CN112175089A - 一种粒细胞集落刺激因子重组蛋白、缀合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)重组蛋白以及缀合物，其制备方法及其在白细胞数量减少相关疾病的治疗方面的应用。

Description

一种粒细胞集落刺激因子重组蛋白、缀合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种重组蛋白或者重组蛋白的缀合物，特别涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重组蛋白以及缀合物，制备所述重组蛋白和缀合物的方法以及其在中性粒细胞减少症的治疗方面的应用。
背景技术
中性粒细胞减少是肿瘤放化疗中常见的不良反应，是引起化疗延迟和减量的首要原因，也是导致放疗暂停的重要原因，随之引起的中性粒细胞减少性发热(febrileneutropenia，FN)可危及生命，是最重要的肿瘤急症之一。
人粒细胞集落剌激因子(G-CSF),是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，能够通过特异性结合细胞髓细胞表面的受体，刺激嗜中性粒细胞的前体进行分裂，促进血液中的中性粒细胞数增加。目前市面上存在多种商业化的G-CSF制剂被用于治疗中性粒细胞减少症，如非格司亭(filgrastim)(商品名为
Figure BDA0002114321130000011
)、雷诺司亭(lenograstim)(商品名为
Figure BDA0002114321130000012
和
Figure BDA0002114321130000013
)、那曲司亭(nartograstim)(商品名为
Figure BDA0002114321130000014
)等和国产药物瑞白等。
然而，天然的G-CSF全长174个氨基酸残基，分子量较小，容易被肾小球过滤，在体内的半衰期很短，通常只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天，影响了患者的依从性。因此通过将G-CSF与其他分子偶联增加分子量能够提高蛋白质的半衰期。例如将G-CSF与白蛋白和IgG偶联，通过FcRn介导的内吞保护作用，使G-CSF不被降解和代谢，延长了半衰期。此外，偶联20KD聚乙二醇的重组人粒细胞集落剌激因子制剂培非格司亭(pegfilgrastim)(商品名
Figure BDA0002114321130000015
)以及国产药物新瑞白，均显著延长了G-CSF的半衰期。
不过，现有的PEG的G-CSF制剂虽然可以延长G-CSF体内半衰期，但是由于活性位点的封闭或空间位阻效应往往伴随着生物学活性的下降，就导致临床应用时需要加大剂量制剂以保证治疗效果，同时带来了各种G-CSF治疗的副作用，例如骨痛等。因此，本领域迫切需要体内活性更好的G-CSF长效试剂。
发明内容
发明人意外的发现，如果改变PEG与G-CSF偶联的方式，即通过在G-CSF的末端(优选C末端)通过Sortase酶定点偶联PEG，特别是40KD的PEG，不但能够显著改善G-CSF的半衰期，还能够最大限度的保留其活性，所获得的技术效果显著优于市面上已有的PEG修饰药物(例如新瑞白)，从而完成了本发明。具体的，本发明提供以下实施方案：
在第一个方面中，本发明提供了一种粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重组蛋白，其包括粒细胞集落刺激因子活性多肽以及包含Sortase酶识别位点的多肽区段P，所述活性多肽与所述多肽区段P直接连接或者通过接头L连接，所述多肽区段P优选连接于所述活性多肽的C端或者N端，更优选C端；所述Sortase酶例如是Sortase A或Sortase B；优选的，所述多肽区段P包含Sortase A的核心识别位点LPXTG，其中X是任意氨基酸，例如LPETG、LPETGG或LPETGGG；还优选的，所述多肽区段P还包含与Sortase酶识别位点连接的亲和标签，例如，所述多肽区段P选自LPETGGHHHHHH和LPETGGWSHPQFEK。
在一个实施方案中，所述粒细胞集落刺激因子活性多肽源自人，如人粒细胞集落刺激因子活性多肽；所述人粒细胞集落刺激因子活性多肽相比较野生型序列可包含1个或更多个氨基酸突变，条件是仍保留其活性；例如所述人粒细胞集落刺激因子活性多肽包含SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或更高的一致性。
在另一个实施方案中，其中所述接头L为包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的肽段；更优选地，所述接头L为包含甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、丙氨酸(Ala，A)和/或苏氨酸(Thr，T)的柔性肽段，例如，(GS)w(GGS)x(GGGS)y(GGGGS)z，其中w、x、y和z分别选自0至50的整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，优选的，w、x、y和z不同时为0；
优选地，接头L的序列为：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)。
在另一个实施方案中，所述重组蛋白包含如SEQ ID NO：1所示的序列，或者由SEQID NO：2所示的核酸分子编码。
在第二个方面中，本发明提供了一种缀合物，其是由亲水聚合物分子连接至第一个方面中任一项所述重组蛋白的末端而形成，所述末端例如N末端或者C末端；其中，优选地经转肽反应连接至所述Sortase酶识别位点。
在一个实施方案中，其中所述亲水聚合物分子选自多糖和聚亚烷基二醇，如聚丙二醇和聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇可以是末端封端的，例如经烷氧基如甲氧基封端的；和/或所述聚亚烷基二醇是直链的或支链的；例如所述聚亚烷基二醇是支链的，例如是支链的聚乙二醇，尤其是经甲氧基封端的支链聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇的分子量可以是>＝1、>＝10、>＝20、>＝30、>＝40、>＝50、>＝60、>＝70、>＝80、>＝90、>＝100、>＝110、>＝120、>＝130、>＝140、>＝150或>＝160kDa，例如是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kDa，或者以上任意二数值之间的值；优选地所述亲水性聚合物分子的分子量是20kD或40kD。
在第三个方面中，本发明提供了一种制备第二个方面中所述缀合物的方法，其中包括使第一个方面的重组蛋白与Sortase酶(如Sortase A或Sortase B)和亲水聚合物分子接触，其中所述亲水聚合物分子一端带有可被Sortase酶酰胺化的氨基，优选的，所述亲水聚合物分子的一端带有聚Gly，例如GGGAA。
在第四个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的第一个方面所述的重组蛋白和/或第二个方面所述的缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，其用于在有需要的患者中提高白细胞计数；优选的，所述患者患有或者有风险罹患嗜中性粒细胞水平不足，例如所述患者患有或者有风险罹患中性粒细胞减少症。
在又一个实施方案中，所述药物组合物可以为液体制剂形式或冻干制剂形式。
在第五个方面中，本发明提供了第一个方面所述的重组蛋白、第二个方面所述的缀合物或第四个方面所述的药物组合物在制备用于在有需要的患者中提高白细胞计数的药物中的用途，优选的，所述患者患有或者有风险罹患嗜中性粒细胞水平不足，例如所述患者患有或者有风险罹患中性粒细胞减少症。
在第六个方面中，本发明提供了一种在有需要的患者中提高白细胞计数的方法，其包括向所述患者施用第一个方面所述的的融合蛋白、第二个方面所述的的缀合物或第四个方面所述的药物组合物，优选的，所述患者患有或者有风险罹患嗜中性粒细胞水平不足，例如所述患者患有或者有风险罹患中性粒细胞减少症。
在一个实施方案中，其中所述患者处于接受能够降低患者白细胞计数的药物治疗之前、之中或者之后。
在又一个实施方案中，其中所述药物治疗为放疗或化疗。
在第七个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其包含第一个方面所述的重组蛋白、第二个方面所述的缀合物或第四个方面所述的药物组合物，以及任选包含的使用说明书。
在第八个和第九个方面中，本发明分别提供了编码第一个方面所述的重组蛋白的核酸序列以及包含所述核酸序列的表达载体。
需要明确的是，此处仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或更多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
附图说明
图1显示了重组蛋白rhG-CSF-G3的SDS-PAGE电泳检测结果。
图2显示了rhG-CSF-G3重组蛋白缀合20kD(A)和40KD(B)GGGAA-PEG后的RPC-HPLC检测结果。
图3显示了在雄性(A)和雌性(B)SD大鼠模型中各组白细胞计数的变化情况。
图4显示了在雄性(A)和雌性(B)SD大鼠模型中各组中性粒细胞计数的变化情况。
图5显示了在SD大鼠模型中单次皮下注射相同剂量(250μg/kg)不同给药制剂后平均血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案、及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本发明进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
术语“粒细胞集落刺激因子(G-CSF)活性多肽”是指能够在体内、体外或离体产生G-CSF活性的蛋白质或者多肽，其中所述活性多肽优选是哺乳动物G-CSF，尤其是人G-CSF。所述人粒细胞集落刺激因子活性肽包含SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、98％、99％或更高的一致性。
术语“粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重组蛋白”是指通过重组方法产生，包括例如在合适的原核或真核宿主细胞中进行表达，然后通过常规技术从中分离出的粒细胞集落因子蛋白。其中本发明的重组蛋白在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)活性多肽的末端尤其是C末端通过接头或者直接连接一段多肽区段P，该区段包含Sortase酶识别位点。
在一个实施方案中，可以首先通过化学合成法合成编码所述重组蛋白的核苷酸序列，随后将所述序列克隆到合适的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达。或者，还可以采用诱变法如PCR诱变法从野生型G-CSF(例如hG-CSF)获得其编码核苷酸序列、并且随后将所述序列以及构建融合蛋白的其他元件的序列克隆到合适的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达。这些技术完全在本领域普通技术人员的能力范围之内，并且在现有技术中有众多的教导。
合适的真核宿主细胞有哺乳动物细胞，例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2。所述细胞优选地生长于适合表达本发明G-CSF重组蛋白的条件下。至于用于生产或分离本发明的G-CSF重组蛋白的试剂和条件，则没有任何特别的限制，本领域已知的或商业上可得到的任何体系均可应用。
有多种表达载体可用于制备重组蛋白，其可选自真核和原核表达载体。原核表达载体可包括例如质粒如pRSET、pET和pBAD等，其中可采用的启动子有例如lac、trc、trp、recA或araBAD等。真核表达载体包括有：(i)用于在酵母中表达的载体如pAO,pPIC,pYES,pMET,其中可使用诸如AOX1,GAP,GAL1,AUG1等的启动子；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体如pMT,pAc[delta],plB,pMIB,pBAC等，其中可使用诸如PH,p10,MT,Ac5,OplE2,gp64,polh等的启动子；和(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体如pSVL,pCMV,pRc/RSV,pcDNA3,pBPV等，以及源自病毒体系的载体如痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等，其中可使用诸如CMV,SV40,EF-1,UbC,RSV,ADV,BPV和β肌动蛋白等的启动子。在一个优选的实施方案中，所述G-CSF重组蛋白在原核或真核细胞体系中进行表达，并且使用经过密码子优化的编码序列，优选的优化后的编码序列包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列，或者与SEQ ID NO：2所示的所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、98％、99％或更高的一致性。
术语“Sortase酶”，包括Sortase A、Sortase B，最早发现其具有将细菌的表面蛋白锚定在细胞壁上的作用。经鉴定发现，表面蛋白的“锚定信号(sorting signal)”由三个关键的部分组成——LPXTG序列、疏水序列和一个大多数情况下带正电荷的残基尾巴，其中LPXTG序列非常保守，能够被Sortase所识别。随后Sortase酶的半胱氨酸(Cys)作为亲核基团进行攻击，作用在底物(如表面蛋白)C末端基序LPXTG的苏氨酸和甘氨酸之间的肽键，使其裂开(酰化作用)，进而产生一个酰基酶中间物。随后把多肽共价联结到细胞壁或菌毛亚基上发挥功能(脱酰作用)。
在本发明的一个实施方案中，利用Sortase A进行聚合物(例如PEG)的定点偶联。在一个具体实施方案中，使用了Sortase A的核心识别位点LPETG、LPETGG、LPETGGG。在另一个具体实施方案中，还可以在识别位点后添加不同亲和标签如:LPETGGHHHHHH、LPETGGWSHPQFEK等。
本发明还提供了G-CSF的缀合物，其中所述聚合物缀合至G-CSF重组蛋白的末端，例如N末端或者C末端。本文所用的“聚合物”优选是生理可接受的，其包括在水溶液或悬液中可溶、并且以药学有效量施用该缀合物后对哺乳动物没有负面影响如副作用的聚合物。可在本发明中使用的聚合物没有特别的限制。所述聚合物通常优选具有2到约3000个重复单元。该聚合物基团可以选自天然或合成聚合物，其实例包括、但不限于例如多糖、聚亚烷基二醇，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧化乙烯(PEO)、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚乙烯醇等或者其任何组合。在一个优选实施方案中，本发明缀合物中使用一个或多个PEG基团进行缀合修饰。
在本发明中，所述聚合物并不限于特别的结构，其可以是线性的(如烷氧基PEG或双功能PEG)、分支或多臂的(如分叉PEG或连接到多元醇核心的PEG)、树枝状的或者可以具有可降解的连键。此外，聚合物的内部结构可以以任意数目的不同模式组织，其可选自均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、无规三聚物和嵌段三聚物等。所述聚合物还可包括聚(环氧烷)聚合物、聚马来酸、聚(D,L-丙氨酸)等。
在一些实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇(PEG)或其衍生物例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)。在本文中，如果没有特别指明，所述聚乙二醇(PEG)既包括末端基团为羟基也包括末端为其它基团的类型。所述其它基团包括但不限于烷氧基、环烷氧基、环烷基氧基、烯基、芳氧基或芳烷基氧基。这些PEG分子类型都是现有技术中已知的，并且在多肽修饰中常规使用。PEG侧链可以是线性的、分枝的、分叉的或者由多个臂组成，不同的聚乙二醇可以具有不同的聚合链长度和聚合结构。
本发明中对于所用PEG的分子量没有特别的限制，其分子量范围可以是0.1至200kDa，例如1至150kDa、2至100kDa、3至80kDa或4至50kDa，还可以是5至40kDa。另一些有用的PEG分子包括例如WO 03/040211、US 6,566,506、US 6,864,350和US 6,455,639中公开的那些。特别地，所述PEG具有通式HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中n的范围是约5至4000。如上所述，本发明的PEG包括带其它末端基团的PEG，例如甲氧基PEG、分支PEG、分叉PEG等。合适的分支PEG可按照美国专利No.5,932,462中所述进行制备，该专利的全部公开内容通过参考并入本文。所述分叉PEG是指在靠近聚合物链一端的地方具有分支的PEG，分叉PEG的主链可以是直链或支链的。
在一个具体实施方案中，在本发明的G-CSF重组蛋白缀合物中，所述一个或多个聚合物基团(如PEG)的分子量为>＝1、>＝10、>＝20、>＝30、>＝40、>＝50、>＝60、>＝70、>＝80、>＝90、>＝100、>＝110、>＝120、>＝130、>＝140、>＝150或>＝160kDa，例如是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kDa，或者以上任意二数值之间的值。需要指出的是，当描述一种缀合物中缀合聚合物基团的分子量时，如果该缀合物中有多个缀合聚合物基团，计算的是该缀合物中所有缀合聚合物基团的分子量总和，除非另外指明。
用于本发明中的聚合物是现有技术中已知的，其可通过多种途径得到，包括例如通过商业途径获得，或者根据本领域中已知的方法自行制备，例如EP1245608中所述的。本发明并不局限于通过任何具体方法制得的聚合物。
缀合反应之后，可以通过合适的方法将缀合物分离出来。适用的方法包括例如超滤法、透析法或色谱法等，这些均在本领域普通技术人员的能力范围之内。
实施例1 rhG-CSF-G3重组蛋白的表达
1.表达载体pET9a-rhG-CSF-G3的构建
C端带有Sortase A酶识别位点的人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF-G3)重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，经密码子优化后的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：2所示。由上海捷瑞生物工程有限公司对所述核酸编码序列进行全基因合成，连接至pGH载体中。用正向引物F(5’-ATCCTACATATGACCCCGTTAGGTCC-3’)(SEQ ID NO：4)和反向引物R(5’-ATCGGGATCC TCATTAACCG CCACCGGTTTCCGGTAATGC TGAGC-3’)(SEQ ID NO：5)扩增完整的rhG-CSF-G3基因，其中PCR反应条件如下：采用高保真DNA聚合酶
Figure BDA0002114321130000081
热启动2×预混液(NEB)，循环条件为98℃，预变性30秒；98℃10秒，55℃30秒，72℃30秒，共30个循环；72℃延伸2分钟。
将扩增产物与表达载体pET9a利用限制性内切酶NdeI/BamHI进行双酶切，37℃水浴酶切过夜。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，使用胶回收试剂盒(宝生物工程(大连))回收目的片段，其中表达载体pET9a回收4300bp左右的片段，扩增产物rhG-CSF-G3基因回收620bp左右的片段。按照目的片段：载体摩尔比3：1连接，在T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜。将连接产物转化感受态细胞Top10，经测序鉴定，所构建的表达载体命名为pET9a-rhG-CSF-G3。
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQPGGGGSGGGGSGGGGSALPETGGG(SEQ ID NO：1)
ATGACCCCGTTAGGTCCGGCCTCAAGCTTACCGCAGAGCTTTCTGCTGAAATGTTTAGAACAGGTTCGTAAAATTCAGGGTGATGGTGCCGCACTGCAGGAAAAACTGTGTGCAACCTATAAATTATGTCATCCGGAAGAATTAGTGTTACTGGGTCATAGTCTGGGTATTCCGTGGGCCCCGCTGAGTAGCTGTCCGAGCCAGGCATTACAGTTAGCAGGTTGTTTAAGTCAGTTACATAGTGGTTTATTTCTGTATCAGGGCTTATTACAGGCCTTAGAAGGTATTTCTCCGGAACTGGGTCCGACCCTGGATACCTTACAGTTAGATGTTGCCGATTTTGCCACCACCATTTGGCAGCAGATGGAAGAATTAGGCATGGCACCGGCCCTGCAGCCGACCCAGGGCGCAATGCCGGCATTTGCAAGCGCCTTTCAGCGTCGCGCAGGCGGCGTGTTAGTTGCCTCACATCTGCAGTCTTTTCTGGAAGTGTCATATCGCGTGCTGCGCCATCTGGCCCAGCCGGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGCGGTGGCTCTGGTGGTGGTGGCTCAGCATTACCGGAAACCGGTGGCGGT(SEQ IDNO：2)
2.rhG-CSF-G3蛋白的包涵体表达
采用42℃热激法将表达载体pET9a-rhG-CSF-G3转化感受态BL21(λDE3)，均匀涂布到含kana抗性的LB固体平板上，37℃倒置培养12-16小时。从平板上挑取6个单克隆，接种于含50μg/mL kana抗性的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12-16小时。
次日，将过夜活化的菌株按5％接种比例转接到LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养。OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG进行诱导表达。诱导条件为42℃，IPTG终浓度1mM，220rpm诱导表达3小时，按OD600*V＝2.0取样制备SDS-PAGE样品。
SDS-PAGE样品的制备：样品经离心后去除上清，沉淀加300μL BugBuster(EMDmillipore)+1μL溶菌酶+1μL核酸酶进行裂解，室温放置15-20分钟，至溶液清亮；12000rpm离心3-5分钟，弃上清；加400μL BugBuster混匀，12000rpm离心3-5分钟，弃上清；沉淀加150μlL ddH2O溶解，随后均匀分成两份，分别加25μL 5*N/R loading buffer，在恒温金属仪上99℃煮样10min，最终制备得到SDS-PAGE样品。
取5μL样品进行15％SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图1所示：rhG-CSF-G3理论分子量大小20.4kD，SDS-PAGE电泳显示在26kD-17kD之间有一条特异性条带，与rhG-CSF-G3理论分子量相符合。
实施例2制备rhG-CSF的PEG缀合物
rhG-CSF-G3重组蛋白的C端含LPETGGG，可被Sortase A特异性识别。Sortase A的作用下，T、G之间的酰胺键被切断，T与Sortase酶184位C的巯基反应形成硫酯键中间体，随后被一端带有聚Gly的GGGAA-PEG攻击，最终将PEG定点连接到重组蛋白的C端。
20KD PEG PEGlation反应体系：将20KD-GGGAA-PEG(即末端用GGGAA氨基酸残基修饰的20KD PEG)用缓冲液溶解并调节pH到7.5，然后将rhG-CSF-G3重组蛋白与20KD-GGGAA-PEG按照1:18的投料比加入到含有20mM Tris、150mM NaCl，pH 7.5的缓冲体系中，随后加入Sortase A酶和10mM CaCl2，1h后加入EDTA终止反应。通过RPC-HPLC检测缀合率。RPC-HPLC使用与Agilent Zorbax C18(4.6*250mm,5μm)规格的色谱柱，色谱条件：流动相A:0.1％TFAH2O；流动相B：0.1％TFA-ACN进行梯度洗脱，柱温50℃，流速0.6mL/min，进样温度4.0℃，进样量12μg。如图2A所示，缀合后的蛋白保留时间在31.956min，底物保留时间在33.567min。PEG化产物比例达到59％。随后所述PEG化产物经阳离子交换层析除去未反应的20KD-GGGAA-PEG、Sortase A酶及未缀合的底物，获得纯化的缀合物，命名为FRSW133DS-A，经SEC-HPLC检测，纯度为99.52％。
40kD PEG PEGlation反应体系：将40KD-GGGAA-PEG(即末端用GGGAA氨基酸残基修饰的40KD PEG)用缓冲液溶解并调节pH到7.5，然后将rhG-CSF-G3重组蛋白与40KD-GGGAA-PEG按照1:5的投料比加入到含有50mM Tris、150mM NaCl，pH 7.5的缓冲体系中，随后加入Sortase A酶和10mM CaCl2，30min后加入EDTA终止反应。通过RPC-HPLC检测缀合率。RPC-HPLC使用与Agilent Zorbax C18(4.6*250mm,5μm)规格的色谱柱，色谱条件：流动相A:0.1％TFA H2O；流动相B：0.1％TFA-ACN进行梯度洗脱，柱温50℃，流速0.6mL/min，进样温度4.0℃，进样量12μg。如图2B所示，缀合后的蛋白保留时间在30.3min，底物保留时间在33.3min。PEG化产物比例达到65％。随后所述PEG化产物经阳离子交换层析除去未反应的GGGAA-PEG、Sortase A酶及未缀合的底物，获得纯化的缀合物，命名为FRSW133DS-C，经SEC-HPLC检测，纯度为99.7％。
实施例3 rhG-CSF-G3重组蛋白及20kD PEG和40kD PEG缀合物的体外活性检测
本实施例检测了实施例2制备的缀合物的体外活性。利用小鼠NFS-60细胞(骨髄白血病细胞)对人粒细胞刺激因子(G-CSF)的依赖性，通过CCK-8法检测细胞在添加G-CSF条件下的增殖情况，以此反映G-CSF的生物学活性。
以中国食品药品检定研究院G-CSF活性标准品作标准，用缓冲液将其稀释至1800IU/mL，在96孔板中连续3倍倍比稀释，共9个稀释度得到标准曲线，作为标准品。取齐鲁制药有限公司
Figure BDA0002114321130000112
聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子注射液(1.35×108IU/mL)，连续倍比稀释至同活性作为活性对照品。取实施例1制备的rhG-CSF重组蛋白及实施例2制备的rhG-CSF-G3重组蛋白20kD PEG和40kD PEG缀合物分别按参考效价连续倍比稀释至同活性。此外还设置空白对照。
将NFS-60细胞用含有重组人粒细胞刺激因子的RPMI 1640培养液培养，取适量细胞洗涤后重悬，在分别加有标准品、活性对照品、rhG-CSF-G3重组蛋白、FRSW133DS-A(rhG-CSF-G3重组蛋白的20kD PEG缀合物)、FRSW133DS-C(rhG-CSF-G3重组蛋白的40kD PEG缀合物)、空白对照的96孔板中，每孔加入50μL细胞悬液，培养40至48小时。每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养4h。以630nm为参比波长，用酶标仪测定样品450nm的吸光度值。以样品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，选择4-Parameter绘制曲线绘制剂量反应曲线，按以下公式计算rhG-CSF及其PEG缀合物的生物学活性。
Figure BDA0002114321130000111
式中：Pr为标准品生物学活性，IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。
根据rhG-CSF及其PEG缀合物的生物学活性可计算PEG定点连接的比活回收率，定义公式如下:
Figure BDA0002114321130000121
表1 rhG-CSF重组蛋白及其PEG缀合物的体外活性
Figure BDA0002114321130000122
结果显示：rhG-CSF-G3重组蛋白测得比活为8.17×107IU/mg，高于
Figure BDA0002114321130000123
重组人粒细胞刺激因子注射液标示比活6.00×107IU/mg；FRSW133DS-A测得比活为3.36×107IU/mg，低于
Figure BDA0002114321130000124
聚乙二醇化组人粒细胞刺激因子注射液标示比活4.50×107IU/mg，与新瑞白的实测比活3.41×107IU/mg接近；而缀合了40kD PEG的FRSW133DS-C测得比活为5.06×107IU/mg，高于
Figure BDA0002114321130000125
标示比活，并且比新瑞白的实测比活高出了48％，而且发明人意外的发现，通常而言偶联的PEG分子量越大，在延长半衰期的同时会降低蛋白或多肽的活性，然而实施例2的方法制备的rhG-CSF 40kD PEG的缀合物，在体外活性(5.06×107IU/mgvs 3.36×107IU/mg)和制备比活回收率(62％vs 41％)方面明显高于20kD PEG的缀合物。
实施例4 rhG-CSF-PEG缀合物具有优异的体内升白效果
本实施例首先利用环磷酰胺诱导得到白细胞降低的SD大鼠模型，随后向SD大鼠模型皮下注射给予实施例2制备的rhG-CSF-PEG缀合物：FRSW133DS-A(20kD PEG)和FRSW133DS-C(40kD PEG)、瑞白(重组人粒细胞刺激因子注射液)、新瑞白(聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子注射液)，比较实施例2制备的与上述上市药物在体内对抑制白细胞降低的效果。
表2本实施例使用的试剂
Figure BDA0002114321130000131
环磷酰胺造模：动物选择为SPF级SD大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，雌雄各半；利用30mg/kg的环磷酰胺，通过腹腔注射的方式每天1次，连续5天进行给药。造模期第1～5天给药前及造模第6天每天对所有大鼠进行血液学检查，每天血样采集时间在大致相同的时间段。给药前，各造模组大鼠NEU均值与正常对照组有统计学差异，且各组大鼠造模期第2～6天及进入试验时NEU相对均一(CV<30％)，表明造模成功。
体内活性检测：设置正常对照组、模型组、RB组(20μg/kg瑞白)、XRB低剂量组(120μg/kg新瑞白)、XRB高剂量组(250μg/kg新瑞白)、FRSW133DS-A和FRSW133DS-C缀合物分别设置低、中、高剂量组(剂量分别为120、250、750μg/kg)共11组，每组12只健康SD大鼠，雌雄各半，实验前预先至少适应环境5天。其中，正常对照组随机选取未造模且中性粒细胞计数(NEU)及体重相对均一的12只大鼠(雌雄各半)，其余各组选取造模期结束NEU及体重相对均一的大鼠(雌雄各半)，根据NEU分性别随机区组。正常对照组及模型组皮下注射给予等体积的溶媒(稀释Buffer)。其余给药组通过颈背部皮下注射的方式给予相应的药物，其中RB组为每天给药1次，连续给药14天；其余给药组中，给药期第1、8天各给药一次；
分组及给药方式和剂量如表3所示：
表3
Figure BDA0002114321130000141
在给药期第1～14天每天给药前及给药期第15天各采集血样进行一次血液学检测(白细胞计数WBC和中性粒细胞计数NEU)。
图3和图4分别显示了各组中白细胞计数和中性粒细胞计数随着用药时间的变化情况。RB、XRB、FRSW133DS-A、FRSW133DS-C各剂量组均可不同程度改善环磷酰胺诱导的大鼠白细胞及中性粒细胞降低，使WBC及NEU的恢复时间提前。其中，同剂量下，缀合了40KD PEG的FRSW133DS-C升高WBC及NEU的幅度最高，其次为缀合了20KD PEG的FRSW133DS-A，均明显高于上市药物新瑞白，这说明实施例2制备的缀合物在体内提高白细胞和中性粒细胞数量方面相比新瑞白具有更好的技术效果。此外，各剂量FRSW133DS-A、FRSW133DS-C升高WBC及NEU的作用具有剂量效应关系，这表明了上述效果确实是由药物本身而非其它不确定因素所带来的。
实施例5 rhG-CSF-PEG缀合物具有良好的体内长效性
本实施例中32只SD大鼠分成4组，RB组、XRB组、FRSW133DS-A组和FRSW133DS-C组，每组8只(雌雄各半)，剂量均为250μg/kg，单次皮下注射给药。RB组于给药前及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、48小时，XRB、FRSW133DS-A及FRSW133DS-C组于给药前及给药后0.5、1、3、6、12、24、36、48、72、96、120、144、168、192、240、288、336小时采集药代样本。采样后，用ELISA法测定血清中的药物浓度。其中具体给药情况如表5所示：
表5剂量设计表
Figure BDA0002114321130000151
采用Phoenix WinNonlin 6.4非房室模型计算药代动力学参数达峰时间(Tmax)、峰浓度(Cmax)、药时曲线下面积(AUClast、AUC0-∞)、表观分布容积(Vz)、清除率(Cl)、平均滞留时间(MRTlast)、末端消除半衰期(t1/2)。
图5显示了SD大鼠单次皮下注射相同剂量(250μg/kg)不同给药制剂后平均血药浓度-时间曲线图。药代动力学数据如表6所示：
表6
Figure BDA0002114321130000152
Figure BDA0002114321130000161
如图5和表6所示，XRB、FRSW133DS-A、FRSW133DS-C的半衰期(T1/2)，生物利用度(AUC)和平均滞留时间(MRTlast)都高于RB。其中，缀合了40KD PEG的FRSW133DS-C组的半衰期，生物利用度和平均滞留时间都高于XRB和缀合了20KD PEG的FRSW133DS-A。FRSW133DS-A的半衰期低于XRB，但是生物利用度和平均滞留时间与XRB相当。本发明构建的缀合PEG的CSF蛋白具有改善的优良特性，特别是缀合40KD PEG的CSF蛋白具有最佳的体内稳定性，具有良好的应用前景。
<110> 北京京晟斯生物科技中心（有限合伙）
<120> 一种粒细胞集落刺激因子重组蛋白、缀合物及其应用
<130> MP1904938
<160> 5
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu
180 185 190
Pro Glu Thr Gly Gly Gly
195
<210> 2
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaccccgt taggtccggc ctcaagctta ccgcagagct ttctgctgaa atgtttagaa 60
caggttcgta aaattcaggg tgatggtgcc gcactgcagg aaaaactgtg tgcaacctat 120
aaattatgtc atccggaaga attagtgtta ctgggtcata gtctgggtat tccgtgggcc 180
ccgctgagta gctgtccgag ccaggcatta cagttagcag gttgtttaag tcagttacat 240
agtggtttat ttctgtatca gggcttatta caggccttag aaggtatttc tccggaactg 300
ggtccgaccc tggatacctt acagttagat gttgccgatt ttgccaccac catttggcag 360
cagatggaag aattaggcat ggcaccggcc ctgcagccga cccagggcgc aatgccggca 420
tttgcaagcg cctttcagcg tcgcgcaggc ggcgtgttag ttgcctcaca tctgcagtct 480
tttctggaag tgtcatatcg cgtgctgcgc catctggccc agccgggcgg tggcggtagc 540
ggcggcggtg gctctggtgg tggtggctca gcattaccgg aaaccggtgg cggt 594
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcctacata tgaccccgtt aggtcc 26
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atcgggatcc tcattaaccg ccaccggttt ccggtaatgc tgagc 45

Claims (17)

1.一种粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重组蛋白，其包括粒细胞集落刺激因子活性多肽以及包含Sortase酶识别位点的多肽区段P，所述活性多肽与所述多肽区段P直接连接或者通过接头L连接，所述多肽区段P优选连接于所述活性多肽的C端或者N端，更优选C端；所述Sortase酶例如是Sortase A或Sortase B；优选的，所述多肽区段P包含Sortase A的核心识别位点LPXTG，其中X是任意氨基酸，例如LPETG、LPETGG或LPETGGG；还优选的，所述多肽区段P还包含与Sortase酶识别位点连接的亲和标签，例如，所述多肽区段P选自LPETGGHHHHHH和LPETGGWSHPQFEK。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其中所述粒细胞集落刺激因子活性多肽源自人；优选地，所述粒细胞集落刺激因子活性多肽可包含1个或更多个氨基酸突变，条件是仍保留其活性；例如所述粒细胞集落刺激因子活性多肽包含SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的第1位至第175位所示的所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或更高的一致性。
3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述接头L为包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的肽段；优选地，所述接头L为包含甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、丙氨酸(Ala，A)和/或苏氨酸(Thr，T)的柔性肽段，例如，(GS)w(GGS)x(GGGS)y(GGGGS)z，其中w、x、y和z分别选自0至50的整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，还优选地，w、x、y和z不同时为0；
更优选地，所述接头L的序列为：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组蛋白，其包含如SEQ ID NO：1所示的序列，或者由如SEQ ID NO：2所示的核酸分子编码。
5.一种缀合物，其中亲水聚合物分子连接至权利要求1至4中任一项所述重组蛋白的末端，所述末端例如N末端或者C末端，优选地经转肽反应连接至所述Sortase酶识别位点。
6.根据权利要求5的缀合物，其中所述亲水聚合物分子选自多糖和聚亚烷基二醇，如聚丙二醇和聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇可以是末端封端的，例如经烷氧基如甲氧基封端的；和/或所述聚亚烷基二醇是直链的或支链的；所述聚亚烷基二醇的分子量可以是>＝1、>＝10、>＝20、>＝30、>＝40、>＝50、>＝60、>＝70、>＝80、>＝90、>＝100、>＝110、>＝120、>＝130、>＝140、>＝150或>＝160kDa，例如是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kDa，或者以上任意二数值之间的值；优选地所述亲水性聚合物分子的分子量是40kD。
7.一种制备权利要求5或6所述缀合物的方法，其中包括使权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白与Sortase酶(如Sortase A或Sortase B)和亲水聚合物分子接触，其中所述亲水聚合物分子一端带有可被Sortase酶酰胺化的氨基，优选地，所述亲水聚合物分子的一端带有聚Gly，例如GGGAA。
8.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白和/或权利要求5或6所述的缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8的药物组合物，其用于在有需要的患者中提高白细胞计数；优选的，所述患者患有或者有风险罹患嗜中性粒细胞水平不足，例如所述患者患有或者有风险罹患中性粒细胞减少症。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其为液体制剂形式或冻干制剂形式。
11.权利要求1至4中任一项的重组蛋白、权利要求5或6所述的缀合物或权利要求8至10中任一项所述的药物组合物在制备用于在有需要的患者中提高白细胞计数的药物中的用途，优选的，所述患者患有或者有风险罹患嗜中性粒细胞水平不足，例如所述患者患有或者有风险罹患中性粒细胞减少症。
12.一种在有需要的患者中提高白细胞计数的方法，其包括向所述患者施用权利要求1至4中任一项的融合蛋白、权利要求5或6所述的缀合物或权利要求8至10中任一项的药物组合物，优选的，所述患者患有或者有风险罹患嗜中性粒细胞水平不足，例如所述患者患有或者有风险罹患中性粒细胞减少症。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者处于接受能够降低患者白细胞计数的药物治疗之前、之中或者之后。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述药物治疗为放疗或化疗。
15.一种试剂盒，其包含权利要求1至4中任一项的重组蛋白、权利要求5或6所述的缀合物或权利要求8至10中任一项的药物组合物，以及任选包含的使用说明书。
16.编码权利要求1至4中任一项重组蛋白的核酸序列。
17.包含权利要求16所述核酸序列的表达载体。
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