JPH10513440A

JPH10513440A - 化学的に修飾したインターフェロン

Info

Publication number: JPH10513440A
Application number: JP8521789A
Authority: JP
Inventors: コリンズ，デイビツド; リウ，ジエニフアー・リン−チユン
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1998-12-22
Also published as: KR19980701814A; WO1996021468A3; IL116730A0; CA2209557A1; EP0804248A2; BR9607599A; WO1996021468A2; MX9705119A; AU4751896A; ZA96206B

Abstract

(57)【要約】本発明は、コンセンサスインターフェロンに結合した１個以上のグリコシルリガンドを有する化学的に修飾したコンセンサスインターフェロンに関する。このような類似体を含有する医薬組成物および本発明の組成物を用いた治療法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】化学的に修飾したインターフェロン本発明は、概ねコンセンサスインターフェロンの修飾、更に詳しくは、グリコシルリガンドが組換えコンセンサスインターフェロンに結合している組換えコンセンサスインターフェロンのネオグリコシル化類似体組成物に関する。発明の背景インターフェロンは、抗ウィルスおよび抗増殖活性の両方を示すサイトカイン類のサブクラスである。生化学的および免疫学的性質に基づいて、ヒトのインターフェロンは、３つの系：インターフェロン−アルファ（白血球）、インターフェロン−ベータ（線維芽細胞）およびインターフェロン−ガンマ（免疫）に分類される。異なるアミノ酸配列を有する少なくとも１４種のアルファインターフェロン（ＡからＨまでのサブタイプに分類される）が、単離されこれらのポリペプチドをコードするＤＮＡの配列を決定することにより同定されてきた。アルファインターフェロンは、その抗ウィルスおよび抗腫瘍成長阻害のため可能性のある治療薬としてかなりの注目を集めている。アルファ−インターフェロンは、現在、ヘアリー細胞白血病、性病いぼ、カポジー肉腫（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患している患者が概して苦しむ癌）、および慢性のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染の治療に合衆国および他の国々で承認されている。アルファインターフェロンの２つの亜種が治療販されるインターフェロンアルファ−２ａ、およびＩＮＴＲＯ表示された適応症に加え、アルファ−インターフェロンは、慢性骨髄性白血病、骨髄種、表在性膀胱癌、皮膚癌（基底細胞癌および悪性黒色腫）、腎癌、卵巣癌、軽度リンパ球性および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ならびに神経膠腫を含む種々の他の細胞増殖疾患に単独でまたは化学療法薬と組合せて用いられ又は評価されている。アルファ−インターフェロンは、肺、結腸直腸および乳癌から生じる固形腫瘍の治療に他の化学療法薬と組み合わせて効果的かもしれない(Rosenberg等， “Principles and Applications of Biologic Therapy”in Cancer：Principles and Practices of Oncology，3rd ed.，Devita 等，eds．pp．301-547(1989)， Balmer DICP，Ann Pharmacother24，761-768(1990)参照)。アルファ−インターフェロンは、正常および異常な細胞の両方におけるＤＮＡ複製ならびにＲＮＡおよび蛋白質合成を含む種々の細胞の機能に影響することが知られている。従って、インターフェロンの細胞毒作用は、腫瘍またはウィルス感染細胞に限定されるわけではなく、正常な健康な細胞においても同様に生じる。結果として、特に高用量を必要とする場合、インターフェロン療法中に望ましくない副作用が起きる。インターフェロンの投与は、赤血球、白血球および血小板水準の減少をもたらす骨髄機能抑制を引きおこすかもしれない。より高用量のインターフェロンは、一般に、カゼ様症状（例えば、発熱、疲労、頭痛および寒気）、胃腸疾患（例えば、食欲不振、悪心および下痢）、目眩および咳を起こすもとになる。天然のヒトのインターフェロン−ベータは、２２−２３ｋＤａの見掛けの分子量および２−５×１０⁸国際単位（ＩＵ）／ｍｇ蛋白質の抗ウィルス比活性を有する糖蛋白質である。ヒトのＩＦＮ−βは、神経膠腫、黒色腫、ウィルス性皮膚向性疾患および肝炎の治療に臨床的に供されてきた；Interferon，Principles a nd Medical Applications，第１版(1992，Univ．of Texas Medical Branch of G alveston)page 107-116参照。米国特許第４，６９５，６２３および４，８９７，４７１は、天然に存在するアルファインターフェロンのサブタイプポリペプチドの中のそれぞれの位置で発見された共通の又は支配的アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する新規なインターフェロンポリペプチドを開示しており、これらは、コンセンサスインターフェロン（ＩＦＮ−ｃｏｎ）と呼ばれる。開示された特定のＩＦＮ−ｃｏｎアミノ酸配列は、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁、ＩＦＮ−ｃｏｎ₂、およびＩＦＮ−ｃｏｎ₃と呼ばれる。ＩＦＮ−ｃｏｎをコードする作成した遺伝子の調製およびこの遺伝子の大腸菌中での発現も開示されている。大腸菌中で産生したＩＦＮ−ｃｏｎ₁の精製は、Klein 等(J．Chromatog．454 ，205-215(1988))に述べられている。この方法で精製したＩＦＮ−ｃｏｎ₁は、Ｔ９８Ｇヒト細胞系を用い細胞変性効果阻害分析で測定した場合、３×１０⁹単位／ｍｇ蛋白質の比活性を有することが報告されている（Fish 等，J．Interfer on Res．9，97-114(1989)）。米国特許第５，３７２，８０８は、コンセンサスインターフェロンを用いた疾患の治療法を開示している。これは、アルファインターフェロンによる治療に影響を受けやすい疾患の治療に用いる場合、ＩＦＮ−ｃｏｎが、患者にアルファインターフェロンと同程度の副作用は引き起こさないことを示している。更に、望ましくない副作用の頻度または重篤度における実質的に対応する増加なしに、３から５倍のより高用量のＩＦＮ−ｃｏｎを用いることができ、治療上の増強された利益をもたらすことが示された。有害な副作用が減少した状態で最大の治療効果を達成するインターフェロンの投薬形態が、はっきりしないままであることから、治療用途のためのインターフェロンの改善された形態を開発する必要性がある。インターフェロン治療と関係がある望ましくない副作用無しに高用量を可能にするインターフェロン形態の開発は、大きな利益となるであろう。従って、インターフェロン治療に影響を受けやすい症状の治療用途のためのインターフェロンへのガラクトース残基の結合物から成るインターフェロンの改善された形態を提供することが本発明の目的である。インターフェロンの肝臓への選択的送達を可能にし、それにより肝細胞表面受容体へのインターフェロン結合の機会が増加し、慢性ＨＣＶのような疾患状態の抗ウィルス治療中に、他の器官へのインターフェロンの望ましくない結合を減少させる組成物を提供することが、本発明の更なる目的である。発明の概要本発明は、組換えコンセンサスインターフェロンのネオグリコシル化類似体を包含する。本発明は、複数の乳糖リガンドが、ＩＦＮ−ｃｏｎに結合してＩＦＮ −ｃｏｎのネオグリコシル化型（ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎ）を与えることができるという発見に基づく。好ましくは、乳糖リガンドは、リシンのε−ＮＨ₂およびＩＦＮ−ｃｏｎのＮ−末端アミンを介して結合する。非修飾コンセンサスインターフェロンと比較した場合、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎは、肝臓に高度に指向する。好ましくは、ＩＦＮ−ｃｏｎは、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁、ＩＦＮ−ｃｏｎ₂、またはＩＦＮ−ｃｏｎ₃のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、結合物は、ＩＦＮ−ｃｏｎ分子１個につき１から１０個のグリコシル残基を有する。最も好ましくは、ＩＦＮ−ｃｏｎは、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁のアミノ酸配列を有し、ネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎは、それぞれのＩＦＮ−ｃｏｎ分子につき４から７個の乳糖残基を有する。また、本発明は、適切な希釈剤、アジュバント、担体、保存料および／または可溶化剤と共に、治療的に効果的な量のｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを含んで成る医薬組成物に関する。これらの組成物は、ＩＦＮ−ｃｏｎを用いる現在影響を受けやすい症状の治療に治療上の利益をもたらすることができる。また、本発明は、化学的に修飾したインターフェロンが少なくとも１個のグリコシルリガンドに結合したインターフェロンから成り、このリガンドが末端ガラクトースから成り、このインターフェロンがＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−ｃｏｎから成る群から選ばれ、治療上効果的な量の化学的に修飾したインターフェロンを患者に投与することから成る、インターフェロンを患者の肝臓に直接送達する方法も包含する。図面の詳細な説明図１は、還元アミノ化によるＩＦＮ−ｃｏｎおよび乳糖からのｌａｃＩＦＮ− ｃｏｎの調製を示す図式である。図２は、示した時間間隔におけるハムスターの肝臓に蓄積される注入した放射線標識したＩＦＮ−ｃｏｎ（−□−）およびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎ（−○−）のパーセンテージの図式的表現である。棒は、標準偏差（ｎ＝３）を表す。図３は、ラットにおける放射線標識したＩＦＮ−ｃｏｎの生体分布の図式的表現である。注入量％を、示した時間間隔で測定した。図４は、ラットにおける放射線標識したｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの生体分布の図式的表現である。注入量％を、示した時間間隔で測定した。図５は、静脈投与（３００μｇ／ｋｇ）後のＩＦＮ−ｃｏｎ（−□−）およびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎ（−○−）のハムスター血清薬物動態の図式的表現である。血清インターフェロン濃度を対時間でプロットした。棒は、標準偏差（ｎ＝３）を表す。図６は、種々の時点における、ＩＦＮ−ｃｏｎ（−□−）、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎ（−○−）、および燐酸緩衝液賦形剤群（−△−）の静脈投与後のハムスター血清で測定した２−５Ａシンテターゼ活性の図式的表現である。棒は、標準偏差（ｎ＝３）を表す。図７は、未処置のＥＭＣＶ−感染ハムスター（−○−）、ＩＦＮ−ｃｏｎを予め注射したＥＭＣＶ−感染ハムスター（−□−）、またはｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎで予め処置したＥＭＣＶ−感染ハムスター（−◇−）の生存率の図式表現である。動物は、毎日２回２７日間検査した。発明の詳細な説明本明細書で用いられるように、コンセンサスヒト白血球インターフェロン（ＩＦＮ−ｃｏｎ）とは、全ての天然に存在するヒト白血球インターフェロンサブタイプ配列に共通するアミノ酸残基を優先的に含み、全てのサブタイプに共通するアミノ酸が存在しない１つ以上の位置に、この位置に優先的に存在するアミノ酸を含み、少なくとも１種の天然に存在するサブタイプのこの位置に現存しないアミノ酸残基を決して含まない、天然には存在しないポリペプチドを意味する。ＩＦＮ−ｃｏｎは、同じ所有者の米国特許４，６９５，６２３および４，８９７，４７１（参照によりこのすべての開示を本明細書に含めるものとする）に開示されているＩＦＮ−ｃｏｎ₁、ＩＦＮ−ｃｏｎ₂およびＩＦＮ−ｃｏｎ₃と呼ばれるアミノ酸配列を包含するが、これらに限定される訳ではない。ＩＦＮ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列は、上記の特許に述べられているように、又は他の標準法により、合成することができる。ＩＦＮ−ｃｏｎポリペプチドは、好ましくは、細菌宿主、特に大腸菌中に形質転換又は形質導入した、作成したＤＮＡ配列の発現の産物である。即ち、ＩＦＮ −ｃｏｎは、好ましくは、組換えＩＦＮ−ｃｏｎである。組換えＩＦＮ−ｃｏｎは、好ましくは、大腸菌内で産生され、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁についてKlein等，supra(1988)に一般的に述べられているような、当業者等に公知の手法により精製される。精製したＩＦＮ−ｃｏｎは、イソフォームの混合物から成ることができる、例えば、精製したＩＦＮ −ｃｏｎ₁は、メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ₁、デス−メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ₁ およびＮ−末端ブロックを有するデス−メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ₁の混合物（K lein等，supra(1990)）から成ることができる。あるいは、ＩＦＮ−ｃｏｎは、特定の単離したイソフォームから成ることができる。ＩＦＮ−ｃｏｎのイソフォームは、当業者等に公知の等電点電気泳動のような技術により互いから分離される。本発明の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎは、蛋白質１個当たり少なくとも１個の末端ガラクトースを含むグリコシルリガンドから成る。このようなグリコシルリガンドは、ガラクトース、末端グリコシルオリゴサッカライド、アシアログリコペプチド、およびアシアログリコプロテインから成る群から選ばれる。グリコシルリガンドがモノサッカライドである場合、通常ガラクトースである。本発明のオリゴサッカライドは、通常、どの場合も、ガラクトース残基がオリゴサッカライドの末端に結合する少なくとも２つの糖部分を有するものである。ＩＦＮ−ｃｏｎへの結合に有用な代表的オリゴサッカライドは、乳糖、Ｎ−アセチルラクトサミンおよびガラクタンである。好ましくは、ネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎ類似体は、４つから７つのリガンドを含有し、グリコシルリガンドは、オリゴサッカライドである。最も好ましくは、ネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎ類似体は、４つから７つのリガンドを含有し、グリコシルリガンドは、乳糖である。複数のリガンドは、好ましくは同一であるが、リガンドの混合物も本発明に包含される。本発明のネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎ類似体は、多数の従来法により得ることができる。このような方法は、非常に良くまとめられている；Kataoka and Tavassoli，Jour．of Histochem．and Cytochemistry，32: 1091-1098(1984); C hipowsky and Lee，Carbohy．Reseapch，31: 339-346(1973)及びその中で言及されている参考文献参照。好ましくは、ネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎ類似体は、リシン、システイン、セリン、トレオニンまたはアスパラギンのような活性なアミノ酸残基を介して蛋白質の骨格に複数のグリコシルリガンドを結合させることより成る方法により得る。最も好ましくは、ネオグリコシル化ＩＦＮ −ｃｏｎ類似体は、リシンのε−ＮＨ₂および／またはＩＦＮ−ｃｏｎのＮ−末端アミンを介して複数のグリコシルリガンドを結合させることより成る方法により得る。この化学的修飾は、特定の反応条件下、好ましくは非変性条件下、アミノ基を還元アミノ化に利用できるような十分な量で、グリコシルリガンドとＩＦＮ−ｃｏｎとを反応させることにより達成される。好ましい態様において、グリコシルリガンドは、乳糖であり、反応は、ｐＨ７．０で行い、大過剰モル量の還元剤、例えば水素化シアノ硼素ナトリウムの添加を必要とし、得られる類似体が蛋白質１個当たり４個から７個の乳糖リガンドを含有するように調節する。このような反応を調節するのに用いる方法は、当業者等により容易に決定される。本発明の方法は、実質的に均質な修飾ＩＦＮ−ｃｏｎ調製物を提供することから、本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤、保存料、可溶化剤、アジュバントおよび／または乳化剤との混合物中の治療上効果的な量のｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを含んで成る医薬組成物も包含する；参照により本明細書に含めるものとするRemington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)page 1435-1712参照。本明細書で用いた“実質的に均質な”とは、観察される唯一のネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎ類似体が、蛋白質１個当たりに結合している４個から７個のリガンドを有するものであるという意味である。調製物は、未反応の（即ち、グリコシルリガンドがない）蛋白質を含有していてもよい。好ましくは、化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎは、少なくとも９０％一生成物（下記の実験例のように）であり、最も好ましくは、化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎは、≧９８％一生成物である。本発明により予想される化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎは、実施例１で述べるような生物学的分析で活性であるそれらの類似体である。これらの類似体は、非修飾ＩＦＮ−ｃｏｎのそれと比較して少なくとも５０％の活性を有する。好ましくは、類似体は、少なくとも６０％の活性を有する。当業者等は、このような類似体を容易に評価することができ、このような分析で活性を示すかどうか測定することができる。通常、本発明の組成物は、ＩＦＮ−ｃｏｎのために前述したのと同じ方法で用いることができ、本組成物は、コンセンサスインターフェロンで治療可能な症状を治療するために用いることができると考えられる。例示的症状としては、これらに限定されるわけではないが、細胞増殖疾患およびウィルス感染が挙げられる。ＩＦＮ−ｃｏｎにより治療可能なウィルス性症状としては、これらに限定されるわけではないが、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、他の非Ａ型非Ｂ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヘルペスウィルス（ＥＢ、ＣＭＬ、単純ヘルペス）、乳頭腫、ポックスウィルス、ピコルナウィルス、アデノウィルス、ライノウィルス、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、およびヒトロタウィルスが挙げられる。また、ＩＦＮ−ｃｏｎは、癌としばしば関係がある細胞増殖疾患を治療するのにも効果的である。このような疾患としては、これらに限定されるわけではないが、ヘアリー細胞白血病およびカポジー肉腫が挙げられる。好ましくは、治療する症状は、肝疾患である。ＩＦＮ−ｃｏｎは、単独で、または、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン− ６（ＩＬ −６）、エリスロポイエチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ならびに巨核球成長および生育因子（ＭＧＤＦ）のような骨髄細胞の増殖または分化を刺激する１つ以上の因子と組み合わせて用いることができる。化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎを用いた治療は、本発明により、アルファインターフェロンを用いた治療と比較した場合、実質的に副作用が減少した又は除去された改善された効果が提供されると予想される。副作用の減少または除去は、治療する症状と無関係に示されることが予期される。更に詳しくは、末端ガラクトース残基を含有するリガンドで修飾したＩＦＮ−ｃｏｎは、肝細胞表面のアシアログリコプロテイン結合受容体に選択的に結合することから、更に、修飾したＩＦＮ−ｃｏｎは、ＨＣＶのような肝疾患の治療に特に有用であることが考えられる。本発明の化学的に修飾したインターフェロンは、肝臓に指向することから、本発明は、治療上効果的な量の本発明の化学的に修飾したインターフェロンを患者に投与することより成る、インターフェロンを患者の肝臓に直接送達する方法も考えられる。このような方法に用いられると考えられるインターフェロンとしては、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−ｃｏｎが挙げられる。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、詳述した実施例の中でＩＦＮ−ｃｏｎのために述べたものと同様の方法でグリコシルリガンドによる化学的修飾を可能にするリシン残基を含有する。特定の疾患の治療に効果的である化学的に修飾したインターフェロンの量は、疾患の性質および他の因子に依存し、標準臨床技法により決定することができるか又は、インターフェロンのために既に確立された用量もしくは投与計画に基づくことができる。以下の実施例は、本発明の種々の態様を更に詳細に具体的に説明する。実施例１この実施例は、化学的に修飾したヒト組換えコンセンサスインターフェロンを示す。更に詳しくは、この実施例は、ネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎ₁の均質な製剤を調製する方法、および製剤の性質を示している。Ａ．コンセンサスインターフェロンの調製参照によりその全体を本明細書に含めるものとする米国特許第４，６９５，６２３の図２に記述されているようなＩＦＮ−ｃｏｎ₁を、ネオグリコシル化ヒト組換えコンセンサスインターフェロンの調製に用いた。ＩＦＮ −ｃｏｎ₁は、細菌中での外因性ＤＮＡの発現により生産され、Ｎ−末端にメチオニル残基を含有していた。Ｂ．ＬａｃＩＦＮ−ｃｏｎの調製ＬａｃＩＦＮ−ｃｏｎを、図１に示したようにリシンのε−ＮＨ₂およびＩＦＮ−ｃｏｎのＮ−末端アミンを介して複数の乳糖リガンドを結合することにより調製した。一般に、結合反応は以下の通りに説明することができる：β−Ｄ−ラクトース（Sigma，St．Louis，MO）を、種々の乳糖：ＩＦＮ−ｃｏｎモル比で、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁を含有する燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。反応物を室温で種々の長さの時間攪拌し、水素化シアノ硼素ナトリウム(ＮａＢＨ₃ＣＮ )(Sigma，St．Louis，MO)を、１日に２回、反応混合物に加えた。反応の進行を、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。この混合物をSephadex Ｇ−２５カラム（Sigma，St．Louis，MO）を通過させＰＢＳで溶出して末反応の乳糖およびＮａＢＨ₃ＣＮを除去することにより、反応を停止させた。この蛋白質を、１．２ｍｌ／分の流速でＰＢＳで溶出し２８０ｎｍでの吸収を測定するPharmacia HiLoad Superdex 75pg 26/60カラム(Piscataway，NJ)を用いたＦＰＬＣにより更に精製した。２ｍｌずつの画分を集め、蛋白質画分をプールした。精製したｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎ調製物を、０．５ｍｌ／分でＰＢＳで溶出するPharmacia Superose 12 H/R 10/30カラム(Piscataway，NJ)またはPhenomene x BioSep SEC-2000カラム(Torrance，CA)を用いたケル濾過ＨＰＬＣにより分析した。これらの誘導化蛋白質を、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Novex，San Die go，CA）およびｐＨ３−１０の等電点電気泳動ゲル（Novex，San Diego，CA）および質量分光法を用いて性質を調べた。反応ｐＨ、反応時間および試薬濃度のような種々の因子を調査することにより、反応条件を最適化した。ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、および７．０のＰＢＳ中で室温で３日間反応を行うことによりｐＨの影響を調査した。反応の進行を、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。誘導化の程度は、アミノ基が、より少なくプロトン化しアルドース型の乳糖への求核攻撃により利用可能であるようなより高いｐＨでより大きかった。ゲル濾過ＨＰＬＣから得た結果に基づき、ＩＦＮ−ｃｏｎのｐＩが５．７であることから、ｐＨ５．５で行ったものを除いて全ての反応条件で、誘導化蛋白質の１０％以上は、二量体またはアグリゲートではなかった。反応物に加えた還元剤の量が反応の進行および蛋白質変性の程度に直接影響することが分かった。蛋白質の安定性を維持するために反応物への添加直前に、水素化シアノ硼素ナトリウムを１０Ｍ溶液になるように水に溶解した。反応の進行を容易にするために反応中に１日２回、２０，０００モルもの大過剰の還元剤を加えたが、その間この処理下で検出された凝集は最小量であった。Ｃ．ＬａｃＩＦＮ−ｃｏｎの性質分析誘導化蛋白質のグリコシル化の程度およびインビトロの生物活性を調査した。この分析に用いるｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを以下の通りに調製した：１グラムのβ −Ｄ−ラクトースを、１２．５ｍｇのＩＦＮ−ｃｏｎ₁を含有する５ｍｌのＰＢＳに溶解した。反応液を室温で４日間攪拌し、５０ｍｇの水素化シアノ硼素ナトリウム（ＮａＢＨ₃ＣＮ）を、１日に２回反応混合物に加えた。乳糖で修飾したＩＦＮ−ｃｏｎの分子量を、Kratos Kompact MALDI-TOF質量分析計を用いた質量分析により測定した。類似体の分子量から１９，５１６を引き、次いでこの数を３２６（乳糖−酸素）で割ることによりＩＦＮ−ｃｏｎに結合している乳糖の数を算定した。培養した細胞系におけるウィルス複製の阻害を測定することによりインビトロ生物活性を測定した。ＨｅＬａ細胞を、９６ウェルのプレート中に１５，０００細胞／ウェルでプレートにまき、１０％ＦＢＳを含有する基礎培地（１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１重量％の非必須アミノ酸、０．１重量％の硫酸ゲンタマイシンおよび１％ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ））中で、５％の二酸化炭素下、３７℃で２４時間インキュベートした。ＩＦＮ− ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを、基礎培地および０．２％ＦＢＳでの多重希釈で調製した。１００マイクロリットルの各標準および適切に希釈したＩＦＮ −ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを、各ウェルに加えた。１９−２３時間の更なるインキュベーション後、培地を吸出し、１％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中の１００−１０００組織培養感染量（ＴＣＩＤ）単位と等しい希釈の１００マイクロリットルの感染試験ウィルス、即ち脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）で置換した。プレートを更に２２時間インキュベートし、培地を除去し、細胞を、２００マイクロリットルの無水メチルアルコールで５分間固定した。固定化剤を除去し、細胞を、０．５％Gentian染料中で３０分間染色し、次いで、染料がなくなるまですすぎ、１から２時間風乾した。染料を２００マイクロリットルのエチレングリコールモノエチルエーテルで溶出し、３０分間振蕩した。各ウェルの６５０ｎｍでの吸収を、Vmax Kinetic Microplate Reader，モデル88026(Molecula r Devices)で測定した。標準の結果を、ＩＦＮ−ｃｏｎの対数濃度対染料の吸収のパーセンテージとしてグラフにし、ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの生物活性を決定した。４つの個別の調製物に対する上記分析の結果を表１に示す。ＩＦＮ−ｃｏｎ活性＝１を用いて力価を比較した。表１のデータは、最適反応条件により、ＩＦＮ−ｃｏｎに結合した平均５−６個の乳糖残基を有するｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎが得られることを示している。これらのｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎ類似体は、ＩＦＮ−ｃｏｎの１１×１０⁸Ｕ／ｍｇと比較した場合６．４×１０⁸Ｕ／ｍｇの平均インビトロ生物活性を有した。実施例２この実施例は、実施例１で調製した通りのＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ −ｃｏｎを用いた生体分布調査に関する。乳糖が結合したＩＦＮ−ｃｏｎの、組織指向性を、ハムスターおよびラットにおける¹²⁵Ｉ−標識した蛋白質の全身の分布を調査することにより測定した。Ａ．ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの沃素化沃素化手法を、Fraker and Speck，Biophys．Res．Comm.，80: 849-857(1978) に述べられているものから僅かに変えた。１２×７５ｍｍの硼珪酸試験管中で３ｍｇのＩＯＤＯ−ＧＥＮ(Pierce)を量りとり、これを、次いで、１００μＬのＣＨＣｌ₃に溶解し、Ｎ₂の穏やかな気流下で乾燥して試験管内に薄いフィルムを形成した。(¹²⁵Ｉ)沃化ナトリウム（１２μＬ、１．２ｍＣｉ）(New England Nucl ear)およびＰＢＳ中の６００μｇの蛋白質を試験管に加え、反応液を氷上で１０分間インキュベートした。反応液を、２０μＬのパラヒドロキシベンゾエート（１１０ナノモル）が入った１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、氷上で１０分間インキュベートした。沃素化蛋白質を、１％ＢＳＡおよび０．０５％のトリトンX100を含有する２５ｍｌのＰＢＳ、ならびに２５ｍｌのＰＢＳで段階的に予め平衡にしたＰＤ−１０のカラム(Pharmacia)で精製した。０．５ｍｌの画分を集め、放射能をカウントした。沃素化蛋白質を含む画分をプールし、末結合の¹²⁵Ｉによる混入を、トリクロロ酸の６％最終溶液での沈殿により測定した。Ｂ．ハムスターにおける生体分布分析 Syrian-Goldenハムスター雄（８５−１３０ｇ）を、Charles River Laborator iesから入手し、２１℃の制御環境で１２／１２明暗サイクルで維持した。Purin a Chowおよび水の食餌は、自由にとることができた。動物を２匹と５匹の群に分けてケージに入れ、到着後１週間この設備に順応させた。１群当たり３匹のハムスター（８５−１３０ｇ）に、¹²⁵Ｉ−標識した蛋白質を２ｍｇ／ｋｇ（２×１０⁷ｃｐｍ／ハムスター）の用量で陰茎静脈を介して静脈に与えた。３、１５、３０、６０および１２０分に、動物を屠殺し、器官と関係のある放射能を測定した。器官重量１グラム当たりの注射した用量のパーセントを、種々の時点で測定した。データを表２にまとめた。表２および図２に示したように、静脈注射は、全身循環で薬物を瞬時に分布させ、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎは、３−５分後、肝臓に急速に蓄積した。肝臓に蓄積した非修飾ＩＦＮ−ｃｏｎの量は、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎと比較した場合１／３未満であった。更に、蓄積は、少なくとも３０分間、非修飾ＩＦＮ−ｃｏｎのそれより高いままであった。Ｃ．ラットにおける生体分布分析 Sprague-Dawleyラット雄（２５０−３００ｇ）を、Charles River Laboratori esから入手し、２１℃の制御環境で１２／１２明暗サイクルで維持した。Purina Chowおよび水の食餌は、自由にとることができた。動物を２匹と５匹の群に分けてケージに入れた。１群当たり３匹のラット（２５０−３００ｇ）に、¹²⁵ Ｉ−標識した蛋白質を１２μｇ／ｋｇ（２ｘ１０⁶ｃｐｍ／ラット）の用量で陰茎静脈を介して静脈に与えた。５、６０および３６０分に、動物を屠殺し、全器官を取り出して総関連放射能を測定した。器官重量１グラム当たりの注射した用量のパーセントを、種々の時点で測定した。データを表３にまとめた。再度、ハムスターの調査と同様に、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎは、３−５分後、肝臓に急速に蓄積し、肝臓に蓄積した非修飾ＩＦＮ−ｃｏｎの量は、ｌａｃＩＦＮ −ｃｏｎと比較した場合１／３未満であった（図３および４も参照のこと）。更に１％ドース未満が、脾臓、十二指腸、脳および心臓に蓄積し、血清中に見られるｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの量は、非修飾ＩＦＮ−ｃｏｎの量の４０％であった。従って、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎのインビトロ生物活性が、より低い（実施例１参照）という事実にもかかわらず、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎは、特異的に肝臓に指向し特定の肝臓疾患の改善された治療を提供することができるという点でまだ有利である。実施例１におけるインビトロ分析にＥＭＣＶをマーカーとして用いたが、ＥＭＣＶは、肝ウィルスではない。実施例３この実施例は、実施例１で調製したようなＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ −ｃｏｎを用いたハムスターにおける薬物動態分析に関する。ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを、３００μｇ／ｋｇの用量でSyrian Goldenハムスター雄（８５−１３０ｇ）に陰茎静脈を介して静脈に投与した。０．０５、０．１７、０．２５、０．５、１、２、４、６および８時間目に、３匹の動物の群を屠殺し、血液試料（１００μＬ）を、心臓穿刺により集めた。血清試料を、血清分離用試験管（Becton Dickinson）を用いて得た。血清試料をサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ分析で分析した。第一固定化抗体(ポリクローナルラビット由来抗−ＣＩＦＮ抗体)、および、第二抗体（マウス由来モノクローナル抗−ＩＦＮＩｇＧ１）を、Amgen Incから得た。ラビットポリクローナル抗−ＩＦＮ抗体の３つの異なるバッチをスクリーニングした。検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役したヤギ由来の抗−マウスＩｇＧ１ (BoehringerMannheim)であり、３，３′，５，５′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質(BoehringerMannheim)処理による発色を、血清試料中のＣＩＦＮおよびｌａｃ−ＣＩＦＮの濃度を測定するのに用いた。この分析の感度は、コンセンサスインターフェロン濃度０．１５６から１０ｎｇ／ｍＬの間で直線関係を有する。非修飾及び乳糖が結合したＩＦＮ−ｃｏｎの両方が、抗−ＩＦＮ抗体に結合することができるが、親和度が異なった。ＩＦＮ−ｃｏｎと比較してｌａｃＩＦＮ −ｃｏｎは全ポリクローナル抗体に対し２５％の結合親和性があり、直線関係が、０．１５６−２．０ｎｇ／ｍＬの蛋白質濃度で得られた。ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎは、類似した二相クリアランス機構を示し、Ｔ_1/2に顕著な相違は見られなかった（図５参照）。同じ用量を与えた場合、ハムスター血清中のｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎ濃度は、注射３分後のＩＦＮ−ｃｏｎのそれの約５０％に急速に減少し、次いで、ほぼ同じ比率を８時間を通して維持した。両方の蛋白質の初期分布半減期（アルファ−Ｔ_1/2）は、〜１１分であり、ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの最終クリアランス半減期（ベータ−Ｔ_1/2）は、それぞれ１．３および１．０時間であった。しかしながら、ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの曲線下面積（ＡＵＣ）および分布の見掛けの容積（Ｖｓｓ）は、非常に異なった。ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎのＡＵＣは、１８１７および６９１ｎｇ・時間／ｍＬであり、Ｖｓｓは、それぞれ１９８および４３４ｍＬ／ｋｇであった。実施例４この実施例において、ハムスターにおけるＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ −ｃｏｎのインビボ生物活性を、２′，５′−オリゴアデニル酸シンテターゼ（２−５Ａシンテターゼ）の血漿水準を測定することにより測定した。２−５Ａシンテターゼは、インターフェロンのその受容体への結合の直接的応答として産生される酵素であり、抗ウィルス活性のメカニズムにおける第一段階であると考えられる；Interferon，Principles and Medical Applications，1st Edition（19 92，Univ．of Texas Medical Branch of Galveston）page 225-237参照。１群当たり３匹のSyrian Goldenハムスター雄（８５−１３０ｇ）に、３００ μｇ／ｋｇのＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを陰茎静脈を介して静脈により投与した。賦形剤群は、１００ μＬのＰＢＳにより投与された。動物を、６、１２、２４、４８、７２および９６時間目に屠殺し、血液試料を心臓穿刺により得た。血清中の２−５Ａシンテターゼ活性を、Sawai等，Biomed．Res.，9:59-66(1988)により述べられた方法を用い２−５ＡＲＩＡキット（Eiken,Kitaku,Japan）を用いて分析した。ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの静脈投与後のハムスター血清中の産生した２−５Ａシンテターゼを比較した（図６参照）。賦形剤群およびゼロ時間群のハムスターで最小量の２−５Ａシンテターゼ活性が見られたが、これは、注射手法が、ハムスターの非常に低いバックグラウンド水準の酵素生産を誘導したことを示す。ＩＦＮ−ｃｏｎで処理した場合、酵素活性が、二相の様式で上昇したことを見い出した。初めのピークは、注射の２４時間後に見られ、酵素活性が、賦形剤群のそれと比較して７倍高いことを見い出した。酵素活性は、４８時間目に基線水準に減少し、７２時間目に再度賦形剤群のそれの４倍の高さまで上昇した。９６時間目に、酵素活性は、基線水準に低下した。ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎでは、酵素活性は、４８時間目に大きく増加し９６時間まで持続することを見い出した。２−５Ａシンテターゼ活性の上昇は、４８時間目の賦形剤群のそれより１０倍高かった。これらの結果は、ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎの異なる酵素生産パターンを示しており、ｌａｃＩＦＮ −ｃｏｎが、ＩＦＮ−ｃｏｎと比較した場合、非常に異なる抗ウィルス活性を刺激するかもしれないこと、おそらく、これらの２つの蛋白質の異なる生体分布プロフィールに関係することを示唆している。実施例５この実施例では、ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎのインビボ抗ウィルス活性を、これらの蛋白質を受け取ったハムスターを脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）に感染させ、次いで、生存率を比較することにより調査した。１群当たり１０匹のSyrian-Goldenハムスター雄（８５−１３０ｇ）に、ＩＦＮ−ｃｏｎおよびｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎを１０μｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した。６時間後、各ハムスターに、次いで、１００μＬ（２Ｅ＋４ｐｆｕ／ｍＬ）のＥＭＣＶを腹空内注射した。動物を１日に２回検査し、後四半部麻痺の兆候を終了点とした。２７日を通じて生き残ったハムスターは、ウィルスから防御されたと考えられた。インターフェロンを投与したハムスターがＥＭＣＶにより感染させられた場合、感染後２７日を通じて観察されたように、ＩＦＮ−ｃｏｎは動物の８６％を防御し、ｌａｃＩＦＮ−ｃｏｎは５７％を防御した（図７参照）。インターフェロンを受け取らなかった対照群は、ＥＭＣＶ感染後４日目またはその以前に全て死んだ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リウ，ジエニフアー・リン−チユンアメリカ合衆国、カリフオルニア・91344、グラナダ・ヒルズ、ゴヤ・ストリート・ 17089

Claims

【特許請求の範囲】１．リガンドが末端ガラクトースから成る、少なくとも１個のグリコシルリガンドに結合したＩＦＮ−ｃｏｎから成る化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。２．当該ＩＦＮ−ｃｏｎが、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁、ＩＦＮ−ｃｏｎ₂、およびＩＦＮ−ｃｏｎ₃から成る群から選ばれる、請求項１の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。３．当該ＩＦＮ−ｃｏｎがＩＦＮ−ｃｏｎ₁である、請求項２の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。４．当該グリコシルリガンドが、モノサッカライド、ジサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、グリコペプチド、およびグリコプロテインから成る群から選ばれる、請求項１の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。５．当該グリコシルリガンドがオリゴサッカライドである、請求項４に記載の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。６．当該オリゴサッカライドが、少なくとも２個の糖残基を有し、末端ガラクトース残基から成る、請求項５に記載の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。７．当該オリゴサッカライドが乳糖である、請求項５に記載の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。８．４個から７個のグリコシルリガンドが当該ＩＦＮ−ｃｏｎに結合している、請求項１に記載の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。９．当該グリコシルリガンドが、リシン、システイン、セリン、トレオニンまたはアスパラギンのような活性なアミノ酸残基を介して蛋白質の骨格に結合している、請求項１に記載の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。１０．当該グリコシルリガンドが、リシンのε−ＮＨ₂および当該ＩＦＮ−ｃｏｎのＮ−末端アミンを介して直接当該ＩＦＮ−ｃｏｎに結合している、請求項１に記載の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎ。１１．ＩＦＮ−ｃｏｎに結合した４個から７個のグリコシルリガンドから成るネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎの実質的に均質な調製物および薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む医薬組成物。１２．ネオグリコシル化ＩＦＮ−ｃｏｎの実質的に均質な調製物。１３．ＩＦＮ−ｃｏｎにより治療可能な症状を有する患者を治療する方法であって、当該患者に治療上効果的な量の請求項１の化学的に修飾したＩＦＮ−ｃｏｎを投与して成ることを特徴とする前記方法。１４．当該症状が細胞増殖疾患またはウィルス性疾患である、請求項１３に記載の方法。１５．当該ウィルス性疾患が肝疾患である、請求項１４に記載の方法。１６．当該肝疾患が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎またはデルタ肝炎である、請求項１５に記載の方法。１７．当該肝疾患が、Ｃ型肝炎である、請求項１６に記載の方法。１８．インターフェロンを患者の肝臓に優先的に送達する方法であって、化学的に修飾したインターフェロンが、少なくとも１個のグリコシルリガンドに共役したインターフェロンから成り、当該リガンドが末端ガラクトースから成り、当該インターフェロンが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−ｃｏｎから成る群から選ばれる、当該患者に化学的に修飾したインターフェロンを投与して成る前記方法。１９．当該インターフェロンがＩＦＮ−αである、請求項１８に記載の方法。２０．当該インターフェロンがＩＦＮ−βである、請求項１８に記載の方法。２１．当該インターフェロンがＩＦＮ−ｃｏｎである、請求項１８に記載の方法。２２．治療上効果的な量の当該化学的に修飾したインターフェロンを、肝疾患を治療するために当該患者に投与する、請求項１８に記載の方法。２３．当該肝疾患がＣ型肝炎である、請求項２２に記載の方法。