EA011351B1 - Полимерные реагенты, способы их получения, а также содержащие их конъюгаты и фармацевтические препараты - Google Patents

Abstract

Предлагаются полимерные реагенты, включающие часть атомов, расположенных в определенном порядке, в котором часть расположена между водорастворимым полимером и реактивной группой, а также способ их получения. Полимерные реагенты являются эффективными, кроме всего прочего, для формирования конъюгатов полимер - активный агент. Также предлагаются фармацевтические препараты, содержащие соответствующие конъюгаты в сочетании с фармацевтическим наполнителем.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к новым полимерным реагентам, включающим специфическую внутреннюю структурную ориентацию, а также к конъюгатам этих новых полимерных реагентов. Кроме того, изобретение относится к способам синтезирования полимерных реагентов и способам конъюгирования полимерных реагентов в активные агенты и другие вещества.

Кроме того, изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, а также к способам введения конъюгатов пациентам.

Предпосылки к созданию изобретения

Ученые и клиницисты сталкиваются с рядом проблем при попытках преобразовать активные агенты в формы, приемлемые для введения пациентам. Активные агенты, представляющие собой полипептиды, нередко вводят скорее путем инъекций, чем орально. В этом случае полипептиды вводятся в большой круг кровообращения и не подвергаются воздействию протеолитической среды желудка. Тем не менее, инъекционное введение полипептидов характеризуется рядом недостатков. Например, многие полипептиды имеют относительно короткий период полураспада, в результате чего возникает необходимость в повторных инъекциях, которые нередко вызывают дискомфорт и являются болезненными. Более того, ряд полипептидов может вызвать одну или несколько иммунных реакций с последствиями, в результате которых иммунная система пациента может быть активирована для разрушения полипептида. Таким образом, введение активных агентов, таких как полипептиды, часто является проблематичным, даже когда эти агенты вводятся инъекционным способом.

Ряд успехов был достигнут при решении проблем введения активных агентов инъекционным способом. Например, конъюгирование активного агента до ввода растворимого полимера привело к образованию конъюгатов полимер-активный агент, обладающих пониженной иммуногенностью и антигенностью. Кроме того, указанные конъюгаты полимер-активный агент имеют значительно более длительный период полураспада по сравнению со своими неконъюгированными аналогами в результате сниженного очищения через почки и(или) пониженного ферментативного расщепления в большом круге кровообращения. В результате увеличения периода полураспада для конъюгата полимер-агент требуется менее частое дозирование, что, в свою очередь, снижает общее количество болезненных инъекций и количество посещений врача. Более того, активные агенты, которые лишь частично являются растворимыми, нередко демонстрируют значительное увеличение растворимости в воде при конъюгировании с водорастворимым полимером.

Благодаря своей документально подтвержденной безопасности, а также одобрению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов как для местного, так и внутреннего применения, полиэтиленгликоль был конъюгирован с активными агентами. Когда активный агент конъюгируется с полимером полиэтиленгликоля или ПЭГ, конъюгированный активный агент рассматривается как прошедший «пегилирование». Коммерческий успех пегилированных активных агентов, таких как пегилированный интерферон а-2а ΡΕ6Α8Υ8® (Нойшапп-Еа РосНс. Νιιΐίον. N1), пегилированный интерферон а-2Ь ΡΕ6-ΙΝΤΚΟΝ® (Бсйетшд Согр., КепшБсойк N1) и ПЭГ-филграстим ΝΕυΕΑδΤΑ™ (Атдеп 1пс., ТЬоикапб Оакк, СА) показал, что введение конъюгированной формы активного агента обладает существенными преимуществами по сравнению с неконъюгированными аналогами. Также были получены молекулы с более низкой молекулярной массой, такие как дистеароилфосфат тидилэтаноламин (2а11ркку (1993) Вюсонщд. Скех. 4 (4): 296-299) и фторурацил (ОисЫ е! а1. (1992) Эгид Оек. Э1ксоу. 9 (1): 93-105), конъюгированные с поли(этиленгликолем). Натк е! а1. предоставили анализ влияния пегиляции на фармацевтические препараты. Натк е! а1. (2003) №11. Веу. Эгид Э1ксоу. 2(3): 214-221.

Несмотря на достигнутые успехи, конъюгация водорастворимых полимеров с активным агентом до сих пор имеет ряд проблем. Одной из таких проблем является деактивация активного агента при присоединении к относительно длинной молекуле полиэтиленгликоля. Несмотря на то, что относительно длинная молекула полиэтиленгликоля обеспечила бы более высокую растворимость в воде соответствующему конъюгату, активный агент-полимер, конъюгаты, содержащие такие длинные части полиэтиленгликоля, оказывались значительно неактивными ίη νί\Ό. Была выдвинута гипотеза, что эти конъюгаты являются неактивными ввиду относительной длины цепи полиэтиленгликоля, которая эффективно «обертывается» вокруг всего активного агента, тем самым блокируя доступ к потенциальным лигандам, необходимым для активности.

Проблема, связанная с неактивными конъюгатами, содержащими относительно крупные части полиэтиленгликоля, была частично решена путем использования «разветвленных» форм полимера. Пример такого «разветвленного» полимера описывается в υδ Ра!еп! № 5932462, Натк е! а1. В соответствии с описанием в патенте тПЭГ2-№гидроксисукцинимид может быть присоединен к доступной аминогруппе (например, аминогруппе, не являющейся физически блокированной ввиду конформационной структуры) на биологически активном протеине. Этот разветвленный полимер (имеющий молекулярную массу около 40000 Да), производимый №к!ат ТЬетареийск (Нип!куШе, АЬ), имеет следующую структуру:

- 1 011351

в которой тПЭГ20К - метоксиблокированный по концам производный полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу около 20000 Да.

Соединение этого разветвленного полимера с интерфероном а-2а позволяет получить конъюгат, содержащий амидную связь, соединяющую интерферон а-2а с полимером. Схематически конъюгат может быть представлен следующим образом:

О _Λ II Η . 1 ^П<РЕ^Г°-^С-^М-Гу^н<

с θ / η / щ рео—о-с-чн

20К

интерферон альфа-2а

Этот конъюгат, серийно выпускаемый под торговой маркой ΡΕΟΆ8Υ8, обозначающей пегилированный интерферон а-2а (НоГГтапп-йа Роейс. МП1су. N1), показан для лечения гепатита С у взрослых больных.

Несмотря на то, что использование разветвленного полимера может решить ряд проблем, связанных с относительно большими линейными полимерами, до сих пор остаются другие проблемы в области создания эффективных конъюгатов. Например, скорость расщепления ίη νίνο в целом (хотя и необязательно) частично регулируется скоростью гидролиза, происходящего в определенный момент в ряде атомов, связывающих активный агент с полимером. Таким образом, относительно быстрая гидролитическая скорость может привести к неприемлемому конъюгату, имеющему слишком короткий период полураспада ίη νίνο, в то время как относительно медленный гидролиз может привести к получению неприемлемого конъюгата, характеризующегося слишком длительным периодом полураспада ίη νίνο. В конечном счете, полимеры, имеющие уникальный ряд атомов (как в самом полимере, так и в соответствующем конъюгате), могут привести к уникальным скоростям гидролиза, которые, в свою очередь, влияют на скорость расщепления конъюгата ίη νίνο.

Гидролиз конъюгатов некоторых активных агентов и шПЭГ2-№гидроксисукцинимида протекает в цепи атомов, соединяющих одну тПЭГ ветвь с другой, при условии, что один из метаболитов имеет молекулярную массу около 20000 Да. Одно предполагаемое место в цепи атомов для такого расщепления о н находится внутри -о-с—н— части, расположенной непосредственно рядом с одной из шПЭГ частей в поо н лимере. Часть -о-с-м— является наиболее приемлемым местом для расщепления, т.к. только другие атомы в цепи, соединяющие одну ветвь тПЭГ с другой, являются рядом атомов углерода, входящих в метио н _ ¹¹ леновые группы, которые относительно более стойки к расщеплению ίη νίνο, чем часть При расщеплении отделенная форма полимера представляет собой тПЭГ-ОН. Таким образом, основываясь, по меньшей мере, частично на преимуществах формирования тПЭГ-ОН, обеспечивается достижение уникальной скорости гидролиза.

Тем не менее, было бы желательным получать полимеры таким образом, чтобы их скорости гидролиза могли бы быть «адаптированы» под потребителя. Например, в отношении обычного еженедельного введения пегилированного интерферона а-2а более медленная скорость гидролиза позволила бы увеличить периоды между ведением препарата. Кроме того, конъюгаты, имеющие исключительно длительный период полураспада ίη νίνο, могли бы быть усовершенствованы путем повышения восприимчивости конъюгатов к гидролизу.

Более широкая гамма полимеров, характеризующихся уникальными скоростями гидролиза, позволила бы исследователям и ученым получить конъюгаты полимер-активный агент, «адаптированные» под потребителя с целью достижения (помимо всего прочего) требуемой более высокой растворимости в воде и(или) скорости расщепления ίη νίνο. Более того, полимеры, имеющие уникальные скорости гидролиза, могли бы быть использованы не только для разветвленных полимеров, но и для других форм (например, линейных или многоответвленных). Таким образом, до сих пор существует необходимость в полимерах, обеспечивающих (помимо всего прочего) уникальные ряды атомов с целью обеспечения скоростей расщепления «адаптированных» под потребителя. Насколько известно заявителям, описанные в настоящем патенте полимеры, конъюгаты, препараты и способы являются новыми и до настоящего времени не предлагались специалистами в данной области техники.

Краткое изложение существа изобретения

Основной целью настоящего изобретения, соответственно, является создание полимерного реаген- 2 011351 та, содержащего следующую структуру:

В’ О ^{1 11} к

Водорастворимый полимер С-У\^—Ζ

Формула (I) где водорастворимый полимер является водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов, каждая -\\- независимо обозначает прямую ковалентную связь или спейсерную часть; В¹ обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин «замещенный» относится к не-интерферирующему заместителю, такому как С₃-С₈ циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил, а Ζ - реактивную группу. Как показано в формуле (I), водорастворимый полимер является ближайшим к атому азота -н-с- части, а реактивная группа Ζ является ближайшей к карбонильному атому углерода части

Г °

Несмотря на то, что полимерные реагенты, содержащие часть -ν-с-, охвачены настоящим изобретеп¹ о I нием, предпочтительно, чтобы атом кислорода находился рядом с карбонильным атомом углерода ~^Ν_0_, и¹ о _ι_η_ _ благодаря чему получают часть ^{Ν с о} , нередко называемую «карбаматной», или «уретановой» группой. Другие функциональные группы также могут быть представлены внутри полимерного реагента или на нем.

Другой целью изобретения является создание такого полимерного реагента, в котором В¹ обозначает Н.

Еще одной целью изобретения является создание полимерного реагента, в котором водорастворимый полимер является полиалкиленоксидом.

Еще одной целью изобретения является создание способа получения вышеописанных полимерных реагентов, в котором способ включает следующие этапы: (ί) обеспечение предшественника, произвольно включающего защищенную реактивную группу или одну или нескольких гидроксильных групп; (ίί) активация по меньшей мере одной гидроксильной группы предшественника для вступления в реакцию с аминогруппой для образования активированного предшественника; (ίίί) контактирование в условиях ковалентного соединения по меньшей мере одной активированной гидроксильной группы с водорастворимым полимером, имеющим аминогруппу, с образованием полимера, содержащего часть водорастворимого полимера и защищенную реактивную группу; и (ίν) удаление защиты защищенной реактивной группы при ее наличии.

Еще одной целью изобретения обозначает создание полимерного конъюгата, содержащего водорасв’ о творимый полимер, часть -ν-с- и фармакологически активный агент, в котором: (ί) водорастворимый ?' ι полимер соединен с атомом азота части -н-с- с помощью либо прямой ковалентной связи, либо с помощью первой спейсерной части; (ίί) фармакологически активный элемент соединен с карбонильным атов' о мом углерода части -н-с- с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части и (ίίί) В¹ обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенно го алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин «замещенный» относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С₃-С₈ циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил; и (ίν) полимерный реагент включает разветв ляющую часть.

Дополнительной целью изобретения является создание способа получения конъюгата, содержащего этап контактирования полимерного реагента, предлагаемого в данном изобретении, с активным агентом при приемлемых условиях с получением лекарственного конъюгата. Обычно активный агент ковалентно присоединяется к полимеру путем протекания реакции между реактивной группой на полимерном реагенте и функциональной группой (например, амин) на активном агенте.

Дополнительной целью изобретения является создание фармацевтического препарата, содержащего конъюгат активный агент-полимер, предлагаемый в настоящем изобретении, в сочетании с фармацевти ческим наполнителем.

Дополнительной целью изобретения является создание способа для получения фармакологически активного агента, включающего этап введения терапевтически эффективного количества конъюгата полимер-активный агент, предлагаемого в настоящем изобретении.

Дополнительные цели, преимущества и новые признаки изобретения изложены в нижеприведенном описании и частично станут очевидными специалистам в данной области техники, исходя из нижесле

- 3 011351 дующего, или путем практического применения изобретения.

Далее в одном примере осуществления изобретения предлагается полимерный реагент, содержащий я’ о ΐ а

-м-ο- часть, расположенную между водорастворимым полимером и реактивной группой. Внутреннее Н¹ о структурное расположение является таковым, что (ί) азот в части -А-'- расположен вблизи водораствон* о римого полимера, (ίί) карбонильный атом углерода части -А-'- расположен вблизи реактивной группы; и (ίίί) В¹ обозначает Н или органический радикал, который обычно выбирают из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин «замещенный» относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С₃-С₈ циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил; и (ίν) полимерный реагент включает разветвляющую часть.

Полимерные реагенты в соответствии с настоящим изобретением также включают водорастворимый полимер, выбранный из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов, в· О часть и реактивную группу, выбранную из группы, состоящей из гидроксила, ортоэфира, карбоната, ацеталя, альдегида, альдегидгидрата, кетона, винилкетона, кетонгидрата, тиона, монотиогидрата, дитиогидрата, гемикеталя, монотиокеталь гемикеталя, дитиогемикеталя, кеталя, дитиокеталя, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, сульфона, амина, гидразида, тиола, дисульфида, тиолгидрата, карбоновой кислоты, изоциаоната, изотиоцианата, малеимида, сукцинимида, бензотриазола, винилсульфона, хлорэтилсульфона, дитиопиридина, винилпиридина, иодоацетамида, эпоксида, глиоксалей, дионов, мезилатов, тозилатов, тиосульфонатов, тресилатов, силана, -(СН2)_ГСО₂Н, -(СН₂)_Г'-СО₂М8, -(СН₂)_Г'-СО₂В1, -(СН₂)_ГСН(ОВ)₂, -(СЩ)_ГСНО, -((ΊΙΑ-ΝΊΙ, -(СН2ХМ, -(СН_;).-8-8О.-В. где г составляет 1-5, г' составляет 05, В - арил или алкил, N8 - Ν-сукцинимидил, Βΐ - 1-бензотриазолил, а М - Ν-малеимидил, в которых (ί) н’ о „ ΐ « _ „ „ водорастворимый полимер связан с атомом азота части -к-с- с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части; (ίί) реактивная группа связана с карбонильным атомом углерода части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; и (ίίί) В¹ обозначает то,

что определено выше.

Для полимерных реагентов в соответствии с настоящим изобретением любой водорастворимый полимер может служить в качестве водорастворимого полимера в полимерном реагенте, и изобретение не ограничено в этом отношении. Тем не менее, предпочтительными полимерами являются полимеры с блокировкой на одном конце. Кроме того, полимеры, имеющие среднюю молекулярную массу менее приблизительно 120000 Да, являются предпочтительными.

В другом примере осуществления изобретения предлагается способ получения полимерных реагентов в соответствии с изобретением. Вкратце, способ включает получение молекулы-предшественника, состоящей из защищенной реактивной группы или предшественника реактивной группы либо одной или нескольких гидроксильных групп. По меньшей мере одна или несколько гидроксильных групп молекулы-предшественника активируется (благодаря чему образуется активированная молекулапредшественник) таким образом, чтобы по меньшей мере одна из одной или нескольких гидроксильных групп вступила в реакцию с аминогруппой. После этого активированная молекула-предшественник помещается в условия ковалентного соединения и обеспечивается ее контакт с водорастворимым полимером, имеющим аминогруппу, в результате чего происходит химическая реакция этих двух регентов. После завершения реакции образуется ковалентная связь между водорастворимым полимером и активированной молекулой-предшественником, которая, в свою очередь, образует полимер, состоящий из части водорастворимого полимера и защищенной реактивной группы или предшественника реактивной группы. Обычно этот полимер может в дальнейшем вступать в реакцию с различными реагентами с целью функционализации полимера с, например, требуемой реактивной группой. Если молекулапредшественник включает защищенную реактивную группу, способ включает, как преимущество, этап удаления защиты с целью удаления группы, защищающей реактивную группу. В другом варианте этап изолирования полимера выполняется таким образом, чтобы полимер мог быть получен в более чистой форме.

Еще в одном примере осуществления настоящего изобретения предлагается конъюгат, содержащий л¹ о водорастворимый полимер, часть -«-с- и фармакологически активный агент, в котором: (ί) водораствон¹ о римый полимер связан с атомом азота части -«-с- с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части; (ίί) фармакологически активный агент связан с карбонильным углеродом части в’ о

-н-с- с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; и (ίίί) В¹ обозначает Н или органический радикал, который обычно выбирают из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила.

- 4 011351

Преимуществом является то, что может быть использован любой активный агент, который может быть соединен с полимерным реагентами, предлагаемыми в настоящем изобретении, и изобретение не ограничено в отношении конкретного используемого активного агента.

Еще в одном примере осуществления изобретения предлагается способ получения конъюгата, включающий этап контактирования полимерного реагента, предлагаемого в настоящем изобретении, с активным агентом при условиях, приемлемых для получения лекарственного конъюгата.

Еще в одном примере осуществления изобретения предлагаются фармакологические препараты, включающие конъюгат в соответствии с изобретением с фармакологическим наполнителем. Фармакологические препараты охватывают все типы составов и, в частности, типы составов, являющиеся приемлемыми для инъекции, например порошки, которые могут быть разбавлены до первоначальной плотности, а также суспензии и растворы.

В дополнительном примере осуществления изобретения предлагается способ введения конъюгата, включающий этап введения пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата, предлагаемого в настоящем изобретении. Обычно, хотя и необязательно, конъюгат предлагается как часть фармацевтического препарата. Может использоваться любой способ введения конъюгата, и изобретение не ограничено в этом отношении. Тем не менее, предпочтительно, чтобы конъюгат вводился путем инъекции.

Подробное описание изобретения

Прежде чем приступить к подробному описанию настоящего изобретения, специалистам в данной области должно быть очевидно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными полимерами, способами синтезирования, активными агентами и т.д., так как они могут изменяться.

В настоящем описании и формуле используются термины в соответствии с описанием, приведенном ниже.

ПЭГ, «полиэтиленгликоль» и «поли(этиленгликоль)», используемый в настоящем описании, охватывает любой водорастворимый поли(этиленоксид) и может быть использован взаимозаменяемо. Обычно ПЭГи, используемые в настоящем изобретении, включают -(ОСН₂СН₂)_т- или О(СН₂СН₂О)_т-, где т находится в интервале от 2 до 4000, и концевые группы и архитектура полного ПЭГ могут изменяться. В том виде, в каком ПЭГ используется в настоящем описании, он также включает -СН₂СН₂О(СН2СН2О)т-СН2СН2- и -(СН2СН2О)т- в зависимости от того, был ли замещен концевой кислород или нет. Когда ПЭГ далее включает спейсерную часть (подробное описание которой приведено ниже), атомы, содержащие спейсерную часть при ковалентном присоединении к водорастворимому полимеру, не приводят к формированию кислород-кислородной связи (т.е. -О-О-, перекисная связь). Следует учитывать, что в описании и в формуле в целом термин «ПЭГ» включает структуры, имеющие различные концевые или «блокированные на концах» группы и т.д. «ПЭГ» означает полимер, содержащий большинство, т.е. более 50% подгрупп, являющихся -СН₂СН₂О-. Одним обычно используемым ПЭГ является блокированный на концах «ПЭГ». Конкретные формы ПЭГ, используемые в настоящем изобретении, включают ПЭГи, имеющие различные молекулярные массы, структуры или конфигурации (например, разветвленные, линейные, раздвоенные ПЭГи, многофункциональные, многоответвленные и т.п.), описание которых более подробно будет приведено ниже.

Термин «концевое блокирование» или «блокирование на концах» является взаимозаменяемым и используется в настоящем тексте для указания на конец, или конечную точку полимера, имеющего часть концевого блокирования. Обычно в отношении ПЭГ часть концевого блокирования включает гидроксиили С_1-20 алкоксигруппу. Таким образом, например, часть концевого блокирования включает алкокси (например, метокси, этокси и бензилокси), а также арил, гетероарил, цикло, гетероцикло и т.п. Следует отметить, что концевые алкокси- и гидроксигруппы могут включать концевой атом кислорода периодического этиленоксидного мономера при вытянутой структуре в зависимости от того, как определен периодический этиленоксидный мономер [например, -(ОСН₂СН₂)_т или -СН₂СН₂О(СН₂СН₂О)_т-СН₂СН₂-]. Кроме того, предусматриваются насыщенные, ненасыщенные, замещенные и незамещенные формы каждого из вышеуказанных частей концевого блокирования. Более того, группа концевого блокирования также может являться силаном или липидом (например, фосфолипидом). Группа концевого блокирования также может, как преимущество, включать обнаруживаемую метку. Когда полимер содержит группу концевого блокирования, включающую обнаруживаемую метку, количество или нахождение полимера и(или) части (например, активного агента), к которой присоединен полимер, может быть определено с использованием приемлемого датчика. Такие метки включают, без ограничения, флюорессеры, хемилюминисценсоры, части, используемые при мечении ферментов, колориметрики (например, краски), металлические ионы, радиоактивные части и т. п. Приемлемые детекторы включают фотометры, пленки, спектрометры и т. д.

Термин «не встречающийся в природе» в отношении полимера означает полимер, который полностью отсутствует в природе. Тем не менее, не встречающийся в природе полимер может содержать один или несколько подзвеньев или сегментов подзвеньев, которые встречаются в природе, поскольку полная структура полимера отсутствует в природе.

Термин «водорастворимый», как и в термине «водорастворимый полимер», включает полимер, рас

- 5 011351 творимый в воде при комнатной температуре. Как правило, водорастворимый полимер пропускает по меньшей мере около 75%, более предпочтительно по меньшей мере около 95% света, пропускаемого тем же раствором после фильтрования. Исходя из массы, водорастворимый полимер или его сегмент предпочтительно обозначает, по меньшей мере, растворимый в воде на 35 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50 мас.% растворимый в воде, еще более предпочтительно приблизительно на 70 мас.% растворимый в воде и еще более предпочтительно приблизительно на 85 мас.% растворимый в воде. Тем не менее, наиболее предпочтительно, чтобы водорастворимый полимер или сегмент являлся растворимым в воде приблизительно на 95 мас.% или полностью растворимым в воде.

Молекулярная масса в контексте водорастворимого полимера изобретения, например ПЭГ, может выражаться либо как среднечисленная молекулярная масса, либо как средневесовая молекулярная масса. Если не указано иное, все ссылки на молекулярную массу в данном описании относятся к средневесовой молекулярной массе. Обе молекулярные массы - среднечисленная и средневесовая - могут быть измерены с использованием гель-проникающей хроматографии или с помощью иных способов жидкостной хроматографии. Также могут быть использованы другие способы измерения молекулярного веса, такие как анализ концевых групп или измерение коллигативных свойств (например, понижение точки замерзания, повышение точки кипения или осмотическое давление) с целью определения среднечисленной молекулярной массы, либо с помощью приборов измерения рассеянного света, ультрацентрифугирования или вискозиметрии для определения средневесовой молекулярной массы. Полимеры в соответствии с изобретением обычно являются полидисперсными (т. е. среднечисленная молекулярная масса и средневесовая молекулярная масса полимеров не являются одинаковыми), обладающими низкими значениями полидисперсности, предпочтительно менее 1,2, более предпочтительно менее приблизительно 1,15, еще более предпочтительно менее 1,10, еще более предпочтительно менее приблизительно 1,05 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1,03.

В том значении, в каком используется в данном описании, термин «карбоновая кислота» означает о II часть, имеющую ^с‘°^н функциональную группу, также представленную в виде -СООН или -С(О)ОН, а также части, являющиеся производными карбоновой кислоты, при этом такие производные включают, например, защищенные карбоновые кислоты. Таким образом, если в тексте четко не указано иное, термин «карбоновая кислота» включает не только кислотную форму, но также соответствующие сложные эфиры, а также защищенные формы. Иллюстративные защищенные группы для карбоновых кислот и другие защищенные группы описаны в работе Огееие е! а1., РгоЮсОус Огоирк ίη Огдашс ЗупШекук, СЬар!ет 6, 3¹'¹ Εάίΐίοη, 1оЬп \УПеу и 8опк, 1пс., №\ν Уогк, 1999 (р. 454-493).

Термин «реактивный» или «активированный» при использовании в сочетании с конкретной функциональной группой относится к реактивной функциональной группе, легко вступающей в реакцию с электрофилом или нуклеофилом на другой молекуле. Эти группы противоположны группам, для которых требуется сильный катализатор или жесткие условия реакции для обеспечения их вступления в реакцию (т. е. «нереактивная» или «инертная» группа).

Термин «защищенный», «защищающая группа» или «защитная группа» относится к наличию части (т.е. защищающей группы), предотвращающей или блокирующей реакцию конкретной химически реактивной функциональной группы в молекуле при определенных условиях реакции. Защищающая группа изменяется в зависимости от типа химически реактивной защищаемой группы, а также от создаваемых условий реакции и наличия дополнительных реактивных или защищающих групп в молекуле, если таковые имеются. Защищающие группы, известные в данной области техники, содержатся в работе Отеепе е! а1., кирга.

«Активированная карбоновая кислота» означает функциональное производное карбоновой кислоты, которая является более реактивной, чем исходная карбоновая кислота, в частности, в отношении замещения нуклеофильного ацила. Активированная карбоновая кислота включает галогенангидриды (например, хлорангидриды кислот), ангидриды, амиды и сложные эфиры, но не ограничивается ими.

Термин «функциональная группа», используемый в настоящем описании, или его любой синоним охватывает ее защищенные формы.

Термин «спейсер» и «спейсерная часть» используется в данном описании и относится к атому или совокупности атомов, произвольно используемых для связывания межсоединяющихся частей, например, таких как конец части водорастворимого полимера или функциональной группы. Спейсерная часть может быть гидролитически устойчивой либо может включать физиологически гидролизуемую или ферментно-деструктурируемую связь.

Термин «алкил» относится к углеводородной цепи, длина которой обычно находится в пределах приблизительно от 1 до 20 атомов. Такие углеводородные цепи предпочтительно, но не обязательно, являются насыщенными и могут представлять собой разветвленную или прямую цепь, хотя обычно прямая цепь является предпочтительной. Иллюстративные алкильные группы включают этил, пропил, бутил, пентил, 1-метилбутил (т.е. 2-пентил), 1-этилпропил (т.е. 3-пентил), 3-метилпентил и т.п. Термин «алкил», используемый в настоящем описании, включает циклоалкил, когда ссылка дается на три или более атомов углерода.

- 6 011351

Термин «низший алкил» относится к алкильной группе, содержащей от 1 до 6 атомов углерода, и может являться прямой или разветвленной цепью, примером чему являются метил, этил, η-бутил, изобутил и трет-бутил.

Термин «циклоалкил» относится к насыщенной или ненасыщенной циклической углеводородной цепи, включающей соединенные мостиковой связью, сплавленные или спиро-циклические соединения, предпочтительно состоящие приблизительно из 3-12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до приблизительно 8.

«Неинтерферирующие заместители» - это группы, которые, присутствуя в молекуле, обычно являются нереактивными с другими функциональными группами, находящимися внутри молекулы.

Термин «замещенный» как, например, «замещенный алкил» относится к части (например, алкильной группе), замещенной одной или несколькими неинтерферирующими замещающими группами, такими как С₃-С₈ циклоалкил, например циклопропил, циклобутил и т.п.; гало, например фторо, хлоро, бромо и йодо; циано; алкокси, фенил; замещенный фенил и т.п., но не ограниченными ими. Замещенный арил является арилом, имеющим одну или несколько неинтерферирующих групп в качестве замещающих групп. Для замещений на фенильном кольце замещающие группы могут находиться в любой ориентации (т.е. орто, мета или пара).

«Алкокси» относится к группе -О-В, где В обозначает алкил или замещенный алкил, предпочтительно С₁-С₂оалкил (например, метокси, этокси, пропилокси, бензил и т.д.), предпочтительно С_1-С₇.

«Алкенил» в том значении, в каком он используется в настоящем описании, относится к разветвленной или неразветвленной углеводородной группе длиной от 1 до 15 атомов, содержащей по меньшей мере одну двойную связь, например этенил, η-пропенил, изопропенил, η-бутенил, изобутенил, октенил, деценил, тетрадеценил и т.п.

Используемый в настоящем описании термин «алкинил» относится к разветвленной или неразветвленной углеводородной группе длиной от 2 до 15 атомов, содержащей по меньшей мере одну тройную связь, этинил, η-бутинил, изопентинил, октинил, децинил и т.д.

Темин «арил» означает одно или несколько ароматических колец, каждое из которых состоит из 5 или 6 основных атомов углерода. Арил включает несколько арильных колец, которые могут быть сплавленными, как в нафтиле, или несплавленными, как в бифениле. Арильные кольца могут также быть сплавлены или несплавлены с одним или более циклическим углеводородом, гетероарилом или гетероциклическими кольцами. Используемое в данном контексте значение «арил» включает гетероарил.

«Гетероарил» обозначает арильную группу, содержащую от одного до четырех гетероатомов, предпочтительно Ν, О, или 8, или их сочетание. Гетероарильные кольца могут также быть сплавлены с одним или более циклическим углеводородом, гетороциклическими, арильными или гетероарильными кольцами.

«Гетероцикл» или «гетероциклический» означает одно или более колец из 5-12 атомов, предпочтительно 5-7 атомов, имеющих ненасыщенные или ароматические свойства, или без них, и имеющие по меньшей мере один кольцевой атом, не являющийся углеродом. Предпочтительные гетероатомы включают серу, кислород и азот.

«Замещенный гетероарил» обозначает гетероарил, имеющий одну или более неинтерферирующую группу в качестве замещающей группы.

«Замещенный гетероцикл» обозначает гетероцикл, имеющий одну или несколько боковых цепей, сформированных из неинтерферирующих замещающих групп.

Темин «электрофил» относится к иону, атому или совокупности атомов, которые могут быть ионными, имеющими электрофильный центр, т.е. центр, ищущий электрон и способный реагировать с нуклеофилом.

Термин «нуклеофил» относится к иону, или атому, или совокупности атомов, которые могут быть ионными, имеющими нуклеофильный центр, т.е. центр, ищущий электрофильный центр и способный реагировать с электрофилом.

«Физиологически расщепляемая», или «гидролизуемая», или «деструктурируемая» связь обозначает относительно слабую связь, которая вступает в реакцию с водой (т.е. гидролизуется) при физиологических условиях.

Склонность связи к гидролизу в воде зависит не только от общего типа связи, соединяющей два центральных атома, но также и от замещающих групп, присоединенных к этим центральным атомам. Соответствующие гидролитически неустойчивые, или слабые, связи включают, но не ограничены карбоксилатным эфиром, фосфорнокислым эфиром, ангидридами, ацеталями, кеталями, ацилоксиалкиловым эфиром, иминами, ортоэфирами, пептидами и олигонуклеотидами.

Термин «ферментно деструктурируемая связь» означает связь, поддающуюся расщеплению с помощью одного или нескольких ферментов.

Термин «гидролитически устойчивая» связь или соединение относится к химической связи, обычно к ковалентной связи, являющейся в целом устойчивой в воде, то есть не подвергается гидролизу при физиологических условиях в какой-либо заметной степени в течение длительного периода времени. Примеры гидролитически устойчивой связи включают, но не ограничены, следующие углерод-углеродные свя

- 7 011351 зи (например, в алифатических цепях), простые эфиры, амиды, уретаны и т.п. В целом, гидролитически устойчивая связь является связью, проявляющей скорость гидролиза менее приблизительно 1-2% в сутки при физиологических условиях. Скорости гидролиза представительных химических связей можно найти в большинстве стандартных учебников по химии.

Термины «активный агент», «биологически активный агент» и «фармакологически активный агент» используются в данном контексте взаимозаменяемо и включают любой агент, лекарственное средство, соединение, состав вещества или смеси, обеспечивающие определенный фармакологический, нередко полезный, эффект, который может быть продемонстрирован ίη νίνο или ίη νίΐτο. Он включает пищевые продукты, пищевые добавки, питательные вещества, нутрицевтики (пийтсеиБсаИ), лекарства, вакцины, антитела, витамины и иные полезные агенты. В данном контексте эти термины далее включают любое физиологически или фармакологически активное вещество, создающее локализованный или систематический эффект в организме пациента.

Термины «фармацевтически приемлемый наполнитель» и «фармацевтически приемлемый носитель» относятся к наполнителю, который может быть включен в составы в соответствии с изобретением и который не вызывает никакого значительного неблагоприятного токсикологического воздействия на организм пациента.

Термины «фармакологически эффективное количество», «физиологически эффективное количество» и «терапевтически эффективное количество» используются взаимозаменяемо в данном контексте и означают количество конъюгата полимер-активный агент, присутствующего в фармацевтическом препарате, который необходим для обеспечения требуемого уровня активного агента и(или) конъюгата в кровотоке или в целевой ткани. Точное количество будет зависеть от многочисленных факторов, например конкретного активного агента, компонентов и физических свойств фармацевтического препарата, предполагаемой совокупности пациентов, заключений пациентов и т.п., и может быть легко определен специалистами в данной области техники на основе информации, представленной в данном описании и содержащейся в соответствующей литературе.

Термин «многофункциональный» в контексте полимера в соответствии с изобретением означает полимер, имеющий 3 или более функциональных групп, содержащихся в нем, при этом функциональные группы могут быть аналогичными или различными. Многофункциональные полимеры в соответствии с изобретением обычно содержат приблизительно от 3 до 100 функциональных групп, или от 3 до 50 функциональных групп, или от 3 до 25 функциональных групп, или от 3 до 15 функциональных групп, или от 3 до 10 функциональных групп, или содержат 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 функциональных групп в основной цепи полимера. «Дифункциональный» полимер означает полимер, имеющий две функциональные группы, содержащиеся в нем, либо аналогичные (т. е. гомодифункциональные), либо различные (т.е. гетеродифункциональные).

Термин «раздвоенный» при ссылке на конфигурацию или полную структуру полимер относится к дифункциональному полимеру, имеющему одну полимерную «ветвь» (т.е. единичный водорастворимый полимер), в котором обе функциональные группы прикреплены (либо непосредственно, либо с помощью одного или нескольких атомов) к атому, служащему в качестве разветвляющего атома, который, в свою очередь, прикреплен (либо непосредственно, либо с помощью одного или нескольких атомов) к водорастворимому полимеру.

Термин «разветвленный» при ссылке на конфигурацию или полную структуру полимера относится к полимеру, имеющему 2 или более полимерных «ветвей». Разветвленный полимер может иметь 2 полимерные ветви, 3 полимерные ветви, 4 полимерные ветви, 6 полимерных ветвей, 8 полимерных ветвей или более. Один конкретный тип сильно разветвленных полимеров обозначает дендритный полимер или дендример, который для целей изобретения рассматривается как обладающий структурой, отличной от структуры разветвленного полимера.

«Дендример» или дендритный полимер является глобулярным, размерным монодисперсным полимером, в котором все соединения отходят радиально от центральной фокальной точки или ядра со систематической структурой разветвления и повторяющимися звеньями, каждое из которых создает точку разветвления. Дендримеры проявляют определенные свойства дендритного состояния, например инкапсуляцию ядра, что делает их уникальными по сравнению с другими типами полимеров, включая разветвленные полимеры.

Основной или кислотный реагент, описанный в данном тексте, включает нейтральные, заряженные или его любые соответствующие формы соли.

Термин «пациент» относится к живому организму, страдающему от заболевания или подверженному состоянию, которое можно предотвратить или вылечить путем приема конъюгата, предлагаемого в настоящем описании изобретения, и включает как людей, так и животных.

«Органический радикал» является частью, содержащей углерод, которая может быть присоединена через ковалентную связь к другому атому. Иллюстративный органический радикал включает радикалы, выбранные из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила.

Термин «произвольный» или «произвольно» означает, что в последующем описанное обстоятельст- 8 011351 во может иметь или может не иметь место, таким образом, описание включет случаи, при которых данное обстоятельство имеет место, а также случаи, при которых оно отсутствует.

В том значении, в котором используется обозначение «гало» (например, фторо, хлоро, йодо, бромо и т.д.), оно, в целом, используется, когда галоген присоединяется к молекуле, в то время как суффикс «ид» (например, фторид, хлорид, йодид, бромид и т.д.) используется при применении ионной формы, когда галоген существует в своей независимой ионной форме (например, в том случае, когда уходящая группа покидает молекулу).

В контексте настоящего описания необходимо признать, что определение переменных, представленных в отношении одной структуры или формулы, приемлемо в отношении аналогичной переменной, повторяющейся в различных структурах, если в контексте не указано иное. Таким образом, например, определения «РОЬУ», «спейсерная часть», «(Ζ)» и т.д. в отношении полимерного реагента применимы к конъюгату водорастворимого полимера, предлагаемому в настоящем описании.

В первом примере осуществления изобретения предлагается уникальный полимерный реагент. Несмотря на то, что заявители не желают ограничиваться теорией, они считают, что отличительные свойства полимерных реагентов, описанных в настоящем изобретении, определяются уникальной ориентацией атомов. Например, когда полимерный реагент, описанный в настоящем изобретении, соединен с активным агентом для образования конъюгата, скорость гидролиза конъюгата ίη νίνο отличается от скорости гидролиза конъюгата, имеющего аналогичные атомы, но которые расположены в другой последовательности. Кроме обеспечения альтернативных скоростей гидролиза, предлагаемые в настоящем изобретении полимерные реагенты обладают дополнительными преимуществами по сравнению с известными полимерными реагентами.

Полимеры в соответствии с настоящим изобретением включают три отдельных компонента, ориентированные специальным образом. Три компонента представляют собой водорастворимый полимер, включающий периодические мономерные звенья; часть, включающую атом азота, ковалентно связанный с атомом углерода карбонила; и реактивную группу. Три компонента полимера специально ориентированы таким образом, чтобы атом азота вышеуказанной части находился вблизи периодически повторяющейся части мономера полимера, в то время как атом углерода расположен вблизи реактивной группы. Следует понимать, что термин «вблизи (проксимальный)» в настоящем контексте относится к «ближайший» по наиболее ближайшей траектории связывающих атомов, а не ближайший в плане пространства или абсолютного расстояния.

Таким образом, полимер может быть схематически представлен следующей формулой:

Водорастворимый полимер ^{Ν с 2} Формула (I) где водорастворимый полимер является водорастворимым полимером, содержащим периодические мономерные звенья; каждая -\\- независимо обозначает прямую ковалентную связь, или спейсерную часть; К.¹ обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин «замещенный» относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С₃-С₈ циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил, а Ζ - реактивную группу.

?

Как представлено в формуле I, азот части -ν-с-о- является проксимальным к водорастворимому полимеру, а атом углерода карбонила - проксимальным к реактивной группе Ζ.

я¹ о I II

Таким образом, полимерные реагенты включают часть -ν-с-о- между водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов, и реактивной группой, выбранной из группы, состоящей из гидроксила, ортоэфира, карбоната, ацеталя, альдегида, альдегидгидрата, кетона, винилкетона, кетонгидрата, тиона, монотиогидрата, дитиогидрата, гемикеталя, монотиокеталь гемикеталя, дитиогемикеталя, кеталя, дитиокеталя, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, сульфона, амина, гидразида, тиола, дисульфида, тиолгидрата, карбоновой кислоты, изоциаоната, изотиоцианата, малеимида, сукцинимида, бензотриазола, винилсульфона, хлорэтилсульфона, дитиопиридина, винилпиридина, иодоацетамида, эпокида, глиоксалей, дионов, мезилатов, тозилатов, тиосульфонатов, тресилатов, силана, -(СН₂)_ГСО₂Н, -(СН₂)_ГСО₂Ы8, -(СН₂)_ГСО₂В1, -(СН₂)_ГСН(ОК)₂, -(СН₂)_ГСНО, -(СН₂)₂-ЛН₂, -(СН₂)_ГМ, -(СН₂)_г-8-8О₂-К, где (г) составляет 1-5, (г') составляет 0-5, К - арил или алкил, N8 - Ν-сукцинимидил, Βΐ - 1-бензотриазолил, а М - Ν-малеимиди, в которой (ί) атом азота в н’ о части -ν-с-о- обозначает проксимальным к водорастворимому полимеру; (ίί) карбонильный атом углен¹ о рода части -ν-с-о- обозначает проксимальным к реактивной группе; и (ίίί) К¹ обозначает Н в соответстн¹ о „ | ¹¹ вии с определением выше. Водорастворимый полимер связан с атомом азота части -ν-с-о- с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части. Реактивная группа связана с карбониль- 9 011351

с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсер-Ν-Οным атомом углерода части ной части.

Кроме того, полимерные реагенты в соответствии с изобретением могут быть описаны как вклюн¹ о чающие водорастворимый полимер, часть -ν-с-о- и реактивную группу, в которых: (1) водорастворимый н¹ о 1_« _ полимер соединен с атомом азота части ^{Ν с_о} либо с помощью первой ковалентной связи, либо первой в¹ о спейсерной части; (и) реактивная группа соединена с карбонильным атомом углерода части -ν-с- либо с помощью прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; (ίίί) В¹ - как указывалось выше; и (ίν) полимерный реагент включает разветвляющую часть.

О¹ О ^{1 1} I

Часть -ν-с- (в которой В - Н или органический радикал) может считаться амидной частью при ее рассмотрении в изоляции или отдельно от смежных атомов. Тем не менее, следует помнить, что часть -н-с- в полимере обозначает часть более крупной структуры. Например, атом кислорода может быть - и и’ о .1 Ϊ предпочтительно - непосредственно прикреплен к карбонильному атому углерода части ’ > тем сап мым создавая часть ^{Ν с_о_} - которая нередко называется как «карбамат» или «уретан».

Таким образом, в целях описания химических структур, изложенных ниже, ссылка в целом будет Р¹ о I й даваться на часть -н-с-о_π ?’?

В отношении части -ν-с-о- ; одна часть атома азота присоединяется к атому углерода смежного карбонильного углерода («карбонильный углерод»), вторая связь присоединяется либо непосредственно к водорастворимому полимеру или спейсерной части и третья связь присоединяется к заместителю В¹. В¹ обозначает любой неинтерферирующий заместитель. В¹ обычно, хотя и необязательно обозначает Н или органический радикал. Тем не менее, предпочтительно, чтобы В¹ обозначал Н. В тех случаях, когда В¹ органический радикал, предпочтительные органические радикалы включают органические радикалы, выбранные из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила. Конкретные примеры предпочтительных органических радикалов включают органические радикалы, выбранные из группы, содержащей метил, этил, η-пропил, изопропил, η-бутил, сек-бутил, изобутил, трет-бутил, η-пентил, изопентил, неопентил, трет-пентил и пиперидонил.

В отношении реактивной группы Ζ эта группа может являться любой группой, реагирующей с приемлемым реагентом при соответствующих условиях.

Предпочтительные реактивные части выбраны из группы, содержащей электрофилы и нуклеофилы. Примеры таких реактивных групп включают, но не ограничены, реактивные группы, выбранные из группы, содержащей гидроксил (-ОН), сложный эфир, ортоэфир, карбонат, ацеталь, альдегид, альдегидгидрат, кетон, винилкетон, кетонгидрат, тион, монотиогидрат, дитиогидрат, гемикеталь, монотиокеталь, гемикеталь, дитиогемикеталь, кеталь, дитиокеталь, алкенил, акрилат, метакрилат, акриламид, сульфон, сульфон, амин, гидразид, тиол, дисульфид, тиолгидрат, карбоновая кислота, изоцианат, изотиоцианат, (ф) № малеимид, ' '· сукцинимид; ' ' бензотриазол; ^!· винилсульфон, хлорэтилсульфон, дитиопиридин, винилпиридин, иодоацетамид, эпокид, глиоксали, дионы, мезилаты, тозилаты, тиосульфонат, тресилат, силан, -(СН2ХСО2Н, -(СН^^Ж -(СН2)_ГСО2В1, -(СН2)_ГСН(ОВ)2, -(СЩ^СНО, -(СН.Т-Х'Н, -(СН₂)_ГМ, -(СН₂)_г-8-8О₂-В, где (г) составляет 1-12, (г') составляет 0-5, В - арил или алкил, N8 - Νсукцинимидил, В1 - 1-бензотриазолил и М - Ν-малеимидил, и защищенные и активированные формы любого из вышеуказанных веществ.

В отношении любой реактивной группы, в частности малеимида и альдегида, произвольный линкер может связывать реактивную группу с полимером. Таким образом, например, линкер может связывать реактивную группу с спейсерной частью или разветвляющей частью (когда она присутствует). Кроме того, при отсутствии как спейсерной части, так и разветвляющей части линкер может связывать реактив

ную группу непосредственно с карбонильным углеродом части

Линкер может включать насыщенные ациклические углеводороды с прямой цепью, содержащие по меньшей мере четыре атома углерода, такие как тетраметилен, пентаметилен и гексаметилен, а также разветвленные насыщенные ациклические углеводороды, содержащие по меньшей мере четыре атома углерода. В одном примере осуществления углеводородная часть связи имеет структуру -(СВ³В⁴)_д-, в которой В³ независимо обозначает Н, алкил или циклоалкил, каждый В⁴ независимо обозначает Н, алкил или циклоалкил и (д) составляет приблизительно от 2 до 20, предпочтительно приблизительно от 4 до 12.

- 10 011351

В одном предпочтительном примере осуществления изобретения каждый В³ и В⁴ обозначает Н. В примерах осуществления разветвленных ациклических углеводородов предпочтительно, чтобы происходило разветвление у одного или нескольких из двух атомов углерода, ближайших к реактивной группе (например, малеимид) с целью максимизации пространственного затруднения. В другом примере осуществления изобретения углеводородная часть связи включает насыщенный двухвалентный алициклический углеводород и имеет структуру -(СВ³В⁴)р-С3-12циклоалкил-(СВ³В⁴)ч-, в которой р и с.| - каждый независимо составляет приблизительно от 0 до 10, предпочтительно приблизительно от 0 до 6 (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) и В³ и В⁴ - как определено выше. Двухвалентная циклоалкильная (например, циклоалкилен) группа предпочтительно является С_3-8 циклоалкиленом, таким как различные изометрические формы циклопропадиила (например, 1,1-, с18-1,2-, или транс-1, 2-циклопропилен), циклобутадиила, циклопентадиила, циклогексадиила и циклогептадиила. Циклоалкиленовая группа может быть замещена одной или несколькими алкильными группами, предпочтительно С1_-6 алкильными группами.

В отношении водорастворимого полимера полимерные реагенты в соответствии с настоящим изобретением также включают по меньшей мере один сегмент водорастворимого полимера. Водорастворимые полимеры, являющиеся непептидными и водорастворимыми, содержащими от 2 до приблизительно 300 концов, являются исключительно эффективными в изобретении. Примеры приемлемых водорастворимых полимеров включают полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, обладающие водорастворимостью, полиолефиновый спирт, поливинилпирролидон, полигидроксиалкилметакриламид, полигидроксиалкилметакрилат, полисахариды, полиаоксикислота, поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли-Ы-акрилоилморфолин, такие как описаны в патенте США № 5629384, но не ограничены ими. В некоторых случаях применения, в которых необходимо исключительно высокая водорастворимость, водорастворимый полимер не является полипропиленоксидом.

Периодические звенья в каждом водорастворимом полимере могут иметь ряд расположений, включающих, но не ограниченных, расположения, выбранные из группы, содержащей гомополимер (в котором каждая мономерное звено, включающее водорастворимый полимер, является одинаковым), чередующийся сополимер (в котором первое мономерное звено последовательно чередуется со вторым мономерным звеном внутри водорастворимого полимера), статистический сополимер (в котором первое мономерное звено непоследовательно чередуется со вторым мономерным звеном внутри водорастворимого полимера), блок-сополимер (в котором два или несколько первых мономерных звена чередуются с двумя или несколькими вторыми мономерными звеньями внутри водорастворимого полимера), чередующийся триполимер, статистический триполимер и блок-триполимер.

Водорастворимый полимер предпочтительно, хотя необязательно, является полиэтиленгликолем (ПЭГ) или его производным. Тем не менее, следует понимать, что родственные полимеры также приемлемы для практического использования настоящего изобретения, и использование термина ПЭГ, или поли(этиленгликоль) является включающим, а не исключающим в этом отношении. Следовательно, термин ПЭГ включает полиэтиленгликоль в любой из его линейных, разветвленных или многоответвленных форм, включающих алкокси ПЭГ, бифункциональный ПЭГ, раздвоенный ПЭГ, разветвленный ПЭГ, подвесной ПЭГ или ПЭГ, содержащий деструктивные связи, которые подробнее описаны ниже.

В одной форме, используемой в настоящем изобретении, свободный или несвязанный ПЭГ является линейным полимером, завершающимся на каждом конце гидроксильными группами

НО-СНгСНгО-ССНгСНгОЭт-СНгСНг-ОН где (т') обычно находится в пределах от нуля до приблизительно 4000.

Описанный выше полимер, альфа-, омега-дигидроксилполи(этиленгликоль) может быть представлен в краткой форме как НО-ПЭГ-ОН, где следует понимаеть, что обозначение ПЭГ может представлять следующее структурное звено:

-СН₂СН₂О-(СН₂СН₂О)_т-СН₂СН₂где (т'), как определено выше.

Другим типом ПЭГ, используемым в настоящем изобретении, является метокси-ПЭГ-ОН, или сокращенно тПЭГ, в котором один конец является относительно инертной метоксигруппой, в то время как второй конец - гидроксильной группой. Структура тПЭГ приведена ниже.

СНзО-СН₂СН₂О-(СН₂СН_гО)_т-СН₂СН2-ОН где (т'), как определено выше.

Дополнительно к вышеописанным формам ПЭГ полимер может быть получен с одной или несколькими слабыми или деструктурируемыми связями в полимере, включая любой из вышеописанных полимеров. Например, ПЭГ может быть получен путем создания эфирных связей в полимере, подвергаемом гидролизу. Как показано ниже, этот гидролиз приводит к расщеплению полимера на фрагменты с более низким молекулярным весом

-ПЭГ-С02-ПЭГ-+ н₂о -> -ПЭГ-СО₂Н + но-пэгДругие гидролитические деструктурируемые связи, являющиеся эффективными в качестве дест

- 11 011351 руктурируемой связи в основной цепи полимера, включают карбонатные связи; иминные связи, получаемые в результате, например, реакции амина и альдегида (см., например, ОисЫ с1 а1. (1997) Ро1утег РгсрппН 38(1):582-3); связи эфира фосфорной кислоты, образуемые, например, путем реакции спирта с фосфатной группой; гидрозонные связи, которые обычно образуются путем реакции гидразида и альдегида; ацетальные связи, которые обычно образуются путем реакции между альдегидом и спиртом; ортоэфирные связи, которые, например, образуются путем реакции между формиатом и спиртом; амидные связи, образуемые аминной группой, например, в конце полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильной группой другой цепи ПЭГ; уретановые связи, образуемые путем реакции, например, ПЭГ с концевой изоцианатной группой и ПЭГ спиртом; пептидные связи, образуемые аминной группой, например, на конце полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильной группой пептида; и олигонуклеотидные связи, образуемые, например, фосфорамидитной группой, например, на конце полимера, и 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что термин поли-(этиленгликоль) или ПЭГ обозначает или включает все вышеприведенные формы ПЭГ.

Несмотря на то, что молекулярная масса водорастворимого полимера (а также полимерного реагента) может изменяться, молекулярная масса будет удовлетворять одному или нескольким из следующих значений: более 100; более 200; более 400; более 500; более 750; более 900; более 1000; более 1400; более 1500; более 1900; более 2000; более 2200; более 2500; более 3000; более 4000; более 4900; более 5000; более 6000; более 7000; более 7500; более 9000; более 10000; более 11000; более 14000; более 15000; более 16000; более 19000; более 20000; более 21000; более 22000; более 25000 и более 30000 Да. Очевидно, что максимальный предел молекулярной массы для любого данного сегмента водорастворимого полимера, используемого в настоящем изобретении, составляет приблизительно 300000 Да.

Молекулярная масса водорастворимого полимера (а также всего полимерного реагента) может быть выражена в виде значения в пределах молекулярных весов. Иллюстративные примеры включают от приблизительно 100 до приблизительно 100000 Да; от приблизительно 500 до приблизительно 80000 Да; от приблизительно 1000 до приблизительно 60000 Да; от приблизительно 2000 до приблизительно 50000 Да и от приблизительно 5000 до приблизительно 40000 Да.

Иллюстративные молекулярные массы для любого данного водорастворимого полимера (а также всего полимерного реагента) внутри полимерного реагента включают приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 2000, приблизительно 2200, приблизительно 2500, приблизительно 3000, приблизительно 4000, приблизительно 4400, приблизительно 5000, приблизительно 6000, приблизительно 7000, приблизительно 7500, приблизительно 8000, приблизительно 9000, приблизительно 10000, приблизительно 11000, приблизительно 12000, приблизительно 13000, приблизительно 14000, приблизительно 15000, приблизительно 20000, приблизительно 22500, приблизительно 25000, приблизительно 30000, приблизительно 40000, приблизительно 50000, приблизительно 60000, приблизительно 75000 и приблизительно 80000 Да.

В отношении ПЭГ, в котором могут быть представлены структуры, содержащие периодический этиленоксидный мономер, такой как -(СН2СН2О)т- или -(ОСН2СН2)т, предпочтительные значения для (т) включают приблизительно от 3 до 3000; приблизительно от 10 до 3000; приблизительно от 15 до 3000; приблизительно от 20 до 3000; приблизительно от 25 до приблизительно 3000; приблизительно от 30 до 3000; приблизительно от 40 до 3000; приблизительно от 50 до 3000; приблизительно от 55 до 3000; приблизительно от 75 до 3000; приблизительно от 100 до 3000 и приблизительно от 225 до 3000.

В том значении, в каком используется термин «водорастворимый полимер» в настоящем описании, он включает полимеры, которые являются биосовместимыми и неиммуногенными, в частности, исключает любые сегменты водорастворимого полимера, не являющиеся биосовместимыми и неиммуногенными. Что касается биосовместимости, вещество считается биосовместимым, если благоприятный эффект, связанный с использованием только одного вещества или с другим веществом (например, активным агентом) в связи с живыми тканями (например, введение пациенту) перевешивает любой неблагоприятный эффект в соответствии с оценкой клинициста, например врача. Что касается неиммуногенности, вещество считается неиммуногенным, если целевое использование вещества ίη νΐνο не вызывает неблагоприятной иммунной реакции (например, образование антител), либо при возникновении иммунной реакции такая иммунная реакция не рассматривается клинически значимой или важной по оценке клинициста. Исключительно предпочтительным является то, что сегменты водорастворимых полимеров, описанных в настоящем патенте, а также конъюгаты являются биосовместимыми или неиммуногенными.

Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что вышеприведенное описание, касающееся в целом водорастворимого полимера, ни в коем случае не рассматривается как исчерпывающее и является исключительно иллюстративным, и что все полимерные материалы, имеющие вышеописанные свойства, являются предполагаемыми. Термин «полимерный реагент» в том значении, в каком он используется в настоящем описании, относится ко всей молекуле, которая может содержать во

- 12 011351 дорастворимый полимер и функциональную группу. Термин «водорастворимый полимер» обычно используется при рассмотрении одной части более крупной молекулярной структуры, такой как полимерный реагент, молекула предшественника, конъюгат и т.д.

Каждая часть (например, функциональная группа, активный агент, водорастворимый полимер и т.д.) полимерного реагента и иные структуры, описанные в настоящем патенте, могут быть непосредственно присоединены друг к другу с помощью прямой ковалентной связи. Тем не менее, в обычном случае каждая часть присоединена с помощью спейсерной части, состоящей из одного или нескольких атомов, служащих для связывания каждой части вместе в единое целое.

Предпочтительные спейсерные части, с помощью которых различные части полимерных реагентов и другие описанные в данном патенте структуры, включают цепь атомов, состоящую из углерода, азота, кислорода и(или) атомов серы. Один или несколько других атомов, таких как углерод, азот, кислород, сера и водород, могут быть присоединены к указанной цепи атомов. Цепь может быть короткой и может содержать от двух до пяти атомов. Также предполагаются более длинные цепи, например цепь длиной из десяти, пятнадцати или более атомов. Кроме того, спейсерная часть может содержать кольцо атомов, которое может быть насыщенным, ненасыщенным, а также ароматическим. При присутствии спейсерной части она может предпочтительно содержать приблизительно 1-20 атомов, исключая любые разветвляющие атомы. Предпочтительно атомы, составляющие спейсерную часть (включающие любые разветвляющие атомы), содержат определенное сочетание атомов кислорода, углерода, азота, серы и водорода. Каждая спейсерная часть (например, первая спейсерная часть, вторая спейсерная часть, третья спейсерная часть и т.д.) в полимерном реагенте может быть аналогичной любой другой спейсерной части, присутствующей в полимере, или отличаться от нее.

Неограничивающие примеры спейсерной части выбраны из группы, состоящей из -0-, -8-, -С(О)-, -О-С(О)-, -С(О)-О-, -Θ(Ο)-ΝΗ-, -ΝΗ-ϋ(Ο)-ΝΗ-, -О-С(О)ΝΗ-, -С(3)-, -СН₂-, -СН_г-СН₂-. -СН₂-СН₂-СН_г-, -СН_г-СН₂-СН₂-СН₂-, -О-СН₂-, -СН₂-О-, -О-СН₂-СН₂-, -СНг-О-СНг-, -СН₂-СН₂-О-, -О-СН₂-СН₂-СН₂-, -СН₂-О-СН_г-СН₂- -СН₂СНг-О-СНг-, -СН₂-СН₂-СН₂О-, -О-СНг-СНг-СНг-СНг-, -СНг-О-СНг-СНг-СНг-, -СН₂СН_г-О-СН₂-СН₂-, -СН₂-СН₂-СН₂-О-СН₂-, -СН₂-СН₂-СН_г-СН₂-О-, -С (Ο)-ΝΗ-ΟΗ₂-, Ο(0)-ΝΗ-ΟΗ₂-ΟΗ₂-, -ΟΗ₂-Ο(Ο)-ΝΗ-ΟΗ₂-, -ΟΗ₂-ΟΗ₂-Ο(Ο)-ΝΗ-, -С(О)-МН-СН₂-СН₂СНг-, -ΟΗ₂-Ο(0)-ΝΗ-ΟΗ₂-ΟΗ₂-, -СН₂-СН₂-С (Ο)-ΝΗ-0Η₂-,-0Η₂-0Η₂-0Η₂-0(Ο)-ΝΗ-, С(О)-МН-СН₂-СН₂-СН₂-СН₂-, -ΟΗ₂-Ο(Ο)-ΝΗ-ΟΗ₂-ΟΗ₂-ΟΗ₂-, -СН₂-СН₂-С(О)-1ЧН-СН₂СН₂-, -СН₂-СН₂-СН₂-С(О)-Г1Н-СН₂-, -СН₂-СН₂-СН₂-С(О)-МН-СН₂-СН₂-, -СН₂-СН₂ΟΗ₂-ΟΗ₂-Ο(Ο)-ΝΗ-, -С(О)-О-СН₂-, -СН₂-С(О)-О-СН₂-, -СН₂-СНг-С(О)-О-СНг-, -С(О)О-СН₂-СН₂-, -ΝΗ-Ο(Ο)-ΘΗ₂-, -СН₂-Ь1Н-С(О)-СН₂-, -СН₂-СН₂-ИН-С(О)-СН₂-, -ΝΗ-Ο(Ο)СНг-СНг-, -СН₂-МН-С(О)-СН₂-СН₂-, -СН₂-СН₂-МН-С(О)-СН₂-СН₂-, -Ο(Ο)-ΝΗ-ΟΗ₂-, С(О)-ИН-СН₂-СН₂-, -Ο-0(Ο)-ΝΗ-0Η₂-, -О-С(О)-МН-СН₂-СН₂-, -Ο-0(Ο)-ΝΗ-0Η₂-0Η₂СН₂-, -ΝΗ-СКг-, -ΝΗ-ΟΗ₂-ΟΗ₂-, -ΟΗ₂-ΝΗ-ΟΗ₂-, -СН₂-СН₂-МН-СН₂-, -С(О)-СН_г-, -С(О)СН₂-СН₂-, -СН₂-С(О)-СН₂-, -СН₂-СН₂-С(О)-СН₂-, -СН₂-СН₂-С(О)-СН₂-СН₂-, -СНг-СНгС(О)-, -ΟΗ₂-ΟΗ₂-ΟΗ₂-Ο(0)-ΝΗ-ΟΗ₂-ΟΗ₂-ΝΗ-, -ΟΗ₂-ΟΗ₂-ΟΗ₂-Ο(0)-ΝΗ-ΟΗ₂-ΟΗ₂-ΝΗС(О)-, -СН₂-СНг-СН₂-С(О)-МН-СН₂-СН₂-ИН-С(О)-СН₂-, -СН₂-СН₂-СН₂-С(О)-МН-СН₂СН₂-Ь1Н-С(О)-СН₂-СН₂-, -0-0(0)-ΝΗ-[ΟΗ₂]ο·6-(ΟΟΗ₂ΟΗ₂)ο-2-, -0(Ο)-ΝΗ-(0Η₂)ι.6-ΝΗС(О)-, -ΝΗ-С (Ο)-ΝΗ-(ΟΗ₂)^-ΝΗ-Ο(Ο)-, -О-С(О)-СН₂-, -О-С(О)-СН₂-СН₂-_г -О-С(О)СН₂-СН₂-СН₂-, -ΟΗ₂-ΟΗ₂-ΟΗ₂-Ο(0)-ΝΗ-ΟΗ₂-ΘΗ₂-ΝΗ-Ο(0)-, -0Η₂-0Η₂-ΘΗ₂-0(Ο)-ΝΗСН₂-СН₂-ЫН-С(О)-СН₂-, двухвалентной циклоалкильной группы, -Ν(Κ²)-, -СН2-СН2СН2-С(О)-НН-СН2-СН2-ЫН-С(О)-СН2-СН2-, О-С(О)-ЫН-[СН2]г(ОСН2СН2)п, и сочетаний двух или нескольких любых вышеуказанных соединений, где ί - от 0 до 6, η - от 0 до 20 (предпочтительно от 0 до 10, например 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, и более предпочтительно 4), В² обозначает Н или органический радикал. Предпочтительные двухвалентные циклоалкильные группы имеют структуру -(СВ³В⁴)р-С_3-1₂циклоалкил-(СВ³В⁴)ч-, где р и с.|. каждый независимо, составляет приблизительно от 0 до 10, предпочтительно приблизительно от 0 до 6 (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6), каждый В³ независимо обозначает Н, алкил или другой циклоалкил, и каждый В⁴ независимо обозначает Н, алкил или другой циклоалкил. Другие двухвалентные циклоалкильные (например, циклоалкилен) группы включают С3-8 циклоалкил, такой как различные изомеры циклопропадиила (например, 1,1-, цис-11,2-, или транс-1,2-циклопропилен), циклобутадиила, циклопентадиила, циклогексадиила и циклогептадиила. Циклоалкиленовая группа может быть замещена одной или несколькими алкильными группами, предпочтительно С1-С6алкильными группами.

Для любой данной спейсерной части, включающей смежные с ней карбонильный и углеродный атом, спейсерная часть произвольно включает органический радикал, присоединенный к атому углерода,

- 13 011351 смежному с карбонилом. Атом углерода, находящийся в непосредственной близости от карбонильного углерода, обычно называют α-углеродом. Таким образом, α-углерод в любой данной спейсерной части может иметь органический радикал, такой как малую алкильную группу (например, метилгруппу), присоединенную к нему.

Общая структура полимерного реагента может принимать любое количество различных форм. Например, полимерный реагент может быть линейным, разветвленным, многоответвленным, дендритным или раздвоенным. Линейные структуры в соответствии с настоящим изобретением соответствуют формуле II и 11а ниже. Тем не менее, предпочтительно, чтобы полимерный реагент имел либо разветвленную, либо многоответвленную структуру. В целом, такие полимеры обладают двумя или несколькими водорастворимыми полимерами и создают более крупное, более плотное полимерное «облако», окружающее активный агент, тем самым сокращая эффективное количество эффективных точек присоединения, имеющихся в соединении. В формулах III, 111а, ШЬ и ШЬ1 ниже разветвленные структуры включают два водорастворимых полимера. Разветвленные структуры могут также включать три водорастворимых полимера. С другой стороны, многоответвленные полимеры включают четыре или более таких водорастворимых полимера. Дендритные формы полимеров имеют несколько (например, от 3 до 50) отдельных водорастворимых полимеров, в конечном счете соединенных с ядром, включающим один или несколько атомов. Для любого конкретного полимерного реагента, включающего два или несколько водорастворимых полимеров, каждый водорастворимый полимер может быть аналогичным или различным. Более того, сочетания аналогичных и различных водорастворимых полимеров могут использоваться, когда полимерный реагент включает три или более водорастворимых полимера, хотя предпочтительно, чтобы каждый водорастворимый полимер в полимере являлся аналогичным другому (другим) водорастворимому (ым) полимеру (ам).

Что касается разветвленных форм полимерного агента, иллюстративные диапазоны приемлемых размеров для общей молекулярной массы полимера (в соответствии с основанными в целом на совестных массах двух частей водорастворимых полимеров) включают (опять-таки, выраженные в значениях молекулярной массы) приблизительно от 200 до 200000 Да; приблизительно от 1000 до 100000 Да; приблизительно от 2000 до 120000 Да; приблизительно от 4000 до 100000 Да; приблизительно от 5000 до 90000 Да; приблизительно от 10000 до 80000 Да и приблизительно от 15000 до 60000 Да. В частности, общая молекулярная масса (в дальтонах) разветвленного варианта полимера изобретения соответствует одному из следующих значений: приблизительно 400; приблизительно 1000; приблизительно 1500; приблизительно 2000; приблизительно 3000; приблизительно 4000; приблизительно 10000; приблизительно 15000; приблизительно 20000; приблизительно 30000; приблизительно 40000; приблизительно 50000; приблизительно 60000; приблизительно 80000; приблизительно 90000; приблизительно 100000, приблизительно 120000, приблизительно 160000 или приблизительно 200000.

При рассмотрении общей структуры описанных в настоящем изобретении полимерных реагентов следует признать определенное различие в отношении полимерных регентов, описанных в известном способе. Например, известные полимерные регенты характеризуются рядом проблем, в результате чего они являются неприемлемыми для присоединения к активному агенту. Например, у некоторых известных полимерных реагентов отсутствует быстро заменяемая функциональная группа, такая как реактивная группа (например, у сложного эфира). Даже при попытках соединения полимерного реагента, у которого отсутствует быстро заменяемая функциональная группа (например, метилен(-СН₂-)группа), условия, необходимые для этого, будут исключительно жесткими (например, условия с высокой концентрацией щелочи), в результате чего существует вероятность деструкции активного агента. Далее ряд известных полимерных реагентов имеет две группы (например, карбонильные группы), замещенные на потенциальных точках присоединения, что нередко приводит к незавершенной конъюгации ввиду стерических эффектов и(или) снижению реактивности в результате близости групп.

Когда присутствует только один водорастворимый полимер в общей структуре полимера, структура полимера предпочтительно соответствует формуле (II) п¹ о гоьу'-^м-с-о-^-г _{{формула (|)} где ΡΘΕΥ¹ - водорастворимый полимер (например, ПЭГ или тПЭГ);

а - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

Ь - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

К¹ - Н или органический радикал (например, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);

X¹ - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;

X² - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть; и

Ζ - реактивная группа.

Кроме того, когда полимер включает только одну водорастворимую часть во всей структуре, структура может также соответствовать той, что приведена в формуле Па

- 14 011351

Ζ-(Χ^-Ο-Ο-Ν-(Χ³Ε—роьу¹—(Χ'^-Ν-^-ο-ίχΉ-ζ _{(формула} |_|а) где РОЬУ¹ - водорастворимый полимер (например, ПЭГ или тПЭГ);

а - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

Ь - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

с - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

б - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

каждый К¹ обозначает независимо Н или органический радикал (например, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);

X¹ - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;

X² - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;

X³ - если присутствует, обозначает третью спейсерную часть;

X⁴ - если присутствует, обозначает четвертую спейсерную часть; а каждый Ζ - независимо реактивная группа.

Кроме того, когда два водорастворимых полимера присутствуют в общей структуре полимерного реагента, структура соответствует формуле III

где РОЬУ¹ - водорастворимый полимер (например, ПЭГ или тПЭГ); РОЬУ² - водорастворимый полимер (например, ПЭГ или тПЭГ); а - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

Ь - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1); е - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

I¹ - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1); д' - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

- 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

(Формула III) ί - от 0 до 20 (т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20);

каждый К¹ обозначает независимо Н или органический радикал (например, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);

X¹ - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть; X² - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;

X⁵ - если присутствует, обозначает пятую спейсерную часть; X⁶ - если присутствует, обозначает шестую спейсерную часть; X⁷ - если присутствует, обозначает седьмую спейсерную часть; X⁸ - если присутствует, обозначает восьмую спейсерную часть;

К⁵ - разветвляющая часть и

Ζ - реактивная группа.

Предпочтительные полимерные регенты, имеющие структуры, охватываемые формулой II, 11а и III, являются полимерными реагентами, в которых каждый водорастворимый полимер (т.е. РОЬУ¹ и/или РОЬУ²) является поли(алкиленоксидом), например поли(этиленоксид). Предпочтительно, хотя не обязательно, поли(этиленоксид) блокирован на одном конце группой, такой как метил, бензил или гидроксил. Наиболее предпочтительным поли(этиленоксидом) с концевой блокировкой является поли(этиленоксид), соответствующий одной из следующих структур: Н₃С-(ОСН₂СН₂)_т- или НзС-(ОСН₂СН₂)_т-О-С(О)-ХН[СН₂]₁-(ОСН₂СН₂)_П-, где т - от 2 до 4000, I - от 0 до 6, η - от 0 до 20.

Каждая спейсерная часть (независимо от того, является ли она первой спейсерной частью, второй спейсерной частью или третьей спейсерной частью), появляющаяся в полимере или охваченная формулами II, Па или III, независимо определена, как указывалось выше в отношении в целом спейсерных частей. Тем не менее, предпочтительно, чтобы каждая из спейсерных частей, таких как спейсерные части, обозначенные X¹ и X⁵, выбиралась из группы, состоящей из -О-, -О-СН2-, -О-СН2-СН2-, -О-С(О)-ПН-СН2СН2- и -О-С(О)-ХН-СН2-СН2-(ОСН2СН2)2-. Что касается спейсерных частей, обозначенных X² и X⁶, то спейсерная часть предпочтительно выбирается из группы, состоящей из -СН2-, -СН₂-СН₂-, -СН₂СН₂(ОК²)-, -СН₂-СН(ОК²)-СН(ОК²)-, -Ν(Κ²)-, и К² обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила. Что касается спейсерной части, обозначенной X⁸, спейсерная часть предпочтительно выбирается из группы, состоящей из -О-, -О-СН2-, -О-СН2-СН2-, -О-СН2

СН2-СН2-, -О-СН2-СН2-СН2-С(О)-, -СН2-, -СН2-СН2-, -СН2-СН2-СН2-, -СН2-СН2-СН2-С(О)-, -СН2-СН2- 15 011351

СН2-С(О)-МН-СН2-СН2-МН-С(О)-СН2-СН2- и -СН2-СН2-СН2-С(О)-МН-(СН2СН2О)п-СН2-СН2-СН2-, где п составляет от 0 до 20. Как вариант, X⁸ может включать дальнейшую точку разветвления или несколько точек разветвления, где могут присутствовать дополнительные реактивные группы, благодаря чему обеспечивается «раздвоенное» расположение. Другие «раздвоенные» расположения, которые могут использоваться в полимере в соответствии с настоящим изобретением, более полно описаны в международной заявке РСТ/υδ 99/05333.

Разветвляющая часть В⁵ в формуле III может обозначать любую разветвляющую часть, которая может обеспечить соединение по меньшей мере с тремя атомами. Тем не менее, предпочтительно, чтобы В⁵ выбирался из группы, состоящей из насыщенного алкила, замещенного насыщенного алкила,

где р - 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) и с.| - 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10).

Несмотря на то, что реактивная группа Ζ, приведенная в формуле II, 11а и III, может быть любой реактивной группой, описанной выше, предпочтительно, чтобы реактивная группа выбиралась из группы, состоящей из карбоновой кислоты, альдегида, сульфона, сложного эфира, сукцинимида и малеимида. Иллюстративные примеры спейсерной части (например, X², X⁴ и X⁸) и сочетания Ζ включают

где г - 1-12 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12), г' - 0-5 (например , 0, 1, 2, 3, 4 или 5) и В⁶ арил или алкил.

Специалистам в данной области очевидно, что настоящее изобретение охватывает большое количество полимеров. Неограничивающие примеры полимеров осуществления в соответствии с настоящим изобретением представлены ниже.

ж, Нй--о—

Например, начиная с формулы III и определяя В⁵ как . в котором каждое р и с.| - единица и каждое Ь и £ - нуль, обеспечивается получение полимера, имеющего структуру, соответствующую формуле (Ша) ниже.

Н¹ О

ΡΟ4_γΐ--(Х’Е-М-^-О-СНг

А¹ о НС--(Х⁷)л— (СНзСН^-р^ь—2

I П I роьуг— (Х⁵),-м-с-о-сн_а (Формула Н1а), в которой ΡΟΕΥ¹, ΡΟΕΥ², а, с, д', _), Ь, В¹, X⁷, X⁸ и Ζ - как определено выше.

Формула Ша, в свою очередь, может быть далее определена с целью получения полимерного реагента, имеющего структуру, соответствующую формуле ШЬ. В частности, начиная с формулы Ша и определения каждого В¹ как Н, каждый ΡΟΕΥ¹ и ΡΟΕΥ² как Н3С-(ОСН2СН2)т-, где т - от 2 до 4000, каждый из а и е равен единице, каждый X¹ и X⁵ обозначает -О-С(О)-МН-[СН2]_г(ОСН₂СН₂)_п-, где £ - от 0 до 6 и п - от 0 до 20, обеспечивается получение полимерного реагента, имеющего структуру, соответствующую формуле ШЬ о о

НзС^ОСНрСН^-О-С-И^СН^СОСН^Нг)—м-с-о-сн_г θ^{Η Н} θ НС (Х⁷}_я—(СН^СН^О)—Ζ

НзС^ОСНгСНг}—О-С-м[сН_гр(ОСН₂СН_?)—ГЬС-О-СН_г ^т и ¹ ° н (Формула 1НЬ) в которой каждый т - от 2 до 4000, каждый £ - независимо от 0 до 6, и каждый п - независимо от 0 до 20, и д', Ь, _), X⁷, X⁸ и Ζ - как определено выше.

Формула ШЬ, в свою очередь, может быть далее определена с целью получения полимерного реагента, имеющего структуру, соответствующую формуле Шс. В частности, начиная с формулы ШЬ и определяя каждый из д' и _) как нуль, Ь равным единице, X⁸ как -СН₂-СН₂-СН₂-, а Ζ обозначающим карбоновую кислоту, обеспечивается получение полимера, имеющего структуру, соответствующую формуле Шс

- 16 011351 ниже.

Оо

8зС-(ОСН2СН2)-О-С-8-|сН₂|-(ОСН₂СН2)—Ν-С-О-СНз ^{г Г н} н1-0.

ОО |

Н/>(ОСНгСН_г)—0-С-М^СН₂|-(ОСН_гС8₂)—N-0-0-082 “ И ^гН

Иг ^С-х_гх' о и .сон (Формула Н1с) где каждый т - от 2 до 4000, каждый ί - независимо от 0 до 6 и каждый η - независимо от 0 до 20 (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20).

Как вариант, формула 111с также может включать алкильную группу, соединенную либо с α- или βуглеродом карбоновой кислоты. Что касается алкильной группы (например, метил), то на α-углероде карбоновой кислоты структура соответствует формуле ШЬ1.

ОО —[Ч-С-О-СИг / ' ” ^А 4-а

Ϊ . ,? I

Н^ЧОСНгСНг)—0-С-1ч[сНг|-(ОСН_яСНа)—61-С-О-СНа ^т Η ¹н

8а θ •С, „сон СН I А1Ку| ‘(Формула 1НЫ)

Кроме того, формула 111а может быть далее определена с целью получения другого предпочтительного полимера, в частности, начиная с формулы Ша и определяя каждый РОЬУ¹ и РОЬУ² как Н3С(ОСН2СН2)т-, в которой т - от 2 до 4000, каждый из а, с, д' и _) - как нуль, 11 - как единица, X⁸ - как -СН2° - обеспечивается получение полимера,

СН₂-СН₂-С(О)-Ж-СН₂-СН₂-Ж-С(О)-СН₂-СН₂- и Ζ как имеющего следующую структуру:

О

II

НзСХОСНзСНД—Ν-С-О—СН₂

НзСХОСНгСНг)—Ν-С-О-СНя го I Н в которой каждое т - от 2 до 4000.

Дополнительные полимерные реагенты в соответствии с изобретением включают

О η

Н_эС-(ОСНгСНг)—Ν-С-О—(СН_аСН_гО)-СН_г ^ш 4

О

II

НзС-СОСНгСНг)—М-С-О-(СНгСН2О) Н * (Формула ПИ)

в’ О

ΡΟίΎ¹--(Х¹)_а“М-С-О-(Х^г)^θ (СНД^-СОН

ΡΟίγ2—(Χ⁵).-Ν-Ο-Ο-(χβ)_Γ;

в¹ о

ΡΟίΥ¹---(Χ’)_β“Ν-Ο“Ο-(ХЭьСНз

В’ О —(СН_г)_о.5-СН-СОН

ΡΟίγϊ—(Х⁵)₃-М-С-О-(Х%.

- 17 011351 ⁰Н

Н₃0(ОСНгСН_г)-0-С-№|СН_г|-(ОСН_гСН_г^—Ν-С-О-СНг “ ^{н 2 Н} Н^-О.

ОО |

ЬЬОСОСНгС^-О-С-мкНгкоСНгСНг)—Ν-С-О-СНг “ н ²н оо

II _Г , II Н₃С-(ОСН_йСН_г)—о-с-м|сн₂]— Ν-С-О-СНг ^{н 2}н1-о.

О ОI

II г 1 I

К₃С-(ОСН2СН_г|-О-С-н1-СН₂|-М-С-О-СН₃

Ш 11 Л-э I н -н я¹ о

РОТ,---(Х')₆-Н-^-О-(Х^г}ь^ я* о I II рО(.У^г--(Х⁵)_е-Н-С-О-(Х°)|·

Н_г I?

Ч^с^сон

Яг

Иг 'С’ Нг

А⁵—(СН_г),.₆-Г1Н₂

К .

(СН₂),.₆-СО-Н

О II НэСИОСНгСН^^-С-О-СНг

НI

НС—< оI

III

Н₃С-(ОСН_гСНг)—Ν—С-О-СН₂ ш I

Н

Нг < х·⁰·'. >

^С Яг 'С' Нг

О II .с·

О II НзС-СОСНгСЩ—Ν-С-О-СНг

НС—О^_ н

о ϋ .

НзСДОСНгСНг)—Ν—с-0-СНг ю I н

Нг •СНг Нг .С—N >=О

- 18 011351 о

НзС^ОСНгСНг^-М-С-О-¹'»-

и 1

НзСЧОСНгСНг)—Ν—С-О-СН_г τη I

II

НзС-СОСНгСНг^-М—С-О-™-

II I

Н₃С-(ОСН₂СН₂)—Ν—С-О-СН?

Ш 1

Й¹ о I II

_Н1 о —(Х⁷)₀.—(ΟΗ^Η^-ΙΧ^π—СН

ΡΟϊΑ—(Х⁵}_е—Ν-С-О—{Х⁶)г

Н’ О ^Н⁵—(Х⁷)_д~(СН₂СН₂О)_Г(С11₂)_М-СН

РО1_№—(Х⁵)е-м-с-о—(Х%·;

_К1 о V—(Χί—(СНгСН^г^-С-СНа

I I' л рсп-уг—(χ5)-Ν-ο-Ο-ίΧθ),;

в’ о

РОСУ¹---(X¹о р! о ^Й³—(Х\— (СНгСН^)_г(Х%-С-СН-СН_г роьуг—(Х⁵)р-А-С-0—(Х®)е;

- 19 011351 и’ £ ροιυ*—(χ’ΐ.-Ν-ο-ο-ίχ'ήι. О __ я’ о (Х⁷),—(СН₂СН₂О)|-(Х)_П-^—\У-0

I II' роиу^г“<х⁶).“М“С-о-(х⁶)_Г я’ о

ΡΟίΥ’—(хЪ-А-ё-о-^,

Я’ О (Х⁷),—(СНгС1^-Р<%-в-3—-О

ΡΟίγί (Χ⁵).-Ν-0“Ο—(X^е),;

О

НэСЧОСНгСНг^-С-О-ССНгСН^-СНг

Н I Н_г й н>

_о Н0-О С С-й-(СН_гСН_гО)_|-^'-с^СН

I I н₂ н'*

Нз^ОСНгСН^—М-С-О^СНгСН^-СНг ^{2 г} ю Iо н

ί

НзС^ОСНгСН;.)—Ν-С-О-СНг “Α I Г С Н0-0 и 1Я>

НзО(ОСНаСН2)—Ν-С-О-СНг [В ΐ н

Н1 ί Η <

С_{х Х}С—Ν—(СНгСНгО),·'' $ с²# 'V ^чсн н₂

- 20 011351

- 21 011351

ΡΟΙΥ’

РОЬУ²

НзС.(ОСН_яСН,)ш

НзС1сща^1^с-о-(ск^^а^ нΊ нс-с ⁰I иI

Η^<ΧΜ^-^ο-ο-(θΗ^α^-α4ζ ПЭ

НзС^ОСНгСН^-ЬНС-О-СНг

- 22 011351

- 23 011351

- 24 011351

в которых все переменные, как определено выше, в которых каждый п' - 0-100, более предпочтительно 040 и наиболее предпочтительно 0-20.

В определенных случаях полимерные реагенты в соответствии с изобретением не включают кетонную часть, т.е. часть, в которой каждый из двух отдельных атомов углерода присоединен к атому углерода карбонильной части.

- 25 011351

Кроме того, предпочтительно, чтобы часть ¢- не являлась частью кольцевой структуры (такой

как малеимид) в некоторых случаях. Более того, также предпочтительно, чтобы располагалось ближе к водорастворимому полимеру, чем реактивная группа, исходя из измерений, например, в плане количества атомов, необходимых для достижения реактивной группы, начиная от ближайшего атома в водорастворимом полимере, по сравнению с количеством атомов для достижения реактивной группы, начиная с ближайшего атома в реактивной группе.

Изобретение также включает способ получения полимерных реагентов, описанных в настоящем изобретении. Способ включает этап (ί) обеспечения предшественника, включающего защищенную реактивную группу или одну или нескольких гидроксильных групп (или незащищенная реактивная группа является такой реактивной группой, которая может остаться неизменной при выполнении этапов способа). Некоторые молекулы предшественника, состоящие из защищенной реактивной группы или реактивной группы предшественника и одной или нескольких гидроксильных групп, могут быть получены промышленным способом. Кроме того, незащищенные формы молекулы предшественника могут быть синтезированы и далее защищены (при необходимости) с использованием известных способов.

Несмотря на существование многочисленных форм приемлемых молекул предшественников, и изобретение не ограничено в этом отношении, предпочтительная молекула предшественника имеет две гидроксильные группы. Пример предпочтительной приемлемой молекулы предшественника соответствует формуле (IV) ниже.

НО но· (Формула IV) где РС - защищающая группа. Этот реагент может быть получен синтетически, например, в соответствии с описанием в примере 1.

Примеры предпочтительных защищающих групп включают группы, выбранные из групп, состоящих из метила, этила, трет-бутила и бензила. Исключительно предпочтительной защищающей группой является метил.

Способ получения полимерного реагента в соответствии с настоящим изобретением включает этап (ίί) активирования по меньшей мере одной гидроксильной группы предшественника для вступления в реакцию с аминогруппой для образования активированного предшественника. Несмотря на то, что могут быть использованы любые приемлемые известные активирующие реагенты, предпочтительно использовать активирующий агент, выбранный из группы, состоящей из карбоната ди(И-сукцинимидила) (О8С), Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида, И-(З-диметиламиноприпил)Ν'-этилкарбодиимида, 1,1'-карбонилдиимизадола (СИ1), 1,1'-карбонил (1,2,4-триазола) (СИТ), бис(4нитрофинил) карбоната, р-нитрофенил хлоркарбоната, 4-диметиламинопиридина (ОМАР), фосгена, трифосгена, 1-гидроксибензотриазола (НОВ!), дибензотриазолил карбоната (61ВТС), Ν-гидроксисукциминида и ЭСС. Ν-гидроксифталимида и ЭСС и тиазолидин тиона. Обычно активирующий агент добавляют в емкость, содержащую молекулу предшественника таким образом, чтобы активирующий агент контактировал с гидроксильной группой предшественника.

Другой этап способа получения полимерных реагентов в соответствии с настоящим изобретением включает (ш) вступление в контакт при условиях ковалентного сочетания по меньшей мере одной активированной гидроксильной группы с водорастворимым полимером, имеющим аминогруппу, с образованием полимера, содержащего часть водорастворимого полимера и защищенную реактивную группу. Специалисты в данной области техники могут определить путем проведения обычного эксперимента, какие условия рН, температура и т. д. являются подходящими для образования ковалентного сочетания. Например, этот этап сочетания может проводиться несколько раз, при этом каждый раз при различном наборе условий (например, различный рН, различные температуры, растворители и т.д.) Путем определения количества полимера, состоящего из части водорастворимого полимера и защищенной реактивной группы (например, путем проведения гель-хроматографии), получаемого в результате каждого набора условий, возможно определить какой(ие) набор(ы) условий является наиболее подходящим для проведения этапа сочетания.

Несмотря на то, что может быть использовано большинство любых водорастворимых полимеров, исключительно предпочтительно использовать один из следующих полимеров:

- 26 011351

Н₃С-(ОСН2СН₂)—-Й-н о ιι

ш

в которых т составляет от 2 до 4000. Водорастворимые полимеры, имеющие аминогруппу, могут быть синтезированы бе ηονο с использованием методов, известных специалистам в данной области техники, и могут быть получены через серийных поставщиков, таких как №к£аг Тбегареибек (НипЦуШе. ЛЬ).

В том случае, когда в молекуле предшественника присутствует защитная группа, способ получения полимерных реагентов также включает этап (ίν) удаления защиты защищенной реактивной группы при ее наличии с образованием полимерного реагента. Этап удаления защиты может проводиться с использованием любого способа, подходящего для удаления конкретной защитной группы. Специалистам в данной области техники известны соответствующие способы удаления защиты в отношении любой конкретной защитной группы. Кроме того, приемлемые способы удаления защиты описаны в соответствующей литературе, например Сгеепе е1 а1., 8ирга. Предпочтительный способ удаления защиты кислотной группы, защищенной как сложный эфир алкильной группы (например, метиловый эфир), заключается в проведении щелочно-катализируемого гидролиза молекулы, содержащей защищенную группу. Примеры приемлемых оснований, добавляемых в реакционный сосуд, в котором находятся молекулы, содержащие защищенную реактивную группу, включают, без ограничений, неорганические гидроксиды, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия и соли металлов слабых кислот, таких как ацетат натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия, фосфат натрия, карбонат калия, бикарбонат калия, цитрат калия, ацетат калия и т.д. Кислотно-катализируемый гидролиз также может быть проведен с ортоэфирами, хотя можно использовать сочетание кислотно-катализируемого гидролиза с последующим щелочнокатализируемым гидролизом с указанными производными. С ацеталями кислотно-катализируемый гидролиз является эффективным, в то время как щелочно-катализируемый гидролиз - неэффективным. С бензиловыми сложными эфирами или бензиловыми эфирами каталитическое восстановление является эффективным, хотя кислотно- или щелочно-катализируемый гидролиз также эффективен со сложными эфирами.

Способ получения полимерных реагентов, как вариант, включает дополнительный этап выделения полимерного реагента после его формирования. Для выделения полимера могут использоваться известные способы, но исключительно предпочтительно использовать хроматографию, например ионнообменную хроматографию или гель-хроматографию. В альтернативном варианте или дополнительно способ включает этап очистки полимера после его формирования. В этом случает также могут быть использованы стандартные известные способы очистки полимера.

В отношении любого данного полимера, полученного в соответствии с настоящим способом, способ обеспечивает более эффективное дальнейшее преобразование полимера (либо до, либо после любого этапа удаления защиты) таким образом, чтобы он содержал конкретную реактивную группу. Таким образом, используя известные в данной области техники способы, полимер может быть функционализирован для включения реактивной группы (например, активный сложный эфир, тиол, малеимид, альдегид, кетон и т.д.).

Различные этапы для получения полимерного реагента проводятся в приемлемом растворителе. Специалисты в данной области техники могут определить, пригоден ли какой-либо конкретный растворитель для любого данного этапа реакции. Тем не менее, нередко растворитель обозначает предпочтительно неполярным растворителем или полярным растворителем. Неограничивающие примеры неполярных растворителей включают бензол, ксилол и толуол. Исключительно предпочтительные неполярные растворители включают толуол, ксилол, диоксан, тетрагидрофуран и трет-бутиловый спирт. Иллюстративные полярные растворители включают, но не ограничены, диоксан, тетрагидрофуран (ТГФ), третбутиловый спирт, ДМСО (диметилсульфоксид), ГМФА (гексаметилфосфорамид), ДМФ (диметилформамид), ДМА (диметилацетамид), и ΝΜΓ (Ν-метилпирролидинон).

Настоящее изобретение также включает конъюгаты, содержащие часть водорастворимого полиме-

Конъюгаты имеют следующую внутреннюю структурную ориентацию: (ί) часть водорастворимого

И полимера связана с атомом азота части -«-с-о- с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части; (ίί) фармакологически активный агент связан с карбонильным атомом углерода части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; и (ίίί) К1 обозначает Н или органический радикал.

- 27 011351

Когда присутствует только один водорастворимый полимер в общей структуре конъюгата, структура конъюгата предпочтительно соответствует формуле V

в которой

РОЬУ¹ - водорастворимый полимер (например, ПЭГ или тПЭГ);

а - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

Ь - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

К¹ - Н или органический радикал (например, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещен ного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);

X¹, если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;

X², если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;

активный агент - фармакологически активный агент.

Кроме того, когда в общей структуре конъюгата присутствуют два водорастворимых полимера, структура конъюгата предпочтительно соответствует формуле VI

в которой

РОЬУ¹ - водорастворимый полимер (например, ПЭГ или тПЭГ);

РОЬУ² - водорастворимый полимер (например, ПЭГ или тПЭГ);

а - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

Ь - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1); е - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1); Г - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1); д' - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1); η - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1);

,) - от 0 до 20 (т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20);

каждый К¹ обозначает независимо Н или органический радикал (например, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);

X¹ - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;

X² - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;

X⁵ - если присутствует, обозначает пятую спейсерную часть;

X⁶ - если присутствует, обозначает шестую спейсерную часть;

X⁷ - если присутствует, обозначает седьмую спейсерную часть;

X⁸ - если присутствует, обозначает восьмую спейсерную часть;

К⁵ - разветвляющая часть;

активный агент - фармакологически активный агент.

Полимерные реагенты, описанные в настоящем патенте, эффективно конъюгируют с биологически активными агентами или поверхностями. Предпочтительными группами, приемлемыми для проведения реакции с полимерными реагентами, описанными в данном патенте, являются электрофильные или нуклеофильные группы. Иллюстративные группы включают первичные амины (например, первичные амины из боковой цепи лизинового остатка или Ν-конца полипептида), спирты (например, первичный спирт из боковой цепи серинового или треонинового остатка), тиолы, гидразины, гидразиды и сульфидрилы. Такие группы, приемлемые для проведения реакции с полимерными реагентами, описанными в данном патенте, известны специалистам в данной области техники. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ получения конъюгата, включающий этап контактирования при условиях конъюги рования активного агента с полимерным реагентом, описанным в настоящем патенте.

Приемлемые условия конъюгации включают время, температуру, рН, концентрацию реагента, функциональную(ые) группу(ы) реагента, имеющиеся функциональные группы на активном агенте, растворитель и иные подобные параметры, достаточные для проведения конъюгации между полимерным реагентом и активным агентом. Как известно в данной области техники, конкретные условия зависят, кроме других факторов, от активного агента, типа требуемой конъюгации, наличия других материалов в реакционной смеси и т.д. Достаточные условия для проведения конъюгации в любом конкретном случае могут быть определены специалистами в данной области техники после ознакомления с изобретением в настоящем описании, со ссылками на соответствующую литературу и(или) путем проведения обычных

- 28 011351 экспериментов.

Например, когда полимерный реагент содержит активный сложный эфир Ν-гидроксисукцинимида (например, сукцинимидил сукцинат, сукцинимидил пропионат и сукцинимидил бутаноат), и активный агент содержит аминогруппу (например, концевую аминогруппу на полипептиде и(или) эпсилон-амине лизинсодержащего полипептида), конъюгация может быть проведена при рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,5 при комнатной температуре. Кроме того, когда полимерный реагент содержит винилсульфоновую реактивную группу или малеимидную группу, и фармакологически активный агент содержит сульфидрильную группу (например, сульфидрильную группу цитеин- или метионинсодержащего полипептида), конъюгация может быть проведена при рН от приблизительно 7 до приблизительно 8,5 при комнатной температуре. Более того, когда реактивная группа, связанная с полимерным агентом, является альдегидом или кетоном, и фармакологически активный агент содержит первичный амин, конъюгация может быть проведена путем проведения реакции гидроаминирования, в которой первичный амин фармакологически активного агента вступает в реакцию с альдегидом или кетоном полимера. Реакция гидроаминирования, протекающая при рН от приблизительно 6 до приблизительно 9,5, первоначально приводит к получению конъюгата, в котором фармакологически активный агент и полимер связаны с помощью иминной связи. Последующая обработка иминсодержащего конъюгата растворителем, восстанавливающим агент, такой как ЫаСЫВН₃, обеспечивает восстановление имина до вторичного амина. Дополнительная информация относительно указанных и других реакций конъюгации содержится в работе Нсгтапкоп ВюсопщдДс Тссйтдиск, Лсабспис Ргекк, 1996.

Иллюстративные условия конъюгации включают проведение реакции конъюгации при рН от приблизительно 4 до приблизительно 10 и, например, при рН приблизительно 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10,0. Реакция протекает в течение периода времени от приблизительно 5 мин до приблизительно 72 ч, предпочтительно от приблизительно 30 мин до приблизительно 48 ч и более предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 24 ч. Температура, при которой протекает реакция конъюгации обычно, хотя не обязательно, находится в диапазоне от приблизительно 0 до приблизительно 40°С и нередко при комнатной температуре или более низкой температуре. Реакции конъюгации обычно проводятся с использованием фосфатного буферного раствора, ацетата натрия или аналогичных соединений.

Что касается концентрации реагента, избыток полимерного реагента обычно соединяется с активным агентом. Тем не менее, в ряде случаев предпочтительно иметь теоретически необходимое количество реактивных групп на полимерном реагенте по отношению к реактивным группам активного агента. Таким образом, например, 1 моль полимерного реагента, содержащего две реактивные группы, соединяется с 2 молями активного агента. Иллюстративные соотношения полимерного реагента к активному агенту включают молярные соотношения приблизительно 1:1 (полимерный реагент:активный агент), 1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1 или 10:1. Реакция конъюгации протекает до тех пор, пока не прекращается конъюгация, что может быть в целом определено путем контроля за протеканием реакции во времени.

Протекание реакции контролируют путем взятия аликвотных проб из реакционной смеси в различные моменты времени и проведения анализа реакционной смеси с использованием масс-спектрометрии 8И8-РАСЕ и МАЬИ1-ТОЕ или любого иного приемлемого аналитического метода. По достижению стабилизации в отношении количества сформированного конъюгата или количества оставшегося, не прошедшего конъюгацию полимерного реагента, реакция считается завершенной. Обычно реакция конъюгации протекает в течение от нескольких минут до нескольких часов (например, от 5 мин до 24 ч и более). Полученная смесь продукта предпочтительно, но не обязательно, очищается для отделения избытка полимерного реагента не прошедших конъюгацию реактантов (например, активного агента) и нежелательных многоконъюгированных продуктов реакции. Полученные конъюгаты могут быть далее исследованы с помощью таких аналитических методов, как МАЬИ1, капиллярный электрофорез, гельэлектрофорез и(или) хроматография.

Конъюгаты полимер-активный агент могут быть очищены с целью получения/выделения различных конъюгированных продуктов реакции. В альтернативном случае и более предпочтительно в отношении полимерных реагентов с более низкой молекулярной массой (например, менее приблизительно 20000 Да, более предпочтительно менее приблизительно 10000 Да), используемых для формирования конъюгатов, смесь продукта может быть очищена с целью достижения распределения сегментов водорастворимого полимера по активному агенту (например, смесь продукта может быть очищена с целью получения в среднем от одного, двух, трех, четырех или пяти присоединений полимерного реагента на активный агент (например, протеин). Стратегия для очищения конечной реакционной смеси конъюгата зависит от ряда факторов, включающих, например, молекулярную массу используемого полимерного реагента, конкретный активный агент, требуемый режим дозирования, остаточная активность и ίη νίνο свойства отдельного конъюгата(ов).

При необходимости конъюгаты, имеющие различные молекулярные массы, могут быть выделены с использованием гель-фильтрационной хроматографии, т.е. гель-фильтрационная хроматография используется для фракционирования различно пронумерованных отношений полимерный агент-активный агент (например, 1-мономерное звено полимера, 2-мономерное звено полимера, 3-мономерное звено полимера

- 29 011351 и т.д., где 1-мономерное звено полимера означает 1 полимерный реагент на активный агент, 2мономерное звено полимера означает два полимерных реагента на активный агент и т.д.) на основе их различных молекулярных масс (где разница, в целом, соответствует среднему молекулярному весу сегментов водорастворимого полимера). Например, в иллюстративной реакции, где протеин с молекулярной массой 100000 Да произвольно конъюгирован с разветвленным ПЭГ, имеющим общую молекулярную массу около 20000 Да (в котором каждая полимерная «ветвь» разветвленного ПЭГ имеет молекулярную массу около 10000 Да), полученная реакционная смесь может содержать немодифицированный протеин (имеющий молекулярный веси около 100000 Да), моноПЭГилированный протеин (имеющий молекулярную массу около 120000 Да), диПЭГилированный протеин (имеющий молекулярную массу около 140000 Да) и т.д.

В то время как данный способ может быть использован для разделения ПЭГ и других конъюгатов полимер-активный агент, имеющих различные молекулярные веса, этот способ, в целом, является неэффективным для разделения позиционных изомеров, имеющих различные центры присоединения полимера внутри протеина. Например, гель-фильтрационная хроматография может использоваться для отделения от других смесей ПЭГ 1-мономерного звена полимера, 2-мономерного звена полимера, 3мономерного звена полимера и т.д., хотя каждый из выделенных составов ПЭГ-мономерных звеньев полимера может содержать ПЭГи, присоединенные к различным реактивным аминогруппам (например, остатки лизина) внутри активного агента.

Гель-фильтрационные колонки, подходящие для проведения такого рода разделения, включают 8ирегбех™ и 8ерйабех™ колонки, поставляемые компанией Лтсгхйат Вюхаспесх. Выбор конкретной колонки будет зависеть от требуемого диапазона фракцинации. Элюирование обычно проводится с использованием приемлемого буферного раствора, например фосфата, ацетата и т.п. Собранные фракции могут быть проанализированы с использованием ряда различных способов, например, (1) оптическая плотность (ΘΌ) при 280 нм на содержание протеина; (и) протеиновый анализ бычьего сывороточного альбумина (В8А); (ш) йодная проба на содержание ПЭГ (δίιηχ е1 а1. (1980) Апа1. Вюсйет, 107: 60-63); и ίν) проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (8Ό8-ΡΑ6Ε) с последующим окрашиванием (проявлением) йодистым барием.

Разделение позиционных изомеров проводится с помощью хроматографии с обращенной фазой с использованием колонки С18 высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ΚΡНРЬС) (компании Атегхйат Вюкаепсе или Уубас) либо с помощью ионообменной хроматографии с использованием ионообменной колонки, например ионообменной колонки Берйагоке™ компании Атегхйат Вюхаепсех. Любой из способов может быть использован для разделения изомеров полимерактивный агент, имеющих один и тот же молекулярный вес (позиционные изомеры).

Полимерные реагенты в соответствии с настоящим изобретением могут присоединяться либо ковалентно, либо нековалентно к ряду объектов, включая пленки, поверхности химического разделения и очистки, твердые опоры, металлические поверхности, такие как золото, титан, тантал, ниобий, алюминий, сталь и их окислы, диоксид кремния, макромолекулы (например, протеины, полипептиды и т.д.) и малые молекулы. Кроме того, полимерные реагенты также могут использоваться в биохимических сенсорах, биоэлектрических выключателях и затворах. Полимерные реагенты могут также использоваться в качестве носителей для синтеза пептидов, для получения поверхностей с полимерным покрытием и полимерных прививок, для получения конъюгатов полимер-лиганд для распределения по сродству, для получения сшитых и несшитых гидрогелей и для получения аддуктов полимер-кофатор для биореакторов.

Биологически активный агент, используемый для присоединения к полимерному реагенту в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой любой один или более из нижеперечисленных. Приемлемые агенты могут быть выбраны, например, из снотворных средств и седативных средств, антидепрессантов, транквилизаторов, респираторных лекарств, противосудорожных средств, миорелаксантов, средств против болезни Паркинсона (антагонисты допамина), болеутоляющих средств, противовоспалительных средств, успокаивающих средств (транквилизаторы), супрессивных средств аппетита, средств против мигрени, противосудорожных средств, противоинфекционных средств (антибиотики, антивирусные средства, противогрибковые средства, вакцины), средств против артрита, противомалярийных средств, противорвотных средств, противоэпилептических средств, бронхилитических средств, цитокинов, факторов роста, противораковых средств, антитромбических средств, гипотензивных средств, сердечно-сосудистых лекарств, средств против аритмии, антиоксидантов, противоастматических средств, гормональных средств, включая противозачаточные средства, симпатомиметики, мочегонные средства, средства, регулирующие содержание липидов, антиандрогенные средства, противопаразитарные средства, антикоагулянты, противоопухолевые средства, средства против пониженного содержания глюкозы в крови, пищевые агенты и добавки, добавки для увеличения роста, средства против энтерита, вакцины, антитела, диагностические средства и контрастирующие средства.

В частности, активный агент может входить в один из ряда структурных классов, включающих, но не ограниченных, малые молекулы (предпочтительно нерастворимые малые молекулы), пептиды, полипептиды, протеины, антитела, фрагменты антител, полисахариды, стериоды, нуклеотиды, олигонуклео

- 30 011351 тиды, полинуклеотиды, жиры, электролиты и т.п. Предпочтительно, чтобы активный агент для присоединения к полимеру в соответствии с настоящим изобретением обладал нативной аминогруппой или, в альтернативном случае, модифицировался для содержания по меньшей мере одной реактивной аминогруппы, приемлемой для присоединения к полимеру в соответствии с изобретением.

Конкретные примеры активных агентов, приемлемых для ковалентного присоединения к полимеру, включают, но не ограничиваются, агалзидазу, алефацепт, аспаригиназу, амдоксовир (ДАПД), антид, бекаплермин, кальцитонины, циановирин, дифтитокс денилейкина, эритропоэтин (ЭПО), ЭПО-агонисты (например, пептиды, состоящие из 10-40 аминокислот по длине и включающие определенную последовательность ядра, как описано в \УО 96/40749), α-дорназу, протеин, стимулирующий эритропоэз, коагуляционные факторы, например фактор V, фактор VII, фактор УПа, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XII, фактор XIII, фактор фон Виллебранда; цередазу, церезим, α-глюкозидазу, коллаген, циклоспорин, α-дефенсины, β-дефенсины, десмопрессин, экседин-4, фактор, стимулирующий колонию гранулоцитов, тромбопоиетин, ингибитор α-1 протеиназы, эклатонин, фактор, стимулирующий колонию макрофагов гранулоцита, фибриноген, филграстим, гормоны роста, гормоны роста человека, соматропин, гормоны, высвобождающие гормон роста, ГРО-β, антитело ГРО-β, костные морфогенетические протеины, например костный морфогенетический протеин-2, костный морфогенетический протеин-6, ОР-1; факторы роста кислотных фибробластов, факторы роста основных фибробластов, С’Э-40 лиганд, гепарин, альбумин человеческой сыворотки, гепарин низкой молекулярной массы, интерфероны, например интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, интерферон-ω, интерферон-τ, интерферон-консенсус; интерлейкины и рецепторы интерлейкинов, например рецептор интерлейкин-1, интерлейкин-2, протеины сплавления интерлейкина-2, антагонист рецептора интерлейкина-1, интерлейкина-3, интерлейкина-4, рецептор интерлейкина-4, интерлейкина-6, интерлейкина-8, интелейкина-12, рецептор интерлейкина-13, рецептор интерлейкина-17; лактоферрин и фрагменты лактоферрина, гормон, высвобождающий лютеинизирующий гормон, инсулин, проинсулин, аналоги инсулина (например, моноацилированный инсулин, описанный в патенте № 5922675), амилин, С-пептид, соматостатин, аналоги соматостатина, включая октреатид, вазопрессин, фолликулостимулирующий гормон, противогриппозная вакцина, инсулиноподобный фактор роста, инсулинтропин, фактор, стимулирующий колониеобразование макрофагов, активаторы плазминогена, например альтеплаза, урокиназа, ретеплаза, стрептокиназа, памитеплаза, ланотеплаза и тенетеплаза; фактор роста нерва, остеопротогерин, тромбоцитарный фактор роста, фактор роста ткани, трансформирующий фактор роста -1, сосудистый эндотелиальный фактор роста, фактор, ингибирующий лейкемию, фактор роста кератиноцитов, нероглиальный фактор роста, рецепторы Т-клетки, комплементзависимые молекулы/антигены, факторы некроза опухоли, протеин-1 хемоаттрактанта моноцита, факторы эндотелиального роста, паращитовидный гормон, глюкагоноподобный пептид, соматотропин, α-1 тимозин, расбуриказу, ингибитор тимозин α-1 ПЬ/Ша, тимозин β-10, тимозин β-9, тимозин β-4, α-1 антитрипсин, соединения фосфодиэстеразы, очень поздний антиген 4, ингибиторы очень позднего антигена 4, бисфосфонаты, респираторное синцитиальное вирусное антитело, трансмембранный ген-регулятор цистического фиброза, дезоксирибонуклеазу, бактерицидный протеин/протеин, повышающий проницаемость, и антитело антивируса мозаики цветной капусты. Примерные моноклональные антитела включают этанерцепт (димерный гибридный белок, состоящий из внеклеточной лигандсвязующей части человеческого рецептора 75 кЭ фактора некроза опухоли, связанного с частью Рс иммуноглобулина 1), абциксимаб, адалимумаб, афелимомаб, алемтузумаб, антитело к В-лимфоциту, алтизумаб, базиликсимаб, бевацизумаб, бициромаб, бертилимумаб, СЭР-571, СЭР-860, СЭР-870, цетуксимаб, кленоликсимаб, даклизумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эпратузумаб, фонтолизумаб, гавелимомаб, гемтузумаб, озокамицин, ибритумомаб, тийэксетан инфликсимаб, инолимомаб, келиксимаб, лабетузумаб, лэрделимумаб, олизумаб, меченый изотопом лим-1, метелимумаб, меполизумаб, митумомаб, муромонад - СЭ-3, небакумаб, натализумаб, одулимомаб, омализумаб, ореговомаб, паливизумаб, пемтумомаб, пекселизумаб, румаб-УЕОР, ритуксимаб, сатумомаб пендетид, севирумаб, сиплизумаб, тозитумомаб, тозитумомаб йода-131, трастузумаб, тувирумаб и визилизумаб.

Дополнительные агенты, приемлемые для ковалентного присоединения к полимеру, включают, но не ограничены, следующие: такрин, мемантин, ревастигмин, галантамин, допенезил, лаветирацетам, репаглинид, аторвастанин, алефацепт, тадалафил, варденафил, силденафил, фозампренавир, озелтамивир, валацикловир и валганцикловир, абареликс, адефовир, алфузосин, алозетрон, амифостин, амиодарон, аминокапроновая кислота, натриевый аминогиппурат, аминоглютетемид, аминолевулиновая кислота, аминосалициловая кислота, амлодипин, амсакрин, анагрелид, анастрозол, апрепинат, арипипразол, аспарагиназа, атазанавир, атомоксетин, антрациклины, бексаротен, бикалутамид, блеомицин, бортезомиб, бузерелин, бусульфан, каберголин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хрорамбуцин, натриевый циластатин, цисплатин, кладрибин, клодронат, циклофосфомид, ципротерон, цитарабин, камптотецины, 13цис-ретиноевая кислота, алл-транс-ретиноевая кислота; дакарбозин, дактиномицин, даптомицин, даунорубицин, дефероксамин, дексаметазон, диклофенак, диэтилстибестрол, доцетаксель, доксорубицин, дутастерид, элетриптан, эмтрицитабин, энфувирид, эплеренон, эпирубицин, эстрамустин, этинил эстрадиол, этопозид, экземестан, эзетимиб, фентанил, фексофенадин, флударабин, флудрокортизон, фторурацил,

- 31 011351 флуоксиместерон, флутамид, флутиказон, фондапаринукс, фулвестрант, гамма-гидроксибутират, нефитимиб, гемцитабин, эпинеферин, Л-Допа, гидроксимочевина, икодекстрин, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, иринотекан, итраконазол, гозерелин, ларонидаза, лансопразол, летрозол, леуковорин, левомизол, лизиноприл, ловотироксин натрия, ломустин, мехлорэтамин, медроксипрогестерон, мегестрол, мелфалан, мематин, меркаптопурин, меквинол, метараминол, битартрат, метотрексат, метоклопромид, мексилетин, миглустат, митомицин, митотан, митоксантрон, модафинил, налоксон, напроксен, невирапин, никатин, нилутамид, нитазаксанид, нитизон, норетиндрон, октреотид, оксалиплатин, палонозетрон, памидронат, пеметрексед, перголид, пентостатин, пилкамицин, порфимер, преднизон, прокарбазин, прохлорперазин, ондансетрон, палонозетрон, оксалиплатин, ралтитрексед, розувастатин, сиролимус, стрептозоцин, пимекролимус, зетраконазол, такролимус, тамоксифен, тегазерод, темозоломид, тенипозид, тестостерон, тетрагидроканнабинол, талидомид, тиогуанин, тиотепа, тиотропиум, топирамат, топотекан, трепростинил, третиноин, вальдекоксиб, целекоксиб, рофекоксиб, валрубицин, винбластин, винкристин, виндесин, винорелбин, вориконазол, доласетрон, гранисетрон, формотерол, флутиказон, лейпролид, мидазолам, алпразолам, амфотерицин В, подофилотоксины, антивирусные нуклеозидные препараты, ароильные гидразоны, суматрептан, элетриптан; макролиды, такие как эритромицин, олеандомицин, тролеандомицин, рокситромицин, кларитромицин, даверцин, азитромицин, флуритромицин, диритромицин, джозамицин, спиромицин, мидекамицин, лоратадин, деслоратадин, лейкомицин, миокамицин, рокитамицин, андазитромицин и свиндолид А; фторокинолоны, такие как ципрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин, тровафлоксацин, алатрфлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, эноксацин, гатифлоксацин, гемифлоксацин, грепафлоксацин, ломефлоксацин, спрафлоксацин, темафлоксацин, пефлоксацин, амифлоксацин, флероксацин, тозуфлоксацин, прулифлоксацин, ирлоксацин, пазуфлоксацин, клинафлоксацин и ситафлоксацин; аминогликозиды, такие как гентамицин, нетилмицин, парамицин, тобрамицин, амикацин, канамицин, неомицин и стрептомицин, ванкомицин, тейкопланин, рамполанин, мидепланин, колестин, даптомицин, грамицидин, колистиметат; полимиксины, такие как полимиксин В, капреомицин, бацитрацин, пенемы; пенициллин, включая агенты, чувствительные к пеникллиназе, например пенициллин Г, пенициллин В; устойчивые к пеникллиназе агенты, такие как метициллин, оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин, флоксациллин, нафциллин; активные агенты грамнегативных микроорганизмов, такие как ампициллин, амоксициллин и гетациллин, циллин и галампициллин; антипсевдомональные пенициллины, такие как карбенициллин, тикарциллин, азлоциллин, мезлоциллин и пипероциллин; цефалоспорины, такие как цефподоксим, цефпрозил, цефтбутен, цефтизоксим, цефтриаксон, цефалотин, цефапирин, цефаликсин, цефрадрин, цефокситин, цефамандол, цефазолин, цефазолоридрин, цефаклор, цефадроксил, цефалоглицин, цефуроксим, цефоранид, цефотаксим, цефатризин, цефацетрил, цефепим, цефиксим, цефоницид, цефоперазон, цефотетан, цефметазол, цефтазидим, лоракарбеф, моксалактам; монобактамы, такие как азтреонам; и карбапенемы, такие как имипенем, меропенем и эртапенем, пентамидин, изетионат, альбутерол сульфат, лидокаин, метапротеренол сульфат, белкометазон дипрепионат, триамцинолон ацетамид, будезонид ацетонид, салметерол, ипратропиум бромид, флунизолид, кромолин нитрат и эрготамин тартрат; таксаны, такие как пакпитаксель, §N-38 и тирфостин.

Предпочтительно малые молекулы для сопряжения с полимером в соответствии с изобретением представляют собой малые молекулы, имеющие по меньшей мере одну естественно встречающуюся аминогруппу. Предпочтительные молекулы включают натриевый аминогиппурат, амфотерицин В, доксорубицин, аминокапроновую кислоту, аминолевулиновую кислоту, аминосалициловую кислоту, кислый виннокислый метараминол, двунатриевый пармидронат, даунорубицин, натриевый левотироксин, лизиноприл, натриевый циластатин, мексилэтин, цефалексин, дефероксамин и амифостин.

Предпочтительными пептидами или протеинами для присоединения к полимеру в соответствии с изобретением являются ЭПЭ (эритропоиэтин) 0-:/., ШМ-β, ^Ν-консенсус, фактор VIII, фактор VIII удаленного В домена, фактор IX, фактор, стимулирующий колониеобразование гранулоцитов, фактор, стимулирующий колониеобразование макрофагов гранулоцита, гормоны роста человека, инсулин, фолликулостимулирующий гормон, пептиды, имеющие активность глюкагоноподобного пептида-1, десмопрессин, амдоксивир и паратироидный гормон.

Подразумевается, что вышеприведенные иллюстративные биологически активные агенты охватывают в тех случаях, где это применимо, аналоги, агонисты, антагониты, ингибиторы, изомеры и их фармацевтически приемлемые формы солей. При ссылке на пептиды и протеины изобретением предусматривается охватить синтетические, рекомбинантные, нативные, гликозированные и негликозированные формы, а также их биологически активные фрагменты. Кроме того, термин «активный агент» охватывает активный агент до конъюгации, а также «остаток» активного агента после конъюгации.

Исключительно предпочтительным фармакологическим агентом является пептид, обладающий активностью агониста или антагониста к рецептору глюкагоноподобного пептида-1. Глюкагоноподобный пептид-1 и его фармакологически активные агонистические производные стимулируют секрецию инсулина β-клетками и ингибируют секрецию глюкагона ίη νίνο. Такие агонисты для рецепторов глюкогоноподобного пептида-1 являются полезными в регулировании процесса выработки инсулина.

Примеры агентов, относящихся к глюкагоноподобному пептиду-1, которые являются эффективны

- 32 011351 ми как конъюгаты, включают, без ограничения, следующие примеры: глюкагоноподобный пептид-1; эксендин-3; эксендин-4; эксендин-4 (1-30); эксендин-4 (1-30) амид; эксендин-4 (1-28) амид; ¹⁴Ьеи (лейцин), ²⁵РЬе (фенилаланин) эксендин-4 амид; ¹⁴Ьеи (лейцин), ²⁵РЬе (фенилаланин) эксендин-4 (1-28) амид; ¹⁴Ьеи (лейцин), ²²А1а (аланин), ²⁵РЬе эксендин-4 (1-28) амид или их фармакологически активные производные. Указанные и другие агенты, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора глюкагоноподобного пептида-1, описаны в \УО 99/07404 и включают агенты, имеющие структуру, соответствующую общей формуле Хаа1 Хаа₂ Хаа₃ 61у ТЬг Хаа₄ Хаа₅ Хаа₆ Хаа₇ Хаа₈ 8ег Ьуз (лизин) 61η (глутаминовая кислота) Хаа₉ 61и 61и 61и А1а Уа1 Агд Ьеи Хаа1₀ Хаац Хаа₁₂ Хаа₁₃ Ьеи Ьуз Αδη 61у 61у Хаа₁₄ 8ег 8ег 61у А1а Хаа₁₅ Хаа1₆ Хаа_г Хаа1₈ -Ζ (идентификационный номер последовательности - 8Е6 ΙΌ NО: 1), где Хаа₁ - Н1з (гистидин), Агд (аргинин) или Туг (тирозин); Хаа₂ - 8ег (серии), 61у (глицин), А1а (аланин) или ТЬг (треонин); Хаа₃ - Азр (аспарагиновая кислота) или 61и (глутаминовая кислота); Хаа₄ - РЬе (фенилаланин), Туг или нафтилаланин; Хаа₅ - ТЬг или 8ег; Хаа₆ - 8ег или ТЬг; Хаа₇ - Азр или 61и; Хаа₈ Ьеи, 11е, Уа1 (валин), пентиглицин или Ме1 (метионин); Хаа₉ -Ьеи, 11е (изолейцин), пентиглицин, Уа1 или Ме1; Хаа1₀, - РЬе, Туг или нафтилаланин; Хаац - 11е, Уа1, Ьеи, пентиглицин, трет-бутилглицин или Ме1; Хаа₁₂ - 61и или Азр; Хаа₁₃ - Тгр (триптофан), РЬе, Туг или нафтилаланин; Хаа_!4, Хаа₁₅, Хаа₁₆ и Хаа₁- - независимо Рго (пролин), гомопролин, 3Нур (гипоксантин), 4Нур, тиопролин, Ν-алкилглицин, Νалкилпентилглицин или Ν-алкиналанин; Хаа₁₈ - 8ег, ТЬг или Туг; и Ζ - -ОН или-ΝΉ^

Другие агонисты глюкагоноподобного пептида-1 описаны в патенте США № 6583111. Исключительно предпочтительные агонисты, описанные в этом патенте, включают NН₂-Н^з⁷-Α1а-61и-61у¹⁰-ТЬ^РЬе-ТЬг^ег-АврФУа^ег^ег-Туг-Ьеи^-бЫ-б^-бЫ-АИ-АИФЬув-бШ-РЬе-Пе-АИ^-Тгр-Ьеи-УаЬЬув61у³⁵-Агд-61у³⁷-ОН (идентификационный номер последовательности - 8Е6 ΙΌ NО: 2), NН2-Н^з⁷-Α1а-61иб^-ТЬг-РЬе-ТЬг^ег-АзрФУа^ег^ег-Туг-Ьеи^-бШ-б^-бЫ-АИ-АИФЬуз-бЫ-РЬе-Пе-А^-Тгр-ЬеиУа1- ^уз-61у³⁵-Α^д-NН2 (идентификационный номер последовательности - 8Е6 ΙΌ NО: 3), и Ν^-Πίδ⁷УаЬбШ-б^-ТЬг-РЬе-ТЬг^ег-АзрФУа^ег^ег-Туг-Ьеи^-бШ-б^-бЫ-АИ-АИФЬуз-бЫ-РЬе-Пе-АИ³⁰Тгр-Ееи-Уа1-Ьуз-61у³⁵-Агд-61у³⁷-ОН (идентификационный номер последовательности - 8Е6 ΙΌ NО:4).

Дополнительные примеры агентов, являющихся эффективными в качестве конъюгатов, включают, без ограничения, примеры, описанные в XVО 01/23420. В соответствии с настоящим изобретением многие из следующих пептидов могут быть получены путем известных способов твердотельного синтезирования (как описано в протоколах синтеза пептидов (1994), т. 35, М1сЬеа1 V. Реηη^ηдΐоη & Веη М. Όιιηη) и/или путем использования рекомбинационных способов. Исключительно предпочтительная последовательность включает

Полипептид

Αθ-Η80ΑνΕΤΕΝΥΤΚΙ_ΚΚΟΝΙβΑΑΚΚΥΙ_ΝΟΙ_ΚΚβΘΤ-ΝΗ2

Αο-Η50ΑνΕΤΕΝΥΤΚΙ_ΚΚΟΙ_ΑΑΚΚΥΙ_ΝΟΕΚΚ<3ΰΤ-ΝΗ₂ Αο-Η30ΑνΓΤΕΝΥΤΚίΚΚΟίΑΑΚΚΥίΝΟΙΚΚΘΘΤ ΗβΟΑνΡΤΕΝΥΤΚίΡΚΟίΑΑΚΚΥίΝΟίΚΚΘΘτ

Αο-Η3ϋΑνΕΤΕΝ (СНЗО-Υ) ΤΚΙ_ΚΚαΝΙθΑΑΚΚΥΙ.ΝΟΙ.ΚΚ-ΝΗ2 ΗΒΟΑνΕΤΕΝΥΤΚΙΕΚΟΕΑΑΚΚΥΙΝΟΙΚΚ

ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΚΕΚΚΟΜΑνΚΚΥΙ_Ν8ΙΚΚ-ΝΗ2

Η80ΑνΕΤΟΝΥΤΚίΚΚΟΜΑνΚΚΥίΝ8ΙΚΚΘΘΤ

Идентификационный номер последовательности

- 33 011351

ΗδΟΑνπΕΝΥΤΚΙΡΚΟίΑΑΚΚΥίΝΟίίΝΘΘΤ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΚΙ_ΕΚαίΑΑΚΚΥΙ_Ν0ΙΙ_ΝΟΘΤ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΕΙ_ΕΚΟΙΑΑΚΚΥΙ_Ν0ΙΚΚ<36Τ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡΙ.ΚΚΟίΑΑΚΚΥΙ_ΝΟΙΚΚ-ΝΗ2 Η5ΟΑνΕΤΟΝΥΤΕΙ_ΕΚ0ΜΑ\/ΚΚΥΙ_ΝΟΙ_ΚΚ<3ΘΤ Η80ΑνΕΤΕΝΥΤΚΙ_ΕΚΟΙ_ΑΑΚΚΥΙ_ΝΟΙ_ΚΚ(36Τ8ννθΕΡ(3ννθΕ ΗδϋΑνΕΤϋΝΥΤΚίΚΚαΜΑΑΚΚΥίΝΟΙΚΚΟατ ΗδϋΑνΓΤΟΝΥΤΡίΡΚαυλνΚΚΥΙ-ΝΟΙΚΚΟΘΤ ΗδϋΑνΡΤΟΝΥΤΡΙ-ΗΚΟΙ-ΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΚΘΟΤ Η60ΑνΕΤΟΝΥΤΡ1_ΗΚΟΙ-ΑΑΚΚΥΙ_ΝΟΙΚΝ6ΘΤ Η30ΑνΕΤ0ΝΥΤΡίΡΚ0υ\νΚΚΥ1_Ν8ΙΚΚΘ0Τ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΚΙ_ΕΚΟΜΑΑΚΚΥΙ_Ν8ΙΚΚΘ<3Τ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚαΐ_ΑνΚΚΥΙ_Ν ϋΙ ΚΝΟΘΤ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙΡΚαΐΑΑΚΚΥΕΝ3ΙΚΝ66Τ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΙΗΚαίΑΑΚΚΥίΝΟΙΚΚΟΘ ΗβΟΑνΕΤϋΝΥΤΡΙ-ΡΚΟΙΑΑΚΚΥΙ-ΝΟΙΚΚΘ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚίΕΚαΐΑΑΚΚΥΙ-ΝΟΙΚΚ ΗδϋΑνΡΤΟ Ν ΥΤΡίΡΚΟ Ι_ΑΑΚΚΥΙ_Ν ϋΙ ΚΚΟ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΕΙΕΚΩίΑΑΚΚΥΙΝΟΙΚΚΝΟ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΚΙ-ΕΚΟΙΑΑΚΚΥΙ-ΝΟΙΚΚΚΕΥ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚίΡΚΩΜΑνΚΚΥίΝδΙΚΚ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚ0ΜΑνΚΚΥΙ-Ν8ΙΚΝ Ηδ0ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΙΒΚαΜΑνΚΚΥΙ-Ν3ΙΙ.Κ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΕίΒΚΟΜΑνΚΚΥίΝδΙΙΝ Η80ΑνΕΤΟΝΥΤΕΙ_ΡΕΟΜΑνΚΚΥΙ_Ν8Ι1-Ν ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΗίΕΚΟΙΑνΚΚΥΙΝδΙίΝ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΙΕΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝδΙίΝ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΗΙ.ΕΚΩΜΑνΚΚΥΙ_Ν0ΙΙ_Ν ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΙ_ΡΚΟΜΑΑΚΚΥΙ_Ν8ΙΚΝ Η80ΑνΕΤΟΝΥΤΒΙ_ΕΚΟΜΑΑΚΚΥΙ_Ν8ΙΙΚ Η80ΑνΕΤΟΝΥΤΚΙ_ΕΚΟΜΑΑΚΚΥΙ_Ν5ΙΚΚ ΗδΟΑνΕΤϋΝΥΤΗΙ-ΕΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΚΚΗΥ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΚΙ-ΕΚΩΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΚΚΕ ΗδΟΑνΕΤϋΝΥΤΗΙ-ΕίΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙ ΚΚΚ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΚΙ_ΕΚΩΜΑΑΚΚΥΙ-Ν3ΙΚΝΚΕΥ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚαΜΑνΚΚΥΕΝδΙΚΚΚΕΥ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΕΙ_ΡΚαΜΑνΚΚΥΙ.Ν8ΙΚΚΚΚ ϋΑνΕΤΟΝΥΤΡΕΡΚΩ ΜΑνΚΚΥίΝ 8ΙΚΚΚ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΕΙ_ΕΚΟΜΑνΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΚΕΥ ΗΒΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΕΡΚΩνΑΑΚΚΥΕΟΒΙΚΚ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΕΕΡΚΟΙΑΑΚΚΥίΟΤΙΚΚ ΗδϋΟΙΕΤΕδΥβΡΥΕΚΟΜΑνΚΚΥΙΑΑίΚΚΚΡΥΚΟΡνΚΝΚ Η80ΑνΕΤΕΝΥΤΡΙ_ΡΚαΜΑνΚΚΥΙ_Ν3Ι_ΚΚ-ΝΗ2 ΗδΟΟΙΡΤΟδΥδΕΥΚΚΟΜΑνΚΚΥΕδΑνΕΗΘΟΤ-ΝΗί ΗδΟΟΙΓΤ08ΥδΕΥΕΚΟΜΑνΚΚΥίΑΑνΚΟΟΘΤ-ΝΗ₂ Ηδ06ΙΕΤ08Υ6ΕίΥΕΚ0ΜΑνΚΚΥΙ_ΑΑνΚΚΥίΑΑνΕΗΘ-ΝΗ2 δννΟΕΡΘννΟΒΗδΟΑνΕΤΕΝΥΤΚΕΕΚΟΙΑΑΚΚΥΙΝΟΕΚΚΟΘΤ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΗΙΡΚΟίΑΑΚΚΥΙΝΟΙίΚΘΘΤ Η80ΑνΡΤΟΝΥΤΕΙ_ΕΚΟΙ-ΑΑΚΚΥΙ_ΝΟΙΙ.ΝΘ(3Τ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΕΙΕΚΟΙΑνΚΚΥΙ_ΝΟΙΙ_Κ(3ΘΤ ΗδϋΘΙΕΤΟδΥδΕΥΡΚαΐΑΑΚΚΥΙΑΟνΚΚΟΘΤ ΗδΟΘΙΡΤΟδΥδΡΥΡΚΟίΑΑΚΚΥΕΑϋνΚΚ

21 22

61

67

- 34 011351

ΗδΟΟΙΡΤϋδΥδΡΥΚΚαΐ^ΧνΚΚΥΙΑΑνΚΚ ΗδΟβίπϋδΥδΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥίΑΑνΚΚ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΙ-ΡΚανΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΚ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΑΚΚΥίΝδΙΚΝΚΡ ΗδϋΑνρτοΝΥΤΡίΡκανΑΑΚκγιαδίκΝΚΡΥ Η8ΟΑνΡΤϋΝΥΤΡΙ_ΡΚΟΙ-ΑΑΚΚΥΙ_ΝΠΚΝΚΡΥ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΙ-ΡΚανΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΚΡΥ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΑΚΚΥΙΟδΙΚΝΚΡΥ ΗδϋΑνΕΤϋΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝΤΙΚΝΚΡΥ ΗδϋΑνΕΤΟαΥΤΡΙΡΚαΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΚΡΥ ΗδϋΑνΕΤΟΟΥΤΡΙ-ΡΚΟΙΑΑΚΚΥΙ-ΝΤΙΚΝΚΡΥ ΗδϋΑνΡΤΟΝΥΤΡΙ-ΡΚΟΜΑΑΗΚΥΕΝδΙΚΝΚΡΥ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚ0ΜΑΑΚΗΥΙ_Ν3ΙΚΝΚΡΥ ΗδϋΑνΕΤΟΩΥΤΡίΡΚΩίΑΑΗΚΥΙΝΤΙΚΝΚΡΥ ΗδΟΑνΕΤΟΟΥΤΡΙ-ΡΚΟΙΑΑΚΗΥΙ-ΝΤΙΚΝΚΡΥ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΕΡΚΟνΑΑΚΚΥΙΟδΙΚΚΚΡ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ-ΡΚανΑΑΚΚΥΙ-Ν3ΙΚΚΚΡ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡΕΡΚΟνΑΑΚΚΥΙΝδΙΚΝΚΡΥ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΕΡΚΟνΑνΚΚΥΙΩδΙΚΚΚΡ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΡΙΡΚθνΑνΚΚΥ1-α3ΙΚΚΚ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΡίΡΚθνΑνΚΚΥΐαδΙΚΝΚΡΥ ΗδΟΑνΕΤϋΝΥΤΡΕΡΚανΑΑΚΚΥΙ-αδΙΙ-ΚΚΡΥ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΡ1_ΡΚΩ\/ΑΑΚΚΥ1-Ω3ΙΙ_ΚΚΡ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚΩνΑΑΚΚΥΙΟδΙΙΚΚ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΕΡΚΟνΑΑΚΚΥΙΟβΙΚΝΚ Η3ΟΑνΡΤϋΝΥΤΡΙ-ΡΚθνΑνΚΚΥΙ-Ο8ΙΙ-ΚΚΡΥ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚΟ\/ΑνΚΚΥ1_Ο3ΙΙ_ΚΚΡ Η80Α\/ΡΤ0ΝΥΤΡ1_ΡΚθνΑνΚΚΥΙ_ΟδΙΙ_ΚΚ ΗδΟΑνΕΤϋΝΥΤΚΙΡΚΟνΑΑΚΚΥΙ-αδΙΙ-ΝΚΡΥ Η8ϋΑνΡΤ0ΝΥΤΚΙ_ΡΚΟ\/ΑΑΚΚΥΙ_08ΙΙ-ΝΚΡ ΗδΟΑΧ/ΡΤΟΝΥΤΡΙ-ΡΚΟνΑΑΚΚΥΙ-ΟδΙΙ-ΝΚ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΎΡΙΡΚΟΜΑΟΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΚΡ ΗδΟΑνΓΤΟΝΥΤΡΙΡΚαΜΑϋΚΚΥΕΝδΙΚΝΚΡ Η50Α\/ΡΤ0ΝΥΤΡΕΡΚ(1ΜΑΕΚΚΥΙ_Ν3ΙΚΝΚΡ ΗδϋΑνΕΤϋΝΥΤΡΙ-ΡΚΟΜΑΕΚΚΥίΝδΙΚΝΚΡ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡΙ-ΡΚΟΜΑΘΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΚΚ Η80ΑνΕΤ0ΝΥτΚΙΡΚ<ΪΜΑΗΚΚΥΙ_Ν8ΙΚΝΚΚ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚΩΜΑΙΚΚΥΕΝδΙΚΝΚΡ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ.ΡΚ0ΜΑΚΚΚΥΙ_Ν3ΙΚΝΚΡ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΡίΡΚΩΜΑΙ-ΚΚΥΙΝ8ΙΚΝΚΡ Η3ϋΑ\/ΕΤ0ΝΥΤΡΙ-ΡΚ0ΜΑΜΚΚΥ1-Ν8ΙΚΝΚΡ Η3ϋΑνΕΤ0ΝΥΤΡΙΡΚ0ΜΑΝΚΚΥΕΝ8ΙΚΝΚΡ Η8ΟΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚΟΜΑΡΚΚΥΙ_Ν3ΙΚΝΚΡ ΗδΟΑνΕΤϋΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΘΚΚΥίΝδΙΚΝΚΡ Η8ΟΑνΕΤΟΝΥΤΡ1_ΡΚΟΜΑΡΚΚΥΙ_Ν8ΙΚΝΚΡ Η8ΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑ3ΚΚΥΙ_Ν8ΙΚΝΚΡ Η8ϋΑ\/ΡΤΟΝΥτΡΙ-ΡΚΟΜΑΤΚΚΥΙ_Ν8!ΚΝΚΡ Η30Α\/ΡΤ0ΝΥΤΡ1-ΡΚ0ΜΑ\/ΚΚΥΙΝδΙΚΝΚΡ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΙΡΚΩΜΑννΚΚΥίΝδΙΚΝΚΡ Η8ΟΑ\/ΡΤ0ΝΥΤΡΙ-ΡΚΟΜΑΥΚΚΥΙ-Ν8ΙΚΝΚΡ Η3ΟΑνΡΤϋΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝ3ΙΑΝΚΡ Η8ΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΙ_ΡΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-Ν3ΙΟΝΚΡ

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

- 35 011351

Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΙ.Ε?Κ0ΜΑΑΚΚΥΙ_Ν8Ι0ΝΚΚ ΗδϋΑνΕΤϋΝΥΤΚΙ-ΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΕΝΚΚ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ_ΠΚΟΜΑΑΚΚΥΙ_Ν8ΙΡΝΚΡ Η8ΟΑνΡΤΟΝΥΤΓίΙΡΚΟΜΑΑΚΚΥ1.Ν8Ι(3ΝΚΚ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΙΒΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝδΙΗΝΚΗ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΕΡΚΟΜΑΑΚΚΥΕΝδΙΙΝΚΡ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΚίΡΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ-Ν8ΙΜΝΚΡ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡίΡΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝδΙΝΝΚΚ Η80Α\/ΡΤ0ΝΥΤΙ4Ι-ΚΚ0ΜΑΑΚΚΥίΝ8ΙΡΝΚΚ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ_ΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ_Ν3Ι0ΝΚΡ Η80Α\/ΡΤ0ΝΥΤΚίΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΕΝ8ΙΚΝΚΚ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΙ.ΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ_Ν6Ι8ΝΚΚ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΚίΚΚΟΜΑΑΚΚΥ1_Ν8ΙΤΝΚΡ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΚίΡΚ0ΜΑΑΚΚΥΙΝ8ΐνΝΚΚ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΙ-ΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδίννΝΚΡ Η8ΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΙ_ΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ.Ν8ΙΥΝΚΚ Η80ΑνΡΤΟΝΥΤΚΙ_ΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ.Ν8ΙΚΝΑΚ Η3ΟΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ.ΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ_Ν8ΙΚΝ0Κ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚίΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΟΚ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚίΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝδΙΚΝΕΚ Ηδ0ΑνΡΤ0ΝΥΤΡ1.ΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ-Ν3ΙΚΝΡΡ Η8ΟΑνΡΤ0ΝΥΤΡίΡΙΚΟΜΑΑΚΚΥΙ.Ν8ΙΚΝΘΕί ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΕίΚΚαΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΗΚ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΙ-ΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ.ΝδΙΚΝΙΚ ΗδΟΑνΡΤϋΝΥΤΡΙ-ΓίΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΙ-Κ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΕίΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΡΜΡ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΡίΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΙΝ8ΙΚΝΝΚ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΕίΡΚΟΜΑΑΚΚΥΕΝδΙΚΝΡΚ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΡΕΡΚ0ΜΑΑΚΚΥίΝ3ΙΚΝ0Κ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΙΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-ΝδΙΚΝΡίΚ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΙ-ΕίΚΟΜΑΑΚΚΥ1-Ν8ΙΚΝ8Ε! Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΡίΙ-ΡΙΚ0ΜΑΑΚΚΥ1_ΝδΙΚΝΤΕ? ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΕΙΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝδΙΚΝνΚ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΒίΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙΝδΙΚΝννΚ Η3ΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΑΚΚΥίΝ8ΙΚΝΥΡ Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΕΡΚ0ΜΑΑΚΚΥίΝ3ΙΚΝΚΑ ΗδϋΑνΡΤϋΝ ΥΤΡίΚ КО ΜΑΑΚΚΥίΝδ IΚΝ КО Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΙΡΚ0ΜΑΑΚΚΥίΝ3ΙΚΝΚΕ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΕΚΚ0ΜΑΑΚΚΥίΝ8ΙΚΝΚΡ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΙΚΚ0ΜΑΑΚΚΥίΝ8ΙΚΝΚΘ Η80Α\/ΡΤ0ΝΥΤΚΙ-ΚΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ-Ν8ΙΚΝΚΗ ΗδΟΑνΡΤϋΝ ΥΤΚ ЬН ΚΟΜΑΑΚΚΥΙ.Ν81 ΚΝΚί ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚΕΡΚΟΜΑΑΚΚΥίΝδΙΚΝΚΚ Η δϋΑΧ/ΡΤΟΝ ΥΤΡίΚ КОМ ΑΑΚΚΥίΝδ1 ΚΝ ΚΙ_ Η30ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΙ_ΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ_Ν3ΙΚΝΚΜ Η δΟΑνΕΤϋΝ ΥΤΡΙ.ΚΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-Ν8 I ΚΝ ΚΝ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΕΡΚΟΜΑΑΚΚΥίΝδΙΚΝΚΡ Η δΟΑνΡΤΟΝ ΥΤΡίΡΚΟ ΜΑΑΚΚΥίΝδ I ΚΝ КО Η80ΑνΡΤ0ΝΥΤΚΕ₽Κ0ΜΑΑΚΚΥίΝ8ΙΚΝΚ8 ΗδϋΑ\/ΡΤ0ΝΥΤΡΙ-ΡΚ0ΜΑΑΚΚΥΙ-Ν8ΙΚΝΚΤ ΗδΟΑνΡΤϋΝ ΥΤΚ1.Κ ΚΟΜΑΑΚΚΥίΝδ ΙΚΝ Κν ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΒΙΚΚΟΜΑΑΚΚΥίΝδΙΚΝΚνν

121 122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160 161 162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

- 36 011351

Η3ϋΑνπθΝΥΤΡίΚΚαΜΑΑΚΚΥ(-Ν3ΙΚΝΚΥ Η80Ανπ0ΝΥΤΡΙΡΚ0νΑΑΚΚΥΙ.(25ΙΚΝΚΓίΥ3νν0ΕΡ6νναΚ Η80ΑνΕΤ0ϋΥΤΡΙ.ΡΚΕνΑΑΚΚΥΙ-Ε8ΙΚ0ΚΡΥ

Ε30ΘIΕΤ08Υ8ΚΥΚΚ0 ΜΑνΚΚΥίΑΑνΐ-ΝΗ₂ Η КОС1 ΕΤΟ3Υ8ΡΥΒΚΟΜΑνΚΚΥίΑΑνί-ΝΗ₂ Η8ΚΘ!ΕΤΟ8Υ8ΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥΙ_ΑΑνΐ--ΝΗ₂ Η80ΚΙΕΤ03Υ8ΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥίΑΑνΐ-ΝΗ₂ Η3ΟΘΚΕΤΟ8Υ8ΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥίΑΑνΐ-ΝΗ₂ Η8Ο6ΙΚΤΟ3Υ3ΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥίΑΑνΐ-ΝΗ₂ Η80ΘΙΕΚ08Υ8ΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥΙΑΑνΐ_-ΝΗ₂ Η8ΟΟΙΡΤΚ8Υ8ΗΥΡΚαΜΑνκΚΥΙΑΑνΐ-ΝΗ₂ Η3Ο6ΙΠΌΚΥ8ΡΥΡΚαΜΑνΚΚΥΙ-ΑΑνΐ_-ΝΗ₂ Η800ΙΕΤ08Κ8ΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥΙΑΑνΐ_-ΝΗ₂ Η80ΘΙΕΤ08ΥΚΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥΙΑΑνΐ_-ΝΗ₂ Η806ΙΕΤ08Υ8ΕΥΡΚ0ΜΑνΚΚΥίΑΑνί-ΝΗ₂ Η80ΘΙΕΤ08Υ8ΒΚΡΚΟΜΑνΚΚΥ1-ΑΑνΐ--ΝΗ2 Η80ΘΙΓΤ08ΥδΡΥΕΚ0ΜΑνΚΚΥΙ_ΑΑνΐ--ΝΗ₂ ΗδΟΘΙΕΤΟδΥ8ΡΥΡΕΟΜΑνΚΚΥΙΑΑνΐ_-ΝΗ₂ Η800ΙΕΤ08Υ8ΚΥΚΚΚΜΑνκΚΥΙ_ΑΑνί-ΝΗ₂ Η80ΘΙΕΤ08Υ8ΡΥΡΚΟΚΑνΚΚΥυΧΑνί-ΝΗ₂ Η8ΟΘΙΡΤϋ8Υ8ΡΥΡΚαΜΚνΚΚΥΙ-ΑΑνί-ΝΗ₂ ΗδΟΟΙΕΤΟ8ΥδΡΥΡΚΩΜΑΚΚΚΥΙ_ΑΑνΐ_-ΝΗ2 Η80(3ΙΕ-Τ08Υ3ΡΥΡΚΩΜΑνΕΚΥ(_ΑΑνΐ_-ΝΗ₂ Η300ΙΕΤ08Υ8ΒΥΚΚαΜΑνΚΕΥυ\Ανί-ΝΗ₂ Η80ΘΙΕΤ08Υ8ΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΚίΑΑ\ΖΙ-ΝΗ₂ Η8ΟΘΙΕΤΟδΥδΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥΚΑΑνΐ_-ΝΗ₂ Ηδ06ΙΕΤ08ΥδΡΥΡΚ0ΜΑνΚΚΥΙ_ΚΑνΐ_-ΝΗ₂ Η8Ο6ΙΕΤΟ8Υ3ΚΥΚΚαΜΑνΚΚΥΙΑΚνΐ-ΝΗ₂ Η8ΟΘΙΕΤΟ8ΥδΡΥΡΚΟΜΑνΚΚΥίΑΑΚί-ΝΗ₂ ΗδϋΘ I ΕΤϋδΥδΡΥΡΚΘ ΜΑνΚΚΥΙ_ΑΑνΚ-ΝΗ₂ Η8ΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΙ-ΡΚΟΜΑΑΚΚΥΙ-Ν8ΙΚΝΡΙ Η80Α\/ΕΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚ0ΜΑΘΚΚΥΙ_ΝδΙΚΝΡΙ Η80Αν₽Τ0ΝΥΤΡΙΡΚ0ΜΑΚΚΚΥΙΝ8ΙΚΝΡΙ ΗδΟΑνΓΤΟΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΡΚΚΥίΝδΙΚΝΡΙ ΗδΟΑνΕΤϋΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑδΚΚΥΙΝδΙΚΝΡΙ Η80Α\/ΓΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚ0ΜΑΑΚΚΥ1-ΝδΙΡΝΡΙ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΡΙΡΚΟΜΑΘΚΚΥίΝδΙΡΝΡΙ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΡΙ_ΡΚΟΜΑΚΚΚΥ1.Ν8ΙΡΝΡΙ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡΙ_ΡΚΟΜΑΡΚΚΥΙ_Ν81ΡΝΡΙ ΗδϋΑνΓΤΟΝΥΤΡίΡΚΟΜΑδΚΚΥΙΝδΙΡΝΡΙ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚΟΜΑΑΚΚΥίΝδΙΟΝΡΙ Η80ΑνΕΤ0ΝΥΤΡίΡΚΟΜΑΘΚΚΥίΝ8Ι0ΝΡΙ ΗδΟΑνΡΤΟΝΥΤΚίΡΚαΜΑΚΚΚΥΙΝδΙΟΝΡΙ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚΟΜΑΡΚΚΥΙΝδίαΝΡΙ Η80ΑνΕΤϋΝΥΤΡίΡΚ0ΜΑ8ΚΚΥίΝ8Ι0ΝΡΙ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚΩΜΑΑΚΚΥίΝδΙΡΝΡΙ ΗδΟΑνΡΤϋΝΥΤΡίΡΚΟΜΑΟΚΚΥίΝδΙΡΝΡΙ ΗδΟΑνΡΤϋΝΥΤΡίΡΚΟΜΑΚΚΚΥίΝδΙΡΝΡΙ ΗδϋΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚΟΜΑΡΚΚΥίΝδΙΡΝΡΙ ΗδΟΑνΕΤΟΝΥΤΡίΡΚΟΜΑδΚΚΥίΝδΙΡΝΡί

173

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

322

323

324

325

326

327

328

329

330

331

332

333

334

335

336

337

338

339

340

341

Другие примеры пептидных агонистов, имеющих активность глюкагоноподобного пептида-1, описаны в патенте США № 6528486 и включают, например,

Н-Н13-С1у-С1и-С1у-Т11г-РКе-ТЬг-8ег-А5р-Ьеи-8ег-Суз-С1п-Ме1-<31и-<31и-О1и- 37 011351

А(а-Уа1-Агд-йеи-РЬе-11е-61и-Тгр-1.еи-1у8-А5п-е1у-(Э1у-Рго-8ег-8ег-61у-А1а-Рго-Рго5ег-(йу8)б-ЫН₂ (8Е0 Ю N0; 342), Н-1_у5₆-Н|$-1Э1у- С!и-С1у-Тпг-Рйе-Т11Г-Зег-А8р-йеи8ег-Ьу8-<31п-Ме(-0)и-<31и-01и-А1аЛ/а1-Агд-кеи-Р11е-11е-0)и-Тгр-!.еи-1_у8-Азп-01у-61уРго-8ег-8ег-С51у-А1а-Рго-Рго-8ег-(1_уз)₆-Ь1Н2 (8Е<2 Ю N0: 343), Н-Н|8-С1у-С1и-61у-ТЬгРйе-ТКг-8ег-А8р-йеи-8ег-1_уз-С1п-Мей(31и-О1и-О1и-А1а-\/а1-Агд-йеи-РЬе-11е-<31и-Тгр-

1-еи-Тгр-1.еи-1-у5-А8п-61у-е1у-Рго-8ег-8ег-61у-А1а-8ег- ΝΗ₂ (8Е0 Ю N0: 344), Н-йуэйу8-йу8-йу8-1у8-йу8-Н1з-С1у-С1а-<31у-Тпг-РКе-ТЬг-8ег-А8р-йеи-Зег-йу8-61п-Ме1-С1и61и-С1и-А1а-\/а1-Агд-йеи-РЬе-11е-С1и-Тгр-йеи-1у8-А8п-61у-61у-Рго-Зег-5ег-О1у-А1а8θγ-ΝΗ₂ (8Е0 Ю N0: 345), Н-А8п-С1и-С1и-С1и-С1и-61и-Н|8-61у-С1и-С1у-Тпг-Рйе-ТЬг5ег-Азр-йеи-5ег-йуз-С1п-Ме(-61и-01и-С1и-А1а-\/а1-Агд-йеи-РНе-11е-61и-Тгр-йеи-йу8А8п-О1у-О1у-Рго-Зег-Зег-61у-А1а-Зег-МН₂ (3ΕΩ Ю N0: 346),Н-Н|3-61у-<Э1и-О1у-ТИгРпе-ТИг-8ег-А8р-йеи-8ег-йуз-61п-Ме1-С1и-С1и-С1и-А1а-Уа1-Агд-йеи-Рпе-11е-01и-Тгр1_еи-йу8-А8п-О1у-О1у-Рго-8ег-8ег-О1у-А1а-8ег-(1-у8)б-МН₂ (8Е0 Ю N0: 347), Н-(йу8)вН|8-С1у-С1и-01у-Тпг-Рпе-Тпг-8ег-А8р-йеи-8ег-йуз-61п-Ме1-С1и-С1и-С1и-А1а-\/а1-Агдйеи-РГ|е-11е-С1и-Тгр-йеи-йуз-Азп-С1у-<31у-Рго-8ег-Зег-С1у-А1а-Зег-(йу8)₆-МН₂ (8Е0 Ю N0: 348), и Н-А8р-О1и-О1и-С1и-С1и-С1и-Н18-61у-<31и-С1у-ТЬг-Р11е-ТТ|г-8ег-А8р-1.еи-Зегйуз-01п-Ме1-С1и-С1и-61и-А1аЛ/а1-Агд-йеи-РНе-11е-01и-Тгр-йеи-йуз-А8п-01у-С1у-РгоЗег-Зег-е1у-А1а-Зег-(йу5)б-МН₂ (8ΕΩ ГО ΝΟ: 349);

Во всех сокращениях аминокислот используются известные и общепринятые формы: фениланин Рйс или Р; лейцин - Ьеи или Ь; изолейцин - Не или I; метионин - Мс1 или М; валин - Vа1 или V; серин §ег или §; пролин - Рго или Р; треонини - Тйг или Т; аланин - А1а или А; тирозин - Туг или Υ; гистидин Н18 или Н; глютамин - Οίη или О; аспарагин - Αδη или Ν; лизин - Ьуз или К; аспарагиновая кислота Ас1б Азр или Ό; глютаминовая кислота - С1и или Е; цистин - Суз или С; триптофан - Тгр или ^; аргинин - Агд или К и глицин - 01у или Ο. Ацетилированные пептиды имеют префикс Ас.

Настоящее изобретение также включает фармацевтические препараты, содержащие конъюгат в соответствии с настоящим изобретением в сочетании с фармацевтическим наполнителем. В целом, конъюгат сам по себе находится в твердой форме (например, осадок), к которому может быть добавлен приемлемый фармацевтический наполнитель, имеющий либо твердую, либо жидкую форму.

Иллюстративные наполнители включают без ограничений наполнители, выбранные из группы, состоящей из карбогидратов, неорганических солей, антимикробных средств, антиоксидантов, поверхностно активных веществ, буферных веществ, кислот, оснований и их сочетаний.

Углевод, такой как сахар, производный сахар, например альдит, альдоновая кислота, эстерифицированный сахар и(или) сахарный полимер, могут присутствовать в качестве наполнителей. Определенные углеводные наполнители включают, например: моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Ό-манноза, сорбоза и т.п; дисахариды, такие как лактоза, сукроза, трегалоза, целабиоза и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюкоцит), пиранозил сорбит, миоинозит и т. п.

Наполнитель также может включать неорганическую соль или буферное вещество, такое как лимонная кислота, хлористый натрий, хлористый калий, натриевый сульфат, азотно-кислый калий, одноосновный фосфорно-кислый натрий, двухосновный фосфорно-кислый натрий и их сочетания.

Препараты также могут включать антимикробное вещество для предотвращения или сдерживания роста микробов. Неограничивающие примеры антимикробных веществ, приемлемых для настоящего изобретения, включают бензалькониум хлорид, бензетониум хлорид, бензиловый спирт, цетилпиридиниум хлорид, хлорбутанол, фенол, фенилэтиловый спирт, фенилртуть нитрат, тимерсол и их сочетания.

В препарате также может присутствовать антиоксидант. Антиоксиданты используются для предотвращения окисления, тем самым предотвращая разрушение конъюгата или других компонентов препарата. Приемлемые антиокисданты для использования в настоящем изобретении включают, например, аскорбиловый пальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, фосфорноватистую кислоту, монотиоглицерин, пропил галлиевокислый, натриевый бисульфит, натриевый формальдегид сульфоксилат, натриевый метабисульфит и их сочетания.

В наполнителях могут присутствовать ПАВ. Примерные ПАВ включают полисорбаты, например Т\уссп 20 и Т\уссп 80, и плуроники, такие как Р68 и Р88 (оба поставляются компанией «БАСФ», Маунт Олиф, шт. Нью-Джерси); сорбитан эфира; липиды, такие как фосфолипиды, например летицин и другие фосфатдилхолины, фосфатидиэтаноламины (хотя предпочтительно не в липосомальной форме), жирные кислоты и жирные эфиры; стероиды, такие как холестерин; и агенты для образования хелатных соединений, например этилендиаминтетрауксусная кислота, цинковые и другие такие подходящие катионы.

- 38 011351

Кислоты или основания могут присутствовать в препарате в качестве наполнителя. Неограничивающие примеры кислот, которые могут быть использованы, включают кислоты, выбранные из групп, состоящих из соляной кислоты, уксусной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, молочной кислоты, муравьиной кислоты, трихлоруксусной кислоты, азотной кислоты, хлорной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, фумаровой кислоты и их сочетаний. Примеры подходящих оснований включают, без ограничения, основания, выбранные из группы, состоящей из гидрохлорида натрия, уксусно-кислого натрия, гидроксида аммония, гидроокиси калия, уксусно-кислого аммония, уксусно-кислого калия, фосфорно-кислого натрия, фосфорно-кислого калия, лимонно-кислого натрия, муравьино-кислого натрия, натриевого сульфата, сульфата калия, фурмерата калия и их сочетаний.

Фармацевтические препараты охватывают все типы рецептур, в частности рецептуры, приемлемые для инъекций. Например, порошки, которые могут быть ресуспендированы, а также суспензии и растворы. Количество конъюгата (т.е. конъюгат, сформированный между активным агентом и полимером, описанном в данном изобретении) в составе будет изменяться в зависимости от ряда факторов, но оптимально будет являться терапевтически эффективной дозой при хранении состава в контейнере для единичной дозы (например, ампуле). Кроме того, фармацевтический препарат может быть помещен в шприц. Терапевтически эффективная доза может быть определена экспериментально путем повторного назначения увеличивающихся количеств конъюгата с целью определения того, какое количество позволяет достичь клинически требуемой конечной точки.

Количество любого индивидуального наполнителя в составе будет зависеть от активности наполнителя и специфических потребностей состава. Как правило, оптимальное количество индивидуального наполнителя определяется экспериментально, т.е. путем получения составов, содержащих различные количества наполнителя (в диапазоне от небольшого до значительного количества), изучения устойчивости и иных параметров и дальнейшего определения диапазона, в рамках которого достигается оптимальная эффективность без значительных негативных эффектов.

Тем не менее, в целом, наполнитель будет присутствовать в составе в количестве приблизительно от 1 до 99 вес.%, предпочтительно от 5 до 98 вес.%, более предпочтительно приблизительно от 15 до 95 вес.% наполнителя, при этом наиболее предпочтительными являются концентрации менее 30 вес.%.

Вышеуказанные фармацевтические наполнители вместе с другими наполнителями описываются в Кеттдоп: ТЬе 8с1епсе & Ргасбсе оГ РЬагтасу, 19⁴¹¹ еб., УДНатз & ХУИНат^ (1995), 1Ье РЬущщап'к Бекк КеГегепсе, 52^пб еб., Меб1са1 Есопоткк, Мопйак, N1 (1998), и К1ЬЬе, А. Н., НпЬоок оГ РЬагтасеибса1 Ехс1р1еп18, 3^гб ЕбШоп, Атепсап РЬагтасеибса1 Аккоаабоп, ХУаЧипЦоп, Б.С., 2000.

Фармацевтические препараты в соответствии с настоящим изобретением, как правило, хотя не обязательно, вводятся путем инъекции, и, в целом, таким образом, они представляют собой растворы или суспензии жидкости непосредственно перед введением. Фармацевтические препараты также могут быть получены в других формах, таких как сиропы, кремы, мази, таблетки, порошки и т. п. Также предусматриваются другие способы введения, например пульмонально, ректально, чрезкожно, через слизистую оболочку, орально, внутриоболочечно, подкожно, внутриартериально и т.д.

Как описывалось выше, конъюгаты могут вводиться парентерально путем внутривенной инъекции, или, что менее предпочтительно, путем внутримышечной или подкожной инъекции. Приемлемые типы рецептур для парентерального введения включают растворы, готовые для инъекции, сухие порошки для комбинации с растворителем до использования, суспензии, готовые для инъекции, сухие нерастворимые составы для комбинации с наполнителем до применения, эмульсии и концентраты жидкостей для разбавления перед введением и т. д.

В изобретении также предлагается способ введения конъюгата пациенту в соответствии с описанием, страдающему от состояния, реагирующего на лечение конъюгатом. Способ включает введение в целом путем инъекций терапевтически эффективного количества конъюгата (предпочтительно включенного как часть фармацевтического препарата). Способ введения может быть использован для лечения любого состояния, которое можно излечить или предупредить путем введения конкретного конъюгата. Специалистам в данной области должно быть очевидно, какие состояния могут быть эффективно излечены конкретным конъюгатом. Фактически вводимая доза будет изменяться в зависимости от возраста, веса и общего состояния пациента, а также остроты состояния, подлежащего лечению, решения врачапрофессионала и вводимого конъюгата. Терапевтически эффективные количества известны специалистам в данной области техники и(или) описаны в соответствующих ссылочных текстах и литературе. В целом, терапевтически эффективное количество будет находиться в пределах от приблизительно 0,001 до 100 мг, предпочтительно в дозах от 0,01 до 75 мг/день и наиболее предпочтительно в дозах от 0,10 до 50 мг/день.

Разовая доза любого данного конъюгата (входящего предпочтительно в виде части фармацевтического препарата) может быть введена в соответствии с различными схемами применения лекарственного средства в зависимости от решения врача, нужд пациента и т. д. Конкретная схема применения лекарственного средства известна специалистам в данной области или может быть определена экспериментально с использованием стандартных способов. Иллюстративные схемы применения лекарственного средства включают, без ограничений, введение пять раз в день, четыре раза в день, три раза в день, дважды в

- 39 011351 день, один раз в день, три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, два раза в месяц, один раз в месяц и их любые сочетания. После достижения клинической конечной точки дозирование состава прекращается.

Одно преимущество введения конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением заключается в том, что отдельные части водорастворимого полимера могут быть отщеплены. Это создает преимущество, когда выведение из организма является потенциальной проблемой ввиду размера полимера. Оптимально расщепление каждой части водорастворимого полимера ускоряется за счет использования физиологически расщепляемых и(или) ферментно деструктурируемых связей, таких как уретан-, амид-, карбонат- или эфирсодержащих связей. Таким образом, выведение конъюгата (путем расщепления отдельных частей водорастворимого полимера) может быть модулировано путем выбора размера полимерных молекул и типа функциональной группы, которые обеспечили бы требуемые свойства выведения из организма. Специалисты в данной области могут определить соответствующий молекулярный размер полимера, а также расщепляемую функциональную группу. Например, специалисты в данной области техники, использующие стандартные эксперименты, могут определить правильный молекулярный размер и отщепляемую функциональную группу, во-первых, путем получения разнообразных производных полимера с различными полимерными весами и отщепляемыми функциональными группами и, вовторых, путем получения профиля выведения (например, путем периодического взятия образцов крови и мочи), вводя производное полимера пациенту и периодически проводя анализ крови и(или) мочи. После получения ряда профилей выведения из организма в отношении каждого протестированного конъюгата может быть определен приемлемый конъюгат.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что, несмотря на то, что изобретение было описано со ссылками на его конкретные предпочтительные варианты осуществления, вышеприведенное описание, а также примеры, приведенные ниже, предназначены для иллюстрирования, а не для ограничения объема изобретения. Другие особенности, преимущества, модификации, не выходящие за пределы его объема, очевидны для специалиста в данной области техники, к которой оно относится.

Все статьи, книги, патенты, патентные заявки и публикации, на которые дается ссылка в настоящем описании, настоящим полностью включены как ссылки.

Экспериментальное использование изобретения

Практическое использование изобретения предусматривает, если не указано иное, применение известных способов органического синтеза и аналогичных способов в рамках данной области техники. Пояснение таких способов полностью изложено в литературе. См., например, 1. МагсЬ, Абуапсеб Огдашс СЬетЦйу: Веасбопк МесЬатктк и §1гис!иге, 4!Ь Еб. (Νονν Уогк: ^Пеу-Шегкаепсе, 1992), кирга.

В нижеприведенных примерах были предприняты меры для обеспечения точности в отношении используемых значений (например, количество, температура и т. д.), однако, следует принимать во внимание некоторую экспериментальную ошибку и отклонение. Если не указано иное, значения температуры приведены в °С, а значения давления - при атмосферном давлении на уровне моря. Если не указано иное, все реагенты были получены промышленным способом. Нижеприведенные аббревиатуры используются в примерах и в описании настоящего изобретения.

Пример 1. Получение молекулы предшественника на основе глицерина.

Молекула предшественника на основе глицерина (соединение 8-02).

Раствор цис-1,3-О-бензилиденглицерола (7,2 г, 0,040 моль) (§1дта-А1бпсЬ Согрогабоп, §!. Ьошк, МО) в толуоле (100 мл) азеотропно высушивали путем отгонки толуола. Высушенное соединение растворяли в безводном толуоле (100 мл), добавляли 1,0М раствор трет-бутоксида калия в третичном бутаноле (60 мл, 0,060 моль) и 1-(3-бромопропил)-4-метил-2,6,7-триоксабицикло[2,2,2]октана (140 г, 0,0558 моль) и смесь перемешивали в течение ночи при 100°С в атмосфере аргона. Смесь отфильтровывали и отгоняли растворитель при пониженном давлении, в результате чего был получен твердый продукт в количестве 15,7 г (соединение 5-02). ЯМР (б₆-ЭМ8О): 0,74 млн^-1 (к, 3Н), 1,61 млн^-1 (т, 4Н), 1,88 млн^-1 (т, 2Н), 3,44 мли^-1 (!, 2Н), 3,81 млн^-1 (к, 6Н), 4,05 мли^-1 (т, 4Н), 5,55 млн^-1 (к, 1Н), 7,37 млн^-1 (т, 5Н).

Схематически реакция представлена следующим образом:

цис-1,3-О-,бензил- 1-(3-бромопропил)-4-метил- Соединение 5-02 иденглицерол 2,6,7-(триоксабицило[2,2,2]октан

Гидролиз 5-02. Соединение 5-02 (15 г) растворяли в смеси ацетонитрила (150 мл) и дистиллированной воды (35 мл). Далее добавляли 10% раствор Н₃РО₄ для доведения рН до 4,5. Смесь перемешивали в

- 40 011351 течение 1 ч при рН 4,5.

ЫаС1 (2 г) добавляли и рН регулировали до 7,5. Продукт экстрагировали СН₂С1₂ (600 и 150 мл).

Экстракт высушивали (над Мд8О₄) и растворитель отгоняли при пониженном давлении для получения твердого продукта (соединение 6-02). Выход составлял 14,2 г.

ЯМР (с1..-1)\18О): 0,78 млн^-1 (к, 3Н), 1,79 млн^-1 (т, 2Н), 2,41 млн^-1 (ί, 2Н), 3,25 млн^-1 (т, 6Н), 3,49 млн^-1 (ί, 2Н), 4,05 млн^-1 (т, 4Н), 4,48 млн^-1 (ί, 3Н), 5,56 млн^-1 (к, 1Н), 7,37 млн^-1 (т, 5Н).

Схематически реакция представлена следующим образом:

Соединение 6-02 (14,2 г) растворяли в смеси ацетонитрила (80 мл) и дистиллированной воды (80 мл). Далее добавляли 6% раствор ЫаОН для доведения рН до 12,5. Раствор перемешивали в течение 5,5 ч при рН в диапазоне от 12,3 до 12,8, который поддерживался путем периодического добавления 6% раствора №1ОН. Добавляли ЫаС1 (5 г) и рН регулировали до 7,5 с помощью 5% раствора Н₃РО₄. Некислотные примеси экстрагировали СН₂С1₂ (две обработки, первая - с использованием 300 мл и вторая - с использованием 200 мл). рН раствора доводили до 3 Н3РО4 и продукт экстрагировали СН2С12 (две обработки, первая - с использованием 200 мл и вторая - с использованием 100 мл). Экстракт высушивали (над Мд8О₄) и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Полученный продукт (соединение 7-02) имел выход 8,7 г. ЯМР (б₆-ЭМ8О): 1,76 млн^-1 (т, 2Н), 2,31 млн^-1 (ί, 2Н), 3,46 млн^-1 (ί, 2Н), 4,05 млн^-1 (т, 4Н), 5,56 млн^-1 (к, 1Н), 7,37 млн^-1 (т, 5Н).

Схематически реакция представлена следующим образом:

--СНХ-Л

Соединение 6-02 Соединение 7-02 О

Соединение 7-02 (8,0 г) растворяли в безводном метаноле (120 мл) и после растворения добавляли концентрированную Н₂8О₄ (1,6 мл). Раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. ЫаНСО₃ (8% раствор) добавляли для доведения смеси до 7,5. Продукт экстрагировали СН₂С1₂ (две обработки, каждая с использованием 100 мл).

Экстракт высушивали (над Мд8О₄) и летучие соединения отгоняли при пониженном давлении (0,05 мм Нд) при 60°С. Полученный продукт (соединение 8-02) имел выход 4,8 г. ЯМР (й₆-ЭМ8О):1,72 млн^-1 (т, 2Н), 2,37 млн^-1 (ί, 2Н), 3,20 млн^-1 (т, 1Н), 3,42 млн^-1 (Ьт, 4Н), 3,49 млн^-1 (ί, 2Н), 3,59 млн^-1 (к, 3Н), 4,46 млн^-1 (ί, 2Н).

Схематически реакция представлена следующим образом:

Пример 2. Получение тПЭГ2(_40К) бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидный эфир гок-Н-С-О—СН_а О Ч.

ϊ I ° т глкг'й^-'С^—о—сн₂ (в котором тПЭГ(20К) обозначает ПЭГ, имеющий молекулярную массу 20000 Да) тПЭГ2(40К)-бутановая кислота, Ν-гидроксисукцинимидный эфир.

Активация гидроксильных групп в молекуле предшественника.

Соединение 8-02 (2,0 г, 0,0208 экв.) растворяли в безводном ацетонитриле (50 мл) и добавляли безводный пиридин (2,2 мл, 0,272 моль) и Ν,Ν-дисукцинимидилкарбонат (5,86 г, 0,0229 моль, Э8С). Раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Далее смесь фильтровали и растворитель отгоняли. Сырой продукт растворяли в СН2С12 (50 мл) и промывали 5% раствором Н3РО4. Раствор далее высушивали (над Мд8О₄) и растворитель отгоняли. Полученный продукт (соединение 902) имел выход 2,8 г. ЯМР (б₆-ЭМ8О): 1,76 млн^-1 (т, 2Н), 2,35 млн^-1 (ί, 2Н), 2,82 млн^-1 (к, 8Н), 3,56 млн^-1

- 41 011351 (ΐ, 2Н), 3,58 млн^-1 (8, 3Н), 3,96 млн^-1 (т, 1Н), 4,37 млн^-1 (т, 2Н), 4,52 млн^-1 (т, 2Н). Схематически реакция представлена следующим образом:

Соединение активированного предшественника с аминсодержащим водорастворимым полимером.

К смеси тПЭГ(_20К)-амин (11 г, 0,00055 моль) (№к!аг ТНегареиНсх. Нип1этШе, АЬ), ацетонитрила (70 мл) и триэтиламина (0,15 мл) добавляли соединение 9-02 (0,119 г, 0,00050 экв.). Смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Далее растворитель отгоняли при пониженном давлении.

Схематически реакция представлена следующим образом:

Этап удаления защиты и хроматографическая очистка ПЭГ2(40К)-бутановой кислоты.

Полученное соединение 10-2 (в данном тексте именуемое как ПЭГ2(40К)-бутановая кислота, метиловый эфир) растворяли в 150 мл дистиллированной воды и рН раствора доводили до 12,2 с помощью 5% раствора ЫаОН. Раствор перемешивали в течение 1,5 ч при рН в диапазоне 12,0-12,2. Далее добавляли №01 (10 г) и рН регулировали до 2,5 с помощью 5% раствора Н₃РО₄. Продукт экстрагировали путем обработки СН₂С1₂. Экстракт высушивали (над Мд§О₄) и растворитель отгоняли при пониженном давлении, получая 9 г твердого продукта. Ионно-обменная хроматография: ПЭГ2(_40К)-бутановая кислота 85%, тПЭГ(20К)амин 10%. Продукт очищали путем ионно-обменной хроматографии в соответствии с описанием в патенте США № 5932462, получая продукт 100% степени чистоты. ЯМР (б₆-ЬМ5>О): 1,72 млн^-1 (ц, 2Н), 2,24 млн^-1 (ΐ, 2Н), 3,24 млн^-1 (8, 6Н), 3,51 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 3,99 млн^-1 (т, 4Н), 7,19 млн^-1 (ΐ, 2Н).

Схематически реакция представлена следующим образом:

тПЭГ2₍₂ок) бутановая кислота, метиловый эфир тПЭГ2₍4₀к) бутановая кислота тПЭГ2(40К)-бутановая кислота может быть использована в качестве полимерного реагента в реакциях для получения конъюгатов полимер-активный агент. Кроме того, тПЭГ2(40К)-бутановая кислота может далее вступать в реакцию с целью получения полимерных реагентов, имеющих функциональные группы, отличающиеся от карбоновой кислоты. Например, ниже описано получение соответствующего Ν-гидроксисукцинимидного эфира тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, а также альдегидных, малеимидных и тиольных производных.

Получение тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты. Ν-гидроксисукцинимидного эфира.

О н » „ т РЕО( 2о_К)—Ν—С—О—Сн_г О О „ г ί тРЕО( гою—N—С—О—ОНг

- 42 011351 тПЭГ2(4ок)-бутановую кислоту (9,0 г, 0,000225 моль) (полученную в соответствии с вышеприведенным описанием) растворяли в безводном дихлорметане (70 мл) и добавляли Ν-гидроксисукцинимид (0,0285 г, 0,000248 моль) и 1,3-дицилокарбоимид (0,0510 г, 0,000247 моль). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Далее часть растворителя отгоняли при пониженном давлении и продукт осаждали с помощью изопропилового спирта при комнатной температуре и высушивали в вакууме, получая 8,6 г белого порошка. ЯМР (6₆-ЭМ8О): 1,81 млн^-1 (с.|. 2Н), 2,70 млн^-1 (ί, 2Н), 2,81 млн^-1 (к, 4Н), 3,24 млн^-1 (8, 6Н), 3,51 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 3,99 млн^-1 (т, 4Н), 7,22 млн^-1 (ί, 2Н).

Пример 3. Получение тПЭГ2(_40К)-бугиральдегида.

Получение тетра(этиленгликоля) монобутиральдегида, диэтилацеталя.

НО-(СН2СН_гО)4СН2(СН_г)2-СН(ОСН_гСН_г)2

Смесь тетра(этиленгликоля) (97,1 г, 0,500 моль) и толуола (200 мл) азеотропно высушивали путем отгонки толуола при пониженном давлении (роторный испаритель). Высушенный тетра(этиленгликоль) растворяли в безводном толуоле (180 мл) и добавляли 1,0М раствор трет-бутоксида калия в третичном бутаноле (120,0 мл, 0,120 моль) и 4-хлорбутиральдегид диэтилацеталя (18,1 г, 0,100 моль) (ЛИа Аекаг, \Уаг6 НШ, МА). Смесь перемешивалась при температуре 95-100°С в течение ночи в атмосфере аргона. После охлаждения до комнатной температуры смесь была отфильтрована, и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Сырой продукт растворяли в 1000 мл деионизированной воды и полученный раствор фильтровали через активированный уголь. Добавляли хлорид натрия (100 г) и продукт экстрагировали с помощью дихлорметана (250, 200 и 150 мл). Экстракт высушивали (над Мд§О₄) и растворитель отгоняли при пониженном давлении (роторное выпаривание).

Сырой продукт растворяли в 300 мл 10% фосфатного буферного раствора (рН 7,5) и примеси экстрагировали с помощью этилацетата (2x50 мл). Полученный продукт экстрагировали с помощью дихлорметана (200, 150 и 100мл). Экстракт высушивали (над Мд§О₄) и растворитель отгоняли при пониженном давлении (путем роторного выпаривания). Выход: 20,3 г. ЯМР (6₆-ЭМ8О): 1,10 млн^-1 (ί, СН3-С-), 1,51 млн^-1 (т, С-СН2-СН₂-), 3,49 млн^-1 (Ьт,-ОСН₂СН₂О-), 4,46 млн^-1 (ί, -СН, ацеталь), 4,58 млн^-1 (ί, -ОН). Степень чистоты: ~100% (отсутствие признаков непрогреагировавших начальных материалов).

Получение тетра(этиленгликоля)-а-мезилат-ш -бутиральдегида, диэтилацеталя.

СНз-8(О)2-О-(СН₂СН₂О)4СН2(СН₂)₂-СН(ОСН₂СН2)2

Смесь тетра(этиленгликоля)монобутиральдегида, диэтилацеталя (12,5 г, 0,037 моль) и толуола (120 мл) азеотропно высушивали путем отгонки толуола при пониженном давлении (роторный испаритель). Высушенный тетра(этиленгликоль)монобутируральдегид, диэтилацеталь растворяли в безводном толуоле (100 мл). К раствору добавляли 20 мл безводного дихлорметана и 5,7 мл триэтиламина (0,041 моль). Далее покапельно добавляли 4,5 г метансульфонилхлорида (0,039 моль). Раствор перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Далее добавляли карбонат натрия (5 г), смесь перемешивали в течение 1 ч. Раствор затем фильтровали и растворители отгоняли при пониженном давлении (роторный испаритель). ЯМР (6₆-ЭМ8О): 1,10 млн^-1 (ί, СН3-С-), 1,51 млн^-1 (т, С-СН2-СН₂-), 3,17 млн^-1 (8, СН3-метансульфонат), 3,49 млн^-1 (Ьт, -ОСН2СН₂О-), 4,30 млн^-1 (т, -СН₂-метансульфонат), 4,46 млн^-1 (ί, -СН, ацеталь). Степень чистоты: ~100%.

Тетра(этиленгликоль)-а-амино-ш -бутиральдегид, диэтилацеталь.

Η₂Ν- (СН2СН₂О)₄СН₂(СН₂)₂-СН(ОСН₂СН₂)₂

Смесь тетра(этиленгликоля)-а-мезилат-ш-бутиральдегида, диэтилацеталя (14,0 г) концентрированного гидроксида аммония (650 мл) и этилового спирта (60 мл) перемешивали в течение 42 ч при комнатной температуре. Далее все летучие вещества отгоняли при пониженном давлении. Сырой продукт растворяли в 150 мл деионизированной воды и рН раствора доводили до 12 с помощью раствора 1,0М №ОН. Продукт экстрагировали с помощью дихлорметана (3x100 мл). Экстракт высушивали (над Мд§О₄) и растворитель отгоняли при пониженном давлении (роторный испаритель). Выход 10,6 г. ЯМР (Б₂О): 1,09 млн^-1 (ί, СН3-С-), 1,56 млн^-1 (т, С-СН2-СН₂-), 2,69 млн^-1 (ί, СН2-Ц), 3,56 млн^-1 (Ьт, -ОСН2СН₂О-), 4,56 млн^-1 (ί, -СН, ацеталь). Степень чистоты: ~100%.

Разветвленный тПЭГ2 (40,3 КЭа)-бутиральдегид, диэтилацеталь.

О н и ш РЕО_{ и)К)-Н—С-О-СНг θ _о «клд, т РЕО(дак)—’ ’С-О-СН;,

К раствору тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира (пример 2) (5,0 г, 0,000125 моль) в метиленхлориде (100 мл) добавляли тетра(этиленгликоль)-а-амино-ш-бутиральдегид, диэтилацеталь (0,050 г, 0,000148 моль) и триэтиламин (0,035 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Растворитель выпаривали до сухого состояния с помощью роторного испарителя. Сырой продукт растворяли в метиленхлориде и осаждали изопропиловым спиртом. Влажный продукт высушивали при пониженном давлении. Выход 4,8 г. ЯМР

- 43 011351 (άβ-ΌΜδΘ): 1,10 млн^-1 (ΐ, 6Н), 1,51 млн^-1 (т, 4Н), 1,67 млн^-1 (т, 2Н), 2,12 млн^-1 (ΐ, 2Н), 3,12 млн^-1 (ц, 4Н), 3,24 млн^-1 (δ, 3Н), 3,51 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 3,99 млн^-1 (т, 4Н), 4,46 млн^-1 (ΐ, 1Н, ацеталь), 7,22 млн^-1 (ΐ, 2Н), 7,82 млн^-1 (ΐ, 1Н). Замещение: ~100%.

Разветвленный тПЭГ2(40,3 КЭа)-бутиральдегид.

УСН₂СН_гО)₄-СН₂СН₂СН₂Л-Н

Разветвленный ПЭГ2(40,3 КЭа)-бутиральдегид, диэтилацеталь (4,8 г) растворяли в 100 мл воды и рН раствора доводили до 3 разбавленной фосфорной кислотой. Раствор перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре, затем добавляли 0,5М гидроксида натрия, достаточного для доведения рН раствора до приблизительно 7. Продукт (разветвленный тПЭГ2(40,3 КЭа)-бутиральдегид) экстрагировали метиленхлоридом и экстракт высушивали сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Выход 4,2 г. ЯМР (ά₆-ΌΜ8Θ): 1,67 млн^-1 (т, 2Н), 1,76 млн^-1 (р,-СН2-СН2-СНО-, 2Н), 2,11 млн^-1 (ΐ, 2Н), 2,44 млн^-1 (Л,-СН2-СНО), 3,24 млн^-1 (8,-ОСН₃, 6Н), 3,51 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 3,99 млн^-1 (т, 4Н), 7,24 млн^-1 (ΐ, 2Н), 7,83 млн^-1 (ΐ, 1Н), 9,66 млн^-1 (ΐ,-СНО). Замещение: ~100%.

Пример 4. Получение тПЭГ2(_40К)-малеимида.

МН-(СН₂СН₂.'|МН-С-СН_;гСН_гн(

К раствору тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира (пример 2) (5,0 г, 0,000125 моль) в безводном ацетонитриле (100 мл) добавляли №(3-малеимидпропионамидо)этилендиамид в форме соли трифторуксусной кислоты (0,042 г, 0,000129 моль) и триэтиламин (0,050 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Растворитель выпаривали до сухого состояния с помощью роторного испарителя. Сырой продукт растворяли в небольшом количестве метиленхлорида и осаждали изопропиловым спиртом. Влажный продукт высушивали при пониженном давлении. Выход - 4,7 г. ЯМР (ά₆-ΌΜ8Ο): 1,69 млн^-1 (т, 2Н), 2,09 млн^-1 (ΐ, 2Н), 2,31 млн^-1 (ΐ, 2Н), 3,03 млн^-1 (с.|. 4Н), 3,12 млн^-1 (с.|. 4Н), 3,24 млн^-1 (8, 6Н), 3,51 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 3,99 млн^-1 (т, 4Н), 7,00 млн^-1 (8, 2Н, малеимид), 7,21 млн^-1 (ΐ, 2Н), 7,75 млн^-1 (ΐ, 1Н), 7,96 млн^-1 (ΐ, 1Н).

Пример 5. Получение тПЭГ2_(40К)-тиола.

К раствору тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира (пример 2) (5,0 г, 0,000125 моль) в метиленхлориде (50 мл) добавляли цистаминдигидрохлорид (0,0142 г, 0,000126 экв.) и триэтиламин (0,040 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Далее добавляли дитиотреитол (0,054 г, 0,000350 моль) и триэтиламин (0,25 мл) и смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Растворитель выпаривали до сухого состояния с помощью роторного испарителя. Сырой продукт растворяли в небольшом количестве метиленхлорида и осаждали изопропиловым спиртом. Влажный продукт высушивали при пониженном давлении. Выход - 4,8 г. ЯМР (СЭС1₃): 1,68 млн^-1 (т, -8Н, 1Н), 1,35 млн^-1 (ΐ, 2Н), 2,65 млн^-1 (ц,-СН₂8Н, 2Н), 3,15 млн^-1 (с.|. 6Н), 3,36 млн^-1 (8, 6Н), 3,65 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 4,15 млн^-1 (т, 4Н). Замещение: ~100%.

Пример 6. Получение тПЭГ(_60К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира с пентаэритритоловым линкером.

Получение соединения 1.04.

- 44 011351

Смесь пентаэтиритритола этоксилата (15/4 ЕО/ОН, Мп=797, §1дта-А1бпсЬ) (100 г, 0,125 моль) и толуола (200 мл) азеотропно высушивали путем отгонки толуола при пониженном давлении. Высушенный пентаэритритол этоксилат растворяли в безводном толуоле (150 мл) и добавляли 1,0М раствор третбутаксида калия в трет-бутаноле (30 мл, 0,03 моль) и 1-(3-бромопропил)-4-метил-2,6,7триоксабицикло[2,2,2]октана (6,3 г, 0,025 моль). Далее смесь перемешивали при 80-85°С в течение ночи в атмосфере аргона. После охлаждения до комнатной температуры смесь фильтровали и растворители отгоняли при пониженном давлении. Сырой продукт растворяли в 800 мл деионизированной воды. рН раствора доводили до 2 с помощью 5% фосфорной кислоты и раствор перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее рН изменяли до 12 с помощью 1М гидроксида натрия и раствор перемешивали в течение 2 ч, поддерживая рН на уровне 12 путем периодического добавления 1М гидроксида натрия. Добавляли хлорид натрия (40 г) и непрореагировавший пентаэритритол этоксалата экстрагировали дихлорметаном. Затем рН доводили до 3 с помощью 5% фосфорной кислоты и продукт экстрагировали дихлорметаном. Экстракт высушивали безводным сульфатом магния и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Выход - 15 г. ЯМР (б₆-ИМ8О): 1,72 млн^-1 (ц, 2Н), 2,24 млн^-1 (!, 2Н), 3,51 млн^-1 (к, 60Н), 4,57 млн^-1 (!, 3Н).

Получение соединение 2-04.

НО-(СНаСН_гО)_га—СНг

Η. Ϊ

НОфСНгСНгО)™ С—

НО-ССНгСНяО^— СН_г

Соединение 2-04

Соединение 1-04 (15 г, 0,017 моль) растворяли в безводном метаноле (300 мл) и добавляли концентрированную серную кислоту (4 мл). Раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуры. NаНСΟз (8% раствор) добавляли для доведения рН смеси до 7,5. Продукт экстрагировали СН₂С1₂. Экстракт высушивали (над Мд§О₄) и летучие соединения отгоняли при пониженном давлении. Выход - 13.5 г. ЯМР (б₆-ЭМ8О): 1,72 млн^-1 (ц, 2Н), 2,37 млн^-1 (!, 2Н), 3,51 млн^-1 (к, 60Н), 4,57 млн^-1 (!, 3Н).

Получение соединения 3-04.

- 45 011351

Соединение 2-04 (13,5 г, 0,0444 экв.) растворяли в безводном ацетонитриле (100 мл) и добавляли безводный пиридин (4,4 мл, 0,544 моль) и Ν,Ν-дисукцинимидил карбонта (12,40 г, 0,0484 моль). Раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Далее смесь фильтровали и растворитель отгоняли. Сырой продукт растворяли в СН₂С1₂ (200 мл) и промывали 5% раствором Н₃РО₄. Затем раствор высушивали (над Мд§О₄) и растворитель отгоняли. Выход - 16,5 г. ЯМР (ά₆ИМ8О): 1,72 млн^-1 (т, 2Н), 2,37 млн^-1 (ΐ, 2Н), 2,82 млн^-1 (8, 12Н), 3,50 млн^-1 (8, 48Н), 3,70 млн^-1 (т, 6Н), 4,45 (т, 6Н).

Получение соединения 4-04, (ПЭГ3(_60К)-бутановая кислота, метиловый эфир).

К смеси тПЭГ(20К)-амина (15 г, 0,00075 моль) (№к1аг 1ЪегареиЯс8, ΜπηΙ^νίΙΙο. ЛЬ), ацетонитрила (70 мл) и триэтиламина (0,15 мл) добавляли соединение 3-04 (0,259 г, 0,00060 экв.). Смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Далее растворитель отгоняли при пониженном давлении.

Этап удаления защиты и хроматографическая очистка ПЭГ3(_60К)-бутановой кислоты. Соединение 404 (именуемое в дальнейшем ПЭГ3(_60К)-бутановая кислота, метиловый эфир) растворяли в 150 мл дистиллированной воды и рН раствора доводили до 12,2 5% раствором №1ОН. Раствор перемешивали в течение 1,5 ч при рН в диапазоне 12,0-12,2. Далее добавляли №1С1 (10 г) и рН доводили до 2,5 5% раствором Н₃РО₄. Продукт экстрагировали путем обработки СН₂С1₂. Экстракт высушивали (над Мд§О₄) и растворитель отгоняли при пониженном давлении, получая 13,8 г твердого продукта. Ионно-обменная хроматография: ПЭГ3(_60К)-бутановая кислота 82%, М-ПЭГ(_20К)-амин 18%. Продукт очищали ионно-обменной хроматографией, описанной в патенте США № 5932462, и получали продукт 100% степени чистоты. ЯМР (й₆-ЭМ8О): 1,72 млн^-1 (ц, 2Н), 2,24 млн^-1 (ΐ, 2Н), 3,24 млн^-1 (8, 6Н), 3,51 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 3,99 млн^-1 (т, 6Н), 7,19 млн^-1 (ΐ, 3Н).

Получение тПЭГ3(_60К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира.

Полученную тПЭГ3(_60К)-бутановую кислоту (предыдущий этап) (9,0 г, 0,000225 моль) растворяли в безводном дихлорметане (70 мл) и добавляли Ν-гидроксисукцинимид (0,0285 г, 0,000248 моль) и 1,3дициклогексилкарбодиимид (0,0510 г, 0,000247 моль). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Далее часть растворителя отгоняли при пониженном давлении и продукт осаждали изопропиловым спиртом при комнатной температуре и высушивали в вакууме, при этом получали белый порошок весом 8,6 г. ЯМР (й₆-ЭМ8О): 1,81 млн^-1 (с.|. 2Н), 2,70 млн^-1 (ΐ, 2Н), 2,81 млн^-1 (8, 4Н), 3,24 млн^-1 (8, 6Н), 3,51 млн^-1 (8, ПЭГ основная цепь), 3,99 млн^-1 (т, 4Н), 7,22 млн^-1 (ΐ, 2Н).

Пример 7. Получение монофункционального тПЭГ.

Получают полимер в соответствии с изобретением, включающий единичный водорастворимый полимер. При получении используют процедуру примера 2 за тем исключением, что соединение 8-02 заменяют 3-гидроксипропионовой кислотой, метиловым эфиром.

3-Гидроксипропионовая кислота, метиловый эфир.

Полученное соединение (тПЭГ-пропионовая кислота, метиловый эфир) имеет следующую структуру^: й Ϊ ш РЕ<3( _2ОК)—N—С—О-х О с—отПЭГ(2ок)-пропионовая кислота, метиловый эфир тПЭГ(20К)-пропионовая кислота, метиловый эфир позволяют получить соответствующую карбоновую кислоту. Например, метиловый эфир может быть растворен в дистиллированной воде и рН доведен до приблизительно 12 с помощью раствора №ОН. Далее может быть добавлена соль, такая как хлорид натрия, и рН далее отрегулирован до приблизительно 3 с помощью приемлемой кислоты. Соответствующая карбоновая кислота (тПЭГ(20К)-пропионовая кислота) может быть экстрагирована путем обра

- 46 011351 ботки метиленхлоридом, высушена, и оставшийся растворитель отгоняют.

тПЭГ_(20К)-пропионовая кислота может быть использована в качестве полимерного реагента в реакциях для получения конъюгатов полимер-активный агент. Кроме того, тПЭГ_(20К)-пропионовая кислота может вступить в дальнейшую реакцию для получения полимерных реагентов, имеющих функциональные группы, отличающиеся от карбоновой кислоты. Например, при использовании ранее описанных способов могут быть получены соответствующие Ν-гидроксисукцинимидный эфир (см. пример 2), альдегид (см. пример 3), малеимид (см. пример 4) и тиоловые производные (см. пример 5) тПЭГ(_20К)пропионовой кислоты.

Пример 8. Получение гомобифункционального ПЭГ.

Получают гомобифункциональный полимер в соответствии с изобретением, включающий единичную часть водорастворимого полимера. Для получения используют процедуру примера 7 за тем исключением, что амин-тПЭГ(_20К)-амин замещают тПЭГ(_20К)-амином. Полученное соединение имеет следующую структуру:

—О тПЭГ(2ок)-пропионовая кислота, метиловый эфир (дифункциональный полимер) тПЭГ(20К)-дипропионовая кислота, метиловый эфир позволяют получить соответствующую дикарбоновую кислоту. Например, тПЭГ(20К)-дипропионовая кислота, метиловый эфир могут быть растворены в дистиллированной воде и рН доведен до приблизительно 12 с помощью раствора №1ОН. Далее может быть добавлена такая соль, как хлорид натрия, и затем рН может быть доведен приблизительно до 3 с помощью приемлемой кислоты. Соответствующая дикарбоновая кислота (тПЭГ_(20К)-дипропионовая кислота) может быть экстрагирована путем обработки метиленхлоридом, высушена, и оставшийся растворитель может быть отогнан.

тПЭГ(20К)-Дипропионовая кислота может быть использована в качестве полимерного реагента для проведения реакций с целью получения конъюгатов полимер-активный агент (включающих два активных агента). Кроме того, тПЭГ(20К)-дипропионовая кислота может вступать в дальнейшую реакцию для получения полимерных реагентов, имеющих функциональные группы, отличающиеся от карбоновой кислоты. Например, при использовании вышеописанных способов могут быть получены соответствующие ди-№гидроксисукцинимидный эфир (см. пример 2), диальдегид (см. пример 3), дималеимид (см. пример 4) и производные дитиола (см. пример 5) тПЭГ(20К)-пропионовой кислоты.

Пример 9. Конъюгация.

тПЭГ2_(40К)-малеимид (пример 4), имеющий сульфидрил селективную реактивную группу, вступает в реакцию с каждой из полипептидных последовательностей, указанных в 8Е0 Ш NО8. 1-349.

где т в вышеприведенной структуре составляет приблизительно 454 и/или молекулярная масса каждого водорастворимого полимера составляет приблизительно 20000 Да, благодаря чему получается реагент, имеющий молекулярную массу приблизительно 40000 Да.

В той степени, в какой у любого конкретного полипептида отсутствует сульфидрильная группа, (например, у полипептида отсутствует как остаток метионина, так и остаток цистеина), остаток метионина или цистеина может быть добавлен к полипептиду с использованием известных способов синтезирования. См., например, УО 90/12874.

Для каждого полипептида в реакционный сосуд, содержащий полипептид, добавляют избыток полимера. Условия проведения реакции включают рН от приблизительно 7 до приблизительно 8 при комнатной температуре. После приблизительно 5 ч получают конъюгат полипептида и полимера.

Пример 10. Многоветвистый полимер.

Многоветвистый полимер, включающий по меньшей мере одну реактивную группу, получают следующим способом.

экв. эфира карбоновой кислоты бис-(2,5-диоксопирролдин-1-ил) соединяли с метил-Эглюкопиранозидом в триэтиламине для получения первого промежуточного соединения, как показано ниже.

- 47 011351

Первое промежуточное соединение затем подвергают обработке небольшим избытком тПЭГ(1_0К)амина в присутствии триэтиламина для получения второго промежуточного соединения, как показано ниже.

тРЕО_(1(Ж>МН_г (небольшой избыток)

Второе промежуточное соединение

Второе промежуточное соединение затем подвергают кислотно-катализированному гидролизу для получения альдегидных и гемиацетальных форм, как показано ниже.

Альдегид состоит из трех 10К ПЭГов, тем самым обеспечивая общую 30К разветвленную структуру. В свою очередь, альдегид произвольно преобразуется в другие производные при образовании кислоты (например, карбоновая кислота образуется, когда альдегид подвергают мягким окислительным условиям).

Способ может быть использован для получения двух ветвей, а также четырех ветвей.

Во время проведения любой данной процедуры могут быть получены смеси веществ (например, дважды замещенные и некоторые четырежды замещенные). Кроме того, также возможно получение позиционных изомеров любого из полимеров.

Пример 11. Получение конъюгата полимер-эритропоиэтина (ЭПЭ)-произвольная пэгиляция ЭПЭ.

Рекомбинантный эритропоиэтин ЭПЭ (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или другом источнике) соединяют с разветвленным тПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

ЭПЭ (~2 мг) растворяли в 1 мл 50 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,6) и добавляли разветвленный ПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегид при 5Х молярной концентрации ЭПЭ. Добавляли восстанавливающий агент ΝηΟΝΒΠί и раствор перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре для присоединения реагента разветвленного ПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной свя зи.

Реакционную смесь анализировали с помощью 8Ό8-ΡΑΟΕ (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью время пролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (ΜΑΣΌΙ-ΤΟΕ). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. При увеличении соотношения реагент ПЭГ-протеин повышается степень конъюгации.

- 48 011351

Вышеприведенное демонстрирует произвольную ПЭГиляцию иллюстративного протеина в соответствии с изобретением для получения распределения ПЭГ илированных ЭПЭ продуктов. При необходимости можно провести дальнейшее разделение с целью выделения отдельных изомеров, как описано ниже.

ПЭГ конъюгаты, имеющие различную молекулярную массу, разделяют путем гель-фильтрационной хроматографии. Различные ПЭГ конъюгаты фракционируют, исходя из их различных молекулярных масс (в этом случае изменяющихся приблизительно на 40000 Да). В частности, разделение выполняют с помощью последовательной (серийной) колоночной системы, приемлемой для эффективного разделения продуктов в диапазоне наблюдаемых молекулярных весов, например, колонка 8ирег6ех™200 (АтегзЬат Вюзаенсез). Продукты элюируют 10 мл буферного раствора ацетата при расходе 1,5 мл/мин. Собранные фракции (1 мл) анализируют методом определения оптической плотности при 280 нм на содержание протеина, а также с помощью йодной пробы на содержание ПЭГ (811115 е1 а1. (1980) Апа1. ВюсЬет. 107:60-63). Кроме того, результаты могут быть визуализированы путем проведения гель-анализа (8Ό8 РАСЕ) с последующим окрашиванием (проявлением) йодистым барием. Фракции, соответствующие элюированным пикам, концентрируют путем ультрафильтрации с использованием мембраны и затем лиофилизуют. Этот способ обеспечивает проведение разделения/очистки конъюгатов, имеющих одни и те же молекулярные веса, но не обеспечивают разделение конъюгатов, имеющих один и тот же молекулярный вес, но различные центры пэгиляции (т.е. позиционные изомеры).

Разделение позиционных изомеров проводится путем хроматографии с обращенной фазой с использованием колонки ВР-НРЬС С18 (АтегзЬат Вюзаенсез или Уубас). Этот способ является эффективным для разделения изомеров ПЭГ-биомолекул, имеющих одну и ту же молекулярную массу (позиционные изомеры). Хроматография с обращенной фазой проводится с использованием препаративной колонки ВР-НРЬС С18 и элюируется градиентом воды/0,05% ТРА (элюент А) и ацетонитрила/0,05% ТРА (элюент В).

Фракции, соответствующие элюированным пикам, собирают, выпаривают с целью удаления ацетонитрила и ТРА с последующим удалением растворителя для выделения отдельных позиционных ПЭГизомеров.

Пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением для получения конъюгатов ЭПЭ (эритропоэтин).

Пример 12. Получение конъюгата полимер-ЭПЭ (эритропоэтин)-№концевая ПЭГиляция ЭПЭ.

Рекомбинантный эритропоэтин ЭПЭ (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетках яичника китайского хомяка, или другом источнике) соединяют с разветвленным тПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

ЭПЭ (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации ЭПЭ. Добавляли восстанавливающий агент NаСNВНз и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Реакционную смесь анализировали с помощью 8Э8-РАСЕ (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (МАЬЭ1-ТОР). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободных ЭПЭ (эритропоэтин) и видов с более высокой молекулярной массой.

Подтверждение Ν-концевой ПЭГиляции проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения ПЭГ-протеин повышается степень ПЭГиляции, в результате чего получают поликонъюгированный протеин.

Вышеизложенное показывает, что ПЭГиляция иллюстративного протеина в соответствии с изобретением позволяет получить, главным образом, Ν-концевой единичный ПЭГилированный протеин.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов ЭПЭ (эритропоэтин).

Пример 13. Ν-Концевое ПЭГилирование фактора, стимулирующего колонию гранулоцитов.

Рекомбинантный фактор, стимулирующий колонию гранулоцитов, СС8Р, (полученный в Е. со11, клетки млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или другой источник) соединяют с тПЭГ2(40 КЭа)-бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

6С8Р (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации СС8Р. Добавляли восстанавливающий агент NаСNВНз и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Реакционную смесь анализировали с помощью 8Э8-РАСЕ (проведение электрофореза в полиакри

- 49 011351 ламидном геле додецилсульфата натрия) с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного СС8Е. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободных СС8Е и видов с более высокой молекулярной массой. Подтверждение Ν-концевой ПЭГиляции проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения ПЭГ-протеин повышается степень ПЭГиляции, в результате чего получают поликонъюгированный протеин.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов СС8Е.

Пример 14. Ν-Концевое ПЭГилирование интерферона-α.

Рекомбинантный интерферон-α, ΙΡΝ-α (полученный в Е. сой, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или других источниках) соединяют с тПЭГ2(40 ЮЭа)бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

ΙΕΝ-α (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 ЮЭа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации ΙΕΝ-α. Добавляли восстанавливающий агент Ν;·ιΟΝΒΗ₃ и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Реакционную смесь анализировали с помощью 8Ό8-ΡΑ6Ε (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (ΜΑΌΌΙ-ΤΟΕ). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободного ΙΕΝ-α и видов с более высокой молекулярной массой. Подтверждение Ν-концевой ПЭГиляции проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения ПЭГ-протеин повышается степень ПЭГиляции, в результате чего получают поликонъюгированный ΙΕΝ-α.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов ΙΕΝ-α.

Пример 15. Ν-Концевое ПЭГилирование гормона роста человека.

Рекомбинантный гормон роста человека, 1СН (полученный в Е. со11, клетки млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или другой источник) соединяют с тПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

1СН (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации 1СН. Добавляли восстанавливающий агент при 5-20 кратном молярном избытке, NаСNΒН₃ и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КЭа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Протекание реакции анализировали с помощью 8Ό8-ΡΑΟΕ (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) или ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ масс-спектрометрии с целью определения степени конъюгации.

Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободного 1СН и видов с более высокой молекулярной массой. Подтверждение Ν-концевой конъюгации проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения ПЭГ2(40 КЭа)-бутиральдегид-протеин повышается степень конъюгации, в результате чего получают популяцию поликонъюгированного 1СН.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов 1СН.

Пример 16. Ν-Концевое ПЭГилирование интерферона-β.

Рекомбинантный интерферон-β, ΙΕΝ-β (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или других источниках) соединяют с тПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

ΙΕΝ-β (-2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КЭа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации ΙΕΝ-β. Добавляли восстанавливающий агент при 5-20кратном молярном избытке, NаСNΒН₃ и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2 (40 КЭа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Протекание реакции анализировали с помощью 8Ό8-ΡΑΟΕ (проведение электрофореза в полиакри

- 50 011351 ламидном геле додецилсульфата натрия) или ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ масс-спектрометрии с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободного ΙΕΝ-β и видов с более высокой молекулярной массой.

Подтверждение Ν-концевой ПЭГиляции проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения тПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегид-протеин повышается степень конъюгации, в результате чего получают популяцию поликонъюгированного ΙΕΝ-β.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов ΙΕΝ-β.

Пример 17. Ν-Концевое ПЭГилирование фолликулостимулирующего гормона (Ε8Η).

Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон, Ε8Η (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или других источниках) соединяют с тПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

Ε8Η (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетата натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КОа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации Ε8Η. Добавляли восстанавливающий агент при 5-20 кратном молярном избытке, Ναί.'ΝΒΗ₃ и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Протекание реакции анализировали с помощью 8Ό8-ΡΆΘΕ (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) или ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ масс-спектрометрии с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных других видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободного Ε8Η и видов с более высокой молекулярной массой. Подтверждение Ν-концевого ПЭГилирования проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения тПЭГ2(40 КОа)бутиральдегид-протеин повышается степень конъюгации, в результате чего получают популяцию поликонъюгированного Ε8Η.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов Ε8Η.

Пример 18. Ν-Концевое ПЭГилирование фактора УШ.

Рекомбинантный фактор УШ, Ε8 (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или других источниках) соединяют с тПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

Ε8 (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетата натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КОа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации Ε8. Добавляли восстанавливающий агент при 5-20кратном молярном избытке, №СХВШ и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Протекание реакции анализировали с помощью 8Ό8-ΡΆΘΕ (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) или ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ масс-спектрометрии с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (ΜΆΕΌΙ-ΤΘΕ). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободного Ε8 и видов с более высокой молекулярной массой. Подтверждение Ν-концевой ПЭГиляции проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения тПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегидпротеин повышается степень конъюгации, в результате чего получают популяцию поликонъюгированного Ε8.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов Ε8.

Пример 19. Ν-Концевое ПЭГилирование фактора УШ удаленного В домена.

Рекомбинантный фактор УШ удаленного В домена, ΒΌΌ Ε8 (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или других источниках) соединяют с тПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегидом (полученным в соответствии с процедурой примера 3).

ΒΌΌ Ε8 (~2мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КОа)бутиральдегид при 5Х молярной концентрации ΒΌΌ Ε8. Добавляли восстанавливающий агент при 5-20кратном молярном избытке, №СХВШ и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для

- 51 011351 присоединения реагента ПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Протекание реакции анализировали с помощью 8Ό8-ΡΆΟΕ (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) или МЛЬОВТОР масс-спектрометрии с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (МЛЬЭЬТОР). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободного ΒΌΌ Р8 и видов с более высокой молекулярной массой. Подтверждение Ν-концевой ПЭГиляции проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения тПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегидпротеин повышается степень конъюгации, в результате чего получают популяцию поликонъюгированного ΒΌΌ Р8.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов ΒΌΌ Р8.

Пример 20. ПЭГилирование фактора VIII с использованием тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Νгидроксисукцинимидного эфира.

Рекомбинантный фактор VIII, Р8 (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка или других источниках) соединяют с тПЭГ2(40 КОа)-бутановой кислотой, Ν-гидроксисуцинимидным эфиром (полученным в соответствии с процедурой примера 2).

Р8 растворяли в воде и добавляли тПЭГ2(_40К)-бутановую кислоту, Ν-гидроксисукцинимидный эфир, превышающие от одного до десяти раз молярную концентрацию Р8 для получения реакционного раствора. рН реакционного раствора регулировали в пределах приблизительно 8-9,5 и поддерживали его температуру в пределах комнатной температуры. Реакционный раствор перемешивали в течение нескольких часов для обеспечения присоединения полимерного реагента к Р8 с помощью амидной связи. После тестирования реакционного раствора было определено, что конъюгация произошла как на Νконце, так и на лизиновых центрах.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов Р8.

Пример 21. ПЭГилирование фактора VIII удаленного В-домена с использованием тПЭГ2(_40К)бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира.

Рекомбинантный фактор VIII удаленного В-домена, ΒΌΌ Р8 (полученный в Е. со11, клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, или другом источнике) соединяют с тПЭГ2(_40К)-бутановой кислотой, Ν-гидроксисуцинимидным эфиром (полученным в соответствии с процедурой примера 2).

ΒΌΌ Р8 растворяли в воде и добавляли тПЭГ2(_40К)-бутановую кислоту, Ν-гидроксисукцинимидный эфир, превышающие от одного до десяти раз молярную концентрацию Р8 для получения реакционного раствора. рН реакционного раствора регулировали в пределах приблизительно 8-9,5 и поддерживали его температуру в пределах комнатной температуры. Реакционный раствор перемешивали в течение нескольких часов для обеспечения присоединения полимерного реагента к ΒΌΌ Р8 с помощью амидной связи. После тестирования реакционного раствора было определено, что конъюгация произошла как на Ν-конце, так и на лизиновых центрах.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов ΒΌΌ Р8.

Пример 22. Ν-Концевое ПЭГилирование десмопрессина.

Десмопрессин присоединяют к тПЭГ2(40 КО а)-бутиральдегиду (полученному в соответствии с процедурой примера 3).

Десмопрессин (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегид при 5Х молярной концентрации десмопрессина ΒΏΏ Р8. Добавляли восстанавливающий агент при 5-20-кратном молярном избытке, NаСNΒНз и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КОа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Протекание реакции анализировали с помощью 8О8-РЛОЕ (проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия) или МЛЬОВТОР масс-спектрометрии с целью определения степени конъюгации. Подтверждение степени конъюгации проводилось с помощью времяпролетной масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (МЛЬОВТОР). Полученные пики для нативных и моноконъюгированных видов различаются приблизительно на 40000 Да. Полученная реакционная смесь, главным образом, содержит смесь нативного и моноконъюгированного протеина. Моноконъюгированные виды очищают путем колоночной хроматографии для удаления свободного десмопрессина и видов с более высокой молекулярной массой. Подтверждение Ν-концевой ПЭГиляции проводится путем пептидного картирования. При увеличении соотношения тПЭГ2(40 КОа)бутиральдегид-протеин повышается степень конъюгации, в результате чего получают популяцию поли

- 52 011351 конъюгированного десмопрессина.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов десмопрессина.

Пример 23. ПЭГилирование десмопрессина с использованием тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Νгидроксисукцинимидного эфира.

Десмопрессин присоединяют к тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидному эфиру (полученному в соответствии с процедурой примера 2).

Десмопрессин растворяли в воде и добавляли тПЭГ2(_40К)-бутановую кислоту, Νгидроксисукцинимидный эфир, превышающие от одного до десяти раз молярную концентрацию десмопрессина для получения реакционного раствора. рН реакционного раствора регулировали в пределах приблизительно 8-9,5 и поддерживали его температуру в пределах комнатной температуры. Реакционный раствор перемешивали в течение нескольких часов для обеспечения присоединения полимерного реагента к десмопрессину с помощью амидной связи. После тестирования реакционного раствора было определено, что произошла конъюгация.

Пример 24. ПЭГилирование амдоксивира (ΌΔΡΩ).

Амдоксивир (ΌΛΡΩ) присоединяют к тПЭГ2 (40 КЭа)-бутиральдегиду (полученному в соответствии с процедурой примера 2).

Амдоксивир (~2 мг) растворяли в 1 мл 0,1 мМ раствора ацетат натрия (рН 5) и добавляли ПЭГ2 (40 КИа)-бутиральдегид при 5Х молярной концентрации амдоксивира. Добавляли восстанавливающий агент при 5-20-кратном молярном избытке, NаСNВНз и раствор перемешивали в течение 24 ч при температуре 4°С для присоединения реагента ПЭГ2(40 КЭа)-бутиральдегида к протеину с помощью аминной связи.

Протекание реакции анализировали путем §^§-ΡΑ6Ε или МАЬПЬТОЕ масс-спектрометрии.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов амдоксивира.

Пример 25. ПЭГилирование амдоксивира (^ΑΡ^) с использованием тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира.

Амдоксивир (^ΑΡ^) присоединяют к тПЭГ2(_40К)-бутановой кислоты, Ν-гидроксисукцинимидному эфиру (полученному в соответствии с процедурой примера 2).

Амдоксивир растворяли в воде и добавляли тПЭГ2(_40К)-бутановую кислоту, Νгидроксисукцинимидный эфир, превышающие от одного до десяти раз молярную концентрацию амдоксивира для получения реакционного раствора. рН реакционного раствора регулировали в пределах приблизительно 8-9,5 и поддерживали его температуру в пределах комнатной температуры. Реакционный раствор перемешивали в течение нескольких часов для обеспечения присоединения полимерного реагента к амдоксивиру с помощью амидной связи. После тестирования реакционного раствора было определено, что произошла конъюгация.

Этот пример демонстрирует возможность использования полимерных реагентов в соответствии с изобретением при получении конъюгатов амдоксивира.

Claims (46)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ в¹ о

   1. Полимерный реагент, включающий часть ^_*^|_с расположенную между водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов, и реактивной группой, выбранной из группы, состоящей из гидроксила, ортоэфира, карбоната, ацеталя, альдегида, альдегидгидрата, кетона, винилкетона, кетонгидрата, тиона, монотиогидрата, дитиогидрата, гемикеталя, монотиокеталь гемикеталя, дитиогемикеталя, кеталя, дитиокеталя, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, сульфона, амина, гидразида, тиола, дисульфида, тиолгидрата, карбоновой кислоты, изоцианата, изотиоцианата, малеимида, сукцинимида, бензотриазола, винилсульфона, хлорэтилсульфона, дитиопиридина, винилпиридина, иодоацетамида, эпокида, глиоксалей, дионов, мезилатов, тозилатов, тиосульфонатов, тресилатов, силана, -(СН₂)_ГСО₂Н, -(СН₂)_£СО₂№, -(СН₂)_ГСО₂В!, -(СН₂)_ГСН(ОВ)₂, (СН₂)_ГСНО, -(СН₂)₂-МН₂, -(СН₂)_ГМ, -(СН₂)_г-8-8О₂-В, где г составляет 1-5, г' составляет 0-5, В - арил или алкил, Ν8 - Ν-сукцинимидил, В! - 1-бензотриазолил, а М - Ν-малеимидил, а также защищенные и активированные формы любого из вышеуказанных веществ, в котором:

   в’ о (ί) атом азота в части -н-с-о- является ближайшим к водорастворимому полимеру;

   в¹ о

   I к (ίί) карбонильный атом углерода части является ближайшим к реактивной группе;

   (ίίί) В¹ обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин «замещенный» относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С₃С8циклоалкил; фтор, хлор, бром, йод, циано, алкокси и фенил; и (ίν) полимерный реагент включает разветвляющую часть.

   - 53 011351
2. 2. Полимерный реагент по п.1, в котором К¹ обозначает Н.
3. 3. Полимерный реагент по п.2, в котором К¹ обозначает органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила.
4. 4. Полимерный реагент по п.2, в котором К¹ выбирают из группы, состоящей из метила, этила, нпропила, изопропила, н-бутила, втор-бутила, изобутила, трет-бутила, н-пентила, изопентила, неопентила, трет-пентила и пиперидонила.
5. 5. Полимерный реагент по п.1, в котором часть водорастворимого полимера представляет собой полиалкиленоксид.
6. 6. Полимерный реагент по п.5, в котором полиалкиленоксид представляет собой полиэтиленгликоль.
7. 7. Полимерный реагент по п.6, в котором полиэтиленгликоль блокирован на концах концевой блокирующей частью, выбранной из группы, состоящей из гидроксила и алкокси.
8. 8. Полимерный реагент по п.6, в котором полиэтиленгликоль блокирован на концах посредством метокси.
9. 9. Полимерный реагент по п.7, в котором полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 100 до 100000 Да.
10. 10. Полимерный реагент по п.9, в котором полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно от 1000 до 60000 Да.
11. 11. Полимерный реагент по п.10, в котором полиэтиленгликоль имеет номинальную среднюю молекулярную массу приблизительно от 2000 до 50000 Да.
12. 12. Полимерный реагент по п.1, в котором водорастворимый полимер является гомополимером.

    я¹ о

    I и
13. 13. Полимерный реагент по п.1, в котором атом азота части связан с водорастворимым по- лимером посредством прямой ковалентной связи.

    в¹ о
14. 14. Полимерный реагент по п.1, в котором атом азота части -н-с-олимером посредством первой спейсерной части.
15. 15. Полимерный реагент по п.1, включающий структуру связан с водорастворимым по где РОЬУ¹ - водорастворимый полимер;

    РОЬУ² - водорастворимый полимер; а - 0, 1, 2 или 3;

    Ь - 0, 1, 2 или 3;

    е - 0, 1, 2 или 3;

    Г¹ - 0, 1, 2 или 3;

    д' - 0, 1, 2 или 3;

    Ь - 0, 1, 2 или 3;

    ί - от 0 до 20;

    каждый К¹ обозначает независимо Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, ари ла и замещенного арила;

    X¹ - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;

    X² - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;

    X⁵ - если присутствует, обозначает пятую спейсерную часть;

    X⁶ - если присутствует, обозначает шестую спейсерную часть;

    X⁷ - если присутствует, обозначает седьмую спейсерную часть;

    X⁸ - если присутствует, обозначает восьмую спейсерную часть;

    К⁵ - разветвляющая часть и

    Ζ - реактивная группа.
16. 16. Полимерный реагент по п.15, в котором К⁵ выбирают из группы, состоящей из в которой р составляет от 1 до 8 и с.| составляет от 1 до 8,

    - 54 011351 в которой РОЬУ¹, X, а, с, О и Ζ - как определено выше.
17. 17. Полимерный реагент по п.15, включающий структуру

    Η^οοη^-ο^^ΙοΉ^ίοοΗϊςΗ^—ы-с-о-снг н ^гн I _нс—о.

    ίθ |

    Н^СнОСНгОу—О-С^СНг^ОСНгСНг)^—14-0-0-0¾ ^Ж н 'Н ¹ (Формула ί 1Ь) в которой т составляет от 2 до 4000, ί - от 0 до 6 и п - от 0 до 20.
18. 18. Полимерный реагент по п.17, в котором ί составляет от 2 до 4 и п составляет от 0 до 4.
19. 19. Полимерный реагент по п.1, включающий структуру, выбранную из группы, состоящей из

    О и

    НзС-(ОСНгСН_г)г- Ν-С-О-СНг

    Η IНг Н

    НС—О. -С. -СОН ί ΐXX

    П^ОСНгСНг)—Ν-С-О-СНг “ Н;

    оо

    Н₃С40СН₂СН_г)^-О-С-1Ч-{СН₂}-(ОСН_гСН_г^— Ν-С-О-СНг ^й * ^н НС—0. Д .и ? , 1? I X

    НзС^ОСНгСН^-О-СН^СНгЦОСНгСНг)—Ν-С-О-СНг ^т н ²н

    ОО

    НзС-СОСНгСН^-О-С-^оЦ-М-С-О-СНг ” н ^г н I НС—о. О ОI

    II с 1 ¹¹I

    НзСЧОСНгСНЛ-О-С-ИкНак Ν-С-О-СНг т Ц Ц I н ³ н н_г θ

    Нг Нг в которой каждый т составляет от 2 до 4000.
20. 20. Полимерный реагент по п.15, включающий структуру, выбранную из группы, состоящей из

    - 55 011351

    Н₃С-1

    Η₃σ-{ΟΟΗ₂ΟΚ,)“Ν-ϋ “ н

    НзСЧОонгСНг^^-м-е-о-сНг н ’

    Ϊ

    Н₃СЧОСН₂СН₂)^-С-О-СН₂ н

    (сн₂сн,О)₄-сн_;сн₂ацХн

    О

    НзС-СОСНгСН^-Ν-С-О-СН₂

    Н нИхАА.

    НзС-СОСНгСНа^^-И-^-О-СНг

    Н

    С

    Нэ&СОС^СНг^-С-О-СНа ^н >хАЛ

    6 I М-СЩСЩ-Ж

    НаСЧОСНгСНг^-Ν—с-О-СН_г н ;

    о чн-ющсвдхн-с-ацсн·,- н¹

    ΚΜ.Υ¹ (х'ц-н-с-о—(χ^Βχ, о ?' ? (СНгСНгС^-рС^-ё—Н^~~У»О

    ΡΟίΥ=—(Χ’Ι.-Ν-Ο-Ο-ΓΧ’ΐτ .

    в которой каждый т составляет от 2 до 4000.
21. 21. Полимерный реагент по п.1, включающий структуру, выбранную из группы, состоящей из
22. 22. Полимерный реагент по п.1, включающий структуру, выбранную из группы, состоящей из

    - 56 011351 в которой каждый т составляет от 2 до 4000, а каждый η - от 0 до 20.
23. 23. Способ получения полимерных реагентов по любому из пп.1-22, включающий этапы:

    (ί) обеспечения предшественника, включающего защищенную реактивную группу или одну или несколько гидроксильных групп;

    (ίί) активации по меньшей мере одной гидроксильной группы предшественника для вступления в реакцию с аминогруппой для образования активированного предшественника;

    (ίίί) контактирования в условиях ковалентного соединения по меньшей мере одной активированной гидроксильной группы с водорастворимым полимером, имеющим аминогруппу, с образованием полимера, содержащего часть водорастворимого полимера и защищенную реактивную группу; и (ίν) удаления защиты защищенной реактивной группы при ее наличии с образованием полимерного реагента.
24. 24. Способ по п.23, далее включающий этап выделения полимерного реагента.
25. 25. Способ по п.24, в котором этап выделения проводят путем хроматографии.
26. 26. Способ по п.23, в котором защищенный предшественник содержит одну гидроксильную группу или ее защищенную форму.
27. 27. Способ по п.23, в котором защищенный предшественник содержит две гидроксильные группы или их защищенные формы.
28. 28. Способ по п.23, в котором защищенный предшественник содержит три гидроксильные группы или их защищенные формы.
29. 29. Способ по п.23, в котором защищенный предшественник имеет следующую структуру:

    - 57 011351 в которой РС обозначает защитную группу.
30. 30. Способ по п.23, в котором защищенный предшественник включает защитную группу, выбран- ную из группы, состоящей из метила, этила, метилоксиметила, метилтиометила, тетрагидропиранила, бензилоксиметила, фенацила, Ν-фталимидометила, 2,2,2-трихлорэтила, 2-галоэтила, 2-(птолуолсульфонил)этила, трет-бутила, синнамина, бензила, дифенилметила, трифенилметила, бис-(онитрофенил)метила, 9-антрилметила, 2-(9,10-диоксо)антрилметила, пиперонила, триметилсилила и третбутилдиметилсилила.
31. 31. Способ по п.23, в котором активирующий агент является ди(№сукцинимидил)карбонатом, Ν,Ν'- дициклогексилкарбодиимидом, Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимидом, Ν-(3 -диметиламинопропил)-№этилкарбодиимидом, 1,1'-карбонилдиимидазолом, 1,1'-карбонил(1,2,4-триазолом), бис-(4нитрофенил)карбонатом, п-нитрофенилхлоркарбонатом, фосгеном, трифосгеном, 1гидроксибензотриазолом, дибензотриазолкарбонатом, Ν-гидроксисукцинимидом и Ν,Ν'дициклогексилкарбодиимидом; Ν-гидроксифталимидом и Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимидом и триазо лидин тионом.
32. 32. Способ по п.23, в котором водорастворимый полимер, имеющий аминогруппу, выбран из группы, состоящей из

    Н₃С-(ОСН_гСН2)—Ν-Η Ν-Η ⁰¹ ό . п ² Η .

    и в которой т - от 2 до 4000.
33. 33. Способ по п.23, в котором этап удаления защиты включает способы, выбранные из группы, состоящей из щелочного гидролиза, кислотно-катализируемого гидролиза и восстановления.
34. 34. Способ по п.23, включающий этап преобразования реактивной группы в несходную реактивную группу.
35. 35. Способ по п.23, включающий этап повышения реактивности реактивной группы.

    я’ °
36. 36. Конъюгат, включающий водорастворимый полимер, часть -ν-с-о- и фармакологически активный агент, в котором:

    _ζ.₄ „ ?’ϊ „ „ (ΐ) водорастворимый полимер связан с атомом азота части -«-с- посредством прямой ковалентной связи либо первой спейсерной части;

    в* О (й) фармакологически активный агент связан с карбонильным атомом углерода части -н-с- посредством либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части;

    (ΐϊϊ) В¹ обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, заме щенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин замещенный относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С₃С8циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, йодо, циано, алкокси и фенил; и (ίν) полимер включает разветвляющую часть, где водорастворимый полимер выбран из группы, включающей полиалкиленоксид, поливинил пирролидон, поливиниловый спирт, полиоксазолин, полиакрилоилморфолин и полиоксиэтилированные полиоли.
37. 37. Способ получения конъюгата, включающий этап контактирования полимерного реагента по п.1 с активным агентом при приемлемых условиях с получением лекарственного конъюгата.
38. 38. Фармацевтический препарат, включающий конъюгат, полученный по п.37 в сочетании с фарма цевтическим наполнителем.
39. 39. Фармацевтический препарат по п.38, в котором наполнителем является сахар.
40. 40. Фармацевтический препарат по п.38 в лиофилизированной форме.
41. 41. Фармацевтический препарат по п.38, дополнительно включающий жидкий разбавитель.
42. 42. Фармацевтический препарат по п.41, в котором жидкий разбавитель выбран из группы, состоящей из бактериостатической воды для инъекции, 5% декстрозы в воде, фосфат-буферированного солевого раствора Рингера, солевого раствора, стерильной воды, деионизированной воды и их сочетаний.
43. 43. Фармацевтический препарат по п.38 в виде единичной лекарственной дозы.
44. 44. Фармацевтический препарат по п.38, помещенный в стекляннную ампулу.

    - 58 011351
45. 45. Способ введения конъюгата, включающий этап введения пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата по п.36.

    Я’ о

    I II
46. 46. Полимер, включающий водорастворимый полимер, часть и реактивную группу, вы- бранную из группы, состоящей из гидроксила, ортоэфира, карбоната, ацеталя, альдегида, альдегидгидрата, кетона, винилкетона, кетонгидрата, тиона, монотиогидрата, дитиогидрата, гемикеталя, монотиокеталь гемикеталя, дитиогемикеталя, кеталя, дитиокеталя, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, сульфона, амина, гидразида, тиола, дисульфида, тиолгидрата, карбоновой кислоты, изоцианата, изотиоцианата, малеимида, сукцинимида, бензотриазола, винилсульфона, хлорэтилсульфона, дитиопиридина, винилпиридина, йодоацетамида, эпоксида, глиоксалей, дионов, мезилатов, тозилатов, тиосульфонатов, тресилатов, силана, -(СН2ХСО2Н, -(СН^^В!, -(СВДЮЩОВЦ, -(СЩДСНО, -(СН^Ж (СН₂)_ГМ, -(СН₂)_Г8-8О₂-В, где г составляет 1-5, г' составляет 0-5, В - арил или алкил, N8 - Νсукцинимидил, Βί - 1-бензотриазолил, а М - Ν-малеимидил, а также защищенные и активированные формы любого из вышеуказанных веществ, в котором:

    я’ о ι « ωο о о водорастворимый полимер связан с атомом азота части ’посреством прямой ковалентной связи либо первой спейсерной части;

    я* о ι ί) (ίί) реактивная группа связана с карбонильным атомом углерода части -н-с-ο-, посредством либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части;

    (ίίί) В¹ обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин замещенный относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С3С8циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, йодо, циано, алкокси и фенил;

    (ίν) полимер включает разветвляющую часть, где водорастворимый полимер выбран из группы, включающей полиалкиленоксид, поливинил пирролидон, поливиниловый спирт, полиоксазолин, полиакрилоилморфолин и полиоксиэтилированные полиоли.