CN101213208A - 粒细胞集落形成刺激因子(g-csf)的突变体及其化学缀合多肽 - Google Patents

粒细胞集落形成刺激因子(g-csf)的突变体及其化学缀合多肽 Download PDF

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Abstract

本发明提供设计用于特异性化学缀合的人粒细胞集落形成刺激因子(G－CSF)的突变体及其化学缀合物，其作为佐剂在癌症治疗中使用。本发明提供G－CSF的突变体，其中G－CSF位置133处的苏氨酸(Thr)残基被半胱氨酸(Cys)残基取代，其中所述G－CSF包括SEQ ID NO：1中所确定的氨基酸序列。另外，本发明提供G－CSF的突变体，其中半胱氨酸(Cys)残基被插入到G－CSF的位置135处的甘氨酸(Gly)残基和位置136处的丙氨酸(Ala)残基之间。进一步，本发明提供化学缀合的突变G－CSF，在其半胱氨酸残基处连接了生物适合聚合物，如聚乙二醇(PEG)，所述半胱氨酸残基是通过取代或插入突变引入的，其由于与生物适合聚合物的缀合，在不降低体内生物活性的同时增加其体内停留时间，从而最终提高其体内生物活性。

Description

粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体及其化学缀合多肽
技术领域
本发明涉及癌症治疗中作为佐剂的人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体及其化学缀合物，其用于通过当施用抗癌症药物时刺激从骨髓细胞形成嗜中性粒细胞集落和诱导骨髓细胞向最终阶段分化来抑制白细胞减少，本发明更具体地，涉及通过G-CSF上的特异性位点处的氨基酸取代或插入而修饰的人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体，以及其与非蛋白质聚合物，如聚乙二醇(PEG)的化学缀合物。
背景技术
人造血活动主要在骨髓中进行，并通过多种复杂的途径产生多种血细胞。造血活动由特异性糖蛋白控制，通常称所述糖蛋白为集落形成刺激因子(CSFs)。已经按照它们的活性确定并识别了CSFs。就是说，在半固体培养基中培养血细胞时，作为生长因子的CSFs刺激单核细胞、粒细胞或其它造血细胞的克隆形成。例如，粒细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞-CSF(M-CSF)分别刺激嗜中性粒细胞和巨噬细胞集落的体外形成，而多-CSF，也称为白介素-3(IL-3)，刺激多种类型的血液和组织细胞，如粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞、红细胞，等的克隆增殖。
特别地，已知G-CSF通过刺激嗜中性先祖细胞的分化和/或增殖和激活成熟嗜中性粒细胞来促进嗜中性粒细胞的吞噬活性，并且促进趋化因子的反应性，其中所述G-CSF是指导髓间干细胞和骨髓外白细胞的分裂和分化的细胞因子((Metcalf，Blood(血液))67：257(1986)；(Yan等，Blood(血液))84(3)：795-799(1994)；(Bensinger等，Blood(血液))81(11)：3158-3163(1993)；(Roberts等，Expt′l Hematology)22：1156-1163(1994)；(Neben等，Blood(血液))81(7)：1960-1967(1993))。
通常通过放射疗法和/或化学疗法进行恶性肿瘤的治疗，其不合需要地导致白血胞的急剧减少，且伴随白细胞减少而发生免疫性的减弱，因此当放射疗法和/或化学疗法的治疗方法进行一段延长的时期时，导致明显的缺陷。最初将G-CSFs报告为能够通过激活患者的免疫能力有效治疗癌症的佐剂(Lopez等，J.Immunol.(免疫学杂志)131(6)：2983-2988，1983；Platzer等，J.Exp.Med.162：1788-1801，1985)，并且目前用于有效地治疗多种癌症和难以治疗的白血病。
G-CSFs的研究最初开始于发现粒细胞-CSF物质出现在人癌CHU-2细胞系(Nomura等，EMBO J.8(5)：871-876，1986)或人膀胱癌细胞系5637(Welte等，Proc.Narl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院会刊)82：1526-1530，1985；Strige等，Blood(血液)69(5)：1508-1523，1987)的培养基中，并且纯化具有粒细胞-集落刺激活性且具有18-19kDa的分子量的蛋白质(Nomura等，EMBO J.5(5)：871-876，1986)。
G-CSFs的cDNA首次由L.M.Souza等从人膀胱癌细胞系5673分离而来(Science(科学)，232：61-65(1986)(见韩国专利公开号1998-77885)，并且然后从鳞状癌细胞系和外周血巨噬细胞的cDNA文库进行克隆(S.Nagata等，Nature(自然)，319：415-417(1986)；S.Nagata等，EMBO J.5：575-581(1986)；Y.Komatsu等，Jpn.J.Cancer Res.(日本癌症研究综述杂志)，78：1179-1181(1987))。
随着基因重组技术的出现，揭示出G-CSFs是在由大肠杆菌(Escherichia coli)表达大量G-CSF期间作为不可溶性内含体产生的，并通过重折叠转化为活性G-CSFs。由大肠杆菌产生的重组G-CSF(rG-CSF)包括SEQ ID NO：2确定的蛋白质(175个氨基酸)，即SEQ ID NO：1确定的天然G-CSF(174个氨基酸)和N-末端的甲硫氨酸，并且具有约为19kDa的分子量。
另外，天然G-CSF在位置第133处的氨基酸苏氨酸(Thr)中具有O-糖基化位点，而源自大肠杆菌的r G-CSF不具糖基化位点。然而，已知糖基化位点和/或N-末端甲硫氨酸的存在或缺乏对生物活性几乎无影响(Souza等：Science(科学)232，1986，61)。
生物蛋白治疗剂，如G-CSF，具有有利地高选择性和低毒性，但它们体内停留时间短并且不稳定。为了克服这些缺点，开发了一种将生物适合性聚合物与生物蛋白(多肽)缀合的方法，其中所述生物适合聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮，所述生物蛋白(多肽)例如G-CSF或干扰素。此PEG缀合通过有效地抑制蛋白酶而阻止生物蛋白的降解，通过阻止生物蛋白治疗剂从肾脏的快速排泄而增加生物蛋白治疗剂的稳定性和半衰期，并降低其免疫原性(Sada等，J.FermentationBioengineering(发酵生物工程杂志)71：137-139(1991))。
特别地，PEG化的蛋白治疗剂的实例包括一种腺苷脱氨酶的PEG化制剂，其被开发为组合的免疫缺陷的治疗剂；一种干扰素的PEG化制剂，其被开发为肝炎的治疗剂；以及葡糖脑苷脂酶和血红蛋白的PEG化制剂，等。
除PEG外，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)通常在化学偶联所述蛋白质治疗剂中使用。
由于作为具有通式HO-(-CH2CH2O-)n-H的聚合化合物的PEG是高亲水性的，所述它与蛋白质结合，以用于医药应用，从而增加其溶解性。与所述蛋白质结合的PEG具有范围在约1,000-约100,000内的分子量。如果PEG的分子量超过1,000，则PEG具有显著低毒性。具有约1,000-约6,000范围内分子量的PEG系统性地存在并通过肾脏代谢。特别地，具有分子量约40,000的分支PEG存在于诸如血液、肝等器官中，并通过肾脏代谢。
美国专利号4,179,337公开一种具有生理活性的非免疫原性的水溶性多肽组合物，其具有与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶联的多肽，并具有500-20,000道尔顿的分子量。为了将PEG与多肽偶联，通常使用活化的PEG。通过将PEG的一个末端的羟基转化为甲醚基，另一个末端的羟基转化为亲电子基团来制备活化的PEG，由此使PEG通过该亲电子基团与多肽偶联。然而，由于这样的化学偶联反应是非特异性的，所以对蛋白质，即多肽活性位点的PEG化不合需要地降低该蛋白质的活性，这种情形的实例见于由Roche和Schering开发的PEG化(PEGylated)的干扰素-α中。由Roche和Schering开发的干扰素-α的PEG缀合物是这样的缀合物，其中PEG分子与干扰素-α分子组合。尽管PEG缀合增加PEG化的干扰素-α的体内半衰期，但PEG与干扰素-α的多种位点偶联，由此显著地降低其生物活性。
普遍使用的活化的PEG的实例包括(a)PEG二氯三嗪，(b)PEG三氟乙基磺酸酯(tresylate)，(c)PEG碳酸琥珀酰亚胺酯，(d)PEG苯并三唑碳酸酯，(e)PEG对硝基苯基碳酸酯，(f)PEG三氯苯基碳酸酯，(h)PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯，等(M.J.Roberts，M.D.Bentley，J.M.Harris，Chemistry for peptide and protein PEG conjugation(肽和蛋白质PEG缀合的化学)，Advanced Drug Delivery Reviews(高级药物递送综述)54(2002)459-476)。由于所述化学偶联反应是非特异性的，所以可以生成多聚体或异构体，其中所述多聚体具有多个与之键合的PEG，所述异构体具有与其不同位点键合的PEG。所述多聚体和异构体降低PEG化产物的生物活性，难以进行精确的PEG缀合的药物动力学测量和纯化过程。
为了克服这些问题，美国专利号5,766,897和WO 00/42175公开了一种利用PEG-马来酰亚胺选择性地使PEG与蛋白质的半胱氨酸(Cys)残基偶联的方法。与二硫键无关的游离半胱氨酸对通过半胱氨酸特异性PEG缀合将PEG偶联于所述蛋白质是必要的。在含有5个半胱氨酸的G-CSF中，在位置36和42(基于天然G-CSF)处的半胱氨酸之间和在位置64和74(基于天然G-CSF)处的半胱氨酸之间形成二硫键，而在位置17处的半胱氨酸是游离的半胱氨酸。位置36处的半胱氨酸与位置42处的半胱氨酸之间，和位置64处的半胱氨酸与位置74处的半胱氨酸之间两个二硫键的形成，在构建天然G-CSF和维持G-CSF的生物活性中是至关重要的。由于用丝氨酸取代位置17处的半胱氨酸不严重影响G-CSF的生物活性，所以天然G-CSF的构型和G-CSF的生物活性不归因于用丝氨酸取代位置17处的半胱氨酸(Winfield等：Biochem.J.(生物化学杂志)256，1988，213)。然而，Piget等报告了位置17处的半胱氨酸可以按照反应条件形成分子间的二硫键或分子内的二硫键，由此阻碍重折叠并降低G-CSF的生物活性和稳定性(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院会刊)，83，1986，7643)。
其间，还报告了用丝氨酸取代G-CSF位置17处的半胱氨酸几乎不导致G-CSF中生物活性的变化(见韩国专利注册号10-0114369)，其中所述半胱氨酸是G-CSF中仅存的游离半胱氨酸(Kyowa Hakko，东京，日本)。
一种利用突变G-CSF开发的示范治疗剂是由日本东京的KyowaHakko制造的
Figure A20068002396700081
(成分名称：纳妥格拉斯丁(Nartograstim))。据说，该突变G-CSF表现出与天然G-CSF相比明显的高活性和更长的体内半衰期。然而，还没有报告指出该突变G-CSF的临床益处。
可从Amgen，Inc.(
Figure A20068002396700082
pegFilgrastim)商购G-CSF和PEG间的N-末端特异性缀合的PEG化产物，其称为PEG-G-CSF。
Maxygen Inc.已经提议了开发突变G-CSF，以用于化学缀合(PCT/DK2001/00011)。然而，按照被提议的公开物，没有详细描述突变G-CSF和由其生成的PEG-G-CSF的特征。所述突变体可以通过多种方式制备。就是说，按照突变位置的选择，突变类型(插入，取代，缺失)，突变程度(1-2个残基～片段)，及其组合，存在着几千到几万种可能的突变体，并且对于各自情形，它们的生物性质和物化性质将会不同。显然地，由该突变体所产生的化学缀合物将会不同。
通常，制备用于形成化学键的突变体是基于它们结构的知识而设计的。按照Osslund等(美国专利号5,581,476)，以可接近的残基为基础选择结合位点，不受来自该化学结合干涉的结合位点选自这样的结构，其中G-CSF分子与G-CSF受体连接，以限制目标突变体的数量，由此选择实际上形成化学键的突变体。然而，本领域中的技术人员应该容易设想以所述方式中的结构知识选择突变位置。
在与突变有关的添加和插入的过程中，被添加和插入的残基数量和突变的特征(即，突变的残基的类型)显著地影响该突变体的生物活性。疏水性残基和亲水性残基的互换，或大量残基和少量残基的互换，对该突变体的结构具有重要影响。本领域技术人员可以容易地推测该结构作用将导致G-CSF的生物活性和稳定性的显著变化。特别地，如Freeman ML等所设想的，将游离半胱氨酸诱导到G-CSF对蛋白质的稳定性发挥显著的作用(Destabilization and denaturation of cellular protein by glutathione depletion(由谷胱甘肽缺失所引起的细胞蛋白的去稳定作用和变性)，Cell StressChaperones.1997 Sep；2(3)：191-8)。
发明公开内容
技术问题
为了解决上述问题，本发明的目的是提供半胱氨酸诱导的人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体及其生物适合的缀合多肽，所述突变体通过将半胱氨酸诱导到G-CSF的特异性位点，促进与生物适合的聚合物，如聚乙二醇(PEG)的特异性缀合，并由于与所述生物适合的聚合物的缀合，在不降低体内生物活性的同时增加其体内停留时间，从而最终提高其体内生物活性。
技术方案
现将更详细描述按照本发明的G-CSF的突变体和其化学缀合物。
在本发明中，由SEQ ID NO：1表示天然存在的G-CSF，由SEQ ID NO：2表示重组G-CSF(rG-CSF)。除非另外特别指出，用于本发明的术语G-CSF包括天然G-CSF和重组G-CSF。
为了实现本发明的目的，提供了人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体，所述突变体包括SEQ ID NO：3中所确定的氨基酸序列，其中在包括SEQ ID NO：1中所确定的氨基酸序列的G-CSF的位置133处，苏氨酸(Thr)残基被半胱氨酸(Cys)残基取代。
另外，本发明提供G-CSF的突变体，其中G-CSF的位置133处的苏氨酸(Thr)残基被半胱氨酸(Cys)残基取代，并且将非蛋白化学化合物修饰以适合该取代的Cys残基，其中所述G-CSF包括SEQ ID NO：1中所确定的氨基酸序列。
本发明还提供G-CSF缀合突变体，其包括SEQ ID NO：4中所确定的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：4具有这样的氨基酸序列，即在SEQ ID NO：1中所确定的G-CSF的位置133处的苏氨酸(Thr)残基被半胱氨酸(Cys)残基取代，且SEQ ID NO：1中位置17处的半胱氨酸(Cys)残基被丝氨酸(Ser)取代，并且将非蛋白化学化合物进行修饰以适合在位置133处的取代的半胱氨酸残基。
所述非蛋白化学化合物是活化的生物适合的聚合物，其用于与位置133处的半胱氨酸的硫醇基化学缀合并且优选地，所述非蛋白化学化合物是选自由下列各项组成的组的一种的化合物：聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚乙烯吡咯烷酮，其与选自由下列各项组成的组的一种结合：马来酰亚胺，乙烯砜，碘乙酰胺(iodacetamide)和邻吡啶基二硫化物(orthopyridyl disulfide)。更优选地，所述非蛋白化学化合物是PEG-马来酰亚胺的生物适合聚合物。
另外，所述非蛋白化学化合物优选地具有在约2-约100kDa范围内的分子量，更优选地，在约5-约100kDa范围内的分子量。
另一方面，提供人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体，所述突变体包括SEQ ID NO：5中确定的氨基酸序列，其中在具有SEQ ID NO：1确定的氨基酸序列的G-CSF的位置135处的甘氨酸(Gly)残基和位置136处的丙氨酸(Ala)残基之间插入半胱氨酸(Cys)残基。
本发明还提供G-CSF的缀合突变体，其包括SEQ ID NO：5中确定的氨基酸序列，其中在具有SEQ ID NO：1中确定的氨基酸序列的G-CSF的位置135处的甘氨酸(Gly)残基和位置136处的丙氨酸(Ala)残基之间插入半胱氨酸(Cys)残基，并且将非蛋白化学化合物进行修饰以适合所述插入的半胱氨酸残基。
本发明还提供G-CSF的缀合突变体，其包括SEQ ID NO：6中确定的氨基酸序列，其中在包含SEQ ID NO：1中确定的氨基酸序列的G-CSF的位置135处的甘氨酸(Gly)残基和位置136处的丙氨酸(Ala)残基之间插入半胱氨酸(Cys)残基，并且位置17处的半胱氨酸残基被丝氨酸(Ser)残基取代，并且将非蛋白化学化合物进行修饰以适合在位置136处的插入的半胱氨酸(Cys)残基。
所述非蛋白化学化合物是活化的生物适合的聚合物，其用于与位置133处的半胱氨酸的硫醇基化学缀合，且优选地是选自由下列各项组成的组的一种的化合物：聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚乙烯吡咯烷酮，其与选自由下列各项组成的组的一种结合：马来酰亚胺，乙烯砜，碘乙酰胺和邻吡啶基二硫化物。更优选地，所述非蛋白化学化合物是PEG-马来酰亚胺的生物适合聚合物。
另外，所述非蛋白化学化合物优选地具有在约2-约100kDa范围内的分子量，更优选地，在约5-约60kDa范围内的分子量。
用于本发明实践的G-CSF突变体可以是从哺乳动物生物分离而来的形式，或备选地，是化学合成过程的产物，或通过基因组或cDNA克隆或通过DNA合成获得的外源DNA序列的原核或真核宿主表达的产物。适合的原核生物宿主包括各种细菌(例如，大肠杆菌)；适合的真核生物宿主包括酵母(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞，猴子细胞)。取决于所使用的宿主，G-CSF表达产物可以是糖基化或非糖基化的。G-CSF表达产物还可以包括初始甲硫氨酸氨基酸残基。G-CSF的突变体可以是从转基因哺乳动物生物获得的产物并可从母牛、绵羊、猪、兔、山羊及不同物种的哺乳动物的乳汁、血液或尿液中获得。
为了使PEG连接于诱导的游离半胱氨酸，必须制备G-CSF的突变体，其在易于进行PEG化并且甚至在PEG连接后仍维持其生物活性的位置具有诱导的游离半胱氨酸。为了实现这个目的，本发明的发明人通过取代或插入将游离半胱氨酸诱导到结构上柔性的CD环区域，并且使PEG缀合于该诱导的游离半胱氨酸，从而产生突变G-CSF。然后，他们筛选了在PEG化期间维持其生物活性和结构稳定性的PEG-G-CSF缀合物的突变体。
在G-CSF(PDB ID，1bgc)的X-射线衍射结构中，认为所述CD环区域是具有相当大柔性的，并且对G-CSF的总体结构不发挥严重影响。因此，本发明人制备了突变体，其在由SEQ ID NO：2确定的rG-CSF的CD环(Gly126-Ser143)处具有诱导的半胱氨酸。如从数个X射线晶体结构(PDB ID，1bgc)中所看到的，认为该CD环区域是结构上不清楚的柔性区域，因此可以减弱(dampen)由PEG化所引起的结构改变。另外，本发明人可以预见CD环区域应该是聚合材料易于接近的区域，原因在于其具有充足的用于化学修饰的外部位点。此外，CD环区域具有无与受体重叠区域的受体结合结构，这有利于形成化学键。
在所述方式中，本发明的发明人制备了突变体，其具有诱导到CD环区域(126-Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala PheAla Ser-143：SEQ ID NO：2)的半胱氨酸，然后在PEG化的过程中筛选PEG-G-CSF缀合物的突变体。由此得到的半胱氨酸诱导的突变体按照诱导位置表现出稳定性和PEG缀合表现中的显著不同。一些突变体表现出在表达和纯化效率上的高稳定性和高水平，但展现出较差的PEG缀合表现，这表示在周围发生突变的微环境下不易于进行PEG缀合，其原因在于位阻现象或邻近残基的作用。另外，一些具有不稳定性的突变体非常难于表达和纯化，从而导致在纯化步骤中形成沉淀物。
由半胱氨酸诱导的突变G-CSF的PEG缀合所预期的一个优点是PEG缀合的精确性。PEG与蛋白质的赖氨酸或N末端胺的缀合通过下列各项进行：(a)PEG二氯三嗪，(b)PEG三氟乙基磺酸酯，(c)PEG碳酸琥珀酰亚胺酯，(d)PEG苯并三唑碳酸酯，(e)PEG对硝基苯基碳酸酯，(f)PEG三氯苯基碳酸酯，(g)PEG羰基咪唑，和(h)PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。上述PEG缀合是非特异性的，且双或更多等价物PEG与所述蛋白质的赖氨酸或N末端胺缀合。即使缀合相同的等价PEG，仍产生区域性异构体，其缀合于随机的位置。然后，这些过程增加去除所生成的缀合物的时间和成本(M.J.Roberts等，Chemistry for peptide and proteinPEG conjugation(多肽和蛋白质PEG缀合的化学)，Advanced Drug DeliveryReviews(高级药物递送综述)54(2002)，459-476)。PEG缀合的另一个优点是随意地选择PEG连接位点。PEG连接位点是广泛的，其包括赖氨酸、天冬氨酸(Aspatate)、谷氨酸、α胺、羧基，等。因此，如果PEG连接位点在结构上是影响所述活性的重要部分，则PEG缀合可以显著地降低所述活性。由这个观点，通过半胱氨酸诱导的特异性PEG化应该有利地用于开发用于维持所述生物活性的PEG缀合物。
由于游离的硫醇基是高反应性的，所以易于对其进行氧化(Rigo A等，Interaction of copper with cysteine：stability of cuprous complexes andcatalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation(铜与半胱氨酸的相互作用：在厌氧条件下的硫醇氧化中的亚铜复合物的稳定性和二价铜离子的催化作用)，J Inorg Biochem.2004，98(9)，1495-501)。然而，在一些情形中，游离硫醇残基可以形成二硫键。为了引起化学修饰，诱导到蛋白质表面的游离硫醇基可以形成分子间的二硫键，其导致二次沉淀或氧化，从而抑制化学修饰(Crow MK等，Protein aggregation mediated by cysteine oxidationduring the stacking phase of discontinuous buffer SDS-PAGE(在不连续缓冲液SDS-PAGE的浓缩部分中，由半胱氨酸氧化介导的蛋白质的聚集)，Biotechniques(生物技术)2001，30(2)，311-6)。当诱导的半胱氨酸残基的位点向外暴露时，该不合需要的现象变得严重。因此，仅基于其结构知识对特异性化学修饰选择半胱氨酸诱导位点会遇到严重的问题，例如由于游离半胱氨酸所导致的蛋白质的不稳定性(Grzegorz Bulaj，Formation ofdisulfide bonds in proteins and peptides(在蛋白质和肽中形成二硫键)，Biotechnology Advances(生物技术进展)23(2005)87-92)。
本发明中所制备的大多数半胱氨酸诱导的突变G-CSF显示出低表达和纯化效率。为了解决具有游离半胱氨酸残基的蛋白质的不稳定性问题，COX G.N.等使用了特别设计用于克服制备半胱氨酸诱导的突变体的不稳定性问题的方法，如WO 00/42175中所述。尽管这些尝试的方法非常适合于减轻游离半胱氨酸诱导的突变体固有的不稳定性，但是它们非常难以应用于实际生产过程中。例如，如WO 00/42175中所述，蛋白质的细胞内表达有利于获得半胱氨酸诱导的突变体的稳定性，然而，为了纯化半胱氨酸诱导的突变体，应该将所述半胱氨酸诱导的突变体分泌到细胞外空间中。WO 00/42175中所述的发明的原理存在于通过保持氧化还原电势水平常数来维持细胞外稳定性，其中所述氧化还原电势水平常数的保持是通过利用氧化还原偶联试剂等实现的。然而，很难在一段延长的时间内，特别是在纯化步骤过程中，将氧化还原电势保持在恒定的水平。然而，在本发明中，选择性地制备了与常规的折叠和纯化步骤相适合的半胱氨酸诱导的突变体，从而证实了按照本发明的半胱氨酸诱导的突变体即使具有游离的半胱氨酸残基，仍维持其结构的稳定性。本发明所选择的半胱氨酸诱导的突变G-CSF在大肠杆菌中作为内含体表达，并通过常规的重折叠技术转化为有活性的突变G-CSF。常规重折叠技术是通过在尿素或胍(guanidium)盐中增溶内含体并通过稀释或去除来移除该尿素或胍盐，以提供生物活性来完成的。按照蛋白质中存在或缺乏二硫键，可将氧化还原偶联试剂(谷胱甘肽(glutatione)或半胱氨酸的氧化或还原形式)加入到所述重折叠步骤中(Ronald W等，Disulphide bond formation in food protein aggregation andgelation(二硫键在食物蛋白聚集和凝胶化中的形成)，BiotechnologyAdvances(生物技术发展)23(2005)75-80)。在本发明中，以下列方式进行了重折叠。即，半胱氨酸诱导的突变G-CSF的内含体在谷胱甘肽存在下，优选地溶解于6-8M的尿素中，并稀释在2-4M的尿素中，从而重折叠它们。
用于缀合的PEG聚合物对分子量没有特殊的限制，但是优选地具有在约2kDa-100kDa范围内的分子量，更优选地，在约10kDa-60kDa范围中的分子量。本发明使用一种将PEG-马来酰亚胺作为生物适合聚合物偶联于半胱氨酸诱导的G-CSF的被诱导半胱氨酸-硫醇残基的方法。就是说，G-CSF与20kDa或30kDa的PEG-马来酰亚胺反应，从而制备20kDa或30kDa的PEG-G-CSF缀合物。
在生物适合聚合物与半胱氨酸诱导的G-CSF的硫醇残基的PEG缀合反应中，PEG与G-CSF的摩尔比优选地在2∶1-200∶1的比率内，且反应温度优选地在约0-约60℃的范围内。该反应优选地在pH值约5.0-约7.7的范围内进行，且反应时间优选地在约5分钟-约24小时的范围内。
在进行了本发明所述方法中的PEG化后，利用SDS-PAGE分析确定PEG和突变G-CSF间的缀合。为了从缀合反应物获得单-PEG-G-CSF缀合物，利用阳离子交换层析分离单-PEG-G-CSF衍生物。对利用阳离子交换层析分离的衍生物进一步进行大小排阻层析，从而仅分离去除了微量未反应的G-CSF的单-PEG-G-CSF缀合物。
为了测量本发明的单-PEG-G-CSF衍生物的生物活性，使用了在多种文献(Baldwin等，Acta Endocrinologica.119：326，1988；Clark等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，271(36)：21969，1996；和Bozzola等，J.endocrinol.Invest.(内分泌学研究杂志)，21：768，1998)中所描述的已知方法。这些测量结果显示按照本发明的PEG-G-CSF缀合物在维持高水平的生物活性的同时具有增加的体内停留时间。
据说N末端单PEG化的非格司亭具有非格司亭体外生物活性的68％(美国专利号5,824,784)。相反地，每种按照本发明的PEG-G-CSF缀合物具有非格司亭体外生物活性的约2.1-约3.5倍(即，250～300％)。另外，每种按照本发明的PEG-G-CSF缀合物的体内半衰期是非格司亭的至少约5倍。此外，其在嗜中性粒细胞活化生物活性方面，优越于非格司亭。上述内容的原因推测如下。即，G-CSF的生物活性和稳定性不受选择的被诱导的半胱氨酸的位置影响，且该选择的位置是其中可以灵活减弱由于G-CSF的PEG化所引起的结构的改变的位置。
有利作用
如上所述，本发明可以提供半胱氨酸诱导的粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体及其生物适合的缀合多肽，其中所述突变体通过将半胱氨酸诱导到G-CSF的特异性位点而促进与生物适合聚合物，如聚乙二醇(PEG)的特异性缀合，并由于与所述生物适合的聚合物的缀合，在不降低体内生物活性的同时增加其体内停留时间，从而最终提高其体内生物活性。另外，由于在考虑药物动力学分布图时，按照本发明的PEG-G-CSF缀合物具有比非格司亭更高的血浆稳定性，4.2-5.1倍更长的体内半衰期，由此维持了其活性并提高了治疗作用。此外，所述嗜中性粒细胞在药效学中的活化作用优越于非格司亭。
附图简述
图1是PEG-G-CSF缀合反应的示意图；
图2显示按照本发明的纯化的G-CSF突变体和PEG缀合物的SDSPAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的结果；
图3显示按照本发明的G-CSF-PEG缀合反应物的SDS PAGE分析结果；
图4显示按照本发明的G-CSF-PEG缀合物的体内药物动力学测量结果；和
图5是举例说明药物动力学测量结果的图解表示，其用于比较G-CSF-PEG缀合物之间的嗜中性粒细胞活化作用的体内活性。
实施本发明的最佳方式
以下，本发明将参考下列实施例进行更详细地描述。提供下列实施例进行举例说明，而不限制本发明。
[实施例1-11]通过SEQ ID NO：2确定的G-CSF的CD环(Gly126-Ser143)中的氨基酸的半胱氨酸取代来制备缀合的突变G-CSF
A.制备重组G-CSF(rG-CSF)
利用在本发明申请人的韩国专利号230579中所述的菌株(KFCC-10961)表达本发明使用的重组G-CSF(rG-CSF)。由此制备的，像非格司亭一样来自大肠杆菌的重组G-CSF，具有SEQ ID NO：2中确定的氨基酸序列。
在这些实施例中，基于使用重组G-CSF作为G-CSF的事实，在SEQ IDNO：2中确定的氨基酸序列的基础上，给所述制备的重组G-CSF指定氨基酸序列号。
B.制备半胱氨酸诱导的重组G-CSF的突变体
从韩国专利号230579中所述的G-CSF表达菌株(KFCC-10961)制备半胱氨酸诱导的突变G-CSF。在LB培养基中搅拌培养所述G-CSF表达菌株12小时，然后利用由Quiagen，Inc制造的质粒制备试剂盒分离G-CSF表达载体(pGW2)。利用含有列于表1中的半胱氨酸诱导的基因的互补突变引物(具有长度为30-40碱基对的互补多核苷酸双链)，对作为模板的分离的G-CSF表达载体(pGW2)，进行聚合酶链式反应(PCR)。然后用DPN1酶处理由用PCR克隆生成的G-CSF表达载体，以去除模板，然后将其转化到铷处理的MC1061大肠杆菌中。在氨苄青霉素培养基中培养该转化宿主，从而筛选转化体菌株。按照使用指导，分别利用pfuTurbo DNA聚合酶和DPN1酶进行了用于去除突变和模板的PCR酶处理，所述pfuTurboDNA聚合酶和DPN1酶可以由位点定向诱变试剂盒(QuikChang位点定向诱变试剂盒，Stratagen，Inc.)获得。通过利用引物(5′-GCGGATCCTGCCTGA-3′)的PCR的碱基测序的分析证实了突变。
C.半胱氨酸诱导的突变G-CSF的表达
在各自补充了5μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中培养半胱氨酸诱导的突变G-CSF 12小时，然后转移到补充了5μg/ml氨苄青霉素的500ml LB培养基中搅拌培养。当所述菌株的光密度(OD)达到0.5时，将最终浓度为1％(w/v)的阿拉伯糖加入到各个培养基中，并搅拌培养约7小时，从而过表达该半胱氨酸诱导的突变G-CSF。
D.半胱氨酸诱导的突变G-CSF的重折叠
对过表达半胱氨酸诱导的突变G-CSF的菌株进行离心，从而使其悬浮于20mM的Tris和150mM的NaCl中，并利用超声波仪破裂所述悬浮的菌株。离心该破裂的菌株，并用2％(w/v)脱氧胆酸钠洗涤，从而回收内含体。将半胱氨酸诱导的突变体的内含体溶解于7M的尿素，20mM的Tris，和100mM的NaCl，pH8.8中，并在3.3M的尿素，5mM的Tris，2mM的还原的谷胱甘肽和0.2M的氧化的谷胱甘肽，pH8.8中稀释10倍。在4℃，随着搅拌进行重折叠步骤18小时。
E-1.制备PEG化的半胱氨酸诱导的突变G-CSF
用HCl滴定作为重折叠样品的半胱氨酸诱导的突变G-CSF达到pH4.5后，利用离心移除由此生成的沉淀。为了纯化具有活性的半胱氨酸诱导的突变G-CSF，将20mM磷酸钠注射到在pH4.0平衡的SP-琼脂糖凝胶快流柱中，用平衡缓冲液进行洗涤，用盐浓度梯度100～5000mM的NaCl进行洗脱。
调节该洗脱的半胱氨酸诱导的突变G-CSF样品的pH值为6.8，并将具有平均分子量约20kDa或约30kDa的甲氧基-PEG-马来酰亚胺(Shearwater，Inc，U.S.A)加入到由此产生的溶液中，由此，半胱氨酸诱导的突变G-CSF：甲氧基-PEG-马来酰亚胺的摩尔比为1∶2。然后，在4℃，随着缓慢搅拌，容许反应发生约18小时。
E-2.制备乙烯砜-PEG化的半胱氨酸诱导的突变G-CSF
在将用如E-1部分中所述相同方法分离的半胱氨酸诱导的突变G-CSF的SP-琼脂糖凝胶流出液样品的pH值调节为7.5后，将具有平均分子量约20kDa的甲氧基-PEG-乙烯砜加入到产生的溶液中，由此，半胱氨酸诱导的突变G-CSF：甲氧基-PEG-马来酰亚胺的摩尔比为1∶5。然后，在4℃，随着缓慢搅拌，容许反应发生约18小时。
E-3.制备碘乙酰胺-PEG化的半胱氨酸诱导的突变G-CSF
在将用与E-1部分中所述相同方法分离的半胱氨酸诱导的突变G-CSF的SP-琼脂糖凝胶流出物样品的pH值调节为7.0后，将具有平均分子量约20kDa的甲氧基-PEG-碘乙酰胺加入到产生的溶液中，由此，半胱氨酸诱导的突变G-CSF∶甲氧基-PEG-碘乙酰胺的摩尔比为1∶2。然后，在4℃，在暗室中，随着缓慢搅拌，容许反应发生约48小时。
F.分离单-PEG-G-CSF衍生物融合体
在将制备的PEG化的半胱氨酸诱导的突变G-CSF的pH值调节为4.0后，在缓冲溶液(20mM Na2HPO4一价碱，pH 4.8)中将由此产生的产物稀释3倍，并将其注射到利用与所述缓冲液相同的平衡缓冲液，即含有20mMNa2HPO4一价碱的pH4.8的平衡缓冲液，平衡的SP-琼脂糖凝胶快流柱中。然后用缓冲溶液(20mM Na2HPO4一价碱，50mM NaCl，pH 4.8)洗涤由此产生的产物，并再用盐浓度梯度50-500mM的NaCl进行洗脱。为了从半胱氨酸诱导的突变G-CSF中移除未反应的G-CSF，对PEG化的半胱氨酸诱导的突变G-CSF进行了大小排阻层析，其中所述PEG化的半胱氨酸诱导的突变G-CSF是从SP-琼脂糖凝胶柱中洗脱出来的。浓缩SP-琼脂糖凝胶流出物，并将其注射到经过缓冲溶液(20mM Na2HPO4一价碱，100mMNaCl(pH4.0))平衡的Superdex 200(2.5×50cm，Pharmacia)中，并用相同的缓冲溶液以1ml/min的洗脱速率进行洗脱。利用SDS-PAGE分析确定该分离的PEG化半胱氨酸诱导的突变G-CSF的纯度。
表1显示实施例1-11中所制备的每种PEG化的半胱氨酸诱导的突变体的回收率和缀合表现，以百分位数(％)表示
表1
Figure A20068002396700191
[在本发明的表中，在突变位点栏中所指出的表示法，例如″Ala 128Cys″，意指编号128的氨基酸，即Ala，被Cys取代，且该表示法以相同的方式用于其它实施例中。]
[突变体回收率意指经过对PEG突变体缀合进行重折叠和纯化后突变体的产量，即纯化的突变G-CSF的数量与在内含体中表达的突变G-CSF的总计数的比例。]
[PEG缀合表现意指与PEG缀合的G-CSF的数量与有关PEG缀合的突变G-CSF的总数的比例。]
[实施例12-22]通过G-CSF的CD环(Gly126-Ser143)的氨基酸中的半胱氨酸取代和用丝氨酸取代位置18处的半胱氨酸来制备缀合的突变G-CSF缀合物。
如实施例1-11中相同的方式制备主题突变体，除了为了通过包含用丝氨酸取代氨基酸中的半胱氨酸(Cys)和用丝氨酸取代CD环(Gly126-Ser143)中位置18处的半胱氨酸来制备突变体，利用Cys 18 Ser取代的突变菌株进行了半胱氨酸诱导的突变，并且该半胱氨酸诱导的突变是以与上述相同的方式进行的。本发明人制备了在SEQ ID NO：2中确定的rG-CSF的CD环上具有半胱氨酸诱导的突变体。
表2显示实施例12-22中所制备的每种PEG化的半胱氨酸诱导的突变体的回收率和缀合表现，以百分位数(％)表示。
表2
Figure A20068002396700201
[实施例23-28]通过在G-CSF的CD环(Gly126-Ser143)中插入半胱氨酸(Cys)来制备G-CSF缀合物的突变体
如实施例1-11中相同的方式制备主题突变体，除了为了通过将半胱氨酸(Cys)插入CD环(Gly126-Ser143)中来制备突变体，利用含有半胱氨酸诱导的基因的互补突变引物(具有长度为30-40碱基对的互补多核苷酸双链)，对作为模板的分离的G-CSF表达载体(pGW2)进行了聚合酶链式反应(PCR)，列于表3中。
表3显示实施例23-28中所制备的每种PEG化的半胱氨酸诱导的突变体的回收率和缀合表现，以百分位数(％)表示
表3
Figure A20068002396700211
[在本发明的表中，在突变位点栏中所指出的表示法，例如″130Cys131″，意指氨基酸Cys被插入到编号130和131的氨基酸之间，且该表示法以相同的方式用于其它实施例中。]
[实施例29-34]通过在G-CSF的CD环(Gly126-Ser143)中插入半胱氨酸(Cys)和用丝氨酸取代位置18处的半胱氨酸来制备G-CSF缀合物的突变体
如实施例23-28中相同的方式制备主题突变体，除了为了通过包含氨基酸中的半胱氨酸(Cys)插入和用丝氨酸取代CD环(Gly126-Ser143)中位置18处的半胱氨酸来制备突变体，利用Cys 18 Ser取代的突变菌株进行了半胱氨酸诱导的突变，并且该半胱氨酸诱导的突变是以与上述相同的方式进行的。
表4显示了实施例29-34中所制备的每种PEG化的半胱氨酸诱导的突变体的回收率和缀合表现，以百分位数(％)表示
表4
Figure A20068002396700221
图2显示实施例33(M2_S)中所制备的纯化的突变G-CSF的PEG缀合物的SDS PAGE分析结果，其中Cys18被Ser取代，且Cys被插入到位置136处的Gly和位置137处的Ala之间，通过与20kDa的PEG-马来酰亚胺或30kDa的PEG-马来酰亚胺缀合并对其进行纯化获得该纯化的PEG缀合物，显示单条带。
图3显示实施例33(M2_S)中所制备的突变G-CSF的20kDa PEG缀合物的SDS PAGE分析结果，其中Cys18被Ser取代，且Cys被插入到位置136处的Gly和位置137处的Ala之间。
如图3中所示，由于半胱氨酸诱导的突变G-CSF的PEG-马来酰亚胺缀合反应对诱导的半胱氨酸是非特异性的，所以可以在不形成寡聚体或多聚体(polygomer)的同时获得单-PEG-G-CSF。
实验例1.体外活性的测量
测量了实施例1-34中所制备的半胱氨酸诱导的突变G-CSF PEG缀合物的生物活性，并与非格司亭(大肠杆菌来源的G-CSF)的活性进行了比较。该活性测量是通过鼠骨髓性白血病细胞系NFS-60(ATCC X65622)的细胞增殖进行的。在含有10％(v/v)FBS(胎牛血清)的RPMI1640培养基和5％WEHI-1640细胞系培养溶液中培养NFS-60细胞，并使其悬浮于含有10％(v/v)FBS的RPMI培养基中，以达到约2×105细胞/ml的浓度。将每50μl的所述悬浮细胞混悬液加入到96孔微量滴定板的每个孔中，每个孔中含有约1×104个细胞。
利用BCA(Bicinconinic acid)蛋白测定，在含有10％(v/v)FBS的RPMI1640培养基中稀释实施例中所制备的非格司亭和半胱氨酸诱导的突变体的PEG缀合物。进一步在含有10％(v/v)FBS的RPMI 1640培养基中以12个阶段将其稀释3倍。将每100μl由此制备的样品加入到各个培养NFS-60细胞的孔中，因此样品在培养基中的浓度连续减少，直到最终样品浓度达到10000-0.05pg/ml的范围。在37℃培养箱中培养48小时后，利用CellTiter96TM(Cat.No.G3580)(PROMEGA)证实了该细胞的增殖。
表5显示实施例1-34中所制备的PEG化的半胱氨酸诱导的突变体的回收率和缀合表现的总数据。
所述突变回收率指来自内含体的纯化的突变G-CSFs的数量相对于突变G-CSFs总数的产率。证明了具有相对高回收率的突变体导致具有相对高稳定性的半胱氨酸诱导的突变体。其间，PEG缀合表现指与PEG缀合的G-CSFs的数量与有关PEG缀合的突变G-CSFs总数的比例。较高的PEG表现意指PEG可以易于与诱导的半胱氨酸偶联。所述NFS60活性指假定非格司亭的体外生物活性为100％时，PEG缀合物的体外生物活性。
表5
Figure A20068002396700241
Figure A20068002396700251
如表1中所示，实施例1，10，11，12，21和22中制备的半胱氨酸诱导的突变体不易于表达和纯化。在易于表达和纯化的半胱氨酸诱导的突变体中，其中Cys18被丝氨酸取代的突变体的生物活性与维持位置18处的半胱氨酸不变的突变体的生物活性没有显著区别。然而，维持位置18处的半胱氨酸的半胱氨酸诱导的突变体在PEG化后经历了生物活性的轻微降低。这个发现与Park等报告的内容(韩国专利申请号10-2003-0017606)一致。相信是对位置18处的半胱氨酸进行了PEG缀合作用。
在筛选步骤后，为了实现PEG缀合，即PEG化，进行了最后的筛选步骤，以确定突变G-CSF(M1)，其中G-CSF的Thr134被半胱氨酸取代；突变G-CSF(M2)，其中Cys被插入到Cly136和Ala137之间；突变G-CSF(M1_S)，其中位置18处的Cys被Ser取代；和突变G-CSF(M2_S)，其中位置18处的Cys被Ser取代，且Cys被插入到Cly136和Ala137之间。将PEG化的M1，M1_S，M2和M2_S突变体分别命名为20kDa PEG-M1，20kDa PEG-M1_S，20kDa PEG-M2和20kDa PEG-M2_S。
实验例2.药物动力学的测量
测量了在实验例1中所确定每种20kDa PEG缀合的半胱氨酸诱导突变G-CSF，即20kDa PEG-M1，20kDa PEG-M1_S，20kDa PEG-M2和20kDaPEG-M2_S的血清停留时间。对于每个组，将非格司亭(对照)和实施例中制备的20kDa PEG-M1，20kDa PEG-M1_S，20kDa PEG-M2和20kDaPEG-M2_S以100μg/kg体重，各自皮下注射到5只SD大鼠(雄性SpragueDawly大鼠，6周，重量200-250g)中，并在注射后0.5，1，2，4，8，12，16，20，24，30，36，48，60，72，96，120，144和168小时收集血液样品。该血液样品在室温下凝固1小时，随后利用微型离心机在10000rpm离心5分钟，从而移除细胞。通过利用单克隆抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血浆G-CSF的量。
表6显示测试组和校对组的血浆半衰期。
表6
  对照   实施例   实施例   实施例   实施例
  非格司亭   20kDaPEG-M1   20kDaPEG-M1_S   20kDaPEG-M2   20kDaPEG-M2_S
  血浆半衰期(T1/2，hr)   1.9   7.9   8.2   8.9   9.7
图4显示按照本发明的G-CSF-PEG缀合物的体内药物动力学测量结果。
参考表6和图4，本发明的20kDa表现出比非格司亭更高的血浆稳定性，即比非格司亭长4.2-5.1倍的体内半衰期，这表示按照本发明的半胱氨酸诱导的突变G-CSF的20kDa PEG缀合物维持体内活性的时期比非格司亭更长，从而提高其治疗功效。
实验例3.药物药效学测量
测量了在实验例1中所确定每种20kDa PEG缀合的半胱氨酸诱导突变G-CSF，即20kDa PEG-M1，20kDa PEG-M1_S，20kDa PEG-M2和20kDaPEG-M2_S的嗜中性粒细胞活性。对于每个组，将非格司亭(对照)和实施例中制备的20kDa PEG-M1，20kDa PEG-M1_S，20kDa PEG-M2和20kDa PEG-M2_S以100μg/kg体重，各自皮下注射到5只SD大鼠(雄性Sprague Dawly大鼠，6周，重量200-250g)中，并通过眼部出血收集血液样品一段时间。然后，计数血浆嗜中性粒细胞的数量。
图5是举例说明药物动力学测量结果的图解表示，其用于比较G-CSF-PEG缀合物之间的嗜中性粒细胞的体内活性。
如图5中所示，与非格司亭相比，每种20kDa PEG缀合的半胱氨酸诱导的突变G-CSF，即20kDa PEG-M1，20kDa PEG-M1_S，20kDa PEG-M2和20kDa PEG-M2_S的嗜中性粒细胞活性要高得多。
工业适用性
如上所述，本发明涉及作为治疗癌症中的佐剂的人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)突变体及其化学缀合多肽，其用于通过当施用抗癌症药物时刺激从骨髓细胞形成嗜中性粒细胞集落，和诱导骨髓细胞向最终阶段分化而抑制白细胞减少。因此，本发明有利地适用于医药目的和治疗疾病。
序列表
<110>  牧岩生命工学研究所
       康官烨
       洪晶云
<120>  粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体及其化学缀合多肽
<130>  SOP-060016PCT-mogam
<160>  6
<170>  KopatentIn 1.71
<210>  1
<211>  174
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  hG-CSF的氨基酸序列
<400>  1
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
  1               5                  10                  15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
             20                  25                  30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
     50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Iie Ser
                 85                  90                  95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
    130                 135                 140
Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145                 150                 155                 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170
<210>  2
<211>  175
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  重组hG-CSF的氨基酸序列
<400>  2
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
  1               5                  10                  15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
             20                  25                  30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
         35                  40                  45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
     50                  55                  60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
                 85                  90                  95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
            100                 105                 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
        115                 120                 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
    130                 135                 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170                 175
<210>  3
<211>  174
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  hG-CSF的氨基酸序列，其在位置133处被半胱氨酸取代
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
  1               5                  10                  15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
             20                  25                  30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
     50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
                 85                  90                  95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Gln Pro Cys Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
    130                 135                 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145                 150                 155                 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170
<210>  4
<211>  174
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>hG-CSF的氨基酸序列，其在位置133处被半胱氨酸取代，
    且在位置17处被丝氨酸取代
<400>4
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
  1               5                  10                  15
Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
             20                  25                  30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
     50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
                 85                  90                  95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Gln Pro Cys Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
    130                 135                 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145                 150                 155                 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170
<210>  5
<211>  175
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  hG-CSF的氨基酸序列，其中半胱氨酸被插入到位置135和136之间
<400>  5
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
  1               5                  10                  15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
             20                  25                  30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
     50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
                 85                  90                  95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Cys Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
    130                 135                 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170                 175
<210>  6
<211>  175
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  hG-CSF的氨基酸序列，其中半胱氨酸被插入到位置135和136之间，
       且在位置17处被丝氨酸取代
<400>  6
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
  1               5                  10                  15
Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
             20                  25                  30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
     50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
                 85                  90                  95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Cys Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
    130                 135                 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170                 175

Claims (12)

1.人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体，所述突变体包括SEQ ID NO：3中确定的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：1中确定的氨基酸序列的G-CSF位置133处的苏氨酸(Thr)残基被半胱氨酸(Cys)残基取代。
2.人G-CSF的缀合突变体，所述突变体包括SEQ ID NO：3中确定的氨基酸序列，其中包括SEQ ID NO：1中确定的氨基酸序列的G-CSF的位置133处的苏氨酸(Thr)残基被半胱氨酸(Cys)残基取代，且所取代的Cys残基连接于非蛋白化学化合物。
3.权利要求2的缀合突变体，其中所述突变体是蛋白质，其包括SEQID NO：4中确定的氨基酸序列，所述氨基酸序列的位置17处的半胱氨酸(Cys)残基被丝氨酸(Ser)残基取代。
4.权利要求2或3的缀合突变体，其中所述非蛋白化学化合物是选自由下列各项组成的组中的一种的化合物：聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚乙烯吡咯烷酮，其与选自包括下列各项的组的一种结合：马来酰亚胺，乙烯砜，碘乙酰胺和邻吡啶基二硫化物。
5.权利要求2或3的缀合突变体，其中所述非蛋白化学化合物具有在约2-约100kDa范围内的分子量。
6.权利要求4的缀合突变体，其中所述PEG具有在约5-约100kDa范围内的分子量。
7.人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体，所述突变体包括SEQ ID NO：5中包括的氨基酸序列，其中半胱氨酸(Cys)残基被插入到包含于SEQ ID NO：1的G-CSF的位置135处的甘氨酸(Gly)残基和位置136处的丙氨酸(Ala)残基之间。
8.人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的缀合突变体，所述突变体包括SEQ ID NO：5中包括的氨基酸序列，其中半胱氨酸(Cys)残基被插入到包含在SEQ ID NO：1中包含的氨基酸序列的G-CSF的位置135处的甘氨酸(Gly)残基和位置136处的丙氨酸(Ala)残基之间，且非蛋白化学化合物连接于插入的半胱氨酸残基。
9.权利要求8的缀合突变体，其中所述突变体是蛋白质，其包括SEQID NO：6中包括的氨基酸序列，所述氨基酸序列的位置17处的半胱氨酸残基被丝氨酸(Ser)残基取代。
10.权利要求8或9的缀合突变体，其中所述非蛋白化学化合物是选自包括下列各项的组中的一种的化合物：聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚乙烯吡咯烷酮，其与选自包括下列各项的组的一种结合：马来酰亚胺，乙烯砜，碘乙酰胺和邻吡啶基二硫化物。
11.权利要求8或9的缀合突变体，其中所述非蛋白化学化合物具有在约2-约100kDa范围内的分子量。
12.权利要求10的缀合突变体，其中所述PEG具有在约5-约100kDa范围内的分子量。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0605684D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Sicor Biotech Uab Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor
WO2008147534A1 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Maxygen Holdings Ltd. Method for the treatment of neutropenia by administration of a multi-pegylated granulocyte colony stimulating factor (g-csf) variant
JP5594691B2 (ja) * 2008-03-17 2014-09-24 独立行政法人理化学研究所 改変タンパク質
WO2009139784A1 (en) * 2008-05-13 2009-11-19 Nora Therapeutics, Inc. Human g-csf analogs and methods of making and using thereof
UA118536C2 (uk) * 2008-07-23 2019-02-11 Амбркс, Інк. Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
US20140187488A1 (en) 2011-05-17 2014-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
JP7046173B2 (ja) * 2017-10-11 2022-04-01 エランコ・ユーエス・インコーポレイテッド ブタｇ－ｃｓｆ変異体とその使用
JP2021509805A (ja) * 2017-12-27 2021-04-08 カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ 顆粒球コロニー刺激因子活性を示すポリペプチド

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
JP2796388B2 (ja) * 1988-05-13 1998-09-10 アムジエン・インコーポレーテツド Ｇ−ｃｓｆの精製方法
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5104651A (en) * 1988-12-16 1992-04-14 Amgen Inc. Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
US6066318A (en) * 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
KR100230579B1 (ko) 1997-04-23 1999-12-01 허영섭 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 재조합 미생물 및 그로부터 전기 재조합 단백질의 제조방법
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
EP1012184B1 (en) * 1997-07-14 2007-10-10 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US7153943B2 (en) * 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
KR100260350B1 (ko) * 1998-02-09 2000-07-01 허영섭 과립구 콜로니 자극인자의 유도체 단백질을 생산하는 재조합 미생물 및 그로부터 전기 재조합 단백질의 제조방법
BR122013003013B8 (pt) 1999-01-14 2021-07-06 Bolder Biotechnology Inc proteína isolada monopeguilada do hormônio do crescimento e método para sua obtenção
US6831158B2 (en) * 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
ES2327606T3 (es) 2000-01-10 2009-11-02 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de g-csf.
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6646110B2 (en) * 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6602498B2 (en) * 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
WO2003078461A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biopolymed Inc. Preparation of g-csf stoichiometrically conjugated with biocompatible polymers at cystein residue
JP4412461B2 (ja) * 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
KR20040083268A (ko) * 2003-03-21 2004-10-01 한미약품 주식회사 안정성이 증가된 인간 과립구 콜로니 자극인자 융합체 및이의 제조방법

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