a la posición 151; H en una posición que corresponde a la posición 151; K en una posición que corresponde a la posición 151; L en una posición que corresponde a la posición 151; M en una posición que corresponde a la posición 151; Q en una posición que corresponde a la posición 151; R en una posición que corresponde a la posición 151; S en una posición que corresponde a la posición 151; T en una posición que corresponde a la posición 151; V en una posición que corresponde a la posición 151; W en una posición que corresponde a la posición 151; Y en una posición que corresponde a la posición 151; R en una posición que corresponde a la posición 152; T en una posición que corresponde a la posición 152; W en una posición que corresponde a la posición 152; D en una posición que corresponde a la posición 155; G en una posición que corresponde a la posición 155; K en una posición que corresponde a la posición 155; R en una posición que corresponde a la posición 155; en una posición que corresponde a la posición 156; Q en una posición que corresponde a la posición 158; S en una posición que corresponde a la posición 158; S en una posición que corresponde a la posición 160; E en una posición que corresponde a la posición 162; A en una posición que corresponde a la posición 163; E en una posición que corresponde a la posición 163 K en una posición que corresponde a la posición 163; Q en una posición que corresponde a la posición 163 R en una posición que corresponde a la posición 163; S en una posición que corresponde a la posición 163; M en una posición que corresponde a la posición 164; V en una posición que corresponde a la posición 164; D en una posición que corresponde a la posición 165; F en una posición que corresponde a la posición 165; N en una posición que corresponde a la posición 165; S en una posición que corresponde a la posición 165; V en una posición que corresponde a la posición 165; A en una posición que corresponde a la posición 166; E en una posición que corresponde a la posición 166; F en una posición que corresponde a la posición 166; H en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 166; Q en una posición que corresponde a la posición 166; R en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166; W en una posición que corresponde a la posición 166; Y en una posición que corresponde a la posición 166; D en una posición que corresponde a la posición 167; L en una posición que corresponde a la posición 169; R en una posición que corresponde a la posición 170; A en una posición que corresponde a la posición 172; R en una posición que corresponde a la posición 173; G en una posición que corresponde a la posición 174; K en una posición que corresponde a la posición 174; N en una posición que corresponde a la posición 174; R en una posición que corresponde a la posición 174; T en una posición que corresponde a la posición 174; T en una posición que corresponde a la posición 175; K en una posición que corresponde a la posición 178; R en una posición que corresponde a la posición 178; K en una posición que corresponde a la posición 179; Q en una posición que corresponde a la posición 193; T en una posición que corresponde a la posición 195; N en una posición que corresponde a la posición 195; con E en una posición que corresponde a la posición 196; R en una posición que corresponde a la posición 196; con D en una posición que corresponde a la posición 198; P en una posición que corresponde a la posición 204; A en una posición que corresponde a la posición 205; E en una posición que corresponde a la posición 205; L en una posición que corresponde a la posición 205; T en una posición que corresponde a la posición 205; I en una posición que corresponde a la posición 206; K en una posición que corresponde a la posición 206; L en una posición que corresponde a la posición 206; R en una posición que corresponde a la posición 206; R en una posición que corresponde a la posición 209; N en una posición que corresponde a la posición 212; S en una posición que corresponde a la posición 212; A en una posición que corresponde a la posición 213; M en una posición que corresponde a la posición 213; N en una posición que corresponde a la posición 213; H en una posición que corresponde a la posición 215; M en una posición que corresponde a la posición 215; A en •una posición que corresponde a la posición 219; I en una posición que corresponde a la posición 219; K en una posición que corresponde a la posición 219; S en una posición que corresponde a la posición 219; H en una posición que corresponde a la posición 220; I en una posición que corresponde a la posición 220; L en una posición que corresponde a la posición 220; V en una posición que corresponde a la posición 220; Q en una posición que corresponde a la posición 221; G en una posición que corresponde a la posición 222; F en una posición que corresponde a la posición 232; G en una posición que corresponde a la posición 233; K en una posición que corresponde a la posición 233; R en una posición que corresponde a la posición 233; M en una posición que corresponde a la posición 234; A en una posición que corresponde a la posición 235; R en una posición que corresponde a la posición 236; C en una posición que corresponde a la posición . 237; E en una posición que corresponde a la posición 237 H en una posición que corresponde a la posición 237; Q en una posición que corresponde a la posición 237; T en una posición que corresponde a la posición 237; E en una posición que corresponde a la posición 238; H en una posición que corresponde a una posición de aminoácidos : 238; S en una posición que corresponde a la posición 238; A en una posición que corresponde a la posición 240; Q en una posición que corresponde a la posición 240; I en una posición que corresponde a la posición ¦ 247; A en una posición que corresponde a la posición 248; V en una posición que corresponde a la posición 249; G en una posición que corresponde a la posición 257 T en una posición que corresponde a la posición 257; R en una posición que corresponde a la posición 257; N en una posición que corresponde a la posición ' 258; S en una posición que corresponde a la posición 258; P en una posición que corresponde a la¦ posición 259; M en una posición que corresponde a la posición 260; Y en una posición que corresponde a la posición 260; A en una posición que corresponde a la posición 261; K en una posición que corresponde a la posición 261; N en una posición que corresponde a la posición 261; K en una posición que corresponde a la posición 263; R en una posición que corresponde a la posición 263 T en una posición que corresponde a la posición 267; A en una posición que corresponde a la posición 269; L en una posición que corresponde a la posición 271; M en una posición que corresponde a la posición 271; D en una posición que corresponde a la posición 272; T en una posición que corresponde a la posición 272; H en una posición que corresponde a la posición 273; Y en una posición que corresponde a la ¦ posición 273; F en una posición que corresponde a la posición 274; D en una posición que corresponde a la posición 276; H en una posición que corresponde a la posición 276; . M en una posición que corresponde a la posición 276; R en . una posición que corresponde a la posición 276; S en una posición que corresponde a la posición 276; Y en una posición que corresponde a la posición 276; A en una posición que corresponde a la posición 277; E en una posición que corresponde a la posición ' 277; H en una posición que corresponde a la posición 277.; K en una posición que corresponde a la posición 277; M en una posición que corresponde a la posición 277; N en una posición que corresponde a la posición 277; Q en una posición que corresponde a la posición 277; R en una posición que corresponde a la posición 277; S en una posición que corresponde a la posición 277; T en una posición que corresponde a la posición 277; E en una posición que corresponde a la posición 278; F en una posición que corresponde a la posición 278; G en una posición que corresponde a la posición 278; H en una posición que corresponde a la posición 278; K en una posición que corresponde a la posición 278; N en una posición que corresponde a la posición 278; R en una posición que corresponde a la . posición 278; S en una posición que corresponde a la posición 278; T en una posición que corresponde a la posición 278; Y en una posición que corresponde a la posición 278; H en una posición que corresponde a la posición 279; M en una posición que corresponde a la posición 282; S en una posición que corresponde a la posición 283 H en una posición que corresponde a la- posición 285 T en una posición que corresponde a la posición 287 S en una posición que corresponde a la posición 289 S en una posición que corresponde a la posición 291 V en una posición que corresponde a la posición 291 C en una posición que corresponde a la posición 292 F en una posición que corresponde a la posición 292 H en una posición que corresponde a la posición 292 K en una posición que corresponde a la posición 292 R en una posición que corresponde a la posición 292 V en una posición que corresponde a la- posición 292 A en una posición que corresponde a la posición 293 C en una posición que corresponde a la posición 293 D en una posición que corresponde a la posición 293 F en una posición que corresponde a la posición 293 K en una posición que corresponde a la posición 293 M en una posición que corresponde a la posición 293 P en una posición que corresponde a la posición 293 Q en una posición que corresponde a la posición 293 V en una posición que corresponde a la posición 293 V en una posición que corresponde a la posición 293 G en una posición que corresponde a la posición 298 E en una posición que corresponde a la posición 305 G en una posición que corresponde a la posición 307; D en una posición que corresponde a la posición 308; G en una posición que corresponde a la posición 308; K en una posición que corresponde a la posición 308; N en una posición que corresponde a la posición 308 R en una posición que corresponde a la posición 308; E en una posición que corresponde a la posición . 309; G en una posición que corresponde a la posición 309; H en una posición que corresponde a la posición 309; L en una posición que corresponde a la posición 309; M en una posición que corresponde a la posición 309; N en una posición que corresponde a la posición 309; Q en una posición que corresponde a la posición 309; R en una posición que corresponde a la posición 309; S en una posición que corresponde a la posición 309; T en una posición que corresponde a la posición 309; V en una posición que corresponde a la posición ¦ 309; A en una posición que corresponde a la posición 310; G en una posición que corresponde a la posición 310; Q en una posición que corresponde a la posición 310; S en una posición que corresponde a la posición 310; A en una posición que corresponde a la posición 313; G en una posición que corresponde a la posición 313; H en una posición que corresponde a la posición 313; K en una posición que corresponde a la posición 313; P en una posición que corresponde a la posición 313; R en una posición que corresponde a la posición 313; T en una posición que corresponde a la posición 313; Y en una posición que corresponde a la posición ; 313; con S en una posición que corresponde a la posición 314; Y en una posición que corresponde a la posición 314; A en una posición que corresponde a la posición 315; H en una posición que corresponde a la posición 315; Y en una po i ión que corresponde a la posición 315; A en una posición que corresponde a la posición 317; I en una . posición que corresponde a la posición 317; K en una posición que corresponde a la posición 317; N en una posición que corresponde a la posición 317; Q en una posición que corresponde a la posición 317; R en una posición que corresponde a la posición 317; S en una posición que corresponde a la posición 317; T en una posición que corresponde a la posición 317; w en una posición que corresponde a la posición 317; D en una posición que corresponde a la posición 318; H en una posición que corresponde a la posición 318; K en una posición que corresponde a la posición 318; M en una posición que corresponde a la posición 318; R en una posición que corresponde a la posición 318; H en una posición que corresponde la posición 320 K en una posición que corresponde la posición 320 R en una posición que corresponde la posición 320 R en una posición que corresponde la posición 321 S en una posición que corresponde la posición 321 N en una posición que corresponde la posición 324 R en una posición que corresponde la posición 324 A en una posición que corresponde la posición 325 D en una posición que corresponde la posición ' 325 E en una posición que corresponde la posición 325 G en una posición que corresponde la posición 325 H en una posición que corresponde la posición 325 K en una posición que corresponde la posición 325 M en una posición que corresponde la posición 325 N en una posición que corresponde la posición 325 Q en una posición que corresponde la posición 325 S en una posición que corresponde la posición 325 V en una posición que corresponde la posición 325 L en una posición que corresponde la posición 326 V en una posición que corresponde la posición 326 C en una posición que corresponde la posición 328 G en una posición que corresponde la posición 328 I en una posición que corresponde la posición 328 K en una posición que corresponde la posición 328 L en una posición que corresponde a la posición 328; S en una posición que corresponde a la posición . 328; Y en una posición que corresponde a la posición 328; S en una posición que corresponde a la posición 335; A en una posición que corresponde a la posición 347; G en una posición que corresponde a la posición 347; S en una posición que corresponde a la posición 347; M en una ¦ posición que corresponde a la posición 349; R en una posición que corresponde a la posición 349; S en una posición que corresponde a la posición 351; V en una posición que corresponde a la posición ! 353; con H en una posición que corresponde a la posición ¦ 356; S en una posición que corresponde a la posición 356; E en una posición que corresponde a la posición 359; H en una posición que corresponde a la posición 359; T en una posición que corresponde a la posición 359; A en una posición que corresponde a la posición 367; G en una posición que corresponde a la posición 367; K en una posición que corresponde a la posición 367; s en una posición que corresponde a la posición 367; A en una posición que corresponde a la posición 368; E en una posición que corresponde a la posición ¦ 368; K en una posición que corresponde a la posición 368; L en una .' posición que corresponde a una posición de aminoácidos 368; M en una posición que corresponde a una posición de aminoácidos 368; R en una posición que corresponde a la posición 368; T en una posición que corresponde a una posición de aminoácidos 368; H en una posición que corresponde a la posición 369; R en una posición que corresponde a la posición 369; F en una posición que corresponde a la posición 371; H en una posición que corresponde a la posición 371; K en una posición que corresponde a la posición 371; L en una posición que corresponde a la posición 371; R en una posición que corresponde a la posición 371; S en una posición que corresponde a la posición 371; M en una posición que corresponde a la posición 373; H en una posición que corresponde a la posición 374; P en una posición que corresponde a la posición 374 A en una posición que corresponde a la posición 375; G en una posición que corresponde a la posición 375; K en una posición que corresponde a la posición 375; R en una posición que corresponde a la posición 375; D en una posición que corresponde a la posición 376; E en una posición que corresponde a la- posición 376; Q en una posición que corresponde a la posición 376; R en una posición que corresponde a la posición 376; T en una posición que corresponde a la .posición 376; V en una posición que corresponde a la posición 376; Y en una posición que corresponde a la posición 376; D en una posición que corresponde a la posición 377; E en una posición que corresponde a la posición 377; H en una posición que corresponde a la posición 377; K en una posición que corresponde a la- posición 377; P en una posición que corresponde a la posición 377; R en una posición que corresponde a la posición 377; S en una posición que corresponde a la posición 377; . T en una posición que corresponde a la posición 377; en una posición que corresponde a la posición 380; Y en una posición que corresponde a la posición 380; S en una posición que corresponde a la posición 381; I en una posición que corresponde a la posición 383; K en una posición que corresponde a la posición 383; L en una posición que corresponde a la posición 383; S en una posición que corresponde a la posición 383; A en una posición que corresponde a la posición 385; Q en una posición que corresponde a la posición 385; V en una posición que corresponde a la posición 385; A en una posición que corresponde a la posición 389; G en una posición que corresponde a la posición 389; L en una posición que corresponde a la posición 389; K en una posición que corresponde a la posición 389; Q en una posición que corresponde a la posición 389; S en una posición que corresponde la posición 389 A en una posición que corresponde la posición 392 F en una posición que corresponde la posición 392 M en una posición que corresponde la posición 392 Q en una posición que corresponde la posición 392 R en una posición que corresponde la posición 392 V en una posición que corresponde la posición 392 F en una posición que corresponde la posición 393 M en una posición que corresponde la posición 393 A en una posición que corresponde la posición 395 H en una posición que corresponde la posición 395 R en una posición que corresponde la posición 395 A en una posición que corresponde la posición 396 H en una posición que corresponde la posición 396 Q en una posición que corresponde la posición 396 S en una posición que corresponde la posición 396 K en una posición que corresponde la posición 399 M en una posición que corresponde la posición 399 T en una posición que corresponde la posición 399 V en una posición que corresponde la posición 399 W en una posición que corresponde la posición 399 A en una posición que corresponde la posición 401 E en una posición que corresponde la posición 401 A en una posición que corresponde la posición 404 G en una posición que corresponde a la posición 405 F en una posición que corresponde a la posición 406 N en una posición que corresponde a la posición 406 A en una posición que corresponde a la posición 407 D en una posición que corresponde a la posición 407 E en una posición que corresponde a la posición 407 F en una posición que corresponde a la posición 407 H en una posición que corresponde a la posición 407 Q en una posición que corresponde a la posición 407 P en una posición que corresponde a la posición 407. A en una posición que corresponde a la posición 409 Q en una posición que corresponde a la posición 409 T en una posición que corresponde a la posición 410 Q en una posición que corresponde a la posición 412 R en una posición que corresponde a la posición 412 V en una posición que corresponde a la posición 412 L en una posición que corresponde a la posición 416 E en una posición que corresponde a la posición 418 L en una posición que corresponde a la posición 418 P en una posición que corresponde a la posición 418 R en una posición que corresponde a la posición 418 V en una posición que corresponde a la posición 418 F en una posición que corresponde a la posición 419 H en una posición que corresponde a la posición 419 I en una posición que corresponde a la posición 419 K en una posición que corresponde a la posición 419 R en una posición que corresponde a la posición 419 S en una posición que corresponde a la posición 419 Y en una posición que corresponde a la posición 419 A en una posición que corresponde a la posición 421 H en . una posición que corresponde a la posición 421 K en una posición que corresponde a la posición 421 N en una posición que corresponde a la posición 421 Q en una posición que corresponde a la posición 421 R en una posición que corresponde a la posición 421 S en una posición que corresponde a la posición 421 G en una posición que corresponde a la posición 425 K en una posición que corresponde a la posición 425 Q en una posición que corresponde a la posición 427 T en una posición que corresponde a la posición 427 L en una posición que corresponde a la posición 428 A en una posición que corresponde a la posición 431 G en una posición que corresponde a la posición 431 E en una posición que corresponde a la posición 431 H en : una posición que corresponde a la posición 431 K en una posición que corresponde a la posición 431 L en una posición que corresponde a la posición 431 N en una posición que corresponde a la posición 431 Q en una posición que corresponde a la posición 431 R en una posición que corresponde a la posición 431 S en una posición que corresponde a la posición 431 V en una posición que corresponde a la posición 431 A en una posición que corresponde a la posición 433 H en una posición que corresponde a la posición 433 I en una posición que corresponde a la posición 433 K en una posición que corresponde a la posición 433 L en una posición que corresponde a la posición 433 R en una posición que corresponde a la posición 433 T en una posición que corresponde a la posición 433 V en una posición que corresponde a la posición . 433 W en una posición que corresponde a la posición 433 K en una posición que corresponde a la posición 436 I en una posición que corresponde a la posición 437 M en una posición que corresponde a la posición 437 A en una posición que corresponde a la posición 438 D en una posición que corresponde a la posición 438 E en una posición que corresponde a la posición 438 L en una posición que corresponde a la posición 438 N en una posición que corresponde a la posición 438 T en una posición que corresponde a la posición . 438 A en una posición que corresponde a la posición 439 C en una posición que corresponde a la posición 439 K en una posición que corresponde a la posición 439; P en una posición que corresponde a la posición 439; Q en una posición que corresponde a la posición 439; T en una posición que corresponde a la posición · 439; V en una posición que corresponde a la posición 439; D en una posición que corresponde a la posición 440; H en una posición que corresponde a la posición 440; M en una posición que corresponde a la posición 440; P en una posición que corresponde a la posición 440; R en una posición que corresponde a la. posición 440; S en una posición que corresponde a la posición 440; A en una posición que corresponde a la posición 441; F en una posición que corresponde a la posición 441; C en una posición que corresponde a la posición ¦ 442; G en una posición que corresponde a la posición 442; R en una posición que corresponde a la posición 442; A en una posición que corresponde a la posición 443; E en una posición que corresponde a la posición 443; F en una posición que corresponde a la posición 443; G en una posición que corresponde a la posición 443; M en una posición que corresponde a la posición 443; N en una posición que corresponde a la posición 443; E en una posición que corresponde a la posición 444 ; H en una posición que corresponde a la posición ¦ 444; V en una posición que corresponde a la posición 444 ; H en una posición que corresponde a la posición 445; M en una posición que corresponde a la posición 445; N en una posición que corresponde a la posición 445; P en una posición que corresponde a la posición 445; Q en una posición que corresponde a la posición 445; S en una posición que corresponde a la posición 445; T en una posición que corresponde a la posición 445; V en una posición que corresponde a la posición 445; w en una posición que corresponde a la posición 445; A en una posición que corresponde a la posición 446; M en una posición que corresponde a la posición 446; W en una posición que corresponde a la posición 446; D en una posición que corresponde a la posición 447; E en una posición que corresponde a la posición 447; G en una posición que corresponde a la posición 447; I en una posición que corresponde a la posición 447; N en una posición que corresponde a la posición 447; P en una posición que corresponde a la posición 447; Q en una posición que corresponde a la posición 447 ; T en una posición que corresponde a la posición 447 y/o el reemplazo con V en una posición que corresponde a la posición 447, cada uno con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
Ejemplares de tales polipéptidos PH20 modificados son cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 74-855, o que tiene una secuencia de aminoácidos que mue'stre por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 74-855 y contenga el reemplazo de aminoácidos y muestre actividad de hialuronidasa.
Cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados anteriores proporcionados en la . presente puede mostrar propiedades o actividades alteradas tales como mejoradas o incrementadas, comparadas con el polipéptido PK20 correspondiente que no contiene la . modificación de aminoácidos (por ejemplo, reemplazo de aminoácidos) . Por ejemplo, las actividades o propiedades alteradas pueden ser una actividad catalítica incrementada y/o una estabilidad incrementada bajo condiciones de desnaturalización. a . Actividad Incrementada se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 modificados o variantes que contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipéptido PH20 y que muestran actividad de hialuronidasa comparada con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos, por ejemplo, el polipéptido PH20 expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 o 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%; 98%, 99% o más de identidad de secuencia al mismo. En particular, los polipéptidos PH20 modificados o variantes proporcionados en la presente muestran actividad de hialuronidasa incrementada comparado con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácidos, por ejemplo, el polipéptido PH20 expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72 y en particular el polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3.
El polipéptido PH20 modificado puede mostrar actividad de hialuronidasa que es por lo menos o aproximadamente por lo menos o 120%, 130%, 135%,' 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos, por ejemplo el polipéptido PH20 expuesto en cualquiera de cualquiera de .SEQ ID NOS: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 o 870 o una variante del mismo, ajo las mismas condiciones. Por ejemplo, la actividad de hialuronidasa se incrementa por lo menos o aproximadamente por lo menos 1.2 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 1 veces, 15 veces, 16 veces, 17. veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces s más.
En ejemplos particulares, los polipéptidos PH20 modificados contienen reemplazos de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácido identificadas por ser asociadas con la actividad de hialuronidasa incrementada. Como se describe en la presente, tales composiciones se han identificado utilizando métodos de mutagénesis y selección o clasificación para identificar aquellas posiciones que dan por resultado actividad de hialuronidasa incrementada. El polipéptido PH20 también puede contener otras modificaciones, tales como otros reemplazos de aminoácidos, que solos no se asocian con la actividad incrementada siempre y. cuando el polipéptido PH20 modificado resultante muestre actividad de hialuronidasa incrementada comparado con la PH20 que no contiene la modificación (es) de aminoácidos, tales como el reemplazo (s) de aminoácidos. El polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, '63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, o más de reemplazos de aminoácidos. Las modificaciones adicionales, tales como inserciones o supresiones, también se pueden incluir. El reemplazo de aminoácidos puede estar en un polipéptido PH20 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 2,3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 u 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, el reemplazo (s) puede estar en un polipéptido PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera.de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72 o una variante del mismo.
Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente contienen un reemplazo de aminoácidos (sustitución) en una o más aminoácido posiciones de aminoácido que corresponden á las posiciones 1, 12, 15, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 3-2, 33, 37, 39, 46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97, 118, 120, 127, 131, 135, 141, 142, 147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206, 209, 212, 213, 215, 21.9, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263, 269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 291, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359, 371, 377, 380, 389, 392, 395, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden ser reemplazos en las posiciones que corresponden al reemplazo de Leucina (L) en la posición 1 (Ll), V12, L15, F24, L26, G27, F29, D30, E31, P32, L33, L37, S39, 146, A48, G52, V58, Y63, 167, D68, S69, 170, T71, G72, V73, T74, V75, S84, G86, D87, A92, K93, K94, T97, T118, A120, D127, N131, E135, N141, V142, T147, E148, T150, E151, K152, Q155, E156, D163, F164, L165, V166, 1169, 170, L174, G198, V206, K209, D212, D213, S215, N219, Q233, Q234, P236, A238, V247, P257, A259, K260 , S261, L263, T269, 1271, V272, : Q276-, V277, L278, S282, G29.1, T293, G305, S308, 1309, M310, M313, S315, L317, L318, D320, E324, T325, 1326, M328, Q347, 1353, S359, A371, G377, F380, E389, E392, S395, Y399, T405, S407, K409, E410, D418, A419, D421, A425, D431, F433, P436, P437, M438, E439, T440, E441, E442, P443, 1445, F446 o Y447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Ejemplares de tales polipéptidos PH20 modificados son los polipéptidos que muestran por lo menos 1.5 veces o más de la actividad del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos.
Ejemplar de los- reemplazos de aminoácidos en los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, reemplazo: con histidina (H) en una posición que corresponde a la posición 1; Q en una posición que corresponde a la posición 1; E en una posición que corresponde a la posición 12; T en una posición que corresponde a la posición 12; V en una posición que corresponde a la posición 15; E en una posición que corresponde a la posición 24; H en una posición que corresponde a la posición 24; E en una . posición que corresponde a la posición 26; K en una posición que corresponde a la posición 26; K en una posición que corresponde a la posición 27; R en una posición que corresponde a la posición 27; E en una posición que corresponde a la posición 29; I en una posición que corresponde a la posición 29; L en una posición que corresponde a la posición 29; M en una posición que corresponde a la posición 29; P en una posición que corresponde a la posición 29; S en una posición que corresponde a l posición 29; V en una posición que corresponde a la posición 29; G en una posición que corresponde a la posición 30; H en una posición que corresponde a la posición 30; K en una posición que corresponde a la posición 30; M en una posición que corresponde a la posición 30; R en una posición que corresponde a la posición 30; S en una posición que corresponde a la posición 30; A en una posición que corresponde a la posición 31; C en una posición que corresponde a la posición 31; H en una posición que corresponde a la posición 31; I en una posición que corresponde a la . posición 31; K en una posición que corresponde a la posición 31; L en una posición que corresponde a la posición 31; P en una posición que corresponde a la posición 31; R en una posición que corresponde a la posición 31; S en una posición que corresponde a la posición 31; T en una posición que corresponde a la posición 31; V en una posición que corresponde a la posición 31; F en una posición que corresponde a la posición 32; G en una posición que corresponde a la posición 32; H en una posición que corresponde a la¦ posición 32; W en una posición que corresponde a la posición 33; F en una posición que corresponde a la posición 37; N en una posición que corresponde a la posición 39; T en una posición que corresponde a la posición 39; R en una posición que corresponde a la posición 46; F en una posición que corresponde a la posición 48; H en una posición que corresponde a la posición 48; N en una posición que corresponde a la posición 48; Q en una posición que corresponde a la posición 52 K en una posición que corresponde a la posición 58 Q en una posición que corresponde a la posición 58 en una posición que corresponde a la posición 63 V en una posición que corresponde a la posición 67 H en una posición que corresponde a la posición 68 Q en una posición que corresponde a la posición 68 ? en una posición que corresponde a la posición 69 C en una posición que corresponde a la posición 69 F en una posición que corresponde a la posición 69 G en una posición que corresponde a la posición 69 I en una posición que corresponde a la posición 69 L en una posición que corresponde a la posición 69 M en una posición que corresponde a la posición 69 P en una posición que corresponde a la posición 69 R en una posición que corresponde a la posición 69 W en una posición que corresponde a la posición 69 Y en una posición que corresponde a la posición 69 A en una posición que corresponde a la posición 70 C en una posición que corresponde a la posición 70 F en una posición que corresponde a la posición 70 G en una posición que corresponde a la posición 70 H en una posición que corresponde a la posición 70 K en una posición que corresponde a la posición 70 L en una posición que corresponde posición 70; N en una posición que corresponde la posición una posición que corresponde la posición 70; R en una posición que corresponde la posición 70; S en una posición que corresponde la posición 70; T en una posición que corresponde la posición 70; V en una posición que corresponde la posición 70; R en una posición que corresponde la posición en una posición que corresponde la posición 71; M en una posición que corresponde la posición 72; Q en una posición que corresponde la posición 72; H en una posición que corresponde la posición 73; L en una posición que corresponde la posición 73; en una posición que corresponde la posición 73; A en una posición que corresponde la posición 74; C en una posición que corresponde la posición 74; . G en una posición que corresponde la posición 74; N en una posición que corresponde la posición 74; P en una posición que corresponde la posición 74; R en una posición que corresponde la posición 74; S en una posición que corresponde la posición 74; V en una posición que corresponde la posición 74; W en la posición que corresponde la posición 74; F en una posición que corresponde la. posición 75; L en una posición que corresponde a la posición 75; R en una posición que corresponde a la posición 75; T en una posición que corresponde a la posición 75; G en una posición que corresponde a la posición 84; R en una posición que corresponde a la posición 84; A en una posición que corresponde a la posición C en una posición que corresponde a la ' posición 87; T en una posición que corresponde a la posición 87; Y en una posición que corresponde a la posición 87; C en una posición que corresponde a la posición 92; I en una posición que corresponde a la posición 93; L en una posición que corresponde a la posición 93; R en una posición que corresponde a la posición 93; T en una posición que corresponde a la posición 93; R en una posición que corresponde a la posición 94; G en una posición que corresponde a la posición 97; Q en una posición que corresponde a la posición 118; F en una posición que corresponde a la posición 120; Y en una posición que corresponde a la posición 120; Y en una posición que corresponde a la posición 120; H en una posición que corresponde a la posición 127; N en una posición que corresponde a la posición 127; G en una posición que corresponde a la posición 131; R en una posición que corresponde a la posición 131; V en una posición que corresponde a la posición 131; D en una posición que corresponde a la posición 135; G en una posición que corresponde a la posición 135; R en una posición que corresponde a la posición 135, con H en una posición que corresponde a la posición 141; Y en una posición que corresponde a la posición 1 1; R en una posición que corresponde a la posición 142; en una posición que corresponde a la posición 147; V en una posición que corresponde a la posición ¦ 147; K en una posición que corresponde a la posición 148; G en una posición que corresponde a la posición 150; K en una posición que corresponde a la posición 151; L en una posición que corresponde a la posición 151; M en una posición que corresponde a la posición 151; Q en una posición que corresponde a la posición 151; R en una posición que corresponde a la posición 151; R en una posición que corresponde a la posición 152; G en una posición que corresponde a la posición 155; K en una posición que corresponde a la posición 155; D en una posición que corresponde a la posición 156; A en una posición que corresponde a la posición 163; E en una posición que corresponde a la posición 163; K en una posición que corresponde a la posición 163; R en una posición que corresponde a la posición 163; M en una posición que corresponde a la posición 164; D en una posición que corresponde a la posición 165; N en una posición que corresponde a la posición 165; A en una posición que corresponde a la posición 166; F en una posición que corresponde a la posición 166; H en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la. posición 166; Q en una posición que corresponde a la posición 166; R en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166; Y en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 169; R en una posición que corresponde a la posición 170; K en una posición que corresponde a la posición 174; D en una posición que corresponde a la posición 198; K en una posición que corresponde a la posición 206; L en una posición que corresponde a la pos.ición 206; N en una posición que corresponde a la posición 212; M en una posición que corresponde a la posición 213; N en una posición que corresponde a la posición 213; M en una posición que corresponde a la posición 215; S en una posición que corresponde a la posición 219; K en una posición que corresponde a la posición 233; R en una posición que corresponde a la posición 233; M en una posición que corresponde a la posición 234; R en una posición que corresponde a la posición 236; E en una posición que corresponde a la posición 237; S en una posición que corresponde a la posición 238; I en una posición que corresponde a la posición 247; T en una posición que corresponde a la posición 257; P en una posición que corresponde a la posición 259; Y en una posición que corresponde a la posición 260; K en una posición que corresponde a la posición 261; N en una posición que corresponde a la posición 261; K en una posición que corresponde a la posición 263; R en una posición que corresponde a la posición 263; A en una posición que corresponde a la posición 269; L en una posición que corresponde a la posición 271; M en una posición que corresponde a la posición 271; T en una posición que corresponde a la posición 272; D en una posición que corresponde a la posición 276; S en una posición que corresponde a la posición 276; Y en una posición que corresponde a la posición 276; K en una posición que corresponde a la posición 277; R en una posición que corresponde a la posición 277; T en una posición que corresponde a la. ¦posición 277; H en una posición que corresponde a la posición 278; K en una posición que corresponde a la posición 278; N en una posición que corresponde a la posición 278 ; R en una posición que corresponde a la posición 278; S en una posición que corresponde a la posición 278; T en una posición que corresponde a la posición 278; Y en una posición que corresponde a la posición 278; M en una posición que corresponde a la posición 282; V en una posición que corresponde a la posición 291; ¦ A en una posición que corresponde a la posición 293; C en una posición que corresponde a la posición 293; F en una posición que corresponde a la posición 293; M en una posición que corresponde a la posición 293; P en una posición que corresponde a la posición 293; Q en una posición que corresponde a la posición 293; V en una posición que corresponde a la posición 293; E en una posición que corresponde a la posición 305; G en una posición que corresponde a la posición 308; N en una posición que corresponde a la posición 308; E en una posición que corresponde a la posición 309; L en una posición que corresponde a la posición 309; N en una posición que corresponde a l posición 309; Q en una posición que corresponde a la posición 309; R en una posición que corresponde a la posición 309; T en una posición que corresponde a la posición 309; ? en una posición que corresponde a la posición 310; G en una posición que corresponde a la posición 310; K en una posición que corresponde a la- posición 313; R en una posición que corresponde a la posición 313; H en una posición que corresponde a la posición 315; .1 en una posición que corresponde a la posición 317, K en una posición que corresponde a la posición ¦ 317; R en una posición que corresponde a la posición. 317; M en una posición que corresponde a la posición 318; H en una posición que corresponde a la posición 320; K en una posi ión que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 324; A en una posición que corresponde a la posición 325; D en una posición que corresponde a la posición 325; E en una posición que corresponde a la posición 325; G en una posición que corresponde a la posición 325; H en una posición que corresponde a la posición 325; K en una posición que corresponde a la posición 325; M en una posición que corresponde a la posición 325; N en una posición que corresponde a la posición 325; Q en una posición que corresponde a la posición 325; S en una posición que corresponde a la posición 325; V en una posición que corresponde a la posición 326; I en una posición que corresponde a la posición 328; K en una posición que corresponde a la posición 328; L en una posición que corresponde a la posición 328; S en una posición que corresponde a la posición 328; Y en una posición que corresponde a la posición 328; G en una posición que corresponde a la posición 347; S en una posición que corresponde a la posición 347; V en una posición que corresponde a la posición 353; con T en una posición que corresponde a la posición 359; R en una posición que corresponde a la posición 371; . P en una posición que corresponde a la posición 377; T en una posición que corresponde a la posición 377; w en una posición que corresponde a la posición 380; Y en una posición que corresponde a la posición 380; K en una posición que corresponde a la posición 389; M en una posición que corresponde a la posición 392; R en una posición que corresponde a la posición 395; M en una posición que corresponde a la posición 399; T en una posición que corresponde a la posición 399; W en una posición que corresponde a la posición 399; G en una posición que corresponde a la posición 405; D en una posición que corresponde a la posición 407; Q en una posición que corresponde a la posición 407; A en una posición que corresponde a la posición 409 Q en una posición que corresponde a la posición 409; T en una posición que corresponde a la posición 410 P en una posición que corresponde a la posición 418 F en una posición que corresponde a la posición 419 I en una posición que corresponde a la posición 419 K en una posición que corresponde a la posición 419 R en una posición que corresponde a la posición 419 S en una posición que corresponde a la posición 419 H en una posición que corresponde a la posición 421 K en una posición que corresponde a la- •posición 421 N en una posición que corresponde a la posición 421 Q en una posición que corresponde a la posición 421 R en una posición que corresponde a la posición 421 S en una posición que corresponde a la posición 421 K en una posición que corresponde a la posición 425 A en una posición que corresponde a la posición 431 H en una posición que corresponde a la posición 431 K en una posición que corresponde a la posición 431 Q en una posición que corresponde a la posición 431 R en una posición que corresponde a la posición 431 S en una posición que corresponde a la posición 431 V en una posición que corresponde a la posición 431 L en una posición que corresponde a la posición 433 R en una posición que corresponde a la posición 433 T en una posición que corresponde a la posición 433 V en una posición que corresponde a la posición 433; K en una posición que corresponde a la posición 436; I en una posición que corresponde a la posición 437; M en una posición que corresponde a la posición 437; T en una posición que corresponde a la posición 438; V en una posición que corresponde a la posición 439; H en una posición que corresponde a la posición 440; R en una posición que corresponde a la posición 440; F en una posición que corresponde a la posición 441; R en una posición que corresponde a la posición 442; A en una posición que corresponde a la posición 443; M en una posición que corresponde a la posición 443; M en una posición que corresponde a la posición 445; P en una posición que corresponde a la posición 445; A en una posición que corresponde a la posición 446; D en una posición que corresponde a la posición 447; N en una posición que corresponde a la posición 447; y/o con Q en una posición que corresponde a la posición 447, cada uno con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Los polipéptidos PH20 modificados pueden contener cualquiera de una o más de las sustituciones de aminoácidos citadas, en cualquier combinación, con o sin modificaciones adicionales, siempre y cuando el polipéptido PH20 muestre actividad de hialuronidasa, al como actividad de hialuronidasa incrementada comparado con la polipéptido PH20 que no contiene la modificación (es) , por ejemplo, por lo menos 1.5 veces actividad de hialuronidasa incrementada.
En algunos ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente contienen uno o más reemplazo ( s ) de aminoácidos en una posición (es) que corresponde a la posición 24, 29, 31, 48, 58, 69, 70, 75, 84, 97, 165, 166, 271, 278, 317, 320, 325, y/o 326 con referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO: 3 Por ej emplo, los reemplazos de aminoácidos ejemplarse incluyen , pero no se limitan a, el reemplazo con: E en una posición que corresponde a la posición 24; E en una posición que corresponde a la posición' 29; V en una posición que corresponde a la posición 31; N en una posición que corresponde a la posición 48; K en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición A en una posición que corresponde a la posición 69; F en una posición que corresponde a la posición G en una posición que corresponde a la posición 69; P en una posición que corresponde a la posición R en una posición que corresponde a la posición 69; A en una posición que corresponde a la posición F en una posición que corresponde a la posición' 70; G en una posición que corresponde a la posición H en una posición que corresponde a la posición 70; H en una posición que corresponde a la posición N en una posición que corresponde a la posición 70; R en una posición que corresponde a la posición T en una posición que corresponde a la posición 70; V en una posición que corresponde a la posición L en una posición que corresponde a la posición' 75; T en una posición que corresponde a la posición G en una posición que corresponde a la posición 84; G en una posición que corresponde a la posición 97; Den una posición que corresponde a la posición 165; L en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 271; H en una posición que corresponde a la posición 278; R en una posición que corresponde a la posición 278; K en una posición que corresponde a la posición ' 317; K en una posición que corresponde a la posición 320; E en una posición que corresponde a la posición 325; con H en una posición que corresponde a la posición 325; K en una posición que corresponde a la posición 325; N en una posición que corresponde a la posición 325; Q en una posición que corresponde a la posición 325; V en una posición que corresponde a la posición 326; cada uno con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:3. Los polipéptidos PH20 modificados pueden contener cualquiera de una o más de las sustituciones de aminoácidos citadas, en cualquier combinación, con o sin modificaciones adicionales, siempre y cuando el polipéptido PH20 muestre actividad de hialuronidasa, tal como actividad de hialuronidasa incrementada comparado con el polipéptido PH20 que no contiene la modificación (es ) , por ejemplo, por lo menos 2.0 veces de actividad de hialuronidasa incrementada.
Los polipéptidos PH20 modificados ejemplares que muestran actividad incrementada comparado con la polipéptido PH20 no modificado (por ejemplo, expuesto en SEQ ID NO: 3) son cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 73, 78, 86, 89, 91, 95, 96, 99, 100, 105, 106, 108, 10-9, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 123-126, 128 -136 , 139-141 , 149, 154, 155, 159, 164, 165, 167, 173, 178, 181, 191-193, 195-197, 199-205, 207-221, 225, 226, 228, 229, 231, 233, 237-239, 242, 247-254, 256, 257, 267, 269, 270, 277, 283, 293, 295, 296, 298, 300, 303, 308, 316, 318, 321, 322, 324, 325, 330, 334, 335, 338-340, 344, 348, 355, 367, 369, 371, 377, 384-388, 394, 398, 399, 401, 406-408, 410, 412, 414, 416, 419, 421-426, 428, 430, 431, 435, 448, 455, 456, 459, 462, 463, 465, 469, 478-480, 482, 484, 490, 493, 497, 501, 503, 505, 506-508, 510-512, 514, 518, 522, 523, 527, 531, 533, 537-543, 545, 551, 558, 559, 561, 563-566, 569, 572, 574, 576, 579, 581-583, 585, 587, 588, 594, 596, 602, 605, 606, 609, 613, 618-620, 624-634, 637, 640-644, 647, 648, 652, 657, 675, 695, 698, 699, 700, 712, 717, 725, 731, 732, 734, 738, 742, 746, 748-750, 757, 760, 762-765, 768-773, 775, 779, 782, 783, 786-789, 794-797, 799-801, 807, 814, 816, 819, 822, 825, 826, 830, 836, 838, 844, 847, 851, 853 o que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 73, 78, 86, 89, 91, 95, 96, 99, 100, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 123-126, 128-136, 139-141, 149, 154, 155, 159, 164, 165, 167, 173, 178, 181, 191-193, 195-197, 199-205, 207-221, 225, 226, 228, 229, 231, 233, 237-239, 242, 247-254, 256, 257, 267, 269, 270, 277, 283, 293, 295, 296, 298, 300, 303, 308, 316, 318, 321, 322, 324, 325, 330, 334, 335, 338-340, 344, 348, 355, 367, 369, 371, 377, 384-388, 394, 398, 399, 401, 406-408, 410, 412, 414, 416, 419, 421-426, 428, 430, 431, 435, 448, 455, 456, 459, 462, 463, 465, 469, 478-480, 482, 484, 490, 493, 497, 501, 503, 505, 506- 508, 510-512, 514, 518, 522, 523, 527, 531, 533, 537-543, 545, 551, 558, 559, 561, 563-566, 569, 572, 574, 576, 579, 581-583, 585, 587, 588, 594, 596, 602, 605, 606, 609, 613, 618-620, 624-634, 637, 640-644, 647, 648, 652, 657, 675, 695, 698, 699,¦ 700, 712, 717, 725, 731, 732, 734, 738, 742, 746, 748-750, 757, 760, 762-765, 768-773, 775, 779, 782, 783, 786-789, 794- 797, 799-801, 807, 814, 816, 819, 822, 825, 826, 830, 836, 838, ' 844, 847, 851, 853 y contenga el reemplazo de aminoácidos y muestre actividad de hialuronidasa incrementadas comparado con el polipéptido no modificado correspondiente. b. Estabilidad Incrementada Se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 que muestran estabilidad incrementada. En particular, los polipéptidos PH20 muestran estabilidad incrementada in vivo y/o in vitro. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 pueden mostrar estabilidad incrementada bajo varias condiciones de almacenamiento. Los polipéptido PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada expresan, e.ntre otros parámetros, resistencia incrementada a las condiciones de desnaturalización, incluyendo pero no limitado a, condiciones de desnaturalización provocadas por la temperatura (por ejemplo, temperatura elevada tal como calor), agitación, nada o bajo contenido de sal,' y/o presencia de excipientes. Los excipientes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, rellenadores y diluyentes, sabores, colores, lubricantes, deslizantes, conservadores, sorbentes o edulcorantes. Por ejemplo, varios excipientes, tales como conservadores, pueden actuar como agentes de desnaturalización de proteina. Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad de proteina incrementada muestran agregación reducida, precipitación reducida y/o actividad incrementada cuando se exponen a una condición de desnaturalización comparada con una PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran por lo menos o por lo menos aproximadamente o 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%,. 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%), 400%), 450%), 500%) o más actividad incrementada cuando se exponen a una condición de desnaturalización comparado con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácidos cuando se expone a la misma condición de desnaturalización.
Los polipéptidos PH20 proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada son polipéptidos PH20 modificados o variantes que contienen un reemplazo de aminoácidos (sustitución) , supresión o inserción u otra modi-ficación, típicamente, . los polipéptidos PH20 proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada contienen uno o más reemplazos de aminoácidos en un polipeptido PH20 comparado con él polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo ( s ) de aminoácidos, por ejemplo, el polipéptido PH20 expuesto' en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6- 66, 68-72, 856-861, 869 o 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) o más de identidad de secuencia al mismo. En particular, los polipéptidos PH20 modificados o variantes proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada, comparado con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácidos, por ejemplo, el polipéptido PH20 expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72 y en particular el polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3.
En ejemplos particulares, los polipéptido PH20 modificados contienen un reemplazo de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácido identificadas por ser asociadas con la estabilidad incrementadas. Como se describe en la presente, tales posiciones se pueden identificar utilizando métodos de mutagénesis y selección o clasificación para identificar esas posiciones que dan por resultado estabilidad (por ejemplo, actividad incrementada) del polipéptido comparado con la PH20 correspondiente que no contiene la modificación y la exposición a una o más condiciones de desnaturalización. El polipéptido PH20 también puede contener otras modificaciones, tales como otros reemplazos de aminoácidos, que solos no se asocian con conferir estabilidad, siempre y. cuando el polipéptido PH20 modificado resultante muestre estabilidad incrementada bajo una o más condiciones de desnaturalización comparado con la PH20 que no contiene la modificación (es) de aminoácidos, tal como el reemplazo (s) de aminoácidos, y muestra actividad de hialuronidasa . El polipéptido PH20. modificado proporcionado en la presente puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, o más de reemplazos de aminoácidos . Las modificaciones adicionales, tales como inserciones o supresiones, también se pueden incluir. El reemplazo de aminoácidos puede estar en un polipéptido PH20 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 o 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, los reemplazos pueden estar en un polipéptido PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72 o una variante del mismo.
Ejemplares de polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente son los polipéptidos PH20 que muestran estabilidad incrementada en la exposición a compuestos de fenol, alta temperatura (calor) , y/o falta de NaCl. i. Fenófilos Son proporcionados en la presente polipéptidos PH20 modificados que muestran estabilidad incrementada en presencia de compuestos fenólicos. Las formulaciones de dosis múltiples deben contener conservadores antimicrobianos para protegerlos de la contaminación microbiana. Para los productos de fármaco parenterales , incluyendo insulina y otros agentes terapéuticos, los conservadores más comunes son compuestos fenólicos, tales como genol, metacresol (m-cresol] , alcohol bencílico, y parabenos incluyendo metilparabeno y propilparabeno. Los conservadores deben estar presentes típicamente en concentraciones suficientes para satisfacer las reglas reguladoras. Por ejemplo, los requisitos reguladores afirman que la eficacia antimicrobiana de la formulación debe satisfacer los requisitos de la prueba de eficacia conservadora (PET) de los mercados objetivos. Las agencias reguladoras actualmente diferentes tienen diferentes criterios de farmacopea para la efectividad antimicrobiana para los productos farmacéuticos diseñados para múltiple dosificación. Los requisitos PET de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) difieren considerablemente, imponiendo restricciones adicionales en el desarrollo de formulaciones de múltiple dosis. La Tabla 4 muestra los criterios para los f rmacos inyectables para cumplir con los criterios USP y EP. Típicamente, las formulaciones que cumplen los requisitos antimicrobianos EP (EPA o EPB) contienen más conservador que aquellos formulados solamente para cumplir con los requisitos antimicrobianos USP.
Tabla 4. Requisito USP y EP para prueba de efectividad antimicrobiana * Reducción unitaria Logio de inoculo medido inicial; sin incremento; no más de 0.5 logio de incremento unitario que el valor previamente medido.
Los conservadores antimicrobianos pueden interactuar con las proteínas que dan por resultado agregaciones y efectos negativos en la estabilidad. De esta manea, aunque un componente necesario, los conservadores poseen un problema significativo en desarrollo de formulaciones de dosis múltiples, estables de proteínas debido a que inducen típicamente la agregación de la proteína en la solución acuosa. En particular,, el incremento o altas cantidades de conservadores pueden impactar negativamente la estabilidad de una proteína, incluyendo efectos en la estabilidad física (agregación o precipitación) que pueden impactar la actividad de la proteína. Por ejemplo, para cumplir con los requisitos de eficacia conservadora EP, las cantidades relativamente altas de compuestos fenólicos, tales como fenol o m-cresol, se pueden requerir, lo cual puede incluir estabilidad de la formulación de la proteína. Por ejemplo, los conservadores tales como fenol, m-cresol, y alcohol bencílico han mostrado que inducen agregación, de la hormona de crecimiento humana (Maa y Hsu (1996) Int. J. Pharm. 140: 155-168), receptor de interleucina-1 recombinante (Re mMele (1998) Pharm. Res.15 : 200-208 ) , factor I de crecimiento similar a insulina humana I (Fransson (1997) Pharm. Res. 14:606-612), rhIFN-? (Lam (1997) Pharm. Res. 14:725-729) y citocromo c (Singh y colaboradores (2011) J. Pharm Sci., 100: 1679-89). El efecto de desestabilización que los conservadores tienen en las proteínas en solución ha sido un factor limitante en el desarrollo de formulaciones de dosis múltiples, y hasta la fecha, se han formulado más productos terapéuticos de proteínas para solamente uso individual.
La hialuronidasa PH20, tal como rHuPH20, pierde rápidamente la actividad en. presencia de conservadores, probablemente debido al desplegamiento. de la proteína y la formación de agregados subsecuentes. Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos en la presente, los conservadores reducen la actividad enzimát.ica de PH20, particularmente en temperaturas elevadas (véase también Solicitud Provisional de E.U.A. No. 61/520,962; y Solicitudes de E.U.A. Nos. 13/507,263 y 13/507,262). Por ejemplo, después de la incubación con 0.4% de m-cresol durante 4 horas, la PH20 (por ejemplo, rHuPH20) retiene solo aproximadamente 10% de actividad {véase por ejemplo, Ejemplo 5) . Cuando se incuba en presencia de 0.1% de fenol y 0.15% o 0.315% de m-cresol durante 6 días a 37°C, la PH20 (por ejemplo, rHuPH20) retiene aproximadamente 0% a 15% de actividad, dependiendo de la presencia de otros excipientes o cantidades de otros excipientes en la formulación (véase por ejemplo, Ejemplos 9 y 10) . Por ejemplo, la presencia de una mayor concentración de sal incrementa generalmente la estabilidad de la PH20. En particular, la temperatura de fusión de la PH20, tal como rHuPH20, se reduce significativamente cuando los conservadores fenólicos, tal como m-Cresol, se agregan a la formulación. Por ejemplo, la temperatura de desplegamiento de rHuPH20 se reduce de 44 °C a 24 °C. La menores te temperaturas de desplegamiento de PH20 conduce a la agregación de PH20 incrementada, especialmente en temperaturas elevadas, y la actividad enzimática. reducida. El efecto de desestabilización es probablemente debido a la naturaleza hidrofóbica de los conservadores fenólicos. La hidrofobicidad de los compuestos fenólicos puede conducir- a la interacción con rHuPH20 a través de la ligación no especifica a la proteina, finalmente perturbando la actividad estructura de la rHuPH20. Esto se traduce a una pérdida significativa de la actividad enzimática de rHuPH20 en presencia de conservadores.
Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada en presencia de conservadores fenólicos muestran más que 15% de actividad enzimática en presencia de por lo menos un conservador fenólico durante por lo menos 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, ¦ 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 3 semanas, 4 semanas o más comparado con la actividad enzimática del polipéptido PH20 modificado en ausencia de un conservador para el mismo periodo de tiempo y bajo las mismas condiciones (excepto para' la presencia del conservador). En algunos ejemplos, los polipéptido PH20 modificados proporcionados en la presente muestran por lo menos. 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más actividad enzimática en presencia de un conservador fenólico comparado en ausencia del conservador. Por ejemplo, el compuesto conservador fenólico puede ser fenol, metacresol (m-cresol) , alcohol bencílico, y/o parabenos incluyendo metilparabeno o propilparabeno .
En ejemplos particulares, la estabilidad incrementada en presencia del conservador se muestra bajo condiciones de temperatura de entre o aproximadamente entre 0°C a 40°C, tal como entre o aproximadamente entre 2°C a 6°C, 24°C a 32°C o 35°C a 40°C, y generalmente en o aproximadamente de 4°C o 5°C, 30°C o 37°C. Se entiende que puesto que la alta temperatura también puede tener un efecto de desestabilización en la actividad de PH20 (véase posteriormente), el porcentaje de la actividad enzimática de un polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente en presencia de un conservador es mayor en temperaturas más bajas que en temperaturas más altas.
Generalmente, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada, y las actividades enzimáticas notadas, en presencia de una cantidad efectiva antimicrobiana de conservador que extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos en una muestra de la composición. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de una cantidad efectiva antimicrobiana de conservador que extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos tal como por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio en los organismos bacterianos que se presenta a 7 días después de la inoculación. En algunos ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de una cantidad efectiva antimicrobiana de conservador que extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos tal que, cuando se someten a prueba en una prueba de actividad conservadora antimicrobiana (APET) , después de la inoculación de la composición con un inoculo microbiano existe por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio en los organismos bacterianos a 7 días después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 3.0 logio a de organismos bacterianos a 14 días después de la inoculación, por lo menos sin incremento adicional en los organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación, y por lo menos sin incremento en los organismos fúngicos 7 días después de la inoculación. En otros ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de una cantidad efectiva antimicrobiana de conservador que extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos tal que, cuando se somete a prueba en una prueba de efectividad conservadora antimicrobiana (APET) , después de la inoculación de la composición con un inoculo microbiano existe por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio de organismos bacterianos a 24 horas después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 3.0 logio de organismos bacterianos a 7 días después de la inoculación, sin incremento adicional en los organismos bacterianos después de 28 días después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio de organismos fúngicos a 14 días después de la inoculación, y por lo menos sin incremento adicional en los organismos fúngicos después de 23 días después de la inoculación. En todavía otro ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de una cantidad efectiva antimicrobiana del conservador que extermina o inhibe la propagación de organismos microbianos tal que, cuando se somete a una prueba de efectividad conservadora antimicrobiana (APET) , después de la inoculación de la composición con un inoculo microbiano existe por lo menos una reducción unitaria de 2.0 logi0 de organismos bacterianos a 6 horas después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 3.0 logio de organismos bacterianos a 24 horas después de la inoculación, sin recuperación de los organismo bacterianos después de- 28 días después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano, por lo menos una reducción unitaria de 2.0 logio de organismo fúngicos a 7 días después de la inoculación, y por lo menos sin incremento adicional en los organismos fúngicos después de 28 días después de la inoculación.
Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada, y actividad enzimática mencionada en lo anterior, en presencia de una cantidad total de uno o más agentes conservadores fenólicos como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) que es o está entre 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive.
Generalmente, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de m-cresol y/o fenol. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de m-cresol en una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) en una formulación que contiene el polipéptido PH20 modificado de entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4%. E otros ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de fenol en una cantidad en un % de concentración de masa (p/v) en una formulación que contiene el polipéptido PH20 modificado de entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% de m-cresol. En ejemplos adicionales, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad incrementada en presencia de fenol y m-cresol en una cantidad como % de concentración de masa (p/v) en una formulación que contiene el polipéptido PH20 modificado de entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.25% fenol y entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.3% de m-cresol, entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.2% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.6% a 0.18% de m-cresol, entre o aproximadamente entre 0.1% a 0.15% fenol y 0.8% a 0.15% de m-cresol, entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.15% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.06% a 0.09% de m-cresol, o entre o aproximadamente entre 0.12% a 0.18% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.14% a 0.22% de m-cresol .
En ejemplos en 'la presente, los polipéptidos PH20 modificados muestran más de 15%, tal como por lo menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más actividad enzimática en presencia de por lo menos aproximadamente entre o entre 0.3% a 0.4%, inclusive, m-cresol y/o fenol durante por lo menos 4 horas a 37 °C comparada con la actividad enzimática del polipéptido PH20 modificado en ausencia del conservador para el mismo periodo de tiempo y bajo las mismas condiciones (excepto para la presencia del conservador) . Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados muestran más de i 15%, tal como por lo menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más actividad enzimática en presencia de aproximadamente o 0.4% de m-cresol durante por lo menos 4 horas a 37 °C comparada con la actividad enzimática del polipéptido ??2? modificado en ausencia de un conservador para el mismo periodo de tiempo y bajo las mismas condiciones (excepto para la presencia del conservador) . Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente también muestran más de 15%, tal como por lo menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más actividad enzimática en presencia de por lo menos aproximadamente entre o entre 0.2% a 0.4%), inclusive, m-cresol y/o fenol durante por lo menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o 6 días a 37°C comparada con la actividad enzimática del polipéptido PH20 modificado en ausencia de un conservador para el mismo período de tiempo y bajo las mismas condiciones (excepto para la presencia del conservador) . Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran más de 15%, tal por lo menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más actividad enzimática en presencia de aproximadamente o 0.10% fenol y aproximadamente o 0.15% m-cresol durante por lo menos 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días o 6 días a 37°C comparada con la actividad enzimática del polipéptido PH20 modificado en ausencia de un conservador para el mismo período de tiempo y bajo las mismas condiciones (excepto para la presencia del conservador) . En otros ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente muestran más de 15%, tal como por lo menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más actividad enzimática en presencia de aproximadamente o 0.315% de m-cresol durante por lo menos 1 día, 2 dias, 3 días, 4 días, 5 días o 6 días, generalmente durante por lo menos 6 días, a 37 °C comparada con la actividad enzimática del polipéptido PH20 modificado en ausencia de un conservador para el mismo periodo de tiempo y bajo las mismas condiciones (excepto para la presencia del conservador) .
Por ejemplo, tales polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada a los compuestos de fenol contienen un reemplazo de aminoácidos (sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 10, 12, 20, 22, 26, 34, 36, 46, 50, 52, 58, 68, .70, 74, 82, 83, 84, 86, 97, 127, 131, 138, 142, 143, 144, 166, 169, 174, 193, 195, 196, 204, 205, 206, 213, 219, 234, 237, 238, 240, 249, 261, 267, 277, 279, 291, 309, 310, 314, 315, 317, 318, 347, 367, 375, 376, 399, 401, 407, 416, 419, 421, 431, 433, 439, 440, 443 o 445 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácido pueden ser reemplazos en una o más posiciones que corresponden al reemplazo de (P) en la posición 10 (PIO), V12, A20, S22, L26, D34, S36, 146, G50, G52, V58, D68, 170, T74, K82, 183, S84, Q86, T97, D127, N131, Q138, V142, Q143, L144, V166, 1169, L174,, H193, K195, K196, F204, ?205, V206, D213, N219, Q234, V237, ?238, ?240, ?249, S261, ?267, V277K279, G291, 1309, M310, K314, S315, L317, Q347, ?367, ?375, ?376, ?399, S401, S407, D416, A419, D421, D431, F433, ?439, ?440, ?443 o 1445 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
Ejemplar de los reemplazos de aminoácidos en los polipéptido PH20 modificados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, el reemplazo con: glicina (G) en una posición que corresponde a la posición 10; K en una posición que corresponde a la posición 12; S en una posición que corresponde a la posición 20; T en una posición que corresponde a la posición 22; M en una posición que corresponde a la posición 26; en una posición que corresponde a la posición 34; N en una posición que corresponde a la posición 36; L en una posición que corresponde a la posición 46; M. en una posición que corresponde a la posición 50; T en una posición que corresponde a la posición 52; S en una posición que corresponde a la posición 52; C en una posición que corresponde a la posición 58; K en una posición que corresponde a la posición 58; R en una posición que corresponde a la posición 58; N en una posición que corresponde a la . posición 58; Y en una posición que corresponde a la posición 58; P en una posición que corresponde a la posición 58; H en una posición que corresponde a la posición 58; P en una posición que corresponde a la posición 68; V en una posición que corresponde a la posición 70; E en una posición que corresponde a la posición 74; L en una posición que corresponde a la posición 82; N en una posición que corresponde a la posición 82; V en una posición que corresponde a la posición 83; Q en una posición que corresponde a la posición 83; S en una posición que corresponde a la posición 83; G en una posición que corresponde a la posición 83; N en una posición que corresponde a la posición 84; A en una posición que corresponde a la posición 86; K en una posición que corresponde a la posición 86; E en una posición que corresponde a la posición 97; L en una posición que corresponde a la posición 97; R en una posición que corresponde a la posición¦ 127; R en una posición que corresponde a la posición 131; L en una posición que corresponde a la posición 138; K en una posición que corresponde a la posición 142; N en una posición que corresponde a la posición 142; P en una posición que corresponde a la posición 142; S en una posición que corresponde a la posición 142; T en una posición que corresponde la posición 142 G en una posición que corresponde la posición 143 K en una posición que corresponde la posición 143 T en una posición que corresponde la posición 144 Q en una posición que corresponde la posición 166 T en una posición que corresponde la posición 166 L en una posición que corresponde la posición 169 G en una posición que corresponde la posición 174 N en una posición que corresponde la posición 174 Q en una posición que corresponde la posición 193 T en una posición que corresponde la posición 195 N en una posición que corresponde la posición 195 E en una posición que corresponde la posición 196 R en una posición que corresponde la posición 196 P en una posición que corresponde la posición 204 A en una posición que corresponde la posición 205 E en una posición que corresponde la posición 205 I en una posición que corresponde la posición 206 A en una posición que corresponde la posición 213 I en una posición que corresponde la posición 219 M en una posición que corresponde la posición 234 T en una posición que corresponde la posición 237 H en una posición que corresponde la posición 238 Q en una posición que corresponde la posición 240 V en una posición que corresponde a la posición 249 A en una posición que corresponde a la posición 261 K en una posición que corresponde a la posición 261 T en una posición que corresponde a la posición 267 K en una posición que corresponde a la posición 277 H en una posición que corresponde a la posición 279 V en una posición que corresponde a la posición 279 V en una posición que corresponde a la posición 291 E en una posición que corresponde a la posición 309 Q en una posición que corresponde a la posición 310 V en una posición que corresponde a la posición 314 V en una posición que corresponde a la posición 315 N en una posición que corresponde a la posición 317 en una posición que corresponde a la posición 317 D en una posición que corresponde a la posición 318 G en una posición que corresponde a la posición 347 A en una posición que corresponde a la posición 367 R en una posición que corresponde a la posición 375 R en una posición que corresponde a la posición 376 V en una posición que corresponde a la posición 399 E en una posición que corresponde a la posición 401 A en una posición que corresponde a la posición 407 L en una posición que corresponde a la posición 416 K en una posición que corresponde a la posición 419 H en una posición que corresponde a la posición 421; E en una posición que corresponde a la posición 431; T en una posición que corresponde a la posición 433; V en una posición que corresponde a la posición 433; C en una posición que corresponde a la posición 439; P en una posición que corresponde a la posición 440; G en una posición que corresponde a la posición 443; N en una posición que corresponde a la posición 445, cada una con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3.
El reemplazo (s) de aminoácidos puede estar en un polipéptido PH20 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6-66, 68- 72, 856-861-, 869 o 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%), 96%, 97%), 98%, 99% o más de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, el reemplazo (s) puede estar en un polipéptido PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72 o una variante del mismo.
Los polipéptidos PH20 modificados ejemplares que muestran actividad incrementada a los compuestos de fenol comparados con los polipéptido PH20 no modificados (por ejemplo, expuestos en SEQ ID N0:3) son cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 83, 88, 93, 94, 101, 144, 148, 158, 171, 176, 175, 177, 178, 180, 182, 183, 184, 185, 194, 221, 240, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 268, 270, 272, 307, 309, 327, 334,.341, 351, 352, 353, 356, 357, 358, 359, 361, 424, 426, 430, 434, 436, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 450, 451, 454, 461, 467, 480, 487, 489, 492, 495, 504, 505, 509, 527, 544, 576, 589, 600, 603, 607, 612, 614, 647, 658, 683, 687, 733, 736, 741, 754, 763, 768, 781, 796, 797, 809, 818, 829 o 837 o que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 83, 88, 93, 94, 101, 144, 148, 158, 171, 176, 175, 177, 178, 180, 182, 183, 184, 185, 194, 221, 240, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 268, 270, 272, 307, 309, 327, 334, 341, 351, 352, 353, 356, 357, 358, 359, 361, 424, 426, 430, 434, 436, 443, 444, 445, 446, 447, 449, 450, 451, 454, 461, 467, 480, 487, 489, 492, 495, 504, 505, 509, 527, 544, 576, 589, 600, 603, 607, 612, 614, 647, 658, 683, 687, 733, 736, 741, 754, 763, 768, 781, 796, 797, 809, 818, 829 o 837 y contenga el reemplazo de aminoácidos, muestre actividad de hialuronidasa y muestre incrementada en presencia de compuestos de fenol comparados con el polipéptido no modificado correspondiente.
En particular, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un remplazo de aminoácido con P en una posición que corresponde al residuo de aminoácidos 204 con referencia a SEQ ID NO: 3. Típicamente, el polipéptido PH20 modificado es un polipéptido humano. Por ejemplo, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos F204P en una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 69, 72 o 32-66, o una .secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID N0S:3, 7, 69, 72 o 32-66 siempre y cuando el polipéptido modificado contenga el reemplazo de aminoácidos que corresponde a F204P. En otros casos, el polipéptido PH20 modificado es un polipéptido no' humano. Por ejemplo, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos F204P en una secuencia de aminoácidos' expuesta en SEQ ID NO: 10, 12, 14, 857, 859, 861 o 870 o una secuencia que muestra por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 857, 859, 861 o 870 siempre y cuando el polipéptido modificado contenga el reemplazo de aminoácidos que corresponda a F204P. En un ejemplo adicional, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos F205P en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24 o Y204P en SEQ ID NO: 31, o una secuencia que muestre por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 24 o 31. Ejemplar de tal polipéptido PH20 modificado es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 449, o que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%', 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 449 y contenga el reemplazo de aminoácidos F204P, muestre actividad de hialuronidasa incrementada y muestre estabilidad incrementada a los compuestos de fenol comparado con el polipéptido no modificado correspondiente (por ejemplo, SEQ ID NO: 3) . En cualquiera de los ejemplos anteriores, el polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos con P en una posición que corresponde al residuo de aminoácidos 204 con referencia a SEQ ID NO: 3 no tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO-: 15-22, 28 o 29.
En otro ejemplo, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde al residuo de aminoácidos 58 con referencia a SEQ ID NO: 3. Ejemplares de reemplazo de aminoácidos son . los reemplazos con lisina (K) o con arginina (R) en. una posición que corresponde la residuo de aminoácidos 58 con referencia a SEQ ID N0:3. Típicamente, el polipéptido PH20 modificado es un polipéptido humano. Por ejemplo, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos V58K o V58R en una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 69, 72 o 32-66, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS:3, 7, 69, 72 o 32-66. En otros casos, el polipéptido PH20 modificado es un polipéptido no humano. Por ejemplo, se proporciona en la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos V58K o V58R en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, 12, 14, 20, 22, 24, 29, 857, 859, 861 o 870 o una secuencia que muestra por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 20, 22, 24, 29, 857, 859, 861 o 870. En un ejemplo adicional, se proporciona en¦ la presente un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos A58R en una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 o 31, o una secuencia que muestra por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 16 o 31. Ejemplar de tal polipéptido PH20 modificado es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 182, o que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 182, que contiene el reemplazo de aminoácidos V58R y muestra actividad de hialuronidasa incrementada y muestra estabilidad incrementada en presencia de compuestos de fenol comparado con el polipéptido no modificado correspondiente (por ejemplo, SEQ ID NO: 3). ii . Termófilos En temperaturas, elevadas, las hialuronidasas PH20 pueden perder la actividad. Se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 modificados que muestran estabilidad incrementada a temperatura elevadas de entre o aproximadamente entre 30 °C a 45°C, inclusive, tal como entre o aproximadamente entre 35°C. a 42°C, en particular en o aproximadamente 37°C. Por ejemplo, se proporcionan en la presente are polipéptidos PH20 modificados que son estables a temperaturas elevadas mayores que 32°C tal como 35°C a 45°C, 37°C a 42°C y en particular en o aproximadamente 37°C durante por lo menos 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días o por lo menos 7 días. Los polipéptidos PH20 modificados que muestran estabilidad a temperaturas elevadas se pueden utilizar en aplicaciones donde las temperaturas son elevadas, pueden fluctuar . o incrementarse. Esto puede presentarse, por ejemplo, en los métodos de administración que utilizan bombas u otros dispositivos de infusión continua.
En particular, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad en temperatura elevadas muestran actividad de hialuronidasa incrementada en temperatura elevadas comparados con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene la modificación, por ejemplo, reemplazo de aminoácidos. Los polipéptidos PH20 pueden mostrar actividad de hialuronidasa incrementada en la incubación en temperaturas elevadas mayores que 32°C tal como 35°C a 45°G o 37°C a 42°C, en particular en o aproximadamente 37 °C durante por lo menos 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 horas, 4 horas,. 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, por lo menos.5 días, por. lo menos 6 días o por lo menos 7 días comparados con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene la modificación incubado bajo las mismas condiciones. Por ejemplo, la actividad de hialuronidasa se puede incrementar por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más comparada con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene la modificación incubada o bajo las mismas condiciones. Por ejemplo, la actividad de hialuronidasa se puede incrementar por lo menos 1.1 veces, 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más comparada con el polipéptido PH20 correspondiente que no contiene la modificación incubada bajo las mismas condiciones.
En otros ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad en temperaturas elevadas retienen la actividad de hialuronidasa en temperaturas elevadas comparada con la actividad del polipéptido PH20 modificado incubado en temperaturas no elevadas bajo las mismas condiciones (excepto para las diferencias en temperatura) Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados muestran mayor que o aproximadamente 50%, tal como mayor que o por lo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la actividad a temperaturas elevadas mayores que 32 °C tales como 35°C a 45°C o 37°C a 42°C, en particular en o aproximadamente 37°C comparado con la actividad de PH20 en temperaturas no elevadas de entre o aproximadamente entre 2°C a 8°C. En algunos ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que. muestran estabilidad en temperaturas elevadas muestran actividad incrementada en temperaturas elevadas comparada con la actividad del polipéptido PH20 modificado incubado en temperaturas no elevadas bajo las mismas condiciones (excepto para la diferencia en temperaturas) . Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados muestran mayor que o aproximadamente 10% de actividad incrementada, tal como mayor que o por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de actividad en temperaturas elevadas mayores que 32°C tales como 35°C a 45°C o 37°C a 42°C, en particular en o aproximadamente 37 °C comparada con la actividad de la PH20 en temperaturas no elevadas de entre o aproximadamente entre 2°C a 8°C. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados muestran mayor que o por lo menos aproximadamente 1.1 veces la actividad de hialuronidasa, tal como mayor que o por lo menos 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más de actividad en temperaturas elevadas mayores que 32 °C tales como 35°C a 45°C o 37°C a 42°C, en particular en o aproximadamente 37 °C comparada con la actividad de la PH20 en temperaturas no elevadas de entre o aproximadamente entre 2°C a 8°C.
Por ejemplo, tales polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad incrementada en temperatura elevadas contienen un reemplazo de aminoácidos (sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 1, 11, 12, 14, 20, 26, 29, 34, 50, 58, 70, 82, 83, 84, 86, 87, 140, 142, 143, 147, 152, 165, 16-7, 172, 174, 178, 193, 195, 206, 212, 213, 219, 233, 23.7, 240, 267, 277, 291, 292, 309, 313, 314, 317, 318, 347, 367, 368, 371, 374, 389, 392, 395, 396, 406, 419, 421, 439 o 443 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden ser reemplazos en una o más posiciones que corresponden al reemplazo de (L) en la posición 1 (Ll) , Nll, V12, F14, A20, L26, F29, D34, G50, V58, 170, K82, 183, S84, Q86,. D87, Q140, V142, Q143, T147, K152, V166, E167, G172, L174, N178, H193, K195,. V206, D212, D213, N219, Q233, V237, ' T240', A267, V277, G291, E292, 1309, M313, K314, L317, L318, Q347, P367,D368, A371, L374, E389, E392, S395, E396, L406, A419, D421, E439 o P443, con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3. El polipéptido PH20 modificado resultante muestra estabilidad incrementada en temperatura elevadas mayores que 32°C tal que 35°C a 45°C, 37°G a 42°C y en particular en o aproximadamente 37°C durante por lo menos 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días, por lo menos 7 días o más.
Los reemplazos de aminoácidos ejemplares en los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, el reemplazo con: R en una posición que corresponde a la posición 1; S en una posición que corresponde a la posición 11; I en una posición que corresponde a la posición 12; V en una posición que corresponde a la posición 14; S en una posición que corresponde a la posición 20; M en una posición que corresponde a la posición : 26; con R en una posición que corresponde a la posición 29; W en una posición que corresponde a la posición 34; M en una posición que corresponde a la posición 50; K en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición 58; V en una posición que corresponde a la posición 70; L en una posición que corresponde a la posición 82; Q en una posición que corresponde a la posición 83; R en una posición que corresponde a la posición 84; A en una posición que corresponde a la posición 86; S en una posición que corresponde a la posición 87; K en una posición que corresponde la posición 140 S en una posición que corresponde la posición 142 T en una posición que corresponde la posición 142 K en una posición que corresponde la posición 143 S en una posición que corresponde la posición 147 T en una posición que corresponde la posición 152 T en una posición que corresponde la posición 166 D en una posición que corresponde la posición 167 A en una posición que corresponde la posición 172 G en una posición que corresponde la posición 174 N en una posición que corresponde la posición 174 R en una posición que corresponde la posición 178 Q en una posición que corresponde la posición 193 T en una posición que corresponde la posición 195 I en una posición que corresponde la posición 206 S en una posición que corresponde la posición 212 A en una posición que corresponde la posición 213 I en una posición que corresponde la posición 219 G en una posición que corresponde la posición 233 T en una posición que corresponde la posición 237 A en una posición que corresponde la posición 240 Q en una posición que corresponde la posición 240 T en una posición que corresponde la posición 267 E en una posición que corresponde la posición 277 S en una posición que corresponde a la posición 291; H en una posición que corresponde a la posición 292; V en una posición que corresponde a la posición 292; S en una posición que corresponde a la posición 309; H en una posición que corresponde a la posición 313; S en una posición que corresponde a la posición 314; I en una posición que corresponde a la posición 317; T en una posición que corresponde a la posición 317; en una posición que corresponde a la posición 317; R en una pos i ci ón que corresponde a la posición 318; G en una posición que corresponde a la posición 347; ? en una posición que corresponde a la posición 367; R en una posición que corresponde a la posición 368; S en una posición que corresponde a la posición 371; P en una posición que corresponde a la posición 374; A en una posición que corresponde a la posición 389; V en una posición que corresponde a la posición 392; A en una posición que corresponde a la posición 395; H en una posición que corresponde a la posición 396; N en una posición que corresponde a la posición 406; ¦ H¦ en una posición que corresponde a la posición 419; K en una posición que corresponde a la posición 419; R en una posición que corresponde a la posición 421; S en una posición que corresponde a la posición 421; A en una posición que corresponde a la posición 439; C en una posición que corresponde a la posición 439; o G en una posición que corresponde a la posición 443, cada una con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
El reemplazo (s) de aminoácidos puede estar en un polipéptido PH20 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 3, 6-66, 68-72, 856-861, 869 o 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%), 98%), 99% o más de identidad de secuencia al mismo. Por ejemplo, el reemplazo (s) puede estar en un polipéptido PH20, humano por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72 o una variante del mismo.
Los polipéptidos PH20 modificados ejemplares muestran estabilidad incrementada a los compuestos de fenol comparados con el polipéptido PH20 no modificado (por ejemplo, expuesta en SEQ ID NO: 3) son cualquiera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 79, 85, 87, 90, 93, 101, 114, 144, 171, 178, 181, 221, 259, 262, 269, 270, 282, 343, 356, 357, 359, 368, 395, 426, 429, 432, 434, 436, 441, 443, 444, 454, 460, 461, 467, 477, 487, 491, 492, 509, 525, 550, 554, 557, 584, 593, 599, 605, 611, 612, 617, 647, 658, 667, 676, 679, 709, 720, 723, 727, 740, 761, 763, 772, 773, 808, 809, o 829 o que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 79, 85, 87, 90, 93, 101, 114, 144, 171, 178, 181, 221, 259, 262, 269, 270, 282, 343, 356, 357, 359, 368, 395, 426, 429, 432, 434, 436, 441, 443, 444, 454, 460, 461, 467, 477, 487, 491, 492, 509, 525, 550, 554, 557, 584, 593, 599, 605, 611, 612, 617, 647, 658, 667, 676, 679, 709, 720, 723, 727, 740, 761, 763, 772, 773, 808, 809, o 829 y contenga el reemplazo de aminoácidos, muestre actividad de hialuronidasa y muestre estabilidad incrementada a temperaturas elevadas comparado con el polipéptido no modificado correspondiente, iii . Ausencia de Sal La PH20 se desnaturaliza en presencia de bajo contenido de sal o sin sal. De esta manera, la PH20 requiere una concentración de sal alta de entre o aproximadamente entre 140 mM a 200 mM para mantener la estabilidad. Otros agentes terapéuticos, por ejemplo insulina, muestran solubilidad disminuida y cristalización/agregación incrementada en presencia de alto contenido de sal. De esta manera, los requisitos- de alto contenido de sal de la PH20 pueden afectar la solubilidad y/o actividad de los agentes terapéuticos co-formulados, mientras que la presencia de bajo contenido de sal puede disminuir la actividad de la PH20. Esto puede crear problemas para generar co-formulaciones de PH20.
Se proporciona en la presente polipéptidos PH20 modificados que muestran ' estabilidad incrementada en presencia de bajas concentraciones de sal (por ejemplo NaCl) menores que 100 mM, por ejemplo, menores que 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o menor. Generalmente, los polipéptido PH20 modificados proporcionados en la presente muestran estabilidad en presencia de bajas concentraciones de sal, por ejemplo, bajas concentraciones de NaCl de entre o aproximadamente entre 10 mM NaCl y 100 mM NaCl, tal que entre o aproximadamente entre NaCl 15 mM a 80 mM. Los polipéptido PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran estabilidad en bajas concentraciones de sal tal como bajas concentraciones de NaCl (es decir, menor, que 100 mM o menos), muestran la actividad de hialuronidasa incrementada comparada con la PH20 correspondiente que no contiene la modificación ( s ) (por ejemplo, reemplazos de aminoácidos). Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados muestran mayor que o aproximadamente 10% de actividad incrementada, tal como mayor que o por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%), 500%) o más de actividad en bajas concentraciones de sal tal como bajas concentraciones de NaCl (es decir, menor que 100 mM) , comparada con la actividad d la PH20 correspondiente que no contiene la modificación ( es ) de aminoácidos (por ejemplo, reemplazo (s) de aminoácidos bajo las mismas condiciones) . Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados muestran mayores que o por lo menos aproximadamente 1.1 veces la actividad de hialuronidasa, tal que mayores que o por lo menos' 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más de la actividad en bajas concentraciones de NaCl menor que 100 mM comparada con la actividad de la PH20 correspondiente que no contiene la modificación (es) de aminoácidos (por ejemplo, reemplazo (s) de aminoácidos bajo las mismas condiciones. 2. Mutantes Inactivos Se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 modificados que contienen uno o más de reemplazos de aminoácidos un polipéptido PH20 y que son inactivos, mediante lo cual los polipéptidos no muestran actividad de hialuronidasa o muestran actividad de hialuronidasa baja o disminuida. Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que son inactivos generalmente muestran menor que 20%, tal que como menor que 10%, de la actividad de hialuronidasa de un . polipéptido PH20 de tipo natural o de referencia, tal como el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que son inactivos muestran menor que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05% o menor de actividad de hialuronidasa de un polipéptido PH20 de tipo natural o de referencia, tal como el polipéptido correspondiente la contiene la modificación de aminoácido (por ejemplo, reemplazo de aminoácidos), por ejemplo, un polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3 o 7.
Por ejemplo, se proporcionan en la presente polipéptidos PH20 que son inactivos . y que se modifican, por ejemplo por el reemplazo o sustitución de aminoácidos, comparado con un polipéptido PH20 de tipo natural o de referencia. Por ejemplo, un polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente que es inactivo contiene uno o más de reemplazos de aminoácidos en la posición (s) que corresponde a la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, .92, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 1G8, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 443, 444, o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, siempre y cuando el polipéptido PH20 modificado resultante sea inactivo y muestre menor que 20%, y generalmente menor que 10%, de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 correspondiente que no contiene el reemplazo de aminoácidos. Típicamente, el residuo de aminoácidos que se modifica (por ejemplo, se reemplaza) en la posición que corresponde a cualquiera de las composiciones anteriores en un polipéptido PH20 es un residuo idéntico, un residuo conservador o un residuo de aminoácidos semi-conservador al resido de aminoácidos expuesto en SEQ ID NO: 3.
Los reemplazos de aminoácidos ejemplares en cualquiera de las composiciones correspondientes anteriores se exponen en la Tabla 5. La referencia a la posición correspondiente en la Tabla 5 es con referencia a las posiciones expuestas en SEQ ID NO: 3. Se entiende que los reemplazos se pueden hacer en la posición correspondiente en otro polipéptido PH20 por la alineación con la misma con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 (véase por ejemplo, Figuras 1 y 2) , mediante lo cual la posición correspondiente en la posición alineada. El reemplazo (s) de aminoácidos puede estar en la posición correspondiente en un polipéptido PH20 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS : 2, 3, '6-66, 68-72, 856-861, 869 o 870 o una variante del mismo que tiene por lo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia al mismo, siempre y cuando el polipéptido PH20 modificado está inactivo. Por ejemplo, el reemplazo (s) puede estar en una posición correspondiente en un polipéptido PH20 humano, por ejemplo, cualquiera expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o una variante del mismo. En particular, cualquiera de más de los reemplazos están en SEQ ID NO: 3, siempre y cuando el polipéptido PH20 modificado resultante está, inactivo y muestre menor que 20%, y generalmente menor que 10%, de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 3. 3. Modificaciones Adicionales y Conjugados.
Los polipéptidos PH20 modificados incluyen aquellos que contienen modificaciones químicas o postraduccionales.
En algunos ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Las modificaciones químicas y postraduccionales se incluyen, pero no se limitan a, PEGilación, sialación, albuminación, glicosilación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica.
También, además de cualquiera de una o más modificaciones de aminoácidos, tales como remplazos de aminoácidos, proporcionados en la presente, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden conjugar o fusionar a cualquier porción utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos químicos y recombinantes , con la condición de que el polipéptido resultante retenga la actividad de hialuronidasa . Por ejemplo, además de cualquiera de una o más modificaciones de aminoácidos, tales como remplazos de aminoácidos, proporcionados en la presenté, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente también pueden contener otras modificaciones que están o no están en la secuencia primaria de polipéptidos, incluyendo, pero no limitado a, la modificación con una porción de carbohidrato, una porción de polietllenglicol (PEG) , una porción de ácido siálico, un dominio Fe de inmunoglobulina G, o cualquier otro dominio o porción. Por ejemplo, tales modificaciones adicionales se pueden hacer para incrementar la estabilidad o vida media en suero de. la proteína.
En algunos casos, el dominio u otra porción es una agente objetivo, incluyendo cualquier agente que fije como objetivo el conjugado a uno o más tipos de células al ligarse selectivamente a un receptor de superficie celular u otra porción de superficie celular. Por ejemplo, el dominio u otra porción es un agente objetivo que fija como objetivo el conjugado a las células tumorales. En tales ejemplos, un polipéptido PH20, tal como cualquiera proporcionado en la presente, se liga directa o indirectamente a un agente objetivo. Tales agentes objetivos incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, citoquinas, quimiocinas, anticuerpos, y hormonas, o variantes alélicas, muteínas, o fragmentos de los mismos, siempre y cuando el agente objetivo se internalice por un receptor de superficie celular. Las modificaciones adicionales, no limitantes, ejemplares se describen a continuación. a) . Inmunogenicidad Disminuida.
Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden hacer para tener inmunogenicidad disminuida. La inmunogenicidad disminuida se puede llevar a cabo por cambios de secuencia que eliminan los epitopos antigénicos del polipéptido o al alterar las modificaciones postraduccionales . Una persona de experiencia en la técnica está familiarizada con métodos para identificar epitopos antigénicos en un polipéptido (véase por ejemplo, Liang y colaboradores (2009) BMC Bioinformatics, 10:302; Yang y colaboradores (2009) Rev. Med. Virol. , 19:77-96). En algunos ejemplos, uno o más aminoácidos se pueden modificar a fin de remover o alterar un epitopo antigénico.
En otro ejemplo, la alteración de la glicosilación de una proteína también puede afectar la inmunogenicidad . Por ejemplo, se contempla la alteración de la glicosilación del péptido, siempre y cuando el polipéptido contenga mínimamente por lo menos la n-acetilglucosamina en los residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos expuestos como N200, N333 y N358 de SEQ ID NO: 3 o 7.
Por ejemplo, los polipéptidos PH20 se pueden modificar tal que carecen de fucosa, particularmente bi fuoosilación, En particular, los polipéptidos PH20 proporcionados en la presente no se bifucosilan. Esto se puede lograr al expresar y al producir el polipéptido PH20 en las células hospederas que no afectan la bifucosilación . La fucosa es una desoxihexosa que está presente ¦ en una amplia variedad de organismos, incluyendo mamíferos, insectos y plantas. Los glicanos fucosilados ' se sintetizan por las fucosil-transferasas ; véase, por ejemplo, Ma y colaboradores, Glycobiology, 16(12): 158R-184R, (2006); Nakayama y colaboradores, J.. Biol. Chem. , 276: 16100-16106 (2001); y Sturla y colaboradores, Glycobiology, 15 (10) : 924-935 (2005). En humanos, la fucosa existe frecuentemente como una modificación terminal a las estructuras de glicano, y la presencia de la fucosa al,6-ligada a N-acetilglucosamina ha mostrado que es importante ' en el procesamiento y reconocimiento de glicoproteinas . En insectos, las estructuras de núcleo de N-glicano muestran bifucosilación con al, 6- y al , 3-ligaciones . La fucosilación de núcleo de celdas de insecto con al , 3-ligaciones genera un epitopo de carbohidrato que inmunogénico en humanos {véase, por ejemplo, Publicación de E.U.A. No. 20070067855). Por ejemplo, los polipéptidos PH20 proporcionados en la presente se pueden generar en células hospederas que son incapaces de bifucosilar el polipéptido. De esta manera, mientras que las células de insecto u otras células que se bifucosilan se pueden utilizar para la expresión de los polipéptidos, se utilizan típicamente células de mamífero, tales como células CHO.
En algunos ejemplos, los polipéptidos PH20 desfucosilados, o deficientes de fucosa se pueden generar en células de insecto con rutas de glicosilación modificadas, a través del uso de vectores de expresión de baculovirus que contienen genes de procesamiento de oligosacáridos de eucarióticos, creando de esta manera sistemas de expresión de células de insectos "tipo mamífero" {véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,461,863). Alternativamente, la antigenicidad se puede eliminar por la expresión de los polipéptidos PH20 en células de insecto que carecen de al,3-fucosiltransferasa (FT3) {véase, por ejemplo, Publicación de E.U.A. No. 20070067855). En otros ejemplos, los polipéptidos PH20 desfucosilados o deficientes de fucosa se pueden generar, por ejemplo, en lineas de células que producen proteínas desfucosiladas incluyendo células Lecl3CHO deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripka y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 249:533- 545 (1986); Publicación de Patente de .E.U.A. No. 2003/0157108; y WO 2004/056312), y líneas de células genéticamente inactivadas, tal como el gen de alfa-1, 6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO genéticamente inactivadas ( Yaname-Ohnuki y colaboradores, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)). b. Conjugación a polímeros.
En algunos ejemplos, los. polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se conjugan a polímeros. Los polímeros ejemplares que se pueden conjugar a los polipéptidos PH20, incluyen homopolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir, poli-HO) poliaminas (es decir, poli-NH2) y ácidos policarboxilxcos (es decir, poli-COOH) , y heteropolímeros adicionales, es decir, polímeros que contienen uno o más grupos de acoplamiento diferentes, por ejemplo, grupos hidroxilo y grupos amina. Ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas incluyen moléculas poliméricas seleccionadas de entre óxidos de polialquileno (PAO), tales como polialquilenglicoles (PAG), incluyendo polietilenglicoles (PEG) , metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, éteres PEG-glicidilicos (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidasol (CDI-PEG) , polietilenglicoles ramificados (PEGs) , alcohol polivinilico (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona poli-D, L-aminoácidos , anhídrido de ácido polietilen-co-maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico, dextranos incluyendo carboximetil-dextranos, heparina, albúmina homologa, celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa e hidroxipropilce] ulosa, hidrolizados de quitosan, almidones tales como hidroxietil-almidones e hidroxipropil-almidones , glicógeno, agarosas y derivados de los mismos, goma guar, pululan, inulina, goma de xantano, carragenano, pectina, hidrolizados de ácido algínico y biopolímeros .
Típicamente, los polímeros son óxidos de polialquileno (PAO), tales como óxidos de polietileno, tales como PEG, típicamente mPEG, que tienen algunos grupos reactivos capaces de reticulación. Típicamente, los polímeros son moléculas poliméricas no toxicas tales como (metoxi) polietilenglicol (mPEG) que se pueden conjugar covalentemente a los polipéptidos PH20 (por ejemplo, a los grupos de unión en la superficie de la proteína) utilizando una química relativamente sencilla.
Las moléculas poliméricas adecuadas para la unión a los polipéptidos PH20 incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxi-polietilenglicoles (mPEG) , éteres PEG-glicidílicos (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG) , PEGs ramificados, y óxido de polietileno (PEO) (véase por ejemplo, Roberts y colaboradores, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54:459-476; Harris y Zalipsky (eds.) "Poly( ethylene glycol) , Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar y colaboradores, J. Pharm. Pharmaceut . Sci., 3(1): 125-136, 2000; Harris y Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21; y Tsubery, J Biol. Chem 279 (37 ) : 38118-24, 2004). La molécula polimérica puede ser de un peso molecular gue varia típicamente de aproximadamente 3 kDa aproximadamente 60 kDa. En algunas modalidades la molécula polimérica gue se conjuga a un polipéptido PH20 proporcionado en la presente tiene peso, molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 kDa.
Varios métodos para modificar los polipéptidos al unir covalentemente (conjugar) un PEG o derivado de PEG (es decir, "PEGilacion") son conocidos en la técnica (véase por ejemplo, U.S 2006/0104968; U.S 5,672,662; U.S 6,737,505; y U.S 2004/0235734). Las técnicas para la PEGilacion incluyen, pero no se limitan a, ligadores especializados y químicas de acoplamiento (véase por ejemplo, Roberts, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), unión de múltiples porciones de PEG a un sitio de conjugación individual (tal como a través del uso de PEGs ramificados; véase por ejemplo, Guiotto y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12: 177-180, 2002), PEGilación especificas de sitio y/o mono-PEGilación (véase por ejemplo, Chapman y colaboradores, Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase por ejemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002) (véase, también, por ejemplo, Lu y Félix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138; Lu y Félix (1993) Peptide Res. 6: 140-6, 1993; Félix y colaboradores (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar y colaboradores (1994) J. Biol. Chem. 269: 13398-404; Brumeanu y colaboradores (1995) J Immunol. 154:3088-95; véase también, Caliceti y colaboradores (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10) : 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2) :3S-8S) . Métodos y técnicas descritas en el campo pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG unidos a una molécula de proteína individual (véase por ejemplo, E.U 2006/0104968) .
Numerosos reactivos ara la PEGilación se ha descrito en la técnica. Tales reactivos incluyen, pero no se limitan a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS ) , succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, mPEG succinimidil alfa-metilbutanoato, mPEG' succinimidil propionato, mPEG succinimidil butanoato, éster succinimidilico de ácido mPEG carboximetil 3-hidroxibutanoico, propionato de PEG-succinimidilo homobifuncional , propionaldehido de PEG homobifuncional, butiraldehido de PEG homobifuncional , PEG maleimida, PEG hidracida, PEG de p-nitrofenil—carbonato, carbonato de mPEG-benzotriazol , PEG propionaldehido PEG, mPEG butrialdehido, mPEG2 butiraldehido ramificado, mPEG acetilo, mPEG piperidona, mPEG .metilcetona, mPEG maleimida "sin ligador", mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, disulfuro de mPEG ortopiridilo, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, PEG-NHS vinilsulfona, PEG-NHS acrilato, PEG-NHS fluorosceina y PEG-NHS biotina {véase por ejemplo, Monfardini y colaboradores, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese y colaboradores, J. Bioactive Compatible Porlymers 12: 197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S. 6, 495,659; U.S. 6, 737, 505; U . S . 4 , 002 , 531 ; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5,324,844; U.S. 5,446,090; U.S. 5,612,460; U.S. 5,643,575; U.S. 5,766,581; U.S. 5,795,569; U.S. 5,808,096; U.S. 5,900,461; U.S. 5,919,455; U.S. 5,985,263; U.S. 5,990/237; U.S. 6,113,906; U.S. 6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S. 6,340,742; U.S. 6,413,507; U.S. 6,420,339; U.S. 6,437,025; U.S. 6,448,369; U.S. 6,461,802; U.S. 6,828,401; ü .S. 6,858,736; U . S. 2001/0021763; U s 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U .S. 2002/0052430; u s 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U .S. 2003/0114647; u s 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U . S. 2003/0220447; u s 2004/0013637; US 2004/0235734; ; U. S. 2005/0114037; u s 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; ( 01076640; WO 0002017; O 0249673; WO 9428024; WO 0187925; y O 2005000360) .
D. MÉTODOS PARA IDENTIFICA ENZIMAS DEGRADADORAS DE HIALURONANO MODIFICADAS CON PROPIEDADES O ACTIVIDADES ALTERADAS Se proporcionan en la presente métodos para identificar una enzima degradadora de hialuronano modificado variante, tal como una hiáluronidasa modificada o polipéptido PH20 modificado, que muestra una actividad o propiedad alterada comparada con una enzima degradadora de hialuronano no modificada. En particular, los métodos proporcionados en la presente se pueden utilizar para clasificar una o más enzimas degradadoras de hialuronano modificadas, tal como una o más hiáluronidasa modificada ' o polipéptido PH20, que muestra actividad incrementada y/o estabilidad incrementada en presencia de un agente o . condición de desnaturalización. Por ejemplo, los métodos se pueden utilizar para identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada o variante, tal como una hialuronidasa modificada o variante o polipéptido PH20 modificado o variante, que muestra estabilidad incrementada en virtud de resistencia incrementada a las condiciones de desnaturalización, incluyendo, pero no limitado a, condiciones de desnaturalización provocadas por temperatura {por ejemplo, temperatura elevada tal como calor) agitación, nada o bajo contenido de sal, presencia de un excipiente y/o agente de desnaturalización. Los agentes de desnaturalización ejemplares o excipientes incluyen, pero no se limitan a, anti-adherentes , aglutinantes, recubrimientos, rellenadores y diluyentes, sabores, colores, lubricantes, deslizantes, conservadores, sorbentes, o edulcorantes. Por ejemplo, varios excipientes, tales como conservadores, pueden actuar como agentes de desnaturalización de proteínas. En el método, la actividad también se puede comparar con una enzima degradadora de hialuronano no modificada bajo las mismas condiciones de desnaturalización, y una enzima degradadora de hialuronano modificada identificada o seleccionada que muestre mayo actividad que la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente.
En el método, se proporcionan una o más enzimas degradadoras de hialuronano modificadas. En algunos ejemplos, se prepara una biblioteca de moléculas modificadas. Métodos de mutagénesis y generación de bibliotecas o colecciones de varias moléculas se describen en la presente y se conocen por una persona de experiencia en el campo utilizando técnicas de ADN recombinantes estándares. En ' un ejemplo, las enzimas que se someten a prueba se pueden agrupar y clasificar, mediante lo cual el método permite la selección de solo estas enzimas que muestran una actividad deseada. En otro ejemplo, las enzimas sometidas a prueba se pueden separar y clasificar físicamente de manera individual, tal como al formatearlas en arreglos, tales como arreglos direccionables .
En un aspecto del método, las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas se someten a prueba o se clasifican para la actividad de hialuronidasa en presencia o ausencia de una o más condiciones de desnaturalización o agente de desnaturalización. Después de someter a prueba ambos conjuntos de condiciones, las actividades se evalúan a fin de identificar enzimas degradadoras de hialuronano modificadas que muestran actividad en presencia de la condición de desnaturalización. El nivel o cantidad deseados de actividad seleccionados como cote en los métodos se puede determinar empíricamente por el usuario, y es dependiente de los factores tales como la enzima degradadora de hialuronano particular, la aplicación deseada o uso de la enzima degradadora de hialuronano, la condición de desnaturalización particular o el agente de · desnaturalización y otros factores similares. Típicamente, se identifica una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra por lo menos 5% o 10% de la actividad en presencia de un agente o condición de desnaturalización comparada en su ausencia, y generalmente por lo menos 15%, 20%, 30%, 40%, -50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más, por ejemplo por lo menos 40% de la actividad.
Adicional, o alternativamente, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada en presencia, de una o más condiciones de desnaturalización o agentes de desnaturalización se compara con la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente en presencia del mismo agente (s) o condición (s) de desnaturalización. En tales ejemplos, se entiende que la actividad de la enzima modificada y no modificada se somete a prueba bajo las mismas condiciones (por ejemplo, tiempo, temperatura, composición) ,. excepto para la diferencia en la enzima particular sometida a prueba (no modificada versus modificada) . Se identifica una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra mayo actividad, tal como por lo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500% o más de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada.
El método se puede llevar a cabo una pluralidad de veces, mediantes las cuales las etapas del método se repiten 1, 2, 3, 4, o 5 veces. El método proporcionado en la presente también es iterativo. En un ejemplo, después de que se lleva a cabo el método, cualquiera enzima degradadora. de hialuronano modificada identificada se puede identificar o modificar adicionalmente para incrementar u optimizar la actividad.
Una de las etapas del método y componentes del método se proporcionan en la subsecciones que siguen. 1. Enzimas Degradádores de Hialuronano y Bibliotecas de Enzimas Degradadoras de Hialuronano Modificadas En los . métodos en la presente, una o más enzimas degradadoras de . hialuronano modificadas, tales como hialuronidasa o un polipéptido PH20, se someten a prueba para una actividad o propiedad deseada, tal como estabilidad incrementada (por ejemplo, resistencia incrementada a una condición de desnaturalización) . La enzima degradadora de hialuronano modificada se puede modificar comparada con una enzima degradadora de hialuronano no modificada, tal como cualquier enzima degradadora de hialuronano conocida en la técnica. Las enzimas degradadoras de hialuronano son una familia de enzimas que degradas en ácido hialurónico, que es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Las enzimas degradadoras de hialuronano actúan para degradar el hialuronano al escindir los polímeros de hialuronano que se componen de unidades de disacáridos de repetición: ácido-D-glucurónico (GlcA) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) , ligadas conjuntamente a través de las ligaciones ß-1?4 y ß-1?3 glicosídicas alternantes. Al catalizar la hidrólisis del ácido hialurónico, un constituyente principal de la barrera intersticial, las enzimas degradadoras de hialuronano reducen la viscosidad del ácido hialurónico, incrementando de esta manera la permeabilidad del tejido. Por consiguiente, las enzimas degradadoras de hialuronano para los usos y método proporcionados en la presente incluyen cualquier enzima que tenga la capacidad de catalizar la escisión de una cadena de disacáridos de hialuronano o polímero. En algunos ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano escinde la ligación ß-1?4 glicosídica en la cadena de hialuronano o polímero. En otros ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano cataliza la escisión de la ligación ß-1?3 glicosídica en la cadena de hialuronano o polímero.
Las enzimas degradadoras de hialuronano incluyen enzimas que se ligan a la membrana o que son formas solubles que se secretan de las células. De esta manera, donde las enzimas degradadoras de hialuronano incluyen una secuencia señal de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) y/o de otra manera se anclan a la membrana o son insolubles, tales enzimas degradadoras de hialuronano se pueden proporcionar en forma soluble por el truncamiento o supresión C-terminal de todo o una porción de la secuencia señal de anclaje GPI para volver la enzima secretada y soluble. De esta manera, las enzimas degradadoras de hialuronano incluyen variantes C-terminalmente truncadas, por ejemplo, truncadas para remover todo o una porción de la secuencia señal de anclaje GPI. Ejemplos de tales hialuronidasas solubles son hialuronidos PH20 solubles, tal como cualquiera expuesta en la Patente de E.U.A. No. 7,767,429; Publicaciones de E.U.A. Nos. 2004/0268425 y 2010/0143457.
Las enzimas degradadoras de hialuronano ejemplares son hialuronidasas animales no humanas o humanas, hialuronidasas bacterianas, hialuronidasas de sanguijuelas o condroitinasas que muestran actividad degradadora de hialuronano, incluyendo formas solubles truncadas de las mismas que son activas. Las hialuronidasas animales no humanas ejemplares son cualquier expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-31, 856-861, 869, 870, 871-886, o variantes C-terminalmente truncada madura que son solubles y activas, o formas activas de las mismas. Las hialuronidasas humanas ejemplares son cualquiera expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: .2, 3, 6, 7, 32-66, 68-72 o 887-890, o variantes C-terminálmente truncadas, maduras que son solubles y activas, o formas activas de las mismas, y particular cualquiera de SEQ ID NOS: .3, 7, 32-66, 69 o 72. Las hialuronidasas bacterianas ejemplares son cualquiera expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 891-919 o variantes C-terminalmente truncada, madura que son solubles y activas, o formas activas de las. mismas. Las hialuronidasas ejemplares de sanguijuelas se exponen en ' SEQ ID NO: 920 o 921, o variantes C-terminalmente truncada, madura que son solubles y activas, o formas activas de las mismas. Las condroitinasas ejemplares que tienen actividad de enzima degradadora de hialuronano se exponen en SEQ ID NO: 922-924, o variantes C-terminalmente truncadas, maduras que son solubles y activas, o formas activas de las mismas.
Por ejemplo, uno o más polipéptidos PH20 modificados se someten a prueba para una actividad o propiedad deseada, tal como estabilidad incrementada (por ejemplo, resistencia incrementada a una condición ' de desnaturalización) . El polipéptido PH20 modificado puede ser un polipéptido PH20 no modificado se puede modificar comparado con un polipéptido PH20 no modificado, tal como cualquier polipéptido PH20 nativo, polipéptido de tipo natural o de referencia. Por ejemplo, el polipéptido PH20 modificado se modifica comparado con la forma de longitud completa, soluble o activa de un polipéptido PH20 tal como cualquiera expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72, o un polipéptido que muestra por lo menos 85%, tal como por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 32-66, 69 o 72. En ejemplos particulares del método en la presente, el polipéptido PH20 de inicio o no modificado tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
Las bibliotecas o colecciones de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas se pueden clasificar. Las enzimas degradadoras de hialuronano se pueden modificar por cualquier proceso conocido por una persona experta en el campo que puede alterar la estructura de una proteina. Ejemplos de modificaciones incluyen reemplazo, visión, y supresión de uno o más aminoácidos de la proteina para formar bibliotecas o colecciones de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas. Esta dentro del nivel de una persona experta en el campo generar proteínas modificadas o variantes para el uso en métodos en la presente. Los métodos de mutagénesis son bien conocidos en el campo e incluyen, po ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio tal como por ejemplo QuikChange (Stratagene) o mutagénesis de saturación. Los métodos de mutagénesis incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis mediada en el sitio, mutagénesis de PCR, mutagénesis de cásete, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis puntual aleatoria, mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo, mutagénesis .dirigida al oligonucleótidos , mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato, mutagénesis que utiliza AD dúplex incompleta, reparación de mal pareamiento puntual, mutagénesis que utiliza cepas hospederas deficientes de reparación, selección de restricción y purificación de restricción, mutagénesis de supresión, mutagénesis por síntesis génica a tal, reparación de rompimiento de doble hebra, y muchas otras conocidas por las personas de experiencia. En los métodos en la presente, la mutagénesis se puede llevar a cabo a través de la longitud completa de una proteína o dentro de una región de una proteína. Las mutaciones se pueden hacer reaccionar o aleatoriamente .
En algunos ejemplos, los métodos proporcionados en la presente se llevaron cabo tal que la identidad de cada proteína mutante es conocida a priori antes que la proteína se someta a prueba. Por ejemplo, los métodos proporcionados en la presente pueden ser conducentes a la mutagénesis y métodos de clasificación o prueba que son tratables. Esa puede permitir el caso de comparaciones entre las actividades de las proteínas sometidas a prueba sin la necesidad para secuenciación de las proteínas identificadas. Por ejemplo, los métodos de mutagénesis dirigida al sitio se pueden utilizar para generar individualmente proteínas mutantes. La mutagénesis se puede llevar a cabo por el reemplazo de residuos de aminoácidos individuales en las porciones objetivo especificas una por una, tal que cada mutante individual generado es el producto individual de cada reacción de mutagénesis individual. Las moléculas de ADN mutante se pueden diseñar, generar por mutagénesis y clonar individualmente, tal como en ensayos direccionables , tal que se separan físicamente entre si y cada uno es el producto individual de una reacción de mutagénesis independiente. Los aminoácidos seleccionados para reemplazar las porciones objetivo en la proteina particular que se optimiza pueden ser ya sea dos de los 19 aminoácidos restantes, o un grupo más restringido que contiene solo aminoácidos seleccionados. En algunos métodos proporcionados en la presente, cada aminoácido que se reemplaza independientemente por 19 de los aminoácidos restantes o por menos de 19 de los aminoácidos restantes, tales como 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 dé los aminoácidos restantes. 2. Clasificación o Prueba Para Una Actividad o Propiedad Deseada La actividad de hialuronidasa u otra actividad de una composición que contiene una enzima degradadora de hialuronano modificada se .clasifica o se somete a prueba bajo condiciones que exponen la enzima, degradadora de hialuronano a una condición de desnaturalización o un agente de desnaturalización (presencia de la condición de desnaturalización o agenté de desnaturalización) . La condición de desnaturalización o. agente de desnaturalización no necesita ser una condición o agente que sea completamente letal a la enzima, sino generalmente es cualquier condición o agente que desestabiliza la actividad enzimática a través del tiempo. Por ejemplo, la condición de desnaturalización puede ser una condición provocada por la temperatura (por ejemplo, temperatura elevada tal como mayo que o aproximadamente 30 °C, por ejemplo, 30°C a 42°C tal como o aproximadamente 37°C), agitación, nada o bajo contenido de sal (por ejemplo, NaCl) , y/o provocada por la presencia de un agente de desnaturalización, tal como la presencia de excipientes (por ejemplo, presencia de conservadores).
Para propósitos de seleccionar o identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestre estabilidad o estabilidad incrementada bajo la condición de desnaturalización, la actividad se puede comparar con la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada en ausencia de la condición y/o actividad de desnaturalización de la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente en presencia de la condición de desnaturalización. Por ejemplo,- la enzima degradadora de hialuronano modificada también se puede clasificar o someter a prueba bajo las mismas condiciones excepto que no incluye una condición de desnaturalización o agente de desnaturalización (ausencia de la condición de desnaturalización o agente ¦ de desnaturalización) . Si se desea, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente (por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos) también se puede someter bajo las mismas condiciones que exponen la enzima degradadora de hialuronano a la misma condición de desnaturalización o un agente de desnaturalización.
Por ejemplo, cada miembro de una biblioteca o colección de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas se incuba bajo o se expone a una o más condiciones de desnaturalización. La incubación o exposición puede presentarse vivo o in vitro. Típicamente, el ensayo se lleva a cabo in vitro. La misma enzima modificada también se expone o se incuba a una condición de referencia o control que no contiene la condición de desnaturalización. Las actividades bajo ambas condiciones se comparan a fin de identificar las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas que muestran estabilidad en la exposición a una condición o condiciones de desnaturalización. Además, en la clasificación o identificación de la actividad de la enzima bajo los dos conjuntas diferentes de condiciones, generalmente las únicas condiciones que son variadas en el ensayo se refieren a la presencia o ausencia de una o más condiciones de desnaturalización. Las otras condiciones del ensayo, incluyendo pero no limitado a, tiempo, temperatura y/u otras condiciones de incubación, pueden ser las mismas para ambos conjuntas de condiciones.
Por ejemplo, la exposición se puede lograr por incubación de una enzima degradadora de hialuronano modificada en una solución amortiguadora de ensayo o composición que se ha modificado o ajustado para contener un agente de desnaturalización tal como un excipiente o bajo contenido o nada de sal. Los agentes o excipientes de desnaturalización ejemplares incluyen, pero no se limitan a, antiadherentes , aglutinantes, recubrimientos, rellenadores y diluyentes, sabores, colores, lubricantes, deslizantes, conservadores, sorbentes o edulcorantes. La elección de la solución amortiguadora que se utiliza se puede determinar empíricamente por una persona experta en el campo dependiendo del parámetro o parámetros particulares que se modifican. Las soluciones amortiguadoras de ensayo ejemplares son soluciones amortiguadoras de Good {véase por ejemplo, Good y colaboradores (1966) Biochemistry, 5:467-477). Ejemplos de tales soluciones amortiguadoras incluyen, pero no se limitan a, soluciones amortiguadoras de ACES, ADA, BES, Bicine, BIS-TRIS, CAPS, HEPES, MES, MOPS, PIPES, TRIS o TrizmaMR. Además, la cantidad o concentración del excipiente o sal se puede determinar empíricamente por una persona de experiencia en el campo dependiendo de la elección del excipiente o sal y el nivel o actividad deseada de la enzima degradadora de hialuronano modificada.
En un ejemplo, la solución amortiguadora o composición de ensayo se modifica por la infusión de una cantidad de un agente de desnaturalización o excipiente de desnaturalización que es conservado por ejemplo, un conservado fenólico. El conservado fenólico puede ser fenol, metacresol (m-cresol) , alcohol bencílico, y parabenos incluyendo metilparabeno y propilparabeno . En particular, el conservador fenólico es fenol y/o m-cresol. La cantidad tal de uno o más agentes conservadores fenólicos como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) puede ser entre 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a.0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive. En tal ejemplo, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada se somete a prueba o se trata en presencia de tal cantidad tal (por ejemplo, entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.6%) de uno o más conservadores, por ejemplo, uno o más conservadores fenólicos. En algunos ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano modificada también se puede someter a prueba o evaluar bajo una condición de control o referencia en la cual la solución amortiguadora de ensayo o composición no se modifica para contener un conservado. En cierros casos, como un control, la actividad de las enzimas degradadora de hialuronano modificadas también se puede comparar con la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente que no contiene la modificación (s ) bajo condiciones que contienen un agente conservado y/o bajo condiciones que no contienen un agente conservado.
En otro ejemplo, la solución amortiguadora de ensayo se modifica por la presencia de una condición de desnaturalización que es de bajo contenido de sal o nada sal. Como se plantea en. cualquier lugar en la presente, las enzimas degradadoras de hialuronano, tal como PH20, requieren generalmente sal (por ejemplo, NaCl, Lys-Lys o MgCl2) para la actividad. Por consiguiente, la ausencia de sal o bajo contenido de sal es la desnaturalización a la enzima. En un ejemplo, la solución amortiguadora de ensayo se modifica por la inclusión de una cantidad de sal que es menos que 100 mM, por ejemplo, menos que 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o meno. En tal ejemplo, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada se somete a prueba en ausencia de sal o en presencia de sal que es menos que 100 mM. En algunos ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano modificada también se somete a prueba o se evalúa bajo una condición de control o referencia en la cual la solución amortiguado de ensayo contiene una concentración de sal más alta, generalmente entre o aproximadamente entre 140 mM a 200 mM . En ciertas casos, como un control, la actividad de las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas también se puede comparar con la · enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente que no contiene la modificación ( s ) bajo condiciones que contienen bajo contenido de sal o nada de sal, tal como menor que 100 mM y/o bajo condiciones que contienen sal en una cantidad que es entre o aproximadamente entre 140 mM a 200 mM.
La exposición de una enzima degradadora de hialuronano a una condición de desnaturalización también se puede lograr mediante la incubación, de una enzima degradadora de hialuronano modificada bajo condiciones que son conocidas por ser desnaturalizantes', tal como bajo condiciones de temperatura elevada tal como una temperatura mayor que o aproximadamente 30 °C (por ejemplo, 30 °C a 42 °C tal como o aproximadamente 37 °C) o agitación. Por ejemplo, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada se somete a prueba a temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente 3Q°C a 42°C. En algunos ejemplos, la enzima degradadora de hialuronano modificada también se puede someter a prueba o evaluar bajo una condición de control o referencia donde las temperaturas son menores que 30°C, tal como entre o aproximadamente entre 0°C a 25°C, por ejemplo, 0°C a 5°C o 18°C a 25°C. En ciertas casos, como un control, la actividad de las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas también se pueden comparar con la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente que no contiene la modificación (s) bajo temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente o 30 °C a 42 °C y/o temperaturas que son menores que 30°C, tal como entre o aproximadamente entre 0°C a 25°C, por ejemplo, 0°C a 5°C o 18°C a 25°C.
La enzima degradadora de hialuronano modificada se puede exponer a una o más de las condiciones. La exposición a una condición puede presentarse simultáneamente, subsecuentemente, intermitentemente o periódicamente a la exposición a una o más de otras condiciones.
En un ejemplo, el método en la presente, la enzima degradadora de hialuronano modificada se incuba o se expone a la condición de . desnaturalización o agente de desnaturalización antes de llevar a cabo un ensayo para la actividad de hialuronidasa . Por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano modificada se incuba en presencia de un agente de desnaturalización o se expone a una o más condiciones de desnaturalización o condiciones de control, tal como una o más . de las condiciones de desnaturalización o condiciones de control como se describe en lo anterior. La incubación o exposición puede ser para cualquier duración de tiempo deseada, y se puede determinar empíricamente por una persona de experiencia en el campo. Por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano modificada se puede encubar o exponer a una o más condiciones de desnaturalización, agentes de desnaturalización o condiciones de control durante o aproximadamente durante 1 minuto a 1 mes, tal como 1 minuto a 3 semanas, 1 minuto a 2 semanas, 1 minuto a 1 semana, 1 minuto a 24 horas, 1 minuto a 12 horas, tal como 30 minutos a 6 horas o 1 hora a 4 horas, y generalmente por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Después del tiempo de incubación o exposición, la muestra o composición que contiene el enzima degradadora de hialuronano modificada (o enzima no modificada de control) se evalúa para ensayo de hialuronidasa . En otro ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano modificada se expone o incuba bajo una o más condiciones de desnaturalización y se evalúa, simultánea o concurrentemente para la actividad de hialuronidasa. En cualquiera de los ejemplos donde una enzima degradadora de hialuronano modificada se evalúa, se entiende que una enzima degradadora de hialuronano no modificada que no contiene la modificación ( s ) también se puede evaluar bajo condiciones de ensayos similares para comparación.
Los ensayos para evaluar la actividad de hialuronidasa son bien conocidos en el campo. Ejemplos de tales ensayos se describen en la Sección G. En un ejemplo, la actividad de hialuronidasa se puede . evaluar en un ensayo de microturbiedad, en donde la cantidad de HA no degradado se mide por la adición de un reactivo que precipita él HA [por ejemplo, cloruro de Cetilpiridinio (CPC) o suero acidificado) después de que la enzima se deja reaccionar con HA. En otro ejemplo, la actividad de hialuronidasa se puede evaluar usando un ensayo de microtitulación en el cual el ácido hialurónico biotinilado residual se mide después de la incubación con hialuronidasa (véase por ejemplo, Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicación de Patente de E.U.A. No. 20050260186). Las actividades resultantes bajo cada una de las condiciones sometidas a prueba se determinan y se compara. 3. Selección o Identificación En el método, después de la clasificación de las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas bajo una o más condiciones de desnaturalización, se comparan las actividades de hialuronidasa de las enzimas sometidas a prueba. El método se práctica a fin de identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada que sea más resistente a la desnaturalización por una condición o un agente de desnaturalización, mediante lo cual la actividad de la enzima es indicativo de la estabilidad de la enzima como una medición de su resistencia a la desnaturalización. Se entiende que alguna reducción de la actividad enzimática, como resultado de la desnaturalización, se puede tolerar en varias aplicaciones, y de esta manera el método se puede practicar para seleccionar enzimas degradadoras de hialuronano modificadas que muestren una actividad requerida en la exposición a una condición de desnaturalización para permitir su uso o aplicación (por ejemplo, actividad terapéutica). Por ejemplo, se puede seleccionar una enzima modificada que pierda la actividad más lentamente que la enzima degradadora de hialuronano no modificado de referencia correspondiente, pero cuya actividad retenida es suficiente para una aplicación o propósito particular.
En ejemplos de los métodos en la presente, la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada se evalúa en la exposición a una primera condición de desnaturalización y también se evalúa en la exposición a una segunda condición que es una condición de control o no de desnaturalización, y las actividades de hialuronidasa resultantes comparadas. Para comparación, en algunos ejemplos, la actividad se puede representar como una relación de actividad o un porcentaje de actividad bajo o una condición de desnaturalización comparada bajo una condición de control o no de desnaturalización. Por ejemplo, donde el parámetro que difiere entre la primera y segunda condición es la presencia del conservador (por ejemplo, conservador fenólico) , la actividad se puede representar como una relación de actividad o porcentaje de actividad observado en presencia del conservador (por ejemplo, conservador fenólico) versus actividad en ausencia del conservador (por ejemplo, conservador fenólico) . En otro ejemplo, donde el parámetro que difiere entre la primera y segunda condición es la temperatura, la actividad se puede representar como una relación de actividad o porcentaje de actividad observado en presencia de temperatura elevada (por ejemplo, 30 °C a 42 °C) comparado con la actividad en presencia de una temperatura más baja tal como 0°C a 25°C, por ejemplo 0°C a 5°C o 18°C a 25°C.
Se selecciona o identifica una enzima degradadora de hialuronano modificada que retiene o muestra cualquier actividad deseada en presencia de la condición de desnaturalización comparada con su ausencia. El corte particular de actividad para la selección de enzimas en la presente es dependiente del usuario particular y/o la práctica del método y se puede determinar empíricamente dependiendo de factores tales como la condición de desnaturalización o agente de desnaturalización particular, la enzima degradadora de hialuronano modificada particular, la aplicación deseada de la enzima degradadora de hialuronano identificada o seleccionada y otros factores similares. Generalmente, una enzima degradadora de hialuronano seleccionado o identificada muestra estabilidad si cualquier actividad detectable se mide o se evalúa en la exposición o incubación con una condición de desnaturalización o agente de desnaturalización. Por ejemplo, una enzima degradadora de hialuronano modificada seleccionada o identificada muestra estabilidad, o resistencia a una condición de desnaturalización o agente de desnaturalización, si muestra por lo menos 5% o 10% de la actividad de la misma enzima en ausencia de la condición de desnaturalización o agente de desnaturalización, y generalmente si la enzima degradadora de hialuronano modificada muestra una actividad que es por lo menos 15% de la actividad de hialuronidasa inicial antes de la incubación en ' presencia de la condición de desnaturalización. Por ejemplo, se selecciona o identifica una enzima degradadora de · hialuronano modificada que muestra por lo menos (o por lo' menos aproximadamente) 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% .o más de la actividad de hialuronidasa inicial de la enzima degradadora de hialuronano modificada sometida a prueba bajo una condición de control o no de desnaturalización.
En otros ejemplos de los métodos en la presente, la actividad de la enzima degradadora. de hialuronano modificada se evalúa en la exposición a una condición de desnaturalización y la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada o de referencia también se evalúa en la exposición a las mismas condiciones de desnaturalización. En . tales ejemplos, las actividades se comparan cuando las enzimas se exponen a las mismas condiciones. Para comparación, la actividad bajo una condición de desnaturalización se puede representar como una relación de actividad, o un porcentaje de actividad de una enzima degradadora de hialuronano modificada comparada con una enzima degradadora de hialuronano no modificada o de referencia. En tales ejemplos, se selecciona una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra mayor actividad bajo una condición de desnaturalización que la enzima degradadora de hialuronano no modificada o de referencia. De esta manera, la enzima degradadora de hialuronano modificada es una gue es más resistente a la condición. Por ejemplo, donde la condición de desnaturalización es la presencia del conservador (por ejemplo, conservador fenólico) , la actividad observada en presencia del conservador (por ejemplo, conservador fenólico) se puede representar como una relación de actividad o porcentaje de actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada comparada con la enzima degradadora de hialuronano no modificada o de referencia. En otro ejemplo, donde la condición de desnaturalización es alta temperatura, la actividad observada en presencia de temperatura elevada (por ejemplo, 30°C a 42°C) se puede representar como una relación de actividad o porcentaje de actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada comparada con la enzima degradadora de hialuronano no modificada o de referencia.
En tales ejemplos, se identifica o se selecciona una enzima degradadora de hialuronano modificada, tal como una PH20 modificada, gue muestra una relación de actividad que es mayor que o por lo menos 1.1,' tal que la enzima muestra mayor actividad que la enzima degradadora de hialuronano no modificada o de referencia bajo la condición de desnaturalización. Por ejemplo, la relación es por lo menos o por lo menos aproximadamente 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 o mayor. Una enzima degradadora de hialuronano modificada (por ejemplo, una PH20 modificada) se puede seleccionar si su actividad es por lo menos 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500% o más de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada o de referencia cuando se somete a prueba bajo las mismas condiciones. De esta manera, se identifican enzimas degradadoras de hialuronano modificadas que muestran mayor estabilidad o mejorada comparada con la enzima degradadora de hialuronano no modificada o una enzima degradadora de hialuronano de referencia como se manifiesta por resistencia incrementada a una condición de desnaturalización o agente de desnaturalización. 4. Métodos Iterativos El método proporcionado en la presente también es iterativo. En un ejemplo, después de que se lleva a cabo el método, cualquiera.de las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas identificadas por mostrar estabilidad, tal como estabilidad incrementada, bajo una condición de desnaturalización se pueden modificar adicionalmente para incrementar u optimizar la estabilidad. Se puede crear una biblioteca secundaria al introducir modificaciones adicionales en una primera enzima degradadora de hialuronano modificada identificada. Por ejemplo, las modificaciones que se identificaron por conferir estabilidad, tal como incrementar estabilidad, se pueden combinar para generar una biblioteca de combinación. La biblioteca secundaria se puede someter a prueba usando los ensayos y métodos descritos en la presente.
En otro ejemplo de un aspecto iterativo del método, las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas que se identifican por no mostrar estabilidad, tal como estabilidad incrementada (por ejemplo, tal que no son activas o no tienen actividad incrementada bajo la condición de desnaturalización) , se pueden modificar y volver a someter a prueba adicionalmente para estabilidad bajo una condición de desnaturalización. Las modificaciones adicionales se pueden fijar como objetivo cerca de las regiones particulares (por ejemplo, residuos de aminoácidos particulares) asociadas con la actividad y/o estabilidad de la molécula. Por ejemplo, los residuos que se asocian con la actividad y/o estabilidad de la molécula son generalmente residuos críticos que se implican en el plegamiento estructural u otras actividades de la molécula. Por consiguiente, tales residuos son requeridos para la actividad, generalmente bajo cualquier condición. Los residuos críticos se pueden identificar debido que, cuando se mutan, a una actividad normal de. la proteina se habla o se reduce. Por ejemplo, se pueden identificar residuos críticos que, cuando se mutan en una enzima degradadora de hialuronano, muestran actividad de hialuronidasa reducida o hablada bajo una condición de ensayo normal o de control. Una biblioteca adicional de proteínas modificadas se puede generar con mutaciones de aminoácidos fijadas como objetivo en o cerca de los residuos de aminoácidos críticos identificados, tal como adyacentes a los residuos de aminoácidos críticos identificados. En algunos ejemplos, las mutaciones pueden . ser un reemplazo de aminoácidos a cualquiera de hasta 19 de otros residuos de aminoácidos. La biblioteca secundaria se puede someter a prueba usando los ensayos y métodos descritos en la presente.
E. PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS PH20 MODIFICADOS Y MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE CODIFICACIÓN Los polipéptidos de un polipéptido PH20 modificado expuesto en la presente se pueden obtener por métodos bien conocidos en el campo para purificación de proteínas y expresión de proteínas recombinantes . Los polipéptidos también se pueden sintetizar químicamente. Formas modificadas o variantes, incluyendo truncadas, se pueden diseñar de un polipéptido de tipo natural utilizando métodos de ADN recombinantes estándares. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados se pueden diseñar de un polipéptido de tipo natural, tal como, por mutagénesis dirigida al sitio. 1. Aislamiento o Preparación de Ácidos Nucleicos que Codifican Polipéptidos PH20 Los polipéptidos se pueden clonar o aislar utilizando cualquiera de los métodos disponibles conocidos en el campo para clonación y aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos. Tales métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y clasificación de bibliotecas, incluyendo clasificación de hibridación de ácidos nucleicos, clasificación basada en anticuerpos y clasificación basada en actividad. Por ejemplo, cuando los polipéptidos se producen por medios recombinantes , cualquier método conocido por aquellas personas de experiencia en el campo para identificación de ácidos nucleicos que codifican genes deseados se pueden utilizar. Cualquier método disponible en el campo se puede utilizar para obtener un ADNc de longitud completa o parcial (es decir que abarca la región de codificación completa) - o clon de ADN genómico que codifica una PH20, tal como de una fuente de células o tejidos.
Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos se pueden utilizar para aislar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido deseado, incluyendo, por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .
Ejemplos de tales métodos incluyen el uso de un ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus y polimerasa Taq (Gene Amp) . Un material que contiene ácido nucleico se puede utilizar como un material de inicio del cual una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado se puede aislar. Por ejemplo, las preparaciones de ADN y ARNm, extractos de células, extractos de tejido, muestras de fluido {por ejemplo, sangre, suero,, saliva), muestra de sujetos sanos y/o enfermos se pueden utilizar en los métodos de amplificación. La fuente se puede ser de cualquiera de las especies eucarióticas incluyendo, pero no limitado a, vertebrados, mamífero, humano, porcino, bovino, felino, aviar, equino, canino, y otras fuentes de primates. Las bibliotecas de ácidos nucleicos también se pueden utilizar como una fuente de material de inicio. Los cebadores se pueden diseñar para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar basados en las secuencias expresadas de las cuales se genera un polipéptido deseado. Los cebadores se pueden diseñar basado la traducción posterior de una secuencia de aminoácidos de polipéptido. Si se desea, se pueden utilizar cebadores degenerados para amplificación. Los cebadores de oligonucleótidos que se hibridan a las secuencias en las terminales 3' y 5' de la secuencia desead pueden ser usos como cebadores para amplificar por las secuencias de PCR de una muestra de ácido nucleico. Los cebadores se pueden utilizar para amplificar la PH20 de longitud completa, o una secuencia truncada de la misma, tal como un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos PH2Q solubles proporcionados en la presente. Las moléculas de ácidos nucleicos generadas por la amplificación se pueden secuenciar y confirmar para codificar un polipéptido deseado..
Las secuencias de nucleótidos adicionales se pueden unir a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, incluyendo secuencias ligadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción para el propósito de clonar el gen sintético en un vector,. por ejemplo, un vector de expresión de proteína o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN de codificación de proteínas núcleo. Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos adicionales que especifican los elementos de ADN funcionales se pueden ligar operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Ejemplos de tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de la proteína intracelular, y las secuencias de secreción, por ejemplo secuencias señal heterólogas ejemplares, diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Tales secuencias son conocidas por aquellas personas de experiencia en el campo. Por ejemplo, las secuencias señal heterólogas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, secuencia señal heterólogas IgG kappa de humano y ratón expuestas en SEQ ID NO: 868. Las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican las regiones de ligación a proteína también se pueden ligar a las moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Tales regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias de residuos que facilitan o codifican proteínas que facilitan la captación de una enzima en células objetivo específicas, o de otra manera alteran la farmacocinética de un producto de un gen sintético.
Además, se pueden agregar etiquetas u otras porciones, por ejemplo, para ayudar a la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican una etiqueta de epítopo u otro marcador detectable también se pueden ligar a las moléculas de ácidos nucleicos que codifican enzimas. Ejemplos de tales secuencias incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican una Etiqueta His o Etiqueta Flag.
Los ácidos nucleicos identificados y aislados luego se pueden insertar en un vector de clonación apropiado. Un gran número de sistemas de vector-hospederos conocidos en el campo se pueden utilizar.. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedera utilizada. Tales vectores- incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados de plásmido pCMV , pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA)'. Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ejemplificado en la presente {véase por ejemplo, SEQ ID NOS: 4 y 5) . La inserción en un vector de clonación se puede, por ejemplo, lograr al ligar el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene terminales o cohesivas complementarias. La inserción se puede llevar a cabo usando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) .
Si los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente . Alternativamente, cualquier sitio deseado se puede producir al ligar las secuencias de nucleótidos (ligadores) en las terminales del ADN; estos ligadores ligados pueden contener oligonucleótidos químicamente sintetizados específicos que codifican las secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción.
En un método alternativo, el vector escindido y el gen protector se pueden modificar por l prolongación homopolimérica .
Las moléculas recombinantes se pueden introducir en las células hospederas a través, por ejemplo, de transformación, transfección, infección, eleetroporación, y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia de genes. En modalidades específicas, la transformación de las células hospederas con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de proteína aislada, ADNc, o secuencia de ADN sintetizada permite la generación de múltiples copias de gen. De esta manera, el gen se puede obtener en grandes cantidades al desarrollar transformantes, al aislar las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando es necesario, recuperar el gen insertado del ADN recombinante aislado.
Además de la producción recombinante, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden producir por síntesis de péptido dirigida utilizando técnicas de fase solida (véase . por ejemplo, Stewart y colaboradores (1969) Solid-Phase Peptide Synthesís, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc, 85:2149-2154) . La síntesis de proteína in vitro se puede llevar a cabo utilizando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptido Applied Biosystems 43.1A (Perkin Elmer, Foster City CA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Varios fragmentos de un polipéptido se pueden sintetizar químicamente de manera separada y se combinan utilizando métodos químicos. 2. Generación de Ácido Nucleico Mutante Modificado y Polipéptidos de Codificación Las modificaciones proporcionadas en la presente se pueden hacer por técnicas de ADN recombinante estándares tal como son rutina para una persona de experiencia en la técnica. Cualquier método conocido en la técnica para llevar a cabo la mutación de cualquiera de uno o más aminoácidos en una proteína objetivo se pueden emplear. Los métodos incluyen mutagénesis dirigido al sitio estándar (utilizando por ejemplo, un kit, tal como QuikChange disponible de Stratagene) de moléculas de ácidos nucleicos de codificación, o por métodos de síntesis de polipéptido de fase sólida. 3. Vectores y Células Para la expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, tal como cualquier polipéptido PH20 modificado descrito en la presente, el ácido nucleico que contiene todo o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína . se pueden insertar en un vector de expresión apropiado, por ejemplo, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación de proteínas insertadas.
Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias también se pueden suministrar por el promotor nativo para los genes de enzimas, y/o sus regiones de flanqueo.
También se proporcionan vectores que contienen un ácido nucleico que codifica la enzima. Las células que contienen los vectores también se proporcionan. Las células incluyen células eucarióticas y procarióticas , y los vectores son cualquier adecuado para el uso en la presente. Generalmente, la célula es una célula que es capaz de llevar a cabo la glicosilación de la proteína codificada.
Se proporcionan células procarióticas y eucarióticas que contienen los vectores. Tales células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células de plantas, células de insecto y células de animal. Las células se utilizan para producir la proteína de las mismas al desarrollar las células descritas en lo anterior bajo condiciones mediante las cuales la proteína codificada se expresa por la célula, y al recuperar la proteína expresada. Para propósitos en la presente, por ejemplo, la enzima se puede secretar en el medio.
Una cepa de célula ' hospedera se puede elegir por su capacidad para modular . la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento pos-traduccional puede impactar el plegamiento y/o función del polipéptido. Diferentes células hospederas, tales como, pero no limitadas a, CHO (DG44, DXB11, CH0-K1), HeLa, MCDK, 293 y WI38 tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades post-traduccionales y se pueden elegir para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteína introducida. Generalmente, la elección de la célula es una que es capaz de introducir glicosilación N-ligada en el polipéptido expresado. Por consiguiente, se proporcionan células eucarióticas que contienen los vectores. Las células eucarióticas ejemplares son células de Ovario de Hámster Chino (CHO) de mamífero. Por ejemplo, las células CHO deficientes en la dihidrofolato reductasa (por ejemplo, células DG44) se utilizan para producir polipéptidos proporcionados en la presente. Cabe destacar que la expresión bacteriana de un polipéptido PII20 proporcionado en la presente no dará por resultado un polipéptido catalíticamente activo, sino cuando se combina con la maquinaria de glicosilació.n apropiada, el PH20 se puede glicosilar artificialmente.
Se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido PH20 modificado, acoplado a la secuencia señal nativa o heteróloga, así como múltiples copias de -la misma. Los vectores se pueden seleccionar para la expresión de la proteína enzimática en la célula o tal que la proteína enzimática se expresa como una proteína secretada. Una variedad de sistemas de hospedero-vector se pueden utilizar para expresar la secuencia de codificación de proteínas. Estas incluyen pero no se limitan a sistemas de células de mamífero infectados con virus (por ejemplo, virus de vaccinia, adenovirus y otros virus) ; sistemas de células de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus) ; microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófago, ADN, ADN plásmido, o ADN cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus resistencias y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedero-vector utilizado, cualquiera de una variedad de elementos de transcripción y traducción adecuados se pueden utilizar. Cualquiera de los métodos conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector se puede utilizar para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales de control transcripcionales/traduccionales apropiadas y secuencias de codificación de proteínas. Estos, métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética) . La expresión de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos, se pueden regular de una segunda secuencia de ácidos nucleicos de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresan en un hospedero transformado con la molécula (s) de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas se puede controlar por cualquier promotor/potenciador conocido en el campo. En una modalidad específica, el promotor no es nativo a los genes para la proteína deseada. Los promotores que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y colaboradores Cell 22:787-797 (1980)), el promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1441-1445 (1981)), la secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster y colaboradores, Nature 296:39-42 (1982)); promotores del vector de expresión procariótica, tal como el promotor de ß-lactamasa (Jay y colaboradores, (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:5543) el promotor tac (DeBoer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 50:21-25 (1983); véase también Gilbert y Villa-Komaroff , "Useful Proteins from Recombinant Bacteria", Scientific American 242:74-94 (1980)); promotores de vector de expresión de plantas, tal como el promotor de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella y colaboradores, Nature 303:209-213 (1984)) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner y colaboradores, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella y colaboradores, Nature 310: 115-120 (1984)); los elementos promotores de la levadura y otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de alcohol de deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol cinasa, el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcionales animales que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen elastasa I que es activo en células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, Cell 35:639-646 (1984); Ornitz y colaboradores, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986) ; MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan y colaboradores, Nature 315: 115-122 (1985)), región del control, del gen de inmunoglobulina que es activa en las células linfoides (Grosschedl y colaboradores, Cell 35:647-658 (1984); Adams y colaboradores, Nature 375:533-538 (1985); Alexander y colaboradores, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares , de mama, linfoides y mastocitos (Leder y colaboradores, Cell 45:485-495 (1986)), región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert y colaboradores, Genes y Devel. 7:268-276 (1987)), región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer y colaboradores, Science 235:53-58 1987) ) , región de control del gen de anti-tripsina alfa-1 que es activa en el hígado (Kelsey y colaboradores, Genes y Devel. 7:161-171 (1987)), región de control del gen de beta globina que es activa en las células mieloides (Magram y colaboradores, Nature 375:338-340 (1985); ollias y colaboradores, Cell 46:89-94 (1986)), región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en las células oligodendrocitos del cerebro (Readhead y colaboradores, Cell 45:703-712 (1987)), región de control del gen de cadena ligera de miosina 2 que es activa en el músculo esquelético (Shani, Nature 374:283-286 (1985)), y región de control del gen de hormona de liberación gonadotrópica que es activa en los gonadotropos del hipotálamo (Masón y colaboradores, Science 234: 1372-1378 (1986)).
En una modalidad especifica, se utiliza un vector que contiene un promotor operablemente ligado a los ácidos nucleicos que codifican una proteína deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo del mismo, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Dependiendo del sistema de expresión, las señales de inicio específico también son requeridas para la traducción eficiente de una secuencia PH20. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes . En casos donde el codón de inicio y las secuencias cadena arriba de la PH20 o formas solubles de la misma se insertan en el vector de expresión apropiado, no se necesitan señales de control traduccionales adicionales. En casos donde solo una secuencia de codificación o una porción de la misma, se inserta, se deben proporcionar señales de control de transcripción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. Adicionalmente, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la transcripción del inserto completo. Los elementos transcripcionales exógenos y los codones de inicio pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede mejorar por la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso. . (Scharf y colaboradores (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-62; Bittner y colaboradores (1987) Methods in Enzymol, 153:516-544).
Los vectores plásmidos ejemplares para la transformación dé células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también la literatura publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tiene un promotor T5 fago (reconocido por la AR polimerasa de E. coli) y un módulo de represión operador lac doble para proporcionar la expresión de alto nivel, estrechamente regulada de proteínas recombinantes en el E. coli, un sitio de ligación ribosómico sintético (RBS II) para la traducción deficiente, una secuencia de codificación de etiqueta 6xHis, terminadores transcripcionales to y TI, origen ColEl de replicación, y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de una etiqueta 6xHis en ya sea la N- o C-terminal de la proteína recombinante . Tales plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31 que proporcionan múltiples sitios de clonación para los tres marcos de lectura y proporcionan la expresión de las proteínas N-terminalmente etiquetadas con 6xHis. Otros vectores plásmidos ejemplares para la transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, Patenté de E.U.A. 4,952,496; disponible de Novagen, Madison, I; véase,. también la literatura publicada por Novagen que describe el sistema) . Tales plásmidos incluyen pETlla, que contiene el promotor T71ac, el terminador T7, el operado lac de E. coli inducible, y el gen represor lac; epET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7, y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (Novagen, Madison, WI), que contiene una secuencia líder His-TagMR para el uso en la purificación con una columna His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de la purificación sobre la columna, la región del promotor T7-lac y el terminador T7.
Típicamente, los vectores pueden ser plásmidos, vectores virales, u otros conocidos en la técnica, utilizados para la expresión del polipéptido PH20 modificado ir¡ vivo o in vitro. Por ejemplo, el polipéptido PH20 modificado se expresa en células de mamífero, incluyendo, por ejemplo, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) . Un vector ejemplar para la expresión de células de mamífero es el vector de expresión HZ24. El vector de expresión HZ24 se derivó de la cadena principal del vector pCI (Promega) . Contiene el ADN que codifica el gen de resistencia a la Beta-lactamasa (AmpR) , un origen Fl de replicación, una región potenciadora/promotora inmediata/temprana de Citomegalovirus (C V) , y una señal de poliadenilación tardía SV40 (SV40) . El vector de expresión también tiene un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón.
Los vectores virales, tales como adenovirus, retrovirus o vectores de virus de vaccinia, se pueden emplear. En algunos ejemplos, el vector es un vector viral defectuoso o retroviral atenuado u otro (véase la Patente de E.U.A. No. 4,980,286). Por ejemplo, Un vector retroviral' se puede utilizar (véase Miller' y colaboradores, Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales se han modificado para suprimir las secuencias retrovirales que no son necesarias para el empaquetado del genoma viral y la integración en el ADN de la célula hospedera.
En algunos ejemplos, los virus armados con un ácido nucleico que codifica un polipéptido PH20 modificado pueden facilitar su replicación y propagación dentro de un tejido objetivo por ejemplo. El tejido objetivo puede ser un tejido canceroso mediante el cual el virus es capaz de la replicación selectiva 'dentro del tumor. El virus también puede ser un virus no lítico en donde el virus se replica colectivamente bajo un promotor especifico de tejido. Conforme los virus · se replican, la co-expresión del polipéptido PH20 con los genes virales facilitará la propagación del virus in vivo.
. Expresión Los polipéptidos PH20 modificados se pueden producir mediante cualquier método conocido por aquellas personas de experiencia en la técnica incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir- las cantidades requeridas y formas de las proteínas,, tal como por ejemplo, aquellas necesarias para la ' administración y tratamiento. Los hospederos de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tale como E.coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluyendo líneas de células humanas y animales transgénicos. Los hospederos de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas así como los tipos de modificaciones post-traduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del hospedero de expresión se puede hacer basado en estos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costos de producción y. la necesidad y métodos para purificación.
Muchos vectores de expresión son disponibles y son conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica y se pueden utilizar para la expresión de las proteínas. La elección del vector de expresión será influida por la elección del sistema de expresión hospedero. En. general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente potenciadores , señales traduccionales, y señales de terminación transcripcionales y traduccionales . Los vectores de expresión que se utilizan para la transformación estable tienen típicamente un marcador seleccionable que permite la selección y mantenimiento de las células transformadas. En .algunos casos, un origen de replicación se puede utilizar para amplificar el número de copias del vector.
Los polipéptidos PH20 modificados también se pueden utilizar o expresas como fusiones de proteínas, por ejemplo, una fusión de enzimas ' se puede generar para agregar funcionalidad adicional a una. enzima. Ejemplos de proteínas de fusión de enzimas incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia señal, una etiqueta tal como para localización, por ejemplo, una etiqueta 6xHis o His6 o una etiqueta myc, o una etiqueta, para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o la asociación de membrana.
Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombinantes , se desea la expresión estable. Por ejemplo, las líneas de células que expresan establemente un polipéptido PH20 modificado se pueden transformar usando vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionable . Después de la introducción del vector, las células se pueden dejar desarrollar durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a- la selección, y su presencia permite el crecimiento y. recuperación de las células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Las células resistentes de las- células establemente transformadas se pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para los tipos de células.
Cualquier variedad de sistemas de selección se puede utilizar para recuperar líneas de células transformadas. Estas incluyen, pero no se limitan a, genes de timidina-cinas de virus de herpes simple ( igler, M y colaboradores (1977) Cell, 11:223-32) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, I y colaboradores (1980) Cell, 22 : 817-23) , que se pueden emplear en células TK- o APRT, respectivamente. También, la resistencia anti-metabolitos, antibióticos o herbicidas se pueden utilizar como la base para la selección. Por ejemplo DHFR, que confiere resistencia a la metotrexato (Wigler, M y colaboradores (1980) Proc. Nati. Acad. Scí, 77:3567-70); npt, que confiere resistencia a aminoglicósidos de neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F y colaboradores (1981) J. Mol. Biol. , 150: 1-14); y ais o pat, que confieren resistencia a clorsulfuron y fosfinotricin acetiltransferasa, respecti amente, se pueden utilizar. Se han descrito genes seleccionados adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen el indol en lugar de triptófano o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc. Nati. Acad. Sel, 85:8047-51). Los marcadores visibles, tales como, pero no se limitan a, antocianinas , beta glucuronidasa y su substrato, GUS, y luciferasa y su substrato luciferina, también se pueden utilizar para identificar transformantes y también para cuantificar la cantidad de expresión de proteina transciente y estable atribuible a un sistema de vectores particulares (Rhodes CA y colaboradores (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
La presencia y expresión de los polipéptidos PH20 se pueden monitorear. Por ejemplo, la detección de un polipéptido funcional se puede determinar al someter a prueba el medio condicionado para la actividad enzimática de hialuronidasa bajo condiciones apropiadas. Ensayos ejemplares para evaluar la solubilidad y actividad de las proteínas expresadas se proporcionan en la presente, a . Células Procarióticas Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. Las transformación de E. coli es una técnica simple y rápida bien conocida por aquellas personas de experiencia en la técnica. Los vectores de expresión para el E. coli pueden contener promotores inducibles. Tales promotores son útiles para introducir altos niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que muestran alguna toxicidad a las células hospederas. Ejemplos · de promotores inducibles incluyen el promotor lac,. el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores T7 y SP6 ARN y le promotor ?PL regulado por temperatura.
Las proteínas, tal como cualquiera proporcionado en la presente, se puede expresar en el entorno citoplásmico de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor, y para algunas moléculas, esto puede dar por resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Los agentes reductores tales como ditiotreotol y ß-mercaptoetánol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea se pueden utilizar para solubilizar las proteínas. Un procedimiento alternativo afecta la expresión de la proteína en el espacio periplásmico de las bacterias que proporciona un entorno de oxidación e isomerasas similares a chaperonina y disulfuro, que pueden ayudar en la producción de la proteina soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona a la proteína que se expresa lo cual dirige la proteína al periplasma. El líder luego se remueve por las peptidasas dentro de la periplasma. Ejemplos de secuencias líder de orientación periplásmicas incluyen el líder pelB del gen de pectato-liasa y el líder derivado del gen de' fosfatase alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la fuga de la proteína expresada en el medio de cultivo. La secreción de las proteínas permite la purificación rápida y simple del sobrenadante del cultivo. Las proteínas que no se secretan se pueden obtener del periplasma o lisis osmótica. Similar a la expresión citoplásmica , en algunos casos las proteínas pueden ser insolubles y desnaturalizantes y los agentes reductores se pueden utilizar para facilitar la solubilización y replegamiento . La temperatura de inducción y crecimiento también pueden incluir en los niveles de expresión y solubilidad, típicamente utilizan temperaturas ente 25 °C y 37°C. Típicamente, las bacterias producen proteínas glicosiladas . De esta manera, si las proteínas requieren glicosilación para funcionar, la glicosilación se puede agregar in vitro después de la purificación de las células hospederas . b . Células de Levadura Las levaduras tales como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica , Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son hospederos de expresión de levadura bien conocidos que se pueden utilizar para la producción de proteínas, tal como cualquiera descrita en la presente. La levadura se puede transformar con vectores de replicación episómicos o por la integración croraosómi na estale por recombinación homologa. Típicamente, los promotores inducible se utilizan para regular la expresión génica. Ejemplos de tales promotores incluyen GAL1 , GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneína, tal que CUP1, A0X1 u otros promotores de levadura Pichia u otros promotores. Los vectores de expresión incluyen frecuentemente un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en la levadura son frecuentemente solubles. La coexpresión con chaperoninas tal como Bip y la proteína disulfuro isomerasa puede, mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en la levadura se pueden ' dirigir para la secreción utilizando fusiones de péptido de señal de secreción tal como la señal de secreción de fato alfa de tipo acoplamiento de levadura de Saccharomyces cerevisae y fusiones con las proteínas de superficie celular de levadura tal como el receptor de adhesión de acoplamiento Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninlvorans . Un -sitio, de escisión de proteasa tal como para la proteasa Kex-2, se puede diseñar para remover las secuencias fusionadas de los polipéptidos expresados conforme sales de la ruta de. secreción. La levadura también es capaz de la glicosilación en los motivos Asn-X-Ser/Thr . c . Insectos y Células de Insecto Las células de insecto, particularmente que utilizan la expresión de baeulovirus, son útiles para la expresión de polipéptidos tales como polipéptidos PH20. Las células de insecto expresan altos niveles de proteínas sy son capaces de la mayoría de las modificaciones postraduccionales utilizadas por los eucariotas superiores. Los baeulovirus tienen un intervalo de hospedero restrictivo que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de la expresión eucariótica. Los vectores de expresión típicos usan un promotor para la expresión de alto nivel tal como el promotor de polihedrina de baeulovirus. Los sistemas de baeulovirus comúnmente utilizados incluyen un baeulovirus, tal como el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) de virus de polihedrosis nuclear de bombyx mori (BmNPV) , y la línea de células de insectos, tal como Sf9 derivadaa de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpNl) . Para la expresión de alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula que se expresa se fusiona inmediatamente cadena abajo del codón de inicio de polihedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en las células de insecto y se pueden utilizar para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas de células de (A7S) y Danaus plexippus (DpNl) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a . los sistemas de células de mamífero. Las células de insecto ejemplares son aquellas que se han alterado para reducir la inmunogenicidad, incluyendo aquellas con vectores de expresión de baculovirus "tipo mamífero" y aquellos que carecen de la enzima FT3.
Un sistema de expresión alternativo en las células de insecto emplea células establemente transformadas. Las líneas de células tales como las células Schnieder 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y las células C7 {Aedes albopictus) se pueden utilizar para la expresión. El promotor de metalotioneína de Drosophila. se puede utilizar para inducir altos niveles de expresión en presencia de la inducción de metal pesado con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen típicamente por el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina. d. Expresión de Mamífero Los sistemas de expresión de mamífero se pueden utilizar para expresar proteínas incluyendo polipéptidos PH20. Los constructos de expresión se pueden transferir a células de mamífero por infección viral tal como por adenovirus o por transferencia de ??? directa tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tal como electroporación y¦ microinyección. Los vectores de expresión para las células de mamífero incluyen típicamente un sitio de tapa ARNm, una caja TATA, una secuencia de inicio traduccional (secuencia consenso Kozak) y elementos de poliadenilación . Los elementos IRES también se pueden agregar para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, tal como un marcador seleccionable . Tales vectores incluyen frecuentemente promotores-potenciadores transcripcionales para la expresión de alto nivel, por ejemplo, el promotor-potenciador SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV) y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV) . Estos promotores-potenciadores son activos en muchos tipos de células. Los promotores de tipo de tejido y célula y las regiones potenciadoras también se pueden utilizar para la expresión. Las regiones de promotores/potenciadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, a agüellas de los genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus de tumor mamario de ratón, albúmina, alfa-fetoproteina , alfa-1-anti-tripsina , beta-globina, proteina básica de mielina, cadena 2 ligera de miosina, y control del gen de hormona de liberación gonadotrópico . Los marcadores seleccionables se pueden utilizar para seleccionar y mantener células con el constructo de expresión.. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, higromicina B fosfotransferasa, adenosina-desaminasa, xantina-guanina fosforibosil-transferasa, aminoglicosido-fosfotransferasa , dihidrofolato-reductasa (DHFR) y timidina-cinasa . Por ejemplo, la expresión se puede llevar a cabo en presencia de metotrexato para seleccionar solamente aquellas células que expresan el gen DHFR. La fusión con las moléculas de señalización de superficie celular tales como TCR-? y FcERI-y pueden dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo sobre la superficie- celular.
Muchas líneas de células son disponibles para la expresión de mamífero incluyendo células de ratón, rata, humano, mono, pollo y hámster. Las líneas de células ejemplares incluyen pero no se limitan a CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NSO de ratón . (no secretora) y las otras líneas de células de mieloma, líneas de células de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, y células HKB . Las líneas de células también son disponibles adaptadas para un medio sin suero que facilita la purificación de las proteínas secretadas del medio de cultivo celular. Ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012). y la línea de células EBNA-1 sin suero (Pham y colaboradores, (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.). También son disponibles líneas de células que se adaptan al crecimiento y medios especiales optimizados para la expresión máxima. Por ejemplo, las células D.G44 CHO se adaptan para desarrollarse en un cultivo de suspensión en un medio sin producto animal, químicamente definido, e. Plantas Las células de planta transgénica y plantas se pueden utilizar para expresar proteínas tal como cualquiera descrito en la presente. Los constructos de expresión se transfieren típicamente a las plantas utilizando transferencia de ADN directa tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG en protoplastos , y con la trasformación mediada . por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de determinación transcripcionales y elementos de control. traduccionales . Los vectores de expresión y las técnicas de transformación se dividen usualmente entre hospedadoras dicotiledóneos, tales como Arabidopsís y tabaco, y hospederos monocotiledóneos , tales como arroz y maíz. Ejemplos de promotores de plantas utilizados para la expresión incluyen el promotor del virus de mosaico de la coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de ribosa-bifosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Los marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa-isomerasa y neomicin-fosfotransferasa se utilizan frecuentemente para facilitar la selección y mantenimiento de las células transformadas. Las células de planta transformadas se pueden mantener en el cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerar en plantas enteras. Las células de plantas transgénicas también pueden incluir algas diseñadas para producir polipéptidos de hialuronidasa . Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación que las células de mamífero, esto puede influir en la elección de la proteína producida en estos hospederos. 5. Purificación Las células hospederas transformadas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PH20 modificado se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas tales como para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante se secreta generalmente, pero puede estar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o vector utilizado. Como se entenderá por aquellas personas de experiencia en la técnica, los vectores de expresión que contienen el ácido nucleico que codifica la PH20 se puede diseñar con secuencia señal que facilitan la secreción directa de la PH20 a través de membranas de células procarióticas o eucarióticas .
De esta manera, los métodos para la purificación de polipéptidos de las células hospederas dependerán de las células hospederas elegidas y los sistemas de expresión. Para las moléculas secretadas, las proteínas se purifican generalmente del medio de cultivo después de la remoción de las células. Para la expresión intracelular, las células se pueden lisar y las. proteínas purificar del extracto. Cuando los organismos transgénicos tales como plantas transgénicas y animales se utilizan para la expresión, tejidos u órganos se pueden utilizar como -material de inicio para fabricar un extracto de células lisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que se pueden recolectar, y si es necesario, las proteínas se pueden extraer y purificar adicionalmente utilizando métodos estándares en la técnica.
Las proteínas, tales como polipéptidos PH20 modificados, se pueden purificar utilizando técnicas de purificación de proteínas estándares conocidas en el campo, incluyendo pero no limitado a, SDS-PAGE, cromatografía de exclusión de tamaño y fraccionamiento de tamaño,' cromatografía de precipitación de sulfato de amonio e intercambio iónico, tal como cromatografía de intercambio aniónico. Las técnicas de purificación por afinidad también se pueden utilizar para mejorar la eficiencia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, los anticuerpos, receptores y otras moléculas que se ligan a las enzimas de hialuronidasa PH20 se pueden utilizar en la purificación por afinidad. Por ejemplo, la PH20 soluble se puede purificar en medios acondicionados.
Los constructos de expresión también se pueden diseñar para agregar una etiqueta de afinidad a una proteína tal como un epítopo myc, fusión GST o Hi-S6 y purificar por afinidad con el anticuerpo myc, resina de glutationa o resina Ni, respectivamente. Tales etiquetas se pueden unir a la secuencia de nucleótidos que codifica una PH20 soluble como se describe en cualquier lugar en la presente, que puede facilitar la purificación de las proteínas solubles. Por ejemplo, un polipéptido PH20 modificado se puede expresar como una proteína recombinante con uno o más dominios de polipéptido adicionales agregados para facilitar la purificación de proteínas. Tales dominios de facilitación de purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metal tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en los metales inmovilizados, dominios de proteina A que permiten la purificación en la inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de extensión FLAGS/purificación por afinidad (Immunex Corp., Seattle Wash. ) . La inclusión de la secuencia ligadora escindible tal como Factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido PH20 expresado es útil para facilitar la purificación. Uno de tal vector de expresión proporciona la expresión de una proteina de fusión que contiene un polipéptido PH20 en y un sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad de ión de metal inmovilizado) , mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido de la proteína de fusión.
La pureza se puede evaluar por cualquier método conocido en la técnica incluyendo electroforesis en gel, métodos HPLC, ortogonales, técnicas de tinción y espectrofotométricas . La proteína expresada y purificada se puede analizar utilizando cualquier ensayo o método conocido por una persona de experiencia en el campo, por ejemplo, cualquiera descrito en la Sección G. Estos incluyen ensayos basados en las propiedades físicas y/o funcionales de la proteina, incluyendo, pero no limitado a, análisis electroforesis en gel, inmunoensayo y ensayos de actividad de hialuronidasa .
Dependiendo del sistema de expresión y las células hospederas utilizadas, · el polipéptido resultante puede ser heterogéneo debido a las peptidasas presentes en el medio de cultivo en la producción y purificación. Por ejemplo, el cultivo de la PH20 soluble en las células CHO puede dar por resultado una mezcla de polipéptidos heterogéneos. 6. Modificación de Polipéptidos por PEGilación El polietilenglicol (PEG) se ha utilizado ampliamente en biomateriales , biotecnología y medicina principalmente debido a que el PEG es un polímero soluble en agua, no tóxico, bocompatible que es típicamente no inmunogénico (Zhao y Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). En el área de la administración de fármacos, los derivados de PEG se han utilizado ampliamente en la unión covalente (es decir, "PEGilación") a proteínas para reducir la inmunogenicidad, proteólisis y limpieza del riñon y para mejorar la solubilidad (Zalipsky, Adv. Drag Del . Rev. 16: 157-82, 1995). Similarmente, el PEG se ha unido . a fármacos relativamente hidrofóbicos, de peso molecular bajo para potenciar la solubilidad, reducir . la toxicidaa y alterar la biodistribución . Típicamente, los fármacos PEGilados se inyectan como soluciones.
Una aplicación estrechamente relacionada es la síntesis de las redes de PEG degradables reticuladas o formulaciones para el uso en la administración de fármacos puesto que mucho de la misma química utilizada en el diseño de los portadores de fármacos solubles, degradables también se pueden utilizar en el diseño de geles degradables. (Sawhney y colaboradores, Macromolecules 26: 581-87, 1993). También se sabe que los complejos intermacromoleculares se pueden formar al mezclar soluciones de dos polímeros complementarios. Tales complejos se estabilizan generalmente por interacciones electrostáticas. (polianión-policatión) y/o ligaciones de hidrógeno (poliácido-polibase) entre los polímeros implicados, y/o por interacciones hidrofóbicas entre los polímeros en un entorno acuoso (Krupers y colaboradores, Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). Por ejemplo, las soluciones de mezclado del ácido poliacrilico (PAAc) y óxido de polietileno (PEO) bajo las condiciones apropiadas da por resultado la formación de complejos basados principalmente en la ligación de hidrógeno. La disociación de estos complejos en las condiciones fisiológicas se ha utilizado para la administración de fármacos libres (es decir, no PEGilados) . Además, los complejos de los polímeros complementarios se han formado de tanto homopolímeros como copolímeros.
Numerosos reactivos para la PEGilación se han descrito en la técnica. Tales reactivos incluyen pero no se limitan a, reacción del polipéptido · con PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS) , succinimidil-mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, mPEG-succinimidil-alfa-metilbutanoato, mPEG-succinimidil-propionato, mPEG-succinimidil-butanoato, éster succinimidílico de ácido mPEG-carboximctil-3-hidroxibutanoico, propionato de PEG-succinimidilo homobifuncional , PEG-propionaldehído homobifuncional , PEG-butiraldehido homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, p-nitrofenil-carbonato PEG, mPEG-benzotriazol-carbonato , propionaldehido PEG, mPEG butrialdehido, mPEG2 butiraldehido ramificado, mPEG-acetilo, mPEG-piperidona, mPEG-metilcetona , mPEG maleimida "sin ligador", mPEG-vinil-sulfona, mPEG tiiol, mPEG-ortopiridiltioéster, disulfuro de mPEG-ortopiridilo, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG NHS, vinilsulfona-PEG-NHS, acrilato PEG-NHS, fluoresceína PEG-NHS, y biotina PEG-NHS (véase por ejemplo, Monfardini y colaboradores, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Verone.se y colaboradores, J. Bioactive Compatible Polymers 12: 197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S. 6,495,659; U.S. 6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5,324, 844; U.S. 5, 446, 090; U.S. 5, 612, 460; U.S. 5, 643, 575; U.S. 5, 766, 581 ; U . S . 5, 795, 569; U.S. 5, 808, 096; U.S. 5, 900, 461; U.S. 5, 919, 455; U.S. 5,985,263; U.S. 5,990, 237; U.S. 6,113,906; U.S. 6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S. 6,340,742; U.S. 6,413,507; U .S 6,420,339; U. S. 6, 437, 025; U.S. 6, 448,369; U.S. 6,461, 8 02 U.S. 6,828,401; U .S. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U . S 2001/0044526; U. S . 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U . s 2002/0072573; U. S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U . S 2003/0143596; U. S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U . s 2004/0013637; US 2004/0235734; WO05000360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; O 0249673; WO 9428024; y O 0187925) .
En un ejemplo, el polietilenglicol tiene un peso molecular que varia de aproximadamente 3 kD a aproximadamente 50 kD, y típicamente de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 30 kD. La unión covalente del PEG al fármaco (conocida como "PEGilación") se puede lograr por técnicas de síntesis químicas conocidas. Por ejemplo, la PEGilación de las proteínas se puede lograr al hacer reaccionar PEG activado con NHS con la proteína bajo condiciones de reacción adecuadas.
Mientras que se han descrito numerosas reacciones para la PEGilación, aquellas que son más generalmente aplicables confieren direccionalidad, utilizan condiciones de reacción leves, y no necesitan procesamiento cadena abajo extensiva para remover la catálisis tóxica o subproductos. Por ejemplo, el monometoxi PEG (mPEG) tiene solo un hidroxilo terminal reactivo, y de esta manera su uso limita algo de la heterogeneidad de la 'mezcla de producto de PEG-proteína resultante. La activación del grupo hidroxilo en el extremo del polímero opuesto al grupo metoxi-terminal es generalmente necesaria para lograr la eficiente PEGilación de la proteína, mientras que el objetivo es hacer el PEG derivado más susceptible al ataque nucleofílico . El nucleófilo de ataque es usualmente el grupo épsilon-amino del residuo de lisilo, pero otras aminas también pueden reaccionar (por ejemplo, la alfa-amina N-terminal o las aminas de anillo de histidina) si las condiciones locales son favorables. Un ataque más directo es posible en las proteínas que contienen una lisina o cisteína individual. El último residuo se puede fijar como objetivo por la PEG-maleimida para la modificación específica de tiol. Alternativamente, el PEG-hidrazida se puede hacer reaccionar con una enzima degradadora de hialuronano oxidada de periodato y reducida en presencia de NaCNBH3. Más específicamente, los azúcares de CMP PEGilados se pueden hace reaccionar con una enzima degradadora de hialuronano en presencia de glicosil-transferasas apropiadas. Una técnica es la técnica de "PEGilación" donde una variedad de moléculas poliméricas se acoplan 'al polipéptido en cuestión. Cuando se utiliza esta técnica, el sistema inmunitario tiene dificultades en reconocer, los epitopos en la superficie del polipéptido responsable por la formación de los anticuerpos, reduciendo de esta manera la respuesta inmunitaría. Para los polipéptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del cuerpo humano para da un efecto fisiológico particular (es decir, farmacéuticos) la respuesta inmunitaría potencial típica es una respuesta de IgG y/o IgM, mientras que los polipéptidos que se inhalan a través del sistema respiratorio (es decir, polipéptido industrial) pueden provocar potencialmente una respuesta de IgE (es decir, repuesta alérgica) . Una . de las teorías que explican la respuesta inmunitaría reducida es que la molécula (s) polimérica protege el epítopo(s) sobre la superficie del polipéptido responsable por la respuesta inmunitaría que conduce la formación de anticuerpos. Otra teoría o por lo menos un factor parcial es que mientras que el conjugado es más pesado, es más reducida la respuesta inmunitaría resultante .
Típicamente, para fabricar un polipéptido PH20 PEGilado proporcionado en la presente, ¦ las porciones de PEG se conjugan, de la unión covalente, a los polipéptidos. Las técnicas para PEGilación incluyen, pero no se limitan a, ligadores especializados y químicas de acoplamiento {véase por ejemplo, Roberts, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), la unión de múltiples' porciones de PEG a un sitio de conjugación individual (tal como a través del uso de PEGs ramificados; véase por ejemplo, Guiotto y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12: 177-180, 2002), PEGilación especifica de sitio y/o mono-PEGilación {véase por ejemplo, Chapman et ah, Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase por ejemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Los métodos y técnicas descritos en el campo pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG unidos a una sola molécula de proteína (véase por ejemplo, U.S. 2006/010.4968).
Como un método ejemplar ilustrativo para fabricar un polipéptido a polipéptido PH20 PEGilado, los PEG aldehidos, succinimidas y carbonatos se han aplicado cada uno a porciones de PEG conjugadas, típicamente succinimidil-PEGs , a rHuPH20. Por ejemplo, la rHuPH20 se ha conjugado con reactivos de succinimidil-monoPEG (mPEG) ejemplares incluyendo Propionatos de mPEG-Succinimidilo (mPEG-SPA) , Butanoatos mPEG-Succinimidilo (mPEG-SBA) , y (para unir los PEGs "ramificados") mPEG2-N-Hidroxilsuccinimida . Los ésteres succinimidilo PEGilados contienen diferente longitud de cadenas principales . de carbono entre el grupo PEG y el reticulador activado, y ya sea un grupo PEG individual o ramificado. Estas diferencias se pueden utilizar, por ejemplo, para proporcionar cinéticas de reacción diferentes y para restringir potencialmente los sitios disponibles para la unión de PEG a rHuPH20 durante el proceso de conjugación.
Los succinimidil-PEGs (como en lo anterior) que contienen ya sea PEGs lineales o ramificados se pueden conjugar a PH20. Los PEGs se pueden utilizar para generar PH20s que contienen reproduciblemente moléculas que tienen, en promedio, entre, aproximadamente tres a seis o tres a seis moléculas de PEG por hialuronidasa . Tales composiciones de rHuPH20 PEGiladas se pueden purificar fácilmente para producir composiciones que tienen actividades especificas de aproximadamente 25, 000 o 30·, 000 Unidad/mg de actividad de hialuronidasa de proteina, y están sustancialmente libres de PH20 no PEGilada (menor que 5% no PEGilada) .
Utilizando varios reactivos de PEG, versiones ejemplares de polipéptido PH20 PEGilado se pueden preparar, por ejemplo, utilizando mPEG-SBA (30 kD) , mPEG-SMB (30 kD) , y versiones ramificadas basadas en mPEG2-NHS (40 kD) y mPEG2-NHS (60 kD) . Las versiones PEGiladas de la PH20 se pueden generar utilizando químicas de NHS, asi como carbonatos, y aldehidos, utilizando cada uno de los siguientes reactivos: mPEG2-NHS-40K ramificado, mPEG-NHS-10K ramificado, mPEG-NHS-20K ramificado, mPEG2-NHS-60K ramificado; mPEG-SBA-5K, mPEG-SBA-20K, mPEG-SBA-30K; mPEG-SMB-20K, mPEG-SMB-30K; mPEG-butiraldehido; mPEG-SPA- 20K, mPEG-SPA-30K; y PEG-NHS-5K-biotina. La PH20 PEGigada también se puede preparar utilizando reactivos de PEG disponibles de Dowpharma, una división de Dow Chemical Corporation; incluyendo polipéptidos PH20 PEGilados con p-nitrofenil-carbonato PEG de Dowpharma (30 kDa) y con propionaldehido PEG (30 kDa) .
En un ejemplo, la PEGilación incluye la conjugación de mPEG-SBA, por ejemplo, mPEG-SBA-30K (que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa) y otro éster succinimidilico de un derivado de ácido butanoico PEG, a un polipéptido PH20. Los ésteres de succinímidilo de derivados de ácido butanoico PEG, tal como mPEG-SBA-30K se acoplan fácilmente a los grupos amino de las proteínas. Por ejemplo, la conjugación covalente de m-PEG-SBA-30K y rHuPH20 (que es aproximadamente 60 KDa en tamaño) proporciona ligaciones de amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra en el Esquema de Reacción 1, a continuación.
Esquema de Reacción 1 rHuPH20 PEGilada Típicamente, el mPEG-SBA-30K u otro PEG se agrega al polipéptido PH20 en una relación molar de PEG : polipéptido de 10:1 en una solución amortiguadora adecuada, por ejemplo, NaC1130 mM/HEPES 10 mM en pH 6.8 o solución amortiguadora de fosfato 70 mM, pH 7, seguido por esterilización, por ejemplo, filtración estéril, y conjugación continuada, por ejemplo, con agitación, durante la noche a 4°C en una habitación fría. En un ejemplo, la PEG-PH20 conjugada se concentra y se intercambia con solución amortiguadora.
Otros métodos para acoplar ásteres succinimidílicos de derivados de PEG ácido butanoico, tales como mPEG-SBA-30K son conocidos en la técnica {véase por ejemplo, U.S. 5, 672,662; U.S. 6,737,505; y U.S. 2004/0235734). Por ejemplo, un polipéptido, tal como un polipéptido PH20, se puede acoplar a un derivado de PEG activado con NHS por la reacción en una solución amortiguadora de borato (0.1 M, pH 8.0) durante una hora a 4°C. La proteína PEGilada resultante se puede purificar por ultrafiltración. Otro método hace reaccionar el polipéptido con mPEG-SBA en agua desionizada a la cual la trietilamina se agrega para elevar el pH a 7.2-9. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias horas para completar la PEGilación.
Los métodos para la PEGilación de los polipéptidos PH20, incluyen, por ejemplo, hialuronidasas derivadas de animales y enzimas degradadoras de hialuronano bacterianas, son conocidos por una persona de experiencia en la técnica. Véase, por ejemplo, Patente Europea No. EP 0400472, que describe la PEGilación de la hialuronidasa de testículos de bovino y condroitina-ABC-liasa . También, la Publicación de E.U.A. No. 2006014968 describe la PEGilación de una hialuronidasa humana derivada de PH'20 humana. Por ejemplo, la enzima degradadora de hialuronano PEGilada contiene generalmente por lo menos 3 porciones de PEG pr molécula. En algunos ejemplos, el polipéptido PH20 contiene tres a seis moléculas de PEG. En otros ejemplos, la enzima puede tener una relación molar de PEG a proteína entre 5:1 y 9: 1, por ejemplo, 7:1.
F. Composiciones Farmacéuticas y Formulaciones, Dosificaciones y Administración Las composiciones farmacéuticas de cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados se proporcionan en la presente para administración. Las composiciones farmacéuticamente aceptables se preparan en vista de aprobaciones por una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales y en humanos. Típicamente, los compuestos se formulan en composiciones farmacéuticas que utilizan técnicas y procedimientos bien conocidos en el campo (véase por ejemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Cuarta Edición, 1985, 126) .
En particular, se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas que son estables como una formulación líquida durante períodos prolongados de tiempo durante por lo menos 1 mes a temperaturas de o de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive o durante por lo menos 3 días en una temperatura de o de aproximadamente 30 °C a 42 °C, inclusive. Las composiciones farmacéuticas, en particular formulaciones líquidas, se pueden limitar por la estabilidad del agente activo que puede ser susceptible a efectos de condiciones de almacenamiento (tiempo o duración de almacenamiento, temperatura y/o agitación) y/o componentes de formulación contenidos en la composición. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas estables contienen generalmente un polipéptido PH20 modificado como se describe en la Sección C.l.b -que muestra estabilidad incrementada manifestada como una resistencia incrementada a una o más condiciones de desnaturalización de proteínas. Tales condiciones de desnaturalización de proteínas pueden incluir, pero no se limitan a, temperatura elevada mayor que o igual a o aproximadamente 30 °C, agitación, bajo contenido de sal o nada de sal, y presencia de excipientes. La estabilidad incrementada se caracteriza por el tiempo de almacenamiento mejorado, fragmentación disminuida, y/o formación de agregados disminuida, mientras que retiene aún la actividad del agente (s) activo, ' por ejemplo, la hialuronidasa PH20. Tales formulaciones se pueden proporcionar como formulaciones líquidas "listas para usar sin reconstitución adicional y/o sin ningún requisito para dilución adicional. En algunos ejemplos, las formulaciones también se pueden preparar en una forma liofilizada concentrada. Las concentraciones farmacéuticas que contienen un polipéptido PH20 modificado se pueden co-administrar con otro agente terapéutico. En tales ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados se pueden formular separadamente como una composición farmacéutica y administrar antes de, 'simultáneamente con, intermitentemente con, o subsecuentemente a una segunda composición que contiene un agente terapéutico activo. En otros ejemplos, los polipéptidos PH20 modificados se pueden co-formular con formulaciones farmacéuticas de otros agentes terapéuticos.
En particular, se proporcionan en la presente co-formulaciones que contiene un polipéptido PH20 modificado como se describe en la presente y un agente terapéutico que es un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente anti-inflamat.orio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida, un agente anti-parkinson, un agente anti-malaria, un agente anticonvulsivo, un agente anti-depresivo, un agente antiartritico, un agente anti-fúngico, un atente anti-hipertensivo, un agente antipirético, un agente anti-parásito, un agente anti-histamina , un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador de canal de calcio, un agente de fármaco cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestionante, un agente diurético, un agente depresor, un agente de diagnóstico, un agente de electrolito, un agente hipnótico, un agent de hormona, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agenta energizante físico, · un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizador, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente . anti-inflamatorio no esteroidal, un agente de inhibidor de enzimas de conversión a angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica o un inductor de sueño. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden co-formular con un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal, una Inmunoglobulina inmunitaria, un antibiótico, un bifosfonato, una citoquina, un agente quimioterapéutico , un factor de coagulación o una insulina. Agentes terapéuticos ejemplares que se pueden co-formular con un polipéptido PH20 modificado se describen en la Sección H. En particular, se proporcionan en la presente co-formulaciones que contienen un polipéptido PH20 modificado y una insulina, tal como una insulina de acción rápida, por ejemplo, una insulina regular o un análogo de insulina e acción rápida (que actúa rápido) . Las co-formulaciones proporcionadas en la presente incluyen co-formulaciones estables, mediante los cuales los agentes activos, es decir, el polipéptido PH20 modificado, y el agente terapéutico, muestran estabilidad incrementada y retiene la actividad durante períodos prolongados como se describe en la presente.
Las formulaciones que contienen PH20 proporcionadas en la presente, incluyendo las formulaciones separadas de las mismas y co-formulaciones , s.on estables durante períodos de tiempo prolongados, incluyendo en temperaturas variadas y bajo almacenamiento variado o condiciones de uso tal como agitación. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables y retienen la actividad del agente (s) activo (por ejemplo, hialuronidasa ??2?) en condiciones de "refrigerador", . por ejemplo, de 2°C a 8°C, tal como en o aproximadamente 4°C, durante por lo menos 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, por lo menos 8 meses, por lo menos 9 meses, por lo menos 10 meses, por lo menos 11 meses, por lo menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, 26 meses, 27 meses, 28 meses, 29 meses o 30 meses o más. En otro ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables y retienen la actividad del agente (s) activo (por ejemplo, hialuronidasa PH20) a temperatura ambiente por ejemplo de 18°C a 32°C, generalmente 20°C a 32°C, tal como 28°C a 32°C, durante por lo menos 2 semanas a 1 año, por ejemplo, por lo menos 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, por lo menos- 7 meses, por lo menos 8 meses, por lo menos 9 meses, o- por lo menos 1 año o más. En un ejemplo adicional, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables y retienen actividad del agente (s) activo (por ejemplo, Hialuronidasa PH20) a temperaturas elevadas de aproximadamente o mayor que 30 °C, generalmente de o de aproximadamente 30°C a 42°C, tal como 32°C a 37°C o 35°C a 37°C o aproximadamente o 37°C durante por lo menos 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 dias, 13 dias, 14 días, 15 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días, 50 días, 60 días o más.
Las composiciones pueden tomar las formas de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, y formulaciones de liberación sostenida. Una composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos . La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, y otros de tales agentes. Las formulaciones tópicas también se pueden contemplar. La formulación debe adaptarse al modo de administración. 1. Formulaciones - líquidos, inyectables, emulsiones La formulación se elabora generalmente para adaptarse a la vía de administración. La administración parenteral, generalmente caracterizada por inyección, infusión, ya sea subcutáneamente, intramuscularmente , intravenosamente o intradérmicamente se contemple en la presente. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados , listos para ser combinados con un solvente justo antes del uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos , suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser combinados con un vehículo justo antes del uso y emulsiones estériles.
Los inyectables se pueden preparar convencionales, ya sea como soluciones y suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Por ejemplo, las composiciones que contiene un polipéptido PH20 modificado, separadamente formulado o co-formulado con otro agente terapéutico, se pueden proporcionar como una preparación farmacéutica en forma líquida como una solución, jarabe y suspensión. En forma líquida, las preparaciones farmacéuticas se pueden proporcionar como una preparación concentrada que se diluye a una concentración terapéuticamente efectiva antes del uso. Generalmente, las preparaciones se proporcionan en una forma de dosificación que no requiere dilución para el uso. En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas se pueden presentar en forma liofilizada para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso.
Los inyectables se diseñan para administración local y sistémica. Para propósitos en la presente, la administración local se desea para administración directa al intersticio afectado. Las soluciones pueden ser ya sea acuosas o no acuosas. Si los portadores adecuados, intravenosamente administrados incluyen solución salina fisiológica o solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y las soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes , tales como glucosa, polietilenglicol , y propilenglicol y mezclas de los mismos .
La concentración del compuesto farmacéuticamente activa se ajusta de modo que una inyección o una infusión proporcionan una cantidad efectiva para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, peso y condición del paciente o animal como es conocido en la técnica. Las preparaciones parenterales. de dosis unitaria se pueden envasar en, por ejemplo, una ampolleta, un cartucho, un vial o una jeringa con una aguja. El volumen de la solución liquida o preparación de polvo reconstituida que contiene el compuesto farmacéuticamente activo, es una función de la enfermedad . que se trata y el articulo particular de fabricación elegido para el envasado. Todas las preparaciones para la administración parenteral deben ser estériles, como es conocido y practicado en la técnica. El porcentaje de compuesto activo contenido en tales composiciones parenterales es sumamente dependiente del carácter especifico del mismo, asi como la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores u otros excipientes. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas · proporcionadas en la presente pueden contener cualquiera de uno o más de un diluyente ( s ) , adyuvante ( s ) , antiadherente ( s ) , aglutinante ( s ) , recubrimiento (s) , rellenador (es) , sabor (es), color (es), lubricante ( s ) , mejorador (es) de flujo, conservador (es ) , detergente ( s ) , sorbente(s) o edulcorante (es) y una combinación de los mismos o vehículo con el cual se administra un polipéptido PH20 modificado. Por ejemplo, los portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en las preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, soluciones amortiguadoras, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsificantes, agentes secuestrantes o quelantes y otra sustancia farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones que incluyen preparaciones líquidas, se pueden preparar por medios convencionales con aditivos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración apropiada al paciente. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, y aceite de ajonjolí. El agua es un .portador típico cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Ejemplos de vehículos acuosos incluyen Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa Isotónica, Inyección de Agua Estéril, Inyección de Dextrosa y Ringer Lactada, Vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de algodón, aceite de maíz, aceite de ajonjolí y aceite de cacahuate. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen, pero no se limitan a, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropil-metilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsificantes incluyen, . pero no se limitan a, lecitina o acacia. Los detergentes incluyen, pero no se limitan a, Polisorbato 80 (TWEEN 80) . Los vehículos no acuosos incluyen, pero- no se limitan a, aceite de almendra, ésteres aceitosos o aceites vegetales fraccionados . Los agentes antimicrobianos o conservadores incluyen, pero no se limitan a, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico, m-cresol, fenol. Un diluyente incluye, pero no se limita a, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, o carboximetilcelulosa. Un lubricante incluye, pero no se limita a, estearato de magnesio, estearato de calcio o talco. Un aglutinante incluye, pero no se limita a, almidón, gomas naturales, tales como goma de acacia, gelatina, glucosa, molasas, polivinilpirrolidona, celulosas y derivados de los mismos, povidona, crospovidonas y otros de tales aglutinantes conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica. Los agentes isotónicos incluyen pero no se limitan a, cloruro de sodio y dextrosa. Las soluciones amortiguadoras incluyen, pero no se limitan a, fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaina. Un agente secuestrante o quelante de iones de metal incluyen EDTA. Otros excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, almidón, glucosa, lactosa, dextrosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propileno, glicol, solución salina, agua y etanol. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol. y propilenglicol para vehículos miscibles en agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico, o ácido láctico para el ajuste de pH. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes de humectación o emulsificantes , o agentes amortiguadores de pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, acetato de sodio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, estabilizantes, potenciadores de solubilidad, y otro de tales agentes tales como por ejemplo, acetato de sodio, fosfato de sodio, monolaurato de ' sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas .
En particular, Los agentes antimicrobianos (por ejemplo, conservadores) en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas (por ejemplo, una cantidad efectiva antimicrobiana) se pueden agregar a las preparaciones parenterales envasadas .en recipientes de dosis múltiples, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil y propil-p-hidroxibenzóico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de benzetonio.
El volumen de las formulaciones, incluyendo las formulaciones que contienen PH20 formuladas o co-formuladas separadamente proporcionadas en la presente, puede ser cualquier volumen adecuado para el recipiente en el que se proporcionan. En algunos ejemplos, las formulaciones se proporcionan en un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o un sistema de bucle cerrado, o cualquier otro recipiente adecuado. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente están entre o aproximadamente entre 0.1 mL a 500 mL, tal como 0.1 mL a 100 mL, 1 mL a 100 mL, 0.1 mL a 50 mL, tal como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 0.1 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL o más. a. Polvos Liofilizados De interés en la presente son los polvos liofilizados, que se pueden reconstituir para administración como soluciones, emulsiones y otras mezclas. También se pueden reconstituir y formular como sólidos o geles.
El polvo liofilizado, estéril se prepara al disolver un compuesto de enzima en una solución amortiguadora. La solución amortiguadora puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o solución reconstituida, preparada del polvo. La filtración estéril subsecuente de la solución seguido por la liofilización bajo condiciones estándares conocidas por aquellas personas de experiencia de experiencia en la técnica proporciona la formulación deseada. Una formulación liquida como se describe en la presente en lo anterior se puede preparar. La mezcla resultante se filtra o se tratar estéril para remover los materiales particulados y para asegurar la esterilizada, y se reparte en viales para liofilización . Por ejemplo, el polvo liofilizado se puede preparar al disolver un excipiente, tal como dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado, en una solución amortiguadora adecuada, tal como citrato, fosfato de sodio o potasio u otra de tal solución amortiguadora conocida por aquellas personas de experiencia en la técnica. Luego, se agrega una enzima seleccionada a la mezcla resultante, y se agita hasta que se disuelve.
Cada vial se fabrica para contener una dosificación individual o múltiples dosificaciones del compuesto. El polvo liofilizado se puede almacenar bajo condiciones apropiadas, tal como en aproximadamente 4°C a temperatura ambiente. La reconstitución de este polvo liofilizado con una solución amortiguadora apropiada proporciona una formulación para el uso en administración parente'ral. b. Formulaciones Ejemplares Las formulaciones de dosis individual de PH20 son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el recombinante HylenexMR (inyección humana de hialuronidasa) contiene, por mL, 8.5 mg de NaCl (145 m ) , 1.4 mg de fosfato de sodio dibásico (9.9 mM) , 1.0 mg de albúmina humana, 0.9 mg de edetato disódico (2.4 mM), 0.3 mg de CaCl2 (2.7 mM) y NaOH para ajustar el. pH a 7.4. Otras formulaciones de hialuronidasa soluble humana, tal como las formulaciones de rHuPH20 descritas en la Publicación de Patente de E.U.A. Pub. No. US2011/0053247, incluyen NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pll 7,0; o histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.0. Cualquiera de los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden formular similarmente .
Además de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido PH20 modificado y/u otro agente terapéutico, las composiciones farmacéuticas ejemplares proporcionadas en la presente, incluyendo formulaciones que contienen PH20 formulada y co-formulada separadamente, pueden contener una concentración de NaCl y se preparan en un pH requerido para mantener la estabilidad del agente (s) activo (por ejemplo, Hialuronidasa PH20 y/u otro agente terapéutico co-formulado) . Para formulaciones de dosis múltiples y otras formulaciones almacenadas durante un tiempo prolongado, las composiciones también contienen generalmente uno o más conservadores. Los agentes estabilizantes adicionales y otros excipientes también se pueden incluir. Los componentes ejemplares se describen a continuación. i. Sal (por ejemplo NaCl) En ejemplos en la presente, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente contiene una concentración de sal, tal como cloruro de sodio (NaCl), para mantener la estabilidad del agente (s) activo (por ejemplo, Hialuronidasa PH20) . La sal, tal como NaCl, se requiere generalmente para retener la estabilidad y actividad de PH20. Las concentraciones de sal bajas de generalmente menor que 120 mM pueden tener efectos perjudiciales en la actividad de PH20 a través del tiempo y dependen de las condiciones de temperatura. Por consiguiente, la ausencia de sal (por ejemplo NaCl) o una baja concentración de sal (por ejemplo NaCl) pueden dar por resultado la inestabilidad de la proteina. En algunos ejemplos en la presente, sin embargo, los polipéptidos PH20 modificados que muestran estabilidad incrementada en ausencia de bajo contenido de sal o nada de sal, tal como bajo contenido o nada de NaCl (véase por ejemplo, Sección C.l.b.iii), no son susceptibles a la desnaturalización. También, la presencia de sal (por ejemplo NaCl) puede tener diferentes efectos en otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, la solubilidad de la insulina y análogos de insulina tienden a incrementarse con concentración de sal más baja, por ejemplo, 140 m ) y las concentraciones de sal altas pueden dar por resultado cristalización/agregación de insulina, especialmente en temperaturas más bajas {véase por ejemplo, Solicitud Provisional de E.U.A. No. 61/520,962; Solicitud de E.U.A. Nos. De Serie 13/507,263 y 13/507,262; y Solicitud PCT Internacional No. PCT/US2012/042816) . De esta manera, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente se prepararon de acuerdo con los requisitos, del agente (s) activo. Si está dentro del nivel de una persona experta en la técnica- evaluar la estabilidad del agente (s) en la formulación y bajo varias ¦ condiciones de almacenamiento {véase por ejemplo, Sección G) . En ejemplos particulares en la presente, las composiciones farmacéuticas, incluyendo las formulaciones que contienen PH20 formuladas o co-formuladas separadamente proporcionadas en la presente, contienen NaCl en una concentración de entre o aproximadamente entre 10 mM a 200 mM, tal como 10 ' mM a 50 mM, 50 mM a 200 mM, 50 mM a 120 mM, 50 mM a 100 mM, 50 mM a 90 mM, 120 mM a 160 mM, 130 mM a 150 mM, 80 mM a 140 mM, 80 mM a 120 mM, 80 mM a 100 mM, 80 mM a 160 mM, 100 mM a 140 mM, 120 mM a 120 mM o 140 mM a 180 mM. ii . pH y Solución Amortiguadora En ejemplos en la presente, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente se preparar en un pH para mantener la estabilidad del agente (s) activo (por ejemplo, Hialuronidasa PH20) . Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente se preparan en un pH de entre o de aproximadamente entre 6.5 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 6.5 a 7.2, 7.0 a 7.8, 7.0 a 7.6 o 7.2 a 7. . La referencia a pH en la presente se basa en la medición de pH a temperatura ambiente. Se entiende que el pH puede cambiar durante el almacenamiento a través del tiempo, pero típicamente permanecerá entre o entre aproximadamente pH 6.5 a o a aproximadamente 7.8. Por ejemplo, el pH puede variar por ± 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 o más. Las co-formulaciones ejemplarse proporcionadas en la presente tienen un de o de aproximadamente 7.0 ± 0.2, 7.1 ± 0.2, 7.2 ± 0.2, 7.3 ± 0.2, 7.4 ± 0.2, 7.5 ± 0.2 o 7.6 ± 0.2 cuando se prepara. Si es necesario, el pH se puede ajustar utilizando agentes de acidificación para reducir el pH o agentes alcalinizantes para incrementar el pH. Los agentes de acidificación ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, solución de fosfato de sodio monobásica, y ácido fosfórico. Los agentes de alcalinización ejemplares incluyen, pero no se limitan a, solución de fosfato de sodio dibásico, carbonato de sodio o hidróxido de sodio.
Las composiciones se preparan generalmente utilizando un agente amortiguador que mantiene el intervalo de pH . Cualquier solución amortiguadora se puede utilizar en las formulaciones proporcionadas en la presente siempre y cuando no afecte adversamente la estabilidad del agente (s) activo (por ejemplo, Hialuronidasa PH20), y soporte el intervalo de pH requerido. Ejemplos de soluciones amortiguadoras particularmente adecuadas incluyen Tris, succinato, acetato, soluciones amortiguadoras de fosfato, citrato, aconitato, malato y carbonato. Aquellas personas de experiencia en la técnica, sin embargo, reconocerán que las formulaciones proporcionadas en la presente no se limitan a una solución amortiguadora particular, siempre y cuando la solución amortiguadora proporcione un grado aceptable de estabilidad de pH, o "capacidad amortiguadora" en el intervalo indicado.
Generalmente, una solución amortiguadora tiene una capacidad amortiguadora adecuada dentro de · aproximadamente 1 unidad de pH de su pK (Lachman y colaboradores en: The Theory and Practice of Industrial Pharmacy 3a Edn. (Lachman, L., Lieberman, HA. y Kanig, J.L., Eds . ) , Lea and Febiger, Philadelphia, p. 458-460, 1986) . La idoneidad amortiguadora se puede evaluar basado en las tabulaciones pK publicadas o se puede determinar empíricamente por métodos bien conocidos en la técnica. El pH de la solución se puede ajustar al punto final deseado con el intervalo como se describe en lo anterior, por ejemplo, utilizando cualquier ácido o base aceptable.
Las soluciones amortiguadoras que se pueden incluir en las co-formulaciones proporcionadas en la presente incluyen, pero no se limitan a, Tris (Trometamina ) , histidina, soluciones amortiguadoras de fosfato, tales como fosfato de sodio dibásico y soluciones amortiguadoras de citrato. Tales agentes amortiguadores pueden estar presentes en las co-formulaciones en concentraciones entre o aproximadamente entre 1 mM a 100 mM, tal como 10 mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM, tal como en o aproximadamente 30 mM. Por ejemplo, tales agentes amortiguadores pueden estar presentes en las co-formulaciones en una concentración de o aproximadamente 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5. mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 m , 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, o. más. iii . Conservador (es) En ejemplos en la presente, formulaciones de dosis múltiples o formulaciones almacenadas durante periodos prolongados contienen una cantidad anti-raicrobianamente efectiva de conservador o mezcla de conservadores en una cantidad que tiene un efecto bacteriostático o fungistático . En ejemplos particulares, los conservadores están presentes en una concentración suficiente para proporcionar los requisitos anti-microbianos de, por ejemplo, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) , incluyendo los requisitos anti-microbianos EP (EPA) y los requisitos anti-microbianos EP preferidos (EPB) (véase Tabla 4). Puesto que la presencia de conservadores, y en particular conservadores fenólicos, pueden tener efectos perjudiciales en estabilidad de la PH20, tales formulaciones contienen típicamente un polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada en presencia de conservadores, tal como cualquiera descrito en la Sección C.l.b.i en la presente. Generalmente, la cantidad mantiene la estabilidad del agente(s) activo (por ejemplo, hialuronidasa PH20).
Una cantidad efectiva antimicrobiana de conservadores una cantidad que muestra actividad anti-microbiana al exterminar o al inhibir la propagación de organismos microbianos en una muestra de la composición como se evalúa en una prueba de efectividad de conservador anti-microbiano (APET) . Una persona de experiencia en la técnica está familiarizada con la prueba de efectividad conservadora antimicrobiana y los estándares que se cumplen bajo USP y EPA o EPB a fin de cumplir con los requisitos mínimos. En general, la prueba de efectividad conservadora anti-microbiana implica estimular una composición con inóculos prescritos de microorganismos adecuados, es decir, bacterias, levaduras, y hongos, almacenar la preparación inoculada en una temperatura prescrita, retirar las muestras en intervalos especificados de tiempo y contar los organismos en las muestras {véase, Sutton y Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutical Science y Technology 56 ( ): 300-311; The United States Pharmacopeial Convention, Inc., (efectiva el 1 de enero de 2002), The United States Pharmacopeia 25th Revisión, Rockville, MD, Capítulo <51> Antimicrobial Effectiveness Testing; y European Pharmacopoeia, Capítulo 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservation) . Los •microorganismos utilizados en la estimulación incluyen generalmente tres sepas de bacterias, particularmente E. coli (ATCC No. 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538), levadura {Candida albicans ATCC No. 10231) y hongo {Aspergillus niger ATCC No. 16404), todas de las cuales se agregan tal que la composición inoculada contiene 103 o 106 de unidades formadoras de colonia (cfu) de microorganismos por mL de composición. Las propiedades conservadoras de la composición se consideran adecuadas si, bajo las condiciones de la prueba, existe una falla significativa o ningún incremento, como es especificado' en la Tabla 3 en el número de microorganismos en la composición inoculada después de los tiempos y las temperaturas prescritas. Los criterios para la evaluación se proporcionan en términos de la reducción log en el número de microorganismos variables como es comparado con la muestra inicial o el punto de tiempo previo.
Ejemplos no limitantes de conservadores que se pueden incluir en las co-forraulaciones proporcionadas en la presente, incluyen,, pero no se limitan a, fenol, meta-cresol (m-cresol), metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, -cloro-l-butanol , diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina , EDTA, bronopol (2-bromo-2-nitropropan-1 , 3-diol ) , acetato fenilmercúrico, glicerol (glicerina) , imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, orto-cresol (o-cresol) , para-cresol (p-cresol), clorocresol, cetrimida, cloruro de bencetonio, etilparabeno, propilparabeno o butilparabeno o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener un solo conservador, las formulaciones contienen por lo menos dos conservadores diferentes o por lo menos tres conservadores diferentes. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener dos conservadores tales L-fenilalanina y m-cresol, L-fenilalanina y metilparabeno, L-fenilalanina y fenol, m-cresol y metilparabeno, fenol metilparabeno, m-cresol y fenol u otras combinaciones similares. En un ejemplo,, el conservador en la formulación contiene por lo menos un conservador fenólico. Por ejemplo, la formulación contiene fenol, m-cresol o fenol y m-cresol.
En la formulaciones proporcionadas en la presente, la cantidad total del uno o más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo, entre de o aproximadamente entre de 0.1% a 0.4%, tal como 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3%, o 0.3% a 0.4%. Generalmente, las formulaciones contienen menor que 0.4% (p/v) de conservador. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo menos o aproximadamente por lo menos 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% 0.17%, 0.175%, 0.18%, 0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 0.35% pero menor que 0.4% de conservador total.
En algunos ejemplos, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen entre o entre aproximadamente 0.1% a 0.25% de fenol y entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.2% de m-cresol, tal como entre o aproximadamente entre 0.10% a 0.2% fenol y entre o aproximadamente entre 0.06% a 0.18% de m-cresol, o entre o aproximadamente entre 0.1% a 0.15% fenol y entre o aproximadamente entre 0.08% a 0.15% de m-cresol. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen aproximadamente 0.1% de fenol y 0.075% de m-cresol; 0.1% de fenol y 0.15% de m-cresol; 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol; 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol; 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol; 0.15% de fenol y 0.175% de m-cresol; o 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol. iv. Estabilizadores En ejemplos. en la presente, las composiciones farmacéuticas proporcionados en la presente pueden contener opcionalmente uno o más de otros agentes estabilizantes para mantener la estabilidad del agente (s) activo (por ejemplo, hialuronidasa PH20) . Incluidos entre los tipos de estabilizantes que se pueden contener en las formulaciones proporcionadas en la presente son los aminoácidos, derivados de aminoácidos, aminas, azucares, polioles, sales y soluciones amortiguadoras, tensoactivos y otros agentes. Las formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo menos un estabilizante. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más estabilizantes. Por consiguiente, cualquiera de uno o más un aminoácido, derivados de aminoácido, aminas, azucares, polioles, sales y soluciones amortiguadoras, tensoactivos y otros agentes se pueden incluir en las formulaciones en la presente. Generalmente, las formulaciones en la presente contienen por lo menos un tensoactivo y una solución amortiguadora apropiada. Opcionalmente, las formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener otros estabilizantes adicionales. Otros componentes incluyen, por ejemplo, uno o más modificadores de tonicidad, uno o más agentes anti-oxidación, u otro estabilizante.
Los estabilizantes de aminoácidos ejemplares, derivados de aminoácidos o aminas incluyen, pero no se limitan a, L-Arginina, Glutamina, Glicina, Lisina, Metionina, Prolina, Lys-Lys, Gly- Gly, óxido de Trimetilamina (TMAO) o betaina. Azucares y polioles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, glicerol, sorbitol, manitol, inositol, sacarosa o trehalosa. Sales ejemplares y soluciones amortiguadoras incluyen, pero no se limitan a, cloruro de magnesio, sulfato la presente contienen poloxámero 188, polisorbato 20, polisorbato 80, generalmente poloxámero 188 (pluronic F68) . Las formulaciones proporcionadas en la presente contienen generalmente por lo menos un tensoactivo, tal como 1, 2 o 3 tensoactivos .
En las formulaciones proporcionadas en la presente, la cantidad total de uno o más . tensoact i vos como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo, entre de o entre aproximadamente de 0.005% a 1.0%, tal como entre de o entre aproximadamente de 0.01% a 0.5%, tal como 0.01% a 0.1% o 0.01% a 0.02%. Generalmente, las formulaciones contienen por lo menos 0.01% y contienen menor que 1.0%, tal como menor que 0.5% o menor que 0.1% de tensoactivo. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener en o aproximadamente 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%·, 0.065%, 0.07%, 0.08%, o 0.09% de tensoactivo. En ejemplos particulares, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen o contienen aproximadamente 0.01%. a o a aproximadamente 0.05% de tensoactivo.
Los modificadores de tonicidad se pueden incluir en la formulación proporcionada en la presente para producir una solución con la osmolalidad deseada. Las formulaciones proporcionadas en la presente tienen una osmolalidad de entre o aproximadamente entre 245 mOsm/kg a 305 mOsm/kg. Por ejemplo, la osmolalidad es o es de aproximadamente 245 mOsm/kg, 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 265 mOsm/kg, 270 mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285 mOsm/kg, 290 mOsm/kg, 295 mOsm/kg, 300 mOsm/kg o 305 mOsm/kg. En algunos ejemplos, las formulaciones tienen una osmolalidad de o de aproximadamente 275 mOsm/kg. Los modificadores de tonicidad incluyen, pero no se limitan .a, glicerina, NaCl, aminoácidos, polialcoholes , trehalosa, y otras sales y/o azucares. La cantidad particular se puede determinar empíricamente a fin de retener la actividad enzimática y/o tonicidad.
En otros casos, la glicerina (glicerol) se incluye en las formulaciones. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen típicamente menor que 60 mM de glicerina, tal como menor que 55 mM, menor que 50 mM, menor que 45 mM, menor que 40 mM, menor que 35 mM, menor que 30 mM, menor que 25 mM, menor que 20 mM, menor que 15 mM, 10 mM o menor. La cantidad de glicerina depende típicamente en la cantidad de¦. NaCl presente: mientras más NaCl está presente en la formulación, se requiere menos glicerina para lograr la osmolalidad u osmolaridad deseada. De esta manera, por ejemplo, en las formulaciones que contienen concentraciones de NaCl más altas, poco o nada de glicerina se necesita incluir en la formulación. En contraste, las formulaciones que contienen concentraciones de NaCl ligeramente menores, la glicerina se puede incluir. Por ejemplo, las formulaciones proporcionados en la presente pueden contener glicerina en una concentración de 40 mM a 60 mM, tal como menor que 50 mM, tal como 20 mM a 50 mM, por ejemplo en o aproximadamente 50 mM.
Las formulaciones proporcionadas en la presente también pueden contener antioxidantes para reducir o para prevenir la oxidación, en particular la oxidación del polipéptido PH20. Por ejemplo, la oxidación se puede llevar a cabo por altas concentraciones de tensoactivos u oligómeros de hialuronano. Antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cisteina, triptófano y metionina. En ejemplos particulares, el antioxidante es metionina. Las formulaciones proporcionadas en la presente pueden incluir un antioxidante en una concentración de entre o de aproximadamente entre 5 mM a o aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM. Por ejemplo, la metionina se puede proporcionar en las formulaciones en la presente en una concentración de entre o de . aproximadamente entre 5 mM a o aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM. Por ejemplo, un antioxidante, por ejemplo metionina, se puede incluir en una concentración que es o es aproximadamente 5 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 1 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. En algunos ejemplos, las formulaciones contienen 10 mM a 20 mM de metionina, tal como o aproximadamente 10 mM o 20 mM de metionina.
Las formulaciones proporcionadas en la presente también pueden contener un estabilizante de aminoácidos, que contribuye a la estabilidad de la preparación. El estabilizante puede ser un aminoácido no polar o básico. Aminoácidos no polares y básicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina y prolina. Por ejemplo, el estabilizante de aminoácido es glicina o prolina, típicamente glicina. El estabilizador puede ser un aminoácido individual o puede ser una combinación de 2 o más de tales aminoácidos. Los estabilizadores de aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales, análogos de aminoácidos, aminoácidos modificados o equivalentes de aminoácidos. Generalmente, el aminoácido es un L-aminoácido . Por ejemplo, cuando se utiliza prolina como el estabilizador, es generalmente L-prolina. También es posible utilizar equivalentes de aminoácidos, por ejemplo, análogos de prolina. La concentración de estabilizador de aminoácidos, por ejemplo glicina, incluida en la formulación, varía de 0.1 M a l M de aminoácido, típicamente de 0.1 M a 0.75 M, generalmente de 0.2 M a 0.5 M, por ejemplo, por lo menos en o aproximadamente 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.75 M o más de aminoácidos. El aminoácido, por ejemplo glicina, puede utilizar una fórmula de una sal farmacéuticamente aceptable, · tal como clorhidrato, bromhidrato, sulfato, acetato, etc. La pureza del aminoácido, por ejemplo glicina, debe ser por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 99.5% o más.
En ejemplos en la presente, si es necesario, los inhibidores de hialuronidasa se incluyen en una formulación para estabilizar la PH20, en particular para reducir los efectos de otra manera los agentes de desestabilización y condiciones, tales como, por ejemplo, bajo contenido de sal, pH alto, la presencia de conservadores y temperaturas elevadas presentes en la formulación. Tal componente no se requiere generalmente para composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido PH20 modificado como se proporciona en la presente que muestra estabilidad incrementada bajo tales condiciones. Cuando se proporciona, el inhibidor de hialuronidasa se proporciona por lo menos en su concentración de equilibrio. Una persona de experiencia en la técnica está familiarizada con varias clases de inhibidores de hialuronidasa (véase por ejemplo, Girish y colaboradores (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:2261-2288, y referencias citadas en la presente). Una persona de la experiencia en la técnica muestra o puede determinar por métodos estándares en la técnica la concentración de equilibrio de un inhibidor de hialuronidasa en una composición de reacción o estable en la presente.
Un inhibidor de hialuronidasa ejemplar para el uso en las composiciones en la presente es hialuronano (HA). El ácido hialurónico (HA, también conocido como hialuronano y hialuronato) el sustrato natural para la PH20. Él HA es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye ampliamente por todo los tejidos conjuntivos, epiteliales y neurales. Es un polímero de hasta 25, 0.00 unidades de disacáridos, compuestas por sí mismas de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina . El peso molecular del HA varia de aproximadamente 5 kDa a 200, 000 kDa. Cualquier tamaño de HA se puede utilizar en las composiciones como un estabilizador. En algunos ejemplos, él HA es un disacárido, compuesto de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina . En otros ejemplos, él HA es un oligosacárido, tal como un tetrasacárido, que contiene 2 unidades de disacárido de repetición, o alternativamente, él HA utilizado en las co-formulaciones proporcionadas en la presente puede contener múltiples unidades de disacáridos de repetición, tales como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, .15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más de unidades de disacáridos. En otro ejemplo, él HA utilizado en las formulaciones proporcionadas en la presente tiene un peso molecular que es de o de aproximadamente 5 kDa a o aproximadamente 5,000 kDa; de o aproximadamente 5 kDa a o aproximadamente 1,000 kDa; de o de aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 500 kDa; o de o de- aproximadamente 5 kDa a o a aproximadamente 200 kDa. Los oligosacáridos HA ejemplares .para el uso en las formulaciones en la presente tienen un peso molecular de o de aproximadamente 6.4 kDa, 74.0 kDa, o 234.4 kDa. Las formulaciones pueden contener 1 mg/mL a 20 mg/mL HA, 8 mg/mL a 12 mg/mL, tal como por lo menos o aproximadamente 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 .mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL o 20 mg/mL o más de HA. En algunos ejemplos, la relación molar de HA a PH20 en o es de aproximadamente 100,000:1, 95,000:1, 90, 000:1, 85, 000:1, 80, 000:1., 75, 000:1, 70,000:1, 65,000:1, 60,000:1, 55,000:1, .50,000:1, 45,000:1, 40,000:1, 35,000:1, 30,000:1, 25,000:1, 20,000:1, 15,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 1,000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, o 100:1 o menos.
En algunos ejemplos, un compuesto nicotinico se utiliza como un agente estabilizador. Los compuestos nicotinicos incluyen, pero no. se limitan a, nicotinamida, ácido nicotinico, niacina, niacinamida, vitamina B3 y/o sales de los mismos y/o cualquier combinación de los mismos. En aplicaciones particulares, el agente estabilizador puede incluir un compuesto nicotinico un aminoácido o aminoácidos (véase por ejemplo, Publicación Internacional No. WO2010149772 ) . Por ejemplo, el aminoácido puede ser arginina, ácido glutámico y/o sales de los mismos o combinaciones de los mismos. 2. Composiciones para las Otras Vías de Administración Dependiendo de. la afección tratada otras vías de administración, tales como aplicación tópica, parches transdérmicos , administración oral o rectal también se contemplan en la presente.
Por ejemplo, las formas de dosificación farmacéuticas para la administración rectal son supositorios rectales, cápsulas y comprimidos para el efecto sistémico. Los supositorios rectales incluyen cuerpos sólidos para la inserción en el recto que se fundé o ablanda en la temperatura corporal que libera uno o más ingredientes farmacológicamente o terapéuticamente activos. Las sustancias farmacéuticamente aceptables utilizadas en los supositorios rectales son bases o vehículos y agentes para elevar el punto de fusión. Ejemplos de base incluyen mantequilla de cacao (aceite de teobroma), glicerina-gelatina , carbocera (polioxietilenglicol ) y mezclas apropiadas de mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Las combinaciones de las diversas bases se "pueden utilizar. Los agentes para elevar el punto de fusión de los supositorios incluyen esperma de ballena y cera. Los supositorios rectales se pueden preparar ya sea por el método comprimido o por moldeo. El peso típico de un supositorio rectal es aproximadamente 2 a 3 gm. Los comprimidos y capsulas para la administración rectal se fabrican utilizando las mismas sustancias farmacéuticamente aceptable y por los mismos métodos como para las formulaciones para la administración oral. Las formulaciones adecuadas para la administración rectal se pueden proporcionar como supositorios de dosis unitaria. Estos se pueden preparar al mezclar el compuesto activo con uno o más portadores sólidos convencionales, por ejemplo, mantequilla de cacao, y luego conformar la mezcla resultante.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de por ejemplo, comprimidos o capsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptable tales como agentes de aglutinación (por ejemplo, almidón de maíz pre- gelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa) ; rellenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o f-osfato de hidrógeno de calcio) ; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio) ; agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio) . Los comprimidos se pueden recubrir por los métodos bien conocidos en la técnica.
Las formulaciones adecuadas para la administración bucal (sublingual) incluyen, por ejemplo, grajeas que contienen el compuesto activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; y pastillas que contienen el compuesto en una base inerte tal .como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.
Las mezclas tópicas se preparan como se describe para administración local y sistémica. Las mezclas resultantes pueden ser soluciones,, suspensiones, emulsiones y similares y se formulan como cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, rocíos, supositorios, vendajes, parches térmicos o cualquier otra de las formulaciones adecuadas para la administración tópica.
Los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos se . pueden formular como aerosoles para aplicación tópica, tal como por inhalación (por ejemplo, véase, Patentes de E.U.A. Nos. 4,044,126, 4,414,209, y 4,364,923, que describen aerosoles para la administración de un esferoide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmente asma). Estas formulaciones, para la administración al tracto respiratorio, pueden estar en la forma de un aerosol o solución para un nebulizador, o como un polvo micro fino para la insuflación, solo o en combinación con un portador .inerte tal como lactosa. En tal caso, las partículas de la formulación tendrán típicamente diámetros de menos que 50 mieras, o menor que 10 mieras.
Los compuestos se pueden formular para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica a la piel '. y las membranas mucosas, tal como en los ojos, en la forma de geles, cremas, y lociones y para aplicación a los ojos o para aplicación suboccipital o intraespinal . La administración tópica se contempla para administración transdérmica y también para la administración a los ojos o mucosa, o para terapias de inhalación. Las soluciones nasales del compuesto activo solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables también se pueden administrar.
Se proporcionan formulaciones adecuadas para administración transdérmica. Se pueden proporcionar en cualquier formato adecuado, tal como parches discretos adaptados para permanecer en .contacto íntimo con la epidermis entre el recipiente durante un período de tiempo prolongado. Tales parches contienen el compuesto activo en una solución acuosa opcionalmente amortiguada de, por ejemplo, una concentración de 0.1 a 0.2 M con respecto al compuesto activo. Las formulaciones adecuadas para la administración transdérmica también se pueden administrar por iontoforesis (véase, por ejemplo, Tyle, P, Pharmaceutical Research 3(6): 318-326 (1986)) y toman típicamente la forma de una solución acuosa opcionalmente amortiguada del compuesto activo.
Las composiciones farmacéuticas . también se pueden administrar mediante formulaciones de liberación controlada y/o dispositivos de administración (véase por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770;; 3,916,899; 4,008,719;; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 y 5, 733, 566) . 3. Dosificaciones y Administración Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden formular como composiciones farmacéuticas para administración de dosis individual o dosis múltiples. El polipéptido PH20 se incluye en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de los efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. La concentración terapéuticamente efectiva se puede determinar empíricamente al someter a prueba los polipéptidos en sistemas in vitro e in vivo conocidos tal como al utilizar los ensayos proporcionados en la presente o conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Taliani colaboradores (1996) Anal. Biochem. , 240: 60-67; Filocamo y colaboradores (1997) J Virology, 71: 1417- 1427; Sudo y colaboradores (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Bouffard y colaboradores (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi y colaboradores (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake y colaboradores (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler y colaboradores (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza y colaboradores (1995) J Gen . Virol, 76: 1729-1736; Takeshita y colaboradores (1997) Anal. Biochem., 247:242-246; véase también por ejemplo, Shimizu y colaboradores (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani y colaboradores (1996) J. Virola 70:7219-7223; Mizutani y colaboradores (1996) Biochem. Biophys. Res. Co mMun . , 227:822-826; Lu y colaboradores (1996) Proc. Nati. Acad. Sci (EUA) , 93: 1412-1417; Hahm y colaboradores, (1996) Virology, 226:318-326; Ito y colaboradores (1996) J. Gen. Virol, 77: 1043-1054; Mizutani y colaboradores (1995) Biochem. Biophys. Res. Co mMun., 212:906-911;' Cho y colaboradores (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 y luego, extrapolados de los mismos para dosificaciones para humanos.
La cantidad de una PH20 modificada que se puede administrar para el tratamiento de una enfermedad o afección se puede determinar por. técnicas clínicas estándares. Además, los ensayos in vitro y los modelos animales se pueden emplear para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimas. La dosificación . precisa que se puede determinar empíricamente, puede depender de la enzima particular, la vía de administración, el tipo de enfermedad que se trata y la seriedad de la enfermedad.' Por consiguiente, se entiende que la dosificación precisa y el tratamiento es una función de la enfermedad que se trata y se puede determinar empíricamente utilizando protocolos de prueba conocidos o por extrapolación de datos de prueba in vivo o in vitro. Cabe destacar que las concentraciones y valores de dosificación también pueden variar con la gravedad de la condición que se alivia. Se va a entender adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar a través del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración expuestos en la presente son ejemplares únicamente y no se proponen para limitar el alcance o uso de las composiciones y combinaciones que los contienen. Las composiciones se pueden administrar cada hora, diariamente, semanalmente , mensuaimente, anualmente o una vez. Generalmente, los regímenes de dosificación se eligen para evitar la toxicidad. Cabe destacar que el médico que atiende sabrá cómo y cuándo .terminar, interrumpir o ajustar la terapia para reducir la dosificación debido a la toxicidad, o disfunciones de la medula ósea, hígado o riñon u otro tejido. A la inversa, el médico que atiende también sabrá cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica no es adecuada (evitando los efectos secundarios tóxicos) .
Típicamente, una dosis terapéuticamente efectiva de una enzima PH20 modificada es en o aproximadamente 10 Unidades (U) a 500,000 Unidades, 100 Unidades a 100,000 Unidades, 500 Unidades a 50,000 Unidades, 1000 Unidades a 10,000 Unidades, 5000 Unidades a 7500 Unidades, 500.0 Unidades a 50, 000 Unidades, o 1,000 Unidades a 10,000 Unidades, generalmente 1,000 a 50,000 Unidades, en una solución o suspensión estabilizada o una forma liofilizada. Por ejemplo, un polipéptido PH20, se puede administrar en la dosis de por lo menos aproximadamente por lo menos o 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 Unidades, 5,000 U o más. Las formulaciones se pueden proporcionar en formas de dosis unitaria, tal como, pero no limitada a, ampolletas, jeringas, y comprimidos o cápsulas individualmente empaquetadas.
La enzima PH20 se puede administrar sola, o con otro agente (s) farmacológicamente efectivo o agente (s), terapéutico en un volumen total de 0.1-100 mL, 1-50 mL, 10-50 mL, 10-30 mL, 1-20 mL, o 1-10 mL, típicamente 10-50 mL . Típicamente, los volúmenes de inyecciones o infusiones de una composición que contiene PH20 son por lo menos o por lo menos aproximadamente 0.01 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL, 0.4 mL, 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL o más. Las formulaciones proporcionadas en la presente, contienen un polipéptido PH20 modificado en una cantidad entre o aproximadamente entre 30 Unidades/mL a 3000 U/mL, 300 U/mL a 2000 U/mL o 600 U/mL a 2000 U/mL o 600 U/mL a 1000 U/mL, tal que por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/mL, 2000 U/mL o 3000 U/mL. Por ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente contienen un PH20 que está en una cantidad que es por lo menos 100 U/mL a 1000 U/mL, por ejemplo por lo menos o. aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 600 U/mL.
El polipéptido PH20 se puede proporcionar como una solución en una cantidad que es por lo menos o aproximadamente o es 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 600 U/mL, 800 U/mL o 1000 U/mL, o se puede proporcionar en una . forma más concentrada, por ejemplo en una cantidad que es por lo menos o aproximadamente o es 2000 U/mL, 3000 Unidades/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 8000 U/mL, 10, 000 U/mL o 20, 000 U/mL para usar directamente o para dilución a la concentración efectiva antes del uso. Las composiciones del polipéptido PH20 se puede proporcionar como una formulación liquida o liofilizada.
Cuando la PH20 se co-formula con un agente terapéutico, las dosificaciones se pueden proporcionar como una relación de la cantidad de un polipéptido PH2Q la cantidad de agente terapéutico administrado. Por ejemplo, un polipéptido PH20 se puede administrar en una U de hialuronidasa/agente terapéutico U (1:1) a 50:1 o más, por ejemplo, en o aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, .13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25: 1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 o más.
Las formulaciones proporcionadas en la presente, incluyendo co-formulaciones y/o formulaciones estables, se pueden preparar para, administración de dosis individual, administración de dosis múltiples o administraciones de infusión continua. El implante de un sistema de liberación sostenida o liberación lenta, tal que un nivel constante de dosificación se mantenga (véase por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 3,710,795), también se contempla en la presente.
Por ejemplo, las formulaciones de los compuestos farmacéuticamente de manera terapéuticamente activos y derivados de los mismos se proporcionan para administración a humanos y animales en formas de dosificación unitarias o formas de múltiples dosificaciones. Por ejemplo, los compuestos se pueden formular como comprimidos, cápsulas, pastillas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, soluciones o suspensiones orales, o emulsiones de aceite en agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto (s) terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador farmacéutico requerido, vehículo o diluyente. Ejemplos de formas de dosificación unitarias incluyen ampolletas y jeringas y comprimidos o cápsulas individualmente empacadas. Las formas de dosificación unitarias se pueden administrar en fracciones o múltiples de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas empaquetadas en un recipiente individual que se administra en formas de dosis unitarias segregadas. Ejemplos de dosis múltiples incluyen viales, botellas de comprimidos o cápsulas o botellas de pintas o galones. Por consiguiente, la forma de dosis múltiple es un múltiple de dosis unitarias que no se segregan en el empaquetamiento. Generalmente, las formas de dosificación o composiciones que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0.005% a 100% con el resto constituido de portador no tóxico se pueden preparar.
Las composiciones proporcionadas en la presente se formulan típicamente para administración por vía subcutánea, aunque otras vías de administración se contemplan, tal como cualquier vía conocida por aquellas personas de experiencia en la técnica incluyendo administración intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, intradérmica , intralesional , inyección intraperitoneal, epidural, vaginal, rectal, local, ótica, administración transdérmica o cualquier vía de administración. Las formulaciones adecuadas para tales vías son conocidas por una persona de experiencia en la técnica. La administración puede ser local, tópica o sistémica dependiendo del sitio del tratamiento. La administración en un área en necesidad de tratamiento se puede lograr por, por ejemplo, pero no limitado a, infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con un aposito de heridas después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante. Las composiciones también se pueden administrar con otros agentes biológicamente activos, ya sea secueneialmente, intermitentemente, o en la' misma composición.
La vía más adecuada en cualquier caso dado depende de una variedad de factores, tal como la naturaleza de la enfermedad, la tolerancia del sujeto a una vía de administración particular, la gravedad de la enfermedad, y la composición particular que se utiliza. Típicamente, las composiciones proporcionadas en la presente se administran parenteralmente . En algunos ejemplos, se administran composiciones de polipéptidos PH20 modificados de modo que alcanzan el intersticio de la piel o tejidos, degradando de esta manera el espacio intersticial para la administración subsecuente de un agente terapéutico. De esta manera, en algunos ejemplos, la administración directa bajo la piel, tal como por métodos de administración subcutánea, se contempla. De esta manera, en un ejemplo, la administración local se puede lograr por inyección, tal como de una jeringa u otro artículo de fabricación que contiene un dispositivo de inyección tal como una aguja. En otro ejemplo, la administración local se puede lograr por infusión, que se puede facilitar por el uso de una bomba u otro dispositivo similar. Otros modos de administración también se contemplan. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados incluyen formas conjugadas con vida media incrementada tal como formas PEGiladas de los mismos, se pueden administrar intravenosamente. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en formas de dosificación apropiadas para cada via de administración.
Los métodos de administración se pueden emplear para disminuir la exposición, de polipéptidos PH20 modificados seleccionados a los procesos de degradación, tal como degradación proteolítida e intervención inmunológica a través de respuestas antigénicas e inmunogénicas . Ejemplos de tales métodos incluyen administración local en el sitio de tratamiento. La PEGilación de productos terapéuticos incrementa la resistencia a la proteólisis, incrementa la vida media en plasma, y disminuye la antigenicidad e inmunogenicidad . Ejemplos de metodologías de PEGilación se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Lu y Félix, Int. J. Peptide Protein Res., 43:. 127-138, 1994; Lu y Félix, Peptide Res., 6: 140-6, 1993; Félix y colaboradores, Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 199'5; Benhar y colaboradores, J. Biol. Chem. , 269: 13398-404, 1994; Brumeanu y colaboradores, J Immunol., 154: 3088-95, 1995; véase también, Caliceti y colaboradores (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (10) : 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). La PEGilación también se puede utilizar en la administración de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por ejemplo, la PEGilación de adenovirus puede incrementar la estabilidad y la transferencia génica (véase, por ejemplo, Cheng y colaboradores (2003). Pharm. Res. 20(9): 1444-51). * En varios otros sistemas de administración se conocen y se pueden utilizar para administrar los polipéptidos PH20 seleccionados, tales como no limitado a, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor, y administración de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos PH20 seleccionados tales como sistemas de administración de retrovirus.
Por consiguiente, en ciertas modalidades, los liposomas y/o nanoparticulas . también se pueden emplear con la administración de polipéptidos PH20 solubles. Los liposomas se forman de fosfolipidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (también llamadas vesículas multilamelares (MLVs) ) . Las MLVs tienen generalmente diámetros de 25 nm a 4 µ?t?. La sonicación de las MLVs da por resultado la formación de vesículas unilamelares más pequeñas (SUVs) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 angstroms que contienen una solución acuosa en el núcleo.
Los fosfolipidos pueden formar una variedad de estructuras diferentes a los liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la relación molar del lipido a agua. En relaciones bajas de lipido a agua, se forman liposomas. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, resistencia iónica y la presencia de los cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a las sustancias iónicas y polares, pero en temperaturas elevadas se someten a una transición de fase que altera notablemente su permeabilidad. La transición de fase implica un cambio de una estructura ordenada, estrechamente empacada, conocido como estado de gel, a una estructura menos ordenada, débilmente empacada, conocida como estado fluido. Esto se presente en una temperatura de transición de fase característica y da por resultado un incremento en la permeabilidad a iones, azucares y fármacos.
Los liposomas . interactúan con células a través de mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tal como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea por fuerzas hidrofóbicas o electrostáticas débiles no específicas, o por interacciones específicas con los componentes de la superficie celular; fusión con la membrana celular plasmática por inserción de la bicapa de lipidos de liposoma en la membrana plasmática,, con liberación simultánea de los contenidos liposomales en el citoplasma; y por transferencia de lipidos liposomas a membranas celulares o sub-celulares o viceversa sin ninguna asociación de los contenidos de liposomas. La variación de la formulación de los liposomas puede . alterar el mecanismo el cual es operativo, aunque más de uno puede operar al mismo tiempo. Las nanocápsula pueden atrapar generalmente compuestos en una forma estable y reproducible . Para evitar los efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular , tales partículas ultra finas (de tamaño aproximado de 0.1 ]im) se deben diseñar utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Las nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen con estos requisitos se contemplan para el uso en la presente, y tales partículas se pueden fabricar fácilmente. 4. Co-Formulación de PH20-Insulina Ejemplar Se proporcionan en las presentes co-formulaciones estables de una insulina de acción rápida, tal como un análogo de insulina de acción rápida (que actúa rápido) y un polipéptido PH20 modificado. Cualquiera de los po.lipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden incluir en una co-formulación con insulina, tal como cualquiera de las co-formulaciones descritas en las Solicitudes de E.U.A. Nos. de Serie 13/507,263 o 13/507,262 o en la Solicitud de PCT Internacional No. de Serie PCT/US2012/042816.
En particular, el polipéptidp PH20 modificado es un polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada bajo condiciones de desnaturalización, tal como cualquiera expuesto en las Secciones C.l.b. En particular, el polipéptido PH20 es 'un polipéptido PH20 modificado que muestra estabilidad incrementada a uno o más conservadores fenólicos, tal como cualquiera expuesto en la Sección C.l.b. i. Por ejemplo, el polipéptido PH20 es un polipéptido PH20 modificado que contiene un aminoácido el reemplazo de aminoácidos con P en una posición que corresponde a la posición 204 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, tal como F204P con referencia de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66. En otros ejemplos, el polipéptido PH20 es un polipéptido PH20 modificado que contiene un reemplazo de aminoácidos con R en una posición que corresponde a la posición 58 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, tal como V58R con referencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66.
La insulina de acción rápida puede ser una insulina regular o un análogo de insulina de acción rápida (que actúa rápido) . La insulina es un polipéptido que cuando se procesa se compone de 51 aminoácidos que contienen una cadena ? y B. Generalmente, la insulina contiene una cadena A de aproximadamente 21' aminoácidos y una cadena B de aproximadamente 30 aminoácidos. Las cadenas A y B se ligan por puentes de disulfuro. Las insulinas regulares ejemplares incluyen, por ejemplo, una insulina, humana (con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B- que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 863) o una insulina porcina (con una cadena A que tiene una 'secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO:864 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 864). Los análogos de insulina de acción rápida ejemplares son variantes de insulina que contienen una o más modificaciones de aminoácidos comparada con una insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 862 y 863 (cadenas A y B) . Por ejemplo, los análogos de insulina ejemplares son conocidos por una persona de experiencia en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, glulisina que tiene una cadena A expuesta en SEQ ID NO:862 y una cadena B que es una variante de SEQ ID NO:863 (cadena B; LysB3, GluB29) , HMR-1 153 que tiene una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que es una variante de SEQ ID NO: 863 (cadena B; LysB3, IleB28), insulina aspart que tiene una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que es una variante de SEQ ID NO: 863 (cadena B; AspB28) , e insulina lispro que tiene una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que es una variante SEQ ID NO:.863 (cadena B LysB28, ProB29) . En cada caso anterior, la nomenclatura de los análogos se basa en la descripción de la sustitución de aminoácidos en las posiciones especificas en- la cadena A o B de la insulina, numerado de la N-terminal de la cadena, en la cual el resto de la secuencia es aquella de la insulina humana natural. Ejemplares de tales formas análogas, se exponen en SEQ ID NOS: 862 (cadena A) y. que tiene una cadena B expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 865-867.
Las co-formulaciones son estables como formulaciones líquidas durante periodos de tiempo prolongados durante por lo menos 1 mes en temperaturas de o de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive, o por lo menos 3' días a una temperatura de o de aproximadamente 30°C a' 42°C, inclusive. Por ejemplo, las co-formulaciones son estables y retienen la activada de la hialuronidasa PH20 y la insulina en condiciones de "refrigerador", por ejemplo, de 2°C a 8°C, tal como en o aproximadamente 4°C, durante por lo menos 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, o 7 meses, por lo menos 8 meses, por lo menos 9 meses, por lo menos 10 meses, por lo menos 11 meses, por lo menos 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 24 meses, 25 meses, 26 meses, 27 meses, 28 meses, 29 meses o 30 meses o más. En otro ejemplo, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables y retienen la actividad de la hialuronidasa PH20 y la insulina a temperatura ambiente por ejemplo de 18 °C a 32 °C, generalmente de 20 °C a 32 °C, tal como de 28 °C a 32 °C, por al menos 2 semanas a 1 año, por ejemplo, por lo menos 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, por lo menos 7 meses, por lo menos 8 meses, por lo menos 9 meses, o por lo menos 1 año o. más. En un ejemplo adicional, las formulaciones proporcionadas en la presente son estables y retienen la actividad de la hialuronidasa PH20 y la insulina en temperaturas elevadas de aproximadamente o mayores que 30°C, generalmente de o de aproximadamente 30°C a 42°C, tal como 32°C a 37°C o 35°C a 37°C o aproximadamente 37°C durante por lo menos 4 dias, 5 dias, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 35 dias, 40 dias, 45 dias, 50 dias, 60 días o más.
Los ensayos para evaluar la estabilidad de los agentes activos son bien conocidos por una persona de experiencia en la técnica. La Sección G proporciona ensayos ejemplares para evaluar la estabilidad de la hialuronidasa PH20. La estabilidad de la insulina se puede evaluar utilizando métodos similares bien- conocidos por una persona de experiencia en la técnica. Por ejemplo, la estabilidad y solubilidad de la insulina se pueden evaluar por evaluación visual (por ejemplo, incluyendo cambios en el color, claridad, presencia de agregados o aglutinación o adhesión de material, o escarchado), clarificación ácida, microscopía óptica, cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) , bioensayos in vitro o in vivo y cromatografía de exclusión de tamaño de desnaturalización y no de desnaturalización (SEC) . Los bioensayos in vitro o in vivo para la actividad de la insulina incluyen, pero no se limitan a, un ensayo de ligación competitivo utilizando células que expresan receptores de insulina {por ejemplo, membranas celulares placentarias humanas) y una insulina radioetiquetada {véase por ejemplo, eiss y colaboradores, (2001) J. Biol. Chem. 276:40018-40024; Duttaroy y colaboradores, (2005) Diabetes 54:251-258); captación de glucosa estimulada por insulina (Louveau y colaboradores, (2004) J. Endocrin. 181 : 271-280, Duttaroy y colaboradores, (2005) Diabetes 54:251-258); ensayos para evaluar la producción de glucosa en presencia de insulina (Wang y colaboradores, (2000) J. Biochem. , 275: 14717-14721, Duttaroy y colaboradores, (2005) Diabetes 54:251-258); y estudios que utilizan modelos animales diabéticos y/o sanos (Atkinson y colaboradores, (1999) Nature Med. 5:601-604; Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY) ratones, Zucker diabetic fatty (ZDF) ratas y Gato-Katazaki (GK) rats (Cefalu (2006) ILAR Journal 47: 186-198) .
Ejemplos de tales formulaciones contienen 100 U/mL a 1000 U/mL de un polipéptido PH20 modificado, y en particular en o aproximadamente o por lo menos 600 U/mL; 10 U/mL a 1000 U/mL de una insulina de acción rápida, y en particular en o por lo menos aproximadamente 100 U/mL; NaCl en una concentración de entre o aproximadamente entre 80-140 mM; un pH de entre o aproximadamente entre 7.0 a 7.8; un agente amortiguador que mantiene el intervalo de pH entre o aproximadamente entre 7.0 a 7.8; 0.1% a 0.4% de conservador como una concentración de masa (p/v) . Opcionalmente , un agente estabilizador adicional se puede incluir. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen 1 mM a 100 mM de un agente amortiguador. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen 0.005% a 0.5% de tensoactivo. Co-formulaciones ejemplares proporcionadas en la presente también pueden contener menor que 60 mM de glicerina (glicerol) y 2 mM a o aproximadamente 50 mM de un antioxidante.
Las siguientes formulaciones estables son ejemplares solamente y proporcionan una plataforma de la cual se pueden hacer menores ajustes. Se entiende que cambios muy pequeños en las concentraciones de los diversos excipientes y otros componentes (por ejemplo, ± 15% de las concentraciones establecidas), o pequeños cambios en el pH, se pueden hacer mientras que retengan algo sino todo de la solubilidad y estabilidad de la insulina y la estabilidad de PH20. Cambios adicionales también se pueden hacer al agregar o remover excipientes. Por ejemplo, el. tipo de tensoactivo estabilizador se puede cambiar.
Por ejemplo, las co-formulaciones ejemplares en la presente contienen 100 U/mL a 1000 U/mL de un polipéptido PH20 modificado, y en particular por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 600 U/mL de un polipéptido PH20 modificado; 10 U/mL a 1000 U/mL de una insulina de acción rápida, y en particular por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 100 U/mL de una insulina de acción rápida; de o de aproximadamente 10 mM a o aproximadamente 50 mM de Tris (por ejemplo, de o de aproximadamente 20 mM a 40 -mM de Tris, tal como o aproximadamente 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM o 40 mM de Tris) ; de o de aproximadamente 80 mM a o aproximadamente 160 mM de NaCl (por ejemplo, en o aproximadamente 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM o 160 mM NaCl); de o aproximadamente 2 mM a o aproximadamente 50 mM de metionina (por ejemplo, en aproximadamente 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM de metionina) ; .de o de aproximadamente 0 mM a o aproximadamente 50 . mM de glicerina (por ejemplo, en o aproximadamente 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM de glicerina); de o de aproximadamente 0.005% a o aproximadamente 0.5% de poloxámero 188, tal como de 0.01% a 0.05% (por ejemplo, en o aproximadamente 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04% o 0.05% de poloxámero 188); de o aproximadamente 0.05% a o a aproximadamente 0.25% de fenol (por ejemplo, en o aproximadamente 0.1%, 0.12%, 0.125%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% o 0.17% de fenol); y de o de aproximadamente 0.05% a o a aproximadamente 0.4% de . m-cresol (por ejemplo, en o aproximadamente 0.075%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16% o 0.17% de m-cresol). Las formulaciones se preparan con un pH de o de aproximadamente 7.0 a o aproximadamente 7.6 (por ejemplo, en o aproximadamente pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 o 7.6). En ejemplos adicionales, el zinc se incluye en una concentración de o aproximadamente 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 ü, 0.02.2 mg/100 U o 0.024 mg/100 U de insulina.
En ejemplos particulares, la insulina de acción rápida es insulina asparto, insulina lispro o insulina glulisina. co-formulaciones ejemplares proporcionadas en la presente que contienen un polipéptido PH20. modificado e insulina lispro son aquellos que contienen de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 35 mM de Tris (por ejemplo, en o aproximadamente 30 mM de Tris) ; de o de aproximadamente 70 mM a o aproximadamente 100 mM de NaCl (por ejemplo, en o aproximadamente 80 . mM o 100 mM de NaCl) ; de o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM de metionina (por ejemplo, en o aproximadamente 10 mM o 20 mM de metionina) ; de o de aproximadamente 40 mM a o aproximadamente 60 mM de glicerina (por ejemplo, en o aproximadamente 50 mM de glicerina); de o de aproximadamente 0.005%) a o a aproximadamente 0.05% de poloxámero 188 (por ejemplo, en o aproximadamente 0.01% de poloxámero 188); de o de aproximadamente 0.017 mg de zinc/100 U de insulina a o aproximadamente 0.024 mg de zinc/100 U de insulina (por ejemplo, 0.017 mg de zinc/100 U de insulina, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U o 0.024 mg de zinc/100 U de insulina); de o de aproximadamente 0.08% a o aproximadamente 0.17% de fenol (por ejemplo, 0.1%, 0.125% o 0.13% de fenol); y de o de aproximadamente 0.07% a o aproximadamente 0.17% de m-cresol (por ejemplo, 0.075%, 0.08%, 0.13% o 0.15% de m-cresol) . Por ejemplo, las co-formulaciones pueden contener de o aproximadamente 0.1% de fenol y 0.015% de m-cresol; en o a aproximadamente 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o a aproximadamente 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o a aproximadamente 0.13% de ' fenol y 0.08% de m-cresol; o en o aproximadamente 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol . Tales formulaciones de insulina lispro y un polipéptido PH20 modificado se preparan con un pH de o aproximadamente 7.0 a o a aproximadamente 7.5 (típicamente un pH de o de aproximadamente pH 7.2 ) .
Co-formulaciones ejemplares proporcionadas en la presente que contienen un polipéptido PH20 modificado y una insulina aspart son aquellas que contiene de o aproximadamente 25 mM a o aproximadamente 35 mM de Tris (por ejemplo, en o a aproximadamente 30 mM de Tris) ; de o de aproximadamente 70 mM a o a aproximadamente 120 mM de NaCl (por ejemplo, en o a aproximadamente 80 mM o 100 mM de NaCl); de o de aproximadamente 2 mM a o a aproximadamente 30 mM de metionina, tal como 2 mM a 10 mM o 5 mM a 30 mM de metionina (por ejemplo, en o aproximadamente 5 mM, 10 mM o 20 mM de metionina); de o . de aproximadamente 0.005% a o a aproximadamente 0.05% de poloxámero 188 (por ejemplo, en o a aproximadamente 0.01% de poloxámero 188); de o de aproximadamente 0.08% a o aproximadamente 0.17% de fenol (por ejemplo, 0.1%, 0.125% o 0.13% de fenol); y de o de aproximadamente 0.07% a o aproximadamente 0.17% de m-cresol (por ejemplo, 0.075%, 0.08%, 0.13% o 0.15% de m-cresol). Por ejemplo, las co-formulaciones pueden contener en o a aproximadamente 0.1% de fenol y 0.015% de m-cresol; en o a aproximadamente 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o a aproximadamente 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o a aproximadamente 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol; o en o aproximadamente 0.17% de fenol y 0.13% de m-cresol. Tales formulaciones de insulina aspart y un polipéptido PH20 modificado se preparan con un pH de o aproximadamente 7.0 a o a aproximadamente 7.6 (típicamente un pH de o aproximadamente pH 7.4 o 7.3) .
Las formulaciones ejemplares adicionales proporcionadas en la presente que contienen un a polipéotido PH20 modificado e insulina aspart son aquellas que no contienen fenol. Tales formulaciones ejemplares contienen de o de aproximadamente 25 mM a o a aproximadamente 35 mM de Tris (por ejemplo, en o aproximadamente 30 mM de Tris); de o de aproximadamente 70 mM a o a aproximadamente 120 mM de NaCl (por ejemplo, en o aproximadamente 80 mM o 100 mM de NaCl) ; de o de aproximadamente 2 mM a o a aproximadamente 30 mM de metionina, tal como 2 mM a 10 mM o 5 mM a 30 mM de metionina (por ejemplo, en o aproximadamente 5 mM, 10 mM o 20 mM de metionina) ; de o de aproximadamente 0.005%) a o a aproximadamente 0.05% poloxámero 188 (por ejemplo, en o aproximadamente 0.01% de poloxámero 188) ; y de o de aproximadamente 0.07% a o a aproximadamente 0.4% de m-cresol, tal como de o de aproximadamente 0.2% a 0.4% de m-cresol (por ejemplo, 0.3%, 0.315%, 0.35%, 0.4% de m-cresol). Tales formulaciones de insulina aspart y un polipéptido PH20 modificado se preparan con un pH de o de aproximadamente 7.0 a o a aproximadamente 7.6 (típicamente un pH de o aproximadamente pH 7.4 o 7.3).
Las co-formulaciones ejemplares proporcionados en la presente que contienen un polipéptido PH20 modificado e insulina glicina son aquellos que contienen de o de aproximadamente 25 mM a o a aproximadamente 35 mM de Tris (por ejemplo, en o aproximadamente .30 mM de Tris); de o de aproximadamente 100 mM a o a aproximadamente 150 mM de NaCl (por ejemplo, en o aproximadamente 100 mM o 140 mM de NaCl) ; de o de aproximadamente 10 mM a o a aproximadamente 30 mM de metionina (por ejemplo, en o aproximadamente 10 mM o 20 mM de metionina) ; de o de aproximadamente 40 mM a o a aproximadamente 60 mM de glicerina (por ejemplo, en o aproximadamente 50 mM de glicerina); de o de aproximadamente 0.005% a o a aproximadamente 0.05% de poloxámero 188 (por ejemplo, en o aproximadamente 0.01% de poloxámero 188); de o de aproximadamente 0.08% a o a aproximadamente 0.17% de fenol (por ejemplo, 0.1%, 0..125% o 0.13% de fenol); y de o de aproximadamente 0.07% a o a aproximadamente 0.17% de m-cresol (por ejemplo, 0.075%, 0.08%, 0.13% o 0.15% de m-cresol). Por ejemplo, las co-formulaciones que contienen en o aproximadamente 0.1% de fenol y 0.015% de m-cresol; en o aproximadamente 0.125% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o aproximadamente 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol; en o aproximadamente 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol; o en o aproximadamente 0.17% de fenol ,y 0.13% de m-cresol. Tales formulaciones de insulina glicina y un polipéptido PH20 modificado se preparan . con un pH de o de aproximadamente 7.0 a o a aproximadamente 7.6 (típicamente un pH de o aproximadamente pH 7.4) . 5. Empaquetado, Artículos de Fabricación y Kits Los compuestos farmacéuticos de polipéptidos PH20 modificados, o ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, o derivados o variantes de los mismos se pueden empacar como artículos de fabricación que contienen material de empaquetado, una composición farmacéutica que es efectiva para tratar una enfermedad o trastorno, y una etiqueta que indica que la composición farmacéutica o molécula terapéutica se va a utilizar para tratar la enfermedad o trastorno. Las combinaciones de un polipéptido PH20 modificado seleccionado, o un derivado o variante del mismo y un agente terapéutico también se pueden empacar en un articulo de fabricación.
Los artículos de fabricación proporcionados en la presente contienen materiales de empaquetado. Los materiales de empaquetado para el uso en productos farmacéuticos de empaquetado son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica. Véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,323,907, 5,052,558 y 5,033,252, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad. Ejemplos de materiales de empaquetado farmacéuticos incluyen, pero no se limitan a, paquetes en láminas al vacío, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, botellas, y cualquier material de empaquetado adecuado para una formulación seleccionada y modo propuesto de administración y tratamiento. Los artículos de fabricación pueden incluir una aguja u otro dispositivo de inyección para facilitar la administración (por ejemplo, administración sub-epidérmica) para propósitos de inyección local. Se contempla un amplio arreglo de formulaciones de los compuestos y formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionados en la presente incluyendo un polipéptido PH20 modificado y un agente terapéutico, tal como una insulina de acción rápida, conocido por tratar una enfermedad o trastorno particular. La elección del paquete depende de la PH20 y/o agente terapéutico, y si tales composiciones se empacarán conjuntamente o separadamente. En un ejemplo, la PH20 se puede empacar como una mezcla con el agente terapéutico. En otro ejemplo, los componentes se pueden empacar como composiciones separadas.
Los polipéptidos PH20 modificados, agentes terapéuticos y/o artículos de fabricación de los mismos también se pueden proporcionar como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente y un artículo para la administración proporcionado como un artículo de fabricación. Por ejemplo, un polipéptido PH20 se puede suministrar con un dispositivo para administración, tal como una jeringa, un inhalador, una tasa de dosificación, un gotero, o un aplicador. Las composiciones se pueden contener en el artículo para la administración o se pueden proporcionar separadamente para hacer agregados después. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para la aplicación incluyendo dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para los modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente y un artículo para la diagnosis. Por ejemplo, tales kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o actividad de la proteasa seleccionada en un sujeto.
G. Métodos para evaluar la Actividad y Estabilidad de PH20 Los ensayos se pueden utilizar para evaluar la estabilidad y actividad de los polipéptidos PH20 proporcionados en la presente. Los ensayos se pueden utilizar para evaluar la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 bajo condiciones particulares, temperatura, y/o a través de tiempo. Tales ensayos se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar la estabilidad del polipéptido PH20 bajo condiciones de desnaturalización especificas, incluyendo, pero no limitado a, temperaturas elevadas mayores que o aproximadamente o 30°C (por ejemplo, 30°C a 42°C tal como o aproximadamente 37 °C), agitación, presencia de excipientes (por ejemplo, conservador) , o bajo contenido o nada de NaCl (sal) . Por ejemplo, la estabilidad bajo condiciones especificas se puede monitorear al evaluar la actividad, solubilidad y estabilidad (por ejemplo, formación de agregados, etc.) en la ausencia de exposición a la condición de desnaturalización y luego en varios puntos de tiempo después en la presencia de la condición. Por consiguiente, la estabilidad se puede evaluar a través del tiempo. La estabilidad también se puede evaluar al comparar cualquiera de uno o más de actividad, solubilidad y agregación en presencia de una o más condiciones de desnaturalización comparadas con un polipéptido PH20 nativo, de tipo natural o de referencia. Los ensayos también se pueden utilizar haciendo menores ajustes a las formulaciones proporcionadas en la presente mientras que retengan la estabilidad de ambos agentes activos. 1. Actividad de hialuronidasa La actividad de un polipéptido . PH20 modificado se puede evaluar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo USP XXII para la hialuronidasa determina la actividad indirectamente al medir la cantidad de ácido hialurónico degradado, o hialuronano, (HA) el sustrato que permanece después de la enzima se deja reaccionar con el HA durante 30 minutos a 37°C (USP XXTI-NF XVII (1990) 644-645 Farmacopea de los Estados Unidos Convention, Inc, Rockville, MD) . Una solución de Hialuronidasa Estándar de Referencia de Hialuronidasa (USP) o Formulario Nacional (NF) se puede utilizar en un ensayo para evaluar la actividad, en unidades, de cualquier hialuronidasa. En un ejemplo, la actividad se mide utilizando un ensayo de¦ microturbiedad . Esto se basa en la formación de un precipitado, insoluble cuando el ácido hialurónico se liga con un reactivo que lo precipita, tal como suero acidificado o cloruro de cetilpiridinio (CPC) . La actividad se mide al incubar la hialuronidasa con hialuronatos de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (por ejemplo, 10 minutos) y luego precipitar el hialuronato de sodio no digerido con la adición de suero acidificado o CPC. La turbiedad de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un periodo de desarrollo adicional. La disminución en la turbiedad que resulta de la actividad de hialuronidasa en el substrato de hialuronato de sodio es una medición de la actividad enzimática de hialuronidasa.
En otro ejemplo, actividad de hialuronidasa se mide utilizando un ensayo de microtitulación en el cual el ácido hialurónico biotinilado residual se mide después de la incubación con hialuronidasa (véase por ejemplo, Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251 : 263-269, Publicación de Patente de E.U.A. No. 20050260186). Los grupos carboxilo libres en los residuos de ácido glucurónico del ácido hialurónico se biotinilan, ni el substrato de ácido hialurónico biotinilado se acopla covalentemente a una placa de microtitulo. Después de la incubación con hialuronidasa, el substrato de ácido hialurónico biotinilado residual se detecta utilizando una reacción de avidina-peroxidasa, y se compara con aquel obtenido después de la reacción con estándares de hialuronidasa de actividad conocida.
Otros ensayos para medir la actividad de hialuronidasa también son conocidos en la técnica y se pueden utilizar en los métodos en la presente (véase por ejemplo, Delpech y colaboradores, (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi y colaboradores, (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
Muchos ensayos de hialuronidasa se han basado en la medición de la generación de nuevos grupos N-acetilamino reductores (Bonnery Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966) , o pérdida de viscosidad (De Salegui y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys .121 : 548-554 , 1967) o turbiedad (Dorfman y Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948). Con los sustratos purificados todos estos métodos son suficientes para la determinación de la presencia o ausencia de la actividad de endoglicosidasa.
Los sustratos de glicosaminoglicano sustancialmente purificados también se pueden utilizar en un Ensayo de Desplazamiento de Gel. Los glicosaminoglicanos se mezclan con PH20 recombinante, tal como una PH20 soluble, para someter a prueba la actividad de endoglicosidasa que da por resultado un cambio en la movilidad del substrato dentro del gel. Ejemplos de tales substratos incluyen, pero no se limitan a, condroitina-4 y 6-sulfato, dermatán-sulfato, heparan-sulfato, que se pueden obtener de Sigma Chemical. El hialuronano de cordón umbilical humano se puede obtener de ICN. Por ejemplo, cada substrato de prueba se puede diluir a en o aproximadamente 0,1 mg/mL en una solución amortiguadora que varia de pH 3.5-7.5. En tal ensayo ejemplar, en o aproximadamente 10 µ? de muestras de PH20 soluble purificada o medio acondicionado de .células que expresan PH20 se pueden mezclar con en o aproximadamente 90 µ? de substrato de prueba en la solución amortiguadora deseada y se incuba durante 3 horas a 37°C. Después de la incubación, las muestras se neutralizan con la solución amortiguadora de muestra (Tris EDTA pH 8.0, Azul Bromofenol y glicerol) seguido por electroforesis . Los glicosaminoglicanos se pueden detectar utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, los glicosaminoglicanos se. pueden detectar al teñir los geles utilizando 0.5% de Azul Alcian en 3% de Ácido Acético Glacial durante la noche seguido por el desmanchado en Ácido Acético Glacial al 7%. La degradación se determina por comparación de la movilidad del substrato en presencia y ausencia de enzimas.
La actividad de hialuronidasa también se puede detectar por zimografía dé gel de substrato (Guentenhoner y colaboradores (1992) Matríx 12:388-396). En este ensayo, una muestra se aplica a un gel SDS-PAGE que contiene ácido hialurónico y las proteínas en la muestra separadas por electroforesis . El gel luego se incuba en una solución amortiguadora de ensayo de enzimas y se tiñe subsecuentemente para detectar el ácido hialurónico en el gel. La actividad de hialuronidasa se visualiza como una zona transparente en el gel de substrato.
La capacidad de un' polipéptido PH20, incluyendo un polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente, para actuar como agente de propagación y difusión también se puede evaluar. Por ejemplo, el tinte de azul de tripán se puede inyectar subcutáneamente con o sin un polipéptido PH20 en la piel lateral en cada lado de ratones desnudos. El área teñida luego se mide, tal como con un microcalibrador , para determinar la capacidad del polipéptido PH20 para actuar como un agente de propagación (Publicación de Patente de E.U.A. No. 20060104968) .
La actividad funcional de un polipéptido PH20 se puede comparar y/o normalizar a un estándar de referencia utilizando cualquiera de estos ensayos. Esto se puede hacer para determinar que sea una cantidad funcionalmente equivalente en un polipéptido PH20. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido PH20 para actuar como un agente de propagación o difusión se puede evaluar al inyectarlo en la piel lateral de ratones con azul tripán, y se determina la cantidad requerida para lograr la misma cantidad de difusión, como por ejemplo 100 unidades de Estándar de Referencia de Hialuronidasa. La cantidad de polipéptido PH20 requerida es, por lo tanto, funcionalmente equivalente a 100 unidades de hialuronidasa . 2. Solubilidad La solubilidad de un polipéptido PH20 se puede determinar por cualquier método conocido por una persona de experiencia en la técnica. Un método para determinar la solubilidad es el particionamiento de detergente. Por ejemplo, un polipéptido PH20 soluble se puede distinguir, por ejemplo, por su particionamiento en la fase acuosa de una solución de TritonMr X-114 a 37 °C (Bordier y colaboradores, (1981) J. Biol. Chem , 256: 1604-1607). Los polipéptidos anclados a membrana, tales como hialuronidasas ancladas a lipidos, incluyendo hialuronidasas ancladas a GPI, se particionarán en la fase rica en detergente, pero se particionarán en la fase deficiente de detergente o acuosa. Después del tratamiento con fosfolipasa C. La fosfolipasa C es una enzima que escinde la ligación de fosfoglicerol encontrada en las proteínas ancladas a GPI. El tratamiento con PLC provocará la liberación de las proteínas ligadas a GPI de la membrana celular exterior. 3. Pureza, Cristalización o Agregación La estabilidad de un polipéptido PH20 proporcionado en la presente también se puede evaluar utilizando otros métodos y ensayos conocidos en la técnica. Además de evaluar la estabilidad basada en actividad de hialuronidasa, la estabilidad se puede evaluar por inspección visual, porcentaje de recuperación, pureza de proteina y temperatura de fusión evidente.
Por ejemplo, la pureza de proteina se puede medir por la cromatografía liquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) . La pureza de proteina, como se determina por RP-HPLC, es el porcentaje del pico de .proteina de PH20 principal presente como es comparada con todas las especies de proteínas principal presente como es comparada con todas las especies de proteínas presentes. De esta manera, la RP-HPLC, y métodos similares conocidos por una persona de experiencia en la técnica, pueden evaluar la evaluación de la enzima. La pureza de la proteína se puede evaluar a través del tiempo. La pureza de la proteína también se puede evaluar en presencia de una o más condiciones de desnaturalización y en cantidades variantes de la misma. El porcentaje de recuperación también se puede determinar como el porcentaje relativo del polipéptido bajo varias condiciones (condiciones de desnaturalización, tiempo de almacenamiento, modo de almacenamiento tal como vasija o recipiente, u otros parámetros similares que se pueden alterar) como es comparado con una muestra de referencia. La estabilidad del polipéptido PH20 también se puede determinar al medir la oxidación de la hialuronidasa por RP-HPLC. El porcentaje de oxidación es una medición de la suma de las áreas pico de los picos mayores (ox-1) y menores (ox-2) .
En un ejemplo, la temperatura de fusión de un polipéptido PH20, tal que a polipéptido PH20 modificado se puede determinar al medir el radio hidrodinámico de las partículas por la dispersión de luz dinámica bajo varias condiciones (por ejemplo, condiciones de desnaturalización u otras condiciones de almacenamiento) . Un incremento en el tamaño de partícula y una disminución en la temperatura de fusión indican la desnaturalización y agregación subsecuente de la hialuronidasa.
Otros métodos conocidos por una persona de experiencia en la técnica se pueden utilizar para determinar la estabilidad de la hialuronidasa en las co-formulaciones proporcionadas en la presente, incluyendo electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) , inmunotinción, espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) , espectroscopia de masas, dicroísmo circular, y ensayos de fluorescencia basados en tinte (CD) . · 4. Farmacodinámica/Farmacocinética El efecto de la administración de un polipéptido PH20, tal como un polipéptido PH20 modificado, o en combinación con otros agente terapéutico, en las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de cualquier agente administrado también se pueden evaluar in vivo utilizando modelos animales y/o sujetos humanos, tal como en la instalación de un ensayo clínico. Los estudios farmacocinéticos o farmacodinámicos se pueden llevar a cabo utilizando modelos animales o se pueden llevar a cabo durante los estudios con pacientes administrados con un polipéptido PH20 o polipéptido PH20 modificado .
Los modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, perros, conejillos de indias y modelos de primates no humanos, tales como monos cynomolgus o macacos rhesus. En algunos casos, en algunos casos, los estudios farmacocinéticos o farmacodinámicos se lleva a cabo utilizando animales sanos. En otros ejemplos, los estudios se lleva a cabo utilizando modelos animales de una enfermedad por la cual la terapia con hxaluronano se considera, tal como modelos animales de cualquier enfermedad o trastorno asociado con hialuronano, por ejemplo un modelo de tumor.
Las propiedades farmacocinéticas de un polipéptido PH20, tal que a polipéptido PH20 modificado, se puede evaluar al medir tales parámetros como ' la concentración máxima (pico) (Cmax) el tiempo pico (es decir, cuando la concentración máxima se presente; Tmax) la concentración mínima (es decir, la concentración mínima entre dosis; Cmin) , la vida media de eliminación (T1/2) y el área bajo la curva (es decir, el área bajo la curva generada por el tiempo de trazado versus concentración; AUC), después de la administración. La biodisponibilidad absoluta de la hialuronidasa se puede determinar al comparar el área bajo la curva de hialuronidasa después de la administración subcutánea (AUCsc) con la AUC de la hialuronidasa después de la administración intravenosa (AUCiv) . La biodisponibilidad absoluta (F), se puede calcular utilizando la fórmula: F = ([AUC]SC x dosissc) / ([AUC]iv x dosisiv) . Un- intervalo de dosis y frecuencia de dosificación diferente de dosificación se pueden administrar en los estudios farmacocinéticos para evaluar el efecto de las concentraciones de incremento o disminución de la enzima, tal como el polipéptido PH20 modificado, en la dosis.
H. Métodos de Tratamiento y Terapia de Combinación Se proporcionan en ' la presente métodos y usos de cualquiera del polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente que muestran actividad de hialuronidasa basada en su capacidad para degradar el glicosaminoglicano ( s ) tal como hialuronano. Debido a tal actividad, los polipéptidos PH20 modificados, se pueden utilizar como un factor de propagación para incrementar el suministro y/o disponibilidad de los agentes terapéuticos subcutáneamente suministrados. La administración de cualquier agente terapéutico, incluyendo pero no limitado a, péptidas, proteínas, fármacos de moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, o virus se pueden utilizar o mejorar por la coadministración con un polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados se pueden evaluar para incrementar la administración de agentes terapéuticos tales como anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales ) , citoquinas, Globulina inmunitaria, una Insulina, o factores de coagulación, a un sitio deseado, tal como al incrementar la penetración de los agentes quimioterapéuticos en los tumores sólidos. Los polipéptidos PH20 modificados también se pueden utilizar para tratar una enfermedad o trastorno por hialuronano que se caracteriza por un exceso o acumulación de hialuronano. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la. presente se pueden utilizar para tratar un tumor; para tratar la acumulación de glicosaminoglicanos en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular; para tratar un trastorno oftálmico; .para tratar una enfermedad pulmonar; para tratar celulitis; y/o para tratar un trastorno proliferativo .
Otros métodos y usos de un polipéptido PH20 modificado incluyen cualquiera que sea conocido por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, varias formas de Hialuronidasas PH20 se han preparado y aprobado para uso terapéutico en humanos. Por ejemplo, las preparaciones de hialuronidasa derivadas en animales incluyen VitraséMR (ISTA Pharmaceuticals ) , una hialuronidasa testicular de ovino purificada, y AmphadaseMR (Amphastar Pharmaceuticals ) , una hialuronidasa testicular bovina. Hylenex® (Halozyme Therapeutics) es una hialuronidasa recombinante humana producida por células de Ovario de Hámster Chino (CHO) genéticamente diseñadas que contienen ácido nucleico que codifica la rHuPH20 soluble (véase por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 7,767,429). Los usos · terapéuticos aprobados para las hialuronidasas incluyen el uso como un adyuvante para incrementar la absorción y dispersión de otros agentes terapéuticos para la hipodermoclisis (administración de fluido subcutánea), y como un adjunto en la urografia subcutánea para mejorar la resorción de los agentes radio-opacos. Además de estas indicaciones, las hialuronidasas se pueden utilizar como un agente terapéutico cosmético para el tratamiento de enfermedades y condiciones adicionales. Por ejemplo, la hialuronidasa se utiliza comúnmente, por ejemplo, para el bloque peribulbar en la anestesia local antes de la cirugía oftálmica. La presencia de la enzima evita la necesidad de bloques adicionales y reduce el tiempo al inicio de la aquinesia (pérdida del movimiento del ojo) . El bloque peribulbar y el sub-bloque de Tenon son las aplicaciones más comunes de hialuronidasa para procedimientos oftálmicos. La hialuronidasa también puede promover la aquinesia en la cirugía cosmética, tal como blefaroplastias y levantamientos faciales. Se entiende que las Hialuronidasas PH20 solubles proporcionadas en la presente, incluyendo Hialuronidasas esPH20, se pueden utilizar en cualquier método de tratamiento o terapia de combinación por el cual se utiliza una Hialuronidasa PH20 {véase por ejemplo, Publicaciones de E.U.A. Nos. US20040268425; US20050260186; US2006010 968 ; y Solicitud de E.U.A. Nos. de Serie 12/381,844, publicada como Publicación de E.U.A. No. US20100074885 ; 12/386,249, publicada como Publicación de ¦ E.U.A. No. US20090311237 ; 12/387,225, publicada como Publicación de E.U.A. No. US20090304665; y 12/386,222, publicada como Publicación de E.U.A. No. US2010003238, cada una incorporada a manera de referencia en su totalidad) .
Métodos ejemplares, no limitantes y usos se describen en las siguientes subsecciones . 1. Métodos para Administrar Agentes Terapéuticos Como se indica en lo anterior, la hialuronidasa es una sustancia de propagación o difusión que modifica la permeabilidad del tejido conjuntivo a través de la hidrólisis de ácido hialurónico, un polisacárido encontrado en la sustancia fundamental intercelular del tejido conjuntivo, y de ciertos tejidos especializados, tal como el cordón umbilical y el humor vitreo. Cuando no está presente un factor de propagación, los materiales inyectados subcutáneamente tales como fármacos, proteínas, péptidos y ácido nucleico se propagan muy lentamente. La co-inyección con hialuronidasa, sin embargo, puede provocar propagación rápida. La velocidad de difusión es proporcionar la cantidad de enzimas, y el grado de difusión es proporcionar al volumen de solución. ' Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden utilizar para promover o potenciar los agentes de suministro y las moléculas a. cualquiera de una variedad de tejidos de mamífero in vivo. Se pueden utilizar para facilitar la difusión y, por lo tanto, promover la administración, de los agentes farmacológicos de moléculas pequeñas así como agentes farmacológicos de moléculas más grandes, tales como proteínas, ácidos nucleicos y ácidos ribonucleicos, y composiciones macromoleculares que pueden contener una combinación de componentes incluyendo, pero no limitado a, ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, lípidos, moléculas basadas en lípidos y fármacos (véase por ejemplo, Publicaciones de E.U.A. Nos. US20040268425 ; US20050260186; y US20060104968 ) . Los polipéptidos PH20 modificados se puede co-administrar y/o co-formular con un agente terapéutico para mejorar la biodisponibilidad asi como las características farmacocinéticas (PK) y/o farmacodinámicas (PD) de los agentes co-formulados o coadministrados. Los parámetros PK/PD que se pueden mejorar al utilizar PH20, tal como esPH20, incluyen tales medidas como Cmax (la concentración máxima de agente lograda después de la absorción en, por ejemplo, el torrente, sanguíneo), Tmax (el tiempo requerido para lograr la concentración máxima) , 1/2 (el tiempo requerido para la concentración encontrada a la mitad), Cmin (la concentración mínima del agente después del metabolismo y excreción) , AUC (área bajo la curva de concentración versus tiempo, una medición de la cantidad total de la biodisponibilidad) , concentraciones en varios tejidos de interés (incluyendo, por ejemplo, la velocidad para lograr concentraciones deseadas, los niveles totales, la duración para mantener los niveles deseados), Emax (el efecto máximo logrado) .
Los métodos de tratamiento proporcionados en la presente incluyen terapias de combinación con un agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o trastorno por el cual pone en peligro el agente terapéutico. Cualquier agente terapéutico que mejora y de otra manera reduce la gravedad de una enfermedad o afección se puede combinar con un polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente a fin de incrementar la biodisponibilidad de tal agente terapéutico. En particular, los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden utilizar en cada una y todas las combinaciones descritas en las solicitudes véase por ejemplo, Publicación de E.U.A. Nos. US20040268425; US20050260186; US20060104968 y Solicitud de E.U.A. Nos. de Serie 12/381,844, publicada como Publicación de E.U.A. No. US20100074885; 12/386,249, publicada como Publicación de E.U.A. No. US20090311237; . 12/387,225, publicada como Publicación de E.U.A. No. US20090304665; y 12/386,222, publicada como Publicación de E.U.A. No. US2010003238 en lugar de la hialuronidasa descrita o la enzima degradadora de hialuronidasa .
Los polipéptidos ??2? modificados es pueden administrar antes de, subsecuentemente . a, intermitentemente con o simultáneamente con la preparación de agente terapéutico. Generalmente, el polipéptido PH20 modificado se administra antes de o simultáneamente con la administración de la preparación de agente terapéutico para permitir la PH20 para degradar el ácido hialurónico en el espacio intersticial. La PH20 se puede administrar en un sitio diferente del sitio de administración de la molécula terapéutica o la PH20 soluble se puede administrar en un sitio en lo mismo como en el sitio de administración de la molécula terapéutica.
Los ejemplos de agentes farmacéuticos, terapéuticos y cosméticos y moléculas que se pueden administrar con la hialuronidasa incluyen, pero no se limitan a, un agente quimioterapéutico o anti-cáncer, un agente analgésico, un agente antibiótico, un agente anti-inflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida, un agente anti-parkinson, un agente anti-malaria, un agente anticonvulsivo, un agente anti-depresivo, un agente antiartrítico, un agente anti-fúngico, un agente anti-hipertensivo, un agente antipirético, un agente antiparasítico, un agente anti-histamina, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador braquial, un agente biocida, un agente bactericida,, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador de canal de calcio, un agente de fármaco cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente cosmético o estético, un agente descongestionante, un agente diurético, un agente depresivo, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de complexión muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante físico, un agente sedante, un agente inductor de sueño, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente anti-inflamatorio no esteroidal, o un agente e inhibidor de enzimas de conversión angiotensina , y cualquier combinación de. los mismos. En particular, los agentes terapéuticos incluyen anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, bifosfonatos, insulinas, factores de coagulación, citoquinas e inmunoglobulinas .
Por ejemplo., los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden utilizar para incrementar la administración de agentes quimioterapéuticos . Las hialuronidasas también se han utilizado para potenciar la actividad de los quimioterapéuticos y/o la accesibilidad de tumores a los quimioterapéuticos (Schuller y colaboradores, 1991, Proc. Azner. Assoc. .Cáncer Res. 32: 173, abstract no. 1034; Czejka y colaboradores, 1990, Pharmazie 45?.9; Baumgartner y colaboradores (1988) Reg. Cáncer Treat. 1:55-58; Zanker y colaboradores (1986) Proc. Amer. Assoc. Cáncer Res. 27:390). La /quimioterapia de combinación con hialuronidasa es efectiva en el tratamiento de una variedad de cánceres incluyendo cáncer de la vejiga urinaria (Horn y colaboradores, 1985, J. Surg. Oncol. 28:304-307), carcinoma de células escamosas (Kohno y colaboradores, 94, J. Cáncer Res. Oncol. 120:293-297), cáncer de mama (Beckenlehner y colaboradores, 1992, J. Cáncer Res. Oncol. 118:591-596), y cáncer gastrointestinal (Scheithauer y colaboradores, 1988, Anticancer Res. 8:391-396). En este ejemplo, la hialuronidasa PH20 modificada potencia la penetración del quimioterapéutico u otros agentes anti-cáncer en los tumores sólidos, tratando de esta manera la enfermedad.
Las composiciones que contienen PH20 soluble se pueden inyectar intratumoralmente con agentes anti-cáncer o intravenosamente para cánceres diseminados o tumores difíciles de alcanzar. El agente anti-cáncer puede ser un quimioterapéutico, un anticuerpo, un péptido, o un vector de terapia génica, virus o ADN . Adicionalmente, la hialuronidasa se puede utilizar para reclutar células tumorales en la acumulación cíclica para la sensibilidad en los tumores previamente quimorefractarios- que han adquirido resistencia a múltiples fármacos (St Croix y colaboradores, (1998) Cáncer Lett September 131(1): 35-44).
Los agentes anti-cáncer ejemplares que se pueden administrar después, coincidente con o antes de la administración de una PH20 soluble, tal como una esPH20, incluyen, pero no se limitan a Acivicinas; Aclarubicinas ; Acodazoles; Acroninas; Adozelesinas; Aldesleucinas ; Alemtuzumabs; Alitretinoinas (Ácidos 9-Cis-Retinoicos ) ; Allopurinoles; Altretaminas ; Alvocidibs; Ambazonas; Ambomicinas; Ametantronas ; Amifostinas ; Aminoglutetimidas ; Amsacrinas; Anastrozóles ; Anaxironas; Ancitabinas; Antramicinas ; Apaziquonas ; Argimesnas; Trióxidos Arsénicos; Asparaginasas; Asperlinas; Atrimustinas ; Azacitidinas ; Azetepas; Azotomicins ; Banoxantronas ; Batabulinas; Batimastats ; BCG Live; Benaxibinas ; Bendamustinas ; Benzodepas; Bexarotenos ; Bevacizumab; Bicalutamidas ; Bietaserpinas ; Biricodars; Bisantrenos; Bisantrenos; Dimesilatos de Bisnafida; Ri zelesinas ; Bleomicinas ; Bortezomibs ; Brequinares ; Bropiriminas; Budotitanos; Busulfanos; Cactinomicinas ; Calusteronas ; Canertinibs; Capecitabinas ; Caracemidas; Carbetimeros ; Carboplatinas ; Carboquonas ; Carmofuros ; Carmustinas con Polifeprosanos ; Carmustinas ; Carabicinas; Carzelesinas ; Cedefingoles ; Celecoxibs; Cemadotinas ; Clorambucilos ; Cioteronelos ; Ciplactina; Cirolemicinas ; Cisplatinas ; Cladribinas ; Clanfenuros; Clofarabinas; . Crisnatoles; Ciclofosfamidas ; Citarabina liposomales ; Citarabinas; Dacarbazinas ; Dactinomicinas ; Darbepoyetina Alfas; Daunorubicina liposomales; Daunorubicinas/Daunomicinas ; Daunorabicinas ; Decitabinas; Denileucin-Diftitoxes; Dexniguldipinas ; Dexonas; Dexrazoxanos ; Dezaguaninas ; Diaziquonas; Dibrospidio ; Dienogests; Dinalinas; . Disermolidas; Docetaxels; Dofequidares ; Doxifluridinas ; Doxorabicina liposomal; Doxorabicina HCL; inyección de Doxorubicina HCL. liposomal; Doxorubicinas ; Droloxifenos ; Propionatos de Dromostanolona ; Duazomicinas ; Ecomustinas ; Edatrexatos ; Edotecarinas ; Eflornitinas ; Elacridares ; Elinafidas; Solución B de Elliott; Elsamitracinas; Emitefuros ; Enloplatinas ; Enpromatos; Enzastaurinas; Epipropidinas ; Epirabicinas ; Epoyetina alfas; Eptaloprosts ; Erbulozoles ; Esorabicinas ; Estramustinas ; Etanidazoles ; Etoglucidos ; Fosfato de Etoposido; Etoposido VP-16s; Etoposidos; Etoprinas; Exemestanos ; Exisulindas; Fadrozoles; Fazarabinas ; Fenretinidas ; Filgrastimas ; Floxuridinas ; Fludarabinas ; Fluorouraciloos ; 5-fluorouracilos ; Fluoximesteronas; Flurocitabinas ; Fosquidonas; Fostriecinas ; Fostriecinas ; Fotretaminas ; Fulvestrantos ; Galarabicinas ; Galocitabinas ; Gemcitabinas ; Gemtuzumabs /Ozogamicinas; Geroquinoles ; Gimatecanos; Gimeracilos; Gloxazonas; Glufosfamidas ; Acetatos de Goserelina; Hidroxiureas; Ibritumomabs/Tiuxetanos ; Idarabicinas ; Ifosfamidas; Ilmofosinas; llomastatos; mesilatos de Imatinib; Imexonas; Improsulfanos ; Indisulams; Inproquonas; Inferieron alfa-2as; Interferón alfa-2bs; Inferieron Alfas; Interferón Betas; Interferón Gammas; Interferones ; Interleucinas-2 y otras Interleucinas (incluyendo Interleucinas recombinantes) ; Intoplicinas ; Iobenguanos [131-1]; Iproplatinas ; Irinotecanos ; Irsogladinas ; Ixabepilones ; Cetotrexatos; L-Alanosinas Lanreotidos ; Lapatinibs; Ledoxantronas ; Letrozoles Leucovorinas ; Leuprolido.s ; Leuprorelinas (Leuprolidos) Levamisoles ; Lexacalcitoles ; Liarozoles; Lobaplatins Lometrexoles; Lomustinas/CCNUs; Lomustinas; Lonafarnibs Losoxantronas; Lurtotecanos ; Mafosfamidas ; Mannosulfanos arimastats ; Masoprocoles ; Maytansinas; Meclorethaminas Meeloretaminas/Mostrazas de nitrógeno; Acetatos de Megestrol Megestroles ; Melengestroles ; Melfalanos; Melfalan L-PAMs Menogariles; Mepitiostanos ; Mercaptopurinas ; 6-Mecaptopurina Mesnas; Metesindes; Methotrexatos ; Metoxsalenos ; Metomidatos Metoprinas; Meturedepas; Miboplatinas ; Miproxifenos Misonidazoles ; Mitindomidas ; Mitocarcinas ; Mitocrominas Mitoflaxonas ; Mitogilinas; Mitoguazonas ; Mitomalcinas Mitomicina Cs; Mitomicinas ; Mitonafidos; Mitoquidonas Mitospers; Mitotanos; Mitoxantronas; Mitozolomidas Mivobulinas; Mizoribinas; Mofarotenos; Mopidamoles Mubritinibs; Ácidos Micofenólicos ; Fenpropionatos d Nandrolona; Nedaplatinas; Nelarabinas; Nemorubicinas Nitracrinas; Nocodazoles; Nofetumomabs ; Nogalamicinas Nolatrexeds; Nortopixantronas ; Octreotidos; Oprelvecinas Ormaplatinas; Ortataxels; Oteracilos; Oxaliplatinas Oxisuranos; Oxofenarsinas ; Paclitaxels; Pamidronatos Patupilonas; Pegademasos; Pegaspargasos; Pegfilgrastimas Peldesinas; Peliomicinas ; Pelitrexoles ; Pemetrexedos ; Pentamustinas; Pentostatinas; Peplomicinas; Perfosfamides ; Perifosines ; Picoplatins ; Pinafidas; Pipobromanos ; Piposulfanos; Pirfenidonas ; Piroxantrons ; Pixantronas; Plevitrexedos; Plicamicina Mitramicinas ; Plicamicinas ; Plomestanos ; Plomestanos ; Porfímero sódico; Porfímeros; Porfiromicinas ; Prednimustinas ; Procarbazinas ; Propamidinas ; Prospidio; Pumitepas; Puromicinas; Pirazofurinas ; Quinacrinas; Ranimustinas ; Rasburicasas ; Riboprinas; Ritrosulfaons; Rituximabs; Rogletimidas ; Roquinimexs; Rufocromomicinas ; Sabarubicinas ; Sáfmgoles; Sargramostimas ; Satraplatinas ; Sebriplatinas ; Semustinas; Simtrazenos ; Sizofiranos; Sobuzoxanos; Sorafenibs; Esparfosatos ; Ácidos Esparfósicos ; Esparsomicinas ; Espirogermanios ; Espiromustinas ; Espiroplatinas ; Espiroplatinas ; Esqualaminaes ; Estreptonigrinas ; Estreptovaricina ; Estreptozocinas ; Sufosfamidas ; Sulofenuros; Malato de Sunitinib; 6-TG; Tacedinalinas ; Talcos; Talisomicinas ; Talimustinas ; Tamoxifenos; Tariquidarés ; Tauromustinas ; Tecogalanos; Tegafuros; Teloxantronas ; Temoporfinas ; Temozolomidas ; Teniposidos /VM-26s ; Teniposidos ; Teroxironas; Testolactonas ; Tiamiprinas; Tioguaninas ; Tiotepas; Tiamiprinas; Tiazofurinas ; Tilomisoles; Tiloronas; Timcodares; Timonacics; Tirapazamines ; Topixantrones ; Topotecanos; Toremifenos; Tositumomabs; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); Trastuzumabs ; Trestolonas ; Tretinoinas/ATRA; Triciribinas ; Trilostanos; Trimetrexatos ; Tetranitratos de Triplatina; Triptorelinas ; Trofosfamidas ; Tubulozoles ; Ubenimexs; Mostazas de Uracilo; Uredepas; Valrubicinas ; Valspodares ; Vapreotidos; Verteporfms ; Vinblastinas ; Vincristinas ; Vindesinas; Vinepidinas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos ; Vinleucinoles ; Vinleurosinas ; Vinorelbinas ; Vinrosidinas ; Vintriptoles ; Vinzolidinas ; Vorozoles; Xantomicinas A (Guameciclinas) ; Zeniplatinas; Zilascorbs [2-H] ; Zinostatinas ; Zoledronato; Zorubicinas; y Zosuquidares , por ejemplo: Aldesleucinas (por ejemplo, PROLEUKINMR) ; Alemtuzumabs (por ejemplo, CAMPATHMR) ; Alitretinoinas (por ejemplo, PANRETINMR) ; Allopurinoles ' (po . ejemplo, ZYLOPRI MMR) ; Altretaminas (por ejemplo, HEXALENMR) ; Amifostinas (por ejemplo, ETHYOLMR) ; Anastrozoles (por ejemplo, ARIMIDEXMR) ; Trióxidos Arsénicos (por ejemplo, TRISEN0XMR) ; Asparaginasas (por ejemplo, ELSPARMR) ; BCG Live (por ejemplo, TICEMR BCG) ; Bexarotenos (por ejemplo, TARGRETINMR) ; Bevacizumab (A VASTESTMR) ; Bleomicinas (por ejemplo, BLENOXANEMR) ; Busulfan intravenoso (por ejemplo, BUSULFEXMR) ; Busulfano orales (por ejemplo, MYLERANMR) ; Calusteronas (por ejemplo, METHOSARBMR) ; Capecitabinas (po ejemplo, XEL0DAMR) ; Carboplatinas (por ejemplo, PARAPLATINMR) ; Carmustinas (por ejemplo, BCNU™, BiCNU®) ; Carmustinas con Polifeprosanos (por ejemplo, GLIADELMR Wafer) ; Celecoxibs (por ejemplo,. CELEBREXMR) ; Clorambucilo (por ejemplo, LEUKERANMR) ; Cisplatinas (por ejemplo, PLATI 0LMR) ; Cladribinas (por ejemplo, LEUSTATINMR, 2-CdAMR) ; Ciclofosfamidas (por ejemplo, CYTOXANMR, NEOSARMR) ; Citarabinas (por ejemplo, CYT'OSAR-UMR) ; Citarabina liposomales (por ejemplo, DepoCytMR) ; Dacarbazinas (por ejemplo, DTIC-Domerj ) : Dactinomicinas (por ejemplo, COS EGENMR) ; Darbepoyetina Alfas (por ejemplo, ARANESPMR) ; Daunorubicina liposomal (por ejemplo DAUNOXO EMR) ; Daunorubicinas/Daunomicinas (por ejemplo, CERUBIDTNEMR) ; Denileucin-Diftitoxas (por ejemplo, ONTAKMR) ; Dexrazoxanos (por ejemplo, ZTNECARDMR) ; Docetaxeles (por ejemplo, TAXOTERE®) ; Doxorubicinas (por ejemplo, ADRIAMYCTN®, RUB EX®) ; Doxorubicina liposomal, incluyendo inyecciones de liposomas de Doxorubicin-HCL (por ejemplo, DOXTT,MR) ; Propionatos de Dromostanolona (por ejemplo, inyección de DRO OSTANOLONEMR y MASTERONEMR) ; Soluciones B de Elliott (por ejemplo, B SolutionMR Elliott); Epirubicinas (por ejemplo, ELLENCEMR) ; Epoyetina alfas (por ejemplo, EPOGENMR) ; Estramustinas (por ejemplo, EMCYTMR) ; Etoposido fosfatos (por ejemplo, ETOPOPHOSMR) ; Etoposido VP-16s (por ejemplo, VEPESIDMR) ; Exemestanos (por ejemplo, AROMASINMR) ; Filgrastimas (por ejemplo, NEÜPOGEN®) ; Floxuridines (por ejemplo, FUDRMR) ; Flúdarabinas (por ejemplo, FLUDARAMR) ; Fluorouracilos incl . 5-FUs (por ejemplo, ADRUCILMR) ; Fulvestrantos (por ejemplo, FASLODEXMR) ; Gemcitabinas (por ejemplo, GEMZARMR). ; Gemtuzumabs /Ozogamicinas (por ejemplo, MYLOTARGMR) ; Acetatos de Goserelina (por ejemplo, ZOLADEXMR) ; Hidroxiureas (por ejemplo, HYDREAMR) ; Ibritumomabs/Tiuxetanos (por ejemplo, ZEVALI MR) ; Idarubicinas (por ejemplo, IDAMYCINMR) ; Ifosfamidas (por ejemplo, IFEXMR) ; mesilato sde Imatinib (por ejemplo, GLEEVECMR) ; Interferón alfa-2as (por ejemplo, ROFERON-AMR) ; Interferón alfa-2bs (por ejemplo, INTRON AMR) ; Irinotecanos (por ejemplo, CAMPTOSARMR) ; Letrozoles (por ejemplo, FEMARAMR) ; Leucovorinas (por ejemplo, WELLCOVORTNMR, LEUCOVORTNMR) ; Levamisoles (por ejemplo, ERGAMISOLMR) ; Lomustinas /CCNUs (por ejemplo, CeeNUMR) ; Mecloretaminas/Mostazas de nitrógeno (por ejemplo, MUSTARGENMR) ; Acetatos de Megestrol (por ejemplo, MEGACEMRMelphalans/L- PAMs (por ejemplo, ALKERAN©) ; Mercaptopurina incl. ß-MPs (por ejemplo, PURTNETHOLMR) ; Mesñas (por ejemplo, MESNEXMR) ; Metotrexatos ; Metoxsalenos (por ejemplo, UVADEXMR) ; Mitomicina Cs (por ejemplo, MUTAMYCINMR, MITOZYTREXMR) ; Mitotanos (por ejemplo, LYSODRENMR) ; Mitoxantronas (por ejemplo, NOVANTRONEMR) ; Fenpropionatos e Nandrolona (por ejemplo, DURABOLIN-50MR) ; Nofetumomabs (por ejemplo, VERLUMAMR) ; Oprelvecinas (por ejemplo, NEUMEGAMR) ; Oxaliplatinas (por ejemplo, ELOXATINMR) ; Paclitaxeles (por ejemplo, PAXENEMR, TAXOLMR) ; Pamidronatos (por ejemplo, AREDIAMR) ; Pegademasos (por ejemplo, ADAGENMR) ; Pegaspargasas (por ejemplo, ONCASPARMR) ; Pegfilgrastimas (por ejemplo, NEULASTAMR) ; Pentostatinas (por ejemplo, NI PENTMR) ; Pipobromanos (por ejemplo, VERCYTEMR) ; Plicamicina/Mitramicinas (por ejemplo, ITHRACINMR) ; Porfímero sódico (por ejemplo, PHOTOFRI MR) ; Procarbazinas (por ejemplo, MATULANEMR) ; Quinacrinas (por ejemplo, ATABRTNEMR) ; Rasburicasas (por ejemplo, ELITEKMR) ; Rituximabs (por ejemplo, RITUXANMR) ; Sargramostimas (por ejemplo, PR0KINEMR) ; Streptozocinas (por ejemplo, ZANOSARMR) ; Sunitinib Malatos (por ejemplo, SUTENTMR) ; Talcos (por ejemplo, SCLEROSOLMR) ; Tamoxifenos (por ejemplo, NOLVADEXMR) ; Temozolomidas (por ejemplo, TEMODARMR) ; Teniposidos/VM-26s (por ejemplo, VUMONMR) ; Testolactonas (por ejemplo, TESLACMR) ; Tioguaninas incl. 6-TG; Tiotepas (por ejemplo, THI0PLEXMR) ; Topotecanos (por ejemplo, HYCAMTINMR) ; Toremifenos (por ejemplo, FARESTONMR) ; Tositumomabs (por ejemplo, BEXXARMR) ; Trastuzumabs (por ejemplo, HERCEP INMR) ; Tretinoinas/ATRA (por ejemplo, VESANOIDMR) ; Mostaza de . Uracilos ; Valrubicinas (por ejemplo, VALSTARMR) ; Vinblastinas (por ejemplo, VELBANMR) ; Vincristinaes (por ejemplo, ONCOVIN®) ; Vinorelbinas (por ejemplo, NAVELBINEMR) ; y Zoledronatos (por ejemplo, ZO ETAMR) .
Por ejemplo, agentes antibióticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ' Aminoglicósidos ; Anfenicoles; Ansamicinas; Carbacefems ; Carbapenems ; Cefalosporinas o Cefems Cefamicinas ; Clavams; lipopéptidos cílieos ; Diaminopirimidinas; Cetolidos; Lincosamidas ; Macrolidas; Monobactams ; Nitrotúranos ; Oxacefems; Oxazolidinonas ; Penems, tienamicinas y beta-lactamas divresas; Penicilinas; Antibióticos de polipéptidos ; Quinolonas; . Sulfonamidas ; Sulfonas; Tetraciclinas ; y otros antibióticos (tales como Clofoctoles, ácido fusidicos, Hexedinas, Metenaminas, Nitrofurantoinas Nitroxolinas , Ritipenems, Taurolidinas , Xibomols) .
También se incluyen entre los agentes terapéuticos ejemplares factores de coagulación u otros modificadores de sangre tal como factores anti-hemo-f-ílieos , complejos coagulantes anti-inhibidores, antitrombina III, Factor de coagulación V, Factor de coagulación VIII, Factor de coagulación IX, fracciones de proteínas plasmáticas, factores von illebrand; agentes anti-plaquetas (incluyendo, por ejemplo, abciximabs, anagrelidos, cilostazoles, bisulfatos de clopidogrel, dipiridamoles, epoprostenoles, eptifibatidas , tirofibanos ; factores estimuladores de colonias (CSFs) (incluyendo, por ejemplo, CSFs de Granulocitos y CSFs de Macrófagos de Granulocitos CSFs) ; estimuladores de eritropoyesis (incluyendo, por ejemplo, eritropoyetinas tales como darbepoyetina alfas) y epoyetina alfas; hemostatics y albúminas (incluyendo, por ejemplo, aprotininas, combinaciones de factores antihemofílicos y plasma, Acetatos de Desmopresina, y albúminas); Globulinas Inmunitarias , así como Globulinas Inmunitarias de hepatitis B; inhibidores de trombina (incluyendo por ejemplo inhibidores de trombina directa y lepirudina) , y drotrecogina alfas; anticoagulantes (incluyendo, por ejemplo, dalteparinas , enoxaparinas y otras heparinas, y warfa inas) .
Anticuerpos ejemplares u otras agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, Cetuximab (IMC-C225; ErbituxMR) ; Trastuzumab (HerceptinMR) ; Rituximab (RituxanMR; MabTheraMR) ; Bevacizumab (AvastinMR) ; Alemtuzumab (CampathMR; Campath-lHMR®; MabcampathMR) ; ¦ Panitumumab (ABX-EGF; VectibixMR) ; Ranibizumab (LucentisMR) ; Ibritumomab; tiuxetano de Ibritumomab (ZevalinMR) ; Tositumomab; Yodo 1131 Tositumomab (BEXXARMR) ; Catumaxomab (RemovabMR) ; Gemtuzumab; oxogamicina de Gemtuzumab (MylotargMR) ; Abatacept (CTLA4-Ig; OrenciaMR) ; Belatacept (LI 04EA29YIg; LEA29Y; LEA); Ipilimumab (MDX-010; MDX-101); Tremelimumab ( ticilimumab; CP-675,206); PRS-010 {véase por ejemplo, US20090042785) ; PRS-050 (US7585940; US20090305982) ; Aflibercept (VEGF Trap, AVE005; Holash y colaboradores, (2002) PNAS 99: 11393-11398); Volociximab (M200) ; fragmento de IgG4 Fa F200 (Quimérico (humano/murino ) de Volociximab (M200) ) ;· IgGl quimérica de Ratón/humana MORAb-009 (US20050054048) ; Proteina de fusión soluble: Fv anti-mesotelina ligada a una exotoxina A de Pseudomonas truncada (SS1P (CAT-5001); ¦ US20070189962 ) ; Cixutumumab (I C-A12); Nimotuzumab (h-R3) (Spicer (2005) Curr Opin Mol Ther 7: 182-191); Zalutumumab (HuMax-EGFR; La mMerts van . Bueren y colaboradores (2008) PNAS ' 105 : 6109-14 ); Necitumumab IMC-11F8 (Li y colaboradores (2008) Structure 16:216-227); Sym004 (Pedersen y colaboradores 2010 Cáncer Res 70:588-597); y mAb-425.
En particular, Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas , Interferón beta, Inferieron alfa-2as, Interferón alfa-ls, Interferón alfa-n3s, Interferón beta-1, Interferón beta-las, Interferón ga mMa-lbs, Peg-interferón alfa-2 y Peginterferón alfa-2bs, insulina, un bisfosfato [por ejemplo, Pamidronatos o Zoledronatos) , . Docetaxels, Doxorubicinas , Doxorubicina liposomales y bevacizumabs.
Otros agentes terapéuticos ejemplares que se pueden combinar por co-administración y/o co-formulación con un polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente, incluyen, pero no se limitan a, Adalimumabs, Agalsidasas Beta, Alefacepts, Ampicilinas, Anaquinras, Vacunas Anti-poliomielíticas , Anti-Timocitos , Azitromicinas , Becaplermins , Caspofungins , Cefaz'olinas, Cefepimas, Cefotetanos, Ceftazidimas , Ceftriáxonas, Cetuximabs, Cilastatinas, Ácidos Clavulánicos , Clindamicinas, Darbepoetinas Alfa, Daclizumabs, Difteria, antitoxinas de Difteria, Toxoides de Difteria, Efalizumabs, Epinefrinas, Eritropoyetinas Alfa, Etanercepts, Filgrastims, Fluconazoles , Hormonas Estimuladoras de Folículos, Folitropinas Alfa,. Folitropina Betas, Fosfenitoinas, Gadodiamidas , Gadopentetatos , Gatifloxacinas , Glatirameros, GM-CSF's, Goserelinas, acetatos de Goserelina, Granisetronas , Influenza Hemofílica B, Haloperidoles , Vacunas de Hepatitis, Vacunas de Hepatitis A, Vacunas de Hepatitis B, Tiuxetanos de Ibritumomab, Ibritümomabs , Tiuxetanos, Inmunoglobulinas , vacunas de influenza hemofílica, Vacunas de Virus de Influenza, Infliximabs, Insulina lispro, 75% de protamina lispro enutro (NPL)/25% de insulina lispro, 50% de protamina neutra Hagedorn (NPH) / 50% de insulina regular, 70% de NPH/30% de insulina regular; Insulina Regular, insulina NPH, Ultra insulina, insulina ultralenta, e Insulina Glarginas, Interferones , Interferón alfa, Interferones Beta, Interferón Gammas, Interferón alfa-2a, Interferón alfa 2-b, Interferón Alfacon, Interferón alfa-n, Interferones Beta, Interferones Beta-la, Interferón Gammas, Interferón alfa-con, Iodixanoles, Iohexoles, Iopamidoles, Ioversoles, Ketorolacos, Laronidasas, Levofloxacina, Lidocainas, Linezolidos, Lorazepams, Vacunas de sarampión, Virus de sarampión, virus de paperas, Vacunas de Virus de sarampión, Paperas-Rubéola, Vacunas de Rubéola,. Medroxiprogesteronas, Meropenems, etilprednisolonas, Midazolams, Morfinas, Octreotidos, Omalizumabs, Ondansetronas, Palivizumabs, Pantoprazoles , Pegaspargasas , Pegfilgrastims, Peg-Interferones Alfa-2a, Peg-Interferones Alfa-2b, Pegvisomants , vacunas de Pertussis, Piperacilinas, . Vacunas de Pneumococo y Vacunas de Conjugado de Pneumococo, Prometazinas , Reteplasas, Somatropinas , Sulbactams, Sumatriptans, Tazobactams, Tenecteplasas , Toxoides Purificados del Tétanos, Ticarcilinas , Tositumomabs , Triamcinolonas, Acetonidos de Triamcinolona, Hexacetonidos de Triamcinolona, Vancomicinas , inmunoglobulinas de Varicela Zoster, Vacunas de Varicela, otras vacunas, Alemtuzumabs , Alitretinoinas, Allopurinoles , Altretaminas , Amifostinas, Anastrozoles, Arsénicos, Trióxidos Arsénicos, Asparaginasas , Vacunas de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) , BCG Vivo, Bexarotenos, Bleomicinas, Busulfanos, Busulfano intravenoso, Busulfan orales, Calusteronas , Capecitabinas , Carboplatinas , Carmustinas, Carmustinas con Polifeprosanos , Celecoxibs, Clorambucilos, Cisplatinas, Cladribinas, Ciclofosfamidas , Citarabinas, Citarabina liposomals, Dacarbazinas , Dactinomicinas, Daunorubicina liposomales, Daunorubicinas , Daunomicinas, Diftitoxes de Denileukina, Dexrazoxanos , Docetaxels, Doxorubicinas , Doxorubicina liposomal, propionatos de Dromostanolona, Soluciones B de Elliott, Epirubicinas , Epoyetina-alfas , Estramustinas, Etoposidos, Fosfato de Etoposido, VP-16s de Etoposide, Exemestanos , Floxuridinas , Fludarabinas , Fluorouraciloos , 5- Fluorouraciloos , Fulvestrantes , Gemcitabinas , Gemtuzumabs, Ozogamicins, ozogamicinas de Gemtuzumab, Hidroxiureas , Idarubicinas , Ifosfamidas , mesilatos de Imatinib, Irinotecanos , Letrozoles, Leucovorinas, Levamisoles, Lomustinas, CCNUs, Mecloretaminas , mostazas de Nitrógeno, Megestroles, acetatos de Megestrol, Melfalanos, L-PAMs, Mercaptopurinas, ß-Mercaptopurinas, Mesnas, Metotrexatos, Metoxsalenos, Mitomicinas, Mitomicinas C, Mitotanos, Mitoxantronas , Nandrolonas, Fenpropionatos de Nandrolona, Nofetumomabs , Oprelvequinas , Oxaliplatinas , Paclitaxels, Pamidronatos , Pegademasos, Pentostatinas , Pipobromanos , Plicamicinas , Mitramicinas , Porfimeros, Porfimero sódico, Procarbazinas , Quinacrinas, Rasburicass, Rituximabs, Sargramostims, Estreptozocinos, Talcos, Tamoxifenos, Temozolomidas, Teniposidas, Testolactonas , Tioguaninas, 6-Tioguaninas, Trietilentiofosforamidas (Tiotepas) , Topotecanos, Toremifenos, Trastuzumabs , Tretinoinas, Mostaza de Uracilo, Valrubicinas, Vinblastinas, Vincristinas , Vinorelbinas, Zoledronatos, Acivicinas, Aclarubicinas , Acodazoles, Acroninas, Adozelesinas, Aldesleucinas , Áciros Retinoicos, Alitretinoinas , Ácidos 9-Cis-Retinoico , Alvocidibs, Ambazonas, Ambomicinas , Ametantronaes , Aminoglutetimidas , Amsacrinaes, Anaxironas, Ancitabinas, Antramiinas , Apaziguomn, Argimesnas, Asperlinas, Atrimustinas , Azacitidinas , Azetepas, Azotomicinas , Banoxantronas , Batabulinas, Batimastatas , Benaxibinas, Bendamustinds , Benzodepas, Bicalutamidas , Bietaserpinas , Biricodars, Bisantrenes, Dimesilatos Bisnafida, Bizelesinas, Bortezomibs, Brequinars, Bropiriminas , Budotitanos, Cactinomicinas, Canertinibs, Caracemides, Carbetimeros , Carboquonas, Carmofurs, Carubicinas, Carzelesinas , Cedefingoles , Cemadotinas, Clorambucilos, Cioteronelos , Cirolemicinas, Clanfenuros, Clofarabinas , Crisnatoles, Decitablnas, Dexniguldipinas , Dexormaplatinas , Dezaguaninas , Diaziquonas, Dibrospidio, Dienogests, Dinalinas, Disermolidas, Dofequidars, Doxifluridinas , Droloxifenos , Duazomicinas, Ecomustinas, Edatrexatos, Edotecarinas , Eflornitinas, Elacridars, Elinafidas, Elsamitrucinas , Emitefurs, Enloplatinas , Enpromatos, Enzastaurinas , Epipropidinas, Eptaloprosts, Erbulozolas, Esorabicinas , Etanidazoles, Etoglucidos-, Etoprinas, Exisulindas, Fadrozoles, Fazarabinas, Fenretinidas , Fluoximesteronas, Flurocitabinas, Fcsquidonas, . Fostriecinas, Fotretaminas , Galarubicinas , Galocitabinas , Geroquinoles , Gimatecanos , Gimeracilos, Gloxazonas, Glufosfamidas, Ilmofosinas , Ilomastatos, Imexonas, Improsulfanos , Indisulamas , Inproquonas, Interleucinas , . Interleucinas-2 , Interleucinas recombinantes , Intoplicinas, lobenguanos, Iproplatinas , Irsogladinas , Ixabepilonas , Cetotrexatos, L-Alanosinas , Lanreotidos, Lapatinibs, Ledoxantronas , Leuprolidos , Leuprorelinas , Lexacalcitoles , Liarozoles, Lobaplatinas , Lometrexoles , Lonafamibs, Losoxantronas , Lurtotecanos , Mafosfamidas, Mannosulfanos , . Marimastatos, Masoprocoles , Maitansinas , Mecloretaminas, Melengestroles , Melfalanos , Menogarilos, Mepitiostanos , Metesinds, Metomidatos , Metoprinas, Meturedepas, Mibopiatinas , Miproxifenos , Misonidazoles, Mitindomidas., Mitocarcinas, Mitocrominas , Mitoflaxonas , Mitogilinas, Mitoguazonas , Mitomalcinas , Mitonafidas , Mitoquidonas , Mitospers, Mitozolomidas , Mivobulins , Mizoribinas, Mofarotenos, Mopidamoles , Mubritinibs, Ácidos Micofenólicos, Nedaplatinas , Neizarabinas , Nemorubicinas , Nitracrinas, Nocodazoles , Nogalamicinas, Nolatrexeds, Nortopixantronas , Ormaplatinas , Ortataxels, Oteracilos, Oxisuranos, Oxofenarsinas , Patupilonas, Peldesinas, Peliomicinas , Pelitrexoles , Pemetrexeds, Pentamustinas, Peplomicinas , Perfosfamidas , Perifosinas, Picoplatinas , ¦ Pinafidas, Piposulfanos , Pirfenidonas , Piroxantronas, Pixantronas, Plevitrexeds , Plomestanos, Porfiromicinas , Prednimustinas , Propamidinas , Prospidiums, Pumitepas, Puromicinas , Pirazofurinas , Ranimustinas, Riboprinas, Ritrosulfanos, Rogletimidas , Roquinimexs , Rufocromomicinas , Sabarubicinas , Safingoles, Satraplatinas , Sebriplatinas , Semustinas, Simtrazenos, Sizofiranos, Sobuzoxanos, Sorafenibs, Esparfosatos , Ácidos Esparfósicos, Eparsomicinas , Espirogermanio, Espiromustinas , Espiroplatinas , Esqualaminas , streptonigrinas , Estreptovaricinas , Sufosfamidas , ¦ Sulofenuros, Tacedinalinas , Talisomicinas , Talimustinas , Tariquidares , Tauromustinas , Tecogalanos, Tegafuros, Teloxantronas , Temoporfinas , Teroxironas, Tiamiprinas , Tiamiprinas, Tiazofurinas , Tilomisoles, Tiloronas, Timcodares, Timonacics, Tirapazaminas, Topixantronas, Trabectedinas , Ecteinascidina 743, Trestolonas, Triciribinas , Trilostanas, Trimetrexatos , Tetranitratos de Triplatina, Triptorelinas , Trofosfamidas , Tubulozoles, Ubenimexs, Uredepas, Valspodares, Vapreotidos, Verteporfinas, . Vinblastinas , Vindesinas, Vinepidinas, Vinfluninas, Vinformidas, Vinglicinatos , Vinleucinoles , Vinleurosinas, Vinrosidinas , Vintriptoles, Vinzolidinas , Vorozoles, Xantomicinas A, Guameciclinas , Zeniplatinas , Zilascorbs [2-H] , Zinostatinas, Zorubicinas, Zosuquidares , Acetazolamidas, Aciclovires, Adipiodonas, Alatrofloxacinas, Alfentaniles, Ectractos Alergénicos, Inhibidores de Alfa 1-proteinasa, Alprostadilos , Amicácinas, Aminoácidos, Ácidos aminocaproicos, Aminofilinas , Amitriptilinas , Amobarbitales , Amrinonas, Analgésicos, Vacunas anti-poliomielíticas , Sueros anti-rábicos , inmunoglobulinas anti-tétanos , vacunas de tétanos, enfermedades Antitrombina, sueros anti-veneno, Argatrobanos, Argininas, ácidos ascórbicos, Atenololes, Atracurio, Atropinas, Aurotioglucosas , Azatioprinas , Aztreonams, Bacitracinas , Baclofenos, Basiliximabs , ácidos bezoicos, Benztropinas, Betametasonas, Biotinas, Bivalirudinas, Antitoxinas de botulismo, Bretilio, Bumetanidas, Bupivacainas , Buprenorfinas , Butorfanoles , Calcitoninas , Calcitrioles , Calcio, Capreomicinas , Carboprosts, Carnitinas, Cefamándoles , Cefoperazonas , Cefotaximas, Cefoxitinas, Ceftizoximas , Cefuroximas, Cloranfenicoles , Cloroprocainas , Cloroquinas, Clorotiazidas , Clorpromazinas , ¦ Ácidos condroitinsulfúricos , Coriogonadotropina-alfas, Cromo, Cidofovires, Cimetidinas, Ciprofloxacinas , Cisatracurio, Clonidinas, Codeinas, Colquicinas, Colistinas, Colágenos, Triflutatos de ovino de corticorelina, Corticotrofinas, Cosintropinas , Cianocobalaminas, Ciclosporinas, Cisteinas, Da.cliximabs , Dalfopristinas, Dalteparinas, Danaparoides, Dantrolenos, Deferoxaminas , Desmopresinas, Dexametasonas , Dexmedetomidinas , Dexpantenoles, Dextranos, Dextranos de hierro, Ácidos Diatrizoicos, Diazepams, Diazoxidas, Diciclominas , Digibindas, Digoxinas, Dihidroergotaminas , Diltiazems, Difenhidraminas , Dipiridamoles , Dobutaminas , Dopaminas, Doxacurio, Doxapramos, Doxercalciferóles , Doxiciclinas , Droperidoles , Difilinas, Ácidos edéticos, Edrofonio, Enalaprilatos , Efedrinas, Epoprostenoles , Ergocalciferóles , Ergonovinas, Ertapenemos, Eritromicinas , Esmololes, Estradioles, Estrogénicos , Ácidos etacrinicos, Etanolaminas , Etanoles, Aceite etiodizados, Ácidos etidrónicos, Etomidatos, Famotidinas , Fenoldopamos , Fentanilo, Flumazenilos , Fluoresceinas , Flufenazinas , Ácidos folíeos, Fomepizoles, Fomivirsenos , Fondaparinuxs , Foscarnets, Fosfenitoinas , Furosemidas , Gadoteridoles , Gadoversetamidas, Ganciclovires , Gentamicinas , Glucagonas, Glucosas, Glicinas, Glicopirrolatos, Gonadorelinas , Gonadotropina corióniea, polisacáridos Hemofilus B, Heminas, Herbales, Histaminas, Hidralazinas , Hidrocortisonas , Hidromorfonas, Hidroxocobalaminas, Hidroxizinas , Hiosciaminas, Ibutilidos, Imiglucerasas , carmines índigo, Indometacinas, Yoduros, Yopromidas, ácido Iotalámicos , ácidos ioxáglicos, Ioxilanos, Isoniazidos, Isoproterenoles , Vacunas de encefalitis Japonesa, Canamicinas , Cetaminas, Labetaloles, Lepirudinas, Levobupivacainas, Levotiroxinas, Lincomicinas , Liotironinas , Hormonas. Luteinizantes , Vacunas de enfermedad de Lyme, Mangafodipires, Manttoles, Vacunas de polisacárido eningocócico, Meperidinas, Mepivacainas , Mesoridazinas , Metaraminoles, Metadonas, Metocarbamoles, Metohexitales , Metildopatos , Metilergonovinas, Metoclopramidas , Metoprololes, etronidazoles , Miriociclinas, Mivacurio, Ácidos morruicos, Moxifloxacinas , Muromonab-CD3s , Mofetilos de micofenolato, Nafcilinas, Malbufinas, Nalmefenos, Naloxonas, Neostigminas , Niacinamidas , Nicardipinas, Nitroglicerinas, Nitroprassidos, Norepinefriñas, Orfenadrinas, Oxacilinas, Oximorfonas, Oxitetraciclinas , Oxitocinas, Pancuronio, Pantenoles, Ácidos pantoténicos, Papaverinas, Peginterferones-alfa 2A, Penicilinas G, Pentamidinas , Pentazocinas, Pentobarbitales, Perflutrenos, Perfenazinas , Fenobarbitales, Fentolaminas, Fenilefriñas , Fenitoinas, Fisostigminas , Fitonadionas, Polimixina, Pralidoximas , Prilocainas, Procainamidas , Procainas, Proclorperazinas , Progesteronas , Propranolol es , Hidróxidos de piridostigmina, Piridoxinas, Quinidinas, Quinupristinas, Inmunoglobulinas de rabia, Vacunas de Rabia, Ranitidinas, Remifentanilos , Riboflavinas, Rifampinas, Ropivacainas , Samario, Escopolaminas, Eselenio, Esermorelinas, Sincalidos, Sornatremos , Espectinomicinas,, Estreptocinasas , Estreptomicinas, Succinilcolinas, Sufentanilos , Sulfametoxazoles, Tacrolimusas , Terbutalinas , Teriparatidos , Testosteronas, antitoxinas de tétano, Tetracainas, Sulfatos de tetradecilo, Teo'filinas, Tiaminas, Tietilperazinas , Tiopentalos, Hormonas estimuladoras de la tiroides, Tinzaparinas , Tirofibanos, Tobramicinas , Tolazolinas, Tolbutamidas , Torsemidas, Ácidos tranoxámicos , Treprostinilos, Trifluoperazinas, Trimetobenzamidas , Trimethoprimas, Trometaminas, Tuberculinas , Vacunas de tifoidea, UroFolitropinas , Urocinasas, ácidos Valproicos, Vasopressinas , Vecuronio, Verapamilos, Voriconazoles , arfarinas , Vacunas de fiebre amarilla, Zidovudinas, Zincs, clorhidratos de Ziprasidona, Aclacinomicinas , Actinomicinas , Adriamicinas , Azaserihas, 6-Azauridinas , Carzinofilinas , Cromomicinas, Denopterinas , 6-Diazo-5-Oxo-L-Norleucinas , Enocitabinas , Floxuridinas , Olivomicinas , Pirarubicinas , Piritreximas, Pteropterinas , Tegafuros, Tubercidinas , Alteplasas, Arcitumomabs , bevacizumabs , Toxinas de Botulinio tipo A, Toxinas de Botulinio tipo B, Capromab Pendetidos, Daclizumabs, Dornasas-alfa, Drotrecoginas-alfa, Pentetatos e Imciromab, Yodos-131.
Suministro de Insulina Los métodos proporcionados en la presente incluyen métodos para co-administrar un polipéptido PH20 modificado y una insulina para incrementar la administración subcutánea de la insulina, tal como una insulina de acción rápida (véase por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 7,767,429; Patente de E.U.A. No. 7,846,431; Publicación de A.U.A. No. US20090304665; y Solicitud . de E.U.A. Nos. De Serie 13/507,263; 13/507,262 y 13/507,261). Tales métodos incluyen métodos para administración directa, y métodos de infusión de bomba y continua, incluyendo sistemas de bomba abierta y cerrada. Por ejemplo, las insulinas ejemplares que se pueden administrar con una hialuronidasa PH20 modificada proporcionada en la presente son insulinas de acción rápida o análogos de insulina. Por ejemplo, una insulina coadministrada incluye una insulina regular, insulina aspart, insulina lispro, insulina glulisina u otras variantes de análogos similares.. Las insulinas ejemplares son insulinas que contienen una cadena A expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B expuesta en SEQ ID NO: 863 o variantes que contienen una o más modificaciones de aminoácido comparada con una insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 862 y 863 (cadenas A y B) . Por ejemplo, Los análogos de insulina ejemplares son con conocidos por una persona de experiencia en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, a aquellas expuestas en SEQ ID NOS: 862 (cadena A) y que tiene una cadena B expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 865-867.
Loas co-formulaciones se pueden administrar subcutáneamente para tratar cualquier condición que sea apta para el tratamiento con la insulina. Los usos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, tratamiento para diabetes mellitus tipo, diabetes mellitus tipo 2, diabetes gestacional y para control glicémico en pacientes criticamente enfermos. Por ejemplo, las co-formulaciones de una insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano se pueden suministrar subcutáneamente en dosis discretas tal como a través de una jeringa o pluma de insulina, antes de una comida como terapia de insulina . prandial en sujetos con diabetes para lograr el control glicémico. Las co-formulaciones también se pueden administrar subcutánea o intraperitonealmente utilizando una bomba de insulina o en el contexto de un sistema de bucle cerrado para controlar continuamente los niveles de glucosa en la sangre por todo el día y la noche y/o para controlar las excursiones glicémicas pos-prandiales . Está dentro de la experiencia de un médico que trata identificar tales enfermedades o afecciones.
Para cualquier enfermedad o afección, incluyendo todas aquellas ejemplificadas en lo anterior, para las cuales una insulina de acción rápida se indica o se ha utilizado y para las cuales otros agentes y tratamientos son disponibles, las co-formulaciones se pueden utilizar en combinación con los mismos. Dependiendo de la enfermedad o afección que se trata, las combinaciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, combinaciones con fármacos antidiabéticos, incluyendo, pero no limitado a, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas , tiazolidinedionas, inhibidores de alfa-glucosidasa, análogos de péptido, incluyen análogos de péptido similar a glucagón (GLP) y, análogos de péptido inhibidor gástrico (GIP) e inhibidores de DPP-4. En otro ejemplo, las co-formulaciones de una insulina de ¦ acción rápida y polipéptido PH20 modificado descrito en la presente se puede administrar en combinación con, ante de, intermitentemente con, o subsecuente a, una o más de otras insulinas, incluyendo insulina de acción rápida, e insulinas de acción basa. 2. Métodos de Enfermedades y Afecciones Asociadas con Hialuronano (por ejemplo, Tumores) En particular, la hialuronidasa PH20 se puede utilizar para tratar enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano. Típicamente, las enfermedades y asociadas con hialuronano se asocian con la expresión de hialuronano elevado en un tejido, célula o fluido corporal (por ejemplo, tejido tumoral o tejido asociado con tumor, sangre, o espacio intersticial) comparado con un control, por ejemplo, otro tejido, célula o fluido corporal. La expresión de hialuronano se puede elevar comparada con un tejido normal, célula o fluido corporal, por ejemplo, un tejido, célula o fluido corporal que es análogo a la muestra que se somete a prueba, pero se aisla de un sujeto diferente, tal como un sujeto que es normal (es decir, no tiene una enfermedad o afección, o no tiene el tipo de enfermedad o afección que está siendo sometido a prueba tiene, por ejemplo, un sujeto que no tiene una enfermedad o afección asociada con hialuronano. La expresión de hialuronano asociada se puede elevar comparada con un tejido análogo de otro sujeto que tiene una enfermedad o afección similar, pero cuya enfermedad no es tan grave y/o no está asociada con. hialuronano o expresa relativamente menos hialuronano y de esta manera se asocia con hialuronano a un menor grado. Por ejemplo, el sujeto que se somete a prueba puede ser con un cáncer asociado con hialuronano, donde las cantidades de HA en el tejido, célula o fluido se elevan relativamente comparado con un sujeto que tiene un cáncer menos grave, tal como uno de etapa temprana, diferenciado a otro tipo de cáncer. En otro ejemplo, la célula, tejido o fluido contiene niveles elevados de hialuronano comparado con una muestra de control, tal como un fluido, tejido, extracto [por ejemplo, extracto celular o nuclear) , ácido nucleico o preparación de péptidos, linea de células, biopsia, estándar u otra muestra, con una cantidad conocida o cantidad relativa de HA, tal como una muestra, por ejemplo una linea de células tumorales, conocida por expresar niveles relativamente bajos de HA, tal como lineas de células tumorales ejemplares descritas en la presente que expresan bajos niveles de HA, por ejemplo, la linea de células HCT 116, la linea de células HT29, la linea de células NCI H460, la linea de células DU145, la linea de células Capan-1, y tumores de modelo de tumor generados utilizando tales lineas de células.
Las enfermedades y afecciones asociadas con hialuronano incluyen aquellas asociadas con presión de fluido intersticial alta, tal como presión de disco, trastornos proliferativos, tal como cáncer e hiperplasia prostética benigna, y edema. El edema puede resultar de o se manifiesta en, por ejemplo, trasplante de órganos, apoplejía o traumas cerebral. Los trastorno proliferativos incluyen, pero no se limitan a, cáncer, . proliferación celular de músculo liso, esclerosis sistémica, cirrosis del hígado, síndrome de dificultad respiratoria de adulto, cardiomiopatía idiopática, lupus eritematoso, retinopatía , por ejemplo, retinopatía diabética u otras retinopatías , hiperplasia cardiaca, trastornos asociados con el sistema reproductor, tales como hiperplasia prostética benigna (BPH) y quistes de ovario, fibrosis pulmonar endometriosis, fibromatosis, hamartomas, linfangiomatosis, sarcoidosis, tumores desmoldes. Los canceres incluyen tumores' sólidos y linfáticos/de sangre y enfermedad metastásica y tumores no diferenciados. Los tumores actos para el tratamiento muestran típicamente expresión celular y/o estromal de un hialuronano, comparado con un tejido canceroso del mismo tipo de tejido o comparado con un tumor no metastásico del mismo tipo de tumor. Los canceres incluyen cualquiera de uno o más de cáncer de ovario, carcinoma in situ (ISC) , carcinoma de células escamosas (SCC) , cáncer de próstata, cáncer pancrático, otros canceres gástricos, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de cerebro y cáncer de colon.
Los polipéptidos PH20 proporcionados en la presente, tales como formas PEGiladas de los mismos, se pueden utilizar para tratar tumores. De esta manera, además de sus efectos anti-cáncer indirectos-, las hialuronidasas también tienen efectos ant i-carci nogénicos directos. La hialuronidasa previene crecimiento de tumores trasplantados en ratones (De Maeyer y colaboradores, 1992, Int. J. Cáncer 51:657-660) e inhibe la formación de tumores a la exposición a los carcinógenos (Pawlowski y colaboradores, 1979, Int. J. Cáncer 23: 105-109; Haberman y colaboradores, 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 22: 105, abstract no. 415). La hialuronidasa PH20 ' ha mostrado que trata varios tumores (véase por ejemplo, Publicación de E.U.A. No. US2010/0003238 y Solicitud de E.U.A. No. de Serie 13/135, 817 , publicada como Publicación de E.U.A. No. US20120020951) .
El cáncer rico en hialuronano puede ser un cáncer en el cual las células cancerosas producen HALOs, canceres que tienen expresión elevada de hialuronano (como es determinado por inmunotinción, pór ejemplo, tinción histológica de secciones del tumor) canceres que tienen HAS2 elevada (Hialuronano sintasa 2) , canceres que no producen hialuronidasa (HYAL1) in vitro. Los canceres ricos en Hialuronanos se pueden identificar por cualquier método para evaluar la expresión de hialuronano, y otros métodos conocidos para evaluar la expresión. de proteina/ARNm.
Varios canceres ricos en hialuronano se han identificado. En algunos · casos, la expresión de hialuronano se correlaciona con prognosis deficiente, por ejemplo, tasa de supervivencia disminuida y/o tasa de supervivencia sin recurrencia, metástasis, angiogénesis , invasión de células cancerosas en otros te idos/áreas, y otros indicadores de prognosis deficiente. Tal correlación se ha observado, por ejemplo, en tumores ricos en hialuronano incluyendo cáncer de ovario, SCC, ISC, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer pancreático {véase, por ejemplo, Anttila y colaboradores, Cáncer Research, 60: 150-155 (2000); Karvinen y colaboradores, British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003); Lipponen y colaboradores, Eur. Journal of Cáncer, 849-856 (2001); Pirinen y colaboradores, Int. J. Cáncer. 95: 12-17 (2001) ; Auvinen y colaboradores, American Journal of Pathology, 156 (2) : 529-536 (2000); Ropponen y colaboradores, Cáncer Research, 58: 342-347 (1998)). De esta manera, los canceres ricos en hialuronano se pueden tratar por administración de una hialuronidasa, tal como una PH20 soluble, para tratar uno o más síntomas del cáncer. Los tumores ricos en hialuronano incluyen, pero no se limitan a aquellos de la próstata, mama, colon, ovario, estómago, cabeza y cuello y otros tumores y canceres.
Otras enfermedades o afecciones asociadas con hialuronano que se asocian con Glicosaminoglicanos en exceso y que se pueden tratar con un polipéptido PH20 modificado proporcionado en la presente incluyen, pero no se limitan a, enfermedad cardiovascular (por ejemplo, después de la reperfusión de isquemia; en la arteriosclerosis ) ; vitrectomia y trastornos y afecciones oftálmicas (por ejemplo, en métodos para licuar el humor vitreo del ojo, reducir la presión posoperativa; otros procedimientos quirúrgicos oculares, tales como glaucoma, cirugía vitrea y de retina y en el trasplante de córneas) en hipodermoelisis (es decir, infusión de fluidos y electrolitos en la hipodermis de la piel) ; aplicaciones cosméticas (por ejemplo, en el tratamiento de celulitis, edema "piel de cerdo" o edema "de cáscara de naranja"; trasplante de órganos (por ejemplo, asociado edemas intersticiales en conexión con injerto de un órgano) ; enfermedad pulmonar. 3. Otros usos En ejemplos adicionales de su uso terapéutico, los poüpéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente, se pueden utilizar para tales propósitos como un antidoto a necrosis local de inyección para venosa de sustancias necróticas tal como alcaloides de la vinca (Few y colaboradores (1987) Amer . J. Matern. Child Nurs. 12, 23-26), tratamiento de quistes ganglionares (Paul y colaboradores (1997) J Hand Surg. 22 (2) : 219-21) y tratamiento de necrosis de tejido debido a insuficiencia venosa (Eider y colaboradores (1980) Lancet 648-649) . Los poüpéptidos PH20 modificados también se pueden utilizar para tratar quistes ganglionares (también conocida como un quiste de la muñeca, quiste Biblia, o quiste del tendón dorsal), que son la masa de tejido blando más común de la mano y son sacos llenados con fluido que se: pueden sentir por debajo de la piel.
Los poüpéptidos PH20 modificados se pueden utilizar en el tratamiento de lesión de la medula espinal al degradar los proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs) . Después de la lesión de la medula espinal, las cicatrices gliales que contienen CSPGs se producen por astrocitos. Los CSPGs desempeñan una función crucial en la inhibición de crecimiento de axones. Además, la expresión de CSPG ha mostrado que se incrementa después de la lesión del sistema nervioso central (CNS) . La PH20 soluble también se puede utilizar para el tratamiento de discos herniados en un proceso conocido como quimionucleosis . La condroitinasa ABC, una enzima que escinde los sustratos similares como la hialuronidasa puede inducir la reducción de la presión intradiscal en la espina lumbar. Existen tres tipos de lesiones discales. Un disco sobresaliente es uno que está intacto pero abultado. En un disco extruido, la envoltura fibrosa se ha desgastado y el NP se ha exudado, pero aún se conecta al disco. En un disco secuestrado, un fragmento del NP se ha roto del disco y está libre en el canal espinal. La quimionucleolisis es típicamente efectiva en discos sobresalientes y extruidos, pero no en las lesiones de disco secuestrado. 4. Anticoncepción Los polipéptidos PH20 modificados proporcionados en la presente se pueden utilizar como vacunas en aplicaciones anticonceptivas. La PH20 está presente en el tracto reproductor masculino, y se expresa en tanto los testículos como la epidermis si está presente en los espermatozoides. La PH20 desempeña una función en la fertilización al facilitar la entrada del espermatozoide a través de la capa del cumulo que circunda el óvulo no fertilizado. La PH20 también es capaz de ligarse al ácido hialurónico (HA) en la zona pelúcida durante las fases tempranas de la fertilización. Esta ligación también inicia la señalización intracelular que ayuda en la reacción del aerosoma. La inmunización con PH20 ha mostrado que es un anticonceptivo eficaz en conejillos de indias machos (Primakoff y colaboradores (1988) Nature 335:543-546, Tung y colaboradores (1997) Biol. Reprod. 56: 1133-1141) . También ha mostrado que es un anticonceptivo eficaz en conejillos de indias hembras debido a la generación de anticuerpos anti-PH20 que previenen que el espermatozoide y el óvulo se liguen. En ejemplos en la presente, los polipéptidos PH20 modificados pueden ser enzimas inactivas, tal como cualquiera descrito en las Secciones C.2. Los polipéptidos se pueden administrar directamente o se pueden administrar como un virus recombinante para administrar el antígeno.
I. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos incluyen para propósitos ilustrativos solamente y no se proponen para limitar el alcance de la invención.
EJEMPLO 1 GENERACIÓN DE HIALURONIDASA PH20 HUMANA RECOMBINANTE (rHuPH20) A. Generación de una linea de células que expresa rHuPH20 soluble Una Hialuronidasa PH20 humana recombinante designa rHuPH20 se generó como se describe en la Publicación de E.U.A. Publicada No. US20110053247. Brevemente, el plásmido pCI-PH20-IRES- DHFR-SV40pa (HZ24) (expuesto en SEQ ID NO:5) se utilizó para transferir células de Ovario de Hámster Chino transíectadas (células CHO) (véase por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 7,767,429 y 7,781,607 y Publicación de E.U.A. No. 2006-0104968) . El vector del plásmido HZ24 para la expresión de rHuPH20 soluble contiene una cadena principal del vector pCI (Promega), ADN gue codifica los aminoácidos 1-482 la Hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO:2), un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) del virus ECMV (Clontech) , y el gen de hidrofolato reductasa de ratón (DHFR) . La cadena principal del vector pCI también incluye ADN que codifica el gen de resistencia de la Beta-lactamasa (AmpR) , un origen fl de replicación, una región potenciadora/promotora temprana inmediata de Citomegalovirus (CMV) , un intrón quimérico, y una señal de poliadenilación posterior (SV40) . El ADN que codifica el constructo rHuPH20 soluble contiene un sitio Nhel y una secuencia consenso Kozak antes del ADN que codifica la metionina en la posición de aminoácidos 1 de la secuencia señal de 35 aminoácido nativa de la PH20 humana, y el codón de detención después del ADN que codifica la tirosina que corresponde a la posición de aminoácidos 482 de la hialuronidasa PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 2, seguido por un sitio de restricción BamHI .
Células DG44-CHO no transfectadas que se desarrollan en un medio CD-CHO de GIBCO para células de DHFR(-), complementadas con Glutamina 4 mMy 18 mL/L de Plurionic F68/L (Gibco) , se sembraron en 0.5 x 106 células/mL en un matraz de agitación en la preparación para la transfeccion. Las células se desarrollaron a 37 °C C02 al 5% en una incubadora humidificada, agitándose a 120 rpm. Las células DG44 CHO no transfectadas que se desarrollan exponencialmente se sometieron a prueba para la viabilidad antes de la transfeccion .
Sesenta millones de células viables del cultivo de células DG44 CHO no transfectadas se formaron en pelotillas y se resuspendieron a una densidad de 2 x 107 células en 0.7 mL de solución amortiguadora de transfección 2x (HeBS 2x: Hepes 40 mM, pH 7.0, NaCl 274 mM, C1 10 mM, Na2HP04 1.4 mM, dextrosa 12 mM) . Para cada alícuota de células resuspendidas, se agregaron 0.09 mL (250 g) de plásmido HZ24 lineal (linealizado por digestión durante la noche con Cía I (New England Biolabs) , y las soluciones de células/ADN se transfirieron en cubetas de electroporación BTX (Centronics) de 0.4 cm de espacio (a temperatura ambiente) . Se llevó a cabo una electroporación de control negativa con ADN no plásmido mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmido se electroporaron con una descarga de capacitor de 330 V y 960 iF o en 350 V y 960 pF.
Las células se removieron de las cubetas después de la electroporación y se transfirieron en 5 mL de medio CD-CHO Modificado para las células DHFR(-), complementadas con Glutamina 4 mM y 18 mL/L de Plurionic F68/L (Gibco) , se dejaron desarrollar en un pocilio de una placa de cultivo de tejido de 6 pocilios sin selección durante 2 días a 37°C en CO2 al 5% en una incubadora humidificada . Dos días post-electroporación, 0.5 mL de medio de cultivo de tejido se removieron de cada pocilio y se sometieron a prueba para la presencia de activada de hialuronidasa, utilizando el ensayo de microturbiedad descrito en el Ejemplo 8. Los resultados se exponen en la Tabla 6.
Células de la Transfección 2 (350V) se recolectaron del pocilio de cultivo de tejido, se contaron y se diluyeron a 1 x 104 a 2 x 104 células viables por ML. Una alícuota de 0.1 mL. de la suspensión celular se transfirió a cada pocilio de cinco, placas de tejido de cultivo de fondo redondo de 96 pocilios, cien microlitros de medio CD-CHO (GIBCO) que contiene suplemento GlutaMAXMR-l 4 mM (GIBC0MR, Invitrogen Corporation) e hipoxantina y timidina se agregaron suplementos a los pocilios que contienen células (volumen final 0.2 mL) . Diez clones se identificaron de las 5 placas desarrolladas sin metotrexato (Tabla 7).
Seis clones de HZ24 se expandieron en el cultivo y se transíectaron en matraces de agitación como suspensiones de células individuales. Los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, y 4D10 se colocaron en placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocilios utilizando una estrategia de dimensión infinita bidimensional en la cual las células se . diluyeron 1:2 hacia debajo de la placa, y 1:3 a través de la placa, comenzando en 500.0 células en el pocilio de la izquierda superior. Los clones diluidos se desarrollaron en un fondo de 500 células DG44 CHO no transfectadas por pocilio, para proporcionar factores de crecimiento necesarios para los días iniciales en el cultivo. Diez placas se hicieron por sub-clon, con 5 placas que contienen metotrexato 50 nM y 5 placas sin metotrexato.
Los 24 subclones visuales produjeron el clon 3D3 (13 del tratamiento sin metotrexato, y 11 del tratamiento con metotrexato 50 nM) . La actividad de hialuronidasa significativa se midió en sobrenadantes de los 8 de 24 subclones (>50 Unidades/mL) , y estos 8 subclones se expandieron en matraces de cultivo de tejido T-25. Los clones aislados del protocolo de tratamiento con metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato 50 nM. El clon 3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM dando origen a clones que producen actividad de hialuronidasa en exceso de 1,000 Unidades/mL en matraces de agitación (clon 3D35M; o Geni 3D35M) . Luego se preparó un banco de células madre (MCB) de las células 3D35M.
B. Producción de Células Gen2 que contienen PH20 humana Soluble (rHuPH20) La línea de células Geni 3D35M descrita en el Ejemplo l.A se adaptó a niveles de metotrexato más altos para producir clones de generación 2 (Gen2). Las células 3D35M se sembraron de cultivos que contienen metotrexato establecido en medio CD CHO que contiene GlutaMAX-lMR 4 mM y metotrexato 1.0 µ?. Las células se adaptaron a un nivel de metotrexato más alto al desarrollarlas y al pasarlas 9 veces durante un período de 46 días a 37°C en una incubadora humidificada a 7% de C02. La población amplificada de células se clonó al limitar la dilución en las placas de cultivo de tejido de 96 pocilios que contienen el medio con metotrexato 2.0 µ?. Después de aproximadamente 4 semanas, los clones se identificaron y el clon 3E10B se seleccionó para la expansión. Las células 3?1?? se desarrollaron en medio CD CHO que contiene GlutaMAX-lMR 4 mM y metotrexato 2.0 µ? para 20 pasajes. Un banco de células madre (MCB) de la línea de células 3E10B se creó y se congeló y se utilizó para estudios subsecuentes. · La amplificación de la línea de células continuó al cultivar células 3E10B en medio CD CHO que contiene GlutaMAX-1MR 4 mM y metotrexato 4.0 µ?. Después del décimo pasaje, las células se congelaron en viales como un banco de células de investigación (RCB) . Un vial del RCB se descongeló y se cultivó en el medio que contiene metotrexato 8.0 µ?. Después de 5 días, la concentración de metotrexato en el medio se incrementó a 16.0 µ?, luego a 20.0 µ? 18 dias después. Las células del octavo pasaje en el medio que contiene metotrexato 20.0 µ? se clonó al limitar la dilución en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios que contiene el medio CD CHO que contiene GlutaMAX-lMR 4 mM y metotrexato 20.0 µ?. Los clones se identificaron 5-6 semanas después y el clon 2B2 se seleccionó para expansión en el medio que contiene metotrexato 20.0 µ?. Después del onceavo pasaje, las células 2B2 se congelaron en viales como un banco de células de investigación (RCB) .
Las células 2B2 resultantes, son células DG44 CHO deficientes de dihidrofolato reductasa (dhfr-) que expresan la PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20) . La PH20 soluble está presente en las células 2B2 en números de copias de aproximadamente 206 copias/célula. El análisis de Southern blot de ADN de células 2B2 genómicas digeridas con Spe I-, Xba I-Y BamH I/Hind III utilizando una sonda especifica de rHuPH20 reveló el siguiente perfil de digestión de restricción: una banda de hibridación mayor de -7.7 kb y cuatro bandas de hibridación menores (-13.9, -6.6, -5.7 y -4.6 kb) con ADN digerido con Spe I; una banda de hibridación mayor de -5.0 kb y dos bandas de hibridación menores (-13.9 y -6.5 kb) con ADN digerido con Xba I; y una sola banda de hibridación de -1.4 kb observada utilizando ADN 2B2 digerido con BamH I/Hind III.
C. Producción de la rHuPH20 soluble en Gen2 en 300 L de Cultivo de Células de Bioreactor Un vial de HZ24-2B2 se descongeló y se expandió de matraces de agitación a través de matraces de agitación de 36 L en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementados con metotrexato 20 µ? y GlutaMAX-lMR ( Invitrogen) . Brevemente, el vial de las células se descongeló en un baño de agua a 37°C, el medio se agregó y las células se centrifugaron. Las células se resuspendieron en un matraz de agitación de 125 mL con 20 mL del medio reciente y se colocó a 37 °C, en una incubadora a 7% de CO2. Las células se expandieron hasta 40 mL en el matraz de agitación de 125 mL. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 125 mL en un volumen de cultivo de 100 mL. El matraz se incubó a 37°C, C02 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 250 mL en un volumen de cultivo de 200 mL, y el matraz se incubó a 37°C, C02 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 1 L en volumen de cultivo de 800 mL y se incubó a 37 °C, C02 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 6 L en un volumen de cultivo de 5000 mL y se incubó a 37 °C, C02 al 7%. Cuando la densidad .celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 36 L en un volumen de cultivo de 32 L y se incubó a 36 L en un . volumen de cultivo de 32 L y se incubó a 37°C, C02 al 71.
Se esterilizó un reactor de 400 L y se agregaron 230 mL de medio CD-CHO. Antes del uso, el reactor se verificó para contaminación. Aproximadamente 30 L de células se transfirieron de los matraces de agitación de 36 L al bioreactor de 400 L (Braun) en una densidad de inoculación de 4.0 x 105 de células viables por mL y un volumen total de 260 L. Los parámetros fueron: punto de ajuste de temperatura, 37°C; Velocidad del Impulsor 40-55 RPM; Presión del Recipiente; 0.21 kg/cm2 (3 psi) ; Burbujeo de Aire Sparge 0.5-1.5 L/Min.; Súper Posición de Aire: 3 L/min. El reactor se muestreo previamente para conteos de células, verificación de pH, análisis del medio, producción y retención de proteínas. También, durante la corrida se agregaron alimentaciones de nutrientes. A 120 horas (día 5), 10.4L del Medio de Alimentación #1 (4x'CD-CH0 + 33 g/L de Glucosa. + 160 mL/L de Glutamax-1MR + 83 mL/L de Yeastolato + 33 mg/L rHuInsulina) se agregaron. A 168 horas (día 7), se agregaron 10.8 L de Alimentación #2 (2x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 80 mL/L de Glutamax-1MR + 167 mL/L de Yeastolato + 0.92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo .se cambió a 36.5°C. A 216 horas (dia 9), se agregaron 10.8 L de Alimentación #3 (1 x CD-CHO + 50 g/L de Glucosa + 50 mL/L de Glutamax-1MR + 250 mL/L de Yeastolato + 1.80 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambió a 36°C. A 264 horas (dia 11), 10.8 L de Alimentación #4 (1 x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 33 mL/L de Glutamax-1MR + 250 mL/L de Yeastolato + 0.92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambió a 35.5°C. La adición del medio de alimentación se observó que aumentó notablemente la producción de la rHuPH20 soluble en las etapas finales de la producción. El reactor se recolectó a 14 o 15 dias o cuando la viabilidad de las células descendió por debajo de 40%. El proceso dio por resultado una productividad final de 17,000 Unidades por mL con una densidad celular máxima de 12 millones de células/mL. En la recolección, el cultivo se muestreo para microplasma, biocarga, endotoxina y virus vitro e in vivo, mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) y actividad enzimática.
El cultivo se bombeó por una bomba peristáltica a través de módulos de sistema de filtración Millistak (Millipore) en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra diatomácea graduada a 4-8 µ?? y una capa de tierra diatomácea graduada a 1.4-1.1 µp?, seguido por una membrana de celulosa, luego a través de un segundo sistema de filtración Millistak individual (Millipore) que contiene una capa de tierra diatomácea graduada a 0.4-0.11 µt? y una capa de tierra diatomácea graduada a <0.1 µp\, seguido por una membrana de celulosa, y luego a través de un filtro final de 0.22 µ?? en una bolsa flexible de un solo uso estéril con una capacidad de 350 L. El fluido del cultivo celular recolectado se complementó con EDTA 10 mM y Tris 10 mM a un pH de 7.5. El cultivo se concentró lOx con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) utilizando cuatro filtros de poliéter sulfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa Sartoslice TFF (Sartorious) , seguido por un intercambio de solución amortiguadora 10 x con Tris 10 mM, Na2S04, 20 mM, pH 7.5 en un filtro final de 0.22 µ?? en una bolsa de almacenamiento estéril de 50 L.
La recolección diafiltrada, concentrada se inactivo para el virus. Antes de la inactivación viral, se preparó una solución de 10% de Tritón X-100MR, 3% de tri- (n-butil) -fosfato (TNBP) . La recolección diafiltrada, concentrada se expuso a 1% de Tritón X-100MR, 0.3% de TNBP durante 1 hora en un recipiente de reacción de vidrio de 36 L inmediatamente antes de la purificación en la columna Q.
D. Purificación de la rHuPH20 soluble en Gen2 Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (9 L de resina, H= 29 cm, D= 20 cm) . Las muestras de lavado se recolectaron para una determinación de pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL) . La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7.5. Después de la inactivación viral, la recolección diafiltrada, concentrada se cargó en la columna Q en una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7.5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.0. La proteina se eluyó con Hepes 10 mM, NaCl 400. mM, pH 7.0 en un filtro final de 0.22 µp? en una bolsa estéril. La muestra de eluato se sometió a prueba para biocarga, concentración de proteínas y actividad de hialuronidasa . Se tomaron lecturas de absorbancia A2so al principio y al final del intercambio.
Luego se llevó a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica de Fenil-Sepharose (Pharmacia) . Se preparó una columna de Fenil-Sepharose (PS) (19-21 L de resina, H=29 cm, D= 30 cm) . El lavado se recolectó y se muestreó para pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL) . La columna se equilibró con 5 volúmenes de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M, CaCl2 0.1 mM, pH 7.0. El eluato de proteina de la columna Q sepharose se complementó con sulfato de amonio 2M, fosfato de potasio 1 M y soluciones madre de CaCl2 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0.5 M y 0.1 mM, respectivamente. La proteina se cargó sobre la columna PS en una velocidad de flujo de 100 cm/hr y se recolectó el flujo pasante de columna. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M y CaCl2 0.1 mM pH 7.0 a 100 cm/hr y el lavado se agregó al flujo pasante recolectado. Combinado con el lavado de la columna, el flujo pasante se hizo pasar a través de un filtro final de 0.22 µta en una bolsa estéril.' El flujo pasante se muestreó para biocarga, concentración de proteina, y actividad enzimática.
Se preparó una columna de boronato de aminofenilo (Prometics) . El lavado se recolectó y se muestreó para pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL) . La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M. El flujo continuo de PS que contiene la proteina purificada se cargó en la columna de boronato de aminofenilo en una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó con fosfato . de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5' M, pH 7.0. La columna se lavó con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0.5 M, pH 9.0. La columna se lavó con bicina 20 mM, cloruro de sodio .100 mM, pH 9.0. La proteina se eluyó con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6.9 y se hizo pasar a través de. un filtro estéril en una bolsa estéril. La muestra eluida se sometió a prueba para biocarga, concentración de proteina y actividad enzimática.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Biorad) . El lavado se recolectó y se sometió a prueba para pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL) . La columna se equilibró con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0.1 mM, pH 7.0. La proteina purificada con boronato de aminofenilo se complementó a concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCl2 0.1 mM y se cargó sobre la columna HAP en una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0.1 mM. La columna luego se lavó con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl20.1 mM. La proteina se eluyó con fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0 y se hizo pasar a través de un filtro ' estéril de 0.22 µp en una bolsa estéril. La muestra eluida se sometió a prueba para biocarga, concentración de proteínas y actividad enzimática.
La proteína purificada con HAP luego se hizo pasar a través de un filtro de remoción de virus. El filtro Viosart esterilizado (Sartorius) primero se preparó al lavarcon 2 L de fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0. Antes del uso, la solución amortiguadora filtrada se muestreó para pH y conductividad. La proteina purificada con HAP se bombeó a través de una bomba peristáltica a través del filtro de remoción de virus de 20 nM. La proteina filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0 se hizo pasar a través de un filtro final de 0.22 µp? en una bolsa estéril. La muestra filtrada se sometió para la concentración de proteínas, actividad enzimática, oligosacáridos , monosacáridos y perfil de ácido siálico. La muestra también se sometió a prueba para impurezas relacionadas con el proceso.
La proteína en el material filtrado luego se concentró a 10 mg/mL utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon Slice de corte de peso molecular (MWCO) de 10 KDa (Sartorius) . El filtro primero se preparó al lavar con histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.0 y el permeado se muestreó para pH y conductividad. Después de la concentración, la proteína concentrada se muestreó y se sometió a prueba para concentración de proteínas y la actividad enzimática. Un intercambio de solución amortiguadora 6x se llevó a cabo en la proteína concentrada en la solución amortiguadora final: histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.0. Después del intercambio de la solución amortiguadora, la proteína concentrada se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 µp\ en una bolsa de almacenamiento estéril 20 L. La proteína se muestreó y se sometió a prueba para concentración de proteínas, actividad enzimática, grupos sulfidrilos libres, perfil de oligosacáridos y osmolalidad. El número de lote WRS2 se utilizó como un estándar en los ensayos ' descritos posteriormente, los resultados mostraron que la descripción de la prueba para la apariencia fue transparente e incolora; el pH fue 7.4; el nivel de endotoxina fue <0.01 EU/mL; la osmolalidad fue 308 mOsm/Kg; la densidad fue 1.005 -g/mL; el contenido de rHuPH20 fue 1.3 ppm; y la actividad de hialuronidasa fue 145 USP U/mL.
La proteína a granel filtrada estéril luego se dispensó asépticamente a 20 mL en viales de Teflon estériles de 30 mL (Nalgene) . Los viales luego se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -20 ± 5°C.
EJEMPLO 2 GENERACIÓN DE BIBLIOTECA DE MUTANTES PH20 A. Clonación y Mutagénesis En este ejemplo, una biblioteca de hialuronidasa PH20 se creó al clonar ADN que "codifica la PH20 humana en un plásmido seguido por transfeccion y expresión de proteínas.
La biblioteca se creó por mutagénesis de una plantilla de PH20 que es una versión optimizada con codón de PH20 con una secuencia líder Ig Kappa. Específicamente, para generar la biblioteca de variantes, el vector de expresión HZ24- PH20 (OHO) -IRES-SEAP (expuesta en SEQ ID NO: 4) se utilizó como una plantilla, que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica PH20 expuesta en SEQ ID NO: 1, que codifica una PH20 precursora expuesta en SEQ ID NO: 2 o una PH20 madura expuesta en SEQ ID NO: 3 que carece de los residuos 1-22 que corresponden a la secuencia señal IgK. La cadena principal del vector se derivó del vector HZ24 original que contiene el marcador de selección DHFR (véase el Ejemplo 1 y SEQ ID NO: 5) con la adición de. una secuencia líder IgK y la optimización del codón. El vector de expresión también se modificó para contener el gen para la fosfatasa alcalina secretada (SEAP). Por consiguiente, además de la secuencia que codifica la PH20, el vector de expresión HZ24-PH20 (OHO) -IRES-SEAP también contiene un sitio de entrada ribosomal interno (EMCV IRES) que se liga a la secuencia decodificación para el gen para la fosfatasa alcalina secretada (SEAP), y un promotor CMV individual que conduce la expresión de la PH20 y SEAP en el constructo. También contiene un gen para la resistencia a 1.a ampicilina. Con referencia a la secuencia de nucleótidos expuesta en . SEQ ID NO:4, la secuencia de nucleótidos que codifica PH20 que corresponde a los nucleótidos 1058-2464 (incluyendo la secuencia líder IgK) , la secuencia de nucleótidos que codifica SEAP corresponde a los nucleótidos 2970-4529, y el gen de resistencia a la ampicilina corresponde a los nucleótidos 5778-6635.
La primera biblioteca se hizo para generar proteínas variante codificadas en donde cada uno de los residuos 23-469 de SEQ ID NO: 2 (que corresponde a los residuos 1-447 de SEQ ID NO: 3 o los residuos 36-482 de SEQ ID NO: 6) se cambió a uno de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos, tal que cada miembro contuvo un cambio de amino individual. La biblioteca resultante contuvo 6753 de miembros variantes, cada uno que contiene una mutación de aminoácidos individual comparada con los residuos 23-469 de SEQ ID NO:2 (que corresponde a los residuos 1-447 de SEQ ID NO: 3 o los residuos 36-482 de SEQ ID NO: 6) . Soluciones madre de glicerol de la biblioteca resultante se prepararon y se almacenaron a -80°C. Los reemplazos de aminoácidos (mut) en cada miembro se listan en la Tabla 8 a continuación, y corresponden a los reemplazos de aminoácidos con referencia a la secuencia de aminoácidos de la PH20 expuesta en SEQ -ID. NO: 3 (y SEQ ID NOS: 7 o 32-66, que son la secuencia madura de la PH20 u otros fragmentos C-terminalmente truncados de la misma) . Los codones mutados correspondientes (cod) de cada variante de PH20 en la biblioteca también se listan en la Tabla 8, y corresponde a los cambios de residuos de nucleótidos en nucleótido de codificación correspondiente para PH20 expuesta como 1058- 2464 de SEQ ID NO: 4. Cada miembro se expresó y se clasificó para la actividad de hialuronidasa como se describe a continuación. 2. Expresión Para la expresión de cada, mutante, el ADN plásmido HZ24-PH20-IRES-SEAP que contiene ADNc que codifica una de la PH20 variante o que codifica la PH20 de tipo natural se transfectó en células CHO-S de monocapa (Invitrogen, Cat . No. 11619-012) utilizando Lipofectamina 200.0 (Invitrogen, Cat. No. 11668-027) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las células CHO-S se sembraron la noche anterior a transfección y desarrollo en DMEM con 10% de FBS que es 80%) confluente al siguiente dia. Después, el medio de las células CHO-S se reemplazó con Opti-MEM. Se hizo una mezcla de ADN plásmido y lipofectamina (0.2 g de ADN y 0.5 µ? de Lipofetamina) . La mezcla de Lipofectamina/ADN se agregó a las células CHO-S y se incubó durante la noche. Al siguiente dia, las células se complementaron con medios sin suero CD-CHO (Invitrogen, Cat. No. 10743-029) . El sobrenadante de las células transfectadas se recolectó en varios puntos de tiempo después de la transfección, y generalmente 96 horas después de la transfección. El sobrenadante, que contiene la proteína PH20 variante o PH20 de tipo natural que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, se almacenó a -20 °C. Las actividades de los sobrenadantes se clasificaron como se describe en los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 3 CLASIFICACIÓN DE LA BIBLIOTECA CON ENSAYO DE ACTIVIDAD DE HIALURONIDASA PARA IDENTIFICAR LA ACTIVIDAD DE MUTANTES En este ejemplo, los sobrenadantes de las variantes PH20 expresadas generadas en el Ejemplo 2 se clasificaron utilizando un ensayo de actividad de hialuronidasa para evaluar la actividad de cada mutante. Además, la actividad de la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) también se midió para permitir la normalización de la actividad de PH20 de los mutantes expresados a la PH20 de tipo natural. Se identificaron mutantes activos e inactivos. 1. Generación del Substrato HA Biotinilado (bHA) Un 1.2-MDa HA (Lifecore) se biotiniló para el uso como un substrato en el ensayo de actividad de hialuronidasa. Primero, 1.2 gramos (g) de 1.2 MDa HA se disolvió a 4°C en 600 mL de ddH20 durante una semana en una concentración de 2 mg/mL con agitación. Después, 645.71 mg de Biotin Hidrazida se disolvieron en 100 mL de DMSO a una concentración de 25 mM (6.458 mg/mL, 247.8 mg en 38.37 mL de DMSO). La solución de biotina se calentó brevemente a 37 °C hasta que la solución fue transparente. También, 368.61 mg de Sulfo-NHS en 20 mL de ddH20 se disolvieron para fabricar una solución 100X (18.4 mg/mL de Sulfo-NHS) . Se hizo una solución de carbodHmida EDC soluble en agua 30 mM (1000X) al disolver 17.63 mg de EDC en 3 mL de ddH20 en una concentración de 5.7513 mg/mL justo antes de que la reacción comenzara.
A cuatro (4) botellas tapadas estériles de 1000-mL, se agregaron los siguientes componentes a temperatura ambiente (RT) y en el siguiente orden con agitación: 1) 200 mL de 2 mg/mL de solución HA; 2) 80 mL de MES 0.5M, pH 5.0 con mezclado suave; y 3) 91.6 mL de dd¾0 con mezclado suave. Después, 24 mL de Biotin-Hidrazida 25 mM y 4 mL de solución Sulfo-NHS 100X se agregaron secuencialmente, inmediatamente seguido por la adición de 500 µ? de EDC. Después de la adición de cada componente, la solución se mezcló al invertir tres veces y agitación. .Después de la adición del último componente, la solución se mezcló por agitación durante la noche a 4°C. Luego, se agregó clorhidrato de Guanidina a una concentración final de 4 M al agregar 38.2 g por 100 mL y se dejó disolver completamente antes de ajustar el volumen de la solución a 600 mL con ddH20.
Para la diálisis, 200 mL de cada lote de la solución de clorhidrato de guanidina HA conjugada se transfirió en membranas de diálisis. Durante el curso de tres días, la solución se dializó contra ddH20 con un cambio en ddH20 por lo menos seis veces. El volumen resultante de aproximadamente 840 mL se ajustó a un volumen final de 1000 mL con ddH20. La concentración final del hialuronano biotinilado (bHA) fue 0.4 mg/mL. 2. Ensayo de Actividad de Hialuronidasa El ensayo enzimático fue una modificación del método descrito por Frost y colaboradores (1997) (A Microtiter-Based Assay for Actividad de hialuronidasa Not Requiring Specialized Reagents. Analytical Biochemistry (1997) 251:263-269) que proporciona una medición de la actividad de actividad de hialuronidasa PH20.
Primero, el substrato de HA biotinilado (bHA) se ligó a placas de microtítulo de plástico para generar placas de ensayo. Brevemente, 100 µ? de b-HA en 1 mg/mL en solución amortiguadora de carbonato 0.5 M (pH 9.6) se dispensó en cada pocilio de una microplaca de ligación alta (ligación extra-alta Immunolon 4 HBX; Thermo Scientific) . La placa se cubrió con un sellador de placas- y se almacenó entre 2-8 °C durante 24-48 horas.
Luego, la placa de ensayo se lavó con solución amortiguadora de lavado de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) 1 X que contiene 0.05% (v/v) de Tween 20 (PBST) . La PBST se generó de IX PBS (generada de Catálogo No. P5368, Sigma (Solución Amortiguadora de Fosfato 10 mM, Cloruro de Potasio 2.7 mM, Cloruro de Sodio 137 mM, pH 7.4) al colocar los contenidos de un paquete de PBS en un cilindro graduado de 1-L con 800 mL de agua desionizada, se disolvió por agitación y al agregar una cantidad suficiente de agua a 1 L) al agregar 500 µ? de Tween 20 (Catálogo No. 6505; EMD Bioscience) a 900 mL de PBS 1 X y al agregar una cantidad suficiente de agua a 1 L. El lavado se hizo utilizando el lavador de placas BioTek ELx405 Select CW (BioTek) al lavar cinco (5) veces con 300 µ? de solución amortiguadora de lavado PBST por pocilio para cada lavada. Al final de cada lavado, la placa se tapó en una toalla de papel para remover el liquido de exceso de cada pocilio. Antes de la incubación con las muestras, 200 µ de Solución Amortiguadora de Bloqueo (1.0% p/v de Albúmina de Suero Bovino (BSA) en PBS) se agregaron a cada pocilio y la placa de ensayo se incubó a 37 °C durante aproximadamente 1 hora previa. La solución amortiguadora de bloqueo se generó al agregar 2.5 g de BSA (Catálogo No. 001- 000-162; Jackson Immuno Research) a 200 mL de PBS 1 X, al agitar, agregar una cantidad suficiente de PBS 1 X a 250 mL y al filtrar a través de una unidad de filtro PES de 0.2 µ?.
Los sobrenadantes de PH20 variantes o de tipo natural transíectados generados como se describen en el Ejemplo 1 se diluyeron en duplicado 1:25 en una solución amortiguadora diluyente de ensayo (pH 7.4 solución amortiguadora HEPES; HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 1 mM, 1 mg/mL de BSA, pH 7.4, 0.05% de Tween-20) en microplacas ligadas altas 4XHB no recubiertas. Para la curva estándar, diluciones en serie de 1:3 de rHuPH20 (generada como se describe en el Ejemplo 1 con una actividad especifica de 145 U/mL) se hicieron en la solución amortiguadora diluyente de ensayo en duplicado comenzando de 3 U/mL para los estándares como sigue: 3 U/mL, 1 U/mL, 1/3 U/mL, 1/9 U/mL, 1/27 U/mL, 1/81 U/mL, y 1/243 U/mL. Cien microlitros (100 µ?) de cada estándar y muestra se transíectaron a las placas de ensayo y se incubaron durante aproximadamente 1.5 horas a 37 °C.
Después de la incubación, la placa se lavó con PBST utilizando el lavador de placas BioTek ELx405 Select CW al lavar cinco (5) veces con 300 µ de solución amortiguadora de lavado de PBST por pocilio para cada lavado. Al final de cada lavado, la placa se tapó en una toalla de papel para remover el exceso de liquido de cada pocilio. Luego, 100 µ? de Estreptavidina-HRP diluida 1:5000 (SA-HRP) se agregó a cada pocilio de la placa y se · incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Para la dilución, 1 mg/mL de una solución madre de conjugado de Estreptavidina-HRP (Catálogo No. 21126; Thermo Scientific) se diluyó 1:5000 en solución amortiguadora de dilución (1 mg/mL de BSA, 0.025% de Tween20, NaCl 137 mM, Tris 20 mM pH 7.5). Después de la incubación, la placa se lavó con PBST utilizando el lavador de placas BioTek ELx405 Select CW al lavar cinco (5) veces con 300 µ? de solución amortiguadora de lavado PBST por pocilio para cada lavado. Al final de cada lavado, la placa se tapó en una toalla de papel para remover el liquido en exceso de cada pocilio. Luego, 100 µ? de solución TMB (Catálogo No. 52-00-03, KPL; temperatura ambiente y protegida de la luz a) se agregó a cada pocilio durante aproximadamente cinco (5) minutos a temperatura ambiente o hasta que se produjo un desarrollo de color óptimo. Para detener la reacción, 100 µ? de Ácido Sulfúrico 3.0 N o solución de Detección TMB (Catálogo No. 50-85-06) se agregaron a cada pocilio y las placas se taparon para mezclado. La densidad óptica se midió a 450 nm dentro de 30 minutos para agregar la solución de detección. Puesto que más PH20 en un estándar o muestra conduciría a menos bHA disponible para ligarse a SA-HRP, el valor de densidad óptica (450 nm) fue proporcionalmente inverso a la concentración de la actividad de hialuronidasa en cada muestra. 3. Actividad de SEAP La actividad de la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) en el sobrenadante de cultivo celular también se midió utilizando un ensayo colorimétrico de fosfatasa alcalina de placenta utilizando pNPP como un substrato de fosfatasa (Anaspec SensoLyte pNPP SEAP kit; Catálogo No. 72144, Anaspec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal de absorbencia se midió en densidad óptica (OD) de 405 nm.
Los criterios para la clasificación de alto rendimiento (HTP) fueron que el sobrenadante transfectado dio por resultado una señal SEÁP de > 0.1 y la señal para el control de tipo natural de rHuPH20 produjo una señal de = 1 U/mL. También, los criterios para cada clasificación fueron que las curvas estándares tuvieran una relación de señal a ruido (S/N) para 0 U/mL del estándar versus 3 u/mL del estándar en OD405 de = 5, tuvo menos que tres (3) estándares con un coeficiente de variación (CV) = 10%), y por lo menos cuatro (4) de los estándares estuvieron en el intervalo lineal.
EJEMPLO VARIANTES DE PH20 SELECCIONADAS CON ACTIVIDAD DE HIALURONIDASA ALTERADA Cada variante generada se clasificó para la actividad de hialuronidasa como se describe en el Ejemplo 3. La expresión de SEAP se utilizó para normalizar la actividad de PH20 de cada variante a la . PH20 de tipo natural. Se identificaron mutantes que mostraron actividad de hialuronidasa comparada con el tipo natural.. 1. Mutantes Activos Se seleccionaron mutantes activos mediante los cuales por lo menos una muestra ' duplicada mostró mayor que 40% de actividad de tipo natural cuando se normalizó a la actividad de SEAP. Los mutantes activos identificados se exponen en la Tabla .9. La Tabla 9 expone el reemplazo de aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de PH20 expuesta en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de mutantes ejemplares también se expone por referencia a una SEQ ID NO. La Tabla también expone la actividad de hialuronidasa promedio de duplicados sometidos a prueba normalizados por valores SEAP comparados con el promedio de. las actividades de PH20 de tipo natural en cada placa, que también se normalizaron por sus propios valores SEAP. Por ejemplo, un valor de 0.40 indica que la variante muestra 40% de la actividad de hialuronidasa de PH20 de tipo natural, un valor de 1 indica que la variante muestra una actividad hialuronidasa similar de tipo natural y un valor de 3.00 indica que la variante muestra. 300% de la actividad de hialuronidasa de PH20 de tipo natural o 3 veces la actividad incrementada comparada con el tipo natural.
Los resultados en la Tabla 9 muestran que más de 600 mutantes sometidos a prueba muestran la actividad que se incrementa comparado con el tipo natural. Por ejemplo, aproximadamente 536 mutantes muestran 120% o mayor que 120% de la actividad de hialuronidasa de PH20 de tipo natural y aproximadamente 75 de los mutantes muestran 300% o mayor que 300% de la actividad de hialuronidasa de PH20 de tipo natural. En particular, los resultados en la Tabla 9 muestran que la actividad de hialuronidasa comparada con el tipo natural del mutante S69A es de aproximadamente 22 veces; el mutante S69R es aproximadamente 14 veces; el mutante I70A es de aproximadamente 27 veces; el mutante I70K es de aproximadamente 14 veces; el mutante I70R es de aproximadamente 14 veces; y el mutante 1271L es de aproximadamente 10 veces. 2. Mutan es Inactivos Los otros mutantes que mostraron menos que 20% de actividad de hialuronidasa de PH20 de tipo natural, en por lo menos uno de los duplicados, se clasificaron para confirmar que los mutantes muertos están inactivos. Para confirmar los mutantes inactivos, el ensayo de actividad de hialuronidasa descrito en el Ejemplo 3 se modificó para incorporar una etapa de incubación de substrato-muestra a 37 °C durante la noche para medición de la actividad enzimática. El ensayo modificado se propone para detectar actividades de PH20 por debajo de 0.2 U/mL.
La preparación de las placas recubiertas con bHA y bloqueo de las placas antes de la adición de los sobrenadantes de variantes transfectadas o PH20 de tipo natural fue la misma como se describe en el Ejemplo 3. El ensayo se modificó como sigue. Primero, los sobrenadantes de variantes transfectadas o PH20 de tipo natural que no contiene una mutación generada como se describe en el Ejemplo 2 se diluyeron en duplicado 1:25 en diluyente de ensayo. Para la curva estándar, las diluciones en serie de 1:3 de rHuPH20 (generada como se describe en el Ejemplo 1) se hicieron en el diluyente de ensayo en duplicado comenzando de 0.1 U/mL por debajo de 0.00014 U/mL. Un pocilio en blanco también se incluyó. Luego, 100 µ? de' las muestras diluidas o estándar se agregaron a los pocilios pre-designados de la placa recubierta y bloqueada con bHA y se . dejó incubar a 37°C durante la noche. Después de la incubación, las placas se lavaron y la ligación a bHA se detectó como se describe en lo anterior en el Ejemplo 3. La densidad óptica se midió a 450 nm dentro de 30 minutos de adición de la solución de detección.
Los mutantes inactivos reconfirmados identificados son como se exponen en la Tabla 10. La Tabla expone el reemplazo de aminoácidos comparado ' con la secuencia de aminoácidos de xpuesta en SEQ ID NO: 3.
TABLA 10 : Mutantes Inactivos EJEMPLO 5 ENSAYO PARA LA ACTIVIDAD DE HIALURONIDASA BAJO CONDICIONES DE TEMPERATURA Y FENOFILICAS Los sobrenadantes de variantes de la actividad de PH20 expuestas en la Tabla 9, como se identifica en el Ejemplo 4, se sometieron a prueba para estabilidad bajo condiciones termofilicas y/o fenofilicas. El ensayo para medir la actividad de hialuronidasa bajo condiciones de temperatura y fenofilicas utilizando HA biotinilado (bHA) como substrato para medir la actividad de hialuronidasa se modificó del ensayo original descrito en el e Ejemplo 3 en que se incorporó una incubación a 37 °C durante 4 horas de las muestras con o sin m-cresol antes de la medición de la actividad enzimática. El ensayo se utilizó para identificar mutantes PH20 con propiedades termofilicas (mayor actividad en una condición a 37°C que a 4°C y/o con propiedades fenolfilicas (actividad mayor, en presencia de m-cresol que PH20 de tipo natural) . 1. Clasificación Primaria Antes de la incubación de las muestras con bHA, las muestras de PH20 variantes se diluyeron en pocilios designados de una placa 4XHB no recubierta para pre-incubación a 37°C durante 4 horas bajo las siguientes condiciones: 1) pre-incubación a 37°C con 0.4% de m-cresol; y 2) pre-incubación a 37°C sin 0.4% de m-cresol. Para la pre-incubación a 37°C con 0.4% de m-cresol, se preparó 1% de solución madre intermedia de m-cresol de 50% (v/v) de solución madre de m-cresol. Brevemente, en un vial de vidrio Wheaton de 2 mL a 50% de solución madre de m-cresol (Fluka, Catálogo No. 65996; Spectrum, Catálogo No. C2773) se hizo en metanol basado en la densidad (D=1.034 g/L) . El vial se selló y se almacenó a -2-0 °C con protección de luz en alícuotas pequeñas. Luego, la solución madre intermedia al 1% se genero por dilución en solución amortiguadora de ensayo HEPES (HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 1 mM, 1 mg/mL de BSA, pH 7.4, 0.05% de T een-20) diaria inmediatamente antes del uso en una campana extractora con agitación vorticial.
Luego, los duplicados de las muestras de sobrenadantes variantes transfectadas expuestas en la Tabla 9, generadas como se describe en lo. anterior en el Ejemplo 2, cada una se sometió separadamente a una dilución de 1:2.5 de 1% de m-cresol en solución amortiguadora de ensayo HEPES/sobrenadante transfectado para obtener 0.4% de concentración final de m-cresol. Para la pre-incubación a 37°C sin 0.4% de m-cresol, las muestras de sobrenadante de variantes transfectadas se sometieron a una dilución de 1:2.5 en solución amortiguadora de ensayo HEPES/sobrenadante ' transfectado. Además, para cada condición, un control de exterminio interno también se sometió a prueba al enriquecerse en 3 U/mL de rHuPH20 en una solución amortiguadora- HEPES de pH 7. (generada como se describe en el Ejemplo 1) que se diluyó como se describe en lo anterior para las muestras transfectadas . Las placas se sellaron con selladores de placas y se incubaron a 37 °C durante 4 horas.
La preparación de las placas recubiertas . con bHA y el bloqueo de las placas antes de la adición de los sobrenadantes de variantes transfectadas o PH20 de tipo natural fue la misma como se describe en el Ejemplo 3. El ensayo se modificó adicionalmente como sigue. Primero, las muestras se diluyeron en duplicado 1:10 en solución amortiguadora de ensayo HEPES en placas 4XHB. Para cada variante, las muestras que se sometieron a prueba fueron 1) sobrenadante variante transfectado no pre-incubado (sin incubación; 4°C; 2) sobrenadantes variantes transíectados pre-incubados a 37 °C durante 4 horas con 0.4% de m-cresol (Cresol); o 3) sobrenadante variante transíectados pre-incubados a 37 °C durante 4 horas sin 0.4% de m-cresol (sin cresol; 37°C). Además, las muestras enriquecidas también se sometieron a prueba. Una curva estándar que utiliza rHuPH20 se hizo como se describe en el Ejemplo 3 sin m-cresol. Cien microlitros (100 µ?) de cada estándar y muestra se transfirieron a pocilio pre-designados de la placa recubierta y bloqueada con bHA y se incubaron durante aproximadamente 1.5 horas a 37 °C. . De esta manera, cada muestra de cada variante se sometió a prueba en cuadriplicado debido a la pre-incubación de las muestras duplicadas de cada uno de los sobrenadantes variantes transfectados en la etapa de pre-incubación y duplicado adicional de cada muestra en el ensayo de bHA.
Después de la incubación, las placas se lavaron y se ligaron a bHA detectados como se describe en lo anterior en el Ejemplo 3. La densidad óptica se midió a 450 nm dentro de 30 minutos de adición de la solución de detección.
La actividad U/mL se calculó de la curva estándar y se comparó. Los resultados se representaron como el porcentaje (%) de actividad que permanece bajo cada uno de los siguientes parámetros: relación de la actividad a 1) pre-incubación 37 °C sin m-cresol/4 °C; 2) 37 °C después de la pre-incubación con m-cresol/4 °C,\ y 3) 37 °C después de la pre-incubación con m-cresol/después de la pre-incubación a 37 °C sin m-cresol. Los aciertos de fenófilos iniciales para reconfirmación se identificaron como aquellos que en un ensayo duplicado mostraron un porcentaje de actividad restante bajo condición 3) de = 20% de la actividad original a 37°C.
Los Aciertos iniciales se volvieron a clasificar utilizando un ensayo de reclasificación de placas de 6 pocilios. Para la reclasificación, el ADN plásmido correspondiente a cierto potencial se transformó en bacterias de E. coli y ADN plásmido preparado y purificado utilizando MaxiPrep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se confirmó la secuencia de ADN.
El ADN plásmido se transfectó en células CHO-S de monocapa (Invitrogen, Cat'. No. 11619-012) desarrolladas sobre placas de 6 pocilios en una densidad de aproximadamente 50- 80% de confluencia utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Cat . No. 11668-027) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Las transfecciones se llevaron a cabo en duplicado. Las células se incubaron a 37°C en un incubador de C02 durante 96 horas pos-transfección antes de la recolección del sobrenadante para el ensayo. Como controles, las células también se transfectaron con el vector de expresión HZ24-PH20 (OHO) -IRES-SEAP (SEQ ID NO : 4 ) que contiene una secuencia PH20 de tipo natural optimizada con codón (OHO) . Las células simuladas también se incluyeron como controles.
Noventa y seis (96) horas post-transfecciones , el sobrenadante se recolectó de cada muestra, incluyendo los controles OHO y simulados, y se sometieron a ensayo para actividad de hialuronidasa bajo varias condiciones como se describe en lo anterior: 1) sobrenadante variante transfectado no pre-incubado (sin incubación; 4°C); 2) sobrenadantes variantes transfectados pre-incubados a 37°C durante 4 horas con 0.4% dem-cresol (Cresol; 37°C); o 3) sobrenadante variante transfectado pre-incubado a 37°C durante 4 horas sin 0.4% de m-cresol (sin cresol; 37°C).
La actividad de hialuronidasa se determinó como se describe en lo anterior utilizando el ensayo bHA.
Los resultados se evaluaron como se describe en lo anterior. La actividad de hialuronidasa absoluta (U/mL) se generó de la curva estándar. Además, el porcentaje d actividad se determinó como una relación de actividad 37°C/4°C, 37°C más m-cresol/4 °C, y 37°C más m-cr.esol/37 °C Los resultados se exponen en las Tablas 11 y 12 continuación. n/a (no disponible; por ejemplo, más allá del limite de detección) n/a (no disponible; por ejemplo, más allá del limite de detección) 2 . Resumen de los Resultados para F204P Para el F204P mutante, los resultados anteriores o sobrenadante sometido a prueba de la transfeccion transciente de las células CHO-S incubadas en presencia de m-cresol en un ensayo de actividad enzimática bHA mostró que la proteina mutante F204P fue sumamente resistente al tratamiento con 0.4% de m-cresol. Los resultados mostraron que la actividad que permaneció después, de 4 horas de incubación con 0.4% de m-cresol a 37 °C fue aproximadamente igual a la actividad observada cuando la enzima se incubó a ya sea 4°C o a 37 °C en ausencia de un m-cresol. El control positivo (WT PH20 - OHO) mostró una reducción en la actividad de 75% y 83% en el día del ensayo (como se sometió a ensayo después de dos transíecciones de OHO diferentes). Esto mostró que el fenófilo F204P fue capaz de retener 60% a 90% mayor de su actividad por arriba de la actividad residual de la enzima de control PH20 de tipo natural.
A fin de confirmar la estabilidad de F204P en el tratamiento con m-cresol. o la exposición a la temperatura incrementada, una segunda transfección de F204P se llevó a cabo en duplicado utilizando células CHO-S, y el sobrenadante clarificado se sometió a prueba nuevamente para su estabilidad a 4°C, a 37 °C durante 4 horas con 0.4% de m-cresol y a 37°C durante 4 horas sin 0.4% de m-cresol. Los resultados confirmaron que la enzima mutante F204P retuvo una alta cantidad de actividad de hialuronidasa después de la incubación a 4 horas en m-cresol a 37°C. Los resultados fueron similares a los resultados observados en la primera clasificación del mutante, con F204P que retiene cualquiera de 57% a mayores que 90% de su actividad por arriba de la actividad residual de la enzima de control PH20 de tipo natural después de la incubación de 4 hora.
Un resumen de la actividad enzimática de F204P comparada con la de control de tipo natural se expone en la Tabla 13.
EJEMPLO 6 EXPRESIÓN A GRAN ESCALA Y PURIFICACIÓN DE LA VARIANTE PH20 HIT 1. Expresión y Purificación ADNc que contiene ADN plásmido HZ24-PH20-IRES-SEAP que codifica una de la PH20 variante se transfectó en células CHO-S de monocapa como se describe generalmente en el Ejemplo 2. Las células CHO-S se cultivaron en matraces de agitación utilizando el medio CD-CHO complementado con GlutaMAX (8 mM) . En el día de la transfección, se prepararon 15 matraces de aproximadamente un volumen · de 300 mL que contienen las células CHO-S en una densidad, de aproximadamente 1.0 x 106 células/mL. Cada .matraz de 300 mL se transfectó utilizando 375 iq de ADN plásmido que codifica el mutante F204P combinado con 375 µg del reactivo de transfección Freestyle MAX. El. ADN plásmido transfectado tuvo una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: que contiene un cambio de codón de TT a ' C.CT en las posiciones de nucleótidos 1733-1735, codificando de esta manera el mutante F204P. Las células transíectadas luego se descongelaron para permanecer en el cultivo durante 96 horas, mediante lo cual las células y el medio se recolectaron y se agruparon. Las células se agruparon por centrifugación (4000 x g, 20'), y el sobrenadante se retuvo para purificación de la proteina F204P (aproximadamente 4.5 litros) .
El sobrenadante crudo se concentró lOx utilizando un sistema de filtro Tangencial de 30 kDa (TFF) (Millipore Pellicon XL, Bimax 30, 200 mL de volumen de hueco; 50 cm2 de área superficial de filtro) hasta que el volumen fue de aproximadamente 450 mL. El permeado se guardó para ensayo para detectar el flujo pasante de la proteina F204P. Un intercambio de solución amortiguadora de flujo libre para el material retenido luego se llevó a cabo utilizando 4 litros de solución amortiguadora (NaP04 10 mM; NaCl 25 mM, pH 7.2). El volumen del material retenido se redujo nuevamente a aproximadamente 200 mL, y luego el permeado restante en el sistema se purgó (volumen de hueco ~200 mL) y el sistema se lavó utilizando aproximadamente 50 mL de solución amortiguadora para producir un producto concentrado final de aproximadamente 450 mL.
Una columna de afinidad anti-rHuPH20 se preparó al acoplar IgG anti-rHuPH20 de conejo purificada por afinidad de antigeno a Sepharose 4 Fast Flow activada con CNBr (GEHealth catálogo No. 17-0981 -01). Brevemente, 0.7 g del polvo de Sepharose 4 pre-activado se suspendió en HC1 1 mM en una columna de vidrio de 10 mL durante 30 minutos para permitir que el polvo se hinchara.. La solución se drenó de la columna y se lavó con 15 volúmenes de gel (aproximadamente 30 mL) de HC1 1 mM frió por gravedad. La columna se lavó con 5 volúmenes de gel de solución amortiguadora de acoplamiento (NaHC03 0.1M; NaCl 0.5M a pH 8.3). Después, 5 mg de IgG anti-rHuPH20 de conejo a > 1.0 mg/mL en solución amortiguadora de acoplamiento se agregó a la columna en una relación de proteina/gel de 2-3 mg/mL de gel. La columna se hizo girar cabeza a cabeza a 4°C durante la noche. El flujo pasante se recolectó para la determinación de deficiencia de acoplamiento. El gel se. lavó con 2 volúmenes de gel de solución amortiguadora de acoplamiento, y luego se lavó y se resuspendió en etanolaminina 1 M a pH 9.5 durante 2 horas a temperatura ambiente para bloquear los sitios activados no utilizados. El gel se lavó 6 veces con 5 volúmenes de gel por solución amortiguadora de acoplamiento alternante de lavado y NaAc 0.1, NaCl 0.5M, pH . 4.5. El gel luego se lavó con 10 volúmenes de gel de TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.15 M, pH 7.5). Se determinó la eficiencia de acoplamiento (una concentración de proteína post-acoplamiento/concentración de proteina pre-acoplamiento x 100%). El anticuerpo acoplado en gel se almacenó en TBS con 0.02% de NaN3 a 4°C.
El producto de sobrenadante concentrado se cargó subsecuentemente sobre una columna de afinidad anti-rHuPH20 en una velocidad de aproximada de 5 mL/min. La elución se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento estándar utilizando un sistema de purificación GEMR AKTA FPLC (GE Healthcare, Product No. 18-1900-26), mediante lo cual la proteina se eluyó a través de un lavado de glicina con pH bajo (glicina-HCl 0.1 M, pH 2.5) en fracciones de 1 mL. Cada fracción se neutralizó inmediatamente por la adición de 100 µ? de Tris 1M, pH 7. '5.
La proteína eluída se sometió a ensayo al resolver las bandas de proteínas en un gel de Tris-glicina gradiente SDS-PAGE al 4-20%. Los estándares M pre-teñidos SeeBlueMRPlus2 (Life Teechnologies; Catálogo No. LC5925) se utilizaron como estándares de peso molecular, y 50 ng de rHuPH20 (como se describe en el Ejemplo 1) se utilizaron como un control positivo. El gel de poliacrila'mida se tiñó con Azul instantáneo para mostrar la proteina total de cada fracción. Para confirmar las bandas · que en el gel son PH20, el gel se transfirió a una membrana PVDF (Invitrogen) , que se sometió al análisis de Western Blot utilizando un anticuerpo primario anti-PH20 de Conejo generado al inmunizar conejos con rHuPH20 y un anticuerpo secundario anti-conejos de HRP-Cabra (Calbiochem, Cat. No. DC03L) .
Luego, el flujo pasante de la carga inicial de la columna de afinidad, se volvió a cargar sobre la columna dos veces debido a la baja capacidad de la columna de afinidad. Todas las fracciones que contienen la proteina, luego se combinaron ando por resultado un volumen total que fue de aproximadamente 13 mL . Este producto luego se dializó durante la noche versus cuatro litros de solución amortiguadora (NaP04 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7.2) utilizando un Slide-A-Lyzer Dialy-sis Cassette G2 (20, 000 MWCO) con una capacidad de 15 mL. La solución amortiguadora luego se cambió y el producto se dializó contra segundos cuatro litros recientes de la misma solución amortiguadora. La proteina F204P luego se concentró utilizando una columna de centrifugación Amicon Ultra (Millipore; 10,000 MWCO) a una volumen final de aproximadamente 450 µ? (10 minutos a 4000 xg) · 2. Caracterización de la Proteina La proteina purificada se caracterizó por su concentración de proteina, actividad y pureza.
Para determinar la concentración de proteina de la proteina purificada, se llevó a cabo un ELISA de cuan.tificación como se describe en el Ejemplo 7. También, la actividad de hialuronidasa se determinó como se describe en e el Ejemplo 3. La concentración de proteina después de la centrifugación se estimó que es de aproximadamente 400 g/mL. La proteina purificada también se resolvió en un gel de Tris-glicina gradiente SDS-PAGE al 4-20%, que luego se tiñó con Azul Instantáneo. Los resultados de la tinción mostraron que la proteina fue esencialmente una proteina de peso molecular individual de aproximadamente 63 kDa, similar al control rHuPH20. Ningún producto degradante apreciable se detectó por este método. Los rendimientos aproximados de la proteina en varios puntos de tiempo y la actividad durante la purificación se describen en la Tabla 14.
La pureza de la 'proteína purificada se determinó por HPLC de Fase Inversa (RP-HPLC) . El tiempo de elución de la columna de fase inversa fue esencialmente idéntica, a aquella observada con la hialuronidasa humana recombinante (HUB) , y proporciona una base para la estimación cruda de la pureza de la muestra a aproximadamente 80-90%.
EJEMPLO 7 CUANTIFICACIÓN UTILIZANDO EL ELISA La cuantificación de PH20 o variantes se llevaron a cabo utilizando un ELISA que captura la proteína utilizando un anticuerpo de captura anti-rHuPH20. Específicamente, un día antes de llevar a cabo el ELISA, placas 4HBX de 96 pocilios se recubrieron con anticuerpo de captura (anticuerpo anti-PH20 policlonal de conejo purificado con proteína G generado al inmunizar conejos con rHuPH20; 1 mg/mL de solución madre) a 1 ug/mL en fosfato 100 mM (pH 7.2) en un volumen total de 100 L por pocilio. Las placas se almacenaron a 4°C durante la noche. Al siguiente día, las placas se lavaron 5x con lxPBS a 300 L/pocillo con un lavador de placas. Después de cada lavado, las placas se les aplicaron palmadas en seco sobre toallas de papel. Luego, las placas se bloquearon con 200 yL de PBS que contiene Tween 20 (lxPBST) por pocilio a temperatura ambiente durante 1 hora. ¦ Los estándares y las muestras se agregaron a la placa. Para generación del estándar, 1 mg/mL de solución m adre de rHuPH20 (Ejemplo 1) se diluyó de manera reciente a 50 yg/mL en solución amortiguadora de ensayo HEPES pH 7.4 como una solución madre intermedia. Luego, para los estándares, 50 µq/ L de solución madre se diluyeron en duplicado en 360 pL de O.SxPBS a 300 ng/mL para el primer estándar (primera fila). Para las otras filas estándares, 240 µL de 0.5xPBST se agregaron a cada pocilio, y se hicieron diluciones en serie de 1:3. Para las muestras de sobrenadante transíectadas, 360 yL por pocilio se agregaron en duplicado en la primera fila, y cada una también se diluyó en serie como se describe en lo anterior en 0.5x PBST. Para las muestras purificadas, 100 ]i se agregaron por pocilio. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron 5x con lxPBST a 300 L/pocillo utilizando un lavador de placas. Después de cada lavado, las placas se palmearon en seco sobre toallas de papel.
Un anticuerpo. anti-PH20 conjugado con HRP . se preparó para detección utilizando un kit de conjugación HRP (Pierce, Thermo-Fisher; Catálogo No. 31489). 1 mg de un anticuerpo policlonal de conejo purificado con proteina G generado al inmunizar conejos con rHuPH20 se diluyó en 1 mL de PBS y 1 mL de solución amortiguadora de kit de carbonato 2 x. Después, 100 L de peroxidasa se agregaron a 1 mL de la solución de anticuerpo anterior y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, 10 pL de solución madre NaBH4 se agregaron en una campana .extractora y la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para desactivar la reacción, 20 pL de etanolamina se agregaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. A esto, 1/25 de volumen de albúmina de suero humano al 5% (jeringa de 0.1 mL) se agregaron para ' proporcionar 2 mg/mL de reacción de solución madre de albúmina. El pH se ajustó a aproximadamente 7.9 por la adición de 250 \iL de Tris 1 M pH 7.4. La concentración de la solución madre fue 400 µq/ L. La solución madre se diluyó adicionalmente 1/10 en PBS Tween20 (0.05%) que contiene 0.5% de albúmina de suero humano y conservadores, y luego se filtró estéril.. La solución madre se almacenó a 4°C o se congeló a -20°C.
Los anticuerpos se detectaron utilizando el anticuerpo anti-PH20 conjugado con HRP que se diluyó lOOOx en 0.5x do PBST. 100 uL del anticuerpo diluido se agregaron a todos los pocilios de la placa y la placa se incubó durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron 5x con lxPBST a 300 L/pocillo utilizando un lavador de placas. Después de cada lavado, las placas se palmearon en seco sobre toallas de papel. Luego, 100 de substrato TMB se agregaron a cada pocilio y la reacción se detuvo después de 5-10 minutos al agregar 100 µ?, de solución de detección por pocilio. La placa se leyó a OD45o- EJEMPLO 8 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE PH20 La actividad enzimática de PH20 en las muestras tal como cultivos celulares, fracciones de purificación y soluciones purificadas se determinó utilizando un ensayo turbidimétrico, que se basa en la formación de un precipitado insoluble cando el ácido hialurónico. se liga con el cloruro de cetilpiridinio (CPC) . La actividad se mide la incubar la PH20 con hialuronano para un periodo de tiempo establecido (30 minutos) y luego se precipita el hialuronano no digerido con la adición de CDC. La turbiedad de la muestra resultante se mide a 640 nm. La disminución en la turbiedad que resulta de la actividad enzimática en el substrato de hialuronano es una medición de la actividad enzimática de PH20. El método se ejecuta utilizando una curva de calibración generada con diluciones de un estándar de referencia de trabajo de ensayo de PH20 (estándar rHuPH20 generado como se describe en el Ejemplo 1), y las mediciones de la actividad de la muestra se hacen relativas a esta curva de calibración.
Las diluciones de la muestra y estándares se prepararon en Solución Diluyente de Enzimas (NaCl 70 mM, 0.1% de albúmina de suero humana [HSA] , 0.67 g/L de hidrolizado de gelatina en solución amortiguadora PIPES 25 mM, pH 5.5). Las muestras se diluyeron a una concentración apropiada. El ácido hialurónico (HA, MW promedio de 20 - 50 kDa) de Lifecore Biomedical (Chaska, MN) también se preparó en 1 mg/mL en solución de substrato que contiene PIPES 25 mM, NaCl 70 mM en pH 5.5. Las cantidades iguales de las dos soluciones anteriores se mezclaron para preparar 1 mL de una mezcla de reacción y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. La reacción se detuvo por la adición de 4 mL de Solución de Cloruro de Cetilpiridinio (CPC, 5.0 mg/mL). Después de un breve movimiento vorticial, la turbiedad de la mezcla de muestra se leyó a 640 nm y la actividad se determinó al ajustarse contra una curva estándar. La actividad especifica (Unidades/mg) se calculó .al dividir la cantidad enzimática (U/mL) por la concentración de proteína (mg/mL) .
EJEMPLO 9 ESTABILIDAD DE LA VARIANTE F204P-PH20 EN CONSERVADOR Para confirmar los resultados de clasificación, una cantidad estimada que para ser aproximadamente 450 U/mL de la proteína F204P purificada como se describe en el Ejemplo 6 se formuló en fosfato de' sodio 10 mM, pH 6.5, NaCl 120 mM, metionina 10 mM, 0.01% de Pluronic F-68, 0.1% de fenol y 0.15% de m-cresol. Un artículo de prueba que también contuvo una cantidad estimada para ser aproximadamente 450 U/mL de rHuPH20 de tipo natural (generada como se describe en el Ejemplo 1) en la misma formulación también se preparó para servir como un control. Cada solución de formulación se dividió en alícuotas en 0.5 mL y se llenó en viales de vidrio de borosilicato Tipo I de USP de - 2 mL con un tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio. Los viales se incubaron a 5°C, 30°C o 37°C. Las muestras se retiraron de la incubadora en varios tiempos y la actividad enzimática se midió como se describe en el Ejemplo 8.
Los resultados de las mediciones de la actividad enzimática se muestran en la Tabla 15. Como se puede observar, la rHuPH20 de control de tipo natural mostró una disminución rápida en actividad cuando se incubó a 37 °C en presencia de conservador fenólicos. En contraste, el mutante F204P no mostró pérdida significativa en la actividad por todo el estudio. Los resultados también muestran que la actividad de PH20 es retenida después de la incubación por hasta 4 semanas a 5°C y 30 °C comparado con la actividad de la rHuPH20 de control de tipo natural que no contiene la mutación. Estos resultados confirman que la F204P tolera el nivel EPB del conservador (0.1% de fenol y 0.15% de m-cresol) y es estable a 37 °C durante por lo menos hasta 6 días a 5°C y 30 °C para mayor que un mes.
TABLA 15: Estabilidad de rHuPH20 de tipo natural y mutante F204P incubado con conservador EJEMPLO 10 ESTABILIDAD DE LA VARIANTE F204P-PH20 EN LA CO-FORMULACIÓN DE INSULINA La variante F204P PH20 se sometió a prueba por su estabilidad en una co-formulación que contiene un análogo de insulina (insulina aspart o insulina lispro).
En las co-formulaciones sometidas a prueba, la insulina lispro fue un producto comercial (Insulina Lispro: Eli Lilly HumalogMR (insulina Lispro) 100 U/mL, Lot A572364).
En las co-formulaciones sometidas a prueba, el análogo de insulina aspart fue un asparto reprocesado preparado al agrupar 12 viales (10 mL cada uno) de un producto comercial (Insulina Aspart: Novo Nordisk, NovoRapidMR (insulina Aspart) , Lot XS60195) , que luego se concentró utilizando un concentrados de columna Ultracel-10 K de Amicon hasta que la concentración final fue de aproximadamente 5 veces la concentración original. El análogo de insulina se precipitó por la adición de acetato de', sodio 1 M, pH 5.3 y cloruro de zinc 30 mM (ZnCl2, EMD, Cat No. 2X0065-1) a 1/10 del volumen de solución de proteina. La solución se colocó sobre hielo durante 30 minutos seguido por centrifugación a 5600 rpm durante 20 minutos en una Centrífuga Avanti J-E con un rotor de cubeta de oscilación JS-5.3 (Beckman Coulter) . El sobrenadante se decantó y la pelotilla se resuspendió y se lavó con acetato de sodio 20 mM, cloruro de zinc 2 mM, solución pH 5.5. La solución resuspendida se centrifugó como se describe en lo anterior la etapa de lavado se repitió un total de 5 vecés. Se. llevó a cabo un lavado final con acetato de sodio 20 mM, pH 5.5 para remover todas las trazas de cloruro de zinc. La pasta de proteína resultante se disolvió con agua que contiene HC1 20 mM. Después de la disolución completa, Tris 250 mM, pH 10.7 se agregó a una concentración de Tris final de 20 mM. El pH de la solución resultante se ajustó tal que el análogo de insulina se formuló como se describe posteriormente y la concentración de proteínas se ajustó a aproximadamente 15-20 mg/mL. Un análogo de insulina preparado de esta manera tuvo típicamente un rendimiento e aproximadamente 90%, con una concentración conservadora · residual a menos que 100 veces el material de inicio.
Brevemente, se generaron tres (3) formulaciones que contiene cada una 600 Unidades (U) de PH20-F204P o rHuPH20 de tipo natural (generada como se describe en el Ejemplo 1) para un total de 6 formulaciones como se expone en la Tabla 16: Cada solución de formulación se dispensó en 0.5 mL de alícuotas en viales de vidrio de borosilicato Tipo 1 USP de 2 mL con un tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio. Los viales se incubaron a 5°C, 30°C y 37°C. Las muestras se retiraron .de la incubadora en puntos de tiempo programados para mediciones de la actividad enzimática como se describe en el Ejemplo 8.
Los resultados de las mediciones de la actividad enzimática para las muestras incubadas a 37°C, 10 30°C y 5°C se muestran en las Tablas 17-19, respectivamente. A 37°C, la actividad enzimática de las muestras que contienen rHuPH20 de tipo natural (F2, F4 y F6) también se perdió casi totalmente dentro de dos días de incubación. En contraste, después de 6 días de incubación a 37 °C, las formulaciones F3 y F5, que contienen PH20-F204P, perdieron de manera aproximada 10% y 30%, respectivamente. La PH20-F2.04P formulada en el Humalog comercial (Fl) perdió casi su actividad dentro de 2 días a 37 °C más probablemente debido a la falta de NaCl en la formulación.
Una tendencia similar para las actividades enzimáticas de las ampolletas incubadas a 30°C se observó entre la PH20-F204P y rHuPH20. Para las formulaciones que contienen un nivel de conservador EPA, las diferencias entre el tipo natural y F204P fueron notables (Tabla 17; Fl y F5 vs . F2 y F6) . Cuando la concentración conservadora se redujo a un nivel de EPB (F3 y F4 ) , la F204P aún superó la rHuPH20 de tipo natural, aunque hubo ligeramente una estabilidad de rHuPH20 más alta comparada con las condiciones EPA. En ambos niveles de conservadores EPA y EPB, la PH20-F204P fue capaz de mantener su estabilidad por hasta 14 dias a 30°C cuando 100 mM de NaCl se incluyen en la formulación.
EJEMPLO 11 ESTABILIDAD DE LA V58R-PH20 EN LA CO-FORMULACIÓN DE INSULINA A. Estabilidad de V58R-PH20 La variante V58R PH20 se expresó en células CHO-S como se describe en el Ejemplo 2 o Ejemplo 6. El ADN plásmido transíectado tuvo una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4 que contiene un cambio de codón de GTG a CGG en las posiciones de nucleótidos 1295-1297, codificados de esta manera el mutante V58R. El mutante V58R se sometió a prueba por su capacidad en una co-formulación que contiene insulina aspart (análogo de insulina aspart preparado como se describe en el Ejemplo 10) y bajo niveles de los conservadores de ??? o EPB brevemente, se generaron cuatro (4) formulaciones conteniendo cada una 600 Unidades (U) de PH20-V58R o rHuPH20 de tipo natural (generada como se describe en el Ejemplo 1) como se expone en la Tabla 20. Las formulaciones Fl y F2 representan los niveles de los conservadores EPB mientras que las formulaciones F3 y F4 representan los niveles de los conservadores EPA.
Cada solución de formulación se dispensó en alícuotas de 0.5 mL en viales de vidrio de borosilicato Tipo I USP de 2 mL con un tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio.
Los viales se incubaron a 30°C y 37°C. Las muestras se retiraron de la incubadora en los puntos de tiempo programados para las mediciones de la actividad enzimática como se describe en el Ejemplo 8.
Los resultados de las mediciones de la actividad enzimática para las muestras se incubadas a 37°C y 30°C se muestra en la Tabla 21 y Tabla 22. A 37°C, la actividad enzimática de las muestras que contienen rHuPH20 de tipo natural ( F2 y F4 ) casi se perdió totalmente dentro de dos días de incubación. En contraste, después de 6 días de incubación a 37°C, las formulaciones Fl (EPB) y F3 (EPA) , que contienen V58R-PH20, perdieron solamente de manera aproximada 25% y 40% de actividad, respectivamente. A 30°C, la actividad enzimática de las muestras que contienen rHuPH20 de tipo natural también se redujo notablemente en presencia de niveles de conservadores EPA o EPB dentro de un mes de incubación, aunque hubo una pérdida notable ligeramente menor en la actividad en la presencia de los niveles de conservadores EPB. En contraste, para la V58R-PH20, no hubo pérdida de actividad enzimática por ya cualquier formulación sometida a prueba hasta 1 mes .
B. Comparación de la Estabilidad de F204P y V58R La variante PH20 V58R-PH20 se comparó a F204P por su estabilidad en una co-formulación que contiene insulina aspart (análogo de insulina aspart preparado como se describe en el Ejemplo 10) y bajo los niveles de conservadores EPA o EPB. Brevemente, se generaron ocho (8) formulaciones como se expone en la Tabla 23. Las formulaciones F1-F4 representan los niveles de conservadores EPB mientras que las formulaciones F5-F8 representan los niveles de conservadores EPA. Las formulaciones F3 y F4 y las formulaciones F7 y F8 fueron idénticas y representan las formulaciones de control de tipo natural utilizadas para los estudios EPB o EPA, respectivamente. · Cada solución de formulación se dispensó en alícuotas de 0.5 mL en viales de vidrio de borosilicato Tipo I USP de 2 mL con un tapón de caucho de clorobutilo y un sello de aluminio. Los viales se incubaron a 30°C y 37°C. Las muestras se retiraron de la incubadora en los puntos de tiempo programados para las mediciones de la actividad enzimática como se describe en el Ejemplo 8. .
Los resultados muestran que el porcentaje de la actividad de hialuronidasa en las formulaciones sometidas a prueba después de la pre-incubación a 3 °C fue ligeramente mayor para ambos mutantes PH20 cuando se formularon en niveles de conservadores EPB y no EPA. Mientras que el porcentaje de actividad restante fue mayor que 80% para ambos mutantes sometidos a prueba después de 6 días de incubación en las formulaciones que contienen niveles de conservadores EPB fue menor en presencia de los niveles de conservador EPA. Por ejemplo, La actividad restante a 6 días en los niveles de conservadores EPA fue ligeramente menor que 80% después de 6 días para F204P-PH20, mientras que para el fue solo aproximadamente 40% para V58R-PH20. Por consiguiente, los resultados también muestran qué a 37 °C, la V58R-PH20 de alguna manera es menos · estable que la F204P-PH20, en particular en una formulación con niveles de conservadores EPA. Después de la incubación a 30 °C durante por lo menos una semana, la F204P-PH20 y V58R-PH20 mostraron casi 100% de actividad inicial en presencia de los niveles de conservadores tanto EPA como EPB. En contraste, la rHuPH20 mostró solo aproximadamente 40% de su actividad inicial después de 4 semanas a 30°C en presencia de niveles de conservadores EPB, mientras que no mostró actividad detectable después de 4 semanas, a 30°C en presencia de niveles de conservadores EPA .
EJEMPLO 12 EXPRESIÓN DE F204P-PH20 UTILIZANDO UN VECTOR DE EXPRESIÓN DE LENTIVIRUS Un vector de expresión de lentivirus, pLV-EFla-PH20 (F204P) -IRES-GFP-Bsd se generó, conteniendo un ADNc de hialuronidasa mutante optimizado con codón que codifica F204P-PH20. La secuencia de pLV-EFla-PH20 (F204P) -IRES-GFP-Bsd se expone en SEQ ID NO: 925. El vector pLV-EFla-PH20 (F2-04P) -IRES-GFP-Bsd contiene un gen de resistencia a la ampicilina (AmpR) situado en los nucleótidos 8611-9471, un promotor EFla en los residuos 1933 a 2327, un IRES en los residuos 4786-5370, un GFP-Bsd en los residuos 5394-6527 y nucleótidos que codifican F204P-PH20 en los residuos 3369-4781.
El lentivirus se produjo como se describe por Bandaranayake y colaboradores ( (2011) Nucleic Acids Research, 39:el43) . Brevemente, las células 293T (ATCC) se colocaron en placas en 6 x 106 células sobre placas de cultivo de tejido de 10 cm. Después de 24 horas, 6 de psPAX2 (SEQ ID NO: 926; Addgene plasmid No. 12260), 3 ug de PMD2. G (SEQ ID NO:927; Addgene plasmid #12259) y 9 pg de plásmido de vector lentiviral pLV-EFla-PH20 (F204P) -IRES-GFP-Bsd se mezclaron en 1.5 mL de Opti-MEM (Life Technologies) . 45 i de Lipofectamina 2000 (LF2000; Life Technologies) se diluyeron en 1.5 mL de Opti-MEM (Life Technologies) . El ADN y la LF2000 se mezclaron suavemente, y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el ADN y el lipido formen complejos. Mientras tanto, el medio de cultivo de una noche se reemplazó con DMEM 5.0 mL + 10% de FBS sin antibióticos. Un volumen de 3.0 mL que contiene los complejos DNA-LF2000 se agregaron a las células 293T. El medio que contiene los complejos DNA-LF2000 se reemplazó con 10 mL de medio completo a 12-16 horas pos-transfección . El sobrenadante se recolectó a 48 horas pos-transfección y el medio se transfirió a un¦ tubo de almacenamiento de polipropileno. El medio que contiene virus se hizo girar a 1300 rpm durante 5 minutos para formar en pelotillas cualquiera de las células 293T que se llevaron durante la recolección. El sobrenadante- se transfirió cuidadosamente a un tubo de almacenamiento de polipropileno estéril.
Las células CHO-S (Invitrogen) se desarrollaron en un medio CHO-S (Invitrogen) con agitación a 120 rpm a 37°C y C02 al 5% en matraces de agitación de 125 mL ventilados (Nalgene) . Para la transducción, las células CHO-S se agregaron a los pocilios de una placa de pocilios a 2 x 106 células por pocilio en 2 mi del medio CHO-S que contiene 4 yg/mL de bromuro de hexadimetrina en una concentración final de 4 pg/mL (Polybrene; SIGMA) . El virus se agregó a cada pocilio en- una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y las células se incubaron con agitación (120 rpm) a 37 °C y C02 al 5% durante 6 horas. Las células luego se recolectaron y se formaron en pelotillas por centrifugación de baja velocidad (500 x g, 5 min) . El medio de transducción se removió y se reemplazó con 10 mL de medio CHO-S reciente (Invitrogen) complementado con GlutaMax (50 mL/litro) y se transfectó a un matraz T-25. Tres días pos-infección, se agregó blasticidina (Invitrogen) al medio de crecimiento en una concentración de 1 µ?/?? . El medio se cambio regularmente en intervalos de 3-4 dias, y las células se transfirieron a un matraz T75 para expansión. Dos semanas después de la infección, inicial, las células se expandieron a matraces de agitación y se mantuvieron en el cultivo utilizando un medio que contiene 1 pg/mL de blasticidina. La proteína F204P-PH20 secretada en el medio CHO-S se recolectó y se purificó por cromatografía por afinidad utilizando una columna de afinidad anti-rHuPH20 como se describe en el Ejemplo 6. La proteína se preparó en solución amortiguadora API estándar (Histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.5) .
EJEMPLO 13 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA Y TEMPERATURA DE FUSIÓN La estructura secundaria , y la temperatura de fusión de la variante F204P PH20 se sometió a prueba y se comparó con la rHuPH20 de tipo natural (generada como se describe en el Ejemplo 1) para evaluar adicionalmente la estabilidad de la variante. La estructura secundaria se sometió a prueba por dicroismo circular. Un Jasco J-810-150S equipado con PTC-424S se empleó para la medición espectral CD y los espectros CD se recolectaron por Spectra Manager (Versión 1.5, Jasco). Los procedimientos para, la recolección de configuración de instrumento y datos se describen en la Tabla 1. Preparación y Medición de la Muestra Doscientos (200) yL de 0.1 mg.mL de una muestra de proteína diluida en solución amortiguadora de Mcllvaine (Mcllvaine (1921) JBC 49: 183) ajustada a pH 6.5 se preparó. Una serie de muestras de la variante F204P también se generaron que variaron en pH por el ajuste utilizando solución amortiguadora de Mcllvaine a un intervalo de pH de 5.0 7.5 como se expone en la Tabla 25. Además, las muestras también se generaron al ajustar la concentración de NaCl de 17.5 mM a 140 mM como se expone en la Tabla 26, Las muestras se filtraron utilizando un filtro de jeringa de 0.2 µp? antes de la medición. Se generaron muestras similares para rHuPH20. Luego, 200 \i de muestras se transfirieron a una cubeta rectangular que tiene 1 mM de ancho y se asentaron en un espectropolarimetro Jasco J-810. Los espectros CD de las muestras se recolectaron bajo las condiciones descritas en la Tabla 20. La temperatura de fusión (Tm) se calculó utilizando el Spectra Manager (v 1.5, Jasco) de la intensidad espectral CD medida en el intervalo de temperatura de 30°C a 75°C. Las cubetas se limpiaron por el limpiador ChromergeMR (C577-12, Fisher scientific) entre la carga de la muestra individual y después de la corrida. 2. Resultados Los resultados muestran que la estructura secundaria de F204P es similar a rHuPH20. Como una función de temperatura, el dicroismo circular mostró que un cambio en la absorción se midió con las temperaturas de incremento. Como una función del pH, la distribución Tm fue estrechamente comparable para tanto F204P como rHuPH20 y la Tm alta para cada una se obtuvo entre pH 5.5 y pH 6.0. Los resultados, sin embargo, mostraron que Tm de la variante F204P fue de aproximadamente 9°C más alta en todos los intervalos sometidos a prueba que la rHuPH20 de tipo natural. Este resultado indicó que el mutante F204P es más estable contra las condiciones de estrés térmicas. Como una función de sal, los resultados muestran que la F204P y la rHuPH20 de tipo natural mostraron ambas una Tm de incremento con concentración de sal más alta, mostrando que ambas tienen una inclinación proporcional hacia la concentración de sal.
EJEMPLO 14 Evaluación de la Actividad Enzimática en un ensayo de Dispersión de Azul Tripán Intradérmico La actividad d propagación de la variante F204P PH20 se evaluó utilizando un ensayo in vivo de dispersión de tinte. Brevemente, la variante F204P PH20 purificada (preparada como se describe en el Ejemplo 12) y la rHuPH20 de tipo natural (preparada como se describe en el Ejemplo 1) ambas se formularon en solución amortiguadora API (Histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.5) en una concentración de 10,000 U/mL. Las soluciones madre se diluyeron adicionalmente a tres concentraciones objetivo de 1000, 100 y 10 U/mL por diluciones 1:10 en serie en solución amortiguadora API. Las proteínas purificadas (ya sea rHuPH20 o F204P-PH20) se diluyeron 1:1 con 0.4% de Azul Tripán (0.4% de solución líquida; Catálogo No. 15250 Invitrogen) para proporcionar una concentración final de 5, 50 y 500 U/mL de proteína, cada una conteniendo 0.2% de azul tripán. También se preparó un control de vehículo (solución amortiguadora API) . Cuarenta y dos (42) ratones homocigotos nu/nu NCr hembras se utilizaron en el estudio con seis ratones utilizados por grupo como se expone en la Tabla 27.
Cuarenta (40) yL de las muestras se administraron por una inyección intradérmica individual. El área de la dispersión del tinte se midió a 2.5, 5, 10, 15 y 20 minutos post-inyección y se registró para la formación de imágenes fotográfica por la fotografía del sitio de inyección con una cámara digital Nikon D90 con microlentes principales de 60 mM. Un medido de distancia láser (Leica D3) se utilizó para colocar con precisión la cámara en una distancia predeterminada del área de tinte de Azul Tripán en el animal. El área del tinte se determinó utilizando el Image-Pro Analyzer 7.0 (MediaCybernetics , Inc) . Las áreas calculadas se expresaron como mM2.
Los resultados se exponen en la Tabla 28. Los resultados mostraron que la actividad de dispersión de la variante F204P PH20 fue sustancialmente idéntica a la actividad de dispersión de la rHuPH20. La capacidad para incrementar el área de la dispersión del tinte fue dependiente de dosis, con ambas proteínas que tienen actividad más grande a 500 U/mL. Los resultados también mostraron que el área de la dispersión de tinte se incrementó con el momento de la inyección pos-intradérmica . Las áreas de la dispersión de tinte de rHuPH20 y F204P-PH20 fueron significativamente mayores que las áreas de la dispersión de tinte para los controles (p<0.05) en todos los puntos de tiempo cuando se formularon en todas las concentraciones (5, 50 y 500 .U/mL) con la excepción de rHuPH20 en la concentración más baja (5 U/mL) . Cuando se compararon entre sí, ¦ la rHuPH20 y F204P-PH20 mostraron efectos de dispersión similares, aunque hubo una diferencia significativa en la dispersión entre los dos grupos en 5 U/mL y 500 U/mL pero no en 50 U/mL. En resumen, los resultados muestran que tanto la rHuPH20 , como la F204P-PH20 proporcionaron un incremento estadísticamente significativo en el área de la dispersión de tinte comparado con el control de vehículo.
Ejemplo 15 Evaluación de la Actividad Enzimática por Reconstitución de la Barrera Dérmica La actividad de F204P-PH20 se evaluó y se comparó con rHuPH20 para medir la cantidad de tiempo requerida para la barrera dérmica para reconstituirla después de la administración de hialuronidasa intradérmica . La reconstitución dérmica se evaluó al compara la duración de la actividad de propagación de hialuronidasa como es evaluado al monitorear el área de 'la difusión de 0.4% de Azul Tripán a través del tiempo. Las proteínas utilizadas en el estudio fueron la variante F204P PH20 purificada (preparada como se describe en el Ejemplo 12) y la rHuPH20 de tipo natural (preparada como se describe en el Ejemplo 1) que ambas se formularon en una solución amortiguadora API (Histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.5). El vehículo (solución amortiguadora API) se utilizó como un control. Los ratones homocigotos nu/nu NCr machos se utilizaron en el estudio con tres animales por punto de tiempo para un total de quince ratones utilizados por grupo cómo se expone en la Tabla 29.
Todos los ratones recibieron dos dosis intradérmicas de control de vehículo o rHuPH20 o F204P-PH20 a 100 U/mL en 0.04 mL en el tiempo de estudio 0. El artículo de control o de pruebas se inyectó en los lados laterales opuestos de cada animal (derecha, R; izquierda, L) . Los sitios de inyección se marcaron con un marcador permanente. La tinción de Azul Tripán (0.4% de solución liquida; 15250, Invitrogen) se administró en un volumen de 0.04 mL por inyección intradérmica en el mismo sitio de inyección a 0.5, 1, 4, 24 y 48 horas post-inyección del articulo de prueba o control. A 5 y 20 minutos post-inyección de la tinción de Azul Tripán, el área del tinte en el sitio de inyección se midió por formación de imágenes digital de la región como se describe en el Ejemplo 14.
Los resultados se exponen en- la Tabla 30. Los resultados muestran que cuando el área de la dispersión de tinte se midió en varios puntos de tiempo después de la administración del articulo de prueba o de control, hubo un incremento estadísticamente significativo en el área de la dispersión de tinte a 30 minutos y 1 hora post-inyección de rHuPH20 o F204P-PH20. Por 4 horas post-administración de las enzimas, sin embargo, no hubo un incremento estadísticamente significativo en el área de la dispersión de tinte comparado con el control. Además, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el área de la dispersión de tinte entre los grupos de tratamiento rHuPH20 ay F204P-PH20. Por lo tanto, la duración de la actividad de propagación de rHuPH20 y F204P fue similar y mostró que la rHuPH20 y F204P-PH20 tienen desempeño in vivo comparable.
Ejemplo 16 Farmacocinetica In Vivo de F204P-PH20 Comparada con rHuPH20 La farmacocinética (PK) de rHuPH20 y F204P-PH20 se comparó después de la administración intravenosa en la vena de la cola al medir los niveles de hialuronidasa en plasma a través del tiempo después de la administración. Las proteínas utilizadas en el estudio fueron la variante F204P PH20 purificada (preparada como se describe en el Ejemplo 12; concentración de lote 1.02 mg/mL) y la rHuPH20 de tipo natural (preparada como se describe en el Ejemplo 1; concentración del lote 0.95 mg/mL) formuladas en solución amortiguadora API (Histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.5). Las proteínas se prepararon en una concentración de 0.087 mg/mL en solución amortiguadora API para un volumen de dosis de aproximadamente 5 mL. Un animal que no se le administró la proteína se utilizó como un control (control pre-dosis) . Cuarenta y dos (42) ratones CD-1 machos (~ 20-30 gramos) se utilizaron en el estudio con seis animales por grupo de tratamiento como se expone en la Tabla 31.
A los ratones se les administró intravenosamente 0.433 mg/kg de rHuPH20 o F204P-PH20 mediante inyección en la vena de la cola. Las muestras de sangre se obtuvieron de los animales 1 minuto, 5 minutos y 10 minutos postadministración. Las muestras de sangre se obtuvieron por sangrado terminal (punción cardiaca) y se recolectaron en tubos de recolección de sangre que contienen el EDTA anticoagulante para la preparación del plasma. Las muestras de sangre se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos y el plasma se removió y se 'congeló a -80°C hasta la evaluación de la actividad de hialuronidasa utilizando el ensayo de microturbiedad descrito en el Ejemplo 8.
Los resultados se exponen en la Tabla 32. Los resultados muestran que la actividad de hialuronidasa no se detecta en el plasma antes del tratamiento con la hialuronidasa . Dentro de 1 minuto post-tratamiento con la hialuronidasa ya se rHuPH20 o F204P PH20, hubo una cantidad detectablemente alta de actividad de hialuronidasa presente en el plasma, que es similar entre ambos grupos de tratamiento. A través del tiempo, la actividad de hialuronidasa disminuye rápidamente para ambos grupos de tratamiento, aunque hubo una actividad de hialuronidasa detectable presente en el plasma 10 minutos post-administración . En los juntos de tiempo postadministración de 5 minutos y 10 minutos, la actividad en el plasma en los animales tratados con F204P-PH20 es mayor que en los animales tratados con rHuPH20. Esto muestra que la F204P-PH20 muestra de alguna manera mayor vida media in vivo que la rHuPH20.
BQL - Por debajo del Limite Cuantificable < 0.625 U/mL con dilución requerida mínima. a-Hemolizado Puesto que las modificaciones serán evidentes para aquellas personas de experiencia en esta técnica se propone que esta invención se limite solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas .

Claims (177)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido PH20 modificado, que comprende un reemplazo de aminoácidos en un polipéptido PH20 no modificado, caracterizado porque: el polipéptido PH20 no modificado consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 3; el polipéptido -PH20 modiciado muestra estabilidad incrementada en presencia de un conservador ( es ) fenólico comparada con el polipéptido PH20 no modificado que no contiene el reemplazo de aminoácidos; y la estabilidad incrementada se manifiesta como actividad hialuronidasa incrementada en presencia del conservador ( es ) fenólico comparada con ' la actividad hialuronidasa del polipéptido PH20 no modificado que no contiene el aminoácido reemplazado en presencia del mismo conservador (es ) fenólico, y la actividad se compara bajo las mismas condiciones.
2. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido PH20 no modificado muestra por lo menos 98% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
3. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el reemplazo (s) de aminoácidos está en un polipéptido PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 3 o 32-66.
. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el reemplazo de aminoácidos está en un polipéptido PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.
5. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque: el polipéptido PH20 modificado muestra mayor que 110% de la actividad de hialuronidasa en presencia de el conservador fenólico comparado con el polipéptido PH20 no modificado que no contiene el reemplazo (s) de aminoácidos; o el polipéptido PH20 modificado, muestra por lo menos 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, .89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más actividad de hialuronidasa en presencia del conservador (es ) fenólico comparada con la actividad de hialuronidasa en ausencia del conservador (es ) fenólico .
6. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido PH20 es estable durante por lo menos 4 horas en presencia del conservador (es ) .
7. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado es estable en presencia de una cantidad efectiva antimicrobiana de uno o más conservadores fenólicos .
8. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cantidad efectiva anti-microbiana es una cantidad total de uno o más agentes conservadores fenólicos como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) que es de o de aproximadamente 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.1.5% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4%, inclusive .
9. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el conservador fenólico se selecciona de entre uno o más de fenol, metacresol (m-cresol) , alcohol bencílico y un parabeno .
10. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el conservador es un parabeno que es metilparabeno o propilparabeno .
11. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 , caracterizado porque el conservador es un conservador fenólico que es m-cresol, fenol, o m-cresol y fenol.
12. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque: el polipéptido PH20 modificado muestra por lo menos 15% de la actividad de hialuronidasa en presencia de un conservador ( es ) durante por lo menos 4 horas comparada con la actividad de hialuronidasa en ausencia del conservado (es) , en donde la actividad se compara bajo las mismas condiciones excepto para la presencia del conservador (es) .
13. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos en una posición de aminoácido, que corresponde a una posición seleccionada de entre 10, 12, 20, 22, 26, 34, 36, 46, 50, 52, 58, 68, 70, 74, 82, 83, 84, 86, 97, 127, 131, 138, 142, 143, 144, 166, 169, 174, 193, 195, 196, 204, 205, 206, 213, 219, 234, 237, 238, 240, 249, 261, 267, 277, 279, 291, 309, 310, 314, 315, 317, 318, 347,- 367, 375, 376, 399, 401, 407, 416, 419, 421, 431, 433, 439, 440, 443 o 445 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el. polipéptido expuesto en SEQ I D NO : 3.
14. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: G en una posición que corresponde a la posición 10; K en una posición que corresponde a la posición 12; S en una posición que corresponde a la posición 20; T en una posición que corresponde a la posición 22; M en una posición que corresponde a la posición 26 W en una posición que corresponde a la posición 34 N en una posición que corresponde a la posición 36 L en una posición que corresponde a la posición 46 M en una posición que corresponde a la posición 59 ; -T en una posición que corresponde a la posición 52 ; S en una posición que corresponde a la posición 52 ; C en una posición que corresponde a la posición 58 ; K en una posición que corresponde a la posición 58 R en una . posición que corresponde a la posición 58 N en una posición que corresponde la posición 58; Y en una posición que corresponde la posición 58; P en una posición que corresponde la posición 58; H en una posición que corresponde la posición 58; P en una posición que corresponde la posición 68 ; V en una posición que corresponde la posición 70; E en una posición que corresponde la posición 74; L en una posición que corresponde la posición 82; N en una posición que corresponde la posición 82; V en una posición que corresponde la posición 83; Q en una posición que corresponde la posición 83; S en una posición que corresponde la posición 83; G en una posición que corresponde la posición 83; N en una posición que corresponde la posición 84; A en una posición que corresponde la posición 85; K en una posición que corresponde la posición 86; E en una posición que corresponde la posición 97; L en una posición que corresponde la posición 97; R en una posición que corresponde la posición 127; R en una posición que corresponde la posición 131; L en una posición que corresponde la posición 138; K en una posición que corresponde la posición 142; N en una posición que corresponde la posición 142; P en una posición que corresponde la posición 142; S en una posición que corresponde a la posición 142; en una posición que corresponde a la posición 142; G en una posición que corresponde a la posición 143; K en una posición que corresponde a la posición 143; T en una posición que corresponde a la posición 144; Q en una posición que corresponde a la posición 166; en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 169; G en una posición que corresponde a la. posición 174; N en una posición que corresponde a la posición 174; Q en una posición que corresponde a la posición 193; T en una posición que corresponde a la posición 195; N en una posición que corresponde a la posición 195; E en una posición que corresponde a la posición 196; R en una posición que corresponde a la posición 196; P en una posición que corresponde a la posición 204; A en una posición que corresponde a la posición 205; E en una posición que corresponde a la posición 205; I en una posición que corresponde a la posición 206; A en una posición que corresponde a la posición 213; I en una posición que corresponde a la posición 219; M en una posición que corresponde a la posición 234; T en una posición que corresponde a la posición 237; H en una . posición que corresponde a la posición 238, Q en una posición que corresponde a la posición 240; V en una posición que corresponde a la posición 249; A en una posición que corresponde a la posición 261; K en una posición que corresponde a la posición 261, T en una posición que corresponde a la posición 267; K en una posición que corresponde a la posición 277, H en una posición que corresponde a la posición 279; V en una posición que corresponde a la posición 279, V en una posición que corresponde a la posición 291; E en una posición que corresponde a la posición 309; Q en una posición que corresponde a la posición 310; Y en una posición que corresponde a la posición 314, Y en una posición que corresponde a la posición 315; N en una posición que corresponde a la posición 317, W en una posición que corresponde a la posición 317; D en una posición que corresponde a la posición 318, G en una posición que corresponde a la posición 347; A en una posición que corresponde a la posición 367, - R en una posición que corresponde a la posición 375; R en una posición que corresponde a la posición 376; V en una posición que corresponde a la posición 399; E en una posición que corresponde a la posición 401; A en una posición que corresponde a la posición 407; L en una posición que corresponde a la posición 416; K en una posición que corresponde a la posición 419; H en una posición que corresponde a la posición 421, E en una posición que corresponde a la posición 431; T en una posición que corresponde a la- posición 433; V en una posición que corresponde a la posición 433; C en una posición que corresponde a la posición 439; P en una posición que corresponde a la. posición 440; G en una posición que corresponde a la posición 443; y N en una posición que corresponde a la posición 445; con referencia a las posiciones de residuos dé aminoácidos expuestas en SEQ ID N0:3.
15. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: T en una posición que corresponde a la posición 52, K en una posición que corresponde a la posición 58, R en una posición que corresponde a la posición 58, P en una posición que corresponde a la posición 68, V en una posición que corresponde a la posición 83, P en una posición que corresponde a la posición 204, A en una posición que corresponde a la posición 261, T en una posición que corresponde a la posición 267, K en una posición que corresponde a la posición 277 y H en una posición que corresponde a la posición 421, con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
16. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque comprende el reemplazo . con P en una posición que corresponde a la posición 204 en un polipéptido PH20 con referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3.
17. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque comprende el reemplazo con R en una posición que corresponde a la posición 58 en un polipéptido PH20 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
18. Un polipéptido PH20 modificado, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos en un polipéptido PH20, en donde: el polipéptido PH20 modificado muestra actividad de hialuronidasa incrementada que es por lo menos 120% de la actividad de hialuronidasa comparada con el polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos.
19. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación .18, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado muestra por lo menos 68% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
20. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 18 o reivindicación 19, caracterizado porque el reemplazo (s) de aminoácidos está en un polipéptido PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66, o una secuencia de aminoácidos que' muestra por lo menos 85% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66.
21. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos en una posición de aminoácido que corresponde a la posición seleccionada de entre 1, 12, 15, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 39, 46, 48, 52, 58, 63, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74' 75, 84, 86, 87, 92, 93, 94, 97, 118, 120, 127, 131, 135, 141, 142, 147, 148, 150, 151, 152, 155, 156, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 174, 198, 206, 209, 212, 213, 215, 219, 233, 234, 236, 238, 247, 257, 259, 260, 261, 263, 269, 271, 272, 276, 277, 278, 282, 291, 293, 305, 308, 309, 310, 313, 315, 317, 318, 320, 324, 325, 326, 328, 347, 353, 359, 371, 377, 380, 389, 392, 395, 399, 405, 407, 409, 410, 418, 419, 421, 425, 431, 433, 436, 437, .438, 439, 440, 441, 442, 443, 445, 446 y 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, en donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el ' polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3.
22. El polipéptido . PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: histidina (H) en una posición que corresponde a la posición 1; Q en una posición que corresponde a la posición 1; E en una posición que corresponde a la posición 12; T en una posición que corresponde a la posición 12; V en una posición que corresponde a la posición 15; E en una posición que corresponde; a la posición · 24; H en una posición que corresponde a la posición 24; E en una posición que corresponde a la posición 26; K en una posición que corresponde a la posición 26; K en una posición que corresponde a la . posición 27; R en una posición que corresponde a la posición 27; E en una posición que corresponde a la posición 29; I en una posición que corresponde a la. posición 29; L en una posición que corresponde a la ; posición 29; M en una posición que corresponde a la posición 29; P en una posición que corresponde a la posición 29; S en una posición que corresponde a la. posición .29; V en una posición que corresponde a la posición 29; G en una posición que corresponde a la posición 30; H en una posición que corresponde a la posición 30; K en una posición que corresponde a la posición . 30; M en una posición que corresponde a la posición 30; R en una posición que corresponde a la posición 30; S en una posición que corresponde a la posición 30; A en una posición que corresponde a la posición 31; C en una posición que corresponde a la posición 31; H en una posición que corresponde a la posición 31; I en una posición que corresponde a la. posición 31; K en una posición que corresponde a la posición 31; L en una posición que corresponde a la posición 31; P en una posición que corresponde a la posición¦ 31; R en una posición que corresponde a la posición 31; S en una posición que corresponde a la posición 31; T en una posición que corresponde a la posición 31; V en una posición que corresponde a la posición 31; F en una posición que corresponde a la posición 32; G en una posición que corresponde a la posición 32; H en una posición que corresponde a la ; posición 32; W en una posición que corresponde a la posición 33; F en una posición que corresponde a la posición 37; N en una posición que corresponde a la posición 39; T en una posición que corresponde a la posición 39; R en una posición que corresponde a la posición 46; F en una posición que corresponde a la posición 48; H en una posición que corresponde a la posición 48; N en una posición que corresponde a la posición 48; Q en una ¦ posición que corresponde a la posición 52; K en una posición que corresponde a la posición 58; Q en una posición que corresponde a la posición 58; W en una posición que corresponde a la posición 63; V en una posición que corresponde a la posición 67;. H en una posición que corresponde a la posición 68; Q en una posición que corresponde a la . posición 68; A en una posición que corresponde a a posición 69; C en una posición que corresponde a la posición 69; F en una posición que corresponde a la posición 69; G en una posición que corresponde a la posición 69; I en una posición que corresponde a la posición 69; L en una posición que corresponde a la posición 69; M en . una posición que corresponde a la posición 69; P en una posición que corresponde a la posición 69; R en una posición que corresponde a la posición 69; W en una posición que corresponde a la posición 69; Y en una posición que corresponde a la posición ' 69; . A en una posición que corresponde a la posición 70; C en una posición que corresponde a la posición 70; F en una posición que corresponde a la posición 70; G en una posición que corresponde a la posición 70; H en una posición que corresponde a la posición 70; K en ¦ una posición que corresponde a la posición 70; L en una posición que corresponde a la posición 70; N en una posición que corresponde a la posición 70; P en una posición que corresponde a la posición 70; R en una posición que corresponde a la posición 70; S en una posición que corresponde a la posición 70; T en una posición que corresponde a la posición 70; V en una posición que corresponde a la posición 70; R en una posición que corresponde a la posición 71; S en una posición que corresponde a la posición 71; M en una posición que corresponde a la' posición 72; Q en una posición que corresponde a la posición 72; H en una posición que corresponde a la posición 73; L en una posición que corresponde a la posición 73; W en una posición que corresponde a la posición 73; A en una posición que corresponde a la posición 74; C en una posición que corresponde a la posición 74; G en una posición que corresponde a la posición 74; N en una posición que corresponde a la posición 74 P en una posición que corresponde a la posición 74 R en una posición que corresponde a la posición' 74 S en una posición que corresponde a la posición 74 V en una posición que corresponde a la posición 74 W en una posición que corresponde a la posición 74 F en una posición que corresponde a la posición 75 L en una posición que corresponde a la posición 75 R en una posición que corresponde a la posición 75 T en una posición que corresponde a la posición 75 G en una posición que corresponde a la posición 84 R en una posición que corresponde a la posición 84 A en una posición que corresponde a la posición' 86 C en una posición que corresponde a la posición 87 T en una posición que corresponde a la posición 87 Y en una posición que corresponde a la posición 87 C en una posición que corresponde a la posición 92 I en una posición que corresponde a la posición 93 L en una posición que corresponde a la posición '93 R en una posición que corresponde a la posición 93 T en una posición que corresponde a la posición 93 R en una posición que corresponde a la posición 94 G en una posición que corresponde a la posición 97; Q en una posición que corresponde a la posición 118; F en una posición que corresponde a la posición 120 V en una posición que corresponde a la posición 120 V en una posición que corresponde a la posición 120 H en una posición que corresponde a la posición 127 N en una posición que corresponde a la posición ' 127 G en una posición que corresponde a la posición 131 R en una posición que corresponde a la posición 131 V en una posición que corresponde a la posición 131 D en una posición que corresponde a la posición 135 G en una posición que corresponde a la posición 135 R en una posición que corresponde a la posición 135 H en una posición que corresponde a la posición 141 V en una posición que corresponde a la posición 141 R en una posición que corresponde a la posición 142 R en una posición que corresponde a la posición ' 147 V en una posición que corresponde a la posición 147. K en una posición que corresponde a la posición 148 G en una posición que corresponde a la posición 150 K en una posición que corresponde a la posición 151 L en una posición que corresponde a la posición 151 M en una posición que corresponde a la posición 151 Q en una posición que corresponde a la posición 151 R en una posición que corresponde a la posición 151 R en una posición que corresponde a la posición 152 G en una posición que corresponde a la posición 155; K en una posición que corresponde a la posición 155; D en una posición que corresponde a la posición 156; A en una posición que corresponde a la posición 163; E en una posición que corresponde a la posición 163 K en una posición que corresponde a la posición 163; R en una posición que corresponde a la posición. 163 en una posición que corresponde a la posición 164; D en una posición que corresponde a la posición 165 N en una posición que corresponde a la posición 165; A en una posición que corresponde a la posición 166 F en una posición que corresponde a la posición 166; H en una posición que corresponde a la posición 166 L en una posición que corresponde a la posición 166; Q en una posición que corresponde a la posición 166 R en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición- 166 Y en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 169 R en una posición que corresponde a la posición 170; K en una posición que corresponde a la posición 174 D en una posición que corresponde a la posición 198; K en una posición que corresponde a la posición 206; L en una posición que corresponde a la posición 206; N en una posición que corre ;ponde la posición 212; M en una posición que corre ¡ponde la posición 213; N ' en una posición que corre ¡ponde la posición 213; M en una posición que corre ¡ponde la posición 215; S en una posición que corre ¡ponde la posición 219; K en una posición que corre ;ponde la posición 233; R en una posición que corre iponde la posición 233; en una posición que corre ;ponde la posición 234; R en una posición que corre iponde la posición · 236; E en una posición que corre ¡ponde la posición 237; S en una posición que corre :ponde la posición 238; I en una posición que corre ;ponde la posición 247; T en una posición que corre ponde la posición 257; P en una posición que corre ¡ponde la posición 259; Y en una posición que corre ponde la . posición 260; K en una posición que corre ponde la posición 261; N en una posición que corre ponde la posición 261; K en una posición que corre ponde la posición 263; R en una posición que corre ponde la posición - 263; A en una posición que corre ponde la posición 269; L en una posición que corre ponde la posición 271; M en una posición que corre ponde la posición 271; T en una posición que corre ponde la posición 272; D en una posición que corre ponde la posición 276; S en una posición que corresponde a la posición 276 Y en una posición que corresponde a la posición 276 K en una posición que corresponde a la posición 277 R en una posición que corresponde a la posición 277 T en una posición que corresponde a la posición 277 H en una posición que corresponde a la posición 278 K en una posición que corresponde a la posición 278 N en una posición que corresponde a la posición 278 R en una posición que corresponde a la posición 278 S en una posición que corresponde a la posición 278 T en una posición que corresponde a la' posición 278 Y en una posición que corresponde a la posición 278 M en una posición que corresponde a la posición 282 V en una posición que corresponde a la posición 291 A en una posición que corresponde a la posición 293 C en una posición que corresponde a la posición 293 F en una posición que corresponde a la posición 293 M en una posición que corresponde a la posición 293 P en una posición que corresponde a la posición 293 Q en una posición que corresponde a la posición 293 V en una posición que corresponde a la' posición . 293 E en una posición que corresponde a la posición 305 G en una posición que corresponde a la posición 308 N en una posición que corresponde a ¦la' posición 308 E en una posición que corresponde a la posición 309; L en una posición que corresponde a la posición 309; N en una posición que corresponde a la' posición 309; Q en una posición que corresponde a la posición 309; R en una posición que corresponde a la posición 309; T en una posición que corresponde a la posición 309; A en una posición que corresponde a la posición 310; G en una posición que corresponde a la posición 310; K en una posición que corresponde a la posición 313; R en una posición que corresponde a la posición 313; H en una posición que corresponde a la posición 315; I en una posición que corresponde a la posición 317; K en una posición que corresponde a la' posición 317; R en una posición que corresponde a la posición 317; M en una posición que corresponde a la posición 318; H en una posición que corresponde a la posición 320; K en una posición que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 320; R en una posición que corresponde a la posición 324; A en una posición que corresponde a la posición 325; D en una posición que corresponde a. la posición 325; E en una posición que corresponde a la posición 325; G en una posición que corresponde a la posición 325; H en una posición que corresponde a la posición 325; K en una posición que corresponde a la posición 325; M en una posición que corresponde a la posición 325; N en una posición que corresponde a la posición 325; Q en una posición que corresponde a la posición 325; s en una posición que corresponde a la posición 325; V en una posición que corresponde a la posición . 326;- I en una posición que corresponde a la posición 328; K en una posición que corresponde a la posición 328; L en una posición que corresponde a la posición 328; S en una posición que corresponde a la posición 328; Y en una posición que corresponde a la posición 328; G en una posición que corresponde a la. posición 347; S en una posición que corresponde a la posición 347; V en una posición que corresponde a la posición 353; T en una posición que corresponde a la posición 359; R en una posición que corresponde a la posición ¦ 371; P en una posición que corresponde a la posición 377; T en una posición que corresponde a la posición 380; Y en una posición que corresponde a la posición 380; K en una posición que corresponde a la posición 389; en una posición que corresponde a l posición 392; R en una posición que corresponde a la posición 395; M en una posición que corresponde a la posición 399; T en una posición que corresponde a la posición 399; en una posición que corresponde a la posición 399 G en una posición que corresponde a la ¦ posición 405 D en una posición que corresponde a la posición 407 Q en una posición que corresponde a la posición 407 A en una posición que corresponde a la . posición 409 Q en una posición que corresponde a la posición 409 T en una posición que corresponde a la posición 410 P en una posición que corresponde a la posición ¦ 418 F en una posición que corresponde a la posición 419 I en una posición que corresponde a la posición 419 K en una posición que corresponde a la posición 419 R en una posición que corresponde a la posición 419 S en una posición que corresponde a la posición 419 H en una posición que corresponde a la- . posición 421 en una posición que corresponde a la posición 421 N en una posición que corresponde a la posición 421 Q en una posición que corresponde a la posición 421 R en una posición que corresponde a la posición ' 421 S en una posición que corresponde a la posición 421 K en una posición que corresponde a la posición 425 A en una posición que corresponde a la posición 431 H en una posición que corresponde a l posición 431 K en una posición que corresponde a la . posición 431 Q en una posición que corresponde a la posición 431 R en una posición que corresponde a la posición 431; S en una posición que corresponde a la posición 431; V en una posición que corresponde a la posición 431; L en una posición que corresponde a la posición 433; R en una posición que corresponde a la . posición 433; T en una posición que corresponde a la.' posición 433; V en una posición que corresponde a la posición 433; K en una posición que corresponde a la posición 436; I en una posición que corresponde a la posición 437; M en una posición que corresponde a la posición 437; T en una posición que corresponde a la posición 438; V en una posición que corresponde a la posición 439; H en una posición que corresponde a la posición 440; R en una posición que corresponde a la posición 440; F en una posición que corresponde a la posición 441; R en una posición que corresponde a !¾ posición 442; A en una posición que corresponde a la posición 443; M en una posición que corresponde a la posición 443; M en una posición que corresponde a la posición 445; P en una posición que corresponde a la posición 445; A en una posición que corresponde a la posición 446; D en una posición que corresponde a la posición 447; N en una posición que corresponde a la posición 447; y/o con Q en una posición que corresponde a la posición 447, con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
23. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-22, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado muestra por lo menos 2.0 veces de la actividad de hialuronidasa comparada con la polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos.
24. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 24, 29, 31, 48, 58, 69, 70, 75, 84, 97, 165, 166, 271, 278, 317, 320, 325 y 326 con referencia a la posiciones expuesta en SEQ ID NO: 3, en- donde las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3.
25. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación .24 , caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre el reemplazo con: E en una posición que corresponde a la posición 24; E en una posición que corresponde a la posición 29; V en una posición que corresponde a la posición 31; N en una posición que corresponde a la posición 48; K en una posición que corresponde a la- posición 58 Q en una posición que corresponde a la posición 58 ; A en una posición que corresponde a la posición 69 F en una posición que corresponde a la posición 69 ; G en una posición que corresponde a la posición 69 i P en una posición que corresponde a la posición 69 R en una posición que corresponde a la posición 69 A en una posición que corresponde a la posición 70 F en una posición que corresponde a la posición 70 ; G en una posición que corresponde a la posición 70 ; H en una posición que corresponde a la posición 70 ; H en una posición que corresponde a la posición 70 ; N en una posición que corresponde a la posición 70 ; R en una posición que corresponde a la posición 70 ; T en una posición que corresponde a la posición 70 ; V en una posición que corresponde a la posición 70 ; L en una posición que corresponde a la posición 75 T en una posición que corresponde a la posición 75 • G en una posición que corresponde a la posición 84; en una posición que corresponde a la posición 97; D en una posición que corresponde a la posición 165; L en una posición que corresponde a la posición 166; R en una posición que corresponde a la posición 166; T en una posición que corresponde a la posición 166; L en una posición que corresponde a la posición 271; H en una posición que corresponde a la posición 278; R en una posición que corresponde a la posición 278; K en una posición que corresponde a la posición 317; K en una posición que corresponde a la posición 320; E en una posición que corresponde a la posición 325; G en una posición que corresponde a la posición 325 en una posición que corresponde a la posición; K en una posición que corresponde a la posición 235; N en una posición que corresponde a la posición 325; Q en una posición que corresponde a la posición 325; y V en una posición que corresponde a la posición 326; con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:3.
26. Un polipéptido PH20 modificado, caracterizado porque comprende por lo menos un reemplazo de aminoácidos un polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 7, un fragmento C-terminalmente truncado del mismo, o en un polipéptido PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 91% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7, en donde: el por lo menos un reemplazo (d) de amino está en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 58, 59, 60, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 , 110, 114, 117, 1 18, 119, 120, 122, 124, 125, 127, 128, 130 , 131, 132, 133, 134 , 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 , 143, 144, 145, 146 , 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 , 155, 156, 15·7, 158 , 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 , 167, 168, 169, 170 , 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178 , 179, 180, 181, 182 , 183, 184, 186, 192, 193, 195, 196, 197 , 198, 200, 202, 204 , 205, 206, 208, 209, 211, 212, 213, 214 , 215, 216, 217 ,218, 219, 220, 221, 222, 224, 226, 230, 231 , 232, 233, 234, 235 , 236, 237, 238, 239, 240, 242, 245, 247 , 248, 251, 253, '255 , 256, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 264 , 265, 266, 267, 269 , 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277 , 278, 279, 280, 282 , 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290 , 291, 292, 293, 294 , 297, 298, 300, 301, 302, 304, 305, 306 , 307, 308, 30-9, 310 , 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318 , 320, 321, .323, 324 , 325, 326, 327, 328, 331, 334, 335, 338 , 339, 342, 343, 347 , 348, 349, 351, 353, 356, 357, 358, 359 , 360,361, 367, 368, 369, 371, 373, 374, 375, 376, 377, 378 , 379, 380, 381, 383 , 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 394 , 395, 396, 397, 398 , 399, 401, 403, 404, 405, 406, 407, 409 , 410, 411, 412, 413 , 414,. 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 425, 426, 427 , 428, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446 y 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 3 o 7; las posiciones de aminoácidos correspondientes que se identifican por la alineación del polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3; y con la condición de que si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a las posiciones 13, 47, 131, o 219 el reemplazo no es el reemplazo con una Alanina (A) .
27. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque: el polipéptido PH20 modificado muestra por lo menos 40% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos; y la actividad se compara bajo las mismas condiciones.
28. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 26 o reivindicación 27, caracterizado porque el reemplazo (s) -de aminoácidos está en un polipéptido PH20 no modificado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID. NOS: 3, 7 o 32-66, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 91% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66.
29. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, caracterizado porque el reemplazo de aminoácidos está en un reemplazo de aminoácidos expuesta en Tabla 3.
30. Un polipéptido PH20 modificado, caracterizado porque comprende por lo menos un- reemplazo de aminoácidos en un polipéptido PH20 expuesto en SEQ ID NO: 7, un fragmento C-terminalmente truncado del mismo o en un polipéptido PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 91% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO : 7 , en donde : el polipéptido PH20 modificado muestra menor que 20% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido PH20 que no contiene el reemplazo de aminoácidos; las actividades se comparan bajo las mismas condiciones; el reemplazo (s) de aminoácidos está en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición seleccionada de entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, , 115, 116 , 117 , 118 , 119 , 121, 122, 123, 124, 125, 126, , 128, 129 , 130 , 131 , 132 , 133, 134, 135, 136, 137, 138, 143, 144, 145, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 1.56, 157, 159, 161 , 163 , 164 , 165 , 166, 167, 168, 169, 170, 171, , 173, 174 175 , 176 , 178 , 179, 180, 181, 182, 183, 184, , 186, 187 188 , 189 , 190 , 191, 192, 193, 194, 195, 197, , 199, 200 201 , 202 , 203 , 204, 206, 207, 208, 209, 210, , 212, 13, 214, 215, 216, 17, -218, 219, 220, 21, 222, 223, , 225, 226 227 228 229 , 230, 231, 232, 233, 234, 235, , 238, 239 240 , 241 , 242 , 243, 244, 245, 246, 247, 248, , 250, 251 252 , 253 , 254 255, 256, 257, 258, 260, 261, , 263, 264 265 , 266 , 267 , 268, ¦ 269, 270, 271, 272, 273, , 275, 276 278 , 279 , 280 282, 283, 284, 285, 286, 287, , 289, 290 291 , 292 293 294, 295, 296, 297, 298, 299, , 301, 302 303 , 304 , 305 , 306, 307, 308, 310, 311, 312, , 314, 315 316 , 317 , 318 , 319, 320, 321, 322, 323, 324, , 326, 327 331 , 333 , 334 , 335, 336, 337, 338, 339, 340, , 342, 343 344 , 345 346 347,. 348, 349, 350, 351, 352, , 354, 355 356 , 357 •358 , 359, 360, 361, 362, 363, 364, , 366, 367 368 369 370 371, 372, 373, 374, 375, 376, , 378, 379 380 , 381 382 383, 384, 385, 386, 387, 388, , 390, 391, 392 393 394 , 395, 396, 397, 398, 399, 400, , 402, 403, 404 40.5 406 , 408, 410, 411, 412, 413, 414, , 416, 417 419 , 420 , 422 , 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 434, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, o 447 con referencia a las posiciones de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o 7 ; las posiciones de aminoácidos correspondientes se identifican por la alineación de polipéptido PH20 con el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 3; y con la condición de que: (i) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a las posiciones 200, 333, 358 o 393 el reemplazo - no es el reemplazo con una Alanina '(A) . (ii) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 111 o 249 el reemplazo no es el reemplazo con una asparagina (N) ; (iii) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 113 el reemplazo no es el reemplazo con una glutamina ; (iv) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 176 el reemplazo no es el reemplazo con una glicina (G) ; y (v) si el polipéptido PH20 modificado contiene un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 252 el reemplazo no es el reemplazo con una treonina (T) .
31. El polipéptido PH20 modificado de 30, caracterizado porque el reemplazo (s) de aminoácidos está en un polipéptido PH20 no modificado que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera' de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 91% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7 o 32-66.
32. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 30 o reivindicación 31, caracterizado porque el reemplazo de ' aminoácidos es un reemplazo de aminoácidos expuesto en la Tabla 5.
33. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2.0, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 o más de reemplazos de aminoácidos.
34. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque es un polipéptido PH20 maduro que carece de la secuencia señal .
35. Un polipéptido PH20 ' modificado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 73-855 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a una seouencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ;ID NOS: 73-855.
36. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-35, caracterizado porque muestra actividad catalítica en pH neutro.
37. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado se secreta en la expresión de células y es soluble en el sobrenadante.
38. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37, caracterizado porque se purifica o aisla sustancialmente .
39. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizado porque se modifica por la modificación seleccionada entre glicosilación, sialación, albuminación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación y fosforilación.
40. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado se glicosila, mediante lo cual el polipéptido comprende por lo menos una' porción de N-acetilglucosamina ligada a cada uno de los por . lo menos tres residuos de asparagina (N) .
41. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque los tres residuos de asparagina corresponden a los residuos de aminoácido 200, 333 y 358 de SEQ ID NO:3.
42. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41, caracterizado porque se modifica por conjugación a un polímero.
43. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el polímero es dextrano o PEG.
44. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-43, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado se conjuga a una porción seleccionada de entre un dominio de multimerización, toxina, etiqueta detectable o fármaco.
45. El polipéptido PH20 modificado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado se conjuga a un dominio Fe.
46. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica un polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37.
47. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 46.
48. El vector de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque es un vector eucariótico o procariotico.
49. El vector de conformidad con la reivindicación 58 o reivindicación 48, caracterizado porque es un vector de mamífero o un vector viral.
50. El vector de · conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque es un vector viral, en donde el vector viral es un vector de adenovirus, un vector de retrovirus o un vector de virus de vaccinia.
51: Una célula, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47-50.
52. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque es una célula de mamífero.
53. La célula de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la célula de mamífero es una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) .
54. Un polipéptido · PH20 modificado, caracterizado porque se produce por la célula de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 51-53.
55. Un método para producir un polipéptido PH20 modificado, caracterizado porque comprende: introducir el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 46 o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 47-50 en una célula capaz de incorporar porciones de azúcar N-ligadas en el polipéptido; cultivar la célula bajo condiciones mediante las cuales un polipéptido PH20 modificado codificado se produce y se secreta por la célula; y recuperar el polipéptido expresado.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor.
57. El método de conformidad con la reivindicación 55 o reivindicación 56, . caracterizado porque la célula es una célula eucariótica.
58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-57, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero.
59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-58, caracterizado porque la célula es una célula de ovario hámster Chino (CHO) .
60. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido PH20 modificado de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1-45.
61. La composición .farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el polipéptido PH20 modificado en la composición es estable en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive, durante por lo menos 1 mes o es estable en una temperatura de o de aproximadamente 30°C a 42°C, inclusive, durante por lo menos 3 días.
62. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60 o reivindicación. 61, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
63. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-62, caracterizada porque es para administración de dosis individual.
64. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-62, caracterizada porque es para administración de dosis múltiple.
65. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-64, caracterizada porque la concentración del polipéptido PH20 modificado es de o de aproximadamente 0.1 iq/mL a 100 µ?/p?, 1 µ?/mL a 50 µ?/?t? o 1 \iq/mL a 20 ig/mL.
66. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-65, caracterizada porque la cantidad de un polipéptido PH20 modificado es entre o aproximadamente entre 10 U/mL a 5000 U/mL, 50 U/mL a 4000 U/mL, 100 U/mL a 2000 U/mL, 300 U/mL a 2000 U/mL, 600 U/mL a 2000 U/mL, o 100 U/mL a 1000 U/mL.
67. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-66, caracterizada porque el volumen de la composición es de o de aproximadamente 0 : 5 mL a 50 mL, 1 mL a 10 mL, o 1 mL a 5 mL.
68. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-67, caracterizada porque comprende NaCl en una concentración menor que o aproximadamente o 200 mM, 180 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 1 10 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM o menor.
69. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-68, caracterizada porque comprende NaCl en una concentración de o de aproximadamente 0.1 ¦ mM a 200 mM, a 1 mM a 100 mM, 120 mM a 200 mM, 10 mM a 50 mM, 10 mM a 90 mM, 80 mM a 200 mM, 80 mM a 140 mM, 50 mM a 100 mM, 80 mM a 100 mM, 50 mM a 80 mM, 100 mM a 140 mM o 120 m a 140 mM.
70. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-69, caracterizada porque comprende una cantidad antimicrobianamente efectiva de un conservador o mezcla de conservadores.
71. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque el conservador ( es ) es un conservador fenólico (s), un conservador (es ) no fenólico o un conservador (es) fenólico y un conservador (es) no fenólico.
72. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 70 o reivindicación 71, caracterizada porque el conservador (es) es (son) selecciona (n) de entre fenol, m-cresol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol, clorhidrato de clorhexidina, digluconato dé clorhexidina, L—fenilalanina, EDTA, bronopol, acetato fenilmercúrico, glicerol, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, o-cresol, p-cresol, clorocresol, cetrimida,- cloruro de benzetonio, etil-parabeno, propilparabeno, butilparabeno y cualquiera de las combinaciones de las mismas.
73. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70-72, caracterizada porque la composición contiene un solo conservador.
74. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70-72, caracterizada porque la composición contiene una mezcla de conservadores que contiene 2, 3 o 4 diferentes conservadores.
75. La composición farmacéutica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-74, caracterizado porque comprende por lo menos un conservador fenólico.
76. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 75, caracterizada porque el conservador (es ) se selecciona (n) de entre fenol, metacresol (m-cresol) , alcohol bencílico, y un parabeno.
77. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada porque el conservador es un parabeno que es metilparabeno o propilparabeno .
78. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70-77, caracterizada porque la cantidad efectiva antimicrobiana es una cantidad total de uno o más conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) que es o está entre 0.05% a 0.6%, 0.1% y 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive.
79. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-78, caracterizada porque comprende un agente terapéuticamente activo.
80. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque el agente terapéutico se formula con la composición o en una composición separada.
81. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79 o reivindicación 80, caracterizada porque el agente terapéutico es un . polipéptido, una proteina, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula pequeña o una molécula orgánica.
82. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-81, caracterizada porque el agente terapéuticamente activo se selecciona de entre un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente anti-inflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida, un agente anti-parkinson , un agente anti-malaria, un agente anti-convulsivo, un agente antidepresivo, un agente anti-artritis, un agente anti-fúngico, un agente anti-hipertensivo, un agente antipirético, un agente anti-parásitos , un agente anti-histamina, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un agente bloqueador de canal de calcio, un agente de fármaco cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestionante, un agente diurético, un agente depresor, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción de músculos, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante físico, un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizador, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente antinflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de enzima convertidora de angiotensina o un inductor del sueño.
83. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-82, caracterizada porque el agente terapéutico se selecciona de entre un anticuerpo, una globulina inmunitaria, un bifosfonato, una citoquina, un agente quimioterapéutico, un factor de coagulación y una insulina.
84. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 83, caracterizada porque el agente terapéutico es una insulina que es una insulina de acción rápida.
85. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 84, caracterizada porque la insulina de acción rápida es insulina regular o es un análogo de insulina.
86. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 84 o reivindicación 85, caracterizada porque la insulina de acción rápida es una insulina regular que es una insulina humana o una insulina de cerdo.
87. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84-86, caracterizada porque: la insulina de acción rápida comprende una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 863;. o la insulina de acción rápida comprende una cadena A con la secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos de 88-108 de SEQ ID NO: 864 y una cadena B con la secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 864.
88. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 84 o reivindicación 85, caracterizada porque la insulina de acción rápida es un análogo de insulina seleccionado de entre insulina¦ lispro, insulina aspart o insulina glulisina.
89. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el análogo de insulina se selecciona de entre una insulina que tiene una cadena A con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS:865-867.
90. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 85-89, caracterizada porque la cantidad de insulina de acción rápida es de o de aproximadamente 10. U/mL a 1000 U/mL, 50 U/mL a 500 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL o 500 U/mL a 1000 U/mL, inclusive.
91. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-82, caracterizada porque el agente terapéutico se selecciona de entre Adalimumabs, Agalsidasas Beta,' . Alefacepts, Ampicilinas, Anaquinras, Vacunas Anti-poliomieliticas , Anti-Timocitos , Azitromicinas , Becaplermins , Caspofungins , Cefazolinas, Cefepimas, Cefotetanos, Ceftazidimas , Ceftriáxonas , Cetuximabs, Cilastatinas, Ácidos Clavulánicos , Clindamicinas , Darbepoetinas Alfa, Daclizumabs, Difteria, antitoxinas de Difteria, Toxoides de Difteria, Efalizumabs, Epinefrinas, Eritropoyetinas Alfa, Etanercepts, Filgrastims, Fluconazoles , Hormonas Estimuladoras de Folículos, Folitropinas Alfa, Folitropina Betas, Fosfenitoinas , Gadodiamidas , Gadopentetatos, Gatifloxacinas,' Glatirameros , GM-CSF's, Goserelinas, acetatos de Goserelina, Granisetronas , Influenza Hemofílica B, Haloperidoles , Vacunas de Hepatitis, Vacunas de Hepatitis A, Vacunas de Hepatitis B, Tiuxetanos de Ibritumomab, Ibritumomabs, Tiuxetanos, Inmunoglobulinas , vacunas de influenza hemofílica, Vacunas de Virus de Influenza, Infliximabs, Insulina lispro, 75% de protamina lispro neutro (NPL) /25% de insulina lispro, 50% de protamina neutra Hagedorn (NPH) / 50% de insulina regular, 70% de NPH/30% de insulina regular; Insulina Regular, insulina NPH, Ultra insulina, insulina ultralenta, e Insulina Glarginas, Interferones , Interferón alfa, Interferones Beta, Interferón Gammas, Interferón alfa-2a, Interferón alfa 2-b, Interferón Alfacon, Interferón alfa-n, Interferones Beta, Interferones Beta-la, Interferón Gammas, Interferón alfa-con, Iodixanoles, Iohexoles, Iopamidoles, Ioversoles, Ketorolacos, Laronidasas, Levofloxacina, Lidocainas, Linezolidos, Lorazepams, Vacunas de sarampión, Virus de sarampión, virus de paperas, Vacunas de Virus de sarampión, Paperas-Rubéola, Vacunas de Rubéola, Medroxiprogesteronas, Meropenems, Metilprednisolonas, Midazolams, Morfinas, Octreotidos, Omalizumabs, Ondansetronas , Palivi zumabs , Pantoprazoles, Pegaspargasas , Pegfilgrastims, Peg-Interferones Alfa-2a, Peg- Interferones Alfa-2b, Pegvisomants, vacunas de Pertussis, Piperacilinas , Vacunas de Pneumococo y Vacunas de Conjugado de Pneumococo, Prometazinas, Reteplasas, Somatropinas, Sulbactams, Sumatriptans, Tazobactams, Tenecteplasas , Toxoides Purificados del Tétanos, Ticarcilinas , Tositumomabs , Triamcinolonas, Acetonidos de Triamcinolona, Hexacetonidos de Triamcinolona, Vancomicinas, inmunoglobulinas de Varicela Zoster, Vacunas de. Varicela, otras vacunas, Alemtuzumabs , Alitretinoinas, Allopurinoles , Altretaminas , Amifostinas , Anastrozoles , Arsénicos, Trióxidos Arsénicos, Asparaginasas , Vacunas de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) , BCG Vivo, Bexarotenos, Bleomicinas, Busulfanos, Busulfano intravenoso, Busulfan orales, Calusteronas , Capecitabinas , Carboplatinas , Carmustinas, Carmustinas con Polifeprosanos, Celecoxibs, Clorambucilos , Cisplatinas, Cladribinas, Ciclofosfamidas , Citarabinas, Citarabina liposomals, Dacarbazinas , Dactinomicinas, Daunorubicina liposomales, Daunorubicinas , Daunomicinas , Diftitoxes de Denileukina, Dexrazoxanos , Docetaxels, Doxorubicinas , Doxorubicina liposomal, propionatos de Dromostanolona, Soluciones B de Elliott, Epirubicinas , Epoyetina-alfas , Estramustinas, Etoposidos, Fosfato de Etoposido, VP-16s de Etoposide, Exemestanos, Floxuridinas , Fludarabinas , Fluorouraciloos , 5- Fluorouraciloos , Fulvestrantes , Gemcitabinas , Gemtuzumabs , Ozogamicins, ozogamioinas de Gemtuzumab, Hidroxiureas , Idarubicinas , Ifosfamidas , mesilatos de Imatinib, Irinotecanos , Letrozoles, Leucovorinas, Levamisoles, Lomustinas, CCNUs, Mecloretaminas , mostazas de Nitrógeno, Megestroles, acetatos de Megestrol, Melfalanos, L-PAMs, Mercaptopurinas, 6-Mercaptopurinas, Mesnas, Metotrexatos , etoxsalenos, Mitomicinas, Mitomicinas C, itotanos, Mitaxantronas, Nandrolonas, Fenpropionatos de Nandrolona, Nofetumomabs , Oprelvequinas , Oxaliplatinas , Paclitaxels, Pamidronatos , Pegademasos , Pentostatinas, . Pipobromanos , Plicamicinas, Mitramicinas , Porfimeros , Porfimero sódico, Procarbazinas, Quinacrinas, Rasburicass, Rituximabs, Sargramostims , Estreptozocinos, Talcos, Tamoxifenos , Temozolomidas , Teniposidas, Testolactonas , Tioguaninas, 6-Tioguaninas, Trietilentiofosforamidas (Tiotepas) , Topotecanos, Toremifenos, Trastuzumabs, Tretinoinas, Mostaza de Uracilo, Valrubicinas , Vinblastinas, Vincristinas , Vinorelbinas , Zoledronatos , Acivicinas, Aclarubicinas , Acodazoles, Acroninas, Adozelesinas, Aldesleucinas , Áciros Retinoicos, Alitretinoinas , Ácidos 9-Cis-Retinoico, Alvocidibs, Ambazonas, Ambomicinas , Ametantronaes , Aminoglutetimidas, Amsacrinaes, Anaxironas, Ancitabinas, AntramHnas, Apaziquomn, Argimesnas, Asperlinas, Atrimustinas , Azacitidinas , Azetepas, Azotomicinas, Banoxantronas , Batabulinas, Batimastatas, Benaxibinas, Bendamustinds , Benzodepas, Bicalutamidas , Bietaserpinas , Biricodars, Bisantrenes, Dimesilatos Bisnafida, Bizelesinas, Bortezomibs , Brequinars, Bropiriminas , Budotitanos, Cactinomicinas , Canertinibs, Caracemides, Carbetimeros, Carboquonas, Carmofurs, Carubicinas, Carzelesinas, Cedefingoles , Cemadotinas , Clorambucilos , Cioteronelos , Cirolemicinas , Clanfenuros, Clofarabinas, Crisnatoles, Decitabinas, Dexniguldipinas , Dexormaplatinas , Dezaguaninas, Diaziquonas, Dibrospidio, Dienogests, Dinalinas, Disermolidas, Dofequidars, Doxifluridinas , Droloxifenos, Duazomicinas, Ecomustinas, Edatrexatos, Edotecarinas, Eflornitinas , Elacridars, Elinafidas, Elsamitrucinas , Emitefurs, Enloplatinas , Enpromatos, Enzastaurinas , Epipropidinas , Eptaloprosts , Erbulozolas, Esorabicinas , Etanidazoles , Etoglucidos, Etoprinas, Exisulindas, Fadrozoles, Fazarabinas, Fenretinidas , Fluoximesteronas, Flurocitabinas, Fosquidonas, Fostriecinas, Fotretaminas , Galarubicinas , Galocitabinas , Geroquinoles, Gimatecanos, Gimeracilos , Gloxazonas, Glufosfamidas , Ilmofosinas, Ilomastatos, Imexonas, Improsulfanos , Indisulamas , Inproquonas, Interleucinas , Interleucinas-2, Interleucinas recombinantes , Intoplicinas, lobenguanos, Iproplatinas , Irsogladinas , Ixabepilonas , Cetotrexatos, L-Alanosinas, Lanreotidos, Lapatinibs, Ledoxantronas , Leuprolidos, Leuprorelinas , Lexacalcitoles , Liarozoles, Lobaplatinas , . Lometrexoles , Lonafamibs, Losoxantronas, Lurtotecanos , Mafosfamidas , Mannosulfanos , Marimastatos, Masoprocoles , Maitansinas, Mecloretaminas , Melengestroles, Melfalanos, Menógarilos, Mepitiostanos , etesinds, Metomidatos, Metoprinas, Meturedepas, Miboplatinas , Miproxifenos , isonidazoles , Mitindomidas , Mitocarcinas, Mitocrominas , Mitoflaxonas , Mitogilinas, itoguazonas, Mitomalcinas, Mitonafidas, Mitoquidonas , Mitospers, Mitozolomidas, Mivobulins, Mizoribinas, Mofarotenos, Mopidamoles, Mubritinibs, Ácidos Micofenólicos , Nedaplatinas , Neizarabinas , Nemorubicinas , Nitracrinas, Nocodazoles, Nogalamicinas , Nolatrexeds, Nortopixantronas , Ormaplatinas , Ortataxels, Oteracilos, Oxisuranos, Oxofenarsinas , Patupilonas, Peldesinas, Peí i omi cinas, Pelitrexoles , Pemetrexeds, Pentamustinas, Peplomicinas, Perfosfamidas , Perifosinas, Picopl at inas , Pinafidas, Piposulfanos, Pirfenidonas, Piroxantronas, Pixantronas, Plevitrexeds , Plomestanos, Porfiromicinas, Prednimustinas , Propamidinas , Prospidiums , Pumitepas, Puromicinas , Pirazofurinas , Ranimustinas, Riboprinas, Ritrosulfanos , Rogletimidas , Roquinimexs, Rufocromomicinas , Sabarubicinas , Safingoles, Satraplatiñas , Sebriplatinas , Semustinas, Simtrazenos , Sizofiranos, Sobuzoxanos, Sorafenibs, Esparfosatos , Ácidos Esparfósicos , Eparsomicinas , Espirogermanio, Espiromustinas , Espiroplatinas , Esqualaminas , streptonigrinas, Estreptovaricinas , Sufosfamidas , Sulofenuros, Tacedinalinas , . Talisomicinas , Talimustinas , Tariquidares, Tauromustinas , Tecogalanos, Tegafuros, Teloxantronas, Temoporfinas , Teroxironas, Tiamiprinas, Tiamiprinas, Tiazofurinas , Tilomisoles, Tiloronas, Timcodares, Timonacics, Tirapazaminas, Topixantronas , Trabectedinas , Ecteinascidina 743, Trestolonas, Triciribinas , Trilostanas, Trimetrexatos , Tetranitratós de Triplatina, Triptorelinas , Trofosfamidas , Tubulozoles, Ubenimexs, Uredepas, Valspodares, Vapreotidos, Verteporfinas, Vinblastinas , Vindesinas, Vinepidinas, Vinfluninas, Vinformidas , Vinglicinatos , Vinleucinoles , Vinleurosinas , Vinrosidinas , Vintriptoles, Vinzolidinas , Vorozoles, Xantomicinas A, Guameciclinas, Zeniplatinas, Zilascorbs [2-H] , Zinostatinas , Zorubicinas, Zosuquidares , Aeetazolamidas , Aciclovires, Adipiodonas, Alatrofloxacinas , Alfentaniles , Ectractos Alergénicos, Inhibidores de Alfa 1-proteinasa, Alprostadilos , Amicacinas, Aminoácidos, Ácidos aminocaproicos, Aminofilinas , Amitriptilinas , Amobarbitales , Amrinonas, Analgésicos, Vacunas anti-poliomieliticas, Sueros anti-rábicos , inmunoglobulinas anti-tétanos , vacunas de tétanos, enfermedades Antitrombina, sueros anti-veneno, Argatrobanos , Argininas, ácidos ascórbicos, Atenololes, Atracurio, Atropinas, Aurotioglucosas, Azatioprinas , Aztreonams, Bacitracinas , Baclofenos, Basiliximabs , ácidos bezoicos, Benztropinas, Betametasonas, Biotinas, Bivalirudinas, Antitoxinas de botulismo, Bretilio, Bumetanidas, Bupivacainas , . Buprenorfinas, Butorfanoles , Calcitoninas , Calcitríoles , Calcio, Capreomicinas , Carboprosts, Carnitinas, Cefamándoles , Cefoperazonas , Cefotaximas, Cefoxitinas, Ceftizoximas, Cefuroximas, Cloranfenicoles , Cloroprocaínas, Cloroquinas, Clorotiazidas , Clorpromazinas, Ácidos condroitinsulfúricos , Coriogonadotropina-alfas, Cromo, Cidofovires, Cimetidinas, Ciprofloxacinas , Cisatracurio, Clonidinas, Codeinas, Colquicinas, Colistinas, Colágenos, Triflutatos de ovino de corticorelina, Corticotrofinas , Cosintropinas , Cianocobalaminas, Ciclosporinas , Cisteinas, Dacliximabs, Dalfopristinas, Dalteparinas , Danaparoides , Dantrolenos, Deferoxaminas , Desmopresinas, Dexametasonas , Dexmedetomidinas , Dexpantenoles, Dextranos, Dextranos de hierro, Ácidos Diatrizoicos, Diazepams, Diazoxidas, Diciclominas, Digibindas, Digoxinas, Dihidroergotaminas , Diltiazems, Difenhidraminas-, Dipiridamoles , Dobutaminas, Dopaminas, Doxacurio, Doxapramos, Doxercalciferóles , Doxiciclinas, Droperidoles , Difilinas, Ácidos edéticos, Edrofonio, Enalaprilatos , Efedrinas, Epoprostenoles , Ergocalciferóles, Ergonovinas, Ertapenemos, Eritromicinas , Esmololes, Estradioles, Estrogénicos , Ácidos etacrinicos, Etanolaminas, Etanoles, Aceite etiodizados, Ácidos etidrónicos, Etomidatos, Famotidinas, Fenoldopamos , Fentanilo, Flumazenilos , Fluoresceinas , Flufenazinas , Ácidos folíeos, Fomepizoles, Fomivi.rsenos, Fondaparinuxs , Foscarnets, Fosfenitoinas , Furosemidas , Gadoteridoles , Gadoversetamidas , Ganciclovires , Gentamicinas , Glucagonas, Glucosas, Glicinas, Glicopirrolatos, Gonadorelinas , Gonadotropina coriónicá, polisacáridos Hemofilias B, Heminas, Herbales, Histaminas, Hidralazinas , Hidrocortisonas , Hidromorfonas , Hidroxocobalaminas, Hidroxi zinas , Hiosciaminas, Ibutilidos, Imiglucerasas , carmines índigo, Indometacinas , Yoduros, Yopromidas, ácido Iotalámicos, ácidos ioxáglicos, Ioxilanos, Isoniazidos, Isoproterenoles, Vacunas de encefalitis Japonesa, Canamicinas, Cetaminas, Labetaloles, Lepirudinas, Levobupivacainas , Levotiroxinas , Lincomicinas , Liotironinas , Hormonas Luteinizantes, Vacunas de enfermedad de Lyme, Mangafodipires , Manttoles, Vacunas de polisacárido Meningocócico, Meperi'dinas, Mepivacainas , Mesoridazinas , Metaraminoles , Metadonas, Metocarbamoles , Metohexitales , Metildopatos , Metilergonovinas, Metoclopramidas , Metoprololes, Metronidazoles , Minociclinas, Mivacurio, Ácidos morruicos, Moxifloxacinas, Muromonab-CD3s , Mofetilos de micofenolato, Nafcilinas, Nalbufinas, Nalmefenos, Naloxonas, Neostigminas , Niacinamidas , Nicardipinas, Nitroglicerinas, Nitroprassidos, Norepinefriñas , Orfenadrinas, Oxacilinas, Oximorfonas, Oxitetraciclinas, Oxitocinas, Pancuronio, Pantenoles, Ácidos pantoténicos, Papaverinas, Peginterferones-alfa 2A, Penicilinas G, Pentamidinas , Pentazocinas , Pentobarbitales, .Perflutrenos, Perfenazinas , Fenobarbitales, Fentolaminas , Fenilefriñas , Fenitoinas, Fisostigminas, Fitonadionas , Polimixina, Pralidoximas , Prilocainas, Procainamidas, Procainas, Proclorperazinas , Progesteronas, Propranololes, Hidróxidos de piridostigmina, Piridoxinas, Quinidinas, Quinupristinas , Inmunoglobulinas de rabia, Vacunas de Rabia, Ranitidinas, Remifentanilos , Riboflavinas, Rifampinas, Ropivacainas, Samario, Escopolaminas, Eselenio, Esermorelinas , Sincalidos, Somatremos, Espectinomicinas , Estreptocinasas , Estreptomicinas, Succinilcolinas, Sufentanilos , Sulfametoxazoles , Tacrolimusas , Terbutalinas , Teriparatidos , Testosteronas, antitoxinas de tétano, Tetracainas, Sulfatos de tetradecilo, Teofilinas, Tiaminas, Tietilperazinas , Tiopentalos, Hormonas estimuladoras de la tiroides, Tinzaparinas , Tirofibanos, Tobramicinas, Tolazolinas, Tolbutamidas, Torsemidas, Ácidos tranoxámicos , Treprostinilos, Trifluoperazinas, Trimetobenzamidas , Trimethoprimas, Trometaminas , Tuberculinas , Vacunas de tifoidea, UroFolitropinas , Urocinasas, ácidos Valproicos, Vasopressinas, Vecuronio, Verapamilos, Voriconazoles , arfarinas, Vacunas de fiebre amarilla, Zidovudinas, Zincs, clorhidratos de Ziprasidona, Aclacinomicinas , Actinomicinas , Adriamicinas, Azaserinas, 6-Azauridinas , Carzinofilinas , Cromomicinas , Denopterinas , 6-Diazo-5-Oxo-L-Norleucinas , Enocitabinas, Floxuridinas, Olivomicinas , Pirarubicinas , Piritreximas , Pteropterinas , Tegafuros, Tubercidinas, Alteplasas, Arcitumomabs, bevacizumabs, Toxinas de Botulinio tipo A, Toxinas de Botulinio tipo B, Capromab Pendetidos, Daclizumabs, Dornasas-alfa , Drotrecoginas-alfa, Pentetatos e Imciromab, Yodos-131, un agente antibiótico; un inhibidor de angiogénesis ; sustancias de retinopatia anti-cataratas y anti-diabéticas ; inhibidores de anhidrasa carbónicos; midriáticos; agentes de terapia fotodinámica; análogos de prostaglandina; factor de crecimiento; anti-neoplásicos ; anti-metabolitos ; anti-virales ; amebicidas y anti-protozoarios ; anti-tuberculosis y anti-lepróticos ; antitoxinas y anti-veninas ; factor anti-hemofilico, complejo coagulante anti-inhibidor, antitrombina HI, factor de coagulación V, Factor de coagulación IX, fracción de proteina plasmática, factor de ???· Willebrand; agente anti-plaquetas , un factor de estimulador de colonia (CSF) ; un estimulador de eritropoyesis ; hemostáticos y albúminas; Globulinas Inmunitarias ; inhibidores de trombina; anticoagulantes; un fármaco anti-inflamatorio esteroidal seleccionado de entre alclometasonas, algestonas, beclometasonas, betametasonas , budesonidos, clobetasoles, clobetasonas , clocortolonas , cloprednoles , corticosteronas , cortisonas, cortivazoles , deflazacortes , desonidos, desoximetasonas , dexametasonas , diflorasonas , diflucortolonas, difluprednatos , enoxolonas, fluazacortes , fluclor nidas , flumetasonas, flunisolidos, fluocinolonas , fluocinonidos , fluocortinas , fluocortolonas , fluorometolonas , fluperolonas, fluprednidenos , fluprednisolonas , flurandrenolidos , fluticasonas, formocortales , halcinonidos , halobetasoles, halometasonas , halopredonas , hidrocortamatos, hidrocortisonas, etabonato de loteprednol, mazipredonas, medrisonas, meprednisonas , metilprednisolonas, furoato de mometasona, parametasonas , prednicarbatos, prednisolonas, prednisonas, prednivales, prednilidenos , rimexolonas, tixocortolesi triamcinolonas ; Docosanoles, prostaglandinas, análogos de prostaglandina, antiprostaglandinas y precursores de prostaglandina; mitóticos, colinérgicos y anti-colinesterasa ; y anti-alergénicos.
92. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-91, caracterizada porque es una composición liquida.
93. Una co-formulación, caracterizada porque comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido PH20 modificada de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1-45; -y una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción rápida.
94. Una co-formulación, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido PH20 modificado de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1-17; -y una cantidad terapéuticamente efectiva de . una insulina de acción rápida.
95. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 93 o reivindicación 94, caracterizada porque el polipéptido PH20 modificado en la formulación es estable en una temperatura de o de aproximadamente 2°C a 8°C, inclusive, durante por lo menos 1 mes o es estable en una temperatura de o de aproximadamente 30°C a 42°C, inclusive, durante por lo menos 3 días.
96. La co-formula'ción de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-95, caracterizada porque la cantidad de polipéptido PH20 modificado es de o de aproximadamente 100 U/mL a l 00 U/mL, 200 U/mL a 800 U/mL, o 400 U/mL a 800 U/mL.
97. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-96, caracterizada porque insulina de acción rápida es insulina regular o un análogo de insulina.
98. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-97, caracterizada porque la insulina de acción rápida es una insulina regular que es una insulina humana o una insulina de cerdo.
99. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-98, caracterizada porque: la insulina de acción rápida comprende una cadena A que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y la cadena B que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 863; o la insulina de acción rápida comprende una cadena A con la secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO: 864 y una cadena B con la secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 864.
100. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-97, caracterizada porque la insulina de acción rápida es un análogo de insulina seleccionado de entre insulina lispro, insulina apartad e insulina glulisina.
101. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque el análogo de insulina se selecciona de entre una insulina que tiene una cadena A con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 865-867.
102. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-101, caracterizada porque la cantidad de insulina de acción rápida es de o de aproximadamente 10 U/mL a 1000 U/mL, 50 U/mL a 500 U/mL, 100 U/mL a 1000 U/mL o 500 U/mL a 1000 U/mL, inclusive.
103. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-102, caracterizada porque tiene un pH de o de aproximadamente 7.0 a 7.6.
104. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-103, caracterizada porque comprende NaCl en una concentración de o de aproximadamente 0.1 mM a 200 mM, 0.1 mM a 100 mM, 120 mM a 200 mM, 10 mM a 50 mM, 10 mM a .90' mM, 80 mM a 200 mM, 80 mM a 140 mM, 50 mM a 100 mM, 80 mM a 100 mM, 50 mM a 80 mM, 100 mM a 140 mM o 120 mM a 140 mM.
105. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-104, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva antimicrobiana de por lo menos un conservador.
106. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 105, caracterizada porque la cantidad efectiva anti-microbiana es una- cantidad total de uno o más agentes conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) que es o está entre 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% a 0.4% inclusive.
107. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 105 o reivindicación 106, caracterizada porque el conservador (es ) es un conservado (es) fenólico, un conservador (es) no fenólico o un conservador (es) fenólico y un conservador (es ) no fenólico.
108. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 105-107 , caracterizada porque el conservador (es) se selecciona (n) de entre fenol, m-cresol, metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol, diclorohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol, acetato fenilmercúrico, glicerol, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, o-cresol, p-cresol, clorocresol, cetrimida, cloruro de benzetonio, etil-parabeno, propilparabeno, butilparabeno y cualquiera de las combinaciones de las mismas.
109. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 105-108, caracterizada porque la composición contiene un conservador individual.
110. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 105-120, caracterizada porque la composición contiene una mezcla de 'conservadores que contiene 2, 3 o 4 de conservadores diferentes.
111. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-110, caracterizada porque comprende por lo menos un conservador fenólico.
112. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 111, caracterizada porque el conservador ( es ) se seleccionado (n ) de entre fenol, metacresol (m-cresol), alcohol bencílico, y un parabeno.
113. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque el conservador es un parabeno que es metilparabeno o propilparabeno.
114. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-113, caracterizada porque comprende un tensoactivo en una cantidad como un % de concentración de masa (p/v) en la formulación que es por lo menos o por lo menos aproximadamente '0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045% , 0.05% , 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%. 0.08% o 0.9%.
115. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado porque el tensoactivo se selecciona de entre un polipropilenglicol, polietilenglicol , glicerina, sorbitol, poloxámero y Polisorbato.
116. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque el tensoactivo se selecciona de entre poloxámero 188, polisorbato 20 y polisorbato 80.
117. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-116, caracterizada porque comprende un agente amortiguador que es un agente de ligación no de metal o es un agente de ligación de metal.
118. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 117, ' caracterizada porque el agente amortiguador se selecciona de entre Tris, histidina, fosfato y citrato.
119. La co-fórmulación de conformidad con la reivindicación 117 o reivindicación 118, caracterizada porque la concentración del agente amortiguador está entre aproximadamente 1 mM a 100 mM, 10 mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM.
120. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-119,- caracterizada porque comprende glicerina en una concentración menor que 60 mM, menor que 55 mM, menor que 50 mM, menor que 45 mM, menor que 40 mM, menor que 35 mM, menor que 30 mM, menor que 25 mM, menor que 20 mM, menor que 15 mM, menor que 10 mM.
121. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-120, caracterizada porque comprende un antioxidante.
122. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 121, caracterizada porque el antioxidante se selecciona de entre cisteina, triptófano y metionina.
123. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 121 o reivindicación 122, caracterizada porque el antioxidante está en una concentración de entre o de aproximadamente entre 2 m a 50 m , 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, inclusive.
124. La co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 93-123, caracterizada porque comprende zinc.
125. La co-formulación de conformidad con la reivindicación 124, caracterizada porque la concentración de zinc es entre o aproximadamente entre 0.001 a 0.1 mg por 100 unidades de insulina (mg/100U) , 0.001 a 0.05 mg/100U o 0.01 a 0.05 mg/100U.
126. Un sistema de bucle cerrado, caracterizado porque comprende la co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 94-125.
127. Una bomba de insulina, caracterizada porque comprende la co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 94-125..
128. Una pluma de insulina, caracterizada porque comprende la co-formulación de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 95-125.
129. Un método para tratar una enfermedad o afección asociada con hialuronano, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto un polipéptido PH20 modificado de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1-56 o una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 60-92.
130. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque la enfermedad o afección asociada con hialuronano es una enfermedad inflamatoria o un tumor o cáncer . ·
131. El método de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque el tumor es un tumor sólido.
132. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 129-131, caracterizado porque la enfermedad o afección asociada con hialuronano se selecciona de entre un cáncer de etapa tardía, cánceres metastásicos y cánceres no diferenciados.
133. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 129-132, caracterizado porque la enfermedad o afección asociada con hialuronano se selecciona de entre cáncer de ovario, carcinoma in situ (ISC) , carcinoma de células escamosas (SCC) , cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de · pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama y cáncer de colon.
134. Un método para tratar diabetes, caracterizado porque comprende administrar un sujeto una composición farmacéutica de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 84-90 o co-formulación de cualquiera de las reivindicaciones 93-125.
135. El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado porque la diabetes se selecciona entre diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 o diabetes gestacional.
136. Un método para incrementar la administración de un agente terapéutico a un sujeto, caracterizado porque comprende : administrar a un sujeto un polipéptido PH20 modificado de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1-45, un composición 'farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 60-92 o una co-formulación de cualquiera de las reivindicaciones 93-125; y administrar un agente terapéutico.
137. El método de conformidad con la reivindicación 136, caracterizado porque la administración es subcutánea.
138. El método de conformidad con la reivindicación 136 o reivindicación 137, caracterizado porque el polipéptido PH20 modificado o composición caracterizado porque comprende a polipéptido PH20 modificado se administra antes de, simultáneamente con, intermitentemente con o subsecuentemente a la administración del agente terapéutico.
139. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-138, caracterizado porque el agente terapéutico es un polipéptido, una proteina, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula pequeña o una molécula orgánica.
140. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-139, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona de. entre agente quimioterapéut i co , un agente analgésico, un agente anti-inflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida , un agente anti-parkinson, un agenté anti-malaria, un agente anti-convulsionante, un agente antidepresivo, y agente antiartritis, un agente ' anti-fúngico, un agente antihipertensión, un agente antipirético, un agente anti-parasito, un agente anti-histamina, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente bloqueador alfa, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueador adrenérgico beta, un. agente bloqueador de canal de calcio, un agente de fármaco cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestionante, un agente diurético, un agente depresor, un agente de diagnóstico, un agente de electrolitos, un agente hipnótico, un agente de hormonas, un agente hiperglicémico, un agente relajante muscular, un agente de contracción de músculos, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante físico, un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizador, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente de vitaminas, un agente antHnflamatorio no esteroidal, un agente inhibidor de enzima de conversión de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica y un inductor de sueño.
141. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-140, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona de entre un anticuerpo, una Globulina inmunitaria, . un bisfosfonato, una citoquina, un agente terapéutico, un factor de coagulación y un a insulina.
142. El método de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado porque el agente terapéutico es una insulina que es una insulina de acción rápida.
143. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque insulina de acción rápida es insulina regular o es un análogo de insulina.
144. El método de conformidad con la reivindicación 142 o 143, caracterizado porque insulina de acción rápida es una insulina regular que es una insulina humana o una insulina de cerdo.
145. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 142-144, caracterizado porque: la insulina de acción rápida comprende una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 862 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 863; o la insulina de acción rápida comprende una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos de aminoácidos de 88-108 de SEQ ID NO:864 y una cadena B que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como posiciones de residuos .de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 864.
146. El método de conformidad con la reivindicación 142 o reivindicación 143, caracterizado porque la insulina de acción rápida es un .análogo de insulina seleccionado de entre insulina lispro, insulina aspart o insulina glulisina.
147. El método de conformidad con la reivindicación 146, caracterizado porque el análogo de insulina comprende una cadena con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO.862 y una cadena B seleccionada de entre las secuencias de aminoácidos expuestas en cualquiera de SFQ ID NOS: 865-867.
148. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-140, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona de entre Adalimumabs, Agalsidasas Beta, Alefacepts, .Ampicilinas , Anaquinras, Vacunas Anti-poliomielíticas, Anti-Timocitos , Azitromicinas , Becaplermins , Caspofungins, Cefazolinas, Cefepimas, Cefotetanos, Ceftazidimas , Ceftriaxónas , Cetuximabs , Cilastatinas , Ácidos Clavulánicos , Clindamicinas , Darbepoetinas Alfa, Daclizumabs, Difteria, antitoxinas de Difteria, Toxoides de Difteria, Efalizumabs, Epinefrinas, Eritropoyetinas Alfa, Etanercepts, FiIgrastims, Fluconazoles , Hormonas Estimuladoras de Folículos, Folitropinas Alfa, Folitropina Betas, Fosfenitoinas , Gadodiamidas, Gadopentetatos , Gatifloxacinas , Glatirameros , GM-CSF's, Goserelinas, acetatos de Goserelina, Granisetronas , Influenza Hemofílica B, Haloperidoles , Vacunas de Hepatitis, Vacunas de Hepatitis A, Vacunas de Hepatitis B, Tiuxetanos de Ibritumomab, Ibritumomabs , Tiuxetanos, Inmunoglobulinas , vacunas de influenza hemofílica, Vacunas de Virus de Influenza, Infliximabs, Insulina lispro, 75% de protamina lispro enutro (NPL) /25% de insulina lispro, 50% de protamina neutra Hagedorn (NPH) / 50% de insulina regular, 70% de NPH/30% de insulina regular; Insulina Regular, insulina NPH, Ultra . insulina, insulina . ultralenta, e Insulina Glarginas, Interferones , Interferón alfa, Interferones Beta, Interferón Gammas, Interferón alfa-2a, Interferón alfa 2-b, Interferón Alfacon, Interferón alfa-n, Interferones Beta, Interferones Beta-la, interferón Gammas, Interferón alfa-con, Iodixanoles, Iohexoles, Iopamidoles, Ioversoles, Ketorolacos, Laronidasas, Levofloxacina, Lidocaínas, Linezolidos, Lorazepams, Vacunas de sarampión, Virus de sarampión, virus de paperas, Vacunas de Virus de sarampión, Paperas-Rubéola, Vacunas de Rubéola, . Medroxiprogesteronas, Meropenems, Metilprednisolonas , Midazolams, Morfinas, Octreotidos, Omalizumabs, Ondansetronas , Palivizumabs , Pantoprazoles , Pegaspargasas, Pegfilgrastims, Peg-Interferones Alfa-2a, Peg-Interferones Alfa-2b, Pegvisomants , vacünas de Pertussis, Piperacilinas , Vacunas de Pneumococo y Vacunas de Conjugado de Pneumococo, Prometazinas , Reteplasas, Somatropinas , Sulbactams, Sumatriptans, Tazobactams, Tenecteplasas , Toxoides Purificados del Tétanos, Ticarcilinas , Tositumomabs , Triamcinolonas, Acetonidos de Triamcinolona, Hexacetonidos de Triamcinolona, Vancomicinas , inmunoglobulinas de Varicela Zoster, Vacunas de Varicela, otras vacunas, Alemtuzumabs , Alitretinoinas, Allopurinoles , Altretaminas , Amifostinas, Anastrozoles , Arsénicos, Trióxidos Arsénicos, Asparaginasas , Vacunas de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) , BCG Vivo, Bexarotenos, Bleomicinas, Busulfanos, Busulfano intravenoso, Busulfan orales, Calusteronas , Capecitabinas , Carboplatinas , Carmustinas, Carmustinas con Polifeprosanos, Celecoxibs, Clorambucilos, Cisplatinas, Cladribinas, Ciclofosfamidas , Citarabinas, Citarabina liposomals, Dacarbazinas , Dactinomicinas, Daunorubicina. liposomales, Daunorubicinas , Daunomicinas, Diftitoxes de Denileukina, Dexrazoxanos , Docetaxels, Doxorubicinas, Doxorubicina liposomal, propionatos de Dromostanolona, Soluciones B de Elliott, Epirubicinas , Epoyetina-al fas , Estramustinas, Etoposidos, Fosfato de Etoposido, VP-16s de Etoposide, Exemestanos , Floxuridinas , Fludarabinas , Fluorouraciloos , 5- Fluorouraciloos , Fulvestrantes , Gemcitabinas , Gemtuzumabs , Ozogamicins, ozogamicinas de Gemtuzumab, Hidroxiureas , Idarubicinas , Ifosfamidas, mesilatos de Imatinib, Irinotecanos , Letrozoles, . Leucovorinas, Levamisoles, Lomustinas, CCNUs, - Mecloretaminas , mostazas de Nitrógeno, Megestroles, acetatos de Megestrol, Melfalanos, L-PAMs, Mercaptopurinas , 6-Mercaptopurinas , Mesnas, Metotrexatos , Metoxsalenos , Mitomicinas, Mitomicinas C, Mitotanos, Mitoxantronas , Nandrolonas, Fenpropionatos de Nandrolona, Nofetumomabs , Oprelvequinas , . Oxaliplatinas , Paclitaxels, Pamidronatos , Pegademasos, Pentostatinas, Pipobromanos , Plicamicinas , Mitramicinas , Porfimeros, Porfimero sódico, Procarbazinas , Quinacrinas, Rasburicass, Rituximabs, Sargramostims, Estreptozocinos, Talcos, Tamoxifenos, Temozolomidas, Teniposidas, Testolactonas , Tioguaninas, 6-Tioguaninas, Trietilentiofosforamidas (Tiotepas) , Topotecanos, Toremifenos, Trastuzumabs , Tretinoinas, Mostaza de üracilo, Valrubicinas , Vinblastinas, Vincristinas , Vinorelbinas, Zoledronatos , Acivicinas, Aclarubicinas , Acodazoles, Acroninas, Adozelesinas, Aldesleucinas , Áciros Retinoicos, Alitretinoinas, Ácidos 9-Cis-Retinoico, Alvocidibs, Ambazonas, Ambomicinas, etantronaes , Aminoglutetimidas , Amsacrinaes, Anaxironas, Ancitabinas, AntramHnas, Apaziquomn, Argimesnas, Asperlinas, Atrimustinas , Azacitidinas , Azetepas, Azotomicinas , Banoxantronas , Batabulinas, Batimastatas , Benaxibinas, Bendamustinds , Benzodepas, Bicalutamidas, Bietaserpinas, Biricodars, Bisantrenes, Dimesilatos Bisnafida, Bizelesinas, Bortezomibs, Brequinars, Bropiriminas, Budotitanos, Cactinomicinas , Canertinibs, Caracemides, Carbetimeros , Carboquonas, Carmofurs, Carubicinas, Carzelesinas , Cedefingoles , Cemadotinas, Clorambucilos , Cioteronelos , Cirolemicinas , Clanfenuros, Clofarabinas , Crisnatoles, Decitabinas, Dexniguldipinas , Dexormaplatinas, Dezaguaninas, Diaziquonas, Dibrospidio, Dienogests, Dinalinas, Disermolidas , Dofequidars, Doxifluridinas , Droloxifenos , Duazomicinas , Ecoraustinas, Edatrex'atos, Edotecarinas , Eflornitinas , Elacridars, Elinafidas, Elsamitrucinas , Emitefurs, Enloplatinas, Enpromatos , Enzastaurinas, Epipropidinas, Eptaloprosts, Erbulozolas, Esorabicinas , Etanidazoles , Etoglucidos, Etoprinas, Exisulindas, Fadrozoles, Fazarabinas, Fenretinidas, Fluoximesteronas, Flurocitabinas, Fosquidonas, Fostriecinas , Fotretaminas , Galarubicinas , Galocitabinas , Geroquinoles, Gimatecanos, Gimeracilos, Gloxazonas, Glufosfamidas , Ilmofosinas , Ilomastatos, Imexonas, Improsulfanos , Indisulamas , Inproquonas, Interleucinas , Interleucinas-2 , Interleucinas recombinantes , Intoplicinas , lobenguanos, Iproplatinas , Irsogladinas , Ixabepilonas , Cetotrexatos, L-Alanosinas, Lanreotidos, Lapatinibs, Ledoxantronas , Leuprolidos, Leuprorelinas , Lexacalcitoles , Liarozoles, Lobaplatinas , Lometrexoles, Lonafamibs, Losoxantronas , Lurtotecanos , Mafosfamidas , Mannosulfanos , Marimastatos , Masoprocoles , Maitansinas, Mecloretaminas , Melengestroles, Melfalanos , Menogarilos, Mepitiostanos , Metesinds, Metomidatos, Metoprinas, Meturedepas, Miboplatinas , Miproxifenos , Misonidazoles, Mitindomidas , Mitocarcinas, Mitocrominas , Mitoflaxonas , Mitogilinas, Mitoguazonas , Mitomalcinas , Mitonafidas, Mitoquidonas , Mitospers, Mitozolomidas , Mivobulins, Mizoribinas , Mofarotenos, Mopidamolés, Mubritinibs, Ácidos Micofenólicos , Nedaplatinas, Neizarabinas , Nemorubicinas , Nitracrinas , Nocodazoles, Nogalamicinas , Nolatrexeds, Nortopixantronas , Ormaplatinas, Ortataxels, Oteracilos, Oxisuranos, Oxofenarsinas, Patupilonas, Peldesinas, Peliomicinas , Pelitrexoles, Pemetrexeds , Pentamustinas, Peplomicinas , Perfosfamidas, Perifosinas, Picoplatinas , Pinafidas, Piposulfanos, Pirfenidonas, Piroxantronas, Pixantronas, Plevitrexeds, Plomestanos, Porfiromicinas , Prednimustinas , Propamidinas, Prospldiums, Pumitepas, Puromicinas, Pirazofurinas , Ranimustinas, Riboprinas, Ritrosulfanos , Rogletimidas , Roquinimexs, Rufocromomicinas , Sabarubicinas , Safingoles, Satraplatinas , Sebriplatinas , Semustinas, Simtrazenos, Sizofiranos , Sobuzoxanos, Sorafenibs, Esparfosatos , Ácidos Esparfósicos , Eparsomioinas , Espirogermanio, Espiromustinas , Espiroplatinas , Esqualaminas , streptonigrinas , Estreptovaricinas , Sufosfamidas , Sulofenuros, Tacedinalinas , Talisomicinas , Talimustinas , Tariquidares , Tauromustinas , Tecogalanos, Tegafuros, Teloxantronas, Temoporfinas, Teroxironas, Tiamiprinas, Tiamiprinas, Tiazofurinas, Tilomisoles , Tiloronas, Timcodares, Timonacics, Tirapazaminas , Topixantronas , Trabectedinas, Ecteinascidina 743, Trestolonas, Triciribinas , Trilostanas, Trimetrexatos, Tetranitratos de Triplatina, Triptorelinas, Trofosfamidas , Tubulozoles, Ubenimexs, Uredepas, Valspodares, Vapreotidos, Verteporfinas , Vinblastinas, Vindesinas, Vinepidinas, Vinfluninas, Vinformidas, Vinglicinatos, Vinleucinoles, Vinleurosinas , Vinrosidinas, Vintriptoles , Vinzolidinas , Vorozoles, Xantomicinas A, Guameciclinas , Zeniplatinas , Zilascorbs [2-H] , Zinostatinas , Zorubicinas, Zosuquidares, Acetazolamidas , Aciclovires, Adipiodonas, Alatrofloxacinas, Alfentaniles , Ectractos Alergénicos, Inhibidores de Alfa 1-proteinasa , Alprostadilos , Amicacinas, Aminoácidos, Ácidos aminocaproicos, Aminofilinas , Amitriptilinas , Amobarbitales , Amrinonas, Analgésicos, Vacunas anti-poliomieliticas , Sueros anti-rábicos , inmunoglobulinas anti-tétanos , vacunas de tétanos, enfermedades Antitrombina, sueros anti-veneno, Argatrobanos , Argininas, ácidos ascórbicos, Atenololes, Atracurio, Atropinas, Aurotioglucosas , Azatioprinas , Aztreonams, Bacitracinas , Baclofenos, Basiliximabs , ácidos bezoicos, Benztropinas, Betametasonas, Biotinas, Bivalirudinas , Antitoxinas de botulismo, Bretilio, Bumetanidas, Bupivacainas, Buprenorfinas, Butorfanoles, Calcitoninas , Calcitrioles , Calcio, Gapreomicinas , Carboprosts, Carnitinas, Cefamándoles , Cefoperazonas , Cefotaximas , Cefoxitinas, Ceftizoximas, Cefuroximas, Cloranfenicoles , Cloroprocainas , Cloroquinas, Clorotiazidas , Clorpromazinas, Ácidos condroitinsulfúricos , Coriogonadotropina-alfas , Cromo, Cidofovires, Cimetidinas, Ciprofloxacinas, Cisatracurio, Clonidinas, Codeinas, Colquicinas, Colistinas, Colágenos, Triflutatos de ovino de corticorelina, Corticotrofinas , Cosintropinas , Cianocobalaminas, Ciclosporinas , Cisteinas, Dacliximabs, Dalfopristinas, Dalteparinas, Danaparoides, Dantrolenos, Deferoxaminas, Desmopresinas , Dexametasonas , Dexmedetomidinas , Dexpantenoles , Dextranos, Dextranos de hierro, Ácidos Diatrizoicos, Diazepams, Diazoxidas, Diciclominas , Digibindas, Digoxinas, Dihidroergotaminas , Diltiazems, Difenhidraminas , Dipiridamoles , Dobutarainas, Dopaminas, Doxacurio, Doxapramos, Doxercalciferóles , Doxiciclinas , Droperidoles , Difilinas, Ácidos edéticos, Edrofonio, Enalaprilatos , Efedrinas, Epoprostenoles , Ergocalciferóles , Ergonovinas, Ertapenemos, Eritromicinas , Esmololes, Estradioles, Estrogénicos , Ácidos etacrinicos, Etanolaminas , Etanoles, Aceite etiodizados, Ácidos etidrónicos, Etomidatos, Famotidinas, Fenoldopamos , Fentanilo, Flumazenilos , Fluoresceinas, Flufenazinas , Ácidos folíeos, Fomepizoles, Fomivirsenos , Fondaparinuxs , Foscarnets, Fosfenitoinas , Furosemidas, Gadoteridoles , Gadoversetamidas , Ganciclovires , Gentamicinas , Glucagonas, Glucosas, Glicinas, Glicopirrolatos, Gonadorelinas , Gonadotropina coriónica, polisacáridos Hemofilus B, Heminas, Herbales, Histaminas, Hidralazinas, Hidrocortisonas , Hidromorfonas , Hidroxocobalaminas , Hidroxizinas, Hiosciaminas, Ibutilidos, Imiglucerasas, carmines índigo, Indometacinas, Yoduros, Yopromidas, ácido Iotalámicos, ácidos ioxáglicos, Ioxilanos, Isoniazidos, Isoproterenoles, Vacunas de encefalitis Japonesa, Canamicinas, Cetaminas, Labetaloles, Lepirudinas, Levobupivacainas , Levotiroxinas , Lincomicinas , Liotironinas, Hormonas Luteinizantes, Vacunas de enfermedad de Lyme, Mangafodipires , Manttoles , Vacunas de polisacárido Meningocócico, Meperidinas, Mepivacainas , Mesoridazinas , Metaraminoles, Metadonas, Metocarbamoles, Metohexitales, Metildopatos , Metilergonovinas, Metoclopramidas , Metoprololes , Metronidazoles, Minociclinas , Mivacurio, Ácidos morruicos, Moxifloxacinas, Muromonab-CD3s, Mofetilos de micofenolato, Nafcilinas, Nalbufinas, Nalmefenos, Naloxonas, Neostigminas , Niacinamidas , Nicardipinas , Nitroglicerinas, Nitroprassidos, Norepinefriñas , Orfenadrinas, Oxacilinas, Oximorfonas, Oxitetraciclinas, Oxitocinas, Pancuronio, Pantenoles, Ácidos pantoténicos, Papaverinas, Peginterferones-alfa 2A, Penicilinas G, Pentamidinas , Pentazocinas , Pentobarbitales, Perflutrenos, Perfenazinas, Fenobarbitales, Fentolaminas , Fenilefriñas , Fenitoinas, Fisostigminas , Fitonadionas , Polimixina, Pralidoximas , Prilocainas, Procainamidas, Procainas, Proclorperazinas , Progesteronas , Propranololes , Hidróxidos de piridostigmina , Piridoxinas, Quinidinas, Quinupristinas , Inmunoglobulinas de rabia, Vacunas de Rabia, Ranitidinas, Remifentanilos , Riboflavinas, Rifampinas, Ropivacainas, Samario, Escopolaminas , Eselenio, Esermorelinas, Sincalidos, Somatremos, Espectinomicinas , Estreptocinasas , Estreptomicinas, Succinilcolinas, Sufentanilos , Sulfametoxazoles, Tacrolimusas , Terbutalinas , Teriparatidos , Testosteronas , antitoxinas de tétano, Tetracainas, Sulfatos de tetradecilo, Teofilinas, Tiaminas, Tietilperazinas , Tiopentalos, Hormonas estimuladoras de la tiroides, Tinzaparinas , Tirofibanos, Tobramicinas , Tolazolinas, Tolbutamidas , Torsemidas, Ácidos tranoxámicos , Treprostinilos, Trifluoperazinas, Trimetobenzamidas , Trimethoprimas, Trometaminas , Tuberculinas , Vacunas de tifoidea, UroFolitropinas , Urocinasas, ácidos Valproicos, Vasopressinas , Vecuronio, Verapamilos, Voriconazoles , Warfarinas, Vacunas dé fiebre amarilla, Zidovudinas, Zincs, clorhidratos de Ziprasidona, Aclacinomicinas , Actinomicinas , Adriamicinas , Azaserinas, ¦ 6-Azauridinas, Carzinofilinas , Cromomicinas , Denopterinas , 6-Diazo-5-Oxo-L-Norleucinas , Enocitabinas , Floxuridinas , Olivomicinas , Pirarubicinas , Piritreximas, Pteropterinas , Tegafuros, Tubercidinas , Alteplasas, Arcitumomabs, bevacizumabs , Toxinas de Botulinio tipo A, Toxinas de Botulinio tipo B, Capromab Pendetidos, Daclizumabs, Dornasas-alfa, Drotrecoginas-alfa, Pentetatos e Imciromab, Yodos-131, un agente antibiótico; un inhibidor de angiogénesis ; sustancias de retinopatia anti-cataratas y anti-diabéticas ; inhibidores de anhidrasa carbónicos; midriáticos; agentes de terapia fotodinámica; análogos de prostaglandina; factor de crecimiento; anti-neoplásicos ; anti-metabolitos ; anti-virales ; amebicidas y anti-protozoarios ; anti-tuberculosis y anti-lepróticos ; antitoxinas y anti-veninas ; factor anti-hemofilico, complejo coagulante anti-inhibidor, antitrombina HI, factor de coagulación V, Factor de coagulación IX, fracción de proteina plasmática, factor de von Willebrand; agente anti-plaquetas , un factor de estimulador de colonia (CSF) ; un estimulador de eritropoyesis ; hemostáticos y albúminas; Globulinas Inmunitarias ; inhibidores de trombina; anticoagulantes; un fármaco anti-inflamatorio esteroidal seleccionado de entre alclometasonas, algestonas, beclometasonas, betametasonas , budesonidos, clobetasoles , clobetasonas , clocortolonas , cloprednoles , corticosteronas , cortisonas, cortivazoles , deflazacortes , desonidos, desoximetasonas , dexametasonas , diflorasonas , diflucortolonas , difluprednatos , enoxolonas, fluazacortes , flucloronidas , flumetasonas , flunisolidos , fluocinolonas , fluocinonidos , fluocortinas , fluocortolonas , fluorometolonas , fluperolonas, fluprednidenos , fluprednisolonas , flurandrenolidos , fluticasonas , formocortales , halcinonidos , halobetasoles, halometasonas , halopredonas , hidrocortamatos, hidrocortisonas, etabonato de loteprednol, mazipredonas, medrisonas, meprednisonas , metilprednisolonas, furoato de mometasona, parametasonas , prednicarbatos, prednisolonas , prednisonas, prednivales, prednilidenos, rímexolonas, tixocortolesi triamcinolonas ; Docosanoles, prostaglandinas, análogos de prostaglandina , antiprostaglandinas y precursores de prostaglandina; mitóticos, colinérgicos y anti-colinesterasa; y anti-alergénicos.
149. Un método para tratar un exceso de glicosaminoglicanos; para tratar un tumor; para tratar acumulación de glicosaminoglicanó en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular; para tratar un trastorno oftálmico; para tratar una enfermedad pulmonar; para incrementar la penetración de agentes quimioterapéut icos en tumores sólidos; para tratar celulitis; para tratar un trastorno proliferativo; o para incrementar la biodisponibilidad de fármacos y otros agentes terapéuticos, caracterizado porque comprende administrar un sujeto el polipéptido PH20 modificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-45 o una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 60-92.
150. La composición · farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-92, caracterizada para el uso en el tratamiento de una enfermedad os trastorno asociado con hialuronano.
151. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84-90, o co-formulación de cualquiera de las reivindicaciones 93-125, caracterizada porque es para el uso en el tratamiento de diabetes.
152. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-92 caracterizada porque es para el uso en la administración de un agente terapéutico a un sujeto.
153. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-92, caracterizada porque es para tratar un exceso de glicosaminoglicanos ; para tratar a tumor; para tratar acumulación de glicosaminoglicano en el cerebro; para tratar un trastorno cardiovascular; para tratar un trastorno oftálmico; para tratar una enfermedad pulmonar; para incrementar la penetración de agentes quimioterapéuticos en tumores sólidos; para tratar celulitis; para tratar un trastorno proliferativo; o para incrementar la biodisponibilidad de fármacos y otros agentes terapéuticos.
154. Un método para identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra estabilidad bajo una condición de desnaturalización, caracterizado porque: el método comprende: a) someter a prueba la . actividad de una enzima degradadora de hialuronano modificada en una composición caracterizado porque comprende a agente de desnaturalización y/o bajo una condición de desnaturalización; b) someter a prueba la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada en la misma composición y/o bajo las mismas condiciones como el a) excepto si el agente o condición de desnaturalización; y c) seleccionar o identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada .que muestra actividad en a) que es por lo menos 5% de la actividad en b) ; y/o el método comprende: a) someter a. prueba la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada en una composición caracterizado porque comprende a' agente de desnaturalización y/o bajo una condición de desnaturalización; b) someter a prueba la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente en una composición que contiene el mismo agente de desnaturalización y/o bajo la misma condición de desnaturalización como a) , mediante lo cual la actividad se somete a prueba bajo las mismas condiciones como a) ; y c) seleccionar . o identificar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra mayor actividad que es por lo menos 120% de la actividad comparada con la enzima degradadora de hialuronano' no modificada.
155. El método de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque la actividad es la actividad de hialuronidasa .
156. El método de conformidad con la reivindicación 154 o reivindicación 155, caracterizado porque comprende: d) comparar la actividad de la enzima degradadora de hialuronano modificada seleccionada o identificada en a) a la actividad de la enzima degradadora de hialuronano no modificada sometida a prueba bajo las mismas condiciones; y e) identificar o seleccionar una enzima degradadora de hialuronano modificada que muestra por lo menos 120%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 1500%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000% o más de la actividad de hialuronidasa comparada con la enzima degradadora de hialuronano no modificada.
157. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-156, caracterizado porque el agente o condición de desnaturalización se provoca por temperatura, agitación, sin sal o bajo contenido de sal o la presencia de un excipiente.
158. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-156, caracterizado porque el agente o condición de desnaturalización es un excipiente de desnaturalización seleccionado de entre antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, rellenadores y diluyentes, sabores, colores,, lubricantes, deslizantes, conservadores, sorbentes y edulcorantes.
159. El método de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque el agente o condición de desnaturalización es un conservador.
160. El método de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque el conservador es un conservador fenólico.
161. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque el conservador fenólico se selecciona de entre fenol, metacresol (m-cresol) , alcohol bencílico, y un parabeno.
162. El método de conformidad con la reivindicación 161, caracterizado porque el conservador es fenol y/o m-cresol.
163. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 160-162, caracterizado porque la cantidad total de conservador fenólico en la composición como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) es de o de aproximadamente 0.05% a 0.6%, 0.1% a 0.4%, 0.1% a 0.3%, 0.15% a 0.325%, 0.15% a 0.25%,. 0.1%. a 0.2%, 0.2% a 0.3% o 0.3% . a 0.4% inclusive.
164. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-163, caracterizado porque antes de someter a prueba la actividad de una composición de enzima degradadora de hialuronano en a) y b) , la enzima degradadora de hialuronano se expone a la . condición dé desnaturalización 0 agente de desnaturalización durante un tiempo predeterminado.
165. El método de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque el tiempo predeterminado es de o de aproximadamente 1 minuto a 1 mes, 1 minuto a 3 semanas, 1 minuto a 2 semanas, 1 minuto a 1 semana, 1 minuto a 24 horas, 1 minuto a 12 horas, 30 minutos a 6 horas o 1 hora a 4 horas.
166. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-165, caracterizado porque la enzima degradadora de hialuronano modificada comprende un reemplazo de aminoácidos, inserción o supresión de aminoácidos comparada con la enzima degradadora de hialuronano no modificada.
167. El método de conformidad con la reivindicación 166, caracterizado porque la enzima degradadora de hialuronano modificada contiene un solo reemplazo de aminoácidos o dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más reemplazos de aminoácidos comparada con una forma no modificada de la enzima degradadora de hialuronano.
168. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-167, caracterizado porque una pluralidad de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas se someten a prueba en a) y/o b) .
169. El método de conformidad con la reivindicación 168, caracterizado porque: la pluralidad de las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas se modifican comparadas con la enzima degradadora de hialuronano no modificada correspondiente para generar una colección de enzimas degradadoras de hialuronano modificadas, mediante lo cual cada proteína modificada en la colección se somete a prueba en cada uno de a) y/o b) , en donde: cada enzima degradadora de hialuronano modificada en la colección contiene un solo reemplazo de aminoácidos comparado con la forma no modificada de la enzima degradadora de hialuronano; en la colección, el aminoácido en cada posición modificada se reemplaza por hasta 1-19 de otros aminoácidos diferentes al aminoácido original en la posición, mediante lo cual cada enzima degradadora de hialuronano modificada contiene un reemplazo de aminoácidos diferente; y en la colección, cada aminoácido a lo largo de la longitud de la enzima degradadora de hialuronano, o una porción seleccionada de la misma, se reemplaza.
170. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-169, caracterizado porque la enzima degradadora de hialuronano no modificada es una condroitinasa o es una hialuronidasa .
171. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque la enzima degradadora de hialuronano no modificada es un a hialuronidasa que es una hialuronidasa PH20 o forma truncada de la misma que carece de un sitio de unión de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porción del sitio de unión de anclaje a GPI, mediante lo cual la forma truncada muestra actividad de hialuronidasa .
172. El método de conformidad con la reivindicación 171, caracterizado porque la enzima degradadora de hialuronano no modificada es una hialuronidasa PH20 que se selecciona de una PH20 humana, de mono, bovino, ovino, rata, zorro, ratón o conejillo de indias.
173. El método de conformidad con la reivindicación 172, caracterizado porque la hialuronidasa no modificada es una PH20 o una forma truncada C-terminal de la misma.
174. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-173, caracterizado porque la enzima degradadora de hialuronano no modificada tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870 o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 10, 12, 14, 24, 32-66, 69, 72, 857, 859, 861, 870.
175. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-174, caracterizado porque se lleva a cabo in vitro.
176. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-175, caracterizado porque además comprende repetir las etapas de una pluralidad de veces, en donde cada repetición, además las enzimas degradadoras de hialuronano modificadas de una enzima degradadora de hialuronano modificada seleccionada se generan y se someten a prueba, mediante lo cual la enzima degradadora de hialuronano modificada se desarrolla para mostrar estabilidad incrementada bajo una condición de desnaturalización.
177. Una enzima degradadora de hialuronano modificada, caracterizada porque . se identifica por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 154-176.
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