MX2007002441A - Conjugados de hormona del crecimiento humana y polietilenglicol ramificado con glicerol, proceso para su preparacion y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Conjugados de hormona del crecimiento humana y polietilenglicol ramificado con glicerol, proceso para su preparacion y metodos de uso de los mismos.

Info

Publication number
MX2007002441A
MX2007002441A MX2007002441A MX2007002441A MX2007002441A MX 2007002441 A MX2007002441 A MX 2007002441A MX 2007002441 A MX2007002441 A MX 2007002441A MX 2007002441 A MX2007002441 A MX 2007002441A MX 2007002441 A MX2007002441 A MX 2007002441A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
hgh
peg
growth hormone
growth
further characterized
Prior art date
Application number
MX2007002441A
Other languages
English (en)
Inventor
Rory F Finn
Ned R Siegel
Original Assignee
Pharmacia & Upjohn Co Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35708806&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2007002441(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pharmacia & Upjohn Co Llc filed Critical Pharmacia & Upjohn Co Llc
Publication of MX2007002441A publication Critical patent/MX2007002441A/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH] (Somatotropin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Abstract

La presente invencion se refiere a la PEGilacion de la hormona del crecimiento humana (hGH) usando un PEG ramificado con glicero; la presente invencion tambien se refiere a procesos para la PEGilacion de hGH; ademas, la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden la hGH PEGilada; otra modalidad es el uso de la hGH PEGilada para el tratamiento de trastornos del crecimiento y del desarrollo.

Description

CONJUGADOS DE HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANA Y I POLIETILENGLICOL RAMIFICADO CON GLICEROL, PROCESO PARA SU I PREPARACIÓN Y MÉTODOS DE USÓ DE LOS MISMOS I i I La presente solicitud reivindica la prioridad según el Título 35, Código de Estados Unidos, §119 de la solicitud de patente Provisional de Estados Unidos con N° de Serie 60/605,945, presentada el 31 de agosto de i 2004, que se incorpora como referencia en su totalidad como si estuviera escrita en este documento.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente ¡nvención se refiere a la PEGilación de la hormona del crecimiento humana (hGH) por medio de la icual pueden cambiarse las propiedades químicas y/o fisiológicas de la hGH. El conjugado de hGH PEGilado puede tener una mayor duración de residencia en plasma, una menor velocidad de eliminación, mayor estabilidad, menor antigenicidad, menor heterogeneidad de PEGilación o una combinación de estas propiedades. La presente invención también se refiere a procesos para la modificación de la hGH. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden la hGH modificada. Otra modalidad es el uso de la hGH modificada para el tratamiento de trastornos del crecimiento y del desarrollo. lii ., ?ÍÉ ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ! La hormona del crecimiento hum'ana (hGH) nativa es una proteína que comprende una sola cadena de 191 aminoácidos entrecruzados por dos puentes disulfuro y la forma monomérica! tiene un peso molecular de 22 kDa. La GH humana se secreta por la glándula pituitaria y también puede producirse por ingeniería genética recombinante. La hGH originará crecimiento en todos los tejidos corporales que pueden crecer. La hGH juega un papel importante no sólo en la promoción ddl crecimiento en la fase de I crecimiento en seres humanos, sino también en el mantenimiento de la composición corporal normal, anabolismo y metabolismo de lípidos (K.
Barneis y U. Keller, Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 10:337 (1996)).
La hGH recombinante ha estado disponible en el mercado desde hace varios años. En el mercado están disponibles dos tipos de preparaciones de hGH recombinante terapéuticamente útiles: 'la auténtica, por ejemplo, Genotropin™, o Nutropin™ y un análogo con un resto de metionina adicional en el extremo N-terminal, por ejemplo, Somatonorm™. La hGH se usa para estimular el crecimiento lineal en pacientes cojn enanismo hipopituitarío, también denominado deficiencia de hormona del crecimiento (GHD) o síndrome de Turner, pero también se han sugerido otras indicaciones incluyendo el tratamiento a largo plazo de la insuficiencia de crecimiento en niños que han nacido con baja estatura para la edad gestacional (SGA), para el tratamiento de pacientes con el síndrome de Prader-Willi (PWS), insuficiencia renal crónica (CRI), debilitamiento por SIDA y envejecimiento. La deficiencia de GH en adultos (aGHD) tiene problemas graves, tales como cambios característicos en la composición corporal, incluyendo el aumento de la masa grasa, la reducción de la masa magra corporal y del fluido extracelular y la reducción de la densidad mineral del hueso, anormalidades de lípidos y disfunción cardiovascular. Muchos de estos problemas mejoran por la terapia de reposición de hGH (J. Verhelst J y R. Abs. Drugs.;62:2399 (2002). Un efecto biológico importante de la hormona del crecimiento (GH) es promover el crecimiento en mamíferos jóvenes y el mantenimiento de los tejidos en mamíferos mayores. Los sistemas de órganos afectados incluyen el esqueleto, tejido conectivo, músculos y visceras tales como el hígado, el intestino y los riñones. Las hormonas del crecimiento ejercen su efecto por la interacción con receptores específicos en la membrana de la célula diana. La hGH es un miembro de una familia de hormonas homologas que incluyen lactógenos placentarios, prolactinas y otras variantes genéticas y de especie u hormonas del crecimiento (Nicoll, C. S.,et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 169). La hGH es poco habitual entre éstas ya que presenta una amplia especificidad de especie y se une a los receptores clonados somatogénico (Leung, D. W.,et al.
[1987] Nature 330; 537) o de prolactina (Boutin, J. M.,et al.
[1988] Cell; 53: 69). El gen clonado para hGH se ha expresado en una forma secretada en Escherichia coli (Chang, C. N.,et al.
[1987] Gene 55:189) y se ha presentado su ADN y su secuencia de aminoácidos (Goeddel, et al. [1979) Nature 281 : 544; Gray, et al.
[1985] Gene 39:247). La hormona del crecimiento humana (hGH) participa en gran medida en la regulación del crecimiento y el desarrollo humano normal. Esta i hormona de la pituitaria presenta una multitud de efectos biológicos incluyendo el crecimiento lineal (somatogénesis), lactación, activación de macrófagos, efectos parecidos a los de la insulina y efectos diabetogénicos, i entre otros (Chawla, R, K. (1983) Ann. Rev. Med., 34, 519; Edwards, C. K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M. 0.,et, al. (1988) J. Clin. Invest. 81 :745). La deficiencia de hormona del crecimiento en niños conduce al enanismo, que se ha tratado satisfactoriamente durante más de una década por la administración exógena de hGH. En adultos, así como en niños,' la hGH mantiene una l composición corporal normal aumentando la retención de nitrógeno y la estimulación del crecimiento del músculo esquelético, y por medio de la movilización de la grasa corporal. El tejido adiposo visceral responde particularmente a la hGH. Además de mejorar la , lipolisis, la hGH reduce la captación de triglicéridos en los almacenes de grasa corporal. Las concentraciones en suero de IGF-I (factor de crecimiento I semejante a insulina) e IGFBP3 (proteína 3 de unión al factor de crecimiento semejante a insulina) aumentan por la hGH. La hGH es un potente agente anabólico, especialmente debido a la retención de nitrógeno, fósforo, potasio y calcio. El tratamiento de ratas hipofisectomizadas con GH puede restaurar al menos una porción de la tasa de crecimiento de las ratas. Moore et al., E?docrinology 122:2920-2926 i (1988). Entre sus efectos más sorprendentes en ¡sujetos con hipopituitarismo (con deficiencia de GH) está la aceleración del crecimiento lineal del cartílago de las placas óseas en crecimiento aumentando la estatura. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964). La hGH produce una diversidad i de efectos fisiológicos y ¡ metabólicos en diversos modelos animales incluyendo el crecimiento lineal del hueso, lactación, activación de macrófagos, efectos semejantes a los de la I insulina y diabetogénicos, y otros (R. K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34:519 (1983); 0. G. P. Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. Al, 483 (1985); C. K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M. OÍ Thomer y M. L. Vanee, J. Clin. Invest. 82:745 (1988); J. P. Hughes y H. G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47:469 (1985)). Se ha notificado que, especialmente en mujeres después de la menopausia, la secreción de GH se reduce con la edad. Millard et al., Neurobiol. Aging, 11 :229-235 (1990); Takahashi et'al., Neuroendocrinology M, L6- 137-142 (1987). Véase también Rudman et al., J. Clin. Invest., 67:1361-1369 (1981 ) y Blackman, Endocrinology and Agiríg, 16:981 (1987). Además, existe un informe de que algunas de las manifestaciones del envejecimiento, incluyendo la reducción de la masa corporal magra, la expansión de la masa de tejido adiposo y el espesamiento de la pielj pueden reducirse por el tratamiento con GH tres veces por semana. Véase, por ejemplo, Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323:1-6 (1990) y el artículo adjunto en el mismo ejemplar de revista de Dr. Vanee (páginas 52-54). Estos efectos biológicos derivan de la interacción entre la hGH y receptores celularesi específicos. Se han clonado dos receptores humanos diferentes, el receptor ¡hepático de la hGH (D. W. Leung et al., Nature 330:537(1987)) y el receptor! de la prolactina humana (J. M. Boutin et al., Mol. Endocrinology. 3:1455 (1989)). Sin embargo, probablemente hay otros, incluyendo el receptor de lactógeno placentario i humano (M. Freemark, M. Comer, G. Komer, y ;S. Handwerger, Endocrinol. 120:1865 (1987)). Estos receptores homólogos contienen un dominio de unión a la hormona extracelular glicosilada, un solo dominio transmembrana y un dominio citoplásmico, que difiere considerablemente en secuencia y tamaño.
Se supone que uno o más receptores juegan uh papel determinante en la respuesta fisiológica a hGH. Generalmente se observa que ciertas proteínas fisiológicamente activas administradas en un cuerpo pueden mostrar su actividad farmacológica sólo durante un corto periodo de tiempo debido a su alta velocidad de eliminación en el cuerpo. Además, lai hidrofobia relativa de estas proteínas puede limitar su estabilidad y/o solubilidad. Para reducir la velocidad de eliminación, mejorar la estabilidad o suprimir la antigenicidad de proteínas terapéuticas; se han propuesto algunos métodos en los que las proteínas se modifican químicamente con polímeros solubles en agua. Una modificación química de este tipo puede bloquear eficazmente una enzima proteolítica del contacto físico con la propia estructura principal de la proteína, previniendo de esta manera la degradación.
La unión química de ciertos polímeros solubles en agua puede reducir eficazmente la eliminación renal debido a un mayor volumen hidrodinámico de la molécula. Otras ventajas incluyen, en ciertas circunstancias, aumentar la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica, aumentar la solubilidad y reducir la inmunogenicidad. El poli(óxido de alquileno), notablemente el poli(etilenglicol) (PEG), es uno de tales restos químicos que se ha usado en la preparación de productos proteicos terapéuticos (significando el verbo "pegilar" unir al menos una molécula de PEG). Se ha demostrado que la unión de poli(etilenglicol) protege contra la proteolisis, Sada, et al., J. Fermentation Bioengineering 71 : 137-139 (1991 ), y se dispone de métodos para unir ciertos restos de poli(etilenglicol). Véase la Patente de Estados Unidos N° 4,179,337, Davis et al., Non-lmmunogenic Polypeptides, expedida el 18 de diciembre de 1979; y la Patente de Estados Unidos N° 4,002,531 , Royer, Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, expedida el 11 de enero de 1977. Como revisión, véase Abuchowski et al., en Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. páginas 367-383 (1981 )). Se han usado otros polímeros solubles en agua, tales como copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), poli(-1 ,3-dioxolano), poli(-1 ,3,6-trioxano), copolímero de etileno/anhídrido maleico o poli-aminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios). Para el poli(etilenglicol), se han usado diversos medios para unir las moléculas de poli(etilenglicol) a la proteína. Generalmente, las moléculas de poli(etilenglicol) se conectan a la proteína a través de un grupo reactivo que se encuentra en la proteína. Los grupos amino, tales como los presentes en restos de lisina o en el extremo N, son convenientes para tal unión. Por ejemplo, Royer (Patente de Estados Unidos N° 4,002,531 , anteriormente) indica que se usó alquilación reductora para unir moléculas de poli(etilenglicol) a una enzima. Chamow et al., Bioconjugate Chem.' 5: 133-140 (1994) presenta la modificación de inmunoadhesina CD4 con monometoxipoli(etilenglicol) aldehido a través de alquilación reductora. El documento U.S. 5,824,784 demuestra la PEGilación de G-CSF, incluyendo en el extremo N-terminal, en condiciones de alquilación reductora. El documento WO 93/00109 se refiere a un método para estimular tejidos que responden a GH de mamífero o de aves que comprende mantener una concentración de GH en plasma eficaz y continua durante un periodo de 3 o más días. Según se indica, una forma de conseguir tal concentración en plasma es por medio del uso de GH acoplada a una sustancia macromolecular tal como PEG (polietilenglicol). Se indica que el acoplamiento a una sustancia macromolecular mejora la vida media. En el documento WO 93/00109 se ha presentado una hormona del crecimiento PEGilada usando mPEG aldehído-5000 y mPEG N-hidroxisuccinimidil éster (mPEG-NHS-5000) para conseguir un volumen hidrodinámico mayor que el límite de peso molecular de 70K de la filtración renal como se describe (Knauf, M.J. et al, J. Biol. Chem. 263:15064-15070.1988). El uso de mPEG-NHS produjo mezclas heterogéneas de múltiples formas PEGiladas de hGH. El documento WO 93/00109 también describe el uso de mPEG-maleimida para PEGilar variantes de cisteína de hGH. El documento WO 99/03887 describe una variante de cisteína de hormona del crecimiento que está PEGilada. Se pretende que este conjugado, denominado BT-005, sea más eficaz en la estimulación del aumento de peso en ratas con deficiencia de hormona del crecimiento y que tenga una mayor vida media que la hGH. También se ha presentado hormona del crecimiento humana PEGilada en Clark et al. usando succinimidil éster de PEG carboximetilado (Journal of Biological Chemistry 271 :21969-21977, 1996). Clark et al. describe derivados de hGH de tamaño creciente usando mPEG-NHS-5000, que se conjuga selectivamente con aminas primarias. Los niveles crecientes de modificación con PEG redujeron la afinidad por su receptor y aumentaron la CE50 en un ensayo basado en células hasta 1500 veces. Olson et al., Polymer Preprints 38:568-569, 1997 describe el uso de N-hidroxisuccinimida (NHS)PEG y propionato de succinimidilo (SPA)PEG para conseguir múltiples especies de hGH PEGiladas. El documento WO 94/20069 describe proféticamente hGH PEGilada como parte de una formulación para suministro pulmonar. El documento US 4,179,337 descpbe métodos de PEGilación de enzimas y hormonas para obtener conjugados de polipéptido no inmunogénicos solubles en agua y fisiológicamente activos. La GH se menciona como un ejemplo de hormona a PEGilar. El documento EP 458064 A2 describe la PEGilación de restos de cisteína introducidos o presentes naturalmente en la somatotropina. El documento EP 458064 A2 menciona adicionalmente la incorporación de dos restos de cisteína en un bucle denominado el bucle omega que, según se indica, está localizado en los restos 102-112 de la somatotropina bovina de tipo silvestre, más específicamente, el documento EP 458064 A2 describe la sustitución de restos con los números 102 y 112 ,de la somatotropina bovina desde Ser a Cys y desde Tyr a Cys, respectivamente. El documento WO 95111987 sugiere la unión de PEG al grupo tio de un resto de cisteína que está presente en la molécula parental o se introduce por mutagénesis de localización dirigida. El documento WO 95/11987 se refiere a la PEGilación de la proteasa nexina-1 , sin embargo, también se sugiere la PEGilación en general de hGH y otras proteínas. El documento WO 99/03887 describé, por ejemplo, la hormona del crecimiento modificada por reemplazo de serina en la posición 25 con un resto de cisteína y unión de PEG al resto de cisteína introducido. El documento WO 00/42175 se refiere a un método para fabricar proteínas que contienen restos de cisteína libres para la unión de PEG. El documento WO 00/42175 describe las siguientes muteínas de hGH: T3C, S144C y T148C y su PEGilación en cisteína. El documento WO 97/11178 (así como los documentos US 5849535, US 6004931 y US 6022711 ) se refiere al uso de variantes de GH como agonistas o antagonistas de hGH. El documento WO 97/11178 también describe la PEGilación de hGH, incluyendo la PEGilación en lisina y la introducción o reemplazo de usina (por ejemplo, K168A y K172R). El documento WO 9711178 también describe la sustitución G120K. El documento WO 03/044056 describe una diversidad de especies de hGH PEGiladas incluyendo un conjugado de hGH y PEG aldehido de 40K ramificado con usina. El documento US 2004/0127417 describe conjugados de hGH y PEG butiraldehído ramificados con lisina. Los documentos WO 04/46222, US 2005/0058620, JP 08- 059818, JP 11-228685 y JP 2000-001541 describen derivados de polialquilenglicol que tienen un grupo reactivo en el carbono primario en la posición 1 de un esqueleto de glicerol y que tienen cadenas de polietilenglicol en las posiciones 2 y 3. La rhGH actualmente se administra diariamente durante un largo periodo de tiempo, y por lo tanto sería muy deseable una administración menos frecuente. Una molécula de hGH con una mayor vida media en circulación reduciría el número de administraciones necesarias y podría proporcionar mayores niveles de hGH terapéuticamente útil con un mejor efecto terapéutico asociado. A pesar de varios intentos de desarrollar una forma de larga duración de hGH, incluyendo la PEGilación de hGH, sigue existiendo la necesidad no satisfecha de una molécula de hGH PEGilada con las propiedades apropiadas como para ser un producto comercial viable. La presente invención proporciona conjugados de PEG-hGH que tienen un solo PEG unido predominantemente a la fenilalani?a N-terminal de hGH, que ! proporciona ventajas con respecto a otros conjugados de PEG-hGH. La unión i de múltiples PEG de bajo peso molecular (5 Kd) en sitios a- o e-amino (lisinas N-terminales y nueve lisinas en hGH) usando mPEG aldehído-5000 o mPEG I I N-hídroxisuccínímidil éster (mPEG-NHS-5000) se ha descrito en el documento i WO 93/00109, Clark et al. (Journal of Biological Chemistry 271 :21969- 21977.1996, y Olson et al. (Polymer Preprints 38:568-569, 1997). Esto da como resultado una población heterogénea. Como ilustración, la hGH con nueve lisinas puede tener algunas moléculas que tienen diez PEG unidos, algunas con nueve, algunas con ocho, algunas con siete, algunas con seis, algunas con cinco, algunas con cuatro, algunas ¡con tres, algunas con dos, I algunas con uno y algunas con ninguno. Y, entre las moléculas con varios PEG, el PEG puede no estar unido a la misma localización en diferentes moléculas. Esta heterogeneidad resultante es | desventajosa cuando se desarrolla un producto terapéutico, haciendo que la conjugación, purificación y caracterización sea difícil, costosa y muy poco reproducible. Otra estrategia (documento WO 00/42175) ha sido usar variantes de hGH que contienen restos de cisteína libres para la unión de PEG. Sin embargo, esta estrategia produce una variante de hGH no natural y también puede conducir a una proteína plegada incorrectamente que tiene enlaces disulfuro emparejados i incorrectamente dando como resultado un producto PEGilado heterogéneo que tiene el PEG unido a algunas o todas las cisteínas. El hecho de tener múltiples PEG unidos a múltiples sitios puede conducir a moléculas que tienen enlaces menos estables entre el PEG y los diversos sitios, que pueden disociarse a diferentes velocidades. Esto hace que sea difícil predecir de forma precisa la farmacocinética del producto dando como resultado una dosificación poco precisa. Un producto heterogéneo también tiene problemas indeseados en la obtención de una aprobación reguladora para el producto terapéutico. Por lo tanto, sería deseable tener una molécula de hPGH PEGilada que tuviera un solo PEG unido en un solo sitio. La presente invención soluciona esta necesidad de varias formas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a hGH PEGilada usando un resto de poli(etilenglicol) ramificado con glicerol que puede tener al menos una propiedad química o física mejorada seleccionada entre, pero sin limitación; menor velocidad de eliminación, mayor duración de residencia en plasma, mayor estabilidad, mejor solubilidad y menor antigenícidad. De esta manera, como se describe más adelante con más detalle, la presente invención tiene varios aspectos que se refieren a la modificación química de la hGH usando un resto de polí(etilenglicol) ramificado con glicerol. La presente invención también puede tener una o más propiedades mejoradas en comparación con conjugados de la hormona del crecimiento humana y PEG ramificados basados en lisina incluyendo, pero sin i limitación: a) mayor estabilidad del esqueleto de glicerol, b) mayor unión al receptor, c) menor coste, d) mayor selectividad N-terminal de la unión, e) mayor solubilidad, f) menor inmunogenicidad, g) mayor estabilidad del conjugado, h) mayor facilidad de fabricación y i) menor proteolisis. ! La presente invención también se refiere a métodos para producir la hGH PEGilada. Particularmente, la presente invención se refiere a I un método para producir hGH PEGilada usando un PEG ramificado con glicerol. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden la hGH PEGilada sola o en combinación con otro agente terapéutico. La presente invención también se refiere al uso de la hGH I PEGilada de la presente ¡nvención, sola o en combinación con otro agente terapéutico, en la prevención y/o tratamiento de trastornos y/o enfermedades en las que es útil el tratamiento con GH.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un gráfico de HPLC de exclusión molecular que I muestra el perfil de elución del producto de reacción de hGH y PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol monoPEGilado purificado en una columna TSK G4000PWXL.
La figura 2 es un gráfico de HPLC del análisis en mapa tríptico de hGH y PEG aldehido de 43K ramificado con g icerol-hGH. El panel superior es el mapa tríptico de hGH. El panel inferior es el mapa tríptico de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH. TÍ es el fragmento tríptico N- terminal.
La figura 3 muestra la secuencia de¡ aminoácidos de la hormona del crecimiento humana (SEC ID N°:1 ).
La figura 4 muestra la eficacia de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH en un Ensayo de Aumento de Peso en Rata de once días. Se adquirieron ratas Sprague-Dawley hembra hipofisectomizadas a la edad de 4-5 semanas (85-110 g) de Harían Labs. Después de entrar en las instalaciones de los animales, éstos se mantuvieron a temperatura ambiente constante de 80°F (26.67°C). Después de 3 días de aclimatación, las ratas se pesaron diariamente durante 4-10 días para establecer las velocidades de crecimiento basal. Empezando el día 0, las ratas (-100 g) de los grupos de control recibieron una inyección subcutánea diaria de -0.3 mg/kg de hGH (^), I o vehículo de PBS {<>) durante once días consecutivos. El grupo de ensayo de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH (a) recibió dosis únicas de 1.8 mg/kg de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH en los días 0 ¡ y 6. Había 6 animales por grupo. Los valores mostrados en el gráfico representan el aumento de peso medio ± SEM.
La figura 5 muestra el crecimiento de las tibias de once días en i respuesta a PEG aldehido de 43K ramificado con 'glicerol-hGH. Los animales fueron los tratados en la figura 4. Los animales se sacrificaron después de medir los pesos en el día 11 , se tomaron radiografías de las tibias izquierdas y se midió la longitud del hueso usando un calibre. Se representa la longitud media +/- SEM. Los asteriscos denotan diferencias significativas del grupo de control (P<0.05). Había 6 animales por grupo. La figura 6 muestra los niveles de nitrógeno de urea en sangre de 11 días en respuesta a PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH. Se tomaron muestras de sangre de los animales tratados en la figura 4. Se preparó suero y se midieron los niveles de nitrógeno de urea. Se representa la media ± SEM (6 animales por grupo). Los asteriscos denotan diferencias significativas del grupo de control (P<0.05). La figura 7 muestra un estudio de eficacia de aumento de la dosis de seis días para PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH Este estudio de crecimiento se realizó de una manera similar a la descrita en la figura 4 con la excepción de que se administraron dosis individuales variadas de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH sólo en el día 0 y el estudio se realizó durante 6 días. Los grupos de control recibieron inyecciones subcutáneas una vez al día de 0.3 mg/kg de hGH (o) vehículo de PBS (o) durante seis días consecutivos. Los grupos de ensayo de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH recibieron una sola dosis de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH en el día 0. Las dosis de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH fueron 1.8 mg/kg ( D ), 0.6 mg/kg (X), 0.2 mg/kg, (+), 0.067 mg/kg (?). Había 6 animales por grupo.
La figura 8 muestra los niveles de IGF-1 en suero para un estudio de eficacia de seis días. Los animales se trataron como se describe en la figura 7. Se tomaron muestras de sangre a los diversos tiempos representados y los niveles de IGF-1 en suero se determinaron por ELISA. Se usaron medias de los grupos (n=6) para calcular la respuesta de IGF-1 usando un análisis de varianza de una vía sobre los valores medidos y se determinaron valores de AUC dO-6 (ng/ml*24h) de 37.839, 28.129, 22.958 y 20.040 para los grupos de dosificación de 1.8, 0.6, 0.2 y 0.067 mg/kg, respectivamente. Las figuras 9A-9B muestran la evaluación de PK/PD después de la administración de una sola dosis de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH a ratas hembra hipofisectomízadas. El efecto de la administración de una sola dosis SC de 1.8 mg/kg de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH sobre los niveles plasmáticos de fármaco como se muestra en la figura 9A o la respuesta de IGF-1 en la figura 9B.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a conjugados de polietilenglicol ramificado con glicerol-hormona del crecimiento humana. En una modalidad específica, el derivado de polietilenglicol ramificado con glicerol tiene un grupo aldehido reactivo y opcionalmente un enlazador entre el polietilenglicol y el grupo funcional reactivo en el carbono primario en la posición 1 de un esqueleto de glicerol y tiene cadenas de polialquilenglicol en las posiciones 2 y 3 como se describe en los documentos WO 04/46222 o US 2005/0058620 (incorporados como referencia) para crear conjugados de hGH. El enlazador no está limitado particularmente siempre que sea un enlace covalente, pero preferiblemente incluye un grupo alquileno y un grupo alquileno que contiene un enlace éster, un enlace uretano, un enlace amida, un enlace éter, un enlace carbonato o un grupo amino secundaria. El grupo alquileno preferible incluye un grupo metileno, un grupo etileno, un grupo trimetileno, un grupo propileno, un grupo isopropileno, un grupo tetrametileno, un grupo butileno, un grupo isobutileno, un grupo pentametileno y un grupo hexametileno. Una modalidad específica de la presente invención es un conjugado de hormona del crecimiento humana-PEG que tiene la estructura de la Fórmula: en la que n es un número entero comprendido entre 60 y 75; m es un número entero comprendido entre 450 y 460; y R es un polipéptido de la hormona del crecimiento humana.
En una modalidad particular, n está comprendido entre aproximadamente 64 y aproximadamente 72. En una modalidad particular, el resto (CH2CH2O)n tiene un peso molecular medio comprendido entre aproximadamente 2.6 y aproximadamente 3.5 Kd, y particularmente, el peso molecular medio es de aproximadamente 3 Kd. En una modalidad particular, cada resto (CH2CH2O)m tiene un peso molecular medio comprendido entre aproximadamente 17.6 y aproximadamente 22 Kd, y particularmente, el peso molecular medio es de aproximadamente 20 Kd. En una modalidad específica, el resto (CH2CH2O)n tiene un peso molecular medio de aproximadamente 3 Kd y cada resto (CH2CH2O)m tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20 Kd. El término "aproximadamente", cuando se usa en relación con el peso molecular de un resto de PEG, significa que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más y otras menos que el peso molecular indicado y el peso molecular indicado se refiere al peso molecular medio. Se entiende que hay algún grado de polidispersidad asociada con polímeros tales como poli(etilenglicol). Es preferible usar PEG con baja polidispersidad. En una modalidad específica, uno de los grupos terminales del extremo hidroxilo del polímero se convierte o protege con un grupo metilo. Como se usa en este documento, el término "mPEG" se refiere a un PEG que está protegido en un extremo con un grupo metilo. El mPEG puede representarse estructuralmente como CH3O-(CH2CH2O)n-H Las expresiones "polipéptido de hormona del crecimiento humana", "polipéptido de hGH" o "proteína hGH", cuando se usan en este documento, incluyen todos los polipéptidos de hGH, caracterizados porque promueven el crecimiento en la fase de crecimiento y mantienen la composición corporal normal, anabolismo y metabolismo de lípidos. Preferiblemente, la expresión "polipéptido de hGH" se refiere al polipéptido de hGH de la SEC ID N°:1 Los polipéptidos de hGH de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Estos polipéptidos de hGH y sus fragmentos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, pueden sintetizarse químicamente, pueden producirse por técnicas recombinantes incluyendo técnicas de traducción in vitro o expresión en una célula hospedadora capaz de expresar ADNc de hGH, o una combinación de estos métodos, usando técnicas conocidas por los especialistas en la técnica (véanse, por ejemplo, en "Methods in Enzymology, Academic Press, 1993" diversos métodos para purificar proteínas; Creíghton, (1983) Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co. 2nd Ed., T. E., New York; en Hunkapiller et al., (1984) Nature. 310(5973): 105-11 la síntesis química de proteínas y en Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NY técnicas recombinantes, incorporándose estas descripciones como referencia en su totalidad). Los polipéptidos de la presente invención preferiblemente se proporcionan en una forma aislada y pueden purificarse parcialmente o, de una forma preferida, sustancialmente. Una modalidad específica de la presente invención es un conjugado de hormona del crecimiento humana-PEG donde más de 80%, más preferiblemente 81 %, más preferiblemente 82%, más preferiblemente 83%, más preferiblemente 84%, más preferiblemente 85%, más preferiblemente 86%, más preferiblemente 87%, más preferiblemente 88%, más preferiblemente 89%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente 91 %, más preferiblemente 92%, más preferiblemente 93%, más preferiblemente 94%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 96%, más preferiblemente 97, y más preferiblemente 98% del polietilenglicol está conjugado con la fenilalanina amino-terminal de la hormona del crecimiento humana de la SEC ID N°:1. Otra modalidad de la presente invención es una preparación sustancialmente homogénea de hGH PEGilada en el extremo N-terminal, opcionalmente en un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable, careciendo sustancialmente dicha preparación de hGH PEGilada en sitios distintos del extremo N-terminal. La expresión "preparación sustancialmente homogénea" significa una preparación donde más de 80%, más preferiblemente 81 %, más preferiblemente 82%, más preferiblemente 83%, más preferiblemente 84%, más preferiblemente 85%, más preferiblemente 86%, más preferiblemente 87%, más preferiblemente 88%, más preferiblemente 89%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente 91 %, más preferiblemente 92%, más preferiblemente 93%, más i preferiblemente 94%, más preferiblemente 95%Jmás preferiblemente 96%, más preferiblemente 97 y más preferiblemente 98% está monoPEGilada. En una modalidad de la invención, , se forman enlaces amina i secundaria entre el grupo a-amino primario N-terminal del polipéptido de hGH y un PEG aldehido de cadena ramificada con glicerol por alquilación reductora como se describe en Chamow et al., Bioconjugate, Chem. 5: 133-140 (1994), Patente de Estados Unidos N° 4,002,531 , documento WO 90/05534 y patente de Estados Unidos N° 5,824,784, con un agente reductor adecuado tal como NaCNBH3, NaBH3, Piridina Borano etc. El PEG aldehido ramificado con glicerol se incuba con un polipéptido de hGH obteniéndose la adición del resto de PEG a grupos amino por medio de la formación de bases de Schiff. Estos enlaces se convierten en aminas secundarias estables por reducción con un agente reductor. El proceso de alquilacíón reductora se representa en el esquema presentado más adelante (de Chamow et al.).
Protelna que contiene amina I pH 6-9 Las reacciones de conjugación, denominadas "reacciones de PEGilación", se realizaron históricamente en solución con un exceso molar de polímero y sin tener en cuenta donde se unirá el polímero a la proteína. Sin embargo, estas técnicas generales típicamente han resultado inadecuadas para conjugar proteínas bioactivas a polímeros no antigénicos mientras se conserva una bioactividad suficiente. Una forma de mantener la bioactividad de la hGH es evitar sustancialmente la conjugación de los grupos reactivos de hGH asociados con el o los sitios de unión al receptor en el proceso de acoplamiento del polímero. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un proceso para conjugar poli(etilenglicol) a hGH manteniendo altos niveles de actividad retenida. La modificación química a través de un enlace covalente puede realizarse en cualquier condición adecuada adoptada generalmente en una reacción de una sustancia biológicamente activa con el poli(etilenglicol) activado. La reacción de conjugación se realiza en condiciones relativamente suaves para evitar la inactivación de la hGH. Las condiciones suaves incluyen mantener el pH de la solución de reacción en el intervalo de 3 a 10 y las temperaturas de reacción dentro del intervalo de aproximadamente 0°-37°C. En los casos en los que los restos aminoacídicos reactivos en hGH tienen grupos amino libres, la modificación anterior preferiblemente se realiza en una lista no limitante de tampones adecuados (pH 4 a 10), incluyendo fosfato, MES, citrato, acetato, succinato o HEPES, durante 1-48 horas a 4°-37°C. Para dirigirse a grupos amino N-terminales con reactivos tales como PEG aldehidos, preferiblemente pe mantiene pH 4-8. El poli(etilenglicol) activado puede usarse en aproximadamente 0.01 -100 veces, preferiblemente aproximadamente 0.01-2.5 veces, la cantidad molar del número de grupos amino libres de hGH. Aunque las condiciones de reacción descritas en este documento pueden dar como resultado cantidades significativas de hGH no modificada, la hGH no modificada puede recíclarse fácilmente en lotes futuros para reacciones de conjugación adicionales. Sorprendentemente, los I I procesos de la presente invención generan muy . poco, es decir, menos de aproximadamente 20% y más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de especies de alto peso molecular y especies que contienen más de I una cadena de polímero por hGH. Estas condiciones de reacción deben contrastarse con las usadas típicamente para reacciones de conjugación poliméricas en las que el polímero activado está presente en excesos molares de varias veces con respecto a la diana. Las reacciones de conjugación de la presente invención inicialmente proporcionan una mezcla de reacción o conjunto que contiene conjugados de mono-PEG-hGH, hGH sin reaccionar, polímero sin reaccionar, y menos de aproximadamente 20% de especies de alto peso molecular. Las especies de alto peso molecular incluyen conjugados que contienen más de una cadena polímérica y/o especies de PEG-hGH polimerizadas. Después de haber retirado las especies sin reaccionar y las especies de alto peso molecular, se recuperan composiciones que |contienen principalmente conjugados de hGH mono-PEGilados. Dado el hecho de que los conjugados en su mayor parte incluyen una sola cadena de polímero, los conjugados son sustancialmente homogéneos. Esta hGH mo'dificada tiene al menos aproximadamente 0.1 % de la actividad biológica ih vitro asociada con la hGH nativa o no modificada medida usando ensayos |de proliferación de células FDC-P1 convencionales, (Clark et al. Journal of Biological Chemistry 271 :21969-21977,1996), ensayos de unión a receptores (documento US 5,057,417), o crecimiento de ratas hipofisectomizadas (Clark et al. Journal of Biological Chemistry 271 :21969-21977, 1996). En' aspectos preferidos de la invención, sin embargo, la hGH modificada tiene aproximadamente 25% de la I actividad biológica in vitro, más preferiblemente, la hGH modificada tiene aproximadamente 50% de la actividad biológica in \vitro, más preferiblemente, la hGH modificada tiene aproximadamente 75% de la actividad biológica in vitro, y aún más preferiblemente la hGH modificada tiene una actividad biológica in vitro equivalente o mejorada. Los procesos de la presente invención preferiblemente incluyen relaciones más bien limitadas entre polímero y hGH. De esta manera, se ha descubierto que los conjugados de hGH están limitados predominantemente a especies que contienen sólo una cadena de polímero. Además, la unión del polímero al grupo reactivo con hGH es sustancialmente menos aleatoria que cuando se usan mayores excesos molares de enlazador polimérico. La hGH no modificada presente en el conjunto de reacción, después de que se haya interrumpido la reacción de conjugación, puede reciclarse a reacciones futuras usando cromatografía de intercambio iónico o de exclusión molecular o técnicas de separación similares. Una hGH modificada con poli(etilenglicol) puede purificarse a partir de una mezcla de reacción por métodos convencionales que se usan para la purificación de proteínas, tales como diálisis, desplazamiento salino, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía en gel y electroforesis. La cromatografía de intercambio iónico es particularmente eficaz para retirar el poli(etilenglicol) y la hGH sin reaccionar. En otra modalidad de la invención, la especie de hGH mono-PEGilada se aisla de la mezcla de reacción para retirar especies de alto peso molecular, y hGH no modificada. La separación se realiza poniendo las especies mezcladas en una solución tampón que contiene de aproximadamente 0.5-10 mg/ml de los conjugados de hGH-polímero. Las soluciones adecuadas tienen un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10. Las soluciones preferiblemente contienen una o más sales tampón seleccionadas entre KCl, NaCI, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO , NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, CH3CO2H y NaOH. Dependiendo del tampón de reacción, la solución de conjugado de hGH-polímero primero puede tener que someterse a intercambio de tampón/ultrafiltración para retirar todo el polímero sin reaccionar. Por ejemplo, la solución de conjugado de PEG-hGH puede ultrafiltrarse a través de una membrana con un bajo límite de peso molecular (de 10.000 a 30.000 Dalton) para retirar la mayor parte de los materiales indeseados tales como polímero sin reaccionar, tensioactivos, si están presentes, o similares. La fraccionación de los conjugados en un conjunto que contiene las especies deseadas preferiblemente se realiza usando un medio de cromatografía de intercambio iónico. Tales medios son capaces de unir selectivamente conjugados de PEG-hGH por diferencias en carga, que varía de una manera algo predecible. Por ejemplo, la carga superficial de la hGH se determina por el número de grupos cargados disponibles en la superficie de la proteína. Estos grupos cargados típicamente sirven como punto de unión potencial de polímeros de poli(óxido de alquileno). Por lo tanto, los conjugados de hGH tendrán una carga diferente de las demás especies para permitir el aislamiento selectivo. Para el método de la presente invención se usan resinas de intercambio catiónicas o aniónicas muy polares tales como resinas de amina cuaternaria o de sulfopropilo, respectivamente. Se prefieren especialmente las resinas de intercambio aniónico. Una lista no limitante de resinas de intercambio catiónico disponibles en el mercado incluidas adecuadas para uso con la presente invención son SP-hitrap® SP Sepharpse HP® y SP Sepharose® fast flow. También pueden usarse otras resinas de intercambio catiónico adecuadas, por ejemplo, resinas S y CM. Una lista no limitante de resinas de intercambio aniónico, incluyendo resinas de intercambio aniónico disponibles en el mercado, adecuadas para uso con la presente invención son Q-hitrap®, Q Sepharose HP® y Q sepharose® fast flow. También pueden usarse otras resinas de intercambio aniónico adecuadas, por ejemplo, resinas DEAE.
Por ejemplo, la resina de intercambio aniónico o catiónico preferiblemente se empaqueta en una columna y se equilibra por medios convencionales. Se usa un tampón que tenga el mismo pH y osmolalidad que la solución de hGH conjugada con polímero. El tampón de elución preferiblemente contiene una o más sales seleccionadas entre KCl, NaCI, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 y (NH4)2C03. La solución que contiene el conjugado después se adsorbe en la columna, sin que queden retenidos el polimero sin reaccionar y algunas especies de alto peso molecular. Al finalizar la carga, se aplica a la columna un flujo en gradiente de un tampón de elución con concentraciones crecientes de sal para eluir la fracción deseada de hGH conjugada con poli(óxido de alquileno). Las fracciones eluidas reunidas preferiblemente se limitan a conjugados de polímero uniformes después de la etapa de separación por intercambio catiónico o aniónico. Después puede retirarse de la columna por lavado cualquier especie de hGH no conjugada utilizando técnicas convencionales. Si se desea, las especies de hGH mono-PEGiladas pueden separarse de las multi-PEGiladas por otra cromatografía de intercambio iónico u otra cromatografía de exclusión molecular. También pueden usarse técnicas que utilizan múltiples etapas ¡socráticas de concentración creciente de sal o pH. Las múltiples etapas de elución ¡socrática de concentración creciente darán como resultado la elución secuencial de conjugados de di- y después mono-hGH-polímero. El intervalo de temperaturas para la elución está comprendido entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 25°C. Preferiblemente, la elución se realiza a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 22°C. Por ejemplo, la elución de la fracción de PEG-hGH se detecta por absorbancia UV a 280 nm. La recogida de las fracciones puede conseguirse por medio de perfiles sencillos de elución con el tiempo. En los procesos para conjugar el polímero de poli(etilenglicol) con el resto de hGH puede usarse un tensioactivo. Los tensioactivos adecuados incluyen agentes de tipo iónico tales como dodecil sulfato sódico (SDS). También pueden usarse otros tensioactivos iónicos tales como dodecilsulfato de litio, compuestos de amonio cuaternario, ácido taurocólico, ácido caprílíco, ácido decanosulfónico, etc. También pueden usarse tensioactivos no ¡ónicos. Por ejemplo, pueden usarse materiales tales como poli(oxietileno)sorbitanos (Tweens) y éteres de poli(oxietileno) (Tritons). Véase también Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. La única limitación sobre los tensioactivos usados en los procesos de la invención es que se usen en condiciones y a concentraciones que no provoquen una desnaturalización irreversible sustancial de la hGH y no inhiban completamente la conjugación con el polímero. Los tensioactivos están presentes en las mezclas de reacción en cantidades de aproximadamente 0.01-0.5%; preferiblemente de 0.05-0.5%; y aún más preferiblemente de aproximadamente 0.075-0.25%. También se contemplan mezclas de los tensioactívos. Se cree que los tensioactivos proporcionan un sistema de protección reversible temporal durante el proceso de conjugación con el polímero. Se ha demostrado que los tensioactívos son eficaces en la inhibición selectiva de la conjugación del polímero mientras que permiten que tenga lugar una conjugación basada en lisina o basada en grupos amino terminales. La presente hGH modificada con poli(etilenglicol) tiene un efecto farmacológico más duradero, que posiblemente puede atribuirse a su vida media prolongada in vivo. Otra modalidad de la invención se refiere a métodos para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad trastorno en el que es beneficioso el uso de GH, preferiblemente hGH, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una hGH modificada con poli(etilenglicol) de la invención o una variante agonista de la misma, sola o en combinación con otro agente terapéutico. La invención también se refiere al uso de una hGH modificada con poli(etilenglicol) de la invención o una variante agonista de la misma en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno en el que es beneficioso el uso de GH, preferiblemente hGH. Además, La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una hGH modificada con poli(etilenglicol) de la invención o una variante agonista de la misma para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno en el que es beneficioso el uso de GH, preferiblemente hGH. Las enfermedades o trastornos en los que es beneficioso el uso de GH incluyen, pero sin limitación, deficiencia de hormona del crecimiento (GHD), deficiencia de hormona del crecimiento en adultos (aGHD), síndrome de Turner, falta de crecimiento en niños que nacieron con baja estatura para la edad gestacional (SGA), síndrome de Prader-Willi (PWS), insuficiencia renal crónica (CRI), debilitamiento por SIDA, envejecimiento, insuficiencia renal en fase terminal, fibrosis quística, disfunción eréctil, lipodistrofia por VIH, fibromialgia, osteoporosis, trastornos de la memoria, depresión, enfermedad de Crohn, displasías esqueléticas, lesión traumática cerebral, hemorragia subaracnoidea, síndrome de Noonan, síndrome de Down, corta estatura idiopática (ISS), enfermedad renal en fase terminal (ESRD), peso muy bajo en el nacimiento (VLBW), rescate de células madre de médula ósea, síndrome metabólico, miopatía por glucocorticoides, baja estatura debido tratamiento con glucocorticoides en niños, y falta de crecimiento en niños prematuros de baja estatura. En una modalidad más específica de la ¡nvención, la hGH modificada con poli(etilenglicol) de la invención o variantes agonistas de la misma se usan en la prevención y/o tratamiento de trastornos o enfermedades seleccionadas entre el grupo que consiste en GHD, aGHD, SGA, PWS, síndrome de Turner y CRI. En otra modalidad más específica de la invención, la hGH modificada con poli(etilenglicol) de la invención o variantes agonistas de la misma se usan en la prevención y/o tratamiento de trastornos o enfermedades seleccionadas entre el grupo que consiste en baja estatura idiopática, peso muy bajo en el nacimiento, lesión traumática cerebral, síndrome metabólico y síndrome de Noonan. Otra modalidad de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una hGH modificada con poli(etilenglicol) de la invención sola o en combinación con otro agente terapéutico, y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La hGH modificada con poli(etilenglicol) de la presente invención entonces puede formularse en agentes farmacéuticos que contienen también un díluyente farmacéuticamente aceptable, un agente para preparar una solución isotónica, un acondicionador del pH y similares, para administrarlos a un paciente. Los agentes farmacéuticos anteriores pueden administrarse por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, pulmonar, intradérmíca u oral, dependiendo del objetivo del tratamiento. Una dosis también puede basarse en el tipo y estado del paciente a tratar, estando comprendida normalmente entre 0.1 mg y 5 mg por inyección y entre 0.1 mg y 50 mg en una administración oral para un adulto. Como se usa en este documento, la hGH modificada con poli(etilenglicol) o variantes agonistas de la misma de la presente invención puede usarse en combinación con otro agente terapéutico. Como se usan en este documento, las expresiones "co-administracíón", "co-administrado" y "en combinación con", haciendo referencia a los compuestos A y uno o más agentes terapéuticos distintos, pretende significar, y hace referencia e incluye lo siguiente: o la administración simultánea de tal combinación de A y uno o más agentes terapéuticos a un paciente en necesidad de tratamiento, cuando tales componentes se formulan conjuntamente en una sola forma de dosificación que libera dichos componentes sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente; o la administración sustancialmente simultánea de tal combinación de A y uno o más agentes terapéuticos a un paciente en necesidad de tratamiento, cuando tales componentes se formulan por separado en formas de dosificación separadas que se toman sustancialmente al mismo tiempo por dicho paciente, después de lo cual dichos componentes se liberan sustancialmente al mismo tiempo a dicho paciente; o la administración secuencial de tal combinación de A y uno o más agentes terapéuticos a un paciente en necesidad de tratamiento, cuando tales componentes se formulan por separado en formas de dosificación separadas que se toman a tiempos consecutivos por dicho paciente con un intervalo de tiempo significativo entre cada administración, después de lo cual dichos componentes se liberan a tiempos sustancialmente diferentes a dicho paciente; y o la administración secuencial de tal combinación de A y uno o más agentes terapéuticos a un paciente en necesidad de tratamiento, cuando tales componentes se formulan juntos en una sola forma de dosificación que libera dichos componentes de una manera controlada, después de lo cual se administran conjuntamente, consecutivamente y/o de manera solapante al mismo tiempo y/o en momentos diferentes por dicho paciente. Los ejemplos adecuados de otros agentes terapéuticos que pueden usarse en combinación con A, sus sales farmacéuticamente aceptables y/o sus formas derivadas incluyen, pero sin limitarse de manera alguna: inhibidores de aromatasa tales como exemestano, formestano, atamestano, fadrozol, letrozol, vorozol y anastrozol; reguladores de ácidos grasos libres incluyendo derivados de ácido fíbrico (tales como fenofibrato, clofibrato, gemfibrozil, bezafibrato y ciprofibrato) y derivados de ácido nicotínico tales como acipimox; agentes sensibilizadores de insulina incluyendo, pero sin limitación, biguanidas tales como metformin, agentes sensibilizadores de insulina que actúan sobre PPAR gamma y tiazolidinadionas tales como troglitazona y rosiglitazona Troglitazona, 5-[[4-[3,4-Dihidro-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2H-]-benzopiran-2-il)metoxi]fenil]metil-3-2,4-tiazolidinadiona V411(DIABII, Glaucanin) Pioglitazona (ACTOS, AD 4833, U 72107, U 72107A, U 72107E, ZACTOS) Nombre Químico: 2,4-Tiazolidinadiona, 5-[[4-[2-(5-etil-2-piridinil)etoxi]fenil]metil]-, monohidrocloruro, (al-), Rosiglitazona (Avandia, BRL 49653,-BRL 49653C) Nombre Químico: 2.4 Tiazolidinadiona, 5-[[4-[2-(metil-2-piridinilam¡no)etoxi]fenil]metilo]; 25 Bexa-roteno-oral (LGD 1069 oral, Targretin oral, Targretin, Targretyn oral Targrexin oral) Nombre Químico: Ácido 4-[1-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftil)etenil]benzoico; ZD 2079, (ICI D 2079) (Nombre Químico: Cloruro de R)-N-[2-4-(carboximetil) 30 fenoxí]etil)-N-(2-hidroxi-2-fenetil)amonio: Netoglita- zona, (Isaglitazona, MCC 555, RWJ 241947) (Nombre Químico: 5-[6(2-Fluorobenciloxi)naftalen-2-ilmetil]tiazolidina-2,4-diona); INS (D-quiro-inositol) (Nombre Químico: D-1.2.3.4.5,6-Hexahidroxicicl?hexano), ON 2344(DRF 2593); Dexlipotam, Nombre Químico: Ácido 5(R)-(1 ,2-ditiolan-3-il)pentaloico 35; HQL 975, Nombre Químico: Ácido 3-[4-[2-(5-metil-2-feníloxazol-4-il)etoxi]fenil]-2(S)-(propilamino)propiónico; YM 268, Nombre Químico: 5.5'-Metileno-bis(1.4-fenileno)bismetilenobis(tiazolidina-2,4-diona). Los agonistas de PPAR en desarrollo incluyen: Reglitazar (JTT 501 , PNU 182716, PNU 716) (Nombre Químico: lsoxazolidien-3,5-diona, 4-[[4-(2-fenil-5-metil)-1 ,3-oxazolil]etoxifenil-4]metil-, (4RS)); l(RP 297, Nombre Químico: 10 5-(2.4-Dioxotiazolidin-5-ílmetil)-2-metoxi-N-[4-(tr¡fluorometil)bencilbenzamida; R 119702 (Cl 1037, CS 011 ) Nombre Químico (/-)-5-[4-(5-Metoxi-1 H-bencimidazol-2-ilmetoxi)bencil]tiazolin-2,4-diona; hidrocloruro; 15 DRF 2189, Nombre Químico: 5-[[4-[2-(1-lndolil)etoxi]fenil]metil]tiazolidina-2,4-diona; inhibidores de la síntesis de cortisol tales como Ketoconazol, econazol o miconazol; hormonas del crecimiento tales como somatotropina o somatonorm y sus derivados tales como proteínas de fusión de la hormona del crecimiento humana tales como ALBUTROPIN; hormonas del crecimiento-politilenglícol tales como la hormona del crecimiento pegilada en cisteína, BT 005 (Bolder BioTechnology Inc.); secretagogos de hormona del crecimiento tales como, por ejemplo, SM 130686 (Sumitomo) capromorelin (Pfizer), mecasermin (Fujisawa), sermorelin (Salk Institute, Bio-Technology General), somatrem, somatomedin (C Llórente; Pharmacia Corporation) examorelin, tabimorelin; CP 464709 (Pfizer), LY 426410 y LY 444711 (Lilly); 8-(aminoalcoxiimino)-8H-dibenzo[a,e]triazolo[4,5-c]cicloheptenos como los descritos en el documento WO2002057241 , dibenzo[a,e]1 ,2,3-triazolo[4,5-c][7]annulen-8-onas 2-sustituidas como las descritas en el documento WO2002056873, péptidos de liberación de hormonas del crecimiento GHRP-6 y GHRP-1 como los descritos en la Patente de Estados Unidos N° 4,411 ,890, y en las publicaciones WO 89/07110, WO 89/07111 B-HT920, hexarelin y GHRP-2 como se describe en el documento WO 93/04081 u hormona de liberación de la hormona del crecimiento (GHRH, también denominado GRF) y sus análogos, somatomedinas, incluyendo IGF-1 e IGF-2 y sus derivados tales como SomatoKine - una fusión recombinante del factor de crecimiento semejante a insulína-1 y su proteína de unión, BP-3, agonistas alfa-2-adrenérgicos tales como clonidina, xilazina, detomidina y medetomidina o agonistas de serotonina 5HTID tales como sumitriptan o agentes que inhiben somatostatina o su liberación tales como fisostigmina y piridostigmina, ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166 (Merck & Company); derivados dipeptídicos tales como los descritos en el documento WO9858947, inhibidores de dipeptidil peptidasa IV tales como amino-acilpirrolidina nitrilo como se describe en los documentos US6521644, WO95/15309 y WO98/19998; Inhibidores de dipeptidil peptidasa beta-amino heterocíclicos tales como los descritos en los documentos US20030100563 y W02003082817; compuestos de liberación de la hormona del crecimiento tales como los descritos en los documentos US20030055261 , US20030040483, EP 18 072, EP 83 864, WO 89/07110, i WO 89/0171 1 , WO 89/10933, WO 88/9780, WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711 , WO 93/04081 ; WO 9514666, EP0923539, Patentes de estados Unidos n° 5,206,235, 5,283,241 , 5,284,841 , 5,3101,737, 5,317,017, 5,374,721 , 5,430,144, 5,434,261 , 5,438,136, 5,494,919, 5,494,920, 5,492,916, 5,536,716 y 5,578,593, WO 94/13696, WO 94/19367, WO 95/03289, WO 95/03290, WO 95/09633, WO 95/11029, WO 95/12598, WO 95/13069, WO 95/14666, WO I 95/16675, WO 95/16692, WO 95/17422, WO 95/17423, WO 95/3431 1 y WO i 96/02530, Piperidinas, pirrolidinas y hexahidro-1 H-|azepinas como se describe en los documentos US5804578, US5783582', W02004007468, amido espiropiperidinas tales como las descritas en el documento WO0104119, compuestos de ácido 2-amino-5-pirimidina acético incluyendo Ácido 2-[(5,6- dimet¡l-2-benzoimidazolil)amino]-4-h¡droxi-6-metil-5rpirimidina acético (2) y Ácido 2-[(5,6-dimet¡l-2-benzoimidadazolil)amino]-4'-hidroxi-6-metil-5-pirimidina i acético, éster etílico como se describe en el documento US6329383, i bencimidazoles como se describe en el documento EP1155014, compuestos j peptidílicos análogos relacionados con GRF y los, péptidos de la Patente de Estados Unidos 4,411 ,890, antagonistas de la hormona de liberación de gonadotropina tales como los descritos en los .documentos WO0170228, WO0170227, WO0170228, WO0069433, WO0004013, WO995156, WO9951595, WO9951231-4, WO9941251-2, WÓ9921557, WO9921553 y compuestos de 6-azaindol como los descritos en los documentos WO0053602, WO0053185, WO0053181 , WO0053180, WO0053179, WO0053178, US6288078; secretagogos de IGF-1 ; factor de crecimiento-2 semejante a insulina (IGF- 2 o somatomedina A) y secretagogos de IGF-2; antagonistas de miostatína y compuestos que inhiben la tirosina quinasa del receptor del factor-3 de crecimiento de fibroblastos (FGFR-3). Las sustancias poliméricas incluidas también son preferiblemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitante de tales polímeros incluye homopolímeros de poli(óxido de alquileno) tales como poli(etilenglicol) o poli(propilenglicoles), poli(polioles oxietilenados), copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad acuosa de los copolímeros de bloque. Como alternativa a los polímeros basados en PEG, pueden usarse materiales no antigénicos eficazmente tales como dextrano, poli(vinilpirrolidonas), poli(acrilamidas), poli(alcoholes vinílicos) polímeros tasados en carbohidratos, y similares. De hecho, la activación d? grupos a- y e-terminales de estas sustancias poliméricas puede realizarse de manera similar a la usada para convertir polí(óxidos de alquíleno) y de esta manera serán evidentes para los especialistas habituales en la técnica. Los especialistas habituales en la técnica se darán cuenta de que la lista anterior es simplemente ilustrativa y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas en este documento. Para los fines de la presente invención, "no antigénico eficazmente" se refiere a todos los materiales considerados en la técnica no tóxicos y que no inducen una respuesta inmunogénica en mamíferos.
Definiciones A continuación se proporciona una lista de abreviaturas y los correspondientes significados que se usan indistintamente en este documento: g gramo(s) mg miligramo(s) ml mililitro(s) TA temperatura ambiente PEG poli(etilenglicol) El contenido completo de todas las¡ publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en esta descripción se incorpora en este documento como referencia como si se indicara específica e individualmente que se incorpora como referencia cada publicación, patente o solicitud de patente individual. Aunque la invención anterior se ha d scrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para aclarar la comprensión, será evidente para un especialista en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que pueden realizarse cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Los siguientes 'ejemplos se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención, que se ha descrito en términos amplios anteriormente. En los siguientes ejemplos, la hGH es la de la SEC ID N°:1. Se entenderá que otros polipéptidos de hGH también podrían PEGilarse de una manera similar a la ejemplificada en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH o H ,C •0(CH CH:0) l-l2CM CH \x - -0(CH,CH,())mCH- donde (CH2CH2O)n tiene un peso molecular medio de aproximadamente 3 Kd y cada ¡ (CH2CH2O)m tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20 Kd I (GL3-400AL2) Este ejemplo demuestra la generación de hGH mono-PEGilada i N-terminalmente por alquilacíón reductora. El reactivo de PEG aldehido I ramificado con glicerol con un peso molecular de aproximadamente 43.000 (GL3-400AL2 NOF Corporation) se acopló por alquilacíón reductora al extremo I N de hGH aprovechando la diferencia en el valor de pKa relativo de la amina primaria en el extremo N frente a los valores de pKj de aminas primarias en la posición e-amino de restos de lisina. Se hizo reaccionar proteína hGH disuelta a 4, 7 ó 10 mg/ml en MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 5.8 o HEPES 20 mM pH 7.0 con PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol por medio de la adición del reactivo para producir una relación molar relativa de PEG:hGH de 1.5:1 , 2:1 , 3.4:1 , 4:1 ó 5:1. Las reacciones se catalizaron por medio de la adición de Piridina Borano (Sigma Chemical, St. Louis, MO), a una concentración final de 10 mM. Las reacciones se realizaron en la oscuridad a 4 grados C durante 16-87 horas. Las reacciones se detuvieron por dilución en tampón apropiado para la purificación. La Tabla 1 muestra el porcentaje de especies multi-PEGiladas, conjugados mono-PEGilados, hGH sin reaccionar y rendimiento de purificación final para PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH que ha reaccionado durante 63 horas a un pH de 5.8 y una relación molar de 1.5:1 :1.
CUADRO 1 Proceso de Síntesis y Purificación de conjugado de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH EJEMPLO 2 Purificación de hGH PEGilada Se purificaron especies de hGH PEGilada a partir de la mezcla de reacción hasta >95% (análisis SEC Figura 1 ) usando una sola etapa de cromatografía de intercambio iónico.
Cromatografía de intercambio aniónico Las especies de PEG hGH se purificaron a partir de la mezcla de reacción hasta >95% (análisis SEC Figura 1 ) usando una sola etapa de cromatografía de intercambio aniónico. La hGH mono-PEGilada se purificó de las especies de hGH no modificada y de hGH multi-PEGilada usando cromatografía de intercambio aniónico. Se purificó una mezcla de reacción típica de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH (80 ó 1500 mg de proteína), como se ha descrito anteriormente, en una columna Q-Sepharose Hitrap (5 ml)(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) o en una columna Q-Sepharose (26/20, volumen del lecho 70 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) equilibrada en HEPES 25 mM, pH 7.3 (Tampón A). La mezcla de reacción se diluyó 7X con tampón A y se introdujo en la columna a un caudal de 2.5 ml/min. La columna se lavó con 3-10 volúmenes de columna de tampón A. Posteriormente, las diversas especies de hGH se eluyeron de la columna en 20 volúmenes de columna de Tampón A y un gradiente lineal de NaCI de 0-100 mM. El eluyente se controló por absorbancia a 280 nm (A 8o) y se recogieron las fracciones de tamaño apropiado. Se recogieron fracciones en relación con el grado de PEGilación, por ejemplo, mono, di, tri etc. (como se evalúa emel ejemplo 3). El conjunto después se concentró a 0.5-5 mg/ml en un concentrador Centriprep YM10 (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA) o por diafiltración. La concentración proteica del conjunto se determinó por A28o usando un coeficiente de extinción de 0.78.
EJEMPLO 3 Caracterización Bioquímica Los conjuntos de hGH PEGilada purificada se caracterizaron por SDS-PAGE no reductora, Cromatografía de Exclusión Molecular no desnaturalizante y mapeo de péptidos.
Cromatografía Líquida de Exclusión Molecular de Alta Resolución (SEC-HPLC) La mezcla de reacción de PEG aldehido de 43K ramificado con glícerol con hGH, los grupos de purificación de intercambio aníónico y los productos purificados finales se evaluaron usando SEC-HPLC no desnaturalizante. La SEC-HPLC analítica no desnaturalizante se realizó usando una columna TSK G4000PWXL (Tosoliaas) o Shodex KW-804 (Waters Corp) en Fosfato 20 mM pH 7.2, NaCI 150 mM a un caudal de 0.5 ml/minuto (opcionalmente, Superdex 200 7.8 mm X 30 cm, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). La PEGilación aumenta en gran medida el volumen hidrodinámico de la proteína dando como resultado un desplazamiento a un tiempo de retención anterior. Se observaron nuevas especies en las mezclas de reacción de PEG aldehido hGH junto con la hGH no modificada. Estas especies PEGiladas y no PEGiladas se separaron en I una cromatografía en Q-Sepharose, y posteriormente se demostró que las especies de mono PEG-aldehído hGH purificadas resultantes eluían como un solo pico en SEC no desnaturalizante (> 95% pureza, Figura 1 ). La etapa de cromatografía en Q-Sepharose retiró eficazmente el PEG libre PEG, hGH, y las especies de hGH multi PEGiladas de la hGH mono-PEGilada.
SDS-PAGE Se usó SDS-PAGE para evaluar la reacción de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol con hGH y los productos finales purificados. La SDS-PAGE se realizó en geles 10-NuPAGE de 1 mm de espesor (Invitrogen, Carisbad, CA) en condiciones reductoras y no reductoras y se tiñó usando un kit de tinción Novex Colloidal Coomassie™ G-250 (I vitrogen, Carlsbad, CA.
Secuencia N-terminal Se usa la química de la degradación de Edman automática para determinar la secuencia de la proteína NH2-terminal. Para la degradación se emplea un secuenciador Applied Biosystems Model 494 Procise (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Los derivados PTH-AA respectivos se identifican por análisis RP-HPLC de una manera on-line empleando un analizador Applied Biosystems Model 140C PTH ajustado a una columna Perkin Elmer/Brownlee 2.1 mm d.i. PTH-C18.
Mapeo de Péptidos Se realizaron digestiones tríptícas a > una concentración de 1 mg/ml y típicamente se usaron 25 µg de material por digestión. Se añadió tripsina de tal manera que la relación entre tripsina y PEG-hGH fue de 1 :30 (p/p). Estaba presente tampón Tris a 30 mM, ' pH 7.5. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 16 + 0.5 horas. Las reacciones se inactivaron por la adición de 50 µl de HCl 1 N por ml de solución de digestión. Las muestras se diluyeron, antes de poner las muestras en el automuestreador, a una concentración final de 0J25 mg/ml en acetonitrilo al 6.25%. Primero se añadió acetonitrilo (a acetonitrilo al 19.8%), se mezcló suavemente y después se añadió agua hasta conseguir el volumen final (cuatro veces el volumen de partida). La solución de digestión sobrante puede retirarse y almacenarse durante un periodo de hasta 1 semana a -20°C. Para el análisis se usó un sistema de HPLC Waters Alliance 2695, pero otros sistemas producirían resultados similares. Se usó una columna Astee C-4 polimérica de 25 cm x 4.6 mm con partículas de 5 µm. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente en una carga típica de 50 µg de proteína por muestra. El tampón A es ácido trifluoroacético al 0.1 % en agua; el tampón B era ácido trifluoroacético al 0.085% en acetonitrilo. Las muestras se eluyeron con un gradiente lineal de 0-45% de B durante 90 minutos. Los picos se detectaron usando un detector Waters 996 PDA que recogía los datos entre 210 y 300 nm. El cromatograma extraído a 214 nm se usó para el análisis de la muestra. Se realizaron mapas trípticos para hGH y PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol que habían reaccionado a una relación molar de 2:1 (PEG:hGH), (Figura 2). El fragmento tríptico N-terminal se denominó T-1. El porcentaje de T-1 presente en comparación con la hGH no PEGilada sugiere que más de 99% de la modificación con PEG se realiza en el extremo N, uniéndose aparentemente el resto a uno de los diversos restos de lisina I posibles.
CUADRO 2 Comparación de T-1 presente EJEMPLO 4 Biología in vitro La capacidad del PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH para reconocer el receptor humano se ensayó usando un instrumento Biacore 3000 en el ensayo configurado para evaluar las interacciones I específicas entre el conjugado y el receptor de la hormona del crecimiento I humana (hGHR) (dominio extracelular de 28 kDa). Los resultados de los experimentos de resonancia de plasmón superficial (SPR) se muestran más adelante en la Tabla 3.
CUADRO 3 Resultados del ensayo Biacore. 3 La ka (proporción de activación) y la kd (proporción de inactivación) se determinaron a un caudal de 50 µl/min a 37°C en tampón HEP-BES (Hepes 0.01 M, pH 7.4, más NaCI 0.15 M, EDTA 3 mM, y Tensioactívo P20 al 0.005%), usando proteína de unión de la hormona del crecimiento humana (28 kDa, dominio extracelular) marcada en un chip CM5 por medio de la química de acoplamiento de amina a ?RU=3000-5000. La ka, expresada como M por segundo, y la kd expresada por segundo, son un valor medio de al menos 3 mediciones en 1 chip ± desviación típica. Los datos asumen que se mide la unión de hGH al sitio 1 de alta afinidad en GHBP a una relación 1 :1.
EJEMPLO 5 Estudios Farmacodinámicos Potencia in vivo Eficacia en Ensayos de 11 días en Ratas (aumento de peso, crecimiento de la tibia, reducción de BUN en suero) Aumento de peso en la rata Se preseleccionaron ratas Sprague Dawley hembra, hipofisectomizadas en Harían Labs, para la velocidad de crecimiento durante un periodo de 4 a 10 días. Las ratas se dividieron en grupos de seis. Empezando el día 0, las ratas de control recibieron una inyección subcutánea diaria de 0.3 mg/kg de hGH o vehículo durante once días consecutivos. El grupo de ensayo recibió dosis únicas (una vez/semanalmente) de 1.8 mg/kg de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH en los días 0 y 6. Los animales se pesaron diariamente. La Figura 4 muestra los efectos de la hGH y de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH sobre el aumento de peso corporal en un estudio representativo. Combinando los datos representados1 por el estudio presentado en la Figura 4 con los datos de estudios históricos del crecimiento durante 11 días para ratas tratadas con hGH (control) más un estudio de crecimiento adicional que usa el conjugado de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH, el aumento de peso medio para los animales tratados una vez por semana con 1.8 mg/kg de conjugado fue 109% del conseguido después i de la administración diaria de hGH (acumulativa 3.3 mg/kg).
Longitud de tibia de rata Se sacrificaron animales del estudio ¡de aumento de peso de 11 días en el día 11 , se extrajeron las tibias izquierdas, se radiografiaron y se midieron las longitudes de los huesos usando un calibre. La Figura 5 muestra las mediciones de las longitudes de las tibias para los anímales tratados con PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH. ¡ Niveles de BUN en rata Como biomarcador para los efectos metabólicos después del tratamiento con hGH, se determinaron los niveles de nitrógeno de urea en sangre a partir de muestras de sangre del día 11. La Figura 6 demuestra que tanto el tratamiento diario con hGH como el tratamiento de una I vez/semanalmente con PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH produce una reducción significativa del nitrógeno dé urea en sangre.
Estudio de Aumento de Peso en Rata con Aumento de la Dosis en 6 Días Se trataron ratas hipofisectomizadas con diversas dosis individuales de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH o, por el contrario, se trataron diariamente con hGH, y se controló el aumento de peso durante 6 días. La Figura 7 muestra el aumento de peso que se obtuvo para los diversos grupos de tratamiento. Se tomaron 'muestras de sangre a los tiempos indicados y los niveles de IGF-1 en suero de determinaron por ELISA. Los datos representados son medias +/- SEM. Se usaron medias de grupo (n=6) para calcular la respuesta de IGF-1 usando un análisis de varianza de una vía sobre los valores medidos y se determinaron valores de AUCdO-6 (ng-h/ml) de 20.040, 22.958, 28.129 y 37.839 para los grupos de dosificación de 0.067, 0.2, 0.6 y 1.8 mg/kg, respectivamente.
Estudio de Aumento de Peso en Rata con Aumento de la Dosis en 11 Días En un segundo estudio, los animales se trataron con 1.8 mg/kg o con una dosis mayor, es decir, 5.1 mg/kg del conjugado de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol y hGH, en el día 0 y de nuevo en el día 6. La Tabla 4 muestra el aumento de peso relacionado con la dosis a los 6 días y a los 11 días en comparación con el conseguido después de la administración diaria (QD 11 ) de vehículo o la administración diaria de hGH (a 0.3 mg/kg/d).
CUADRO 4 Peso en relación con la dosis en el día 6 y 11. aumento de peso medio (g) medido desde, el día 0; PC, peso corporal; hGH, hormona del crecimiento humana. Los valores representan la media + SEM (error típico de la media). Los valores entre paréntesis representan e I cambio desde el día 0 en la media ± SEM.
Estudios de IGF-1 Se usaron animales de estudios de aumento de peso de seis días. Se tomaron muestras de sangre a los diversos tiempos durante el estudio y se determinaron los niveles de IGF-1 en suero por ELISA como se muestra en la Figura 8. Los niveles de IGF-1 de rata se controlaron por un kit de inmunoensayo (Diagnostic System Laboratories).
EJEMPLO 6 Estudios Farmacocinéticos Los estudios farmacocinéticos se realizaron en ratas Sprague-Dawley macho canuladas. Las inyecciones se realizaron como una sola dosis intravenosa de 1.0 mg/kg o como un solo bolo subcutáneo de 1.8 mg/kg de hGH o de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH usando seis ratas por grupo. Se tomaron muestras de sangreí durante uno a cinco días cuando fue apropiado para la evaluación de los parámetros de PK relevantes. Los niveles sanguíneos de hGH y de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH se controlaron en cada muestreo usando inmunoensayo. La Tabla 4 muestra los parámetros PK de rata para el PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH. El efecto de la PEGilación es evidente en la vida media observada de eliminación, ya que este parámetro excedía de 6 horas para el conjugado mientras que los datos presentados para la hGH a partir de estudios similares son 1.35±0.2 (Clark ibid,) 0.77-1.7 (Jorgensen et.ai, "Polyetilene glycol-conjugated proteins", PSTT 1 (8), noviembre de 1998), o 1 hora (Genotropin® (PNU-180307) Investigator Brochure).
Inmunoensayo de hGH Los niveles de concentración de proteína hGH y PEG aldehido i de 43K ramificado con glicerol-hGH en plasma de rata se determinaron usando el inmunoensayo de fluorescencia de hGH del kit AutoDELFIA (Perkín- Elmer).
CUADRO 5 La relación entre los niveles de fármaco en plasma y la I respuesta de IGF-1 también se determinó directamente en un diseño de I estudio exhaustivo después de la administración subcutánea de una sola dosis de PEG aldehido de 43K ramificado con glicerol-hGH (1.8-mg/kg) a roedores hembra hipofisectomizados.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un conjugado de polietilenglicol-hormona del crecimiento (PEG-hGH) que tiene la estructura; en la que n es un número entero comprendido entre 60 y 75; m es un número entero comprendido entre 450 y 460; y R es una hormona del crecimiento humana. 2.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho resto (CH2CH2O)n tiene un peso molecular medio de aproximadamente 3 Kd y cada resto (CH2CH2O)m tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20 Kd. 3.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además poique dicha hormona del crecimiento humana comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:1. A.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el ¡PEG está conjugado en la fenilalanina N-terminal de la SEC ID N°:1. 5.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho conjugado está mono-PEGilado. 6.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque al menos 80% del PEG está conjugado en el grupo alfa-amino de la fenilalanina N-terminal de la SEC ID N°:1. 7.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque al menos 90% del PEG está conjugado en el grupo alfa-amino de la fenilalanina N-terminal de la SEC ID N°:1. 8.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque al ímenos 95% del PEG está conjugado en el grupo alfa-amino de la fenilalanina N-terminal de la SEC ID N°:1. 9.- El conjugado de PEG-hGH de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque al menos 98% del PEG está conjugado en la fenilalanina N-terminal de la SEC ID N°:1. 10.- El uso del conjugado de hormona del crecimiento humana-PEG de la reivindicación 1-9, en la elaboración de un medicamento útil para tratar a un paciente que tiene un trastorno del crecimiento o del desarrollo. 11.- El uso que se reclama en la reivindicación 10, donde dicho I trastorno del crecimiento o del desarrollo se selecciona entre el grupo que consiste en deficiencia de hormona del crecimiento (GHD), síndrome de I Turner, insuficiencia renal crónica y baja estatura| para la edad gestacional (SGA). : 12.- El uso que se reclama en la reivindicación 11 , donde dicho i trastorno del crecimiento o del desarrollo se selecciona entre el grupo que consiste en disfunción eréctil, lipodistrofia por VIH,1 fibromialgia, osteoporosis, trastornos de la memoria, depresión, enfermedad de Crohn, displasias esqueléticas, lesión traumática cerebral, hemorragia subaracnoidea, síndrome de Noonan, síndrome de Down, corta estatura idiopática (ISS), enfermedad renal en fase terminal (ESRD), peso muy bajo en el nacimiento (VLBW), rescate de células madre de médula ósea, síndrome metabólico, miopatía por glucocorticoides, baja estatura debido al tratamiento con glucocorticoides en niños, y falta de crecimiento en niños prematuros de baja estatura.
MX2007002441A 2004-08-31 2005-08-25 Conjugados de hormona del crecimiento humana y polietilenglicol ramificado con glicerol, proceso para su preparacion y metodos de uso de los mismos. MX2007002441A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60594504P 2004-08-31 2004-08-31
PCT/IB2005/002939 WO2006024953A2 (en) 2004-08-31 2005-08-25 Glycerol branched polyethylene glycol human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2007002441A true MX2007002441A (es) 2007-05-04

Family

ID=35708806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2007002441A MX2007002441A (es) 2004-08-31 2005-08-25 Conjugados de hormona del crecimiento humana y polietilenglicol ramificado con glicerol, proceso para su preparacion y metodos de uso de los mismos.

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP1789092A2 (es)
JP (1) JP2008511610A (es)
KR (1) KR20070042567A (es)
CN (1) CN101010105A (es)
AP (1) AP2007003919A0 (es)
AR (1) AR050851A1 (es)
AU (1) AU2005278903A1 (es)
BR (1) BRPI0515118A (es)
CA (1) CA2577999A1 (es)
CR (1) CR8942A (es)
EA (1) EA200700380A1 (es)
EC (1) ECSP077281A (es)
GT (1) GT200500235A (es)
IL (1) IL181085A0 (es)
MA (1) MA28908B1 (es)
MX (1) MX2007002441A (es)
NL (1) NL1029828C2 (es)
NO (1) NO20071322L (es)
PE (1) PE20060654A1 (es)
TN (1) TNSN07078A1 (es)
TW (1) TW200621291A (es)
UY (1) UY29088A1 (es)
WO (1) WO2006024953A2 (es)
ZA (1) ZA200701802B (es)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1881005B1 (en) 1997-07-14 2013-04-03 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of G-CSF and related proteins
US7495087B2 (en) 1997-07-14 2009-02-24 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11
ATE526401T1 (de) 1999-01-14 2011-10-15 Bolder Biotechnology Inc Verfahren zur herstellung von proteinen mit freien cysteinresten
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP1834963A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-19 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
MX2008014358A (es) * 2006-05-12 2008-11-24 Dong A Pharm Co Ltd Conjugado de polietilenglicol-interferon alfa.
JP2008069073A (ja) * 2006-09-12 2008-03-27 Yokohama Tlo Co Ltd ラクトフェリン複合体及びその製造方法
KR101079993B1 (ko) 2006-11-17 2011-11-04 동아제약주식회사 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
AU2009274738B2 (en) * 2008-07-23 2012-12-13 Hanmi Science Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
CN102131844B (zh) 2008-07-31 2016-03-02 药华医药股份有限公司 肽-聚合物缀合物
SG195531A1 (en) * 2008-10-10 2013-12-30 Bionic Ear Inst Biodegradable polymer - bioactive moiety conjugates
EP2340271B1 (en) * 2008-10-10 2018-12-05 PolyActiva Pty Ltd. Polymer-bioactive agent conjugates
US8535655B2 (en) 2008-10-10 2013-09-17 Polyactiva Pty Ltd. Biodegradable polymer—bioactive moiety conjugates
PT2393828T (pt) 2009-02-03 2017-01-18 Amunix Operating Inc Polipéptidos recombinantes estendidos e composições que compreendem os mesmos
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
EP2461831B1 (en) 2009-08-06 2018-11-21 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
CN101831067A (zh) * 2010-05-31 2010-09-15 王二新 聚乙二醇脂类缀合物及其在制备药物中的应用
EP2446898A1 (en) 2010-09-30 2012-05-02 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients
CN102367290B (zh) * 2011-04-26 2013-05-08 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 链官能化的多级支化聚乙二醇及其合成方法
WO2014110867A1 (zh) * 2013-01-17 2014-07-24 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 一种单一官能化的支化聚乙二醇及其修饰的生物相关物质
CN104877127B (zh) 2015-06-23 2017-11-10 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种八臂聚乙二醇衍生物、制备方法及其修饰的生物相关物质
KR20230079520A (ko) 2014-11-06 2023-06-07 파마에센시아 코퍼레이션 Peg화된 인터페론의 투약 요법
ES2909454T3 (es) * 2017-12-29 2022-05-06 Hoffmann La Roche Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada
SG11202005990RA (en) * 2017-12-29 2020-07-29 Hoffmann La Roche Process for providing pegylated protein composition
SI3731872T1 (sl) 2017-12-29 2022-04-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za zagotavljanje sestavka PEGiliranih beljakovin

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000109A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
JP3092531B2 (ja) * 1996-11-05 2000-09-25 日本油脂株式会社 コハク酸イミジル基置換ポリオキシアルキレン誘導体の製造方法
EP1881005B1 (en) * 1997-07-14 2013-04-03 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of G-CSF and related proteins
JP3921781B2 (ja) * 1998-02-12 2007-05-30 日本油脂株式会社 カルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物
ATE526401T1 (de) * 1999-01-14 2011-10-15 Bolder Biotechnology Inc Verfahren zur herstellung von proteinen mit freien cysteinresten
PL374354A1 (en) * 2001-11-20 2005-10-17 Pharmacia Corporation Chemically-modified human growth hormone conjugates
KR100974843B1 (ko) * 2002-09-09 2010-08-11 넥타르 테라퓨틱스 수용성 중합체 알카날
JP4412461B2 (ja) * 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
EP1581260B1 (en) * 2002-12-31 2014-09-17 Nektar Therapeutics Polymeric reagents comprising a ketone or a related functional group
LT2644206T (lt) * 2003-05-23 2019-05-27 Nektar Therapeutics Peg dariniai, susidedantys iš dviejų peg grandinių

Also Published As

Publication number Publication date
EP1789092A2 (en) 2007-05-30
AP2007003919A0 (en) 2007-02-28
WO2006024953A3 (en) 2007-01-18
UY29088A1 (es) 2006-03-31
NL1029828A1 (nl) 2006-03-01
ZA200701802B (en) 2008-08-27
MA28908B1 (fr) 2007-10-01
GT200500235A (es) 2006-03-21
IL181085A0 (en) 2007-07-04
CA2577999A1 (en) 2006-03-09
JP2008511610A (ja) 2008-04-17
WO2006024953A2 (en) 2006-03-09
AR050851A1 (es) 2006-11-29
AU2005278903A1 (en) 2006-03-09
PE20060654A1 (es) 2006-08-12
TNSN07078A1 (fr) 2008-06-02
NL1029828C2 (nl) 2006-10-20
TW200621291A (en) 2006-07-01
BRPI0515118A (pt) 2008-07-01
NO20071322L (no) 2007-05-29
CR8942A (es) 2007-08-16
KR20070042567A (ko) 2007-04-23
ECSP077281A (es) 2007-03-29
EA200700380A1 (ru) 2007-10-26
CN101010105A (zh) 2007-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2007002441A (es) Conjugados de hormona del crecimiento humana y polietilenglicol ramificado con glicerol, proceso para su preparacion y metodos de uso de los mismos.
EP1715887B1 (en) N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and use thereof
EP2279007B1 (en) Pegylated recombinant human growth hormone compounds
KR20050044858A (ko) 화학적으로 개질된 인간 성장 호르몬 콘쥬게이트
NL1032282C2 (nl) N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan.
US20030171285A1 (en) Chemically-modified human growth hormone conjugates
US20040038892A1 (en) Chemically-modified human growth hormone conjugates
Finn PEGylation of human growth hormone: strategies and properties
MXPA06008888A (es) Conjugados de la hormona del crecimiento humana monopegilados en el extremo n, procedimiento para su preparacion y metodos para usarlos