JP2015504666A - Ph20ポリペプチド変異体、その製剤および使用 - Google Patents

Ph20ポリペプチド変異体、その製剤および使用 Download PDF

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Abstract

増大した安定性および/または増大した活性を示す修飾ポリペプチドを含めた修飾PH20ヒアルロニダーゼポリペプチドが提供される。また、その組成物および製剤および使用も提供される。

Description

関連出願
各々「PH20 Polypeptide Variants,Formulations and Uses Thereof」と題された、2011年12月30日に出願された米国仮出願第61/631,313号および2012年11月1日に出願された米国仮出願第61/796,208号の優先権の利益が主張される。

本願は、米国仮出願第61/631,313号および米国仮出願第61/796,208号の優先権を主張する、「PH20 Polypeptide Variants,Formulations and Uses Thereof」と題された本明細書と同日に出願された米国出願番号第13/684,731号と関連する。

許可される場合には、上記の関連出願各々の主題は、参照によりその全体が組み込まれる。

電子的に提供される配列表の参照による組込
配列表の電子版が、本明細書とともに出願されており、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。電子ファイルは、2012年12月28日に作製され、3.48メガバイトの大きさであり、3087seqPC1.txtとタイトルがついている。

発明の分野
増大した安定性および/または増大した活性を示す修飾ポリペプチドを含めた修飾PH20ヒアルロニダーゼポリペプチドが提供される。また、その組成物および製剤および使用も提供される。

ヒアルロナン(ヒアルロン酸;HA)は、多数の細胞の細胞外マトリックス中に、特に、軟部結合組織中に見られるポリペプチドである。HAはまた、主に、皮膚、軟骨において、また哺乳類では滑液において見られる。ヒアルロナンはまた、眼の硝子体の主な構成物である。HAは、種々の生理学的プロセスにおいて、例えば、水および血漿タンパク質ホメオスタシスにおいて役割を有する(Laurent TC et al.(1992)FASEB J 6:2397-2404)。特定の疾患は、ヒアルロナンの発現および/または産生と関連している。ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンを分解する酵素である。ヒアルロナン分解酵素(例えば、ヒアルロニダーゼ)は、HA分解を触媒することによって、HAまたはその他のグリコサミノグリカンの蓄積と関連している疾患または障害を治療するために使用できる。また、HAは、間質バリアの主要な成分であるので、ヒアルロナン分解酵素(例えば、ヒアルロニダーゼ)は、組織透過性を高め、したがって、治療薬の分散およびデリバリーを増大するために使用できる。種々のヒアルロニダーゼが、通常、その他の治療薬と組み合わせて分散剤および拡延剤として治療上使用されてきた(例えば、Hydase(商標)、Vitrase(商標)およびWydase(商標))。これらの多くは、ヒツジまたはウシ型であり、ヒトの治療にとって免疫原性であり得る。治療のために使用できる、ヒアルロニダーゼなどの改善されたヒアルロナン分解酵素およびその組成物が必要である。

修飾(複数可)を有さないPH20ポリペプチドと比較して、変更された特性(単数または複数)を有する修飾PH20ポリペプチドが提供される。修飾は、アミノ酸置換、欠失および/または挿入を含む。PH20ポリペプチド中の事実上各アミノ酸の詳細な構造/機能が、本明細書において提供され、ならびに特定の条件における安定性などの特性の変更に寄与する残基および遺伝子座の同定が提供される。したがって、種々の条件下で、活性を保持するか、および/または増大した安定性もしくは変更された安定性を示すPH20ポリペプチドをもたらす、1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドが提供される。保持される活性は、例えば、置換を含まないPH20ポリペプチドの少なくとも約40%またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性であり得る。例示的修飾として、アミノ酸置換がある。本明細書における目的上、アミノ酸置換は、アミノ酸1文字と、それに続く置換が起こる配列番号3中の対応するアミノ酸位置によって示される。アミノ酸残基の1文字アミノ酸略語は、当業者に周知であり(例えば、表1を参照のこと)、説明および例を通じて本明細書において使用される。例えば、配列番号3中に示されるアミノ酸残基位置に関して、PH20ポリペプチド中の位置204に対応する位置におけるPでの置換は、置換が、配列番号3に示されるPH20ポリペプチド中のF204Pまたは別のPH20ポリペプチド中の対応する位置の同一置換を包含することを意味する。

PH20ポリペプチド中に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有し、それによって、修飾PH20ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドと比較して増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドが提供される。増大した安定性は、タンパク質に対して変性である1種または複数種のタンパク質条件に対する増大した耐性として現れ得る。修飾および非修飾PH20の安定性は、同一条件下で比較される。例示的タンパク質変性(denaturation)(または、本明細書において同義的に使用される、変性(denaturing))条件として、それだけには限らないが、30℃または約30℃を超える高温、撹拌、本質的にもしくは実質的にまたは無塩を含めた低塩およびタンパク質を変性する傾向がある賦形剤の存在が挙げられる。このような賦形剤の例示的なものとして、抗付着剤(複数可)、結合剤(複数可)、コーティング(複数可)、増量剤(複数可)および希釈剤(複数可)、香料(複数可)、色(color)(複数可)、滑沢剤(複数可)、流動促進剤(複数可)、防腐剤(preservative)(複数可)、洗浄剤(複数可)、吸着剤(複数可)およびそれらの組み合わせがある。

修飾PH20ポリペプチドは、非修飾形態が配列番号3に対して少なくとも約68%の配列同一性を有し、安定性を変更する修飾をさらに含有するものであり得るか、および/またはPH20から最大約100、110、120、130、150個ものアミノ酸の相違を含むが、酵素活性、特に、非修飾PH20ポリペプチドの活性の少なくとも約40%を保持し、変性条件下での安定性などの増大した安定性を示すPH20ポリペプチドであり得る。したがって、配列番号3に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも68%または約68%のアミノ酸配列同一性を有する修飾PH20ポリペプチドが含まれる。配列番号3に示されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有する修飾PH20ポリペプチドが含まれる。このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号3、7、10、12、14、24、32〜66、69、72、857、859、861、870のいずれかに示されるようなアミノ酸残基の配列または配列番号3、7、10、12、14、24、32〜66、69、72、857、859、861もしくは870のいずれかに対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であるアミノ酸の配列を含むPH20ポリペプチド中にアミノ酸置換(複数可)を含有するポリペプチドがある。

例えば、増大した安定性を付与するPH20ポリペプチド中のアミノ酸置換を含有する増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供され、増大した安定性は、1種または複数種のタンパク質変性条件の存在下での変性に対する増大した抵抗性として現れ、安定性は、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドと比較して増大し、非修飾PH20ポリペプチドは、配列番号7に示されるアミノ酸の配列からなるか、または可溶性PH20ポリペプチドであるそのC末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する。上記のように、増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドは、30℃超または約30℃の温度、撹拌、塩が低いこともしくはないこと、または抗付着剤(複数可)、結合剤(複数可)、コーティング(複数可)、増量剤(複数可)および希釈剤(複数可)、香料(複数可)、色(複数可)、滑沢剤(複数可)、流動促進剤(複数可)、防腐剤(複数可)、洗浄剤(複数可)、吸着剤(複数可)もしくは甘味料(複数可)およびそれらの組合せ、特に、防腐剤などの賦形剤もしく変性剤の存在である変性条件に対する増大した安定性を示す。増大した安定性を示すこのような修飾PH20ポリペプチドのいくつかの例では、変性条件は、30℃超の温度であり、修飾PH20ポリペプチドは、アミノ酸置換(複数可)を含有しない非修飾PH20ポリペプチドと比較して、その温度でヒアルロニダーゼ活性の増大を示し、活性は、同一条件下で比較される。その他の例では、タンパク質変性条件は、100mM未満の低濃度の塩の存在であり、修飾PH20ポリペプチドは、アミノ酸置換(複数可)を含有しない非修飾PH20ポリペプチドと比較して、低濃度の塩の存在下でのヒアルロニダーゼ活性の増大を示し、活性は、同一条件下で比較される。

増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドの上記の例のいずれかにおいて、安定性は、ヒアルロニダーゼ活性、溶解度、凝集および/または結晶化を含めた種々のパラメータに基づいて評価され得る。安定性は、変性条件の存在下で評価され得る。2種以上のポリペプチドの安定性が比較される場合には、安定性は、同一条件下で評価される。いくつかの例では、本明細書において提供されたPH20ポリペプチドの中で、修飾PH20ポリペプチドは、アミノ酸置換(複数可)を含有しないPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも120%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%またはそれ以上を示す。

増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドの上記の例のいずれにおいても、変性条件は、タンパク質を変性する賦形剤の存在を含む。このような条件の例示的なものとして、フェノール系防腐剤などの防腐剤の存在がある。抗菌上有効な量の1種または複数種のフェノール系防腐剤の存在下で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドが提供される。抗菌上有効な量は、境界も含めて、0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%であるか、またはその間(または少なくとも約もしくはおよそ)である質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)として表され得る1種または複数種のフェノール系防腐剤の総量である。例示的フェノール系防腐剤として、それだけには限らないが、メチルパラベンプロピルパラベン、m−クレゾール、フェノールまたはm−クレゾールおよびフェノールなどのフェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールおよびパラベンが挙げられる。提供される修飾PH20ポリペプチドによって達成される安定性の例示的なものとして、防腐剤の不在下での修飾PH20ポリペプチドと比較して、防腐剤(複数可)の存在下で少なくとも15%または約15%のヒアルロニダーゼ活性を少なくとも4時間示すものがある。活性は、防腐剤(複数可)の存在を除いて同一条件下で比較される。例えば、フェノール系防腐剤(複数可)の存在下で、同一防腐剤(複数可)の不在下と比較して、ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも(または少なくとも約)16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上を示す修飾PH20ポリペプチドが提供される。したがって、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドの中でも、アミノ酸置換(複数可)によって、このような置換を有さないPH20ポリペプチドと比較してフェノール親和性(phenophilic)であるPH20ポリペプチドが提供される。同一期間の防腐剤の不在下で、防腐剤(複数可)の存在を除いて同一条件下での修飾PH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、防腐剤(複数可)の存在下で、ヒアルロニダーゼ活性が、少なくとも5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3週間、4週間またはそれ以上後に示される修飾PH20ポリペプチドが含まれる。

フェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドの例では、フェノール系防腐剤における増大した安定性は、例えば、0℃〜40℃、2℃〜6℃、24℃〜32℃および35℃〜40℃の間または約0℃〜40℃、2℃〜6℃、24℃〜32℃および35℃〜40℃の間などの0℃から40℃の間の温度条件下で示され得る。例示的ポリペプチドは、各々両端を含めて、30℃〜45℃、35℃〜45℃、30℃〜37℃、35℃〜37℃もしくは37℃〜42℃の間または約30℃〜45℃、35℃〜45℃、30℃〜37℃、35℃〜37℃もしくは37℃〜42℃の間の温度で増大した安定性を示す。特定の修飾PH20ポリペプチドおよび条件は、意図される製剤、製剤が曝露される条件および/または意図される適用に応じて変わる。

フェノール系防腐剤に対する増大した安定性などの増大した安定性を示す特定の、例示的修飾PH20ポリペプチドとして、置換などの単一アミノ酸修飾および少なくとも、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有するものが挙げられる。これらとして、少なくとも1つの置換が、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443または445の中から選択される位置に対応する(すなわち、アラインメントによって)アミノ酸位置にある、1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドが挙げられ、対応するアミノ酸位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。このような修飾の例示的なものとして、配列番号3に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置10に対応する位置におけるグリシン(G)、位置12に対応する位置におけるK、位置20に対応する位置におけるS、位置22に対応する位置におけるT、位置26に対応する位置におけるM、位置34に対応する位置におけるW、位置36に対応する位置におけるN、位置46に対応する位置におけるL、位置50に対応する位置におけるM、位置52に対応する位置におけるT、位置52に対応する位置におけるS、位置58に対応する位置におけるC、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるR、位置58に対応する位置におけるN、位置58に対応する位置におけるY、位置58に対応する位置におけるP、位置58に対応する位置におけるH、位置68に対応する位置におけるP、位置70に対応する位置におけるV、位置74に対応する位置におけるE、位置82に対応する位置におけるL、位置82に対応する位置におけるN、位置83に対応する位置におけるV、位置83に対応する位置におけるQ、位置83に対応する位置におけるS、位置83に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるN、位置86に対応する位置におけるA、位置86に対応する位置におけるK、位置97に対応する位置におけるE、位置97に対応する位置におけるL、位置127に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるR、位置138に対応する位置におけるL、位置142に対応する位置におけるK、位置142に対応する位置におけるN、位置142に対応する位置におけるP、位置142に対応する位置におけるS、位置142に対応する位置におけるT、位置143に対応する位置におけるG、位置143に対応する位置におけるK、位置144に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるQ、位置166に対応する位置におけるT、位置169に対応する位置におけるL、位置174に対応する位置におけるG、位置174に対応する位置におけるN、位置193に対応する位置におけるQ、位置195に対応する位置におけるT、位置195に対応する位置におけるN、位置196に対応する位置におけるE、位置196に対応する位置におけるR、位置204に対応する位置におけるP、位置205に対応する位置におけるA、位置205に対応する位置におけるE、位置206に対応する位置におけるI、位置213に対応する位置におけるA、位置219に対応する位置におけるI、位置234に対応する位置におけるM、位置237に対応する位置におけるT、位置238に対応する位置におけるH、位置240に対応する位置におけるQ、位置249に対応する位置におけるV、位置261に対応する位置におけるA、位置261に対応する位置におけるK、位置267に対応する位置におけるT、位置277に対応する位置におけるK、位置279に対応する位置におけるH、位置279に対応する位置におけるV、位置291に対応する位置におけるV、位置309に対応する位置におけるE、位置310に対応する位置におけるQ、位置314に対応する位置におけるY、位置315に対応する位置におけるY、位置317に対応する位置におけるN、位置317に対応する位置におけるW、位置318に対応する位置におけるD、位置347に対応する位置におけるG、位置367に対応する位置におけるA、位置375に対応する位置におけるR、位置376に対応する位置におけるR、位置399に対応する位置におけるV、位置401に対応する位置におけるE、位置407に対応する位置におけるA、位置416に対応する位置におけるL、位置419に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるH、位置431に対応する位置におけるE、位置433に対応する位置におけるT、位置433に対応する位置におけるV、位置439に対応する位置におけるC、位置440に対応する位置におけるP、位置443に対応する位置におけるG、位置445に対応する位置におけるNでの置換の中から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換がある。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置52に対応する位置におけるT、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるR、位置68に対応する位置におけるP、位置83に対応する位置におけるV、位置204に対応する位置におけるP、位置261に対応する位置におけるA、位置267に対応する位置におけるT、位置277に対応する位置におけるKおよび位置421に対応する位置におけるHでの置換の中から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含有し得る。例示的修飾PH20ポリペプチドとは、配列番号3に示されるアミノ酸残基位置に関して、PH20ポリペプチド中の位置204に対応する位置にP(またはそれに対する保存的アミノ酸)を含むものである。

したがって、増大した安定性を付与するPH20ポリペプチド中のアミノ酸置換を含有する、フェノール系防腐剤の存在下で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドが本明細書において提供され、安定性は、アミノ酸置換を有さない非修飾ポリペプチドと比較して増大され、非修飾PH20ポリペプチドは、配列番号7に示されるアミノ酸の配列を有するか、または可溶性PH20ポリペプチドであるそのC末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する。例えば、非修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3または32〜66のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する可溶性PH20ポリペプチドである。特定の例では、修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。修飾PH20ポリペプチドのこのような例のいずれにおいても、ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75またはそれ以上のアミノ酸置換を含有する。本明細書における例では、修飾PH20ポリペプチドは、ヒトPH20である。修飾PH20ポリペプチドは、防腐剤(複数可)の存在下で、フェノール系防腐剤(複数可)の不在下でのヒアルロニダーゼ活性と比較して、少なくとも15%のヒアルロニダーゼ活性を少なくとも4時間示す場合に、フェノール系防腐剤の存在下で安定性を示し、活性は、フェノール系防腐剤(複数可)の存在を除いて同一条件下で比較される。上記の例のいずれにおいても、修飾PH20ポリペプチドは、両端を含めて、0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%または約0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%である質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)としての1種または複数種のフェノール系防腐剤の総量などの抗菌上有効な量の1種または複数種のフェノール系防腐剤の存在下で安定である。フェノール系防腐剤は、m−クレゾール、フェノールまたはm−クレゾールおよびフェノールなどのフェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールまたはパラベンであり得る。アミノ酸置換は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関してアミノ酸残基204、58、10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443または445であり得、対応するアミノ酸位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。例えば、アミノ酸置換は、配列番号3に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置10に対応する位置におけるG、位置12に対応する位置におけるK、位置20に対応する位置におけるS、位置22に対応する位置におけるT、位置26に対応する位置におけるM、位置34に対応する位置におけるW、位置36に対応する位置におけるN、位置46に対応する位置におけるL、位置50に対応する位置におけるM、位置52に対応する位置におけるT、位置52に対応する位置におけるS、位置58に対応する位置におけるC、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるR、位置58に対応する位置におけるN、位置58に対応する位置におけるY、位置58に対応する位置におけるP、位置58に対応する位置におけるH、位置68に対応する位置におけるP、位置70に対応する位置におけるV、位置74に対応する位置におけるE、位置82に対応する位置におけるL、位置82に対応する位置におけるN、位置83に対応する位置におけるV、位置83に対応する位置におけるQ、位置83に対応する位置におけるS、位置83に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるN、位置86に対応する位置におけるA、位置86に対応する位置におけるK、位置97に対応する位置におけるE、位置97に対応する位置におけるL、位置127に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるR、位置138に対応する位置におけるL、位置142に対応する位置におけるK、位置142に対応する位置におけるN、位置142に対応する位置におけるP、位置142に対応する位置におけるS、位置142に対応する位置におけるT、位置143に対応する位置におけるG、位置143に対応する位置におけるK、位置144に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるQ、位置166に対応する位置におけるT、位置169に対応する位置におけるL、位置174に対応する位置におけるG、位置174に対応する位置におけるN、位置193に対応する位置におけるQ、位置195に対応する位置におけるT、位置195に対応する位置におけるN、位置196に対応する位置におけるE、位置196に対応する位置におけるR、位置204に対応する位置におけるP、位置205に対応する位置におけるA、位置205に対応する位置におけるE、位置206に対応する位置におけるI、位置213に対応する位置におけるA、位置219に対応する位置におけるI、位置234に対応する位置におけるM、位置237に対応する位置におけるT、位置238に対応する位置におけるH、位置240に対応する位置におけるQ、位置249に対応する位置におけるV、位置261に対応する位置におけるA、位置261に対応する位置におけるK、位置267に対応する位置におけるT、位置277に対応する位置におけるK、位置279に対応する位置におけるH、位置279に対応する位置におけるV、位置291に対応する位置におけるV、位置309に対応する位置におけるE、位置310に対応する位置におけるQ、位置314に対応する位置におけるY、位置315に対応する位置におけるY、位置317に対応する位置におけるN、位置317に対応する位置におけるW、位置318に対応する位置におけるD、位置347に対応する位置におけるG、位置367に対応する位置におけるA、位置375に対応する位置におけるR、位置376に対応する位置におけるR、位置399に対応する位置におけるV、位置401に対応する位置におけるE、位置407に対応する位置におけるA、位置416に対応する位置におけるL、位置419に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるH、位置431に対応する位置におけるE、位置433に対応する位置におけるT、位置433に対応する位置におけるV、位置439に対応する位置におけるC、位置440に対応する位置におけるP、位置443に対応する位置におけるG、または位置445に対応する位置におけるNである。特に、アミノ酸置換は、配列番号3に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置52に対応する位置におけるT、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるR、位置68に対応する位置におけるP、位置83に対応する位置におけるV、位置204に対応する位置におけるP、位置261に対応する位置におけるA、位置267に対応する位置におけるT、位置277に対応する位置におけるKまたは位置421に対応する位置におけるH、例えば、位置204に対応する位置におけるPまたは位置58に対応する位置におけるRでの置換である。フェノール系防腐剤に対する増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドは、実質的に精製または単離され得る。フェノール系防腐剤に対する増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドは、グリコシル化、シアル化(sialation)、アルブミン化(albumination)、ファルニシル化(farnysylation)、カルボキシル化、水酸化およびリン酸化によって修飾され得、通常、グリコシル化され、それによって、ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸残基200、333および358に対応するアミノ酸残基でなど、少なくとも3つのアスパラギン(N)残基の各々と連結している少なくとも1つのN−アセチルグルコサミン部分を含む。フェノール系防腐剤に対する増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドは、PEGもしくはデキストランなどのポリマーとコンジュゲートされる場合もあり、および/または多量体化ドメイン、毒素、検出可能な標識または薬物である部分とコンジュゲートされる場合もある。

増大した安定性を示す、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドの中には、アミノ酸置換(複数可)を含有しないPH20ポリペプチドと比較して、高温でヒアルロニダーゼ活性の増大を示すもの、例えば、アミノ酸置換(複数可)を含有しないPH20ポリペプチドと比較して、少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%またはそれ以上のヒアルロニダーゼ活性を、少なくとも4時間示すものがある。また、ポリペプチドの中には、高温下で、活性を示し、通常、増大した安定性またはその他の特性も示すもの、例えば、2℃〜8℃の間または約2℃〜8℃の間の温度での修飾PH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、32℃〜37℃の間または約32℃〜37℃の間の温度でヒアルロニダーゼ活性の少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%を、少なくとも4時間示す修飾PH20ポリペプチドがあり、これでは、活性は、温度の相違を除いて同一条件下で比較される。ヒアルロニダーゼ活性は、同一期間の2℃〜8℃の間または約2℃〜8℃の間の温度で温度の相違を除いて同一条件下での修飾PH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、32℃〜37℃の間または約32℃〜37℃の間の高温下で、少なくとも5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3週間、4週間またはそれ以上後に示され得る。このような修飾ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439および443の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有するものがあり、対応するアミノ酸位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。例示的突然変異として、例えば、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1に対応する位置におけるR、位置11に対応する位置におけるS、位置12に対応する位置におけるI、位置14に対応する位置におけるV、位置20に対応する位置におけるS、位置26に対応する位置におけるMでの、位置29に対応する位置におけるR、位置34に対応する位置におけるW、位置50に対応する位置におけるM、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるQ、位置58に対応する位置におけるQ、位置70に対応する位置におけるV、位置82に対応する位置におけるL、位置83に対応する位置におけるQ、位置84に対応する位置におけるR、位置86に対応する位置におけるA、位置87に対応する位置におけるS、位置140に対応する位置におけるK、位置142に対応する位置におけるS、位置142に対応する位置におけるT、位置143に対応する位置におけるK、位置147に対応する位置におけるS、位置152に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるT、位置167に対応する位置におけるD、位置172に対応する位置におけるA、位置174に対応する位置におけるG、位置174に対応する位置におけるN、位置178に対応する位置におけるR、位置193に対応する位置におけるQ、位置195に対応する位置におけるT、位置206に対応する位置におけるI、位置212に対応する位置におけるS、位置213に対応する位置におけるA、位置219に対応する位置におけるI、位置233に対応する位置におけるG、位置237に対応する位置におけるT、位置240に対応する位置におけるA、位置240に対応する位置におけるQ、位置267に対応する位置におけるT、位置277に対応する位置におけるE、位置291に対応する位置におけるS、位置292に対応する位置におけるH、位置292に対応する位置におけるV、位置309に対応する位置におけるS、位置313に対応する位置におけるH、位置314に対応する位置におけるS、位置317に対応する位置におけるI、位置317に対応する位置におけるT、位置317に対応する位置におけるW、位置318に対応する位置におけるR、位置347に対応する位置におけるG、位置367に対応する位置におけるA、位置368に対応する位置におけるR、位置371に対応する位置におけるS、位置374に対応する位置におけるP、位置389に対応する位置におけるA、位置392に対応する位置におけるV、位置395に対応する位置におけるA、位置396に対応する位置におけるH、位置406に対応する位置におけるN、位置419に対応する位置におけるH、位置419に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるR、位置421に対応する位置におけるS、位置439に対応する位置におけるA、位置439に対応する位置におけるC、および位置443に対応する位置におけるGでの置換が挙げられる。本明細書において提供された特定の例では、このような修飾PH20ポリペプチドのいずれも、置換などの単一アミノ酸修飾および少なくとも、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有する。置換などの修飾は、配列番号7に示されるアミノ酸の配列を有するか、または例えば、配列番号3もしくは32〜66のいずれかに示されるものなどの可溶性PH20ポリペプチドであるそのC末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する非修飾PH20ポリペプチド中であり得る。例えば、このような修飾PH20ポリペプチドのいずれも、配列番号3に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。

また、低塩条件、例えば、100mM未満のNaClの濃度、例えば、それだけには限らないが、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM未満またはそれより低いNaClの濃度で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドも提供される。修飾PH20ポリペプチドの中には、アミノ酸置換(複数可)を含有しないPH20ポリペプチドと比較して、低濃度の塩でヒアルロニダーゼ活性の増大を示すものがある。このような活性は、アミノ酸置換(複数可)を含有しないPH20ポリペプチドと比較して、例えば、少なくとも100%超または少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%またはそれより高いヒアルロニダーゼ活性を含む。このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、両端を含めて、10mM NaClから100mM NaClの間または約10mM NaClから100mM NaClの間などの低濃度の塩(またはその他の塩もしくは塩の混合物の匹敵する濃度)において、150mM NaClにおける修飾PH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性と比較して、ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも60%を示すものがあり、これでは、活性は、塩濃度の相違を除いて同一条件下で比較される。本明細書において提供された特定の例では、このような修飾PH20ポリペプチドのいずれも、置換などの単一アミノ酸修飾および少なくとも、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有する。置換などの修飾は、配列番号7に示されるアミノ酸の配列を有するか、または、例えば、配列番号3もしくは32〜66のいずれかに示される可溶性PH20ポリペプチドであるC末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する非修飾PH20ポリペプチド中であり得る。例えば、このような修飾PH20ポリペプチドのいずれも、配列番号3に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。

また、PH20ポリペプチド中に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドも提供され、これでは、修飾PH20ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドと比較して、ヒアルロニダーゼ活性の増大を示す。ポリペプチド間で活性を比較する場合には、活性は、同一条件下で比較される。これらの中には、非修飾PH20が、配列番号3に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を示すか、または得られた修飾PH20が、配列番号3に示されるアミノ酸の配列に対してこのような配列同一性を示すポリペプチドがある。このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号3、7、10、12、14、24、32〜66、69もしくは72のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号3、7、10、12、14、24、32〜66、69もしくは72のいずれかに対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であるアミノ酸の配列中にアミノ酸置換(複数可)を含有する任意のものがある。アミノ酸置換(複数可)はまた、配列番号857、859、861もしくは870のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号857、859、861もしくは870のいずれかに対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であるアミノ酸の配列中で行われてもよい。特に、配列番号3、7、32〜66、69または72に示されるアミノ酸の配列中にアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドが提供される。修飾PH20ポリペプチドの中には、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも120%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%またはそれ以上を示すものがある。活性は、任意の温度で評価され得、特に、このような活性は、ヒアルロニダーゼが、2℃から8℃の間または約2℃から8℃の間の温度である温度に曝される場合に存在する。これらの修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、1、12、15、24、26、27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446および447の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有し、対応するアミノ酸位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。例示的修飾は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1に対応する位置におけるヒスチジン(H)、位置1に対応する位置におけるQ、位置12に対応する位置におけるE、位置12に対応する位置におけるT、位置15に対応する位置におけるV、位置24に対応する位置におけるE、位置24に対応する位置におけるH、位置26に対応する位置におけるE、位置26に対応する位置におけるK、位置27に対応する位置におけるK、位置27に対応する位置におけるR、位置29に対応する位置におけるE、位置29に対応する位置におけるI、位置29に対応する位置におけるL、位置29に対応する位置におけるM、位置29に対応する位置におけるP、位置29に対応する位置におけるS、位置29に対応する位置におけるV、位置30に対応する位置におけるG、位置30に対応する位置におけるH、位置30に対応する位置におけるK、位置30に対応する位置におけるM、位置30に対応する位置におけるR、位置30に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるA、位置31に対応する位置におけるC、位置31に対応する位置におけるH、位置31に対応する位置におけるI、位置31に対応する位置におけるK、位置31に対応する位置におけるL、位置31に対応する位置におけるP、位置31に対応する位置におけるR、位置31に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるT、位置31に対応する位置におけるV、位置32に対応する位置におけるF、位置32に対応する位置におけるG、位置32に対応する位置におけるH、位置33に対応する位置におけるW、位置37に対応する位置におけるF、位置39に対応する位置におけるN、位置39に対応する位置におけるT、位置46に対応する位置におけるR、位置48に対応する位置におけるF、位置48に対応する位置におけるH、位置48に対応する位置におけるN、位置52に対応する位置におけるQ、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるQ、位置63に対応する位置におけるW、位置67に対応する位置におけるV、位置68に対応する位置におけるH、位置68に対応する位置におけるQ、位置69に対応する位置におけるA、位置69に対応する位置におけるC、位置69に対応する位置におけるF、位置69に対応する位置におけるG、位置69に対応する位置におけるI、位置69に対応する位置におけるL、位置69に対応する位置におけるM、位置69に対応する位置におけるP、位置69に対応する位置におけるR、位置69に対応する位置におけるW、位置69に対応する位置におけるY、位置70に対応する位置におけるA、位置70に対応する位置におけるC、位置70に対応する位置におけるF、位置70に対応する位置におけるG、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるK、位置70に対応する位置におけるL、位置70に対応する位置におけるN、位置70に対応する位置におけるP、位置70に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるS、位置70に対応する位置におけるT、位置70に対応する位置におけるV、位置71に対応する位置におけるR、位置71に対応する位置におけるS、位置72に対応する位置におけるM、位置72に対応する位置におけるQ、位置73に対応する位置におけるH、位置73に対応する位置におけるL、位置73に対応する位置におけるW、位置74に対応する位置におけるA、位置74に対応する位置におけるC、位置74に対応する位置におけるG、位置74に対応する位置におけるN、位置74に対応する位置におけるP、位置74に対応する位置におけるR、位置74に対応する位置におけるS、位置74に対応する位置におけるV、位置74に対応する位置におけるW、位置75に対応する位置におけるF、位置75に対応する位置におけるL、位置75に対応する位置におけるR、位置75に対応する位置におけるT、位置84に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるR、位置86に対応する位置におけるA、位置87に対応する位置におけるC、位置87に対応する位置におけるT、位置87に対応する位置におけるY、位置92に対応する位置におけるC、位置93に対応する位置におけるI、位置93に対応する位置におけるL、位置93に対応する位置におけるR、位置93に対応する位置におけるT、位置94に対応する位置におけるR、位置97に対応する位置におけるG、位置118に対応する位置におけるQ、位置120に対応する位置におけるF、位置120に対応する位置におけるV、位置120に対応する位置におけるY、位置127に対応する位置におけるH、位置127に対応する位置におけるN、位置131に対応する位置におけるG、位置131に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるV、位置135に対応する位置におけるD、位置135に対応する位置におけるG、位置135に対応する位置におけるRでの、位置141に対応する位置におけるH、位置141に対応する位置におけるY、位置142に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるV、位置148に対応する位置におけるK、位置150に対応する位置におけるG、位置151に対応する位置におけるK、位置151に対応する位置におけるL、位置151に対応する位置におけるM、位置151に対応する位置におけるQ、位置151に対応する位置におけるR、位置152に対応する位置におけるR、位置155に対応する位置におけるG、位置155に対応する位置におけるK、位置156に対応する位置におけるD、位置163に対応する位置におけるA、位置163に対応する位置におけるE、位置163に対応する位置におけるK、位置163に対応する位置におけるR、位置164に対応する位置におけるM、位置165に対応する位置におけるD、位置165に対応する位置におけるN、位置166に対応する位置におけるA、位置166に対応する位置におけるF、位置166に対応する位置におけるH、位置166に対応する位置におけるL、位置166に対応する位置におけるQ、位置166に対応する位置におけるR、位置166に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるY、位置169に対応する位置におけるL、位置170に対応する位置におけるR、位置174に対応する位置におけるK、位置198に対応する位置におけるD、位置206に対応する位置におけるK、位置206に対応する位置におけるL、位置212に対応する位置におけるN、位置213に対応する位置におけるM、位置213に対応する位置におけるN、位置215に対応する位置におけるM、位置219に対応する位置におけるS、位置233に対応する位置におけるK、位置233に対応する位置におけるR、位置234に対応する位置におけるM、位置236に対応する位置におけるR、位置237に対応する位置におけるE、位置238に対応する位置におけるS、位置247に対応する位置におけるI、位置257に対応する位置におけるT、位置259に対応する位置におけるP、位置260に対応する位置におけるY、位置261に対応する位置におけるK、位置261に対応する位置におけるN、位置263に対応する位置におけるK、位置263に対応する位置におけるR、位置269に対応する位置におけるA、位置271に対応する位置におけるL、位置271に対応する位置におけるM、位置272に対応する位置におけるT、位置276に対応する位置におけるD、位置276に対応する位置におけるS、位置276に対応する位置におけるY、位置277に対応する位置におけるK、位置277に対応する位置におけるR、位置277に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるH、位置278に対応する位置におけるK、位置278に対応する位置におけるN、位置278に対応する位置におけるR、位置278に対応する位置におけるS、位置278に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるY、位置282に対応する位置におけるM、位置291に対応する位置におけるV、位置293に対応する位置におけるA、位置293に対応する位置におけるC、位置293に対応する位置におけるF、位置293に対応する位置におけるM、位置293に対応する位置におけるP、位置293に対応する位置におけるQ、位置293に対応する位置におけるV、位置305に対応
する位置におけるE、位置308に対応する位置におけるG、位置308に対応する位置におけるN、位置309に対応する位置におけるE、位置309に対応する位置におけるL、位置309に対応する位置におけるN、位置309に対応する位置におけるQ、位置309に対応する位置におけるR、位置309に対応する位置におけるT、位置310に対応する位置におけるA、位置310に対応する位置におけるG、位置313に対応する位置におけるK、位置313に対応する位置におけるR、位置315に対応する位置におけるH、位置317に対応する位置におけるI、位置317に対応する位置におけるK、位置317に対応する位置におけるR、位置318に対応する位置におけるM、位置320に対応する位置におけるH、位置320に対応する位置におけるK、位置320に対応する位置におけるR、位置324に対応する位置におけるR、位置325に対応する位置におけるA、位置325に対応する位置におけるD、位置325に対応する位置におけるE、位置325に対応する位置におけるG、位置325に対応する位置におけるH、位置325に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるM、位置325に対応する位置におけるN、位置325に対応する位置におけるQ、位置325に対応する位置におけるS、位置326に対応する位置におけるV、位置328に対応する位置におけるI、位置328に対応する位置におけるK、位置328に対応する位置におけるL、位置328に対応する位置におけるS、位置328に対応する位置におけるY、位置347に対応する位置におけるG、位置347に対応する位置におけるS、位置353に対応する位置におけるVでの、位置359に対応する位置におけるT、位置371に対応する位置におけるR、位置377に対応する位置におけるP、位置377に対応する位置におけるT、位置380に対応する位置におけるW、位置380に対応する位置におけるY、位置389に対応する位置におけるK、位置392に対応する位置におけるM、位置395に対応する位置におけるR、位置399に対応する位置におけるM、位置399に対応する位置におけるT、位置399に対応する位置におけるW、位置405に対応する位置におけるG、位置407に対応する位置におけるD、位置407に対応する位置におけるQ、位置409に対応する位置におけるA、位置409に対応する位置におけるQ、位置410に対応する位置におけるT、位置418に対応する位置におけるP、位置419に対応する位置におけるF、位置419に対応する位置におけるI、位置419に対応する位置におけるK、位置419に対応する位置におけるR、位置419に対応する位置におけるS、位置421に対応する位置におけるH、位置421に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるN、位置421に対応する位置におけるQ、位置421に対応する位置におけるR、位置421に対応する位置におけるS、位置425に対応する位置におけるK、位置431に対応する位置におけるA、位置431に対応する位置におけるH、位置431に対応する位置におけるK、位置431に対応する位置におけるQ、位置431に対応する位置におけるR、位置431に対応する位置におけるS、位置431に対応する位置におけるV、位置433に対応する位置におけるL、位置433に対応する位置におけるR、位置433に対応する位置におけるT、位置433に対応する位置におけるV、位置436に対応する位置におけるK、位置437に対応する位置におけるI、位置437に対応する位置におけるM、位置438に対応する位置におけるT、位置439に対応する位置におけるV、位置440に対応する位置におけるH、位置440に対応する位置におけるR、位置441に対応する位置におけるF、位置442に対応する位置におけるR、位置443に対応する位置におけるA、位置443に対応する位置におけるM、位置445に対応する位置におけるM、位置445に対応する位置におけるP、位置446に対応する位置におけるA、位置447に対応する位置におけるD、位置447に対応する位置におけるNでの、および/または位置447に対応する位置におけるQでの置換の中から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。

ヒアルロニダーゼ活性の増大を示すポリペプチドの中には、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも2.0倍を示すものがある。例えば、これらの中には、配列番号3に示される位置に関して、24、29、31、48、58、69、70、75、84、97、165、166、271、278、317、320、325および326の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチド、例えば、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置24に対応する位置におけるE、位置29に対応する位置におけるE、位置31に対応する位置におけるV、位置48に対応する位置におけるN、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるQ、位置69に対応する位置におけるA、位置69に対応する位置におけるF、位置69に対応する位置におけるG、位置69に対応する位置におけるP、位置69に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるA、位置70に対応する位置におけるF、位置70に対応する位置におけるG、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるN、位置70に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるT、位置70に対応する位置におけるV、位置75に対応する位置におけるL、位置75に対応する位置におけるT、位置84に対応する位置におけるG、位置97に対応する位置におけるG、位置165に対応する位置におけるD、位置166に対応する位置におけるL、位置166に対応する位置におけるR、位置166に対応する位置におけるT、位置271に対応する位置におけるL、位置278に対応する位置におけるH、位置278に対応する位置におけるR、位置317に対応する位置におけるK、位置320に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるEでの、位置325に対応する位置におけるG、位置325に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるN、位置325に対応する位置におけるQ、および位置326に対応する位置におけるVでの置換の中から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドがあり、対応するアミノ酸位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定される。

ヒアルロニダーゼ活性の増大を示す本明細書において提供されたポリペプチドのいずれの中でも、このような修飾PH20ポリペプチドのいずれも、置換などの単一アミノ酸修飾ならびに少なくとも、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100およびそれ以上の修飾などの修飾の組合せを含有する。置換などの修飾は、配列番号7に示されるアミノ酸の配列を有するか、または例えば、配列番号3もしくは32〜66のいずれかに示される可溶性PH20ポリペプチドであるC末端切断断片であるか、またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性を有する非修飾PH20ポリペプチド中であってもよい。例えば、このような修飾PH20ポリペプチドのいずれも、配列番号3に対して少なくとも85%の配列同一性を有する。

また、その配列が、配列番号7に示されるPH20ポリペプチド、そのC末端で切断された断片、その可溶性断片中に、または配列番号7に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも91%同一であるアミノ酸の配列を有するPH20ポリペプチド中に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドが提供され、これでは、少なくとも1つのアミノ置換は、配列番号3または7に示されるアミノ酸位置に関して、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446および447の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置にあり、対応するアミノ酸位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定され、ただし、修飾PH20ポリペプチドが、位置13、47、131または219に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、アラニン(A)との置換ではない。これらの修飾PH20ポリペプチドの中に、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも40%を示すものがあり、活性は、本明細書におけるすべての例においてと同様、同一条件下で比較される。

これらのポリペプチドの中に、配列番号3、7、32〜66、69および72のいずれかに示されるアミノ酸の配列中に、または配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに対して少なくとも91%の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換を含有するものが含まれる。特に、配列番号7のC末端で切断された断片であるポリペプチドまたは配列番号7に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも91%同一であるアミノ酸の配列を有するPH20ポリペプチドである修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72中にアミノ酸置換を含有する。特に、本明細書において提供されたこのような修飾PH20ポリペプチドのいずれかの中に、アミノ酸置換が、以下の表3に示されるアミノ酸置換であるものを含むいずれかがある。例えば、このような修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、1、6、8、9、10、11、12、14、15、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、46、47、48、49、50、52、58、59、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、79、82、83、84、86、87、89、90、92、93、94、97、102、104、107、114、118、120、127、128、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、155、156、158、160、162、163、164、165、166、167、169、170、172、173、174、175、178、179、193、195、196、198、204、205、206、209、212、213、215、219、220、221、222、232、233、234、235、236、237、238、240、247、248、249、257、258、259、260、261、263、267、269、271、272、273、274、276、277、278、279、282、283、285、287、289、291、292、293、298、305、307、308、309、310、313、314、315、317、318、320、321、324、325、326、328、335、347、349、351、353、356、359、367、368、369、371、373、374、375、376、377、380、381、383、385、389、392、393、395、396、399、401、404、405、406、407、409、410、412、416、418、419、421、425、427、428、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446または447の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を有するものを含む。このような置換の例示的なものとして、各々、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1に対応する位置におけるヒスチジン(H)、位置1に対応する位置におけるA、位置1に対応する位置におけるE、位置1に対応する位置におけるG、位置1に対応する位置におけるK、位置1に対応する位置におけるQ、位置1に対応する位置におけるR、位置6に対応する位置におけるA、位置8に対応する位置におけるM、位置9に対応する位置におけるQ、位置10に対応する位置におけるG、位置10に対応する位置におけるH、位置11に対応する位置におけるS、位置12に対応する位置におけるE、位置12に対応する位置におけるI、位置12に対応する位置におけるK、位置12に対応する位置におけるT、位置14に対応する位置におけるV、位置15に対応する位置におけるV、位置15に対応する位置におけるM、位置20に対応する位置におけるS、位置22に対応する位置におけるT、位置24に対応する位置におけるE、位置24に対応する位置におけるH、位置24に対応する位置におけるR、位置26に対応する位置におけるA、位置26に対応する位置におけるE、位置26に対応する位置におけるK、位置26に対応する位置におけるM、位置26に対応する位置におけるQ、位置26に対応する位置におけるR、位置27に対応する位置におけるD、位置27に対応する位置におけるK、位置27に対応する位置におけるR、位置28に対応する位置におけるR、位置29に対応する位置におけるE、位置29に対応する位置におけるI、位置29に対応する位置におけるK、位置29に対応する位置におけるL、位置29に対応する位置におけるM、位置29に対応する位置におけるP、位置29に対応する位置におけるR、位置29に対応する位置におけるS、位置29に対応する位置におけるT、位置29に対応する位置におけるV、位置30に対応する位置におけるG、位置30に対応する位置におけるH、位置30に対応する位置におけるK、位置30に対応する位置におけるL、位置30に対応する位置におけるM、位置30に対応する位置におけるR、位置30に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるA、位置31に対応する位置におけるC、位置31に対応する位置におけるG、位置31に対応する位置におけるH、位置31に対応する位置におけるI、位置31に対応する位置におけるK、位置31に対応する位置におけるL、位置31に対応する位置におけるP、位置31に対応する位置におけるR、位置31に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるT、位置31に対応する位置におけるV、位置31に対応する位置におけるW、位置32に対応する位置におけるC、位置32に対応する位置におけるF、位置32に対応する位置におけるG、位置32に対応する位置におけるH、位置33に対応する位置におけるW、位置33に対応する位置におけるG、位置34に対応する位置におけるW、位置35に対応する位置におけるQ、位置35に対応する位置におけるV、位置36に対応する位置におけるH、位置36に対応する位置におけるN、位置37に対応する位置におけるF、位置37に対応する位置におけるM、位置38に対応する位置におけるY、位置39に対応する位置におけるA、位置39に対応する位置におけるL、位置39に対応する位置におけるN、位置39に対応する位置におけるT、位置40に対応する位置におけるL、位置41に対応する位置におけるT、位置46に対応する位置におけるL、位置46に対応する位置におけるR、位置47に対応する位置におけるD、位置47に対応する位置におけるF、位置47に対応する位置におけるT、位置47に対応する位置におけるWでの、位置48に対応する位置におけるF、位置48に対応する位置におけるH、位置48に対応する位置におけるK、位置48に対応する位置におけるN、位置49に対応する位置におけるR、位置50に対応する位置におけるD、位置50に対応する位置におけるS、位置50に対応する位置におけるM、位置52に対応する位置におけるN、位置52に対応する位置におけるQ、位置52に対応する位置におけるR、位置52に対応する位置におけるS、位置52に対応する位置におけるT、位置58に対応する位置におけるC、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるL、位置58に対応する位置におけるP、位置58に対応する位置におけるQ、位置58に対応する位置におけるR、位置58に対応する位置におけるH、位置58に対応する位置におけるN、位置58に対応する位置におけるY、位置59に対応する位置におけるN、位置63に対応する位置におけるK、位置63に対応する位置におけるL、位置63に対応する位置におけるM、位置63に対応する位置におけるR、位置63に対応する位置におけるW、位置67に対応する位置におけるV、位置68に対応する位置におけるH、位置68に対応する位置におけるP、位置68に対応する位置におけるQ、位置69に対応する位置におけるA、位置69に対応する位置におけるC、位置69に対応する位置におけるE、位置69に対応する位置におけるF、位置69に対応する位置におけるG、位置69に対応する位置におけるI、位置69に対応する位置におけるL、位置69に対応する位置におけるM、位置69に対応する位置におけるP、位置69に対応する位置におけるR、位置69に対応する位置におけるT、位置69に対応する位置におけるW、位置69に対応する位置におけるY、位置70に対応する位置におけるA、位置70に対応する位置におけるC、位置70に対応する位置におけるF、位置70に対応する位置におけるG、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるK、位置70に対応する位置におけるL、位置70に対応する位置におけるN、位置70に対応する位置におけるP、位置70に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるS、位置70に対応する位置におけるT、位置70に対応する位置におけるV、位置70に対応する位置におけるY、位置71に対応する位置におけるG、位置71に対応する位置におけるN、位置71に対応する位置におけるR、位置71に対応する位置におけるS、位置72に対応する位置におけるK、位置72に対応する位置におけるM、位置72に対応する位置におけるQ、位置73に対応する位置におけるA、位置73に対応する位置におけるH、位置73に対応する位置におけるK、位置73に対応する位置におけるL、位置73に対応する位置におけるQ、位置73に対応する位置におけるR、位置73に対応する位置におけるT、位置73に対応する位置におけるW、位置74に対応する位置におけるA、位置74に対応する位置におけるC、位置74に対応する位置におけるE、位置74に対応する位置におけるF、位置74に対応する位置におけるG、位置74に対応する位置におけるH、位置74に対応する位置におけるK、位置74に対応する位置におけるL、位置74に対応する位置におけるM、位置74に対応する位置におけるN、位置74に対応する位置におけるP、位置74に対応する位置におけるR、位置74に対応する位置におけるS、位置74に対応する位置におけるV、位置74に対応する位置におけるW、位置75に対応する位置におけるF、位置75に対応する位置におけるL、位置75に対応する位置におけるM、位置75に対応する位置におけるR、位置75に対応する位置におけるT、位置79に対応する位置におけるL、位置82に対応する位置におけるL、位置82に対応する位置におけるN、位置83に対応する位置におけるV、位置83に対応する位置におけるQ、位置83に対応する位置におけるS、位置83に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるE、位置84に対応する位置におけるF、位置84に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるN、位置84に対応する位置におけるR、位置86に対応する位置におけるA、位置86に対応する位置におけるH、位置86に対応する位置におけるK、位置86に対応する位置におけるN、位置86に対応する位置におけるS、位置86に対応する位置におけるT、位置86に対応する位置におけるW、位置87に対応する位置におけるC、位置87に対応する位置におけるG、位置87に対応する位置におけるL、位置87に対応する位置におけるM、位置87に対応する位置におけるR、位置87に対応する位置におけるS、位置87に対応する位置におけるT、位置87に対応する位置におけるV、位置87に対応する位置におけるY、位置89に対応する位置におけるC、位置90に対応する位置におけるA、位置90に対応する位置におけるE、位置90に対応する位置におけるH、位置90に対応する位置におけるK、位置90に対応する位置におけるN、位置90に対応する位置におけるR、位置92に対応する位置におけるC、位置92に対応する位置におけるL、位置93に対応する位置におけるI、位置93に対応する位置におけるL、位置93に対応する位置におけるQ、位置93に対応する位置におけるR、位置93に対応する位置におけるS、位置93に対応する位置におけるT、位置94に対応する位置におけるD、位置94に対応する位置におけるQ、位置94に対応する位置におけるR、位置97に対応する位置におけるA、位置97に対応するアミノ酸残基でのC、位置97に対応する位置におけるD、位置97に対応する位置におけるE、位置97に対応する位置におけるG、位置97に対応する位置におけるL、位置97に対応する位置におけるS、位置102に対応する位置におけるS、位置102に対応する位置におけるT、位置104に対応する位置におけるR、
位置107に対応する位置におけるL、位置114に対応する位置におけるA、位置118に対応する位置におけるQ、位置120に対応する位置におけるH、位置120に対応する位置におけるF、位置120に対応する位置におけるI、位置120に対応する位置におけるS、位置120に対応する位置におけるV、位置120に対応する位置におけるY、位置127に対応する位置におけるE、位置127に対応する位置におけるH、位置127に対応する位置におけるN、位置127に対応する位置におけるQ、位置127に対応する位置におけるR、位置128に対応する位置におけるI、位置130に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるG、位置131に対応する位置におけるI、位置131に対応する位置におけるM、位置131に対応する位置におけるQ、位置131に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるV、位置132に対応する位置におけるN、位置132に対応する位置におけるL、位置135に対応する位置におけるD、位置135に対応する位置におけるG、位置135に対応する位置におけるRでの、位置138に対応する位置におけるL、位置139に対応する位置におけるT、位置140に対応する位置におけるK、位置141に対応する位置におけるH、位置141に対応する位置におけるR、位置141に対応する位置におけるS、位置141に対応する位置におけるW、位置141に対応する位置におけるY、位置142に対応する位置におけるD、位置142に対応する位置におけるG、位置142に対応する位置におけるK、位置142に対応する位置におけるN、位置142に対応する位置におけるP、位置142に対応する位置におけるQ、位置142に対応する位置におけるR、位置142に対応する位置におけるS、位置142に対応する位置におけるT、位置143に対応する位置におけるG、位置143に対応する位置におけるK、位置144に対応する位置におけるR、位置144に対応する位置におけるT、位置146に対応する位置におけるP、位置146に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるA、位置147に対応する位置におけるF、位置147に対応する位置におけるL、位置147に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるS、位置147に対応する位置におけるV、位置148に対応する位置におけるH、位置148に対応する位置におけるK、位置148に対応する位置におけるQ、位置149に対応する位置におけるT、位置149に対応する位置におけるV、位置150に対応する位置におけるA、位置150に対応する位置におけるD、位置150に対応する位置におけるG、位置150に対応する位置におけるN、位置150に対応する位置におけるS、位置150に対応する位置におけるW、位置150に対応する位置におけるY、位置151に対応する位置におけるA、位置151に対応する位置におけるH、位置151に対応する位置におけるK、位置151に対応する位置におけるL、位置151に対応する位置におけるM、位置151に対応する位置におけるQ、位置151に対応する位置におけるR、位置151に対応する位置におけるS、位置151に対応する位置におけるT、位置151に対応する位置におけるV、位置151に対応する位置におけるW、位置151に対応する位置におけるY、位置152に対応する位置におけるR、位置152に対応する位置におけるT、位置152に対応する位置におけるW、位置155に対応する位置におけるD、位置155に対応する位置におけるG、位置155に対応する位置におけるK、位置155に対応する位置におけるR、位置156に対応する位置におけるD、位置158に対応する位置におけるQ、位置158に対応する位置におけるS、位置160に対応する位置におけるS、位置162に対応する位置におけるE、位置163に対応する位置におけるA、位置163に対応する位置におけるE、位置163に対応する位置におけるK、位置163に対応する位置におけるQ、位置163に対応する位置におけるR、位置163に対応する位置におけるS、位置164に対応する位置におけるM、位置164に対応する位置におけるV、位置165に対応する位置におけるD、位置165に対応する位置におけるF、位置165に対応する位置におけるN、位置165に対応する位置におけるS、位置165に対応する位置におけるV、位置166に対応する位置におけるA、位置166に対応する位置におけるE、位置166に対応する位置におけるF、位置166に対応する位置におけるH、位置166に対応する位置におけるL、位置166に対応する位置におけるQ、位置166に対応する位置におけるR、位置166に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるW、位置166に対応する位置におけるY、位置167に対応する位置におけるD、位置169に対応する位置におけるL、位置170に対応する位置におけるR、位置172に対応する位置におけるA、位置173に対応する位置におけるR、位置174に対応する位置におけるG、位置174に対応する位置におけるK、位置174に対応する位置におけるN、位置174に対応する位置におけるR、位置174に対応する位置におけるT、位置175に対応する位置におけるT、位置178に対応する位置におけるK、位置178に対応する位置におけるR、位置179に対応する位置におけるK、位置193に対応する位置におけるQ、位置195に対応する位置におけるT、位置195に対応する位置におけるNでの、位置196に対応する位置におけるE、位置196に対応する位置におけるRでの、位置198に対応する位置におけるD、位置204に対応する位置におけるP、位置205に対応する位置におけるA、位置205に対応する位置におけるE、位置205に対応する位置におけるL、位置205に対応する位置におけるT、位置206に対応する位置におけるI、位置206に対応する位置におけるK、位置206に対応する位置におけるL、位置206に対応する位置におけるR、位置209に対応する位置におけるR、位置212に対応する位置におけるN、位置212に対応する位置におけるS、位置213に対応する位置におけるA、位置213に対応する位置におけるM、位置213に対応する位置におけるN、位置215に対応する位置におけるH、位置215に対応する位置におけるM、位置219に対応する位置におけるI、位置219に対応する位置におけるK、位置219に対応する位置におけるS、位置220に対応する位置におけるH、位置220に対応する位置におけるI、位置220に対応する位置におけるL、位置220に対応する位置におけるV、位置221に対応する位置におけるQ、位置222に対応する位置におけるG、位置232に対応する位置におけるF、位置233に対応する位置におけるG、位置233に対応する位置におけるK、位置233に対応する位置におけるR、位置234に対応する位置におけるM、位置235に対応する位置におけるA、位置236に対応する位置におけるR、位置237に対応する位置におけるC、位置237に対応する位置におけるE、位置237に対応する位置におけるH、位置237に対応する位置におけるQ、位置237に対応する位置におけるT、位置238に対応する位置におけるE、アミノ酸位置238に対応する位置におけるH、位置238に対応する位置におけるS、位置240に対応する位置におけるA、位置240に対応する位置におけるQ、位置247に対応する位置におけるI、位置248に対応する位置におけるA、位置249に対応する位置におけるV、位置257に対応する位置におけるG、位置257に対応する位置におけるT、位置257に対応する位置におけるR、位置258に対応する位置におけるN、位置258に対応する位置におけるS、位置259に対応する位置におけるP、位置260に対応する位置におけるM、位置260に対応する位置におけるY、位置261に対応する位置におけるA、位置261に対応する位置におけるK、位置261に対応する位置におけるN、位置263に対応する位置におけるK、位置263に対応する位置におけるR、位置267に対応する位置におけるT、位置269に対応する位置におけるA、位置271に対応する位置におけるL、位置271に対応する位置におけるM、位置272に対応する位置におけるD、位置272に対応する位置におけるT、位置273に対応する位置におけるH、位置273に対応する位置におけるY、位置274に対応する位置におけるF、位置276に対応する位置におけるD、位置276に対応する位置におけるH、位置276に対応する位置におけるM、位置276に対応する位置におけるR、位置276に対応する位置におけるS、位置276に対応する位置におけるY、位置277に対応する位置におけるA、位置277に対応する位置におけるE、位置277に対応する位置におけるH、位置277に対応する位置におけるK、位置277に対応する位置におけるM、位置277に対応する位置におけるN、位置277に対応する位置におけるQ、位置277に対応する位置におけるR、位置277に対応する位置におけるS、位置277に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるE、位置278に対応する位置におけるF、位置278に対応する位置におけるG、位置278に対応する位置におけるH、位置278に対応する位置におけるK、位置278に対応する位置におけるN、位置278に対応する位置におけるR、位置278に対応する位置におけるS、位置278に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるY、位置279に対応する位置におけるH、位置282に対応する位置におけるM、位置283に対応する位置におけるS、位置285に対応する位置におけるH、位置287に対応する位置におけるT、位置289に対応する位置におけるS、位置291に対応する位置におけるS、位置291に対応する位置におけるV、位置292に対応する位置におけるC、位置292に対応する位置におけるF、位置292に対応する位置におけるH、位置292に対応する位置におけるK、位置292に対応する位置におけるR、位置292に対応する位置におけるV、位置293に対応する位置におけるA、位置293に対応する位置におけるC、位置293に対応する位置におけるD、位置293に対応する位置におけるF、位置293に対応する位置におけるK、位置293に対応する位置におけるM、位置293に対応する位置におけるP、位置293に対応する位置におけるQ、位置293に対応する位置におけるV、位置293に対応する位置におけるY、位置298に対応する位置におけるG、位置305に対応する位置におけるE、位置307に対応する位置におけるG、位置308に対応する位置におけるD、位置308に対応する位置におけるG、位置308に対応する位置におけるK、位置308に対応する位置におけるN、位置308に対応する位置におけるR、位置309に対応する位置におけるE、位置309に対応する位置におけるG、位置309に対応する位置におけるH、位置309に対応する位置におけるL、位置309に対応する位置におけるM、位置309に対応する位置におけるN、位置309に対応する位置におけるQ、位置309に対応する位置におけるR、位置309に対応する位置におけるS、位置309に対応する位置におけるT、位置309に対応する位置におけるV、位置310に対応する位置におけるA、位置310に対応する位置におけるG、位置310に対応する位置におけるQ、位置310に対応する位置におけるS、位置313に対応する位置におけるA、位置313に対応する位置におけるG、位置313に対応する位置におけるH、位置313に対応する位置におけるK、位置313に対応する位置におけるP、位置313に対応する位置におけるR、位置313に対応する位置におけるT、位置313に対応する位置におけるY
での、位置314に対応する位置におけるS、位置314に対応する位置におけるY、位置315に対応する位置におけるA、位置315に対応する位置におけるH、位置315に対応する位置におけるY、位置317に対応する位置におけるA、位置317に対応する位置におけるI、位置317に対応する位置におけるK、位置317に対応する位置におけるN、位置317に対応する位置におけるQ、位置317に対応する位置におけるR、位置317に対応する位置におけるS、位置317に対応する位置におけるT、位置317に対応する位置におけるW、位置318に対応する位置におけるD、位置318に対応する位置におけるH、位置318に対応する位置におけるK、位置318に対応する位置におけるM、位置318に対応する位置におけるR、位置320に対応する位置におけるH、位置320に対応する位置におけるK、位置320に対応する位置におけるR、位置321に対応する位置におけるR、位置321に対応する位置におけるS、位置324に対応する位置におけるN、位置324に対応する位置におけるR、位置325に対応する位置におけるA、位置325に対応する位置におけるD、位置325に対応する位置におけるE、位置325に対応する位置におけるG、位置325に対応する位置におけるH、位置325に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるM、位置325に対応する位置におけるN、位置325に対応する位置におけるQ、位置325に対応する位置におけるS、位置325に対応する位置におけるV、位置326に対応する位置におけるL、位置326に対応する位置におけるV、位置328に対応する位置におけるC、位置328に対応する位置におけるG、位置328に対応する位置におけるI、位置328に対応する位置におけるK、位置328に対応する位置におけるL、位置328に対応する位置におけるS、位置328に対応する位置におけるY、位置335に対応する位置におけるS、位置347に対応する位置におけるA、位置347に対応する位置におけるG、位置347に対応する位置におけるS、位置349に対応する位置におけるM、位置349に対応する位置におけるR、位置351に対応する位置におけるS、位置353に対応する位置におけるVでの、位置356に対応する位置におけるH、位置356に対応する位置におけるS、位置359に対応する位置におけるE、位置359に対応する位置におけるH、位置359に対応する位置におけるT、位置367に対応する位置におけるA、位置367に対応する位置におけるG、位置367に対応する位置におけるK、位置367に対応する位置におけるS、位置368に対応する位置におけるA、位置368に対応する位置におけるE、位置368に対応する位置におけるK、アミノ酸位置368に対応する位置におけるL、アミノ酸位置368に対応する位置におけるM、位置368に対応する位置におけるR、アミノ酸位置368に対応する位置におけるT、位置369に対応する位置におけるH、位置369に対応する位置におけるR、位置371に対応する位置におけるF、位置371に対応する位置におけるH、位置371に対応する位置におけるK、位置371に対応する位置におけるL、位置371に対応する位置におけるR、位置371に対応する位置におけるS、位置373に対応する位置におけるM、位置374に対応する位置におけるH、位置374に対応する位置におけるP、位置375に対応する位置におけるA、位置375に対応する位置におけるG、位置375に対応する位置におけるK、位置375に対応する位置におけるR、位置376に対応する位置におけるD、位置376に対応する位置におけるE、位置376に対応する位置におけるQ、位置376に対応する位置におけるR、位置376に対応する位置におけるT、位置376に対応する位置におけるV、位置376に対応する位置におけるY、位置377に対応する位置におけるD、位置377に対応する位置におけるE、位置377に対応する位置におけるH、位置377に対応する位置におけるK、位置377に対応する位置におけるP、位置377に対応する位置におけるR、位置377に対応する位置におけるS、位置377に対応する位置におけるT、位置380に対応する位置におけるW、位置380に対応する位置におけるY、位置381に対応する位置におけるS、位置383に対応する位置におけるI、位置383に対応する位置におけるK、位置383に対応する位置におけるL、位置383に対応する位置におけるS、位置385に対応する位置におけるA、位置385に対応する位置におけるQ、位置385に対応する位置におけるV、位置389に対応する位置におけるA、位置389に対応する位置におけるG、位置389に対応する位置におけるL、位置389に対応する位置におけるK、位置389に対応する位置におけるQ、位置389に対応する位置におけるS、位置392に対応する位置におけるA、位置392に対応する位置におけるF、位置392に対応する位置におけるM、位置392に対応する位置におけるQ、位置392に対応する位置におけるR、位置392に対応する位置におけるV、位置393に対応する位置におけるF、位置393に対応する位置におけるM、位置395に対応する位置におけるA、位置395に対応する位置におけるH、位置395に対応する位置におけるR、位置396に対応する位置におけるA、位置396に対応する位置におけるH、位置396に対応する位置におけるQ、位置396に対応する位置におけるS、位置399に対応する位置におけるK、位置399に対応する位置におけるM、位置399に対応する位置におけるT、位置399に対応する位置におけるV、位置399に対応する位置におけるW、位置401に対応する位置におけるA、位置401に対応する位置におけるE、位置404に対応する位置におけるA、位置405に対応する位置におけるG、位置406に対応する位置におけるF、位置406に対応する位置におけるN、位置407に対応する位置におけるA、位置407に対応する位置におけるD、位置407に対応する位置におけるE、位置407に対応する位置におけるF、位置407に対応する位置におけるH、位置407に対応する位置におけるQ、位置407に対応する位置におけるP、位置409に対応する位置におけるA、位置409に対応する位置におけるQ、位置410に対応する位置におけるT、位置412に対応する位置におけるQ、位置412に対応する位置におけるR、位置412に対応する位置におけるV、位置416に対応する位置におけるL、位置418に対応する位置におけるE、位置418に対応する位置におけるL、位置418に対応する位置におけるP、位置418に対応する位置におけるR、位置418に対応する位置におけるV、位置419に対応する位置におけるF、位置419に対応する位置におけるH、位置419に対応する位置におけるI、位置419に対応する位置におけるK、位置419に対応する位置におけるR、位置419に対応する位置におけるS、位置419に対応する位置におけるY、位置421に対応する位置におけるA、位置421に対応する位置におけるH、位置421に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるN、位置421に対応する位置におけるQ、位置421に対応する位置におけるR、位置421に対応する位置におけるS、位置425に対応する位置におけるG、位置425に対応する位置におけるK、位置427に対応する位置におけるQ、位置427に対応する位置におけるT、位置428に対応する位置におけるL、位置431に対応する位置におけるA、位置431に対応する位置におけるG、位置431に対応する位置におけるE、位置431に対応する位置におけるH、位置431に対応する位置におけるK、位置431に対応する位置におけるL、位置431に対応する位置におけるN、位置431に対応する位置におけるQ、位置431に対応する位置におけるR、位置431に対応する位置におけるS、位置431に対応する位置におけるV、位置433に対応する位置におけるA、位置433に対応する位置におけるH、位置433に対応する位置におけるI、位置433に対応する位置におけるK、位置433に対応する位置におけるL、位置433に対応する位置におけるR、位置433に対応する位置におけるT、位置433に対応する位置におけるV、位置433に対応する位置におけるW、位置436に対応する位置におけるK、位置437に対応する位置におけるI、位置437に対応する位置におけるM、位置438に対応する位置におけるA、位置438に対応する位置におけるD、位置438に対応する位置におけるE、位置438に対応する位置におけるL、位置438に対応する位置におけるN、位置438に対応する位置におけるT、位置439に対応する位置におけるA、位置439に対応する位置におけるC、位置439に対応する位置におけるK、位置439に対応する位置におけるP、位置439に対応する位置におけるQ、位置439に対応する位置におけるT、位置439に対応する位置におけるV、位置440に対応する位置におけるD、位置440に対応する位置におけるH、位置440に対応する位置におけるM、位置440に対応する位置におけるP、位置440に対応する位置におけるR、位置440に対応する位置におけるS、位置441に対応する位置におけるA、位置441に対応する位置におけるF、位置442に対応する位置におけるC、位置442に対応する位置におけるG、位置442に対応する位置におけるR、位置443に対応する位置におけるA、位置443に対応する位置におけるE、位置443に対応する位置におけるF、位置443に対応する位置におけるG、位置443に対応する位置におけるM、位置443に対応する位置におけるN、位置444に対応する位置におけるE、位置444に対応する位置におけるH、位置444に対応する位置におけるV、位置445に対応する位置におけるH、位置445に対応する位置におけるM、位置445に対応する位置におけるN、位置445に対応する位置におけるP、位置445に対応する位置におけるQ、位置445に対応する位置におけるS、位置445に対応する位置におけるT、位置445に対応する位置におけるV、位置445に対応する位置におけるW、位置446に対応する位置におけるA、位置446に対応する位置におけるM、位置446に対応する位置におけるW、位置447に対応する位置におけるD、位置447に対応する位置におけるE、位置447に対応する位置におけるG、位置447に対応する位置におけるI、位置447に対応する位置におけるN、位置447に対応する位置におけるP、位置447に対応する位置におけるQは、位置447に対応する位置におけるTでの置換、および/または位置447に対応する位置におけるVでの置換の中から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含有するものがある。これらの修飾PH20ポリペプチドの中には、特定のアミノ酸置換を含有しないPH20の活性の少なくとも40%を示すものがある。活性は、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の例えば、40%〜5000%、40%〜2000%、40%〜1000%、40%〜500%、40%〜100%、80%〜2000%、80%〜600%、80%〜200%、80%〜300%の間で変わり得る。このような活性は、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%またはそれ以上を含み、活性は、本明細書におけるすべての例においてと同様、同一条件下で比較される。

特に、配列番号7に示されるPH20ポリペプチドもしくはそのC末端で切断された断片中、または配列番号7に示されるアミノ酸の配列もしくはその対応する切断断片に対して少なくとも91%同一であるアミノ酸の配列を有するPH20ポリペプチド中に少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドが提供され、これでは、修飾PH20ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドの20%未満のヒアルロニダーゼ活性を示し、活性は、同一条件下で比較され、アミノ酸置換(複数可)は、配列番号3または7に示されるアミノ酸位置に関して2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444、または447の中から選択される位置に対応するアミノ酸位置にあり、対応するアミノ酸位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるポリペプチドとのアラインメントによって同定され、ただし、
(i)修飾PH20ポリペプチドが、位置200、333、358または393に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、アラニン(A)での置換ではなく、
(ii)修飾PH20ポリペプチドが、位置111または249に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、アスパラギン(N)での置換ではなく、
(iii)修飾PH20ポリペプチドが、位置113に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、グルタミン(Q)での置換ではなく、
(iv)修飾PH20ポリペプチドが、位置176に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、グリシン(G)での置換ではなく、
(v)修飾PH20ポリペプチドが、位置252に対応する位置にアミノ酸置換を含有するならば、置換は、トレオニン(T)での置換ではない。

このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するPH20ポリペプチド中に、または配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに対して少なくとも91%の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換(複数可)を含有するいずれかがある。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3、7、32〜66、69または72中にアミノ酸置換(複数可)を含有する。配列番号7のC末端で切断された断片であるポリペプチドまたは配列番号7に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも91%同一であるアミノ酸の配列を有するPH20ポリペプチドである。本明細書において提供されたこのような修飾PH20ポリペプチドの例では、修飾PH20ポリペプチドは、修飾を含まないPH20と同様または同一の活性を示し得るか、または活性の増大もしくはアミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%未満もしくはそれ以下である活性を示し得る。このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、表5に示されるいずれかがある。

本明細書および上記において提供されたありとあらゆる修飾PH20ポリペプチドの中では、修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3、6〜66、69〜72、856〜861、869または870のいずれかに示されるアミノ酸の配列からならないものがある。特に、本明細書において上記で、または本明細書において他の場所に提供された任意の修飾PH20ポリペプチドの中に、配列番号3、7、69または72のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するPH20ポリペプチド中にアミノ酸置換(複数可)を含有するいずれかのものがあり、ただし、(i)修飾PH20ポリペプチドが、単一のアミノ酸置換のみを含む場合には、置換は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、アミノ酸置換V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、E249Q、R252T、N333AまたはN358Aに対応せず、(ii)修飾PH20ポリペプチドが、2つのアミノ酸置換のみを含む場合には、置換は、配列番号3に示される位置に関して、アミノ酸置換P13A/L464W、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N219AまたはN333A/N358Aに対応せず、(iii)修飾PH20ポリペプチドが、3つのアミノ酸置換のみを含む場合には、置換は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、アミノ酸置換N47A/N131A/N219Aに対応しない。

上記の修飾PH20ポリペプチドのいずれかも、および本明細書において提供された、上記の、以下のいずれも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。修飾PH20ポリペプチドは、天然配列または異種配列または修飾配列を含めたシグナル配列を含む場合もあり、また、シグナル配列を欠く成熟PH20ポリペプチドも含む。

本明細書において上記で提供されたまたは以下に記載された修飾PH20ポリペプチドのいずれかの中に、配列番号3に示されるアミノ酸の配列に対して比較される位置に関して、配列番号73〜855のいずれかに示されたアミノ酸の配列または配列番号73〜855のいずれかに示されたアミノ酸の配列に対して少なくとも75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示し、上記でもしくは本明細書において他の場所で記載されるいずれかなどの少なくとも1つのアミノ酸置換を含有するアミノ酸の配列を含有するか、または有する修飾PH20ポリペプチドがある。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドの例のいずれでも、修飾PH20ポリペプチドは、配列番号8〜31、69〜72、856〜861、869または870のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有さないか、または含有しない。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、実質的に精製または単離され得、中性pHで触媒活性を示し得、発現時に細胞から分泌され得、上清中に可溶性であり、および/またはグリコシル化、シアル化(sialation)、アルブミン化(albumination)、ファルニシル化(farnysylation)、カルボキシル化、水酸化、ペグ化などのポリマーとのコンジュゲーションまたはデキストランとのコンジュゲーション、多量体化ドメイン、毒素、検出可能な標識もしくは薬物などの別の部分とのコンジュゲーションおよびリン酸化の中から選択される修飾などの修飾アミノ酸を含み得る。修飾PH20ポリペプチドは、少なくとも3個のアスパラギン(N)残基の各々と連結している少なくとも1つのN−アセチルグルコサミン部分を含有することなどによってグリコシル化され得、これでは、例えば、3個のアスパラギン残基は、配列番号3のアミノ酸残基200、333および358に相当する。多量体化ドメインは、Fcドメインを含む。

また、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も提供される。核酸分子を含有する真核生物および原核生物のベクターが提供される。ベクターは、発現ベクターを含み、ウイルスベクターを含めた哺乳類ベクターを含む。ウイルスベクターとして、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスベクターおよびその他のこのようなウイルスベクターが挙げられる。腫瘍に蓄積するか、または腫瘍にターゲッティングされる腫瘍退縮性ベクターが注目される。また、核酸分子を含有する細胞およびベクターを含有する細胞が提供される。細胞は、原核生物のものであっても、真核生物のものであっても、特に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳類細胞であってもよい。

また、提供された細胞のいずれかによって産生される修飾PH20ポリペプチドが本明細書において提供される。したがって、本明細書において提供された細胞のいずれかを、コードされる修飾PH20ポリペプチドが細胞によって産生または分泌される条件下で培養することおよび発現されたポリペプチドを回収することによって修飾PH20ポリペプチドを産生する方法が、本明細書において提供される。また、本明細書において提供された核酸のいずれかまたは本明細書において提供されたベクターのいずれかを、N結合型糖部分をポリペプチドに導入できる細胞に導入することおよびコードされた修飾PH20ポリペプチドが、細胞によって産生および分泌される条件下で細胞を培養することおよび発現されたポリペプチドを回収することによって修飾PH20ポリペプチドを産生する方法が、本明細書において提供される。このような例では、核酸は、プロモーターと作動可能に連結している。培養される細胞は、哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの真核細胞であり得る。

また、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのいずれかまたは本明細書において提供された核酸またはベクターのいずれかを含有する医薬組成物が提供される。組成物は、その他の薬剤とともに、および/または保存料などのその他の成分とともに製剤され得る。組成物は、成分、特に、PH20および任意のその他の活性薬剤が、予め選択された条件下で活性のままであるか、または安定であるように製剤され得る。さらに、本明細書において記載されたように、PH20ポリペプチドは、種々の条件下で増大した安定性を示すように修飾される。例えば、修飾PH20ポリペプチドが、両端を含めて2℃〜8℃または約2℃〜8℃の温度で、少なくとも1カ月間安定である(すなわち、本明細書において記載されるような活性を保持する)か、または両端を含めて30℃〜42℃または約30℃〜42℃の温度で少なくとも3日間安定である組成物が提供される。組成物中の修飾PH20ポリペプチドが、両端を含めて2℃〜8℃または約2℃〜8℃の温度で、少なくとも2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、少なくとも8カ月、少なくとも9カ月、少なくとも10カ月、少なくとも11カ月、少なくとも12カ月、13カ月、14カ月、15カ月、16カ月、17カ月、18カ月、19カ月、20カ月、21カ月、22カ月、23カ月、24カ月、25カ月、26カ月、27カ月、28カ月、29カ月または30カ月間安定である組成物が提供される。また、組成物中の修飾PH20ポリペプチドが、両端を含めて30℃〜42℃または約30℃〜42℃の温度で少なくとも3日、少なくとも4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、35日、40日、45日、50日、60日間またはそれ以上安定である組成物が提供される。医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤を含有し得る。

条件、製剤、成分および修飾PH20ポリペプチドは、所望の安定性を達成するために選択される。医薬組成物は、直接投与のために製剤され得、希釈を必要とし得る。それらは、複数回または単回投与量投与用に製剤され得る。例示的組成物は、0.1μg/mL〜100μg/mL、1μg/mL〜50μg/mLまたは1μg/mL〜20μg/mLまたは10U/mL〜5000U/mL、50U/mL〜4000U/mL、100U/mL〜2000U/mL、300U/mL〜2000U/mL、600U/mL〜2000U/mLもしくは100U/mL〜1000U/mLの間または約0.1μg/mL〜100μg/mL、1μg/mL〜50μg/mLまたは1μg/mL〜20μg/mLまたは10U/mL〜5000U/mL、50U/mL〜4000U/mL、100U/mL〜2000U/mL、300U/mL〜2000U/mL、600U/mL〜2000U/mLもしくは100U/mL〜1000U/mLの間の修飾PH20の濃度を含む。例示的塩として、200mM、180mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM未満または約200mM、180mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mMまたは200mM、180mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mMもしくはそれ以下、または0.1mM〜200mM、0.1mM〜100mM、120mM〜200mM、10mM〜50mM、10mM〜90mM、80mM〜200mM、80mM〜140mM、50mM〜100mM、80mM〜100mM、50mM〜80mM、100mM〜140mMもしくは120mM〜140mMの間または約0.1mM〜200mM、0.1mM〜100mM、120mM〜200mM、10mM〜50mM、10mM〜90mM、80mM〜200mM、80mM〜140mM、50mM〜100mM、80mM〜100mM、50mM〜80mM、100mM〜140mMもしくは120mM〜140mMの間の濃度のNaClが挙げられる。

医薬組成物は、それだけには限らないが、フェノール、m−クレゾール、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、4−クロロ−1−ブタノール、クロルヘキシジン二塩酸塩、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、L−フェニルアラニン、EDTA、ブロノポール、酢酸フェニル水銀、グリセロール、イミドウレア(imidurea)、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、o−クレゾール、p−クレゾール、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンおよびそれらの任意の組合せなどの抗菌的に有効な量のフェノール系防腐剤(複数可)、非フェノール系防腐剤(複数可)またはフェノール系防腐剤(複数可)および非フェノール系防腐剤(複数可)の1、2、3、4種またはそれ以上などの防腐剤または防腐剤の混合物を含有し得る。フェノールとして、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのフェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールおよびパラベンが挙げられる。1種または複数種の防腐剤の抗菌上有効な濃度(質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)として)は、両端を含めて、0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%または0.3%〜0.4%の間であり得る。その例として、防腐剤が、フェノール、m−クレゾールまたはフェノールおよびm−クレゾールである医薬組成物があり、製剤中の質量濃度(w/v)の%としての量は、0.1%〜0.25%もしくは約0.1%〜0.25%の間のフェノールおよび0.05%〜0.2%もしくは約0.05%〜0.2%の間のm−クレゾールであり、0.10%〜0.2%もしくは約0.10%〜0.2%の間のフェノールおよび0.6%〜01.8%もしくは約0.6%〜01.8%の間のm−クレゾール、0.1%〜0.15%もしくは約0.1%〜0.15%の間のフェノールおよび0.8%〜0.15%のm−クレゾールであり、0.10%〜0.15%もしくは約0.10%〜0.15%の間のフェノールおよび0.06〜0.09%もしくは約0.06〜0.09%の間のm−クレゾールであるか、または0.12%〜0.18%もしくは約0.12%〜0.18%の間のフェノールおよび0.14〜0.22%もしくは約0.14〜0.22%の間のm−クレゾールである。

医薬組成物は、治療上活性な薬剤をさらに含有し得る。活性薬剤は、組成物に製剤され得るか、またはPH20含有組成物との組合せであるが、別個に、逐次、断続的に、同時にまたは一緒に投与するための別個の組成物として提供される場合もある。治療上活性な薬剤として、例えば、化学療法薬、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤(trichomonacidal agent)、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬および抗関節炎薬、抗真菌剤、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫剤、抗ヒスタミン剤、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔剤、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管治療薬、避妊薬、鬱血除去薬、利尿薬、降下薬、診断薬、電解質剤、催眠薬、ホルモン剤、高血糖薬、筋弛緩薬、筋肉収縮薬、眼部薬、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、交感神経作用薬、トランキライザー薬、泌尿器薬、膣薬、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の中から選択される薬剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、薬物、有機分子および睡眠誘導物質が挙げられる。このような薬剤の例示的なものとして、抗体、特に、モノクローナル抗体、免疫グロブリン調製物、ビスホスホネート、サイトカイン、化学療法薬、血液凝固因子およびインスリンがある。インスリンとして、例えば、基礎インスリンおよびレギュラーインスリンなどの速効型インスリン、特に、組換えヒトインスリンおよびインスリンリスプロ、インスリンアスパルトまたはインスリングルリジンなどのインスリン類似体が挙げられる。特定の速効型インスリンとして、配列番号862に示されるアミノ酸の配列を有するA鎖および配列番号863に示されるアミノ酸の配列を有するB鎖を有するものまたは配列番号864のアミノ酸残基位置88〜108として示されるアミノ酸の配列を有するA鎖および配列番号864のアミノ酸残基位置25〜54として示されるアミノ酸の配列を有するB鎖を有するインスリンまたは配列番号862に示されるアミノ酸の配列を有するA鎖および配列番号865〜867のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するB鎖を有するインスリンの中から選択されるインスリン類似体がある。組成物中の速効型インスリンの量は、経験的に決定され得るが、通常、両端を含めて、10U/mL〜1000U/mL、50U/mL〜500U/mL、100U/mL〜1000U/mLまたは500U/mL〜1000U/mLであり得る。

特定の例では、フェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのいずれかおよび速効型インスリンなどのインスリンを含有する医薬組成物が本明細書において提供される。修飾PH20ポリペプチドおよびインスリンは、治療上有効な量で提供され得る。例えば、フェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのいずれかを、100U/mL〜1000U/mLまたは約100U/mL〜1000U/mLである量で、および速効型インスリンを10U/mL〜1000U/mLまたは約10U/mL〜1000U/mLである量で含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。例えば、速効型インスリンは、インスリンリスプロ、インスリンアスパルトまたはインスリングルリジンなどのインスリン類似体またはその他の類似体であり得る。このような医薬組成物のいずれも、7.0〜7.6または約7.0〜7.6であるpHで製剤され得る。このような医薬組成物のいずれも、0.1mM〜200mMまたは約0.1mM〜200mMである濃度のNaClなどの塩および/または抗菌上有効な量の少なくとも1種の防腐剤を含有するよう製剤され得、これでは、組成物は、一般に、少なくとも1種のフェノール系防腐剤を含有する。抗菌上有効な量は、0.05%〜0.6%であるか、またはその間である質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)としての1種または複数種の防腐剤の総量である。フェノール系防腐剤(複数可)は、フェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールまたはパラベンであり得る。医薬組成物の上記の例のいずれにおいても、組成物はまた、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロキサマーまたはポリソルベートなどの界面活性物質を、少なくとも0.001%または少なくとも約0.001%である製剤中の質量濃度(w/v)の%としての量で;Tris、ヒスチジン、リン酸塩またはクエン酸塩などの非金属性結合剤であるか、または金属性結合剤である緩衝剤を含有し得、緩衝剤の濃度は、1mM〜100mMまたは約1mM〜100mMの間であり;60mM未満の濃度のグリセリン;両端を含めて、2mM〜50mMまたは約2mM〜50mMの間の濃度のシステイン、トリプトファンまたはメチオニンなどの抗酸化薬および/またはインスリン100単位あたり0.001〜0.1mgまたは約0.001〜0.1mgの間の濃度(mg/100U)の亜鉛を含有し得る。また、閉ループシステム、医薬組成物のいずれかを含有する連続皮下注入インスリン(CSII)ポンプを含めたインスリンポンプおよびインスリンペンが本明細書において提供される。医薬組成物は、1型真性糖尿病、2型真性糖尿病または妊娠糖尿病などの糖尿病を治療するための方法または使用において使用され得る。

本明細書において提供された医薬組成物のいずれか中のその他の治療薬として、それだけには限らないがアダリムマブ、アガルシダーゼベータ、アレファセプト、アンピシリン、アナキンラ、抗ポリオワクチン、抗胸腺細胞、アジスロマイシン、ベカプレルミン、カスポファンギン、セファゾリン、セフェピム、セフォテタン、セフタジジム、セフトリアキソン、セツキシマブ、シラスタチン、クラブラン酸、クリンダマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダクリズマブ、ジフテリア、ジフテリア抗毒素、ジフテリアトキソイド、エファリズマブ、エピネフリン、エリスロポエチンアルファ、エタネルセプト、フィルグラスチム、フルコナゾール、卵胞刺激ホルモン、フォリトロピンアルファ、フォリトロピンベータ、ホスフェニトイン、ガドジアミド、ガドペンテト酸、ガチフロキサシン、グラチラマー、GM−CSF、ゴセレリン、酢酸ゴセレリン、グラニセトロン、ヘモフィルスインフルエンザb菌、ハロペリドール、肝炎ワクチン、A型肝炎ワクチン、B型肝炎ワクチン、イブリツモマブチウキセタン、イブリツモマブ、チウキセタン、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、インフリキシマブ、インスリンリスプロ、75%中性プロタミンリスプロ(NPL)/25%インスリンリスプロ、50%中性プロタミンハーゲドルン(NPH)/50%レギュラーインスリン、70%NPH/30%レギュラーインスリン、レギュラーインスリン、NPHインスリン、ウルトラインスリン、ウルトラレンテインスリンおよびインスリングラルギン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−2a、インターフェロンアルファ2−b、インターフェロンアルファコン、インターフェロンアルファ−n、インターフェロンベータ、インターフェロンベータ−1a、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−コン、イオジキサノール、イオヘキソール、イオパミドール、イオベルソール、ケトロラク、ラロニダーゼ、レボフロキサシン、リドカイン、リネゾリド、ロラゼパム、麻疹ワクチン、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹−ムンプス−風疹ウイルスワクチン、風疹ワクチン、メドロキシプロゲステロン、メロペネム、メチルプレドニゾロン、ミダゾラム、モルヒネ、オクトレオチド、オマリズマブ、オンダンセトロン、パリビズマブ、パントプラゾール、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグ−インターフェロンアルファ−2a、ペグ−インターフェロンアルファ−2b、ペグビソマント、百日咳ワクチン、ピペラシリン、肺炎球菌ワクチンおよび肺炎球菌コンジュゲートワクチン、プロメタジン、レテプラーゼ、ソマトロピン、スルバクタム、スマトリプタン、タゾバクタム、テネクテプラーゼ、テタヌス精製毒素、チカルシリン、トシツモマブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド、バンコマイシン、水痘帯状疱疹免疫グロブリン、水痘ワクチン、その他のワクチン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ヒ素、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)ワクチン、BCG生、ベキサロテン、ブレオマイシン、ブスルファン、静脈内ブスルファン、経口ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ポリフェプロサンを伴うカルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、シタラビンリポソーマル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノルビシン、ダウノマイシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーマル、プロピオン酸ドロモスタノロン、エリオットB溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エトポシドVP−16、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、5−フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、ロムスチン、CCNU、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、L−PAM、メルカプトプリン、6−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシン、マイトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ナンドロロンフェンプロピオネート(Nandrolone Phenpropionates)、ノフェツモマブ(Nofetumomabs)、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ミトラマイシン、ポルフィマー、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、6−チオグアニン、トリエチレンチオホスホラミド(チオテパ)、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、レチノイン酸、アリトレチノイン、9−シス−レチノイン酸、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン(Ambomycins)、アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナキシロン(Anaxirones)、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ(Argimesnas)、アスペルリン(Asperlins)、アトリムスチン(Atrimustines)、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン(Azotomycins)、バノキサントロン(Banoxantrones)、バタブリン(Batabulins)、バチマスタット、ベナキシビン(Benaxibines)、ベンダムスチン、ベンゾデパ(Benzodepas)、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダール(Biricodars)、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン(Budotitanes)、カクチノマイシン(Cactinomycins)、カネルチニブ、カラセミド(Caracemides)、カルベチマー(Carbetimers)、カルボコン、カルモフール、カルビシン、カルゼレシン(Carzelesins)、セデフィンゴール(Cedefingols)、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル(Cioteronels)、シロレマイシン(Cirolemycins)、クランフェヌル(Clanfenurs)、クロファラビン、クリスナトール(Crisnatols)デシタビン、デクスニグルジピン(Dexniguldipines)、デキソルマプラチン(Dexormaplatins)、デザグアニン(Dezaguanines)、ジアジキオン(Diaziquones)、ジブロスピジウム(Dibrospidiums)、ジエノゲスト、ジナリン(Dinalins)、ジセルモリド(Disermolides)、ドフェキダル(Dofequidars)、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、デュアゾマイシン、エコムスチン(Ecomustines)、エダトレキサート、エドテカリン(Edotecarins)、エフロルニチン(Eflornithines)、エラクリダール(Elacridars)、エリナフィド(Elinafides)、エルサミトルシン(Elsamitrucins)、エミテフール(Emitefurs)、エンロプラチン(Enloplatins)、エンプロメート(Enpromates)、エンザスタウリン、エピプロピジン(Epipropidines)、エプタロプロスト(Eptaloprosts)、エルブロゾール(Erbulozoles)、エソルビシン(Esorubicins)、エタニダゾール、エトグルシド、エトプリン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン(Fazarabines)、フェンレチニド、フルオキシメステロン、フルオロシタビン(Flurocitabines)、フォスキドン(Fosquidones)、フォストリエシン、ホトレタミン(Fotretamines)、ガラルビシン(Galarubicins)、ガロシタビン(Galocitabines)、ゲロキノール(Geroquinols)、ギマテカン(Gimatecans)、ギメラシル、グロキサゾン(Gloxazones)、グルフォスファミド(Glufosfamides)、イルモホシン(Ilmofosines)、イロマスタット、イメキソン(Imexons)、インプロスルファン、インジスラム、インプロクオン、インターロイキン、インターロイキン−2s、組換えインターロイキン、イントプリシン(Intoplicines)、ヨーベングアン(Iobenguanes)、イプロプラチン(Iproplatins)、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート(Ketotrexates)、L−アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン(Ledoxantrones)、リュープロリド、リュープロレリン、レクサカルシトール(Lexacalcitols)、リアロゾール(Liarozoles)、ロバプラチン(Lobaplatins)、ロメトレキソール(Lometrexols)、ロナファーニブ、ロソキサントロン(Losoxantrones)、ルルトテカン(Lurtotecans)、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メピチオスタン、メテシンド(Metesinds)、メトミデート(Metomidates)、メトプリン(Metoprines)、メツレデパ(Meturedepas)、ミボプラチン(Miboplatins)、ミプロキシフェン(Miproxifenes)、ミソニダゾール、ミチンドミド(Mitindomides)、ミトカルシン(Mitocarcins)、ミトクロミン(Mitocromins)、ミトフラキソン(Mitoflaxones)、ミトギリン(Mitogillins)、ミトグアゾン、ミトマルシン(Mitomalcins)、ミトナフィド(Mitonafides)、ミトキドン(Mitoquidones)、ミトスペル(Mitospers)、ミトゾロミド(Mitozolomides)、ミボブリン(Mivobulins)、ミゾリビン、モファロテン(Mofarotenes)、モピダモール、ムブリチニブ(Mubritinibs)、ミコフェノール酸、ネダプラチン、ネイザラビン(Neizarabines)、ネモルビシン(Nemorubicins)、ニトラクリン、ノコダゾール、ノガラマイシン、ノラトレキセド(Nolatrexeds)、ノルトピキサントロン(Nortopixantrones)、オルマプラチン(Ormaplatins)、オルタタキセル(Ortataxels)、オテラシル、オキシスラン(Oxisurans)、オキソフェナルシン(Oxophenarsines)、パツピロン(Patupilones)、ペルデシン(Peldesines)、ペリオマイシン(Peliomycins)、ペリトレキソール(Pelitrexols)、ペメトレキセド(Pemetrexeds)、ペンタムスチン(Pentamustines)、ペプロマイシン、ペルホスファミド(Perfosfamides)、ペリフォシン、ピコプラチン、ピナフィド(Pinafide
s)、ピポスルファン(Piposulfans)、ピルフェニドン、ピロキサントロン(Piroxantrones)、ピクサントロン、プレビトレキセド(Plevitrexeds)、プロメスタン(Plomestanes)、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ(Pumitepas)、ピューロマイシン、ピラゾフリン(Pyrazofurins)、ラニムスチン、リボプリン(Riboprines)、リトロスルファン(Ritrosulfans)、ログレチミド(Rogletimides)、ロキニメックス、ルフォクロモマイシン(Rufocromomycins)、サバルビシン(Sabarubicins)、サフィンゴール、サトラプラチン、セブリプラチン(Sebriplatins)、セムスチン、シムトラゼン(Simtrazenes)、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルフォセート(Sparfosates)、スパルフォス酸(Sparfosic Acids)、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン(Streptovarycins)、スホスファミド(sufosfamides)、スロフェヌル(Sulofenurs)、タセジナリン(Tacedinalines)、タリソマイシン(Talisomycins)、タリムスチン(Tallimustines)、タリキダル(Tariquidars)、タウロムスチン(Tauromustines)、テコガラン(Tecogalans)、テガフール、テロキサントロン(Teloxantrones)、テモポルフィン、テロキシロン(Teroxirones)チアミプリン(Thiamiprines)、チアミプリン(Tiamiprines)、チアゾフリン、チロミソール(Tilomisoles)、チロロン、チムコダル(Timcodars)、チモナシック(Timonacics)、チラパザミン、トピクサントロン、トラベクテジン、エクチナサイジン743、トレストロン(Trestolones)、トリシリビン(Triciribines)、トリロスタン、トリメトレキサート、トリプラチンテトラニトレート(Triplatin Tetranitrates)トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール(Tubulozoles)、ウベニメクス、ウレデパ(Uredepas)、バルスポダール(Valspodars)、バプレオチド(Vapreotides)、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンピジン(Vinepidines)、ビンフルニン、ビンホルミド(Vinformides)、ビングリシネート(Vinglycinates)、ビンロイシノール(Vinleucinols)、ビンロイロシン(Vinleurosines)、ビンロシジン(Vinrosidines)、ビントリプトール(Vintriptols)、ビンゾリジン(Vinzolidines)、ボロゾール、キサントマイシンA(Xanthomycin A)、グアメシクリン(Guamecyclines)、ゼニプラチン(Zeniplatins)、ジラスコルブ(Zilascorbs)[2−H]、ジノスタチン、ゾルビシン、ゾスキダル(Zosuquidars)、アセタゾラミド、アシクロビル、アジピオドン、アラトロフロキサシン(Alatrofloxacins)、アルフェンタニル、アレルゲン性抽出物、アルファ1−プロテイナーゼ阻害剤、アルプロスタジル、アミカシン、アミノ酸、アミノカプロン酸、アミノフィリン、アミトリプチリン、アモバルビタール、アムリノン、鎮痛薬、抗ポリオワクチン、抗狂犬病血清、抗テタヌス免疫グロブリン、テタヌスワクチン、アンチトロンビンIII、抗毒素(antivenom)血清、アルガトロバン、アルギニン、アスコルビン酸、アテノロール、アトラクリウム、アトロピン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、アズトレオナム、バシトラシン、バクロフェン、バシリキシマブ、安息香酸、ベンズトロピン、ベタメタゾン、ビオチン、ビバリルジン、ボツリヌス抗毒素、ブレチリウム、ブメタニド、ブピバカイン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、カルシトニン、カルシトリオール、カルシウム、カプレオマイシン、カルボプロスト、カルニチン、セファマンドール、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフチゾキシム、セフロキシム、クロラムフェニコール、クロロプロカイン、クロロキン、クロロチアジド、クロルプロマジン、コンドロイチン硫酸、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、クロム、シドホビル、シメチジン、シプロフロキサシン、シサトラクリウム、クロニジン、コデイン、コルヒチン、コリスチン、コラーゲン、コルチコレリンオーバイントリフルテート、コルチコトロピン、コシントロピン、シアノコバラミン、シクロスポリン、システイン、ダクリキシマブ(Dacliximabs)、ダルホプリスチン、ダルテパリン、ダナパロイド、ダントロレン、デフェロキサミン、デスモプレシン、デキサメタゾン、デクスメデトミジン、デクスパンテノール、デキストラン、鉄デキストラン、ジアトリゾ酸、ジアゼパム、ジアゾキシド、ジサイクロミン、ジギバインド(Digibinds)、ジゴキシン、ジヒドロエルゴタミン、ジルチアゼム、ジフェンヒドラミン、ジピリダモール、ドブタミン、ドパミン、ドキサクリウム、ドキサプラム、ドキセルカルシフェロール、ドキシサイクリン、ドロペリドール、ジフィリン、エデト酸、エドロホニウム、エナラプリラート、エフェドリン、エポプロステノール、エルゴカルシフェロール、エルゴノビン、エルタペネム、エリスロマイシン、エスモロール、エストラジオール、エストロゲニック(Estrogenics)、エタクリン酸、エタノールアミン、エタノール、ヨード化ケシ油エチルエステル(Ethiodized oil)、エチドロン酸、エトミデート、ファモチジン、フェノルドパム、フェンタニル、フルマゼニル、フルオレセイン、フルフェナジン、葉酸、フォメピゾール、ホミビルセン、フォンダパリヌクス、ホスカルネット、ホスフェニトイン、フロセミド、ガドテリドール、ガドベルセタミド、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、グルカゴン、グルコース、グリシン、グリコピロレート、ゴナドレリン、ゴナドトロピン絨毛性、ヘモフィルスB型多糖、ヘミン、ハーバル(Herbals)、ヒスタミン、ヒドララジン、ヒドロコルチゾン、ヒドロモルホン、ヒドロキソコバラミン、ヒドロキシジン、ヒヨスチアミン、イブチリド、イミグルセラーゼ、インジゴカルミン、インドメタシン、ヨウ化物、イオプロミド、イオタラム酸、イオキサグル酸、イオキシラン、イソニアジド、イソプロテレノール、日本脳炎ワクチン、カナマイシン、ケタミン、ラベタロール、レピルジン、レボブピバカイン、レボチロキシン、リンコマイシン、リオチロニン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、マンガホジピール、マンストール(Manthtols)、髄膜炎菌多糖体ワクチン、メペリジン、メピバカイン、メソリダジン、メタラミノール、メサドン、メトカルバモール、メトヘキシタール、メチルドーペート(Methyldopate)、メチルエルゴノビン、メトクロプラミド、メトプロロール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ミバクリウム、モルルイック酸(Morrhuic acids)、モキシフロキサシン、ムロモナブ−CD3、ミコフェノール酸モフェチル、ナフシリン、ナルブフィン、ナルメフェン、ナロキソン、ネオスチグミン、ナイアシンアミド、ニカルジピン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ノルエピネフリン、オルフェナドリン、オキサシリン、オキシモルフォン、オキシテトラサイクリン、オキシトシン、パンクロニウム、パンテノール、パントテン酸、パパベリン、ペグインターフェロンアルファ−2A、ペニシリンG、ペンタミジン、ペンタゾシン、ペントバルビタール、パーフルトレン、ペルフェナジン、フェノバルビタール、フェントラミン、フェニレフリン、フェニトイン、フィゾスチグミン、フィトナジオン、ポリミキシン、プラリドキシム、プリロカイン、プロカインアミド、プロカイン、プロクロルペラジン、プロゲステロン、プロプラノロール、水酸化ピリドスチグミン、ピリドキシン、キニジン、キヌプリスチン、狂犬病免疫グロブリン、狂犬病ワクチン、ラニチジン、レミフェンタニル、リボフラビン、リファンピン、ロピバカイン、サマリウム、スコポラミン、セレン、セルモレリン、シンカリド、ソマトレム、スペクチノマイシン、ストレプトキナーゼ、ストレプトマイシン、スクシニルコリン、スフェンタニル、スルファメトキサゾール、タクロリムス、テルブタリン、テリパラチド、テストステロン、テタヌス抗毒素、テトラカイン、硫酸テトラデシル、テオフィリン、チアミン、チエチルペラジン、チオペンタール、甲状腺刺激ホルモン、チンザパリン、チロフィバン、トブラマイシン、トラゾリン、トルブタミド、トルセミド、トラネキサム酸、トレプロスチニル、トリフルオペラジン、トリメトベンズアミド、トリメトプリム、トロメタミン、ツベルクリン、腸チフスワクチン、ウロフォリトロピン、ウロキナーゼ、バルプロ酸、バソプレシン、ベクロニウム、ベラパミル、ボリコナゾール、ワーファリン、黄熱ワクチン、ジドブジン、亜鉛、塩酸ジプラシドン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アザセリン、6−アザウリジン、カルジノフィリン(Carzinophilins)、クロモマイシン、デノプテリン(Denopterins)、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、エノシタビン、フロクスウリジン、オリボマイシン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プテロプテリン(Pteropterins)、テガフール、ツベルシジン、アルテプラーゼ、アルシツモマブ、ベバシズマブ、ボツリヌス毒素A型、ボツリヌス毒素B型、カプロマブペンデチド、ダクリズマブ、ドルナーゼアルファ、ドロトレコギンアルファ、イムシロマブペンテテート、ヨウ素−131、抗生物質剤;血管新生阻害剤;抗白内障および抗糖尿病性網膜症物質;炭酸脱水酵素阻害剤;散瞳薬;光線力学的療法剤;プロスタグランジン類似体;増殖因子;抗新生物薬;代謝拮抗剤;抗ウイルス薬;抗アメーバ薬および抗原虫薬;抗結核および抗ハンセン病剤;抗毒素およびアンチベニン(antivenin);抗血友病因子、抗インヒビター血液凝固複合体、アンチトロンビンIII、血液凝固因子V、血液凝固因子IX、血漿タンパク質画分、フォンヴィルブランド因子;抗血小板薬、コロニー刺激因子(CSF);赤血球新生刺激物質;止血剤およびアルブミン;免疫グロブリン;トロンビン阻害剤;抗凝固剤;アルクロメタゾン、アルゲストン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコルト(fluazacorts)、フルクロロニド(flucloronides)、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロン、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、フルチカゾン、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロベタゾール、ハロメタゾン、ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、エタボン酸ロテプレドノール、マジプレドン(mazipredones)、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバール(prednivals)、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトールおよびトリアムシノロンの中から選択されるステロイド性抗炎症薬;ドコサノール(Docosanols)、プロスタグランジン、プロスタグランジン類似体、抗プロスタグランジンおよびプロスタグラン
ジン前駆体;縮瞳薬、コリン作動薬および抗コリンエステラーゼ;ならびに抗アレルギー物質が挙げられる。

組成物および修飾PH20ポリペプチドは、PH20ポリペプチドまたは治療上活性な薬剤によって普通治療される任意の状態を治療するために使用してもよい。これらとして、例えば、ヒアルロナンが、例えば、ヒアルロナンの蓄積または過剰産生によって、役割を果たすか、または、疾患の病因論と関連している状態が挙げられる。したがって、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドまたは組成物のいずれかを投与することによってヒアルロナン関連疾患または状態を治療するための組成物および修飾PH20ポリペプチドの方法、使用が提供される。ヒアルロナン関連疾患および状態として、例えば、炎症性疾患および腫瘍または卵巣癌、上皮内癌(in situ carcinoma)(ISC)、扁平上皮癌(SCC)、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌および結腸癌などの、末期癌、転移性癌および未分化癌を含めた癌が挙げられる。PH20ポリペプチドは、このような治療の半減期の増大を示すよう修飾され得る。例えば、PH20ポリペプチドは、このような治療のために、PEG部分などのポリマーを用いて修飾され得る。

また、対象に本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドまたは組成物のいずれかを投与することおよび治療薬を投与することによって、対象への治療薬のデリバリーを増大する方法が提供される。治療薬は、同一組成物中で投与されても、別個に投与されてもよく、PH20ポリペプチド(複数可)の投与の前または後に、同時に、または断続的に(intermittently with)投与されてもよい。投与は、治療薬の投与と同時に、断続的にまたはその後になど、静脈内および皮下投与を含めた任意の経路を含む。治療薬は、本明細書において上記、他の場所に記載されたものおよび/または当技術分野で公知のもののいずれかを含む。

また、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドまたは組成物の投与によって、過剰のグリコサミノグリカンを治療するため;腫瘍を治療するため;脳においてグリコサミノグリカン蓄積を治療するため;心血管障害を治療するため;眼部障害を治療するため;肺の疾患を治療するため;固形腫瘍への化学療法薬の浸透を増大するため;セルライトを治療するため;増殖性障害を治療するため;または薬物およびその他の治療薬のバイオアベイラビリティを高めるための方法が提供される。

また、ヒアルロナン関連疾患または障害の治療において使用するため;対象への治療薬のデリバリーにおいて使用するため;過剰のグリコサミノグリカンを治療するため;腫瘍を治療するため;脳においてグリコサミノグリカン蓄積を治療するため;心血管障害を治療するため;眼部障害を治療するため;肺の疾患を治療するため;固形腫瘍への化学療法薬の浸透を増大するため;セルライトを治療するため;増殖性障害を治療するため;または薬物およびその他の治療薬のバイオアベイラビリティを高めるため;およびPH20ポリペプチドを含有する組成物の任意のその他の使用のための医薬組成物が提供される。

変性条件下で安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための方法であって、a)変性剤を含有する組成物中および/または変性条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、b)変性剤または条件の不在を除いてa)と同一組成物中および/または同一条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、c)b)における活性の少なくとも5%であるa)における活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定する工程とを含む方法が本明細書において提供される。このような例では、活性は、ヒアルロニダーゼ活性である。いくつかの方法の例では、a)における活性が、b)における活性の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上である場合に、修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択または同定され、例えば、a)における活性が、b)における活性の少なくとも40%またはそれ以上である場合に、修飾ヒアルロナン分解酵素が選択または同定される。方法はまた、d)a)における修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を、同一条件下で試験された非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性に対して比較する工程と、e)非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して少なくとも120%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%またはそれ以上のヒアルロニダーゼ活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択する工程とを含み得る。

また、変性条件下で増大した安定性などの安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための方法であって、a)変性剤を含有する組成物中および/または変性条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、b)a)と同一の変性剤を含有する組成物中および/または同一の変性条件下で、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験し、それによって活性がa)と同一の条件下で試験される工程と、c)非修飾ヒアルロナン分解酵素よりも大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定し、それによって、変性条件下で増大した安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択する工程とを含む方法が、本明細書において提供される。このような例では、活性は、ヒアルロニダーゼ活性であり得る。方法の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、活性が、非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較される活性の少なくとも120%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%またはそれ以上である場合に選択または同定される。このような例では、方法はまた、d)変性剤を含有する組成物中および/または変性条件下で、選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、e)変性剤または条件がないことを除いてd)と同一組成物中および/または同一条件下で同一の選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素の活性を試験する工程と、f)e)における活性の少なくとも5%であるd)において活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定する工程のさらなる工程を含み得る。このような例では、活性は、ヒアルロニダーゼ活性である。いくつかの方法の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、d)における活性が、e)における活性の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上である場合に選択または同定され、例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、d)における活性が、e)における活性の少なくとも40%またはそれ以上である場合に選択または同定される。

修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、変性剤または状態は、温度、撹拌、無塩もしくは低塩または賦形剤の存在によって引き起こされる。例えば、変性剤または条件は、30℃〜42℃または約30℃〜42℃である、例えば、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃もしくは42℃より高いまたは約30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃もしくは42℃より高い高温によって引き起こされる。その他の例では、変性剤または条件は、塩の不在または100mM未満の低塩、例えば、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM未満の低塩である。さらなる例では、変性剤または条件は、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤および甘味料の中から選択される変性性賦形剤である。

修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれかの特定の例では、変性剤または条件は、防腐剤(複数可)、例えば、フェノール系防腐剤(複数可)である。フェノール系防腐剤(複数可)は、フェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールまたはパラベンであり得る。例えば、変性剤または条件は、フェノールおよび/またはm−クレゾールである防腐剤(複数可)である。このような例では、質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)としての組成物中のフェノール系防腐剤の総量は、両端を含めて0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%または約0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%である。

修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、a)および/またはb)におけるヒアルロナン分解酵素組成物の活性の試験に先立って、ヒアルロナン分解酵素は、所定の時間の間変性条件または変性剤に曝露される。所定の時間は、進化または選択されている特定のヒアルロナン分解酵素、特定の変性条件または変性剤、変性条件または変性剤の量または程度、ヒアルロナン分解酵素およびその他の同様の因子の適用または使用に応じてユーザーによって選択される期間である。例えば、所定の時間は、1分〜1カ月、1分〜3週間、1分〜2週間、1分〜1週間、1分〜24時間、1分〜12時間、30分〜6時間または1時間〜4時間または約1分〜1カ月、1分〜3週間、1分〜2週間、1分〜1週間、1分〜24時間、1分〜12時間、30分〜6時間または1時間〜4時間、例えば、少なくともまたはおよそ少なくとも30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、2週間または1カ月であり得る。

修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、修飾ヒアルロナン分解酵素は、非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して、アミノ酸のアミノ酸置換、挿入または欠失を含有するものである。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン分解酵素の非修飾形態と比較して単一アミノ酸置換または2、3、4、5、6、7、8、9またはそれ以上のアミノ酸置換などのアミノ酸置換を含有する。本方法の特定の態様では、変性条件下で増大した安定性などの安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を進化させるまたは同定するまたは選択するために、修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物がスクリーニングされる。したがって、本明細書における方法の例では、複数の修飾ヒアルロナン分解酵素が、a)および/またはb)において試験される。このような例では、複数の修飾ヒアルロナン分解酵素が、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾されて、修飾ヒアルロナン分解酵素の収集物を作製し、それによって、収集物中の各修飾タンパク質は、a)および/またはb)の各々において試験される。収集物またはライブラリーでは、各修飾ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン分解酵素の非修飾形態と比較して単一のアミノ酸置換を含有し、その結果、複数の修飾酵素は、各修飾位置のアミノ酸が、その位置の元のアミノ酸以外の最大1〜19種のその他のアミノ酸によって置換されるようなものであり、それによって、各修飾ヒアルロナン分解酵素は、種々のアミノ酸置換を含有し、ヒアルロナン分解酵素またはその選択され他一部の長さに沿ってどのアミノ酸も置換される。

本明細書において提供された方法のいずれかにおいて、修飾ヒアルロナン分解酵素は、アミノ酸(複数可)の挿入、欠失または置換によって非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾されている。非修飾ヒアルロナン分解酵素は、コンドロイチナーゼであり得るか、またはヒアルロニダーゼであり得る。本明細書における例では、非修飾ヒアルロニダーゼは、PH20ヒアルロニダーゼまたはC末端グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー結合部位もしくはGPIアンカー結合部位の一部を欠くその切断型であり、それによって、切断形態は、ヒアルロニダーゼ活性を示す。PH20ヒアルロニダーゼは、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ラット、キツネ、マウスまたはモルモットPH20であり得る。特定の例では、PH20ヒアルロニダーゼは、ヒトPH20またはそのC末端切断形態である。例えば、非修飾ヒアルロナン分解酵素は、配列番号3、7、10、12、14、24、32〜66、69、72、857、859、861、870のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号3、7、10、12、14、24、32〜66、69、72、857、859、861、870のいずれかに対して少なくとも80%の配列同一性である、例えば、配列番号3、7、10、12、14、24、32〜66、69、72、857、859、861もしくは870のいずれかに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性であるアミノ酸の配列を有するものである。特定の例では、非修飾ヒアルロナン分解酵素は、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに対して少なくとも85%の配列同一性を示すアミノ酸の配列、例えば、配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに対して少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するPH20ヒアルロニダーゼである。

安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定または選択するための本明細書において提供された方法のいずれにおいても、方法は、インビトロ(in vitro)で実施される。また、反復性であり、それによって方法の工程が複数回反復される任意の方法も提供され、各反復では、選択された修飾ヒアルロナン分解酵素のさらなる修飾ヒアルロナン分解酵素が作製および試験され、それによって、修飾ヒアルロナン分解酵素は、変性条件下で増大した安定性を示すように進化する。また、本明細書において提供される方法のいずれかによって同定された修飾ヒアルロナン分解酵素が本明細書において提供される。

図1は、全長ヒトPH20(配列番号7に示される)およびその可溶性C末端切断変異体のアミノ酸配列を表す。全長PH20の例示的C末端切断変異体のC末端アミノ酸残基は、太字で示される。全長PH20の例示的C末端切断変異体の完全アミノ酸配列も、配列番号3および32〜66に提供される。完全配列が、配列番号3に示されている、例示的可溶性PH20のC末端アミノ酸残基も下線によって示されている。アミノ酸置換の例示的な、制限するものではない位置は、強調することによって示されている。対応する位置は、対象とする配列の、配列番号3、7または32〜66のいずれかとの、特に、配列番号3とのアラインメントによって同定され得る。 図2は、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、その他のPH20ポリペプチドとの例示的アラインメントを表す。「*」は、アラインされた残基が同一であることを意味し、「:」は、アラインされた残基が同一ではないが、類似しており、アラインされた位置に保存的アミノ酸残基を含有することを意味し、「.」は、アラインされた残基が類似しており、アラインされた位置に半保存的アミノ酸残基を含有することを意味する。アミノ酸置換の例示的な、制限するものではない対応する位置は、強調することによって示されている。例えば、図2Aは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号10に示されるチンパンジーPH20とのアラインメントを表す。 図2Bは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号12に示されるアカゲザルPH20とのアラインメントを表す。 図2Cは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号14に示されるカニクイザルPH20とのアラインメントを表す。 図2Dは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号16に示されるウシPH20とのアラインメントを表す。 図2Eは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号20に示されるマウスPH20とのアラインメントを表す。 図2Fは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号22に示されるラットPH20とのアラインメントを表す。 図2Gは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号24に示されるウサギPH20とのアラインメントを表す。 図2Hは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号29に示されるモルモットPH20とのアラインメントを表す。 図2Iは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号31に示されるキツネPH20とのアラインメントを表す。 図2Jは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号857に示されるテナガザルPH20とのアラインメントを表す。 図2Kは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号859に示されるマーモセットPH20とのアラインメントを表す。 図2Lは、配列番号3に示されるヒト可溶性PH20の、配列番号861に示されるオランウータンPH20とのアラインメントを表す。

概要
A.定義
B.PH20ヒアルロニダーゼ
1.構造
2.機能
3.可溶性PH20ポリペプチド
C.修飾PH20ポリペプチド
1.活性突然変異体
a.増大した活性
b.増大した安定性
i.フェノール親和性(Phenophiles)
ii.好熱性
iii.塩の不在
2.不活性突然変異体
3.さらなる修飾
a.低減された免疫原性
b.ポリマーとのコンジュゲーション
D.変更された特性または活性を有する修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するための方法
1.ヒアルロナン分解酵素および修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリー
2.所望の活性または特性についてのスクリーニングまたは試験
3.選択または同定
4.反復性方法
E.修飾ポリペプチドおよびコードする核酸分子の産生
1.PH20ポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
2.突然変異体または修飾核酸およびコードするポリペプチドの作製
3.ベクターおよび細胞
4.発現
a.原核細胞
b.酵母細胞
c.昆虫および昆虫細胞
d.哺乳類発現
e.植物および植物細胞
5.精製
6.ペグ化によるポリペプチドの修飾
F.医薬組成物および製剤、投与量および投与
1.製剤(液体、注射用、溶液およびエマルジョン)
a.凍結乾燥した
b.例示的製剤
i.NaCl
ii.pHおよびバッファー
iii.防腐剤
iv.安定剤
2. 投与のその他の経路のための組成物
3.投与量および投与
4.例示的PH20−インスリン共製剤(Co−Formulation)
5.パッケージング、製造品およびキット
G.ヒアルロニダーゼ活性を評価する方法
1.ヒアルロニダーゼ活性
2.溶解度
3.純度、結晶化または凝集
4.薬動力学/薬物動態学
H.治療および併用療法の方法
1.治療薬を送達する方法
インスリンのデリバリー
2.ヒアルロナン関連疾患および状態を治療する方法
3.その他の使用
4.避妊
I.実施例

A.定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明(複数可)が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、GenBank配列、データベース、ウェブサイトおよび本明細書において全開示内容を通じて参照されるその他の公開された材料は、別に記載されない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書における用語について複数の定義がある場合には、この節におけるものが通用する。URLまたはその他のこのような識別子もしくはアドレスが言及される場合には、このような識別子は、変更する場合があり、インターネットでの特定の情報は行き来し得るが、同等の情報は、インターネットを検索することによって見出すことができると理解される。それに対する言及は、このような情報のアベイラビリティーおよび公的な普及を証明する。

本明細書において、ヒアルロナン分解酵素とは、ヒアルロナンポリマー(ヒアルロン酸またはHAとも呼ばれる)をより小さい分子量の断片に切断するのを触媒する酵素を指す。例示的ヒアルロナン分解酵素として、ヒアルロニダーゼならびにヒアルロナンを脱重合する能力を有する特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼがある。ヒアルロナン分解酵素である例示的コンドロイチナーゼとして、それだけには限らないが、コンドロイチンABCリアーゼ(コンドロイチナーゼABCとしても知られる)、コンドロイチンACリアーゼ(コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる)およびコンドロイチンCリアーゼが挙げられる。コンドロイチンABCリアーゼは、2種の酵素、コンドロイチン硫酸−ABCエンドリアーゼ(EC4.2.2.20)およびコンドロイチン硫酸−ABCエキソリアーゼ(EC4.2.2.21)を含有する。例示的コンドロイチン硫酸−ABCエンドリアーゼおよびコンドロイチン硫酸−ABCエキソリアーゼとして、それだけには限らないが、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)およびペドバクター・ヘパリヌス(Pedobacter heparinus)に由来するものが挙げられる(プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)コンドロイチン硫酸−ABCエンドリアーゼは、配列番号922に示されている;Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)。細菌由来の例示的コンドロイチナーゼAC酵素として、それだけには限らないが、配列番号923に示されるペドバクター・ヘパリヌス(Pedobacter heparinus)、配列番号924に示されるビクチバリス・バデンシス(Victivallis vadensis)およびアースロバクター・オーレセンス(Arthrobacter aurescens)(Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)に由来するものが挙げられる。細菌由来の例示的コンドロイチナーゼC酵素として、それだけには限らないが、ストレプトコッカスおよびフラボバクテリウムに由来するもの(Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)が挙げられる。

本明細書において、ヒアルロニダーゼとは、ヒアルロナンを分解する酵素のクラスを指す。ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、細菌ヒアルロニダーゼ(EC4.2.2.1またはEC4.2.99.1)、ヒル、その他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ(EC3.2.1.36)および哺乳類型ヒアルロニダーゼ(EC3.2.1.35)が挙げられる。ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、ネズミ、イヌ、ネコ、ウサギ、鳥類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、細菌およびヒル、その他の寄生虫および甲殻類由来の任意のものを含めた非ヒト起源のいずれかのものが挙げられる。例示的ヒトヒアルロニダーゼとして、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4およびPH20が挙げられる。また、ヒアルロニダーゼの中には、ヒツジおよびウシPH20を含めた可溶性ヒアルロニダーゼおよび可溶性PH20も含まれる。例示的ヒアルロニダーゼとして、配列番号6、7〜31、69、70、71、72、856〜861、869〜921に示されるいずれかのもの、その成熟した形態(シグナル配列を欠く)またはその対立遺伝子もしくは種変異体が挙げられる。ヒアルロニダーゼはまた、可溶性であるC末端切断変異体を含めた、ヒアルロニダーゼ活性を示すその切断形態も含む。

本明細書において、PH20とは、精子中に生じ、中性で活性であるヒアルロニダーゼの種類を指す。PH−20は、精子表面に、リソソーム由来の先体中に生じ、ここでは、内先体膜と結合している。PH20として、それだけには限らないが、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、ネズミ、ウシ、ヒツジ、モルモット、ウサギおよびラット起源を含めた任意の起源のものが挙げられる。前駆体および成熟形態を含めた例示的PH20ポリペプチドとして、ヒト(配列番号6および7)、チンパンジー(配列番号8、9、10、869および870)、アカゲザル(配列番号11および12)、カニクイザル(配列番号13および14)、ウシ(例えば、配列番号15〜18)、マウス(配列番号19および20)、ラット(配列番号21および22)、ウサギ(配列番号23および24)、ヒツジ(配列番号25〜27)、モルモット(配列番号28および29)、キツネ(配列番号30および31)、テナガザル(配列番号856および857)、マーモセット(配列番号858および859)およびオランウータン(配列番号860および861)に由来するものが挙げられる。PH20への言及は、前駆体PH20ポリペプチドおよび成熟PH20ポリペプチド(シグナル配列が除去されているものなど)、活性を有するその切断形態を含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライシング変異体によってコードされる変異体および配列番号7に示される前駆体ポリペプチドに対して少なくとも40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含めたその他の変異体またはその成熟形態を含む。PH20ポリペプチドはまた、化学的修飾または翻訳後修飾を含有するものおよび化学的修飾または翻訳後修飾を含有しないものも含む。このような修飾として、それだけには限らないが、ペグ化、アルブミン化(albumination)、グリコシル化、ファルニシル化(farnysylation)、カルボキシル化、水酸化、リン酸化および当技術分野で公知のその他のペプチド修飾が挙げられる。市販のウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼの例として、ビトラーゼ(Vitrase)(登録商標)ヒアルロニダーゼ(ヒツジヒアルロニダーゼ)およびアンファダーゼ(Amphadase)(登録商標)ヒアルロニダーゼ(ウシヒアルロニダーゼ)が挙げられる。

本明細書において、可溶性PH20とは、生理学的条件下でのその溶解性を特徴とするポリペプチドを指す。一般に、可溶性PH20は、グリコホスファチジルアンカー(GPI)結合配列のすべてまたは一部を欠くか、そうでなければ、細胞膜に十分に固定しない。例えば、可溶性PH20は、グリコホスファチジルアンカー(GPI)結合配列のすべてまたは一部に対応する連続アミノ酸の配列を欠くPH20のC末端で切断された変異体であり得る。したがって、細胞からの発現の際に、可溶性PH20は、培地中に分泌される。可溶性PH20タンパク質は、例えば、37℃に加温したTriton X−114溶液の水相へ分配することによって区別され得る(Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7)。膜固定型、例えば、脂質固定型ヒアルロニダーゼは、洗浄剤が豊富な相に分配するが、ホスホリパーゼ−Cでの処理後に、洗浄剤が乏しい相または水相に分配する。可溶性PH20ヒアルロニダーゼの中には、ヒアルロニダーゼの膜への固定と関連している1つまたは複数の領域が除去または修飾されている膜固定型ヒアルロニダーゼが含まれ、これでは、可溶性形態は、ヒアルロニダーゼ活性を保持する。可溶性ヒアルロニダーゼは、組換え可溶性ヒアルロニダーゼおよび天然供給源、例えば、ヒツジまたはウシ由来の精巣抽出物に含有されるものまたはそれから精製されたものを含む。このような可溶性ヒアルロニダーゼの例示的なものとして、可溶性ヒトPH20(配列番号3または32〜66)が挙げられる。その他の可溶性ヒアルロニダーゼとして、ヒツジ(配列番号25〜27)およびウシ(配列番号16または18)PH20が挙げられる。

本明細書において、可溶性ヒトPH20(sHuPH20)は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー配列(C末端で切断されたPH20ポリペプチド)のすべてまたは一部を含むヒトPH20のC末端からのアミノ酸の連続配列を欠くヒトPH20ポリペプチドを含み、その結果、発現時に、ポリペプチドは、生理学的条件下で可溶性である。例えば、可溶性ヒトPH20ポリペプチドは、その前駆体形態で配列番号6として、またはシグナル配列を欠くその成熟形態でした配列番号7に示されるヒトPH20のC末端で切断されたポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体(例えば、配列番号68〜72のいずれかに示される)である。溶解度は、生理学的条件下での溶解性を実証する任意の適した方法によって評価され得る。このような方法の例示的なものとして、水相への分配を評価し、上記に記載されるTriton(登録商標)X−114アッセイがある。さらに、可溶性ヒトPH20ポリペプチドは、CHO−S細胞などのCHO細胞において産生される場合には、発現され、細胞培養培地中に分泌されるポリペプチドである。しかし、可溶性ヒトPH20ポリペプチドは、CHO細胞において産生されるものに限定されず、任意の細胞において、または組換え発現およびポリペプチド合成を含めた任意の方法によって産生され得る。CHO細胞における分泌への言及は、定義的なものである。したがって、ポリペプチドは、CHO細胞において発現および分泌され得、培地に可溶性であり、すなわち、Triton(登録商標)X−114を用いて抽出されると水相に分配する場合、そのように産生されるかどうかにかかわらず可溶性PH20ポリペプチドである。sHuPH20ポリペプチドの前駆体ポリペプチドは、異種または非異種(すなわち、天然)シグナル配列などのシグナル配列を含み得る。前駆体の例示的なものとして、アミノ酸位置1〜35の天然の35個のアミノ酸シグナル配列(例えば、配列番号6のアミノ酸1〜35を参照のこと)などのシグナル配列を含むものがある。

本明細書において、PH20ポリペプチドに関連して「天然の」または「野生型」とは、自然に、ヒトおよびその他の動物を含めた生物中に存在する対立遺伝子変異体を含めた、天然の、または天然に存在するPH20遺伝子によってコードされるPH20ポリペプチドを指す。野生型PH20への言及は、種に関係なく、任意の種の野生型PH20を包含するものとする。野生型PH20ポリペプチドの中には、コードされる前駆体ポリペプチド、その断片およびそのプロセシングされた形態、例えば、シグナルペプチドを欠く成熟形態、ならびにその任意の翻訳前または翻訳後プロセシングまたは修飾された形態が含まれる。また、天然PH20ポリペプチドの中に、それだけには限らないが、グリコシル化、カルボキシル化および/または水酸化によって修飾されるものを含めた翻訳後修飾されるものも含まれる。例示的野生型ヒトPH20のアミノ酸配列は、配列番号6および7に示されており、その成熟形態を含めた対立遺伝子変異体のものは、配列番号68〜72に示されている。その他の動物は、それだけには限らないが、配列番号8〜31、856〜861、869または870のいずれかに示される天然または野生型配列を含めた天然PH20を産生する。

本明細書において、修飾は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の修飾に関連しており、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。修飾はまた、翻訳後修飾または別の部分との直接的または間接的なコンジュゲーションまたは連結によって起こり得る分子へのその他の変更も含み得る。ポリペプチドを修飾する方法は、組換えDNA方法論を使用することによってなど、当業者には日常的なものである。

本明細書において、「修飾ヒアルロナン分解酵素」とは、参照または非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾を含有するヒアルロナン分解酵素を指す。修飾は、1個または複数のアミノ酸残基のアミノ酸置換(replacement)(置換(substitution))、挿入(付加)または欠失であり得る。アミノ酸残基は、天然または非天然アミノ酸であり得る。いくつかの場合には、修飾は、翻訳後修飾であり得る。修飾ヒアルロナン分解酵素は、得られる修飾ヒアルロナン分解酵素が、ヒアルロニダーゼ活性を示す限り、参照または非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して最大150個のアミノ酸の相違を有し得る。通常、修飾ヒアルロナン分解酵素は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49および50のアミノ酸修飾を含有する。

本明細書において、非修飾ヒアルロナン分解酵素とは、本明細書において提供されるような修飾のために選択される出発ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する、野生型形態であり得る。さらに、出発ポリペプチドは、天然の野生型アイソフォームとは異なるが、それにもかかわらず、本明細書において産生されるその後に修飾されるポリペプチドに対して、出発非修飾ポリペプチドと本明細書において呼ばれるように変更または突然変異されてもよい。したがって、非修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性の所望の増大または減少を有するよう修飾されている当技術分野で公知の既存のタンパク質は、出発非修飾ポリペプチドとして選択および使用され得る。例えば、グリコシル化を変更するためのアミノ酸残基(単数または複数)の変更など、その天然形態から、1つまたは複数の単一アミノ酸変更によって修飾されており、所望の特性の増大または減少のいずれかを有するタンパク質が修飾のために選択され得、したがって、本明細書において、さらなる修飾のために非修飾と呼ばれる。非修飾ヒアルロナン分解酵素として、非ヒト哺乳類および細菌由来のヒアルロナン分解酵素を含めたヒトおよび非ヒトヒアルロナン分解酵素が挙げられる。例示的非修飾ヒアルロナン分解酵素として、ヒアルロニダーゼ活性を示す配列番号2、3、6、7〜66、68〜72、856〜861、869〜924に示されたいずれかのものまたはその成熟した、C末端で切断された形態または配列番号2、3、6、7〜66、68〜72、856〜861、869〜924のいずれかに対して少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を示すヒアルロナン分解酵素がある。非修飾ヒアルロナン分解酵素は、一般に、修飾ヒアルロナン分解酵素のアミノ酸置換(複数可)などの修飾(複数可)を含有しないものであると理解される。

本明細書において、「修飾PH20ポリペプチド」または「変異体PH20ポリペプチド」とは、参照非修飾PH20ポリペプチドと比較して、そのアミノ酸の配列中に、本明細書において記載されたような少なくとも1つのアミノ酸置換などの少なくとも1つのアミノ酸修飾を含有するPH20ポリペプチドを指す。修飾PH20ポリペプチドは、得られる修飾PH20ポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を示す限り、最大150のアミノ酸置換を有し得る。通常、修飾PH20ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50のアミノ酸置換を含有する。修飾PH20ポリペプチドはまた、本明細書において記載されたような少なくとも1つのアミノ酸置換に加えて、任意の1つまたは複数のその他の修飾を含み得ると理解される。

本明細書において、非修飾PH20ポリペプチドとは、本明細書において提供されるような修飾のために選択された出発PH20ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に生じる、野生型形態であり得る。さらに、出発ポリペプチドは、天然の野生型アイソフォームとは異なるが、それにもかかわらず、本明細書において産生されるその後に修飾されるポリペプチドに対して、出発非修飾ポリペプチドと本明細書において呼ばれるように変更または突然変異されてもよい。したがって、非修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性の所望の増大または減少を有するよう修飾されている当技術分野で公知の既存のタンパク質は、出発非修飾ポリペプチドとして選択および使用され得る。例えば、グリコシル化を変更するためのアミノ酸残基(単数または複数)の変更など、その天然形態から、1つまたは複数の単一アミノ酸変更によって修飾されており、所望の特性の増大または減少のいずれかを有するタンパク質が修飾のために選択され得、したがって、本明細書において、さらなる修飾のために非修飾と呼ばれる。例示的非修飾PH20ポリペプチドとして、ヒトPH20ポリペプチドまたはその対立遺伝子もしくは種変異体または成熟および前駆体ポリペプチドを含めたその他の変異体がある。例えば、例示的参照PH20ポリペプチドとして、配列番号7、69または72に示される成熟全長PH20ポリペプチドまたは配列番号3および32〜66のいずれかに示されるものなどのそのC末端で切断された形態または配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに対して少なくとも68%、69%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を示すPH20ポリペプチドがある。参照PH20ポリペプチドはまた、配列番号2、6、68、70、71のいずれかに示される対応する前駆体形態またはその他の前駆体形態または配列番号2、6、68、70、71のいずれかに対して少なくとも68%、69%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を示すPH20ポリペプチドを含み得る。非修飾ヒアルロナン分解酵素は、一般に、修飾ヒアルロナン分解酵素のアミノ酸置換(複数可)などの修飾(複数可)を含有しないものであると理解される。

本明細書において、N結合型部分とは、ポリペプチドの翻訳後修飾によってグリコシル化され得るポリペプチドのアスパラギン(N)アミノ酸残基を指す。ヒトPH20の例示的N結合型部分として、配列番号3または7に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸N47、N131、N200、N219、N333、N358およびN365(配列番号6に示されるヒトPH20のアミノ酸残基N82、N166、N235、N254、N368、N393およびN490に対応する)が挙げられる。

本明細書において、N−グリコシル化ポリペプチドとは、少なくとも3個のN結合型アミノ酸残基、例えば、配列番号3または7のアミノ酸残基N200、N333およびN358に対応するN結合型部分のオリゴ糖結合を含有するPH20ポリペプチドを指す。N−グリコシル化ポリペプチドは、N結合型部分のうち3、4、5および最大すべてが、オリゴ糖と連結しているポリペプチドを含み得る。N結合型オリゴ糖は、オリゴマンノース、複合体、ハイブリッドまたは硫酸化オリゴ糖またはその他のオリゴ糖および単糖を含み得る。

本明細書において、N−部分グリコシル化ポリペプチドとは、少なくとも3つのN結合型部分と結合しているN−アセチルグルコサミングリカンを最小に含有するポリペプチドを指す。部分グリコシル化ポリペプチドは、ポリペプチドのEndoH、EndoF1、EndoF2および/またはEndoF3を用いる処理によって形成されるものを含めた、単糖、オリゴ糖および分岐糖形態を含めた種々のグリカン形態を含み得る。

本明細書において、「条件」とは、タンパク質または薬剤の活性または特性に影響を及ぼし得る任意のパラメータを指す。本明細書における目的上、条件は、一般に、活性薬剤(例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼ)以外の製剤中の賦形剤、担体またはその他の成分の量を含めた存在、温度、時間(例えば、保存または曝露の時間)、保存容器、保存の特性(例えば、撹拌)および/または曝露もしくは使用と関連するその他の条件を指す。

本明細書において、タンパク質に関連して「変性」または「変性する」またはその文法上の変動は、タンパク質の特性または活性が、低減または排除されるようなタンパク質における生化学的変化を指す。生化学的変化は、フォールディングされないためのタンパク質の三次構造における変化であり得る。特性または活性は、完全に無効にされ得るか、または10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくはそれ以上低減され得る。

本明細書において、特性とは、三次元構造、pI、半減期、コンホメーションおよびその他のこのような物理的特徴などの物理的または構造的特性を指す。例えば、特性の変化は、タンパク質の溶解度、凝集または結晶化として現れ得る。

本明細書において、活性とは、全長(完全)タンパク質と関連するポリペプチドまたはその一部の機能的活性(単数または複数)を指す。機能的活性として、それだけには限らないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体と結合するか、それとの結合についてポリペプチドと競合する能力)、免疫原性、多量体を形成する能力およびポリペプチドの受容体またはリガンドと特異的に結合する能力を指す。

本明細書において、ヒアルロニダーゼ活性とは、ヒアルロン酸の切断を酵素によって触媒する能力を指す。ヒアルロニダーゼの米国薬局方(USP)XXIIアッセイによって、酵素を37℃で30分間HAと反応させた後に残存する高分子量ヒアルロン酸またはヒアルロナン(HA)基質の量を測定することによって、ヒアルロニダーゼ活性を間接的に決定する(USP XXII−NF XVII(1990年)644〜645頁 United States Pharmacopeia Convention、Inc、Rockville、MD)。任意のヒアルロニダーゼの単位での相対活性を確認するために、アッセイにおいて参照標準溶液を使用してもよい。修飾PH20ポリペプチドを含めたPH20などのヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性を調べるためのインビトロアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。例示的アッセイとして、切断されていないヒアルロン酸が血清アルブミンと結合する場合に形成される不溶性沈殿物を検出することによって、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の切断を間接的に測定する本明細書に記載されたマイクロ濁度アッセイが挙げられる。例えば、標準曲線を作製して、試験されているヒアルロニダーゼの単位での活性を決定するために参照標準を使用してもよい。

本明細書において、中性活性とは、pH6.0からpH7.8の間または約pH6.0からpH7.8の間などの中性pHでヒアルロン酸の切断を酵素によって触媒するPH20ポリペプチドの能力を指す。

本明細書において、修飾PH20ヒアルロニダーゼに関連して「増大した活性」とは、同一条件下で試験された場合に、修飾PH20ヒアルロニダーゼが、アミノ酸置換(複数可)を含有しない非修飾PH20ヒアルロニダーゼと比較して大きなヒアルロニダーゼ活性を示すことを意味する。例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、非修飾または参照PH20ヒアルロニダーゼの活性の少なくともまたはおよそ少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%もしくはそれ以上を示す。

本明細書において、タンパク質に関連して「溶解度」とは、水溶液中で均質である、それによって、タンパク質分子が拡散し、自発的に沈降しないタンパク質を指す。したがって、可溶性タンパク質溶液は、タンパク質を含有する溶液中に、粒子が容易に濾過され得ないような可視の、または別個の粒子がないものである。一般に、タンパク質は、溶液中に可視の、または別個の粒子がない場合には可溶性である。例えば、タンパク質は、0.22μmの孔サイズを有するフィルターによって除去され得る粒子を含有しないか、またはわずかな粒子しか含有しない場合に可溶性である。

本明細書において、タンパク質に関連して、凝集または結晶化とは、タンパク質を含有する溶液中の、可視の、または別個の粒子の存在を指す。一般に、粒子の大きさは、10μmより大きい、例えば、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μmまたはそれ以上より大きい。凝集または結晶化は、溶解度の低下、タンパク質の変性の増大または共有結合の形成によって起こり得る。

本明細書において、「変性条件(denaturing condition)」または「変性条件(denaturation condition)」とは、タンパク質に曝露される場合に、一般に、タンパク質の三次または二次構造の喪失または部分的喪失の結果として、タンパク質の分解または変性に影響を与えるか、または影響を及ぼす任意の条件または薬剤を指す。変性条件は、活性の喪失または低減、溶解度の喪失または低減、凝集および/または結晶化などの効果をもたらし得る。変性条件は、タンパク質に対して完全に致命的であるものである必要はないが、それにもかかわらず、経時的なタンパク質の活性の低減につながるものである。したがって、条件は、その不在においてよりも条件の存在において、タンパク質の活性が、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上低減される場合に変性する。変性条件は、外部ストレスまたは物理的条件(例えば、撹拌、温度、保存時間、安定剤の不在)によるものである場合も、変性剤の存在による場合もある。例えば、変性条件は、熱、酸または化学変性剤によって引き起こされ得る。例示的変性条件として、それだけには限らないが、強酸または塩基の存在、濃無機塩、有機溶媒(例えば、アルコールまたはクロロホルム)、尿素、高または低pH(極端なpH)、高温(例えば、熱)、変性し得る賦形剤の存在(例えば、フェノール系防腐剤または洗浄剤)、およびそうでなければタンパク質の安定性に必要である分解防止剤(例えば、NaCl)が低いまたは実質的にないことが挙げられる。

本明細書において、「変性剤(denaturing agent)」または「変性剤(denaturant)」とは、変性を引き起こす任意の物質、分子または化合物を指す。例えば、変性剤として、強酸または塩基、濃無機塩、有機溶媒(例えば、アルコールまたはクロロホルム)、防腐剤、洗浄剤またはその他の賦形剤を挙げることができる。

本明細書において、「変性条件に対する耐性」とは、変性と関連しているか、それによって引き起こされるタンパク質の特性または活性の低減または排除の任意の量の減少を指す。例えば、変性は、結晶化または凝集の増大、溶解度の減少または活性の低下と関連しているか、それを引き起こす。したがって、変性に対する耐性とは、参照タンパク質(例えば、非修飾酵素)と比較して、変性条件に曝露された場合に、タンパク質が凝集または結晶化の減少、溶解度の増大または活性(例えば、ヒアルロニダーゼ活性)の増加を示すことを意味する。変性条件に対する耐性は、絶対的なものまたは永久的なものである必要はないが、変性条件において修飾ヒアルロナン分解酵素の変性は、非修飾酵素よりもゆっくりと起こり、その結果、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性または特性がより長く達成されるので達成され得る。例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼなどの修飾ヒアルロナン分解酵素は、例えば、非修飾ポリペプチドよりも変性条件または変性剤の存在下で、変性に対して1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、…20%、…30%、…40%、…50%、…60%、…、70%、…80%、…90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%より耐性を示す場合に、変性条件に対する耐性を示す。いくつかの例では、修飾ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドと比較して、変性に対して105%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、300%、400%、500%またはそれ以上増大した耐性を示す。

本明細書において、修飾PH20ヒアルロニダーゼの安定性とは、変性条件または変性剤によって引き起こされる変性に対する耐性を示すことを意味する。修飾PH20ポリペプチドは、変性条件(複数可)に対する曝露の前の元のまたは最初のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上など、変性条件または変性剤の存在下で幾分かの活性を保持する場合に安定性を示す。一般に、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、変性条件の不在下と比較して、変性条件下でヒアルロニダーゼ活性の少なくとも50%またはそれ以上を保持する場合に安定である。ヒアルロニダーゼ活性を評価するためのアッセイは、当業者に公知であり、本明細書に記載されている。酵素の安定性は、永久的または長期である必要ではないが、活性が望まれる期間現れると理解される。例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、1種または複数種の変性条件または変性剤に対する曝露の際、または曝露の期間(例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下)、少なくとも2時間、3時間、4時間、6時間、12時間、24時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、1カ月、6カ月または1年間活性を示す場合に安定である。例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、1種または複数種の変性条件または変性剤に対する曝露の際、または曝露の期間(例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下)、両端を含めて2℃〜8℃もしくは約2℃〜8℃の温度で少なくとも1カ月間または両端を含めて30℃〜42℃もしくは約30℃〜42℃の温度で少なくとも3日間活性を示す場合に安定である。

したがって、本明細書において提供された製剤または共製剤に関連して「安定な」または「安定性」とは、その中の修飾PH20ヒアルロニダーゼなどの修飾ヒアルロナン分解酵素が、その中での、1種または複数種の変性条件または変性剤に対する曝露の際に(例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下で)、両端を含めて2℃〜8℃もしくは約2℃〜8℃の温度で少なくとも1カ月間または両端を含めて30℃〜42℃もしくは約30℃〜42℃の温度で少なくとも3日間安定であるものを指す。

本明細書において、修飾PH20ヒアルロニダーゼに関連して「増大した安定性」とは、同一変性性または変性条件(複数可)の存在下で(例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下で)、修飾PH20ヒアルロニダーゼが、アミノ酸置換(複数可)を含有しない非修飾PH20ヒアルロニダーゼと比較してより大きなヒアルロニダーゼ活性を示すことを意味する。例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、変性性または変性条件(複数可)の存在下で(例えば、防腐剤などの変性性賦形剤の存在下で)非修飾または参照PH20ヒアルロニダーゼの活性の少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%もしくはそれ以上を示す場合に、増大した安定性を示す。

本明細書において、「高温」とは、室温または周囲温度より高い温度を指す。一般に、高温とは、30℃〜42℃などの少なくとも30℃、30℃より高いまたは約30℃であり、一般に、両端を含めて32℃〜37℃または35℃〜37℃である温度である。

本明細書において、室温とは、一般に、約18℃または18℃〜約32℃または32℃の範囲を指す。当業者ならば、室温は、位置および支配的な条件によって変わるということは理解されよう。例えば、室温は、イタリアまたはテキサスなどの温暖化した気候では高いものであり得る。

本明細書において、タンパク質は、「同一条件下で比較される」という記載は、タンパク質または薬剤の活性または特性に影響を及ぼし得る任意の1種または複数種の条件が、試験薬剤間で変わらないか、または実質的に変わらないように、異なるタンパク質が、同一にまたは実質的に同一に処理されることを意味する。例えば、修飾PH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性が、非修飾PH20ポリペプチドに対して比較される場合には、ポリペプチドの量または濃度;活性薬剤(例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼ)以外の製剤中の賦形剤、担体またはその他の成分の量を含めた存在;温度;保存時間;保存容器;保存の特性(例えば、撹拌)および/または曝露もしくは使用と関連するその他の条件などの任意の1種または複数種の条件が、比較されるポリペプチド間およびそれらの間で同一または実質的に同一である。

本明細書において、「所定の時間」とは、予め確立または決定された時間を指す。例えば、所定の時間は、タンパク質の所望の適用または使用に応じて、ヒアルロナン分解酵素の活性の所望の期間と関連している予め選択された時間であり得る。所定の時間は、数時間、数日、数カ月または数年であり得る。例えば、所定の時間は、少なくともおよそまたは約2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、1カ月、6カ月または1年またはそれ以上であり得る。

本明細書において、「保存」とは、製剤が、調製された時点で対象に直ちに投与されず、使用前に特定の条件(例えば、特定の温度、時間および/または形態(例えば、液体または凍結乾燥形態))下で一定期間維持されることを意味する。例えば、液体製剤は、冷蔵された(0℃〜10℃、例えば、2℃〜8℃)、室温(例えば、最大32℃の温度、例えば、18℃〜約32℃または32℃)または高温(例えば、30℃〜42℃、例えば、32℃〜37℃または35℃〜37℃)などの変更された温度下で、対象への投与の前に数日、数週間、数カ月または数年維持され得る。

本明細書において、「賦形剤」とは、活性薬剤の不在下で投与された場合に、活性薬剤の生物学的効果を提供しない活性薬剤の製剤中の化合物を指す。例示的賦形剤として、それだけには限らないが、塩、バッファー、安定剤、浸透圧調節因子、金属、ポリマー、界面活性物質、防腐剤、アミノ酸および糖が挙げられる。

本明細書において、分解防止剤とは、必要に応じて、修飾PH20ポリペプチドまたはその他の活性薬剤を、製剤が、取り扱い、保存または使用される際に曝露される変性条件などによる分解から保護するために製剤に添加される化合物を指す。したがって、タンパク質が、組成物中のその他の成分から分解するのを防ぐ薬剤が含まれる。このような薬剤の例示的なものとして、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩およびバッファー、界面活性物質、阻害剤または基質および本明細書において記載されたその他の薬剤がある。

本明細書において、抗菌有効性試験または防腐剤有効性試験(PET)は、製品中の防腐剤システムの有効性を実証する。製品は、制御された量の特定の生物とともに播種される。次いで、試験は、対照サンプル対試験サンプルで見られる微生物のレベルを28日間にわたって比較する。一般に、目標市場は、異なるPET必要条件を有する。例えば、米国薬局方(USP)および欧州薬局方(EP)のPET必要条件は異なる。異なる市場を含めた、抗菌有効性試験を実施するためのパラメータは、本明細書において記載されたように当業者には公知である。

本明細書において、防腐剤の抗菌的または抗菌上有効な量とは、保存または使用から導入され得るサンプル中の微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の量を指す。例えば、複数回用量容器については、防腐剤の抗菌的に有効な量が、個々の用量を反復して引き出すことから導入され得る微生物の増殖を阻害する。USPおよびEP(EPAおよびEPB)は、防腐剤有効性を決定し、ストリンジェンシーが異なる抗菌必要条件を有する。例えば、防腐剤の抗菌上有効な量は、抗菌防腐剤有効性試験(APET)において播種後7日で細菌生物の少なくとも1.0log10単位低減が起こるような量である。特定の例では、防腐剤の抗菌上有効な量は、播種後7日で細菌生物の少なくとも1.0log10単位低減が起こる、播種後14日で細菌生物の少なくとも3.0log10単位低減が起こる、播種後28日で細菌生物の少なくともさらなる増加は起こらない、および播種後7日で少なくとも真菌生物の増加は起こらないような量である。さらなる例では、防腐剤の抗菌上有効な量とは、播種後24時間で細菌生物の少なくとも1.0log10単位低減が起こる、播種後7日で細菌生物の少なくとも3.0log10単位低減が起こる、播種後28日で細菌生物のさらなる増加が起こらない、播種後14日で真菌生物の少なくとも1.0log10単位低減が起こる、および播種後28日で少なくとも真菌生物のさらなる増加が起こらないような量である。追加の例では、防腐剤の抗菌上有効な量とは、播種後6時間で細菌生物の少なくとも2.0log10単位低減が起こる、播種後24時間で細菌生物の少なくとも3.0log10単位低減が起こる、微生物播種菌液を伴う組成物の播種後28日で細菌生物の回復が起こらない、播種後7日で真菌生物の少なくとも2.0log10単位低減が起こる、および播種後28日で少なくとも真菌生物のさらなる増加が起こらないような量である。

本明細書において、「防腐剤」とは、分子またはタンパク質組成物に添加された場合に、組成物中での細菌または真菌増殖を含めた微生物の増殖を防ぐ、天然に存在するか、合成によってか、または組換えによって産生された物質を指す。

本明細書において、「フェノール系防腐剤」とは、ベンゼン環などの芳香族炭素環と結合している1つのヒドロキシル基を含有する防腐剤を指す。例示的フェノール系防腐剤として、それだけには限らないが、フェノール、m−クレゾール、p−ヒドロキシ安息香酸、メチルパラベン、エチルパラベンおよびプロピルパラベンが挙げられる。例えば、メタ−クレゾール(m−クレゾール)を含めたクレゾールは、フェノール分子のベンゼン環上に置換されたメチル基を有する。

本明細書において、「フェノール親和性(phenophile)」とは、抗菌的に有効な量の防腐剤(複数可)の存在下で安定性を示す、修飾PH20ポリペプチドなどのタンパク質を指す。用語「フェノール親和性(phenolphile)」は、本明細書において「フェノール親和性(phenophile)」と同義的に使用され得、同一の意味を有する。例えば、フェノール親和性(phenophile)またはフェノール親和性(phenolphile)である修飾PH20ポリペプチドは、通常、フェノール系防腐剤(複数可)を含有する同一変性条件(複数可)下で試験された場合に、アミノ酸置換(複数可)を含有しない非修飾PH20ヒアルロニダーゼと比較して増大した安定性を示す。例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、フェノール系防腐剤(複数可)の存在下で非修飾または参照PH20ヒアルロニダーゼの活性の少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%もしくはそれ以上を示す。

本明細書において、「好熱性」とは、30℃または約30℃よりも高い高温、例えば、30℃〜42℃、一般に、32℃〜37℃または35℃〜37℃下で安定性を示す修飾PH20ポリペプチドなどのタンパク質を指す。例えば、好熱性である修飾PH20ポリペプチドは、通常、同一高温変性条件(複数可)下で試験された場合に、アミノ酸置換(複数可)を含有しない非修飾PH20ヒアルロニダーゼと比較して増大した安定性を示す。例えば、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、高温下で非修飾または参照PH20ヒアルロニダーゼの活性の少なくとも少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%もしくはそれ以上を示す。

本明細書において、用語「洗浄剤」は、用語「界面活性物質」または「表面活性化剤」と同義的に使用される。界面活性物質は、通常、両親媒性である、すなわち、界面活性物質を、有機溶媒および水の両方において可溶性にする、疎水基(「テイル」)および親水基(「ヘッド」)の両方を含有する有機化合物である。界面活性物質は、そのヘッドにおける形式的な荷電基の存在によって分類され得る。非イオン性界面活性物質は、そのヘッドに荷電基がないのに対し、イオン性界面活性物質は、そのヘッドに正味電荷を保持する。双性イオン性界面活性物質は、2つの反対に帯電した基を有するヘッドを含有する。一般的な界面活性物質のいくつかの例として、陰イオン性(硫酸、スルホン酸またはカルボン酸陰イオンをベースとする):パーフルオロオクタノエート(PFOAまたはPFO)、パーフルオロオクタンスルホネート(PFOS)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリル硫酸アンモニウムおよびその他のアルキル硫酸塩、ラウレス(laureth)硫酸ナトリウム(ラウリルエーテル硫酸ナトリウムまたはSLESとしても知られる)、アルキルベンゼンスルホネート;陽イオン性(第四級アンモニウム陽イオンをベースとする):セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)a.k.a.ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびその他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム(CPC)、ポリエトキシル化獣脂アミン(POEA)、塩化ベンザルコニウム(BAC)、塩化ベンゼトニウム(BZT);双性イオン性(両性):ドデシルベタイン;コカミドプロピルベタイン;ココアンホ(coco ampho)グリシネート;非イオン性:アルキルポリ(エチレンオキシド)、アルキルフェノールポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレンオキシド)およびポリ(プロピレンオキシド)のコポリマー(ポロキサマーまたはポロキサミンとして商業的に知られる)、オクチルグルコシドを含めたアルキルポリグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール(例えば、セチルアルコールおよびオレイルアルコール)、コカミドMEA、コカミドDEA、ポリソルベート(Tween 20、Tween 80など)、Triton洗浄剤およびドデシルジメチルアミンオキシドが挙げられる。

本明細書において、「バッファー」とは、強酸または強塩基の添加および温度、圧力、容量または酸化還元電位の外的影響にもかかわらず、そのpHを一定に維持できる物質、一般に、溶液を指す。バッファーは、水素イオン濃度(pH)の著しい変化を防ぐ別の化学物質、例えば、プロトン供与体およびアクセプターシステムの濃度の変化を防ぐ。すべてのバッファーのpH値は、温度および濃度依存的である。pH値または範囲を維持するためのバッファーの選択は、既知バッファーの既知緩衝能に基づいて、当業者によって経験的に決定され得る。例示的バッファーとして、それだけには限らないが、重炭酸バッファー、カコジル酸バッファー、リン酸バッファーまたはTrisバッファーが挙げられる。例えば、Trisバッファー(トロメタミン)は、8.06のpKaを有し、7.9から9.2の間の有効pH範囲を有するアミンベースのバッファーである。Trisバッファーについて、pHは、℃温度低下あたり約0.03単位増大し、10倍希釈あたり0.03〜0.05単位減少する。

本明細書において、天然に存在するα−アミノ酸の残基は、ヒトにおける同族mRNAコドンを有する帯電したtRNA分子の特異的認識によってタンパク質中に組み込まれる天然に見られる20種のα−アミノ酸の残基である。

本明細書において、核酸は、DNA、RNAおよびペプチド核酸(PNA)を含めたその類似体ならびにそれらの混合物を含む。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。適宜蛍光または放射標識などの検出可能な標識などを用いて標識されるローブまたはプライマーを指す場合には、一本鎖分子が考慮される。このような分子は、通常、ライブラリーのプロービングまたは誘導に対して、その標的が統計的に独特であるような長さのものであるか、低コピー数(通常、5未満、一般に、3未満)のものである。一般に、プローブまたはプライマーは、対照とする遺伝子と相補的であるか、または同一である配列の少なくとも14、16または30の連続するヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100またはそれ以上の核酸長であり得る。

本明細書において、ペプチドとは、2〜40のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。

本明細書において、本明細書に提供されたアミノ酸の種々の配列中に生じるアミノ酸は、その公知の3文字または1文字略語に従って同定される(表1)。種々の核酸断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使用される標準の1文字名で指定される。

本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、2個以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、20種の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体(すなわち、α-炭素が側鎖を有するアミノ酸)を含む。

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、ポリペプチドのそのペプチド結合での化学消化(加水分解)の際に形成されるアミノ酸を指す。本明細書において記載されたアミノ酸残基は、「L」異性体形態であると推定される。そのように命名される「D」異性体形態の残基は、ポリペプチドによって所望の機能特性が保持される限り、任意のL−アミノ酸残基と置換され得る。NHとは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。COOHとは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。アミノ酸残基の略語は、J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載され、37 C.F.R.§§1.821−1.822に採用された標準ポリペプチド命名法を踏まえて、表1に示されている。

式によって本明細書において表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来の方向で、左から右の配向を有するということは留意されなければならない。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応表(表1)中に列挙されるアミノ酸ならびに37 C.F.R.§§1.821−1.822において参照され、参照により本明細書に組み込まれるものなどの修飾されたアミノ酸および普通でないアミノ酸を含むよう広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは最後のダッシュ記号は、1個または複数のアミノ酸残基のさらなる配列との、NHなどのアミノ末端基との、またはCOOHなどのカルボキシル末端とのペプチド結合を示すことは留意されなければならない。

本明細書において、「天然に存在するα−アミノ酸」とは、ポリペプチド中に生じる20種のL−アミノ酸を指す。

本明細書において、「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸と同様の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を摸倣するよう構造的に修飾されている有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、例えば、20種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、それだけには限らないが、アミノ酸のD−立体異性体を含む。例示的非天然アミノ酸は、本明細書に記載され、当業者に公知である。

本明細書において、等速性混合物とは、アミノ酸のモル比が、その報告された反応速度に基づいて調整されているものである(例えば、Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34:1681を参照のこと)。

本明細書において、アミノ酸の適した保存的置換は、当業者に公知であり、一般に、得られる分子の生物活性を変更することなく行うことができる。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しないということは認識している(例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224を参照のこと)。このような置換は、以下の表2に示されるものに従って行うことができる。

本明細書において、DNAコンストラクトは、天然には見られない方法で組み合わされた、および並置されたDNAのセグメントを含有する一本鎖または二本鎖、直鎖または環状DNA分子である。DNAコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよびその他のコピーを含む。

本明細書において、DNAセグメントとは、特定の特質を有する大きなDNA分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNAセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片などのより長いDNA分子の一部であり、5’から3’方向に読まれる場合に、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。

本明細書において、用語ポリヌクレオチドとは、5’から3’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNAを含み、天然の供給源から単離される場合も、インビトロ合成される場合も、天然および合成分子の組合せから調製される場合もある。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチドを単位として(「nt」と略される)または塩基対を単位として(「bp」と略される)本明細書では与えられている。用語ヌクレオチドは、文脈が許す場合には、一本鎖および二本鎖分子のために使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合には、長さ全体を表すよう使用され、用語塩基対と同等であると理解される。当業者ならば、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖が、長さがわずかに異なっている場合もあることおよびその末端がねじれ型である場合もあり、したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対を形成していない場合もあるということは認識されよう。このような対を形成していない末端は、一般に、20ヌクレオチドの長さを超えない。

本明細書において、「に対応する位置の」またはヌクレオチドまたはアミノ酸位置が、配列表に示されるものなどの開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸位置「と対応する」という記載は、GAPアルゴリズムなどの標準アラインメントアルゴリズムを使用する同一性を最大にするための開示された配列とのアラインメントの際に同定されたヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。本明細書における目的上、PH20配列のアラインメントは、配列番号3、7または32〜66のいずれか、特に、配列番号3に示されるアミノ酸配列に対してである。したがって、本明細書における配列は、配列番号3に示される対応する残基と同一であるので、位置またはアミノ酸置換が、配列番号3に関連した位置に対応するという本明細書における言及はまた、位置またはアミノ酸置換が、配列番号7または32〜66のいずれかに関連する位置に対応するということも意味する。配列をアラインすることによって、当業者ならば、ガイドとして保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を使用して対応する残基を同定できる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列が最高次のマッチが得られるようアラインされる(例えば: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照のこと)。図2は、例示的アラインメントおよび置換のための例示的な対応する残基の同定を例示する。

本明細書において、「配列同一性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較における、同一または同様のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。配列同一性は、類似または同一の領域を同定するための核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントによって決定できる。本明細書における目的上、配列同一性は、一般に、同一残基を同定するためのアラインメントによって決定される。アラインメントはローカルであってもグローバルであってもよいが、本明細書における目的上、アラインメントは、一般に、各配列の全長が比較されるグローバルアラインメントである。マッチ、ミスマッチおよびギャップが、比較される配列間で同定され得る。ギャップは、同一または同様の特徴がアラインされるようにアラインされた配列の残基間に挿入された無効なアミノ酸またはヌクレオチドである。一般に、内部および末端のギャップがあり得る。配列同一性は、同一残基の数/最短の配列の長さ×100としてギャップを考慮することによって決定されてもよい。ギャップペナルティーを使用する場合には、配列同一性は、末端ギャップについてはペナルティーを用いずに決定され得る(例えば、末端ギャップにはペナルティーは課されない)。あるいは、配列同一性は、同一位置の数/アラインされた総配列の長さ×100としてギャップを考慮せずに決定されてもよい。

本明細書において、「グローバルアラインメント」とは、2種の配列を最初から最後までアラインし、各配列中の各文字を1回だけアラインするアラインメントである。アラインメントは、配列間に類似性または同一性があるか否かにかかわらず作製される。例えば、「グローバルアラインメント」に基づいた50%の配列同一性とは、各々100ヌクレオチドの長さの2種の比較される配列の全配列のアラインメントにおいて、残基の50%が同一であることを意味する。グローバルアラインメントはまた、アラインされる配列の長さが同一ではない場合でさえ、配列同一性の決定において使用され得るということは理解される。「末端ギャップについてペナルティーなし」が選択されない限り、配列の末端の相違は、配列同一性の決定において考慮される。一般に、グローバルアラインメントは、その長さのほとんどにわたって相当な類似性を共有する配列で使用される。グローバルアラインメントを実施するための例示的アルゴリズムとして、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)が挙げられる。グローバルアラインメントを実施するための例示的プログラムは、公的に利用可能であり、National Center for Biotechnology Information(NCBI)ウェブサイト(ncbi.nlm.nih.gov/)で入手可能なグローバル配列アラインメントツールおよびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlで入手可能なプログラムが挙げられる。

本明細書において、「ローカルアラインメント」とは、2種の配列をアラインするが、類似性または同一性を共有する配列の部分のみをアラインするアラインメントである。したがって、ローカルアラインメントは、一方の配列のサブセグメントが、もう一方の配列中に存在するかどうかを決定する。類似性がない場合には、アラインメントは戻されない。ローカルアラインメントアルゴリズムとして、BLASTまたはSmith−Watermanアルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))が挙げられる。例えば、「ローカルアラインメント」に基づく50%の配列同一性とは、任意の長さの2種の比較される配列の全配列のアラインメントでは、100ヌクレオチドの長さの類似性または同一性の領域は、類似性または同一性の領域において同一である残基の50%を有することを意味する。

本明細書における目的上、配列同一性は、各供給業者によって確立されたデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準アラインメントアルゴリズムプログラムによって決定され得る。GAPプログラムのデフォルトパラメータは、(1)単項比較マトリックス(同一性に対して1および非同一性に対して0の値を含有する)およびSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載される、Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986)の加重比較マトリックス;(2)各ギャップに対して3.0のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号に対してさらなる0.10のペナルティーおよび(3)末端ギャップに対するペナルティーなしを含み得る。任意の2種の核酸分子が、ヌクレオチド配列を有するかどうか、または、任意の2種のポリペプチドが、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%「同一」であるアミノ酸配列を有するかどうか、またはパーセント同一性を物語るその他の同様の変動は、ローカルまたはグローバルアラインメントに基づいて既知コンピュータアルゴリズムを使用して決定され得る(例えば、数十の公知の公的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムとのリンクを提供するwikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_softwareを参照のこと)。一般に、本明細書における目的上、配列同一性は、NCBI/BLASTから入手可能なNeedleman−Wunschグローバル配列アラインメントツール(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome);LAlign(William Pearsonが実行するHuang and Millerアルゴリズム(Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357));およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlで入手可能なXiaoqui Huang製のプログラムなどのグローバルアラインメントに基づくコンピュータアルゴリズムを使用して決定される。一般に、本明細書においてヌクレオチド配列を比較する場合には、末端ギャップについてペナルティーを用いるアラインメントが使用される。ローカルアラインメントはまた、比較されている配列が、実質的に同じ長さである場合に使用され得る。

したがって、本明細書において、用語「同一性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較またはアラインメントを表す。1つの限定されない例では、「と少なくとも90%同一である」とは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する90〜100%のパーセント同一性を指す。90%またはそれ以上のレベルの同一性は、例示目的で、100アミノ酸またはヌクレオチドの試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド長を仮定すると、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチド中の10%(すなわち、100のうち10)以下のアミノ酸またはヌクレオチドが、参照ポリペプチドのものと異なるという事実を示す。同様の比較を、試験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。このような相違は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分配された点突然変異として表され得るか、または許容可能な最大までの種々の長さの1つまたは複数の位置に密集している場合もあり、例えば、10/100アミノ酸の相違(およそ90%の同一性)。相違はまた、アミノ酸残基の欠失または切断によるものであり得る。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。比較される配列の長さに応じて、約85〜90%を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットと独立したものであり得、このような高レベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく容易に評価され得ることが多い。

本明細書において、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異とは、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の任意の2種以上の代替形態を言及する。対立遺伝子変異は、突然変異によって天然に起こり、集団内に表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントである(コードされるポリペプチドに変化なし)場合も、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。用語「対立遺伝子変異体」はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を示すために使用される。通常、遺伝子の参照形態は、集団に由来するポリペプチドの野生型形態および/または支配的な形態または種の単一の参照メンバーをコードする。通常、種の間の変異体を含む対立遺伝子変異体は、通常、同一種に由来する野生型および/または支配的な形態との少なくとも80%、90%またはそれ以上のアミノ酸同一性を有し、同一性の程度は、比較が種間であるか種内であるかにかかわらず、遺伝子に応じて変わる。一般に、種内対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの野生型および/または支配的な形態との96%、97%、98%、99%またはそれ以上の同一性を含めた、野生型および/または支配的な形態との少なくとも約80%、85%、90%または95%の同一性またはそれ以上を有する。本明細書において、対立遺伝子変異体への言及は、一般に、同一種のメンバー間のタンパク質の変動を指す。

本明細書において、本明細書において「対立遺伝子変異体」と同義的に使用される「対立遺伝子」とは、遺伝子またはその一部の代替形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同一遺伝子座または位置を占有する。対象が遺伝子の2種の同一の対立遺伝子を有する場合には、対象は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であるといわれる。対象が、遺伝子の2種の異なる対立遺伝子を有する場合には、対象は、その遺伝子についてヘテロ接合性であるといわれる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、互いに、単一ヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドで異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入などの修飾を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、突然変異を含有する遺伝子の形態であり得る。

本明細書において、種変異体とは、マウスおよびヒトなどの異なる哺乳類種を含めた異なる種の間のポリペプチドにおける変異体を指す。本明細書において提供される種変異体の例示的なものとして、それだけには限らないが、ヒト、チンパンジー、マカクザル、カニクイザル、テナガザル、オランウータンまたはマーモセットなどの霊長類PH20がある。一般に、種変異体は、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%または98%の配列同一性を有する。種変異体間の対応する残基は、マッチするヌクレオチドまたは残基の数を最大にするよう配列を比較およびアラインすることによって決定でき、その結果、例えば、配列間の同一性は、95%と等しいかそれより高い、96%と等しいかそれより高い、97%と等しいかそれより高い、98%と等しいかそれより高い、または99%と等しいかそれより高い。次いで、対象とする位置に、参照核酸分子において割り当てられた数を与える。アラインメントは、特に、配列同一性が80%より高い場合には、手作業で、または目視によって達成され得る。

本明細書において、実質的に純粋なとは、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)などの標準的な分析法によって決定されるような、容易に検出可能な不純物を含まないと思われるほど十分に均一であることまたはさらなる精製が、物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変更しないように十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体または異性体の混合物であり得る。このような例では、さらなる精製は、化合物の特定の活性を増大し得る。

本明細書において、単離または精製ポリペプチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、細胞物質またはタンパク質が由来する細胞もしくは組織に由来するその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)などの標準的な分析法によって決定されるような、容易に検出可能な不純物を含まないと思われる場合に、実質的に含まないか、またはさらなる精製が、物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変更しないように十分に純粋であると決定され得る。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。このような例では、さらなる精製は、化合物の特定の活性を増大し得る。

したがって、実質的に精製されたPH20ポリペプチドなどの実質的に精製されたポリペプチドへの言及は、細胞物質を実質的に含まないPH20タンパク質の調製物を指し、タンパク質が、それから単離または組換え産生された細胞の細胞成分から分離されているタンパク質の調製物を含む。一実施形態では、用語、細胞物質を実質的に含まないは、約30%(乾重で)未満の非酵素タンパク質(本明細書において、夾雑タンパク質とも呼ばれる)、一般に、約20%未満の非酵素タンパク質または10%の非酵素タンパク質または約5%未満の非酵素タンパク質を有する酵素タンパク質の調製物を含む。酵素タンパク質が組換え産生される場合には、培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、酵素タンパク質調製物の容量の約20%、10%もしくは5%未満または20%、10%または5%に相当する。

本明細書において、用語、化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないは、タンパク質が、タンパク質の合成に関与している化学前駆体またはその他の化学物質から分離されている酵素タンパク質の調製物を含む。この用語は、約30%(乾重で)、20%、10%、5%未満またはそれ以下の化学前駆体または非酵素化学物質または成分を有する酵素タンパク質の調製物を含む。

本明細書において、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関連して合成とは、組換え法によって、および/または化学合成法によって産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。

本明細書において、組換え手段による、または組換えDNA法を使用する産生は、クローニングされたDNAによってコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。

本明細書において、ベクター(またはプラスミド)とは、異種核酸を、その発現または複製のいずれかのために細胞に導入するために使用される別個の要素を指す。ベクターは、通常、エピソームのままであるが、遺伝子またはその一部の、ゲノムの染色体中への組込みを達成するよう設計され得る。また、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考慮される。このような媒体の選択および使用は、当業者に周知である。

本明細書において、発現ベクターとして、作動可能に連結しているDNA断片の発現を達成できるプロモーター領域などの調節配列と作動可能に連結しているDNAを発現できるベクターが挙げられる。このようなさらなるセグメントとして、プロモーターおよびターミネーター配列を挙げることができ、適宜、1つまたは複数の複製起点、1つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを挙げることができる。発現ベクターは、一般に、プラスミドまたはウイルスDNAに由来するか、または両方のエレメントを含有する場合もある。したがって、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適当な宿主細胞に導入されると、クローニングされたDNAの発現をもたらすその他のベクターなどの組換えDNAまたはRNAコンストラクトを指す。適当な発現ベクターは、当業者に周知であり、真核細胞および/または原核細胞において複製可能であるものおよびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが挙げられる。

本明細書において、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルス性ベクターは、外因性遺伝子を細胞に移す(媒体またはシャトルとして)ために外因性遺伝子と作動可能に連結している操作されたウイルスである。ウイルス性ベクターとして、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターが挙げられる。

本明細書において、「作動可能に」または「作動可能に連結している」とは、DNAセグメントに言及する場合には、セグメントが、その意図される目的のために協力して機能するよう配置されていることを意味し、例えば、転写が、プロモーターの下流および任意の転写された配列の上流に開始する。プロモーターは、普通、転写装置が結合し、転写を開始し、コーディングセグメントをとおってターミネーターまで進行するドメインである。

本明細書において、コンジュゲートとは、1種または複数種のその他のポリペプチドまたは化学部分と直接的または間接的に連結している修飾PH20ポリペプチドを指す。このようなコンジュゲートとして、融合タンパク質、化学コンジュゲートによって産生されるものおよび少なくとも1種の修飾PH20ポリペプチドが、コンジュゲートがヒアルロニダーゼ活性を保持する限り、別のポリペプチドまたは化学部分と直接的または間接的に連結される任意のその他の方法によって産生されるものが挙げられる。本明細書において提供されたコンジュゲートの例示的なものとして、多量体化ドメイン(例えば、Fc部分)、毒素、標識または薬物と直接的または間接的に連結しているPH20ポリペプチドが挙げられる。

本明細書において、融合タンパク質とは、一方の核酸分子に由来するコード配列およびもう一方の核酸分子に由来するコード配列を含有する核酸配列によってコードされるポリペプチドを指し、これでは、融合コンストラクトが、宿主細胞において転写および翻訳されると、2種のタンパク質を含有するタンパク質が産生されるよう、コード配列は同一リーディングフレームにある。2種の分子は、コンストラクトで隣接していても、1、2、3またはそれ以上であるが、通常、10、9、8、7または6個より少ないアミノ酸を含有するリンカーポリペプチドによって分かれていてもよい。融合コンストラクトによってコードされるタンパク質産物は、融合ポリペプチドと呼ばれる。融合ポリペプチドの例として、Fc融合物が挙げられる。

本明細書において、修飾PH20ポリペプチドとコンジュゲートしているポリマーとは、このようなポリペプチドと直接的にか、またはリンカーを介して、共有結合によって、またはそうでなく安定に連結された任意のポリマーを指す。このようなポリマーは、通常、血清半減期を増大させ、それだけには限らないが、シアル部分、ポリエチレングリコール(PEG)部分、デキストランならびに糖およびグリコシル化のためなどのその他の部分を含む。

本明細書において、用語、評価または決定とは、産物の活性について絶対値を得る、また活性のレベルを示す、指数、比、パーセンテージ、視覚的値またはその他の値を得るという意味での定量的および定性的決定を含むものとする。評価は、直接であっても間接であってもよい。

本明細書において、「組成物」とは、2種以上の産物または化合物の任意の混合物を指す。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性物、非水性物またはそれらの任意の組合せであり得る。

本明細書において、製剤とは、少なくとも1種の活性医薬品または治療薬および1種または複数種の賦形剤を含有する組成物を指す。

本明細書において、共製剤とは、2種以上の活性薬剤または医薬品または治療薬および1種または複数種の賦形剤を含有する組成物を指す。例えば、速効型インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の共製剤は、速効型インスリン、ヒアルロナン分解酵素および1種または複数種の賦形剤を含有する。

本明細書において、「組合せ」とは、2種またはそれ以上の項目またはエレメント間の任意の関係を指す。例示的組合せとして、それだけには限らないが、2種またはそれ以上の医薬組成物、2種の修飾PH20ポリペプチド;修飾PH20ポリペプチドと化学療法薬化合物などの抗癌剤;修飾PH20ポリペプチドと治療薬(例えば、インスリン);修飾PH20ポリペプチドと複数の治療薬および/または造影剤またはそれらの任意の関係などの2種以上の有効成分を含有する組成物が挙げられる。このような組合せは、キットとしてパッケージングされ得る。

本明細書において、キットは、適宜、組合せの使用のための説明書ならびに/またはこのような使用のためのその他の反応物および成分を含むパッケージングされた組合せである。

本明細書において、「疾患または障害」とは、それだけには限らないが、感染、後天性の状態、遺伝子状態を含めた原因または状態に起因し、同定可能な症状を特徴とする生物における病状を指す。

本明細書において、ヒアルロナン関連疾患、障害または状態とは、疾患または状態において、原因、結果としてヒアルロナンレベルが上がるか、そうでなければ観察される任意の疾患または状態を指す。ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織または細胞におけるヒアルロナン発現の上昇、間質液圧の上昇、血管容量の減少および/または組織における水分含量の増大と関連している。ヒアルロナン関連疾患、障害または状態は、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素を、単独で、または別の治療および/または薬剤と組み合わせて、または別の治療および/または薬剤に加えて含有する組成物の投与によって治療され得る。例示的疾患および状態として、それだけには限らないが、ヒアルロナンが豊富な癌、例えば、末期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌(in situ carcinoma)、扁平上皮癌(SCC)、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌およびその他の癌などの固形腫瘍を含めた腫瘍が挙げられる。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態としてまた、椎間板圧と関連している疾患などの間質液圧の上昇と関連している疾患および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の損傷によって引き起こされる浮腫がある。例示的ヒアルロナン関連疾患および状態として、癌、椎間板圧および浮腫を含めた、間質液圧の上昇、血管容量の減少および/または組織における水分含量の増大と関連している疾患および状態が挙げられる。一例では、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の治療は、寛解、低減または間質液圧(IFP)の上昇、血管容量の減少および組織における水分含量の増大のうち1つ以上に対するその他の有益な効果を含む。

本明細書において、疾患または状態を有する対象を「治療すること」は、対象の症状が部分的または完全に軽減されること、または治療後に変化がないままであることを意味する。したがって、治療は、予防、療法および/または治癒を包含する。予防とは、可能性ある疾患の防止および/または症状の悪化もしくは疾患の進行の防止を指す。治療はまた、修飾インターフェロンおよび本明細書において提供された組成物の任意の医薬使用も包含する。

本明細書において、医薬上有効な薬剤または治療薬は、疾患または障害を治療するための治療効果を示し得る任意の生物活性薬剤を含む。例示的治療薬は、本明細書に記載されている。治療薬として、それだけには限らないが、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、それだけには限らないが、ビスホスホネートを含めた小分子薬物を含めた従来の治療薬物ならびにそれだけには限らないが、インスリン、IgG分子、抗体、サイトカインおよび血液凝固因子を含めた治療用タンパク質が挙げられる。

本明細書において、「インスリン」とは、グルコース取り込みおよび保存を増大し、および/または内因性グルコース産生を低減するよう作用するホルモン、前駆体またはその合成もしくは組換え類似体を指す。インスリンおよびその類似体は、ヒトにおいて、およびその対立遺伝子および種変異体を含めて、当業者に周知である。インスリンは、タンパク質を小胞体(ER)に向かわせるシグナルペプチドを含有するプレプロインスリン(ヒトインスリンについては110個のアミノ酸)と名づけられた前駆体ポリペプチドとして翻訳され、小胞体でシグナル配列が切断され、その結果、プロインスリンとなる。プロインスリンは、さらにプロセシングされて、C−鎖または連結鎖ペプチド(ヒトインスリンにおける31個のアミノ酸のC−鎖)を放出する。得られたインスリンは、ジスルフィド結合によって架橋しているA鎖(ヒトインスリンでは21個のアミノ酸長;配列番号862に示される)およびB鎖(ヒトインスリンでは30個のアミノ酸長;配列番号863に示される)を含有する。十分に架橋したヒトインスリンは、3つのジスルフィド橋:A鎖の位置7とB鎖の位置7の間の1つ、A鎖の位置20とB鎖の位置19の間の2番目のものおよびA鎖の位置6と11の間の3番目のものを含有する。インスリンへの言及は、六量体インスリンならびにヒト化インスリンを含めた、単量体および多量体のインスリンを含む。例示的インスリンポリペプチドとして、ヒトを含めた哺乳類起源のものがある。インスリンへの言及は、一本鎖または二本鎖形態、活性を有するその切断形態のプレプロインスリン、プロインスリンおよびインスリンポリペプチドを含み、ヒトインスリンの対立遺伝子変異体および種変異体、スプライシング変異体によってコードされる変異体およびインスリン類似体などのその他の変異体を含む。例示的インスリンとして、それぞれ、配列番号862および863に示されるヒトインスリンのA鎖およびB鎖のアミノ酸の配列を有するヒトインスリンおよびA鎖またはB鎖の一方または両方に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を示し、グルコース取り込みおよび保存を増大し、および/または内因性グルコース産生を低減するよう作用するその変異体または類似体がある。さらなる例示的インスリンとして、配列番号864に示されるようなプレプロインスリンのアミノ酸の配列を有し、それによって、A鎖がアミノ酸残基位置88〜108に対応し、B鎖がアミノ酸に対応するブタインスリンならびにA鎖またはB鎖の一方または両方に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を示し、グルコース取り込みおよび保存を増大し、および/または内因性グルコース産生を低減するよう作用するその変異体または類似体がある。

本明細書において、「速効型インスリン」とは、対象への皮下投与のわずか4時間後に、またはわずか約4時間後にピークインスリンレベルを示す任意のインスリンを指す。速効型インスリンは、速効型インスリンの投与後、約4時間の時点で、または4時間内に生じる対象における、実際の、認知された、または予測された高血糖性状態(食物の消費に起因するか、または起因すると予測される食事性高血糖状態など)に応じた、糖尿病の対象への急性投与のための任意のインスリンまたは任意の速効型インスリン組成物を含み、それによって、速効型インスリンは、急性高血糖性状態を防ぎ、制御し、または寛解する。速効型インスリンは、組換えインスリンならびにヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンとして販売されているインスリンなどの単離インスリン(「レギュラー」インスリンとも呼ばれる)、ならびにアミノ酸変更によって迅速に作用するよう設計された速効型(rapid acting)インスリン類似体(本明細書において、速効型(fast−acting)インスリン類似体とも呼ばれる)を含む。例示的レギュラーインスリン調製物として、それだけには限らないが、商標Humulin(登録商標)R、Novolin(登録商標)RおよびVelosulin(登録商標)の下で販売されるものなどのヒトレギュラーインスリン、インスリンヒト、USPおよびインスリンヒト注射液、USP、ならびに例えば、トロントインスリン(Toronto Insulin)、オールドインスリン(Old Insulin)およびクリアーインスリン(Clear insulin)などのインスリンの酸性製剤ならびにIletin II(登録商標)(ブタインスリン)などのレギュラーブタインスリンが挙げられる。レギュラーインスリンは、通常、30分から1時間の間の作用の開始および投与後2〜5時間のピークインスリンレベルを有する。

本明細書において、速効型(rapid acting)インスリン類似体(速効型(fast−acting)インスリン類似体とも呼ばれる)は、作用の迅速な開始を有するインスリンである。迅速なインスリンは、通常、レギュラーインスリンよりも迅速に作用するための1つまたは複数のアミノ酸置換の導入などによって操作されているインスリン類似体である。速効型(rapid acting)インスリン類似体は、通常、注射後10〜30分の作用の開始を有し、注射後30〜90分でピークインスリンレベルが観察される。例示的な速効型(rapid acting)インスリン類似体として、それぞれ、配列番号862または863に示されるヒトインスリンのA鎖および/またはB鎖中に1つまたは複数のアミノ酸変更を含有し、注射後10〜30分で作用の開始を示し、注射後30〜90分でピークインスリンレベルが観察されるヒトインスリンの類似体がある。例示的な速効型(rapid acting)インスリン類似体として、それだけには限らないが、例えば、インスリンリスプロ(例えば、Humalog(登録商標)インスリン)、インスリンアスパルト(例えば、NovoLog(登録商標)インスリン)およびインスリングルリジン(例えば、Apidra(登録商標)インスリン)、VIAject(登録商標)およびVIAtab(登録商標)として販売される速効型(fast−acting)インスリン組成物が挙げられる(例えば、米国特許第7,279,457号を参照のこと)。例示的な速効型(rapid−acting)インスリン類似体のアミノ酸配列は、配列番号862に示されるアミノ酸の配列を有するA鎖および配列番号865〜867のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するB鎖を有する。また。注射後、30分以下の作用の開始および90分より以前の、通常30〜90分のピークレベルを有する任意のその他のインスリンも含まれる。

本明細書において、ヒトインスリンとは、その対立遺伝子変異体および類似体を含めたヒトポリペプチドに基づく、合成物であるか、または組換えによって産生されるインスリンを指す。

本明細書において、速効型(fast−acting)ヒトインスリンまたはヒト速効型(fast−acting)インスリン組成物は、速効型(fast−acting)である任意のヒトインスリンまたはヒトインスリンの組成物を含むが、レギュラーブタインスリンなどの非ヒトインスリンは含まない。

本明細書において、用語「基礎作用性インスリン」または「基礎インスリン」とは、糖尿病のような慢性状態を治療するための全治療計画の一部として、基礎インスリンレベルを維持するために投与されるインスリンを指す。一般に、基礎作用性インスリンは、周期的に(例えば、1日に1回または2回)投与される場合のインスリンの制御された放出によって、ほぼ定常状態のインスリンレベルを維持するよう処方される。基礎作用性インスリンとして、結晶性インスリン(例えば、NPHおよびLente(登録商標)、プロタミンインスリン、スルフェン(surfen)インスリン)、基礎インスリン類似体(インスリングラルギン、HOE 901、NovoSol Basal)およびレギュラーインスリンの吸収速度を遅らせるその他のインスリンの化学製剤(例えば、アラビアガム、レシチンまたはオイル懸濁液)が挙げられる。本明細書において、基礎作用性インスリンは、通常、長時間作用性(一般に、比較的低いピーク濃度に到達するが、約20〜30時間を超える最大作用期間を有する)または中間作用性(通常、投与後約4〜12時間でピークインスリン濃度を引き起こす)と理解されるインスリンを含み得る。

本明細書において、治療とは、状態、障害または疾患またはその他の適応症の症状が、寛解されるか、そうでなければ有益に変更される任意の方法を意味する。

本明細書において、治療効果とは、疾患または状態の症状を変更、通常、改善もしくは寛解させるか、または疾患または状態を治癒する、対象の治療に起因する効果を意味する。治療上有効な量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす組成物、分子または化合物の量を指す。

本明細書において、用語「対象」とは、ヒトなどの哺乳類を含めた動物を指す。

本明細書において、患者とは、疾患または障害の症状を示すヒト対象を指す。

本明細書において、医薬組成物またはその他の治療薬の投与によるなどの治療による特定の疾患または障害の症状の寛解とは、組成物または治療薬の投与に起因するか、それと関連し得る、永久的であるか、一時的であるか、持続性であるか、一過性であるかにかかわらない、症状の任意の減少を指す。

本明細書において、防止または予防とは、疾患または状態を発生するリスクが低減される方法を指す。

本明細書において、「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」とは、治療効果をもたらすのに少なくとも十分である、薬剤、化合物、物質または化合物を含有する組成物の量を指す。したがって、疾患または障害の症状を防ぐ、治癒する、寛解させる、停止するまたは部分的に停止するのに必要な量である。

本明細書において、単位用量形態とは、当技術分野で公知であるように、ヒトおよび動物対象に適した、個別にパッケージングされた物理的に別個の単位を指す。

本明細書において、単回投与形製剤とは、直接投与用の治療薬の単回用量を含有する製剤を指す。単回投与形製剤は、一般に、任意の防腐剤を含有しない。

本明細書において、複数回用量製剤とは、治療薬の複数回用量を含有し、治療薬の数回の単回用量を提供するよう直接投与され得る製剤を指す。用量は、数分、数時間、数週間、数日または数カ月にわたって投与され得る。複数回用量製剤は、用量調整、用量をプールすることおよび/または用量分割を可能にし得る。複数回用量製剤は、経時的に使用されるので、それらは、一般に、微生物の増殖を防ぐために1種または複数種の防腐剤を含有する。

本明細書において、「製造品」は、製造され、販売されている製品である。本願を通じて使用されるように、この用語は、同一または別個のパッケージング品に含有される、esPH20などの可溶性PH20とともに治療薬を、またはesPH20を単独で包含するものとする。

本明細書において、流体とは、流動し得る任意の組成物を指す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態にある組成物およびその他のこのような組成物を包含する。

本明細書において、「対照」または「標準」とは、試験パラメータで処理されない点を除いて、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルを指すか、血漿サンプルである場合には、対象の状態を患っていない正常なボランティアに由来するものであり得る。対照はまた、内部対照であり得る。例えば、対照は、既知特性または活性を有するウイルスなどのサンプルであり得る。

本明細書において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、明確に別に示さない限り、複数の参照対照を含む。したがって、例えば、「1つの(an)」薬剤への言及は、1種または複数種の薬剤を含む。

本明細書において、用語「または」は、代替物のみを指すまたは代替物が相互排他的であると明確に示されない限り、「および/または」を意味するよう使用される。

本明細書において、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表され得る。約はまた、正確な量も含む。したがって、「約5個の塩基」とは、「約5個の塩基」および「5個の塩基」も意味する。

本明細書において、「適宜の」または「適宜に」とは、続いて記載される事象または状況が起こるか、または起こらないことおよび記載は前記事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、適宜置換されている基とは、基が置換されていないか、または置換されていることを意味する。

本明細書において、任意の保護基、アミノ酸およびその他の化合物の略語は、別に示されない限り、その一般的な利用、認識される略語または生化学命名法に関するIUPAC−IUB 委員会(IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclature)((1972) Biochem. 11:1726を参照のこと)に一致する。

開示内容を明確にするために、制限としてではないが、詳細な説明は以下の小区分に分けられている。

B.PH20ヒアルロニダーゼ
修飾PH20ポリペプチドが本明細書において提供される。PH20(精子表面タンパク質、精子接着分子1またはSPAM1としても知られる)は、細胞外マトリックスなどの結合組織中に見られるヒアルロナン(ヒアルロン酸、ヒアルロネートまたはHAとも呼ばれる)を加水分解するヒアルロニダーゼである。ヒアルロナンポリマーは、交互のβ−1→4およびβ−1→3グリコシド結合によって一緒に連結している、反復する二糖単位、D−グルクロン酸(GlcA)およびN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)から構成される。ヒアルロナン鎖は、約25,000の二糖反復またはそれ以上の長さに達し得、ヒアルロナンのポリマーは、インビボ(in vivo)で約5,000〜20,000,000Daの大きさの範囲であり得る。ヒアルロナンはまた、ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ばれ、結合組織、上皮組織および神経組織中に広く分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質バリアの主要な構成物である。PH20は、ヒアルロン酸のβ1→4グリコシド結合を四糖類および六糖類などの種々のオリゴ糖の長さに加水分解するエンド−β−N−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。PH20は、加水分解活性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有する。ヒアルロン酸を分解することに加えて、PH20はまた、C4−SおよびC6−Sなどのコンドロイチン硫酸も分解し得る。PH20は、酸性pHおよび中性pHでヒアルロニダーゼ活性を示し得る。

1.構造
PH20 cDNAは、多数の哺乳類種からクローニングされている。例示的PH20前駆体ポリペプチドとして、それだけには限らないが、ヒト(配列番号6)、ウシ(配列番号15または17)、ウサギ(配列番号23)、カニクイザル(配列番号13)、モルモット(配列番号28)、ラット(配列番号21)、マウス(配列番号19)、チンパンジー(配列番号8、配列番号9または配列番号869)アカゲザル(配列番号11)、キツネ(配列番号30)、テナガザル(配列番号856)、マーモセット(配列番号858)またはオランウータン(配列番号860)PH20ポリペプチドが挙げられる。mRNA転写物は、通常、翻訳されて、N末端に35個のアミノ酸シグナル配列を含有する前駆体タンパク質を作製する。ERへの輸送後、シグナルペプチドが除去されて、成熟したPH20ポリペプチドが得られる。例示的な成熟PH20ポリペプチドとして、それだけには限らないが、ヒト(配列番号7)、ウシ(配列番号16または18)、ウサギ(配列番号24)、カニクイザル(配列番号14)、モルモット(配列番号29)、ラット(配列番号22)、マウス(配列番号20)、チンパンジー(配列番号10または配列番号870)、アカゲザル(配列番号12)、キツネ(配列番号31)、テナガザル(配列番号857)、マーモセット(配列番号859)またはオランウータン(配列番号861)PH20ポリペプチドが挙げられる。例えば、ヒトPH20 mRNA転写物は、普通、翻訳されて、N末端(配列番号6のアミノ酸残基位置1〜35)に35個のアミノ酸のシグナル配列を含有する509個のアミノ酸の前駆体タンパク質(配列番号6)を作製する。したがって、ERへの輸送およびシグナルペプチドの除去後、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有する474個のアミノ酸の成熟したポリペプチドが得られる。ヒツジ由来のPH20の配列も知られている(例えば、配列番号25〜27を参照のこと)。

特に、ヒトPH20は、配列番号6に示されるアミノ酸の配列を有する。シグナル配列を欠く成熟ヒトPH20は、配列番号7に示されている。PH20対立遺伝子変異体およびその他の変異体が知られている。PH20のその他の配列が報告されている。例えば、PH20変異体は、配列番号7に示される配列と比較して、位置48にAlaおよび位置499にTrpを含有する配列番号68に示される前駆体配列またはそれぞれ、位置13および464に対応する相違を含有する配列番号69に示されるその成熟配列において示されるように知られている(例えば、Gmachl et al. (1993) FEBS Lett., 336:545-548;GenBank受託番号AAC60607を参照のこと)。さらに、配列番号6に示されるアミノ酸の前駆体配列と比較して、位置5にグルタミン(Gln;Q)を含有するPH20の天然変異体が同定されている(例えば、配列番号70を参照のこと、Varela et al. (2011) Nature, 469:539-542も参照のこと)。別の天然変異体は、配列番号6に示されるアミノ酸の配列と比較して位置47に(配列番号71に示されるように)、配列番号3または7に示されるアミノ酸の配列と比較して位置12に対応して(配列番号72に示されるように)、アラニン(Ala;A)を含有する。

PH20ポリペプチドの配列および構造は、高度に保存されている。種々の種に由来するPH20タンパク質間の配列同一性は、約50%〜90%である。35個のアミノ酸長の疎水性N末端シグナル配列は、PH20ヒアルロニダーゼポリペプチドの間で全般的に保存されている。PH20ヒアルロニダーゼは、配列番号6に示される前駆体ヒトPH20配列のアミノ酸残基38〜374に対応する約340個のアミノ酸長の共通のコアヒアルロニダーゼドメイン領域を含有する。シグナル配列を欠き、配列番号6のアミノ酸残基464に対応するC末端アミノ酸残基を有する連続するアミノ酸の配列(例えば、配列番号6に示されるアミノ酸配列の位置36〜464に対応するアミノ酸残基)を含有する成熟PH20ポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性に必要な最小配列である(例えば、米国特許第7,767,429号として発行される米国特許出願第10/795,095号を参照のこと;米国公開番号US20100143457も参照のこと)。

共通ヒアルロニダーゼドメイン領域内で、種間で少なくとも57個のアミノ酸が保存されている(例えば、Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814; ten Have et al. (1998) Reprod. Fertil. Dev., 10:165-72; Chowpongpang et al. (2004) Biotechnology Letters, 26:1247-1252を参照のこと)。例えば、PH20ヒアルロニダーゼは、配列番号3または7に示されるものなどのシグナル配列を欠く成熟PH20のアミノ酸の配列のアミノ酸残基25、189、203、316、341、346、352、400、402、408、423および429に対応する(配列番号6に示される全長ヒトPH20のアミノ酸残基60、224、238、351、376、381、387、435、437、443、458または464に対応する)12個の保存されたシステイン残基を含有する。25および316に対応するシステイン残基ならびに189および203に対応するシステイン残基が、ジスルフィド橋を形成する。その他のシステイン残基も、ジスルフィド橋を形成し、翻訳後タンパク質成熟および/または活性調節に関与している。例えば、さらなる4つのジスルフィド結合が、配列番号6に例示されるポリペプチドのシステイン残基C376およびC387間;C381およびC435間;C437およびC443間;ならびにC458およびC464間(それぞれ、配列番号3または7に示される成熟ポリペプチドの位置C341およびC352;C346およびC400間;C402およびC408間;ならびにC423およびC429間に対応する)で形成される。

配列番号3または7に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸残基D111、E113およびE249に対応するアミノ酸残基は、酵素活性部位の酸性残基部分であり、PH20種間で保存されている。配列番号3または7に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸残基R176、R246、R252もまた、種間で保存されており、基質結合および/またはヒアルロニダーゼ活性に貢献している。アミノ酸突然変異D111N、E113Q、R176G、E249NおよびR252Tは、検出可能な酵素活性または残存する酵素活性を有さない酵素をもたらす(例えば、Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814を参照のこと)。

本明細書における結果によって、ヒアルロニダーゼ活性にとっての、配列番号3または7に示されるものなどのシグナル配列を欠く成熟PH20に示されるアミノ酸の配列の位置25、111、113、176、189、203、246、249、252、316、341、346、352、400、402、408、423および429に対応するPH20アミノ酸残基の必要性が確認されるが、これは、これらの残基の突然変異誘発が、活性ではない酵素(例えば、発現されないか、または発現された場合に不活性である、例えば、表5および10を参照のこと)をもたらすからである。R176KおよびC316Dに対応するアミノ酸置換が、幾分かの残存するヒアルロニダーゼ活性を生じた突然変異体をもたらしたことは例外である。

グリコシル化もまた、認識モチーフNxSまたはNxTに基づくPH20ヒアルロニダーゼ活性にとって必要である。配列番号3または7に示されるアミノ酸の配列の位置N47、N131、N200、N219、N333およびN358に対応する(配列番号6に示されるヒトPH20のアミノ酸残基N82、N166、N235、N254、N368およびN393に対応する)アミノ酸残基に6つのN結合型オリゴ糖がある。特に、少なくとも、アミノ酸残基N200、N333およびN358に対応するN結合型グリコシル化部位は、酵素の分泌および/または活性にとって必要である(例えば、米国公開番号US20100143457を参照のこと)。例えば、アミノ酸突然変異N200A、N333A、N358AまたはN333A/N393Aを含有するPH20ポリペプチドは、不活性タンパク質をもたらす。グリコシル化部位N47A、N131A、N219A、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N291Aの単一突然変異は、活性を保持する。配列番号6に示されるヒトPH20のアミノ酸残基N368に対応するN結合型グリコシル化部位は、種間で保存されている(例えば、Chowpongpang et al. (2004) Biotechnology Letters, 26:1247-1252を参照のこと)。PH20ヒアルロニダーゼはまた、O結合型グリコシル化部位も含有する。例えば、ヒトPH20は、配列番号3または7に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸T440に対応する(配列番号6中のアミノ酸残基T475に対応する)アミノ酸残基で1つのO結合型オリゴ糖を有する。

PH20はまた、触媒部位に加えて、ヒアルロナン結合部位も含有する。この部位は、ペプチド2領域中に位置し、配列番号6に示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置205〜235および配列番号3または7に示される成熟ポリペプチドの位置170〜200に対応する。この領域は、ヒアルロニダーゼ間で高度に保存されており、ヘパリン結合モチーフと類似している。位置176のアルギニン残基(配列番号3または7に示される成熟PH20ポリペプチドに対応する)のグリシンへの突然変異は、野生型ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の約1%のみを有するポリペプチドをもたらす(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。

PH20ポリペプチドは、細胞の細胞膜の細胞外リーフレットにタンパク質を固定するタンパク質のC末端と結合しているグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを含有する。少なくともヒト、サル、マウスおよびモルモットPH20は、GPIアンカーによって細胞膜と強力に結合しており、これはホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI−PLC;例えば、Lin et al. (1994) Journal of Cell Biology, 125:1157-1163;Lin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90:10071-10075を参照のこと)を用いて処理することによって放出され得る。ウシPH20などのその他のPH20酵素は、細胞膜と緩く結合しており、ホスホリパーゼ感受性アンカーによって固定されていない。下記で論じられるように、発現された場合に、膜と結合していないが、分泌される可溶性活性形態は、GPIアンカー結合シグナル部位部分のすべての除去によって生成され得ない(米国特許第7,767,429号;米国公開番号US20100143457も参照のこと)。これらとして、例えば、配列番号3または32〜66のいずれかに示される可溶性PH20ポリペプチドまたはシグナル配列を含有するその前駆体形態が挙げられる。

GPI固定されるタンパク質、例えば、ヒトPH20は、タンパク質を小胞体(ER)に向かわせる切断可能なN末端シグナルペプチドとともに翻訳される。これらのタンパク質のC末端には、ERの内腔内のポリペプチドへの予め形成されたGPIアンカーの付加を指示する別のシグナル配列がある。GPIアンカーの付加は、ω−部位と呼ばれる特定のアミノ酸位置(通常、C末端からおよそ20〜30個のアミノ酸に位置する)でのC末端部分の切断後に起こる。ω−部位の位置を同定するためのコンセンサス配列はないと思われるが、GPI固定されるタンパク質は、通常、ω−部位のすぐ下流に8〜12個のアミノ酸の親水性スペーサー領域が先行し、8〜20個のアミノ酸の主に疎水性領域を含有するC末端GPIアンカー結合シグナル配列またはドメインを含有する。この親水性スペーサー領域は、荷電アミノ酸およびプロリンが豊富であることが多い(White et al. (2000) J. Cell Sci. 113(Pt.4):721-727)。一般に、予想される二次構造の量が少ないことを特徴とするω−1位置の前のおよそ11個のアミノ酸の領域、小さい側鎖残基の存在を特徴とする切断部位(ω−部位)ω−1からω+2の周辺の領域、位置ω+3からω+9の間のスペーサー領域、ω+10からC末端までの疎水性テールがある(Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392)。

GPIアンカー結合シグナルコンセンサス配列はないが、ExPASyプロテオミクスツールサイト(expasy.ch/tools/)などの生物情報学のウェブサイトで容易に入手可能であるものを含め、ポリペプチド中のこのような配列を同定するために使用され得る種々のコンピュータによる方法およびアルゴリズムが開発されている(例えば、Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582; Eisenhaber et al. (1999) J. Mol. Chem. 292: 741-758; Kronegg and Buloz, (1999), 「Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)」, 129.194.185.165/dgpi/; Fankhauser et al. (2005) Bioinformatics 21:1846-1852; Omaetxebarria et al. (2007) Proteomics 7:1951-1960; Pierleoni et al. (2008) BMC Bioinformatics 9:392を参照のこと)。したがって、当業者ならば、PH20ポリペプチドが、GPIアンカー結合シグナル配列を含有する可能性があるかどうか、したがって、PH20ポリペプチドが、GPI固定されるタンパク質であるかどうかを決定できる。

ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI−PLC)加水分解研究を使用して、GPIアンカーのヒトPH20のC末端との共有結合、したがって、PH20の膜結合性が確認された(例えば、Lin et al., (1994) J. Biol. Chem. 125:1157-1163を参照のこと)。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI−PLC)およびD(PI−PLD)は、GPIアンカーを加水分解し、PH20ポリペプチドを細胞膜から放出する。先行技術文献は、ヒトPH20のω−部位切断部位が、Ser−490からAla−491の間で同定され、サルPH20については、Ser491からThr492の間で同定されることを報告する(Lin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci, (1993) 90:10071-10075)。したがって、文献は、ヒトPH20のGPIアンカー結合シグナル配列は、配列番号6に示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸位置491〜509に位置し、ω−部位は、アミノ酸位置490であることを報告する。したがって、ヒトPH20のこのモデリングでは、アミノ酸491〜509は、ERへの輸送後に切断され、GPIアンカーは、位置490のセリン残基と共有結合している。

2.機能
PH20は、単一の精巣特異的遺伝子から精子において正常に発現される。PH20は、受精に関与している精子関連タンパク質である。PH20は、普通、精子表面に、およびリソソーム由来先体中に局在し、そこでは、内先体膜と結合している。PH20は、多機能性であり、ヒアルロニダーゼ活性、ヒアルロナン(HA)媒介性細胞シグナル伝達活性を示し、先体反応した(AR)精子上に存在する場合に卵母細胞の周囲の透明帯の精子受容体として作用する。例えば、PH20は、天然に、精子−卵子接着に関与しており、ヒアルロン酸を消化することによって卵丘細胞の層の精子による浸透を補助する。PH20は、ヒアルロニダーゼであることに加えて、HA誘導性細胞シグナル伝達の受容体、卵母細胞の周囲の透明帯の受容体でもあると思われる。PH20は、受精におけるPH20の役割のために、免疫避妊の抗原として使用できる。

PH20は、いくつかの場合には酸性活性活性を示し得るが、中性活性ヒアルロニダーゼである。PH20のヒアルロニダーゼ活性は、細胞膜結合性および内先体膜結合性PH20によって示される。細胞膜PH20は、中性pHでヒアルロニダーゼ活性のみを示すのに対し、内先体膜結合性PH20は、酸性活性酵素活性を示す。これらの相違の構造的基礎は、PH20中の2つの触媒部位の存在によるものである。第1の触媒部位は、ペプチド1領域と命名され、配列番号6のアミノ酸残基142〜172に対応し、中性pHでのPH20の酵素活性に関与している。第2の触媒部位は、ペプチド3領域と命名され、配列番号6のアミノ酸残基277〜297に対応し、低pHでの酵素活性に関与している。内先体膜結合性PH20の構造の変化は、先体反応後に起こり、それによって、PH20は、細胞内タンパク質分解によって切断されるが、ジスルフィド結合によって一緒に保たれる。細胞内タンパク質分解の結果は、ペプチド3領域が活性化され、したがって、PH20の中性および酸性活性を達成し得るということである(例えば、Cherr et al. (2001) Matrix Biology, 20:515-525を参照のこと。また、先体反応後に、内先体膜からの放出によって低分子量形態が生じる(例えば、サルでは、PH20の53kDaの可溶性形態が生じる)。低分子量形態(複数可)もまた酸性活性である。

PH20のヒアルロニダーゼ活性は、薬物の分散および吸収を高めるために数十年間臨床的に使用されてきた動物精巣抽出物において観察される拡延活性の主要因となっている(例えば、Bookbinder et al. (2006) J Controlled Release, 114:230-241を参照のこと)。例えば、ヒアルロニダーゼを含有する医薬品が、拡延剤として、またその他の適用において治療的使用するために、ウシ精巣から分画抽出物として開発された(Schwartzman (1951) J. Pediat., 39:491-502)。元のウシ精巣抽出物調製物は、例えば、商標Wydase(登録商標)、Hylase(登録商標)、「Dessau」、Neopermease(登録商標)、Alidase(登録商標)およびHyazyme(登録商標)の下で販売される抽出物を含んでいた。今では、精巣抽出物調製物の拡延活性が、PH20ヒアルロニダーゼ活性によるものであるということは公知である。例えば、2001年に、雄ウシにおける精子ヒアルロニダーゼが、ヒアルロニダーゼPH20として同定された(Lalancette et al. (2001) Biol. Reprod., 65:628-36)。PH20ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の加水分解を触媒することによって、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それによって、組織透過性を高める。したがって、PH20の可溶性形態は、その他の薬剤、薬物およびタンパク質とともに、その分散およびデリバリーを増強するために、また同時に投与される薬剤、薬物またはタンパク質の薬物動態および薬力学的プロフィールを改善するために拡延剤または分散剤として使用される(例えば、米国特許第7,767,429号;Bookbinder et al. (2006) J Controlled Release, 114:230-241を参照のこと)。

3.可溶性PH20ポリペプチド
PH20は、膜結合性形態または膜会合性形態で存在する場合も、細胞から発現されるときに培地中に分泌される場合もあり、それによって、可溶性形態で存在する場合もある。可溶性PH20は、それだけには限らないが、Triton(登録商標)X−114アッセイを使用するものを含めた、当技術分野で周知の方法を使用して、不溶性の、膜結合性PH20から検出および識別され得る。このアッセイでは、可溶性PH20ヒアルロニダーゼは、37℃に加温したTriton(登録商標)X−114溶液の水相に分配される(Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7)、一方、膜に固定されたPH20ヒアルロニダーゼは、洗浄剤が豊富な相へ分配される。したがって、PH20ポリペプチドが天然にGPIによって固定される、したがって、膜結合性であるかどうかを評価するためのアルゴリズムを使用することに加えて、溶解度実験も実施され得る。

可溶性PH20酵素は、GPIアンカー結合シグナル配列を含有するが、膜と緩く結合しているヒアルロニダーゼを含み、その結果、ホスホリパーゼ感受性アンカーを含有しない。例えば、可溶性PH20ポリペプチドとして、ヒツジまたはウシPH20が挙げられる。このような可溶性PH20ヒアルロニダーゼの種々の形態は、ヒトを含めた対象において治療的に使用するために調製され、承認されている。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物として、Vitrase(登録商標)(ISTA Pharmaceuticals)、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼおよびAmphadase(登録商標)(Amphastar Pharmaceuticals)、ウシ精巣ヒアルロニダーゼが挙げられる。可溶性PH20酵素はまた、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー結合シグナル配列の1個または複数のアミノ酸残基を欠くが、ヒアルロニダーゼ活性は保持する、非ヒトまたはヒト膜会合性PH20ヒアルロニダーゼの切断形態を含む(例えば、米国特許第7,767,429号;米国公開番号US20100143457を参照のこと)。したがって、これらのポリペプチドは、ERにおいてタンパク質のC末端と共有結合しているGPIアンカーを有する、および細胞膜の細胞外リーフレットに固定される代わりに、細胞から発現されるときに分泌され、可溶性である。ポリペプチドが、可溶性であり(すなわち、細胞から発現されるときに分泌される)、活性であるという条件で、可溶性ヒアルロナン分解酵素が、GPIアンカー結合シグナル配列の一部を保持する事例では、GPIアンカー結合シグナル配列中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のアミノ酸残基を保持し得る。

C末端切断型であり、GPIアンカー結合シグナル配列のすべてまたは一部を欠く例示的可溶性ヒアルロニダーゼとして、それだけには限らないが、霊長類起源のPH20ポリペプチド、例えば、ヒトおよびチンパンジーPH20ポリペプチドなどが挙げられる。例えば、可溶性PH20ポリペプチドは、配列番号7、10、12、14、69、72、857、859、861もしくは870に示されるポリペプチドまたは配列番号7、10、12、14、69、72、857、859、861もしくは870のいずれかに対して少なくとも80%、85%、90%、95%またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体のC末端の切断によって製造され得、これでは得られたポリペプチドは、活性であり、可溶性であり、GPIアンカー結合シグナル配列に由来するアミノ酸残基のすべてまたは一部を欠く。

例示的可溶性PH20ポリペプチドは、成熟している(シグナル配列を欠く)、可溶性であり、天然活性を示し、配列番号6に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸残基464で、またはその後で、C末端切断されたアミノ酸残基を最小に有する配列番号6または配列番号7に示されるアミノ酸の配列の連続配列を含有する、C末端切断型ヒトPH20ポリペプチドである。例えば、可溶性PH20ポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸36〜464の連続配列を最小に含有するか、または配列番号6のアミノ酸464後のC末端アミノ酸残基を有するアミノ酸の連続配列に対して少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、ヒアルロニダーゼ活性を保持するC末端切断型ポリペプチドを含む。例示的C末端切断型ヒトPH20ポリペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸の配列の464後、例えば、アミノ酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499または500後のC末端残基を有する配列番号6に示されるアミノ酸の連続配列を含む、成熟しているポリペプチド(シグナル配列を欠く)またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性、例えば、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%の配列同一性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を保持するその変異体である。例えば、例示的C末端PH20ポリペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸の配列のアミノ酸36〜465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499もしくは500の配列またはそれに対して少なくとも85%の配列同一性、例えば、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%の配列同一性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を保持するその変異体を有する。可溶性PH20ポリペプチドは、配列番号3もしくは32〜66に示されるアミノ酸の配列または配列番号3もしくは32〜66に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも85%の配列同一性、例えば、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する任意のものを含む。

特に、可溶性ヒトPH20ポリペプチドは、配列番号6に示される配列のアミノ酸482後で切断されたポリペプチドである。このようなポリペプチドは、例えば、配列番号1(IgGκシグナル配列を含有する)または配列番号67(天然のシグナル配列を含有する)に示されるような、シグナル配列およびコードするアミノ酸36〜482を含有する核酸分子から作製され得る。翻訳後プロセシングによって、シグナル配列が除去され、447個のアミノ酸の可溶性組換えヒトPH20(配列番号3)が残る。配列番号4または5に示され、配列番号67に示される核酸分子を含有するベクターの発現の際に生じる生成物は、C末端に不均一性を示す、培養培地中にrHuPH20と命名された分泌生成物をもたらし、その結果、生成物は、種々の存在量で配列番号3および44〜48のうち任意の1種または複数を含み得る種の混合物を含む。通常、rHuPH20は、哺乳類細胞、例えば、CHO細胞(例えば、DG44 CHO細胞)などの、正しいN−グリコシル化を促進し、活性を保持する細胞において産生される。Hylenex(登録商標)(Halozyme)は、切断型ヒトPH20ポリペプチド(rHuPH20と命名された)をコードする核酸を含有する遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞によって産生されるヒト組換えヒアルロニダーゼである。

C.修飾PH20ポリペプチド
修飾または変異体PH20ポリペプチドが本明細書において提供される。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、野生型、天然または参照PH20ポリペプチドと比較して変更された活性または特性を示す。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドの中に、活性突然変異体であり、それによって、アミノ酸修飾(例えば、アミノ酸置換)を含有しない対応するPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも40%を示すPH20ポリペプチドが含まれる。特に、ヒアルロニダーゼ活性を示し、アミノ酸修飾を含有しないPH20と比較して増大した安定性を示す、PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。また、不活性であり、例えば、避妊ワクチンにおいて抗原として使用され得る修飾PH20ポリペプチドも提供される。

修飾は、単一アミノ酸置換(replacements)(置換(substitutions))、挿入または欠失などの単一アミノ酸修飾である場合も、複数のアミノ酸置換、挿入または欠失などの複数アミノ酸修飾である場合もある。例示的修飾として、単一または複数のアミノ酸置換を含めたアミノ酸置換がある。アミノ酸置換は、表2に示されるものなどの保存的置換である場合も、本明細書に記載される任意のものなどの非保存的置換である場合もある。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、修飾を含有しないPH20ポリペプチドと比較して、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20もしくはそれ以上または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20もしくはそれ以上の修飾位置を含有し得る。

本明細書に記載された修飾は、修飾形態がヒアルロニダーゼ活性を示す限り、前駆体、成熟した、またはC末端切断形態を含めた任意のPH20ポリペプチド中にあり得る。例えば、PH20ポリペプチドは、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869もしくは870のいずれかに示される野生型、天然または参照PH20ポリペプチドと比較して、または配列番号3、6〜66、68〜72、856〜861、869もしくは870のいずれかに対して少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であるアミノ酸の配列を有するポリペプチド中に修飾を含有する。例えば、修飾は、配列番号7、配列番号69または配列番号72を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するヒトPH20ポリペプチド;配列番号16もしくは18を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するウシPH20ポリペプチド;配列番号24を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するウサギPH20ポリペプチド;配列番号14を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するカニクイザルPH20ポリペプチド;配列番号29を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するモルモットPH20ポリペプチド;配列番号22を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するラットPH20ポリペプチド;配列番号20を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するマウスPH20ポリペプチド;配列番号10もしくは870を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するチンパンジーPH20ポリペプチド;配列番号12を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するアカゲザルPH20ポリペプチド;配列番号31を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するキツネPH20ポリペプチド;配列番号857を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するテナガザルPH20ポリペプチド;配列番号859を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するマーモセットPH20ポリペプチド;配列番号861を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するオランウータンPH20ポリペプチド;または配列番号25〜27を含むか、もしくはそれに示されるアミノ酸の配列を有するヒツジPH20ポリペプチドにおいて;または配列番号7、10、12、14、16、18、20、22、24〜27、29、31、69、72、857、859、861もしくは870のいずれかに対して少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列変異体もしくは切断型変異体において行われる。

特に、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72に示されるPH20ポリペプチドまたは配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに対して少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であるアミノ酸の配列を有するポリペプチドと比較して修飾を含有するPH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供された修飾は、配列番号10、12、14、24、857、859、861または870として示されるPH20ポリペプチドにおいて行われ得る。

特に、本明細書において提供された修飾を含有するPH20ポリペプチドであり、細胞から発現されると、可溶性タンパク質として培地中に分泌される修飾された可溶性PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、修飾は、GPIアンカーシグナル配列を含有するPH20ポリペプチドのGPIアンカーシグナル配列を含有するC末端部分内またはその付近でC末端で切断されている可溶性PH20ポリペプチドにおいて行われる。C末端の切断は、得られるC末端で切断されたポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を示し、発現された場合に細胞から分泌される(例えば、培地中に)限り、C末端での8個の連続するアミノ酸の、C末端での9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個またはそれ以上のアミノ酸の切断または欠失であり得る。いくつかの例では、本明細書において提供された修飾は、配列番号7、10、12、14、69、72、857、859、861もしくは870のいずれかに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示す、配列番号7、10、12、14、69、72、857、859、861もしくは870のC末端で切断されたポリペプチドまたはその変異体である可溶性PH20ポリペプチドにおいて行われる。特に、本明細書において提供された修飾は、配列番号3もしくは32〜66に示されるアミノ酸の配列または配列番号3もしくは32〜66のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する、可溶性またはC末端で切断されたヒトPH20ポリペプチドにおいて行われる。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるPH20ポリペプチドに関連して、アミノ酸置換(replacements)または置換(substitutions)、付加または欠失、切断およびそれらの組合せを含有する。

修飾はまた、配列番号3、7、10、12、14、16、18、20、22、24〜27、29、31、32〜66、69、72、857、859、861または870のいずれかのシグナルペプチドを含有する対応する前駆体形態において行われ得る。例えば、本明細書において提供された修飾は、配列番号2、6、8、9、11、13、15、17、19、21、23、28、30、856、858、860もしくは869のいずれかまたは配列番号2、6、8、9、11、13、15、17、19、21、23、28、30、856、858、860もしくは869のいずれかに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体において示される前駆体形態において行われ得る。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドの例では、修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3〜66、68〜72、856〜861、869または870のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない。通常、修飾PH20ポリペプチドは、ヒトPH20ポリペプチドであり、配列番号8〜31、856〜861、869または870のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない。

一般に、PH20ポリペプチドでは、アミノ酸置換、欠失または置換などの任意の修飾が行われ得るが、ただし、修飾は、唯一の修飾が、V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、E249Q、R252T、N333AまたはN358Aである単一のアミノ酸置換であるアミノ酸置換ではない。また、修飾PH20ポリペプチドが、2つのみのアミノ酸置換を含有する場合には、アミノ酸置換は、P13A/L464W、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N219AまたはN333A/N358Aではない。さらなる例では、修飾PH20ポリペプチドが、3つのみのアミノ酸置換を含有する場合には、アミノ酸置換は、N47A/N131A/N219Aではない。本明細書において提供される例示的修飾を、以下に詳細に記載する。

本明細書における目的上、アミノ酸置換または置換を含めた本明細書における修飾の位置およびアミノ酸への言及は、配列番号3に示されるPH20ポリペプチドに関連してである。配列番号6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24〜27、28、29、30、31、32〜66、68〜72、856、857、858、859、860、861、869もしくは870に示されるいずれか、または配列番号6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24〜27、28、29、30、31、32〜66、68〜72、856、857、858、859、860、861、869もしくは870のいずれかに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体など、別のPH20ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を同定することによって別のPH20ポリペプチドにおいて本明細書において提供された修飾のいずれかを作製することは当業者のレベルの範囲内である。別のPH20ポリペプチド中の対応する位置は、PH20ポリペプチドの、配列番号3に示されるPH20ポリペプチドに関するアラインメントによって同定され得る。例えば、図2は、例示的PH20ポリペプチドの、配列番号3とのアラインメントおよび例示的な対応する位置の同定を表す。また、配列番号3、7、32〜66、69および72は、異なるC末端アミノ酸残基を有する成熟ヒトPH20のすべての形態であり、配列番号7、32〜66、69および72のいずれかにおけるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号3と同一であり、したがって、各々の対応する残基は、配列番号3に示されるものと同一である(例えば、図1参照のこと)。さらに、配列番号2、6、70または71のいずれかに示される配列番号は、シグナル配列の存在のみによって異なるその前駆体形態である。修飾(例えば、アミノ酸置換)の目的上、対応するアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であり得、配列番号3に示される残基と同一である必要はない。通常、配列番号3中の残基とのアラインメントによって同定される対応するアミノ酸残基は、配列番号3と同一であるアミノ酸残基か、それに対する保存的もしくは半保存的アミノ酸残基である(例えば、図2参照のこと)。また、本明細書において提供された例示的置換は、置換が、PH20ポリペプチドの非修飾形態において存在するのと異なる限り、PH20ポリペプチド中の対応する残基で行われ得ると理解される。この説明および本明細書中の他の場所での説明に基づいて、記載された突然変異の任意の1種または複数を含有する修飾PH20ポリペプチドを作製することおよび本明細書において記載されたような特性または活性について各々を試験することは、当業者のレベル内にある。

PH20ポリペプチドにおける修飾はまた、一次配列の修飾およびポリペプチドの一次配列にはない修飾を含めたその他の修飾も含有するPH20ポリペプチドに行われ得る。例えば、本明細書に記載された修飾は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドであるPH20ポリペプチドにおいてであり得る。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドはまた、PEG試薬などのポリマーとコンジュゲートしているポリペプチドも含む。

また、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。特定の例では、核酸配列は、例えば、コードされた配列の発現レベルを高めるようコドン最適化され得る。特定のコドン使用は、修飾ポリペプチドが発現される宿主生物に依存している。当業者ならば、哺乳類またはヒト細胞、例えば、大腸菌(E.coli)またはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を含めた細菌または酵母における発現にとっての最適コドンに精通している。例えば、コドン使用情報は、kazusa.or.jp.codon(データベースの説明についてはRichmond (2000) Genome Biology, 1:reports241を参照のこと)で入手可能なコドン使用データベース(Codon Usage Database)から入手可能である。Forsburg (1994) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78も参照のこと)。いくつかの例では、コードする核酸分子は、ポリペプチドの発現および分泌を変更する(例えば、高める)ために異種シグナル配列を含有するよう修飾され得る。異種シグナル配列の例示的なものとして、IgGκシグナル配列をコードする核酸(配列番号868に示される)がある。

本明細書において提供された修飾ポリペプチドおよびコードする核酸分子は、当業者公知の標準組換えDNA技術によって産生され得る。標的タンパク質中の任意の1種または複数種のアミノ酸の突然変異を達成するための当技術分野で公知の任意の方法が使用され得る。方法として、コードする核酸分子の標準的な部位指定またはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法が挙げられる。例えば、PH20ポリペプチドをコードする核酸分子は、コードする核酸のランダム突然変異誘発などの突然変異誘発、エラープローンPCR、位置指定突然変異誘発、オーバーラップPCR、遺伝子シャッフリングまたはその他の組換え法に付され得る。次いで、ポリペプチドをコードする核酸は、異種性に発現されるよう宿主細胞に導入され得る。したがって、本明細書において提供された修飾ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子もまた本明細書において提供される。いくつかの例では、修飾PH20ポリペプチドは、固相または液相ペプチド合成を使用してなど、合成によって産生される。

以下の小区分では、本明細書において提供される、特性および活性の変更を示す例示的修飾PH20ポリペプチドおよびコードする核酸分子を記載する。

1.活性突然変異体
PH20ポリペプチド中に1種または複数種のアミノ酸置換を含有し、ヒアルロニダーゼ活性を示す修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3または7に示されるポリペプチドなど、野生型または参照PH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の40%〜5000%を示し得る。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、野生型または参照PH20ポリペプチド、例えば、アミノ酸修飾(例えば、アミノ酸置換)を含有しない対応するポリペプチド、例えば、配列番号3または7に示されるポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも40%、例えば、ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%またはそれ以上を示す。例えば、例えば、アミノ酸置換(replacement)または置換(substitution)によって、修飾され得る例示的位置として、それだけには限らないが、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して位置1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446または447に対応する位置のいずれかが挙げられる。通常、PH20ポリペプチド中の上記の位置のいずれかに対応する位置で修飾される(例えば、別のアミノ酸で置換される)アミノ酸残基は、配列番号3に示されるアミノ酸残基の同一残基、保存的残基または半保存的アミノ酸残基である。

ヒアルロニダーゼ活性を保持するために、修飾は、通常、変化に対してあまり寛容でない、ヒアルロニダーゼ活性に必要な位置では行われない。例えば、一般に、修飾は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して位置7、16、17、18、19、21、25、53、55、56、57、62、64、76、78、80、88、95、100、101、109、111、112、113、115、116、121、123、126、129、185、187、188、189、190、191、194、199、201、203、207、210、223、225、227、228、229、241、243、244、246、249、250、252、254、262、268、282、295、296、298、299、303、319、322、329、330、332、333、336、337、340、341、344、345、346、350、352、354、355、362、363、364、365、366、370、372、382、384、386、390、400、402、408、423、424、429、430、431に対応する位置では行われない。また、修飾が、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して位置2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、94、96、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、197、198、200、202、204、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、425、426、427、428、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444、または447のいずれかで行われる例では、修飾(複数可)は、不活性ポリペプチドをもたらすアミノ酸置換である、本明細書において表5または10に示される対応するアミノ酸置換(複数可)ではない。例えば、修飾が、配列番号3に関連して位置2に対応する位置における修飾である場合には、修飾は、ヒスチジン(H)、リシン(K)、トリプトファン(W)またはチロシン(Y)への置換ではない。

上記の対応する位置のいずれかでの例示的アミノ酸置換は、表3に示される。表3中の対応するアミノ酸位置への言及は、配列番号3に示される位置に関してである。置換は、配列番号3に示される配列とのアラインメントによって別のPH20ポリペプチド中の対応する位置で行われ得(例えば、図1および2参照のこと)、それによって、対応する位置は、アラインされた位置であると理解される。特定の例では、アミノ酸置換(複数可)は、得られる修飾PH20ポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない対応するPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも40%を示す限り、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869または870のいずれかに示されるようなPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中の対応する位置であり得る。特に、置換(複数可)は、ヒトPH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに示されるいずれか、または配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すその変異体中の対応する位置においてであり得る。一例では、置換のうち任意の1種または複数は、得られる修飾PH20ポリペプチドが、配列番号3に示されるPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の少なくとも40%を示す限り、配列番号3においてである。




特定の例では、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して1、6、8、9、10、11、12、14、15、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、46、47、48、49、50、52、58、59、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、79、82、83、84、86、87、89、90、92、93、94、97、102、104、107、114、118、120、127、128、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、155、156、158、160、162、163、164、165、166、167、169、170、172、173、174、175、178、179、193、195、196、198、204、205、206、209、212、213、215、219、220、221、222、232、233、234、235、236、237、238、240、247、248、249、257、258、259、260、261、263、267、269、271、272、273、274、276、277、278、279、282、283、285、287、289、291、292、293、298、305、307、308、309、310、313、314、315、317、318、320、321、324、325、326、328、335、347、349、351、353、356、359、367、368、369、371、373、374、375、376、377、380、381、383、385、389、392、393、395、396、399、401、404、405、406、407、409、410、412、416、418、419、421、425、427、428、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446または447に対応する位置(単数または複数)にアミノ酸置換(単数または複数)を含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、アミノ酸位置は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1(L1)、P6、V8、I9、P10、N11、V12、F14、L15、A20、S22、F24、L26、G27、K28、F29、D30、E31、P32、L33、D34、M35、S36、L37、F38、S39、F40、I41、I46、N47、A48、T49、G50、G52、V58、D59、Y63、I67、D68、S69、I70、T71、G72、V73、T74、V75、I79、K82、I83、S84、G86、D87、L89、D90、A92、K93、K94、T97、V102、N104、M107、E114、T118、A120、D127、V128、K130、N131、R132、E135、Q138、Q139、Q140、N141、V142、Q143、L144、L146、T147、E148、A149、T150、E151、K152、Q155、E156、E158、A160、K162、D163、F164、L165、V166、E167、I169、K170、G172、K173、L174、L175、N178、H179、H193、K195、K196、G198、F204、N205、V206、K209、D212、D213、S215、N219、E220、S221、T222、T232、Q233、Q234、S235、P236、V237、A238、T240、V247、R248、E249、P257、D258、A259、K260、S261、L263、A267、T269、I271、V272、F273、T274、Q276、V277、L278、K279、S282、Q283、E285、V287、T289、G291、E292、T293、A298、G305、L307、S308、I309、M310、M313、K314、S315、L317、L318、D320、N321、E324、T325、I326、N328、T335、Q347、Q349、V351、I353、N356、S359、P367、D368、N369、A371、Q373、L374、E375、K376、G377、F380、T381、R383、K385、E389、E392、Q393、S395、E396、Y399、S401、S404、T405、L406、S407、K409、E410、A412、D416、D418、A419、D421、A425、G427、A428、D431、F433、P436、P437、M438、E439、T440、E441、E442、P443、Q444、I445、F446またはY447のロイシン(L)の置換に対応する位置の置換であり得る。

本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチド中の例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、各々、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1に対応する位置におけるヒスチジン(H)、位置1に対応する位置におけるA、位置1に対応する位置におけるE、位置1に対応する位置におけるG、位置1に対応する位置におけるK、位置1に対応する位置におけるQ、位置1に対応する位置におけるR、位置6に対応する位置におけるA、位置8に対応する位置におけるM、位置9に対応する位置におけるQ、位置10に対応する位置におけるG、位置10に対応する位置におけるH、位置11に対応する位置におけるS、位置12に対応する位置におけるE、位置12に対応する位置におけるI、位置12に対応する位置におけるK、位置12に対応する位置におけるT、位置14に対応する位置におけるV、位置15に対応する位置におけるV、位置15に対応する位置におけるM、位置20に対応する位置におけるS、位置22に対応する位置におけるT、位置24に対応する位置におけるE、位置24に対応する位置におけるH、位置24に対応する位置におけるR、位置26に対応する位置におけるA、位置26に対応する位置におけるE、位置26に対応する位置におけるK、位置26に対応する位置におけるM、位置26に対応する位置におけるQ、位置26に対応する位置におけるR、位置27に対応する位置におけるD、位置27に対応する位置におけるK、位置27に対応する位置におけるR、位置28に対応する位置におけるR、位置29に対応する位置におけるE、位置29に対応する位置におけるI、位置29に対応する位置におけるK、位置29に対応する位置におけるL、位置29に対応する位置におけるM、位置29に対応する位置におけるP、位置29に対応する位置におけるR、位置29に対応する位置におけるS、位置29に対応する位置におけるT、位置29に対応する位置におけるV、位置30に対応する位置におけるG、位置30に対応する位置におけるH、位置30に対応する位置におけるK、位置30に対応する位置におけるL、位置30に対応する位置におけるM、位置30に対応する位置におけるR、位置30に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるA、位置31に対応する位置におけるC、位置31に対応する位置におけるG、位置31に対応する位置におけるH、位置31に対応する位置におけるI、位置31に対応する位置におけるK、位置31に対応する位置におけるL、位置31に対応する位置におけるP、位置31に対応する位置におけるR、位置31に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるT、位置31に対応する位置におけるV、位置31に対応する位置におけるW、位置32に対応する位置におけるC、位置32に対応する位置におけるF、位置32に対応する位置におけるG、位置32に対応する位置におけるH、位置33に対応する位置におけるW、位置33に対応する位置におけるG、位置34に対応する位置におけるW、位置35に対応する位置におけるQ、位置35に対応する位置におけるV、位置36に対応する位置におけるH、位置36に対応する位置におけるN、位置37に対応する位置におけるF、位置37に対応する位置におけるM、位置38に対応する位置におけるY、位置39に対応する位置におけるA、位置39に対応する位置におけるL、位置39に対応する位置におけるN、位置39に対応する位置におけるT、位置40に対応する位置におけるL、位置41に対応する位置におけるT、位置46に対応する位置におけるL、位置46に対応する位置におけるR、位置47に対応する位置におけるD、位置47に対応する位置におけるF、位置47に対応する位置におけるT、位置47に対応する位置におけるWでの、位置48に対応する位置におけるF、位置48に対応する位置におけるH、位置48に対応する位置におけるK、位置48に対応する位置におけるN、位置49に対応する位置におけるR、位置50に対応する位置におけるD、位置50に対応する位置におけるS、位置50に対応する位置におけるM、位置52に対応する位置におけるN、位置52に対応する位置におけるQ、位置52に対応する位置におけるR、位置52に対応する位置におけるS、位置52に対応する位置におけるT、位置58に対応する位置におけるC、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるL、位置58に対応する位置におけるP、位置58に対応する位置におけるQ、位置58に対応する位置におけるR、位置58に対応する位置におけるH、位置58に対応する位置におけるN、位置58に対応する位置におけるY、位置59に対応する位置におけるN、位置63に対応する位置におけるK、位置63に対応する位置におけるL、位置63に対応する位置におけるM、位置63に対応する位置におけるR、位置63に対応する位置におけるW、位置67に対応する位置におけるV、位置68に対応する位置におけるH、位置68に対応する位置におけるP、位置68に対応する位置におけるQ、位置69に対応する位置におけるA、位置69に対応する位置におけるC、位置69に対応する位置におけるE、位置69に対応する位置におけるF、位置69に対応する位置におけるG、位置69に対応する位置におけるI、位置69に対応する位置におけるL、位置69に対応する位置におけるM、位置69に対応する位置におけるP、位置69に対応する位置におけるR、位置69に対応する位置におけるT、位置69に対応する位置におけるW、位置69に対応する位置におけるY、位置70に対応する位置におけるA、位置70に対応する位置におけるC、位置70に対応する位置におけるF、位置70に対応する位置におけるG、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるK、位置70に対応する位置におけるL、位置70に対応する位置におけるN、位置70に対応する位置におけるP、位置70に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるS、位置70に対応する位置におけるT、位置70に対応する位置におけるV、位置70に対応する位置におけるY、位置71に対応する位置におけるG、位置71に対応する位置におけるN、位置71に対応する位置におけるR、位置71に対応する位置におけるS、位置72に対応する位置におけるK、位置72に対応する位置におけるM、位置72に対応する位置におけるQ、位置73に対応する位置におけるA、位置73に対応する位置におけるH、位置73に対応する位置におけるK、位置73に対応する位置におけるL、位置73に対応する位置におけるQ、位置73に対応する位置におけるR、位置73に対応する位置におけるT、位置73に対応する位置におけるW、位置74に対応する位置におけるA、位置74に対応する位置におけるC、位置74に対応する位置におけるE、位置74に対応する位置におけるF、位置74に対応する位置におけるG、位置74に対応する位置におけるH、位置74に対応する位置におけるK、位置74に対応する位置におけるL、位置74に対応する位置におけるM、位置74に対応する位置におけるN、位置74に対応する位置におけるP、位置74に対応する位置におけるR、位置74に対応する位置におけるS、位置74に対応する位置におけるV、位置74に対応する位置におけるW、位置75に対応する位置におけるF、位置75に対応する位置におけるL、位置75に対応する位置におけるM、位置75に対応する位置におけるR、位置75に対応する位置におけるT、位置79に対応する位置におけるL、位置82に対応する位置におけるL、位置82に対応する位置におけるN、位置83に対応する位置におけるV、位置83に対応する位置におけるQ、位置83に対応する位置におけるS、位置83に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるE、位置84に対応する位置におけるF、位置84に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるN、位置84に対応する位置におけるR、位置86に対応する位置におけるA、位置86に対応する位置におけるH、位置86に対応する位置におけるK、位置86に対応する位置におけるN、位置86に対応する位置におけるS、位置86に対応する位置におけるT、位置86に対応する位置におけるW、位置87に対応する位置におけるC、位置87に対応する位置におけるG、位置87に対応する位置におけるL、位置87に対応する位置におけるM、位置87に対応する位置におけるR、位置87に対応する位置におけるS、位置87に対応する位置におけるT、位置87に対応する位置におけるV、位置87に対応する位置におけるY、位置89に対応する位置におけるC、位置90に対応する位置におけるA、位置90に対応する位置におけるE、位置90に対応する位置におけるH、位置90に対応する位置におけるK、位置90に対応する位置におけるN、位置90に対応する位置におけるR、位置92に対応する位置におけるC、位置92に対応する位置におけるL、位置93に対応する位置におけるI、位置93に対応する位置におけるL、位置93に対応する位置におけるQ、位置93に対応する位置におけるR、位置93に対応する位置におけるS、位置93に対応する位置におけるT、位置94に対応する位置におけるD、位置94に対応する位置におけるQ、位置94に対応する位置におけるR、位置97に対応する位置におけるA、位置97に対応するアミノ酸残基でのC、位置97に対応する位置におけるD、位置97に対応する位置におけるE、位置97に対応する位置におけるG、位置97に対応する位置におけるL、位置97に対応する位置におけるS、位置102に対応する位置におけるS、位置102に対応する位置におけるT、位置104に対応する位置におけるR、位置107に対応する位置におけるL、位置114に対応する位置におけるA、位置118に対応する位置におけるQ、位置120に対応する位置におけるH、位置120に対応する位置におけるF、位置120に対応する位置におけるI、位置120に対応する位置におけるS、位置120に対応する位置におけるV、位置120に対応する位置におけるY、位置127に対応する位置におけるE、位置127に対応する位置におけるH、位置127に対応する位置におけるN、位置127に対応する位置におけるQ、位置127に対応する位置におけるR、位置128に対応する位置におけるI、位置130に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるG、位置131に対応する位置におけるI、位置131に対応する位置におけるM、位置131に対応する位置におけるQ、位置131に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるV、位置132に対応する位置におけるN、位置132に対応する位置におけるL、位置135に対応する位置におけるD、位置135に対応する位置におけるG、位置135に対応する位置におけるRでの、位置138に対応する位置におけるL、位置139に対応する位置におけるT、位置140に対応する位置におけるK、位置141に対応する位置におけるH、位置141に対応する位置におけるR、位置141に対応する位置におけるS、位置141に対応する位置におけるW、位置141に対応する位置におけるY、位置142に対応する位置におけるD、位置142に対応する位置におけるG、位置142に対応する位置におけるK、位置142に対応する位置におけるN、位置142に対応する位置におけるP、位置142に対応する位置におけるQ、位置142に対応する位置におけるR、位置142に対応する位置におけるS、位置142に対応する位置におけるT、位置143に対応する位置におけるG、位置143に対応する位置におけるK、位置144に対応する位置におけるR、位置144に対応する位置におけるT、位置146に対応する位置におけるP、位置146に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるA、位置147に対応する位置におけるF、位置147
に対応する位置におけるL、位置147に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるS、位置147に対応する位置におけるV、位置148に対応する位置におけるH、位置148に対応する位置におけるK、位置148に対応する位置におけるQ、位置149に対応する位置におけるT、位置149に対応する位置におけるV、位置150に対応する位置におけるA、位置150に対応する位置におけるD、位置150に対応する位置におけるG、位置150に対応する位置におけるN、位置150に対応する位置におけるS、位置150に対応する位置におけるW、位置150に対応する位置におけるY、位置151に対応する位置におけるA、位置151に対応する位置におけるH、位置151に対応する位置におけるK、位置151に対応する位置におけるL、位置151に対応する位置におけるM、位置151に対応する位置におけるQ、位置151に対応する位置におけるR、位置151に対応する位置におけるS、位置151に対応する位置におけるT、位置151に対応する位置におけるV、位置151に対応する位置におけるW、位置151に対応する位置におけるY、位置152に対応する位置におけるR、位置152に対応する位置におけるT、位置152に対応する位置におけるW、位置155に対応する位置におけるD、位置155に対応する位置におけるG、位置155に対応する位置におけるK、位置155に対応する位置におけるR、位置156に対応する位置におけるD、位置158に対応する位置におけるQ、位置158に対応する位置におけるS、位置160に対応する位置におけるS、位置162に対応する位置におけるE、位置163に対応する位置におけるA、位置163に対応する位置におけるE、位置163に対応する位置におけるK、位置163に対応する位置におけるQ、位置163に対応する位置におけるR、位置163に対応する位置におけるS、位置164に対応する位置におけるM、位置164に対応する位置におけるV、位置165に対応する位置におけるD、位置165に対応する位置におけるF、位置165に対応する位置におけるN、位置165に対応する位置におけるS、位置165に対応する位置におけるV、位置166に対応する位置におけるA、位置166に対応する位置におけるE、位置166に対応する位置におけるF、位置166に対応する位置におけるH、位置166に対応する位置におけるL、位置166に対応する位置におけるQ、位置166に対応する位置におけるR、位置166に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるW、位置166に対応する位置におけるY、位置167に対応する位置におけるD、位置169に対応する位置におけるL、位置170に対応する位置におけるR、位置172に対応する位置におけるA、位置173に対応する位置におけるR、位置174に対応する位置におけるG、位置174に対応する位置におけるK、位置174に対応する位置におけるN、位置174に対応する位置におけるR、位置174に対応する位置におけるT、位置175に対応する位置におけるT、位置178に対応する位置におけるK、位置178に対応する位置におけるR、位置179に対応する位置におけるK、位置193に対応する位置におけるQ、位置195に対応する位置におけるT、位置195に対応する位置におけるNでの、位置196に対応する位置におけるE、位置196に対応する位置におけるRでの、位置198に対応する位置におけるD、位置204に対応する位置におけるP、位置205に対応する位置におけるA、位置205に対応する位置におけるE、位置205に対応する位置におけるL、位置205に対応する位置におけるT、位置206に対応する位置におけるI、位置206に対応する位置におけるK、位置206に対応する位置におけるL、位置206に対応する位置におけるR、位置209に対応する位置におけるR、位置212に対応する位置におけるN、位置212に対応する位置におけるS、位置213に対応する位置におけるA、位置213に対応する位置におけるM、位置213に対応する位置におけるN、位置215に対応する位置におけるH、位置215に対応する位置におけるM、位置219に対応する位置におけるA、位置219に対応する位置におけるI、位置219に対応する位置におけるK、位置219に対応する位置におけるS、位置220に対応する位置におけるH、位置220に対応する位置におけるI、位置220に対応する位置におけるL、位置220に対応する位置におけるV、位置221に対応する位置におけるQ、位置222に対応する位置におけるG、位置232に対応する位置におけるF、位置233に対応する位置におけるG、位置233に対応する位置におけるK、位置233に対応する位置におけるR、位置234に対応する位置におけるM、位置235に対応する位置におけるA、位置236に対応する位置におけるR、位置237に対応する位置におけるC、位置237に対応する位置におけるE、位置237に対応する位置におけるH、位置237に対応する位置におけるQ、位置237に対応する位置におけるT、位置238に対応する位置におけるE、アミノ酸位置238に対応する位置におけるH、位置238に対応する位置におけるS、位置240に対応する位置におけるA、位置240に対応する位置におけるQ、位置247に対応する位置におけるI、位置248に対応する位置におけるA、位置249に対応する位置におけるV、位置257に対応する位置におけるG、位置257に対応する位置におけるT、位置257に対応する位置におけるR、位置258に対応する位置におけるN、位置258に対応する位置におけるS、位置259に対応する位置におけるP、位置260に対応する位置におけるM、位置260に対応する位置におけるY、位置261に対応する位置におけるA、位置261に対応する位置におけるK、位置261に対応する位置におけるN、位置263に対応する位置におけるK、位置263に対応する位置におけるR、位置267に対応する位置におけるT、位置269に対応する位置におけるA、位置271に対応する位置におけるL、位置271に対応する位置におけるM、位置272に対応する位置におけるD、位置272に対応する位置におけるT、位置273に対応する位置におけるH、位置273に対応する位置におけるY、位置274に対応する位置におけるF、位置276に対応する位置におけるD、位置276に対応する位置におけるH、位置276に対応する位置におけるM、位置276に対応する位置におけるR、位置276に対応する位置におけるS、位置276に対応する位置におけるY、位置277に対応する位置におけるA、位置277に対応する位置におけるE、位置277に対応する位置におけるH、位置277に対応する位置におけるK、位置277に対応する位置におけるM、位置277に対応する位置におけるN、位置277に対応する位置におけるQ、位置277に対応する位置におけるR、位置277に対応する位置におけるS、位置277に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるE、位置278に対応する位置におけるF、位置278に対応する位置におけるG、位置278に対応する位置におけるH、位置278に対応する位置におけるK、位置278に対応する位置におけるN、位置278に対応する位置におけるR、位置278に対応する位置におけるS、位置278に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるY、位置279に対応する位置におけるH、位置282に対応する位置におけるM、位置283に対応する位置におけるS、位置285に対応する位置におけるH、位置287に対応する位置におけるT、位置289に対応する位置におけるS、位置291に対応する位置におけるS、位置291に対応する位置におけるV、位置292に対応する位置におけるC、位置292に対応する位置におけるF、位置292に対応する位置におけるH、位置292に対応する位置におけるK、位置292に対応する位置におけるR、位置292に対応する位置におけるV、位置293に対応する位置におけるA、位置293に対応する位置におけるC、位置293に対応する位置におけるD、位置293に対応する位置におけるF、位置293に対応する位置におけるK、位置293に対応する位置におけるM、位置293に対応する位置におけるP、位置293に対応する位置におけるQ、位置293に対応する位置におけるV、位置293に対応する位置におけるY、位置298に対応する位置におけるG、位置305に対応する位置におけるE、位置307に対応する位置におけるG、位置308に対応する位置におけるD、位置308に対応する位置におけるG、位置308に対応する位置におけるK、位置308に対応する位置におけるN、位置308に対応する位置におけるR、位置309に対応する位置におけるE、位置309に対応する位置におけるG、位置309に対応する位置におけるH、位置309に対応する位置におけるL、位置309に対応する位置におけるM、位置309に対応する位置におけるN、位置309に対応する位置におけるQ、位置309に対応する位置におけるR、位置309に対応する位置におけるS、位置309に対応する位置におけるT、位置309に対応する位置におけるV、位置310に対応する位置におけるA、位置310に対応する位置におけるG、位置310に対応する位置におけるQ、位置310に対応する位置におけるS、位置313に対応する位置におけるA、位置313に対応する位置におけるG、位置313に対応する位置におけるH、位置313に対応する位置におけるK、位置313に対応する位置におけるP、位置313に対応する位置におけるR、位置313に対応する位置におけるT、位置313に対応する位置におけるYでの、位置314に対応する位置におけるS、位置314に対応する位置におけるY、位置315に対応する位置におけるA、位置315に対応する位置におけるH、位置315に対応する位置におけるY、位置317に対応する位置におけるA、位置317に対応する位置におけるI、位置317に対応する位置におけるK、位置317に対応する位置におけるN、位置317に対応する位置におけるQ、位置317に対応する位置におけるR、位置317に対応する位置におけるS、位置317に対応する位置におけるT、位置317に対応する位置におけるW、位置318に対応する位置におけるD、位置318に対応する位置におけるH、位置318に対応する位置におけるK、位置318に対応する位置におけるM、位置318に対応する位置におけるR、位置320に対応する位置におけるH、位置320に対応する位置におけるK、位置320に対応する位置におけるR、位置321に対応する位置におけるR、位置321に対応する位置におけるS、位置324に対応する位置におけるN、位置324に対応する位置におけるR、位置325に対応する位置におけるA、位置325に対応する位置におけるD、位置325に対応する位置におけるE、位置325に対応する位置におけるG、位置325に対応する位置におけるH、位置325に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるM、位置325に対応する位置におけるN、位置325に対応する位置におけるQ、位置325に対応する位置におけるS、位置325に対応する位置におけるV、位置326に対応する位置におけるL、位置326に対応する位置におけるV、位置328に対応する位置におけるC、位置328に対応する位置におけるG、位置328に対応する位置におけるI、位置328に対応する位置におけるK、位置328に対応する位置におけるL、位置328に対応する位置におけるS、位置328に対応する位置におけるY、位置335に対応する位置におけるS、位置347に対応する位置におけるA、位置347に対応する位置におけるG、位置347に対応する位置におけるS、位置349に対応する位置におけるM、位置34
9に対応する位置におけるR、位置351に対応する位置におけるS、位置353に対応する位置におけるVでの、位置356に対応する位置におけるH、位置356に対応する位置におけるS、位置359に対応する位置におけるE、位置359に対応する位置におけるH、位置359に対応する位置におけるT、位置367に対応する位置におけるA、位置367に対応する位置におけるG、位置367に対応する位置におけるK、位置367に対応する位置におけるS、位置368に対応する位置におけるA、位置368に対応する位置におけるE、位置368に対応する位置におけるK、アミノ酸位置368に対応する位置におけるL、アミノ酸位置368に対応する位置におけるM、位置368に対応する位置におけるR、アミノ酸位置368に対応する位置におけるT、位置369に対応する位置におけるH、位置369に対応する位置におけるR、位置371に対応する位置におけるF、位置371に対応する位置におけるH、位置371に対応する位置におけるK、位置371に対応する位置におけるL、位置371に対応する位置におけるR、位置371に対応する位置におけるS、位置373に対応する位置におけるM、位置374に対応する位置におけるH、位置374に対応する位置におけるP、位置375に対応する位置におけるA、位置375に対応する位置におけるG、位置375に対応する位置におけるK、位置375に対応する位置におけるR、位置376に対応する位置におけるD、位置376に対応する位置におけるE、位置376に対応する位置におけるQ、位置376に対応する位置におけるR、位置376に対応する位置におけるT、位置376に対応する位置におけるV、位置376に対応する位置におけるY、位置377に対応する位置におけるD、位置377に対応する位置におけるE、位置377に対応する位置におけるH、位置377に対応する位置におけるK、位置377に対応する位置におけるP、位置377に対応する位置におけるR、位置377に対応する位置におけるS、位置377に対応する位置におけるT、位置380に対応する位置におけるW、位置380に対応する位置におけるY、位置381に対応する位置におけるS、位置383に対応する位置におけるI、位置383に対応する位置におけるK、位置383に対応する位置におけるL、位置383に対応する位置におけるS、位置385に対応する位置におけるA、位置385に対応する位置におけるQ、位置385に対応する位置におけるV、位置389に対応する位置におけるA、位置389に対応する位置におけるG、位置389に対応する位置におけるL、位置389に対応する位置におけるK、位置389に対応する位置におけるQ、位置389に対応する位置におけるS、位置392に対応する位置におけるA、位置392に対応する位置におけるF、位置392に対応する位置におけるM、位置392に対応する位置におけるQ、位置392に対応する位置におけるR、位置392に対応する位置におけるV、位置393に対応する位置におけるF、位置393に対応する位置におけるM、位置395に対応する位置におけるA、位置395に対応する位置におけるH、位置395に対応する位置におけるR、位置396に対応する位置におけるA、位置396に対応する位置におけるH、位置396に対応する位置におけるQ、位置396に対応する位置におけるS、位置399に対応する位置におけるK、位置399に対応する位置におけるM、位置399に対応する位置におけるT、位置399に対応する位置におけるV、位置399に対応する位置におけるW、位置401に対応する位置におけるA、位置401に対応する位置におけるE、位置404に対応する位置におけるA、位置405に対応する位置におけるG、位置406に対応する位置におけるF、位置406に対応する位置におけるN、位置407に対応する位置におけるA、位置407に対応する位置におけるD、位置407に対応する位置におけるE、位置407に対応する位置におけるF、位置407に対応する位置におけるH、位置407に対応する位置におけるQ、位置407に対応する位置におけるP、位置409に対応する位置におけるA、位置409に対応する位置におけるQ、位置410に対応する位置におけるT、位置412に対応する位置におけるQ、位置412に対応する位置におけるR、位置412に対応する位置におけるV、位置416に対応する位置におけるL、位置418に対応する位置におけるE、位置418に対応する位置におけるL、位置418に対応する位置におけるP、位置418に対応する位置におけるR、位置418に対応する位置におけるV、位置419に対応する位置におけるF、位置419に対応する位置におけるH、位置419に対応する位置におけるI、位置419に対応する位置におけるK、位置419に対応する位置におけるR、位置419に対応する位置におけるS、位置419に対応する位置におけるY、位置421に対応する位置におけるA、位置421に対応する位置におけるH、位置421に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるN、位置421に対応する位置におけるQ、位置421に対応する位置におけるR、位置421に対応する位置におけるS、位置425に対応する位置におけるG、位置425に対応する位置におけるK、位置427に対応する位置におけるQ、位置427に対応する位置におけるT、位置428に対応する位置におけるL、位置431に対応する位置におけるA、位置431に対応する位置におけるG、位置431に対応する位置におけるE、位置431に対応する位置におけるH、位置431に対応する位置におけるK、位置431に対応する位置におけるL、位置431に対応する位置におけるN、位置431に対応する位置におけるQ、位置431に対応する位置におけるR、位置431に対応する位置におけるS、位置431に対応する位置におけるV、位置433に対応する位置におけるA、位置433に対応する位置におけるH、位置433に対応する位置におけるI、位置433に対応する位置におけるK、位置433に対応する位置におけるL、位置433に対応する位置におけるR、位置433に対応する位置におけるT、位置433に対応する位置におけるV、位置433に対応する位置におけるW、位置436に対応する位置におけるK、位置437に対応する位置におけるI、位置437に対応する位置におけるM、位置438に対応する位置におけるA、位置438に対応する位置におけるD、位置438に対応する位置におけるE、位置438に対応する位置におけるL、位置438に対応する位置におけるN、位置438に対応する位置におけるT、位置439に対応する位置におけるA、位置439に対応する位置におけるC、位置439に対応する位置におけるK、位置439に対応する位置におけるP、位置439に対応する位置におけるQ、位置439に対応する位置におけるT、位置439に対応する位置におけるV、位置440に対応する位置におけるD、位置440に対応する位置におけるH、位置440に対応する位置におけるM、位置440に対応する位置におけるP、位置440に対応する位置におけるR、位置440に対応する位置におけるS、位置441に対応する位置におけるA、位置441に対応する位置におけるF、位置442に対応する位置におけるC、位置442に対応する位置におけるG、位置442に対応する位置におけるR、位置443に対応する位置におけるA、位置443に対応する位置におけるE、位置443に対応する位置におけるF、位置443に対応する位置におけるG、位置443に対応する位置におけるM、位置443に対応する位置におけるN、位置444に対応する位置におけるE、位置444に対応する位置におけるH、位置444に対応する位置におけるV、位置445に対応する位置におけるH、位置445に対応する位置におけるM、位置445に対応する位置におけるN、位置445に対応する位置におけるP、位置445に対応する位置におけるQ、位置445に対応する位置におけるS、位置445に対応する位置におけるT、位置445に対応する位置におけるV、位置445に対応する位置におけるW、位置446に対応する位置におけるA、位置446に対応する位置におけるM、位置446に対応する位置におけるW、位置447に対応する位置におけるD、位置447に対応する位置におけるE、位置447に対応する位置におけるG、位置447に対応する位置におけるI、位置447に対応する位置におけるN、位置447に対応する位置におけるP、位置447に対応する位置におけるQ、位置447に対応する位置におけるTを用いた置換および/または位置447に対応する位置におけるVを用いた置換が挙げられる。

このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号74〜855のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号74〜855のいずれかに対して少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有し、ヒアルロニダーゼ活性を示すアミノ酸の配列を有するいずれかがある。

本明細書において提供される上記の修飾PH20ポリペプチドのいずれも、アミノ酸修飾(例えば、アミノ酸置換)を含有しない対応するPH20ポリペプチドと比較して、変更された、例えば、改善または増大した特性または活性を示し得る。例えば、変更された活性または特性は、変性条件下で、増大した触媒活性および/または増大した安定性であり得る。

a.増大した活性
PH20ポリペプチド中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、アミノ酸置換(複数可)を含有しない対応するPH20ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す修飾または変異体PH20ポリペプチド、例えば、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869もしくは870のいずれかに示されるPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体が、本明細書において提供される。特に、本明細書において提供される修飾または変異体PH20ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しない対応するPH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに示されるPH20ポリペプチド、特に、配列番号3に示されるPH20ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す。

修飾PH20ポリペプチドは、同一条件下で、アミノ酸置換(複数可)を含有しない対応するPH20ポリペプチド、例えば、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869もしくは870のいずれかに示されるPH20ポリペプチドまたはその変異体のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも120%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%またはおよそ少なくとも120%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%であるヒアルロニダーゼ活性を示し得る。例えば、ヒアルロニダーゼ活性は、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍もしくはそれ以上またはおよそ少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍もしくはそれ以上増大される。

特定の例では、修飾PH20ポリペプチドは、増大したヒアルロニダーゼ活性と関連していると同定された1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。本明細書において記載されたように、このような位置は、増大したヒアルロニダーゼ活性をもたらす位置を同定するための突然変異誘発および選択またはスクリーニング法を使用して同定されている。PH20ポリペプチドはまた、得られる修飾PH20ポリペプチドが、アミノ酸置換(複数可)などのアミノ酸修飾(複数可)を含有しないPH20と比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す限り、単独で活性の増大と関連していないその他のアミノ酸置換などのその他の修飾を含有し得る。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。挿入または欠失などのさらなる修飾も含まれ得る。アミノ酸置換は、配列番号2,3、6〜66、68〜72、856〜861、869もしくは870のいずれかに示されるようなPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体においてであり得る。例えば、置換(複数可)は、ヒトPH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに示されるいずれか、またはその変異体においてであり得る。

例えば、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して位置1、12、15、24、26、27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446または447に対応する1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換(replacement)(置換(substitution))を含有する。例えば、アミノ酸位置は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1でのロイシン(L)の置換(L1)、V12、L15、F24、L26、G27、F29、D30、E31、P32、L33、L37、S39、I46、A48、G52、V58、Y63、I67、D68、S69、I70、T71、G72、V73、T74、V75、S84、G86、D87、A92、K93、K94、T97、T118、A120、D127、N131、E135、N141、V142、T147、E148、T150、E151、K152、Q155、E156、D163、F164、L165、V166、I169、K170、L174、G198、V206、K209、D212、D213、S215、N219、Q233、Q234、P236、A238、V247、P257、A259、K260、S261、L263、T269、I271、V272、Q276、V277、L278、S282、G291、T293、G305、S308、I309、M310、M313、S315、L317、L318、D320、E324、T325、I326、N328、Q347、I353、S359、A371、G377、F380、E389、E392、S395、Y399、T405、S407、K409、E410、D418、A419、D421、A425、D431、F433、P436、P437、M438、E439、T440、E441、E442、P443、I445、F446またはY447に対応する位置における置換であり得る。このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、アミノ酸置換を含有しない対応するPH20ポリペプチドの少なくとも1.5倍またはそれ以上の活性を示すポリペプチドがある。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチド中のアミノ酸置換の例示的なものとして、それだけには限らないが、各々、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1に対応する位置におけるヒスチジン(H);位置1に対応する位置におけるQ、位置12に対応する位置におけるE、位置12に対応する位置におけるT、位置15に対応する位置におけるV、位置24に対応する位置におけるE、位置24に対応する位置におけるH、位置26に対応する位置におけるE、位置26に対応する位置におけるK、位置27に対応する位置におけるK、位置27に対応する位置におけるR、位置29に対応する位置におけるE、位置29に対応する位置におけるI、位置29に対応する位置におけるL、位置29に対応する位置におけるM、位置29に対応する位置におけるP、位置29に対応する位置におけるS、位置29に対応する位置におけるV、位置30に対応する位置におけるG、位置30に対応する位置におけるH、位置30に対応する位置におけるK、位置30に対応する位置におけるM、位置30に対応する位置におけるR、位置30に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるA、位置31に対応する位置におけるC、位置31に対応する位置におけるH、位置31に対応する位置におけるI、位置31に対応する位置におけるK、位置31に対応する位置におけるL、位置31に対応する位置におけるP、位置31に対応する位置におけるR、位置31に対応する位置におけるS、位置31に対応する位置におけるT、位置31に対応する位置におけるV、位置32に対応する位置におけるF、位置32に対応する位置におけるG、位置32に対応する位置におけるH、位置33に対応する位置におけるW、位置37に対応する位置におけるF、位置39に対応する位置におけるN、位置39に対応する位置におけるT、位置46に対応する位置におけるR、位置48に対応する位置におけるF、位置48に対応する位置におけるH、位置48に対応する位置におけるN、位置52に対応する位置におけるQ、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるQ、位置63に対応する位置におけるW、位置67に対応する位置におけるV、位置68に対応する位置におけるH、位置68に対応する位置におけるQ、位置69に対応する位置におけるA、位置69に対応する位置におけるC、位置69に対応する位置におけるF、位置69に対応する位置におけるG、位置69に対応する位置におけるI、位置69に対応する位置におけるL、位置69に対応する位置におけるM、位置69に対応する位置におけるP、位置69に対応する位置におけるR、位置69に対応する位置におけるW、位置69に対応する位置におけるY、位置70に対応する位置におけるA、位置70に対応する位置におけるC、位置70に対応する位置におけるF、位置70に対応する位置におけるG、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるK、位置70に対応する位置におけるL、位置70に対応する位置におけるN、位置70に対応する位置におけるP、位置70に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるS、位置70に対応する位置におけるT、位置70に対応する位置におけるV、位置71に対応する位置におけるR、位置71に対応する位置におけるS、位置72に対応する位置におけるM、位置72に対応する位置におけるQ、位置73に対応する位置におけるH、位置73に対応する位置におけるL、位置73に対応する位置におけるW、位置74に対応する位置におけるA、位置74に対応する位置におけるC、位置74に対応する位置におけるG、位置74に対応する位置におけるN、位置74に対応する位置におけるP、位置74に対応する位置におけるR、位置74に対応する位置におけるS、位置74に対応する位置におけるV、位置74に対応する位置におけるW、位置75に対応する位置におけるF、位置75に対応する位置におけるL、位置75に対応する位置におけるR、位置75に対応する位置におけるT、位置84に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるR、位置86に対応する位置におけるA、位置87に対応する位置におけるC、位置87に対応する位置におけるT、位置87に対応する位置におけるY、位置92に対応する位置におけるC、位置93に対応する位置におけるI、位置93に対応する位置におけるL、位置93に対応する位置におけるR、位置93に対応する位置におけるT、位置94に対応する位置におけるR、位置97に対応する位置におけるG、位置118に対応する位置におけるQ、位置120に対応する位置におけるF、位置120に対応する位置におけるV、位置120に対応する位置におけるY、位置127に対応する位置におけるH、位置127に対応する位置におけるN、位置131に対応する位置におけるG、位置131に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるV、位置135に対応する位置におけるD、位置135に対応する位置におけるG、位置135に対応する位置におけるRでの、位置141に対応する位置におけるH、位置141に対応する位置におけるY、位置142に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるR、位置147に対応する位置におけるV、位置148に対応する位置におけるK、位置150に対応する位置におけるG、位置151に対応する位置におけるK、位置151に対応する位置におけるL、位置151に対応する位置におけるM、位置151に対応する位置におけるQ、位置151に対応する位置におけるR、位置152に対応する位置におけるR、位置155に対応する位置におけるG、位置155に対応する位置におけるK、位置156に対応する位置におけるD、位置163に対応する位置におけるA、位置163に対応する位置におけるE、位置163に対応する位置におけるK、位置163に対応する位置におけるR、位置164に対応する位置におけるM、位置165に対応する位置におけるD、位置165に対応する位置におけるN、位置166に対応する位置におけるA、位置166に対応する位置におけるF、位置166に対応する位置におけるH、位置166に対応する位置におけるL、位置166に対応する位置におけるQ、位置166に対応する位置におけるR、位置166に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるY、位置169に対応する位置におけるL、位置170に対応する位置におけるR、位置174に対応する位置におけるK、位置198に対応する位置におけるD、位置206に対応する位置におけるK、位置206に対応する位置におけるL、位置212に対応する位置におけるN、位置213に対応する位置におけるM、位置213に対応する位置におけるN、位置215に対応する位置におけるM、位置219に対応する位置におけるS、位置233に対応する位置におけるK、位置233に対応する位置におけるR、位置234に対応する位置におけるM、位置236に対応する位置におけるR、位置237に対応する位置におけるE、位置238に対応する位置におけるS、位置247に対応する位置におけるI、位置257に対応する位置におけるT、位置259に対応する位置におけるP、位置260に対応する位置におけるY、位置261に対応する位置におけるK、位置261に対応する位置におけるN、位置263に対応する位置におけるK、位置263に対応する位置におけるR、位置269に対応する位置におけるA、位置271に対応する位置におけるL、位置271に対応する位置におけるM、位置272に対応する位置におけるT、位置276に対応する位置におけるD、位置276に対応する位置におけるS、位置276に対応する位置におけるY、位置277に対応する位置におけるK、位置277に対応する位置におけるR、位置277に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるH、位置278に対応する位置におけるK、位置278に対応する位置におけるN、位置278に対応する位置におけるR、位置278に対応する位置におけるS、位置278に対応する位置におけるT、位置278に対応する位置におけるY、位置282に対応する位置におけるM、位置291に対応する位置におけるV、位置293に対応する位置におけるA、位置293に対応する位置におけるC、位置293に対応する位置におけるF、位置293に対応する位置におけるM、位置293に対応する位置におけるP、位置293に対応する位置におけるQ、位置293に対応する位置におけるV、位置305に対応する位置におけるE、位置308に対応する位置におけるG、位置308に対応する位置におけるN、位置309に対応する位置におけるE、位置309に対応する位置におけるL、位置309に対応する位置におけるN、位置309に対応する位置におけるQ、位置309に対応する位置におけるR、位置309に対応する位置におけるT、位置310に対応する位置におけるA、位置310に対応する位置におけるG、位置313に対応する位置におけるK、位置313に対応する位置におけるR、位置315に対応する位置におけるH、位置317に対応する位置におけるI、位置317に対応する位置におけるK、位置317に対応する位置におけるR、位置318に対応する位置におけるM、位置320に対応する位置におけるH、位置320に対応する位置におけるK、位置320に対応する位置におけるR、位置324に対応する位置におけるR、位置325に対応する位置におけるA、位置325に対応する位置におけるD、位置325に対応する位置におけるE、位置325に対応する位置におけるG、位置325に対応する位置におけるH、位置325に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるM、位置325に対応する位置におけるN、位置325に対応する位置におけるQ、位置325に対応する位置におけるS、位置326に対応する位置におけるV、位置328に対応する位置におけるI、位置328に対応する位置におけるK、位置328に対応する位置におけるL、位置328に対応する位置におけるS、位置328に対応する位置におけるY、位置347に対応する位置におけるG、位置347に対応する位置におけるS、位置353に対応する位置におけるVでの、位置359に対応する位置におけるT、位置371に対応する位置におけるR、位置377に対応する位置におけるP、位置377に対応する位置におけるT、位置380に対応する位置におけるW、位置380に対応する位置におけるY、位置389に対応する位置におけるK、位置392に対応する位置におけるM、位置395に対応する位置におけるR、位置399に対応する位置におけるM、位置399に対応する位置におけるT、位置399に対応する位置におけるW、位置405に対応する位置におけるG、位置407に対応する位置におけるD、位置407に対応する位置におけるQ、位置409に対応する位置におけるA、位置409に対応する位置におけるQ、位置410に対応する位置におけるT、位置418に対応する位置におけるP、位置419に対応する位置におけるF、位置419に対応する位置におけるI、位置419に対応する位置におけるK、位置419に対応する位置におけるR、位置419に対応する位置におけるS、位置421に対応する位置におけるH、位置421に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるN、位置421に対応する位置におけるQ、位置421に対応する位置におけるR、位置421に対応する位置におけるS、位置425に対応する位置におけるK、位置431に対応する位置におけるA、位置431に対応する位置におけるH、位置431に対応する位置におけるK、位置431に対応する位置におけるQ、位置431に対応する位置におけるR、位置431に対応する位置におけるS、位置431に対応する位置におけるV、位置433に対応する位置におけるL、位置433に対応する位置におけるR、位置433に対応する位
置におけるT、位置433に対応する位置におけるV、位置436に対応する位置におけるK、位置437に対応する位置におけるI、位置437に対応する位置におけるM、位置438に対応する位置におけるT、位置439に対応する位置におけるV、位置440に対応する位置におけるH、位置440に対応する位置におけるR、位置441に対応する位置におけるF、位置442に対応する位置におけるR、位置443に対応する位置におけるA、位置443に対応する位置におけるM、位置445に対応する位置におけるM、位置445に対応する位置におけるP、位置446に対応する位置におけるA、位置447に対応する位置におけるD、位置447に対応する位置におけるNを用いた、および/または位置447に対応する位置におけるQを用いた置換が挙げられる。修飾PH20ポリペプチドは、PH20ポリペプチドが、修飾(複数可)を含有しないPH20ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性、例えば、少なくとも1.5倍増大したヒアルロニダーゼ活性などのヒアルロニダーゼ活性を示す限り、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の1つまたは複数を、さらなる修飾とともにか、または伴わずに任意の組合せで含有し得る。

いくつかの例では、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示される位置に関して、位置(複数可)24、29、31、48、58、69、70、75、84、97、165、166、271、278、317、320、325および/または326に対応する位置(複数可)に1つまたは複数のアミノ酸置換(複数可)を含有する。例えば、例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、各々、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置24に対応する位置におけるE、位置29に対応する位置におけるE、位置31に対応する位置におけるV、位置48に対応する位置におけるN、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるQ、位置69に対応する位置におけるA、位置69に対応する位置におけるF、位置69に対応する位置におけるG、位置69に対応する位置におけるP、位置69に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるA、位置70に対応する位置におけるF、位置70に対応する位置におけるG、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるH、位置70に対応する位置におけるN、位置70に対応する位置におけるR、位置70に対応する位置におけるT、位置70に対応する位置におけるV、位置75に対応する位置におけるL、位置75に対応する位置におけるT、位置84に対応する位置におけるG、位置97に対応する位置におけるG、位置165に対応する位置におけるD、位置166に対応する位置におけるL、位置166に対応する位置におけるR、位置166に対応する位置におけるT、位置271に対応する位置におけるL、位置278に対応する位置におけるH、位置278に対応する位置におけるR、位置317に対応する位置におけるK、位置320に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるEでの、位置325に対応する位置におけるG、位置325に対応する位置におけるK、位置325に対応する位置におけるN、位置325に対応する位置におけるQ、位置326に対応する位置におけるVを用いる置換が挙げられる。修飾PH20ポリペプチドは、PH20ポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性、例えば、修飾(複数可)を含有しないPH20ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性、例えば、少なくとも2.0倍増大したヒアルロニダーゼ活性を示す限り、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の1つまたは複数を、さらなる修飾とともにか、または伴わずに、任意の組合せで含有し得る。

非修飾PH20ポリペプチド(例えば、配列番号3に示される)と比較して増大した活性を示す例示的修飾PH20ポリペプチドは、配列番号73、78、86、89、91、95、96、99、100、105、106、108、109、111、112、113、115、117、118、119、120、123-126、128-136、139-141、149、154、155、159、164、165、167、173、178、181、191-193、195-197、199-205、207-221、225、226、228、229、231、233、237-239、242、247-254、256、257、267、269、270、277、283、293、295、296、298、300、303、308、316、318、321、322、324、325、330、334、335、338-340、344、348、355、367、369、371、377、384-388、394、398、399、401、406-408、410、412、414、416、419、421-426、428、430、431、435、448、455、456、459、462、463、465、469、478-480、482、484、490、493、497、501、503、505、506-508、510-512、514、518、522、523、527、531、533、537-543、545、551、558、559、561、563-566、569、572、574、576、579、581-583、585、587、588、594、596、602、605、606、609、613、618-620、624-634、637、640-644、647、648、652、657、675、695、698、699、700、712、717、725、731、732、734、738、742、746、748-750、757、760、762-765、768-773、775、779、782、783、786-789、794-797、799-801、807、814、816、819、822、825、826、830、836、838、844、847、851、853のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号73、78、86、89、91、95、96、99、100、105、106、108、109、111、112、113、115、117、118、119、120、123-126、128-136、139-141、149、154、155、159、164、165、167、173、178、181、191-193、195-197、199-205、207-221、225、226、228、229、231、233、237-239、242、247-254、256、257、267、269、270、277、283、293、295、296、298、300、303、308、316、318、321、322、324、325、330、334、335、338-340、344、348、355、367、369、371、377、384-388、394、398、399、401、406-408、410、412、414、416、419、421-426、428、430、431、435、448、455、456、459、462、463、465、469、478-480、482、484、490、493、497、501、503、505、506-508、510-512、514、518、522、523、527、531、533、537-543、545、551、558、559、561、563-566、569、572、574、576、579、581-583、585、587、588、594、596、602、605、606、609、613、618-620、624-634、637、640-644、647、648、652、657、675、695、698、699、700、712、717、725、731、732、734、738、742、746、748-750、757、760、762-765、768-773、775、779、782、783、786-789、794-797、799-801、807、814、816、819、822、825、826、830、836、838、844、847、851、853のいずれかに対して少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有し、対応する非修飾ポリペプチドと比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示すアミノ酸の配列を有する任意のものである。

b.増大した安定性
増大した安定性を示すPH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。特に、PH20ポリペプチドは、インビボおよび/またはインビトロで増大した安定性を示す。例えば、PH20ポリペプチドは、種々の保存条件下で増大した安定性を示し得る。増大した安定性を示す、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、その他のパラメータの中でも、それだけには限らないが、温度(例えば、熱などの高温)、撹拌、無塩もしくは低塩および/または賦形剤の存在によって引き起こされる変性条件を含めた変性条件に対する増大した耐性を示す。例示的賦形剤として、それだけには限らないが、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤または甘味料が挙げられる。例えば、防腐剤などの種々の賦形剤は、タンパク質変性剤として作用し得る。増大したタンパク質安定性を示す本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、変性条件に曝露された場合に、アミノ酸置換を含有しない対応するPH20と比較して、凝集の減少、沈殿の減少および/または活性の増大を示す。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、変性条件に曝露された場合に、同一変性条件に曝露された場合にアミノ酸置換を含有しない対応するPH20ポリペプチドと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%もしくはそれ以上または少なくともおよそ10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%もしくはそれ以上または10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%もしくはそれ以上増大した活性を示す。

増大した安定性を示す、本明細書において提供されたPH20ポリペプチドとして、アミノ酸置換(replacement)(置換(substitution))、欠失または挿入またはその他の修飾を含有する修飾または変異体PH20ポリペプチドがある。通常、増大した安定性を示す、本明細書において提供されたPH20ポリペプチドは、アミノ酸置換(複数可)を含有しない対応するPH20ポリペプチド、例えば、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869もしくは870のいずれかに示されるPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体と比較してPH20ポリペプチド中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。特に、本明細書において提供された修飾または変異体PH20ポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないPH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに示されるPH20ポリペプチド、特に、配列番号3に示されるPH20ポリペプチドと比較して増大した安定性を示す。

特定の例では、修飾PH20ポリペプチドは、増大した安定性と関連していると同定された1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。本明細書において記載されたように、このような位置は、1つまたは複数の変性条件に曝露される際に修飾を含有しない対応するPH20と比較してポリペプチドの安定性(例えば、増大した活性)をもたらす位置を同定するための突然変異誘発および選択またはスクリーニング法を使用して同定され得る。PH20ポリペプチドはまた、得られる修飾PH20ポリペプチドが、アミノ酸置換(複数可)などのアミノ酸修飾(複数可)を含有しないPH20と比較して、1つまたは複数の変性条件下で増大した安定性を示し、ヒアルロニダーゼ活性を示す限り、単独では、安定性の付与と関連しないその他のアミノ酸置換などのその他の修飾を含有し得る。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。挿入または欠失などのさらなる修飾も、含まれ得る。アミノ酸置換は、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869もしくは870のいずれかにおいて示されるようなPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中であり得る。例えば、置換は、ヒトPH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに示されるいずれかまたはその変異体中であり得る。

本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、フェノール化合物、高温(熱)および/またはNaClの欠如に曝露された際に増大した安定性を示すPH20ポリペプチドがある。

i.フェノール親和性(Phenophiles)
フェノール化合物の存在下で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチド本明細書において提供される。複数回用量製剤は、微生物汚染からそれらを保護するために抗菌防腐剤を含有しなくてはならない。インスリンおよびその他の治療薬を含めた非経口薬物製剤については、最も一般的な防腐剤として、フェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールおよびメチルパラベンおよびプロピルパラベンを含めたパラベンなどのフェノール化合物がある。防腐剤は、通常、取締規則を満たすのに十分な濃度で存在しなくてはならない。例えば、規制上の要件は、製剤の抗菌有効性は、標的マーカーの防腐剤有効性試験(PET)必要要件を満たさなくてはならないと主張する。現在異なる規制当局が、複数回投薬用に設計された医薬製剤の抗菌有効性について異なる薬局方収載の判定基準を有する。米国薬局方(USP)および欧州薬局方(EP)のPET必要条件は、相当に異なり、複数回用量製剤の開発において更なる制約を課す。表4は、USPおよびEP判定基準に満たす注射可能物質薬物の判定基準を示す。通常、EP(EPAまたはEPB)抗菌必要要件を満たす製剤は、USP抗菌必要要件を満たすだけのために処方されたものよりも多くの防腐剤を含有する。

抗菌防腐剤は、タンパク質と相互作用し、凝集および安定性に対する負の効果をもたらし得る。したがって、防腐剤は、必要な成分であるが、通常、水溶液中でタンパク質の凝集を誘導するので、タンパク質の安定な複数回用量製剤の開発において大きな問題を引き起こす。特に、防腐剤を増加することまたは多量の防腐剤は、タンパク質活性に影響を及ぼし得る物理的安定性(凝集または沈殿)に対する効果を含め、タンパク質の安定性に負に影響を与え得る。例えば、EP防腐剤有効性必要条件を満たすために、比較的多量の、フェノールまたはm−クレゾールなどのフェノール化合物が必要であり得、これは、タンパク質製剤の安定性に影響を及ぼし得る。例えば、フェノール、m−クレゾールおよびベンジルアルコールなどの防腐剤は、ヒト成長ホルモン(Maa and Hsu (1996) Int. J. Pharm.140:155−168)、組換えインターロイキン−1受容体(Remmele (1998) Pharm. Res.15:200−208)、ヒトインスリン様成長因子I(Fransson (1997) Pharm. Res. 14:606−612)、rhIFN−γ(Lam (1997) Pharm. Res. 14:725−729)およびシトクロムc(Singh et al. (2011) J. Pharm Sci., 100:1679-89)の凝集を誘導するとわかっている。防腐剤が溶液中のタンパク質に対して有する不安定化効果は、複数回用量製剤の開発における制限因子であり、今まで、ほとんどのタンパク質治療薬は、単回使用だけのために製剤されてきた。

rHuPH20などのPH20ヒアルロニダーゼは、恐らくは、タンパク質のアンフォールディングおよびその後の凝集体形成のために、防腐剤の存在下で活性を迅速に失う。例えば、本明細書における実施例で示されるように、防腐剤は、特に、高温下でPH20酵素活性を低下させる(米国仮出願第61/520,962号;および米国出願第13/507,263号および同13/507,262号も参照のこと)。例えば、0.4% m−クレゾールとともに4時間インキュベーションした後、PH20(例えば、rHuPH20)は、その活性の約10%しか保持しない(例えば、実施例5を参照のこと)。0.1%フェノールおよび0.15%または0.315% m−クレゾールの存在下、37℃で6日間インキュベートした場合には、PH20(例えば、rHuPH20)は、製剤中のその他の賦形剤の存在またはその他の賦形剤の量に応じて約0%〜15%の活性を保持する(例えば、実施例9および10を参照のこと)。例えば、高濃度の塩の存在は、一般に、PH20の安定性を高める。特に、rHuPH20などのPH20の融解温度は、製剤にm−クレゾールなどのフェノール系防腐剤が添加された場合には大きく低下する。例えば、rHuPH20のアンフォールディング温度は、44℃から24℃に低下する。低いPH20アンフォールディング温度は、特に、高温下でのPH20凝集の増大および酵素活性の低下につながる。不安定化効果は、恐らくは、フェノール系防腐剤の疎水性によるものである。フェノール化合物の疎水性は、タンパク質との非特異的結合によるrHuPH20との相互作用につながり得、最終的に、rHuPH20の構造完全性を乱す。これは、防腐剤の存在下でのrHuPH20酵素活性の大幅な喪失に変換される。

フェノール系防腐剤の存在下で増大した安定性を示す、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、少なくとも1種のフェノール系防腐剤の存在下で、同一期間および同一条件下(防腐剤の存在を除いて)の防腐剤の不在下での修飾PH20ポリペプチドの酵素活性と比較して、15%超の酵素活性を、少なくとも4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3週間、4週間またはそれ以上示す。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、フェノール系防腐剤の存在下で、防腐剤の不在下と比較して、少なくとも16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上の酵素活性を示す。例えば、フェノール系防腐剤化合物は、フェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールおよび/またはメチルパラベンもしくはプロピルパラベンを含めたパラベンであり得る。

特定の例では、防腐剤の存在下で増大した安定性は、2℃〜6℃、24℃〜32℃もしくは35℃〜40℃の間または約2℃〜6℃、24℃〜32℃もしくは35℃〜40℃の間などの0℃〜40℃の間もしくは約0℃〜40℃の間、一般に、4℃または5℃、30℃もしくは37℃または約4℃または5℃、30℃もしくは37℃の温度条件下で示される。高温も、PH20活性に対して不安定化効果を有し得るので(以下を参照)、防腐剤の存在下での本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドの酵素活性のパーセンテージは、高温よりも低温で高いということは理解される。

一般に、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、組成物のサンプルにおいて微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性および記載された酵素活性を示す。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、細菌生物の少なくとも1.0 log10単位減少が、播種後7日で起こるような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。いくつかの例では、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、抗菌防腐剤有効性試験(APET)において試験された場合に、微生物播種菌液とともに組成物が播種された後に、播種後7日での細菌生物の少なくとも1.0 log10単位減少、播種後14日での細菌生物の少なくとも3.0 log10単位減少があるような、播種後28日での細菌生物の少なくともさらなる増大がない、播種後7日での真菌生物の少なくとも増加がないような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。その他の例では、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、抗菌防腐剤有効性試験(APET)において試験された場合に、微生物播種菌液とともに組成物が播種された後に、播種後24時間での細菌生物の少なくとも1.0 log10単位減少、播種後7日での細菌生物の少なくとも3.0 log10単位減少があり、播種後28日での細菌生物のさらなる増大がない、播種後14日での真菌生物の少なくとも1.0 log10単位減少があり、播種後28日での真菌生物の少なくともさらなる増大がないような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。さらに別の例では、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、抗菌防腐剤有効性試験(APET)において試験された場合に、微生物播種菌液とともに組成物が播種された後に、播種後6時間での細菌生物の少なくとも2.0 log10単位減少、播種後24時間での細菌生物の少なくとも3.0 log10単位減少があり、微生物播種菌液を伴う組成物の播種後28日での細菌生物の回復がなく、播種後7日での真菌生物の少なくとも2.0 log10単位減少があり、播種後28日での真菌生物の少なくともさらなる増大がないような、微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害する防腐剤の抗菌上有効な量の存在下で、増大した安定性を示す。

例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、両端を含めて、0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%であるか、またはその間である、質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)としての1種または複数種のフェノール系防腐剤の総量の存在下で、増大した安定性および上記で列挙された酵素活性を示す。

一般に、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、m−クレゾールおよび/またはフェノールの存在下で増大した安定性を示す。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%の間または約0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%の間の、修飾PH20ポリペプチドを含有する製剤中の質量濃度(w/v)の%としての量でのm−クレゾールの存在下で、増大した安定性を示す。その他の例では、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4% m−クレゾールの間または約0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4% m−クレゾールの間の、修飾PH20ポリペプチドを含有する製剤中の質量濃度(w/v)の%としての量でのフェノールの存在下で、増大した安定性を示す。さらなる例では、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、0.05%〜0.25%の間または約0.05%〜0.25%の間のフェノールおよび0.05%〜0.3%の間または約0.05%〜0.3%の間のm−クレゾール、0.10%〜0.2%の間または約0.10%〜0.2%の間のフェノールおよび0.6%〜0.18%の間または約0.6%〜0.18%の間のm−クレゾール、0.1%〜0.15%の間または約0.1%〜0.15%の間のフェノールおよび0.8%〜0.15%のm−クレゾール、0.10%〜0.15%の間または約0.10%〜0.15%の間のフェノールおよび0.06%〜0.09%の間または約0.06%〜0.09%の間のm−クレゾール、または0.12%〜0.18%の間または約0.12%〜0.18%の間のフェノールおよび0.14%〜0.22%の間または約0.14%〜0.22%の間のm−クレゾールの、修飾PH20ポリペプチドを含有する製剤中の質量濃度(w/v)の%としての量でのフェノールおよびm−クレゾールの存在下で、増大した安定性を示す。

本明細書における例では、修飾PH20ポリペプチドは、両端を含めて、0.3%〜0.4%の間または約0.3%〜0.4%の間のm−クレゾールおよび/またはフェノールの存在下、37℃で、同一期間および同一条件下(防腐剤の存在を除いて)の防腐剤の不在下での修飾PH20ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも4時間、少なくとも16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上など、15%超の酵素活性を示す。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、約0.4%または0.4%のm−クレゾールの存在下、37℃で、同一期間および同一条件下(防腐剤の存在を除いて)の防腐剤の不在下での修飾PH20ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも4時間、少なくとも16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上など、15%超の酵素活性を示す。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドはまた、両端を含めて、少なくとも約0.2%〜0.4%の間または0.2%〜0.4%の間のm−クレゾールおよび/またはフェノールの存在下で、37℃で、同一期間および同一条件下(防腐剤の存在を除いて)の防腐剤の不在下での修飾PH20ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日または6日間、少なくとも16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上など、15%超の酵素活性を示す。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、約0.10%または0.10%のフェノールおよび約0.15%または0.15%のm−クレゾールの存在下で、37℃で、同一期間および同一条件下(防腐剤の存在を除いて)の防腐剤の不在下での修飾PH20ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日または6日間、少なくとも16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上など、15%超の酵素活性を示す。その他の例では、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、約0.315%または0.315%のm−クレゾールの存在下で、37℃で、同一期間および同一条件下(防腐剤の存在を除いて)の防腐剤の不在下での修飾PH20ポリペプチドの酵素活性と比較して、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日または6日間、一般に、少なくとも6日間、少なくとも16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上など、15%超の酵素活性を示す。

例えば、フェノール化合物に対して増大した安定性を示す、本明細書において提供されたこのような修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443または445に対応する1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換(replasement)(置換(substitution))を含有する。例えば、アミノ酸位置は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置10の(P)(P10)、V12、A20、S22、L26、D34、S36、I46、G50、G52、V58、D68、I70、T74、K82、I83、S84、Q86、T97、D127、N131、Q138、V142、Q143、L144、V166、I169、L174、H193、K195、K196、F204、N205、V206、D213、N219、Q234、V237、A238、T240、E249、S261、A267、V277K279、G291、I309、M310、K314、S315、L317、Q347、P367、E375、K376、Y399、S401、S407、D416、A419、D421、D431、F433、E439、T440、P443またはI445の置換に対応する1つまたは複数の位置で置換され得る。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチド中のアミノ酸置換の例示的なものとして、それだけには限らないが、各々配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置10に対応する位置におけるグリシン(G)、位置12に対応する位置におけるK、位置20に対応する位置におけるS、位置22に対応する位置におけるT、位置26に対応する位置におけるM、位置34に対応する位置におけるW、位置36に対応する位置におけるN、位置46に対応する位置におけるL、位置50に対応する位置におけるM、位置52に対応する位置におけるT、位置52に対応する位置におけるS、位置58に対応する位置におけるC、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるR、位置58に対応する位置におけるN、位置58に対応する位置におけるY、位置58に対応する位置におけるP、位置58に対応する位置におけるH、位置68に対応する位置におけるP、位置70に対応する位置におけるV、位置74に対応する位置におけるE、位置82に対応する位置におけるL、位置82に対応する位置におけるN、位置83に対応する位置におけるV、位置83に対応する位置におけるQ、位置83に対応する位置におけるS、位置83に対応する位置におけるG、位置84に対応する位置におけるN、位置86に対応する位置におけるA、位置86に対応する位置におけるK、位置97に対応する位置におけるE、位置97に対応する位置におけるL、位置127に対応する位置におけるR、位置131に対応する位置におけるR、位置138に対応する位置におけるL、位置142に対応する位置におけるK、位置142に対応する位置におけるN、位置142に対応する位置におけるP、位置142に対応する位置におけるS、位置142に対応する位置におけるT、位置143に対応する位置におけるG、位置143に対応する位置におけるK、位置144に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるQ、位置166に対応する位置におけるT、位置169に対応する位置におけるL、位置174に対応する位置におけるG、位置174に対応する位置におけるN、位置193に対応する位置におけるQ、位置195に対応する位置におけるT、位置195に対応する位置におけるN、位置196に対応する位置におけるE、位置196に対応する位置におけるR、位置204に対応する位置におけるP、位置205に対応する位置におけるA、位置205に対応する位置におけるE、位置206に対応する位置におけるI、位置213に対応する位置におけるA、位置219に対応する位置におけるI、位置234に対応する位置におけるM、位置237に対応する位置におけるT、位置238に対応する位置におけるH、位置240に対応する位置におけるQ、位置249に対応する位置におけるV、位置261に対応する位置におけるA、位置261に対応する位置におけるK、位置267に対応する位置におけるT、位置277に対応する位置におけるK、位置279に対応する位置におけるH、位置279に対応する位置におけるV、位置291に対応する位置におけるV、位置309に対応する位置におけるE、位置310に対応する位置におけるQ、位置314に対応する位置におけるY、位置315に対応する位置におけるY、位置317に対応する位置におけるN、位置317に対応する位置におけるW、位置318に対応する位置におけるD、位置347に対応する位置におけるG、位置367に対応する位置におけるA、位置375に対応する位置におけるR、位置376に対応する位置におけるR、位置399に対応する位置におけるV、位置401に対応する位置におけるE、位置407に対応する位置におけるA、位置416に対応する位置におけるL、位置419に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるH、位置431に対応する位置におけるE、位置433に対応する位置におけるT、位置433に対応する位置におけるV、位置439に対応する位置におけるC、位置440に対応する位置におけるP、位置443に対応する位置におけるG、位置445に対応する位置におけるNでの置換が挙げられる。

アミノ酸置換(複数可)は、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869または870のいずれかに示されるPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中であり得る。例えば、置換(複数可)は、ヒトPH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに示されるまたはそのいずれかまたはその変異体中であり得る。

非修飾PH20ポリペプチド(例えば、配列番号3に示される)と比較して、フェノール化合物に対して増大した安定性を示す例示的修飾PH20ポリペプチドは、配列番号83、88、93、94、101、144、148、158、171、176、175、177、178、180、182、183、184、185、194、221、240、259、260、261、262、263、264、268、270、272、307、309、327、334、341、351、352、353、356、357、358、359、361、424、426、430、434、436、443、444、445、446、447、449、450、451、454、461、467、480、487、489、492、495、504、505、509、527、544、576、589、600、603、607、612、614、647、658、683、687、733、736、741、754、763、768、781、796、797、809、818、829または837のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号83、88、93、94、101、144、148、158、171、176、175、177、178、180、182、183、184、185、194、221、240、259、260、261、262、263、264、268、270、272、307、309、327、334、341、351、352、353、356、357、358、359、361、424、426、430、434、436、443、444、445、446、447、449、450、451、454、461、467、480、487、489、492、495、504、505、509、527、544、576、589、600、603、607、612、614、647、658、683、687、733、736、741、754、763、768、781、796、797、809、818、829または837のいずれかに対して少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有するアミノ酸の配列を有するいずれかであり、ヒアルロニダーゼ活性を示し、対応する非修飾ポリペプチドと比較してフェノール化合物の存在下で増大した安定性を示す。

特に、配列番号3に関連してアミノ酸残基204に対応する位置にPでのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。通常、修飾PH20ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号3、7、69、72または32〜66のいずれかに示されるアミノ酸の配列または修飾ポリペプチドが、F204Pに対応するアミノ酸置換を含有する限り、配列番号3、7、69、72または32〜66のいずれかに対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換F204Pを含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。その他の場合には、修飾PH20ポリペプチドは、非ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号10、12、14、857、859、861または870に示されるアミノ酸の配列または修飾ポリペプチドが、F204Pに対応するアミノ酸置換を含有する限り、配列番号10、12、14、857、859、861もしくは870のいずれかに対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列中にアミノ酸置換F204Pを含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例では、アミノ酸置換、配列番号24に示されるアミノ酸の配列中のF205Pまたは配列番号31中のY204P、または配列番号24または31に対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号449に示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号449に対して少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有し、アミノ酸置換F204P含有し、対応する非修飾ポリペプチド(例えば、配列番号3)と比較して、増大したヒアルロニダーゼ活性を示し、フェノール化合物に対して増大した安定性を示すポリペプチドがある。上記の例のいずれにおいても、配列番号3に関連してアミノ酸残基204に対応する位置にPでのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドは、配列番号15〜22、28または29に示されるアミノ酸の配列を有さない。

別の例では、配列番号3に関連してアミノ酸残基58に対応する位置にアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。アミノ酸置換の例示的なものとして、配列番号3に関連してアミノ酸残基58に対応する位置におけるリシン(K)での、またはアルギニン(R)での置換がある。通常、修飾PH20ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号3、7、69、72もしくは32〜66のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号3、7、69、72もしくは32〜66のいずれかに対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列中にアミノ酸置換V58KまたはV58Rを含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。その他の場合には、修飾PH20ポリペプチドは、非ヒトポリペプチドである。例えば、配列番号10、12、14、20、22、24、29、857、859、861もしくは870に示されるアミノ酸の配列または配列番号10、12、14、20、22、24、29、857、859、861もしくは870のいずれかに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列中にアミノ酸置換V58KまたはV58Rを含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例では、配列番号16もしくは31に示されるアミノ酸の配列または配列番号16もしくは31に対して、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列中に、アミノ酸置換A58Rを含有する修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。このような修飾PH20ポリペプチドの例示的なものとして、配列番号182に示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号182に対して、少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有し、アミノ酸置換V58Rを含有し、対応する非修飾ポリペプチド(例えば、配列番号3)と比較して、増大したヒアルロニダーゼ活性を示し、フェノール化合物の存在下で増大した安定性を示すポリペプチドがある。

ii.好熱性
高温下で、PH20ヒアルロニダーゼは、活性を失い得る。両端を含めて、30℃〜45℃の間または約30℃〜45℃の間、例えば、35℃〜42℃の間または約35℃〜42℃の間、特に、37℃または約37℃の高温下で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、32℃を超える、例えば、35℃〜45℃、37℃〜42℃、特に、37℃または約37℃の高温下で、少なくとも3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、少なくとも5日、少なくとも6日または少なくとも7日安定である修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。高温下で安定性を示す修飾PH20ポリペプチドは、温度が高い、変動し得る、増大し得る適用において使用され得る。これは、例えば、ポンプまたはその他の連続注入デバイスを利用する投与法において起こり得る。

特に、高温下で安定性を示す本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、修飾、例えば、アミノ酸置換を含有しない対応するPH20ポリペプチドと比較して、高温下で増大したヒアルロニダーゼ活性を示す。PH20ポリペプチドは、32℃を超える、例えば、35℃〜45℃または37℃〜42℃、特に、37℃または約37℃の高温下でのインキュベーションの際に、同一条件下でインキュベートされた、修飾を含有しない対応するPH20ポリペプチドと比較して、増大したヒアルロニダーゼ活性を少なくとも4時間、5時間、6時間、12時間、1日、2日、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、少なくとも5日、少なくとも6日または少なくとも7日示し得る。例えば、ヒアルロニダーゼ活性は、同一条件下でインキュベートされた、修飾を含有しない対応するPH20ポリペプチドと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%またはそれ以上増大され得る。例えば、ヒアルロニダーゼ活性は、同一条件下でインキュベートされた、修飾を含有しない対応するPH20ポリペプチドと比較して、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれ以上増大され得る。

その他の例では、高温下で安定性を示す、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、同一条件下で(温度の相違を除いて)非高温でインキュベートされた修飾PH20ポリペプチドの活性と比較して、高温下でヒアルロニダーゼ活性を保持する。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、2℃〜8℃の間または約2℃〜8℃の間の非高温でのPH20の活性と比較して、50%または約50%を超える、例えば、55%、60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%を超える、または少なくとも55%、60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の活性を、32℃を超える高温、例えば、35℃〜45℃または37℃〜42℃、特に、37℃または約37℃で示す。いくつかの例では、高温下で安定性を示す本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、同一条件下で(温度の相違を除いて)非高温でインキュベートされた修飾PH20ポリペプチドの活性と比較して、高温下で増大した活性を示す。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、2℃〜8℃の間または約2℃〜8℃の間の非高温でのPH20の活性と比較して、10%を超えるまたは約10%の活性、例えば、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%もしくはそれ以上を超える、または少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%もしくはそれ以上の活性を、32℃を超える高温、例えば、35℃〜45℃または37℃〜42℃、特に、37℃または約37℃で示す。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、2℃〜8℃の間または約2℃〜8℃の間の非高温でのPH20の活性と比較して、約1.1倍を超える、または少なくとも約1.1倍のヒアルロニダーゼ活性、例えば、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍もしくはそれ以上を超える、または少なくとも1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍もしくはそれ以上の活性を、32℃を超える高温、例えば、35℃〜45℃または37℃〜42℃、特に、37℃または約37℃で示す。

例えば、高温下で増大した安定性を示す、本明細書において提供されたこのような修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して位置1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439または443に対応する1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換(replacement)(置換(substitution))を含有する。例えば、アミノ酸位置は、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置1の(L)の置換(L1)、N11、V12、F14、A20、L26、F29、D34、G50、V58、I70、K82、I83、S84、Q86、D87、Q140、V142、Q143、T147、K152、V166、E167、G172、L174、N178、H193、K195、V206、D212、D213、N219、Q233、V237、T240、A267、V277、G291、E292、I309、M313、K314、L317、L318、Q347、P367、D368、A371、L374、E389、E392、S395、E396、L406、A419、D421、E439またはP443に対応する1つまたは複数の位置で置換され得る。得られる修飾PH20ポリペプチドは、32℃を超える高温、例えば、35℃〜45℃、37℃〜42℃、特に、37℃または約37℃で、少なくとも3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日またはそれ以上、増大した安定性を示す。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチド中の例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、各々、配列番号3に示されるアミノ酸残基位置に関して、位置1に対応する位置におけるR、位置11に対応する位置におけるS、位置12に対応する位置におけるI、位置14に対応する位置におけるV、位置20に対応する位置におけるS、位置26に対応する位置におけるMでの、位置29に対応する位置におけるR、位置34に対応する位置におけるW、位置50に対応する位置におけるM、位置58に対応する位置におけるK、位置58に対応する位置におけるQ、位置58に対応する位置におけるQ、位置70に対応する位置におけるV、位置82に対応する位置におけるL、位置83に対応する位置におけるQ、位置84に対応する位置におけるR、位置86に対応する位置におけるA、位置87に対応する位置におけるS、位置140に対応する位置におけるK、位置142に対応する位置におけるS、位置142に対応する位置におけるT、位置143に対応する位置におけるK、位置147に対応する位置におけるS、位置152に対応する位置におけるT、位置166に対応する位置におけるT、位置167に対応する位置におけるD、位置172に対応する位置におけるA、位置174に対応する位置におけるG、位置174に対応する位置におけるN、位置178に対応する位置におけるR、位置193に対応する位置におけるQ、位置195に対応する位置におけるT、位置206に対応する位置におけるI、位置212に対応する位置におけるS、位置213に対応する位置におけるA、位置219に対応する位置におけるI、位置233に対応する位置におけるG、位置237に対応する位置におけるT、位置240に対応する位置におけるA、位置240に対応する位置におけるQ、位置267に対応する位置におけるT、位置277に対応する位置におけるE、位置291に対応する位置におけるS、位置292に対応する位置におけるH、位置292に対応する位置におけるV、位置309に対応する位置におけるS、位置313に対応する位置におけるH、位置314に対応する位置におけるS、位置317に対応する位置におけるI、位置317に対応する位置におけるT、位置317に対応する位置におけるW、位置318に対応する位置におけるR、位置347に対応する位置におけるG、位置367に対応する位置におけるA、位置368に対応する位置におけるR、位置371に対応する位置におけるS、位置374に対応する位置におけるP、位置389に対応する位置におけるA、位置392に対応する位置におけるV、位置395に対応する位置におけるA、位置396に対応する位置におけるH、位置406に対応する位置におけるN、位置419に対応する位置におけるH、位置419に対応する位置におけるK、位置421に対応する位置におけるR、位置421に対応する位置におけるS、位置439に対応する位置におけるA、位置439に対応する位置におけるC、または位置443に対応する位置におけるGでの置換が挙げられる。

アミノ酸置換(複数可)は、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869または870のいずれかに示されるPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中にあり得る。例えば、置換(複数可)は、ヒトPH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに示されるいずれかまたはその変異体中にあり得る。

非修飾PH20ポリペプチド(例えば、配列番号3に示される)と比較して、フェノール化合物に対して増大した安定性を示す例示的修飾PH20ポリペプチドは、配列番号79、85、87、90、93、101、114、144、171、178、181、221、259、262、269、270、282、343、356、357、359、368、395、426、429、432、434、436、441、443、444、454、460、461、467、477、487、491、492、509、525、550、554、557、584、593、599、605、611、612、617、647、658、667、676、679、709、720、723、727、740、761、763、772、773、808、809、または829のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有するか、または配列番号79、85、87、90、93、101、114、144、171、178、181、221、259、262、269、270、282、343、356、357、359、368、395、426、429、432、434、436、441、443、444、454、460、461、467、477、487、491、492、509、525、550、554、557、584、593、599、605、611、612、617、647、658、667、676、679、709、720、723、727、740、761、763、772、773、808、809、または829のいずれかに対して、少なくとも68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有し、ヒアルロニダーゼ活性を示し、対応する非修飾ポリペプチドと比較して高温に対して増大した安定性を示すアミノ酸の配列を有するいずれかである。

iii.塩の不在
PH20は、低塩の存在下または塩の不在において変性する。したがって、PH20は、安定性を維持するために、140mM〜200mMの間または約140mM〜200mMの間の高塩濃度を必要とする。その他の治療薬、例えば、インスリンは、高塩の存在下で溶解度の低下および結晶化/凝集の増大を示す。したがって、PH20の高塩必要条件は、共製剤される治療薬の溶解度および/または活性に影響を及ぼし得、一方で、低塩の存在は、PH20の活性を低下させ得る。これは、PH20共製剤の作製について問題を引き起こし得る。

100mM未満、例えば、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM未満またはそれ以下の低濃度の塩(例えばNaCl)の存在下で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。一般に、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、低濃度の塩、例えば、10mM NaCl〜100mM NaClの間または約10mM NaCl〜100mM NaClの間、例えば、15mM〜80mM NaClの間または約15mM〜80mM NaClの間の低濃度のNaClの存在下で安定性を示す。低濃度の塩、例えば、低濃度のNaCl(すなわち、100mM未満またはそれ以下)で安定性を示す本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、修飾(複数可)(例えば、アミノ酸置換)を含有しない対応するPH20と比較して増大したヒアルロニダーゼ活性を示す。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、低濃度の塩、例えば、低濃度のNaCl(すなわち、100mM未満)で、同一条件下でアミノ酸修飾(複数可)(例えば、アミノ酸置換(複数可)を含有しない対応するPH20の活性と比較して、10%を超えて、または約10%増大した活性、例えば、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%もしくはそれ以上を超えて、または少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%もしくはそれ以上の活性を示す。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、100mM未満の低濃度のNaClで、同一条件下で、アミノ酸修飾(複数可)(例えば、アミノ酸置換(複数可)を含有しない対応するPH20の活性と比較して、約1.1倍を超える、または少なくとも約1.1倍のヒアルロニダーゼ活性、例えば、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍もしくはそれ以上を超える、または少なくとも1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍もしくはそれ以上の活性を示す。

2.不活性突然変異体
PH20ポリペプチド中に1種または複数種のアミノ酸置換を含有し、不活性であり、それによってポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を示さないか、または低いもしくは減少したヒアルロニダーゼ活性を示す修飾PH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。不活性である本発明において提供された修飾PH20ポリペプチドは、一般に、野生型または参照PH20ポリペプチド、例えば、配列番号3または7に示されるポリペプチドの20%未満、例えば、10%未満のヒアルロニダーゼ活性を示す。例えば、不活性である本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、野生型または参照PH20ポリペプチド、例えば、アミノ酸修飾(例えば、アミノ酸置換)を含有しない対応するポリペプチド、例えば、配列番号3または7に示されるポリペプチドの9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%未満またはそれ以下のヒアルロニダーゼ活性を示す。

例えば、野生型または参照PH20ポリペプチドと比較して、不活性であり、例えば、アミノ酸置換(replasement)または置換(substitution)によって修飾されているPH20ポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、不活性である、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、得られた修飾PH20ポリペプチドが、不活性であり、アミノ酸置換を含有しない対応するPH20ポリペプチドの20%未満、一般に、10%未満のヒアルロニダーゼ活性を示す限り、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して、位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444、または447に対応する位置(複数可)に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。通常、PH20ポリペプチド中の上記の位置のいずれかに対応する位置で修飾されている(例えば、置換されている)アミノ酸残基は、配列番号3に示されるアミノ酸残基に対して同一残基、保存的残基または半保存的アミノ酸残基である。

上記の対応する位置のいずれかの例示的アミノ酸置換は、表5に示されている。表5中の対応する位置への言及は、配列番号3に示される位置に関してである。置換は、配列番号3に示される配列とのアラインメントによって別のPH20ポリペプチド中の対応する位置でなされ得(例えば、図1および2を参照のこと)、それによって対応する位置は、アラインされた位置であるということは理解される。アミノ酸置換(複数可)は、得られた修飾PH20ポリペプチドが、不活性である限り、配列番号2、3、6〜66、68〜72、856〜861、869または870のいずれかに示されるPH20ポリペプチドまたはそれに対して少なくとも75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を有するその変異体中の対応する位置であり得る。例えば、置換(複数可)は、ヒトPH20ポリペプチド中の対応する位置、例えば、配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかに示されるいずれかまたはその変異体中であり得る。特に、置換のうち任意の1種または複数は、得られた修飾PH20ポリペプチドが不活性であるか、配列番号3に示されるPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の20%未満、一般に、10%未満を示す限り、配列番号3中である。





3.さらなる修飾およびコンジュゲート
修飾PH20ポリペプチドは、化学修飾または翻訳後修飾を含有するものを含む。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、化学修飾または翻訳後修飾を含有しない。化学修飾および翻訳後修飾として、それだけには限らないが、ペグ化、シアル化(sialation)、アルブミン化(albumination)、グリコシル化、ファルニシル化(farnysylation)、カルボキシル化、水酸化、リン酸化および当技術分野で公知のその他のポリペプチド修飾が挙げられる。

また、本明細書において提供されたアミノ酸置換などの任意の1種または複数種のアミノ酸修飾に加えて、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、得られたポリペプチドが、ヒアルロニダーゼ活性を保持する限り、化学法および組換え法を含めた当技術分野で公知の任意の方法を使用して任意の部分とコンジュゲートまたは融合され得る。例えば、本明細書において提供されたアミノ酸置換などの任意の1種または複数種のアミノ酸修飾に加えて、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドはまた、それだけには限らないが、炭水化物部分、ポリエチレングリコール(PEG)部分、シアル酸部分、免疫グロブリンG由来のFcドメインまたは任意のその他のドメインもしくは部分を用いる修飾を含めた、ポリペプチドの一次配列中であるか、一次配列中ではないその他の修飾を含有し得る。例えば、このようなさらなる修飾は、タンパク質の安定性または血清半減期を高めるためになされ得る。

いくつかの例では、ドメインまたはその他の部分は、細胞表面受容体またはその他の細胞表面部分と選択的に結合することによる1種または複数種の細胞種とのコンジュゲートをターゲッティングする任意の薬剤を含めた標的剤である。例えば、ドメインまたはその他の部分は、腫瘍細胞とのコンジュゲートをターゲッティングする標的剤である。このような例において、修飾PH20ポリペプチド、例えば、本明細書において提供された任意のものは、標的剤と直接的または間接的に連結される。このような標的化薬剤として、標的化薬剤が、細胞表面受容体によってインターナリゼーションされる限り、それだけには限らないが、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体およびホルモンまたは対立遺伝子変異体、ムテインまたはその断片が挙げられる。例示的な、制限するものではない、さらなる修飾は、以下に記載される。

a.低減された免疫原性
本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、低減された免疫原性を有するよう製造され得る。低減された免疫原性は、ポリペプチドから抗原性エピトープを排除する配列変更によって、または翻訳後修飾を変更することによって達成され得る。当業者ならば、ポリペプチド中の抗原性エピトープを同定する方法に精通している(例えば、Liang et al. (2009) BMC Bioinformatics, 10:302;Yang et al. (2009) Rev. Med. Virol., 19:77-96を参照のこと)。いくつかの例では、1種または複数種のアミノ酸は、抗原性エピトープを除去または変更するよう修飾され得る。

別の例では、タンパク質のグリコシル化を変更することも、免疫原性(immunogenecity)をもたらし得る。例えば、ポリペプチドが、配列番号3または7のN200、N333およびN358として示されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基で少なくともN−アセチルグルコサミンを最小に含有する限り、ペプチドのグリコシル化を変更することが考慮される。

例えば、PH20ポリペプチドは、フコース、特に、ビフコシル化(bifucosylation)を欠くように修飾され得る。特に、本明細書において提供されるPH20ポリペプチドは、ビフコシル化されない。これは、ビフコシル化を達成しない宿主細胞においてPH20ポリペプチドを発現させ、産生することによって達成され得る。フコースは、哺乳類、昆虫および植物を含めた広範な生物中に存在するデオキシヘキソースである。フコシル化グリカンは、フコシルトランスフェラーゼによって合成される;例えば、Ma et al., Glycobiology、16(12):158R-184R, (2006); Nakayama et al., J. Biol. Chem., 276:16100-16106 (2001);およびSturla et al., Glycobiology, 15(10):924-935 (2005)を参照のこと。ヒトでは、フコースは、グリカン構造の末端修飾として存在することが多く、N−アセチルグルコサミンとα1,6連結されたフコースの存在が、糖タンパク質プロセシングおよび認識において重要であるとわかっている。昆虫では、N−グリカンコア構造は、α1,6−およびα1,3−連結を有するビフコシル化を示す。α1,3−連結を有する昆虫細胞コアフコシル化は、ヒトでは免疫原性である炭水化物エピトープを生成する(例えば、米国公開第20070067855号を参照のこと)。例えば、本明細書において提供されたPH20ポリペプチドは、ポリペプチドをビフコシル化できない宿主細胞において作製され得る。したがって、ビフコシル化する昆虫細胞またはその他の細胞は、ポリペプチドの発現のために使用され得るが、通常、CHO細胞などの哺乳類細胞が使用される。

いくつかの例では、真核細胞のオリゴ糖プロセシング遺伝子を含有するバキュロウイルス発現ベクターを使用し、それによって、「哺乳類化された(mammalianized)」昆虫細胞発現系を作製することによって、修飾グリコシル化経路を有する昆虫細胞において、脱フコシル化された、またはフコースに欠陥のあるPH20ポリペプチドが作製され得る(例えば、米国特許第6,461,863号を参照のこと)。あるいは、抗原性は、α1,3−フコシルトランスフェラーゼ(fucosylatransferase)(FT3)(例えば、米国公開第20070067855号)を欠く昆虫細胞におけるPH20ポリペプチドの発現によって排除され得る。その他の例では、脱フコシル化された、またはフコースに欠陥のあるPH20ポリペプチドが、例えば、タンパク質フコシル化に欠陥のあるLec13 CHO細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許公開第2003/0157108号;およびWO2004/056312)およびノックアウト細胞株、例えば、α−1,6−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))を含めた、脱フコシル化タンパク質を産生する細胞株において作製され得る。

b.ポリマーとのコンジュゲーション
いくつかの例では、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、ポリマーとコンジュゲートされる。PH20ポリペプチドとコンジュゲートされ得る例示的ポリマーとして、天然および合成ホモポリマー、例えば、ポリオール(すなわち、ポリ−OH)、ポリアミン(すなわち、ポリ−NH)およびポリカルボン酸(すなわち、ポリ−COOH)ならびにさらなるヘテロポリマー、すなわち、1種または複数種の異なるカップリング基、例えば、ヒドロキシル基およびアミン基を含有するポリマーが挙げられる。適したポリマー分子の例として、ポリエチレングリコール(PEG)、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)およびポリプロピレングリコールを含めたポリアルキレングリコール(PAG)などのポリアルキレンオキシド(PAO)、PEG−グリシジルエーテル(Epox−PEG)、PEG−オキシカルボニルイミダゾール(CDI−PEG)、分岐ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリ−D,L−アミノ酸、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、カルボキシメチル−デキストランを含めたデキストラン、ヘパリン、同種アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースを含めたセルロース、キトサンの加水分解物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物およびバイオポリマーの中から選択されるポリマー分子が挙げられる。

通常、ポリマーは、ポリアルキレンオキシド(PAO)、例えば、ポリエチレンオキシド、例えば、PEG、通常、2、3の架橋できる反応性基しか有さないmPEGである。通常、ポリマーは、(メトキシ)ポリエチレングリコール(mPEG)などの非毒性ポリマー分子であり、これは、比較的簡単な化学を使用してPH20ポリペプチドと(例えば、タンパク質表面上の結合基と)共有結合によってコンジュゲートされ得る。

PH20ポリペプチドとの結合に適したポリマー分子として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール(PEG)およびメトキシ−ポリエチレングリコール(mPEG)、PEG−グリシジルエーテル(Epox−PEG)、PEG−オキシカルボニルイミダゾール(CDI−PEG)、分岐PEGおよびポリエチレンオキシド(PEO)などのPEG誘導体(例えば、Roberts et al.,Advanced Drug Delivery Review 2002, 54:459-476;Harris and Zalipsky (eds.) 「Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications」ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000;Harris and Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21;およびTsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004を参照のこと)。ポリマー分子は、通常、約3kDa〜約60kDaの範囲の分子量のものであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されたPH20ポリペプチドとコンジュゲートされるポリマー分子は、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60kDaまたは60kDaを超える分子量を有する。

PEGまたはPEG誘導体を共有結合によって結合すること(コンジュゲートすること)(すなわち「ペグ化」)によってポリペプチドを修飾する種々の方法が、当技術分野で公知である(例えば、U.S.2006/0104968;U.S.5,672,662;U.S.6,737,505;およびU.S.2004/0235734を参照のこと)。ペグ化のための技術として、それだけには限らないが、特殊化されたリンカーおよびカップリング化学(例えば、Roberts, Adv.Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002を参照のこと)、複数のPEG部分の単一コンジュゲーション部位との結合(分岐PEGの使用などによる;例えば、Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002を参照のこと)、部位特異的ペグ化および/またはモノペグ化(例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999を参照のこと)および部位指定酵素的ペグ化(例えば、Sato, Adv.Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照のこと)が挙げられる(例えば、Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:140-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95も参照のこと;Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8Sも参照のこと)。当技術分野において記載される方法および技術は、単一タンパク質分子と結合している1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10を超えるPEGまたはPEG誘導体を有するタンパク質を産生し得る(例えば、U.S.2006/0104968を参照のこと)。

ペグ化のための多数の試薬が、当技術分野で記載されている。このような試薬として、それだけには限らないが、N−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性化PEG、スクシンイミジルmPEG、mPEG2−N−ヒドロキシスクシンイミド、mPEGスクシンイミジルα−メチルブタノエート、mPEGスクシンイミジルプロピオネート、mPEGスクシンイミジルブタノエート、mPEGカルボキシメチル3−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二機能性PEG−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二機能性PEGプロピンアルデヒド、ホモ二機能性PEGブチルアルデヒド、PEGマレイミド、PEGヒドラジド、p−ニトロフェニル−カルボネートPEG、mPEG−ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドPEG、mPEGブチルアルデヒド(butryaldehyde)、分岐mPEG2ブチルアルデヒド、mPEGアセチル、mPEGピペリドン、mPEGメチルケトン、mPEG「リンカーレス」マレイミド、mPEGビニルスルホン、mPEGチオール、mPEGオルトピリジルチオエステル、mPEGオルトピリジルジスルフィド、Fmoc−PEG−NHS、Boc−PEG−NHS、ビニルスルホンPEG−NHS、アクリレートPEG−NHS、フルオレセインPEG−NHSおよびビオチンPEG−NHSが挙げられる(例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995;Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997;U.S.5,672,662;U.S.5,932,462;U.S.6,495,659;U.S.6,737,505;U.S.4,002,531;U.S.4,179,337;5,122,614;5,324,844;U.S.5,446,090;U.S.5,612,460;U.S.5,643,575;U.S.5,766,581;U.S.5,795,569;U.S.5,808,096;U.S.5,900,461;U.S.5,919,455;U.S.5,985,263;U.S.5,990,237;U.S.6,113,906;U.S.6,214,966;U.S.6,258,351;U.S.6,340,742;U.S.6,413,507;U.S.6,420,339;U.S.6,437,025;U.S.6,448,369;U.S.6,461,802;U.S.6,828,401;U.S.6,858,736;U.S.2001/0021763;U.S.2001/0044526;U.S.2001/0046481;U.S.2002/0052430;U.S.2002/0072573;U.S.2002/0156047;U.S.2003/0114647;U.S.2003/0143596;U.S.2003/0158333;U.S.2003/0220447;U.S.2004/0013637;US2004/0235734;;U.S.2005/0114037;U.S.2005/0171328;U.S.2005/0209416;EP1064951;EP0822199;WO01076640;WO0002017;WO0249673;WO9428024;WO0187925;およびWO2005000360を参照のこと)。

D.変更された特性または活性を有する修飾ヒアルロナン分解酵素を同定する方法
非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して、変更された活性または特性を示す修飾ヒアルロニダーゼまたは修飾PH20ポリペプチドなどの修飾または変異体ヒアルロナン分解酵素を同定する方法が、本明細書において提供される。特に、本明細書において提供される方法は、変性剤または変性条件の存在下で、増大した活性および/または増大した安定性を示す1種または複数種の修飾ヒアルロニダーゼまたはPH20ポリペプチドなどの1種または複数種の修飾ヒアルロナン分解酵素をスクリーニングするために使用され得る。例えば、本方法は、それだけには限らないが、温度によって引き起こされる変性条件(例えば、熱などの高温)、撹拌、無塩または低塩、賦形剤および/または変性剤の存在を含めた変性条件に対する増大した耐性によって増大した安定性を示す修飾もしくは変異体ヒアルロニダーゼまたは修飾もしくは変異体PH20ポリペプチドなどの修飾または変異体ヒアルロナン分解酵素を同定するために使用される。例示的変性剤または賦形剤として、それだけには限らないが、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤または甘味料が挙げられる。例えば、防腐剤などの種々の賦形剤が、タンパク質変性剤として作用し得る。本方法では、活性はまた、同一変性条件下で非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素よりも大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定または選択される。

本方法では、1種または複数種の修飾ヒアルロナン分解酵素が提供される。いくつかの例では、修飾分子のライブラリーが調製される。標準組換えDNA技術を使用して、突然変異誘発する方法および変異体分子のライブラリーまたは収集物を作製する方法は、本明細書において記載されており、当業者に公知である。一例では、試験される酵素は、プールされ、スクリーニングされ得、それによって、本方法によって、所望の活性を示す酵素のみを選択することが可能になる。別の例では、試験される酵素は、アドレス可能なアレイなどのアレイに形式をあわせることなどによって物理的に分離され、個別にスクリーニングされ得る。

本方法の一態様では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、1種または複数種の変性条件または変性剤の存在下および不在下でヒアルロニダーゼ活性について試験またはスクリーニングされる。条件の両設定下で試験した後、変性条件の存在下で活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するために活性が評価される。本方法においてカットオフとして選択される活性の所望のレベルまたは量は、使用者によって経験的に決定され得、特定のヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン分解酵素の所望の適用または使用、特定の変性条件または変性剤などの因子およびその他の同様の因子に応じて変わる。通常、変性剤または条件の存在下で、その不在下と比較して、活性の少なくとも5%または10%、一般に、活性の少なくとも15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上、例えば、少なくとも40%を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定される。

さらにまたはあるいは、1種または複数種の変性条件または変性剤の存在下での修飾ヒアルロナン分解酵素の活性が、同一変性剤(複数可)または条件(複数可)の存在下での対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性に対して比較される。このような例では、修飾および非修飾酵素の活性が、試験される特定の酵素における相違(未修飾対修飾)を除いて同一条件下で(例えば、時間、温度、組成物)試験されるということは理解される。非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%またはそれ以上など、大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定される。

本方法は、複数回実施され得、それによって、方法の工程が1、2、3、4または5回反復される。本明細書において提供される方法はまた、反復性である。一例では、方法が実施された後、任意の同定された修飾ヒアルロナン分解酵素が、活性を高める、または最適化するために、修飾またはさらに修飾され得る。

本方法の工程および本方法の成分の説明は、以下の小区分において提供される。

1.ヒアルロナン分解酵素および修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリー
本明細書における方法において、ヒアルロニダーゼまたはPH20ポリペプチドなどの1種または複数種の修飾ヒアルロナン分解酵素は、増大した安定性(例えば、変性条件に対する増大した耐性)などの所望の活性または特性について試験される。修飾ヒアルロナン分解酵素は、当技術分野で公知の任意のヒアルロナン分解酵素などの非修飾ヒアルロナン分解酵素と比較して修飾され得る。ヒアルロナン分解酵素は、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質バリアの主要な構成物であるヒアルロン酸を分解する酵素のファミリーである。ヒアルロナン分解酵素は、反復する二糖類単位:交互のβ−1→4およびβ−1→3グリコシド結合によって一緒に連結しているD−グルクロン酸(GlcA)およびN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)から構成されているヒアルロナンポリマーを切断することによってヒアルロナンを分解するよう作用する。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロン酸、間質バリアの主要な構成物の加水分解を触媒することによって、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それによって、組織透過性を高める。したがって、本明細書において提供された使用および方法のためのヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン二糖鎖またはポリマーの切断を触媒する能力を有する任意の酵素を含む。いくつかの例では、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン鎖またはポリマー中のβ−1→4グリコシド結合を切断する。その他の例では、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン鎖またはポリマー中のβ−1→3グリコシド結合の切断を触媒する。

ヒアルロナン分解酵素は、膜結合型である、または細胞から分泌される可溶性形態である酵素を含む。したがって、ヒアルロナン分解酵素が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーシグナル配列を含むおよび/または、そうではなく、膜固定型もしくは不溶性である場合には、酵素が分泌され、可溶性であるようにするために、このようなヒアルロナン分解酵素は、C末端切断またはGPIアンカーシグナル配列のすべてもしくは一部の欠失によって可溶性形態で提供され得る。したがって、ヒアルロナン分解酵素は、C末端で切断された、例えば、GPIアンカーシグナル配列のすべてもしくは一部を除去するために切断された変異体を含む。このような可溶性ヒアルロニダーゼの例として、米国特許第7,767,429号、米国公開番号US2004/0268425および同US2010/0143457に示される任意のものなどの可溶性PH20ヒアルロニド(hyaluronides)がある。

例示的ヒアルロナン分解酵素として、活性であるその可溶性形態または切断形態を含めた、非ヒト動物またはヒトヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼ、ヒル由来ヒアルロニダーゼまたはヒアルロナン分解活性を示すコンドロイチナーゼがある。例示的非ヒト動物ヒアルロニダーゼとして、配列番号8〜31、856〜861、869、870、871〜886のいずれかに示される任意のものまたは可溶性であり、活性である、成熟したC末端で切断された変異体またはその活性形態がある。例示的ヒトヒアルロニダーゼとして、配列番号2、3、6、7、32〜66、68〜72または887〜890のいずれかに示される任意のもの、または可溶性であり、活性である、成熟したC末端で切断された変異体またはその活性形態、特に、配列番号3、7、32〜66、69または72のいずれかがある。例示的細菌ヒアルロニダーゼとして、配列番号891〜919のいずれかに示される任意のものまたは可溶性であり、活性である、成熟した、C末端で切断された変異体またはその活性形態がある。ヒル由来の例示的ヒアルロニダーゼ、または可溶性であり、活性である、成熟した、C末端で切断された変異体またはその活性形態は、配列番号920または921に示されている。ヒアルロナン分解酵素活性を有する例示的コンドロイチナーゼ、または可溶性であり、活性である、成熟した、C末端で切断された変異体またはその活性形態は、配列番号922〜924に示されている。

例えば、1種または複数種の修飾PH20ポリペプチドは、増大した安定性(例えば、変性条件に対する増大した耐性)などの所望の活性または特性について試験される。修飾PH20ポリペプチドは、任意の公知のPH20ポリペプチド、天然の、野生型または参照ポリペプチドなどの非修飾PH20ポリペプチドと比較して修飾され得る。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに示される任意のものまたは配列番号3、7、32〜66、69もしくは72のいずれかに対して、少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示す任意のものなどの、PH20ポリペプチドの全長、可溶性形態または活性形態と比較して修飾される。本明細書における方法の特定の例では、出発または非修飾PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸の配列を有する。

修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物は、スクリーニングされ得る。ヒアルロナン分解酵素は、タンパク質の構造を変更し得る当業者に公知の任意のプロセスによって修飾され得る。修飾の例として、修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物を形成するための、タンパク質の1個または複数のアミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。本明細書における方法において使用するために修飾または変異体タンパク質を作製することは、当業者のレベルの範囲内にある。突然変異誘発の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、例えば、QuikChange(Stratagene)などの位置指定突然変異誘発または飽和突然変異誘発が挙げられる。突然変異誘発法として、それだけには限らないが、部位媒介性(site−mediated)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、カセット突然変異誘発、位置指定突然変異誘発、ランダムポイント突然変異誘発、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発、ギャップド二本鎖DNAを使用する突然変異誘発、点ミスマッチ修復、修復するに欠陥のある宿主株を使用する突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、総遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復および当業者に公知の多数のその他のものが挙げられる。本明細書における方法では、突然変異誘発は、タンパク質の全長にわたって、またはタンパク質の一定領域内で達成され得る。突然変異は、合理的にまたは無作為に行われ得る。

いくつかの例では、本明細書において提供された方法は、各突然変異株タンパク質の同一性が、タンパク質が試験される前に事前に知られているように実施される。例えば、本明細書において提供される方法は、取り組み可能である突然変異誘発およびスクリーニングまたは試験方法を促進し得る。これは、同定されるタンパク質の配列決定を必要とせず、試験されるタンパク質の活性間の比較の容易性を可能にし得る。例えば、位置指定突然変異誘発法は、突然変異株タンパク質を個々に作製するよう使用され得る。突然変異誘発は、作製される各個々の突然変異株が、各単一突然変異誘発反応の単一生成物であるように、特定の標的位置における1つずつの単一アミノ酸残基の置換によって実施され得る。突然変異株DNA分子は、突然変異誘発によって設計され、作製され、互いに物理的に分離されてり、各々が独立した突然変異誘発反応の単一生成物であるようなアドレス可能なアレイなどにおいて個々にクローニングされ得る。最適化されている、特定のタンパク質上の標的位置を置換するよう選択されたアミノ酸が、残りの19種のアミノ酸のすべて、または選択されたアミノ酸のみを含有するより制限された群のいずれかであり得る。本明細書において提供されたいくつかの方法では、置換される各アミノ酸は、残りのアミノ酸の19種によって、または残りのアミノ酸のうち10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18などの、残りのアミノ酸のうち19種未満によって独立に置換される。

2.所望の活性または特性についてのスクリーニングまたは試験
修飾ヒアルロナン分解酵素を含有する組成物のヒアルロニダーゼ活性またはその他の活性は、ヒアルロナン分解酵素を変性条件または変性剤に曝露する条件下でスクリーニングまたは試験される(変性条件または変性剤の存在)。変性条件または変性剤は、酵素に対して完全に致命的である条件または薬剤である必要はないが、一般に、酵素活性を経時的に不安定化する任意の条件または薬剤である。例えば、変性条件は、温度(例えば、30℃を超える、または約30℃または30℃などの高温、例えば、30℃〜42℃、例えば、37℃または約37℃)、撹拌、無塩または低塩(例えば、NaCl)によって引き起こされる、および/または変性剤の存在、例えば、賦形剤の存在(例えば、防腐剤の存在)によって引き起こされる条件であり得る。

変性条件下で安定性または増大した安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択または同定する方法のために、活性は、変性条件の不在下での修飾ヒアルロナン分解酵素の活性および/または変性条件の存在下での対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素の活性に対して比較され得る。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、変性条件または変性剤を含むことを除いて同一条件下で(変性条件または変性剤の不在)スクリーニングまたは試験され得る。必要に応じて、対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素(例えば、アミノ酸置換(複数可)を含有しないヒアルロナン分解酵素)の活性もまた、ヒアルロナン分解酵素を同一変性条件または変性剤に曝露する同一条件下で試験され得る。

例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素のライブラリーまたは収集物の各メンバーは、1種または複数種の変性条件下でインキュベートされるか、それに対して曝露される。インキュベーションまたは曝露は、インビボまたはインビトロで起こり得る。通常、アッセイは、インビトロで実施される。同一修飾酵素はまた、変性条件を含有しない参照または対照条件に曝露またはインキュベートされる。両条件下での活性が、変性条件または条件に対する曝露の際に安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するために比較される。さらに、条件の2つの異なるセットの下での酵素の活性のスクリーニングまたは同定では、一般に、アッセイにおいて変更される唯一の条件は、1種または複数種の変性条件の存在または不在と関連する。それだけには限らないが、時間、温度および/またはその他のインキュベーション条件を含めたアッセイのその他の条件は、条件の両セットについて同一であり得る。

例えば、曝露は、賦形剤などの変性剤または低塩もしくは無塩を含有するよう修飾または調整されているアッセイバッファーまたは組成物中で修飾ヒアルロナン分解酵素をインキュベーションすることによって達成され得る。例示的変性剤または賦形剤として、それだけには限らないが、抗付着剤、結合剤、コーティング、増量剤および希釈剤、香料、色、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着剤または甘味料が挙げられる。使用されるバッファーの選択は、修飾される特定のパラメータ(単数または複数)に応じて当業者によって経験的に決定され得る。例示的アッセイバッファーとして、グッドバッファー(例えば、Good et al. (1966) Biochemistry, 5:467-477を参照のこと)がある。このようなバッファーの例として、それだけには限らないが、ACES、ADA、BES、Bicine、BIS−TRIS、CAPS、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TRISまたはTrizma(登録商標)バッファーが挙げられる。さらに、賦形剤または塩の量または濃度は、賦形剤または塩の選択および修飾ヒアルロナン分解酵素の所望のレベルまたは活性に応じて、当業者によって経験的に決定され得る。

一例では、アッセイバッファーまたは組成物は、一定量の変性剤または防腐剤、例えば、フェノール系防腐剤である変性性賦形剤を含めることによって修飾される。フェノール系防腐剤は、フェノール、メタクレゾール(m−クレゾール)、ベンジルアルコールおよびメチルパラベンおよびプロピルパラベンを含めたパラベンであり得る。特に、フェノール系防腐剤は、フェノールおよび/またはm−クレゾールである。質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)としての1種または複数種のフェノール系防腐剤の総量は、両端を含めて、0.05%〜0.6%、0.1%〜0.4%、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%または0.3%〜0.4%の間であり得る。このような例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、1種または複数種の防腐剤、例えば、1種または複数種のフェノール系防腐剤のこのような総量(例えば、0.05%〜0.6%の間または約0.05%〜0.6%の間)の存在下で試験または評価され得る。いくつかの例では、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、アッセイバッファーまたは組成物が、防腐剤を含有するよう修飾されていない、対照または参照条件下で試験または評価され得る。特定の例では、対照として、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性はまた、防腐剤を含有する条件下および/または防腐剤を含有しない条件下で、修飾(複数可)を含有しない対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得る。

別の例では、アッセイバッファーは、低塩または無塩である変性条件の存在によって修飾される。本明細書において別の場所で論じられるように、PH20などのヒアルロナン分解酵素は、一般に、活性のために塩(例えば、NaCl、Lys−LysまたはMgCl)を必要とする。したがって、塩の不在または低塩は、酵素に対して変性性である。一例では、アッセイバッファーは、100mM未満、例えば、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM未満またはそれ以下である塩の量を含むことによって修飾される。このような一例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、塩の不在下で、または100mM未満である塩の存在下で試験され得る。いくつかの例では、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、アッセイバッファーが、高塩濃度、一般に、140mM〜200mMの間または約140mM〜200mMの間を含有する対照または参照条件下で試験または評価され得る。特定の例では、対照として、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、100mM未満などの低塩を含有するか、もしくは塩を含有しない条件下および/または140mM〜200mMの間もしくは約140mM〜200mMの間である量の塩を含有する条件下で、修飾(複数可)を含有しない対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得る。

ヒアルロナン分解酵素の変性条件に対する曝露はまた、変性性であるとわかっている条件下、例えば、30℃を超える、または約30℃または30℃の温度などの高温(例えば、30℃〜42℃、例えば37℃または約37℃)または撹拌の条件下での修飾ヒアルロナン分解酵素のインキュベーションによって達成され得る。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、30℃〜42℃を超える、または約30℃〜42℃または30℃〜42℃の高温下で試験される。いくつかの例では、修飾ヒアルロナン分解酵素はまた、温度が、30℃未満、例えば、0℃〜25℃の間もしくは約0℃〜25℃、例えば、0℃〜5℃または18℃〜25℃である、対照または参照条件下で試験または評価され得る。特定の例では、対照として、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性はまた、30℃〜42℃を超える、または約30℃〜42℃または30℃〜42℃の高温下および/または温度が30℃未満、例えば、0℃〜25℃の間もしくは約0℃〜25℃、例えば、0℃〜5℃または18℃〜25℃である下で、修飾(複数可)を含有しない対応する非修飾ヒアルロナン分解酵素に対して比較され得る。

修飾ヒアルロナン分解酵素は、1種または2種以上の条件に対して曝露され得る。1種の条件に対する曝露は、1種または複数種のその他の条件に対する曝露に対して同時に、逐次、断続的にまたは周期的に起こり得る。

一例では、本明細書における方法において、修飾ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロニダーゼ活性についてのアッセイを実施する前に変性条件または変性剤に対してインキュベートまたは曝露される。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、変性剤の存在下でインキュベートされるか、または1種もしくは複数の変性条件もしくは対照条件、例えば、上記の1種または複数種の変性条件もしくは対照条件に対して曝露される。インキュベーションまたは曝露は、任意の所望の期間であり得、当業者によって経験的に決定され得る。例えば、修飾ヒアルロナン分解酵素は、1種または複数種の変性条件、変性剤または対照条件に対して、1分〜1カ月、例えば、1分〜3週間、1分〜2週間、1分〜1週間、1分〜24時間、1分〜12時間、例えば、30分〜6時間もしくは1時間〜4時間または約1分〜1カ月、例えば、1分〜3週間、1分〜2週間、1分〜1週間、1分〜24時間、1分〜12時間、例えば、30分〜6時間もしくは1時間〜4時間、一般に、少なくとも30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間もしくは12時間またはおよそ少なくとも30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間もしくは12時間インキュベートまたは曝露され得る。インキュベーションまたは曝露時間の後、修飾ヒアルロナン分解酵素(または対照非修飾酵素)を含有するサンプルまたは組成物は、ヒアルロニダーゼアッセイについて評価される。別の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素は、1種または複数種の変性条件下で曝露またはインキュベートされ、ヒアルロニダーゼ活性について同時に(simultaneously)、または同時に(concurrently)評価される。修飾ヒアルロナン分解酵素が評価される任意の例では、修飾(複数可)を含有しない非修飾ヒアルロナン分解酵素も比較のために同様のアッセイ条件下で評価され得るということは理解される。

ヒアルロニダーゼ活性を評価するためのアッセイは、当技術分野で周知である。このようなアッセイの例は、節Gに記載されている。一例では、ヒアルロニダーゼ活性は、分解されていないHAの量が、酵素をHAと反応させた後、HAを沈殿させる試薬(例えば、塩化セチルピリジニウム(CPC)または酸性化血清)の添加によって測定されるマイクロ濁度アッセイにおいて評価され得る。別の例では、ヒアルロニダーゼ活性は、残存するビオチン化ヒアルロン酸が、ヒアルロニダーゼとともにインキュベートした後に測定されるマイクロタイターアッセイを使用して評価され得る(例えば、Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269、米国特許公開第20050260186号を参照のこと)。試験された条件の各々の下で得られた活性が、決定され、比較される。

3.選択または同定
本方法では、1種または複数種の変性条件下で修飾ヒアルロナン分解酵素をスクリーニングした後、試験された酵素のヒアルロニダーゼ活性が比較される。本方法は、条件または変性剤による変性に対してより耐性である修飾ヒアルロナン分解酵素を同定するために実施され、それによって、酵素の活性が、変性に対するその耐性の尺度として酵素の安定性を示す。変性の結果としての酵素活性の幾分かの低下は、種々の適用において許容され得、したがって、本方法は、その使用または適用を可能にする、変性条件に対する曝露の際に必要な活性(例えば、治療活性)を示す修飾ヒアルロナン分解酵素を選択するために実施され得るということは理解される。例えば、対応する非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素よりも遅く活性を失うが、その保持された活性が特定の適用または目的にとって十分である修飾酵素が選択され得る。

本明細書における方法の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、第1の変性条件に対する曝露の際に評価され、また対照または非変性条件である第2の条件に対する曝露の際に評価され、得られたヒアルロニダーゼ活性が比較される。比較のために、いくつかの例では、活性は、対照または非変性条件下と比較された変性条件下の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。例えば、第1および第2の条件間で異なるパラメータが、防腐剤(例えば、フェノール系防腐剤)の存在である場合には、活性は、防腐剤(例えば、フェノール系防腐剤)の不在下での活性に対する防腐剤(例えば、フェノール系防腐剤)の存在下で観察される活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。別の例では、第1および第2の条件間で異なるパラメータが、温度である場合には、活性は、0℃〜25℃、例えば、0℃〜5℃または18℃〜25℃などの低温の存在下での活性と比較した、高温(例えば、30℃〜42℃)の存在下で観察される活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。

変性条件の存在下で、その不在下においてと比較して、任意の所望の活性を保持または示す修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択または同定される。本明細書における酵素の選択のための活性の個々のカットオフは、個々のユーザーおよび/または方法の実施に応じて異なり、個々の変性条件または変性剤、個々の修飾ヒアルロナン分解酵素、同定または選択されたヒアルロナン分解酵素の所望の適用などの因子およびその他の同様の因子に応じて経験的に決定され得る。一般に、選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素は、任意の検出可能な活性が、変性条件または変性剤を用いる曝露またはインキュベーションの際に測定または評価される場合に安定性を示す。例えば、選択または同定された修飾ヒアルロナン分解酵素は、変性条件または変性剤の不在下での同一酵素の活性の少なくとも5%または10%を示す場合に、一般に、修飾ヒアルロナン分解酵素が、変性条件の存在下でのインキュベーションの前の最初のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも15%である活性を示す場合に、安定性または変性条件もしくは変性剤に対する耐性を示す。例えば、対照または非変性条件下で試験される修飾ヒアルロナン分解酵素の最初のヒアルロニダーゼ活性の少なくとも(または少なくとも約)16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、300%、400%、500%またはそれ以上を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択または同定される。

本明細書における方法のその他の例では、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性は、変性条件に対する曝露の際に評価され、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素の活性もまた、同一変性条件に対する曝露の際に評価される。このような例では、活性は、酵素が同一条件に対して曝露される場合に比較される。比較のために、変性条件下での活性は、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素に対して比較された、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。このような例では、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素よりも変性条件下で大きな活性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が、選択される。したがって、修飾ヒアルロナン分解酵素は、条件に対してより耐性であるものである。例えば、変性条件が、防腐剤(例えば、フェノール系防腐剤)の存在である場合には、防腐剤(例えば、フェノール系防腐剤)の存在下で観察された活性は、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素と比較された、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。別の例では、変性条件が高温である場合には、高温(例えば、30℃〜42℃)の存在下で観察される活性は、非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素と比較された、修飾ヒアルロナン分解酵素の活性の比または活性のパーセンテージとして表され得る。

このような例では、酵素が、変性条件下で非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素より大きな活性を示すような、1.1を超えるか、または少なくとも1.1である活性の比を示す、修飾PH20などの修飾ヒアルロナン分解酵素が、同定または選択される。例えば、比は、少なくとも1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0またはそれ以上であるか、または少なくとも約1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0またはそれ以上である。修飾ヒアルロナン分解酵素(例えば、修飾PH20)は、その活性が、同一条件下で試験された場合に非修飾または参照ヒアルロナン分解酵素の活性の、少なくとも120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%またはそれ以上である場合に選択され得る。したがって、変性条件または変性剤に対する増大した耐性によって表されるような、非修飾ヒアルロナン分解酵素または参照ヒアルロナン分解酵素と比較して、大きな、または改善された安定性を示す修飾ヒアルロナン分解酵素が同定される。

4.反復性方法
本明細書において提供される方法はまた、反復性である。一例では、方法が実施された後に、変性条件下で増大した安定性などの安定性を示すと同定された任意の修飾ヒアルロナン分解酵素は、安定性を高め、または最適化するよう修飾またはさらに修飾され得る。第2のライブラリーは、第1の同定された修飾ヒアルロナン分解酵素中にさらなる修飾を導入することによって作製され得る。例えば、増大する安定性などの安定性を付与すると同定された修飾は、コンビナトリアルライブラリーを作製するために組み合わされ得る。第2のライブラリーは、本明細書において記載されたアッセイおよび方法を使用して試験され得る。

本方法の反復性態様の別の例では、増大した安定性などの安定性を示さない(例えば、変性条件下で活性でないか、または増大した活性を有さないような)と同定される修飾ヒアルロナン分解酵素は、さらに修飾され、変性条件下での安定性について再試験され得る。さらなる修飾は、分子の活性および/または安定性と関連している特定の領域(例えば、特定のアミノ酸残基)付近にターゲッティングされ得る。例えば、分子の活性および/または安定性と関連している残基は、一般に、分子の構造フォールディングまたはその他の活性に関与している重大な残基である。したがって、このような残基は、一般に、任意の条件下で活性にとって必要である。重大な残基は、突然変異されると、タンパク質の正常な活性が消失するか、または低減されるので同定され得る。例えば、ヒアルロナン分解酵素において突然変異された場合に、正常または対照アッセイ条件下で、低減または消失したヒアルロニダーゼ活性を示す重大な残基が同定され得る。修飾タンパク質のさらなるライブラリーは、同定された重大なアミノ酸残基またはその付近、例えば、同定された重大なアミノ酸残基に隣接するものにターゲッティングされるアミノ酸突然変異を用いて作製され得る。いくつかの例では、突然変異は、最大19種のその他のアミノ酸残基の任意の他のものへのアミノ酸置換であり得る。第2のライブラリーは、本明細書において記載されたアッセイおよび方法を使用して試験され得る。

E.核酸分子をコードする修飾PH20ポリペプチドの産生
本明細書において示される修飾PH20ポリペプチドのポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための当技術分野で周知の方法によって得ることができる。ポリペプチドはまた、化学合成され得る。切断形態を含めた修飾形態または変異体形態は、標準組換えDNA法を使用して野生型ポリペプチドから操作され得る。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、位置指定突然変異誘発などによって野生型ポリペプチドから操作され得る。

1.PH20ポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するための当技術分野で公知の任意の利用可能な方法を使用してクローニングまたは単離され得る。このような方法は、核酸のPCR増幅および核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含めたライブラリーのスクリーニングを含む。
例えば、ポリペプチドが、組換え手段によって産生される場合には、所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための当業者に公知の任意の方法が使用され得る。細胞または組織供給源などからPH20をコードする全長または部分(すなわち、全コーディング領域を包含する)cDNAまたはゲノムDNAクローンを得るために当技術分野で利用可能な任意の方法が使用され得る。

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を含めた核酸の増幅方法は、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用され得る。このような方法の例として、Perkin−Elmer CetusサーマルサイクラーおよびTaqポリメラーゼ(Gene Amp)の使用が挙げられる。核酸含有材料が、所望のポリペプチドをコードする核酸分子が単離され得る出発材料として使用され得る。例えば、健常および/または罹患対象から得た、DNAおよびmRNA調製物、細胞抽出物、組織抽出物、流体サンプル(例えば、血液、血清、唾液)、サンプルが、増幅方法において使用され得る。供給源は、それだけには限らないが、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、ウマ、イヌおよびその他の霊長類供給源を含めた任意の真核細胞種から得られ得る。核酸ライブラリーはまた、出発材料の供給源として使用され得る。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するよう設計され得る。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが作製される、発現された配列に基づいて設計され得る。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計され得る。必要に応じて、増幅のために縮重プライマーが使用され得る。所望の配列の3’および5’末端で配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが、PCRによって核酸サンプルから得られた配列を増幅するためのプライマーとして使用され得る。プライマーは、全長PH20全体または本明細書において提供される可溶性PH20ポリペプチドのいずれかをコードする核酸などのその切断配列を増幅するために使用され得る。増幅によって作製された核酸分子は、配列決定され、所望のポリペプチドをコードすると確認され得る。

合成遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングDNA配列の増幅のために設計されたベクター中にクローニングする目的で、制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含めたさらなる核酸配列が、ポリペプチドをコードする核酸分子と結合され得る。さらに、機能的DNAエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする核酸分子と機能し得る形で連結され得る。このような配列の例として、それだけには限らないが、細胞内タンパク質発現を促進するよう設計されたプロモーター配列および分泌配列、例えば、タンパク質分泌を促進するよう設計された異種シグナル配列が挙げられる。このような配列は、当業者に公知である。例えば、例示的異種シグナル配列として、それだけには限らないが、配列番号868に示されるヒトおよびマウスκIgG異種シグナル配列が挙げられる。タンパク質結合領域を特定する塩基の配列などのさらなるヌクレオチド残基配列も、酵素をコードする核酸分子に連結され得る。このような領域として、それだけには限らないが、特定の標的細胞中への酵素の取り込みを促進するタンパク質を促進またはコードする残基の配列または、そうではなく、合成遺伝子の産物の薬物動態を変更する残基の配列が挙げられる。

さらに、例えば、ポリペプチドの検出またはアフィニティー精製を補助するために、タグまたはその他の部分が付加され得る。例えば、エピトープタグまたはその他の検出可能なマーカーを特定する塩基の配列などのさらなるヌクレオチド残基配列もまた、酵素をコードする核酸分子と連結され得る。このような配列の例として、HisタグまたはFlagタグをコードする核酸配列が挙げられる。

同定および単離された核酸は、次いで、適当なクローニングベクター中に挿入され得る。当技術分野で公知の多数のベクター−宿主系が使用され得る。可能性あるベクターとして、それだけには限らないが、プラスミドまたは修飾ウイルスが挙げられるが、ベクター系は、使用される宿主細胞と適合しなくてはならない。このようなベクターとして、それだけには限らないが、λ誘導体などのバクテリオファージまたはpCMV4、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体などのプラスミドまたはBluescriptベクター(Stratagene、La Jolla、CA)が挙げられる。その他の発現ベクターとして、本明細書において例示されるHZ24発現ベクターが挙げられる(例えば、配列番号4および5を参照のこと)。クローニングベクターへの挿入は、例えば、DNA断片を、完全付着末端を有するクローニングベクター中にライゲーションすることによって達成され得る。挿入は、TOPOクローニングベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して達成され得る。

DNAを断片化するために使用される相補的制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合には、DNA分子の末端は、酵素的に修飾され得る。あるいは、所望の任意の部位は、ヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端にライゲーションすることによって産生され得、これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含有し得る。代替法では、切断されたベクターベクターおよびタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングによって修飾され得る。

組換え分子は、遺伝子配列の多数のコピーが作製されるように、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーション(sonoporation)によって宿主細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、単離タンパク質遺伝子、cDNAまたは合成DNA配列を組み込む組換えDNA分子での、宿主細胞の形質転換によって、遺伝子の複数のコピーの作製が可能となる。したがって、形質転換体を増殖させること、形質転換体から組換えDNA分子を単離することおよび、必要な場合には、単離された組換えDNAから挿入された遺伝子を取り出すことによって、遺伝子を多量に得ることができる。

組換え産生に加えて、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、固相技術を使用する直接ペプチド合成によって産生され得る(例えば、Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide synthesis,WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc., 85:2149-2154を参照のこと)。インビトロタンパク質合成は、手作業による技術を使用して、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Applied Biosystems 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer、Foster City CA)を使用して、製造業者によって提供された使用説明書にしたがって達成できる。ポリペプチドの種々の断片を、別個に化学合成し、化学法を使用して組み合わせてもよい。

2.突然変異株または修飾核酸およびコーディングポリペプチドの作製
本明細書において提供された修飾は、当業者には日常的であるものなどの標準組換えDNA技術によって行われ得る。標的タンパク質中の任意の1個または複数のアミノ酸の突然変異を達成するために、当技術分野で公知の任意の方法が使用され得る。方法として、コーディング核酸分子の標準位置指定突然変異誘発(例えば、Stratageneから入手可能なQuikChangeなどのキットを使用して)、または固相ポリペプチド合成法によってが挙げられる。

3.ベクターおよび細胞
本明細書において記載された任意の修飾PH20ポリペプチドなどの1種または複数種の所望のタンパク質の組換え発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のための必須エレメントを含有するベクター中に挿入され得る。必須転写および翻訳シグナルは、酵素遺伝子の天然のプロモーターおよび/またはそのそれぞれの両端に位置する領域によって供給され得る。

酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供される。ベクターを含有する細胞もまた提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、それにおいて使用するための任意の適したものである。一般に、細胞は、コードされるタンパク質のグリコシル化(glyosylation)を達成できる細胞である。

ベクターを含有する原核細胞および真核細胞が提供される。このような細胞として、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。細胞は、上記の細胞を、コードされたタンパク質が細胞によって発現される条件下で増殖させることおよび発現されたタンパク質を回収することによってそのタンパク質を産生するために使用される。本明細書においてにおける目的上、例えば、酵素は、培地中に分泌され得る。

宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節し、発現されたタンパク質を所望の方法でプロセシングする能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾として、それだけには限らないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられる。翻訳後プロセシングは、ポリペプチドのフォールディングおよび/または機能に影響を及ぼし得る。それだけには限らないが、CHO(DG44、DXB11、CHO−K1)、HeLa、MCDK、293およびWI38などの種々の宿主細胞は、このような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的な機構を有し、導入されたタンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするよう選択され得る。一般に、細胞の選択は、発現されたポリペプチド中にN結合型グリコシル化を導入できるものである。したがって、ベクターを含有する真核細胞が提供される。例示的真核細胞として、哺乳類チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞がある。例えば、ジヒドロホレートレダクターゼ(例えば、DG44細胞)に欠陥のあるCHO細胞が、本明細書において提供されるポリペプチドを産生するために使用される。本明細書において提供されたPH20ポリペプチド(polypepyide)の細菌発現は、触媒的に活性なポリペプチドをもたらさず、適切なグリコシル化機構と組み合わせた場合に、PH20は、人工的にグリコシル化され得ることに留意されたい。

天然または異種シグナル配列と結合している修飾PH20ポリペプチド、ならびにその複数のコピーをコードするヌクレオチドの配列を含有するベクターが提供される。ベクターは、細胞における酵素タンパク質の発現のために、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択され得る。

種々の宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現するために使用され得る。これらとして、これだけには限らないが、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびその他のウイルス)に感染した哺乳類細胞系;ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;酵母ベクターを含有する酵母などの微生物;またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNAで形質転換された細菌が挙げられる。ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が変わる。使用される宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適した転写および翻訳エレメントのいずれか1種が使用され得る。

適当な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために、ベクターへのDNA断片の挿入のための当業者に公知の任意の方法が使用され得る。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成技術およびインビボ組換え体(遺伝子組換え)を含み得る。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、断片または相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、組換えDNA分子(複数可)で形質転換された宿主において発現されるよう、第2の核酸配列によって調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター/エンハンサーによって制御され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、所望のタンパク質の遺伝子にとって天然ではない。使用され得るプロモーターとして、それだけには限らないが、SV40初期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981))、ラウス肉腫ウイルスの3’長い末端反復配列中に含有されるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982));β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物の発現ベクタープロモーター(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543)またはtacプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983);Gilbert and Villa-Komaroff,「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」, Scientific American 242:74-94 (1980)も参照のこと);ノパリンシンセターゼプロモーターなどの植物発現ベクタープロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984))またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981))および光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984));酵母およびGal4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどのその他の真菌由来のプロモーターエレメントならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた以下の動物転写制御領域:膵腺房細胞において活性であるエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al.,Cell 38:639-646 (1984);Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986);MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987));膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984);Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳房、リンパ球および肥満細胞において活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986))、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al.、Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓において活性であるα-フェトタンパク質遺伝子制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985);Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓において活性であるα-1アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄系細胞において活性であるβグロビン遺伝子制御領域(Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Shani, Nature 314:283-286 (1985))、および視床下部のゴナドトロピン分泌細胞において活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))が挙げられる。

特定の実施形態では、所望のタンパク質またはそのドメイン、断片、誘導体または同族体をコードする核酸と作動可能に連結しているプロモーター、1種または複数種の複製起点および適宜、1種または複数種の選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含有するベクターが使用される。発現系に応じて、PH20配列の効率的な翻訳にとって特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルとして、ATG開始コドンおよび隣接する配列が挙げられる。PH20またはその可溶性形態の開始コドンおよび上流配列が、適当な発現ベクターに挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要ではない。コード配列またはその一部のみが、挿入される場合には、ATG開始コドンを含めた外因性転写制御シグナルが提供されなくてはならない。さらに、開始コドンは、全挿入物の転写を確実にするよう正しいリーディングフレーム中になくてはならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成両方の種々の起源のものであり得る。発現の効率は、使用中の細胞系にとって適当なエンハンサーを含めることによって増強され得る(Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62;Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol, 153:516-544)。

大腸菌の形質転換のための例示的プラスミドベクターとして、例えば、pQE発現ベクター(Qiagen、Valencia、CAから入手可能;この系を説明するQiagenによって公開された文献も参照のこと)が挙げられる。pQEベクターは、大腸菌における組換えタンパク質の堅固に調節された、高レベル発現を提供するための、ファージT5プロモーター(大腸菌RNAポリメラーゼによって認識される)および二重lacオペレーター抑制モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位(RBS II)、6×Hisタグコード配列、tおよびT1転写ターミネーター、ColE1複製起点およびアンピシリン耐性を付与するためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。pQEベクターは、組換えタンパク質のN−またはC−末端のいずれかに6×Hisタグを配置できる。このようなプラスミドとして、3つすべてのリーディングフレームに多重クローニング部位を提供し、N末端に6×Hisタグをつけたタンパク質の発現を提供する、pQE32、pQE30およびpQE31が挙げられる。大腸菌細胞の形質転換のためのその他の例示的プラスミドベクターとして、例えば、pET発現ベクター(米国特許第4,952,496号;Novagen、Madison、WIから入手可能を参照のこと;この系を説明するNovagenによって公開された文献も参照のこと)が挙げられる。このようなプラスミドとして、T7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導可能な大腸菌lacオペレーターおよびlacレプレッサー遺伝子を含有するpET 11a;T7プロモーター、T7ターミネーターおよび大腸菌ompT分泌シグナルを含有するpET 12a−c;ならびにHisカラムを用いる精製において使用するためのHis−Tag(商標)リーダー配列およびカラムでの精製後の切断を可能にするトロンビン切断部位、T7−lacプロモーター領域およびT7ターミネーターを含有するpET 15bおよびpET19b (Novagen、Madison、WI)が挙げられる。

通常、ベクターは、インビボまたはインビトロでの修飾PH20ポリペプチドの発現のために使用される、プラスミド、ウイルスベクターまたは当技術分野で公知のその他のものであり得る。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含めた哺乳類細胞において発現される。哺乳類細胞発現のための例示的ベクターとして、HZ24発現ベクターがある。HZ24発現ベクターは、pCIベクター骨格(Promega)から誘導された。Β−ラクタマーゼ耐性遺伝子(AmpR)、F1複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー/プロモーター領域(CMV)およびSV40後期ポリアデニル化シグナル(SV40)をコードするDNAを含有する。発現ベクターはまた、ECMVウイルス(Clontech)由来の配列内リボソーム進入部位(IRES)およびマウスジヒドロホレートレダクターゼ(DHFR)遺伝子を有する。

アデノウイルス、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用され得る。いくつかの例では、ベクターは、欠陥のある、または弱毒化レトロウイルスまたはその他のウイルスベクターである(米国特許第4,980,286号を参照のこと)。例えば、レトロウイルスベクターは、使用され得る(Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)を参照のこと)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みに必要ではないレトロウイルス配列を欠失するよう修飾されている。

いくつかの例では、修飾PH20ポリペプチドをコードする核酸を備えたウイルスは、例えば、その複製および標的組織内での蔓延を促進し得る。標的組織は、癌性組織であり得、それによって、ウイルスは、腫瘍内で選択的に複製可能である。ウイルスはまた、ウイルスが、組織特異的プロモーターの下で選択的に複製する非溶解性ウイルスであり得る。ウイルスが複製するので、PH20ポリペプチドのウイルス遺伝子との同時発現は、インビボでのウイルスの蔓延を促進する。

4.発現
修飾PH20ポリペプチドは、インビボおよびインビトロ法を含めた当業者に公知の任意の方法によって産生され得る。所望のタンパク質は、例えば、投与および治療にとって必要とされるものなどのタンパク質の必要な量および形態を産生するのに適した任意の生物において発現され得る。発現宿主として、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含めた哺乳類細胞などの原核および真核細胞の生物が挙げられる。発現宿主は、そのタンパク質産生レベルならびに発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類が異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび規制上および安全上の検討事項、産生費用および必要性および精製方法などのその他の因子に基づいて行われ得る。

多数の発現ベクターが利用可能であり、当業者に公知であり、タンパク質の発現のために使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を受ける。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび適宜、エンハンサー、翻訳シグナルならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換のために使用される発現ベクターは、通常、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合には、複製起点は、ベクターのコピー数を増幅するために使用され得る。

修飾PH20ポリペプチドはまた、タンパク質融合物として利用または発現され得る。例えば、酵素融合物は、酵素にさらなる機能性を付加するために作製され得る。酵素融合タンパク質の例として、それだけには限らないが、シグナル配列、局在性などのためのタグ、例えば、6×HisもしくはHisタグもしくはmycタグまたは精製のためのタグ、例えば、GST融合物およびタンパク質分泌および/または膜結合に向かわせるための配列の融合物が挙げられる。

組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定な発現が望まれる。例えば、修飾PH20ポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用して形質転換され得る。ベクターの導入後、細胞を栄養強化された培地中で1〜2日間増殖させることができ、その後、それを選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在によって、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収が可能となる。安定に形質転換された細胞の耐性細胞は、細胞種にとって適当な組織培養技術を使用して増殖させることができる。

形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系が使用され得る。これらとして、それだけには限らないが、それぞれ、TK−またはAPRT−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler, M et al. (1977) Cell, 11:223-32)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, I et al. (1980) Cell, 22:817-23)遺伝子が挙げられる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性が、選択の根拠として使用され得る。例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するDHFR(Wigler, M et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, 77:3567-70);アミノグリコシドネオマイシンおよびG−418に対する耐性を付与するnpt(Colbere-Garapin, F et al. (1981) J. Mol. Biol.、150:1-14);およびそれぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシン(phosphinotricin)アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するalsまたはpatが使用され得る。さらなる選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファン(typtophan)の代わりにインドールを利用するのを可能にするtrpBまたは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール(histinol)を利用するのを可能にするhisDが記載されている(Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci、85:8047-51)。それだけには限らないが、アントシアニン、βグルクロニダーゼおよびその基質、GUSおよびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどの可視マーカーも、形質転換体を同定するために、また、特定のベクター系に起因し得る一時的または安定なタンパク質発現の量を定量化するために使用され得る(Rhodes CA et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131)。

PH20ポリペプチドの存在および発現は、モニタリングされ得る。例えば、機能的ポリペプチドの検出は、適当な条件下でヒアルロニダーゼ酵素活性についてコンディショニング培地を試験することによって決定され得る。発現されたタンパク質の溶解度および活性を評価するための例示的アッセイは、本明細書において提供される。

a.原核細胞
原核生物、特に、大腸菌は、多量のタンパク質を産生するための系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡単な迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは、誘導プロモーターを含有し得る。このようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに、また宿主細胞に対して幾分かの毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用である。誘導プロモーターの例として、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6 RNAプロモーターおよび温度調節性λPLプロモーターが挙げられる。

本明細書において提供されるいずれかのものなどのタンパク質は、大腸菌の細胞質環境において発現され得る。細胞質は、還元性環境であり、一部の分子にとっては、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオスレオトール(dithiothreotol)およびβ-メルカプトエタノールなどの還元剤ならびにグアニジン−HClおよび尿素などの変性剤がタンパク質を再可溶化するために使用され得る。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供する細菌の細胞膜周辺腔におけるタンパク質発現を達成し、これは、可溶性タンパク質の産生に役立ち得る。通常、タンパク質を周辺質に向かわせるリーダー配列が、発現されるべきタンパク質に融合される。次いで、周辺質内のシグナルペプチダーゼによってリーダーが除去される。周辺質をターゲッティングするリーダー配列の例として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するpelBリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーが挙げられる。いくつかの場合には、原形質周辺の発現によって、発現されたタンパク質の培養培地への漏出が可能となる。タンパク質の分泌によって、培養上清からの迅速な、簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によって周辺質から得ることができる。細胞質発現同様、いくつかの場合には、タンパク質は、不溶性となり得、可溶化および再折りたたみを促進するために変性剤および還元剤が使用され得る。誘導および増殖の温度も、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得る。通常、25℃から37℃の間の温度が使用される。一般に、細菌は、グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とする場合にはグリコシル化は、宿主細胞からの精製後にインビトロで付加され得る。

b.酵母細胞
サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母は、本明細書において記載される任意のものなどのタンパク質の産生のために使用され得る周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製性ベクターを用いて、または相同組換えによる安定な染色体組込みによって形質転換され得る。通常、誘導プロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用される。このようなプロモーターの例として、GAL1、GAL7およびGAL5およびメタロチオネインプロモーター、例えば、CUP1、AOX1またはその他のピキア(Pichia)またはその他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換されたDNAの選択および維持のために、選択マーカー、例えば、LEU2、TRP1、HIS3およびURA3を含むことが多い。酵母において発現されるタンパク質は、可溶性であることが多い。Bipなどのシャペロンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現は、発現レベルおよび溶解度を改善し得る。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)由来の酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物およびAga2p接合接着受容体またはアルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用して分泌に向かわせることができる。Kex−2プロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位を、分泌経路を出るときに発現されたポリペプチドから融合された配列を除去するよう操作してもよい。酵母はまた、Asn−X−Ser/Thrモチーフでグリコシル化できる。

c.昆虫および昆虫細胞
特に、バキュロウイルス発現を使用する昆虫細胞は、PH20ポリペプチドなどのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用される翻訳後修飾のほとんどを行うことができる。バキュロウイルスは、真核細胞発現の安全性を改善し、規制上の検討事項を減少する、制限的宿主域を有する。通常の発現ベクターは、高レベル発現のためにバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系として、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)またはボンビックス・モリ(Bombyx mori)核多核体病ウイルス(BmNPV)などのバキュロウイルスならびにスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)由来Sf9、ヨトウガ(Pseudaletia unipuncta)(A7S)およびオオカバマダラ(Danaus plexippus)(DpN1)などの昆虫細胞株が挙げられる。高レベル発現のためには、発現される分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングされ、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌するために使用できる。さらに、細胞株ヨトウガ(Pseudaletia unipuncta)(A7S)およびオオカバマダラ(Danaus plexippus)(DpN1)は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。例示的昆虫細胞は、「哺乳類化(mammalianized)」バキュロウイルス発現ベクターを有するものおよび酵素FT3を欠くものを含めた免疫原性を低減するよう変更されているものである。

昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。シュナイダー(Schnieder)2(S2)およびKc細胞(キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster))およびC7細胞(ヒトスジシマカ(Aedes albopictus))などの細胞株を発現のために使用できる。ショウジョウバエ(Drosophila)メタロチオネインプロモーターを使用して、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導できる。発現ベクターは、通常、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって維持される。

d.哺乳類発現
哺乳類発現系を使用して、PH20ポリペプチドを含めたタンパク質を発現させることができる。発現コンストラクトを、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランなどの直接DNAトランスファーによって、またエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって哺乳類細胞に移すことができる。哺乳類細胞の発現ベクターは、通常、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列(コザックコンセンサス配列)およびポリアデニル化エレメントを含む。IRESエレメントも、別の遺伝子を用いるバイシストロニック発現を可能にするために付加され得る。このようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、SV40プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス(RSV)の長い末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多数の細胞種において活性である。組織および細胞種プロモーターおよびエンハンサー領域も、発現のために使用できる。例示的プロモーター/エンハンサー領域として、それだけには限らないが、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α1アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものが挙げられる。選択マーカーを使用して、発現コンストラクトを有する細胞を選択および維持できる。選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼが挙げられる。例えば、発現は、DHFR遺伝子を発現する細胞のみを選択するためにメトトレキサートの存在下で実施され得る、TCR−ζおよびFcεRI−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合によって、細胞表面で活性な状態でタンパク質の発現を指示できる。

哺乳類発現には、マウス、ラット ヒト、サルおよびニワトリおよびハムスター細胞を含めて多数の細胞株が利用可能である。例示的細胞株として、それだけには限らないが、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0(非分泌性)およびその他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8およびHKB細胞が挙げられる。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を促進する血清不含培地に適応した細胞株もまた、利用可能である。例として、CHO−S細胞(Invitrogen、Carlsbad、CA、カタログ番号11619−012)および血清不含EBNA−1細胞株(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.)が挙げられる。最大発現のために最適化された特定の培地で増殖するよう適応した細胞株もまた、利用可能である。例えば、DG44 CHO細胞は、化学的に定義された、動物生成物を含まない培地における懸濁培養において増殖するよう適応している。

e.植物
本明細書において記載された任意のものなどのタンパク質を発現させるために、トランスジェニック植物細胞および植物を使用できる。発現コンストラクトは、通常、微粒子銃およびプロトプラストへのPEG媒介性移入などの直接DNAトランスファーを使用して、またアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて植物に移される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナ(Arabidopsis)およびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびコメなどの単子葉植物宿主間で分かれている。発現のために使用される植物プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびUBQ3プロモーターが挙げられる。形質転換された細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーが使用されることが多い。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)として培養で維持される場合も、全植物体に再生される場合もある。トランスジェニック植物細胞としてまた、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するよう操作された藻類を挙げることができる。植物は、哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主において産生されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。

5.精製
修飾PH20ポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からのコードされたタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、一般に、分泌されるが、配列および/または使用されるベクターに応じて細胞内に含有される場合もある。当業者には理解されるであろうが、PH20をコードする核酸を含有する発現ベクターは、原核細胞または真核細胞膜を通るPH20の直接分泌を容易にするシグナル配列を用いて設計され得る。

したがって、宿主細胞からポリペプチドを精製するための方法は、選択される宿主細胞および発現系に応じて異なる。分泌された分子については、タンパク質は、一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、抽出物からタンパク質を精製できる。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物が、発現に使用される場合には、組織または臓器を、溶解された細胞抽出物を製造するための出発材料として使用できる。さらに、トランスジェニック動物産生は、乳または卵におけるポリペプチドの産生を含む場合があり、これは集めることができ、必要に応じて、当技術分野における標準方法を使用して、タンパク質を抽出し、さらに精製できる。

修飾PH20ポリペプチドなどのタンパク質は、それだけには限らないが、SDS−PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィーを含めた当技術分野で公知の標準タンパク質精製技術を使用して精製できる。調製物の効率および純度を改善するためにアフィニティー精製技術を利用してもよい。例えば、PH20ヒアルロニダーゼ酵素と結合する抗体、受容体およびその他の分子をアフィニティー精製において使用してもよい。例えば、可溶性PH20を、コンディショニング培地から精製できる。

また、発現コンストラクトを、タンパク質に、mycエピトープ、GST融合物またはHisなどのアフィニティータグを加えるよう操作し、それぞれ、myc抗体、グルタチオン樹脂およびNi樹脂を用いてアフィニティー精製してもよい。このようなタグが、本明細書において別の場所に記載されるような可溶性PH20をコードするヌクレオチド配列と結合され得、これによって、可溶性タンパク質の精製が容易になり得る。例えば、修飾PH20ポリペプチドを、1種または複数種のさらなるポリペプチドドメインがタンパク質精製を容易にするために付加された組換えタンパク質として発現させてもよい。このような精製を容易にするドメインとして、それだけには限らないが、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインAドメインおよびFLAGS伸長/アフィニティー精製システム(Immunex Corp.、Seattle Wash.)において利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインおよび発現されるPH20ポリペプチドの間に因子XAまたはエンテロキナーゼなどの切断可能なリンカー配列(Invitrogen、San Diego、CA)を含めることは、精製を容易にするために有用である。1つのこのような発現ベクターは、PH20ポリペプチドおよびエンテロキナーゼ切断部位を含有する融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、IMIAC(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)での精製を容易にし、一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。

純度は、ゲル電気泳動、直交型HPLC法、染色および分光光度的技術を含めた当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。発現され、精製されたタンパク質は、当業者に公知の任意のアッセイまたは方法、例えば、節Gにおいて記載される任意のものを使用して分析され得る。これらとして、それだけには限らないが、ゲル電気泳動による分析、イムノアッセイおよびヒアルロニダーゼ活性のアッセイを含めた、タンパク質の物理的および/または機能的特性に基づくアッセイが挙げられる。

使用される発現系および宿主細胞に応じて、得られるポリペプチドは、産生および精製の際に培養培地中に存在するペプチダーゼのために不均一であり得る。例えば、CHO細胞における可溶性PH20の培養は、不均一ポリペプチドの混合物をもたらし得る。

6.ペグ化によるポリペプチドの修飾
ポリエチレングリコール(PEG)は、PEGが、一般に、非免疫原性である、生体適合性で、非毒性の水溶性ポリマーであるので(Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997)、主に、生体材料、バイオテクノロジーおよび医薬において広く使用されている。薬物デリバリーの領域では、PEG誘導体は、免疫原性、タンパク質分解および腎臓クリアランスを低減し、溶解度を高めるためにタンパク質との共有結合において広く使用されている(すなわち「ペグ化」)(Zalipsky, Adv.Drug Del. Rev. 16:157-82、1995)。同様に、PEGは、溶解度を高め、毒性を低下させ、体内分布を変更するために、低分子量の、比較的疎水性の薬物と結合されてきた。通常、PEG化薬物は、溶液として注射される。

分解可能な、可溶性薬物担体の設計において使用される同化学の多くが、分解性ゲルの設計においても使用できるので、密接に関連する適用は、架橋された分解可能なPEGネットワークまたは薬物デリバリーにおいて使用するための製剤の合成である(Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993)。2種の相補的ポリマーの溶液を混合することによって、高分子間錯体が形成され得るということは公知である。このような錯体は、一般に、関与するポリマー間の静電相互作用(ポリアニオン−ポリカチオン)および/または水素結合(ポリ酸−ポリ塩基)によって、および/または水性の周囲中のポリマー間の疎水性相互作用によって安定化される(Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996)。例えば、適当な条件下でポリアクリル酸(PAAc)およびポリエチレンオキシド(PEO)の溶液を混合することは、主に水素結合に基づく錯体の形成をもたらす。生理学的条件でのこれらの複合体の解離は、遊離薬物(すなわち、非PEG化された)のデリバリーのために使用されてきた。さらに、相補的ポリマーの錯体は、ホモポリマーおよびコポリマーの両方から形成された。

ペグ化のための多数の試薬が、当技術分野で記載されてきた。このような試薬として、それだけには限らないが、N−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性化PEG、スクシンイミジルmPEG、mPEG−N−ヒドロキシスクシンイミド、mPEGスクシンイミジルα−メチルブタノエート、mPEGスクシンイミジルプロピオネート、mPEGスクシンイミジルブタノエート、mPEGカルボキシメチル3−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二機能性PEG−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二機能性PEGプロピオンアルデヒド、ホモ二機能性PEGブチルアルデヒド、PEGマレイミド、PEGヒドラジド、p−ニトロフェニル−カルボネートPEG、mPEG−ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドPEG、mPEGブチルアルデヒド、分岐mPEGブチルアルデヒド、mPEGアセチル、mPEGピペリドン、mPEGメチルケトン、mPEG「リンカーレス」マレイミド、mPEGビニルスルホン、mPEGチオール、mPEGオルトピリジルチオエステル、mPEGオルトピリジルジスルフィド、Fmoc−PEG−NHS、Boc−PEG−NHS、ビニルスルホンPEG−NHS、アクリレートPEG−NHS、フルオレセインPEG−NHSおよびビオチンPEG−NHSとのポリペプチドの反応物が挙げられる(例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995;Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997;U.S.5,672,662;U.S.5,932,462;U.S.6,495,659;U.S.6,737,505;U.S.4,002,531;U.S.4,179,337;U.S.5,122,614;U.S.5,324,844;U.S.5,446,090;U.S.5,612,460;U.S.5,643,575;U.S.5,766,581;U.S.5,795,569;U.S.5,808,096;U.S.5,900,461;U.S.5,919,455;U.S.5,985,263;U.S.5,990,237;U.S.6,113,906;U.S.6,214,966;U.S.6,258,351;U.S.6,340,742;U.S.6,413,507;U.S.6,420,339;U.S.6,437,025;U.S.6,448,369;U.S.6,461,802;U.S.6,828,401;U.S.6,858,736;U.S.2001/0021763;U.S.2001/0044526;U.S.2001/0046481;U.S.2002/0052430;U.S.2002/0072573;U.S.2002/0156047;U.S.2003/0114647;U.S.2003/0143596;U.S.2003/0158333;U.S.2003/0220447;U.S.2004/0013637;US2004/0235734;WO05000360;U.S.2005/0114037;U.S.2005/0171328;U.S.2005/0209416;EP1064951;EP0822199;WO01076640;WO0002017;WO0249673;WO9428024;およびWO0187925を参照のこと)。

一例では、ポリエチレングリコールは、約3kD〜約50kDの間、通常、約5kD〜約30kDの範囲の分子量を有する。PEGの薬物との共有結合(「ペグ化」として知られる)は、既知化学合成技術によって達成され得る。例えば、タンパク質のペグ化は、適した反応条件下でNHS活性化PEGをタンパク質と反応させることによって達成され得る。

ペグ化について多数の反応が記載されているが、最も一般的に適用可能なものは、方向性を付与し、穏やかな反応条件を利用し、毒性触媒または副生成物を除去するための大規模な下流処理を必要としない。例えば、モノメトキシPEG(mPEG)は、1つのみの反応性末端ヒドロキシルを有し、したがって、その使用は、得られるPEG−タンパク質生成物混合物の不均一性を幾分か制限する。末端メトキシ基の反対側のポリマーの末端のヒドロキシル基の活性化は、一般に、誘導体化PEGを求核攻撃に対してより感受性にすることを目的とした、効率的なタンパク質ペグ化を達成するために必要である。攻撃性求核試薬は、普通、リシル残基のε−アミノ基であるが、局所条件が好都合である場合には、その他のアミンもまた、反応し得る(例えば、N末端α−アミンまたはヒスチジンの環アミン)。単一のリシンまたはシステインを含有するタンパク質では、より方向性のある結合があり得る。後者の残基が、チオール特異的修飾のためのPEG−マレイミドによって標的とされ得る。あるいは、PEGヒドラジドは、過ヨウ素酸酸化されたヒアルロナン分解酵素と反応され、NaCNBH3の存在下で還元され得る。より詳しくは、PEG化CMP糖は、適当なグリコシル−トランスフェラーゼの存在下でヒアルロナン分解酵素と反応され得る。1つの技術として、いくつかのポリマー分子が、問題のポリペプチドと結合される「ペグ化」技術がある。この技術を使用する場合には、免疫系は、抗体の形成に関与するポリペプチドの表面上のエピトープの認識が困難となり、それによって、免疫応答が低下する。特定の生理学的効果をもたらすよう、ヒト身体の循環器系に直接導入されるポリペプチド(すなわち、医薬品)については、通常の潜在的免疫応答として、IgGおよび/またはIgM反応があるが、呼吸系によって吸入されたポリペプチド(すなわち、産業用ポリペプチド)は、IgE反応(すなわち、アレルギー反応)を引き起こす可能性がある。免疫応答の低下を説明する理論の1つは、ポリマー分子(複数可)が、抗体の形成につながる免疫応答に関与するポリペプチドの表面上のエピトープ(複数可)を遮断するということである。別の理論または少なくとも部分的な因子は、コンジュゲートが重いほど、得られる免疫応答はより低減されるということである。

通常、本明細書において提供されたPEG化PH20ポリペプチドを作製するために、PEG部分は、共有結合によってポリペプチドにコンジュゲートされる。ペグ化のための技術として、それだけには限らないが、特殊化されたリンカーおよびカップリング化学(例えば、Roberts、Adv.Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002)、複数のPEG部分の単一コンジュゲーション部位との結合(分岐PEGの使用などによる;例えば、Guiotto et al.、Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180、2002)、部位特異的ペグ化および/またはモノペグ化(例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999)および部位指定酵素的ペグ化(例えば、Sato, Adv.Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照のこと)が挙げられる。当技術分野で記載される方法および技術は、単一タンパク質分子と結合している1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10を超えるPEGまたはPEG誘導体を有するタンパク質を産生し得る(例えば、U.S.2006/0104968を参照のこと)。

PEG化PH20ポリペプチドを作製するための代表的な例示的方法として、PEGアルデヒド、スクシンイミドおよびカルボネートは、各々、PEG部分、通常、スクシンイミジルPEGをrHuPH20とコンジュゲートするために適用されている。例えば、rHuPH20は、mPEG−スクシンイミジルプロピオネート(mPEG−SPA)、mPEG−スクシンイミジルブタノエート(mPEG−SBA)および(「分岐」PEGを結合するための)mPEG2−N−ヒドロキシルスクシンイミドを含めた例示的スクシンイミジルモノPEG(mPEG)試薬を用いてコンジュゲートされている。これらのPEG化スクシンイミジルエステルは、PEG基と活性化されるクロスリンカーの間に種々の長さの炭素骨格、単一または分岐PEG基のいずれかを含有する。これらの相違は、例えば、異なる反応速度論を提供するために、コンジュゲーションプロセスの間にrHuPH20とのPEG結合に利用可能な部位を潜在的に制限するために使用され得る。

直鎖または分岐PEGのいずれかを含有するスクシンイミジルPEG(上記のとおり)は、PH20にコンジュゲートされ得る。PEGは、平均して、ヒアルロニダーゼあたり約3〜6または3〜6のPEG分子を有する分子を含有するPH20を再現性よく作製するために使用され得る。このようなPEG化rHuPH20組成物は、容易に精製され得、およそ25,000または30,000単位/タンパク質1mgの比活性のヒアルロニダーゼ活性を有し、非PEG化PH20を実質的に含まない(5%未満の非PEG化)組成物をもたらす。

種々のPEG試薬を使用して、例えば、mPEG−SBA(30kD)、mPEG−SMB(30kD)を使用して、PEG化PH20ポリペプチドの例示的なものならびにmPEG2−NHS(40kD)およびmPEG2−NHS(60kD)に基づいて分岐したものが調製され得る。PH20のPEG化されたものは、NHS化学ならびにカルボネートおよびアルデヒドを使用して、以下の試薬:mPEG2−NHS−40K分岐、mPEG−NHS−10K分岐、mPEG−NHS−20K分岐、mPEG2−NHS−60K分岐;mPEG−SBA−5K、mPEG−SBA−20K、mPEG−SBA−30K;mPEG−SMB−20K、mPEG−SMB−30K;mPEG−ブチルアルデヒド(butyrldehyde);mPEG−SPA−20K、mPEG−SPA−30K;およびPEG−NHS−5K−ビオチンの各々を使用して作製され得る。Dowpharmaのp−ニトロフェニル−カルボネートPEG(30kDa)を用い、プロピオンアルデヒドPEG(30kDa)を用いてPEG化されたPH20ポリペプチドを含め、PEG化PH20はまた、Dow Chemical Corporationの一部門であるDowpharmaから入手可能なPEG試薬を使用して調製され得る。

一例では、ペグ化は、mPEG−SBA、例えば、mPEG−SBA−30K(約30kDaの分子量を有する)またはPEGブタン酸誘導体の別のスクシンイミジルエステルの、PH20ポリペプチドとのコンジュゲーションを含む。PEGブタン酸誘導体、例えば、mPEG−SBA−30Kのスクシンイミジルエステルは、タンパク質のアミノ基と容易にカップリングする。例えば、m−PEG−SBA−30KおよびrHuPH20の共有結合コンジュゲーション(およそ60KDaの大きさである)は、以下のスキーム1に示されるようにrHuPH20およびmPEGの間に安定なアミド結合を提供する。

通常、mPEG−SBA−30Kまたはその他のPEGは、適したバッファー、例えば、滅菌法、例えば、滅菌濾過を続けた、pH6.8の130mM NaCl/10mM HEPESまたは70mMリン酸バッファー、pH7中、10:1のPEG:ポリペプチドモル比でPH20ポリペプチドに付加され、例えば、低温室中4℃で、撹拌しながら、一晩コンジュゲーションを継続した。一例では、コンジュゲートされたPEG−PH20は、濃縮され、バッファー交換される。

PEGブタン酸誘導体のスクシンイミジル、例えば、mPEG−SBA−30Kをカップリングするその他の方法は、当技術分野で公知である(例えば、U.S.5,672,662;U.S.6,737,505;およびU.S.2004/0235734)。例えば、PH20ポリペプチドなどのポリペプチドは、4℃で1時間のホウ酸バッファー(0.1M、pH8.0)中の反応によってNHS活性化PEG誘導体とカップリングされ得る。得られたPEG化タンパク質は、限外濾過によって精製され得る。別の方法は、脱イオン水中でポリペプチドをmPEG−SBAと反応させ、それに、pHを7.2〜9に高めるためにトリエチルアミンが添加される。得られた混合物を、室温で数時間撹拌し、ペグ化を完了する。

例えば、動物由来ヒアルロニダーゼおよび細菌ヒアルロナン分解酵素を含めたPH20ポリペプチドをペグ化する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ウシ精巣ヒアルロニダーゼ(hyaluorindase)およびコンドロイチンABCリアーゼのペグ化を記載する欧州特許番号EP0400472を参照のこと。また、米国公開第2006014968号には、ヒトPH20に由来するヒトヒアルロニダーゼのペグ化が記載されている。例えば、PEG化ヒアルロナン分解酵素は、一般に、分子あたり少なくとも3つのPEG部分を含有する。いくつかの例では、PH20ポリペプチドは、3〜6つのPEG分子を含有する。その他の例では、酵素は、5:1から9:1の間、例えば、7:1のPEG対タンパク質分子比を有し得る。

F.医薬組成物および製剤、投与量および投与
修飾PH20ポリペプチドのいずれかの医薬組成物が、投与のために本明細書において提供される。医薬上許容される組成物は、動物において、およびヒトにおいて一般に認識される薬局方に一致して準備された、規制当局およびその他の機関の承認を考慮して調製される。一般に、化合物は、当技術分野で周知の技術および手順を使用して医薬組成物に製剤される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと)。

特に、液体製剤として、両端を含めて、2℃〜8℃もしくは約2℃〜8℃の温度で、少なくとも1カ月間または両端を含めて、30℃〜42℃もしくは約30℃〜42℃の温度で少なくとも3日間という長期間安定である医薬組成物が本明細書において提供される。特定の液体製剤中の医薬組成物は、保存条件(保存時間または保存の長さ、温度および/または撹拌)および/または組成物中に含有される製剤成分の効果に対して感受性であり得る活性薬剤の安定性によって制限され得る。したがって、安定な医薬組成物は、一般に、1種または複数種のタンパク質変性条件に対する増大した耐性として表れる、増大した安定性を示す、節C.1.bに記載される修飾PH20ポリペプチドを含有する。このようなタンパク質変性条件として、それだけには限らないが、30℃を超える、30℃に等しい、または約30℃の高温、撹拌、低塩または無塩および賦形剤の存在を挙げることができる。増大した安定性は、活性薬剤(複数可)、例えば、PH20ヒアルロニダーゼの活性を依然として保持しながらの、改善された保存時間、減少した断片化および/または減少した凝集体形成を特徴とする。このような製剤は、さらなる再構築を伴わないおよび/またはさらなる希釈のための任意の必要条件を伴わない「使用準備済み」液体製剤として提供され得る。いくつかの例では、製剤はまた、凍結乾燥形態または濃縮形態で調製され得る。

修飾PH20ポリペプチドを含有する医薬組成物は、別の治療薬と同時投与されてもよい。このような例では、修飾PH20ポリペプチドは、医薬組成物として別個に製剤され、活性治療薬を含有する第2の組成物の前に、それと同時に、それと断続的にまたはその後に投与され得る。その他の例では、修飾PH20ポリペプチドは、その他の治療薬の医薬製剤と共製剤され得る。

特に、本明細書において記載されたような修飾PH20ポリペプチドと化学療法薬、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬および抗関節炎薬、抗真菌剤、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫剤、抗ヒスタミン剤、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔剤、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管治療薬、避妊薬、鬱血除去薬、利尿薬、降下薬、診断薬、電解質剤、催眠薬、ホルモン剤、高血糖薬、筋弛緩薬、筋肉収縮薬、眼部薬、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、交感神経作用薬、トランキライザー薬、泌尿器薬、膣薬、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ポリペプチド、タンパク質、核酸、薬物、有機分子または睡眠誘導物質である治療薬とを含有する共製剤が本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、モノクローナル抗体、免疫グロブリン、抗生物質、ビスホスホネート、サイトカイン、化学療法薬、血液凝固因子またはインスリンなどの抗体と共製剤され得る。修飾PH20ポリペプチドと共製剤され得る例示的治療薬が、節Hに記載されている。特に、修飾PH20ポリペプチドおよび速効型(fast−acting)インスリン、例えば、レギュラーインスリンまたは速効型(rapid−acting)インスリン類似体などのインスリンを含有する共製剤が、本明細書において提供される。本明細書において提供される共製剤として、活性薬剤、すなわち、修飾PH20ポリペプチドおよび治療薬が、本明細書において記載されたように増大した安定性を示し、活性を長期間保持する安定な共製剤が挙げられる。

別個の製剤を含めた本明細書において提供されたPH20を含有する製剤および共製剤は、変動する温度で、また撹拌などの変動する保存または使用条件下でを含めて、長期間安定である。例えば、本明細書において提供された製剤は、安定であり、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の活性を、「冷蔵庫」条件、例えば、2℃〜8℃、例えば、4℃または約4℃で、少なくとも少なくとも2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、少なくとも8カ月、少なくとも9カ月、少なくとも10カ月、少なくとも11カ月、少なくとも12カ月、13カ月、14カ月、15カ月、16カ月、17カ月、18カ月、19カ月、20カ月、21カ月、22カ月、23カ月、24カ月、25カ月、26カ月、27カ月、28カ月、29カ月または30カ月またはそれ以上保持する。別の例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の活性を、室温で、例えば、18℃〜32℃、一般に、20℃〜32℃、例えば、28℃〜32℃で、少なくとも2週間〜1年、例えば、少なくとも3週間、4週間、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、少なくとも7カ月、少なくとも8カ月、少なくとも9カ月または少なくとも1年またはそれ以上の間保持する。さらなる例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の活性を、約30℃または30℃を超える、一般に、30℃〜42℃または約30℃〜42℃、例えば、32℃〜37℃または35℃〜37℃または約37℃もしくは37℃の高温下で、少なくとも4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、35日、40日、45日、50日、60日間またはそれ以上保持する。

組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤および持続放出製剤の形態をとり得る。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐剤として製剤されてもよい。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体およびその他のこのような薬剤を含み得る。局所製剤もまた考慮される。製剤は、投与様式に適合しなくてはならない。

1.製剤−液体、注射用、エマルジョン
製剤は、一般に、投与経路に適合するよう製造される。一般に、皮下に、筋肉内に、静脈内にまたは皮内にのいずれかでの注射または注入を特徴とする非経口投与が、本明細書において考慮される。非経口投与用調製物として、注射準備のできた滅菌溶液、滅菌乾燥可溶性製剤、例えば、皮下錠剤を含めた使用の直前に溶媒とあわせられる準備のできた凍結乾燥した散剤、注射準備のできた滅菌懸濁液、使用の直前に媒体とあわせられる準備のできた滅菌乾燥不溶性製剤および滅菌エマルジョンを含めたが挙げられる。注射用物質は、液体溶液または懸濁液のいずれか、注射に先立って液体での溶液または懸濁液に適した固体形態として、またはエマルジョンとして従来の形態に調製され得る。例えば、別の治療薬と別個に製剤された、または共製剤された修飾PH20ポリペプチドを含有する組成物は、溶液、シロップまたは懸濁液として液体形態の医薬品として提供され得る。液体形態では、医薬品は、使用前に治療上有効な濃度に希釈される濃縮調製物として提供され得る。一般に、調製物は、使用前に希釈を必要としない剤形で提供される。別の例では、医薬品は、使用前に水またはその他の適した媒体で再構成するための凍結乾燥形態で提示され得る。

注射用物質は、局所および全身投与のために設計される。本明細書における目的上、罹患した間質への直接投与のために局所投与が望まれる。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。静脈内に投与される場合には、適した担体として、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)およびグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。

医薬上活性な化合物の濃度は、注射または注入が、所望の薬理効果をもたらすのに有効な量を提供するよう調整される。当技術分野で公知であるように、正確な用量は、患者または動物の年齢、体重および状態に応じて変わる。単位用量非経口調製物は、例えば、アンプル、カートリッジ、バイアルまたはニードルを有するシリンジ中にパッケージングされ得る。医薬上活性な化合物を含有する液体溶液または再構成された散剤調製物の容量は、治療される疾患およびパッケージングのために選択される特定の製造品の関数である。非経口投与用のすべての調製物は、当技術分野で公知であり、実施されるように、無菌でなくてはならない。このような非経口組成物中に含有される活性化合物のパーセンテージは、その特定の性質ならびに化合物の活性および対象の必要性に高度に依存している。

医薬組成物は、担体またはその他の賦形剤を含み得る。例えば、本明細書において提供された医薬組成物は、希釈剤(複数可)、アジュバント(複数可)、抗付着剤(複数可)、結合剤(複数可)、コーティング(複数可)、増量剤(複数可)、香料(複数可)、色(複数可)、滑沢剤(複数可)、流動促進剤(複数可)、防腐剤(複数可)、洗浄剤(複数可)、吸着剤(複数可)または甘味料(複数可)およびそれらの組合せまたは修飾PH20ポリペプチドがともに投与される媒体のうち任意の1種または複数を含有し得る。例えば、非経口調製物において使用される医薬上許容される担体または賦形剤として、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、バッファー、抗酸化薬、局所麻酔、懸濁剤および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート化剤およびその他の医薬上許容される物質が挙げられる。液体調製物を含めた製剤は、医薬上許容される添加剤または賦形剤を用いて従来手段によって調製され得る。

適した医薬品担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、治療上有効な量の化合物を、一般に精製形態で、患者への適切な投与のための形態を提供するよう適した量の担体と一緒に含有する。このような医薬品担体は、滅菌液体、例えば、水または石油、動物、植物もしくは合成起源のもの、例えば、ピーナッツオイル、大豆オイル、鉱物油およびゴマ油を含めたオイルであり得る。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合の通常の担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に、注射用溶液のための液体担体として使用され得る。水性媒体の例として、塩化ナトリウム注射溶液、Ringers注射溶液、等張性デキストロース注射溶液、滅菌水注射溶液、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射溶液が挙げられる。非水性非経口媒体として、植物起源の硬化油、綿実油、コーンオイル、ゴマ油およびピーナッツオイルが挙げられる。懸濁剤および分散剤として、それだけには限らないが、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤として、それだけには限らないが、レシチンまたはアラビアガムが挙げられる。洗浄剤として、それだけには限らないが、ポリソルベート80(TWEEN 80)が挙げられる。非水性媒体として、それだけには限らないが、アーモンドオイル、油性エステルまたは精留植物油が挙げられる。抗菌剤または防腐剤として、それだけには限らないが、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸、m−クレゾール、フェノールが挙げられる。希釈液として、それだけには限らないが、ラクトース、スクロース、二リン酸カルシウムまたはカルボキシメチルセルロースが挙げられる。滑沢剤として、それだけには限らないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはタルクが挙げられる。結合剤として、それだけには限らないが、デンプン、アラビアガムなどの中性ゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に公知のその他のこのような結合剤が挙げられる。等張剤として、それだけには限らないが、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。バッファーとして、それだけには限らないが、リン酸塩およびクエン酸塩が挙げられる。抗酸化薬として、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔として、塩酸プロカインが挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート化剤として、EDTAがあげられる。その他の適した医薬品賦形剤として、それだけには限らないが、デンプン、グルコース、ラクトース、デキストロース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、生理食塩水、水およびエタノールが挙げられる。医薬品担体としてまた、水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールおよびpH調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸が挙げられる。組成物はまた、必要に応じて、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、安定化剤、溶解度エンハンサーおよび例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなどのその他のこのような薬剤を含有し得る。

特に、静菌性または静真菌性濃度(例えば、抗菌有効量)の抗菌剤(例えば、防腐剤)が、複数回用量容器中にパッケージングされた非経口調製物に添加され得、これとして、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルp−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。

別個に製剤された、または共製剤された本明細書において提供されたPH20含有製剤を含めた製剤の容量は、その中に提供される容器に適した任意の容量であり得る。いくつかの例では、製剤は、バイアル、シリンジ、ペン、ポンプのリザーバーまたは閉ループ系中で提供される。例えば、本明細書において提供される製剤は、0.1mL〜500mLの間または約0.1mL〜500mLの間、例えば、0.1mL〜100mL、1mL〜100mL、0.1mL〜50mL、例えば、少なくとも0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mLもしくはそれ以上、またはおよそ少なくとも0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mLもしくはそれ以上または約0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mLもしくはそれ以上または0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mLもしくはそれ以上である。

a.凍結乾燥散剤
溶液、エマルジョンおよびその他の混合物として投与のために再構成され得る凍結乾燥散剤が、本明細書において注目される。それらはまた、固体またはゲルとして再構成および製剤され得る。

滅菌、凍結乾燥散剤は、バッファー溶液に酵素の化合物を溶解することによって調製される。バッファー溶液は、散剤または散剤から調製された再構成された溶液の安定性またはその他の薬理成分を改善する賦形剤を含有し得る。溶液のその後の滅菌濾過と、それに続く、当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥によって、所望の製剤が提供される。本明細書において上記に記載されたような液体製剤は、調製され得る。得られた混合物は、粒子を除去し、無菌性を保証するよう滅菌濾過または処理され、凍結乾燥のためのバイアル中に配分される。例えば、凍結乾燥散剤は、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の適した薬剤などの賦形剤を、クエン酸、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムまたは当業者に公知のその他のこのようなバッファーなどの適したバッファーに溶解することによって調製され得る。次いで、選択された酵素が得られた混合物に添加され、溶解するまで撹拌される。

各バイアルは、化合物の単回投与量または複数回投与量を含有するよう製造される。凍結乾燥散剤は、約4℃〜室温などの適当な条件下で保存され得る。この凍結乾燥散剤の、適当なバッファー溶液での再構成は、非経口投与において使用するための製剤を提供する。

b.例示的製剤
PH20の単回用量製剤は、当技術分野で公知である。例えば、Hylenex(登録商標)組換え体(ヒアルロニダーゼヒト注射溶液)は、mLあたり、8.5mg NaCl(145mM)、1.4mg二塩基性リン酸ナトリウム(9.9mM)、1.0mgヒトアルブミン、0.9mgエデト酸二ナトリウム(2.4mM)、0.3mg CaCl2(2.7mM)および7.4にpHを調整するためのNaOHを含有する。米国特許公開第2011/0053247号に記載されるrHuPH20製剤などのヒト可溶性ヒアルロニダーゼのその他の製剤は、130mM NaCl、10mM Hepes、pH7.0;または10mMヒスチジン、130mM NaCl、pH6.0を含む。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのいずれかは同様に製剤され得る。

治療上有効な量の修飾PH20ポリペプチドおよび/またはその他の治療薬に加えて、別個に製剤された、または共製剤されたPH20含有製剤を含めた本明細書において提供された例示的医薬組成物は、一定濃度のNaClを含有し得、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼおよび/またはその他の共製剤された治療薬)の安定性を維持するのに必要なpHで調製される。複数回用量製剤および長期間保存されるその他の製剤については、組成物はまた、一般に、1種または複数種の防腐剤を含有する。さらなる分解防止剤およびその他の賦形剤もまた含まれ得る。例示的成分は以下に記載される。

i.塩(例えば、NaCl)
本明細書における例では、本明細書において提供された医薬組成物は、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の安定性を維持するために一定濃度の塩化ナトリウム(NaCl)などの塩を含有する。NaClなどの塩は、一般に、PH20安定性および活性を保持するために必要である。一般に、120mM未満の低塩濃度は、PH20活性に対して有害な効果を経時的に、また温度条件に応じて有し得る。したがって、塩(例えば、NaCl)がないことまたは低濃度の塩(例えば、NaCl)は、タンパク質の不安定性をもたらし得る。しかし、本明細書におけるいくつかの例では、低塩または無塩、例えば、低NaClまたはNaClがないことの不在下で増大した安定性を示す(例えば、節C.1.b.iiiを参照のこと)修飾PH20ポリペプチドは、変性に対して感受性ではない。また、塩(例えば、NaCl)の存在は、その他の治療薬に対して異なる効果を有し得る。例えば、インスリンおよびインスリン類似体の溶解度は、塩濃度が低いほど増大する傾向があり(例えば、<140mM)、高塩濃度は、特に、低温でインスリンの結晶化/凝集をもたらし得る(例えば、米国仮出願第61/520,962号;米国出願番号第13/507,263号および同13/507,262号;および国際PCT出願番号PCT/US2012/042816を参照のこと)。したがって、本明細書において提供された医薬組成物は、活性薬剤(複数可)の必要条件に一致して調製される。製剤中の、種々の保存条件下での活性薬剤(複数可)の安定性を評価することは、当業者のレベル内にある(例えば、節G参照のこと)。本明細書における特定の例では、別個に製剤された、または共製剤された本明細書において提供されたPH20含有製剤を含めた医薬組成物は、10mM〜200mM、例えば、10mM〜50mM、50mM〜200mM、50mM〜120mM、50mM〜100mM、50mM〜90mM、120mM〜160mM、130mM〜150mM、 80mM〜140mM、80mM〜120mM、80mM〜100mM、80mM〜160mM、100mM〜140mM、120mM〜120mMもしくは140mM〜180mMの間または約10mM〜200mM、例えば、10mM〜50mM、50mM〜200mM、50mM〜120mM、50mM〜100mM、50mM〜90mM、120mM〜160mM、130mM〜150mM、 80mM〜140mM、80mM〜120mM、80mM〜100mM、80mM〜160mM、100mM〜140mM、120mM〜120mMもしくは140mM〜180mMの間の濃度のNaClを含有する。

ii.pHおよびバッファー
本明細書における例では、本明細書において提供される医薬組成物は、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の安定性を維持するためのpHで調製される。例えば、本明細書において提供された医薬組成物は、6.5〜7.8の間または約6.5〜7.8の間、例えば、6.5〜7.2、7.0〜7.8、7.0〜7.6もしくは7.2〜7.4の間または約6.5〜7.2、7.0〜7.8、7.0〜7.6もしくは7.2〜7.4の間のpHで調製される。本明細書におけるpHへの言及は、室温でのpHの測定に基づいている。pHは、保存の間、経時的に変更し得るが、通常、6.5〜7.8の間または約6.5〜7.8の間を保持する。例えば、pHは、±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5またはそれ以上変わり得るということは理解される。本明細書において提供される例示的共製剤は、調製される際に、約7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2もしくは7.6±0.2のpHまたは約7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2もしくは7.6±0.2を有する。必要に応じて、pHは、pHを低下させる酸性化剤またはpHを高めるアルカリ化剤を使用して調整され得る。例示的酸性化剤として、それだけには限らないが、酢酸、クエン酸、硫酸、塩酸、リン酸二水素ナトリウム溶液およびリン酸が挙げられる。例示的アルカリ化剤として、それだけには限らないが、リン酸水素ナトリウム溶液、炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムが挙げられる。

組成物は、一般に、pH範囲を維持する緩衝剤を使用して調製される。任意のバッファーが、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の安定性に悪影響を及ぼさず、必要とされる必要なpH範囲を支持する限り、本明細書において提供される製剤中で使用され得る。特に適したバッファーの例として、Tris、コハク酸、酢酸、リン酸バッファー、クエン酸、アコニット酸、リンゴ酸およびカルボン酸が挙げられる。しかし、当業者ならば、本明細書において提供された製剤は、バッファーが、許容可能な程度のpH安定性または示される範囲において「緩衝能」を提供する限り、特定のバッファーに制限されないことを認識するであろう。一般に、バッファーは、そのpKの約1pH単位内の適切な緩衝能を有する(Lachman et al. In: The Theory and Practice of Industrial Pharmacy 3rd Edn. (Lachman, L., Lieberman, HA. and Kanig, J.L., Eds.),Lea and Febiger, Philadelphia, p. 458-460, 1986)。バッファー適合性は、公開されたpK表に基づいて推定され得るか、または当技術分野で周知の方法によって経験的に決定され得る。溶液のpHは、例えば、任意の許容される酸または塩基を使用して上記のような範囲内の所望のエンドポイントに調整され得る。

本明細書において提供された共製剤中に含まれ得るバッファーとして、それだけには限らないが、Tris(トロメタミン)、ヒスチジン、リン酸バッファー、例えば、リン酸水素ナトリウムおよびクエン酸バッファーが挙げられる。このような緩衝剤として、1mM〜100mMの間または約1mM〜100mMの間、例えば、10mM〜50mMまたは20mM〜40mM、例えば、30nMまたは約30mMの濃度で共製剤中に存在し得る。例えば、このような緩衝剤は、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mMもしくはそれ以上のまたは約1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mMもしくはそれ以上の濃度で共製剤中に存在し得る。

iii.防腐剤(複数可)
本明細書における例では、複数回用量製剤または長期間保存された製剤は、抗菌的に有効な量の防腐剤または防腐剤の混合物を、静菌性または静真菌性効果を有するための量で含有する。特定の例では、防腐剤は、EPの抗菌の必要条件(EPA)および望ましいEP抗菌の必要条件(EPB)(表4を参照のこと)を含めた、例えば、米国薬局方(USP)および欧州薬局方(EP)の抗菌の必要条件を提供するのに十分な濃度で存在する。防腐剤、特に、フェノール系防腐剤の存在は、PH20の安定性に対して有害な効果を有し得るので、このような製剤は、通常、本明細書において節C.1.b.iに記載される任意のものなどの防腐剤の存在下で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチドを含有する。一般に、量は、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の安定性を維持する。

防腐剤の抗菌上有効な量とは、抗菌防腐剤有効性試験(APET)において評価されるように、組成物のサンプル中の微生物を死滅させるか、またはその増殖を阻害することによって抗菌活性を示す量である。当業者ならば、抗菌防腐剤有効性試験および最小必要条件を満たすためにUSPおよびEPAまたはEPBの下で、満たされるべき標準に精通している。一般に、抗菌防腐剤有効性試験は、適した微生物、すなわち、細菌、酵母および真菌の規定の播種を用いて組成物に負荷すること、播種された調製物を規定の温度で保存すること、指定の時間間隔でサンプルをとることおよびサンプル中の生物をカウントすること含む(Sutton and Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutica Science and Technology 56(4):300-311; The United States Pharmacopeial Convention, Inc., (effective January 1,2002),The United States Pharmacopeia 25th Revision, Rockville, MD, Chapter <51> Antimicrobial Effectiveness Testing;およびEuropean Pharmacopoeia, Chapter 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservationを参照のこと)。負荷に使用される微生物は、一般に、3種の細菌株、すなわち、大腸菌(ATCC番号8739)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC番号9027)および黄色ブドウ球菌(staphylococcus aureus)(ATCC番号6538)、酵母(カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)ATCC番号10231)および真菌(クロコウジカビ(Aspergillus niger)ATCC番号16404)を含み、そのすべてが、播種された組成物が、組成物1mLあたり105または106コロニー形成単位(cfu)の微生物を含有するよう添加される。組成物の防腐剤特性は、試験の条件下で、播種された組成物中の微生物の数において表3において特定されるように、一定時間後に、規定の温度で相当な低下があるか、または増加がない場合に適当であると考えられる。評価の判定基準は、最初のサンプルまたは過去の時と比較された、生存微生物の数のlog低下の点で示される。

本明細書において提供される共製剤中に含まれ得る防腐剤の限定されない例として、それだけには限らないが、フェノール、メタ−クレゾール(m−クレゾール)、メチルパラベン、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、4−クロロ−1−ブタノール、クロルヘキシジンジヒドロクロリド、クロルヘキシジンジグルコネート、L−フェニルアラニン、EDTA、ブロノポール(2−ブロモ−2−ニトロプロパン−1,3−ジオール)、酢酸フェニル水銀、グリセロール(グリセリン)、イミドウレア(imidurea)、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、オルト−クレゾール(o−クレゾール)、パラ−クレゾール(p−クレゾール)、クロロクレゾール、セトリミド、塩化ベンゼトニウム、エチルパラベン、プロピルパラベンまたはブチルパラベンおよびそれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、本明細書において提供される製剤は、単一防腐剤を含有し得る。その他の例では、製剤は、少なくとも2種の異なる防腐剤または少なくとも3種の異なる防腐剤を含有する。例えば、本明細書において提供された製剤は、L−フェニルアラニンおよびm−クレゾール、L−フェニルアラニンおよびメチルパラベン、L−フェニルアラニンおよびフェノール、m−クレゾールおよびメチルパラベン、フェノールおよびメチルパラベン、m−クレゾールおよびフェノールまたはその他の同様の組合せなどの2種の防腐剤を含有し得る。一例では、製剤中の防腐剤は、少なくとも1種のフェノール系防腐剤を含有する。例えば、製剤は、フェノール、m−クレゾールまたはフェノールおよびm−クレゾールを含有する。

本明細書において提供された製剤では、製剤中の質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)としての1種または複数種の防腐剤の総量は、例えば、0.1%〜0.4%、例えば、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%の間または約0.1%〜0.4%、例えば、0.1%〜0.3%、0.15%〜0.325%、0.15%〜0.25%、0.1%〜0.2%、0.2%〜0.3%もしくは0.3%〜0.4%の間であり得る。一般に、製剤は、0.4%(w/v)未満の防腐剤を含有する。例えば、本明細書において提供される共製剤は、少なくとも0.1%、0.12%、0.125%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16% 0.17%、0.175%、0.18%、0.19%、0.2%、0.25%、0.3%、0.325%、0.35%またはおよそ少なくとも0.1%、0.12%、0.125%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16% 0.17%、0.175%、0.18%、0.19%、0.2%、0.25%、0.3%、0.325%、0.35%であるが、0.4%未満である総防腐剤を含有する。

いくつかの例では、本明細書において提供される製剤は、0.1%〜0.25%の間または約0.1%〜0.25%の間のフェノールおよび0.05%〜0.2%の間または約0.05%〜0.2%の間のm−クレゾール、例えば、0.10%〜0.2%の間または約0.10%〜0.2%の間のフェノールおよび0.06%〜0.18%の間または約0.06%〜0.18%の間のm−クレゾールまたは0.1%〜0.15%の間または約0.1%〜0.15%のフェノールおよび0.08%〜0.15%の間または約0.08%〜0.15%の間のm−クレゾールを含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、0.1%のフェノールおよび0.075%のm−クレゾール;0.1%のフェノールおよび0.15%のm−クレゾール;0.125%のフェノールおよび0.075%のm−クレゾール;0.13%のフェノールおよび0.075%のm−クレゾール;0.13%のフェノールおよび0.08%のm−クレゾール;0.15%のフェノールおよび0.175%のm−クレゾール;または0.17%のフェノールおよび0.13%のm−クレゾールを含有するか、またはおよそ0.1%のフェノールおよび0.075%のm−クレゾール;0.1%のフェノールおよび0.15%のm−クレゾール;0.125%のフェノールおよび0.075%のm−クレゾール;0.13%のフェノールおよび0.075%のm−クレゾール;0.13%のフェノールおよび0.08%のm−クレゾール;0.15%のフェノールおよび0.175%のm−クレゾール;または0.17%のフェノールおよび0.13%のm−クレゾールを含有する。

iv.安定化剤
本明細書における例では、本明細書において提供される医薬組成物は、適宜、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の安定性を維持するために、1種または複数種のその他の分解防止剤を含有し得る。本明細書において提供される製剤中に含有され得る安定化剤の種類の中に、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩およびバッファー、界面活性物質およびその他の薬剤が含まれる。本明細書において提供される製剤は、少なくとも1種の安定剤を含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、少なくとも1、2、3、4、5、6種またはそれ以上の安定化剤を含有する。したがって、任意の1種または複数種のアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩およびバッファー、界面活性物質およびその他の薬剤が、本明細書において製剤中に含まれ得る。一般に、本明細書における製剤は、少なくとも界面活性物質および適当なバッファーを含有する。適宜、本明細書において提供される製剤は、その他のさらなる安定化剤を含有し得る。その他の成分として、例えば、1種または複数種の張力モディファイヤー、1種または複数種の抗酸化剤またはその他の安定剤が挙げられる。

例示的アミノ酸安定化剤、アミノ酸誘導体またはアミンとして、それだけには限らないが、L−アルギニン、グルタミン、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、Lys−Lys、Gly−Gly、Triメチルアミンオキシド(TMAO)またはベタインが挙げられる。例示的糖およびポリオールとして、それだけには限らないが、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、スクロースまたはトレハロースが挙げられる。例示的塩およびバッファーとして、それだけには限らないが、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、Tris(100mM)などのTrisまたは安息香酸ナトリウムが挙げられる。例示的界面活性物質として、それだけには限らないが、ポロキサマー188(例えば、Pluronic(登録商標)F68)、ポリソルベート80(PS80)、ポリソルベート20(PS20)が挙げられる。その他の安定化剤として、それだけには限らないが、ヒアルロン酸(HA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、フェニル酪酸、タウロコール酸、ポリビニルピロリドン(PVP)または亜鉛が挙げられる。

本明細書において特定の例では、製剤は、活性薬剤(複数可)(例えば、PH20ヒアルロニダーゼ)の安定性を維持するために、1種または複数種の、界面活性物質などの洗浄剤を含有する。例えば、界面活性物質は、PH20の凝集を阻害し、吸収性喪失を最小化し得る。界面活性物質は、一般に、非イオン性界面活性物質である。本明細書において製剤中に含まれ得る界面活性物質として、それだけには限らないが、グリセロールまたはソルビトールなどの多価アルコールの部分および脂肪酸エステルおよびエーテル、ポロキサマーおよびポリソルベートが挙げられる。例えば、本明細書において製剤中の例示的界面活性物質として、ポロキサマー188(PLURONIC(登録商標)F68などのPLURONICS(登録商標))、TETRONICS(登録商標)、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG400、PEG3000、Tween(登録商標)(例えば、Tween(登録商標)20またはTween(登録商標)80)、Triton(登録商標)X−100、SPAN(登録商標)、MYRJ(登録商標)、BRIJ(登録商標)、CREMOPHOR(登録商標)、ポリプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのうち任意の1種または複数が挙げられる。いくつかの例では、本明細書における製剤は、ポロキサマー188、ポリソルベート20、ポリソルベート80、一般に、ポロキサマー188(プルロニックF68)を含有する。本明細書において提供される製剤は、一般に、少なくとも1種の界面活性物質、例えば、1、2または3種の界面活性物質を含有する。

本明細書において提供される製剤では、製剤中の質量濃度(w/v)のパーセンテージ(%)としての1種または複数種の界面活性物質の総量は、例えば、0.005%〜1.0%の間または約0.005%〜1.0%の間、例えば、0.005%〜1.0%の間、例えば、0.01%〜0.5%の間または約0.01%〜0.5%の間、例えば、0.01%〜0.1%または0.01%〜0.02%であり得る。一般に、製剤は、少なくとも0.01%の界面活性物質を含有し、1.0%未満、例えば、0.5%未満または0.1%未満の界面活性物質を含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、0.001%、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.055%、0.06%、0.065%、0.07%、0.08%もしくは0.09%または約0.001%、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.055%、0.06%、0.065%、0.07%、0.08%もしくは0.09%の界面活性物質を含有し得る。特定の例では、本明細書において提供された製剤は、0.01%〜0.05%または約0.01%〜約0.05%の界面活性物質を含有する。

所望の浸透圧を有する溶液を製造するために、張力モディファイヤーが、本明細書において提供された製剤中に含まれ得る。本明細書において提供された製剤は、245mOsm/kg〜305mOsm/kgの間または約245mOsm/kg〜305mOsm/kgの間の浸透圧を有する。例えば、浸透圧は、245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、295mOsm/kg、300mOsm/kgもしくは305mOsm/kgまたは約245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、295mOsm/kg、300mOsm/kgもしくは305mOsm/kgである。いくつかの例では、製剤は、275mOsm/kgまたは約275mOsm/kgの浸透圧を有する。張力モディファイヤーとして、それだけには限らないが、グリセリン、NaCl、アミノ酸、ポリアルコール、トレハロースおよびその他の塩および/または糖が挙げられる。酵素活性および/または浸透圧を保持するための特定の量は、経験的に決定され得る。

その他の例では、グリセリン(グリセロール)が、製剤中に含まれる。例えば、本明細書において提供される製剤は、通常、60mM未満のグリセリン、例えば、55mM未満、50mM未満、45mM未満、40mM未満、35mM未満、30mM未満、25mM未満、20mM未満、15mM未満、10mMまたはそれ以下を含有する。グリセリンの量は、通常、存在するNaClの量に応じて変わり:製剤中により多くのNaClが存在するほど、所望の浸透圧または浸透圧を達成するためにより少ないグリセリンが必要である。したがって、例えば、高NaCl濃度を含有する製剤中に、製剤中にグリセリンが含まれる必要がほとんどないか、全くない。対照的に、わずかに低いNaCl濃度を含有する製剤中には、グリセリンが含まれ得る。例えば、本明細書において提供された製剤は、40mM〜60mM、例えば、50mM未満、例えば、20mM〜50mM、例えば、50mMまたは約50mMの濃度のグリセリンを含有し得る。

本明細書において提供された製剤はまた、酸化、特に、PH20ポリペプチドの酸化を低減または防ぐために抗酸化薬を含有し得る。例えば、酸化は、高濃度の界面活性物質またはヒアルロナンオリゴマーによって達成する。例示的酸化物質として、それだけには限らないが、システイン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。特定の例では、抗酸化薬は、メチオニンである。本明細書において提供された製剤は、5mM〜50mMの間または約5mM〜約50mMの間、例えば、5mM〜40mM、5mM〜20mMまたは10mM〜20mMの濃度の抗酸化薬を含み得る。例えば、メチオニンは、5mM〜50mMの間または約5mM〜50mMの間、例えば、5mM〜40mM、5mM〜20mMまたは10mM〜20mMの濃度で本明細書における製剤中に提供され得る。例えば、抗酸化薬、例えば、メチオニンは、5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mMもしくは50mMまたは約5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mMもしくは50mMである濃度で含まれ得る。いくつかの例では、製剤は、10mM〜20mMのメチオニン、例えば、10mMもしくは20mMまたは約10mMもしくは20mMのメチオニンを含有する。

本明細書において提供される製剤はまた、調製物の安定性に寄与するアミノ酸安定剤を含有し得る。安定剤は、非極性または塩基性アミノ酸であり得る。例示的非極性および塩基性アミノ酸として、それだけには限らないが、アラニン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グリシンおよびプロリンが挙げられる。例えば、アミノ酸安定剤は、グリシンまたはプロリン、通常、グリシンである。安定剤は、単一アミノ酸であり得るか、または2個以上のこのようなアミノ酸の組合せであり得る。アミノ酸安定化剤は、天然アミノ酸、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸またはアミノ酸同等物であり得る。一般に、アミノ酸は、L−アミノ酸である。例えば、プロリンが安定剤として使用される場合には、一般に、L−プロリンである。アミノ酸同等物、例えば、プロリン類似体を使用することも可能である。製剤中に含まれるアミノ酸安定剤、例えば、グリシンの濃度は、0.1M〜1Mアミノ酸、通常、0.1M〜0.75M、一般に、0.2M〜0.5M、例えば、少なくとも0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75Mまたはそれ以上のアミノ酸または約0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75Mまたはそれ以上のアミノ酸の範囲である。アミノ酸、例えば、グリシンは、医薬上許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩などの形態で使用され得る。アミノ酸、例えば、グリシンの純度は、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%またはそれ以上でなくてはならない。

本明細書における例では、必要に応じて、PH20を安定化するため、特に、例えば、製剤中に存在する、低塩、高pH、防腐剤の存在および高温などの他の不安定化剤および状態の効果を低減するために、ヒアルロニダーゼ阻害剤が製剤中に含まれる。このような成分は、一般に、このような条件下で増大した安定性を示す本明細書において提供されるような修飾PH20ポリペプチドを含有する医薬組成物には必要ではない。提供される場合には、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、少なくともその平衡濃度で提供される。当業者ならば、種々のクラスのヒアルロニダーゼ阻害剤に精通している(例えば、Girish et al. (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:2261-2288およびそれに引用される参考文献を参照のこと)。当業者ならば、反応物中のヒアルロニダーゼ阻害剤の平衡濃度または本明細書における安定な組成物を承知しており、当技術分野における標準方法によって決定することができる。

本明細書における組成物において使用するための例示的ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロナン(HA)である。ヒアルロン酸(HA、ヒアルロナンおよびヒアルロネートとしても知られる)は、PH20の天然基質である。HAは、結合組織、上皮組織および神経組織中に広く分布している非硫酸化グリコサミノグリカンである。それ自体がD−グルクロン酸およびD−N−アセチルグルコサミンから構成される、最大25,000の二糖単位のポリマーである。HAの分子量は、約5kDa〜200,000kDaの範囲である。任意の大きさHAが、安定剤として組成物中に使用され得る。いくつかの例では、HAは、D−グルクロン酸およびD−N−アセチルグルコサミンから構成される二糖である。その他の例では、HAは、2つの反復する二糖単位を含有する四糖類などのオリゴ糖であるか、あるいは、本明細書において提供される共製剤中に使用されるHAは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30またはそれ以上の二糖単位などの、複数の反復性二糖単位を含有し得る。別の例では、本明細書において提供される製剤中に使用されるHAは、5kDa〜5,000kDaまたは約5kDa〜約5,000kDa;5kDa〜1,000kDaまたは約5kDa〜約1,000kDa;5kDa〜500kDaまたは約5kDa〜約500kDa;または5kDa〜200kDaまたは約5kDa〜約200kDaである分子量を有する。本明細書において製剤中で使用するための例示的HAオリゴ糖は、6.4kDa、74.0kDaもしくは234.4kDaまたは約6.4kDa、74.0kDaもしくは234.4kDaの分子量を有する。製剤は、1mg/mL〜20mg/mL HA、8mg/mL〜12mg/mL、例えば、少なくとも1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mLもしくは20mg/mLまたは約1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mLもしくは20mg/mLもしくはそれ以上のHAを含有し得る。いくつかの例では、HA対PH20のモル比は、100,000:1、95,000:1、90,000:1、85,000:1、80,000:1、75,000:1、70,000:1、65,000:1、60,000:1、55,000:1、50,000:1、45,000:1、40,000:1、35,000:1、30,000:1、25,000:1、20,000:1、15,000:1、10,000:1、5,000:1、1,000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1もしくは100:1または約100,000:1、95,000:1、90,000:1、85,000:1、80,000:1、75,000:1、70,000:1、65,000:1、60,000:1、55,000:1、50,000:1、45,000:1、40,000:1、35,000:1、30,000:1、25,000:1、20,000:1、15,000:1、10,000:1、5,000:1、1,000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1もしくは100:1またはそれ以下である。

いくつかの例では、ニコチン性化合物は、分解防止剤として使用される。ニコチン性化合物として、それだけには限らないが、ニコチンアミド、ニコチン酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、ビタミンB3および/またはその塩および/またはその任意の組合せが挙げられる。特定の適用では、分解防止剤は、ニコチン性化合物アミノ酸(単数または複数)を含み得る(例えば、国際公開番号WO2010149772を参照のこと)。例えば、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン酸および/またはその塩またはそれらの組合せであり得る。

2.その他の投与経路のための組成物
治療される状態に応じて、局所適用、経皮パッチ、経口および直腸投与などのその他の投与経路が本明細書において考慮される。

例えば、直腸投与のための医薬品剤形は、全身効果のための直腸の剤、カプセル剤および錠剤である。直腸の坐剤は、体温で融解または軟化し、1種または複数種の薬理学的にまたは治療上有効な成分を放出する、直腸への挿入のための固形物を含む。直腸坐剤において利用される医薬上許容される物質として、融点を上げるための基剤または媒体および薬剤が挙げられる。基剤の例として、ココアバター(カカオオイル)、グリセリン−ゼラチン、カーボワックス(ポリオキシエチレングリコール)および脂肪酸のモノ−、ジ−、トリグリセリドの適当な混合物が挙げられる。種々の基剤の組合せが使用され得る。坐剤の融点を上げる薬剤として、鯨蝋およびワックスが挙げられる。直腸坐剤は、圧縮法によって、または成形によって調製され得る。直腸坐剤の通常の重量は、約2〜3gmである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、経口投与用の製剤と同一の医薬上許容される物質を使用して、同一の方法によって製造される。直腸投与に適した製剤が、単位用量坐剤として提供され得る。これらは、活性化合物を1種または複数種の従来の固体担体、例えば、ココアバターと混合すること、ついで、得られた混合物を成形することによって調製され得る。

経口投与用には、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);増量剤(例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの医薬上許容される賦形剤を用いて、従来手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。

頬側(舌下)投与に適した製剤として、例えば、香味付けた基剤、普通、スクロースおよびアラビアガムまたはトラガカント中に活性化合物を含有するトローチ剤;およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性の基剤中に化合物を含有する芳香錠が挙げられる。

局所混合物は、局所および全身投与のために記載されるように調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、泡状物質、エアロゾル、洗浄物、スプレー、坐剤、救急絆、皮膚パッチまたは局所投与に適した任意のその他の製剤として製剤される。

本化合物またはその医薬上許容される誘導体は、吸入などによる局所適用用のエアロゾルとして製剤され得る(例えば、炎症性疾患、特に、喘息の治療にとって有用なステロイドのデリバリーのためのエアロゾルを記載する、米国特許第4,044,126号、同4,414,209号および同4,364,923号を参照のこと)。気道へ投与するためのこれらの製剤は、単独またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた、噴霧器用のエアゾールまたは溶液または吹送用の超微粒散剤としての形態であり得る。このような場合には、製剤の粒子は、一般に、50ミクロン未満または10ミクロン未満の直径を有する。

本化合物は、局所(local)または局所(topical)適用用に、例えば、皮膚および粘膜への、例えば、眼中への局所適用用に、また眼中または大槽内または脊髄内適用用に、ゲル、クリームおよびローションの形態で製剤され得る。局所投与は、経皮デリバリーのために、また眼もしくは粘膜への投与のために、または吸入治療のために考慮される。活性化合物の鼻腔溶液は、単独で、またはその他の医薬上許容される賦形剤と組み合わせて、投与され得る。

経皮投与に適した製剤が提供される。それらは、レシピエントの表皮と長期間、密接に接触したままであるよう適応された個別のパッチなど、任意の適した形態で提供され得る。このようなパッチは、活性化合物を、例えば、活性化合物に関して0.1〜0.2Mの濃度の適宜緩衝された水溶液で含有する。経皮投与に適した製剤はまた、イオン導入法(例えば、Tyle, P, Pharmaceutical Research 3(6):318-326 (1986)を参照のこと)によって送達され得、通常、活性化合物の、適宜緩衝された水溶液の形態をとる。

医薬組成物はまた、制御放出製剤および/またはデリバリー装置によって投与され得る(例えば、米国特許第3,536,809号;同3,598,123号;同3,630,200号;同3,845,770号;;同3,916,899号;同4,008,719号;;同4,769,027号;同5,059,595号;同5,073,543号;同5,120,548号;同5,591,767号;同5,639,476号;同5,674,533号および同5,733,566号を参照のこと)。

3.投与量および投与
本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、単回投与量または複数回投与量投与用の医薬組成物として製剤され得る。PH20ポリペプチドは、治療される患者に対して望ましくない副作用の不在下で治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。治療上有効な濃度は、既知インビトロおよびインビボ系においてポリペプチドを試験することによって、例えば、本明細書において提供された、もしくは当技術分野で公知のアッセイを使用することによって経験的に決定され得る(例えば、Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Bouffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D’Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem., 247:242-246を参照のこと;また、例えば、Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207も参照のこと、次いで、ヒトのための投与量についてそれから推定される。

疾患または状態を治療するために投与されるべき修飾PH20の量は、標準臨床技術によって決定され得る。さらに、最適投与量範囲を同定するのに役立つよう、インビトロアッセイおよび動物モデルが使用され得る。経験的に決定され得る正確な投与量は、個々の酵素、投与経路、治療される疾患の種類および疾患の重篤度に応じて異なり得る。

したがって、正確な投与量および治療期間は、治療されている疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して、またはインビボまたはインビトロ試験データからの推定によって経験に決定され得るということは理解される。濃度および投与量の値は、軽減されるべき状態の重篤度によって変わりうるということは留意されたい。任意の特定の対象について、特定の投与計画は、個々の必要性および組成物の投与を投与し、または監督する人の専門家の判断にしたがって経時的に調整されなければならないことおよび示される濃度範囲は、単に例示的なものであって、組成物およびそれを含有する組合せの範囲または使用を制限しようとするものではないということはさらに理解される。組成物は、時間毎、毎日、毎週、毎月、毎年または一度投与され得る。一般に、投与計画は、毒性を制限するよう選択される。毒性または骨髄、肝臓もしくは腎臓もしくはその他の組織機能障害のために療法を終了、中断または投与量を低下させるよう調整する方法および時間を主治医は承知しているということは留意されなくてはならない。逆に、主治医はまた、臨床反応が適切ではない場合に、治療を高レベルに調整する(毒性副作用を防ぎながら)方法および時間も承知している。

通常、修飾PH20酵素の治療上有効な用量は、安定化された溶液または懸濁液または凍結乾燥形中で、10単位(U)〜500,000単位、100単位〜100,000単位、500単位〜50,000単位、1000単位〜10,000単位、5000単位〜7500単位、5000単位〜50,000単位もしくは1,000単位〜10,000単位または約10単位(U)〜500,000単位、100単位〜100,000単位、500単位〜50,000単位、1000単位〜10,000単位、5000単位〜7500単位、5000単位〜50,000単位もしくは1,000単位〜10,000単位、一般に、1,000〜50,000単位である。例えば、PH20ポリペプチドは、少なくとも10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000単位、5,000Uもしくはそれ以上またはおよそ少なくとも10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000単位、5,000Uもしくはそれ以上の用量で投与され得る。製剤は、単位用量形態、例えば、それだけには限らないが、アンプル、シリンジおよび個々にパッケージングされた錠剤またはカプセル剤で提供され得る。

PH20酵素は、単独で、またはその他の薬理学的に有効な薬剤(複数可)または治療薬(複数可)とともに、0.1〜100mL、1〜50mL、10〜50mL、10〜30mL、1〜20mLまたは1〜−10mL、通常、10〜50mLの総容量で投与され得る。通常、PH20含有組成物の注射または注入の容量は、少なくとも0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mLもしくはそれ以上または少なくとも約0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mLもしくはそれ以上である。本明細書において提供される製剤は、修飾PH20ポリペプチドを、30単位/mL〜3000U/mL、300U/mL〜2000U/mLもしくは600U/mL〜2000U/mLもしくは600U/mL〜1000U/mLの間または約30単位/mL〜3000U/mL、300U/mL〜2000U/mLもしくは600U/mL〜2000U/mLもしくは600U/mL〜1000U/mLの間、例えば、少なくとも30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/mL、2000U/mLもしくは3000U/mLまたはおよそ少なくとも30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/mL、2000U/mLもしくは3000U/mLの量で含有する。例えば、本明細書において提供される製剤は、少なくとも100U/mL〜1000U/mL、例えば、少なくとも600U/mLまたはおよそ少なくとも600U/mLまたは約600U/mLまたは600U/mLである量のPH20を含有する。

PH20ポリペプチドは、少なくとも100U/mL、150U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、800U/mLもしくは1000U/mLまたは約100U/mL、150U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、800U/mLもしくは1000U/mLまたは100U/mL、150U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、800U/mLもしくは1000U/mLである量で溶液として提供され得るか、またはより濃縮した形態で、例えば、直接使用するための、または使用前に有効な濃度へ希釈のための、少なくとも2000U/mL、3000単位/mL、4000U/mL、5000U/mL、8000U/mL、10,000U/mLもしくは20,000U/mLまたは約2000U/mL、3000単位/mL、4000U/mL、5000U/mL、8000U/mL、10,000U/mLもしくは20,000U/mLである量で提供され得る。PH20ポリペプチド組成物は、液体または凍結乾燥製剤として提供され得る。

PH20が治療薬共製剤される場合には、投与量は投与される、PH20ポリペプチドの量対治療薬の量の比として提供され得る。例えば、PH20ポリペプチドは、1ヒアルロニダーゼU/治療薬U(1:1)〜50:1またはそれ以上で、例えば、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1もしくはそれ以上で、または約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1もしくはそれ以上で投与され得る。

共製剤および/または安定な製剤を含めた本明細書において提供される製剤は、単回用量投与、複数回用量投与または連続注入投与用に調製され得る。一定レベルの投与量が維持されるような徐放または持続放出システムの移植(例えば、米国特許第3,710,795号を参照のこと)も本明細書において考慮される。

例えば、医薬上治療上活性な化合物およびその誘導体の製剤は、単位剤形または複数回剤形で、ヒトおよび動物への投与のために提供される。例えば、化合物は、適した量の化合物または医薬上許容される誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液または懸濁液、経口溶液または懸濁液またはオイル−水エマルジョンとして製剤され得る。各単位用量は、必要な医薬品担体、媒体または希釈液と関連して、十分な所定の量の治療上活性な化合物(複数可)を含有する。単位用量形態の例として、アンプルおよびシリンジおよび個々にパッケージングされた錠剤またはカプセル剤が挙げられる。単位用量形態は、画分またはその複数で投与され得る。複数回用量形態は、分離された単位用量形態で投与される、単一容器にパッケージングされた複数の同一の単位剤形である。複数回用量形態の例として、バイアル、錠剤またはカプセル剤のボトルまたはピンのボトルまたはガロン瓶が挙げられる。したがって、複数回用量形態は、パッケージングにおいて分離されない複数の単位用量である。一般に、剤形または非毒性担体から構成されるバランスをとって、0.005%〜100%の範囲で有効成分を含有する組成物は、調製され得る。

本明細書において提供される組成物は、通常、皮下経路による投与のために製剤されるが、筋肉内、腹腔内、静脈内の、皮内、病巣内、腹膜内注射、硬膜外、膣内、直腸、局所、耳、経皮投与または任意の投与経路を含めた、当業者に公知の任意の経路など、その他の投与経路が考慮される。このような経路に適した製剤は、当業者には公知である。投与は、治療の部位に応じて局所(lcal)、局所(topical) または全身であり得る。治療を必要とする領域への局所投与は、例えば、それだけには限らないが、手術の際の局所注入、局所適用、例えば、術後の創傷包帯とともに、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または埋込錠によって達成され得る。組成物はまた、その他の生物学的に活性な薬剤とともに逐次、断続的に、または同一組成物中のいずれかで投与され得る。

任意の所与の場合における最も適した経路は、疾患の性質、個々の投与経路に対する対象の耐性、疾患の重篤度および使用される個々の組成物などの種々の因子に応じて変わる。通常、本明細書において提供される組成物は、非経口的に投与される。いくつかの例では、修飾PH20ポリペプチド組成物は、皮膚または組織の間質に到達し、それによって、治療薬のその後のデリバリーのために間質空間を分解するよう投与される。したがって、いくつかの例では、皮下投与法などの皮膚下への直接投与が考慮される。したがって、一例では、局所投与は、シリンジまたはニードルなどの注射装置を含有するその他の製造品などからの注射によって達成され得る。別の例では、局所投与は、注入によって達成され得、これは、ポンプまたはその他の同様の装置の使用によって容易にされ得る。その他の投与様式も考慮される。例えば、PEG化形態などの増大した半減期を有するコンジュゲートしている形態に含まれる修飾PH20ポリペプチドは、静脈内に投与され得る。医薬組成物は、各投与経路にとって適当な剤形に製剤され得る。

投与法は、選択された修飾PH20ポリペプチドの、タンパク質分解ならびに抗原性および免疫原性反応による免疫学的介入などの分解性プロセスへの曝露を低減するために使用され得る。このような方法の例示的なものとして、治療部位での局所投与が挙げられる。治療薬のペグ化は、タンパク質分解に対する耐性を増大し、血漿半減期を増大し、抗原性および免疫原性を低減する。ペグ化法の例は、当技術分野で公知である(例えば、 Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138、1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 140-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995を参照のこと;Caliceti et al. (2003) Adv.Druf Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8Sも参照のこと)。ペグ化はまた、インビボでの核酸分子のデリバリーにおいて使用され得る。例えば、アデノウイルスのペグ化は、安定性および遺伝子導入を増大し得る(例えば、Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51を参照のこと)。

それだけには限らないが、リポソームへのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル剤、化合物を発現できる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスおよびレトロウイルスデリバリー系などの選択されたPH20ポリペプチドをコードする核酸分子のデリバリーなどの種々のその他のデリバリー系が公知であり、選択されたPH20ポリペプチドを投与するために使用され得る。

したがって、特定の実施形態では、リポソームおよび/またはナノ粒子もまた、可溶性PH20ポリペプチドの投与とともに使用され得る。リポソームは、水性培地において分散され、自発的に多重膜同心性二層小胞(multilamellar concentric bilayer vesicles)(多重膜小胞(multilamellar vesicles)(MLV)とも呼ばれる)を形成するリン脂質から形成される。MLVは、一般に、25nm〜4μmの直径を有する。MLVの超音波処理は、200〜500オングストロームの直径を有し、コアに水溶液を含有する小さい単層膜リポソーム(small unilamellar vesicles)(SUV)の形成をもたらす。

リン脂質は、水に分散されると、脂質対水のモル比に応じてリポソーム以外の種々の構造を形成し得る。脂質対水の低い比では、リポソームが形成する。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度および二価カチオンの存在に応じて変わる。リポソームは、イオン性および極性物質に対して低い透過性を示し得るが、高温下では相転移を受け、これはその透過性を著しく変更する。相転移は、ゲル状態としても知られる、ぎっしりと詰まった、正しく並んだ構造から、流体状態としても知られる、緩く詰まった、あまり並んでいない構造への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で起こり、イオン、糖および薬物に対する透過性の増大をもたらす。

リポソームは、種々の機序:細網内皮系の食細胞、例えば、マクロファージおよび好中球によるエンドサイトーシス;非特異的弱疎水性力または静電力による、または細胞表面成分との特異的相互作用による細胞表面への吸着;リポソームの脂質二重層の細胞膜への挿入による細胞膜との融合、細胞質へのリポソーム内容物の同時放出を伴う;リポソーム内容物の何らかの結合を伴わない、細胞膜または細胞内膜へのリポソーム脂質の移動による、逆もまた同様によって細胞と相互作用する。リポソーム製剤を変えることは、どの機序が働くかを変更し得るが、2種以上が同時に働き得る。ナノカプセル剤は、一般に、安定な、再現性のある方法で化合物を封入し得る。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、このような超微細粒子(およそ0.1μmの大きさ)は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されなければならない。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本明細書において使用するために考慮され、このような粒子は、容易に製造され得る。

4.例示的PH20-インスリン共製剤
速効型(rapid acting)(速効型(fast−acting))インスリン類似体および修飾PH20ポリペプチドなどの速効型(fast−acting)インスリンの安定な共製剤が、本明細書において提供される。本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのいずれかが、インスリンとの共製剤、例えば、米国出願番号第13/507,263号または同13/507,262号に、または国際PCT出願番号PCT/US2012/042816に記載される共製剤のいずれか中に含まれ得る。

特に、修飾PH20ポリペプチドは、変性条件下で増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチド、例えば、節C.1.bに示される任意のものである。特に、PH20ポリペプチドは、1種または複数種のフェノール系防腐剤に対して増大した安定性を示す修飾PH20ポリペプチド、例えば、節C.1.b.iに示される任意のものである。例えば、PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して位置204に対応する位置にPでのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7または32〜66のいずれかに関連してF204Pである。その他の例では、PH20ポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸位置に関して位置58に対応する位置にRでのアミノ酸置換を含有する修飾PH20ポリペプチド、例えば、配列番号3、7または32〜66のいずれかに関連してV58Rである。

速効型(fast acting)インスリンは、レギュラーインスリンまたは速効型(rapid acting)(速効型(fast−acting))インスリン類似体であり得る。インスリンは、プロセシングされると、A鎖およびB鎖を含有する51個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。一般に、インスリンは、約21個のアミノ酸のA鎖と、約30個のアミノ酸のB鎖とを含有する。A鎖およびB鎖は、ジスルフィド橋によって連結している。例示的レギュラーインスリンとして、例えば、ヒトインスリン(配列番号862に示されるアミノ酸の配列を有するA鎖および配列番号863に示されるアミノ酸の配列を有するB鎖を有する)またはブタインスリン(配列番号864のアミノ酸残基位置88〜108として示されるアミノ酸の配列を有するA鎖と、配列番号864のアミノ酸残基位置25〜54として示されるアミノ酸の配列を有するB鎖とを有する)が挙げられる。例示的速効型インスリン類似体として、配列番号862および863(AおよびB鎖)に示されるヒトインスリンと比較して、1つまたは複数のアミノ酸修飾を含有するインスリン変異体がある。例えば、例示的インスリン類似体は、当業者に公知であり、それだけには限らないが、配列番号862に示されるA鎖および配列番号863の変異体であるB鎖(B鎖;LysB3、GluB29)を有するグルリシン(fast−acting)、配列番号862に示されるA鎖および配列番号863の変異体であるB鎖(B鎖;LysB3、IleB28)を有するHMR−1 153、配列番号862に示されるA鎖および配列番号863の変異体であるB鎖(B鎖;AspB28)を有するインスリンアスパルトおよび配列番号862に示されるA鎖および配列番号863の変異体であるB鎖(B鎖;LysB28、ProB29)を有するインスリンリスプロが挙げられる。上記のどの例においても、類似体の命名法は、鎖のN末端から番号付けられた、インスリンのAまたはB鎖上での特定の位置におけるアミノ酸置換の記載に基づいて折り、これでは、配列の残りの部分は、天然ヒトインスリンのものである。このような類似体形態の例示的なものは、配列番号862(A鎖)に示され、配列番号865〜867のいずれかに示されるB鎖を有する。

共製剤は、液体製剤として、長期間、両端を含めて、2℃〜8℃もしくは約2℃〜8℃の温度で少なくとも1カ月間または両端を含めて、30℃〜42℃もしくは約30℃〜42℃の温度で少なくとも3日間安定である。例えば、共製剤は、安定であり、PH20ヒアルロニダーゼおよびインスリンの活性を、「冷蔵庫」条件、例えば、2℃〜8℃、例えば、4℃または約4℃で、少なくとも少なくとも2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、少なくとも8カ月、少なくとも9カ月、少なくとも10カ月、少なくとも11カ月、少なくとも12カ月、13カ月、14カ月、15カ月、16カ月、17カ月、18カ月、19カ月、20カ月、21カ月、22カ月、23カ月、24カ月、25カ月、26カ月、27カ月、28カ月、29カ月または30カ月またはそれ以上保持する。別の例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、PH20ヒアルロニダーゼおよびインスリンの活性を、室温で、例えば、18℃〜32℃、一般に、20℃〜32℃、例えば、28℃〜32℃で、少なくとも2週間〜1年、例えば、少なくとも3週間、4週間、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、少なくとも7カ月、少なくとも8カ月、少なくとも9カ月または少なくとも1年またはそれ以上の間保持する。さらなる例では、本明細書において提供された製剤は、安定であり、PH20ヒアルロニダーゼおよびインスリンの活性を、約30℃または30℃を超える、一般に、30℃〜42℃または約30℃〜42℃、例えば、32℃〜37℃または35℃〜37℃または約37℃もしくは37℃の高温下で、少なくとも4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、35日、40日、45日、50日、60日またはそれ以上保持する。

活性薬剤の安定性を評価するためのアッセイは、当業者にとって周知である。節Gは、PH20ヒアルロニダーゼの安定性を評価するための例示的アッセイを提供する。インスリンの安定性は、当業者に周知の同様の方法を使用して評価され得る。例えば、インスリン安定性および溶解度は、視覚的評価(例えば、色の変化、透明性、凝集体または凝集塊の存在および材料接着またはつや消しを含めた)、酸性清澄化、光学顕微鏡、逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)、インビトロまたはインビボバイオアッセイおよび変性および非変性サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって評価され得る。インスリン活性のインビトロまたはインビボバイオアッセイとして、それだけには限らないが、インスリン受容体を発現する細胞(例えば、ヒト胎盤細胞膜)および放射標識インスリンを使用する競合結合実験(例えば、Weiss et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:40018-40024; Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258を参照のこと);インスリン刺激性グルコース取り込み(Louveau et al., (2004) J Endocrin. 181:271-280、Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258);インスリンの存在下でのグルコース産生を評価するアッセイ(Wang et al., (2000) J. Biochem., 275:14717-14721、Duttaroy et al., (2005) Diabetes 54:251-258);および糖尿病および/または健常動物モデルを使用する研究(Atkinson et al., (1999) Nature Med. 5:601-604; Nagoya-Shibata-Yasuda (NSY) mice, Zucker diabetic fatty (ZDF) rats and Gato-Katazaki (GK) rats (Cefalu (2006) ILAR Journal 47:186-198)が挙げられる。

このような製剤の例示的なものは、100U/mL〜1000U/mLの修飾PH20ポリペプチド、特に、約600U/mL;10U/mL〜1000U/mLまたは少なくとも600U/mL;10U/mL〜1000U/mLの、特に、100U/mLまたは少なくとも100U/mLまたは約100U/mL速効型インスリン;80〜140mMの間または約80〜140mMの間の濃度のNaCl;7.0〜7.8の間または約7.0〜7.8の間のpH;7.0〜7.8の間または約7.0〜7.8の間のpH範囲を維持する緩衝剤質量濃度(w/v)として0.1%〜0.4%の防腐剤を含有する。適宜、さらなる分解防止剤が含まれ得る。例えば、本明細書において提供される共製剤は、1mM〜100mMの緩衝剤を含有する。例えば、本明細書において提供された共製剤は、0.005%〜0.5%の界面活性物質を含有する。本明細書において提供された例示的共製剤はまた、60mM未満のグリセリン(グリセロール)および2mM〜50mMまたは約50mMの抗酸化薬を含有する。

以下の安定な製剤は、単に例示的なものであって、微調整が行われ得るプラットフォームを提供する。インスリン溶解度および安定性ならびにPH20安定性のすべてではなくとも幾分かを保持しながら、種々の賦形剤およびその他の成分の濃度の極めてわずかな変化(例えば、記載された濃度の±15%)またはpHの小さな変化がなされ得るということは理解される。賦形剤を付加または除去することによってさらなる変化もなされ得る。例えば、安定化界面活性物質の種類も変更され得る。

例えば、本明細書における例示的共製剤は、100U/mL〜1000U/mLの修飾PH20ポリペプチド、特に、少なくとも600U/mLまたはおよそ少なくとも600U/mLまたは約600U/mLの修飾PH20ポリペプチド;10U/mL〜1000U/mLの速効型インスリン、特に、少なくとも100U/mLまたはおよそ少なくとも100U/mLまたは約100U/mLの速効型インスリン;10mM〜50mMまたは約10mM〜約50mMのTris(例えば、20mM〜40mMまたは約20mM〜40mMのTris、例えば、20mM、25mM、30mM、35mMもしくは40mMまたは約20mM、25mM、30mM、35mMもしくは40mM Tris);80mM〜約160mまたは約80mM〜約160mM NaCl(例えば、80mM、90mM、100mM、110mM 120mM、130mM、140mM、150mMもしくは160mMまたは約80mM、90mM、100mM、110mM 120mM、130mM、140mM、150mMもしくは160mM NaCl);2mM〜50mMまたは約2mM〜約50mMメチオニン(例えば、5mM、10mM、20mM、30mM、40mMもしくは50mMまたは約5mM、10mM、20mM、30mM、40mMもしくは50mMメチオニン);0mM〜50mMまたは約0mM〜約50mMグリセリン(例えば、5mM、10mM、20mM、30mM、40mMもしくは50mMまたは約5mM、10mM、20mM、30mM、40mMもしくは50mMグリセリン);0.005%〜0.5%または約0.005%〜約0.5%ポロキサマー188、例えば、0.01%〜0.05%(例えば、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%もしくは0.05%または約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%もしくは0.05%ポロキサマー188);0.05%〜0.25%または約0.05%〜約0.25%フェノール(例えば、0.1%、0.12%、0.125%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%もしくは0.17%または約0.1%、0.12%、0.125%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%もしくは0.17%フェノール);0.05%〜0.4%または約0.05%〜約0.4% m−クレゾール(例えば、0.075%、0.08%、0.09%、0.1%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%もしくは0.17%または約0.075%、0.08%、0.09%、0.1%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%もしくは0.17% m−クレゾール)を含有する。製剤は、7.0〜7.6または約7.0〜約7.6(例えば、pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5もしくは7.6または約pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5もしくは7.6)のpHで調製される。さらなる例では、亜鉛は、0.01mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100Uまたは0.024mg/100Uまたは約0.01mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100Uまたは0.024mg/100Uのインスリンの濃度でインキュベートされる。

特定の例では、速効型インスリンとして、インスリンアスパルト、インスリンリスプロまたはインスリングルリジンがある。修飾PH20ポリペプチドおよびインスリンリスプロを含有する本明細書において提供される例示的共製剤は、25mM〜35mMまたは約25mM〜約35mMのTris(例えば、約30mM Trisまたは約30mM Tris);70mM〜100mMまたは約70mM〜約100mM NaCl(例えば、80mMもしくは100mMまたは約80mMもしくは約100mM NaCl);10mM〜30mMまたは約10mM〜約30mMメチオニン20mMメチオニン);40mM〜60mMまたは約40mM〜約60mMのグリセリン(例えば、50mMまたは約50mMグリセリン);0.005%〜0.05%または約0.005%〜約0.05%のポロキサマー188(例えば、0.01%または約0.01%ポロキサマー188);0.017mgまたは約0.017mg亜鉛/100Uインスリン〜0.024mgまたは約0.024mg亜鉛/100Uインスリン(例えば、0.017mg亜鉛/100Uインスリン、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100Uまたは0.024mg亜鉛/100Uインスリン);0.08%または約0.08%〜0.17%または約0.17%フェノール(例えば、0.1%、0.125%または0.13%フェノール);0.07%または約0.07%〜0.17%または約0.17% m−クレゾール(例えば、0.075%、0.08%、0.13%もしくは0.15% m-クレゾール)を含有するものである。例えば、共製剤は、0.1%または約0.1%のフェノールおよび0.015% m−クレゾール;0.125%または約0.125%のフェノールおよび0.075% m−クレゾール; 0.13%または約0.13%のフェノールおよび0.075% m−クレゾール;0.13%または約0.13%のフェノールおよび0.08% m−クレゾール;または0.17%または約0.17%のフェノールおよび0.13% m−クレゾールを含有し得る。インスリンリスプロおよび修飾PH20ポリペプチドのこのような製剤は、7.0または約7.0〜7.5または約7.5(一般に、pH7.2または約pH7.2のpH)のpHで調製される。

修飾PH20ポリペプチドおよびインスリンアスパルトを含有する本明細書において提供された例示的共製剤は、25mMまたは約25mM〜35mMまたは約35mMのTris(例えば、30mMまたは約30mM Tris);70mMまたは約70mM〜120mMまたは約120mM NaCl(例えば、80mMもしくは100mMまたは約80mMもしくは100mM NaCl);2mMまたは約2mM〜30mMまたは約30mMメチオニン、例えば、2mM〜10mMまたは5mM〜30mMメチオニン(例えば、5mM、10mMもしくは20mMまたは約5mM、10mMもしくは20mM メチオニン);0.005%または約0.005%〜0.05%または約0.05%ポロキサマー188(例えば、0.01%または約0.01%ポロキサマー188);0.08%または約0.08%〜0.17%または約0.17%フェノール(例えば、0.1%、0.125%または0.13%フェノール);および0.07%または約0.07%〜0.17%または約0.17% m−クレゾール(例えば、0.075%、0.08%、0.13%または0.15% m−クレゾール)を含有するものである。例えば、共製剤は、0.1%または約0.1%フェノールおよび0.015% m−クレゾール;0.125%または約0.125%フェノールおよび0.075% m−クレゾール;0.13%または約0.13%フェノールおよび0.075% m−クレゾール;0.13%または約0.13%フェノールおよび0.08% m−クレゾール;または0.17%または約0.17%フェノールおよび0.13% m-クレゾールを含有し得る。インスリンアスパルトおよび修飾PH20ポリペプチドのこのような製剤は、7.0または約7.0〜7.6または約7.6のpH(通常、pH7.4もしくは7.3または約pH7.4もしくは7.3)で調製される。

修飾PH20ポリペプチドおよびインスリンアスパルトを含有する本明細書において提供されるさらなる例示的製剤は、フェノールを含有しないものである。このような例示的製剤は、25mMまたは約25mM〜35mMまたは約35mM Tris(例えば、30mMまたは約30mM Tris);70mMまたは約70mM〜120mMまたは約120mM NaCl(例えば、80mMもしくは100mMまたは約80mMもしくは100mM NaCl);2mMまたは約2mM〜30mMまたは約30mMメチオニン、例えば、2mM〜10mMまたは5mM〜30mMメチオニン(例えば、5mM、10mMもしくは20mMまたは約5mM、10mMもしくは20mMメチオニン);0.005%または約0.005%〜0.05%または約0.05%ポロキサマー188(例えば、0.01%または約0.01%ポロキサマー188);および0.07%または約0.07%〜0.4%または約0.4% m−クレゾール、例えば、0.2%または約0.2%〜0.4% m−クレゾール(例えば、0.3%、0.315%、0.35%、0.4% m−クレゾール)を含有する。インスリンアスパルトおよび修飾PH20ポリペプチドのこのような製剤は、7.0または約7.0〜7.6または約7.6のpH(通常、pH7.4もしくは7.3または約pH7.4もしくは7.3)で調製される。

修飾PH20ポリペプチドおよびインスリングルリジンを含有する本明細書において提供される例示的共製剤は、25mMまたは約25mM〜35mMまたは約35mM Tris(例えば、30mMまたは約30mM Tris);100mMまたは約100mM〜150mMまたは約150mM NaCl(例えば、100mMもしくは約100mMまたは140mM NaCl);10mMまたは約10mM〜30mMまたは約30mMメチオニン(例えば、10mMもしくは20mMまたは約10mMもしくは20mMメチオニン);40mMまたは約40mM〜60mMまたは約60mMグリセリン(例えば、50mMまたは約50mMグリセリン);0.005%または約0.005%〜0.05%または約0.05%ポロキサマー188(例えば、0.01%または約0.01% ポロキサマー188);0.08%または約0.08%〜0.17%または約0.17%フェノール(例えば、0.1%、0.125%または0.13%フェノール);0.07%または約0.07%〜0.17%または約0.17% m−クレゾール(例えば、0.075%、0.08%、0.13%または0.15% m−クレゾール)を含有するものである。例えば、共製剤は、0.1%または約0.1%フェノールおよび0.015% m−クレゾール;0.125%または約0.125%フェノールおよび0.075% m−クレゾール;0.13%または約0.13%フェノールおよび0.075% m−クレゾール;0.13%または約0.13%フェノールおよび0.08% m−クレゾール;または0.17%もしくは約0.17%フェノールおよび0.13% m−クレゾールを含有し得る。インスリングルリジンおよび修飾PH20ポリペプチドのこのような製剤は、7.0または約7.0〜7.6または約7.6のpH(通常、7.4または約pH7.4のpH)で調製される。

5.パッケージング、製造品およびキット
修飾PH20ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸またはその誘導体もしくは変異体の医薬品化合物は、パッケージング材料、疾患または障害を治療するのに有効である医薬組成物および医薬組成物または治療分子が、疾患もしくは障害を治療するために使用されることを示す標識を含有する製造品としてパッケージングされ得る。選択された修飾PH20ポリペプチドまたはその誘導体もしくは変異体および治療薬の組合せは、製造品にパッケージングされ得る。

本明細書において提供される製造品は、パッケージング材料を含有する。パッケージング医薬製剤において使用するためのパッケージング材料は、当業者に周知である。例えば、その全体が各々本明細書に組み込まれる、米国特許第5,323,907号、同5,052,558号および同5,033,252号を参照のこと。医薬品パッケージング材料の例として、それだけには限らないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトルおよび選択された製剤および意図される投与様式および治療に適した任意のパッケージング材料が挙げられる。製造品は、局所注射目的で投与(例えば、表皮下投与)を容易にするためのニードルまたはその他の注射装置を含み得る。修飾PH20ポリペプチドおよび特定の疾患または障害を治療するとわかっている速効型インスリンなどの治療薬を含めた、本明細書において提供される化合物および組成物の幅広い製剤が考慮される。パッケージの選択は、PH20および/または治療薬ならびにこのような組成物が、一緒にパッケージングされるか、別個にパッケージングされるかに応じて変わる。一例では、PH20は、治療薬との混合物としてパッケージングされ得る。別の例では、成分は、別個の組成物としてパッケージングされ得る。

修飾PH20ポリペプチド、治療薬および/またはその製造品はまた、キットとして提供され得る。キットは、本明細書に記載された医薬組成物および製造品として提供される投与のための項目を含み得る。例えば、PH20ポリペプチドは、シリンジ、吸入器、投与量カップ、ドロッパーまたはアプリケーターなどの投与のための装置を用いて供給され得る。組成物は、投与のための項目中に含有され得、後に添加されるよう別個に提供され得る。キットは、適宜、投与量、投薬計画および投与様式についての使用説明書を含めた、適用のための使用説明書を含み得る。キットはまた、本明細書に記載された医薬組成物および診断のための項目を含み得る。例えば、このようなキットは、対象において選択されたプロテアーゼの濃度、量または活性を測定するための項目を含み得る。

G.PH20活性および安定性を評価する方法
アッセイを使用して、本明細書において提供されたPH20ポリペプチドの安定性および活性を評価できる。アッセイを使用して、特定の条件、温度下で、および/または経時的にPH20ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性を評価できる。このようなアッセイを使用して、例えば、それだけには限らないが、30℃を超える、または約30℃または30℃の高温(例えば、30℃〜42℃、例えば、37℃または約37℃)、撹拌、賦形剤(例えば、防腐剤)の存在または低NaCl(塩)もしくはNaClがないことを含めた特定の変性条件下で、PH20ポリペプチドの安定性を決定できる。例えば、特定の条件下での安定性は、変性条件への曝露の不在下で、次いで、条件の存在下でその後の種々の時点で活性、溶解度および安定性(例えば、凝集の形成など)を評価することによってモニタリングできる。したがって、安定性は、経時的に評価され得る。安定性はまた、天然の、野生型または参照PH20ポリペプチドと比較して、1種または複数種の変性条件の存在下での、活性、溶解度または凝集のうち任意の1種または複数を比較することによって評価され得る。アッセイはまた、両活性薬剤の安定性を保持したまま本明細書において提供される製剤に微調整を行うために使用され得る。

1.ヒアルロニダーゼ活性
修飾PH20ポリペプチドの活性は、当技術分野で周知の方法を使用して評価され得る。例えば、ヒアルロニダーゼのUSP XXIIアッセイによって、分解されていないヒアルロン酸またはヒアルロナン、酵素をHAと37℃で30分間反応させた後に残存する(HA)基質の量を測定することによって間接的に活性が決定される(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD)。ヒアルロニダーゼ参照標準(USP)またはNational Formulary (NF)標準ヒアルロニダーゼ溶液が、任意のヒアルロニダーゼの単位での活性を確認するためにアッセイにおいて使用され得る。一例では、活性は、マイクロ濁度アッセイを使用して測定される。これは、ヒアルロン酸が、酸性化血清または塩化セチルピリジニウム(CPC)などの沈殿させる試薬と結合する場合の不溶性沈殿物の形成に基づいている。活性は、ヒアルロニダーゼをヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)とともに一定期間(例えば、10分)インキュベートすること、次いで、消化されていないヒアルロン酸ナトリウムを、酸性化血清またはCPCの添加によって沈殿させることによって測定される。得られたサンプルの濁度は、さらなる展開期間の後に640nmで測定される。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性に起因する濁度の低下が、ヒアルロニダーゼ酵素活性の尺度である。

別の例では、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼとともにインキュベートした後に残存するビオチン化ヒアルロン酸が測定されるマイクロタイターアッセイを使用して測定される(例えば、Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269、米国特許公開第20050260186号を参照のこと)。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基はビオチン化され、ビオチン化ヒアルロン酸基質は、マイクロタイタープレートと共有結合される。ヒアルロニダーゼとともにインキュベーションした後、残存するビオチン化ヒアルロン酸基質がアビジン−ペルオキシダーゼ反応を使用して検出され、公知の活性のヒアルロニダーゼ標準を用いる反応後に得られたものと比較される。

ヒアルロニダーゼ活性を測定するためのその他のアッセイもまた、当技術分野で公知であり、本明細書における方法において使用され得る(例えば、Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263を参照のこと)。

多数のヒアルロニダーゼアッセイは、新規還元性N−アセチルアミノ基の生成(Bonner and Cantey, Clin. Chim. Acta 13:746-752, 1966)、または粘度の喪失(De Salegui et al., Arch. Biochem. Biophys.121:548-554, 1967)または濁度(Dorfman and Ott, J. Biol. Chem. 172:367, 1948)の測定に基づいていた。精製された基質を用いた場合、これらの方法のすべてが、エンドグリコシダーゼ活性の有無の決定には十分である。

実質的に精製されたグリコサミノグリカン基質はまた、ゲルシフトアッセイにおいて使用され得る。グリコサミノグリカンは、ゲル内の基質移動度のシフトをもたらすエンドグリコシダーゼ活性について試験するために、組換えPH20、例えば、可溶性PH20と混合される。このような基質の例として、それだけには限らないが、コンドロイチン−4および6硫酸塩、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸が挙げられ、これらは、Sigma Chemicalから入手できる。ヒト臍帯ヒアルロナンは、ICNから入手できる。例えば、各試験基質は、pH3.5〜7.5のバッファー範囲で0.lmg/mLまたは約0.lmg/mLに希釈され得る。このような一例示的アッセイでは、精製可溶性PH20の10μlまたは約10μlのサンプルまたはPH20発現細胞から得たコンディショニング培地は、所望のバッファー中の90μlまたは約90μlの試験基質と混合され、37℃で3時間インキュベーションされ得る。インキュベーションした後、サンプルをサンプルバッファー(Tris EDTA pH8.0、ブロモフェノールブルーおよびグリセロール)を用いて中和し、続いて、電気泳動した。グリコサミノグリカンは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して検出され得、例えば、グリコサミノグリカンは、3%氷酢酸中0.5%アルシアンブルーを使用して一晩ゲルを染色することと、続いて、7%氷酢酸中で脱染することによって検出され得る。分解は、酵素の存在下および不在下での基質移動度の比較によって決定される。

ヒアルロニダーゼ活性はまた、基質ゲルザイモグラフィ(Guentenhoner et al. (1992) Matrix 12:388-396)によって検出され得る。このアッセイでは、サンプルは、ヒアルロン酸を含有するSDS−PAGEゲルに適用され、サンプル中のタンパク質が、電気泳動によって分離される。次いで、ゲルを、酵素アッセイバッファー中でインキュベートし、続いて、ゲル中のヒアルロン酸を検出するために染色する。ヒアルロニダーゼ活性は、基質ゲル中の透明化された領域として可視化される。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドを含めたPH20ポリペプチドの、拡延剤または拡散剤として作用する能力も評価され得る。例えば、トリパンブルーダイをPH20ポリペプチドとともにか、または伴わずに、ヌードマウスの各側の側面皮膚中に皮下注入してもよい。次いで、マイクロキャリパーなどを用いてダイ領域を測定して、PH20ポリペプチドの、拡延剤として作用する能力を決定する(米国特許公開第20060104968号)。

PH20ポリペプチドの機能活性、これらのアッセイのいずれかを使用して参照標準に対して比較および/または正規化され得る。これは、PH20ポリペプチドの官能性当量を決定するために行われ得る。例えば、PH20ポリペプチドの、拡延剤または拡散剤として作用する能力は、トリパンブルーとともに、マウスの側面皮膚中に注射することによって評価され得る。例えば、ヒアルロニダーゼ参照標準100単位と同量の拡散を達成するのに必要な量が決定され得る。したがって、必要なPH20ポリペプチドの量は、100ヒアルロニダーゼ単位と官能的に同等である。

2.溶解度
PH20ポリペプチドの溶解度は、当業者に公知の任意の方法によって決定され得る。溶解度を決定するための1つの方法は、洗浄剤分配である。例えば、可溶性PH20ポリペプチドは、例えば、37℃のTriton(登録商標)X−114溶液の水相へのその分配によって区別され得る(Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-1607)。GPI固定されたヒアルロニダーゼを含めた脂質に固定されたヒアルロニダーゼなどの膜に固定されたポリペプチドは、洗浄剤の豊富な相に分配するが、ホスホリパーゼCを用いる処理後に洗浄剤の乏しい相または水相に分配する。ホスホリパーゼCは、GPI固定されたタンパク質中に見られるホスホ−グリセロール結合を切断する酵素である。PLCを用いる処理は、外細胞膜からのGPIが連結されたタンパク質の放出を引き起こす。

3.純度、結晶化または凝集
本明細書において提供されたポリペプチドの安定性は、その他の方法および当技術分野で公知のアッセイを使用して評価され得る。ヒアルロニダーゼ活性に基づいて安定性を評価することに加え、安定性は、目視検査、回収パーセント、タンパク質純度および見かけの融解温度によって評価され得る。

例えば、タンパク質純度は、逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)によって測定され得る。RP−HPLCによって決定されるようなタンパク質純度は、存在するタンパク質種すべてに対して比較される、存在する主なPH20タンパク質ピークのパーセントである。したがって、RP−HPLCおよび当業者に公知の類似の方法は、酵素の分解を評価し得る。タンパク質純度は、経時的に評価され得る。タンパク質純度はまた、1種または複数種の変性条件の存在下で、またその変動する量で評価され得る。回収パーセントもまた、参照サンプルと比較される、種々の条件下(変性条件、保存時間、容器(vessel)または容器(container)などの保存様式または変更され得るその他の同様のパラメータ)下でのポリペプチドの相対パーセンテージとして決定され得る。PH20ポリペプチド安定性はまた、RP−HPLCによってヒアルロニダーゼの酸化を測定することによって決定され得る。酸化パーセントは、主要な(ox−1)および微量な(ox−2)ピークのピーク面積の合計の尺度である。

一例では、修飾PH20ポリペプチドなどのPH20ポリペプチドの融解温度は、種々の条件(例えば、変性条件またはその他の保存条件)下で、動的光散乱による粒子の水力学的半径を測定することによって決定され得る。粒子の大きさの増大および融解温度の低下は、ヒアルロニダーゼの変性およびその後の凝集を示す。

本明細書において提供された共製剤中のヒアルロニダーゼの安定性を決定するために使用され得る当業者公知のその他の方法として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、免疫ブロット法、核磁気共鳴(NMR)分光法、質量分析、円偏光二色性(CD)およびダイベースの蛍光アッセイが挙げられる。

4.薬動力学/薬物動態学
単独または別の治療薬と組み合わせた、修飾PH20ポリペプチドなどのPH20ポリペプチドの投与の、任意の投与された薬剤の薬物動態および薬力学的特性に対する効果はまた、臨床試験の設定などにおいて動物モデルおよび/またはヒト対象を使用してインビボで評価され得る。薬物動態または薬力学的研究は、動物モデルを使用して実施され得るか、またはPH20ポリペプチドまたは修飾PH20ポリペプチドを用いて投与された患者についての研究の際に実施され得る。

動物モデルとして、それだけには限らないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類モデルが挙げられる。いくつかの例では、薬物動態または薬力学的研究は、健常動物を使用して実施される。その他の例では、研究は、任意のヒアルロナン関連疾患または障害、例えば、腫瘍モデルの動物モデルなどの、ヒアルロナンを用いる療法が考慮される疾患の動物モデルを使用して実施される。

修飾PH20ポリペプチドなどのPH20ポリペプチドの薬物動態特性は、投与後の、最大(ピーク)濃度(Cmax)、ピーク時間(すなわち、最大濃度が生じるとき;Tmax)、最小濃度(すなわち、用量の間の最小濃度;Cmin)、消失半減期(T1/2)および曲線下面積(すなわち、時間対濃度をプロットすることによって作製される曲線下面積;AUC)のようなパラメータを測定することによって評価され得る。ヒアルロニダーゼの絶対バイオアベイラビリティは、皮下デリバリー後のヒアルロニダーゼの曲線下面積(AUCsc)を、静脈内デリバリー後のヒアルロニダーゼのAUC(AUCiv)と比較することによって決定され得る。絶対バイオアベイラビリティ(F)は、式:F=([AUC]sc×dosesc)/([AUC]iv×doseiv)を使用して算出され得る。薬物動態研究において、用量中の、漸増または漸減濃度の修飾PH20ポリペプチドなどの酵素の効果を評価するために、投薬のさまざまな用量および種々の投薬頻度が投与され得る。

H.治療方法および併用療法
ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカン(複数化)を分解する能力に基づいてヒアルロニダーゼ活性を示す、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドのうちいずれかの方法および使用が本明細書において提供される。このような活性のために、修飾PH20ポリペプチドは、皮下投与された治療薬のデリバリーおよび/またはバイオアベイラビリティを増大するための拡延因子として使用され得る。それだけには限らないが、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、核酸またはウイルスを含めた任意の治療薬のデリバリーが、本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドとの同時投与によって促進または増強され得る。例えば、修飾PH20ポリペプチドは、化学療法薬の固形腫瘍への浸透を増大することなどによって、抗体(例えば、モノクローナル抗体)、サイトカイン、免疫グロブリン、インスリンまたは血液凝固因子などの治療薬の、所望の位置へのデリバリーを高めるために使用され得る。修飾PH20ポリペプチドはまた、ヒアルロナンの過剰の蓄積を特徴とするヒアルロナン疾患または障害を治療するために使用され得る。例えば、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、腫瘍を治療するため;脳におけるグリコサミノグリカン蓄積を治療するため;心血管障害を治療するため;眼部障害を治療するため;肺の疾患を治療するため;セルライトを治療するため;および/または増殖性障害を治療するために使用され得る

修飾PH20ポリペプチドのその他の方法および使用は、当業者に公知である任意のものを含む。例えば、PH20ヒアルロニダーゼの種々の形態が調製され、ヒトにおける治療的使用のために承認されている。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物として、ビトラーゼ(Vitrase)(登録商標)(ISTA Pharmaceuticals)、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼおよびアンファダーゼ(Amphadase)(登録商標)(Amphastar Pharmaceuticals)、ウシ精巣ヒアルロニダーゼが挙げられる。ハイレネックス(Hylenex)(登録商標)(Halozyme Therapeutics)は、可溶性rHuPH20をコードする核酸を含有する、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞によって産生されたヒト組換えヒアルロニダーゼである(例えば、米国特許第7,767,429号を参照のこと)。ヒアルロニダーゼの承認された治療的使用として、皮下点滴療法(皮下流体投与)のためのその他の治療薬の吸収および分散を高めるためのアジュバントとしての使用および放射不透過性薬剤の再吸収を改善するための皮下尿路造影における補助剤としての使用が挙げられる。ヒアルロニダーゼは、これらの適応症に加えて、さらなる疾患および状態の治療のための治療薬または化粧剤として使用され得る。例えば、ヒアルロニダーゼは、眼部手術に先立つ局所麻酔における眼球周囲ブロックのためによく使用される。酵素の存在が、さらなるブロックの必要性を防ぎ、無動(眼の運動の喪失)の発生までの時間を低減する。眼球周囲およびテノン嚢下ブロックは、眼部手順のためのヒアルロニダーゼの最も一般的な適用である。ヒアルロニダーゼはまた、眼瞼形成およびフェースリフトなどの美容整形においても無動を促進し得る。PH20ヒアルロニダーゼを含めて本明細書において提供された可溶性PH20ヒアルロニダーゼは、治療またはPH20ヒアルロニダーゼが使用される併用療法の任意の方法において使用され得るということは理解される(例えば、その全体が参照により各々組み込まれる、米国公開番号US20040268425;US20050260186;US20060104968;および米国公開番号US20100074885として公開された米国出願番号第12/381,844号;米国公開番号US20090311237として公開された同12/386,249号;米国公開番号US20090304665として公開された同12/387,225号;米国公開番号US2010003238として公開された同12/386,222号を参照のこと)。

例示的な、制限するものではない方法および使用が、以下の小区分に記載されている。

1.治療薬を送達する方法
上記のように、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸、結合組織の細胞内基底質にみられる多糖の、また特定の特殊化した組織、例えば、臍帯および硝子体液の加水分解によって結合組織の透過性を変更する拡延物質または拡散物質である。拡延因子が存在しない場合には、薬物、タンパク質、ペプチドおよび核酸などの皮下に注射される材料は、極めて遅く広がる。しかし、ヒアルロニダーゼとの同時注射は、迅速な拡延を引き起こし得る。拡散速度は酵素の量に比例し、拡散の程度は、溶液の容量に比例する。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、インビボで種々の哺乳類組織のいずれかへのデリバリー物質および分子を促進または増強するために使用され得る。小分子薬理作用物質ならびに大きな分子の薬理作用物質、例えば、タンパク質、核酸およびリボ核酸ならびにそれだけには限らないが、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、脂質ベースの分子および薬物を含めた成分の組み合わせを含有し得る高分子組成物の拡散を促進し、したがって、デリバリーを促進するために使用され得る(例えば、米国公開番号US20040268425;US20050260186;およびUS20060104968)。修飾PH20ポリペプチドは、共製剤または同時投与される薬剤のバイオアベイラビリティならびに薬物動態(PK)および/または薬力学的(PD)特徴を改善するために、治療薬と、同時投与および/または共製剤され得る。esPH20などの可溶性PH20を使用することによって改善され得るPK/PDパラメータとして、Cmax(例えば、血流中への吸収後に達成される最大濃度)、Tmax(最大濃度を達成するのに必要な時間)、T1/2(濃度が半分まで低下するのに必要な時間)、Cmin(代謝および排泄後の薬剤の最小濃度)、AUC(濃度対時間の曲線下面積、バイオアベイラビリティの全体量の尺度)、対象とする種々の組織の濃度(および例えば、所望の濃度、全体レベルを達成する速度、所望のレベルを維持する期間を含む)およびEmax(達成される最大効果)のような尺度が挙げられる。

本明細書において提供された治療の方法は、治療薬が治療する疾患または障害の治療のための治療薬を用いる併用療法を含む。疾患または状態を寛解させるか、そうでなければその重篤度を和らげる任意の治療薬が、このような治療薬のバイオアベイラビリティを増大するために、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドと組み合され得る。特に、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、出願に記載される組み合わせの各々すべてにおいて、開示されたヒアルロニダーゼまたはヒアルロニダーゼ分解酵素の代わりに使用され得る。例えば、米国公開番号US20040268425;US20050260186;US20060104968および米国公開番号US20100074885として公開された米国出願番号第12/381,844号;米国公開番号US20090311237として公開された同12/386,249号;米国公開番号US20090304665として公開された同12/387,225号および米国公開番号US2010003238として公開された同12/386,222号を参照のこと。

修飾PH20ポリペプチドは、治療薬調製物の前に、その後に、それと断続的に、または同時に投与され得る。一般に、修飾PH20ポリペプチドは、PH20が、間質空間中のヒアルロン酸を分解するのを可能にするよう、治療薬調製物の投与に先立って、または同時に投与される。PH20は、治療分子の投与部位とは異なる部位に投与されてもよく、可溶性PH20は、治療分子の投与部位と同一部位で投与されてもよい。

ヒアルロニダーゼとともに投与され得る医薬品、治療薬および化粧剤および分子の例として、それだけには限らないが、化学療法薬または抗癌剤、鎮痛薬、抗生物質、抗炎症薬、抗菌剤、殺アメーバ剤、殺トリコモナス剤(trichomonacidal agent)、抗パーキンソン病薬、抗マラリア薬、抗痙攣薬、抗うつ薬および抗関節炎薬、抗真菌剤、抗高血圧薬、解熱剤、抗寄生虫剤、抗ヒスタミン剤、α−アドレナリン作動性アゴニスト剤、α遮断薬、麻酔剤、気管支拡張剤、殺生物剤、殺菌剤、静菌剤、βアドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、心血管治療薬、避妊薬、化粧剤または審美性物質、鬱血除去薬、利尿薬、降下薬、診断薬、電解質剤、催眠薬、ホルモン剤、高血糖薬、筋弛緩薬、筋肉収縮薬、眼部薬、副交感神経作動薬、精神賦活剤、鎮静剤、睡眠誘導物質、交感神経作用薬、トランキライザー薬、泌尿器薬、膣薬、抗ウイルス剤、ビタミン剤、非ステロイド系抗炎症薬またはアンジオテンシン変換酵素およびその.任意の組合せが挙げられる。特に、治療薬として、モノクローナル抗体を含めた抗体、ビスホスホネート、インスリン、血液凝固因子、サイトカインおよび免疫グロブリン(Immun Globulins)が挙げられる。

例えば、本明細書において提供されたPH20ポリペプチドは、化学療法薬のデリバリーを増大するために使用され得る。ヒアルロニダーゼはまた、化学療法薬の活性および/または化学療法薬に対する腫瘍の接触性を増強するために使用されてきた(Schuller et al., 1991, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 32:173, abstract no. 1034; Czejka et al., 1990, Pharmazie 45:H.9; Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390)。ヒアルロニダーゼとの組合せ化学療法は、膀胱癌(Horn et al., 1985、J. Surg. Oncol. 28:304-307)、扁平上皮癌(Kohno et al., 94、J. Cancre Res. Oncol. 120:293-297)、乳癌(Beckenlehner et al., 1992, J. Cancer Res. Oncol. 118:591-596)および胃腸癌(Scheithauer et al., 1988, Res. 8:391-396)を含めた種々の癌の治療において有効である。この例では、修飾PH20ヒアルロニダーゼは、化学療法薬またはその他の抗癌剤の固形腫瘍への浸透を増強し、それによって、疾患を治療する。

可溶性PH20を含有する組成物は、抗癌剤とともに腫瘍内に注射され得る。播種性癌または到達するのが困難な腫瘍については静脈内に注射されてもよい。抗癌剤は、化学療法薬、抗体、ペプチドまたは遺伝子療法ベクター、ウイルスまたはDNAであり得る。さらに、ヒアルロニダーゼは、多剤耐性を獲得してしまったこれまでの化学療法抵抗性腫瘍において、腫瘍細胞を感作のためのサイクリングプールに補充するために使用され得る(St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44)。

PH20などの可溶性PH20の投与の後に、それと同時にまたはそれ以前に投与され得る例示的抗癌剤として、それだけには限らないが、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン;アレムツズマブ、アリトレチノイン(9−シス−レチノイン酸)、アロプリノール、アルトレタミン、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン(Ambomycins)、アメタントロン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾールアナキシロン(Anaxirones)、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ(Argimesnas)、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン(Asperlins)、アトリムスチン(Atrimustines)、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン(Azotomycins)、バノキサントロン(Banoxantrones)、バタブリン(Batabulins)、バチマスタット;BCG生、ベナキシビン(Benaxibines)、ベンダムスチン、ベンゾデパ(Benzodepas)、ベキサロテン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダール(Biricodars)、ビサントレン、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン(Budotitanes)、ブスルファン、カクチノマイシン(Cactinomycins)、カルステロン、カネルチニブ、カペシタビン、カラセミド、カルベチマー(Carbetimers)、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、ポリフェプロサンを伴うカルムスチン、カルムスチン、カルビシン、カルゼレシン(Carzelesins)、セデフィンゴール(Cedefingols)、セレコキシブ、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル(Cioteronels)、シプラクチン(Ciplactin)、シロレマイシン(Cirolemycins)、シスプラチン、クラドリビン、クランフェヌル(Clanfenurs)、クロファラビン、クリスナトール(Crisnatols)、シクロホスファミド、シタラビンリポソーマル、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノルビシン/ダウノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デクスニグルジピン(Dexniguldipines)、デキソナ(Dexonas)、デクスラゾキサン、デザグアニン(Dezaguanines)、ジアジキオン(Diaziquones)、ジブロスピジウム(Dibrospidiums)、ジエノゲスト、ジナリン(Dinalins)、ジセルモリド(Disermolides)、ドセタキセル、ドフェキダル(Dofequidars)、ドキシフルリジン、ドキソルビシンリポソーマル、ドキソルビシンHCL、ドキソルビシンHCLリポソーム注射、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エコムスチン(Ecomustines)、エダトレキサート、エドテカリン(Edotecarins)、エフロミチン(Eflomithines)、エラクリダール(Elacridars)、エリナフィド(Elinafides)、エリオットB溶液、エルサミトルシン(Elsamitrucins)、エミテフール(Emitefurs)、エンロプラチン(Enloplatins)、エンプロメート(Enpromates)、エンザスタウリン、エピプロピジン(Epipropidines)、エピルビシン、エポエチンアルファ、エプタロプロスト(Eptaloprosts)、エルブロゾール(Erbulozoles)、 エソルビシン(Esorubicins)、エストラムスチン、エタニダゾール、エトグルシド、リン酸エトポシド、エトポシドVP−16、エトポシド、エトプリン、エキセメスタン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン(Fazarabines)、フェンレチニド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、5−フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルオロシタビン(Flurocitabines)、フォスキドン(Fosquidones)、フォストリエシン、フォストリエシン、ホトレタミン(Fotretamins)、フルベストラント、ガラルビシン(Galarubicins)、ガロシタビン(Galocitabines)、ゲムシタビン、ゲムツズマブ/オゾガマイシン、ゲロキノール(Geroquinols)、ギマテカン(Gimatecans)、ギメラシル、グロキサゾン(Gloxazones)、グルフォスファミド(Glufosfamides)、酢酸ゴセレリン、ヒロキシ尿素、イブリツモマブ/チウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン(Ilmofosines)、イロマスタット、メシル酸イマチニブ、イメキソン(Imexons);インプロスルファン、インジスラム、インプロクオン、インターフェロンアルファ−2a、インターフェロンアルファ−2b、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インタフェロン、インターロイキン−2sおよびその他のインターロイキン(組換えインターロイキンを含む)、イントプリシン(Intoplicines)、ヨーベングアン(Iobenguanes)[131−I]、イプロプラチン(Iproplatins)、イリノテカン、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート(Ketotrexates)、L-アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン(Ledoxantrones)、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、リュープロレリン、(リュープロリド)、レバミソール、レクサカルシトール(Lexacalcitols)、リアロゾール(Liarozoles)、ロバプラチン(Lobaplatins)、ロメトレキソール(Lometrexols)、ロムスチン/CCNU、ロムスチン、ロナファーニブ、ロソキサントロン(Losoxantrones)、ルルトテカン(Lurtotecans)、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メクロレタミン/ナイトロジェンマスタード;酢酸メゲストロール;メゲストロール、メレンゲストロール、メルファラン、メルファランL−PAM、メノガリル、メピチオスタン、メルカプトプリン、6-メカプトプリン(Mecaptopurine)、メスナ、メテシンド(Metesinds)、メトトレキサート、メトキサレン、メトミデート(Metomidates)、エトプリン、メツレデパ(Meturedepas)、ミドプラチン(Miboplatins)、ミプロキシフェン(Miproxifenes)、ミソニダゾール、ミチンドミド(Mitindomides)、ミトカルシン(Mitocarcins)、ミトクロミン(Mitocromins)、ミトフラキソン(Mitoflaxones)、ミトギリン(Mitogillins)、ミトグアゾン、ミトマルシン(Mitomalcins)、マイトマイシンC、マイトマイシン、ミトナフィド(Mitonafides)、ミトキドン(Mitoquidones)、ミトスペル(Mitospers)、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾロミド(Mitozolomides)、ミボブリン(Mivobulins)、ミゾリビン、モファロテン(Mofarotenes)、モピダモール、ムブリチニブ(Mubritinibs)、ミコフェノール酸、ナンドロロンフェンプロピオネート、ネダプラチン、ネララビン、ネモルビシン(Nemorubicins)、ニトラクリン、ノコダゾール、ノフェツモマブ(Nofetumomabs)、ノガラマイシン、ノラトレキセド(Nolatrexeds)、ノルトピキサントロン(Nortopixantrones)、オクトレオチド、オプレルベキン、オルマプラチン(Ormaplatins)、オルタタキセル(Ortataxels)、オテラシル、オキサリプラチン、オキシスラン、オキソフェナルシン(Oxophenarsines)、パクリタキセル、パミドロネート、、パツピロン(Patupilones)、ペガデマーゼ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペルデシン(Peldesines)、ペリオマイシン(Peliomycins)、ペリトレキソール(Pelitrexols)、ペメトレキセド(Pemetrexeds)、ペンタムスチン(Pentamustines)、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド(Perfosfamides)、ペリフォシン、ピコプラチン、ピナフィド(Pinafides)、ピポブロマン、ピポスルファン(Piposulfans)、ピルフェニドン、ピロキサントロン(Piroxantrones)、ピクサントロン、プレビトレキセド(Plevitrexeds)、プリカマイシンミトラマイシン、プリカマイシン、プロメスタン(Plomestanes)、ポルフィマーナトリウム、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ(Pumitepas)、ピューロマイシン、ピラゾフリン(Pyrazofurins)、キナクリン、ラニムスチン、ラスブリカーゼ、リボプリン(Riboprines)、リトロスルファン(Ritrosulfans)、リツキシマブ、ログレチミド(Rogletimides)、ロキニメックス、ルフォクロモマイシン(Rufocromomycins)、サバルビシン(Sabarubicins)、サフィンゴール、サルグラモスチム、サトラプラチン、セブリプラチン(Sebriplatins)、セムスチン、シムトラゼン(Simtrazenes)、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルフォセート(Sparfosates)、スパルフォス酸(Sparfosic Acids)、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン(Streptovarycins)、ストレプトゾシン、スホスファミド(sufosfamide)、スロフェヌル(Sulofenurs)、リンゴ酸スニチニブ、6−TGタセジナリン(Tacedinalines)、タリソマイシン(Talisomycins)、タリスムチン(Tallimustines)、タモキシフェン、タリキダル(Tariquidars)、タウロムスチン(Tauromustines)、テコガラン(Tecogalans)、テガフール、テロキサントロン(Teloxantrones)、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド/VM−26、テニポシド、テロキシロン(Teroxirones)、テストラクトン、チアミプリン(Thiamiprines)、チオグアニン、チオテパ、チアミプリン(Tiamiprines)、チアゾフリン、チロミソール(Tilomisoles)、チロロン、チムコダル(Timcodars)、チモナシック(Timonacics)、チラパザミン、トピクサントロン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン(エクチナサイジン743)、トラスツズマブ、トレストロン(Trestolones)、トレチノイン/ATRA、トリシリビン(Triciribines)、トリロスタン、トリメトレキサート、トリプラチンテトラニトレート(Triplatin Tetranitrates)、トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール(Tubulozoles)、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ(Uredepas)、バルルビシン、バルスポダール(Valspodars)、バプレオチド(Vapreotides)、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンピジン(Vinepidines)、ビンフルニン、ビンホルミド(Vinfo
rmides)、ビングリシネート(Vinglycinates)、ビンロイシノール(Vinleucinols)、ビンロイロシン(Vinleurosines)、ビノレルビン、ビンロシジン(Vinrosidines)、ビントリプトール(Vintriptols)、ビンゾリジン(Vinzolidines)、ボロゾール、キサントマイシン(Xanthomycin A)、グアメシクリン(Guamecyclines)、ゼニプラチン(Zeniplatins)、ジラスコルブ(Zilascorbs)[2−H]、ジノスタチン、ゾレドロネート、ゾルビシン、および、ゾスキダル、例えば、
アルデスロイキン(例えば、プロロイキン(PROLEUKIN)(登録商標));アレムツズマブ(例えば、キャンパス(登録商標));アリトレチノイン(例えば、パンレチン(PANRETIN)(登録商標));アロプリノール(例えば、ジロプリム(ZYLOPRIM)(登録商標));アルトレタミン(例えば、ヘキサレン(HEXALEN)(登録商標));アミホスチン(例えば、エチオール(ETHYOL)(登録商標));アナストロゾール(例えば、アリミデックス(登録商標));三酸化ヒ素(例えば、トリセノックス(登録商標));アスパラギナーゼ(例えば、エルスパール(ELSPAR)(登録商標));BCG生(例えば、TICE(登録商標)BCG);ベキサロテン(例えば、タルグレチン(TARGRETIN)(登録商標));ベバシズマブ(アバスチン(登録商標));ブレオマイシン(例えば、ブレノキサン(BLENOXANE)(登録商標));静脈内ブスルファン(例えば、ブスルフェクス(登録商標));経口ブスルファン(例えば、ミレラン(商標));カルステロン(例えば、メトサーブ(METHOSARB)(登録商標));カペシタビン(例えば、ゼローダ(登録商標));カルボプラチン(例えば、パラプラチン(登録商標));カルムスチン(例えば、BCNU(登録商標)、BiCNU(登録商標));ポリフェプロサンを伴うカルムスチン(例えば、ギリアデル(登録商標)ウエハー);セレコキシブ(例えば、セレブレックス(CELEBREX)(登録商標));クロラムブシル(例えば、ロイケラン(登録商標));シスプラチン(例えば、プラチノール(PLATINOL)(登録商標));クラドリビン(例えば、ロイスタチン(登録商標)、2−CdA(登録商標));シクロホスファミド(例えば、シトキサン(登録商標)、ネオサール(NEOSAR)(登録商標));シタラビン(例えば、シトサール(CYTOSAR)−U(登録商標));シタラビンリポソーマル(例えば、デポサイト(登録商標));ダカルバジン(例えば、DTIC−Domeυ):ダクチノマイシン(例えば、コスメゲン(登録商標));ダルベポエチンアルファ(例えば、アパネスプ(ARANESP)(登録商標));ダウノルビシンリポソーマル(例えば、ダウノキソン(DAUNOXOME)(登録商標));ダウノルビシン/ダウノマイシン(例えば、セルビジン(登録商標));デニロイキンジフチトクス(例えば、オンタック(ONTAK)(登録商標));デクスラゾキサン(例えば、ジンカード(ZINECARD)(登録商標));ドセタキセル(例えば、タキソテール(登録商標));ドキソルビシン(例えば、アドリアマイシン(登録商標)、ルベックス(RUBEX)(登録商標));ドキソルビシンHCLリポソーム注射用(例えば、ドキシル(登録商標))を含むドキソルビシンリポソーマル;プロピオン酸ドロモスタノロン(例えば、ドロモスタノロン(登録商標)およびマステロン(MASTERONE)(登録商標)注射用);エリオットB溶液(例えば、エリオットB溶液(登録商標));エピルビシン(例えば、エレンス(ELLENCE)(登録商標));エポエチンアルファ(例えば、EPOGEN(登録商標));エストラムスチン(例えば、EMCYT(登録商標));リン酸エトポシド(例えば、エトポフォス(ETOPOPHOS)(登録商標));エトポシドVP−16(例えば、ベプシド(登録商標));エキセメスタン(例えば、アロマシン(登録商標));フィルグラスチム(例えば、ニューポジェン(登録商標));フロクスウリジン(例えば、FUDR(登録商標));フルダラビン(例えば、フルダラ(登録商標));フルオロウラシルincl.5−FU(例えば、ADRUCIL(登録商標));フルベストラント(例えば、フェソロデックス(登録商標));ゲムシタビン(例えば、ジェムザール(登録商標));ゲムツズマブ/オゾガマイシン(例えば、マイロターグ(登録商標));酢酸ゴセレリン(例えば、ゾラデックス(登録商標));ヒドロキシ尿素(例えば、ハイドレア(登録商標));イブリツモマブ/チウキセタン(例えば、ゼバリン(登録商標));イダルビシン(例えば、イダマイシン(登録商標));イホスファミド(例えば、IFEX(登録商標));メシル酸イマチニブ(例えば、グリベック(登録商標));インターフェロンアルファ−2a(例えば、ロフェロン(ROFERON)−A(登録商標));インターフェロンアルファ−2b(例えば、イントロンA(登録商標));イリノテカン(例えば、カンプトサール(CAMPTOSAR)(登録商標));レトロゾール(例えば、フェマーラ(登録商標));ロイコボリン(例えば、ウェルコボリン(WELLCOVORIN)(登録商標)、ロイコボリン(登録商標));レバミソール(例えば、エルガミソール(ERGAMISOL)(登録商標));ロムスチン/CCNU(例えば、CeeNU(登録商標));メクロレタミン/ナイトロジェンマスタード(例えば、ムスタルゲン(MUSTARGEN)(登録商標));酢酸メゲストロール(例えば、メゲース(MEGACE)(登録商標));メルファラン/L−PAM(例えば、アルケラン(登録商標));メルカプトプリンincl.6−MP(例えば、プリネトール(PURINETHOL)(登録商標));メスナ(例えば、メスネックス(MESNEX)(登録商標));メトトレキサート;メトキサレン(例えば、ウバデックス(UVADEX)(登録商標));マイトマイシンC(例えば、ムタマイシン(MUTAMYCIN)(登録商標)、ミトザイトレックス(MITOZYTREX)(登録商標));ミトタン(例えば、リソドレン(LYSODREN)(登録商標));ミトキサントロン(例えば、ノバントロン(NOVANTRONE)(登録商標));ナンドロロンフェンプロピオネート(例えば、デュラボリン(DURABOLIN)−50(登録商標));ノフェツモマブ(Nofetumomabs)(えば、ベルマ(VERLUMA)(登録商標));オプレルベキン(例えば、ニューメガ(NEUMEGA)(登録商標));オキサリプラチン(例えば、エロキサチン(登録商標));パクリタキセル(例えば、パキセン(PAXENE)(登録商標)、タキソール(登録商標));パミドロネート(例えば、アレディア(登録商標));ペガデマーゼ(例えば、アダゲン(ADAGEN)(登録商標));ペグアスパルガーゼ(例えば、オンカスパール(ONCASPAR)(登録商標));ペグフィルグラスチム(例えば、ニューラスタ(NEULASTA)(登録商標));ペントスタチン(例えば、ニペントNIPENT(登録商標));ピポブロマン(例えば、VERCYTE(登録商標));プリカマイシン/ミトラマイシン(例えば、MITHRACIN(登録商標));ポルフィマーナトリウム(例えば、フォトフリン(登録商標));プロカルバジン(例えば、マツラン(MATULANE)(登録商標));キナクリン(例えば、アタブリン(ATABRINE)(登録商標));ラスブリカーゼ(例えば、エリテック(ELITEK)(登録商標));リツキシマブ(例えば、リツキサン(登録商標));サルグラモスチム(例えば、プロカイン(PROKINE)(登録商標));ストレプトゾシン(例えば、ザノソール(ZANOSAR)(登録商標)); リンゴ酸スニチニブ(例えば、スーテント(登録商標));タルク(例えば、スクレロソール(SCLEROSOL)(登録商標));タモキシフェン(例えば、ノルバデックス(登録商標));テモゾロミド(例えば、テモダール(TEMODAR)(登録商標));テニポシド/VM−26(例えば、ブモン(VUMON)(登録商標));テストラクトン(例えば、テスラック(TESLAC)(登録商標));チオグアニンincl.6−TG;チオテパ(例えば、チオプレックス(THIOPLEX)(登録商標));トポテカン(例えば、ハイカムチン(登録商標));トレミフェン(例えば、フェアストン(登録商標));トシツモマブ(例えば、ベキサール(登録商標));トラスツズマブ(例えば、ヘルセプチン(登録商標));トレチノイン/ATRA(例えば、ベサノイド(登録商標));ウラシルマスタード;バルルビシン(例えば、バルスタール(VALSTAR)(登録商標));ビンブラスチン(例えば、ベルバン(VELBAN)(登録商標));ビンクリスチン(例えば、オンコビン(登録商標));ビノレルビン(例えば、ナベルビン(登録商標));およびゾレドロネート(例えば、ゾメタ(登録商標))が挙げられる。

例えば、例示的抗生物質として、それだけには限らないが、アミノグリコシド;アンフェニコール(Amphenicols);アンサマイシン;カルバセフェム(Carbacephems);カルバペネム;セファロスポリンまたはセフェム;セファマイシン;クラバム(Clavams);環状リポペプチド;ジアミノピリミジン;ケトライド;リンコサミド;マクロライド;モノバクタム;ニトロフラン;オキサセファム(Oxacephems);オキサゾリジノン;ペネム、チエナマイシンおよび種々のβ−ラクタム;ペニシリン;ポリペプチド抗生物質;キノロン;スルホンアミド;スルホン;テトラサイクリン;およびその他の抗生物質(例えば、クロホクトール、フシジン酸、ヘキセジン、メテナミン、ニトロフラントインニトロキソリン、リチペネム(Ritipenems)、タウロリジン、キシボモール(Xibomols))が挙げられる。

また、例示的治療薬の中には、血液凝固因子またはその他の抗血友病因子、抗阻害剤血液凝固薬複合体、アンチトロンビンIII、血液凝固因子V、血液凝固因子VIII、血液凝固因子IX、血漿タンパク質画分、フォンヴィルブランド因子などのその他の血液モディファイヤー;抗血小板薬(例えば、アブシキシマブ、アナグレリド、シロスタゾール、重硫酸クロピドグレル、ジピリダモール、エポプロステノール、エプチフィバチド、チロフィバンを含む;コロニー刺激因子(CSF)(例えば、顆粒球CSFおよび顆粒球マクロファージCSFを含む);赤血球新生刺激物質(例えば、ダルベポエチンアルファなどのエリスロポエチンを含む)およびエポエチンアルファ;止血剤およびアルブミン(例えば、アプロチニン、抗血友病因子および血漿、酢酸デスモプレシンおよびアルブミンの組み合わせを含む);免疫グロブリンならびにB型肝炎免疫グロブリン;トロンビン阻害剤(例えば、直接トロンビン阻害剤およびレピルジンを含む)およびドロトレコギンアルファ;抗凝固薬(例えば、ダルテパリン、エノキサパリンおよびその他のヘパリンおよびワーファリンを含む)も含まれる。

例示的抗体またはその他の治療薬として、それだけには限らないが、セツキシマブ(IMC−C225;アービタックス(登録商標));トラスツズマブ(ヘルセプチン(登録商標));リツキシマブ(リツキサン(登録商標);マブセラ(登録商標));ベバシズマブ(アバスチン(登録商標));アレムツズマブ(キャンパス(登録商標);キャンパス−1H(登録商標);マブキャンパス(登録商標));パニツムマブ(ABX−EGF;ベクティビックス(登録商標));ラニビズマブ(ルセンティス(登録商標));イブリツモマブ;イブリツモマブ・ティウキセタン(ゼバリン(登録商標));トシツモマブ;ヨウ素I 131トシツモマブ(ベキサール(登録商標));カツマキソマブ(レモバブ(登録商標));ゲムツズマブ;ゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ(登録商標));アバタセプト(CTLA4−Ig;オレンシア(登録商標));ベラタセプト(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA);イピリムマブ(MDX−010;MDX−101);トレメリムマブ(チシリムマブ;CP−675,206);PRS−010(例えば、US20090042785を参照のこと);PRS−050(US7585940;US20090305982);アフリベルセプト(VEGF Trap、AVE005;Holash et al., (2002) PNAS 99:11393-11398);ボロシキシマブ(M200);ボロシキシマブ(M200)のF200(キメラ(ヒト/ネズミ)IgG4 Fab断片);MORAb−009マウス/ヒトキメラIgG1(US20050054048);可溶性融合タンパク質:切断型シュードモナス外毒素Aと連結している抗メソテリンFv(SS1P(CAT−5001);US20070189962);シクスツムマブ(Cixutumumab)(IMC−A12);ニモツズマブ(Nimotuzumab)(h−R3)(Spicer(2005) Curr Opin Mol Ther 7:182-191);ザルツムマブ(HuMax−EGFR;Lammerts van Bueren et al. (2008) PNAS 105:6109-14);ネシツムマブIMC−11F8(Li et al. (2008) Structure 16:216-227);Sym004(Pedersen et al. 2010 Cancer Res 70:588-597);およびmAb−425も挙げられる。

特に、治療薬として、それだけには限らないが、免疫グロブリン、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−2a、インターフェロンアルファ−1、インターフェロンアルファ−n3、インターフェロンベータ−1、インターフェロンベータ−1a、インターフェロンガンマ−1b、Peg−インターフェロンアルファ−2およびペグインターフェロンアルファ−2b、インスリン、ビスホスフェート(例えば、パミドロネートまたはゾレドロネート)、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーマルおよびベバシズマブが挙げられる。

本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドとの同時投与および/または共製剤によって組み合され得るその他の例示的治療薬として、それだけには限らないが、アダリムマブ、アガルシダーゼベータ、アレファセプト、アンピシリン、アナキンラ、抗ポリオワクチン、抗胸腺細胞、アジスロマイシン、ベカプレルミン、カスポファンギン、セファゾリン、セフェピム、セフォテタン、セフタジジム、セフトリアキソン、セツキシマブ、シラスタチン、クラブラン酸、クリンダマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダクリズマブ、ジフテリア、ジフテリア抗毒素、ジフテリアトキソイド、エファリズマブ、エピネフリン、エリスロポエチンアルファ、エタネルセプト、フィルグラスチム、フルコナゾール、卵胞刺激ホルモン、フォリトロピンアルファ、フォリトロピンベータ、ホスフェニトイン、ガドジアミド、ガドペンテト酸、ガチフロキサシン、グラチラマー、GM−CSF、ゴセレリン、酢酸ゴセレリン、グラニセトロン、ヘモフィルスインフルエンザb菌、ハロペリドール、肝炎ワクチン、A型肝炎ワクチン、B型肝炎ワクチン、イブリツモマブチウキセタン、イブリツモマブ、チウキセタン、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、インフリキシマブ、インスリン、インスリングラルギン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−2a、インターフェロンアルファ−2b、インターフェロンアルファ−1、インターフェロンアルファ−n3、インターフェロンベータ、インターフェロンベータ−1a、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ−コンセンサス、イオジキサノール、イオヘキソール、イオパミドール、イオベルソール、ケトロラク、ラロニダーゼ、レボフロキサシン、リドカイン、リネゾリド、ロラゼパム、麻疹ワクチン、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹−ムンプス−風疹ウイルスワクチン、風疹ワクチン、メドロキシプロゲステロン、メロペネム、メチルプレドニゾロン、ミダゾラム、モルヒネ、オクトレオチド、オマリズマブ、オンダンセトロン、パリビズマブ、パントプラゾール、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグ−インターフェロンアルファ−2a、ペグ−インターフェロンアルファ−2b、ペグビソマント、百日咳ワクチン、ピペラシリン、肺炎球菌ワクチンおよび肺炎球菌コンジュゲートワクチン、プロメタジン、レテプラーゼ、ソマトロピン、スルバクタム、スマトリプタン、タゾバクタム、テネクテプラーゼ、テタヌス精製毒素、チカルシリン、トシツモマブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド、バンコマイシン、水痘帯状疱疹免疫グロブリン、水痘ワクチン、その他のワクチン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ヒ素、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)ワクチン、BCG生、ベキサロテン、ブレオマイシン、ブスルファン、静脈内ブスルファン、経口ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ポリフェプロサンを伴うカルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、シタラビンリポソーマル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノルビシン、ダウノマイシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーマル、プロピオン酸ドロモスタノロン、エリオットB溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エトポシド、エトポシドVP−16、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、5−フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、ロムスチン、CCNU、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、L−PAM、メルカプトプリン、6−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシン、マイトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ナンドロロンフェンプロピオネート、ノフェツモマブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ミトラマイシン、ポルフィマー、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、6−チオグアニン、トリエチレンチオホスホラミド(チオテパ)、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、レチノイン酸、アリトレチノイン、9−シス−レチノイン酸、アルボシジブ、アンバゾン、アンボマイシン、アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナキシロン、アンシタビン、アントラマイシン、アパジコン、アルギメスナ、アスペルリン、アトリムスチン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バノキサントロン、バタブリン、バチマスタット、ベナキシビン、ベンダムスチン、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビエタセルピン、ビリコダール、ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、ボルテゾミブ、ブレキナル、ブロピリミン、ブドチタン、カクチノマイシン、カネルチニブ、カラセミド、カルベチマー、カルボコン、カルモフール、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セマドチン、クロラムブシル、シオテロネル、シロレマイシン、クランフェヌル、クロファラビン、クリスナトール、デシタビン、デクスニグルジピン、デキソルマプラチン、デザグアニン、ジアジキオン、ジブロスピジウム、ジエノゲスト、ジナリン、ジセルモリド、ドフェキダル、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、デュアゾマイシン、エコムスチン、エダトレキサート、エドテカリン、エフロミチン(Eflomithines)、エラクリダール、エリナフィド、エルサミトルシン、エミテフール、エンロプラチン、エンプロメート、エンザスタウリン、エピプロピジン、エプタロプロスト、エルブロゾール、エソルビシン、エタニダゾール、エトグルシド、エトプリン、エクシスリンド、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フルオキシメステロン、フルオロシタビン、フォスキドン、フォストリエシン、ホトレタミン、ガラルビシン、ガロシタビン、ゲロキノール、ギマテカン、ギメラシル、グロキサゾン、グルフォスファミド、イルモホシン、イロマスタット、イメキソン、インプロスルファン、インジスラム、インプロクオン、インターロイキン、インターロイキン−2s、組換えインターロイキン、イントプリシン、ヨーベングアン、イプロプラチン、イルソグラジン、イクサベピロン、ケトトレキサート、L−アラノシン、ランレオチド、ラパチニブ、レドキサントロン、リュープロリド、リュープロレリン、レクサカルシトール、リアロゾール、ロバプラチン、ロメトレキソール、ロナファーニブ、ロソキサントロン、ルルトテカン、マホスファミド、マンノスルファン、マリマスタット、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メピチオスタン、メテシンド、メトミデート、メトプリン、メツレデパ、ミボプラチン、ミプロキシフェン、ミソニダゾール、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトフラキソン、ミトギリン、ミトグアゾン、ミトマルシン、ミトナフィド、ミトキドン、ミトスペル、ミトゾロミド、ミボブリン、ミゾリビン、モファロテン、モピダモール、ムブリチニブ、ミコフェノール酸、ネダプラチン、ネイザラビン、ネモルビシン、ニトラクリン、ノコダゾール、ノガラマイシン、ノラトレキセド、ノルトピキサントロン、オルマプラチン、オルタタキセル、オテラシル、オキシスラン、オキソフェナルシン、パツピロン、ペルデシン、ペリオマイシン、ペリトレキソール、ペメトレキセド、ペンタムスチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ペリフォシン、ピコプラチン、ピナフィド、ピポスルファン、ピルフェニドン、ピロキサントロン、ピクサントロン、プレビトレキセド、プロメスタン、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロパミジン、プロスピジウム、プミテパ、ピューロマイシン、ピラゾフリン、ラニムスチン、リボプリン、リトロスルファン、ログレチミド、ロキニメックス、ルフォクロモマイシン、サバルビシン、サフィンゴール、サトラプラチン、セブリプラチン、セムスチン、シムトラゼン、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、スパルフォセート、スパルフォス酸、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアラミン、ストレプトニグリン、ストレプトバリシン、スホスファミド、スロフェヌル、タセジナリン、タリソマイシン、タリムスチン、タリキダル、タウロムスチン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テロキシロン、チアミプリン(Thiamiprines)、チアミプリン(Tiamiprines)、チアゾフリン、チロミソール、チロロン、チムコダル、チモナシック、チラパザミン、トピクサントロン、トラベクテジン、エクチナサイジン743、トレストロン、トリシリビン、トリロスタン、トリメトレキサート、トリプラチンテトラニトレート、トリプトレリン、トロホスファミド、ツブロゾール、ウベニメクス、ウレデパ、バルスポダール、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンピジン、ビンフルニン、ビンホルミド、ビングリシネート、ビンロイシノール、ビンロイロシン、ビンロシジン、ビントリプトール、ビンゾリジン、ボロゾール、キサントマイシンA、グアメシクリン、ゼニプラチン、ジラスコルブ[2−H]、ジノスタチン、ゾルビシン、ゾスキダル、アセタゾラミド、アシクロビル、アジピオドン、アラトロフロキサシン、アルフェンタニル、アレルゲン性抽出物、アルファ1−プロテイナーゼ阻害剤、アルプロスタジル、アミカシン、アミノ酸、アミノカプロン酸、アミノフィリン、アミトリプチリン、アモバルビタール、アムリノン、鎮痛薬、抗ポリオワクチン、抗狂犬病血清、抗テタヌス免疫グロブリン、テタヌスワクチン、アンチトロンビンIII、抗毒素血清、アルガトロバン、アルギニン、アスコルビン酸、アテノロール、アトラクリウム、アトロピン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、アズトレオナム、バシトラシン、バクロフェン、バシリキシマブ、安息香酸、ベンズトロピン、ベタメタゾン、ビオチン、ビバリルジン、ボツリヌス抗毒素、ブレチリウム、ブメタニド、ブピバカイン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、カルシトニン、カルシトリオール、カルシウム、カプレオマイシン、カルボプロスト、カルニチン、セファマンドール、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフチゾキシム、セフロキシム、クロラムフェニコール、クロロプロカイン、クロロキン、クロロチアジド、クロルプロマジン、コンドロイチン硫酸、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、クロム、シドホビル、シメチジン、シプロフロキサシン、シサトラクリウム、クロニジン、コデイン、コルヒチン、コリスチン、コラーゲン、コルチコレリンオーバイントリフルテート、コルチコトロピン、コシントロピン、シアノコバラミン、シクロスポリン、システイン、ダクリキシマブ、ダルホプリスチン、ダルテパリン、ダナパロイド、ダントロレン、デフェロキサミン、デスモプレシン、デキサメタゾン、デクスメデト
ミジン、デクスパンテノール、デキストラン、鉄デキストラン、ジアトリゾ酸、ジアゼパム、ジアゾキシド、ジサイクロミン、ジギバインド、ジゴキシン、ジヒドロエルゴタミン、ジルチアゼム、ジフェンヒドラミン、ジピリダモール、ドブタミン、ドパミン、ドキサクリウム、ドキサプラム、ドキセルカルシフェロール、ドキシサイクリン、ドロペリドール、ジフィリン、エデト酸、エドロホニウム、エナラプリラート、エフェドリン、エポプロステノール、エルゴカルシフェロール、エルゴノビン、エルタペネム、エリスロマイシン、エスモロール、エストラジオール、エストロゲニック、エタクリン酸、エタノールアミン、エタノール、ヨード化ケシ油エチルエステル、エチドロン酸、エトミデート、第VIII因子、ファモチジン、フェノルドパム、フェンタニル、フルマゼニル、フルオレセイン、フルフェナジン、葉酸、フォメピゾール、ホミビルセン、フォンダパリヌクス、ホスカルネット、ホスフェニトイン、フロセミド、ガドテリドール、ガドベルセタミド、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、グルカゴン、グルコース、グリシン、グリコピロレート、ゴナドレリン、ゴナドトロピン絨毛性、ヘモフィルスB型多糖、ヘミン、ハーバル、ヒスタミン、ヒドララジン、ヒドロコルチゾン、ヒドロモルホン、ヒドロキソコバラミン、ヒドロキシジン、ヒヨスチアミン、イブチリド、イミグルセラーゼ、インジゴカルミン、インドメタシン、ヨウ化物、イオプロミド、イオタラム酸、イオキサグル酸、イオキシラン、イソニアジド、イソプロテレノール、日本脳炎ワクチン、カナマイシン、ケタミン、ラベタロール、レピルジン、レボブピバカイン、レボチロキシン、リンコマイシン、リオチロニン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、マンガホジピール、マンストール、髄膜炎菌多糖体ワクチン、メペリジン、メピバカイン、メソリダジン、メタラミノール、メサドン、メトカルバモール、メトヘキシタール、メチルドーペート、メチルエルゴノビン、メトクロプラミド、メトプロロール、メトロニダゾール、ミノサイクリン、ミバクリウム、モルルイック酸、モキシフロキサシン、ムロモナブ−CD3、ミコフェノール酸モフェチル、ナフシリン、ナルブフィン、ナルメフェン、ナロキソン、ネオスチグミン、ナイアシンアミド、ニカルジピン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ノルエピネフリン、オルフェナドリン、オキサシリン、オキシモルフォン、オキシテトラサイクリン、オキシトシン、パンクロニウム、パンテノール、パントテン酸、パパベリン、ペグインターフェロン−アルファ(例えば、インターフェロンアルファ2aまたは2b)、ペニシリンG、ペンタミジン、ペンタゾシン、ペントバルビタール、パーフルトレン、ペルフェナジン、フェノバルビタール、フェントラミン、フェニレフリン、フェニトイン、フィゾスチグミン、フィトナジオン、ポリミキシンb、プラリドキシム、プリロカイン、プロカインアミド、プロカイン、プロクロルペラジン、プロゲステロン、プロプラノロール、水酸化ピリドスチグミン、ピリドキシン、キニジン、キヌプリスチン、狂犬病免疫グロブリン、狂犬病ワクチン、ラニチジン、レミフェンタニル、リボフラビン、リファンピン、ロピバカイン、サマリウム、スコポラミン、セレン、セルモレリン、シンカリド、ソマトレム、スペクチノマイシン、ストレプトキナーゼ、ストレプトマイシン、スクシニルコリン、スフェンタニル、スルファメトキサゾール、タクロリムス、テルブタリン、テリパラチド、テストステロン、テタヌス抗毒素、テトラカイン、硫酸テトラデシル、テオフィリン、チアミン、チエチルペラジン、チオペンタール、甲状腺刺激ホルモン、チンザパリン、チロフィバン、トブラマイシン、トラゾリン、トルブタミド、トルセミド、トラネキサム酸、トレプロスチニル、トリフルオペラジン、トリメトベンズアミド、トリメトプリム、トロメタミン、ツベルクリン、腸チフスワクチン、ウロフォリトロピン、ウロキナーゼ、バルプロ酸、バソプレシン、ベクロニウム、ベラパミル、ボリコナゾール、ワーファリン、黄熱ワクチン、ジドブジン、亜鉛、塩酸ジプラシドン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アザセリン、6−アザウリジン、カルジノフィリン、クロモマイシン、デノプテリン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、エノシタビン、フロクスウリジン、オリボマイシン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プテロプテリン、テガフール、ツベルシジン、アルテプラーゼ、アルシツモマブ、ベバシズマブ、ボツリヌス毒素A型、ボツリヌス毒素B型、カプロマブペンデチド、ダクリズマブ、ドルナーゼアルファ、ドロトレコギンアルファ、イムシロマブペンテテート、およびヨウ素−131が挙げられる。

インスリンのデリバリー
本明細書において提供される方法は、速効型インスリンなどのインスリンの皮下デリバリーを増大するために、修飾PH20ポリペプチドおよびインスリンを同時投与する方法を含む。(例えば、米国特許第7,767,429号;同7,846,431号;米国公開番号US20090304665;米国出願番号第13/507,263号;同13/507,262号および同13/507,261号を参照のこと)。このような方法は、直接投与する方法および開および閉ポンプシステムを含むポンプおよび連続注入方法を含む。例えば、本明細書において提供された修飾PH20ヒアルロニダーゼとともに投与され得る例示的インスリンは、速効型インスリンまたはインスリン類似体である。例えば、同時投与されるインスリンとして、レギュラーインスリン、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジンまたはその他の同様の類似体変異体が挙げられる。例示的インスリンとは、配列番号862に示されるA鎖および配列番号863に示されるB鎖を含有するインスリンまたは配列番号862および863(AおよびB鎖)に示されるヒトインスリンと比較して1つまたは複数のアミノ酸修飾を含有する変異体である。例えば、例示的インスリン類似体は、当業者に公知であり、それだけには限らないが、配列番号862(A鎖)に示され、配列番号865〜867のいずれかに示されるB鎖を有するものが挙げられる。

共製剤は、インスリンを用いる治療を受け入れられる任意の状態を治療するために皮下投与され得る。治療的使用は、それだけには限らないが、1型真性糖尿病、2型真性糖尿病、妊娠糖尿病の治療および危篤状態の患者における血糖コントロールのための治療を含む。例えば、速効型インスリンおよびヒアルロナン分解酵素の共製剤は、血糖コントロールを達成するために、糖尿病を有する対象における食事のインスリン療法として、食事の前にシリンジまたはインスリンペンなどによって、別個の用量で皮下投与され得る。共製剤はまた、昼夜を通じて血糖レベルを継続的にコントロールするために、および/または食事後血糖変動をコントロールするために、インスリンポンプを使用して、または閉ループシステムに関連して投与され得る。このような疾患または状態を同定することは、治療医師の技術の範囲内である。

速効型インスリンが示されるか、使用されてきた、その他の薬剤および治療が利用可能である、上記で例示されたものすべてを含めた任意の疾患または状態について、共製剤が、それと組み合わせて使用され得る。治療される疾患または状態に応じて、例示的組み合わせとして、それだけには限らないが、抗糖尿病薬、例えば、それだけには限らないが、スルホンル尿素、ビグアナイド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、αグルコシダーゼ阻害剤、グルカゴン様ペプチド(GLP)類似体を含めたペプチド類似体および胃抑制ペプチド(GIP)類似体およびDPP−4阻害剤との組み合わせが挙げられる。別の例では、速効型インスリンおよび本明細書において記載された修飾PH20ポリペプチドの共製剤は、1種または複数種の、速効型インスリンおよび基礎作用インスリンを含めたその他のインスリンと組み合わせて、その前に、それと断続的に、またはその後に、投与され得る。

2.ヒアルロナン関連疾患および状態(例えば、腫瘍)の方法
特に、PH20ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン関連疾患または状態を治療するために使用され得る。一般に、ヒアルロナン関連疾患および状態は、対照、例えば、別の組織、細胞または体液と比較した、組織、細胞または体液(例えば、腫瘍組織または腫瘍関連組織、血液または間質性空間)におけるヒアルロナン発現の上昇と関連している。ヒアルロナン発現の上昇は、正常組織、細胞または体液、例えば、試験されているサンプルと類似しているが、正常である(すなわち、疾患もしくは状態を有さないか、または対象が試験されている疾患もしくは状態の種類を有さない)対象、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態を有さない対象などの異なる対象から単離された組織、細胞または体液と比較して上昇され得る。ヒアルロナン発現の上昇は、同様の疾患または状態を有するが、その疾患が重篤ではない、および/またはヒアルロナン関連ではない、または比較的少ないヒアルロナンを発現し、したがって、少ない程度にヒアルロナンと関連している別の対象から得た類似の組織と比較して上昇され得る。例えば、試験されている対象は、ヒアルロナン関連癌を有する対象であり得、これでは、組織、細胞または流体中のHA量が、あまり重篤ではない癌、例えば、早期の、分化した、またはその他の種類の癌を有する対象と比較して比較的に高い。別の例では、細胞、組織または流体は、比較的低いレベルのHAを発現するとわかっているサンプル、例えば、腫瘍細胞株などの、既知量または相対量のHAを有する、流体、組織、抽出物(例えば、細胞抽出物または核抽出物)、核酸またはペプチド調製物、細胞株、生検、標準またはその他のサンプル、例えば、低レベルのHAを発現する、本明細書において記載された例示的腫瘍細胞株、例えば、HCT116細胞株、HT29細胞株、NCI H460細胞株、DU145細胞株、Capan−1細胞株およびこのような細胞株を使用して作製された腫瘍モデルから得た腫瘍などの対照サンプルと比較して上昇したレベルのヒアルロナンを含有する。

ヒアルロナン関連疾患および状態は、高い間質液圧、例えば、椎間板圧、増殖性障害と関連しているもの、例えば、癌および良性前立腺肥大および浮腫を含む。浮腫は、例えば、臓器移植、卒中または脳外傷に起因し得るか、そこで現れ得る。増殖性障害として、それだけには限らないが、癌、平滑筋細胞増殖、全身性硬化症、肝臓の硬変、成人性呼吸窮迫症候群、特発性心筋症、紅斑性狼瘡、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症またはその他の網膜症、心肥大(cardiac hyperplasia)、生殖器系関連障害、例えば、良性前立腺肥大(BPH)および卵巣嚢胞、肺線維症、子宮内膜症、線維腫症、過誤腫、リンパ管筋腫症、サルコイドーシス、デスモイド腫瘍が挙げられる。癌として、固形腫瘍およびリンパ/血液腫瘍および転移性疾患および未分化腫瘍が挙げられる。治療を受け入れられる腫瘍は、通常、同一組織種の非癌性組織と比較して、または同一腫瘍種の非転移性腫瘍と比較して、ヒアルロナンの細胞性および/または間質性の発現を示す。癌は、卵巣癌、上皮内癌(in situ carcinoma)、扁平上皮癌(SCC)、前立腺癌、膵臓癌、その他の胃癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳癌および結腸癌を含む。

本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチド、そのPEG化形態などを使用して、腫瘍を治療できる。したがって、ヒアルロニダーゼはまた、その間接的な抗癌薬効果に加えて、直接的な抗癌効果を有する。ヒアルロニダーゼは、マウスに移植された腫瘍の増殖を妨げ(De Maeyer et al., 1992, Int. J. Cancer 51:657-660)、発癌物質に曝露された際に腫瘍形成を阻害する(Pawlowski et al., 1979, Int. J. Cancer 23:105-109; Haberman et al., 1981, Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Washington, D.C., 22:105, abstract no. 415)。PH20ヒアルロニダーゼは、種々の腫瘍を治療するとわかっている(例えば、米国公開番号US2010/0003238および米国公開番号US20120020951として公開された米国出願番号第13/135,817号)。

ヒアルロナンリッチな癌は、癌細胞がHALOを産生する癌、ヒアルロナンの上昇した発現を有する(免疫染色、例えば、腫瘍から得た切片の組織学的染色によって決定されるような)癌、上昇したHAS2(ヒアルロナンシンターゼ2)を有する癌、インビトロでヒアルロニダーゼ(HYAL1)を産生しない癌であり得る。ヒアルロナンリッチな癌は、ヒアルロナン発現を評価する任意の方法およびタンパク質/mRNA発現をアッセイするためのその他の公知の方法によって同定され得る。

いくつかのヒアルロナンリッチな癌が同定されている。いくつかの場合には、ヒアルロナン発現は、予後不良、例えば、生存率の低下および/または再発のない生存率、血管新生、その他の組織/領域への癌細胞浸潤、予後不良のその他の指標と相関がある。このような相関は、例えば、卵巣癌、SCC、ISC、前立腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)を含めた肺癌、乳癌、結腸癌および膵臓癌を含めたヒアルロナンリッチな腫瘍において観察された(例えば、Anttila et al, Cancer Research, 60:150-155 (2000); Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003); Lipponen et al., Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001); Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95: 12-17 (2001); Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000); Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)を参照のこと)。したがって、ヒアルロナンリッチな癌は、癌の1種または複数種の症状を治療するための、可溶性PH20などのヒアルロニダーゼの投与によって治療され得る。ヒアルロナン−リッチな腫瘍として、それだけには限らないが、前立腺、乳房、結腸、卵巣、胃、頭頸部のものおよびその他の腫瘍および癌が挙げられる。

過剰のグリコサミノグリカンと関連しており、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドを用いて治療され得る、その他のヒアルロナン関連疾患または状態として、それだけには限らないが、心血管疾患(例えば、虚血後再潅流;動脈硬化症における);硝子体切除術および眼部障害および状態(例えば、眼の硝子体液液化する;術後圧を低減する方法における;緑内障、硝子体および網膜手術などのその他の眼の手術における、角膜移植における);皮下点滴療法における(すなわち、皮膚の皮下組織への流体および電解質の注入);美容的適用(例えば、セルライト、「ピッグスキン」浮腫または「オレンジピール」浮腫の治療における);臓器移植(例えば、臓器の移植と関連する間質浮腫と関連する);肺の疾患が挙げられる。

3.その他の使用
その治療的使用のさらなる例では、本明細書において提供される修飾PH20ポリペプチドは、ビンカアルカロイドなどの壊死性物質の静脈傍注射からの局所壊死の解毒薬(Few et al. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12、23-26)、神経節嚢胞の治療(Paul et al. (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219-21)および静脈不全による組織壊死の治療(Elder et al. (1980) Lancet 648-649)のような目的で使用され得る。修飾PH20ポリペプチドはまた、手の最もよくある軟部組織塊であり、皮膚の下に感じることができる流体が詰まった嚢である、神経節嚢胞(手首嚢胞、聖書嚢胞または背側腱嚢胞としても知られる)を治療するために使用され得る。

修飾PH20ポリペプチドは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)を分解することによって脊髄損傷の治療において使用され得る。脊髄損傷後に、CSPGを含有する神経膠瘢痕が、星状細胞によって産生される。CSPGは、軸索成長の阻害において重大な役割を果たす。さらに、CSPGの発現は、中枢神経系(CNS)の損傷後に増大するとわかっている。可溶性PH20はまた、化学的髄核融解術として知られるプロセスにおける椎間板ヘルニアの治療に利用され得る。コンドロイチナーゼABC、ヒアルロニダーゼと同様の基質を切断する酵素は、腰椎中の椎間板内圧の低下を誘導し得る。3種の椎間板損傷がある。突出した椎間板は、無傷であるが、隆起しているものである。押し出された椎間板では、線維輪(fibrous wrapper)は断裂を有し、NPが漏出しているが、まだ椎間板とつながっている。隔絶された椎間板では、NPの断片が壊れて椎間板から離れており、脊柱管中で自由になっている。化学的髄核融解術は、通常、突出した、押し出された椎間板に対して有効であるが、隔絶された椎間板損傷に対しては有効でない。

4.避妊
本明細書において提供された修飾PH20ポリペプチドは、避妊薬適用においてワクチンとして使用され得る。PH20は、男性生殖器系に存在し、精巣および精巣上体の両方において発現され、精子中に存在する。PH20は、未授精卵の周囲の卵丘層を通る精子の侵入を容易にすることによって受精において役割を果たす。PH20はまた、受精の初期相の間に透明帯上のヒアルロン酸(HA)と結合できる。この結合はまた、先体反応に役立つ細胞内シグナル伝達を開始する。PH20を用いる免疫化は、雄のモルモットにおいて有効な避妊薬であるとわかっている(Primakoff et al. (1988) Nature 335:543-546, Tung et al. (1997) Biol. Reprod. 56:1133-1141)。精子および卵子の結合を妨げる抗PH20抗体の生成のために、雌のモルモットにおいても有効な避妊薬であるとわかっている。本明細書における例では、修飾PH20ポリペプチドは、節C.2に記載される任意のものなど不活性の酵素であり得る。ポリペプチドは、直接的に投与される場合も、抗原を送達するための組換えウイルスとして投与される場合もある。

I.実施例
以下の実施例は、単に例示目的で含まれており、本発明の範囲を制限しようとするものではない。

実施例1
組換えヒトPH20ヒアルロニダーゼ(rHuPH20)の作製
A.可溶性rHuPH20を発現する細胞株の作製
公開された米国公開番号US20110053247に記載されるように、rHuPH20と名付けられた組換えヒトPH20ヒアルロニダーゼを作製した。手短には、pCI−PH20−IRES−DHFR−SV40pa(HZ24)プラスミド(配列番号5に示される)を使用して、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)をトランスフェクトした(例えば、米国特許第7,767,429号および同7,781,607号米国公開第2006−0104968号を参照のこと)。可溶性rHuPH20の発現のためのHZ24プラスミドベクターは、pCIベクター骨格(Promega)、ヒトPH20ヒアルロニダーゼ(配列番号2)のアミノ酸1〜482をコードするDNA、ECMVウイルス由来の配列内リボソーム進入部位(IRES)(Clontech)およびマウスジヒドロホレートレダクターゼ(DHFR)遺伝子を含有していた。pCIベクター骨格はまた、Β−ラクタマーゼ耐性遺伝子(AmpR)をコードするDNA、f1複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー/プロモーター領域(CMV)、キメライントロンおよびSV40後期ポリアデニル化シグナル(SV40)を含む。可溶性rHuPH20コンストラクトをコードするDNAは、ヒトPH20の天然の35アミノ酸シグナル配列のアミノ酸位置1のメチオニンをコードするDNAの前にNheI部位およびKozakコンセンサス配列、停止コドンとそれに続く、配列番号2に示されるヒトPH20ヒアルロニダーゼのアミノ酸位置482に対応するチロシンをコードするDNAと、それに続く、BamHI制限部位を含有する。

4mMグルタミンおよび18mL/L Plurionic F68/L(Gibco)を補給した、DHFR(−)細胞のためのGIBCO修飾CD−CHO培地で増殖しているトランスフェクトされたDG44 CHO細胞を、0.5×10個細胞/mLで、トランスフェクションのための準備したシェーカーフラスコ中に播種した。細胞を、120rpmで振盪しながら、加湿インキュベーター中5% CO中、37℃で増殖させた。指数関数的に増殖するトランスフェクトされていないDG44 CHO細胞を、トランスフェクション前の生存力について試験した。

トランスフェクトされていないDG44 CHO細胞培養物の6000万個の生存細胞をペレットにし、2×トランスフェクションバッファー(2×HeBS:40mM Hepes、pH7.0、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM NaHPO、12mMデキストロース)0.7mL中、2×10個細胞の密度に再懸濁した。再懸濁された各アリコートに、直鎖HZ24プラスミド(Cla Iでの一晩消化によって直線化された(New England Biolabs)0.09mL(250μg)を加え、室温で、細胞/DNA溶液を、0.4cm gap BTX(Gentronics)エレクトロポレーションキュベット中に移した。陰性対照エレクトロポレーションは、細胞と混合されるプラスミドDNAを用いずに実施した。細胞/プラスミド混合物を、330Vおよび960μFまたは350Vおよび960μFのコンデンサ放電を用いてエレクトロポレーションした。

エレクトロポレーション後に細胞をキュベットから回収し、4mMグルタミンおよび18mL/Lプルリオニック(Plurionic)F68/L(Gibco)を補給した、DHFR(−)細胞のための修飾CD−CHO培地5mL中に移し、6ウェル組織培養プレートのウェル中で、選択せずに2日間、加湿インキュベーター中5% CO中、37℃で増殖させた。

エレクトロポレーションの2日後、各ウェルから0.5mLの組織培養培地を採取し、実施例8に記載されたマイクロ濁度アッセイを使用してヒアルロニダーゼ活性の存在について試験した。結果は、表6に示されている。

トランスフェクション2(350V)から得られた細胞を、組織培養ウェルから集め、カウントし、mLあたり1×10〜2×10個生存細胞に希釈した。細胞懸濁液の0.1mLアリコートを、5つの96ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移した。4mM GlutaMAX(商標)−1栄養補助剤(GIBCO(商標)、Invitrogen Corporation)を含有し、ヒポキサンチンおよびチミジン栄養補助剤を含まない、100マイクロリットルのCD−CHO培地(GIBCO)を、細胞を含有するウェルに加えた(最終容量0.2mL)。5枚のプレートから10のクローンを同定し、メトトレキサートを含まずに増殖させた(表7)。

6つのHZ24クローンを培養で増やし、単細胞懸濁液としてシェーカーフラスコに移した。クローン3D3、3E5、2G8、2D9、1E11および4D10を、最上部の左側のウェルで5000個細胞で出発し、細胞を下に1:2希釈し、横に1:3希釈する2次元無限希釈戦略を使用して96ウェル丸底組織培養プレート中にプレーティングした。希釈したクローンを、ウェルあたり500個のトランスフェクトされていないDG44 CHO細胞バックグラウンドで増殖させ、培養の初日に必要な増殖因子を提供した。サブクローンあたり10枚のプレートを作製し、5枚のプレートが50nMメトトレキサートを含有しており、5枚のプレートがメトトレキサートを含んでいなかった。

クローン3D3から、24の視覚的サブクローンが得られた(13が、メトトレキサート不含処理から、11が50nMメトトレキサート治療から)。24のサブクローンのうち8から、上清において相当なヒアルロニダーゼ活性が測定された(>50単位/mL)、これら8つのサブクローンをT−25組織培養フラスコ中で増やした。メトトレキサート処理プロトコールから単離されたクローンを、50nMメトトレキサートの存在下で増やした。クローン3D35Mを、500nMメトトレキサートでさらに増やし、シェーカーフラスコ中、1,000単位/mLを超えるヒアルロニダーゼ活性をもたらすクローンを生じさせた(クローン3D35M;またはGen1 3D35M)。次いで、3D35M細胞のマスター細胞バンク(MCB)を調製した。

B.可溶性ヒトPH20(rHuPH20)を含有するGen2細胞の産生
実施例1.Aに記載されたGen1 3D35M細胞株を、より高いメトトレキサートレベルに適応させ、世代2(Gen2)クローンが得られた。3D35M細胞を、4mM GlutaMAX−1(商標)および1.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO 培地中の確立されたメトトレキサート含有培養物から播種した。細胞を、加湿インキュベーター中7% CO中、37℃で増殖させ、46日の期間にわたって9回継代することによって、より高いメトトレキサートレベルに適応させた。細胞の増幅させた集団を、2.0μMメトトレキサートを有する培地を含有する96ウェル組織培養プレートにおける制限希釈によってクローニングした。およそ4週間後、クローンを同定し、増やすためにクローン3E10Bを選択した。3E10B細胞を、4mM GlutaMAX−1(商標)および2.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO培地で、20継代間増殖させた。3E10B細胞株のマスター細胞バンク(MCB)を作製し、凍結し、その後の研究に使用した。

細胞株の増幅は、3E10B細胞を、4mM GlutaMAX−1(商標)および4.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO培地で培養することによって継続した。12回継代した後、研究細胞バンク(RCB)として細胞をバイアル中で凍結した。RCBの1つのバイアルを解凍し、8.0μMメトトレキサートを含有する培地で培養した。5日後、培地中のメトトレキサート濃度を16.0μMに増大させ、次いで、18日後に20.0μMに増大した。20.0μMメトトレキサートを含有する培地での8回目の継代から得た細胞を、4mM GlutaMAX−1(商標)および20.0μMメトトレキサートを含有するCD CHO培地を含有する96ウェル組織培養プレートにおける制限希釈によってクローニングした。5〜6週間後にクローンを同定し、20.0μMメトトレキサートを含有する培地で増やすためにクローン2B2を選択した。11回目の継代後、研究細胞バンク(RCB)として2B2細胞をバイアル中で凍結した。

得られた2B2細胞は、可溶性組換えヒトPH20(rHuPH20)を発現する、ジヒドロホレートレダクターゼに欠陥のある(dhfr−)DG44 CHO細胞である。可溶性PH20は、およそ206コピー/細胞のコピー数で2B2細胞中に存在する。rHuPH20特異的プローブを使用する、Spe I−、Xba I−およびBamH I/Hind III消化されたゲノム2B2細胞DNAのサザンブロット解析によって、以下の制限消化プロフィールが示された:Spe Iで消化されたDNAを用いて、約7.7kbの1つの主要な加水分解バンドおよび4つの微量の加水分解バンド(約13.9、約6.6、約5.7および約4.6kb);Xba Iで消化されたDNAを用いて、約5.0kbの1つの主要な加水分解バンドおよび2つの微量の加水分解バンド(約13.9および約6.5kb);およびBamH I/Hind IIIを用いて消化された2B2 DNAを使用して観察された、約1.4の1つの単一加水分解バンド。

C.300Lバイオリアクター細胞培養における、Gen2可溶性rHuPH20の産生
HZ24−2B2のバイアルを解凍し、20μMメトトレキサートおよびGlutaMAX−1(商標)(Invitrogen)を補給したCD−CHO培地(Invitrogen、Carlsbad、CA)中で、シェーカーフラスコから36Lスピナーフラスコを通して増やした。手短には、細胞のバイアルを、37℃の水浴中で解凍し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を、20mLの新鮮培地を有する125mLの振盪フラスコ中に再懸濁し、37℃、7% COインキュベーター中に入れた。細胞を125mL振盪フラスコ中で最大40mLに増やした。細胞密度が、1.5×10個細胞/mL超に達した時点で、培養物を、125mLスピナーフラスコ中の100mL培養容量で増やした。フラスコを、37℃、7% COでインキュベートした。細胞密度が1.5×100個細胞/mL超に達した時点で、培養物を、250mLスピナーフラスコ中の200mL培養容量で増やした。フラスコを、37℃、7% COでインキュベートした。細胞密度が、1.5×10個細胞/mL超に達した時点で、培養物を、1Lスピナーフラスコ中の800mL培養容量で増やし、37℃、7% COでインキュベートした。細胞密度が、1.5×10個細胞/mL超に達した時点で、培養物を、6Lスピナーフラスコ中の5000mL培養容量で増やし、37℃、7% COでインキュベートした。細胞密度が、1.5×10個細胞/mL超に達した時点で、培養物を、36Lスピナーフラスコ中の32L培養容量で増やし、37℃、7% COでインキュベートした。

400Lのリアクターを滅菌し、230mLのCD−CHO培地を加えた。使用する前に、リアクターを、汚染についてチェックした。36Lのスピナーフラスコから400Lのバイオリアクター(Braun)におよそ30Lの細胞を、mLあたり4.0×10個生存細胞の播種密度および260Lの総容量で移した。パラメータは:温度設定、37℃;Impeller Speed 40−55 RPM;容器圧:3psi;空気スパージ 0.5〜1.5L/Min.;空気オーバーレイ:3L/分であった。リアクターを、細胞数、pH確認、培地分析、タンパク質産生および保持時間について毎日サンプリングした。また実施の間に、栄養供給物を加えた。120時間(5日目)で、10.4Lの供給物1培地(4× CD−CHO+33g/L グルコース+160mL/L Glutamax−1(商標)+83mL/L Yeastolate+33mg/L rHuインスリン)を加えた。168時間(7日目)で、10.8Lの供給物2(2× CD−CHO+33g/Lグルコース+80mL/L Glutamax−1(商標)+167mL/L Yeastolate+0.92g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を36.5℃変更した。216時間(9日目)で、10.8Lの供給物3(1×CD−CHO+50g/L+グルコース+50mL/L Glutamax−1(商標)+250mL/L Yeastolate+1.80g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を36℃に変更した。264時間(11日目)に、10.8Lの供給物4(1×CD−CHO+33g/Lグルコース+33mL/L Glutamax−1(商標)+250mL/L Yeastolate+0.92g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を35.5℃に変更した。供給培地の添加が産生の最終段階で可溶性rHuPH20の産生を著しく増強することが観察された。14もしくは15日で、または細胞の生存力が40%未満に低下した時点で、リアクターを回収した。このプロセスの結果、mLあたり17,000単位の最終生産性が得られ、1200万個細胞/mLの最大細胞密度を有していた。回収時に、培養物を、透過型電子顕微鏡(TEM)および酵素活性によって、インビトロおよびインビボで、マイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシンおよびウイルスについてサンプリングした。

培養物は、蠕動ポンプによって、各々4〜8μmに段階づけされた珪藻土の層および1.4〜1.1μmに段階づけされた珪藻土の層と、それに続く、セルロースメンブレンを含有する、並行した、4つのMillistak濾過システムモジュール(Millipore)を通って、次いで、0.4〜0.11μmに段階づけされた珪藻土の層および<0.1μmに段階づけされた珪藻土の層と、それに続く、セルロースメンブレンを含有する第2の単一Millistak 濾過システム(Millipore)を通って、次いで、0.22μmの最終フィルターを通って、350Lの用量を有する滅菌単回使用フレキシブルバッグに、ポンプで送った。回収された細胞培養液に、10mM EDTAおよび10mM Trisを補給し、7.5のpHとした。4つのSartoslice TFF 30kDa分子量カットオフ(MWCO)ポリエーテルスルホン(PES)フィルター(Sartorious)を用いる、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)装置を用いて、培養物を10×濃縮し、それに続いて、10mM Tris、20mM NaSO、pH7.5を用いて10×バッファー交換、0.22μm最終フィルターに入れ、50L滅菌保存バッグ中に入れた。

濃縮され、ダイアフィルトレーションされた回収物をウイルスについて不活化した。ウイルス不活性化の前に、10% Triton(登録商標)X−100、3% トリ(n−ブチル)ホスフェート(TNBP)の溶液を調製した。濃縮され、ダイアフィルトレーションされた回収物を、36Lガラス反応容器中で1% Triton(登録商標)X−100、0.3% TNBPに1時間曝露し、直後に、Qカラムで精製した。

D.Gen2 可溶性rHuPH20の精製
Qセファロース(Pharmacia)イオン交換カラム(9L樹脂、H=29cm、D=20cm)を調製した。pH、伝導率およびエンドトキシン(LALアッセイ)を決定するために、洗浄サンプルを集めた。5カラム容積の10mM Tris、20mM NaSO、pH7.5を用いてカラムを平衡化した。ウイルス不活性化後、濃縮され、ダイアフィルトレーションされた回収物を、100cm/時間の流速でQカラムにロードした。カラムを、5カラム容積の10mM Tris、20mM NaSO、pH7.5および10mM Hepes、50mM NaCl、pH7.0を用いて洗浄した。10mM Hepes、400mM NaCl、pH7.0を用いて、滅菌バッグ中の0.22μm最終フィルター中にタンパク質を溶出した。溶出液サンプルをバイオバーデン、タンパク質濃度およびヒアルロニダーゼ活性について試験した。A280吸光度読み取り値を、交換の最初と最後にとった。

フェニル−セファロース(Pharmacia)疎水性相互作用クロマトグラフィーを次いで実施した。フェニル−セファロース(PS)カラム(19−21L樹脂、H=29cm、D=30m)を調製した。洗浄物を回収し、pH、伝導率およびエンドトキシン(LALアッセイ)のためにサンプリングした。5カラム容積の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、0.1mM CaCl、pH7.0を用いて、カラムを平衡化した。Qセファロースカラムからのタンパク質溶出液に、2M硫酸アンモニウム、1Mリン酸カリウムおよび1M CaCl保存溶液を補給し、それぞれ、5mM、0.5Mおよび0.1mMの終濃度とした。タンパク質を、100cm/時間の流速でPSカラムにロードし、カラムフロースルーを集めた。カラムを、100cm/時間で、5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウムおよび0.1mM CaCl pH7.0を用いて洗浄し、洗浄物を、集められたフロースルーに加えた。カラム洗浄物と合わされたフロースルーを、0.22μm最終フィルターに通して、滅菌バッグ中に入れた。フロースルーを、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性についてサンプリングした。

アミノフェニルボロネートカラム(Prometics)を調製した。洗浄物を集め、pH、伝導率およびエンドトキシン(LALアッセイ)についてサンプリングした。5カラム容積の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウムを用いてカラムを平衡化した。精製タンパク質を含有するPSフロースルーを、アミノフェニルボロネートカラムに100cm/時間の流速でロードした。5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH7.0を用いてカラムを洗浄した。カラムを20mMビシン、0.5M硫酸アンモニウム、pH9.0を用いて洗浄した。カラムを、20mMビシン、100mM 塩化ナトリウム、pH9.0を用いて洗浄した。タンパク質を50mM Hepes、100mM NaCl、pH6.9を用いて溶出し、滅菌フィルターを通して、滅菌バッグ中に入れた。溶出したサンプルは、バイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。

ヒドロキシアパタイト(HAP)カラム(Biorad)を調製した。洗浄物を集め、pH、伝導率およびエンドトキシン(LALアッセイ)について試験する。カラムを5mMリン酸カリウム、100mM NaCl、0.1mM CaCl、pH7.0を用いて平衡化した。アミノフェニルボロネート精製タンパク質を、5mMリン酸カリウムおよび0.1mM CaClの終濃度に補い、100cm/時間の流速でHAPカラムにロードした。カラムを、5mMリン酸カリウム、pH7、100mM NaCl、0.1mM CaClを用いて洗浄した。次いで、カラムを、10mMリン酸カリウム、pH7、100mM NaCl、0.1mM CaClを用いて洗浄した。タンパク質を、70mMリン酸カリウム、pH7.0を用いて溶出し、0.22μmの滅菌フィルターを通して、滅菌バッグに入れた。溶出されたサンプルをバイオバーデン、タンパク質濃度および酵素活性について試験した。

次いで、HAP精製したタンパク質をウイルス除去フィルターに通した。滅菌2Lの70mMリン酸カリウム、pH7.0を用いて洗浄することによって、Viosartフィルター(Sartorius)をまず調製した。使用前に、pHおよび伝導率のために濾過されたバッファーをサンプリングした。HAP精製したタンパク質を、蠕動ポンプによって、ウイルス除去フィルターを通してポンプで送った。70mMリン酸カリウム、pH7.0で濾過されたタンパク質を0.22μmの最終フィルターに通して、滅菌バッグ中に入れた。濾過されたサンプルを、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸プロフィーリングについて試験した。サンプルはまた、不純物と関連するプロセスについて試験した。

次いで、濾液中のタンパク質を、10kDa分子量カットオフ(MWCO)Sartocon Sliceタンジェンシャルフロー濾過(TFF)システム(Sartorius)を使用して10mg/mLに濃縮した。フィルターを、10mMヒスチジン、130mM NaCl、pH6.0を用いて洗浄することによってまず調製した。透過物を、pHおよび伝導率についてサンプリングした。濃縮後、濃縮されたタンパク質をサンプリングしタンパク質濃度および酵素活性について試験した。濃縮されたタンパク質で6×バッファー交換を実施し、最終バッファー:10mMヒスチジン、130mM NaCl、pH6.0とした。バッファー交換後、濃縮されたタンパク質を、0.22μmフィルターに通して、20L滅菌保存バッグ中に入れた。タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフィドリル基、オリゴ糖プロファイリングおよび浸透圧について試験した。ロット番号WRS2を、以下に記載されるアッセイにおいて標準として使用した。結果は、外観についての試験説明は、透明で、無色であり:pHは、7.4であり;エンドトキシンレベルは<0.01EU/mLであり;浸透圧は、30mOsm/Kgであり;密度が1.005g/mLであり;rHuPH20含量は、1.3ppmであり;ヒアルロニダーゼ活性は、145USP U/mLであったと示した。

滅菌濾過されたバルクタンパク質を、20mLで30mL滅菌テフロン(登録商標)バイアル(Nalgene)中に無菌的に(asceptically)分配した。次いで、バイアルを瞬間凍結し、−20±5℃で保存した。

実施例2
PH20変異株ライブラリーの作製
A.クローニングおよび突然変異誘発
この実施例では、ヒトPH20をコードするDNAを、プラスミドにクローニングし、続いて、トランスフェクションし、タンパク質を発現させることによって、ヒトヒアルロニダーゼPH20ライブラリーを作製した。
ライブラリーは、Ig κリーダー配列を含まない、PH20のコドン最適化されたものであるPH20鋳型の突然変異誘発によって作製した。具体的には、変異体のライブラリーを作製するために、HZ24−PH20(OHO)−IRES−SEAP発現ベクター(配列番号4に示される)を鋳型として使用し、これは、配列番号1に示されるPH20をコードするヌクレオチドの配列を含有し、配列番号2に示される前駆体PH20またはIgKシグナル配列に対応する残基1〜22を欠く配列番号3に示される成熟PH20をコードする。ベクター骨格は、DHFR選択マーカーを含有する元のHZ24ベクターから導き(実施例1および配列番号5を参照のこと)、IgKリーダー配列を加え、コドン最適化を行った。発現ベクターはまた、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の遺伝子を含有するよう修飾された。したがって、HZ24−PH20(OHO)−IRES−SEAP発現ベクターは、PH20をコードする配列に加えて、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の遺伝子のコード配列と連結している配列内リボソーム進入部位(EMCV IRES)およびコンストラクトにおいてPH20およびSEAPの発現を駆動する単一CMVプロモーターも含有する。また、アンピシリン耐性のための遺伝子も含有する。配列番号4に示されるヌクレオチドに関連して、PH20をコードするヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド1058から2464に対応し(IgKリーダー配列を含む)、SEAPをコードするヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド2970〜4529に対応し、アンピシリン耐性遺伝子は、ヌクレオチド5778〜6635に対応する。

第1のライブラリーは、配列番号2の残基23〜469(配列番号3の残基1〜447または配列番号6の残基36〜482に対応する)の各々が、約15種のアミノ酸残基のうち1種に変更され、その結果、各メンバーが単一のアミノ変更を含有する、コードされる変異体タンパク質が生じるよう作製した。得られたライブラリーは、各々が、配列番号2の残基23〜469(配列番号3の残基1〜447または配列番号6表の残基36〜482に対応する)と比較して、単一のアミノ酸突然変異を含有する、6753の変異体メンバーを含有する。得られたライブラリーのグリセロールストックを、調製し、−80℃で保存した。各メンバー中のアミノ酸置換(mut)が、以下の表8に列挙されており、配列番号3(PH20の成熟した配列またはその他のC末端で切断された断片である、配列番号7または32〜66)に示されるPH20のアミノ酸の配列に関連してアミノ酸置換に対応する。ライブラリー中の各PH20変異体の対応する突然変異されたコドン(cod)もまた、表8に列挙されており、配列番号4の1058〜2464として示されるPH20の対応するコーディングヌクレオチド中のヌクレオチド残基変更にも対応する。各メンバーは、以下に記載されるようにヒアルロニダーゼ(hyaluoridase)活性について表され、スクリーニングされた。

























2.発現
各変異株の発現のために、変異体PH20の1種をコードするか、または野生型PH20をコードするcDNAを含有するHZ24−PH20−IRES−SEAPプラスミドDNAを、リポフェクタミン2000(Invitrogen、カタログ番号11668−027)を、製造業者によって示唆されるプロトコールに従って使用して、単層CHO−S細胞(invitrogen、カタログ番号11619−012)にトランスフェクトした。CHO−S細胞は、トランスフェクションの前夜に播種し、10% FBSを有するDMEM中で、翌日、80%コンフルエントとなるまで増殖させた。次いで、CHO−S細胞の培地をOpti−MEMと交換した。プラスミドDNAおよびリポフェクタミンの混合物を作製した(0.2μg DNAおよび0.5μLリポフェクタミン)。CHO−S細胞にリポフェクタミン/DNA混合物を加え、一晩インキュベートした。翌日、細胞にCD−CHO血清不含培地(Invitrogen、カタログ番号10743−029)を補給した。トランスフェクション後種々の時点、一般に、トランスフェクション後96時間で、トランスフェクトされた細胞から上清を集めた。変異体PH20タンパク質または配列番号3に示されるアミノ酸の配列を有する野生型PH20を含有する上清を、−20℃で保存した。上清の活性を、以下の実施例に記載されるようにスクリーニングした。

実施例3
活性な突然変異体を同定するための、ヒアルロニダーゼ活性測定法を用いるライブラリーのスクリーニング
この実施例では、各変異株の活性を評価するためにヒアルロニダーゼ活性測定法を使用して、実施例2において作製された発現されたPH20変異体の上清をスクリーニングした。さらに、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の活性も、測定して、発現された突然変異体のPH20活性の、PH20野生型に対する標準化を可能にした。活性および不活性突然変異体が同定された。

1.ビオチン化HA(bHA)基質の作製
1.2−MDa HA(Lifecore)を、ヒアルロニダーゼ活性測定法において基質として使用するためにビオチン化した。まず、1.2グラム(g)の1.2MDa HAを4℃で600mLのddH0に、2mg/mLの濃度で、撹拌しながら1週間溶解した。次いで、645.71mgのビオチンヒドラジドを、100mLのDMSOに、25mM(6.458mg/mL、38.37mL DMS 中、247.8mg)の濃度で溶解した。ビオチン溶液を37℃で、溶液が透明になるまで短時間加温した。また、20mL ddHO中、368.61mg Sulfo−NHSを溶解して、100X溶液(18.4mg/mL Sulfo−NHS)を作製した。3mLのddH20に17.63mg EDCを、反応が開始した直前に5.7513mg/mLの濃度で溶解することによって、30mM(1000X)水溶性カルボジイミドEDC溶液を作製した。

4本の1000mL滅菌キャップ付きボトルに、室温(RT)で、以下の成分を、撹拌しながら以下の順序で加えた:1)200mLの2mg/mL HA溶液;穏やかに混合しながら、2)80mLの0.5M MES、pH5.0;および穏やかに混合しながら、3)91.6mLのddH0。次いで、24mLの25mMビオチン−ヒドラジドおよび4mLの100X Sulfo−NHS溶液を逐次加え、直後に500μLのEDCを加えた。各成分を加えた後、3回反転させることによって溶液を混合し、撹拌した。最後の成分を加えた後、溶液を4℃で一晩撹拌することによって混合した。次いで、グアニジン塩酸塩を、100mLあたり38.2gを加えることによって4Mの終濃度に加え、完全に溶解させ、その後、溶液容量をddHOを用いて600mLに調整した。

透析のために、コンジュゲートしているHAグアニジン塩酸塩溶液の各バッチから200mLを、透析膜中に移した。3日にわたって、溶液をddHOに対して透析し、ddHOで少なくとも6回変更した。約840mLの得られた容量をddHOを用いて、1000mLの最終容量に調整した。ビオチン化ヒアルロナン(bHA)の終濃度は、0.4mg/mLとした。

2.ヒアルロニダーゼ活性測定法
酵素アッセイは、PH20ヒアルロニダーゼ活性の尺度を提供する、Frost et al. (1997) (A Microtiter-Based Assay for Hyauronidase Activity Not Requiring Specialized Reagents. Analytical Biochemistry (1997) 251:263-269)に記載される方法の修飾とした。

第1に、ビオチン化HA(bHA)基質を、プラスチックマイクロタイタープレートと結合させて、アッセイプレートを作製した。手短には、0.5Mカルボネートバッファー(pH9.6)中、1mg/mLのb−HA 100μlを、ハイバインドマイクロプレート(Immunolon 4 HBX extra high binding;Thermo Scientific)の各ウェルに分配した。プレートをプレートシーラーで覆い、2〜8℃で24〜48時間保存した。

次いで、アッセイプレートを、0.05%(v/v)Tween 20(PBST)を含有する1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)洗浄バッファーを用いて洗浄した。PBSTは、1×PBS(カタログ番号P5368、Sigma(10mMリン酸バッファー、2.7mM塩化カリウム、137mM塩化ナトリウム、pH7.4)から、PBSの1つのパケットの内容物を、800mLの脱イオン水を入れた1Lのメスシリンダー中に入れ、撹拌または振盪し、1Lまでの十分な量の水を加えることによって溶解して作製した)から、1×PBS 900mLに500μlのTween 20(カタログ番号6505;EMD Bioscience)を加え、1Lまでの十分な量の水を加えることによって作製した。洗浄は、BioTek ELx405 Select CWプレートウォッシャー(BioTek)を使用し、各洗浄に、ウェルあたり300μlのPBST洗浄バッファーを用いて5回洗浄することによって行った。各洗浄の最後に、プレートをペーパータオルの上で指でたたいて、各ウェルから過剰の液体を除去した。サンプルととものインキュベーションの前に、各ウェルに200μlブロッキングバッファー(PBS中、1.0%w/vウシ血清アルブミン(BSA))を加え、アッセイプレートを37℃で事前におよそ1時間にインキュベートした。ブロッキングバッファーは、200mL 1×PBSに、撹拌しながら、2.5gのBSA(カタログ番号001−000−162;Jackson Immuno Research)を加え、250mLまで1×PBSの十分な量を加えることおよび0.2μM PESフィルターユニットを通して濾過することによって作製した。

実施例1に記載の通り作製されたトランスフェクトされた変異体または野生型PH20上清を、コーティングされていない4XHBハイバウンドマイクロプレートにおいて、2連で、アッセイ希釈バッファー(pH7.4 HEPES バッファー;10mM HEPES、50mM NaCl、1mM CaCl、1mg/mL BSA、pH7.4、0.05%Tween−20)で1:25希釈した。標準曲線のために、rHuPH20の1:3段階希釈(145U/mLの比活性を有する実施例1に記載の通り作製した)を、2連で、アッセイ希釈バッファーで、標準の3U/mLから出発して、以下の通り:3U/mL、1U/mL、1/3U/mL、1/9U/mL、1/27U/mL、1/81U/mLおよび1/243U/mLに作製した。100マイクロリットル(100μl)の各標準およびサンプルを、アッセイプレートに移し、37℃でおよそ1.5時間インキュベートした。

インキュベートした後、プレートを、PBSTを用い、BioTek ELx405 Select CWプレートウォッシャーを使用し、各洗浄に、ウェルあたり300μlのPBST洗浄バッファーを用いて5回洗浄した。各洗浄の最後に、プレートをペーパータオルの上で指でたたいて、各ウェルから過剰の液体を除去した。次いで、プレートの各ウェルに、100μlの1:5000希釈したストレプトアビジン−HRP(SA−HRP)を加え、周囲温度でおよそ1時間インキュベートした。希釈のために、ストレプトアビジン−HRPコンジュゲート(カタログ番号21126;Thermo Scientific)の1mg/mLのストックを、希釈バッファー(1mg/mL BSA、0.025%Tween20、137mM NaCl、20mM Tris pH7.5)で1:5000希釈した。インキュベートした後、プレートを、PBSTを用い、BioTek ELx405 Select CWプレートウォッシャーを使用して、各洗浄のためにウェルあたり300μlのPBST洗浄バッファーを用いて5回洗浄した。各洗浄の最後に、プレートを、ペーパータオルの上で指でたたいて、各ウェルから過剰の液体を除去した。次いで、100μlのTMB溶液(カタログ番号52−00−03、KPL;周囲温度および光からの保護)を各ウェルに、室温でおよそ5分間、または最適な色の発色が得られるまで加えた。反応を停止するために、100μlの1.0N硫酸またはTMB停止溶液(カタログ番号50−85−06)を各ウェルに加え、プレートを指でたたいて混合した。停止溶液を加えた30分以内に450nmで光学濃度を測定した。標準またはサンプル中に多くのPH20があるほど、少ない、SA−HRPを結合するのに利用可能なbHAにつながるので、光学濃度(450nm)値は、各試料におけるヒアルロニダーゼ活性の濃度に反比例した。

3.SEAP活性
細胞培養上清における分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)の活性を、ホスファターゼ基質としてpNPPを使用し、胎盤アルカリホスファターゼの比色アッセイを(Anaspec SensoLyte pNPP SEAPキット;カタログ番号72144、Anaspec)、製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。吸光度シグナルは、405nmの光学濃度(OD)で測定した。

ハイスループット(HTP)スクリーニングの判定基準は、トランスフェクトされた上清が≧0.1のSEAPシグナルをもたらし、rHuPH20野生型対照のシグナルが≧1U/mLのシグナルをもたらすということとした。また、各スクリーニングの判定基準は、標準曲線が、≧5の、OD405での0U/mL標準対3u/mL標準のシグナル対ノイズ比(S/N)を有し、≧10%の変動係数(CV)を有する3未満の標準を有し、少なくとも4の標準が直線範囲にあるということとした。

実施例4
ヒアルロニダーゼ活性の変更された選択されたPH20変異体
各作製された変異体を、実施例3に記載されるようにヒアルロニダーゼ活性についてスクリーニングした。SEAP発現を使用して、各変異体のPH20活性をPH20野生型に対して正規化した。野生型と比較して変更されたヒアルロニダーゼ活性を示した突然変異体を同定した。

1.活性突然変異体
少なくとも1つの二連サンプルが、SEAP活性に対して正規化された場合に野生型活性の40%超を示した活性突然変異体を選択した。同定された活性突然変異体は、表9に示されている。表は、配列番号3に示されるPH20のアミノ酸の配列と比較した、アミノ酸置換を示す。例示的突然変異体のアミノ酸配列も、配列番号に対する参照によって示されている。表はまた、その自身のSEAP値によって同様に正規化された、各プレートにおける野生型PH20活性の平均と比較された、SEAP値によって正規化された、試験された二連の平均ヒアルロニダーゼ活性を示す。例えば、0.40の値は、変異体が、野生型PH20のヒアルロニダーゼ活性の40%を示すことを示し、1の値は、変異体が、野生型の同様のヒアルロニダーゼ活性を示すことを示し、3.00の値は、変異体が、野生型PH20のヒアルロニダーゼ活性の300%または野生型と比較して3倍増大した活性を示すことを示す。

表9の結果は、600を超える試験された突然変異体が、野生型と比較して増大している活性を示すことを示す。例えば、約536種の突然変異体は、野生型PH20のヒアルロニダーゼ活性の120%以上を示し、約75種の突然変異体が、野生型PH20のヒアルロニダーゼ活性の300%以上を示す。特に、表9における結果は、変異株S69Aの野生型と比較したヒアルロニダーゼ活性が、約22倍であり;変異株S69Rが、約14倍であり;変異株I70Aが、約27倍であり;変異株I70Kが、約14倍であり;変異株I70Rが約14倍であり;変異株I271Lが約10倍であることを示す。




















2.不活性突然変異体
二連のうち少なくとも一方において、野生型PH20の20%未満のヒアルロニダーゼ活性を示すその他の突然変異体を、再スクリーニングして、死滅した突然変異体が不活性であることを確認した。不活性突然変異体を確認するために、実施例3に記載されたヒアルロニダーゼ活性測定法を、酵素活性の測定の前に、一晩の37℃での基質−サンプルインキュベーション工程を組み込むよう修飾した。修飾アッセイは、0.2U/mL未満のPH20活性を検出するよう意図される。

トランスフェクトされた変異体上清または野生型PH20の添加に先立つ、bHAでコーティングされたプレートの調製およびプレートのブロッキングは、実施例3に記載されるものと同一とした。アッセイは、以下の通りに修飾した。まず、実施例2に記載されたように作製された、トランスフェクトされた変異体上清または突然変異を含有しない野生型PH20を、二連で、アッセイ希釈液で1:25希釈した。標準曲線のために、0.1U/mLから出発して、0.00014U/mLまで下がる、rHuPH20の1:3段階希釈(実施例1に記載されるように作製された)を二連で、アッセイ希釈液で作製した。ブランクウェルもインキュベートした。次いで、bHAコーティングされたプレートおよびブロッキングされたプレートの予め設計されたウェルに、希釈されたサンプルまたは標準100μlを加え、37℃で一晩インキュベートさせた。インキュベートした後、プレートを洗浄し、上記の実施例3に記載されるようにbHAとの結合を検出した。停止溶液を加えた30分以内に450nmで光学濃度を測定した。

同定され再確認された不活性突然変異体が、表10に示されている。表は、配列番号3に示されるPH20のアミノ酸の配列と比較したアミノ酸置換を示す。










実施例5
温度およびフェノール親和性(PHENOPHILIC)条件下でのヒアルロニダーゼ活性のアッセイ
実施例4において同定されるような、表9に示されるPH20活性変異体から得た上清を、好熱性および/またはフェノール親和性(phenophilic)条件下での安定性について試験した。ヒアルロニダーゼ活性を測定するための基質としてビオチン化HA(bHA)を使用する、温度およびフェノール親和性(phenophile)条件下でのヒアルロニダーゼ活性を測定するアッセイは、酵素活性の測定の前に4時間の、37℃での、m−クレゾールを伴うか伴わないサンプルのインキュベーションを組み込むという点で、実施例3に記載される元のアッセイから修飾された。アッセイは、好熱特性(37℃条件での4℃でより大きい活性)を有する、および/またはフェノール親和性特性(野生型PH20よりもm−クレゾールの存在下で大きい活性)を有するPH20突然変異体を同定するために使用された。

一次スクリーニング
bHAとともにサンプルをインキュベートする前に、変異体PH20サンプルを、以下の条件下で、37℃で4時間のプレインキュベーションのためにコーティングされていない4XHBプレートの設計されたウェル中に希釈した:1)0.4%m−クレゾールとともに37℃でのプレインキュベーション;および2)0.4%m−クレゾールを伴わない37℃でのプレインキュベーション。0.4%m−クレゾールを伴う37℃でのプレインキュベーションのために、1%m−クレゾール中間体ストックを、50%(v/v)m−クレゾール保存溶液から調製した。手短には、2mL Wheatonガラスバイアル中で、m−クレゾール(Fluka、カタログ番号65996;Spectrum、カタログ番号C2773)の50%ストックを、密度(D=1.034g/L)に基づいて、メタノールで作製した。バイアルを密閉し、光から保護しながら小さいアリコートで−20℃で保存した。次いで、毎日、使用の直前に、ドラフト中で、ボルテックス処理し、HEPESアッセイバッファー(10mM HEPES、50mM NaCl、1mM CaCl、1mg/mL BSA、pH7.4、0.05%Tween−20)で希釈することによって、1%中間体ストックを作製した。

次いで、実施例2において上記のように作製された、表9に示されるトランスフェクトされた変異体上清サンプルの二連を、HEPESアッセイバッファー/トランスフェクトされた上清での1%m−クレゾールの1:2.5希釈に各々別個に付し、0.4%の最終濃度のm−クレゾールを得た。0.4%m−クレゾールを伴わない37℃でのプレインキュベーションのために、トランスフェクトされた変異体上清サンプルを、HEPESアッセイバッファー/トランスフェクトされた上清での1:2.5希釈に付した。さらに、各条件について、トランスフェクトされたサンプルについて上記と同様に希釈された(実施例1に記載されるように作製した)、pH7.4 HEPESバッファーでのrHuPH20の3U/mLで添加することによって内部死滅制御も試験した。プレートをプレートシーラーを用いて密閉し、37℃で4時間インキュベートした。

トランスフェクトされた変異体上清または野生型PH20の添加に先立つ、bHAでコーティングされたプレートの調製およびプレートのブロッキングは、実施例3に記載したものと同一であった。アッセイは、以下の通りにさらに修飾された。まず、サンプルを、4XHBプレートにおいて、二連で、HEPESアッセイバッファーで1:10希釈した。各変異体について、試験サンプルされたサンプルは、1)プレインキュベートされていない、トランスフェクトされた変異体上清(インキュベーションなし;4℃);2)0.4%m−クレゾールとともに37℃で4時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清(クレゾール);または3)0.4%m−クレゾールを伴わずに37℃で4時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清(クレゾールなし;37℃)とした。さらに、添加されたサンプルも試験した。m−クレゾールを用いずに、実施例3に記載されるように、rHuPH20を使用して標準曲線を作製した。各標準およびサンプルの100マイクロリットル(100μl)を、bHAコーティングされたプレートおよびブロッキングされたプレートの予め設計されたウェルに移し、37℃でおよそ1.5時間インキュベートした。したがって、プレインキュベーション工程における、各トランスフェクトされた変異体上清の二連のサンプルのプレインキュベーションおよびbHAアッセイにおける各サンプルのさらなる二連のために、各変異体の各サンプルを四連で試験した。

インキュベートした後、実施例3において上記のように、プレートを洗浄し、bHAとの結合を検出した。停止溶液を添加した30分以内に、450nmでの光学濃度を測定した。

標準曲線からU/mL活性を算出し、比較した。結果は、以下のパラメータの各々の下で残存するパーセント(%)活性として表された:1)m−クレゾール/4℃を伴わない、37℃プレインキュベーション;2)m−クレゾール/4℃を伴う37℃でのプレインキュベーション後;および3)m−クレゾールを伴う37℃でのプレインキュベーション後/m−クレゾールを伴わない37℃でのプレインキュベーション後での活性の比。再確認のために最初のフェノール親和性(phenophile)ヒットを、二連でアッセイが、条件3)下で、37℃での元の活性の≧20%の残存する活性のパーセンテージを示したものとして同定した。

最初のヒットを、6ウェルプレート再スクリニングアッセイを使用して再スクリーニングした。再スクリーニングのために、可能性あるヒットに対応するプラスミドDNAを、大腸菌細菌に移し、MaxiPrepを製造業者の使用説明書に従って、プラスミドDNAを調製し、精製した。DNA配列を確認した。

プラスミドDNAを、リポフェクタミン2000(Invitrogen、カタログ番号11668−027)を製造業者によって示唆されるプロトコールに従って使用して、約50〜80%コンフルエンシーの密度で6ウェルプレートで増殖させた単層CHO−S細胞(invitrogen、カタログ番号11619−012)にトランスフェクトした。トランスフェクションは二連で実施した。細胞を、COインキュベーター中、37℃で、トランスフェクション後、アッセイのための上清の収集の前に96時間インキュベートした。対照として、細胞をまた、コドン最適化された野生型PH20配列(OHO)を含有する、HZ24−PH20(OHO)−IRES−SEAP発現ベクター(配列番号4)を用いてトランスフェクトした。対照としてニセ細胞をインキュベートした。

トランスフェクションの96時間後、OHOおよびニセ対照を含めた各サンプルから上清を集め、上記の種々の条件下でヒアルロニダーゼ活性をアッセイした:1)プレインキュベートされていない、トランスフェクトされた変異体上清(インキュベーションなし;4℃);2)0.4%m−クレゾールとともに37℃で4時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清(クレゾール;37℃);または3)0.4%m−クレゾールを伴わずに37℃で4時間プレインキュベートされた、プレインキュベートされ、トランスフェクトされた変異体上清(クレゾールなし;37℃)。ヒアルロニダーゼ活性は、bHAアッセイを使用して、上記のように決定した。

結果は、上記のように評価した。絶対ヒアルロニダーゼ活性(U/mL)は、標準曲線から作製した。さらに、パーセント活性は、37℃/4℃、37℃およびm−クレゾール/4℃ならびに37℃およびm−クレゾール/37℃の活性の比として決定した。結果は、以下の表11および12に示されている。

















2.F204Pの結果のまとめ
変異株F204Pについて、bHA酵素活性測定法においてm−クレゾールの存在下でインキュベートされたCHO−S細胞の一時的トランスフェクションから得られた試験された上清の上記の結果は、F204P突然変異体タンパク質が、0.4%m−クレゾール処理に対して高度に耐性であったことを示した。結果は、37℃で0.4%m−クレゾールとともに4時間インキュベートした後に残存した活性が、酵素が、m−クレゾールの不在下で4℃または37℃のいずれかでインキュベートされた場合に観察された活性にほぼ等しいことを示した。陽性対照(WT PH20−OHO)は、アッセイの当日に75%および83%の活性の低下を示した(2つの異なるOHOトランスフェクションからアッセイされるように)。これは、F204Pフェノール親和性(phenophile)が、野生型PH20対照酵素の残存活性を上回る、その活性の60%〜90%またはそれ以上を保持できることを実証した。

m−クレゾール処理または高温に対する曝露の際のF204Pの安定性を確認するために、F204Pの第2のトランスフェクションをCHO−S細胞を使用して二連で実施し、清澄化した上清を、4℃での、37℃で0.4%m−クレゾールとともの4時間および37℃で0.4%m−クレゾールを伴わない4時間のその安定性について再度試験した。結果から、F204P突然変異体酵素は、m−クレゾール中、37℃で4時間インキュベートした後に、多量のヒアルロニダーゼ活性を保持したことが確認された。結果は、突然変異体の第1のスクリーニングにおいて見られた結果と同様であり、F204Pは、4時間インキュベーションした後に、野生型PH20対照酵素の残存活性を上回る、その活性の57%から90%を超えるどこかを保持していた。

野生型対照と比較したF204Pの酵素活性のまとめが、表13に示されている。

実施例6
PH20 HIT変異体の大規模発現および精製
1.発現および精製
変異体PH20の1種をコードするcDNAを含有するHZ24−PH20−IRES−SEAPプラスミドDNAを、全般的に実施例2に記載されるように、単層CHO−S細胞にトランスフェクトした。CHO−S細胞を、GlutaMAX(8mM)を補給したCD−CHO培地を使用してシェーカーフラスコ中で培養した。トランスフェクションの当日、およそ1.0×10個細胞/mLの密度でCHO−S細胞を含有するおよそ300mLの容量の15本のフラスコを準備した。300mLのフラスコを各々、375μLのFreestyle MAXトランスフェクション試薬と組み合わせた375μgのF204P突然変異体をコードするプラスミドDNAを使用してトランスフェクトした。トランスフェクトされたプラスミドDNAは、ヌクレオチド位置1733〜1735でTTCのCCTへのコドン変更を含有し、それによってF204P突然変異体をコードする配列番号4に示されるヌクレオチドの配列を有していた。次いで、トランスフェクトされた細胞を96時間培養中にし、そこで、細胞および培地を回収し、プールした。細胞を遠心分離(4000×g、20秒)によってペレットにし、上清をF204Pタンパク質の精製のために保持した(およそ4.5リットル)。

粗上清を、30kDaのタンジェンシャルフローフィルター(TFF)システム(Millipore Pellicon XL、Bimax 30、200mLボイド容量;50cmフィルター表面積)を使用し、容量がおよそ450mLとなるまで10×濃縮した。透過物を、F204Pタンパク質のフロースルーを検出するアッセイのために保存した。次いで、4リットルのバッファー(10mM NaPO;25mM NaCl、pH7.2)を使用して保持液のフリーフローバッファー交換を実施した。保持液の容量を、およそ200mLに再度低減し、次いで、システム中の残存する透過物をパージし(ボイド容量約200mL)、およそ50mLのバッファーを使用してシステムをフラッシュし、およそ450mLの最終濃縮生成物を得た。

抗rHuPH20親和性カラムを、抗原親和性精製したウサギ抗rHuPH20 IgGを、CNBr活性化セファロース4 Fast Flow (GEHealthカタログ番号17−0981−01)にカップリングすることによって調製した。手短には、0.7gの予備活性化セファロース4粉末を、10mLガラスカラム中で1mM HClに30分間懸濁し、粉末を膨潤させた。カラムから溶液を流し出し、15ゲル容積(約30mL)の冷1mM HClを用いて重力によって洗浄した。5ゲル容積のカップリングバッファー(pH8.3の0.1M NaHCO、0.5M NaCl)を用いてカラムを洗浄した。次いで、カップリングバッファー中、>1.0mg/mLの、5mgのウサギ抗rHuPH20 IgGを、2〜3mg/ゲル1mLのタンパク質/ゲル比でカラムに加えた。カラムを4℃で一晩ぐるぐる回転させた。カップリング効率決定のためにフロースルーを集めた。ゲルを、2ゲル容積のカップリングバッファーを用いて洗浄し、次いで、1Mエタノールアミニン(ethanolaminine)pH9.5で洗浄し、室温で2時間再懸濁し、使用されていない活性化部位をブロックした。ゲルを、洗浄あたり、5ゲル容積の代替カップリングバッファーおよび0.1 NaAc、0.5M NaCl、pH4.5を用いて6回洗浄した。次いで、ゲルを10ゲル容積のTBS(20mM Tris−HCl、0.15M NaCl、pH7.5)を用いて洗浄した。カップリング効率を決定した(1−カップリング後タンパク質濃度/カプリング前タンパク質濃度×100%)。抗体がカップリングしたゲルは、4℃で0.02%NaNを有するTBS中で保存した。

続いて、濃縮上清生成物を、5mL/分のおおよその速度で抗rHuPH20親和性カラムにロードした。溶出は、GE(商標)AKTA FPLC精製システム(GE Healthcare、製品番号18−1900−26)を使用し、標準手順に従って実施し、それによって、タンパク質を低pHグリシン洗浄(0.1M グリシン−HCl、pH2.5)によって、1mLの画分で溶出した。各画分を、100μLの1M Tris、pH7.5の添加によって直ちに中和した。

溶出したタンパク質を、4〜20%SDS−PAGE 勾配Tris−グリシンゲルでタンパク質バンドを分離することによってアッセイした。SeeBlue(登録商標)Plus2 Pre−stained MW標準(Life Teechnologies;カタログ番号LC5925)を、分子量標準として使用し、50ngのrHuPH20(実施例1に記載されるように)陽性対照として使用した。各画分からの総タンパク質を示すために、ポリアクリルアミドゲルをInstant Blueを用いて染色した。ゲル上のバンドがPH20であることを確認するために、ゲルをPVDFメンブレン(Invitrogen)にトランスファーし、これを、rHuPH20を用いてウサギを免疫処置することによって作製したウサギ抗PH20一次抗体およびHRP−ヤギ抗ウサギ二次抗体(Calbiochem、カタログ番号DC03L)を使用するウエスタンブロットに付した。

次いで、親和性カラムの低い能力のために、親和性カラムの最初のローディングから得たフロースルーを、カラムに2回再ロードした。次いで、タンパク質を含有するすべての画分を合わせ、その結果、およそ13mLである総容量となった。次いで、この生成物を、15mLの能力を有するSlide−A−Lyzer透析カセットG2(20,000 MWCO)を使用し、4リットルのバッファー(10mM NaPO、140mM NaCl、pH7.2)に対して一晩透析した。次いで、バッファーを変更し、生成物を、第2の新鮮な4リットルの同一バッファーに対して透析した。次いで、F204Pタンパク質を、Amicon Ultra遠心分離カラム(Millipore;10,000 MWCO)を使用して濃縮し、およそ450μLの最終容量とした(4000xgで10分)。

2.タンパク質の特性決定
精製タンパク質を、そのタンパク質濃度、活性および純度について特性決定した。

精製タンパク質のタンパク質濃度を決定するために、実施例7に記載されるように定量ELISAを実施した。また、ヒアルロニダーゼ活性を、実施例3に記載されるように決定した。遠心分離後のタンパク質濃度を、およそ400μg/mLであると推定した。精製タンパク質をまた、4〜20%SDS−PAGE勾配Tris−グリシンゲルで分離し、これを、次いで、Instant Blueを用いて染色した。染色結果は、タンパク質が、rHuPH20対照と同様のおよそ63kDaの本質的に単一分子量タンパク質であることを実証した。この方法によって、かなり分解性の生成物は検出されなかった。種々の時点でのタンパク質のおよその収率および精製の間の活性が、表14に記載されている。

逆相HPLC(RP−HPLC)によって精製タンパク質の純度を決定した。逆相カラムからの溶出時間は、組換えヒトヒアルロニダーゼ(HUB)を用いて観察されたものと本質的に同一であリ、およそ80〜90%のサンプルの純度の粗推定の基礎を提供する。

実施例7
ELISAを使用する定量化
モノクローナル抗rHuPH20捕獲抗体を使用して、タンパク質を捕獲するELISAを使用して、PH20または変異体の定量化を実施した。具体的には、ELISAを実施する1日前に、96ウェル4HBXプレートを、捕獲抗体(ウサギをrHuPH20;1mg/mLストックを用いて免疫処置することによって作製したプロテインG精製ウサギポリクローナル抗PH20抗体)を100mMリン酸塩(pH7.2)中、1μg/mLで、ウェルあたり100μLの総容量で用いてコーティングした。プレートは、4℃で一晩保存した。翌日、プレートをプレートウォッシャーを用い、1xPBSを、300μL/ウェルで用いて5回洗浄した。各洗浄後、プレートをペーパータオル上でパットドライした。次いで、プレートを、ウェルあたり、Tween 20を含有するPBS(1xPBST) 200μLを用いて室温で1時間ブロッキングした。

プレートに標準およびサンプルを加えた。標準を作製するために、rHuPH20の1mg/mLストック(実施例1)を、HEPES pH7.4アッセイバッファーで、中間ストックとして50μg/mLに新たに希釈した。次いで、標準のために、50μg/mLストックを二連で、第1の標準のために、300ng/mLの0.5xPBST 360μLに希釈した(第1の列)。その他の標準列のために、240μLの0.5xPBSTを、各ウェルに加え、1:3段階希釈を行った。トランスフェクトされた上清サンプルのために、ウェルあたり360μLを、二連で第1の列に加え、各々を同様に上記のように、0.5×PBSTに段階希釈した。精製サンプルのために、ウェルあたり100μLを加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを、プレートウォッシャーを使用し、1xPBSTを300μL/ウェルで用いて5回洗浄した。各洗浄後、プレートをペーパータオル上でパットドライした。

HRPコンジュゲーションキット(Pierce、Thermo−Fisher;カタログ番号31489)を使用する検出のために、HRPがコンジュゲートしている抗PH20抗体を調製した。ウサギをrHuPH20を用いて免疫処置することによって作製した1mgのプロテインG精製ウサギポリクローナル抗体を、1mL PBSおよび2xカルボネートキットバッファーの1mLで希釈した。次いで、上記の抗体溶液1mLに、100μLのペルオキシダーゼを加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、ドラフト中で10μL NaBHストックを加え、サンプルを室温で20分間インキュベートした。反応をクエンチするために20μLのエタノールアミンを加え、室温で15分間インキュベートした。これに、1/25容量の5%ヒト血清アルブミン(0.1mLシリンジ)を加え、2mg/mLアルブミンストック反応物を得た。250μLの1M Tris pH7.4を添加することによって、pHを約7.9に調整した。ストックの濃度は、400μg/mLとした。保存溶液を、0.5%ヒト血清アルブミンおよび防腐剤を含有するPBS Tween20(0.05%)で1/10にさらに希釈し、次いで、滅菌濾過した。ストックを4℃で保存し、−20℃で凍結した。

抗体は、0.5x PBSTに1000x希釈された、HRPがコンジュゲートしている抗PH20抗体を使用して検出性であった。プレートのすべてのウェルに100μLの希釈された抗体を加え、プレートを室温でさらに2時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートを、プレートウォッシャーを使用し、1xPBSTを300μL/ウェルで用いて5回洗浄した。各洗浄後、プレートをペーパータオル上でパットドライした。次いで、各ウェルに、100μLのTMB基質を加え、ウェルあたり100μLの停止溶液を加えることによって、5〜10分後、反応を停止した。OD450でプレートを読み取った。

実施例8
PH20の酵素活性の決定
細胞培養物、精製画分および精製溶液などのサンプル中のPH20の酵素活性を、ヒアルロン酸が塩化セチルピリジニウム(CPC)と結合する場合の不溶性沈殿物の形成に基づく比濁法アッセイを使用して決定した。活性は、PH20をヒアルロナンとともに、一定期間(30分)インキュベートすること、次いで、消化されていないヒアルロナンをCDCの添加で沈殿させることによって測定される。得られたサンプルの濁度は、640nmで測定される。ヒアルロナン基質に対する酵素活性に起因する濁度の低下は、PH20酵素活性の尺度である。方法は、PH20アッセイ作業参照標準(実施例1に記載のように作製されたrHuPH20標準)の希釈を用いて作製された較正曲線を使用して実施され、サンプル活性測定は、この較正曲線に対して行われる。

サンプルおよび標準の希釈は、酵素希釈溶液(70mM NaCl、0.1%ヒト血清アルブミン[HSA]、25mM PIPESバッファー、pH5.5中、0.67g/Lゼラチン加水分解物)で調製した。サンプルは、適当な濃度に希釈した。Lifecore Biomedical(Chaska、MN)製のヒアルロン酸(HA、20〜50kDaの平均MW)はまた、pH5.5の25mM PIPES、70mM NaClを含有する基質溶液中、1mg/mLで調製した。上記2種の溶液の等量を混合して、1mLの反応混合物を調製し、37℃で30分間インキュベートした。反応は、4mLの塩化セチルピリジニウム溶液(CPC、5.0mg/mL)を添加することによって停止した。短時間ボルテックス処理した後、サンプル混合物の濁度を、640nmで読み取り、標準曲線に対してフィッティングすることによって活性を決定した。比活性(単位/mg)は、タンパク質濃度(mg/mL)によって酵素活性(U/mL)を除することによって算出した。

実施例9
防腐剤におけるF204P−PH20変異体の安定性
スクリーニング結果を確認するために、実施例6に記載されるような精製F204Pタンパク質の約450U/mLであると推定される量を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5、120mM NaCl、10mMメチオニン、0.01%プルロニックF−68、0.1%フェノールおよび0.15%m−クレゾールで製剤した。同一製剤中の、約450U/mLの野生型rHuPH20(実施例1に記載される通りに作製された)であると推定される量を含有する試験品も、対照として働くよう調製した。各製剤溶液を0.5mLにアリコートに分け、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、2mL USP I型ホウケイ酸ガラス中に入れた。バイアルを、5℃、30℃または37℃でインキュベートした。種々の時点でインキュベーターからサンプルを取り出し、実施例8に記載の通りに酵素活性を測定した。

酵素活性測定の結果は、表15に示されている。わかるように、rHuPH20野生型対照は、フェノール系防腐剤の存在下、37℃でインキュベートした場合に活性の迅速な減少を示した。対照的に、F204P突然変異体は、研究を通じて活性の大幅な低下を示さなかった。結果はまた、突然変異を含有しないrHuPH20野生型対照の活性と比較して、PH20の活性が、5℃および30℃での最大4週間のインキュベーション後に保持されることを示す。これらの結果から、F204Pが、防腐剤のEPBレベル(0.1%フェノールおよび0.15%m−クレゾール)に耐容性を示し、37℃で、少なくとも最大6日、5℃および30℃で1カ月超安定であることが確認される。

実施例10
インスリン共製剤中のF204P−PH20変異体の安定性
PH20変異体F204Pを、インスリン類似体(インスリンアスパルトまたはインスリンリスプロ)を含有する共製剤におけるその安定性について試験した。

試験された共製剤では、インスリンリスプロは、市販の製品(インスリンリスプロ:Eli Lillyヒューマログ(登録商標)(インスリンリスプロ)100U/mL、ロットA572364)であった。

試験された共製剤では、インスリンアスパルト類似体は、市販の製品(インスリンアスパルト:Novo Nordisk、NovoRapid(登録商標)(インスリンアスパルト)、ロットXS60195)の12バイアル(各10mL)をプールし、次いで、終濃度が元濃度の約5倍となるまで、Amicon Ultracel−10 Kカラム濃縮器を使用して濃縮することによって調製された再生アスパルトとした。インスリン類似体は、1M酢酸ナトリウム、pH5.3および30mM塩化亜鉛(ZnCl、EMD、カタログ番号ZX0065−1)を、タンパク質溶液容量の1/10で添加することによって沈殿させた。溶液を氷上に30分間置き、続いて、JS−5.3スインギングバケットローター(Beckman Coulter)を備えたAvanti J−E遠心機において5600rpmで20分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを再懸濁し、20mM酢酸ナトリウム、2mM塩化亜鉛、pH5.5溶液を用い洗浄した。再懸濁した溶液を、上記のように遠心分離した。洗浄工程を合計5回反復した。最終洗浄は、20mM酢酸ナトリウム、pH5.5を用いて実施し、塩化亜鉛のすべてのトレーサーを除去した。得られたタンパク質ペーストを、20mM HClを含有する水で溶解した。完全に溶解した後、250mM Tris、pH10.7を、20mMの最終Tris濃度に加えた。得られた溶液のpHを、インスリン類似体が、以下に記載されるように製剤され、タンパク質濃度が約15〜20mg/mLに調整されるように調整した。この方法で調製されたインスリン類似体は、通常、約90%の収率を有しており、残存する防腐剤濃度は、出発材料の100倍未満である。

手短には、表16に示されるような合計6種の製剤について、各々600単位(U)のPH20−F204Pまたは野生型rHuPH20(実施例1に記載の通りに作製した)を含有する3種の製剤を作製した。

各製剤溶液を、0.5mLアリコートに分配し、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、2mL USP I型ホウケイ酸ガラスバイアル中に入れた。バイアルを、5℃、30℃および37℃でインキュベートした。実施例8に記載される酵素活性測定のために、予定された時点でインキュベーターからサンプルを取り出した。

37℃、30℃および5℃でインキュベートされたサンプルの酵素活性測定の結果は、それぞれ表17から19に示されている。37℃では、野生型rHuPH20を含有するサンプルの酵素活性(F2、F4およびF6)は、2日のインキュベーション内にほとんど完全に失われていた。対照的に、37℃で6日インキュベートした後、PH20−F204Pを含有する製剤F3およびF5は、それぞれ約10%および30%のみを失った。市販のヒューマログ(F1)に製剤されたPH20−F204Pは、おそらくは製剤中にNaClが不足しているために、その活性のほとんどを37℃で2日内に失った。

PH20−F204PおよびrHuPH20間で30℃でインキュベートされたアンプルの酵素活性について同様の傾向が記載される。EPA防腐剤レベルを含有する製剤について、野生型およびF204P間の相違は著しかった(表17;F1およびF5対F2およびF6)。防腐剤濃度が、EPBレベルに低減された場合には(F3およびF4)、F204Pは、依然として野生型rHuPH20より優れていたが、EPA条件と比較してわずかに高いrHuPH20安定性があった。EPAおよびEPB防腐剤レベルの両方において、PH20−F204Pは、製剤中に100mMのNaClが含まれる場合に30℃で活性を最大14日間維持できた。

実施例11
インスリン共製剤中のV58R−PH20の安定性
A.V58R−PH20の安定性
PH20変異体V58Rを、実施例2または実施例3または実施例6に記載の通りCHO−S細胞において発現させた。トランスフェクトされたプラスミドDNAは、ヌクレオチド位置1295〜1297でGTGのCGGへのコドン変更を含有し、それによって、V58R突然変異体をコードする配列番号4に示されるヌクレオチドの配列を有していた。V58R突然変異体を、インスリンアスパルト(実施例10に記載の通りに調製したインスリンアスパルト類似体)を含有する共製剤における、またEPAもしくはEPB防腐剤レベル下でのその安定性について試験した。手短には、表20に示されるような、各々、600単位(U)のPH20−V58Rまたは野生型rHuPH20(実施例1に記載の通りに作製した)を含有する4種の製剤を作製した。製剤F1およびF2は、EPB防腐剤レベルに相当し、一方、製剤F3およびF4は、EPA防腐剤レベルに相当する。

各製剤溶液を0.5mLアリコートに分配し、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、2mL USP I型ホウケイ酸ガラスバイアル中に入れた。バイアルは、30℃および37℃でインキュベートした。実施例8に記載される酵素活性測定のために、予定された時点でインキュベーターからサンプルを取り出した。

37℃および30℃でインキュベートされたサンプルの酵素活性測定の結果は、表21および表22に示されている。37℃では、野生型rHuPH20を含有するサンプルの酵素活性(F2およびF4)は、2日のインキュベーション内にほとんど完全に失われていた。対照的に、37℃で6日インキュベートした後、V58R−PH20を含有する製剤F1(EPB)およびF3(EPA)は、それぞれ約25%および40%の活性しか失わなかった。30℃では、野生型rHuPH20を含有するサンプルの酵素活性は、1カ月のインキュベーション以内に、EPAまたはEPB防腐剤レベルの存在下で著しく低下したが、EPB防腐剤レベルの存在下で活性のわずかに少ない著しい喪失があった。対照的に、V58R−PH20について、試験された製剤の酵素活性の喪失が最大1カ月なかった。

B.F204PおよびV58Rの安定性の比較
PH20変異体V58R−PH20を、F204Pと、インスリンアスパルト(実施例10に記載の通りに調製したインスリンアスパルト類似体)を含有する共製剤における、またEPAもしくはEPB防腐剤レベル下でのその安定性について比較した。手短かには、表23に示されるように8種の製剤を作製した。製剤F1〜F4は、EPB防腐剤レベルに相当し、一方、製剤F5〜F8は、EPA防腐剤レベルに相当する。製剤F3およびF4ならびに製剤F7およびF8は同一であり、野生型対照製剤、それぞれEPBまたはEPA研究に使用される製剤に相当する。

各製剤溶液を、0.5mLアリコートに分配し、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムシールを備えた、2mL USP I型ホウケイ酸ガラスバイアル中に入れた。バイアルは、30℃および37℃でインキュベートした。実施例8に記載される酵素活性測定のために、予定された時点でインキュベーターからサンプルを取り出した。

結果は、37℃でのプレインキュベーション後の試験された製剤におけるパーセンテージヒアルロニダーゼ活性は、EPA防腐剤レベルではなくEPB防腐剤にレベル製剤された場合に、両PH20突然変異体についてわずかに多かったことを示す。EPB防腐剤レベルを含有する製剤中で6日インキュベートした後に、残存する活性のパーセントは、試験された両突然変異体について80%よりも大きかったが、EPA防腐剤レベルの存在下では少なかった。例えば、EPA防腐剤レベルにおいて6日で残存する活性は、F204P−PH20について6日後に、80%よりもわずかに少なかったが、V58R−PH20についてはわずか約40%であった。したがって、結果はまた、37℃では、V58R−PH20は、特に、EPA防腐剤レベルを有さない製剤では、F204P−PH20よりも幾分かあまり安定ではないということを示す。30℃で少なくとも1週間インキュベートした後に、F204P−PH20およびV58R−PH20は、EPAおよびEPB両防腐剤レベルの存在下で安定であり、ほぼ100%の最初の活性を示した。対照的にrHuPH20は、EPB防腐剤レベルの存在下、30℃で4週間後、その最初の活性の約40%しか示さなかったが、EPA防腐剤レベルの存在下では、30℃で4週間後、検出可能な活性を示さなかった。

実施例12
レンチウイルス発現ベクターを使用するF204P−PH20の発現
F204P−PH20をコードするコドン最適化突然変異体ヒアルロニダーゼcDNAを含有するレンチウイルス発現ベクター、pLV−EF1a−PH20(F204P)−IRES−GFP−Bsdを作製した。pLV−EF1a−PH20(F204P)−IRES−GFP−Bsdの配列は、配列番号925に示されている。pLV−EF1a−PH20(F204P)−IRES−GFP−Bsdベクタ