ES2727480T3 - Mutantes degradantes de proteoglicanos para el tratamiento del SNC - Google Patents

Mutantes degradantes de proteoglicanos para el tratamiento del SNC Download PDF

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Abstract

Un polipéptido mutante de condroitinasa AC purificado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.

Description

DESCRIPCIÓN
Mutantes degradantes de proteoglicanos para el tratamiento del SNC
Antecedentes y resumen
Las condroitinasas son enzimas de origen bacteriano que actúan sobre el sulfato de condroitina, un componente de los proteoglicanos que son componentes de la matriz extracelular de una amplia variedad de tejidos como el sistema nervioso central y, por ejemplo, pueden mediar la unión entre la retina y el cuerpo vítreo del ojo humano. Ejemplos de enzimas condroitinasa son la condroitinasa ABC I, SEQ ID NO: 37, que es producida por la bacteria Proteus vulgaris (P. vulgaris), y la condroitinasa AC, SEQ ID NO: 5, que es producida por Flavobacterium heparinum. Las condroitinasas ABC I SEQ ID NO: 37, y la condroitinasa AC SEQ ID NO: 5, funcionan degradando las cadenas laterales de polisacáridos en complejos proteína-polisacáridos, sin degradar el núcleo proteico.
Yamagata et al. (J. Biol. Chem. 243: 1523-1535, 1968) describen la purificación de las condroitinasas como ABC I SEQ ID NO: 37 a partir de extractos de P. vulgaris. Esta enzima degrada selectivamente los glicosaminoglicanos condroitina-4-sulfato, dermatan-sulfato y condroitina-6-sulfato (también denominados respectivamente sulfatos de condroitina A, B y C, que son cadenas laterales de proteoglicanos) a un pH 8 a ratas más altas que aquellas con las que degrada la condroitina o el ácido hialurónico. Los productos de la degradación son oligosacáridos insaturados de alto peso molecular y un disacárido insaturado. Sin embargo, la condroitinasa ABC I, SEQ ID NO: 37, no actúa sobre el queratosulfato, la heparina o el sulfato de heparitina.
Los usos de las condroitinasas incluyen la interrupción rápida, específica y no quirúrgica de la unión del cuerpo vítreo a la retina neural del ojo, lo que facilita la remoción del cuerpo vítreo.
La condroitinasa de P. vulgaris, por ejemplo, ABC I SEQ ID NO: 37, migra con una masa molecular aparente de aproximadamente 110 kDa cuando se resuelve mediante SDS-PAGE. Se ha informado la aparición de un doblete en la resolución SDS-PAGE de la condroitinasa ABC (Sato et al., Agric. Biol. Chem. 50: 4,1057-1059, 1986). Sin embargo, este doblete representa la condroitinasa ABC intacta y un producto de degradación de 90 kDa. Las preparaciones de proteína de condroitinasa ABC comercial contienen cantidades variables de este producto de degradación de 90 kDa y un producto de degradación adicional de 18 kDa también derivado de la condroitinasa ABC I, SEQ ID NO: 37.
La condroitinasa ABC II, SEQ ID NO: 27, también se ha aislado y purificado a partir de P. Vulgaris. La condroitinasa ABC II, SEQ ID NO: 27, es un polipéptido de 990 aminoácidos con una masa molecular aparente por SDS-PAGE de unos 112 kDa. Su masa molecular determinada por espectrometría de masas con electroaspersión y desorción con láser es de aproximadamente 111.772 daltons. La condroitinasa ABC II, SEQ ID NO: 27, tiene un punto isoeléctrico de 8.4-8.45. Su actividad enzimática es distinta de, pero complementaria a, la condroitinasa ABC I SEQ ID NO: 37. La condroitinasa ABC I, SEQ ID NO: 37, escinde endolíticamente proteoglicanos para producir disacáridos del producto final, así como al menos otros dos productos que se cree que son tetrasacáridos. La condroitinasa ABC II, SEQ ID NO: 27, digiere al menos uno de estos tetrasacáridos productos de la digestión de proteoglicanos por la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37).
Después de una lesión en el sistema nervioso central (SNC) de mamíferos adultos, la incapacidad de los axones para regenerarse puede llevar a una parálisis permanente. Una lesión causada por lesión desarrollará una cicatrización glial, que contiene moléculas de matriz extracelular que incluyen proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG). Los CSPG inhiben el crecimiento del tejido nervioso in vitro y la regeneración del tejido nervioso falla en las regiones ricas en CSPG in vivo.
Un cierto número de moléculas, y regiones específicas de ellas, han sido implicadas en la capacidad de soportar el brote de neuritas de una célula neuronal, un proceso también denominado crecimiento de neuritas. El término neurita se refiere tanto a las estructuras de axones como a las de dendritas. Este proceso de expulsión de neuritas es esencial en el desarrollo y la regeneración neurales, especialmente después de que una lesión física o una enfermedad haya dañado las células neuronales. Las neuritas se alargan profusamente durante el desarrollo tanto en el sistema nervioso central como en el periférico de todas las especies animales. Este fenómeno se refiere tanto a los axones como a las dendritas. Sin embargo, el crecimiento de neuritas en el SNC disminuye a medida que aumenta la edad del animal.
Las enzimas de condroitinasa han demostrado eficacia para mejorar los resultados funcionales en varios modelos in vivo de lesión de la médula espinal. Los polipéptidos de condroitinasas AC (SEQ ID NO: 5) y condroitinasa B (SEQ ID NO: 12) producidas de manera recombinante han demostrado su eficacia in vitro al superar la barrera de un límite de sustrato inhibitorio, como el aggrecano, que resulta en una extensión de neurita para las neuronas corticales de rata.
Los inventores han descubierto a través de un análisis de eliminación basado en las estructuras cristalinas disponibles, polipéptidos mutantes capaces de degradar proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG). La actividad de escisión de todos estos mutantes se ha analizado in vitro mediante un ensayo zimográfico utilizando aggrecano como sustrato. Se encontró que un polipéptido truncado de condroitinasa AC (nA50-cA275), (SEQ ID NO: 11), que carece de 50 y 275 aminoácidos de los extremos amino y carboxi, respectivamente, y que tiene un peso molecular de 38 kDa en comparación con 75 kDa de la proteína de longitud completa, era el tamaño mínimo que retenía la actividad según lo probado por un ensayo zimográfico. También se describe el mutante por eliminación de la condroitinasa B (nA120cA120), (SEQ ID NO: 17), que carece de 120 aminoácidos de cada uno de los extremos amino y carboxi y tiene un peso molecular de 26 kDa en comparación con 52 kDa de la proteína de longitud completa, y se demostró que conserva la actividad también en un ensayo zimográfico. La reducción en el tamaño y la complejidad de la molécula puede facilitar la difusión al sitio de acción y potencialmente reducir la inmunogenicidad para un uso terapéutico prolongado. Estas condroitinasas más pequeñas podrían ser posibles terapias para la lesión de la médula espinal.
La presente divulgación se refiere a un polipéptido mutante de AC con condroitinasa purificado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, Se Q ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO: 11, y también una composición que comprende un polipéptido mutante de la condroitinasa AC purificada que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO: 11, como se reivindica a continuación. Dicha composición puede comprender además compuestos que faciliten la plasticidad, el crecimiento y la regeneración de las neuritas, moléculas que superen la inhibición del crecimiento de las neuritas o promuevan el crecimiento nervioso, moléculas terapéuticas, moléculas de diagnóstico o una combinación de éstas, y los compuestos que facilitan la plasticidad y el crecimiento y la regeneración de las neuritas seleccionadas de antagonistas solubles de NOGO, moléculas de adhesión de células neurales, factores neurotróficos, factores de crecimiento, inhibidores de la fosfodiesterasa, inhibidores de MAG o MOG, neuregulinas y anticuerpos que promueven la remielinización. Las composiciones de la invención son para uso en el tratamiento de una lesión o trastorno del sistema nervioso central, en donde la lesión o trastorno del sistema nervioso central se selecciona de una lesión de contusión, una lesión cerebral traumática, un accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, una lesión del plexo braquial, amblioplia, y lesión de la médula espinal. Las composiciones son en forma de aplicación tópica, inyección de bolos, inyección intravenosa, inyección intratecal, inyección intramuscular, inyección peritoneal, inyección subcutánea, infusión continua, liberación sostenida de implantes, productos farmacéuticos de liberación sostenida y administración oral.
Los métodos asociados también se describen en este documento para ayudar a comprender la invención, pero estos no forman parte de la invención reivindicada. Ejemplos o realizaciones descritos en el presente documento que no se incluyen en la definición de las reivindicaciones no forman parte de la presente invención.
Se describen aquí mutantes polipeptídicos de las condroitinasas, por ejemplo, condroitinasa ABC Tipo I, SEQ ID NO: 1 o 37, condroitinasa ABC Tipo II, SEQ ID NO: 27, condroitinasa AC, SeQ ID NO: 5 y condroitinasa B, SEQ ID NO: 12. Otras enzimas de mamíferos mutantes con actividad similar a la condroitinasa pueden incluir independientemente enzimas tales como hialuronidasa 1, SEQ ID NO: 30, hialuronidasa 2, SEQ ID n O: 31, hialuronidasa 3, SEQ ID NO: 32, hialuronidasa 4, SEQ ID NO: 33 y, opcionalmente, PH-20, SEQ ID NO: 34. Este mutante de eliminación o sustitución se puede usar solo o en combinación con condroitinasas o sus mutantes de eliminación o sustitución como composiciones terapéuticas y mezclas. Además, se describe el uso de estos mutantes, y preferiblemente los mutantes de supresión o sustitución de condroitinasa para promover la recuperación funcional neurológica en mamíferos después de una lesión en el SNC, incluida la lesión por contusión.
Se describen aquí moléculas de ácido nucleico aisladas que consisten en, y que comprenden preferiblemente, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de polipéptidos que son eliminaciones y/o mutantes de sustitución de moléculas degradantes de proteoglicanos. Independientemente, las moléculas de ácido nucleico pueden codificar polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes de la condroitinasa, por ejemplo, condroitinasa ABC Tipo I, Se Q iD NO: 1 o 37, condroitinasa ABC Tipo II, SEQ ID NO: 27, condroitinasa AC, Se Q ID NO: 5 y condroitinasa B, SEQ ID NO: 12, hialuronidasa 1, SEQ ID NO: 30, hialuronidasa 2, SEQ ID NO: 31, hialuronidasa 3, SEQ ID NO: 32, hialuronidasa 4, SEQ ID NO: 33, u opcionalmente PH-20, SEQ ID NO: 34 y combinaciones de estos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos codifican mutantes de eliminación y sustitución de condroitinasa, más preferiblemente los ácidos nucleicos codifican polipéptidos ABC de tipo I o II de condroitinasa. También se describen moléculas de ácido nucleico que consisten en, y preferiblemente comprenden, una secuencia de nucleótidos complementaria a las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente. También se describen moléculas de ácido nucleico al menos 80%, preferiblemente 85% o 90%, aún más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. También se describen moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. También se describen vectores recombinantes que comprenden estas moléculas de ácido nucleico y células huésped transformadas con tales vectores.
También se describen polipéptidos aislados que consisten en, y que comprenden preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de eliminación y/o mutantes de sustitución de polipéptidos degradantes de proteoglicanos. Independientemente, los polipéptidos degradantes de proteoglicanos pueden incluir condroitinasas, por ejemplo, ABC Tipo I, SEQ ID NO: 1 o 37, condroitinasa ABC Tipo II, SEQ ID NO: 27, condroitinasa AC, SEQ ID NO: 5 y condroitinasa B, SEQ ID NO: 12, hialuronidasa 1, SEQ ID NO: 30, hialuronidasa 2, SEQ ID NO: 31, hialuronidasa 3, SEQ ID NO: 32, hialuronidasa 4, SEQ ID NO: 33, opcionalmente PH-20, SEQ ID NO: 34. Los polipéptidos son mutantes por eliminación de las condroitinasas. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse a partir de moléculas degradantes de proteoglicanos mutantes tales como estas condroitinasas y/o hialuronidasas; la composición puede incluir uno o más de los mutantes de eliminación y sustitución de diferentes polipéptidos degradantes de proteoglicanos.
Se describen polipéptidos degradantes de proteoglicanos biológicamente activos que tienen una eliminación o sustitución de al menos un aminoácido. Los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes incluyen aquellos que tienen el tamaño mínimo pero que aún retienen un grado de actividad determinado por los ensayos enzimáticos descritos en la especificación. Los mutantes de eliminación o sustitución preferidos de la molécula degradante de proteoglicanos son aquellos que degradan la condroitina y tienen una o más eliminaciones de aminoácidos del extremo N, de aproximadamente 1 a al menos aproximadamente 120 aminoácidos y/o del extremo C, de aproximadamente 1 a al menos aproximadamente 275 aminoácidos, más preferiblemente las eliminaciones son de una condroitinasa o una condroitinasa sustituida, e incluso más preferiblemente la condroitinasa ABC I o II o una condriotinasa sustituida ABC I o II.
En el presente documento se divulgan mutantes de eliminación y/o sustitución de polipéptidos degradantes de proteoglicanos, preferiblemente mutantes de eliminación de polipéptidos de condroitinasa, que promueven la regeneración de neuritas y/o plasticidad en el SNC y promueven o inhiben la difusión de moléculas terapéuticas en tejidos por degradación de proteoglicanos.
Los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes, preferiblemente mutantes de supresión y/o sustitución de condroitinasas, pueden promover la regeneración de neuritas en el SNC y/o promover o inhibir la difusión de moléculas terapéuticas en tejidos por degradación de proteoglicanos y pueden obtenerse mediante la expresión de secuencias de ADN adecuadamente modificadas. Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona vectores de expresión adecuados y células huésped compatibles con ellos.
La presente divulgación también incluye composiciones farmacéuticas que incluyen polipéptidos biológicamente activos de eliminación y/o sustitución de mutantes de moléculas degradantes de proteoglicanos, y preferiblemente mutantes de eliminación o sustitución de polipéptidos de degradación de condroitina como se describe anteriormente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los mutantes de eliminación y/o mutantes de sustitución de los polipéptidos degradantes de proteoglicanos de la presente divulgación pueden usarse para promover la regeneración de neuritas en el tejido nervioso. Estos mutantes también podrían ser útiles en el tratamiento de otros trastornos del SNC en los que la plasticidad, la regeneración, o ambos podrían ser beneficiosos. Por ejemplo, las lesiones y trastornos del SNC pueden incluir, entre otros, lesión por contusión, lesión cerebral traumática, apoplejía, esclerosis múltiple, lesión del plexo braquial, ambliopía. Debido a sus propiedades de degradación de proteoglicanos, se pueden usar para promover el suministro de composiciones terapéuticas y diagnósticos a tejidos y células que normalmente son impermeables a ellos. Alternativamente, se pueden usar para inhibir la penetración de composiciones terapéuticas, materiales de diagnóstico o células en tejidos que usan parte de la matriz extracelular para entrar en los tejidos. Debido a su tamaño más pequeño en comparación con la enzima de longitud completa, los mutantes de supresión y/o sustitución son más fáciles de hacer y más fáciles de administrar a las células y tejidos objetivo. Estos y otros mutantes aún más pequeños de eliminación o sustitución de moléculas degradantes de proteoglicanos podrían usarse como posibles agentes terapéuticos con menor inmunogenicidad y capacidad de penetración tisular similar o superior para el tratamiento de la lesión del SNC.
Los mutantes por eliminación pueden ofrecer ventajas significativas sobre las proteínas de longitud completa en el proceso de desarrollo terapéutico. La penetración tisular de las enzimas puede verse significativamente afectada por el tamaño de la proteína. El efecto del tamaño de la proteína en la penetración del tejido es difícil de predecir, pero depende del tamaño y la carga. La velocidad de penetración depende de la composición del tejido, las interacciones de carga y los efectos de hidratación. Tener enzimas activas de un tamaño muy amplio puede permitir la selección de una enzima en función de las propiedades óptimas de penetración del tejido, quizás maximizando las concentraciones efectivas o limitando la exposición periférica a la enzima.
La respuesta inmunitaria de un mamífero a una proteína bacteriana puede o no limitar la capacidad de usar la proteína o el polipéptido como un agente terapéutico. La generación de anticuerpos contra la proteína puede restringir las exposiciones repetidas, así como potencialmente inactivar la proteína terapéutica haciéndola inefectiva. Las enzimas degradantes de proteoglicanos mutantes más pequeñas, preferiblemente enzimas condroitinasas mutantes, pueden limitar los sitios antigénicos, limitar una respuesta inmune o al menos simplificar el proceso de ingeniería de una enzima con inmunogenicidad reducida.
La velocidad de liberación de proteínas a partir de matrices utilizadas a menudo en formulaciones de liberación sostenida puede depender del tamaño y la reticulación. La velocidad de liberación efectiva de los mutantes de eliminación del polipéptido degradante de proteoglicanos de la matriz se puede diseñar mediante la manipulación del tamaño de la enzima. Tener un repertorio de enzimas condroitinasas de varios tamaños y cargas dará una ventaja significativa para el desarrollo de formulaciones de liberación sostenida.
Breve descripción de las figuras.
La figura 1(A) muestra Inmunoprecipitación Western de Anti-His-etiqueta (parte superior) y zimograma (parte inferior) que demuestra la actividad de expresión de la condroitinasa B delimitada NA120 CA120 mutante (SEQ ID NO: 17); la figura 1(B) muestra el Inmunoprecipitación Western Anti-His-tag (arriba) y el zimograma (abajo) que demuestran la actividad de expresión de la eliminación de condroitinasa NA50 CA275 mutante (SEQ ID NO: 11);
La figura 2 ilustra la actividad de degradación relativa del sustrato de diversos polipéptidos mutantes de detección de la condroitinasa AC (SEQ ID NO: 6-11) en relación con la condroitinasa AC de longitud completa SEQ ID NO: 5; La figura 3(A) muestra un esquema de polipéptidos mutantes por eliminación de la condroitinasa AC (SEQ ID NO: 6­ 11); la figura 3(B)muestra la confirmación de mutantes por eliminación de condroitinasa AC mediante Inmunoprecipitación Western;
La figura 4 muestra la confirmación de la expresión de la proteína y la actividad catalítica de los mutantes de eliminación de la condroitinasa AC (SEQ ID NO: 6-11) mediante (A) Inmunoprecipitación Western y (B) zimografía;
La figura 5 muestra un esquema de polipéptidos mutantes por eliminación (SEQ ID NO: 13-17) de la condroitinasa B (SEQ ID NO: 12);
La figura 6 muestra la confirmación de la expresión de la proteína y la actividad catalítica de la condroitinasa B y los mutantes de eliminación (SEQ ID NO: 12-17) mediante (A) Inmunoprecipitación Western y (B) zimografía;
La figura 7 muestra un esquema de los polipéptidos mutantes por eliminación de la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 2-4) de la condroitinasa a Bc I SEQ ID No : 1;
Descripción detallada
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a una "célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia posteriormente descrito puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que ocurre el evento o el material está presente y casos en los que el evento no ocurre o donde el material no está presente.
Un aspecto de la presente divulgación se relaciona con una serie de mutantes de supresión y/o sustitución de genes de condroitinasa que se pueden usar para generar enzimas mutantes de eliminación con un peso molecular sustancialmente menor, pero modificado, y preferiblemente una actividad catalítica degradante de proteoglicanos equivalente en comparación con enzimas tipo silvestre. Los mutantes de eliminación y/o sustitución pueden generarse por reacción en cadena de la polimerasa. Los mutantes resultantes se expresan y luego se puede confirmar la actividad enzimática del polipéptido mutante mediante el uso de zimografía.
Los mutantes de las moléculas degradantes de proteoglicanos se pueden usar para tratar lesiones del SNC en los mamíferos, típicamente causadas por un trauma o enfermedad. En particular, un mutante por eliminación de una molécula polipeptídica degradante de proteoglicanos como la condroitinasa, por ejemplo ABC Tipo I, (SEQ ID NO: 1 o 37), condroitinasa ABC Tipo II, (SEQ ID NO: 27), condroitinasa AC, (SEQ ID NO: 5), y condroitinasa B, (SEQ ID NO: 12), o enzimas de mamíferos con actividad similar a la condroitinasa, como la hialuronidasa 1, (SEQ ID NO: 30), hialuronidasa 2, (SEQ ID NO: 31), hialuronidasa 3, (SEQ ID NO: 32), hialuronidasa 4, (SEQ ID NO: 33), y opcionalmente PH-20, (SEQ ID NO: 34), o mezclas de cualquiera de estos se pueden usar para proporcionar un tratamiento terapéutico para las lesiones y trastornos del SNC que pueden incluir, entre otros, lesión por contusión, lesión cerebral traumática, apoplejía, esclerosis múltiple, lesión del plexo braquial, ambliopía, lesiones de la médula espinal. Las lesiones de la médula espinal incluyen enfermedades y lesiones traumáticas, como el aplastamiento de las neuronas provocadas por un accidente automovilístico, una caída, una contusión o una herida de bala, así como otras lesiones. La práctica de los métodos actuales puede conferir beneficios clínicos al mamífero tratado, proporcionando mejoras clínicamente relevantes en al menos una de las funciones de coordinación motora del sujeto y la percepción sensorial. Las mejoras clínicamente relevantes pueden ir desde una mejora detectable hasta una restauración completa de una función deteriorada o pérdida del SNC.
Los mutantes de las moléculas degradantes de proteoglicanos, por ejemplo, los mutantes por eliminación de la condroitinasa AC (SEQ ID NO: 5), pueden tener su actividad enzimática estabilizada por la adición de excipientes o por liofilización. Los estabilizadores pueden incluir carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos y surfactantes y son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos incluyen carbohidratos tales como sacarosa, lactosa, manitol y dextrano, proteínas tales como albúmina y protamina, aminoácidos tales como arginina, glicina y treonina, surfactantes tales como TWEEN® y PLURONIC®, sales tales como cloruro de calcio y fosfato de sodio, y lípidos tales como ácidos grasos, fosfolípidos y sales biliares. Los estabilizantes pueden agregarse a los mutantes de eliminación del polipéptido degradante de proteoglicanos en una proporción de 1:10 a 4:1, carbohidrato a polipéptido, polipéptido de aminoácidos, estabilizador de proteína a polipéptido y sales a polipéptido 1:1000 a 1:20; tensioactivo para polipéptido; y 1:20 a 4:1, lípidos a polipéptido. Otros estabilizadores incluyen altas concentraciones de sulfato de amonio, acetato de sodio o sulfato de sodio, en base a estudios comparativos con la actividad heparinasa. Los agentes estabilizantes, preferiblemente el sulfato de amonio u otra sal similar, se agregan a la enzima en una proporción de 0.1 a 4.0 mg de sulfato de amonio/UI.
Los polipéptidos mutantes degradantes de proteoglicanos pueden formularse como composiciones y pueden administrarse por vía tópica, local o sistémica a un sujeto o paciente. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero e incluso más preferiblemente un ser humano que necesita una composición degradante de proteoglicanos tal como una de las condroitinasas. La administración tópica o local se puede utilizar para un mayor control de la aplicación. Se pueden mezclar uno o más polipéptidos mutantes degradantes de proteoglicanos, individualmente o en combinación, con un vehículo farmacéutico apropiado antes de la administración. Ejemplos de vehículos y aditivos farmacéuticos generalmente usados son diluyentes convencionales, aglutinantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes desintegrantes, agentes tampón, agentes isotonizantes, conservantes, anestésicos y similares. Específicamente, los portadores farmacéuticos que se pueden usar son dextrano, albúmina sérica, gelatina, creatinina, polietilenglicol, tensioactivos no iónicos (por ejemplo, ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, aceite de ricino endurecido con polioxietileno, ésteres de ácido graso de sacarosa, polioxietileno, polioxipropilen glicol) y compuestos similares.
Las composiciones que tienen un polipéptido degradante de proteoglicanos o un ácido nucleico para expresarlo también pueden incluir moléculas terapéuticas, diagnósticos y agentes para promover el crecimiento y la regeneración de las neuritas. Ejemplos de moléculas de diagnóstico pueden incluir, entre otros, sondas fluorescentes, radioisótopos, colorantes o agentes de contraste magnético. Los compuestos que facilitan la plasticidad, el crecimiento de las neuritas y la regeneración pueden incluir moléculas que superan la inhibición del crecimiento de las neuritas, o promueven el crecimiento de los nervios, como los antagonistas solubles de NOGO como NgR27-311, moléculas de adhesión de las células neurales como L1, factores neurotróficos, factores de crecimiento, inhibidores de la fosfodiesterasa, e inhibidores de MAG o MOG. Además, los mutantes por eliminación se pueden combinar con otros compuestos que promueven la remielinización, como las neuregulinas (GGF2) y los anticuerpos que promueven la remielinización.
La plasticidad del sistema nervioso se refiere a cualquier tipo de reorganización funcional. Esta reorganización se produce con el desarrollo, el aprendizaje y la memoria y la reparación del cerebro. Los cambios estructurales que se producen con la plasticidad pueden incluir la formación de sinapsis, la eliminación de sinapsis, el brote de neuritas e incluso pueden incluir el fortalecimiento o el debilitamiento de las sinapsis existentes. La regeneración generalmente se diferencia de la plasticidad por el crecimiento de largo alcance de los axones en tractos interrumpidos que es característico de la regeneración.
La actividad biológica de las moléculas de degradación de proteoglicanos de la presente invención se puede usar para controlar la tasa de degradación de los proteoglicanos en un tejido, y por ejemplo se puede elegir para tener una actividad de degradación más lenta para los tejidos sensibles y una mayor rata de degradación para degradar pociones de tejido que son más gruesas. La actividad puede controlarse por una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácidos en el polipéptido o vectores utilizados para expresarlos; la actividad puede controlarse mediante la concentración o combinación de polipéptidos degradantes de proteoglicanos en una composición. Se puede hacer que la actividad degradante del proteoglicano sea mayor o menor que la del polipéptido de longitud completa. Por ejemplo, se puede hacer que sea menor que la de la condroitinasa AC de longitud completa (SEQ ID NO: 5), y se puede hacer que sea menos de la mitad de activo que el polipéptido de longitud completa como se muestra en la figura 2. También, como se ilustra adicionalmente en la figura 2, se puede hacer que la actividad degradante del proteoglicano sea mayor que la condroitinasa AC de longitud completa (SEQ ID NO: 5), se puede hacer más activa que el polipéptido de longitud completa por un factor de 1.5 o más; puede ser más activo que el polipéptido de longitud completa por un factor de 2.5 o más.
También se describen en el presente documento cepas bacterianas de P. vulgaris nativas o de tipo salvaje que se pueden usar típicamente para producir condroitinasas ABC I, (SEQ ID NO: 1 o 37), y condroitinasa ABC II, (SEQ ID NO: 27), y mutantes de estos polipéptidos de longitud completa en condiciones de crecimiento ordinarias. Las cepas de tipo salvaje de P. vulgaris pueden inducirse para producir niveles detectables de condroitinasa ABCI y sus mutantes al proporcionar un sustrato inductor, como el sulfato de condroitina, como única fuente de carbono.
Se pueden usar ácidos nucleicos mutantes para expresar polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes. Los polipéptidos expresados o los ácidos nucleicos mutantes se pueden usar para tratar lesiones del SNC en mamíferos, generalmente causadas por un trauma o enfermedad. En particular, un ácido nucleico mutante por eliminación para expresar una molécula polipeptídica degradante de proteoglicanos como la condroitinasa ABC Tipo I, puede incluir la condroitinasa ABC I clonada (SEQ ID NO: 22 o 28), la condroitinasa ABC II, (SEQ ID NO: 26), los ácidos nucleicos para expresar las proteínas de fusión de los mutantes de eliminación TAT-condroitinasa ABC I NA60 (SEQ ID NO: 43) y los mutantes de estos genes en E. coli se pueden expresar utilizando un sistema de expresión heterólogo con un inductor artificial. La condroitinasa AC (SEQ ID NO: 22 o 28) y la condroitinasa B (SEQ iD NO: 26) y sus mutantes pueden clonarse a partir de F. heparinum y expresarse en E. coli.
Las moléculas de degradación de proteoglicanos de longitud completa como la condroitinasa AC (SEQ ID NO: 5), así como los mutantes de eliminación y/o sustitución de los polipéptidos de degradación de proteoglicanos se pueden clonar en varios vectores de expresión bacterianos y de mamíferos. Los vectores incluyen pET15b, pET14b, pGEX 6P1, pDNA4HisMax o pSECTag2b. Los mutantes de eliminación y los polipéptidos sustituidos exhiben la capacidad de degradar proteoglicanos como la condroitina CS y DS, y tienen un tamaño y peso molecular más pequeños que los polipéptidos de enzimas maduras, lo que se espera que facilite su difusión en las células, los tejidos y las membranas. Los vectores de expresión pueden incluir la secuencia de ácido nucleico que expresa un polipéptido degradante de proteoglicano mutante operativamente unido a una secuencia de control de la expresión. El enlace operativamente puede referirse a un enlace entre una secuencia de control de expresión y una secuencia de codificación, donde el enlace permite que la secuencia de control de expresión controle la expresión de la secuencia de codificación.
Las propiedades de los mutantes naturales, sustituidos y/o de eliminación de las moléculas degradantes de proteoglicanos pueden alterarse introduciendo una variedad de mutaciones en la proteína. Dichas alteraciones se introducen adecuadamente utilizando las técnicas de mutagénesis, por ejemplo, pero no se limitan a la mutagénesis de PRC, y las moléculas de polipéptidos mutados se sintetizan adecuadamente utilizando los vectores de expresión.
Los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes incluyen eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos de polipéptidos degradantes de proteoglicanos maduros. Preferiblemente, las eliminaciones o sustituciones incluyen cualesquiera dos aminoácidos consecutivos o separados, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos N o C terminales, y eliminaciones o sustituciones internas de aminoácidos en el polipéptido. Las eliminaciones y/o sustituciones pueden comenzar con cualquier aminoácido en la molécula y es posible tener dos eliminaciones separadas en la molécula. La eliminación o sustitución da como resultado un polipéptido degradante de proteoglicanos mutantes que es más pequeño que la enzima madura y conserva la capacidad de degradación de proteoglicanos. Los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes pueden fusionarse o unirse a otro polipéptido. El polipéptido se usa para englobar sin ambigüedad secuencias de aminoácidos para mutantes de cualquier longitud que tienen actividad degradante de proteoglicanos y mejorar la plasticidad, incluidas aquellas menos la secuencia de señalización que es inicialmente parte del polipéptido cuando se traduce y que se escinde mediante una modificación de la traducción del huésped.
Los ácidos nucleicos mutantes incluyen eliminaciones y/o sustituciones de nucleótidos de genes que expresan los polipéptidos degradantes de proteoglicanos maduros. Las mutaciones de eliminación y sustitución a nivel de ADN se utilizan para introducir sustituciones de aminoácidos y/o eliminaciones en la proteína codificada. Estas eliminaciones y sustituciones de nucleótidos pueden usarse para introducir eliminaciones y/o sustituciones en importantes regiones conformacionales o activas del polipéptido. Un fragmento de ácido nucleico es un ácido nucleico que tiene menos nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido degradante de proteoglicano maduro, pero que preferiblemente codifica un polipéptido mutante que retiene cierta actividad biológica de la proteína de longitud completa, por ejemplo, el fragmento polipeptídico conserva la capacidad de inducir la degradación de los proteoglicanos, promover la difusión de agentes terapéuticos en las células y tejidos, o promover la regeneración de neuritas. Los genes que codifican mutantes N o C terminales de dominios de polipéptidos degradantes de proteoglicanos unidos a otros polipéptidos también pueden usarse en construcciones para la expresión de proteínas de fusión unidas a polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes.
Los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes por eliminación y/o sustitución también pueden incluir derivados de estos polipéptidos que se han modificado química o enzimáticamente, pero que conservan su actividad biológica para degradar los proteoglicanos. La actividad degradante de proteoglicanos de estos mutantes puede controlarse dependiendo de la eliminación y/o sustitución realizada al polipéptido o al ácido nucleico usado para expresar el polipéptido. Las variantes, fragmentos o análogos de los polipéptidos o ácidos nucleicos degradantes de proteoglicanos maduros y los vectores utilizados para expresarlos incluyen polipéptidos mutantes y ácidos nucleicos que tienen una secuencia que difiere del polipéptido maduro o la secuencia de ácidos nucleicos en una o más eliminaciones, sustituciones o combinación de ambos, de tal manera que los polipéptidos degradantes de proteoglicanos retienen su actividad biológica y pueden degradar los proteoglicanos, y preferiblemente degradan los proteoglicanos de sulfato de condroitina.
Debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá que un gran número de moléculas de ácido nucleico tienen una secuencia de al menos el 80%, preferiblemente el 85% o el 90%, aún más preferiblemente el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula degradante de proteoglicanos mutantes codificará un polipéptido mutante que tiene actividad degradante de proteoglicanos y preferiblemente capacidad degradante de condroitina. Se reconocerá además que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido mutante que tiene actividad degradante de proteoglicanos. Esto se debe a que las sustituciones de aminoácidos que tienen una probabilidad menor o ninguna probabilidad de afectar significativamente la actividad polipeptídica (por ejemplo, reemplazar un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) degradan los proteoglicanos y preferiblemente degradan la condroitina.
Las variantes incluidas en el presente documento pueden contener sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a las secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos. Tales cambios alterarán, agregarán o eliminarán un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada. Las variantes se denominan "variantes modificadas de manera conservadora" en las que la alteración produce la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.
El descubrimiento de que la actividad degradante de proteoglicanos de los polipéptidos mutantes de eliminación y sustitución puede controlarse para que sea menor, aproximadamente igual o mayor que la molécula degradante de proteoglicanos de longitud completa tiene otra ventaja potencial. Una composición farmacéutica que contiene las moléculas degradantes de proteoglicanos puede administrarse por vía parenteral, intravenosa o subcutánea. El uso de un hidrogel compuesto por un polímero biodegradable que contiene el polipéptido y libera continuamente el polipéptido está limitado por la cantidad de polipéptido que puede estar incluido en el hidrogel. El uso de un mutante por eliminación del polipéptido con mayor actividad específica implica que, en una base molar, se puede encerrar más del principio activo en el mismo volumen, lo que aumenta el tiempo entre administraciones sucesivas o posiblemente evita administraciones repetidas.
La purificación del polipéptido obtenido después de la expresión depende de la célula hospedadora y del constructo de expresión utilizado. En general, la purificación de mutantes de supresión o sustitución de proteoglicanos se puede realizar de la misma manera que la purificación de polipéptidos nativos de longitud completa, incluido el uso de etiquetas de histidina.
Los polipéptidos y proteínas degradantes de proteoglicanos mutantes por eliminación o sustitución se administran en una cantidad eficaz para degradar los CSPG. Los polipéptidos pueden usarse para ayudar a la difusión de composiciones terapéuticas y de diagnóstico a los tejidos y pueden usarse para promover la recuperación de la función neurológica y el crecimiento de las neuritas. Una vez que las proteínas o polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes en las composiciones se han purificado en la medida deseada, se pueden suspender o diluir en un portador o excipiente fisiológico apropiado para el tratamiento con SCI o para ensayos de selección de composiciones que promuevan el crecimiento de neuritas in vitro en sustratos adecuados como aggrecano. En los modelos de SCI, las dosis intratecales efectivas de condroitinasas en ratas han sido de aproximadamente 0.06 unidades en días alternos durante 14 días. Una dosis para un humano de 70 kilogramos puede ser de aproximadamente 17 Unidades. A aproximadamente 100 Unidades/miligramo, esto equivaldría a unos 170 microgramos. Las dosis de hasta 20 Unidades parecen seguras en sujetos mamíferos como las ratas. Las composiciones pueden incluir un polipéptido mutante degradante de proteoglicano, preferiblemente polipéptidos de condroitinasa mutantes, y más preferiblemente aun polipéptidos de condroitinasa mutantes de eliminación. Estas composiciones también pueden incluir otras moléculas degradantes de proteoglicanos y mutantes de eliminación y/o sustitución de ellas, moléculas que bloquean la acción de los inhibidores del crecimiento de neuritas, moléculas que promueven la adhesión de neuritas o axones, diagnóstico, terapéutica o la molécula degradante de proteoglicanos como parte de una proteína de fusión. La mezcla o proteína de fusión se puede agregar a un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y se puede inyectar, generalmente en concentraciones en el rango de 1 |jg a 500 mg/kg de sujeto. La administración del agente puede ser mediante inyección en bolo, administración intravenosa, infusión continua, liberación sostenida de implantes o productos farmacéuticos de liberación sostenida. La administración por inyección puede ser intramuscular, peritoneal, subcutánea, intravenosa, intratecalmente. La administración oral puede incluir tabletas o cápsulas, preferiblemente la dosis oral es una formulación de liberación sostenida para administración una o dos veces al día. La administración percutánea puede ser una vez al día, y preferiblemente es menos de una administración al día. La administración al paciente humano u otro sujeto mamífero puede continuarse hasta que se logre una mejora medible en la función autónoma o motora en el paciente.
Los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes o polipéptidos de fusión que los incluyen también pueden expresarse o secretarse por células modificadas genéticamente. El polipéptido degradante de proteoglicano o polipéptidos de fusión expresados pueden recogerse y purificarse para una composición terapéutica, o las células modificadas genéticamente pueden implantarse, ya sea libres o en una cápsula, en o cerca del sitio de la lesión del SNC o un tejido en el que se desea la difusión controlada de la molécula terapéutica o diagnóstica. Los ácidos nucleicos mutantes para expresar polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes se ilustran mediante ejemplos de condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 22 y 28) que codifican polipéptidos ABC I de condroitinasa sustituidos y aquellos sin secuencias de aminoácidos líder; mutante de ácido nucleico de la condroitinasa B (SEQ ID NO: 21) que codifica el polipéptido mutante NA120 CA120 de la condroitinasa B (SEQ ID NO: 21); y la condroitinasa AC mutante de ácido nucleico (SEQ ID NO: 19) que codifica el polipéptido mutante NA50 CA275 de la condroitinasa AC (SEQ ID NO: 11). Un ejemplo de un ácido nucleico de fusión incluye un constructo de ADN de fusión de condroitinasa ABCI mutante por eliminación TAT (SEQ ID NO: 41). Otro ejemplo sería un ácido nucleico para TAT-condroitinasa ABCI-NA60 (SEQ ID NO: 43) para el polipéptido expresado (SEQ Id NO: 44).
Una vez que el polipéptido degradante de proteoglicano mutante se administra a células o un tejido con CSPG, la degradación de los CSPG elimina las moléculas inhibitorias que bloquean el crecimiento de las neuritas y permiten la regeneración de las neuritas en el área afectada. La eliminación de CSPG también promueve la plasticidad en el SNC. Por ejemplo, los polipéptidos de longitud completa de la condroitinasa AC (SEQ ID NO: 5) y la condroitinasa B (SEQ ID NO: 12), degradan CS y DS, respectivamente, dando como resultado disacáridos sulfatados insaturados. La condroitinasa AC (SEQ ID NO: 5), escinde CS en enlaces glicosídicos 1,4 entre N-acetilgalactosamina y ácido glucurónico en el esqueleto de polisacárido de CS. La escisión se produce a través de la eliminación beta en un patrón de acción endolítica aleatoria. La condroitinasa B (SEQ ID NO: 12) rompe el enlace del ácido idurónico galactosamina 1,4 en el esqueleto de polisacárido de DS. La división tanto de CS como de DS ocurre a través de un proceso de eliminación beta que diferencia estos mecanismos enzimáticos de las enzimas degradadoras de GAG de mamíferos. La condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 1), la condroitinasa ABC II (SEQ ID NO: 27) son exo y endoliasas que escinden tanto CS como DS. La eliminación de CS y DS de una cicatriz glial permite la regeneración de las neuritas en el área lesionada y promueve la plasticidad. Por ejemplo, las moléculas degradantes de proteoglicanos ilustradas en la Figura 2, condroitinasa AC (SEQ ID NO: 5) y varios condroitinasa AC mutante (SEQ ID NO: 6-11) degradan un sustrato de proteoglicano modelo en diversas cantidades. Se muestran resultados similares mediante un zimógrafo in vitro para la condroitinasa B (SEQ ID NO: 12) y los mutantes ilustrativos (SEQ ID NO: 13-17) en la Figura 6. Es razonable esperar que, dado que una molécula degradadora de proteoglicanos como la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 1) mejora la recuperación funcional en ratas con lesión contusiva de la médula espinal y también facilita la difusión de compuestos modelo en el tejido cerebral, los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes y las composiciones que los contienen también pueden mejorar la recuperación funcional en sujetos mamíferos como ratas con lesiones contusivas de la médula espinal y también pueden facilitar la difusión de compuestos modelo en el tejido cerebral.
La regeneración de las células nerviosas y la restauración de la plasticidad en el área del SNC afectada permite el retorno de la función motora y sensorial. La mejora clínicamente relevante variará desde una mejora detectable hasta una restauración completa de una función nerviosa deteriorada o perdida, que varía según los pacientes y las lesiones individuales. El grado de recuperación funcional se puede demostrar mejorando la conducción del tracto corticoespinal, mejorando la extracción de la cinta, la marcha en viga, marcha rejilla y la colocación de la pata después del tratamiento con condroitinasa de una lesión de la columna dorsal. La mejora de las habilidades motoras, así como la función autónoma: la función intestinal, vesical, sensorial y sexual también pueden usarse como medidas de mejora de la función y ser relacionadas con la estructura molecular y los componentes en las composiciones de la presente divulgación.
Se puede generar una serie de polinucleótidos que incluyen la codificación para la eliminación o mutación de sustitución de los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mediante PCR utilizando los ADNc de longitud completa para los proteoglicanos como plantillas y se clonan en un vector de expresión como pET15b en los sitios NdeI y BamHI para expresión en E. coli. Después de la inducción de la expresión génica con isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG), las bacterias pueden someterse a lisis por sonicación con la extracción concomitante del polipéptido mutante con un surfactante como Triton X-114/PBS. La mayoría de los polipéptidos degradantes de proteoglicanos recombinantes se pueden encontrar en la fracción citosólica del lisado de células bacterianas y los protocolos de purificación de condroitinasa se pueden usar para obtener la enzima degradante de proteoglicanos mutantes con alta actividad con altos rendimientos. Este protocolo puede incluir la purificación por una columna que tenga un anticuerpo anti-His para unirse selectivamente a los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes marcados con His y también puede incluir cromatografía de intercambio catiónico como paso de captura y filtración en gel como paso de pulimiento. Después de estos pasos, la filtración de membrana de intercambio aniónico, por ejemplo, Intercept Q, Millipore, puede usarse para la eliminación de endotoxinas y ADN del huésped. Después de la filtración, los polipéptidos mutantes degradantes de proteoglicanos pueden dializarse en un regulador volátil, pH 8.0 y liofilizarse hasta sequedad. Se espera que el producto final sea estable a -70°C para el almacenamiento a largo plazo. El pl del polipéptido mutante degradante de proteoglicano básico purificado puede determinarse mediante el análisis IEF-PAGE de las muestras del lisado celular crudo.
Se puede usar una variedad de métodos analíticos para comparar la actividad enzimática de la versión recombinante de los mutantes de eliminación o sustitución de los polipéptidos degradantes de proteoglicanos con los de las moléculas degradantes de proteoglicanos de longitud completa como la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37) o una forma disponible comercialmente de la enzima. Los métodos también pueden adaptarse para evaluar la actividad de proteínas de fusión que incluyen una porción de polipéptido degradante de proteoglicano mutante. Las mediciones de actividad específica se pueden obtener utilizando un ensayo espectrofotométrico aceptado que mide el cambio en la absorbancia debido a la producción de productos de reacción a partir de la degradación de los proteoglicanos. La cromatografía de exclusión por tamaño se puede usar para comparar las propiedades hidrodinámicas de las enzimas mutantes.
Se puede usar una forma de zimografía para caracterizar la enzima degradadora de proteoglicanos madura y se puede adaptar para la caracterización de los mutantes polipéptidos degradantes de proteoglicanos. Los geles de poliacrilamida pueden polimerizarse en presencia de aggrecano, un sustrato para moléculas degradantes de proteoglicanos como la condroitinasa ABCI. Los polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes, muestras de enzimas, pueden resolverse en los geles impregnados con aggrecano por electroforesis en presencia de SDS. Los geles se pueden someter luego a una etapa de renaturalización en donde se puede extraer el SDS y dejar que las enzimas se replieguen. La enzima replegada recupera la actividad y luego digiere el aggrecano dentro del gel y la pérdida resultante de carbohidratos en esa región del gel que puede visualizarse mediante una mancha específica de carbohidratos. Se esperaría una pérdida similar de carbohidratos en el gel para formas igualmente activas y concentración de las moléculas degradantes de proteoglicanos mutantes. En el caso de la condroitinasa ABCI recombinante, su actividad se puede visualizar como un punto claro en el zimograma. Los resultados de la zimografía son consistentes con el análisis espectrofotométrico.
Los métodos de HPLC se pueden usar para detectar los cuatro y seis disacáridos sulfatados (A4DS y A6DS, respectivamente) liberados como resultado de la digestión del polipéptido degradante de proteoglicanos mutantes de CSPG. Los dos disacáridos pueden resolverse eficazmente por cromatografía de intercambio aniónico. Se espera que el ensayo de HPLC para la cuantificación de A4DS y A6DS de los cromatogramas produzca una relación lineal proporcional a las cantidades inyectadas en la HPLC. La producción de A4DS y A6DS a partir de la digestión con CSPG está directamente relacionada con la cantidad de actividad específica de condroitinasa determinada por el ensayo espectrofotométrico. Este ensayo se puede usar como un método sensible y preciso para cuantificar independientemente la A4DS y la A6DS liberada por la digestión de polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes de una variedad de sustratos y también se puede usar para determinar la actividad de los polipéptidos degradantes de proteoglicanos y las proteínas de fusión que los incluyen.
Otro ensayo funcional que se puede realizar para caracterizar la actividad del polipéptido proteoglicano mutante es cuando se colocan neuronas ganglianas de la raíz dorsal (DRG) en placas de aggrecano o aggrecano tratado con un polipéptido degradante de proteoglicano mutante por eliminación o sustitución. Se espera que las neuronas sembradas en aggrecano no se adhieran a la placa y extiendan los axones. En contraste, se esperaría que las neuronas sembradas en aggrecano tratado con un polipéptido degradante de proteoglicanos mutantes en una composición o como parte de un polipéptido de fusión se adhieran a la superficie y extiendan los axones. Se cree que el extenso crecimiento del axón, que se observa para la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37) se debe a la digestión de los carbohidratos en la proteína del núcleo de aggrecano que crea un sustrato más permisivo para el crecimiento del axón.
La invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Este ejemplo vaticinador ilustra la difusión de moléculas en células y tejidos utilizando un mutante de eliminación o sustitución de un polipéptido degradante de proteoglicanos en una composición.
Un cerebro de una rata Sprague Dawley adulta puede retirarse del cráneo y los hemisferios pueden empaparse en regulador solo o que contiene aproximadamente 33 U/ml de un polipéptido degradante de proteoglicanos mutantes tal como la proteína (SEQ ID NO: 9) NA50 CA200 AC (T74-T500) durante 2 horas a 37°C. Los hemisferios pueden enjuagarse y colocarse inmediatamente en un colorante como la eosina Y (Sigma) o una solución saturada de rojo Congo (Sigma) en etanol al 70%. Se pueden cortar secciones de tejido y obtener imágenes en un escáner. La penetración de los colorantes en el tejido cerebral puede usarse como una indicación de la actividad degradante de proteoglicanos de una molécula degradante de proteoglicanos mutantes y la penetración o difusión expectante de moléculas terapéuticas y de diagnóstico en el mismo tipo de tejido.
Ejemplo 2
Este ejemplo vaticinador ilustra un protocolo de ensayo de condroitinasa ABC I que puede modificarse para medir la actividad de una molécula degradante de proteoglicanos mutante, por ejemplo, un mutante de eliminación de condroitinasa ABCI o proteínas de fusión que incluyen una mutación por eliminación y/o sustitución de un mutante de un polipéptido degradante de proteoglicanos.
La producción de productos de reacción a partir de la actividad catalítica de una molécula degradante de proteoglicanos o proteína de fusión se puede determinar mediante una medición de la absorbancia del producto de degradación de proteoglicanos a una longitud de onda de 232 nm. Una mezcla de reacción típica consistió en 120 pl de mezcla de reacción (Tris 40 mM, pH 8.0, acetato de Na 40 mM, caseína al 0.002%) combinada con un sustrato (5 pl de condroitina C 50 mM (PM 521), condroitina 6 SO4 o sulfato de dermatán) y 1.5 pl de condroitinasa ABCI (SEQ ID NO: 1) o un mutante de la condroitinasa similar (SEQ ID NO: 2). Se pueden preparar alícuotas de la mezcla de reacción de aproximadamente 120 pl a 30-37°C durante 3 minutos o más. La formación del producto se controla como un aumento de la absorbancia a 232 nm en función del tiempo a una longitud de onda de 232 nm utilizando un espectrómetro. La reacción se puede detener mediante la adición de SDS al 0.1%, seguida de ebullición durante 5 minutos. La actividad observada se puede convertir en unidades (pmoles de producto formado por minuto) utilizando el coeficiente de absorción molar para el doble enlace C4-C5 formado en la reacción (3800 c irr1min'1).
Conociendo el coeficiente de absorción molar para el producto de reacción, midiendo el cambio en la absorbancia del producto de reacción a una lectura de 232 nm a lo largo del tiempo al agregar una cantidad conocida de condroitinasa ABCI (SEQ ID NO: 1) u otro polipéptido degradante de proteoglicano mutante a la mezcla de reacción de 120 pl con 0.002% de caseína y un sustrato de condroitina agregado, puede determinarse la actividad específica en umol/min del polipéptido degradante de proteoglicano mutante. La condroitinasa ABC I de Seikagaku tiene una actividad específica en estas condiciones de ensayo de aproximadamente 450 pmoles/min/mg.
Una molécula degradante de proteoglicanos como la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37) digiere la condroitina presente en el tejido del SNC y mejora la recuperación funcional en ratas con lesiones por contusión en la médula espinal. Es razonable esperar que los mutantes de las moléculas degradantes de proteoglicanos, como el polipéptido (SEQ ID NO: 11) NA50 CA275 AC (T74-T426) que muestre actividad degradante de proteoglicanos también puedan mostrar cierta regeneración de los nervios, estimular la plasticidad y ser útiles para la difusión de agentes en los tejidos. El modo de administración, el momento de la administración y la dosificación se llevan a cabo de manera que la recuperación funcional del deterioro del SNC se vea favorecida por la promoción del crecimiento y la plasticidad de las neuritas. Es razonable esperar que una vez que se administren los mutantes de eliminación o sustitución de las moléculas degradantes de proteoglicanos tales como la proteína (SEQ ID NO: 11) NA50 CA275 AC (T74-T426), la degradación de los CSPG pueda eliminar las moléculas inhibitorias en el tejido que bloquea la difusión del fármaco, bloquear el crecimiento de las neuritas y promover la regeneración de las neuritas u otras terapias en el área afectada. La regeneración y la plasticidad de las células nerviosas en el área del SNC afectada puede permitir el retorno de la función motora y sensorial. Las mejoras clínicamente relevantes irán desde una mejora detectable hasta una restauración completa de una función nerviosa deteriorada o perdida, que varía según los pacientes individuales y las lesiones.
Ejemplo 3
Este ejemplo muestra que los mutantes por eliminación de la condroitinasa son biológicamente activos.
Las condroitinasas AC y B producidas de forma recombinante han demostrado su eficacia in vitro al superar la barrera de un borde de sustrato inhibitorio, como el aggrecano, y dan como resultado la extensión de las neuritas para las neuronas corticales de rata. Para facilitar el transporte efectivo de las enzimas anteriores al sitio de la lesión, se prepararon mutantes por eliminación de estas condroitinasas para determinar los polipéptidos de tamaño mínimo capaces de degradar los CSPG. La actividad de escisión de todos estos mutantes se ha analizado in vitro mediante un ensayo zimográfico utilizando aggrecano como sustrato. Se encontró que un polipéptido truncado de condroitinasa AC (nA50-cA275) (SEQ ID NO: 11) que carece de 50 y 275 aminoácidos de los terminales amino y carboxi, respectivamente, que tiene un peso molecular de 38 kDa en comparación con 75 kDa de la proteína de longitud completa aproximadamente el tamaño mínimo de la condroitinasa AC mutante que retiene la actividad según se analiza mediante un ensayo de zimografía Figura 4(B). Sin embargo, un mutante aún más pequeño, el mutante por eliminación de la condroitinasa B (nA 120-cA 120) (SEQ ID NO: 17) que carece de 120 aminoácidos de cada uno de los extremos amino y carboxi, tiene un peso molecular de 26 kDa en comparación con 52 kDa de la proteína de longitud completa, también se ha demostrado que retiene la actividad en el ensayo de zimografía figura 6(B). Estos y otros mutantes de eliminación incluso más pequeños se podrían usar como posibles agentes terapéuticos con menor inmunogenicidad y una capacidad de penetración tisular similar o superior en comparación con la enzima madura y se podrían usar para el tratamiento de lesiones de la médula espinal.
Se generó una serie de mutantes de eliminación de condroitinasa AC y B mediante PCR utilizando los ADNc de longitud completa para condroitinasas AC y B como moldes y se clonaron en el vector de expresión pET15b en los sitios Ndel y BamHI. Se construyeron mutantes de longitud completa y de eliminación con etiquetas de histidina para facilitar la detección y purificación. Cada uno de estos ADNc se indujo mediante isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y la expresión se confirmó mediante inmunoprecipitación Western usando un anticuerpo anti-His (Novagen). La figura 3(A) muestra esquemáticamente varios mutantes de eliminación no limitantes, y la figura 3(B) muestra la confirmación de la expresión de estos polipéptidos mutantes de la condroitinasa AC mediante transferencia de antihistidina con etiqueta Inmunoprecipitación Western. Las figuras 5 y 6 muestran la misma información para las eliminaciones de condroitinasa B. Las transferencias Western demuestran proteínas de tamaño predicho. La PAGE zimográfica de los mutantes por eliminación muestra bandas intensas de digestión del sustrato (liviano) y tinción negativa para carbohidratos.
Ensayo de zimografía. Los geles de SDS-poliacrilamida se vertieron con aggrecano (85 pg/ml) polimerizado en él. Los extractos crudos de mutantes por eliminación de las condroitinasas AC y B se corrieron y se volvieron a madurar a 37°C durante la noche. Después de la separación, el gel se incuba en cetilpiridinio al 0.2% durante 90 minutos a temperatura ambiente. La digestión de los proteoglicanos por las condroitinasas se visualiza tiñendo el gel con Azul de toluideno al 0.2% en etanol-H2O-ácido acético (50:49:1 v/v/v) durante 30 minutos y se destiñe con etanol-H2O-ácido acetálico (50: 49:1 v/v/v). Después de desteñir, el gel se incuba durante la noche en una solución de 50 pg/ml de Stains-all en etanol al 50% en la oscuridad y se destiñe con H2O. La aparición de bandas claras en el gel muestra la digestión de los carbohidratos por las condroitinasas de la CSPG que abandonan la proteína central que permanece sin teñir (figura 4 y figura 6).
Ejemplo 4
Este ejemplo describe el enlace de una etiqueta His a un polipéptido degradante de proteoglicanos mutantes.
Los mutantes por eliminación de la condroitinasa ABC I en donde al mutante le falta un cierto número de aminoácidos del extremo N-terminal y mantiene la actividad degradante de proteoglicanos se pueden generar (SEQ ID NO: 2-4). Estas eliminaciones N-terminales mantienen una etiqueta de histidina que está unida al extremo N; sin embargo, la condroitinasa ABC I de longitud completa etiquetada de manera similar (SEQ ID NO: 1) no mantuvo la etiqueta de histidina después de la experimentación.
Los mutantes de eliminación catalíticamente activos de la condroitinasa ABC I se pueden preparar, por ejemplo, pero no se limitan a eliminar 20 y 60 aminoácidos respectivamente del extremo N de la proteína ABC I madura como se muestra en la figura 7. También se puede hacer un polipéptido mutante con eliminaciones N y C terminales tales como la condroitinasa ABC I-NA60-CA80 (SEQ ID NO: 4).
Estos mutantes de eliminación de condroitinasa y mutantes de otras moléculas degradantes de proteoglicanos pueden usarse para la construcción de la proteína quimérica de fusión N-terminal. Las pruebas de ensayo con estos polipéptidos de fusión para la degradación de condroitina se pueden usar para determinar la eficacia de ABCI maduro frente a varios mutantes por eliminación en composiciones y proteínas de fusión con respecto a la especificidad del sustrato, la unión al sustrato y la penetración en el tejido. El ensayo funcional se puede realizar para caracterizar la actividad del polipéptido proteoglicano mutante o polipéptidos de fusión que los incluyen. En este ensayo funcional, las neuronas ganglianas de la raíz dorsal (DRG) se pueden colocar en placas de aggrecano o aggrecano tratado con un polipéptido degradante de proteoglicanos mutantes o un polipéptido de fusión que incluya el mutante. Se espera que las neuronas sembradas en aggrecano no se adhieran a la placa y extiendan los axones. En contraste, se esperaría que las neuronas sembradas en aggrecano tratadas con un polipéptido degradante de proteoglicanos mutantes o un polipéptido de fusión que incluya el mutante en una composición o como parte de un polipéptido de fusión se adhieran a la superficie y extiendan los axones. Se cree que el crecimiento extenso del axón, que se observa para una condroitinasa como la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 1 o 37) en el sustrato de aggrecano se debe a la digestión de los carbohidratos en la proteína del núcleo de aggrecano, lo que crea un sustrato más permisivo para crecimiento del axón.
Ejemplo 5
Este ejemplo vaticinador describe un mutante de la condroitinasa ABC I que tiene una estructura de proteína nativa, pero carece de actividad catalítica degradadora de proteoglicanos.
Este mutante se puede preparar como un control nulo o negativo para los bioensayos y los estudios de SCI. Sobre la base de la estructura cristalina de la condroitinasa ABC I, se puede preparar un mutante específico del sitio designado como H501a e Y508a (SEQ ID NO: 36) para eliminar la actividad catalítica en el sitio activo supuesto. Dichos mutantes pueden analizarse para determinar la inactivación de la actividad catalítica y la SEC para compararlos con la enzima de tipo salvaje. El mutante de actividad nula también se puede usar para proporcionar un control negativo para las diversas proteínas de fusión degradantes de proteoglicanos para su uso en bioensayos y, en última instancia, en estudios con animales con SCI.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra ejemplos de polipéptidos degradantes de proteoglicanos mutantes que incluyen tanto la sustitución como las eliminaciones de los polipéptidos de la presente invención.
La secuencia de la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37) es una secuencia publicada para un péptido de la condroitinasa ABC I madura e incluye la secuencia guía. La secuencia de la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO: 37) es similar a (SEQ ID NO: 1 o 29), sin embargo (SEQ ID NO: 1) no tiene los primeros 25 aminoácidos de (SEQ ID No : 37), y los aminoácidos en las posiciones 154 y 195 de (SEQ ID NO: 37) difieren de aquellos (sustituciones) encontrados en posiciones similares cuando (SEQ ID NO: 1) y (SEQ ID NO: 37) están alineados.
(La SEQ ID NO: 38-40) ilustra las eliminaciones del terminal N o C del polipéptido (SEQ ID NO: 37) y las sustituciones relativas a la (SEQ ID NO: 1). Estos polipéptidos mutantes son NA20 (SEQ ID NO: 38), NA60 (SEQ ID NO: 39) y NA60 CA80 (SEQ ID NO: 40).
Ejemplo 7
Este ejemplo presenta ilustraciones no limitativas de polipéptidos mutantes de la presente invención fusionados con un polipéptido de transducción de membrana tal como, entre otros, una porción polipeptídica de una proteína TAT del VIH. Las listas de secuencias completas para los polipéptidos de fusión mutantes se proporcionan en la lista de secuencias incluida en la especificación.
Una secuencia de nucleótidos para la condroitinasa ABCI-nA20 de TAT (SEQ ID NO 41), una parte de la cual se ilustra a continuación, muestra los nucleótidos de la secuencia TAT resaltados subrayando los enlaces a los nucleótidos de condroitinasa.
1 ggtc gtaaaaagcg tcgtcaacgt cgtcgtcctc ctcaatgcgc acaaaataac
61 ccattagcag acttctcatc agataaaaac tcaatactaa cgttatctga taaacgtagc
Los nucleótidos subrayados en esta porción de la secuencia de ácido nucleico denotan una secuencia TAT unida al 5' del ácido nucleico de la condroitinasa ABC I-NA20 (SEQ ID NO. 47).
Una secuencia de aminoácidos para TAT-condroitinasa ABCI-nA20 (SEQ ID NO. 42), una parte de la cual se muestra a continuación, ilustra los aminoácidos de la secuencia TAT resaltados subrayando en el extremo N de la condroitinasa ABCI-NA20 (SEQ ID NO. 2). grkkrrqrrrppqcaqnnpladfssdknsiltlsdkrsimgnqsllwkwkggssftlhkklivptdkeaskawgrsstpvfsfwly nekpidgyltidfgeklistseaqagfkvkldfígwrtvgvslnndlenremtlnatntssdgtqdsigrslgakvdsirfkapsnvsq geiy
Una secuencia de nucleótidos para TAT-ABCI-NA60 (SEQ ID NO. 43), una parte de la cual se ilustra a continuación, muestra los nucleótidos TAT N-terminales (SEQ ID NO. 49) resaltados al subrayar. ggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtcgtcgtcctcctcaatgctttactttacataaaaaactgattgtccccaccgataaagaagcatcta aagcatggggacgctcatccacccccgttttctcattttggctttacaatgaaaaaccgattgatggttatcttactatcgatttcgg.......
La secuencia de aminoácidos para TAT-ABCI-nA60 (SEQ ID NO. 44) una parte de la cual se muestra a continuación, ilustra la secuencia TAT (SEQ ID NO. 50) resaltada al subrayar en el extremo N de la condroitinasa ABC I -NA60 (SEQ ID NO. 3).
grkkrrqrrrppqcftlhkklivptdkeaskawgrsstpvfsfwlynekpidgyltidfgeklistseaqagfkvkldftgwrtvgvsl nndlenremtlnatntssdgtqdsigrslgakvdsirfkapsnvsqgeiyidrimfsvddaryqwsdyqvktrlsepeiqf....
La secuencia de nucleótidos para ABCI-TAT-C (SEQ ID NO. 45), una parte de la cual se ilustra a continuación, muestra los nucleótidos de la secuencia TAT C-terminal resaltados por el subrayado. El codón de detención de la condroitinasa ABC I (SEQ ID NO. 28) se reemplazó por la secuencia TAT y se colocó en el extremo 3' de la secuencia TAT.
... gattaatggcaaatggcaatctgctgataaaaatagtgaagtgaaatatcaggtttctggtgataacactgaactgacgtttacgagtt actttggtattccacaagaaatcaaactctcgccactccct ggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtcgtcgtcctcctcaatgctag
La secuencia de aminoácidos para ABCI-TAT-C (SEQ ID NO. 46), una parte de la cual se muestra a continuación, ilustra la secuencia TAT, resaltada por el subrayado, unida al polipéptido condroitinasa en el extremo C-terminal de la condroitinasa madura ABC I (SEQ ID NO: 1).
... aekvnvsrqhqvsaenknrqptegnfssawidhstrpkdasyeymvfldatpekmgemaqkfrennglyqvlrkdkdvhi ildklsnvtgyafyqpasiedkwikkvnkpaivmthrqkdtlivsavtpdlnmtrqkaatpvtinvtingkwqsadknsevkyq vsgdnteltftsvfgipqeiklsplpgrkkrrqrrrppqc
Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra la secuencia de ácido nucleico de condroitinasa y polipéptidos que pueden usarse para eliminaciones o sustituciones en mutantes de la presente invención. En esta secuencia, las discrepancias de las secuencias publicadas se resaltan en negrita tanto a nivel de nucleótidos como a nivel de aminoácidos. Estos son ilustrativos de las sustituciones en la presente invención.
SEQ ID NO: 26 Ácido nucleico de condroitinasa ABC II de la presente invención
> ABC i maduro ¡ 2973 i t ve .
>_ ABC l (prESEnte invención) 297 ■' n t
matriz de puntuación:. penalidad de brecha - 12 / - 2
deidenídad: Puntuación de alineación global: " 984
10 20 30 40 50 60 8C6559 TTACCCACTCTGTCTCATGAAGCTTTCGGCGATATTTATCTTTTTGAAGGTGAATTACCC _ TTACCCAC TCTGTCTCATGAAGCTTTCGGCGATATTTATCTTTTTGAAGGCGAATTACCC 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 80655 9 AATACCCTTACCACTTCAAATAATAATCAATTATCGCTAAGCAAACAGCATGCTAAAGAT _ AATATC CTTACCACTTCAAATAATAATCAAT TATCGC TAAGCAAACAGCAT GCTAAAGAT 70 80 90 100 110 12C 130 140 150 160 170 180 806559 GGTGAACAATCACTCAAATGGCAATATCAACCACAAGCAACATTAACACTAAATAATATT _ GGTGAACAATCACTCAAATGGCAATATCAACCACAAGCAACATTAACACTAAATAATATT 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 806559 GTTAATTACCAAGATGATAAAAATACAGCCACACCACTCACTT TTATGATGTGGATTTAT _ GTTAATTACCAAGAT GATAAAAATACAGCCACACCACTCAC TTTTATGATGTGGAT TTAT 190 2C0 210 220 230 240 550 260 270 260 290 300 806559 AATGAAAAACCTCAATCTTCCCCATTAACGTTAGCATTTAAACAñAATAATAAAATTGCA _ AATGAAAAACC TCAATCTTCCCCAT TAACGTTAGCAT TTAAACAAAATAATAAAATT GCA 250 260 270 260 290 300 310 320 330 340 350 36C 806559 CTAAGTTTTAATGCTGAACTTAATTTTACGGGGTGGCGAGGTATTGCTGTTCCTTTTCGT CTAAGTTTTAATGCTGAACTTAATTTTACGGGGTGGCGAGGTATTGCTGTTCCTTTTCGT
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 806c5 9 GATATGCAAGGCTCTGTGACAGGTCAACT TGATCAATTAGTGATCACCGC TCCAAACCAA _ GATATGCAAGGCTCTGCGACAGGTCAACTTGATCAATTAGTGATCACCGCTCCAAACCAA 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 806559 GCCGGAACACTCTTTTTTGATCAAATCATCATGAGTGTACCGTTAGACAATCGTTGGGCA _ GCCGGAACACTCTTTTTTGATCAAATCATCATGAGTGTACCGTTAGACAATCGTTGGGCA 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 806559 GTACCTGACTATCAAACACCTTACGTAAATAACGCAGTAAACACGATGGTTAGTAAAAAC _ GTACCTGACTATCAAACACCTTACGTAAATAACGCAGTAAACACGATGGTTAGTAAAAAC 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 806559 TGGAGTGCATTATTGATGTACGATCAGATGTTTCAAGCCCATTACCCTACTTTAAACTTC _ TGGAGTGCATTATTGATGTACGATCAGATGTTTCAAGCCCATTACCCTACTTTAAACTTC 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 806559 GATACTGAATTTCGCGATGACCAAACAGAAATGGCTTCGAGGTATCAGCGCTTTGAATAT _ GATACTGAATTTCGCGATGACCAAACAGAAATGGCTTCGATTTATCAGCGCTTTGAATAT 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 806559 TATCAAGGAATTCGTAGTGATAAAAAAATTACTCCAGATATGCTAGATAAACATTTAGCA _ TATCAAGGAATTCGTAGTGATAAAAAAATTACTCCAGATATGCTAGATAAACATTTAGCG 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 806559 TTATGGGAAAAATTGGTGTTAACACAACACGCTGATGGTTCAATCACAGGAAAAGCCCTT _ TTATGGGAAAAATTGGGGTTAACACAACACGCTGATGGCTCAATCACAGGAAAAGCCCTT 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 806559 GATCACCCTAACCGGCAACATTTTATGAAAGTCGAAGGTGTATTTAGTGAGGGGACTCAA _ GATCACCCTAACCGGCAACATTTTATGAAAGTCGAAGGTGTATTTAGTGAGGGGACTCAA 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 806559 AAAGCATTACTTGATGCCAATATGCTAAGAGATGTGGGCAAAACGCTTCTTCAAACTGCT _ AAAGCATTACTTGATGCCAATATGCTAAGAGATGTGGGCAAAACGCTTCTTCAAACTGCT 850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950 960 806559 ATTTACTTGCGTAGCGATTCATTATCAGCAACTGATAGAAAAAAATTAGAAGAGCGCTAT _ ATTTACTTGCGTAGCGATTCATTATCAGCAACTGGTAGAAAAAAATTAGAAGAGCGCTAT 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 806559 TTATTAGGTACTCGTTATGTCCTTGAACAAGGTTTTCACCGAGGAAGTGGTTATCAAATT
Figure imgf000016_0001
1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 806559 TTAGATACCACATTATCCGCCGCTTATGCAAAATTAGACAACAAAACGCATTTTGAAGGC _ TTAGATACCACATTATCCGCCGCTTATGCAAACTTAGACAACAAAACGCATTTTGAAGGC 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 1710 1720 1730 1740 806559 ATTAAGGCTGAAAGTGAGCCAGTCGGCGCATGGGCAATGAATTATGCATCAATGGCAATA _ ATTAACGCTGAAAGTGAGCCAGTCGGCGCATGGGCAATGAATTATGCATCAATGGCAATA 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 806559 CAACGAAGAGCATCGACCCAATCACCACAACAAAGCTGGCTCGCCATAGCGCGCGGTTTT _ CAACGAAGAGCATCGACCCAATCACCACAACAAAGCTGGCTCGCCATAGCGCGCGGTTTT 1750 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 1830 1840 1850 1860 806559 AGCCGTTATCTTGTTGGTAATGAAAGCTATGAAAATAACAACCGTTATGGTCGTTATTTA _ AGCCGTTATCTTGTTGGTAATGAAAGCTATGAAAATAACAACCGTTATGGTCGTTATTTA 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910 1920 806559 CAATATGGACAAT TGGAAAT TAT TCCAGCTGAT TTAACTCAATCAGGGT T TAGCCATGCT _ CAAT AT GGACAAT T GGAAAT T AT T CCAGC T GAT T TAAC T CAAT CAGGGT T T AGCCAT GC T 1870 1880 1890 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 806559 GGATGGGATTGGAATAGATATCCAGGTACAACAACTATTCATCTTCCCTATAACGAACTT _ GGATGGGATTGGAATAGATATCCAGGTACAACAACTATTCATCTTCCCTATAACGAACTT 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 2030 2040 806559 GAAGCAAAACTTAATCAATTACCTGCTGCAGGTATTGAAGAAATGTTGCTTTCAACAGAA _ GAAGCAAAACTTAATCAATTACCTGCTGCAGGTATTGAAGAAATGTTGCTTTCAACAGAA 1990 2000 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 806559 AGTTACTCTGGTGCAAATACCCTTAATAATAACAGTATGTTTGCCATGAAATTACACGGT _ AGTTACTCTGGTGCAAATACCCTTAATAATAACAGTATGTTTGCCATGAAATTACACGGT 2050 2060 2070 2080 2090 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 806559 CCAAGTAAATATCAACAACAAAGCTTAAGGGCAAATAAATCCTATTTCTTATTTGATAAT _ CACAGTAAATATCAACAACAAAGCTTAAGGGCAAATAAATCCTATTTCTTATTTGATAAT 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 2210 2220 806559 AGAGT TAT TGCT T TAGGCTCAGGTAT TGAAAATGATGATAAACAACATACGACCGAAACA AGAGTTATTGCTTTAGGCTCAGGTATTGAAAATGATGATAAACAACATACGACCGAAACA
2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 806559 ACACTATTCCAGTTTGCCGTCCCTAAATTACAGTCAGTGATCATTAATGGCAAAAAGGTA _ ACACTATTCCAGTTTGCCGTCCCTAAATTACAGTCAGTGATCATTAATGGCAAAAAGGTA 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 2340 806559 AATCAATTAGATACTCAATTAACTTTAAATAATGCAGATACATTAATTGATCCTGCCGGC _ AATCAATTAGATACTCAATTAACTTTAAATAATGCAGATACATTAATTGATCCTGCCGGC 2290 2300 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 806559 AATTTATATAAGCTCACTAAAGGACAAACTGTAAAATTTAGTTATCAAAAACAACATTCA _ AATTTATATAAGCTCACTAAAGGACAAACTGTAAAATTTAGTTATCAAAAACAACATTCA 2350 2360 2370 2380 2390 2400 2410 2420 2430 2440 2450 2460 806559 CTTGATGATAGAAATTCAAAACCAACAGAACAATTATTTGCAACAGCTGTTATTTCTCAT _ CTTGAT GATAGAAAT T CAAAACCAACAGAACAAT TAT T T GCAACAGC TGTTATTTCTCAT 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500 2510 2520 806559 GGTAAGGCACCGAGTAATGAAAATTATGAATATGCAATAGCTATCGAAGCACAAAATAAT _ GGTAAGGCACCGAGTAATGAAAATTATGAATATGCAATAGCTATCGAAGCACAAAATAAT 2470 2480 2490 2500 2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 806559 AAAGCTCCCGAATACACAGTATTACAACATAATGATCAGCCCCATGCGGTAAAAGATAAA _ AAAGCTCCCAAATACACAGTATTACAACATAATGATCAGCTCCATGCGGTAAAAGATAAA 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 2610 2620 2630
806559 ATAACCCAAGAAGAGGGATATGCTTTTTTTGAAGCCACTAAGTTAAAATCAGCGGATGC _ ATAACCCAAGAAGAGGGATATGGTTTTTTTGAAGCCACTAAGTTAAAATCAGCGGATGC 2590 2600 2610 2620 2630 2640
2640 2650 2660 2670 2680 2690
806559 AACATTATTATCCAGTGATGCGCCGGTTATGGTCATGGCTAAAATACAAAATCAGCAATT _ AACATTATTATCCAGTGATGCGCCGGTTATGGTCATGGCTAAAATACAAAATCAGCAATT 2650 2660 2670 2680 2690 2700
2700 2710 2720 2730 2740 2750
806559 AACATTAAGTATTGTTAATCCTGATTTAAATTTATATCAAGGTAGAGAAAAAGATCAATT _ AACATTAAGTATTGTTAATCCTGATTTAAATTTATATCAAGGTAGAGAAAAAGATCAATT 2710 2720 2730 2740 2750 2760
2760 2770 2780 2790 2800 2810
806559 TGATGATAAAGGTAATCAAATCGAAGTTAGTGTTTATTCTCGTCATTGGCTTACAGCAGA TGATGATAAAGGTAATCAAATCGAAGTTAGTGTTTATTCTCGTCATTGGCTTACAGCAGA
2770 2780 2790 2800 2810 2820
2820 2830 2840 2850 2860 2870
806559 ATCGCAATCAACAAATAGTACTATTACCGTAAAAGGAATATGGAAATTAACGACACCTCA
_ ATCGCAATCAACAAATAGTACTATTACCGTAAAAGGAATATGGAAATTAACGACACCTCA
2830 2840 2850 2860 2870 2880
2880 2890 2900 2910 2920 2930
806559 ACCCGGTGTTATTATTAAGCACCACAATAACAACACTCTTATTACGACAACAACCATACA
_ ACCCGGTGTTATTATTAAGCACCACAATAACAACACTCTTATTACGACAACAACCATACA
2890 2900 2910 2920 2930 2940
2940 2950 2960 2970
806559 GGCAACACCTAC TGT TAT TAAT T TAGT TAAGTAA
_ GGCAACACCTAC TGT TAT TAAT T TAGT TAAGTAA
2950 2960 2970
Las discrepancias anteriores, el texto en negrita, en el nivel de nucleótidos dieron como resultado una identidad del 98.3% a nivel de aminoácidos y los residuos sustituidos se marcan en el texto en negrita a continuación.
SEQ ID NO: 27 Proteína de Condroitinasa ABC II de la presente invención
> ABC (presente invención) 99C a ; v s .
>_ ABC (maduro) 39 C a a
matriz de puntuación:, penalidad de brecha 2/-2
38-3% de Identidad: Puntuación de alineación global: 63 Í3
10 20 30 40 50 60
457676 LPTLSHEAFGDIYLFEGELPNILTTSNNNQLSLSKQHAKDGEQSLKWQYQPQATLTLNN1
_ LPTL SHEAFGDIYLFEGELPNTLT TSNNNQL SLSKQHAKDGEQSLKWQYQPQATLTLNNI
10 20 30 40 50 60
70 80 90 100 110 12C
457676 VNYQDDKNTATPLTFMMWIYNEKPQSSPLTLAFKQNNKIALSFNAELNFTGWRGIAVPFR
_ VNYQDDKNTATPLTFMMWIYNEKPQSSPLTLAFKQNNKIALSFNAELNFTGWRGIAVPFR
70 80 90 100 110 120
130 140 150 160 170 180
457676 DMQGSATGQLDQLVITAPNQAGTLFFDQIIMSVPLDNRWAVPDYQTPYVNNAVNTMVSKK
_ DMQGSVTGQLDQLVITAPNQAGTLFFDQIIMSVPLDNRWAVPDYQTPYVNNAVNTMVSKN
130 140 150 160 170 180
190 200 210 220 230 240
457676 WSALLMYDQMFQAHYPTLNFDTEFRDDQTEMASIYQRFEYYQGIRSDKKITPDMLDKHLA
_ WSALLMYDQMFQAHYPTLNFDTEFRDDQTEMASRYQRFEYYQGIRSDKKITPDMLDKHLA
190 200 210 220 230 240
550 260 270 280 290 30C
457676 LWEKLGLTQHADGSITGKALDHPNRQHFMKVEGVFSEGTQKALLDANMLRDVGKTLLQTA _ LWEKLVLTQHADGSITGKALDHPNRQHFMKVEGVFSEGTQKALLDANMLRDVGKTLLQTA 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 457676 IYLRSDSLSATGRKKLEERYLLGTRYVLEQGFTRGSGYQIITHVGYQTRELFDAWFIGRH _ IYLRSDSLSATDRKKLEERYLLGTRYVLEQGFHRGSGYQIISHVGYQTRELFDAWFIGRH 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 457676 VLAKNNLLAPTQQAMMWYNATGRIFEKDNEIVDANVDILNTQLQWMIKSLLMLPDYQQRQ _ VLAKNNLLAPTQQAMMWYNATGRIFEKNNEIVDANVDILNTQLQWMIKSLLMLPDYQQRQ 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 457676 QALAQLQSWLNKTILSSKGVAGGFKSDGSIFHHSQHYPAYAKDAFGGLAPSVYALSDSPF _ QALAQLQRWLNKTILSSKGVAGGFKSDGSIFHHSQHYPAYAKDAFGGLAPSVYALSDSPF 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 457676 RLSTSAHEHLKDVLLKMRIYTKETQIPWLSGRHPTGLHKIGIAPFKWMALAGTPDGKQK _ RLSTSAHERLKDVLLKMRIYTKETQIPAVLSGRHPTGLHKIGIAPFKWMALAGTPDGKQK 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 457676 LDTTLSAAYANLDNKTHFEGINAESEPVGAWAMNYASMAIQRRASTQSPQQSWLAIARGF _ LDTTLSAAYAKLDNKTHFEGIKAESEPVGAWAMNYASMAIQRRASTQSPQQSWLAIARGF 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 457676 SRYLVGNESYENNNRYGRYLQYGQLEIIPADLTQSGFSHAGWDWNRYPGTTTIHLPYNEL _ SRYLVGNESYENNNRYGRYLQYGQLEIIPADLTQSGFSHAGWDWNRYPGTTTIHLPYNEL 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 457676 EAKLNQLPAAGIEEMLLSTESYSGANTLNNNSMFAMKLHGHSKYQQQSLRANKSYFLFDN _ EAKLNQLPAAGIEEMLLSTESYSGANTLNNNSMFAMKLHGPSKYQQQSLRANKSYFLFDN 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 457676 RVIALGSGIENDDKQHTTETTLFQFAVPKLQSVIINGKKVNQLDTQLTLNNADTLIDPAG _ RVIALGSGIENDDKQHTTETTLFQFAVPKLQSVIINGKKVNQLDTQLTLNNADTLIDPAG 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 457676 NLYKLTKGQTVKFSYQKQHSLDDRNSKPTEQLFATAVISHGKAPSNENYEYAIAIEAQNN _ NLYKLTKGQTVKFSYQKQHSLDDRNSKPTEQLFATAVISHGKAPSNENYEYAIAIEAQNN 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 457676 KAPKYTVLQHNDQLHAVKDKITQEEGYGFFEATKLKSADATLLSSDAPVMVMAKIQNQQL KAPEYTVLQHNDQPHAVKDKITQEEGYAFFEATKLKSADATLLSSDAPVMVMAKIQNQQL 850 860 870 880 890 900
910 920 930 940 950 960
457676 TLSIVNPDLNLYQGREKDQFDDKGNQIEVSVYSRHWLTAESQSTNSTITVKGIWKLTTPQ
_ TLSIVNPDLNLYQGREKDQFDDKGNQIEVSVYSRHWLTAESQSTNSTITVKGIWKLTTPQ
910 920 930 940 950 960 970 980 990
457676 PGVIIKHHNNNTLITTTTIQATPTVINLVK
_ PGVIIKHHNNNTLITTTTIQATPTVINLVK
970 980 990
SEQ ID NO: 28 Ácido nucleico de Condroitinasa ABC I de la presente invención
> ABC presente invención 2994 nt vs.
> _ ABC1 maduro 2994 nt
matnz de puntuación: , penalidad de brecha : - 12/-2
99.7 % deidentidad; Puntuación de alineación global: ' ' 509
10 20 30 -10 50 00 8C 6559 GCCACCAGCAATCCTGCATTTGATCCTAAAAATCTGATGCAGTCACAAATTTACCATT2 T _ GCCAC CAGCAAT CCTGCATTTGATCCTAAAAATC TGATGCAGTCAGAAATTTACCATT TT 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 12C 8C 6559 GCACAAAATAACCCATTAGCAGACTTCTCATCAGATAAAAACTCAATACTAACGTTATCT _ GCACAAAATAACCCATTAGCAGACT TCTCATCAGATAAAAACTCAATACTAACGT TATC T 70 80 90 100 110 12C 130 140 150 160 170 180 8C 6559 GATAAACGTAGCATTATGGGAAACCAATCTCTTTTATGGAAATGGAAAGGTGGTAGTAGC _ GATAAACGTAGCATT ATGGGAAACCAAT C'_CTTTTATGGAAATGGAAAGGTGGTAGTAGC 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 24C 8C6559 TTTACTTTACATAAAAAACTGATTGTCCCCACCGATAAAGAAGCATCTAAACCATCCCC-A _ TTTACT TTACATAAAAAACTGATTGTCCCCACCGATAAAGAAGCATCTAAAGCATGGGGA 190 2C0 210 220 230 240 250 260 270 250 290 30C 8C 6559 CGCTCATCC A.CCCCCGT TTTCTC AT TTTGGC TTTA CAATG AAAAA CCGA TTGAT GGTTAT _ CGCTCATCTACCCCCGT TTTCTCATTTTGGCTTTACAATGAAAAACCGATTGATGGT TAT 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 36C 8C6559 CTTACTATCGATTTCGGAGAAAAACTCATTTCAACCAGTGAGGCTCAGGCAGGCTTTAAA C TTAC TATCGATTTC GGAGAAAAACT CATT TCAACCAGTGAGGCT CAGGCAGGC T TTAAA
310 320 330 340 35 0 360 370 380 390 400 410 42 C 8C 6o59 GTAAAATTAGATTTCACTGGCTGGCGTACTGTGGGAGTCTCTTTAAATAACGATCTTGAA _ GTAAAATTAGATTTCACTGGCTGGCGTGCTGTGGGAGTCTCTTTAAATAACGATCTTGAA 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 806559 AATCGAGAGATGACCTTAAATGCAACCAATACCTCCTCTGATGGTACTCAAGACAGCATT _ AATCGAGAGATGACCTTAAATGCAACCAATACCTCCTCTGATGGTACTCAAGACAGCATT 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 806559 GGGCGTTCTTTAGGTGCTAAAGTCGATAGTATTCGTTTTAAAGCGCCTTCTAATGTGAGT _ GGGCGTTCTTTAGGTGCTAAAGTCGATAGTATTCGTTTTAAAGCGCCTTCTAATGTGAGT 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 806559 CAGGGTGAAATCTATATCGACCGTATTATGTTTTCTGTCGATGATGCTCGCTACCAATGG _ CAGGGTGAAATCTATATCGACCGTATTATGTTTTCTGTCGATGATGCTCGCTACCAATGG 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 806559 TCTGATTATCAAGTAAAAACTCGCTTATCAGAACCTGAAATTCAATTTCACAACGTAAAG _ TCTGATTATCAAGTAAAAACTCGCTTATCAGAACCTGAAATTCAATTTCACAACGTAAAG 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 806559 CCACAACTACCTGTAACACCTGAAAATTTAGCGGCCATTGATCTTATTCGCCAACGTCTA _ CCACAACTACCTGTAACACCTGAAAATTTAGCGGCCATTGATCTTATTCGCCAACGTCTA 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 806559 ATTAATGAATTTGTCGGAGGTGAAAAAGAGACAAACCTCGCATTAGAAGAGAATATCAGC _ ATTAAT GAAT T TGTCGGAGGT GAAAAAGAGACAAAC C T C GCATTAGAAGAGAATAT CAGC 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 806559 AAATTAAAAAGTGATTTCGATGCTCTTAATACTCACACTTTAGCAAATGGTGGAACGCAA _ AAATTAAAAAGTGATTTCGATGCTCTTAATATTCACACTTTAGCAAATGGTGGAACGCAA 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 806559 GGCAGACATC T GAT CAC T GATAAACAAAT CAT TAT T TAT CAACCAGAGAAT C T TAACT CT _ GGCAGACAT C T GAT CAC T GATAAACAAAT CAT TAT T TAT CAACCAGAGAATC T TAAC T CC 850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950 960 806559 CAAGATAAACAACTATTTGATAATTATGTTATTTTAGGTAATTACACGACATTAATGTTT _ CAAGATAAACAACTATTTGATAATTATGTTATTTTAGGTAATTACACGACATTAATGTTT 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 806559 AATATTAGCCGTGCTTATGTGCTGGAAAAAGATCCCACACAAAAGGCGCAACTAAAGCAG _ AATATTAGCCGTGCTTATGTGCTGGAAAAAGATCCCACACAAAAGGCGCAACTAAAGCAG 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 806559 ATGTACTTATTAATGACAAAGCATTTATTAGATCAAGGCTTTGTTAAAGGGAGTGCTTTA _ ATGTACTTATTAATGACAAAGCATTTATTAGATCAAGGCTTTGTTAAAGGGAGTGCTTTA 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 806559 GTGACAACCCATCACTGGGGATACAGTTCTCGTTGGTGGTATATTTCCACGTTATTAATG _ GTGACAACCCATCACTGGGGATACAGTTCTCGTTGGTGGTATATTTCCACGTTATTAATG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 806559 TCTGATGCACTAAAAGAAGCGAACCTACAAACTCAAGTTTATGATTCATTACTGTGGTAT _ TCTGATGCACTAAAAGAAGCGAACCTACAAACTCAAGTTTATGATTCATTACTGTGGTAT 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 806559 TCACGTGAGTTTAAAAGTAGTTTTGATATGAAAGTAAGTGCTGATAGCTCTGATCTAGAT _ TCACGTGAGTTTAAAAGTAGTTTTGATATGAAAGTAAGTGCTGATAGCTCTGATCTAGAT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 806559 TATTTCAATACCTTATCTCGCCAACATTTAGCCTTATTACTACTAGAGCCTGATGATCAA _ TATTTCAATACCTTATCTCGCCAACATTTAGCCTTATTATTACTAGAGCCTGATGATCAA 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 806559 AAGCGTATCAACTTAGTTAATACTTTCAGCCATTATATCACTGGCGCATTAACGCAAGTG _ AAGCGTATCAACTTAGTTAATACTTTCAGCCATTATATCACTGGCGCATTAACGCAAGTG 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 806559 CCACCGGGTGGTAAAGATGGTTTACGCCCTGATGGTACAGCATGGCGACATGAAGGCAAC _ CCACCGGGTGGTAAAGATGGTTTACGCCCTGATGGTACAGCATGGCGACATGAAGGCAAC 1390 1400 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 806559 TATCCGGGCTACTCTTTCCCAGCCTTTAAAAATGCCTCTCAGCTTATTTATTTATTACGC _ TATCCGGGCTACTCTTTCCCAGCCTTTAAAAATGCCTCTCAGCTTATTTATTTATTACGC 1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 1550 1560 806559 GATACACCATTTTCAGTGGGTGAAAGTGGTTGGAATAGCCTGAAAAAAGCGATGGTTTCA _ GATACACCATTTTCAGTGGGTGAAAGTGGTTGGAATAACCTGAAAAAAGCGATGGTTTCA 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620 806559 GCGTGGATCTACAGTAATCCAGAAGTTGGATTACCGCTTGCAGGAAGACACCCTCTTAAC GCGTGGATCTACAGTAATCCAGAAGTTGGATTACCGCTTGCAGGAAGACACCCTTTTAAC 1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 806559 TCACCTTCGTTAAAATCAGTCGCTCAAGGCTATTACTGGCTTGCCATGTCTGCAAAATCA _ TCACCTTCGTTAAAATCAGTCGCTCAAGGCTATTACTGGCTTGCCATGTCTGCAAAATCA 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 1710 1720 1730 1740 806559 TCGCCTGATAAAACACTTGCATCTATTTATCTTGCGATTAGTGATAAAACACAAAATGAA _ TCGCCTGATAAAACACTTGCATCTATTTATCTTGCGATTAGTGATAAAACACAAAATGAA 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 806559 TCAACTGCTATTTTTGGAGAAACTATTACACCAGCGTCTTTACCTCAAGGTTTCTATGCC _ TCAACTGCTATTTTTGGAGAAACTATTACACCAGCGTCTTTACCTCAAGGTTTCTATGCC 1750 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 1830 1840 1850 1860 806559 TTTAATGGCGGTGCTTTTGGTATTCATCGTTGGCAAGATAAAATGGTGACACTGAAAGCT _ TTTAATGGCGGTGCTTTTGGTATTCATCGTTGGCAAGATAAAATGGTGACACTGAAAGCT 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910 1920 806559 TATAACACCAATGTTTGGTCATCTGAAATTTATAACAAAGATAACCGTTATGGCCGTTAC _ TATAACACCAATGTTTGGTCATCTGAAATTTATAACAAAGATAACCGTTATGGCCGTTAC 1870 1880 1890 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 806559 CAAAGTCATGGTGTCGCTCAAATAGTGAGTAATGGCTCGCAGCTTTCACAGGGCTATCAG _ CAAAGTCATGGTGTCGCTCAAATAGTGAGTAATGGCTCGCAGCTTTCACAGGGCTATCAG 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 2030 2040 806559 CAAGAAGGTTGGGATTGGAATAGAATGCCAGGGGCAACCACTATCCACCTTCCTCTTAAA _ CAAGAAGGTTGGGATTGGAATAGAATGCAAGGGGCAACCACTATTCACCTTCCTCTTAAA 1990 2000 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 806559 GACTTAGACAGTCCTAAACCTCATACCTTAATGCAACGTGGAGAGCGTGGATTTAGCGGA _ GACTTAGACAGTCCTAAACCTCATACCTTAATGCAACGTGGAGAGCGTGGATTTAGCGGA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 806559 ACATCATCCCTTGAAGGTCAATATGGCATGATGGCATTCGATCTTATTTATCCCGCCAAT _ ACATCATCCCTTGAAGGTCAATATGGCATGATGGCATTCGATCTTATTTATCCCGCCAAT 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 2210 2220 806559 CTTGAGCGTTTTGATCCTAATTTCACTGCGAAAAAGAGTGTATTAGCCGCTGATAATCAC CTTGAGCGTTTTGATCCTAATTTCACTGCGAAAAAGAGTGTATTAGCCGCTGATAATCAC
2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 806559 T TAATT T T TAT TGGTAGCAATATAAATAGTAGTGATAAAAATAAAAATGT TGAAACGACC _ T TAAT T T T TAT TGGTAGCAATATAAATAGTAGTGATAAAAATAAAAATGT TGAAACGACC 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 2340 806559 TTATTCCAACATGCCATTACTCCAACATTAAATACCCTTTGGATTAATGGACAAAAGATA _ TTATTCCAACATGCCATTACTCCAACATTAAATACCCTTTGGATTAATGGACAAAAGATA 2290 2300 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 806559 GAAAACATGCCTTATCAAACAACACTTCAACAAGGTGATTGGTTAATTGATAGCAATGGC _ GAAAACATGCCTTATCAAACAACACTTCAACAAGGTGATTGGTTAATTGATAGCAATGGC 2350 2360 2370 2380 2390 2400 2410 2420 2430 2440 2450 2460 806559 AATGGTTACTTAATTACTCAAGCAGAAAAAGTAAATGTAAGTCGCCAACATCAGGTTTCA _ AATGGTTACTTAATTACTCAAGCAGAAAAAGTAAATGTAAGTCGCCAACATCAGGTTTCA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500 2510 2520 806559 GCGGAAAATAAAAATCGCCAACCGACAGAAGGAAACTTTAGCTCGGCATGGATCGATCAC _ GCGGAAAATAAAAATCGCCAACCGACAGAAGGAAACTTTAGCTCGGCATGGATCGATCAC 2470 2480 2490 2500 2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 806559 AGCACTCGCCCCAAAGATGCCAGTTATGAGTATATGGTCTTTTTAGATGCGACACCTGAA _ AGCACTCGCCCCAAAGATGCCAGTTATGAGTATATGGTCTTTTTAGATGCGACACCTGAA 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 2610 2620 2630 2640 806559 AAAATGGGAGAGATGGCACAAAAATTCCGTGAAAATAATGGGTTATATCAGGTTCTTCGT _ AAAATGGGAGAGATGGCACAAAAATTCCGTGAAAATAATGGGTTATATCAGGTTCTTCGT 2590 2600 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 806559 AAGGATAAAGACGTTCATATTATTCTCGATAAACTCAGCAATGTAACGGGATATGCCTTT _ AAGGATAAAGACGTTCATATTATTCTCGATAAACTCAGCAATGTAACGGGATATGCCTTT 2650 2660 2670 2680 2690 2700 2710 2720 2730 2740 2750 2760 806559 TATCAGCCAGCATCAATTGAAGACAAATGGATCAAAAAGGTTAATAAACCTGCAATTGTG _ TATCAGCCAGCATCAATTGAAGACAAATGGATCAAAAAGGTTAATAAACCTGCAATTGTG 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 2810 2820 806559 ATGACTCATCGACAAAAAGACACTCTTATTGTCAGTGCAGTTACACCTGATTTAAATATG ATGACTCATCGACAAAAAGACACTCTTATTGTCAGTGCAGTTACACCTGATTTAAATATG
2770 2780 2790 2800 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 806559 ACTCGCCAAAAAGCAGCAACTCCTGTCACCATCAATGTCACGATTAATGGCAAATGGCAA _ ACTCGCCAAAAAGCAGCAACTCCTGTCACCATCAATGTCACGATTAATGGCAAATGGCAA 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900 2910 2920 2930 2940 806559 TCTGCTGATAAAAATAGTGAAGTGAAATATCAGGTTTCTGGTGATAACACTGAACTGACG _ TCTGCT GATAAAAATAGT GAAGT GAAATAT CAGGTT T C T GG T GATAACAC T GAAC T GACG 2890 2900 2910 2920 2930 2940
2950 2960 2970 2980 2990
806559 TTTACGAGTTACTTTGGTATTCCACAAGAAATCAAACTCTCGCCACTCCCTTGA
_ TTTACGAGTTACTTTGGTATTCCACAAGAAATCAAACTCTCGCCACTCCCTTGA
2950 2960 2970 2980 2990
La identidad de secuencia a nivel de aminoácidos se muestra a continuación:
SEQ ID NO: 29 Proteína de la Condroitinasa ABC I de la presente invención
>_ABCI presente invención 997 aa VS.
>_ ABCI maduro 997 aa
matriz de puntuación:, penalidad de brecha ; - 12/-2
99.5% de identidad; Puntuación de alineación global 6595
10 20 30 40 50 60
365019 ATSNPAFDPKNLMGSEIYHFAQNNPLADFSSDKNSILTLSDKRSIMGNQSLLWKWKGGSS
_ ATSNPAFDPKNLMQSEIYHFAQNNPLADFSSDKNSILTLSDKRSIMGNQSLLWKWKGGSS
10 20 30 40 50 60
70 80 90 100 110 120
365019 FTLHKKLIVPTDKEASKAWGRSSTPVFSFWLYNEKPIDGYLTIDFGEKLISTSEAQAGFK
_ FTLHKKLIVPTDKEASKAWGRSSTPVFSFWLYNEKPIDGYLTIDFGEKLISTSEAQAGFK
70 80 90 100 110 120
130 140 150 160 170 180
365019 VKLDFTGWRTVGVSLNNDLENREMTLNATNTSSDGTQDSIGRSLGAKVDSIRFKAPSNVS
VKLDFTGWRAVGVSLNNDLENREMTLNATNTSSDGTGDSIGRSLGAKVDSIRFKAPSNVS
130 140 150 160 170 180
190 200 210 220 230 240
365019 QGEIYIDRIMFSVDDARYQWSDYQVKTRLSEPEIQFHNVKPQLPVTPENLAAIDLIRQRL
_ QGEIYIDRIMFSVDDARYQWSDYQVKTRLSEPEIQFHNVKPQLPVTPENLAAIDLIRQRL 190 200 210 220 230 240
250 260 270 280 290 300
365019 INEFVGGEKETNLALEENISKLKSDFDALNTHTLANGGTQGRHLITDKQIIIYQPENLNS
_ INEFVGGEKETNLALEENISKLKSDFDALNIHTLANGGTQGRHLITDKQIIIYQPENLNS 250 260 270 280 290 300
310 320 330 340 350 360
365019 QDKQLFDNYVILGNYTTLMFNISRAYVLEKDPTQKAQLKQMYLLMTKHLLDQGFVKGSAL
_ QDKQLFDNYVILGNYTTLMFNISRAYVLEKDPTQKAQLKQMYLLMTKHLLDQGFVKGSAL 310 320 330 340 350 360
370 380 390 400 410 420
365019 VTTHHWGYSSRWWYISTLLMSDALKEANLQTQVYDSLLWYSREFKSSFDMKVSADSSDLD
_ VTTHHWGYSSRWWYISTLLMSDALKEANLQTQVYDSLLWYSREFKSSFDMKVSADSSDLD 370 380 390 400 410 420
430 440 450 460 470 480
365019 YFNTLSRQHLALLLLEPDDQKRINLVNTFSHYITGALTQVPPGGKDGLRPDGTAWRHEGN
_ YFNTLSRQHLALLLLEPDDQKRINLVNTFSHYITGALTQVPPGGKDGLRPDGTAWRHEGN 430 440 450 460 470 480
490 500 510 520 530 540
365019 YPGYSFPAFKNASQLIYLLRDTPFSVGESGWNSLKKAMVSAWIYSNPEVGLPLAGRHPLN
_ YPGYSFPAFKNASQLIYLLRDTPFSVGESGWNNLKKAMVSAWIYSNPEVGLPLAGRHPFN 490 500 510 520 530 540
550 560 570 580 590 600
365019 SPSLKSVAQGYYWLAMSAKSSPDKTLASIYLAISDKTQNESTAIFGETITPASLPQGFYA
_ SPSLKSVAQGYYWLAMSAKSSPDKTLASIYLAISDKTQNESTAIFGETITPASLPQGFYA
550 560 570 580 590 600
610 620 630 640 650 660
365019 FNGGAFGIHRWQDKMVTLKAYNTNVWSSEIYNKDNRYGRYQSHGVAQIVSNGSQLSQGYQ
_ FNGGAFGIHRWQDKMVTLKAYNTNVWSSEIYNKDNRYGRYQSHGVAQIVSNGSQLSQGYQ
610 620 630 640 650 660
670 680 690 700 710 720
365019 QEGWDWNRMPGATTIHLPLKDLDSPKPHTLMQRGERGFSGTSSLEGQYGMMAFDLIYPAN
_ QEGWDWNRMQGATTIHLPLKDLDSPKPHTLMQRGERGFSGTSSLEGQYGMMAFDLIYPAN
670 680 690 700 710 720
730 740 750 760 770 780
365019 LERFDPNFTAKKSVLAADNHLIFIGSNINSSDKNKNVETTLFQHAITPTLNTLWINGQKI
_ LERFDPNFTAKKSVLAADNHLIFIGSNINSSDKNKNVETTLFQHAITPTLNTLWINGQKI
730 740 750 760 770 780
790 800 810 820 830 840
365019 ENMPYQTTLQQGDWLIDSNGNGYLITQAEKVNVSRQHQVSAENKNRQPTEGNFSSAWIDH
_ ENMPYQTTLQQGDWLIDSNGNGYLITQAEKVNVSRQHQVSAENKNRQPTEGNFSSAWIDH
790 800 810 820 830 840
850 860 870 880 890 900
365019 STRPKDASYEYMVFLDATPEKMGEMAQKFRENNGLYQVLRKDKDVHIILDKLSNVTGYAF
_ STRPKDASYEYMVFLDATPEKMGEMAQKFRENNGLYQVLRKDKDVHIILDKLSNVTGYAF
850 860 870 880 890 900
910 920 930 940 950 960
365019 YQPASIEDKWIKKVNKPAIVMTHRQKDTLIVSAVTPDLNMTRQKAATPVTINVTINGKWQ
YQPASIEDKWIKKVNKPAIVMTHRQKDTLIVSAVTPDLNMTRQKAATPVTINVTINGKWQ
910 920 930 940 950 960
970 980 990
365019 SADKNSEVKYQVSGDNTELTFTSYFGIPQEIKLSPLP
SADKNSEVKYQVSGDNTELTFTSYFGIPQEIKLSPLP
970 980 990
Referencias
1. Fethiere J, Eggimann B, Cygler M (1999) Crystal structure of chondroitin AC lyase, a representative of a family of glycosaminoglycan degrading enzymes. J Mol Biol. 288:635-47.
2. Pojasek K, Shriver Z, Kiley, P Venkataraman G and Sasisekharan R. (2001) Biochem Biophys Res Commun.
286:343-51.
3. Huang W, Matte A, Li Y, Kim YS, Linhardt RJ, Su H, Cygler M. (1999) Crystal structure of chondroitinase B from Flavobacterium heparinum and its complex with a disaccharide product at 1.7 A resolution. J Mol Biol. 294:1257-69.
4. Miura RO, Yamagata S, Miura Y, Harada T and Yamagata T. (1995) Anal Biochem. 225:333-40.
5. Yamagata T, Saito H, Habuchi O and Suzuki S. (1968) J Biol Chem. 243:1536-42.
LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 Proteína de Condroitinasa ABCI
ORIGEN
atsnpa fdpknlmqse iyhfaqnnpl adfssdknsi
61 ltlsdkrsim gnqsllwkwk ggssñlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp
121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwrTvgvsln ndlenremtl natntssdgt
181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf
241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnThtlan
301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka
361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga
481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr
661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafhli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn
781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq
841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp
961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl
1021 p
SEQ ID NO: 2 proteína NA20 ABCI (A45-N1023),
aqnnpl adfssdknsi
61 ltlsdkrsim gnqsllwkwk ggssñlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp
121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenremtl natntssdgt
181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf
241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnthtlan
301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka
361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga
481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr
661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn
781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq
841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp
961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl
1021 p
SEQ ID NO: 3 proteína NA60 ABCI (F85-Ni023)
ftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnthtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfhisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafhli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp 961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl 1021 p
SEQ ID No. 4: proteína NA60 CA80ABCI (F85-A942)
ftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnthtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafhli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk pa
SEQ ID NO: 5 proteína Condroitinasa AC Locus 1HMW_A
ORIGEN
1 mkklfvtciv ffsilspall iaqqtgtael imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfhv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya ldydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist agktgrgkit tfkaqgqfwl lhdaigyyfp eganlslstq 541 sqkgnwfhin nshskdevsg dvfklwinhg arpenaqyay ivlpginkpe eikkyngtap 601 kvlantnqlq avyhqqldmv qaifytagkl svagieietd kpcavlikhi ngkqviwaad 661 plqkektavl sirdlktgkt nrvkidfpqq efagatvelk
SEQ ID NO: 6 proteína CA200 AC (Q23-T50q)
qqtgtael imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya ldydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist
SEQ ID NO: 7 proteína CA220 AC (Q23-A480)
qqtgtael imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya ldydslqakk awfffdkeiv clgaginsna
SEQ ID NO: 8 proteína NA20 CA200 AC (L43-T500)
lrnmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya ldydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist
SEQ ID NO: 9 proteína NA50 CA200 AC (T74-T500)
tnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya ldydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist
SEQ ID NO: 10 proteína NA100 CA200 AC (S123-T500)
smwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya ldydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist
SEQ ID NO: 11 proteína NA50 CA275 AC (T74-L426)
tnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfhv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltkl
SEQ ID NO: 12 proteína Condroitinasa B Locus Q46079
ORIGEN
1 mkmlnklagy llpimvllnv apclgqwas netlyqwke vkpgglvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfftgdakve lrgehlileg iwfkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarlsa draakfkavi kmkeh
SEQ ID NO: 13 proteína NA80 Seguimiento B (Gi 06-H5o6)
gnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarlsa draakfkavi kmkeh
SEQ ID NO: 14 proteína NA120 Seguimiento B (Ii46-H506)
ittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarlsa draakfkavi kmkeh
SEQ ID NO: 15 proteína CA19 Seguimiento B (Q26-L488)
qwas netlyqwke vkpgglvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfftgdakve lrgehlileg iwfkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 ty altar 1
SEQ ID NO: 16 proteína CA120 Seguimiento B (Q26-K390)
qwas netlyqwke vkpgglvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfftgdakve lrgehlileg iwfkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafmv ngyaihfiipl 361 derrkeycaa nrlkfetphq Imlkgnlffk
SEQ ID NO: 17 proteína NA120 CA120 Seguimiento B (Ii46-K39o)
ittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln
181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafmv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq Imlkgnlffk
SEQ ID NO: 18 nucleótido Condroitinasa AC Locus CHU27583
ORIGEN
1 atgaagaaat tatttgtaac ctgtatagtc tttttctcta ttttaagtcc tgctctgctt
61 attgcacagc agaccggtac tgcagaactg attatgaagc gggtgatgct ggaccttaaa 121 aagcctttgc gcaatatgga taaggtggcg gaaaagaacc tgaatacgct gcagcctgac 181 ggtagctgga aggatgtgcc ttataaagat gatgccatga ccaattggtt gccaaacaac 241 cacctgctac aattggaaac tattatacag gcttatattg aaaaagatag tcactattat 301 ggcgacgata aagtgtttga ccagatttcc aaagctttta agtattggta tgacagcgac 361 ccgaaaagcc gcaactggtg gcacaatgaa attgccactc cgcaggccct tggtgaaatg 421 ctgatcctga tgcgttacgg taaaaagccg cttgatgaag cattggtgca taaattgacc 481 gaaagaatga agcggggcga accggagaag aaaacggggg ccaacaaaac agatatcgcc 541 ctgcattact tttatcgtgc tttgttaacg tctgatgagg ctttgctttc cttcgccgta
601 aaagaattgt tttatcccgt acagtttgta cactatgagg aaggcctgca atacgattat 661 tcctacctgc agcacggtcc gcaattacag atatcgagct acggtgccgt atttattacc 721 ggggtactga aacttgccaa ttacgttagg gatacccctt atgctttaag taccgagaaa 781 ctggctatat tttcaaagta ttaccgcgac agttatctga aagctatccg tggaagttat 841 atggatttta acgtagaagg ccgcggagta agccggccag acattctaaa taaaaaggca 901 gaaaaaaaga ggttgctggt ggcgaagatg atcgatctta agcatactga agaatgggct 961 gatgcgatag ccaggacaga tagcacagtt gcggccggct ataagattga gccctatcac 1021 catcagttct ggaatggtga ttatgtgcaa catttaagac ctgcctattc ttttaatgtt 1081 cgtatggtga gtaagcggac ccgacgcagt gaatccggca ataaagaaaa cctgctgggc 1141 aggtatttat ctgatggggc tactaacata caattgcgcg gaccagaata ctataacatt 1201 atgccggtat gggaatggga caagattcct ggcataacca gccgtgatta tttaaccgac 1261 agacctttga cgaagctttg gggagagcag gggagcaatg actttgcagg aggggtgtct 1321 gatggtgtat acggggccag tgcctacgca ttggattacg atagcttaca ggcaaagaaa 1381 gcctggttct tttttgacaa agagattgta tgtcttggtg ccggtatcaa cagcaatgcc 1441 cctgaaaaca ttaccactac ccttaaccag agctggttaa atggcccggt tataagtact 1501 gcaggtaaaa ccggccgggg taaaataaca acgtttaaag cacagggaca gttctggttg 1561 ttgcacgatg cgattggtta ttactttcct gaaggggcca accttagtct gagtacccag 1621 tcgcaaaaag gcaattggtt ccacatcaac aattcacatt caaaagatga agtttctggt 1681 gatgtattta agctttggat caaccatggt gccaggccag aaaatgcgca gtatgcttat 1741 atcgttttgc cgggaataaa caagccggaa gaaattaaaa aatataatgg aacggcaccg 1801 aaagtccttg ccaataccaa ccagctgcag gcagtttatc atcagcagtt agatatggta 1861 caggctatct tctatacagc tggaaaatta agcgtagcgg gcatagaaat tgaaacagat 1921 aagccatgtg cagtgctgat caagcacatc aatggcaagc aggtaatttg ggctgccgat 1981 ccattgcaaa aagaaaagac tgcagtgttg agcatcaggg atttaaaaac aggaaaaaca 2041 aatcgggtaa aaattgattt tccgcaacag gaatttgcag gtgcaacggt tgaactgaaa 2101 tag
//
SEQ ID NO: 19 eliminación de ácido nucleico Condriotinasa AC NA50 C A275 (a220 - t i278) atgccatga ccaattggtt gccaaacaac
241 cacctgctac aattggaaac tattatacag gcttatattg aaaaagatag tcactattat 301 ggcgacgata aagtgtttga ccagatttcc aaagctttta agtattggta tgacagcgac 361 ccgaaaagcc gcaactggtg gcacaatgaa attgccactc cgcaggccct tggtgaaatg 421 ctgatcctga tgcgttacgg taaaaagccg cttgatgaag cattggtgca taaattgacc 481 gaaagaatga agcggggcga accggagaag aaaacggggg ccaacaaaac agatatcgcc 541 ctgcattact tttatcgtgc tttgttaacg tctgatgagg ctttgctttc cttcgccgta
601 aaagaattgt tttatcccgt acagtttgta cactatgagg aaggcctgca atacgattat 661 tcctacctgc agcacggtcc gcaattacag atatcgagct acggtgccgt atttattacc 721 ggggtactga aacttgccaa ttacgttagg gatacccctt atgctttaag taccgagaaa 781 ctggctatat tttcaaagta ttaccgcgac agttatctga aagctatccg tggaagttat 841 atggatttta acgtagaagg ccgcggagta agccggccag acattctaaa taaaaaggca 901 gaaaaaaaga ggttgctggt ggcgaagatg atcgatctta agcatactga agaatgggct 961 gatgcgatag ccaggacaga tagcacagtt gcggccggct ataagattga gccctatcac 1021 catcagttct ggaatggtga ttatgtgcaa catttaagac ctgcctattc ttttaatgtt 1081 cgtatggtga gtaagcggac ccgacgcagt gaatccggca ataaagaaaa cctgctgggc 1141 aggtatttat ctgatggggc tactaacata caattgcgcg gaccagaata ctataacatt 1201 atgccggtat gggaatggga caagattcct ggcataacca gccgtgatta tttaaccgac 1261 agacctttga cgaagctt
SEQ ID NO: 20 ácido nucleico Condroitinasa B Locus CHU27584
ORIGEN
1 atgaagatgc tgaataaact agccggatac ttattgccga tcatggtgct gctgaatgtg 61 gcaccatgct taggtcaggt tgttgcttca aatgaaactt tataccaggt tgtaaaggag 121 gtaaaacccg gtggtctggt acagattgcc gatgggactt ataaagatgt tcagctgatt 181 gtcagcaatt caggaaaatc tggtttgccc atcactatta aagccctgaa cccgggtaag 241 gtttttttta ccggagatgc taaagtagag ctgaggggcg agcacctgat actggaaggc 301 atctggttta aagacgggaa cagagctatt caggcatgga aatcacatgg acccggattg 361 gtggctatat atggtagcta taaccgcatt accgcatgtg tatttgattg ttttgatgaa 421 gccaattctg cttacattac tacttcgctt accgaagacg gaaaggtacc tcaacattgc 481 cgcatagacc attgcagttt taccgataag atcacttttg accaggtaat taacctgaac 541 aatacagcca gagctattaa agacggttcg gtgggaggac cggggatgta ccatcgtgtt 601 gatcactgtt ttttttccaa tccgcaaaaa ccgggtaatg ccggaggggg aatcaggatt 661 ggctattacc gtaatgatat aggccgttgt ctggtagact ctaacctgtt tatgcgtcag 721 gattcggaag cagagatcat caccagcaaa tcgcaggaaa atgtttatta tggtaatact 781 tacctgaatt gccagggcac catgaacttt cgtcacggtg atcatcaggt ggccattaac 841 aatttttata taggcaatga ccagcgattt ggatacgggg gaatgtttgt ttggggaagc 901 aggcatgtca tagcctgtaa ttattttgag ctgtccgaaa ccataaagtc gagggggaac 961 gccgcattgt atttaaaccc cggtgctatg gcttcggagc atgctcttgc tttcgatatg 1021 ttgatagcca acaacgcttt catcaatgta aatgggtatg ccatccattt taatccattg 1081 gatgagcgca gaaaagaata ttgtgcagcc aataggctta agttcgaaac cccgcaccag 1141 ctaatgttaa aaggcaatct tttctttaag gataaacctt atgtttaccc attttttaaa 1201 gatgattatt ttatagcagg gaaaaatagc tggactggta atgtagcctt aggtgtggaa 1261 aagggaatcc ctgttaacat ttcggccaat aggtctgcct ataagccggt aaaaattaaa 1321 gatatccagc ccatagaagg aatcgctctt gatctcaatg cgctgatcag caaaggcatt 1381 acaggaaagc cccttagctg ggatgaagta aggccctact ggttaaaaga aatgcccggg 1441 acgtatgctt taacggccag gctttctgca gatagggctg caaagtttaa agccgtaatt 1501 aaaagaaata aagagcactg a
SEQ ID NO: 21 eliminación de ácido nucleico Condriotinasa B NA120 CA120 (a436 - g ii7o) attac tacttcgctt accgaagacg gaaaggtacc tcaacattgc 481 cgcatagacc attgcagttt taccgataag atcacttttg accaggtaat taacctgaac 541 aatacagcca gagctattaa agacggttcg gtgggaggac cggggatgta ccatcgtgtt 601 gatcactgtt ttttttccaa tccgcaaaaa ccgggtaatg ccggaggggg aatcaggatt 661 ggctattacc gtaatgatat aggccgttgt ctggtagact ctaacctgtt tatgcgtcag 721 gattcggaag cagagatcat caccagcaaa tcgcaggaaa atgtttatta tggtaatact 781 tacctgaatt gccagggcac catgaacttt cgtcacggtg atcatcaggt ggccattaac 841 aatttttata taggcaatga ccagcgattt ggatacgggg gaatgtttgt ttggggaagc 901 aggcatgtca tagcctgtaa ttattttgag ctgtccgaaa ccataaagtc gagggggaac 961 gccgcattgt atttaaaccc cggtgctatg gcttcggagc atgctcttgc tttcgatatg 1021 ttgatagcca acaacgcttt catcaatgta aatgggtatg ccatccattt taatccattg 1081 gatgagcgca gaaaagaata ttgtgcagcc aataggctta agttcgaaac cccgcaccag 1141 ctaatgttaa aaggcaatct tttctttaag
SEQ ID NO: 22 ácido nucleico Condroitinasa ABCI 129953
ORIGEN
1 ggaattccat cactcaatca ttaaatttag gcacaacgat gggctatcag cgttatgaca 61 aatttaatga aggacgcatt ggtttcactg ttagccagcg tttctaagga gaaaaataat 121 gccgatattt cgttttactg cacttgcaat gacattgggg ctattatcag cgccttataa 181 cgcgatggca gccaccagca atcctgcatt tgatcctaaa aatctgatgc agtcagaaat 241 ttaccatttt gcacaaaata acccattagc agacttctca tcagataaaa actcaatact 301 aacgttatct gataaacgta gcattatggg aaaccaatct cttttatgga aatggaaagg 361 tggtagtagc tttactttac ataaaaaact gattgtcccc accgataaag aagcatctaa 421 agcatgggga cgctcatcta cccccgtttt ctcattttgg ctttacaatg aaaaaccgat 481 tgatggttat cttactatcg atttcggaga aaaactcatt tcaaccagtg aggctcaggc 541 aggctttaaa gtaaaattag atttcactgg ctggcgtgct gtgggagtct ctttaaataa 601 cgatcttgaa aatcgagaga tgaccttaaa tgcaaccaat acctcctctg atggtactca 661 agacagcatt gggcgttctt taggtgctaa agtcgatagt attcgtttta aagcgccttc 721 taatgtgagt cagggtgaaa tctatatcga ccgtattatg ttttctgtcg atgatgctcg 781 ctaccaatgg tctgattatc aagtaaaaac tcgcttatca gaacctgaaa ttcaatttca 841 caacgtaaag ccacaactac ctgtaacacc tgaaaattta gcggccattg atcttattcg 901 ccaacgtcta attaatgaat ttgtcggagg tgaaaaagag acaaacctcg cattagaaga 961 gaatatcagc aaattaaaaa gtgatttcga tgctcttaat attcacactt tagcaaatgg 1021 tggaacgcaa ggcagacatc tgatcactga taaacaaatc attatttatc aaccagagaa 1081 tcttaactcc caagataaac aactatttga taattatgtt attttaggta attacacgac 1141 attaatgttt aatattagcc gtgcttatgt gctggaaaaa gatcccacac aaaaggcgca 1201 actaaagcag atgtacttat taatgacaaa gcatttatta gatcaaggct ttgttaaagg 1261 gagtgcttta gtgacaaccc atcactgggg atacagttct cgttggtggt atatttccac 1321 gttattaatg tctgatgcac taaaagaagc gaacctacaa actcaagttt atgattcatt 1381 actgtggtat tcacgtgagt ttaaaagtag ttttgatatg aaagtaagtg ctgatagctc 1441 tgatctagat tatttcaata ccttatctcg ccaacattta gccttattat tactagagcc 1501 tgatgatcaa aagcgtatca acttagttaa tactttcagc cattatatca ctggcgcatt 1561 aacgcaagtg ccaccgggtg gtaaagatgg tttacgccct gatggtacag catggcgaca 1621 tgaaggcaac tatccgggct actctttccc agcctttaaa aatgcctctc agcttattta 1681 tttattacgc gatacaccat tttcagtggg tgaaagtggt tggaataacc tgaaaaaagc 1741 gatggtttca gcgtggatct acagtaatcc agaagttgga ttaccgcttg caggaagaca 1801 cccttttaac tcaccttcgt taaaatcagt cgctcaaggc tattactggc ttgccatgtc 1861 tgcaaaatca tcgcctgata aaacacttgc atctatttat cttgcgatta gtgataaaac 1921 acaaaatgaa tcaactgcta tttttggaga aactattaca ccagcgtctt tacctcaagg 1981 tttctatgcc tttaatggcg gtgcttttgg tattcatcgt tggcaagata aaatggtgac 2041 actgaaagct tataacacca atgtttggtc atctgaaatt tataacaaag ataaccgtta 2101 tggccgttac caaagtcatg gtgtcgctca aatagtgagt aatggctcgc agctttcaca 2161 gggctatcag caagaaggtt gggattggaa tagaatgcaa ggggcaacca ctattcacct 2221 tcctcttaaa gacttagaca gtcctaaacc tcatacctta atgcaacgtg gagagcgtgg 2281 atttagcgga acatcatccc ttgaaggtca atatggcatg atggcattcg atcttattta 2341 tcccgccaat cttgagcgtt ttgatcctaa tttcactgcg aaaaagagtg tattagccgc 2401 tgataatcac ttaattttta ttggtagcaa tataaatagt agtgataaaa ataaaaatgt 2461 tgaaacgacc ttattccaac atgccattac tccaacatta aatacccttt ggattaatgg 2521 acaaaagata gaaaacatgc cttatcaaac aacacttcaa caaggtgatt ggttaattga 2581 tagcaatggc aatggttact taattactca agcagaaaaa gtaaatgtaa gtcgccaaca 2641 tcaggtttca gcggaaaata aaaatcgcca accgacagaa ggaaacttta gctcggcatg 2701 gatcgatcac agcactcgcc ccaaagatgc cagttatgag tatatggtct ttttagatgc 2761 gacacctgaa aaaatgggag agatggcaca aaaattccgt gaaaataatg ggttatatca 2821 ggttcttcgt aaggataaag acgttcatat tattctcgat aaactcagca atgtaacggg 2881 atatgccttt tatcagccag catcaattga agacaaatgg atcaaaaagg ttaataaacc 2941 tgcaattgtg atgactcatc gacaaaaaga cactcttatt gtcagtgcag ttacacctga 3001 tttaaatatg actcgccaaa aagcagcaac tcctgtcacc atcaatgtca cgattaatgg 3061 caaatggcaa tctgctgata aaaatagtga agtgaaatat caggtttctg gtgataacac 3121 tgaactgacg tttacgagtt actttggtat tccacaagaa atcaaactct cgccactccc 3181 ttgatttaat caaaagaacg ctcttgcgtt ccttttttat ttgcaggaaa tctgattatg 3241 ctaataaaaa accctttagc ccacgcggtt acattaagcc tctgtttatc attacccgca 3301 caagcattac ccactctgtc tcatgaagct ttcggcgata tttatctttt tgaaggtgaa 3361 ttacccaata cccttaccac ttcaaataat aatcaattat cgctaagcaa acagcatgct 3421 aaagatggtg aacaatcact caaatggcaa tatcaaccac aagcaacatt aacactaaat 3481 aatattgtta attaccaaga tgataaaaat acagccacac cactcacttt tatgatgtgg 3541 atttataatg aaaaacctca atcttcccca ttaacgttag catttaaaca aaataataaa 3601 attgcactaa gttttaatgc tgaacttaat tttacggggt ggcgaggtat tgctgttcct 3661 tttcgtgata tgcaaggctc tgcgacaggt caacttgatc aattagtgat caccgctcca 3721 aaccaagccg gaacactctt ttttgatcaa atcatcatga gtgtaccgtt agacaatcgt 3781 tgggcagtac ctgactatca aacaccttac gtaaataacg cagtaaacac gatggttagt 3841 aaaaactgga gtgcattatt gatgtacgat cagatgtttc aagcccatta ccctacttta 3901 aacttcgata ctgaatttcg cgatgaccaa acagaaatgg cttcgattta tcagcgcttt 3961 gaatattatc aaggaattcc
//
SEQ ID NO: 23 ácido nucleico TAT fusión condroitinasa ABCI ggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtcgtcg tggtggtggtggtggtgccaccagca atcctgcatt tgatcctaaa aatctgatgc agtcagaaat 241 ttaccatttt gcacaaaata acccattagc agacttctca tcagataaaa actcaatact 301 aacgttatct gataaacgta gcattatggg aaaccaatct cttttatgga aatggaaagg 361 tggtagtagc tttactttac ataaaaaact gattgtcccc accgataaag aagcatctaa 421 agcatgggga cgctcatcta cccccgtttt ctcattttgg ctttacaatg aaaaaccgat 481 tgatggttat cttactatcg atttcggaga aaaactcatt tcaaccagtg aggctcaggc 541 aggctttaaa gtaaaattag atttcactgg ctggcgtgct gtgggagtct ctttaaataa 601 cgatcttgaa aatcgagaga tgaccttaaa tgcaaccaat acctcctctg atggtactca 661 agacagcatt gggcgttctt taggtgctaa agtcgatagt attcgtttta aagcgccttc 721 taatgtgagt cagggtgaaa tctatatcga ccgtattatg ttttctgtcg atgatgctcg 781 ctaccaatgg tctgattatc aagtaaaaac tcgcttatca gaacctgaaa ttcaatttca 841 caacgtaaag ccacaactac ctgtaacacc tgaaaattta gcggccattg atcttattcg 901 ccaacgtcta attaatgaat ttgtcggagg tgaaaaagag acaaacctcg cattagaaga 961 gaatatcagc aaattaaaaa gtgatttcga tgctcttaat attcacactt tagcaaatgg 1021 tggaacgcaa ggcagacatc tgatcactga taaacaaatc attatttatc aaccagagaa 1081 tcttaactcc caagataaac aactatttga taattatgtt attttaggta attacacgac 1141 attaatgttt aatattagcc gtgcttatgt gctggaaaaa gatcccacac aaaaggcgca 1201 actaaagcag atgtacttat taatgacaaa gcatttatta gatcaaggct ttgttaaagg 1261 gagtgcttta gtgacaaccc atcactgggg atacagttct cgttggtggt atatttccac 1321 gttattaatg tctgatgcac taaaagaagc gaacctacaa actcaagttt atgattcatt 1381 actgtggtat tcacgtgagt ttaaaagtag ttttgatatg aaagtaagtg ctgatagctc 1441 tgatctagat tatttcaata ccttatctcg ccaacattta gccttattat tactagagcc 1501 tgatgatcaa aagcgtatca acttagttaa tactttcagc cattatatca ctggcgcatt 1561 aacgcaagtg ccaccgggtg gtaaagatgg tttacgccct gatggtacag catggcgaca 1621 tgaaggcaac tatccgggct actctttccc agcctttaaa aatgcctctc agcttattta 1681 tttattacgc gatacaccat tttcagtggg tgaaagtggt tggaataacc tgaaaaaagc 1741 gatggtttca gcgtggatct acagtaatcc agaagttgga ttaccgcttg caggaagaca 1801 cccttttaac tcaccttcgt taaaatcagt cgctcaaggc tattactggc ttgccatgtc 1861 tgcaaaatca tcgcctgata aaacacttgc atctatttat cttgcgatta gtgataaaac 1921 acaaaatgaa tcaactgcta tttttggaga aactattaca ccagcgtctt tacctcaagg 1981 tttctatgcc tttaatggcg gtgcttttgg tattcatcgt tggcaagata aaatggtgac 2041 actgaaagct tataacacca atgtttggtc atctgaaatt tataacaaag ataaccgtta 2101 tggccgttac caaagtcatg gtgtcgctca aatagtgagt aatggctcgc agctttcaca 2161 gggctatcag caagaaggtt gggattggaa tagaatgcaa ggggcaacca ctattcacct 2221 tcctcttaaa gacttagaca gtcctaaacc tcatacctta atgcaacgtg gagagcgtgg 2281 atttagcgga acatcatccc ttgaaggtca atatggcatg atggcattcg atcttattta
2341 tcccgccaat cttgagcgtt ttgatcctaa tttcactgcg aaaaagagtg tattagccgc
2401 tgataatcac ttaattttta ttggtagcaa tataaatagt agtgataaaa ataaaaatgt
2461 tgaaacgacc ttattccaac atgccattac tccaacatta aatacccttt ggattaatgg
2521 acaaaagata gaaaacatgc cttatcaaac aacacttcaa caaggtgatt ggttaattga 2581 tagcaatggc aatggttact taattactca agcagaaaaa gtaaatgtaa gtcgccaaca 2641 tcaggtttca gcggaaaata aaaatcgcca accgacagaa ggaaacttta gctcggcatg 2701 gatcgatcac agcactcgcc ccaaagatgc cagttatgag tatatggtct ttttagatgc 2761 gacacctgaa aaaatgggag agatggcaca aaaattccgt gaaaataatg ggttatatca 2821 ggttcttcgt aaggataaag acgttcatat tattctcgat aaactcagca atgtaacggg
2881 atatgccttt tatcagccag catcaattga agacaaatgg atcaaaaagg ttaataaacc 2941 tgcaattgtg atgactcatc gacaaaaaga cactcttatt gtcagtgcag ttacacctga
3001 tttaaatatg actcgccaaa aagcagcaac tcctgtcacc atcaatgtca cgattaatgg 3061 caaatggcaa tctgctgata aaaatagtga agtgaaatat caggtttctg gtgataacac 3121 tgaactgacg tttacgagtt actttggtat tccacaagaa atcaaactct cgccactccc
3181 ttgatttaat caaaagaacg ctcttgcgtt ccttttttat ttgcaggaaa tctgattatg
3241 ctaataaaaa accctttagc ccacgcggtt acattaagcc tctgtttatc attacccgca
3301 caagcattac ccactctgtc tcatgaagct ttcggcgata tttatctttt tgaaggtgaa
3361 ttacccaata cccttaccac ttcaaataat aatcaattat cgctaagcaa acagcatgct
3421 aaagatggtg aacaatcact caaatggcaa tatcaaccac aagcaacatt aacactaaat 3481 aatattgtta attaccaaga tgataaaaat acagccacac cactcacttt tatgatgtgg
3541 atttataatg aaaaacctca atcttcccca ttaacgttag catttaaaca aaataataaa
3601 attgcactaa gttttaatgc tgaacttaat tttacggggt ggcgaggtat tgctgttcct
3661 tttcgtgata tgcaaggctc tgcgacaggt caacttgatc aattagtgat caccgctcca 3721 aaccaagccg gaacactctt ttttgatcaa atcatcatga gtgtaccgtt agacaatcgt 3781 tgggcagtac ctgactatca aacaccttac gtaaataacg cagtaaacac gatggttagt 3841 aaaaactgga gtgcattatt gatgtacgat cagatgtttc aagcccatta ccctacttta
3901 aacttcgata ctgaatttcg cgatgaccaa acagaaatgg cttcgattta tcagcgcttt
3961 gaatattatc aaggaattcc
SEQ ID NO: 24 Una secuencia VIH TAT y proteína penta enlazadora Gly
GRKKRRQRRRGGGGG
SEQ ID NO: 25 Secuencia de Tat y ácido nucleico penta enlazador ggt cgt aaa aag cgt cgt caa cgt cgt cgt ggt ggt ggt ggt ggt
SEQ ID NO: 26 ácido nucleico de condroitinasa ABC II de la presente invención ttacccactctgtctcatgaagctttcggcgatatttatctttttgaaggcgaattacccaatatccttaccacttcaaataataatcaattatcg ctaagcaaacagcatgctaaagatggtgaacaatcactcaaatggcaatatcaaccacaagcaacattaacactaaataatattgttaatt accaagatgataaaaatacagccacaccactcacttttatgatgtggatttataatgaaaaacctcaatcttccccattaacgttagcattta aacaaaataataaaattgcactaagttttaatgctgaacttaattttacggggtggcgaggtattgctgttccttttcgtgatatgcaaggctc tgcgacaggtcaacttgatcaattagtgatcaccgctccaaaccaagccggaacactcttttttgatcaaatcatcatgagtgtaccgtta gacaatcgttgggcagtacctgactatcaaacaccttacgtaaataacgcagtaaacacgatggttagtaaaaactggagtgcattattg atgtacgatcagatgtttcaagcccattaccctactttaaacttcgatactgaatttcgcgatgaccaaacagaaatggcttcgatttatcag cgctttgaatattatcaaggaattcgtagtgataaaaaaattactccagatatgctagataaacatttagcgttatgggaaaaattggggtta acacaacacgctgatggctcaatcacaggaaaagcccttgatcaccctaaccggcaacattttatgaaagtcgaaggtgtatttagtga ggggactcaaaaagcattacttgatgccaatatgctaagagatgtgggcaaaacgcttcttcaaactgctatttacttgcgtagcgattca ttatcagcaactggtagaaaaaaattagaagagcgctatttattaggtactcgttatgtccttgaacaaggttttacacgaggaagtggtta tcaaattattactcatgttggttaccaaaccagagaactttttgatgcatggtttattggccgtcatgttcttgcaaaaaataaccttttagccc ccactcaacaagctatgatgtggtacaacgccacaggacgtatttttgaaaaagataatgaaattgttgatgcaaatgtcgatattctcaat actcaattgcaatggatgataaaaagcttattgatgctaccggattatcaacaacgtcaacaagccttagcgcaactgcaaagttggcta aataaaaccattctaagctcaaaaggtgttgctggcggtttcaaatctgatggttctatttttcaccattcacaacattaccccgcttatgcta aagatgcatttggtggtttagcacccagtgtttatgcattaagtgattcaccttttcgcttatctacttcagcacatgagcatttaaaagatgtt ttgttaaaaatgcggatctacaccaaagagacacaaattcctgtggtattaagtggtcgtcatccaactgggttgcataaaatagggatcg cgccatttaaatggatggcattagcaggaaccccagatggcaaacaaaagttagataccacattatccgccgcttatgcaaacttagac aacaaaacgcattttgaaggcattaacgctgaaagtgagccagtcggcgcatgggcaatgaattatgcatcaatggcaatacaacgaa gagcatcgacccaatcaccacaacaaagctggctcgccatagcgcgcggttttagccgttatcttgttggtaatgaaagctatgaaaata acaaccgttatggtcgttatttacaatatggacaattggaaattattccagctgatttaactcaatcagggtttagccatgctggatgggatt ggaatagatatccaggtacaacaactattcatcttccctataacgaacttgaagcaaaacttaatcaattacctgctgcaggtattgaaga aatgttgctttcaacagaaagttactctggtgcaaatacccttaataataacagtatgtttgccatgaaattacacggtcacagtaaatatca acaacaaagcttaagggcaaataaatcctatttcttatttgataatagagttattgctttaggctcaggtattgaaaatgatgataaacaacat acgaccgaaacaacactattccagtttgccgtccctaaattacagtcagtgatcattaatggcaaaaaggtaaatcaattagatactcaatt aactttaaataatgcagatacattaattgatcctgccggcaatttatataagctcactaaaggacaaactgtaaaatttagttatcaaaaaca acattcacttgatgatagaaattcaaaaccaacagaacaattatttgcaacagctgttatttctcatggtaaggcaccgagtaatgaaaatt atgaatatgcaatagctatcgaagcacaaaataataaagctcccaaatacacagtattacaacataatgatcagctccatgcggtaaaag ataaaataacccaagaagagggatatggtttttttgaagccactaagttaaaatcagcggatgcaacattattatccagtgatgcgccggt tatggtcatggctaaaatacaaaatcagcaattaacattaagtattgttaatcctgatttaaatttatatcaaggtagagaaaaagatcaattt gatgataaaggtaatcaaatcgaagttagtgtttattctcgtcattggcttacagcagaatcgcaatcaacaaatagtactattaccgtaaa aggaatatggaaattaacgacacctcaacccggtgttattattaagcaccacaataacaacactcttattacgacaacaaccatacaggc aacacctactgttattaatttagttaagtaa
SEQ ID NO: 27 proteína Condroitinasa ABC II Presente invención
> .ABC (presenteinvención) 990 aa v > ABC (maduro) 990 aa matrizdepuntuación:,penalidaddebrecha : - 12 / - 2
98.3% deidentidad; Puntuacióndealineaciónglobal: 6393
13 20 30 40 50 60
453676 LPTLSHEAFGDIYLFEGELPNILTTSNNNQLSLSKQHAKDGEQSLKWQYQPQATLTLNNI
LPTLSHEAFGDIYLFEGELPNTLTTSNNNQLSLSKQHAKDGEQSLKWQYQPQATLTLNNI
13 20 30 40 50 60
73 80 90 130 110 120
457676 VNYQDDKNTATPLTFMMWIYNEKPQSSPLTLAFKQNNKIALSFNAELNFTGWRGIAVPFR
VNYQDDKNTATPLTFMMWIYNEKPQSSPLTLAFKQNNKIALSFNAELNFTGWRGIAVPFR
73 80 90 130 110 120
133 140 150 160 170 180
457676 DMQGSATGQLDQLVITAPNQAGTLFFDQIIMSVPLDNRWAVPDYQT?YVNNAVNTMVSKK
DMQGSVTGQLDQLVITAPNQAGTLFFDQIIMSVPLDNRWAVPDYQT?YVNNAVNTMVSKK 133 140 150 160 170 180
193 200 210 220 230 24 0
457676 WSALLMYDQMFQAHYPTLNFDTEFRDDQTEMASIYQRFEYYQGIRSDKKITPDMLDKHLA _ WSALLMYDQMFQAHYPTLNFDTEFRDDQTEMASRYQRFEYYQGIRSDKKITPDMLDKHLA 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 457676 LWEKLGLTQHADGSITGKALDHPNRQHFMKVEGVFSEGTQKALLDANMLRDVGKTLLQTA _ LWEKLVLTQHADGSITGKALDHPNRQHFMKVEGVFSEGTQKALLDANMLRDVGKTLLQTA 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 457676 IYLRSDSLSATGRKKLEERYLLGTRYVLEQGFTRGSGYQIITHVGYQTRELFDAWFIGRH _ IYLRSDSLSATDRKKLEERYLLGTRYVLEQGFHRGSGYQIISHVGYQTRELFDAWFIGRH 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 457676 VLAKNNLLAPTQQAMMWYNATGRIFEKDNEIVDANVDILNTQLQWMIKSLLMLPDYQQRQ _ VLAKNNLLAPTQQAMMWYNATGRIFEKNNEIVDANVDILNTQLQWMIKSLLMLPDYQQRQ 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 457676 QALAQLQSWLNKTILSSKGVAGGFKSDGSIFHHSQHYPAYAKDAFGGLAPSVYALSDSPF _ QALAQLQRWLNKTILSSKGVAGGFKSDGSIFHHSQHYPAYAKDAFGGLAPSVYALSDSPF 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 457676 RLSTSAHEHLKDVLLKMRIYTKETQIPWLSGRHPTGLHKIGIAPFKWMALAGTPDGKQK _ RLSTSAHERLKDVLLKMRIYTKETQIPAVLSGRHPTGLHKIGIAPFKWMALAGTPDGKQK 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 457676 LDTTLSAAYANLDNKTHFEGINAESEPVGAWAMNYASMAIQRRASTQSPQQSWLAIARGF _ LDTTLSAAYAKLDNKTHFEGIKAESEPVGAWAMNYASMAIQRRASTQSPQQSWLAIARGF 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 457676 SRYLVGNESYENNNRYGRYLQYGQLEIIPADLTQSGFSHAGWDWNRYPGTTTIHLPYNEL _ SRYLVGNESYENNNRYGRYLQYGQLEIIPADLTQSGFSHAGWDWNRYPGTTTIHLPYNEL 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 457676 EAKLNQLPAAGIEEMLLSTESYSGANTLNNNSMFAMKLHGHSKYQQQSLRANKSYFLFDN _ EAKLNQLPAAGIEEMLLSTESYSGANTLNNNSMFAMKLHGPSKYQQQSLRANKSYFLFDN 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 457676 RVIALGSGIENDDKQHTTETTLFQFAVPKLQSVIINGKKVNQLDTQLTLNNADTLIDPAG _ RVIALGSGIENDDKQHTTETTLFQFAVPKLQSVIINGKKVNQLDTQLTLNNADTLIDPAG 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 457676 NLYKLTKGQTVKFSYQKQHSLDDRNSKPTEQLFATAVISHGKAPSNENYEYAIAIEAQNN
NLYKLTKGQTVKFSYQKQHSLDDRNSKPTEQLFATAVISHGKAPSNENYEYAIAIEAQNN 790 800 810 820 830 840
850 860 870 880 890 900
457676 KAPKYTVLQHNDQLHAVKDKITQEEGYGFFEATKLKSADATLLSSDAPVMVMAKIQNQQL
_ KAPEYTVLQHNDQPHAVKDKITQEEGYAFFEATKLKSADATLLSSDAPVMVMAKIQNQQL
850 860 870 880 890 900
910 920 930 940 950 960
457676 TLSIVNPDLNLYQGREKDQFDDKGNQIEVSVYSRHWLTAESQSTNSTITVKGIWKLTTPQ
_ TLSIVNPDLNLYQGREKDQFDDKGNQIEVSVYSRHWLTAESQSTNSTITVKGIWKLTTPQ
910 920 930 940 950 960
970 980 990
457676 PGVIIKHHNNNTLITTTTIQATPTVINLVK
_ PGVIIKHHNNNTLITTTTIQATPTVINLVK
970 980 990
SEQ ID NO: 28 ácido nucleico Condroitinasa ABC I Presente invención gccaccagcaatcctgcatttgatcctaaaaatctgatgcagtcagaaatttaccattttgcacaaaataacccattagcagacttctcatc agataaaaactcaatactaacgttatctgataaacgtagcattatgggaaaccaatctcttttatggaaatggaaaggtggtagtagcttta ctttacataaaaaactgattgtccccaccgataaagaagcatctaaagcatggggacgctcatccacccccgttttctcattttggctttac aatgaaaaaccgattgatggttatcttactatcgatttcggagaaaaactcatttcaaccagtgaggctcaggcaggctttaaagtaaaatt agatttcactggctggcgtactgtgggagtctctttaaataacgatcttgaaaatcgagagatgaccttaaatgcaaccaatacctcctctg atggtactcaagacagcattgggcgttctttaggtgctaaagtcgatagtattcgttttaaagcgccttctaatgtgagtcagggtgaaatc tatatcgaccgtattatgttttctgtcgatgatgctcgctaccaatggtctgattatcaagtaaaaactcgcttatcagaacctgaaattcaatt tcacaacgtaaagccacaactacctgtaacacctgaaaatttagcggccattgatcttattcgccaacgtctaattaatgaatttgtcggag gtgaaaaagagacaaacctcgcattagaagagaatatcagcaaattaaaaagtgatttcgatgctcttaatactcacactttagcaaatg gtggaacgcaaggcagacatctgatcactgataaacaaatcattatttatcaaccagagaatcttaactctcaagataaacaactatttgat aattatgttattttaggtaattacacgacattaatgtttaatattagccgtgcttatgtgctggaaaaagatcccacacaaaaggcgcaacta aagcagatgtacttattaatgacaaagcatttattagatcaaggctttgttaaagggagtgctttagtgacnacccatcactggggataca gttctcgttggtggtatatttccacgttattaatgtctgatgcactaaaagaagcgaacctacaaactcaagtttatgattcattactgtggtat tcacgtgagtttaaaagtagttttgatatgaaagtaagtgctgatagctctgatctagattatttcaataccttatctcgccaacatttagcctt attactactagagcctgatgatcaaaagcgtatcaacttagttaatactttcagccattatatcactggcgcattaacgcaagtgccaccgg gtggtaaagatggtttacgccctgatggtacagcatggcgacatgaaggcaactatccgggctactctttcccagcctttaaaaatgcct ctcagcttatttatttattacgcgatacaccattttcagtgggtgaaagtggttggaatagcctgaaaaaagcgatggtttcagcgtggatct acagtaatccagaagttggattaccgcttgcaggaagacaccctcttaactcaccttcgttaaaatcagtcgctcaaggctattactggct tgccatgtctgcaaaatcatcgcctgataaaacacttgcatctatttatcttgcgattagtgataaaacacaaaatgaatcaactgctattttt ggagaaactattacaccagcgtctttacctcaaggtttctatgcctttaatggcggtgcttttggtattcatcgttggcaagataaaatggtg acactgaaagcttataacaccaatgtttggtcatctgaaatttataacaaagataaccgttatggccgttaccaaagtcatggtgtcgctca aatagtgagtaatggctcgcagctttcacagggctatcagcaagaaggttgggattggaatagaatgccaggggcaaccactatccac cttcctcttaaagacttagacagtcctaaacctcataccttaatgcaacgtggagagcgtggatttagcggaacatcatcccttgaaggtc aatatggcatgatggcattcgatcttatttatcccgccaatcttgagcgttttgatcctaatttcactgcgaaaaagagtgtattagccgctg ataatcacttaatttttattggtagcaatataaatagtagtgataaaaataaaaatgttgaaacgaccttattccaacatgccattactccaac attaaataccctttggattaatggacaaaagatagaaaacatgccttatcaaacaacacttcaacaaggtgattggttaattgatagcaatg gcaatggttacttaattactcaagcagaaaaagtaaatgtaagtcgccaacatcaggtttcagcggaaaataaaaatcgccaaccgaca gaaggaaactttagctcggcatggatcgatcacagcactcgccccaaagatgccagttatgagtatatggtctttttagatgcgacacct gaaaaaatgggagagatggcacaaaaattccgtgaaaataatgggttatatcaggttcttcgtaaggataaagacgttcatattattctcg ataaactcagcaatgtaacgggatatgccttttatcagccagcatcaattgaagacaaatggatcaaaaaggttaataaacctgcaattgt gatgactcatcgacaaaaagacactcttattgtcagtgcagttacacctgatttaaatatgactcgccaaaaagcagcaactcctgtcacc atcaatgtcacgattaatggcaaatggcaatctgctgataaaaatagtgaagtgaaatatcaggtttctggtgataacactgaactgacgt ttacgagttactttggtattccacaagaaatcaaactctcgccactcccttga
SEQ ID NO: 29 proteína Condroitinasa ABC I Presente invención
365019 ATSNPAFDPKNLMQSEIYHFAQNNPLADFSSDKNSILTLSDKRSIMGNQSLLWKWKGGSS
365019 FTLHKKLIVPTDKEASKAWGRSSTPVFSFWLYNEKPIDGYLTIDFGEKLISTSEAQAGFK
365019 VKLDFTGWRTVGVSLNNDLENREMTLNATNTSSDGTQDSIGRSLGAKVDSIRFKAPSNVS
365019 QGEIYIDRIMFSVDDARYQWSDYQVKTRLSEPEIQFHNVKPQLPVTPENLAAIDLIRQRL
365019 INEFVGGEKETNLALEENISKLKSDFDALNTHTLANGGTQGRHLITDKQIIIYQPENLNS
365019 QDKQLFDNYVILGNYTTLMFNISRAYVLEKDPTQKAQLKQMYLLMTKHLLDQGFVKGSAL
365019 VTTHHWGYSSRWWYISTLLMSDALKEANLQTQVYDSLLWYSREFKSSFDMKVSADSSDLD
365019 YFNTLSRQHLALLLLEPDDQKRINLVNTFSHYITGALTQVPPGGKDGLRPDGTAWRHEGN
365019 YPGYSFPAFKNASQLIYLLRDTPFSVGESGWNSLKKAMVSAWIYSNPEVGLPLAGRHPLN
365019 SPSLKSVAQGYYWLAMSAKSSPDKTLASIYLAISDKTQNESTAIFGETITPASLPQGFYA
365019 FNGGAFGIHRWQDKMVTLKAYNTNVWSSEIYNKDNRYGRYQSHGVAQIVSNGSQLSQGYQ
365019 QEGWDWNRMPGATTIHLPLKDLDSPKPHTLMQRGERGFSGTSSLEGQYGMMAFDLIYPAN
365019 LERFDPNFTAKKSVLAADNHLIFIGSNINSSDKNKNVETTLFQHAITPTLNTLWINGQKI
365019 ENMPYQTTLQQGDWLIDSNGNGYLITQAEKVNVSRQHQVSAENKNRQPTEGNFSSAWIDH
365019 STRPKDASYEYMVFLDATPEKMGEMAQKFRENNGLYQVLRKDKDVHIILDKLSNVTGYAF
365019 YQPASIEDKWIKKVNKPAIVMTHRQKDTLIVSAVTPDLNMTRQKAATPVTINVTINGKWQ
365019 SADKNSEVKYQVSGDNTELTFTSYFGIPQEIKLSPLP
proteína hialuronidasa 1, SEQ ID NO: 30, Locus HSU96078
proteína hialuronidasa 2, SEQ ID NO: 31,
proteína hialuronidasa 3, SEQ ID NO: 32, Locus BC012892
proteína hialuronidasa 4, SEQ ID NO: 33, AF009010
proteína PH-20, SEQ ID NO: 34,
péptido Tat SEQ ID NO: 35
ABCI es un mutante específico del sitio designado como H501a e Y508a SEQ ID NO: 36
SEQ ID NO: 37 proteína Condroitinasa ABCI Locus P59807
ORIGEN
1 mpifrftala mtlgllsapy namaatsnpa fdpknlmqse iyhfaqnnpl adfssdknsi 61 ltlsdkrsim gnqsllwkwk ggssftlhkk liyptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwravgvsln ndlenremtl natntssdgt
181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnihtlan
301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka
361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga
481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk
541 amvsawiysn pevglplagr hpfhspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr
661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafiili ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn
781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq
841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp
961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl
1021 pXX
SEQ ID NO: 38 proteína NA20 ABCI (A45-N1023),
aqnnpl adfssdknsi 61 ltlsdkrsim gnqsllwkwk ggssftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwravgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnihtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfhspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafhli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp 961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl 1021 pXX
SEQ ID NO: 39 proteína NA60 ABCI (F85-N1023)
ftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwravgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnihtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfhspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafhli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp 961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl 1021 pXX
SEQ ID NO. 40: proteína NA60 CA80ABCI (F85-A942)
ftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwravgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnihtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfhspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafhli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk pa
SEQ ID NO. 41: I. Secuencia de nucleótidos para TAT-ABCI-nA20:
1 ggtc gtaaaaagcg tcgtcaacgt cgtcgtcctc ctcaatgcgc acaaaataac 61 ccattagcag acttctcatc agataaaaac tcaatactaa cgttatctga taaacgtagc 121 attatgggaa accaatctct tttatggaaa tggaaaggtg gtagtagctt tactttacat 181 aaaaaactga ttgtccccac cgataaagaa gcatctaaag catggggacg ctcatccacc 241 cccgttttct cattttggct ttacaatgaa aaaccgattg atggttatct tactatcgat 301 ttcggagaaa aactcatttc aaccagtgag gctcaggcag gctttaaagt aaaattagat 361 ttcactggct ggcgtactgt gggagtctct ttaaataacg atcttgaaaa tcgagagatg 421 accttaaatg caaccaatac ctcctctgat ggtactcaag acagcattgg gcgttcttta 481 ggtgctaaag tcgatagtat tcgttttaaa gcgccttcta atgtgagtca gggtgaaatc 541 tatatcgacc gtattatgtt ttctgtcgat gatgctcgct accaatggtc tgattatcaa 601 gtaaaaactc gcttatcaga acctgaaatt caatttcaca acgtaaagcc acaactacct 661 gtaacacctg aaaatttagc ggccattgat cttattcgcc aacgtctaat taatgaattt 721 gtcggaggtg aaaaagagac aaacctcgca ttagaagaga atatcagcaa attaaaaagt 781 gatttcgatg ctcttaatac tcacacttta gcaaatggtg gaacgcaagg cagacatctg 841 atcactgata aacaaatcat tatttatcaa ccagagaatc ttaactctca agataaacaa 901 ctatttgata attatgttat tttaggtaat tacacgacat taatgtttaa tattagccgt 961 gcttatgtgc tggaaaaaga tcccacacaa aaggcgcaac taaagcagat gtacttatta 1021 atgacaaagc atttattaga tcaaggcttt gttaaaggga gtgctttagt gacnacccat 1081 cactggggat acagttctcg ttggtggtat atttccacgt tattaatgtc tgatgcacta 1141 aaagaagcga acctacaaac tcaagtttat gattcattac tgtggtattc acgtgagttt 1201 aaaagtagtt ttgatatgaa agtaagtgct gatagctctg atctagatta tttcaatacc 1261 ttatctcgcc aacatttagc cttattacta ctagagcctg atgatcaaaa gcgtatcaac 1321 ttagttaata ctttcagcca ttatatcact ggcgcattaa cgcaagtgcc accgggtggt 1381 aaagatggtt tacgccctga tggtacagca tggcgacatg aaggcaacta tccgggctac 1441 tctttcccag cctttaaaaa tgcctctcag cttatttatt tattacgcga tacaccattt 1501 tcagtgggtg aaagtggttg gaatagcctg aaaaaagcga tggtttcagc gtggatctac 1561 agtaatccag aagttggatt accgcttgca ggaagacacc ctcttaactc accttcgtta 1621 aaatcagtcg ctcaaggcta ttactggctt gccatgtctg caaaatcatc gcctgataaa 1681 acacttgcat ctatttatct tgcgattagt gataaaacac aaaatgaatc aactgctatt 1741 tttggagaaa ctattacacc agcgtcttta cctcaaggtt tctatgcctt taatggcggt 1801 gcttttggta ttcatcgttg gcaagataaa atggtgacac tgaaagctta taacaccaat 1861 gtttggtcat ctgaaattta taacaaagat aaccgttatg gccgttacca aagtcatggt 1921 gtcgctcaaa tagtgagtaa tggctcgcag ctttcacagg gctatcagca agaaggttgg 1981 gattggaata gaatgccagg ggcaaccact atccaccttc ctcttaaaga cttagacagt 2041 cctaaacctc ataccttaat gcaacgtgga gagcgtggat ttagcggaac atcatccctt 2101 gaaggtcaat atggcatgat ggcattcgat cttatttatc ccgccaatct tgagcgtttt 2161 gatcctaatt tcactgcgaa aaagagtgta ttagccgctg ataatcactt aatttttatt 2221 ggtagcaata taaatagtag tgataaaaat aaaaatgttg aaacgacctt attccaacat 2281 gccattactc caacattaaa taccctttgg attaatggac aaaagataga aaacatgcct 2341 tatcaaacaa cacttcaaca aggtgattgg ttaattgata gcaatggcaa tggttactta 2401 attactcaag cagaaaaagt aaatgtaagt cgccaacatc aggtttcagc ggaaaataaa 2461 aatcgccaac cgacagaagg aaactttagc tcggcatgga tcgatcacag cactcgcccc 2521 aaagatgcca gttatgagta tatggtcttt ttagatgcga cacctgaaaa aatgggagag 2581 atggcacaaa aattccgtga aaataatggg ttatatcagg ttcttcgtaa ggataaagac 2641 gttcatatta ttctcgataa actcagcaat gtaacgggat atgcctttta tcagccagca 2701 tcaattgaag acaaatggat caaaaaggtt aataaacctg caattgtgat gactcatcga 2761 caaaaagaca ctcttattgt cagtgcagtt acacctgatt taaatatgac tcgccaaaaa 2821 gcagcaactc ctgtcaccat caatgtcacg attaatggca aatggcaatc tgctgataaa 2881 aatagtgaag tgaaatatca ggtttctggt gataacactg aactgacgtt tacgagttac 2941 tttggtattc cacaagaaat caaactctcg ccactccctt ga
SEQ ID NO. 42: II. Secuencia de aminoácidos para TAT-ABCI-nA20:
grkkrrqrrrppqcaqnnpladfssdknsiltlsdkrsimgnqsllwkwkggssftlhkklivptdkeaskawgrsstpvfsfw lynekpidgyltidfgeklistseaqagfkvkldftgwrtvgvslnndlenremtlnatntssdgtqdsigrslgakvdsirfkapsnv sqgeiyidrimfsvddaryqwsdyqvktrlsepeiqfhnvkpqlpvtpenlaaidlirqrlinefvggeketnlaleenisklksdfd alnthtlanggtqgrhlitdkqiiiyqpenlnsqdkqlfdnyvilgnyttlmfhisrayvlekdptqkaqlkqmyllmtkhlldqgfv kgsalvtthhwgyssrwwyistllmsdalkeanlqtqvydsllwysrefkssfdmkvsadssdldyfiitlsrqhlallllepddqkr inlvntfshyitgaltqvppggkdglrpdgtawrhegnypgysfpafknasqliyllrdtpfsvgesgwnslkkamvsawiysnp evglplagrhplnspslksvaqgyywlamsaksspdktlasiylaisdktqnestaifgetitpaslpqgfyafnggafgihrwqdk mvtlkayntnvwsseiynkdnrygryqshgvaqivsngsqlsqgyqqegwdwnrmpgattihlplkdldspkphtlmqrger gfsgtsslegqygmmafdliypanlerfdpnftakksvlaadnhlifigsninssdknknvettlfqhaitptlntlwingqkienm pyqttlqqgdwlidsngngylitqaekvnvsrqhqvsaenknrqptegnfssawidhstrpkdasyeymvfldatpekmgema qkfrennglyqvlrkdkdvhiildklsnvtgyafyqpasiedkwikkvnkpaivmthrqkdtlivsavtpdlnmtrqkaatpvtin vtingkwqsadknsevkyqvsgdnteltftsyfgipqeiklsplp
SEQ ID NO. 43: II. Secuencia de nucleótidos para TAT-ABCI-nA60:
ggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtcgtcgtcctcctcaatgctttactttacataaaaaactgattgtccccaccgataaagaagcatcta aagcatggggacgctcatccacccccgttttctcattttggctttacaatgaaaaaccgattgatggttatcttactatcgatttcggagaaa aactcatttcaaccagtgaggctcaggcaggctttaaagtaaaattagatttcactggctggcgtactgtgggagtctctttaaataacgat cttgaaaatcgagagatgaccttaaatgcaaccaatacctcctctgatggtactcaagacagcattgggcgttctttaggtgctaaagtcg atagtattcgttttaaagcgccttctaatgtgagtcagggtgaaatctatatcgaccgtattatgttttctgtcgatgatgctcgctaccaatg gtctgattatcaagtaaaaactcgcttatcagaacctgaaattcaatttcacaacgtaaagccacaactacctgtaacacctgaaaatttag cggccattgatcttattcgccaacgtctaattaatgaatttgtcggaggtgaaaaagagacaaacctcgcattagaagagaatatcagca aattaaaaagtgatttcgatgctcttaatactcacactttagcaaatggtggaacgcaaggcagacatctgatcactgataaacaaatcatt atttatcaaccagagaatcttaactctcaagataaacaactatttgataattatgttattttaggtaattacacgacattaatgtttaatattagc cgtgcttatgtgctggaaaaagatcccacacaaaaggcgcaactaaagcagatgtacttattaatgacaaagcatttattagatcaaggc tttgttaaagggagtgctttagtgacnacccatcactggggatacagttctcgttggtggtatatttccacgttattaatgtctgatgcactaa aagaagcgaacctacaaactcaagtttatgattcattactgtggtattcacgtgagtttaaaagtagttttgatatgaaagtaagtgctgata gctctgatctagattatttcaataccttatctcgccaacatttagccttattactactagagcctgatgatcaaaagcgtatcaacttagttaat actttcagccattatatcactggcgcattaacgcaagtgccaccgggtggtaaagatggtttacgccctgatggtacagcatggcgacat gaaggcaactatccgggctactctttcccagcctttaaaaatgcctctcagcttatttatttattacgcgatacaccattttcagtgggtgaa agtggttggaatagcctgaaaaaagcgatggtttcagcgtggatctacagtaatccagaagttggattaccgcttgcaggaagacaccc tcttaactcaccttcgttaaaatcagtcgctcaaggctattactggcttgccatgtctgcaaaatcatcgcctgataaaacacttgcatctatt tatcttgcgattagtgataaaacacaaaatgaatcaactgctatttttggagaaactattacaccagcgtctttacctcaaggtttctatgcct ttaatggcggtgcttttggtattcatcgttggcaagataaaatggtgacactgaaagcttataacaccaatgtttggtcatctgaaatttataa caaagataaccgttatggccgttaccaaagtcatggtgtcgctcaaatagtgagtaatggctcgcagctttcacagggctatcagcaag aaggttgggattggaatagaatgccaggggcaaccactatccaccttcctcttaaagacttagacagtcctaaacctcataccttaatgc aacgtggagagcgtggatttagcggaacatcatcccttgaaggtcaatatggcatgatggcattcgatcttatttatcccgccaatcttga gcgttttgatcctaatttcactgcgaaaaagagtgtattagccgctgataatcacttaatttttattggtagcaatataaatagtagtgataaa aataaaaatgttgaaacgaccttattccaacatgccattactccaacattaaataccctttggattaatggacaaaagatagaaaacatgc cttatcaaacaacacttcaacaaggtgattggttaattgatagcaatggcaatggttacttaattactcaagcagaaaaagtaaatgtaagt cgccaacatcaggtttcagcggaaaataaaaatcgccaaccgacagaaggaaactttagctcggcatggatcgatcacagcactcgc cccaaagatgccagttatgagtatatggtctttttagatgcgacacctgaaaaaatgggagagatggcacaaaaattccgtgaaaataat gggttatatcaggttcttcgtaaggataaagacgttcatattattctcgataaactcagcaatgtaacgggatatgccttttatcagccagca tcaattgaagacaaatggatcaaaaaggttaataaacctgcaattgtgatgactcatcgacaaaaagacactcttattgtcagtgcagtta cacctgatttaaatatgactcgccaaaaagcagcaactcctgtcaccatcaatgtcacgattaatggcaaatggcaatctgctgataaaa atagtgaagtgaaatatcaggtttctggtgataacactgaactgacgtttacgagttactttggtattccacaagaaatcaaactctcgcca ctcccttga
SEQ ID NO. 44: IV. Secuencia de aminoácidos para TAT-ABCI-nA60
grkkrrqrrrppqcftlhkklivptdkeaskawgrsstpvfsfwlynekpidgyltidfgeklistseaqagfkvkldftgwrtvgvsl nndlenremtlnatntssdgtqdsigrslgakvdsirfkapsnvsqgeiyidrimfsvddaryqwsdyqvktrlsepeiqfhnvkp qlpvtpenlaaidlirqrlinefvggeketnlaleenisklksdfdalnthtlanggtqgrhlitdkqiiiyqpenlnsqdkqlfdnyvil gnyttlmfhisrayvlekdptqkaqlkqmyllmtkhlldqgfvkgsalvtthhwgyssrwwyistllmsdalkeanlqtqvydsll wysrefkssfdmkvsadssdldyfiitlsrqhlallllepddqkrinlvntfshyitgaltqvppggkdglrpdgtawrhegnypgys fpafknasqliyllrdtpfsvgesgwnslkkamvsawiysnpevglplagrhplnspslksvaqgyywlamsaksspdktlasiy laisdktqnestaifgetitpaslpqgfyafnggafgihrwqdkmvtlkayntnvwsseiynkdnrygryqshgvaqivsngsqls qgyqqegwdwnrmpgattihlplkdldspkphtlmqrgergfsgtsslegqygmmafdliypanlerfdpnftakksvlaadn hlifigsnmssdknknvettlfqhaitptlntlwingqkienmpyqttlqqgdwlidsngngylitqaekvnvsrqhqvsaenknr qptegnfssawidhstrpkdasyeymvfldatpekmgemaqkfrennglyqvlrkdkdvhiildklsnvtgyafyqpasiedk wikkvnkpaivmthrqkdtlivsavtpdlnmtrqkaatpvtinvtingkwqsadknscvkyqvsgdntcltftsyfgipqciklsp lp
SEQ ID NO. 45: V. Secuencia de nucleótidos para ABCI-TAT-C:
gccaccagcaatcctgcatttgatcctaaaaatctgatgcagtcagaaatttaccattttgcacaaaataacccattagcagacttctcatc agataaaaactcaatactaacgttatctgataaacgtagcattatgggaaaccaatctcttttatggaaatggaaaggtggtagtagcttta ctttacataaaaaactgattgtccccaccgataaagaagcatctaaagcatggggacgctcatccacccccgttttctcattttggctttac aatgaaaaaccgattgatggttatcttactatcgatttcggagaaaaactcatttcaaccagtgaggctcaggcaggctttaaagtaaaatt agatttcactggctggcgtactgtgggagtctctttaaataacgatcttgaaaatcgagagatgaccttaaatgcaaccaatacctcctctg atggtactcaagacagcattgggcgttctttaggtgctaaagtcgatagtattcgttttaaagcgccttctaatgtgagtcagggtgaaatc tatatcgaccgtattatgttttctgtcgatgatgctcgctaccaatggtctgattatcaagtaaaaactcgcttatcagaacctgaaattcaatt tcacaacgtaaagccacaactacctgtaacacctgaaaatttagcggccattgatcttattcgccaacgtctaattaatgaatttgtcggag gtgaaaaagagacaaacctcgcattagaagagaatatcagcaaattaaaaagtgatttcgatgctcttaatactcacactttagcaaatg gtggaacgcaaggcagacatctgatcactgataaacaaatcattatttatcaaccagagaatcttaactctcaagataaacaactatttgat aattatgttattttaggtaattacacgacattaatgtttaatattagccgtgcttatgtgctggaaaaagatcccacacaaaaggcgcaacta aagcagatgtacttattaatgacaaagcatttattagatcaaggctttgttaaagggagtgctttagtgacnacccatcactggggataca gttctcgttggtggtatatttccacgttattaatgtctgatgcactaaaagaagcgaacctacaaactcaagtttatgattcattactgtggtat tcacgtgagtttaaaagtagttttgatatgaaagtaagtgctgatagctctgatctagattatttcaataccttatctcgccaacatttagcctt attactactagagcctgatgatcaaaagcgtatcaacttagttaatactttcagccattatatcactggcgcattaacgcaagtgccaccgg gtggtaaagatggtttacgccctgatggtacagcatggcgacatgaaggcaactatccgggctactctttcccagcctttaaaaatgcct ctcagcttatttatttattacgcgatacaccattttcagtgggtgaaagtggttggaatagcctgaaaaaagcgatggtttcagcgtggatct acagtaatccagaagttggattaccgcttgcaggaagacaccctcttaactcaccttcgttaaaatcagtcgctcaaggctattactggct tgccatgtctgcaaaatcatcgcctgataaaacacttgcatctatttatcttgcgattagtgataaaacacaaaatgaatcaactgctattttt ggagaaactattacaccagcgtctttacctcaaggtttctatgcctttaatggcggtgcttttggtattcatcgttggcaagataaaatggtg acactgaaagcttataacaccaatgtttggtcatctgaaatttataacaaagataaccgttatggccgttaccaaagtcatggtgtcgctca aatagtgagtaatggctcgcagctttcacagggctatcagcaagaaggttgggattggaatagaatgccaggggcaaccactatccac cttcctcttaaagacttagacagtcctaaacctcataccttaatgcaacgtggagagcgtggatttagcggaacatcatcccttgaaggtc aatatggcatgatggcattcgatcttatttatcccgccaatcttgagcgttttgatcctaatttcactgcgaaaaagagtgtattagccgctg ataatcacttaatttttattggtagcaatataaatagtagtgataaaaataaaaatgttgaaacgaccttattccaacatgccattactccaac attaaataccctttggattaatggacaaaagatagaaaacatgccttatcaaacaacacttcaacaaggtgattggttaattgatagcaatg gcaatggttacttaattactcaagcagaaaaagtaaatgtaagtcgccaacatcaggtttcagcggaaaataaaaatcgccaaccgaca gaaggaaactttagctcggcatggatcgatcacagcactcgccccaaagatgccagttatgagtatatggtctttttagatgcgacacct gaaaaaatgggagagatggcacaaaaattccgtgaaaataatgggttatatcaggttcttcgtaaggataaagacgttcatattattctcg ataaactcagcaatgtaacgggatatgccttttatcagccagcatcaattgaagacaaatggatcaaaaaggttaataaacctgcaattgt gatgactcatcgacaaaaagacactcttattgtcagtgcagttacacctgatttaaatatgactcgccaaaaagcagcaactcctgtcacc atcaatgtcacgattaatggcaaatggcaatctgctgataaaaatagtgaagtgaaatatcaggtttctggtgataacactgaactgacgt ttacgagttactttggtattccacaagaaatcaaactctcgccactccct
ggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtcgtcgtcctcctcaatgctag
SEQ ID NO. 46: V. Secuencia de aminoácidos para ABCI-TAT-C:
atsnpafdpknlmqseiyhfaqnnpladfssdknsiltlsdkrsimgnqsllwkwkggssftlhkklivptdkeaskawgrsstpv fsfwlynekpidgyltidfgeklistseaqagfkvkldftgwrtvgvslnndlenremtlnatntssdgtqdsigrslgakvdsirfka psnvsqgeiyidrimfsvddaryqwsdyqvktrlsepeiqfhnvkpqlpvtpenlaaidlirqrlinefvggeketnlaleenisklk sdfdalnthtlanggtqgrhlitdkqiiiyqpenlnsqdkqlfdnyvilgnyttlmfhisrayvlekdptqkaqlkqmyllmtkhlld qgfvkgsalvtthhwgyssrwwyistllmsdalkeanlqtqvydsllwysrefkssfdmkvsadssdldyfiitlsrqhlallllepd dqkrinlvntfshyitgaltqvppggkdglrpdgtawrhegnypgysfpafknasqliyllrdtpfsvgesgwnslkkamvsawi ysnpevglplagrhplnspslksvaqgyywlamsaksspdktlasiylaisdktqnestaifgetitpaslpqgfyafhggafgihr wqdkmvtlkayntnvwsseiynkdnrygryqshgvaqivsngsqlsqgyqqegwdwnrmpgattihlplkdldspkphtlm qrgergfsgtsslegqygmmafdliypanlerfdpnftakksvlaadnhliñgsninssdknknvettlfqhaitptlntlwingqki enmpyqttlqqgdwlidsngngylitqaekvnvsrqhqvsaenknrqptegnfssawidhstrpkdasyeymvfldatpekm gemaqkfrennglyqvlrkdkdvhiildklsnvtgyafyqpasiedkwikkvnkpaivmthrqkdtlivsavtpdlnmtrqkaa tpvtinvtingkwqsadknsevkyqvsgdnteltftsyfgipqeiklsplpgrkkrrqrrrppqc
SEQ ID NO. 47 Secuencia de nucleótidos para la condroitinasa ABCI-nA20
ge acaaaataac 61 ccattagcag acttctcatc agataaaaac tcaatactaa cgttatctga taaacgtagc 121 attatgggaa accaatctct tttatggaaa tggaaaggtg gtagtagctt tactttacat 181 aaaaaactga ttgtccccac cgataaagaa gcatctaaag catggggacg ctcatccacc 241 cccgttttct cattttggct ttacaatgaa aaaccgattg atggttatct tactatcgat 301 ttcggagaaa aactcatttc aaccagtgag gctcaggcag gctttaaagt aaaattagat 361 ttcactggct ggcgtactgt gggagtctct ttaaataacg atcttgaaaa tegagagatg 421 accttaaatg caaccaatac ctcctctgat ggtactcaag acagcattgg gcgttcttta 481 ggtgctaaag tegatagtat tcgttttaaa gcgccttcta atgtgagtca gggtgaaatc 541 tatatcgacc gtattatgtt ttctgtcgat gatgeteget accaatggtc tgattatcaa 601 gtaaaaactc gcttatcaga acctgaaatt caatttcaca acgtaaagcc acaactacct 661 gtaacacctg aaaatttagc ggccattgat cttattcgcc aacgtctaat taatgaattt 721 gtcggaggtg aaaaagagac aaacctcgca ttagaagaga atatcagcaa attaaaaagt 781 gatttcgatg ctcttaatac tcacacttta gcaaatggtg gaacgcaagg cagacatctg 841 atcactgata aacaaatcat tatttatcaa ccagagaatc ttaactctca agataaacaa 901 ctatttgata attatgttat tttaggtaat tacacgacat taatgtttaa tattagccgt 961 gcttatgtgc tggaaaaaga tcccacacaa aaggcgcaac taaagcagat gtaettatta 1021 atgacaaagc atttattaga tcaaggcttt gttaaaggga gtgctttagt gacnacccat 1081 cactggggat acagttctcg ttggtggtat atttccacgt tattaatgtc tgatgcacta 1141 aaagaagcga acctacaaac tcaagtttat gattcattac tgtggtattc acgtgagttt 1201 aaaagtagtt ttgatatgaa agtaagtgct gatagetetg atetagatta tttcaatacc 1261 ttatctcgcc aacatttagc cttattacta ctagagcctg atgatcaaaa gcgtatcaac 1321 ttagttaata ctttcagcca ttatatcact ggcgcattaa cgcaagtgcc accgggtggt 1381 aaagatggtt tacgccctga tggtacagca tggcgacatg aaggcaacta tccgggctac 1441 tctttcccag cctttaaaaa tgcctctcag cttatttatt tattaegega tacaccattt 1501 tcagtgggtg aaagtggttg gaatagcctg aaaaaagcga tggtttcagc gtggatctac 1561 agtaatccag aagttggatt accgcttgca ggaagacacc ctcttaactc accttcgtta 1621 aaatcagtcg ctcaaggcta ttactggctt gccatgtctg caaaatcatc gcctgataaa 1681 acacttgcat ctatttatct tgcgattagt gataaaacac aaaatgaatc aactgctatt 1741 tttggagaaa ctattacacc agcgtcttta cctcaaggtt tetatgeett taatggcggt 1801 gcttttggta ttcatcgttg gcaagataaa atggtgacac tgaaagctta taacaccaat 1861 gtttggtcat ctgaaattta taacaaagat aaccgttatg gccgttacca aagtcatggt 1921 gtcgctcaaa tagtgagtaa tggctcgcag ctttcacagg gctatcagca agaaggttgg 1981 gattggaata gaatgccagg ggcaaccact atccaccttc etettaaaga cttagacagt 2041 cctaaacctc ataccttaat gcaacgtgga gagcgtggat ttagcggaac atcatccctt 2101 gaaggtcaat atggcatgat ggcattcgat cttatttatc ccgccaatct tgagcgtttt 2161 gatcctaatt tcactgcgaa aaagagtgta ttagccgctg ataatcactt aatttttatt 2221 ggtagcaata taaatagtag tgataaaaat aaaaatgttg aaacgacctt attccaacat 2281 gccattactc caacattaaa taccctttgg attaatggac aaaagataga aaacatgcct 2341 tatcaaacaa cacttcaaca aggtgattgg ttaattgata gcaatggcaa tggttactta 2401 attactcaag cagaaaaagt aaatgtaagt cgccaacatc aggtttcagc ggaaaataaa 2461 aatcgccaac cgacagaagg aaactttagc tcggcatgga tcgatcacag cactcgcccc 2521 aaagatgcca gttatgagta tatggtcttt ttagatgcga cacctgaaaa aatgggagag 2581 atggcacaaa aattccgtga aaataatggg ttatatcagg ttcttcgtaa ggataaagac 2641 gtteatatta ttctcgataa actcagcaat gtaacgggat atgcctttta tcagccagca 2701 tcaattgaag acaaatggat caaaaaggtt aataaacctg caattgtgat gactcatcga 2761 caaaaagaca ctcttattgt cagtgcagtt acacctgatt taaatatgac tcgccaaaaa 2821 gcagcaactc ctgtcaccat caatgtcacg attaatggca aatggcaatc tgctgataaa 2881 aatagtgaag tgaaatatca ggtttctggt gataacactg aactgacgtt tacgagttac 2941 tttggtattc cacaagaaat caaactctcg ccactccctt ga
SEQ ID NO. 48: II. Secuencia de nucleótidos para ABCI-nA60:

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido mutante de condroitinasa AC purificado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.
2. Una composición que comprende un polipéptido mutante de condroitinasa AC que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, Se Q ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.
3. La composición de la reivindicación 2, que comprende además compuestos que facilitan la plasticidad, el crecimiento y la regeneración de las neuritas, moléculas que superan la inhibición del crecimiento de las neuritas o promueven el crecimiento nervioso, moléculas terapéuticas, moléculas de diagnóstico o una combinación de éstas.
4. La composición de la reivindicación 3, en donde los compuestos que facilitan la plasticidad y el crecimiento y la regeneración de las neuritas se seleccionan de antagonistas de NOGO solubles, moléculas de adhesión de células neurales, factores neurotróficos, factores de crecimiento, inhibidores de la fosfodiesterasa, inhibidores de MAG o MOG, neuregulinas y anticuerpos que promover la remielinización.
5. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 o 4 para uso en el tratamiento de una lesión o trastorno del sistema nervioso central.
6. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la lesión o trastorno del sistema nervioso central se selecciona de una lesión por contusión, una lesión cerebral traumática, un accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, una lesión del plexo braquial, ambliopía y una lesión de la médula espinal.
7. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la composición está en forma de una aplicación tópica, inyección en bolo, inyección intravenosa, inyección intratecal, inyección intramuscular, inyección peritoneal, inyección subcutánea, infusión continua, liberación sostenida de implantes, productos farmacéuticos de liberación sostenida, y por vía oral.
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