CN114624366B - 一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法。采用分子排阻色潽法，通过严格控制流动相组分比例、设置合理的洗脱条件，有效分离了西曲瑞克峰及其聚合物杂质峰，分离效果突出，基线平稳，稳定性好，专属性好，灵敏度高，能够同时检测多种聚合物杂质，各聚合物杂质分离度好，且本方法能够排除醋酸西曲瑞克原料药或其制剂中小分子杂质的干扰，可应用于醋酸西曲瑞克的质量控制，具有较大的积极进步效果和实际应用价值。

Description

一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法。
背景技术
促性腺激素释放激素（GnRH）由下丘脑分泌，通过与垂体GnRH受体结合，引起垂体促性腺激素即黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的释放，从而导致性腺分泌雌激素、睾酮等性类固醇激素。西曲瑞克是一种促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂，这种药物通过抑制GnRH的作用，防止卵泡在发育充分之前排出，也可刺激卵巢产生更多的卵子，用于女性的生育治疗。
醋酸西曲瑞克系化学合成的十肽，其化学名称为：N-乙酰-3-(2-萘)-d-丙氨酰-p-氯-d-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-d-丙氨酰-l-丝氨酰-l-酪氨酰-N5-氨甲酰-d-鸟氨酰-l-亮氨酰-l-精氨酰-l-脯氨酰-d-丙氨酰胺醋酸盐。
其结构式如下：
Figure 566111DEST_PATH_IMAGE001
多肽本身是由不同的氨基酸以不同的顺序排列组合而形成的聚合物，其结构中反应结合位点较多，很有可能受物料纯度、反应环境或储存条件的影响，与环境中的化合物、反应溶剂中的杂质或者另一分子发生聚合反应，从而产生分子量大于醋酸西曲瑞克分子量的杂质，此处统称为醋酸西曲瑞克聚合物杂质。目前，在醋酸西曲瑞克的原料药和制剂品种的质量控制中，已报道研究的杂质其相对分子量与醋酸西曲瑞克相对分子量均相差在10%以内，在分子排阻色潽法中很难被准确定量。如专利CN107664666A中公开的杂质，所述杂质检测方法是基于反相色谱理论的键合相与被测物相互作用的色谱理论，经研究，与本发明中杂质非相同杂质。
鉴于理论上存在聚合物杂质的可能，其存在可能引发不良反应例如过敏症状的安全风险，因此，如何提供一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法。
本发明分析方法专属性好，检测灵敏度高，能将西曲瑞克峰及其聚合物杂质峰有效分离，可应用于醋酸西曲瑞克的质量控制，克服了现有技术的不足。
本发明主要是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，是采用分子排阻色谱法进行检测，所述检测方法包括以下步骤：
以乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂溶解所述醋酸西曲瑞克药品，得到供试品溶液；
以乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂分别溶解抑肽酶对照品、胸腺法新对照品、依替巴肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品、醋酸西曲瑞克对照品，得到系统适应性溶液，
再以硅胶表面键合了亲水性官能团的填料的色谱柱为固定相，以乙腈-水-三氟乙酸的混合溶液为流动相，使用高效液相色谱仪检测所述供试品溶液中醋酸西曲瑞克聚合物杂质的含量。
本发明所述检测方法中，所述供试品溶液中醋酸西曲瑞克的浓度为0.01～0.5mg/mL，例如可以是0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL等；优选地，所述供试品溶液中醋酸西曲瑞克的浓度为0.2mg/mL。
本发明所述检测方法中，所述所述系统适应性溶液中抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽、醋酸西曲瑞克的质量浓度为0.01～0.5mg/mL，例如可以是0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL等；
优选地，所述系统适应性溶液中抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽、醋酸西曲瑞克的质量浓度为0.2mg/mL。
本发明所述检测方法中，所述乙腈-水-三氟乙酸溶液为乙腈、水、三氟乙酸混合得到；
优选地，所述乙腈、水、三氟乙酸的体积比为40：60：（0.045~0.055），例如可以是40：60：0.045、40：60：0.046、40：60：0.047、40：60：0.048、40：60：0.049、40：60：0.05、40：60：0.051、40：60：0.052、40：60：0.053、40：60：0.054、40：60：0.055；优选地，所述乙腈、水、三氟乙酸的体积比为40：60：0.05。
本发明所述检测方法中，所述检测方法使用色谱柱为TSK GEL 2000SWXL色谱柱，规格为7.8mm×300mm，5µm。
本发明所述检测方法中，所述色谱柱柱温设置在28~32℃；例如可以是28℃、29℃、30℃、31℃、32℃；优选地，柱温设置为30℃。
所述检测方法的检测时间为10～30min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min。
本发明所述检测方法中，所述流动相流速为0.6~0.8ml/min，例如可以是0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min；优选地，流速为0.7ml/min。
本发明所述检测方法中，所述检测方法使用的检测器为紫外检测器和/或二极管阵列检测器；所述检测器的检测波长为210~215nm，例如可以是210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm；优选地，检测波长为210nm。
本发明所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量；检测醋酸西曲瑞克聚合物杂质的相对分子量在1431.04~6511.47之间，优选地，醋酸西曲瑞克聚合物杂质的相对分子量在1976.83~3945.61 之间。
作为本发明优选的技术方案，所述检测方法具体包括以下步骤：
（1）色谱条件设置：
色谱柱：TSK GEL 2000SWXL色谱柱，规格为7.8mm×300mm，5µm
柱温：28~32℃
流动相：乙腈-水-三氟乙酸（40：60：0.045~0.055）
流速：0.6~0.8ml/min
检测波长：210~215nm
进样体积：10-40μl
运行时间：10~30min
（2）样品配制：
供试品溶液制备：用乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂溶解所述醋酸西曲瑞克药品，得到浓度为0.2mg/ml的供试品溶液；
对照溶液制备：用乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂将供试品溶液稀释100倍，即得；
系统适应性溶液制备：用乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂分别溶解抑肽酶对照品、胸腺法新对照品、依替巴肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品、醋酸西曲瑞克对照品，得到各组分浓度为0.2mg/ml的系统适应性溶液；
（3）检测：
取配制的系统适应性溶液注入高效液相色谱仪，抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽和醋酸西曲瑞克峰之间的分离度应符合要求；再取等体积的对照溶液、供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明采用分子排阻色潽法对醋酸西曲瑞克的聚合物杂质进行检测，所述方法流动相组份简单，基线平稳，方法专属性好，灵敏度高，分子量线性关系及耐用性良好，能将西曲瑞克峰及其聚合物杂质峰有效分离，可应用于醋酸西曲瑞克的质量控制，完善了现有杂质谱中杂质的种类，能更加全面的控制醋酸西曲瑞克的产品质量，具有较高的实用价值。
（2）本发明检测方法通过采用主成分自身对照法对聚合物杂质进行定量检测，并通过强制降解实验和加速实验考查聚合物产生和增加影响因素，对于指导醋酸西曲瑞克的储存运输有较好的指导意义。
附图说明
图1为本发明系统适用性溶液色谱图。
图2为本发明实施例1未破坏供试品溶液色谱图。
图3为本发明实施例1氧化破坏供试品溶液色谱图。
图4为本发明实施例1液体光破坏供试品溶液色谱图。
图5为本发明实施例1液体高温破坏供试品溶液色谱图。
图6为本发明实施例1固体高温破坏供试品溶液色谱图。
图7为本发明试验例1加速25℃（包装）1个月样品的色谱图。
图8为本发明试验例1加速30℃（包装）1个月样品的色谱图。
图9为本发明试验例1高湿条件1裸放样品10天的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。如无特别说明，所用原料可通过市售或自制获得。
实施例1：系统适用性、精密度及专属性
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，具体步骤如下：
（1）色谱条件设置：
色谱柱：TSK GEL 2000SWXl色谱柱，规格为7.8mm×300mm，5µm
柱温：30℃
流动相：乙腈-水-三氟乙酸（40：60：0.05）
流速：0.7ml/min
检测波长：210nm
进样体积：20μl
运行时间：30min
（2）溶剂配制：配制乙腈-水-三氟乙酸（体积比为40：60：0.05）的溶液为溶剂；
（3）系统适应性溶液制备：分别取抑肽酶对照品、胸腺法新对照品、依替巴肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品、醋酸西曲瑞克对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含有抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽、醋酸西曲瑞克各0.2mg的溶液，作为系统适应性溶液；
（4）专属性供试品溶液制备
以醋酸西曲瑞克为考察对象，配制一系列强制降解试验溶液：
a）未破坏供试品溶液：取醋酸西曲瑞克约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
b）氧化破坏供试品溶液：取醋酸西曲瑞克约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加3%过氧化氢溶液5ml混匀，室温放置24小时，加溶剂溶剂并稀释至刻度，摇匀，即得；
c）液体光破坏供试品溶液：取醋酸西曲瑞克约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，置4500lx±500lx日光和90W紫外光照条件下25℃放置24小时，即得；
d）液体高温破坏供试品溶液：取醋酸西曲瑞克约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，置60℃高温条件下放置24小时，取出放冷，即得；
e）固体高温破坏供试品溶液：取醋酸西曲瑞克约10mg，精密称定，置50ml量瓶，置60℃高温条件下放置24小时，取出放冷，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（5）对照溶液制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
（6）检测及定量分析：分别考察系统适用性、精密度和专属性，定量分析时，供试品溶液中主峰前如有杂质峰，计算主峰前所有杂质峰面积之和与对照溶液主峰面积的比值，根据自身对照法，计算聚合物杂质的含量；
（7）试验结果：
系统适用性：精密量取系统适应性溶20µ1，注入液相色谱仪，抑肽酶、胸腺法新、西曲瑞克、依替巴肽和还原型谷胱甘肽依次出峰，各峰之间的分离度应符合要求，西曲瑞克峰理论塔板数不低于5000。系统适用性色谱图如附图1，结果见表1；
表1 系统适用性试验结果
Figure 499432DEST_PATH_IMAGE002
精密度：系统适用性溶液连续进样6针，各峰峰面积的RSD不得大于2.0%，各峰保留时间的RSD不得大于2.0%，以每个峰的保留时间均值作为横坐标，每个化合物分子量对数作为纵坐标作标准曲线，作线性回归方程，线性方程相关系数R值不小于0.990，验证结果见表2；
表2 精密度试验结果
Figure 902732DEST_PATH_IMAGE003
专属性：精密量取专属性对照溶液和专属性供试品溶液各20µ1，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
未破坏供试品溶液样品结果如附图2，氧化破坏供试品溶液结果如附图3，液体光破坏供试品溶液结果如附图4，液体高温破坏供试品溶液结果如附图5，固体高温破坏供试品溶液结果如附图6。从图中可以看出，该聚合物杂质出峰位置在西曲瑞克和抑肽酶之间，即分子量在1431.04~6511.47之间；进一步根据图中聚合物杂质的保留时间，由分子量线性方程可推算出实验中所检出的相对分子量约为1976.83~3945.61 。
分子量线性方程：y=0.2724x+6.3366。
专属性试验结果见表3；
表3 专属性试验结果
Figure 863472DEST_PATH_IMAGE004
以上结果表明：系统适用性溶液各峰之间分离度均大于1.5；进样精密度结果及分子量线性结果符合要求；专属性各破坏条件下，主峰与杂质峰的分离度均大于1.5，本方法专属性良好；由专属性破坏结果判断，高温条件下醋酸西曲瑞克中聚合物杂质产生或增加明显。
实施例2
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，所述供试品溶液中对醋酸西曲瑞克的浓度为0.5mg/mL；所述系统适应性溶液中抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽、醋酸西曲瑞克的质量浓度为0.5mg/mL。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.03%。
实施例3
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，所述供试品溶液中对醋酸西曲瑞克的浓度为0.1mg/mL；所述系统适应性溶液中抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽、醋酸西曲瑞克的质量浓度为0.1mg/mL。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.04%。
实施例4
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，所述供试品溶液中对醋酸西曲瑞克的浓度为0.3mg/mL；所述系统适应性溶液中抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽、醋酸西曲瑞克的质量浓度为0.3mg/mL。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.03%。
实施例5
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，
所述乙腈、水、三氟乙酸的体积比为40：60：0.045。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.03%。
实施例6
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，
所述乙腈、水、三氟乙酸的体积比为40：60：0.055。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.03%。
实施例7
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，所述色谱柱柱温设置在28℃。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.03%。
实施例8
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，所述色谱柱柱温设置在32℃。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.03%。
实施例9
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，
所述流动相流速为0.6ml/min。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.02%。
实施例10
本实施例提供一醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，与实施例1的区别仅在于，
所述流动相流速为0.8ml/min。所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量为0.04%。
试验例1：样品检测及影响因素考察
（1）色谱条件：参见实施例1中色谱条件设置；
（2）溶剂配制：参见实施例1中溶剂配制；
（3）影响因素和加速试验放样：取实施例1中专属性试验的未破坏供试品溶液进行影响因素放样，放置条件见表4；
表4 影响因素考察条件
Figure 352222DEST_PATH_IMAGE005
备注：①带包装样品：内包装为口服固体药用高密度聚乙烯瓶，外包装为聚酯/铝/聚乙烯药用复合袋
②以上部分条件参考2020版《中国药典》四部指导原则9001原料药物与制剂稳定性试验指导原则。
（4）供试品溶液配制：取醋酸西曲瑞克约10mg，精密称定，置50ml量瓶，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（5）对照溶液制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
（6）检测及定量分析：精密量取对照溶液和供试品溶液各20µ1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；根据自身对照法，计算聚合物杂质的含量；3批醋酸西曲瑞克0时样品检测结果及1批样品影响因素样品检测结果见表5；加速25℃（包装）1个月样品结果如附图7，加速30℃（包装）1个月样品结果如附图8，影响因素40℃（包装）1个月样品结果如附图9；
表5 样品检测结果
Figure 558076DEST_PATH_IMAGE006
以上结果表明：
（1）光照条件下裸放样品聚合物增长明显，包装可减少聚合物杂质的产生；
（2）高温条件下裸放样品及带包装样品聚合物杂质增加基本一致，表明包装对高温条件下产生的聚合物杂质无明显影响；
（3）高湿条件下裸放样品及带包装样品聚合物杂质略有增长，表面包装对聚合物的产生和增长影响不大；
（4）室温条件下带包装样品放置1个月后，聚合物杂质略有增长。
综上所述，影响因素和加速条件下，聚合物杂质均有所增长。本发明方法可有效的控制醋酸西曲瑞克聚合物杂质，完善了现有杂质谱中杂质的种类，能更加全面的控制醋酸西曲瑞克的产品质量，且本实验结果对于指导醋酸西曲瑞克的储存和运输有较好的指导意义。

Claims (7)

1.一种醋酸西曲瑞克聚合物杂质的检测方法，其特征在于，采用分子排阻色谱法进行检测，所述检测方法包括以下步骤：
以乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂溶解所述醋酸西曲瑞克药品，得到供试品溶液；
以乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂分别溶解抑肽酶对照品、胸腺法新对照品、依替巴肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品、醋酸西曲瑞克对照品，得到系统适应性溶液；
再以硅胶表面键合了亲水性官能团的填料的色谱柱为固定相，以乙腈-水-三氟乙酸的混合溶液为流动相，使用高效液相色谱仪检测所述供试品溶液中醋酸西曲瑞克聚合物杂质的含量；
所述检测方法使用色谱柱为TSK GEL 2000SWXL色谱柱，规格为7.8mm×300mm，5µm；
所述色谱柱柱温设置为30℃；
所述乙腈-水-三氟乙酸溶液为乙腈、水、三氟乙酸混合得到，所述乙腈、水、三氟乙酸的体积比为40：60：0.05；
所述流动相流速为0.7ml/min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
所述供试品溶液中醋酸西曲瑞克的浓度为0.2mg/mL；
所述系统适应性溶液中抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽、醋酸西曲瑞克的质量浓度为0.2mg/mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的检测时间为10～30min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法使用的检测器为紫外检测器和/或二极管阵列检测器；所述检测器的检测波长为210nm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的进样量为20µl。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量；检测醋酸西曲瑞克聚合物杂质的相对分子量在1976.83~3945.61 之间。
7.根据权利要求1~6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
（1）色谱条件设置：
色谱柱：TSK GEL 2000SWXL色谱柱，规格为7.8mm×300mm，5µm
柱温：30℃
流动相：乙腈-水-三氟乙酸，所述乙腈、水、三氟乙酸的体积比为40：60：0.05
流速：0.7ml/min
检测波长：210nm
进样体积：20μl
运行时间：10~30min
（2）样品配制：
供试品溶液制备：用乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂溶解所述醋酸西曲瑞克药品，得到浓度为0.2mg/ml的供试品溶液；
对照溶液制备：用乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂将供试品溶液稀释100倍，即得；
系统适应性溶液制备：用乙腈-水-三氟乙酸溶液为溶剂分别溶解抑肽酶对照品、胸腺法新对照品、依替巴肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品、醋酸西曲瑞克对照品，得到各组分浓度为0.2mg/ml的系统适应性溶液；
（3）检测：
取配制的系统适应性溶液注入高效液相色谱仪，抑肽酶、胸腺法新、依替巴肽、还原型谷胱甘肽和醋酸西曲瑞克峰之间的分离度应符合要求；再取等体积的对照溶液、供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并采用自身对照法进行定量分析，计算聚合物杂质的含量。
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