CONJUGADO DE POLIETILENGLICOL-INTERFERÓN ALFA CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con conjugado de pólietilenglicol tri-ramificado-interferón alfa. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El interferón fue descubierto en 1975 pos Isaacs y Lindenmann, y se ha sabido que tiene excelente efecto contra virus [Isaacs y col, Virus interférente, 147 (1975)]. El interferón se clasifica en Tipo I (IFN-a, ß y ?) y Tipo II (IFN-Y) , y las células generadas por interferón son diferentes tales como células blancas, fibroblasto, célula-T, etc. El interferón alfa modificado se permitió y empezó a usarse como un agente terapéutico para leucemia de célula peluda desde 1986. De esta manera, el interferón es la primera citosina producida por tecnologia de recombinación de gene y usada par.a tratar cáncer [Pestka y col., Semin. Oncol., 24 (1997) ] . El interferón alfa es una proteina farmacéuticamente activa que tiene actividades antivirales y antitumorales, y se ha usado para tratar más de 14 clases de tumor y enfermedades de virus en más de 40 naciones en el mundo. Los campos de tratamiento clínicamente efectivos de
interferón alfa son leucemia de célula peluda, sarcoma dé Kaposi, Leucemia Mielógena crónica (MCL) , linfoma de célüla-B, linfoma de célula-T, melanoma, mieloma, carcinoma de célula renal [Nagabh.ush.an T.L. y col., Práctica regulatoria para producción biofarmacéutica, 221-234 (1994)]. Asimismo, el interferón es la primera proteína humana que puede aumentar la extensión de vida de paciente de cáncer, y se espera ser capaz de aplicarse a diferentes clases de tumores tales como cáncer ovárico, cáncer de pecho, cáncer bronquial, cáncer de vejiga, cáncer gástrico y otros, y leucemia aguda [Mosbe Talpaz y col, Seminars in Heptagology, 38(3), 22-27 (2001)]. Particularmente, para tratar hepatitias tipo B o tipo C, el interferón alfa-2a (INFalfa-2a) , interferón alfa-2b, e interferón conl (IFN-conl) como muteína del mismo se usa actualmente. Y, se ha reportado que si la infección mediante virus tal como virus de hepatitis tipo B (HBV) o virus de hepatitis tipo C (HCV) se progresa crónicamente, existe un riesgo de que la infección puede progresar a carcinoma heptaocelular . Por lo tanto, el interferón se puede usar para prevenir el cáncer. Sin embargo, el interferón como remedio de proteína clínicamente útil tiene problemas tales como baja estabilidad
in vivo, eliminación rápida in vivo, formación de anticuerpo mediante administraciones repetidas y reacción dé hipersensibilidad por la misma, como enzimas, proteínas, hormonas, péptidos generados por métodos de ingeniería genética. En particular, . la administración frecuencia tal como una vez al día, tres veces por semana, etc., induce dolor en pacientes. Además, para aquellos pacientes que necesitan un tratamiento durante un período de tiempo prolongado, dicha administración puede amenazar su calidad de vida . Para mejorar estos problemas, como una medicina que pueda ser estable y mantener la actividad durante un período de tiempo prolongado, se desarrolló un polietilenglicol que modifica el remedio de proteína y se están usando actualmente . El polietilenglicol es fuertemente hidrofílico, y puede aumentar la solubilidad en el momento de enlazarse4 con proteína terapéutica. Asimismo, el polietilenglicol es efectivo para aumentar la cantidad molecular de proteína enlazada al mismo, con mantenimiento de las funciones biológicas principales tales como actividad de enzima y enlace receptor. De esta manera, el polietilenglicol puede
disminuir la filtración glomerular, y proteger la proteina ef ctivamente de enzima proteolitica para descomponer la proteina. Por lo tanto, el polietilenglicol tiene las ventajas de prevenir degradación de proteina, aumentar la estabilidad y el tiempo de circulación de proteina, y disminuir la inmunogenicidad. El polietilenglicol lineal comúnmente usado tiene un peso molecular de alrededor de 1,000-25,000 daltons, pero tiene una limitación en enlazar muchas moléculas elevadas li8neales a proteina o péptido, con mantenimiento de sus actividades, debido a las regiones activas biológicas limitadas de proteina y péptido. Para mejorar estos problemas de polietilenglicol lineal, Wana, H y col trataron de enlazar derivados de mono-metoxi polietileno (mPEG) a proteina usando triclorotriazina [Wana, H y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 613:95-108 (1990=] Sin embargo, el tamaño de derivados de polietilenglicol ramificados activados es grande, y asi induce impedimento estérico en las superficies de proteina o péptido, reduciendo de esta manera las actividades de proteina o péptido modificado. Asimismo, los der9ivados usualmente ocasionan bajo rendimiento de purificación debido a derivados de polietilenglicol ramificados incompletos .
La patente coreana No. 0396983 trató de mejorar estos problemas de los derivados moleculares elevados ramificados. En particular, la patente trató de minimizar la reducción de actividad biológica protegiendo la estructura de proteina a través de la minimización del número de reticuladores enlazados a regiones biológicamente activas prolongando los reticuladores para conectar molécula elevada y proteina, y reduciendo el impedimento estérico inducido por las moléculas elevadas ramificadas. Sin embargo, tri-PEG-NHS que es derivados moleculares elevados ramificados activados que tienen reticuladores largtos contienen exceso de PEG-NHS lineal y Di-PEG-NHS que tiene cantidades moleculares pequeñas como impurezas cuando la estructura de reticulador se prepara. Participan competitivamente en la reacción de enlace a interferón, y generan conjugado de PEG-ínterferón alfa molecular bajo y conjugado de Di-PEG-interferón alfa que son difíciles de purificar. De esta manera, este método tiene problemas de baja pureza y bajo rendimiento. Por lo tanto, todavía ha existido la necesidad de conjugado de polietilenglicol macromolecular-interferón que pueda reducir al mínimo la bioactividad de interferón alfa, y tener pureza elevada y buena estabilidad. EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN
OBJETOS DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención es proporcionar conjugados de polietilenglicol tri-ramificado-i9nterferón alfa, que tiene pureza y rendimiento de producción elevados, que aumenta la vida media en sangre, y reduce al mínimo la reducción de bioactividad de interferón en comparación con conjugados de interferón alfa y poliegilenglil-interferón conocidos en el ramo; un método de preparación del mismo, una composición farmacéutica que contiene el mismo. SOLUCIÓN TÉCNICA Para lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona un derivado de polietilenglicol tri-ramificado de enlace de molécula elevado a interferón alfa, y que tiene purezas elevada, y una composición farmacéutica que contiene la molécula. La presente invención se explica con detalle abajo. El conjugado de polietilenglicol-interferón alfa se genera mediante una reacción de enlace de derivados de polietilenglicol tri-ramificados e interferón alfa, y se puede representar mediante la siguiente fórmula general (1),
en donde n es un entero de 1 a 1,000, y m es un entero de 10 a 1,000. En el conjugado anterior, el peso molecular promedio de polietilenglicol es de 400 a 45,000 daltons, de preferencia 30,000 a 45,000 daltons, más preferentemente 43,000 daltons. Como el peso molecular del polietilenglicol es superior, las farmacocinéticas del conjugado molecular elevado son mejores, pero la actividad se disminuye. Asi, es importando un peso molecular apropiado. Z es (CH2)2 o (CH2)sNHCO(CH2)s para hacer el papel de interferón alfa y polietilenglicol, en donde S es un entero de 1 a 6. Y es una amina secundaria o un enlace de amida, formado mediante una reacción de enlace de grupo funcional NH2 de molécula de interferón y un grupo funcional de derivado de polietilenglicol. Asimismo, la presente invención proporciona un método para preparar conjugado de polietilenglicol tri-ramificado-interferón alfa como se muestra en la fórmula
general (1) en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular de 400 a 45,000 daltons, de preferencia 30,000 a 45,000 daltons, más preferentemente 43,000 daltons. Los derivados de polietilenglicol tri-ramificado de la presente invención son molécula elevada que tiene estructura ramificada que se combinan tres moléculas elevadas receptivas biológicas lineales . Todas las tres regiones OH (hidroxi) en la estructura de glicerol se polimerizan con moléculas de unidad de etilenglicol, y el final de una región se activa como un grupo funcional. Las otras dos regiones excepto la región activada se substituyen con monometoxi para impedir reacciones adicionales. Cuando los derivados de polietilenglicol ramificado anteriores se preparan, el tamaño de cada polietilenglicol lineal se puede controlar libremente, mediante lo cual se puede preparar una molécula elevada que tiene estructura y peso molecular apropiados y ligarse al interferón alfa. El derivado de polietilenglicol (PEG) ramificado que se enlaza a interferón alfa, se representa mediante la siguiente fórmula general (2)
en donde, n es un entero de 1 a 1,000 y m es un entero de 10 a 1,000. El peso molecular promedio de .unidad de polietilenglxcol del conjugado es de 400 a 45,000 daltons, de preferencia 30,000 a 45,000 daltons, más preferentemente
43,000 daltons. X es un grupo funcional que puede reaccionar químicamente a interferón alfa que contiene proteina o péptido, como se muestra en la fórmula general (3) abajo. De preferencia, x es N-hidroxisuccinimida (a) o aldehido (b) en el compuesto de la fórmula (3) , y cada uno forma enlace de amida y enlace de estructura de amina secundaria en la reacción de enlace a interferón alfa en rendimientos elevados .
(3)
Z es (CHs)s o (CH2)sNHCO(CH2)s para representar un papel réticulador de 9interferón alfa y polietilenglicol en donde S es un entero de 1 a 6. En esta invención, la relación molar de reacción de interferón alfa al derivado de polietilenglicol ramificado es de 1:0.5 a 1:50. De preferencia, la relación molar de interferón alfa al derivado de polietilenglicol ramificado es de 1:05. a 1:3. A medida que se aumenta la relación molar de polietilenglicol a interferón alfa, el rendimiento de conjugado de monopolietilenglicol-interferón alfa por tiempo unitario se disminuye. Asimismo, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar o prevenir enfermedades receptoras de interferón alfa, que comprende un conjugado de polietilenglicol-interferón alfa de conformidad con esta invención como un ingrediente activo. La composición se puede componer en una dosis efectiva de conjugado de polietilenglicol interferón alfa de la presente invención, diluyente, antisépticos, solubilizador, emulsionante, juvancia, y/o portador. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular a un agente de inyección, una cápsula, una tableta, una droga liquida, una pildora, un
ungüento, un oculento, un colirio, un agente absorbente transdérmico, una pasta, un cataplasma, un agente de parche, un aerosol, etc. Y la dosificación efectiva de composición farmacéutica de la presente invención se puede variar de conformidad con la edad, condición, peso, etc., del paciente, pero generalmente una vez a la semana o una vez cada dos semanas. Y, la composición se puede administrar una vez o muchas veces al dia dentro de una escala de dosificación efectiva diariamente. Además, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir' enfermedades receptoras de interferón alfa, que comprende administrar el conjugado de la presente invención como un ingrediente efectivo. Las enfermedades receptoras de interferón alfa incluyen leucemia de célula peluda, sarcoma de Kaposi, Leucemia Mielógena crónica (CML) , linfoma de célula-B, linfoma de célula-T, melanoma, mieloma, carcinoma de célula renal. Y la enfermedad incluye cáncer ovárico, cáncer de pecho, cáncer bronquial, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, etc., y los otros cánceres como leucemia aguda. La presente invención se explica particularmente por los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar adicionalmente la presente invención,
pero el alcance de la presente invención no se pretende que esté limitada por los mismos en forma alguna. EFECTOS DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con conjugados de polietilenglicol tri-ramificado-interferón alfa nuevos, biológicamente activos que tienen estructura de glicerol. Asi, esta invención se caracteriza en que tiene pureza elevada y rendimiento elevado, reduciendo al mínimo- la reducción de bioactividad, y aumentar la vida media en sangre, superando los problemas que el polietilenglicol lineal no puede enlazar muchas moléculas elevadas lineales a proteína o péptido; · derivados moleculares elevados ramificados inducen el impedimento estérico excesivo en las superficies de la proteína o péptido; y derivados moleculares elevados ramificados cuyos reticuladores son alargados tienen bajo rendimiento de purificación por baja pureza, etc. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención que contiene conjugado de polietilenglicol-interferón alfa que tiene actividad antivirus y actividad antitumor tiene .los efectos de que la reducción de actividad se minimiza, y el efecto de tratamiento se puede mejorar. Y la incomodidad del paciente se puede reducir al mínimo disminuyendo la frecuencia de
administración debido a la vida media alargada en el cuerpo, comparada con el agente de tratamiento de interferón alfa conocido en el ramo. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo 1 mediante cromatografía líquida de alto funcionamiento de exclusión detamaño (a continuación: SE-HPLC) . La Figura 2 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo 2 mediante SE-HPLC. La Figura 3 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo Comparativo 1 mediante SE-HPLC . La Figura 4 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo Comparativo 2 mediante SE-HPLC. · La # Figura 5 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo Comparativo 3 mediante SE-HPLC. La Figura 6 es un dibujos, esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo Comparativo 4 mediante SE-HPLC. La Figura 7 es un dibujo esquemático que ilustra
los ejemplos analíticos del Ejemplo 1 mediante Ionización de Desorción Láser Ayudada por Matriz - Tiempo de Vuelto (MALD-I-TOF) Espectrómetro de masa (a continuación. MALDI-TOF) . La Figura 8 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo 2 mediante MALDI-TOF. La Figura 9 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo Comparativo 1 mediante MALDI-TOF. La Figura 10 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos del Ejemplo Comparativo 2 mediante MALDI-TOF. La Figura 11 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados de supresión de los efectos citopáticos (CPE) de conjugados de interferón alfa modificados con polietilenglicol del Ejemplo 1, y Ejemplos Comparativos 1 y 3 usando, virus de estomatitis vesicular y células de Riñon Bovino Narbin-Darby (MDBK) . La Figura 12 es un dibujo esquemático que ilustra el analítico comparativo resulta de farmacocinéticas de interferón alfa y el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa del Ejemplo 1. La Figura 13 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados de comparación de efecto de actividades
antitumor de interferón alfa, y el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa del Ejemplo 1, usando células Daudi . La Figura 14 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados de comparación de cambios de actividad biológica de interferón alfa, y conjugado de interferón alfa modificado con polietilenglicol tri-ramificado (PEG, MW243,000) - del Ejemplo 1 de conformidad con el cambio de temperatura . La Figura 15 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de actividades biológicas de interferón-alfa, y conjugados de interferón alfa modificados con el polietilenglicol del Ejemplo 1 a enzima proteolítica y tiempo. MODO PARA LA INVENCIÓN <Ejemplo 1> Preparación de conjugado de polietilenglicol tri-ramificado (PM 43,000) Da) -interferón alfa (I) de la fórmula (1) usando N-hidroxisuccinimida de polietilenglicol tri-ramificado. 68 mg de H-hidroxisuccinimida de polietilenglicol tri-ramificado 8NOF Corporation, Japón) que tiene un peso molecular de 43,000 daltons se añadieron a 10 mg de interferón alfa (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) en 100 mM de tampón
de bicina, H 8.0. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. Y, la reacción se detuvo añadiendo 0.1 M de glicina. Se dio entrada al reactivo en columna de desalación Hiprep10 26/10 8Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 40 mM de solución de tampón de NaH2P04 (pH 4.0) y la solución de tampón se cambió eluyendo con la misma solución de tampón. La N-hidroxisuccinimida separada del polietilenglicol-N-hidroxi succinimidatri-ramificado mediante esta reacción se remoció. Se dio entrada a un eluyente en cromatografía de intercambio de catión SP-Sepharose Fast Flow (£mersham Parhamcia Biotech) equilibrado con 40 mM de solución de tampón de Na¾P04 (pH 40), y luego el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa se separó mediante la cromatografía líquida. El conjugado de polietilenglicol-interferón alfa se fraccionó usando gradiente 0 - 500 mM de gradiente de concentración de cloruro de sodio (NaCl) . La forma y tamaño del eluato fraccionado se confirmó mediante HPLC y SDS-PAGE. Y los conjugados de formas de polietilenglicoles di- o tri-ramificados con interferón alfa, e interferón alfas no modificados restantes después de la reacción se excluyeron, para obtener el conjugado del título, conjugado de polietilenglicol interferón alfa ligado
a un polietilenglicol tri-ramificado (PM 43,000) con un interferón alfa (o llamado como conjugado de- polietilenglicol mono-tri-ramificado-interferón alfa) . Mediante cromatografía liquida de alto funcionamiento de exclusión de tamaño, se confirmó que la mezcla de reactivos consistió de alrededor de 47% de conjugado de mono-polietilenglicol interferón alfa (mono-PEG-INF a), alrededor de 36% de interferón no modificado a (IFN ) , y los otros [conjugado de di-PEGilado interferón alga (di-PEG-IFN a) y N-hidroxisuccinimda (NHS)J {VER LA Figura 1; la absorción se midió a 280 nm; y el tiempo de retención para (a) di-PEG-IFN oc fue alrededor de 8 min, para (b) mono-PEG-IFN OÍ alrededor de 9 min, para (c) IFNa 13.5 min, y para (d9 NHS alrededor de , 15.3 min}. Y, el conjugado de polietilenglicol mono-tres-ramificado interferón alfa se analizó usando el MALDI-TOF, como se muestra en la Figura 7, y el valor fue 65943.2 (m/z (ver la Figura 7) . <Ejemplo 2> preparación de conjugado de polietilenglicol tres-ramificado (PM 43,000 Da) -interferón alfa (II) usando aldehido de polietilenglicol tres-ramificado. 68 mg de aldehido de polietilenglicol tres-ramificado (NOF Corporation, Japón) que tiene un peso molecular de 43,000 daltons se añadieron a 10 mg de
interferón alfa (Donga-A Pharm. Co., Ltd.) en 40 mM de tampón de acetato de sodio (C2H3Na02) , pH 4.0. La mezcla de reacción se agitó durante 14 hr a temperatura fría. Y, el reactivo se introdujo en columna de desalado Hiprep"11 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) igualada con 40 mM de solución de tampón de NaH2P04 (pH 4.0), y luego la solución de tampón se cambió eluyendo don la misma solución de tampón. Luego, el eluato se introdujo en cromatografía de intercambio de catión SP-Sepharose Fast Flo (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 40 mM de solución de tampón de NaH2P04, y el conjugado de polietilenglicol interferón alfa se separó mediante cromatografía líquida. El conjugado de polietilenglicol-interferón alfa se fraccionó usando 0 - 500 mM de concentración de gradiente de cloruro de sodio (NaCl) . Del eluato fraccionado, el interferón alfa restante después de la reacción se excluyó a través de HPLC y SDS-PAGE, para obtener el conjuugado del título, (PM 43,000)-conjugado de interferón alfa (II) (conjugado de polietilenglicol mono-tres-ramificadó interferón alfa) en el que solamente el polietilenglicol tres-ramificado se enlazó a N-terminal de interferón alfa. Se confirmó mediante cromatografía líquida de alto
funcionamiento de exclusión de tamaño que la mezcla consistió de alrededor de 42% de conjugado de mono-polietilenglicol interferón alfa (mono-PEG-IFNa) y alrededor de 55% de interferón ex no modificado (IFN a) {ver la Figura 2; la absorción se midió a 280 mg, y el tiempo de retención de (a) mono-PEG-IFNa fue alrededor de 9.5 min y aquel de (b) IFNa fue alrededor de 14 min.}. Y, la pureza y peso molecular del conjugado de conjugado de polietilenglicol mono-tres-ramificado interferón alfa se confirmó usando ALDI-TOF, y el valor fue 66141.9 (m/z (ver la Figura 8) . <Ejemplo Comparativo 1> Preparación de conjugado de polietilenglicol dos-ramificado (PEG, PM 40,000 Da)-interferón alfa (III) usando polietilenglicol dos-ramificado-N-hidroxisuccinimida 63 mg de polietilenglicol-N-hidroxisuccinimida dos-ramificada (NOF Corporation, Japón) que tiene un peso molecular de 40,000 daltons se añadieron a 10 mg de interferón alfa preparado mediante un método conocido [Pestka,, Sci. ¾m. 249, 36 (1983)] en 100 mM de tampón de bicina, pH 8.0. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. Y, la reacción se detuvo añadiendo 0.1M de glicina. El reactivo se introdujo en columna de desalado
Hiprep*" 26/10 (Amersham Pharmacia Tiotech) equilibrada con 40 mM de solución de tampón aH2PC>4 (pH 4.0) y la solución de tampón se cambió eluyendo con la misma solución de tampón. La N-hidroxisuccinimidaseparada de la succinimida de tres-ramificado polietilenglicol-N-hidroxi mediante esta reacción se removió. Un eluyente se introdujo en cromatografía de intercambio de catión SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 40 mM de solución de tampón de NaH2P04 (pH 4.0), y el conjugado de polietilenglicol interferón alfa se separó del mismo usando la cromatografía líquida. El conjugado de polietilenglicol-interferón alfa se fraccionó usando 0 - 500 mM de concentración de gradiente de cloruro de sodio (NaCl) . La forma y tamaño del eluato fraccionado se confirmó mediante HPLC y SDS-PAGE. Y el interferón alfa restante después de la reacción y los conjugados de interferón alfa a los que están ligados dos (d) o más dos-ramificados polietilenglicoles con un interferón alfa, se separan del mismo, para obtener el conjugado del título, 1 el conjutado de interferón alfa al que solamente dos-ramificado polietilenglicol se enlazó con un interferón alfa. Se confirmó mediante cromatografía líquida de alto funcionamiento de exclusión de tamaño que la mezcla consistió
de alrededor de 405 de conjugado de mono-polietilenglicol-inter4ferón alfa (mono-PEG-IFNc , alrededor de 50% de interferon a no modificado (IFNa) , los otros {conjugado de interferon alfa di-PEGilado (di-PEG-IFN a) , los otros [conjugado de interferon alfa di-PEGilado (di-PEG-IFNcc) , y N-hidroxisuccinimida (NHS) ] {VER LA Figura 3; la absorción se midió a 280 nm, y el tiempo de retención de (a) di-PEG-IFN OÍ fue alrededor de 8 min, que de (b) mono-PEG-IFNa alrededor de 9 min, aquella de (c) IFN ex alrededor de 13.5 min, 1 y aquel de (d) NHS alrededor de 15 min} . Y, el peso molecular se midió para el conjugado mono-dos-ramificado polxetilenglicol interferon alfa separado usando MALDI-TOF, y el valor fue 62708.2 (m/z) (ver la Figura 9) . <Ejemplo Comparativo 2> Preparación de conjugado de dos ramificado polxetilenglicol (PEG, MW 40,000 Da)-interferón alfa (IV) , usando aldehido de dos-ramificado polxetilenglicol . 63 mg de aldehido de dos-ramificado polxetilenglicol (NOF Corporation, Japón) que tiene un peso molecular de 40,000 daltons se añadieron a 10 mg de interferon alfa (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) en 40 mM de tamón de acetato de sodio (CaEb aOa) , pH 4.0. La mezcla de reacción
se agitó durante 10 - 14 horas a temperatura fria. Y, el reactivo se introdujo en columna de desalación Hiprep1^ 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) igualada con 40 mM de solución de tampón de Na¾P04 (pH 4.0), y luego la solución de tampón se cambió eluyendo con la misma solución de tampón. Luego, el eluato se introdujo en cromatografia de intercambio de catión SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech9 equilibrada con 40 mM de solución de tampón de HaH2P04 (pH 4.0), y el conjugado de polietilenglicol interferón alfa se separó mediante cromatografia liquida. El reactivo se fraccionó usando 0 - 500 mM de concentración de gradiente de cloruro de sodio (NaCl) . El eluato fraccionado se confirmó mediante HPLC y SDES-PAGE. Y, el interferón alfa restante después de la reacción se separó del mismo para obtener conjugado de polietilenglicol-interferón alfa (II) al que solamente un dos-ramificado polietilenglicol se enlazó con una N-terminal de conjugado de interferón alfa. Se confirmó mediante cromatografia liquida de alto funcionamiento de alta exclusión que la mezcla consistió de alrededorde 37% de conjugtado demono-polietilenglicol interferón alfa (mono-PEG-IFN a) y alrededor de 60% de interferón no modificado (IFN ) {ver la Figura 4; la
absorción se midió a 280 nm, y el tiempo de retención de (a) mono-PEG-IFN a fue alrededor de 9.5 min, y aquel de (b) IFNa fue alrededor de 14 min} . Y, el peso molecular del conjugado de mono-tres-ramificado polietilenglicol-interferón alfa separado se midió usando MALDI-TOF, y el valor fue 62718.9 (m/z) (ver la Figura 10) . <Ejemplo Comparativo 3> preparación de conjugado de polietilenglicol-interferón alfa que se enlazó un polietilenglicol dos-ramificado estructurado con lisina (PM 4,000 Da) que tiene grupo funcional de áster de N-hidroxisuccinimida (éster de NHS) con un interferón alfa. Conjutado de polietilenglicol dos-ramificado (PM 40,000) interferón alfa se preparó haciendo reaccionar 50 mg de interferón alfa con N-hidroxisuccinimida de polietilenglicol dos-ramificado (Nektar, America, el peso molecular promedio= 40," 000 dalton) , de conformidad con el método descrito en la Patentecoreana No. 10-0254097. Se confirmó mediante cromatografía liquida de alto funcionamiento de exclusión de tamaño que la mezcla consistió de alrededor de 17% de conjugado de mono-polietilenglicol-interferón alfa (mono-PEG-IFN ) , alrededor de 74% de interferón no modificado (IFN OÍ) y N-hidroxisuccinimida (NHS) ] {ver la Figura 5, la absorción se midió a 280 nm, y el
tiempo de retención de (a) di-PEG-IFN . di-PEG-IFN a fue alrededor de 8.5 min, que (b) mono-PEG-IFN alrededor de 9.5 min, aquel de (c) IFN alrededor de 14 min. y alque de (d) NHS alrededor de 16.5 min}. <Ejemplo Comparativo 4> preparación de conjugado de polietilenglicol-interferón alfa que se enlazó con polietilenglicol tres-ramificado estructurado con lisina (PM 43,000 Da) que tiene grupo funcional de éster de N-hidroxisuccinimida (éster NHS) se enlazó con interferón alfa Se preparó tri-PEG-NHS (PM 43,000) mediante el método descrito en la Patente coreana No. 10-0396983, y luego se hizo reaccionar con 3 mg de interferón alfa para obtener conjugado de polietilenglicol tres-ramificado (PM 43,k000) interferón alfa. Se confirmó mediante cromatografía líquida de alto funcionamiento de exclusión de tamaño que la mezcla consistió de alrededor de 32% de conjugado de mono-polietilenglicol interferón alfa (mono-PEG-IFN a) , alrededor de 52% de interferón a no modificado (IFN a), y los otros [conjugado de di-PEGilado interferón alfa (di-PEG-IFN a) y N-hidroxisuccinimida (NHS) ] {ver la Figura 6; la absorción se midió a 280 nm; y el tiempo de retención de (a) di-PEG-IFN ce fue alrededor de 8.5 min, aquel de (b) mono-PEG-IFNa
alrededor de 9.5 min, aquel de (c) IFNa alrededor de 14 min, y aquel de (d) NHS alrededor de 16.5 min}. La caracterización y prueba de actividad farmacológica se condujeron usando los conjugados arriba preparados, y los resultados son como sigue. <Ejemplo Experimental 1> Prueba de reactividad de derivado de polietilenglicol e interferon alfa Para probar la reactividad de derivados de polietilenglicol e interferon alfa arriba usados, la cantidad de conjugado de mono-polietilenglicol interferon alfa generado por hacer reaccionar interferon alfa con polietilenglicol y la cantidad de interferon alfa no modificado se determinaron de las áreas de cresta (Figuras 1 a 6) mediante cromatografía liquida de alto funcionamiento de exclusión de tamaño, como se muestra en los Ejemplo 1 y 2, y los Ejemplos Comparativos 1 a. 4. Como resultado, la reactividad de interferon alfa de conformidad con la estructura de polietilenglicol se puedo obtener (ver los Cuadros 1 y 2) . Considerando la cantidad restante de interferon alfa no modificado y la cantidad de conjugado de mono-polietilenglicol interferon alfa generado, la reactividad de enlace del polietilenglicol tres*-ramificado e interferon alfa
en los Ejemplos 1 y 2 fueron más excelentes. <Ejemplo Experimental 2> El peso molecular y rendimiento de conjugado de polietilenglicol interferón alfa
Los conjugados de polietilenglicol-interferón alfa que tienen pureza elevada obtenidos de los Ejemplos 1 y 2 y Ejemplos Comparativos 1 y 2 se analizaron mediante MALDI-TOF, para confirmar que los resultados corresponden a los pesos moleculares esperados (ver las Figuras 7, 8, 9 y 10) . Con relación a la cantidad de interferón alfa no modificado y el rendimiento del conjugado de mono-polietilenglicol-interferón alfa generado, se confirmó que los Ejemplos 1 y 2 tuvieron excelentes rendimientos purificados [ver Cuadro 1 (Comparación de la reactividad y rendimiento de derivado de polietilenglicol usando N-hidroxisuccinimida e interferón alfa) y Cuadro 2 (Comparación de la reactividad y rendimiento de derivado de polietilenglicol usando aldehido e interferón alfa ) ] . [Cuadro 1] PEG-IFNa Mono-PEG-IFN a IFN no Rendimiento Generado (%) modificado (%) (%) Ejemplo 1 47 36 23 Ejemplo 41 50 20 Comparativo 1
Ejemplo 17 74 11 Comparativo 4 Ejemplo 32 52 16 Comparativo 4
[Cuadro 2] PEG-IFN Mono-PEG-IFNa IFN a No Rendimiento Generado Modificado (%) Ejemplo 2 42 55 28 Ejemplo 37 60 24 Comparativo 2
<Ejemplo Experimental 3> Prueba de actividad antiviral y prueba in Vitro de conjugado de polietilenglicol-interferón alfa Para investigar el efecto de los conjugados de derivados de polietilenglicol e interferón alfa usados arriba con respecto a la actividad de interferón alfa, las actividades antivirales de cada uno de los conjugados de mono-polietilenglicol interferón alfa generados en el Ejemplo 1 y Ejemplos Comparativos 1 y 3 se midieron medianhte ensayo de efecto citopático (CPE) usando células de Riñon Bovino Marbin-Darby (MDBK) . Las células fueron retadas con Virus de
Estomatits Vesiular (VSV) . Y, sus actividades relativas a interferón alfa también se midieron (ver, Figura 11) . Para medir la actividad relativa, el interferón alfa se diluyó 105 veces, el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa del Ejemplo Comparativo 1 se diluyó 2X105 veces, el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa del Ejemplo 1 se diluyó 105 veces, y el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa del Ejemplo Comparativo 3 se diluyó 2X104 veces. Después de diluido en serie 2 veces, se añadieron a células de Riñon Bovino Marbin-Darby (mdbk) Y SE RETARON CON Virus De Estomatitis Vesicular (VSV) . Después de eso, los valores de relación de dilución continua que muestran valor TCID50 (Dosis Inefectiva de Cultivo de Tejido, 50% dee dosis inefectiva de células de cultivo de tejido) se calcularon, y cada valor de actividad se obtuvo mediante el método estadístico. Los resultados mostrados en el siguiente Cuadro 3 sugieren que la disminución de actividad biológica mediante modificación de polietilenglicol fue menos en el conjugado de tres-ramificado polietilenglicol-interferón alfa que el conjugado de dos-ramificado polietilenglicol-interferón alfa [ver Cuadro 3 (Actividad biológica de conjugado de polietilengtlicol-interferón alfa) ] .
[Cuadro 3]
<Ejemplo Experimental 4> Prueba farmacodinámica de conjugado de polietilenglicol-interferón alfa La prueba farmacodinámica se condujo mediante inyección subcutánea de interferón alfa y conjugado de polietilenglicol-interferón alfa del Ejemplo 1 en animales experimentales (ratas Sprague Da ley) que tuvieron 240 - 260 g de pesos corporales. Después de inyectarlas por la canti8dad de 1X107 Iü por cabeza, las muestras de sangre se recogieron de las ratas a 0 min, 30 min, 1 hora, 4 horas, 10 horas, 24 horas, 34 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias y 7 dias después de la inyección. Las actividades antivirales de las muestras se midieron mediante ensayo de efecto citofático (CPE) , y de esta manera los valores de vida media (T ½) de interferón alfa y conjugado de polietilenglicol-interferón alfa se obtuvieron (ver la Figura 12) .
La vida media en sangre de conjugado de tres- ramificado polietilenglicol inteferón alfa del Ejemplo 1 se aumentó 9.2 veces comparada con aquella del interferón alfa [ver el Cuadro 4 (Parmacodinámicas de interferón alfa y polietilenglicol-interferón alfa en rata . (rata Sprague Dawley) } ] . [Cuadro 4]
* Las abreviaturas en el cuadro anterior tienen los siguientes significados: Tmax: tiempo para alcanzar la concentración máxima Cmax: concentración máxima en sangre MRT: Tiempo Residual Medio en sangre CL/F: limpieza de plasma total Vss/F: volumen aparente de distribución a estado constante
tl/2: vida media de eliminación AÜC: área bajo la curva de tiempo de concentración <Ejemplo Experimental 5> Prueba de actividad antitumoral de conjugado de polietilenglicol-interferón alfa Células Daudi (ATCC CCL-2138 se desarrollaron en medio RAPI 1640 (Gibco, América) suplementado con 10% de suero bovino fetal y penicilina-estreptomicinaO .5% a 37°C, CO2 incubadora durante 2 dias. Después de que el cultivo se completó, la célula se lavó con el medio una vez, y luego sediluyó para hacer la densidad de 106 célula/ml. El inter4ferón alfa y conjugado de tres-ramificado polietilenglicol-interferón alfa del Ejemplo 1 se diluyeron para ser 2 mg/ml y 19.2 mg/ml, respectivamente. Y cada una de estas soluciones se diluyó en serie mediante diez veces, para hacer 10 muestras que tienen diferentes concentraciones. Después de eso, 100 ul de diluyentes/pozo de microplaca 96 se prepararon en todos los pozos, excepto aquellos de las células de control, 50ul de medio de mantenimiento que contiene VSV se añadieron. Como control, los pozos que contienen células y virus, excepto la muestra se prepararon. La microplaca se incubó en incubadora de CO2 a 37°C durante 5 dias. Después de 5 dias, 40 ul de solución de TS que comprende PMS (Promega, Améria9 se añadió a cada uno de los
pozos, que luego se incubaron durante 1.5 horas. La absorción se midió para las mismas a 490 nm, para calcular EC50 (50% de concentración efectiva) . Los resultados como se muestran en la Figura 13 sugieren que el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa tiene actividad antitumoral a interferón alfa (ver la Figura 13) . <Ejemplo Experimental 6> Prueba de estabilidad de temperatura de conjugado de polietilenglicol-interferón alfa
Interferón alfa y el conjugado de tres-ramificado polietilenglicol interferón alfa del Ejemplo 1 se añadieron a una solución de tampón de 40 mM de NaH2P04 (pH 5.0) para hacer concentraciones de 1 mg/ml de las soluciones respectivamente. Después de incubarlas a 0°C, 20°C, 37°C, 50°C, 70aC y 100°C, durante 15 minutos, y enfriarlas á temperatura ambiente, se midieron sus actividades biológicas (ver la Figura 14) . Los resultados en la Figura 14 sugieren que el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa es farmacéuticamente más estable que un interferón alfa no modificado. <Ejemplo Experimental 7> Prueba de estabilidad de conjugado de polietilenglicol interferón alfa contra digestión triptica Interferón alfa y el conjugado de tres-ramificado
polietilenglicol interferón alfa del ejemplo 1 se prepararon a la concentración de 1 mg/ml con solución de tampón, y 1 mg de tripsina (pH 7.0) se añadió por mililitro de solución para inducir proteolisis a temperatura ambiente, respectivamente. Alícuotas de cadea solución se recogieron a 5 min, 10 min, 20 min, 40 min. y 60 min después de iniciar la reacción, y se midieron sus actividades biológicas (verla Figura 15) . Los resultadeos sugieren que el conjugado de polietilenglicol-interferón alfa es más estable contra la proteasa que el interferón alfa no modificado. APLICABILIDAD INDUSTRIAL La presente invención se relaciona con conjugados biológicamente activos de tres-ramificado polietilenglicol-interferón alfa que tienen estructura de glicerol. Así, esta invención se caracteriza en que tiene alta pureza y rendimiento elevado, reduciendo al mínimo la reducción de bioactividad, y aumentando la vida media en sangre, superando los problemas de que el polietilenglicol lineal no puede ligar muchas moléculas altas lineales a proteína o péptido, derivados moleculares elevados ramificados inducen el impedimento esférico excesivo en las superficies de proteína o péptido; y derivados moleculares elevados ramificados cuyos reticuladores están alargados tienen bajo rendimiento de
purificación por baja pureza, etc. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención que contiene conjugado de polietilenglicol-interferón alfa que tiene actividad antiviral y actividad antitumoral tiene los efectos de que la reducción de actividad se minimiza, y la eficiencia terapéutica se puede mejorar, y el cumplimiento del paciente se puede mejorar disminuyendo la frecuencia de administración debido a la vida media alargada en el cuerpo, comparada con agente de tratamiento de interferón alfa conocido en el ramo.