BRPI0621664A2 - conjugado de interferon alfa com polietileno glicol - Google Patents
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Abstract
CONJUGADO DE INTERFERON ALFA COM POLIETILENO GLICOL. A presente invenção se refere ao conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificação da fórmula geral (1) onde polietileno glicol tem um peso molecular médio de 400 a 45.000 daltons, e uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo. O conjugado de interferon alfa com polietileno glicol bioativo da fórmula geral (1) tem atividades de antiviral e anti-tumor, rendimento e pureza melhorada através de reatividade elevada na reação, e os efeitos para aumentar a meia vida em sangue notavelmente, e minimizar as diminuições em atividade biológica de interferon.
Description
"CONJUGADO DE INTERFERON ALFA COM POLIETILENO GLICOL"
Campo Técnico
A presente invenção se refere a um conjugado de interferon alfa com polietileno gli- col de três ramificações.
Técnica Antecedente
Interferon foi descrito em 1957 por Isaacs e Lindenmann, e foi conhecido por ter um efeito antivírus excelente [lsaacs e outros, Virus interference, 147 (1957)]. O interferon é classificado no Tipo I (IFN-α, β, ω) e Tipo Il (IFN-V)1 e as células geradas através de interfe- ron são diferentes tais como célula branca, fibroblasto, T-célula, etc.
Interferon alfa modificado foi permitido e iniciar a ser empregado como um agente terapêutico para leucemia de células pilosas de 1986. Desse modo, interferon é a primeira citocina produzida pela tecnologia de recombinação de gene e empregada para tratamento de câncer [Pestka e outros, Semin. Oncol, 24 (1997)].
Interferon alfa é uma proteína ativa farmaceuticamente tendo atividades de antiviral e anti-tumor, e foi empregado para tratar mais do que 14 classes de doenças por vírus e tumor em mais do que 40 nações no mundo. Os campos de tratamento efetivos clinicamen- te de interferon alfa são leucemia de células pilosas, a sarcoma de Kaposi, Leucemia Mielo- genosa crônica (CML), Iinfoma de B-célula, Iinfoma de T-célula, melanoma, mieloma, carci- noma de células renais [Nagabhushan T.L. e outros, Regulatory practice para biopharma- ceutical, 221-234 (1994)].
Também, interferon é a primeira proteína humana que pode aumentar o período de vida de paciente de câncer, e é esperado a ser capaz aplicado aos tipos diferentes de tumo- res tal como câncer ovariano, câncer de mama, câncer bronquial, câncer de bexiga, câncer gástrico e outros, e leucemia aguda [Mosbe Talpaz e outros, Seminars em Hepatology, 38(3), 22-27(2001)].
Particularmente, para tratamento de hepatite tipo B ou tipo C, interferon alfa-2a (IFN alfa-2a), interferon alfa-2b, e interferon-conl (IFN-conl) como muteína destes são atualmente empregados. E, foi informado que se uma infecção por vírus tal como vírus de hepatite tipo B (HBV) ou vírus de hepatite tipo C (HCV) é cronicamente progredido, há um risco que a infecção pode ser progredida a carcinoma hepatocelular. Entretanto, interferon pode ser empregado para prevenir câncer.
Embora, interferon como remédio de proteína clinicamente útil tem tais problemas como baixa estabilidade in vivo, eliminação rápida in vivo, formação de anticorpo através de administrações repetidas e reação de hipersensibilidade desse modo, como enzimas, prote- ínas, hormônios, peptídeos gerados através de método de engenharia genética.
Em particular, a administração freqüente tal como uma vez por dia, 3 vezes por se- mana, etc. induz dor aos pacientes. Alem disso, para esses pacientes que necessita de um tratamento durante um período longo de tempo, tal administração pode ameaçar sua quali- dade de vida.
Para melhorar estes problemas, como uma medicina que pode ser estável e manter a atividade durante um período de tempo, um polietileno glicol modificando remédio de pro- teína foi desenvolvida e foi atualmente empregado.
Polietileno glicol é hidrófilo fortemente, e pode aumentar solubilidade na hora de li- gação com proteína terapêutica. Também, polietileno glicol é efetivo para aumentar a quan- tidade molecular de ligação de proteína a essa, com funções biológicas principais mantidas tal como atividade de enzima e ligação de receptor. Desse modo, polietileno glicol pode diminuir a filtração de glomerular, e protege a proteína efetivamente de enzima proteolítica para decompor a proteína. Consequentemente, o polietileno glicol tem as vantagens de prevenir degradação de proteína, aumentando o tempo de circulação e estabilidade de pro- teína, e imunogenicidade decrescente.
Polietileno glicol linear geralmente empregado tem um peso molecular de cerca de 1.000-25.000 daltons, porém tem uma limitação em ligação de moléculas elevadas muitas lineares proteína ou peptídeo, com suas atividades mantidas, devido a regiões ativas bioló- gicas limitadas de proteína e peptídeo.
Para melhorar estes problemas de polietileno glicol linear, Wana, H e outras tentati- vas para ligação de derivado de polietileno(mPEG) de mono-metóxi para proteína empre- gando-se triclorotriazina [Wana, H e outros, Ann. N.Y.Acad.Sci. 613:95-108 (1990)].
Entretanto, o tamanho de derivado de polietileno glicol de ramificação ativado é ex- tenso, também induz bloqueio estérico nas superfícies de proteína ou peptídeo, desse modo reduzindo as atividades de proteína ou peptídeo modificado. Também, os derivados nor- malmente causam baixo rendimento de purificação devido aos derivados de polietileno glicol de ramificação incompleto.
A Patente Coreana No. 0396983 de tentativa para melhorar estes problemas dos derivados moleculares de ramificação elevada. Em particular, a tentativa da patente para minimizar a redução de atividade biológica protegendo-se a estrutura de proteína por mini- mizar o número de Iigantes ligados a regiões ativas biologicamente alongando-se o Iigantes para conectar molécula e proteína elevadas, e reduzindo bloqueio estérico induzido pelas moléculas elevadas ramificadas. Entretanto, tri-PEG-NHS que são derivados moleculares ativadas de ramificação elevadas tendo Iigantes longos contendo excesso de PEG-NHS linear e Di-PEG-NHS tendo quantidades moleculares pequenas como impurezas quando a estrutura de Iigante está preparada. Eles participam competitivamente na reação de ligação a interferon, e gera conjugado PEG-interferon alfa molecular baixa e conjugado Di-PEG- interferon alfa que são difíceis para purificar. Desse modo, este método tem baixa pureza e problemas de baixos rendimentos. Entretanto, ainda houve uma necessidade por conjugado de interferon com polieti- Ieno glicol de macromolecular que pode minimizar redução do bioatividade de interferon alfa, e tem pureza elevada e estabilidade boa.
Descrição da Invenção
Objeção da Invenção
O objetivo da presente invenção é para fornecer conjugados de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações, tendo pureza de produção e rendimento elevado, au- mentando a meia-vida em sangue, e minimizando a redução de bioatividade de interferon em comparação a interferon alfa e conjugado de interferon alfa com polietileno glicol conhe- cido na técnica; um método de preparação do mesmo, e uma composição farmacêutica con- tendo o mesmo.
Solução Técnica
Para obter o objetivo acima, a presente invenção fornece um polietileno glicol de três ramificações de ligação de molécula elevada derivado a interferon alfa, e tendo pureza elevada, e uma composição farmacêutica contendo a molécula.
A presente invenção é explicada em detalhes abaixo.
O conjugado de interferon alfa com polietileno glicol é gerado por uma reação de li- gação de polietileno glicol de três ramificações derivado e interferon alfa, e pode ser repre- sentado pela fórmula geral seguinte (1),
<formula>formula see original document page 4</formula>
Onde η é um número inteiro de 1 a 1.000, e m é um número inteiro de 10 a 1.000.
No conjugado acima, o peso molecular médio de polietileno glicol é de 400 a 45.000 daltons, preferivelmente 30.000 a 45.000 daltons, mais preferivelmente 43.000 daltons.
Como o peso molecular de polietileno glicol é mais elevado, a farmacocinética de conjugado molecular elevado é melhor, porém a atividade é diminuída. Assim, um peso molecular próprio é importante.
Z é (CH2)s ou (CH2)sNHCO(CH2)s para fazer um papel de Iigante de interferon alfa e polietileno glicol, onde S é um número inteiro de 1 a 6. Y é uma amina secundária ou uma ligação de amida, formados por uma reação de ligação de grupo funcional NH2 de molécula interferon e um grupo funcional de derivado de polietileno glicol.
Também, a presente invenção fornece um método de preparação de conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações como mostrado na fórmula geral seguinte (1) onde polietileno glicol tem um peso molecular médio de 400 a 45.000 daltons, preferivelmente 30.000 a 45.000 daltons, mais preferivelmente 43.000 daltons.
Derivados de polietileno glicol da presente invenção de três ramificações de três ramificações são moléculas elevadas ativadas tendo estrutura ramificada que três moléculas elevadas receptivas biológicas lineares são combinadas. Todas de três regiões (hidróxi) OH na estrutura de glicerol são polimerizado com unidade de moléculas de etileno glicol, e o fim de uma região é ativada como um grupo funcional. As outras duas regiões exceto a região ativada são substituídas com monometóxi para prevenir reações adicionais. Quando os derivados de polietileno glicol ramificado acima são preparados, o tamanho de cada polieti- leno glicol linear pode ser controlado livremente, por meio de que uma molécula elevada tendo estrutura própria e peso molecular pode ser ligada e preparada a interferon alfa.
Um derivado de polietileno glicol ramificado (PEG) ligando o interferon alfa é repre- sentado pela fórmula geral seguinte (2)
<formula>formula see original document page 5</formula>
Onde, η é um número inteiro de 1 a 1.000 e m é um número inteiro de 10 a 1.000. O peso molecular médio de unidade de polietileno glicol do conjugado é de 400 a 45.000 daltons, preferivelmente 30.000 a 45.000 daltons, mais preferivelmente 43.000 daltons. X é um grupo funcional que pode reagir quimicamente à proteína ou peptídeo contendo interfe- ron alfa, como mostrado na fórmula geral (3) abaixo. Preferivelmente, X é imida de N- hidróxisucina (a) ou aldeído (b) no composto da fórmula (3), e cada formas de ligação de amida e ligação de estrutura de amina secundária na reação de ligação para interferon alfa em rendimentos elevados.
Copiar a Fórmula da página 6.
Z é (CH2)S ou (CH2)sNHCO(CH2)s para fazer um papel de Iigante de interferon alfa e polietileno glicol onde S é um número inteiro de 1 a 6.
Nesta invenção, a razão molar de reação de interferon alfa para os derivados de polietileno glicol ramificado é de 1: 0,5 a 1: 50. Preferivelmente, a razão molar de interferon alfa para os derivados de polietileno glicol ramificado é de 1: 0,5 a 1: 3. Como a razão molar de polietileno glicol para interferon alfa é aumentado, o rendimento de conjugado de interfe- ron alfa com polietileno glicol por tempo de unidade é diminuído.
Também, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir doenças receptivas de interferon alfa, compreendendo um conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de acordo com esta invenção como um ingrediente efetivo. A composição pode ser composta de uma dose efetiva de conjugado de interferon com polieti- Ieno glicol da presente invenção, diluente, anti-sépticos, solubilizante, emulsificante, juvanti- a, e/ou veículo.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas a um agente de injeção, uma cápsula, um comprimido, uma droga líquida, uma pílula, um ungüen- to, um ungüento oftálmico, um colírio, um agente de absorção de transdermal, uma pasta, uma cataplasma, agente de emplasto, um aerossol, etc. E, a dosagem efetiva de composi- ção farmacêutica da presente invenção pode ser variada de acordo com a idade de pacien- te, condição, peso etc, porém geralmente uma vez por semana ou duas vezes por semanas. E, a composição pode ser administrada uma vez ou muitas vezes por dia dentro de uma faixa de dosagem diária efetiva.
Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de doenças receptivas de interferon alfa, compreendendo administrar o conjugado da pre- sente invenção como um ingrediente efetivo. As doenças receptivas de interferon alfa inclu- em leucemia de células pilosas, a sarcoma de Kaposi, Leucemia Mielogenosa crônica (CML), Iinfoma de B-célula, Iinfoma de T-célula, melanoma, mieloma, carcinoma de células renais. E a doença inclui câncer ovariano, câncer de mama, câncer bronquial, câncer de bexiga, câncer gástrico, etc e os outros cânceres como leucemia aguda.
A presente invenção é explicada particularmente pelos exemplos seguintes. Os exemplos seguintes são pretendidos para também ilustra a presente invenção, porém o es- copo da presente invenção não é pretendido a ser limitada desse modo de maneira alguma.
Efeitos da Invenção
A presente invenção se refere ao conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações novo biologicamente ativo tendo estrutura de glicerol. Assim, esta in- venção é caracterizada tendo pureza elevada e rendimento elevado, minimizando a redução de bioatividade, e aumentando a meia-vida em sangue, superando-se os problemas que polietileno glicol linear não ligam muitas moléculas elevadas lineares a proteína ou peptídeo; derivados moleculares de ramificação elevada induzem bloqueio estérico excessivo nas su- perfícies de proteína ou peptídeo; e derivados moleculares de ramificação elevada cujos Iigantes são alongados têm baixo rendimento de purificação por baixa pureza, etc.
Entretanto, a composição farmacêutica da presente invenção contendo conjugado de interferon alfa com polietileno glicol tendo atividade antivírus e atividade de anti-tumor tem os efeitos que a redução de atividade é minimizada, e o efeito de tratamento pode ser melhorado, e o desconforto do paciente pode ser minimizado diminuindo-se a freqüência de administração devido à meia-vida alongada no corpo, comparado ao agente de tratamento de interferon alfa conhecido na técnica.
Descrição das Figuras
Figura 1 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 1 através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho (em seguida: SE-HPLC).
Figura 2 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 2 através de SE-HPLC.
Figura 3 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 1 Comparativo através de SE-HPLC.
Figura 4 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 2 Comparativo através de SE-HPLC.
Figura 5 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 3 Comparativo através de SE-HPLC.
Figura 6 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 4 Comparativo através de SE-HPLC.
Figura 7 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 1 através de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight (MALDI- TOF) Mass Spectrometer(em seguida: MALDI-TOF).
Figura 8 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 2 através de MALDI-TOF.
Figura 9 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do E- xemplo 1 Comparativo através de MALDI-TOF.
Figura 10 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos do
Exemplo 2 Comparativo através de MALDI-TOF.
Figura 11 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados de supressão dos efeitos citopáticos (CPE) de conjugado interferon alfa modificado com polietileno glicol do Exemplo 1, e Exemplos 1 e 3 Comparativos empregando vírus de estomatite vesicular e células de Rim Bovinas Marbin-Darby (MDBK).
Figura 12 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos com- parativos de farmacocinética de interferon alfa e o conjugado de interferon alfa com polieti- leno glicol do Exemplo 1.
Figura 13 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados de comparação de efeito de atividades de anti-tumor de interferon alfa, e o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol do Exemplo 1 empregando-se células de Daudi.
Figura 14 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados de comparação de alterações de atividade biológicas de interferon alfa, e conjugado de interferon alfa modi- ficado com três ramificações de polietileno glicol (PEG, MW43.000) - do Exemplo 1 de acor- do com a alteração da temperatura.
Figura 15 é uma ilustração de desenho esquemático os resultados analíticos de ati- vidades biológicas de interferon alfa, e conjugado de interferon alfa modificado com o polieti- Ieno glicol do Exemplo 1 a enzima proteolítica e tempo.
Modo para a Invenção
<Exemplo 1> preparação de polietileno glicol de três ramificações (MW 43,000 Da)- conjugado de interferon alfa (I) da fórmula (1) empregando-se N-hidroxissucinaimida de po- Iietileno glicol de três ramificações
68 mg de N-hidróxisucinaimde de polietileno glicol de três ramificações (corporação de NOF, Japão) tendo o peso molecular de 43,000 daltons foram adicionados a 10 mg de interferon alfa (Dong-um Pharm. Cia., Ltd.) em 100 mM de tampão de bicina, ρΗδ.Ο. A mis- tura de reação foi agitado durante 2hr em temperatura ambiente. E, a reação foi impedida a adição de 0,1M de glicina.
O reagente foi fornecido em Hiprep(TM) 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) co- luna de dessalgamento equilibrada com 40 mM de NaH2PO4 (pH4,0) solução de tampona- mento e a solução de tamponamento foi alterado eluindo-se com mesma solução de tampo- namento. N-hidroxissucinaimida separado da sucinaimida de polietileno glicol-N-hidróxi de três ramificações por esta reação foi removida. Um eluente foi fornecido em cromatografia de permuta de cátion SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrado com 40 mM de NaH2PO4 (pH4,0) solução de tamponamento, e então conjugado de interfe- ron alfa com polietileno glicol foi separado pela cromatografia líquida.
O conjugado de interferon alfa com polietileno glicol foi fracionado empregando 0-500 mM de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI).
A forma e tamanho do eluído fracionado foram confirmados por HPLC e SDS- PAGE. E o conjugado de formas de ligação de di- ou tri-polietileno glicóis de três ramifica- ções com um interferon alfa, e interferon alfa não modificados permanecem após a reação foram excluídas, para obter o título conjugado, de três ramificações de uma ligação de con- jugado de polietileno glicol interferon (MW 43.000) com um interferon alfa (ou chamado co- mo conjugado de interferon alfa com polietileno glicol mono-três ramificações).
Através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho, foi confirmado que a mistura de reagentes foi consistida de cerca de 47% de conjugado de in- terferon com mono-polietileno glicol (mono-PEG-IFN a), cerca de 36% de interferon não modificado a(IFN [alfa]), e os outros [conjugado de interferon alfa de di-PEGilado (di-PEG- IFN a) e N-hidroxissucinaimida(NHS)] {veja Figura 1; o absorbância foi medido a 280 nm; e a retenção de tempo para (a) di-PEG-IFN a foi cerca de 8 minutos, para (b) mono-PEG-IFN α cerca de 9 minutos, para (c) IFN α cerca de 13,5 minutos, e para (d)NHS cerca de 15,3 minutos}. Ε, o conjugado de interferon alfa de polietileno glicol de mono-três de ramifica- ções separados foi analisado empregando-se o MALDI-TOF, como mostrado na Figura 7, e o valor foi 65943,2(m/z) (veja Fig.7).
<Exemplo 2> Preparação de polietileno glicol de três ramificações (MW 43.000 Da)- conjugado de interferon alfa (II) empregando-se aldeído de polietileno glicol de três ramificações
68 mg de aldeído de polietileno glicol de três ramificações (corporação de NOF, Ja- pão) tendo o peso molecular de 43.000 daltons foram adicionados a 10 mg de interferon alfa (Dong-um Pharm. Cia., Ltd.) em 40 mM de acetato de sódio (C2H3NaO2) tampão, pH4,0. A mistura de reação foi agitada durante 14 hr em temperatura resfriada. Ε, o reagente foi for- necido em Hiprep™ 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) coluna de dessalgamento iguala- da com 40mM de NaH2PO4 (pH4,0) solução de tamponamento, e então a solução de tam- ponamento foi alterada eluindo-se com mesma solução de tamponamento.
Então, o eluído foi fornecido em cromatografia de permuta de cátion SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrado com 40 mM de NaH2PO4 (pH4,0) so- lução de tamponamento, e conjugado de interferon alfa com polietileno glicol foi separado pela cromatografia líquida. O conjugado de interferon alfa com polietileno glicol foi fraciona- do empregando 0 ~ 500mM de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI).
Do eluído fracionado, interferon alfa permanece após a reação foi excluída através de HPLC e SDS-PAGE, para obter o título conjugado, polietileno glicol (MW 43.000)- conjugado de interferon alfa (II) (conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de mono- três ramificações) no qual somente um polietileno glicol de três ramificações foi ligado a N- término de interferon alfa.
Foi confirmado através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho que a mistura foi consistida de cerca de 42% de conjugado de interferon alfa com mono-polietileno glicol (mono-PEG-IFN a) e cerca de 55% de interferon não modificado α (IFN a) {veja Figura 2; a absorbância foi medido a 280 nm, e a retenção de tempo de (a) mono-PEG-IFN α foi cerca de 9,5 minutos e que de (b) IFN α foi de cerca de 14 minutos}. E, a pureza e peso molecular do conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de mono- três ramificações separados foram confirmados empregando-se MALDI-TOF, e o valor foi 66141,9(m/z) (veja Figura 8).
<Exemplo 1 comparativo> Preparação de polietileno glicol de duas ramificações (PEG, MW 40.000 Da)-conjugado de interferon alfa (III) empregando polietileno glicol-N- hidroxissucinaimida de duas ramificações
63 mg de N-hidróxisucinaimde de polietileno glicol de duas ramificações (corpora- ção de NOF, Japão) tendo o peso molecular de 40.000 daltons foram adicionados a 10 mg de interferon alfa preparado através de um método conhecido [Pestka, Sei. Am. 249, 36 (1983)] em 100 mM de tampão de bicina, pH8,0. A mistura de reação foi agitada durante 2hr em temperatura ambiente. E, a reação foi interrompida através de adição de 0,1 M de glicina.
O reagente foi interrompido em Hiprep™ 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) co- luna de dessalgamento equilibrado com 40 mM de NaH2PO4 (pH4,0) solução de tampona- mento e a solução de tamponamento foi alterado eluindo-se com a mesma solução de tam- ponamento. N-hidroxissucinaimida separada da sucinaimida de polietileno glicol-N-hidróxi de três ramificações por esta reação foi removido. Um eluente foi interrompido cromatogra- fia de permuta de cátion de Fluxo rápido SP-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrado com 40mM de solução de tamponamento NaH2PO4 (pH4,0), e conjugado de in- terferon alfa com polietileno glicol foi separado pela cromatografia líquida. O conjugado de interferon alfa com polietileno glicol foi fracionado empregando O ~ 500mM de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCl). A forma e tamanho do eluído fracionado foram confirmados por HPLC e SDS-PAGE. E, interferon alfa permanece após a reação, e conju- gado de interferon alfa para a qual dois (2) ou mais polietileno glicóis de duas ramificações são ligados com um interferon alfa, são removidos aqui, para obter o título conjugado, con- jugado de interferon alfa no qual polietileno glicol de duas ramificações foi ligado com um interferon alfa.
Foi confirmado através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho que a mistura foi consistida de cerca de 40% de conjugado de interferon alfa com mono-polietileno glicol (mono-PEG-IFN a), cerca de 50% de interferon não modificado α(IFN [alfa]), os outros [conjugado de interferon alfa de di-PEGilado (di-PEG-IFN α), e N- hidroxissucinaimida (NHS)] {veja Figura 3; a absorbância foi medido às 280nm, e a retenção de tempo de (a) di-PEG-IFN α foi cerca de 8 minutos, que de (b) mono-PEG-IFN α cerca de 9 minutos, que de (c) IFN α cerca de 13,5 minutos, e que de (d)NHS cerca de 15 minuto}.
Ε, o peso molecular foi medido para o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol separado de mono-duas ramificações empregando-se MALDI-TOF, e o valor foi 62708,2(m/z)(veja Figura 9).
<Exemplo 2 comparativo> Preparação de polietileno glicol de duas ramificações (PEG, MW 40.000 Da)-conjugado interferon alfa (IV), empregando-se aldeído de polietileno glicol de duas ramificações
63 mg de aldeído de polietileno glicol de duas ramificações (corporação de NOF, Japão) tendo o peso molecular de 40.000 daltons foram adicionados a 10 mg de interferon alfa (Dong-um Pharm. Cia., Ltd.) em 40 mM de acetato de sódio (C2H3NaO2) tampão, pH4,0. A mistura de reação foi agitada durante 10 ~ 14 hr em temperatura resfriada. Ε, o reagente foi interrompido em Hiprep™ 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) coluna de dessalgamen- to igualado com 40mM de NaH2P04 (pH4.0) solução de tamponamento, e então a solução de tamponamento foi alterada eluindo-se com a mesma solução de tamponamento.
Então, o eluído foi interrompido em cromatografia de permuta de cátion SP- Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrado com 40 mM de NaH2PO4 (pH4,0) solução de tamponamento, e conjugado de interferon alfa com polietileno glicol foi separado pela cromatografia líquida. O reagente foi fracionado empregando 0 ~ 500mM de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI).
O eluído fracionado foi confirmado através de HPLC e SDS-PAGE. E, interferon al- fa permanece após a reação foi removido deste, para obter conjugado de interferon alfa com polietileno glicolm (II) no qual somente polietileno glicol de duas ramificações foi ligado com um N-terminal de conjugado de interferon alfa.
Foi confirmado através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho que a mistura foi consistida de cerca de 37% de conjugado de interferon com mono-polietileno glicol (mono-PEG-IFN a) e cerca de 60% de interferon não modificado a(IFN [alfa]) {veja Figura 4; a absorbância foi medido a 280 nm, e a retenção de tempo de (a) mono-PEG-IFN α foi de cerca de 9,5 minutos, e que de (b) IFN α foi de cerca de 14 mi- nutos}. Ε, o peso molecular do conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de mono- três ramificações separados foi medido empregando MALDI-TOF, e o valor foi 62718,9(m/z) (veja Figura 10).
<Exemplo 3 comparativo> Preparação de conjugado de interferon alfa com polieti- leno glicol no qual um polietileno glicol de duas ramificações de Iisina estruturada (MW 40,000 Da) tendo N-hidroxissucinaimida éster(NHS éster) grupo funcional foi ligado com um interferon alfa
Polietileno glicol de duas ramificações (MW 40.000) conjugado de interferon alfa foi preparado reagindo-se 50 mg de interferon alfa com N-hidroxissucinaimida de polietileno glicol de duas ramificações (Nektar, América, o peso molecular médio = 40.000 dalton), de acordo com o método descrito na Patente Coreana No. 10-0254097.
Foi confirmado através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho que a mistura foi consistida de cerca de 17% de conjugado de interferon alfa com mono-polietileno glicol (mono-PEG-IFN a), de cerca de 74% de interferon não modifi- cado a(IFN [alfa]), e os outros [di-PEGilado conjugado de interferon alfa de (di-PEG-IFN a) e N-hidroxissucinaimida (NHS)] {veja Figura 5; a absorbância foi medido às 280nm, e a reten- ção de tempo de (a) di-PEG-IFN α foi de cerca de 8.5 minutos que de (b) mono-PEG-IFN α de cerca de 9,5 minutos que de (c) IFN α de cerca de 14 minutos, e que de (d)NHS de cerca de 16,5 minutos}.
<Exemplo 4 comparativo> Preparação de conjugado de interferon alfa com polieti- leno glicol que polietileno glicol de três ramificações de Iisina estruturada (MW 43.000 Da) tendo éster de N-hidroxissucinaimida (éster de NHS) grupo funcional foi ligado com um inter- feron alfa
Tri-PEG-NHS (MW 43,000) foi preparado pelo método descrito na Patente Coreana No. 10-0396983, e então foi reagido com 3 mg de interferon alfa para obter conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações (MW 43,000). Foi confirmado através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho que a mistura foi consistida de cerca de 32% de conjugado de interferon alfa com mono-polietileno glicol (mono-PEG-IFN a), de cerca de 52% de interferon não modifi- cado a(IFN a), e os outros [di-PEGilado de conjugado de interferon alfa (di-PEG-IFN a) e N- hidroxissucinaimida (NHS)] {veja Figura 6; a absorbância foi medido às 280nm; e a retenção de tempo de (a) di-PEG-IFN α foi de cerca de 8,5 minutos que de (b) mono-PEG-IFN α de cerca de 9,5 minutos que de (c) IFN α de cerca de 14 minutos, e que de (d)NHS de cerca de 16,5 minutos}.
A caracterização e teste de atividade farmacológica foram conduzidos empregando- se o conjugado preparado acima, e os resultados são como segue.
<Exemplo 1 Experimental> Teste de reatividade de derivado de polietileno glicol e interferon alfa
Para testar a reatividade de derivado de polietileno glicol e interferon alfa emprega- do acima, a quantidade de conjugado de interferon alfa com mono-polietileno glicol reagin- do-se interferon alfa com polietileno glicol e a quantidade de interferon alfa não modificado foram determinados de áreas de pico (Figuras 1 a 6) através de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho, como mostrado nos Exemplos 1 e 2, e os Exemplos 1 a 4 Comparativos. Como resultado, a reatividade de interferon alfa de acordo com a estru- tura de polietileno glicol pode ser obtida (veja Tabelas 1 e 2).
Considerando a quantidade restante de interferon alfa não modificado e a quantida- de de conjugado de interferon alfa com mono-polietileno glicol gerado, a reatividade de liga- ção de polietileno glicol de três ramificações e interferon alfa nos Exemplos 1 e 2 foram mais excelentes.
<Exemplo 2 Experimental> O peso molecular e rendimento do conjugado de interfe- ron alfa com polietileno glicol
O conjugado de interferon alfa com polietileno glicol tendo pureza elevada obtida dos Exemplos 1 e 2 e Exemplos 1 e 2 Comparativos foram analisados por MALDI-TOF, para confirmar que os resultados correspondentes aos pesos moleculares esperados (veja Figu- ras. 7, 8, 9 e 10). Em relação à quantidade de interferon alfa não modificado e o rendimento de conjugado de interferon alfa com mono-polietileno glicol gerado, foi confirmado que E- xemplos 1 e 2 tem rendimento de purificado excelente [veja Tabela 1 (Comparação da reati- vidade e rendimento de derivado de polietileno glicol empregando N-hidroxissucinaimida e interferon alfa) e Tabela 2(Comparação da reatividade e rendimento de derivado de polieti- leno glicol empregando aldeído, e interferon alfa)].
[Tabela 1]
<table>table see original document page 12</column></row><table> <table>table see original document page 13</column></row><table>
<Exemplo 3 Experimental> Teste de atividade Antiviral e teste de atividade in vitro de conjugado de interferon alfa com polietileno glicol
Para investigar o efeito do derivado de polietileno glicol e conjugado de interferon alfa empregado o anterior com respeito à atividade de interferon alfa, as atividades antiviró- ticas de cada de conjugados de interferon alfa com mono-polietileno glicol gerado nos E- xemplo 1 e Exemplos 1 e 3 Comparativos foram medidos através de efeito citopático (CPE) ensaio empregando células de Rim Bovino Marbin-Darby (MDBK). As células foram desafi- adas com Vírus de Estomatite Vesicular Virus(VSV). E1 suas atividades relativas para inter- feron alfa foram também medidas (veja, Figura 11).
Para medir a atividade relativa, interferon alfa foi diluído 105 vezes, o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol do Exemplo 1 Comparativo foi diluído 2 X 10^5 tempos, o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol do Exemplo 1 foi diluído 10^5 vezes, e o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de Exemplo 3 Comparativo foi diluído 2 X 10^4 vezes. Após 2 vezes diluído em série, eles foram adicionados as células de Rim Bo- vino Marbin-Darby (MDBK) e desafio com Vírus de Estomatite Vesicular (VSV). Após que, o valor da razão de diluição contínua mostrada TCID50 (Dose Infecciosa de Cultura de Tecido, 50% de dose infecciosa de células de cultura de tecido) foi calculado, e cada valor de ativi- dade foi obtido através de um método estatístico.
Os resultados mostrados na seguinte Tabela 3 sugeriram que a diminuição de ativi- dade biológica através de modificação de polietileno glicol foi menos aos conjugados de in- terferon alfa com polietileno glicol de três ramificações que o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de duas ramificações [veja Tabela 3 (atividade Biológica de conjugado de interferon alfa com polietileno glicol)].
[Tabela 3]
<table>table see original document page 13</column></row><table> <table>table see original document page 14</column></row><table>
<Exemplo 4 Experimental> O teste Farmacodinâmica de conjugado de interferon alfa com polietileno glicol
O teste de farmacodinâmica foi conduzido por injeção subcutânea de interferon alfa e conjugado de interferon alfa com polietileno glicol do Exemplo 1 em animais experimentais 5 (Rato Sprague Dawley) que teve 240 ~ 260 g de peso corporal. Após injetar pela quantida- de de 1x10^7 IU por cabeça, as amostras sangüínea foram colecionadas dos ratos a 0 minu- tos, 30 minutos, I hora, 4 hora, 10 hora, 24 hora, 34 hora, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, e 7 dias após a injeção. As atividades antiviróticas das amostras foram medidas pelo efeito de citofática (CPE) ensaio, e desse modo a meia vida(T 1/2) valores de interferon alfa e conjugado de interferon alfa com polietileno glicolm foi obtido (veja Figura 12).
A meia-vida em sangue de conjugado de interferon com polietileno glicol de três ramificações do Exemplo 1 foi aumentado 9,2 vezes comparadas com aquele interferon al- pha [veja, Tabela 4(Farmacodinâmicas de interferon alfa e interferon alfa com polietileno glicol em rato (Sprague rato de Dawley))]
[Tabela 4]
<table>table see original document page 14</column></row><table>
* As abreviações na tabela acima têm os significados seguintes:
Tmax: tempo para alcançar a concentração máxima
Cmax: concentração de máximo em sangue
MRT: Tempo de Resíduo Médio em sangue
CL/F: depuração de plasma total
Vss/F: volume aparente de distribuição em estado estável
tl/2: meia-vida de eliminação
AUC: área sob a curva de tempo de concentração.
<Exemplo 5 experimental > teste de atividade Anti-tumor de conjugado de interferon alfa com polietileno
As células de Daudi (ATCC CCL-213) foram desenvolvidas em RAPI 1640 (Gibco, América) médio suplementado com 10% de soro bovino fetal e estreptomicina de penicilina 0,5% às 37°C, CO2 incubadora durante 2 dias. Após a cultura foi completada, a célula foi lavada com o médio uma vez, e então diluiu para fazer a densidade de 106 de célula/ml. O interferon alfa e conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações do Exemplo 1 foram diluídos a ser 2 mg/ml e 19,2 mg/ml, respectivamente. E, cada uma des- tas soluções foi diluída em série por 10 vezes, para fazer 10 amostras têm concentrações diferentes. Após que, 100 de diluentes/cavidade de 96-microplacas foram preparados a todas as cavidades exceto esses das células de controle, 50 médio de manutenção con- tendo VSV foi adicionado. Como controle, as cavidades contendo células e vírus exceto amostra foram preparados. A microplaca foi incubada em incubadora de CO2 às 37°C du- rante 5 dias. Após 5 dias, 40 de solução de MTS compreendendo PMS (Promega, Amé- rica) foi adicionado a cada das cavidades, que então foram incubados durante 1,5 hora. A absorbância foi medida para eles a 490 nm, para calcular EC50 (50% de concentração efeti- va). Os resultados como mostrado na Figura 13 sugerem que o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol tem atividade de anti-tumor similar a interferon alfa (veja Figura 13).
<Exemplo 6 experimental> teste de estabilidade de Temperatura de conjugado de interferon alfa com polietileno glicol
Interferon alfa e o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramifi- cações do Exemplo 1 foram adicionados a 40 mM NaH2PO4 (pH 5,0) de soluções de tampo- namento para fazer 1 mg/ml de concentração de soluções respectivamente. Após incubar às 0°C, 20°C, 37°C, 50°C, 70°C e 100°C, durante 15 minutos, e resfriado em temperatura ambiente, suas atividades biológicas foram medidas (veja. Figura 14).
Os resultados na Figura 14 sugerem que o conjugado de interferon alfa com polieti- leno glicol é farmaceuticamente mais estável que um interferon alfa não modificado.
<Exemplo 7 experimental> O teste de estabilidade de conjugado de interferon alfa com polietileno glicol contra uma digestão tríptico
O interferon alfa de e o conjugado de interferon com polietileno glicol de três ramifi- cações do Exemplo 1 foram preparado à concentração de 1 mg/ml com solução de tampo- namento, e 1 mg de tripsina(pH 7,0) foi adicionado por mililitro de solução para induzir pro- teólise em temperatura ambiente, respectivamente. As alíquotas de cada soluções foram coletadas a 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, e 60 minutos após iniciar a rea- ção, e suas atividades biológicas foram medidas (veja. Figura 15).
Os resultados sugerem que o conjugado de interferon alfa com polietileno glicol é mais estáveis contra protease que um interferon alfa não modificado.
Aplicabilidade Industrial
A presente invenção se refere o novo conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações biologicamente ativo tendo estrutura de glicerol. Assim, esta in- venção é caracterizada tendo pureza elevada e rendimento elevado, minimizando a redução de bioatividade, e aumentando a meia vida em sangue, superando os problemas que polieti- leno glicol linear não pode ligar muitas moléculas elevadas a proteína ou peptídeo; deriva- dos moleculares elevado ramificados induzem bloqueio estérico excessivo nas superfícies de proteína ou peptídeo; e derivados moleculares elevados ramificados cujos Iigantes são alongados têm baixo rendimento de purificação por baixa pureza, etc.
Entretanto, a composição farmacêutica da presente invenção contendo conjugado de interferon alfa com polietileno glicol tendo atividade antivirótica e atividade anti-tumoral tem os efeitos que a redução de atividade é minimizada, e a eficiência terapêutica pode ser melhorada, e a complacência do paciente pode ser melhorada diminuindo-se a freqüência de administração devido à meia vida alongada no corpo, comparado a agente de tratamento de interferon alfa conhecido na técnica.
Claims (11)
1. Conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações da fórmu- la geral (I)1 CARACTERIZADO pelo fato de que polietileno glicol tem um peso molecular médio de 400 a 45.000 daltons, H2CO(CH2CH2O)n-Z-Y-Interferon α HCO(CH2CH2O)mCH3 H2CO(CH2CH2O)mCH3 onde, η é um número inteiro de 1 a 1.000; m é um número inteiro de 10 a 1.000; Z é (CH2)s ou (CH2)sNHCO(CH2)s como um Iigante de interferon alfa e polietileno glicol, onde S é um número inteiro de 1 a 6; Y é uma amina secundária ou uma ligação de amida que uma ligação do grupo fun- cional NH2 em molécula interferon, e um grupo funcional de derivado de polietileno glicol.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polietileno glicol tem um peso molecular médio de 30.000 a 45.000 daltons.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polietileno glicol tem o peso molecular médio de 43.000 daltons.
4. Método para preparação de conjugado de interferon alfa com polietileno glicol de três ramificações da fórmula geral (1), CARACTERIZADO pelo fato de que o polietileno gli- col tem um peso molecular médio de 400 a 45.000 daltons, compreendendo a formação de uma ligação covalente de derivado de polietileno glicol ramificado da fórmula geral (2) e in- terferon alfa. H2CO(CH2CH2O)n-Z-Y-Interferon α HCO(CH2CH2O)niCH3 H2CO(CH2CH2O)mCH3 onde, η é um número inteiro de 1 a 1.000; m é um número inteiro de 10 a 1.000; Z é (CH2)s ou (CH2)sNHCO(CH2)s como um Iigante de interferon alfa e polietileno glicol, onde S é um número inteiro de 1 a 6; Y é uma amina secundária ou uma ligação de amida que uma ligação do grupo fun- cional NH2 em molécula interferon, e um grupo funcional de derivado de polietileno glicol; <formula>formula see original document page 18</formula> onde, η é um número inteiro de 1 a 1.000; m é um número inteiro de 10 a 1.000; X é um grupo funcional representado pela fórmula geral (3) que pode reagir quimi- camente com proteína ou peptídeo contendo interferon alfa <formula>formula see original document page 18</formula> Z é (CH2)s ou (CH2)sNHCO(CH2)s como um ligante de interferon alfa e polietileno glicol, onde S é um número inteiro de 1 a 6
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polietileno glicol tem um peso molecular médio de 30.000 a 45.000 daltons.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polietileno glicol tem o peso molecular médio de 43.000 daltons.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que X é (a) ou (b) na fórmula geral (3).
8. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão molar de interferon alfa para derivado de polietileno glicol de três ramificações é de 1: -0,5 a 1:50.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão molar de interferon alfa para derivado polietileno glicol de três ramificações na reação é de 1: 0,5 a 1: 3.
10. Composição farmacêutica por tratar ou prevenir doenças receptivas de interfe- ron alfa CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o conjugado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3 como ingrediente efetivo.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que as doenças receptivas de interferon alfa são leucemias de células pilosas, a sarcoma de Kaposi, Leucemia Mielogenosa crônica (CML)1 Iinfoma de B-célula, Iinfoma de T-célula, melanoma, mieloma, e carcinoma de células renais.
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