JPH03106900A

JPH03106900A - 糖鎖修飾ヒトインターフェロン集合体

Info

Publication number: JPH03106900A
Application number: JP1246163A
Authority: JP
Inventors: Jun Uchiumi; 潤内海; Shiyoujirou Yamazaki; 山崎　晶次郎; Yuichiro Sato; 雄一郎佐藤
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1989-09-20
Filing date: 1989-09-20
Publication date: 1991-05-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は医薬あるいは診断薬として利用し得る生理活性
を有する糖タンパク質に関する。

［従来の技術］近年、生体由来の生理活性を有する糖タンパク質を、医
薬あるいは診断薬として利用する試みがなされている。

この対象となる糖タンパク質を生産する手段としては、
該糖タンパク質を有する組織からの抽出のほか、該糖タ
ンパク質を産生ずる細胞の大量培養、あるいは該糖タン
パク質の遺伝子操作による組換え型タンパク質の大量生
産などが挙げられる。しかしながら、得られた糖タンパ
ク質の同一性として、アミノ酸組成分析に代表されるよ
うに、そのポリペプチド部分の構造によって、その生理
活性成分として特徴づけることが一般に行なわれており
、その生理活性発現の重要要素として、その糖鎖構造を
特徴づける報告は見当たらない。

しかし、最近、糖タンパク質の生理活性発現上、糖鎖が
重要な役割を果たしていることが明らかにされつつあり
、それらは、例えばタンパク質の安定化、代謝における
シグナル作用、細胞内局所のシグナル作用、およびレセ
プターや標的細胞に対する認識としてのシグナル作用な
どである（例えば、高崎誠一、細胞工学、Ｖｏｌ．５，
　ｐ４２７，　　１９８６，秀潤社）。このように、糖
タンパク質を医薬あるいは診断薬として有効かつ特異的
に利用するためには、糖鎖構造を目的にそって規定され
る要件も重要となってくる。

すなわち、糖鎖構造を修飾することにより、生理活性糖
タンパク質の医薬あるいは診断薬利用の際に問題となる
、該糖タンパク質の血中安定性を高めることや、シグナ
ル的作用を強調して標的細胞あるいは標的臓器への取り
込みを促進させること、また、本来付与された生理活性
を増大させることなどを解決し、さらには新たな生理活
性の付与なども期待することができる。

糖タンパク質糖鎖の体内における挙動に最も関与してい
るのは、糖鎖非還元末端のシアル酸（Ｎ一アセチルノイ
ラミン酸）であり、このシアル酸が除去されたアジアロ
化糖タンパク質は肝細胞に認識されて取り込まれ、血中
から速やかに消失することかすでにＡｓｈｗｅｌｌとＭ
ｏｒｅｌｌ　　（Ａｄｖ，　　ＥｎＢｍｄ．，４１，　
　９９．　　１９７４）によって報告されている。医薬
の体内における薬効は一般に有効血中濃度を維持するこ
とが重要であるため、従来のこの知見からの応用は、糖
タンパク質のアシアロ化を防いで肝での取り込みを抑制
し、体内循環における半減期を延長させようとする試み
であった。例えば、シアル酸を付与したり、肝細胞に認
識される糖鎖非還元末端のガラクトースを除去したイン
ターフェロン（特公昭５７−０２８５５７号公報）、ア
ミノ酸、ペプチド、糖タンパク質に結合させて体内循環
中での生物学的半減期を延長させるシアル酸誘導体（特
開昭６３−２９５６４１号公報）、あるいは糖鎖でシア
ル酸一ガラクトースーＮ−アセチルグルコサミンとなる
配列およびその製造法（特開昭６３−５０２７１６号公
報）などである。しかしながら、アシアロ化糖タンパク
質の肝親和性を積極的に生かして、生理活性糖タンパク
質の糖質を修飾して、その薬効を高める応用は試みられ
ていなかった。

［発明が解決しようとする課題］抗ウィルス作用、抗細胞増殖作用および免疫調節作用を
有する生理活性タンパク質であるヒトインターフェロン
（以下、■ＦＮと略す）は、α、β、γ型の３種存在し
、β型とγ型、および一部のα型ＩＦＮは糖鎖を有して
いる。これらのＴＦＮは、臨床的に抗ウィルス剤あるい
は抗悪性腫瘍剤として用いられているが、精製されたタ
ンパク質そのままの形で医薬として使われている。しか
しながら、体内でできるだけ分解されずに、速やかにＩ
ＦＮを治療対象とする疾患部位に有効に到達させる手法
の開発が最大の問題点として残っている。特に肝疾患の
治療領域にＩＦＮを有効に到達させる手法は、従来試み
られていなかった。

ＩＦＮを疾患部位に有効に到達させることは、該糖タン
パク質の医薬としての有効性を高めることのみならず、
投与量の低減化にもつながり、副作用の軽減などによる
安全性を向上させ、さらに疾病治療上の経済的負担の軽
減させる効果も期待できる。このことは、すなわち医薬
の臨床応用上抱えるこれらの問題点を解決することにつ
ながるものである。

本発明は、ＩＦＮを医薬として用いる際に、その糖鎖が
修飾されたＩＦＮを用いることにより、上記の問題点を
解決することを目的とする。

［課題を解決するための手段］上記目的は、以下の本発明により達成される。

すなわち本発明は、糖鎖を有し、かつその糖鎖の非還元
末端にシアル酸を含まないＩＦＮを８５％以上、望まし
くは９０％以上含む糖鎖修飾ＩＦＮ集合体である。ここ
でＩＦＮ集合体とは、ＩＦＮ分子の集合をいう。また糖
鎖の非還元末端とは、タンパク質に結合していない方の
末端のことをいう。

ＩＦＮは糖鎖を有するタンパク質分子であれば、α、β
、γ型を限定しないが、特にβ型が好ましい。またＩＦ
Ｎが有する糖鎖構造も、アスパラギン結合型糖鎖および
ムチン型糖鎖いずれにも限定されない。

本発明のＩＦＮを得る手段はいかなるものでもよいが、
例えば糖鎖を有するＩＦＮを産生ずる能力をもつ細胞に
より生産されたＩＦＮを、物理化学的または生化学的処
理によりシアル酸を除去すること、あるいはアシアロ体
を精製分離することで得られる。すなわち、ＩＦＮ生産
のための細胞は、ＩＦＮを自然産生ずるヒト線維芽細胞
などの真該細胞、あるいはウィルス、合成ポリマー、マ
イトージエン、発ガンプロモーター、レクチン、リポ多
糖類、カルシウムイオノフォアなどの刺激によってＩＦ
Ｎを産生ずるヒト線維芽細胞などの真該細胞が用いられ
る。また遺伝子操作においては、ＩＦＮの構造遺伝子を
組み込み、糖鎖を有するＴＦＮを生産できる微生物、昆
虫、動物細胞、例えば酵母、カイコの幼虫、夜盗蛾の幼
虫、マウス、ハムスター、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、
ウシ、サル、ヒトなどの細胞が用いられる。これら宿主
細胞の中では、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞が好ましく用いられる。さらに、噛乳動物初期胚
にＩＦＮ構造遺伝子を導入し、成獣として体内でＩＦＮ
を産生ずるようになったトランスジェニック動物の体液
中からでも、糖鎖を有するＩＦＮを得ることができる。

このようにして得られたＩＦＮを０．０１〜０，ＩＭ硫
酸、塩酸あるいはギ酸（ｐＨ１．０〜３．０）中で、６
０〜８０℃、１〜６時間処理することにより、その糖鎖
非還元末端のシアル酸を除去することができる。あるい
は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．，　Ｖｉｂｒｉ
ｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐ
ｅｒｆｒｉｎｇｅｎＳまたはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
　Ｕｒｅａｆａｃｉｅｎ＋＋などの細菌由来のシアリダ
ーゼ（ノイラミニダーゼ）を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４〜６）あるいは５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７〜８
）中で、３７℃、１〜４時間作用させることにより、同
様に糖鎖非還元末端のシアル酸を除去することができる
。こうして、シアル酸を除去（アシアロ化）したＩＦＮ
の分子を８５％含むＩＦＮ集合体を得ることができる。

このほか遺伝子操作法においては、シアル酸合成能を欠
いた宿主細胞（例えば、ハムスター卵巣細胞のシアル酸
転移酵素欠損株）を用いて最初からアシアロ化ＩＦＮを
作製する方法、また糖タンパク質の精製法として、糖鎖
を有するＩＦＨの中からイオン交換クロマトグラフィー
や等電点電気泳動、レクチンク口マトグラフィーを用い
てアシアロ化ＩＦＮのみを分離する方法などによっても
該ＩＦＮを得ることができる。これらの方法の中でも、
シアリダーゼを用いる方法が好ましい。

アシアロ化ＩＦＮは、上述の酸加水分解あるいはシアリ
ダーゼ処理を施さないで精製分離したＩＦＮ標品にも天
然に存在することが知られ、その含量は２０〜５０％で
ある（Ｕｔｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｔ．，（１９８９）　Ｅ
ｕｒ，　　Ｊ，　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　　１８１，　
５４５）。本発明における糖鎖修飾ヒトインターフェロ
ンに含まれるアシアロ化ＩＦＮはこれより多く、ＩＦＮ
分子の８５％以上、望ましくは９０％以上がアシアロ体
である。

本発明の糖鎖修飾ＩＦＮ組成物は、ＩＦＮが有効とされ
る疾病の中で、特に肝疾患に対して利用できる。すなわ
ち、ウィルス性肝炎、肝ガンなどである。本発明のアシ
アロ化ＩＦＮを含む該組或物は、肝におけるアシアロ化
タンパク質に対するレセプターに対して親和性を持つた
め、肝への移行性が高く、少ない投与量で有効に肝に到
達することが期待できる。

本発明の糖鎖修飾ＩＦＮは、精製後、タンパク質製剤と
してそのまま粉末として、また薬理学的に許容され得る
担体、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射薬
、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏）として、ヒトなどの
噛乳動物に対して非経口的あるいは経口的に安全に投与
できる。

このように、本発明の糖鎖修飾ＩＦＮは天然型ＩＦＮが
有効である。主として肝疾患の治療領域に、新規で有用
な製剤として提供することができる。

［実　施　例］以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ヒト線維芽細胞を１０％牛胎児血清′を含むイーグルＭ
ＥＭ培地で培養し、十分に増殖して単層を形成した後、
ポリＩ：ポリＣ　　１０μｇ／ｍｌ，シクロヘキシイミ
ド　４μｇ　／　ｍｌおよびアクチノマイシンＤ　５μ
ｇ　／　ｍｌで処理し、ｒＦＮを誘発した。誘発２日目
の培養上清には、ＩＦＮ一β換算で２０，ＯＯＯＩＵ　
（国際単位）／ｍｌのＩＦＮ活性が産生されていた。こ
の培養上清４０ｌを２０ｍｌ“ブルーセファロース”　
（ファルマシア／ＬＫＢ社）に流し、ＩＭ塩化ナトリウ
ムと３０％エチレングリコール（ＥＧ）を含むリン酸緩
衝液（ｐＨ　７　．　　４　）　２　０　０　ｍｌでカ
ラムを洗浄した後、ＩＭ塩化ナトリウムと６０％ＥＧを
含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４０ｍｌでＩＦＮ−β
を溶出した。

次に、この活性画分を４　ｍｌ抗ヒトＩＦＮ一β抗体（
ＹＳＢ−１）カラムに流し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ７．４）４０ｍｌで洗浄後、１５ｍＭ塩酸（ｐＨ２．
０）１２ｍｌで溶出した。さらに、コノ塩酸溶出画分を
“Ｃｏｓｍｏａｉｌ　５Ｃ１８−３００”カラム（８Ｘ
２５０ｍｍ、ナカライ・テスク社）にかけ、０．１％ト
リフルオ口酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２．Ｏ）存在下、Ｏ〜
７０％アセトニトリルの濃度勾配によりタンパク質を溶
出した。ＩＦＮ一βは約５０％アセトニトリル濃度で２
．５ｍｌで溶出された。

精製されたＩＦＮ−βは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量２
３，０００のほぼ均一なバンドとして検出され、そのア
ミノ酸分析から１６６個のアミノ酸からなるポリペプチ
ド鎖およびその糖組成分析からフコース：マンノース：
ガラクトース二Ｎーアセチルグルコサミン二Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸＝↓．２：３．Ｏ：２．２：４．６：１
．Ｏからなる糖鎖から構戊されていることがわかった。

次に、この精製ＩＦＮ−β　１．Ｏｍｇを２　ｍｌの２
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、これに＾ｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ＩＪｒｅａｌａｃｉｅｎｓ由来
のノイラミニダーゼ（ナカライ・テスク社）０．５単位
を加え、３７℃で３時間処理した。続いて反応溶液を２
０ｍｌ“セファデックスＧ−２５”　（ファルマシア／
ＬＫＢ社）に流し、遊離のＮ−アセチルノイラミン酸を
除去して生成物を得た。この生成物の糖組成を分析した
ところ、Ｎ−アセチルノイラミン酸含量は反応前に比べ
約９５％減少しており、アシアロ体となっていることが
わかった。

このアシアロ化ＩＦＮ−βを、全量“ＺｏｒｂａｘＰｒ
ｏｌＯ”カラム（４．　　６　Ｘ　２　５　０ｍｍ、Ｄ
ｕ　Ｐｏｎｔ）にかけ、０．１％ＴＦＡ　（ｐＨ２．０
）存在下、Ｏ〜７０％アセトニトリルの濃度勾配により
ＩＦＮ一βを溶出した。このＩＦＮ一β溶出画分を減圧
濃縮し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＴＩ４．５）で２ｍｌ
とし、これにヒト血清トランスフエリン１■を加え、３
７℃、４時間処理した後、この反応液の遊離シアル酸量
をＨｏｎｄａらの方法（Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
　　１６０，　４５５．　　１９８７）で測定したが検
出限界以下であり、精製後のアシアロ化ＩＦＮ画分には
ノイラミニダーゼ活性は含まれないことがわかった。

アシアロ化ＩＦＮ−βと無処理ＩＦＮ−βの投与後の体
内分布を調べるために、ウサギ（２．５〜３．　　０ｋ
ｇ）　３匹ずつに、それぞれ２００万ＩＵ／ｋｇで右耳
介静脈より単回投与し、１５分目に各組織を摘出し、１
０％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ中でホモジナイズ
して得られた上清のＩＦＮ活性を測定した。

表１に各組織１ｇ中に含まれるＩＦＮ活性の投与量あた
りの分布量（％）を、ウサギ３匹の平均値で示した（Ｎ
．Ｄ，は測定限界以下）。

表１その結果、アシアロ体では無処理例に比べ、肝への分布
が４．４倍も高く、肝への移行性の高いことが明らかと
なった。

なお、本実施例におけるＩＦＮ活性は、ヒトＦＬ細胞と
水泡性口炎ウィルス（Ｖ　Ｓ　Ｖ）を用いたＣＰＥ阻止
法（Ｊ，Ａ，　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　（１９８１）　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｘ７ｍｏｌ．，　　７８，　　
３８１）で測定した。

実施例２ＩＦＮ−β構造遺伝子をＤＨＦＲベクター（Ｙ．　Ｃｈ
ｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，　ＤＮＡ，　３
，　２９７．　１９８４）に組み込み、リン酸カルシウ
ム法でチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（
前記と同誌）に感染させた。この組換えＣＨＯ細胞を２
．５％牛胎児血清を含むアルファＭＥＭ培地で培養し、
３日毎に培養液を交換して、その培養土清３５ｌを得た
。この培養上清にはＩＦＮ一β換算で２２，０　０　０
　Ｉ　Ｕ／ｍｌのＩＦＮ活性が含まれていた。この培養
上清から実施例１に記載した精製法でＩＦＮ一βを精製
した。精製されたＩＦＮ一βはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子
量２３，０００のほぼ均一なバンドとして検出され、そ
のアミノ酸分析から１６６個のアミノ酸からなるポリペ
プチド鎖、およびその糖組成分析からフコース：マンノ
ース：ガラクトース二Ｎ−アセチルグルコサミン二Ｎ−
アセチルノイラミン酸＝１．１：３．Ｏ：２．４：４．
８：１．３からなる糖鎖から構成されていることがわか
った。

次に、この精製ＩＦＮ一β　１．０■を材料として、実
施例ｌに記載した方法によってアシアロ体を調製し、さ
らに実施例１と同様の実験条件でウサギ各組織への分布
量を調べた。

表２に各組織１ｇ中に含まれるＩＦＮ活性の投与量あた
りの分布量（％）を、ウサギ３匹の平均値で示した（Ｎ
，　Ｄ，は測定限界以下）。

（以下・，余白）表２肝疾患に対してより有効であり、かつ投与量を低減させ
ることができる。この結果、薬効の増強、副作用の軽減
、治療費の低減化などに寄与する新規で有用なＩＦＮ製
剤と１７で提供することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）糖鎖を有し、かつ該糖鎖の非還元末端にシアル酸
を含まないヒトインターフェロンを８５％以上含む糖鎖
修飾ヒトインターフェロン集合体。
（２）ヒトインターフェロンが化学構造的かつ免疫学的
にβ型である請求項（１）記載の糖鎖修飾ヒトインター
フェロン集合体。
（３）ヒトインターフェロンがヒト線維芽細胞が産生す
るものである請求項（１）または（２）記載の糖鎖修飾
ヒトインターフェロン集合体。
（４）ヒトインターフェロンがチャイニーズ・ハムスタ
ー卵巣細胞を宿主として遺伝子組換え技術により製造さ
れるものである請求項（１）または２記載の糖鎖修飾ヒ
トインターフェロン集合体。