KR19980701814A

KR19980701814A - 화학적으로 변형된 인터페론

Info

Publication number: KR19980701814A
Application number: KR1019970705211A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 콜린즈; 제니퍼 린-춘 리우
Original assignee: 스티브 엠. 오드레; 암젠 인코포레이티드
Priority date: 1995-01-11
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1998-06-25
Also published as: EP0804248A2; WO1996021468A3; MX9705119A; CA2209557A1; JPH10513440A; IL116730A0; BR9607599A; ZA96206B; AU4751896A; WO1996021468A2

Abstract

본 발명은 칸센서스 인터페론에 결합된 하나 또는 그 이상의 글리코실 리간드(들)을 갖는 화학적으로 변형된 칸센서스 인터페론에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그와 같은 유사체를 포함하는 제약학적 조성물, 및 본 발명의 조성물을 이용하는 치료방법에 관한 것이다.

Description

화학적으로 변형된 인터페론

[기술분야]

본 발명은 일반적으로 칸센서스 인터페론(consensus interferon)의 변형에 관한 것이며, 특히, 글리코실 리간드가 결합된 재조합 칸센서스 인터페론의 신생글리코실화된 유사체 조성물에 관한 것이다.

[발명의 배경]

인터페론은 항바이러스성 및 항증식성 활성도 둘 다를 나타내는 사이토카인의 아강(亞綱)이다. 생화학 및 면역학적 특성을 기초로 인체 인터페론은 3종류로 분류된다 : 인터페론 - 알파(백혈구), 인터페론 - 베타(섬유아세포) 및 인터페론 - 감마(면역). 별개의 아미노산 서열을 가지는 최소한 14개의 알파 인터페론(아유형 A내지 H로 분류)이 이들 폴리펩티드를 암호하는 DNA를 분리하고 서열결정함으로써 확인되었다. 알파 인터페론은 그것의 항바이러스성 및 항종양성 성장 억제로 인해 잠재적 치료제로서 상당한 주목을 받아왔다.

현재 알파 인터페론은 미국 및 다른 나라에서 모양세포성 백형별, 성병사마귀, 카포시육종 [후천성면역결핍증(AIDS)을 앓고 있는 환자에게서 주로 발병하는 암] 및 만성 C형 간염 바이러스(HCV)감염의 치료용으로 승인되어 있다. 2개의 알파 인터페론 변종이 치료학적 용도를 위해 승인되었다 : 상표명 Roferon- A로 시판되는 인터페론 알파 - 2a, 및 상표명 INTRONA로 시판되는 인터페론 알파 - 2b.

상기 분류된 지시 이외에도, 알파 인터페론은 단독으로 또는, 만성골수성백혈병, 다발성골수종, 표재성방광암, 피부암(기저세포암 및 악성흑색종), 신장세포암, 난소암, 저급림프구성 및 피부 T 세포 림프종 및 신경교종을 포함하여, 다양한 다른 세포성증식질환의 화학요법제와 결합시켜 사용되거나 평가되고 있다. 알파 인터페론은 폐, 결장 직장 및 유방암에서 유발되는 고형 종양을 치료하기 위한 다른 화학요법제와 공동하여 효과적일 것이다[Rosenberg 등의 Principles and Applications of Biologic Therapy in Cancer : Principles and Practices of Oncology, 3rd ed., Devita 등의 eds. pp. 301-547(1989), Balmer DICP, Ann Pharmacother 24, 761-768(1990) 참조].

알파-인터페론은 정상 및 비정상 세포에서, DNA 복제, 및 RNA와 단백질 합성을 포함하여 다양한 세포기능에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 인터페론의 세포 독성 효과는 종양이나 바이러스 감염 세포로 제한되지는 않으나, 정상의, 건강한 세포에서도 역시 발현된다. 결과로서, 바람직하지 않은 부작용은 인터페론 치료중에, 특히 고투여량이 요구될 때 나타난다. 인터페론 투여는 골수억제를 일으켜 결과적으로 적혈구, 백혈구 및 혈소판 수준을 감소시킬 수 있다. 보다 고투여량의 인터페론은 보통 유행성감기-유사증상(예를 들어, 발열, 피로, 두통 및 오한), 위장질환(예를 들어, 식욕부진, 구역 및 설사), 현기 및 기침을 유발한다.

천연 인체 인터페론-베타는 22-23 kDa의 겉보기 분자량 및 2-5 x 10⁸국제단위(IU)/mg 단백질의 항바이러스성 고유활성도를 가지는 당단백질이다. 인체 IFN-β는 신경교종, 흑색종, 바이러스 피부 친화성 질병 및 간염 치로에 임상적으로 적용되고 있다 ; Interferon, Principles and Medical Applications, 1st Edition(1992, Univ. of Texas Medical Branch of Galveston) Page 107-116 참조.

미국 특허 제 4,695,623호 및 제 4,897,471호는 자연발생적인 알파-인터페론 아유형 폴리펩티드 중의 각 위치에서 발견된 보통 또는 우성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 새로운 인터페론 폴리펩티드에 관하여 기술하고 있으며, 이를 칸센서스 인터페론(IFN-con)이라고 언급하고 있다. 기술된 특이 IFN-con 아미노산 서열을 IFN-con₁, IFN-con₂, IFN-con₃이라고 명명한다. IFN-con 을 암호하는 제조된 유전자 제제 및 E. coli 내 상기 유전자의 발현 또한 기술되어 있다.

E. coli 에서 생산된 IFN-con₁의 정제에 관하여는 Klein 등의 문헌[J. Chromatog. 454, 205-215(1988) 참조]에 기술되어 있다. 이와 같은 방식으로 정제된 IFN-con₁은, T98G 인체 세포주[Fish 등의 J.Interferon Res. 9, 97-114(1989) 참조]를 사용하여 세포변성 효과억제 검정으로 측정한 바와 같이 3 x 10⁹단위/mg 단백질의 고유활성도를 가진다고 보고되어 있다.

미국 특허 제 5,372,808호는 컨센서스 인터페론을 사용한 질병 치료 방법에 관하여 기술하고 있다. IFN-con은, 알파 인터페론에 의한 치료에 감수성인 질병 치료에 사용했을 때, 환자에게 알파 인터페론에서와 같은 정도의 부작용을 유발시키지 않는 것으로 보여진다. 또한, 바람직하지 않은 부작용의 빈도나 심각성을 실질적으로 증가시키지 않으면서, 치료학적 이익이 증진되도록 3-5배 더 많은 투여량의 IFN-con을 사용할 수 있는 것으로 보여진다.

역부작용은 감소시키면서 최대의 치료효과를 얻을 수 있는 인터페론 투여형태가 여전히 분명하지 않으므로, 치료학적 용도를 위한 개량된 인터페론 형태를 개발할 필요가 있다. 인터페론 치료와 관련된 바람직하지 않은 부작용 없이 높은 투여량을 허용하는 인터페론 형태의 개발이 크게 이로울 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 인터페론 치료에 감수성인 증상을 치료하는데 사용하기 위해 인터페론에 갈락토스 잔기의 결합을 포함시킨 개량된 인터페론 형태를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 인터페론을 간에 선택적으로 전달시켜, 간세포 표면 수용체에 인터페론이 결합하는 기회를 증가시키고, 만성 HCV와 같은 질병 상태를 항바이러스성 치료하는 동안 다른 기관에 인터페론이 바람직하지 못하게 결합되는 것을 감소시키는 조성물을 제공하는 것이다.

[발명의 요약]

본 발명은 재조합 칸센서스 인터페론의 신생글리코실화된 유사체를 포함한다. 본 발명은 다중 락토스 리간드가 IFN-con에 결합되어 신생글리코실화된 형태의 IFN-con(lac IFN-con)을 제공할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 바람직하게, 락토스 리간드는 리신의 ε-NH₂및 IFN-con의 N-말단 아민을 통하여 결합된다. 천연 칸센서스 인터페론과 비교하여 lacIFN-con은 간에 대하여 고도로 표적화된다.

바람직하게, IFN-con은 IFN-con₁, IFN-con₂, 또는 IFN-con₃의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이며, 이 결합체는 IFN-con 분자당 1내지 10개의 글리코실 잔기를 가질 것이다. 가장 바람직하게, IFN-con은 IFN-con₁의 아미노산 서열을 가지며, 신생글리코실화된 IFN-con은 각 IFN-con분자에 대해 4내지 7개의 락토스 잔기를 가질 것이다.

또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 lacIFN-con유사체와 함께 적합한 희석제, 보조제, 담체, 방부제 및/또는 가용화제를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 이들 조성물은, 일반적으로 IFN-con을 수반한 치료에 감수성인 이들 증상의 치료에 치료학적 이익을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 화학적으로 변형된 인터페론의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 간에 인터페론을 직접 전달시키는 방법을 포함하는데, 여기서 화학적으로 변형된 인터페론은 최소한 하나의 글리코실 리간드에 결합된 인터페론으로 이루어져 있고 상기 리간드는 말단 갈락토스를 포함하며, 상기 인터페론은 IFN-α, IFN-β 및 IFN-con로 구성된 그룹 중에서 선택한 것이다.

[도면의 상세한 설명]

제 1도는 IFN-con과 락토스로 부터 환원성 아미노화를 통해 lacIFN-con을 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.

제 2도는 표시된 시간 간격에서, 햄스터의 간에 주사하여 축적된 방사선표지 IFN-con(-□-) 및 lacIFN-con(-○-)의 백분율을 그래프로 나타낸 것이다.

제 3도는 랫에서 방사선표지 IFN-con의 생물분포를 그래프로 나타낸 것이다. 주사량(%)은 표시된 시간간격에서 측정하였다.

제 4도는 랫에서 방사선표지 lacIFN-con의 생물분포를 그래프로 나타낸 것이다. 주사량(%)은 표시된 시간 간격에서 측정하였다.

제 5도는 정맥내 투여(300㎍/kg)후, IFN-con(-□-), 및 lacIFN-con(-○-)의 햄스터 혈청 약력학을 그래프로 나타낸 것이다. 혈청 인터페론 농도는 시간에 대하여 점을 이어 곡선을 그린 것이다. 선은 표준편차를 나타낸다(n=3).

제 6도는 IFN-con(-□-), lacIFN-con(-○-) 및 인산염 완충액 운반체 군(-△-)을 정맥내 투여한 후 여러 시점에서 햄스터 혈청에 대해 측정한 2-5A합성효소 활성도를 그래프로 나타낸 것이다. 선은 표준편차를 나타낸다(n=3).

제 7도는 처리하지 않은 EMCV-감염 햄스터(-○-), IFN-con을 미리 주사한 EMCV-감염 햄스터(-□-) 또는 lacIFN-con으로 미리 처리한 EMCV-감염 햄스터(-◇-)의 생존율을 그래프로 나타낸 것이다. 이 동물들을 27일간 매일 2회 측정하였다.

[발명의 상세한 설명]

본원에 사용한 바와 같이, 칸센서스 인체 백혈구 인터페론(IFN-con)은 비자연 발생적인 폴리펩티드를 의미하는데, 이것은 모든 자연 발생적인 인체 백혈구 인터페론 아유형 서열에 공통적인 이들 아미노산 잔기를 우선적으로 포함하고, 모든 아유형에 공통적인 아미노산이 없는 하나 또는 그 이상의 이들 위치에서, 최소한 하나의 자연 발생적인 아유형의 그 위치에 잔존하지 않는 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않으며 그 위치에서 우선적으로 나타나는 아미노산을 포함한다. IFN-con은, 이들 전체 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용한 공동 소유의 미국 특허 제 4,695,623호 및 제 4,897,471호에 기술되어 있는 IFN-con₁, IFN-con₂및 IFN-con₃라고 명명한 아미노산 서열을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. IFN-con을 암호화하는 DNA 서열은 상기 언급한 특허문헌에 기술된 바와 같이 합성하거나 다른 표준방법으로 합성할 수 있다.

IFN-con 폴리펩티드는 박테리아 숙주, 특히 E.coli 내에 형질전환시키거나 형질감염시킨 제조된 DNA 서열의 발현 산물이 바람직하다. 즉, IFN-con은 재조합 IFN-con이 바람직하다. 재조합 IFN-con은 IFN-con₁에 대해 klein등의 상기문헌(1988)에 일반적으로 기술된 바와 같이, E.coli 내에서 생산하고 본 분야의 기술자들에게 공지되어 있는 방법에 의해 정제하는 것이 바람직하다. 정제된 IFN-con은 동형(isoform)의 혼합물을 포함할 것인데, 예를 들어 정제된 IFN-con₁은 메티오닐 IFN-con₁, 데스-메티오닐 IFN-con₁및 차단된 N-말단을 갖는 데스-메티오닐 IFN-con₁을 포함할 것이다[klein 등의 상기문헌(1990) 참조]. 택일적으로, IFN-con은 특이한, 분리된 동형을 포함할 것이다. IFN-con의 동형은 본 분야의 기술자들에게 공지되어 있는 등전점전기이동과 같은 기술에 의해 서로 분리된다.

본 발명의 화학적으로 변형된 IFN-con은 단백질당 최소한 하나의 말단 갈락토스-함유 글리코실 리간드로 이루어 질 것이다. 그러한 글리코실 리간드는 갈락토스, 말단 글리코실 과당류, 무시알로글리코펩티드 및 무시알로당단백질로 구성된 그룹 중에서 선택될 것이다. 글리코실 리간드가 단당류일 때, 그것은 대개 갈락토스일 것이다. 글리코실 리간드가 단당류일 때, 그것은 대개 갈락토스일 것이다. 본 발명의 과당류는 일반적으로 최소한 2개의 당 성분을 갖는 것들이며, 여기서 각 경우에 갈락토스 잔기(들)은 과당류의 말단(들)에 부가될 것이다. IFN-con에 부가되기에 유용한 대표적인 다소의 과당류는 락토스, N-아세틸락토사민 및 갈락탄이다. 바람직하게, 신생글리코실화된 IFN-con유사체는 4-7개의 리간드를 함유할 것이고 글리코실 리간드는 과당류가 될 것이다. 더 바람직하게, 신생글리코실화된 IFN-con유사체는 4-7개의 리간드를 함유할 것이고 글리코실리간드는 락토스가 될 것이다. 다중 리간드는 동일한 것이 바람직하지만, 리간드 혼합물 역시 본 발명에 포함된다.

본 발명의 신생글리코실화된 IFN-con 유사체는 다수의 종래 방법에 의해 수득될 수 있다. 그러한 방법은 다음 문헌에 매우 잘 요약 되어 있다 : Kataoka 및 Tavassoli의 Jour. of Histochem. and Cytochemistry, 32 : 1091-1098(1984) ; Chipowsky 및 Lee의 Carbohy. Research, 31 : 339-346(1973) 및 이들 문헌에서 인용한 참고문헌 참조. 바람직하게, 리신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴과 같은 활성 아미노산 잔기(들)을 통하여 다중 글리코실 리간드를 단백질 골격에 결합시킴을 포함하는 방법에 의해 신생글리코실화된 IFN-con 유사체를 수득한다. 더 바람직하게, 신생글리코실화된 IFN-con 유사체는, 리신의 ε-NH₂및/또는 IFN-con의 N-말단 아민을 통하여 다중 글리코실 리간드에 결합됨을 포함하는 방법에 의해 수득한다. 이와 같은 화학적 변형은, 특정 반응조건, 바람직하게 비변성 조건하에서 아미노기가 환원성 아미노화에 영향받기 쉽도록 충분한 양으로 글리코실 리간드를 IFN-con과 반응시킴으로써 획득한다. 바람직한 실시행태로, 글리코실 리간드는 락토스이고 반응은 pH 7.0에서 수행하되, 환원제, 예를 들어, 소디움 시아노보로하이드라이드를 몰 과량으로 부가하는 것이 필요하며, 수득된 유사체가 단백질당 4-7개의 락토스 리간드를 함유하도록 조절한다. 그와 같은 반응을 조절하는데 사용되는 수단은 본 분야의 숙련된 기술자들에 의해 쉽게 결정된다.

본 발명의 방법은 실질적으로 균질한 변형된 IFN-con 제제를 제공하므로, 본 발명 역시 제약학적으로 용인가능한 담체, 희석제, 방부제, 가용화제, 보조제 및/또는 유화제와 함께 혼합물내에 치료학적 유효량의 lacIFN-con을 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다 : 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712 참조.

본원에 사용된 바와 같이 실질적으로 균질한이란 오로지 신생글리코실화된 IFN-con 유사체가 단백질당 4-7개의 부가된 리간드를 가지는 것을 의미한다. 제제는 비반응(즉, 글리코실 리간드가 결여되어 있다) 단백질을 포함할 수도 있다. 바람직하게, 화학적으로 변형된 IFN-con은 최소한 90%의 하나의 산물이며(하기 실시예에서와 같음) 보다 바람직하게, 화학적으로 변형된 IFN-con은 ≥ 98%의 하나의 산물이다.

본 발명에서 의도하는 화학적으로 변형된 IFN-con은 실시예1에 기술된 바와 같은 생물학적 검정에 활성인 그들 유사체이다. 이 유사체는 천연 IFN-con의 활성도와 비교하여 최소한 50%의 활성도를 가질 것이다. 바람직하게, 유사체는 최소한 60%의 활성도를 가질 것이다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 상기 유사체를 용이하게 평가할 수 있을 것이며 그것들이 상기 검정에서 활성도를 증명하는지의 여부를 결정할 수 있을 것이다.

일반적으로, 본 발명의 조성물은 IFN-con에 대하여 이미 기술한 바와 동일한 방식으로 사용될 수 있으며 이 조성물이 칸센서스 인터페론으로 치료가능한 이들 증상을 치료하는데 사용될 것이다. 전형적인 증상에는 세포 증식 질환 및 바이러스 감염이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.

IFN-con에 의해 치료가능한 바이러스 증상에는 A형 간염, C형 간염, 다른 비-A형, 비-B형 간염, B형 간염, 포진 바이러스(EB, CML, 단순포진), 유두종, 폭스바이러스군, 피코르나바이러스, 아데노바이러스, 라이노바이러스, HTLV I, HTLV II 및 인체 로타바이러스가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 또한 IFN-con은 암과 관련하여 빈번히 유발되는 세포 증식 질환을 치료하는데 효과적이다. 그러한 질환에는 모발세포백혈병 및 카포시육종이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 바람직하게, 치료될 증상은 간 질환이다.

IFN-con은 단독으로 사용될 수 있거나, 과립구 군체 자극인자(G-CSF), 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 에리트로포이에틴, 간세포 인자(SCF), 및 거핵세포 성장 및 발육 인자(MGDF)와 같은, 골수 세포 증식 또는 분화를 자극시키는 하나 또는 그 이상의 인자와 함께 사용 될 수 있다.

본 발명에서 의도하는 바는 화학적으로 변형된 IFN-con을 치료가 알파 인터페론을 수반한 치료와 비교하여 실질적으로 부작용을 감소시키거나 제거시킨 증진된 효능을 제공하고자 한다. 부작용의 감소 또는 제거는 치료될 증상에 상관없이 설명되는 것으로 예상된다. 보다 특히, 말단 갈락토스 잔기를 함유하는 리간드로 변형된 IFN-con이 간세포 표면 상의 무시알로당단백질-결합 수용체에 선택적으로 결합될 것이므로, HCV와 같은 간 질환 치료에 변형된 IFN-con이 특히 유용할 것이라고 예상된다.

본 발명의 화학적으로 변형된 인터페론은 간 지시하고 있으므로, 본 발명 역시, 본 발명의 화학적으로 변형된 인터페론의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 간에 직접적으로 인터페론을 전달시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 사용하고자 하는 인터페론에는 IFN-α, IFN-β 및 IFN-con이 포함된다. IFN-α 및 IFN-β 는, 상세한 실시예에서 IFN-con에 대하여 기술한 바와 유사한 방식으로 글리코실 리간드에 의한 화학 변형을 수용하는 리신잔기를 포함하고 있다.

화학적으로 변형된 인터페론의 양은 질병의 성질 및 다른 인자에 좌우될 특정 질병의 치료에 효과적일 것이며, 이는 표준 임상 기술에 의해서나, 인터페론에 대해 이미 확적되어 있는 투여량 또는 양생법을 기초로 하여 결정할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 여러 가지 양상을 보다 상세히 설명할 것이다.

[실시예 1]

이 실시예는 화학적으로 변형된 인체 재조합 칸센서스 인터페론을 설명한다. 보다 특히, 이 실시예는 신생글리코실화된 IFN-con₁의 균질한 제제를 제조하는 방법, 및 그 제제의 특정화를 설명한다.

A. 칸센서스 인터페론의 제조

미국 특허 제 4,695,623호(이 문헌 전부를 본원의 참고문헌으로 인용함)의 제2도에 기술된 바와 같은 IFN-con₁을 신생글리코실화된 인체 재조합 칸센서스 인터페론을 제조하는데 사용하였다. 이 IFN-con₁은 박테리아내에서 외인성 DNA를 발현시켜 생산하였으며, 그것의 N-말단에는 메티오닌 잔기를 함유하였다.

B. LacIFN-con의 제조

제1도에 도시된 바와 같이 리신의 ε-NH₂및 IFN-con의 N-말단아민을 통하여 다중 락토스 리간드를 결합시킴으로써 LacIFN-con을 제조하였다. 일반적으로, 결합반응은 다음과 같이 설명할 수 있다 : 다양한 락토스 : IFN-con 몰농도에서 IFN-con₁을 함유하는 인산염완충 식염수(PBS)에 β-D-락토스(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)를 용해하였다. 반응물을 다양한 시간대 동안 실온에서 교반시키고, 소디움 시아노보로하이드리드(NaBH₃CN)(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)를 반응 혼합물에 1일 2회 가하였다. 16% SDS-PAGE에서 반응의 진행을 모니터하였다. 그런다음 비반응 락토스와 NaBH₃CN을 제거하기 위해, PBS로 용리시킨 세파덱스 G-25 칼럼(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)을 통하여 혼합물을 통과시켜 반응을 정지시킨다.

1.2ml/분 유속에서 PBS로 용리되는 파마시아 하이로드 수퍼덱스(Pharmacia HiLoad Superdex) 75 pg 26/60 컬럼(뉴저지 피스카타웨이)을 갖는 FPLC로 상기 단백질을 더 정제하고 280nm에서 흡수를 모니터하였다. 2mL의 분획들을 모아 그 단백질을 분획을 풀(pool)로 만들었다. 0.5ml/분에서 PBS로 용리되는 파마시아 수퍼로스 12 H/R 10/30 칼럼(미국 뉴저지 피스카타웨이)이나 페노메넥스 바이오셉 SEC-2000 칼럼(미국 캘리포니아 토런스)을 갖는 겔 여과 HPLC로 정제된 lacIFN-con 제제를 분석하였다. 16% SDS-PAGE 겔(미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 노벡스에서 구입)과 pH 3-10 등전점전기이동 겔(미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 노벡스에서 구입) 및 질량 분광법을 사용하여 상기 유도체화된 단백질을 특정화하였다.

반응 pH, 반응시간 및 시약농도와 같은 다양한 인자를 연구함으로써 반응조건을 최적화하였다. 실온에서 3일간 pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 및 7.5 PBS에서 반응을 수행함으로써 pH효과를 연구하였다. 반응의 진행은 16% SDS-PAGE상에서 모니터하였다. 유도체화 정도는 더 높은 pH에서 더 커졌는데 그 이유는, 아미노기가 덜 양자수여되어 락토스의 알도스형에 대한 친핵성 공격에 더 많이 접근할 수 있기 때문이다. 겔 여과 HPLC의 결과를 기초로 하면, 유도체화된 단백질은 ph 5.5에서 수행한 한 조건을 제외하고는-IFN-con에 대한 pI가 5.7이므로 - 모든 반응조건에서 이량체나 집합체로서 발견되었다.

반응물에 가한 환원제의 양이 반응의 진행 및 단백질 변성 정도에 직접적으로 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 소디움 시아노보로하이드라이드는, 단백질 안정성을 보호하기 위해 반응물에 가하기 바로 전에 물에 용해시켜 10M 용액으로 만들었다. 반응의 진행을 촉진시키기 위해 반응되는 동안 20,000 몰 과량 만큼 많은 환원제를 1일 2회 가하였으나 이 처리에서 최소량의 집합체가 검출되었다.

C. LacIFN-con의 특정화

글리코실화의 정도, 및 유도체화된 단백질의 시험관내 생물활성도를 조사하였다. 이 분석을 위해 사용한 lacIFN-con은 다음과 같이 제조하였다 : 1g의 β-D-락토스를 12.5mg IFN-con₁을 함유하는 5mL PBS내에 용해시켰다. 실온에서 4일간 반응물을 교반하고 이반응 혼합물에 50mg의 소디움 시아노보로하이드라이드(NaBH₃CN)를 1일 2회 가하였다.

크라토스 콤팩트 MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하여 질량 분광법에 따라, 락토스-변형 IFN-con의 분자량을 측정하였다. IFN-con에 부가된 락토스의 수는, 유사체의 분자량으로부터 19.516을 뺀 다음 그 수를 326(락토스-산소)으로 나누어 계산하였다.

배양세포주내 바이러스 복제 저해를 측정함으로써 시험관내 생물활성도를 측정하였다. 헬라 세포(HeLa cell)(입수처 : ATCC 제 CCL 2호)를 15,000 세포/웰로 96-웰 평판내에 평판화시키고 10% FBS와 함께 염기 배지[100 유닛/ml의 페니실린, 100mg/ml의 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 1중량%의 비필수 아미노산, 0.1중량%의 젠타마이신 설페이트 및 1% HEPES 완충액을 함유시킨 둘베코의 변형된 이글스 배지(DMEM)] 내 5% 이산화탄소하 37℃에서 24시간 동안 항온하였다. 염기배지 및 0.2% FBS에서 다중희석하여 IFN-conRHK lacIFN-con을 제조하였다. 각 표준 100마이크로리터와 적절히 희석시킨 IFN-con 및 lacIFN-con을 각 웰에 가하였다. 19-23시간 동안 더 항온한 후, 이 배지를 흡입시키고 1% FBS를 수반한 DMEM 내 100-1000 조직배양 감염량(TCID) 단위와 같이 희석시킨, 100 마이크로리터의 공격바이러스, 즉 뇌심근염바이러스(EMCV)로 대체시켰다. 이 평판을 22시간 동안 더 항온한 뒤 배지를 제거하고, 세포를 200 마이크로리터의 무수 메틸 알콜과 함께 5분간 고정시켰다. 고정액을 제거하고 이 세포를 0.5% 젠티안(Gentian) 염료로 30분간 염색한 다음 염료없이 세척하여 1-2시간 동안 공기건조하였다. 200 마이크로리터의 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르로 염료를 용리시켜 30분간 진탕하였다. 브이맥스 키네틱 마이크로플레이트 리이더(Vmax Kinetic Microplate Reader), 모델 88026(몰레큘라 디바이스)으로 650nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. IFN-con의 로그 농도 대 염료 흡수 백분율로서 표준용 결과를 그래프로 나타내고, IFN-con 및 lacIFN-con의 생물활성도를 결정하였다.

4개의 개별 제제에 대한 상기 분석 결과는 표1에 나타나 있다. IFN-con 활성도=1을 이용하여 효능을 비교하였다.

[표 1]

제 제lac의 수효능

IFN-con 0 1

lacIFN-con #1 4 .55

lacIFN-con #2 5 .60

lacIFN-con #3 6 .62

lacIFN-con #4 7 .55

표1의 데이터는 최적 반응조건으로, IFN-con에 평균 5-6개의 락토스 잔기가 부가된 lacIFN-con이 제공되었음을 보여준다. 이들 lacIFN-con유사체는 IFN-con에 대한 11 x 10⁸U/mg와 비교하여 6.4 x 10⁸U/mg의 평균 시험관내 생물활성도를 가졌다.

[실시예 2]

이 실시예는 실시예 1에서 제조한 IFN-con 및 lacIFN-con을 사용한 생물분포 연구에 관한 것이다. IFN-con에 결합되는 락토스의 조직-표적 능력을, 햄스터 및 랫에서¹²⁵I-표지 단백질의 총신체 분포를 연구함으로써 측정하였다.

A. IFN-con 및 lacIFN-con의 요오드화

요오드화 과정은, Fraker 및 Speck의 Biophys. Res. Comm., 80: 849-857(1978) 문헌에 기술된 과정을 약간 변형시켰다. 무게를 달은 12 x 75mm 보로실리케이트 시험관에서 3mg의 IODO-GEN(피어스)을 100㎕ CHCl₃에 용해시키고 시험관 내에 얇은 막이 형성되도록 조용한 N₂흐름하에서 건조시켰다. (¹²⁵I) 요오드화나트륨(12 ㎕, 1.2mCi)(뉴 잉글랜드 뉴클리어) 및 PBS 내 600㎍ 단백질을 이 시험관에 가하고 얼음상에서 10분간 항온하였다. 20㎕의 파라하이드록시벤조네이트(110nmol)를 함유하는 1.5mL 에펜도르프 시험관내로 상기 반응물을 옮겨 10분 간 얼음상에서 항온하였다. 1% BSA 및 0.05% 트리톤 x 100을 함유하는 25mL의 PBS와 25mL의 PBS로 점자척으로 예비-평형화시킨 PD-10 칼럼(파마시아)을 사용하여 요오드화된 단백질을 정제하였다. 0.5mL 분획을 모아 방사능을 계수하였다. 요오드화된 단백질을 함유하는 분획을 풀로 만들고 트리클로릭 에시드로 된 6% 최종 용액으로 침전시킴으로써 비결합¹²⁵I에 기인하는 오염을 측정하였다.

B. 햄스터 생물분포 분석

찰즈 라보라토리스에서 수컷 시리안-골든 햄스터(85-130g)를 수득하여 21℃로 조절된 환경에서 12/12 명암 주기로 유지시켰다. 퓨리나 차우 규정식과 물을 임의로 사용할 수 있었다. 이 동물들을 두 마리 군 및 다섯 마리 군으로 우리에 가두고 도착한 후 일주일간 시설에 순응하도록 하였다. 군 당 세마리의 햄스터(85-130g)에 2mg/kg의 투여량(2 x 10⁷cpm/햄스터)으로¹²⁵I-표지 단백질을 음경정맥을 통하여 정맥내 주입하였다. 3, 15, 30, 60 및 120분에서 동물을 희생시키고 기관들과 관련된 방사능을 검출하였다. 기관 무게(g)당 주입시킨 투여량의 백분율을 여러 시점에서 측정하였다. 데이터는 표2에 요약되어 있다.

[표2]

햄스터¹내 IFN-con 및 lacIFN-con의 생물분포

¹IFN-con에 대한 수는 상부에 나타내고 lacIFN-con에 대한 수는 하부에 굵게 나타냈다. 괄호안의 수는 S.D이다(n=3).

²총 체중의 7.3%가 혈액이라는 점을 추정하여, 수집된 혈액으로부터 계산.

³하나의 간엽내 방사능을 측정한 다음 전체 기관에 대하여 계산함.

⁴하나의 신장내 방사능을 측정한 다음 두 신장에 대해 두배로 함.

⁵10cm의 십이지장내 방사능을 측정함.

표2 및 제2도에 나타난 바와 같이, 정맥내 주사로 약물이 체순환내에 즉시 분포되었고, lacIFN-con은 3-5분 후에 간내에 신속히 축적되었다. 간에 축적된 IFN-con의 양은 lacIFN-con의 양과 비교하여 3분의 1보다 덜했다. 게다가, 최소한 30분간 잔존 축적물은 천연 IFN-con의 양보다 더 많았다.

C. 랫 생물분포 분석

수컷 스프래그-돌레이 랫(250-300g)을 찰즈 리버 라보라토리스에서 수득하여 21℃로 조절된 환경에서 12/12명암 주기로 유지시켰다. 퓨리나 차우 규정식과 물을 임의로 사용하였다. 이 동물들을 두마리 군 및 다섯 마리 군으로 우리에 가두었다. 군 당 3마리의 랫(250-300g)에 12㎍/kg(2 x 10⁶cpm/랫) 투여량의¹²⁵I-표지 단백질을 음경 정맥을 통하여 정맥내 주입하였다. 5, 60 및 360분에서, 상기 동물들을 희생시키고 총연합 방사능을 측정하기 위해 전 기관을 제거하였다. 기관 무게(g)당 주입시킨 투여량의 백분율을 여러 시점에서 측정하였다. 이 데이터는 표3에 요약되어 있다.

[표3]

랫¹내 IFN-con 및 lacIFN-con의 생물분포

⁵10cm의 십이지장내 방사능을 측정함.

다시, 햄스터 연구에서와 같이, lacIFN-con은 3-5분후에 간내에 신속히 축적되었고, 간내에 축적된 천연 IFN-con의 양은 lacIFN-con의 양과 비교하여 ⅓보다 덜 하였다(제 3도 및 제 4도 참조). 더욱이, 비장, 십이지장, 뇌 및 심장에서는 1% 투여량 보다 적게 축적되었으며 혈청내에서 발견된 lacIFN-con의 양은 천연 IFN-con양의 40%였다. 따라서, lacIFN-con의 시험관내 생물활성도가 더 낮다는 사실(실시예 1 참조)에도 불구하고, lacIFN이 간에서 특이하게 표적으로 되어 개량된 특정 간 질환 치료법을 제공할 것이라는 점에서 여전히 이롭다. 실시예 1의 시험관내 검정에 표식물로서 EMCV를 사용했으며 EMCV는 간 바이러스가 아니다.

[실시예 3]

이 실시예는 실시예 1에서 제조한 IFN-con 및 lacIFN-con을 사용하는 햄스터내 약력학 분석에 관한 것이다. IFN-con 및 lacIFN-con을, 수컷 시리안 골든 햄스터(85-130g)에 음경정맥을 통하여 300㎍/kg의 투여량으로 정맥내 투여하였다. 0.05, 0.17, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6 및 8시간에서 3마리의 상기 동물로 된 군을 희생시키고 심장천자에 의해 혈액시료(100㎕)를 모았다. 혈청 분리 시험관(벡톤 디킨슨)을 사용하여 혈청 시료를 수득하였다.

샌드위치형 ELISA 검정으로 혈청 시료를 분석하였다. 1차, 고정 항체(폴리클로날 토끼-유래 항-CIFN 항체) 및 2차 항체(마우스-유래 모노클로날 항-IFN IgGl)는 암젠에서 생성하였다. 토끼 폴리클로날항-IFN항체의 서로 다른 3개의 배치를 선별하였다. 검출 항체는 양고추냉이 과산화효소(뵈링거 만하임)와 결합된 염소-유래 항-마우스 IgFl 이었고, 혈청 시료내 CIFN 및 lac-CIFN의 농도를 결정하기 위해 3, 3', 5, 5' - 테트라메틸에틸에네디아민(TMB) 과산화효소 기질(뵈링거 만하임) 처리에 의한 색 현상을 이용하였다. 이 검정의 민감성은 칸센서스 인터페론 농도에 대해 0.156과 10ng/mL 사이에서 직선 상호관계를 갖는다.

천연 IFN-con과 락토스 결합 IFN-con 둘 다 항-IFN 항체에 결합할 수 있었으나 서로 다른 정도의 친화성을 갖는다. IFN-con이 모든 폴리클로날 항체에 대해 친화성을 갖는 것에 비해 LacIFN-con은 25%의 결합 친화성을 가지며, 0.156-2.0ng/mL 사이의 단백질 농도에 대해 직선 상호관계가 수득되었다. IFN-con 및 lacIFN-con은 유사한 이상성 청소율 기작을 나타냈으나 T½에서는 상당한 차이가 발견되지 않았다(제 5도 참조). 동일 투여량을 주입시켰을 때, 햄스터 혈청내 lacIFN-con 농도는 주입 3분 후에 IFN-con 농도의 약 50% 까지 빠르게 감소한 다음 8시간 동안 내내 대략 동일한 비율로 유지되었다. 두 단백질에 대한 초기 분포 반감기(알파-T½)는 둘 다 ~ 11분이었고 IFN-con 및 lacIFN-con에 대한 말단 청소율 반감기(베타-T½)는 각각 1.3 및 1.0 시간이었다. 그러나 IFN-con 및 lacIFN-con에 대한 곡선하 면적(area under the curve)(AUC)과 겉보기 분포부피(Vss)는 매우 상이하였다. IFN-con 및 lacIFN-con에 대한 AUC는 각각 1817 및 691 ng·hr/mL였고, Vss는 198 및 434 mL/kg이었다.

[실시예 4]

이 실시예에서는 2', 5'-올리고아데닐레이트 합성효소(2-5A 합성효소)의 혈장수준을 측정함으로써 햄스터내 IFN-con 및 lacIFN-con의 생체내 생물활성도를 결정하였다. 2-5A 합성효소는 그 수용체에 결합하는 인터페론의 직접 반응에 따라 생성된 효소이며 제1단계가 항바이러스성 활성도 기작일 것이라 여겨진다 ; Interferon, Principles and Medical Applications, 1st Edition (1992, Univ. of Texas Medical Branch of Galveston) pages 225-237 참조.

군 당 세 마리의 수컷 시리안 골든 햄스터(85-130g)에 300㎍/kg의 IFN-con 및 lacIFN-con을 음경정맥을 통하여 정맥내 투여하였다. 운반체 군에는 100㎕의 PBS를 투여하였다. 6, 12, 24, 48, 72 및 96시간에서 상기 동물을 희생시키고 심장천자에 의해 혈액시료를 수득하였다. Sawai 등의, Biomed, Res., 9 : 59-66(1988) 문헌에 기술되어 있는 방법을 이용하여 2-5A RIA 키트(일본 기타쿠에 소재하는 에이켄에서 구입)를 사용하여 혈청내 2-5A 합성효소 활성도를 검정하였다.

IFN-con 및 lacIFN-con을 정맥내 투여한 후 햄스터 혈청내에서 생성된 2-5A 합성효소를 비교하였다(제 6도 참조). 햄스터 운반체 군 및 0시간 군에서 최소량의 2-5A 합성효소 활성도가 발견되었는데, 이것은 이 주입과정이 햄스터의 매우 낮은 효소 생성 배경수준을 유도했음을 나타내는 것이다. IFN-con으로 처리했을 때 효소 활성도가 이상성 방식으로 상승됨을 발견하였다. 주입후 24시간에서 제1피크가 발견되었으며 효소활성도는 운반체 군의 효소 활성도 보다 7배 더 높았음이 발견되었다. 이 효소 활성도는 48시간에서 기본량 수준까지 감소되었고, 다시 72시간에서 운반체군의 효소 활성도보다 4배 더 높게 상승되었다. 96시간에서 효소 활성도는 기본량 수준까지 감소되었다.

lacIFN-con에 대한 효소 활성도는 48시간에서 훨씬 증가하여 96시간까지 계속되었다. 2-5A 합성효소의 활성도 상승은 48시간에서 운반체군의 효소 활성도보다 10배 더 높았다. 이 결과는, IFN-con과 lacIFN-con의 효소 생성 유형이 상이함을 나타내는데, 이것은 lacIFN-con이 IFN-con과 비교하여 매우 다른 항바이러스성 활성도를 자극할 것이며, 아마도 두 단백질의 상이한 생물분포 단면에 관한 것임을 암시한다.

[실시예 5]

이 실시예에서, 뇌심근염 바이러스(EMCV)와 함께 IFN-con 및 lacIFN-con을 주입한 햄스터를 항원투여시킨 다음 생존율을 비교함으로써 상기 두 단백질의 생체내 항바이러스성 활성도를 연구하였다.

군 당 10마리의 수컷 시리안-골든 햄스터(85-130g)에 10㎍/kg의 투여량으로 IFN-con 및 lacIFN-con을 복강내 주사하였다. 6시간 후 각 햄스터에 EMCV 100㎕(2E+4 pfu/mL)를 복강내 주사하였다. 이 동물들을 매일 2회 모니터하였고, 그 종점이 후제벽측부(hind quarter) 마비의 징후였다. 27일 동안 내내 생존한 햄스터가 바이러스로부터 보호되었음을 알 수 있다. 인터페론을 투여한 햄스터를 EMCV로 항원투여 시켰을 때, 이 항원투여 후 27일 동안 내내 관찰한 바와 같이 IFN-con은 상기 동물의 86%를 보호하였고 lacIFN-con은 57%를 보호하였다(제 7도 참조). 인터페론을 주입하지 않은 대조군 모두는 EMCV 항원투여 후 4시간 및 그 전에 죽었다.

Claims

말단 갈락토스를 포함하는 최소한 하나의 글리코실 리간드에 결합된 IFN-con으로 이루어 진 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 1항에 있어서, 상기 IFN-con은 IFN-con₁, IFN-con₂및 IFN-con₃으로 구성된 그룹 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 2항에 있어서, 상기 IFN-con이 IFN-con₁임을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 1항에 있어서, 상기 글리코실 리간드는 단당류, 이당류, 올리고당류, 다당류, 글리코펩티드 및 당단백질로 구성된 그룹 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 4항에 있어서, 상기 글리코실 리간드가 올리고당류임을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 5항에 있어서, 상기 올리고당류는 최소한 2개의 당 잔기를 가지고, 말단 갈락토스 잔기를 포함함을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 5항에 있어서, 상기 올리고당류가 락토스임을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 1항에 있어서, 4-7개의 글리코실 리간드가 상기 IFN-con에 결합됨을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 1항에 있어서, 상기 글리코실 리간드(들)은 리신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴과 같은 활성 아미노산 잔기(들)을 통하여 단백질 골격에 결합됨을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
제 1항에 있어서, 상기 글리코실 리간드(들)은 리신(들)의 ε-NH₂및 상기 IFN-con의 N-말단 아민을 통하여 상기 IFN-con에 직접 결합됨을 특징으로 하는 화학적으로 변형된 IFN-con.
IFN-con에 결합된 4-7개의 글리코실 리간드로 이루어 진 신생 글리코실화된 IFN-con의 실질적으로 균질한 제제와 제약학적으로 용인가능한 희석제, 보조제 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
신생글리코실화된 IFN-con의 실질적으로 균질한 제제.
제 1항의 화학적으로 변형된 IFN-con의 치료학적 유효량을 IFN-con으로 치료가능한 증상을 지닌 환자에게 투여함을 포함하는 상기 환자의 치료방법.
제 13항에 있어서, 상기 증상이 세포증식질환이나 바이러스성 질환임을 특징으로 하는 치료방법.
제 14항에 있어서, 바이러스성 질환이 간 질환임을 특징으로 하는 치료방법.
제 15항에 있어서, 상기 간 질환이 A형 간염, B형 간염, C형 간염 또는 델타 간염임을 특징으로 하는 치료방법.
제 16항에 있어서, 상기 간 질환이 C형 간염임을 특징으로 하는 치료방법.
화학적으로 변형된 인터페론을 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자의 간에 우선적으로 인터페론을 전달시키는 방법으로서, 상기 화학적으로 변형된 인터페론은 최소한 하나의 글리코실 리간드에 결합된 인터페론으로 이루어진 것이고, 상기 리간드는 말단 갈락토스를 포함하며, 상기 인터페론은 IFN-α, IFN-β 및 IFN-con으로 구성된 그룹 중에서 선택한, 환자의 간에 우선적으로 인터페론을 전달시키는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 인터페론이 IFN-α임을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 인터페론이 IFN-β임을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 인터페론이 IFN-con임을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 간 질환을 치료하기 위해 상기 화학적으로 변형된 인터페론의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여함을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 간 질환이 C형 간염임을 특징으로 하는 방법.