JP2002543141A

JP2002543141A - アシアロサイトカインおよび肝臓疾患の治療

Info

Publication number: JP2002543141A
Application number: JP2000615021A
Authority: JP
Inventors: タカハシヒロシ
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2002-12-17
Also published as: EP1173189A1; EP1173189A4; US6296844B1; WO2000066137A1; CA2372946A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アシアロサイトカイン（たとえば、アシアロインターフェロン）を投与することによって、肝臓疾患（たとえば、ウイルス性肝炎）を治療するための方法を特徴とする。本発明はさらに、糖タンパク質の標的を肝細胞とする方法、およびアシアロサイトカインを含有する組成物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本出願は、現在放棄された１９９５年９月２７日出願の米国特許仮出願第６０
／００４３５７号からの優先権を主張する、現在係属中の１９９６年９月２７日
に出願された米国特許出願第０８／７２１８２８号の一部継続出願である。

【０００２】（連邦出資研究に関する声明）本発明は、米国国立医療研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆＨｅａｌｔｈ）によって授与されたＣＡ５７５８４およびＮＩＤＤＫ４３
３１のもとで、米国政府の後援で行われた。米国政府は、本発明において一定の
権利を有する。

【０００３】（発明の背景）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、世界的な健康上の問題である。この感染
は、不顕性感染から致命的な肝細胞疾患まで広範囲の病状を引き起こす（Ｔｉｏ
ｌｌａｉｓ等、Ｎａｔｕｒｅ３１７、４８９、１９８５年）。ＨＢＶビリオン
は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を持つエンベロープ、およびヌクレオカプ
シドからなる。このヌクレオカプシドは、ＲＮＡ中間体を経て複製する環状部分
２本鎖の３．２ｋｂＤＮＡを包んでいる。ヌクレオカプシドは、Ｂ型肝炎コア抗
原によって形成される。血液中にビリオンが存在するとき、ヌクレオカプシドに
関連するさらなる可溶性抗原、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）が、一般に血清中
に検出される。いくつかの研究は、ＨＢＶが直接に肝細胞変性するのではなく、
感染した肝細胞の表面に存在するウイルス抗原に対する宿主免疫応答が、病因に
おいて重要な役割を果たしている可能性があることを示唆している（Ｍｏｎｄｅ
ｌｌｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９、２７７３、１９８２年、Ｍｏｎｄｅｌ
ｌｉ等、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１１２、４８９、１９８８
年、Ｃｈｉｓａｒｉ等、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．６、３１１、１９８９年
）。

【０００４】Ｂ型肝炎に関する適切な動物モデルの不足が、肝細胞死およびウイルスクリア
ランスの原因である分子機構の理解を妨げてきた（Ｏｃｈｉｙａ等、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６、１８７５、１９８９年、Ｇｒｉｐ
ｏｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、４１３６、１９８８年）。ＨＢＶ感染の病因を
調査するために、生殖系列遺伝子導入マウスモデルが作られてきたが、これらの
動物は免疫的にＨＢＶ抗原に耐性であり、自然発生的には肝炎を発症しない（Ｍ
ｏｒｉｙａｍａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８、３６１、１９９０年）。たとえば
、同系の動物においてＨＢＶタンパク質でリンパ球をプライミングし、そのプラ
イム細胞をｉｎｖｉｖｏで養子移植することを含む、複雑な複数段階の方法に
よって、これらの動物に肝炎を導入しなければならない（Ｍｏｒｉｙａｍａ等、
前出、Ａｎｄｏ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８、１５４１、１９９３年）。

【０００５】（発明の概要）本発明は、アシアロインターフェロン−β（アシアロＩＦＮ−β）が肝細胞に
おいてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製を有効に阻害するという発見に、部分
的に基づくものである。驚いたことに、達成された阻害レベルは天然インターフ
ェロン−βで得られたものより高く、アシアロインターフェロン−βは肝細胞で
のウイルス複製の阻害に関して天然インターフェロン−βに比べて有効でないと
いうこれまでの理解に反する結果であった。

【０００６】したがって、本発明は、治療用量のアシアロインターフェロン（たとえば、ア
シアロＩＦＮ−アルファ、アシアロＩＦＮ−β、またはアシアロＩＦＮ−ガンマ
）を含む組成物を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物（たとえば、ヒト
）においてウイルス性肝炎を治療する方法を特徴とする。この方法は任意選択で
、その哺乳動物がウイルス性肝炎、たとえば、Ｂ型肝炎ウイルス感染、またはＣ
型肝炎ウイルス感染に起因する肝炎を有していることを確認する段階を含む。

【０００７】任意の確認段階は、哺乳動物の肝炎ウイルス複製のレベルを測定する段階を含
むことができる。ウイルス複製のレベルは、肝炎ウイルス特異性ポリメラーゼ連
鎖反応を含む当分野でよく知られている任意の方法によって、または哺乳動物の
体液（たとえば、血液）中の肝炎ウイルス抗原（Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原）を検
出することによって測定できる。

【０００８】この組成物は、皮下、筋肉内、動脈内、または静脈内を含む、任意の適切な経
路で投与することができる。さらに、治療用量はおよそ、たとえば０．０２から
２００ｉｇ／ｋｇ（体重）／日、３０から７５ｉｇ／ｋｇ（体重）／日、あるい
は１００００から２０００００ＩＵ／ｋｇ（体重）／日であることができる。

【０００９】この組成物はさらに、デキストロース、アルブミン、塩化ナトリウム、リン酸
ナトリウム、または水などの、薬剤として許容される賦形剤を含むことができる
。

【００１０】他の態様において、本発明は、糖タンパク質からシアル酸残基を除去すること
によって生成されたアシアロ糖タンパク質を提供し、そのアシアロ糖タンパク質
を肝細胞と接触させることによって、糖タンパク質の標的を肝細胞とする方法を
特徴とする。このようにして肝細胞を標的とすることのできる糖タンパク質の中
には、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−
９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、エリトロ
ポイエチン、線維芽細胞増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ）、ガンマインターフェロン、腫瘍壊死因子−β、白血病抑制因子、
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、マクロファージ遊走阻止因子
、神経発育因子、オステオスタチン（ｏｓｔｅｏｓｔａｔｉｎ）Ｍ、血小板由来
成長因子、幹細胞増殖因子、トロンボポイエチン、血管内皮増殖因子、または肝
細胞増殖因子がある。標的とされる肝細胞は肝臓の内部にあることができ、その
肝臓は哺乳動物（たとえば、ヒト）の内部にあることができる。アシアロ糖タン
パク質は、哺乳動物へのアシアロ糖タンパク質の静脈内、動脈内、皮下、または
筋肉内注射によって、肝細胞と接触させることができる。

【００１１】本発明はさらに、糖タンパク質からシアル酸残基を除去することによって生成
されたアシアロ糖タンパク質を含む組成物を特徴とし、この糖タンパク質は、イ
ンターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ
−１５、エリトロポイエチン、線維芽細胞増殖因子、顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ガンマインターフェロン、腫瘍壊死因子−β、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、
マクロファージ遊走阻止因子、神経発育因子、オステオスタチンＭ、血小板由来
成長因子、幹細胞増殖因子、トロンボポイエチン、血管内皮増殖因子、または肝
細胞増殖因子である。本発明はさらに、アシアロ糖タンパク質を薬剤として許容
される担体と混合することによって、薬剤、たとえば肝臓疾患（たとえば、肝炎
）を治療するための薬剤を調製する方法を特徴とする。この組成物はさらに、薬
剤として許容される賦形剤を含むことができる。

【００１２】本発明の方法および組成物は、ウイルス性肝炎を治療するために、ＩＦＮの送
達を含め、アシアロ形で糖タンパク質を肝細胞に送達するために用いることがで
きる。これらのアシアロ糖タンパク質は患者に投与されたとき、天然糖タンパク
質に比べて肝臓内でより高い特定の活性を有することが期待される。特定の疾患
を治療するために、他の糖タンパク質サイトカインを使用することもよく知られ
ている。たとえば、アシアロＩＬ−１は貧血の治療のために用いることができ、
アシアロＩＬ−３、アシアロＩＬ−６、およびアシアロエリトロポイエチンも同
様に用いることができる。アシアロＩＬ−７、およびアシアロＩＬ−１０は、Ｔ
細胞の増殖、および分化を促進するために用いることができる。アシアロＩＬ１
２は、ナチュラルキラー細胞を活性化するために用いることができる。アシアロ
ＧＭ−ＣＳＦ、およびアシアロＧ−ＣＳＦは、マクロファージを活性化し、増殖
するために用いることができる。

【００１３】さらにアシアロＩＬ−１は、劇症、または亜急性肝炎を治療するために用いる
ことができる。アシアロＩＬ−３は、汎血球減少症を治療するために用いること
ができる。アシアロＩＬ−６は、劇症肝炎、または慢性活動性肝炎の急性増悪を
治療するために、または宿主防御のための急性期反応物質を生成するために用い
ることができる。アシアロＩＬ−１０は、自己免疫性肝炎、または原発性胆汁性
肝硬変の治療のために用いることができる。アシアロＩＬ−１２は、肝細胞癌、
肝転移性腫瘍、ＨＢＶ感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、エイズ、または寄生虫感染
を治療するために用いることができる。アシアロＧＭ−ＣＳＦは、悪性腫瘍、ま
たは白血病を治療するために用いることができる。肝細胞増殖因子は、肝硬変、
肝線維症、または慢性肝炎を治療するために用いることができる。

【００１４】したがって、本発明はさらに、糖タンパク質（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２
、またはエリトロポイエチン）からシアル酸残基を除去することによって生成さ
れたアシアロ糖タンパク質であるアシアロ糖タンパク質を治療用量有する組成物
を提供し、その組成物を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において貧
血を治療する方法を含む。

【００１５】本発明はさらに、糖タンパク質（たとえば、ＩＬ−７、またはＩＬ−１０）か
らシアル酸残基を除去することによって生成されたアシアロ糖タンパク質を提供
し、Ｔ細胞をそのアシアロ糖タンパク質と接触させることによって、Ｔ細胞の増
殖、または分化を促進する方法を含む。このＴ細胞は、哺乳動物の内部にあるこ
とができ、接触段階は、アシアロ糖タンパク質を含む組成物を哺乳動物に投与す
る段階を含むことができる。

【００１６】本発明はさらに、糖タンパク質（たとえば、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＭ−ＣＳＦ
）からシアル酸残基を除去することによって生成されたアシアロ糖タンパク質を
提供し、マクロファージをそのアシアロ糖タンパク質と接触させることによって
、マクロファージの増殖、または分化を促進する方法を含む。このマクロファー
ジは、哺乳動物の内部にあることができ、接触段階は、アシアロ糖タンパク質を
含む組成物を哺乳動物に投与する段階を含むことができる。

【００１７】さらに他の態様において、本発明は、糖タンパク質からシアル酸残基を除去す
ることによって生成されたアシアロ糖タンパク質（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−
６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、または肝細胞増殖因子）を提供し、治療用量のア
シアロ糖タンパク質を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物（たとえば、
ヒト）において肝炎を治療する方法を含む。

【００１８】（発明の詳細な説明）本発明は、ウイルス性肝炎を治療するためのアシアロインターフェロン−βの
使用に関する。アシアロインターフェロン−βは、肝細胞上のアシアロ糖タンパ
ク質受容体が優勢のためにウイルス性肝炎治療において、天然のインターフェロ
ン−βよりも効果的であると考えられている。

【００１９】

【化１】

【００２０】の糖質鎖は、伸張コンフォメーションを有し、

【００２１】

【化２】

【００２２】（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４
：１１８１３１〜１１８１８，１９９７）と相互作用するＩＦＮ−βの部分から
少し離れた距離でＩＦＮ−βに結合することから、

【００２３】

【化３】

【００２４】は、アシアロ糖タンパク質受容体とＩＦＮ受容体とに同時に関係することができ
る。これは、アシアロ糖タンパク質受容体に結合するアシアロ−ＩＮＦ−β部が
、伸張コンフォメーションを有する糖質鎖の末端に位置し、したがって

【００２５】

【化４】

【００２６】に結合するアシアロ−ＩＦＮ−β部から空間的に離れているからである。したが
って、アシアロ−ＩＦＮ−β分子におけるアシアロ糖質部は、アシアロ−ＩＦＮ
−βの

【００２７】

【化５】

【００２８】への結合を妨害しないと考えられる。

【００２９】さらに、アシアロ糖タンパク質受容体にアシアロ−ＩＦＮ−βが結合すると、

【００３０】

【化６】

【００３１】の近傍におけるアシアロ−ＩＦＮ−βの濃度が増加し、それにより

【００３２】

【化７】

【００３３】に対する結合および

【００３４】

【化８】

【００３５】のシグナル経路の活性化が促進すると考えられる。別途に、

【００３６】

【化９】

【００３７】は、最初、二触角型ガラクトース末端オリゴ糖に関して約１０^-6、三触角型ガラ
クトース末端オリゴ糖に関しては約１０^-8から１０^-9の解離定数（Ｋｄ）を有す
る低アフィニティー受容体であるＡＳＧＰ受容体（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５８：１９９−２０２，１９８３）に結合する可能性がある。アシ
アロ糖タンパク質受容体に結合した二触角型アシアロ−ＩＦＮ−βは、高アフィ
ニティー（Ｋｄ＝１０^-10から１０^-12）を有する

【００３８】

【化１０】

【００３９】に容易に移動し得る。斯様に、三触角型複合体よりもむしろ主に二触角型複合体
のから成るアシアロ−ＩＦＮ−β複合体を投与することが望ましいと考えられる
。

【００４０】ここに記載されたヒト線維芽細胞において生成されたヒトアシアロ−ＩＦＮ−
βは、約８２％の二触角型ガラクトース−末端オリゴ糖、および約１８％の三触
角型ガラクトース−末端オリゴ糖を含有する。二触角型複合体の高比率または低
比率を有するＩＮＦ−βを作成するための種々の方法が知られている。例えば、
線維芽細胞にて産生されたＩＦＮは、ＣＨＯ細胞にて産生されたＩＦＮよりも高
比率の二触角型複合体を有する。

【００４１】ＩＦＮ受容体結合は

【００４２】

【化１１】

【００４３】および

【００４４】

【化１２】

【００４５】にとりそれらの抗ウィルス活性を誘導するために必須である。これらのＩＦＮｓ
による細胞表面受容体の活性化には、受容体の内在化を必要としないが、それら
の細胞内受容体に対する

【００４６】

【化１３】

【００４７】または

【００４８】

【化１４】

【００４９】の結合により、ＩＦＮシグナル化が誘発され得る。例えば、

【００５０】

【化１５】

【００５１】または

【００５２】

【化１６】

【００５３】は、活性を発現するために細胞表面に到達する必要がないように思われる。さら
に、リポソーム類に取り込まれた

【００５４】

【化１７】

【００５５】は、恐らくこのサイトカインの細胞内区画への送達のために、

【００５６】

【化１８】

【００５７】よりもかなり大きな活性を生みだすことができる。したがって、

【００５８】

【化１９】

【００５９】は、ＩＦＮ受容体の細胞内貯蔵を活性化する能力により、天然のＩＦＮ−βより
も活性であり得る。

【００６０】肝細胞に対する標的薬剤（例えば、ポリペプチド薬）に係る以前の方法は、ア
シアロ糖タンパク質受容体に結合する部分に薬剤を共役させることを含んでいた
。例えば、ＷＯ第９５／１８６３６号；ＷＯ第９１／２２３１０号；およびＮｉ
ｓｈｉｋａｗａら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ
．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２２：５０２−５０３，１９９５を参
照されたい。これらの方法は、最終薬剤分子のサイズを実質的に増大させる可能
性がある。対照的に、シアル酸の除去によるアシアロ−ＩＦＮの調製は、ＩＦＮ
分子のサイズを減少させ、それによりインビボ肝臓組織に浸透するＩＦＮ能を増
加させる。これは、血液と肝実質との間の物質交換が、円形窓または細穴を含む
アシヌソイズ（Ａｓｉｎｕｓｏｉｄｓ）＠と呼ばれる特殊化されたキャピラリ類
で行なわれるからである。窓の直径は、８０ｎｍから１５０ｎｍの範囲である。
斯様に、作用態様が肝臓への通過を要する薬剤分子は、この窓よりも小さな一般
的直径を有する必要がある。

【００６１】肝細胞に対する標的タンパク質の以前の方法は、天然のアシアロ糖タンパク質
に対するタンパク質の化学共役を伴っていた。しかしながら、大きな多量体高分
子は窓を通過できないため、その形成は、インビボ肝臓への接近可能性を制限す
ると思われる。ここに定義され、記載されるアシアロ−ＩＦＮｓは、ノイラミニ
ダーゼを用いてグリコシル化ＩＦＮｓからシアル酸類を除去することにより調製
されることから、この糖質側鎖の修飾は、ＩＦＮｓの分子サイズを増加させず、
したがって肝臓の肝細胞へのＩＦＮ接近を可能にする。ここに定義するように、
アシアロ糖タンパク質（例えば、アシアロ−ＩＦＮ−βなどのアシアロＩＦＮ）
は、末端シアル酸残基の無い少なくともＮ結合またはＯ結合糖質基を有するタン
パク質である。

【００６２】下記の実施例は、ヒト肝炎ウィルスのＤＮＡをマウス肝細胞に形質移入するこ
とにより生み出されたウィルス性肝炎の好適な小動物モデルを確立する。

【００６３】ウィルス性肝炎のラットモデルの作成クローン化ＨＢＶ（ｐＨＢＶ−ＨＴＤ）、ａｄｗサブタイプの頭−尾ホモダイ
マーが構築され、Ｂｌｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１８３６，１９９１お
よびＢｌｕｍら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１４：５６，１９９１に記載される
とおり、ｐＧＥＭ−７２ｆ（＋）ベクター（プロメガ、マジソンＷＩ）のＥｃｏ
ＲＩ部位に挿入された。（ａｄｗサブタイプのクローン化は、Ｖａｌｅｎｚｕｅ
ｌａらの動物ウィルス遺伝学「Ｂ型肝炎ウィルスゲノムのヌクレオチド配列およ
び主要ウィルス遺伝子の同定」、Ｆｉｅｌｄｓら編集、アカデミィックプレス、
ニューヨーク、１９８０年、５７頁）に記載されている。幾つかの例では、ｐＨ
ＢＶ−ＨＴＤと同様の複製能のあるＨＢＶ構築体であるＨＢＶの頭−尾ヘテロダ
イマー、ａｄｗＲ９が、形質移入に使用された（Ｂｌｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６５：１８３６，１９９１およびＢｌｕｍら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１４：
５６，１９９１）。

【００６４】肝切除術がＨＢＶトランス遺伝子の発現を増加させることから、インビボ形質
移入の２４時間前に、２／３の肝切除術をＨｉｇｇｉｎｓ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ法
（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．１２：１８６，１９３１）に
従って実施した。クローン化ＨＢＶ構築体は、膜融合促進カチオン性脂質、ジオ
クタデシルアミドグリシルスペルミン（Ｂｅｈｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６９８２，１９８９）を用いることによりイン
ビボラット肝臓に直接送達された。５０μｇのｐＨＢＶ−ＨＴＤまたはｐＧＥＭ
−７Ｚｆ（＋）ベクターを、５００ｉｌの無菌生理食塩水（０．１５４ＭＮａ
Ｃｌ）中の２５０ｉｇカチオン性脂質と混合し、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合化
させた。動物をエーテルで麻酔し、動物の門脈を止血用鉗子により一時的に結紮
し、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を肝臓の右中葉に注射した。

【００６５】上記の方法に加えて、２０ｉｇのｐＨＢＶ−ＨＴＤ（または他の選ばれたＤＮ
Ａ分子）を、５０ｉｇアシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジンおよび２５０ｉ
ｇＨＢＳＳ中の１００ｉｇカチオン性リポソームと複合体にし、上記のように注
射することができる。

【００６６】ラット組織におけるＨＢＶＲＮＡ形質移入されたラットにおけるＨＢＶの発現を調べるために、全ＲＮＡを、ｐ
ＨＢＶ−ＨＴＤによるインビボ形質移入３日後に殺処理したラットの選択された
組織から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した（Ｃｈｅｌｌｙら、Ｎａｔｕｒｅ
３３３：８５９，１９９８）。ＨＢＶ転写体の６５９−ｂｐＰＣＲフラグメ
ントが、肝臓において検出され、他の組織では検出されなかった。本実験におい
て、ｐＨＢＶ−ＨＴＤを形質移入したＨｕｂ−７肝細胞癌細胞系から分離された
全ＲＮＡを、ポジティブコントロールとして用いた。

【００６７】ＨＢＶ発現レベルは以下のごとく測定された。ｐＨＢＶ−ＨＴＤにより形質移
入されたラットからの肝臓、心臓、肺、腎臓、腸管および脾臓から全ＲＮＡを抽
出し、ＲＮａｓｅの無いＤＮａｓｅＩ（ＲＮＡの２単位／ｉｇ）により３７ＥＣ
で３０分間消化した。ｃＤＮＡｓを、全ＲＮＡの２ｉｇを含む混合物において逆
転写酵素（ＢＲＬ）を用いてアンチセンスプライマー類の伸張により合成した。
ＣＤＮＡのＰＣＲは、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂および各プライマーの１００ｐｍ
ｏｌを含有する１００ｉｌの最終容量で実施した。増幅サイクルは、９５ＥＣで
３０秒、５０ＥＣで１分、７２ＥＣで１分であった。３５サイクル後、ＰＣＲ生
成物を、１．５％アガロースゲルの電気泳動により分離し、ハイボンド（Ｈｙｂ
ｏｎｄ）−Ｎ＋ナイロン膜（アマーシャム）に移した。サザンブロットは、³²Ｐ
−標識ＨＢＶ−特異的制限フラグメント（ｐＨＢＶ−ＨＴＤのＡａｔＩＩフラグ
メント；３２２１ｂｐ）により混成した。増幅に使用されたプライマー類は、Ｈ
ＢＶのＳオープンリーディングフレーム内に位置した（センスプライマー、５′
−ＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡ−３′（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１）；アンチセンスプライマー、５′−ＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴ
ＣＴＧＣＧＧＴＡＴＴＧＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＧ−３′（ＳＥＱＩＤＮＯ
：２）、それらは６５９−ｂｐフラグメントを生成した。８３８−ｂｐフラグメ
ントを増幅したａ−アクチンプライマー類をとして用いた：コントロール（セン
スプライマー、５′−ＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡ
ＧＣＴＧＣＧ−３′；ＳＥＱＩＤＮＯ：３）；アンチセンスプライマー、５
′−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３
′；ＳＥＱＩＤＮＯ：４）。インビトロｐＨＢＶ−ＨＴＤ（Ｂｌｕｍら、Ｈ
ｅｐａｔｏｌｏｇｙ１４：５６，１９９１）により形質移入したヒト肝細胞
癌細胞系（Ｈｕｈ−７）から得られた全ＲＮＡを、ＨＢＶＲＮＡの検出用ポジ
ティブコントロールとして用いた。

【００６８】ラット血清におけるＨＢＶビリオン血清中のＨＢＶビリオンの存在は、ラット血清のＤＮａｓｅＩ処理およびＨＢ
Ｖビリオン類と抗ＨＢｓＡｇ共役ビーズとの免疫沈降反応後のＰＣＲによるＨＢ
ＶＤＮＡを検出することにより評価した。１８匹から２１匹のラットにおける
ビリオン類に関して血清は陽性であった。血清中に検出されたＨＢＶ量は、サザ
ン分析より検出されたＰＣＲ増幅可能な物質の増加により評価されるとおり、形
質移入後、最初の３日間増加し、次いで急速に減少し、形質移入後１４日目には
もはや検出できなかった。

【００６９】ＨＢＶビリオン血清は、以下のとおり測定された。最初に血清を１ｍｌにつき
２０単位のＤＮａｓｅＩ（ベーリンガーマンハイム）により３７ＥＣで３０分間
処理し、ｐＨＢＶ−ＨＴＤプラスミドなどの裸のＤＮＡｓを消化した。次いで、
アズラクトン−アクリルアミドコポリマービーズ（ピアース）に共役したマウス
抗ＨＢｓＡｇ抗体（５Ｄ３モノクローナル抗体）（Ｔａｎａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１１２：９１，１９９８）を用いることにより、
ＨＢＶ粒子を血清から免疫沈降した。完全ＨＢＶビリオンは、２本鎖３．２ｋｂ
ＨＢＶＤＮＡを含有し、そのエンベロープにＨＢｓＡｇを担持していることか
ら、ＨＢＶはこれらの抗体共役ビーズにより免疫沈降する。さらに洗浄後、９５
ＥＣで５分間加熱することによりＨＢＶＤＮＡをビーズから遊離させ、上記の
同一プライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、サザン分析におけるＨＢＶプロー
ブに混成させて、ＰＣＲ生成物の特異性を確認した（Ｌｉａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１３６７，１９８９）。

【００７０】他に、ＰＣＲ分析は以下のとおり実施できる。ＨＢＶのＰＣＲ分析は、２．５
ｍＭＭｇＣｌ₂および各プライマーの１ｉＭを有する５０ｉｌの最終容量にて
実施する。サイクルは、９５ＥＣ３０秒、５０ＥＣ１分、７２ＥＣ１分である。
３０サイクル後、ＰＣＲ生成物は、１．５％アガロースゲル上の電気泳動により
分離し、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ⁺ナイロン膜（アマーシャム）に移す
。ブロットは、サザン分析のために³²Ｐ−標識ＨＢＶ−特異的制限フラグメント
（ｐＨＢＶ−ＨＴＤのＡａｔＩＩフラグメント；３２２１ｂｐ）により混成する
。ＨＢＶ遺伝子のコアオープンリーディングフレーム内に位置する以下のプライ
マー類は、ＨＢＶの検出用に使用される：センスプライマー、ＧＡＧＡＡＴＴＣ
ＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；ア
ンチセンスプライマー、ＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＧ
ＡＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）。これらのプライマー類は、５７８ｂｐフラ
グメントを生成する。以下のβ−アクチンプライマー類は、コントロールとして
使用する：センスプライマー、ＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡ
ＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）；アンチセンスプライマー、
ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣ（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：８）。これらのプライマー類は１０４５ｂｐフラグメントを生成
した。

【００７１】ＨＢＶ肝臓ＤＮＡＨＢＶＤＮＡは、ａｄｗＲ９で形質移入されたラットから分離された肝臓Ｄ
ＮＡのゲノムサザン分析により検出された。７．２ｋｂおよび３．２ｋｂのＤＮ
Ａバンドは、ＨＢＶ特異的プローブ（ｐＨＢＶ−ＨＴＤのＡａｔＩＩフラグメン
ト）による混成によるＥｃｏＲＶ消化ゲノムＤＮＡｓにおいて検出された。該７
．２ｋｂバンドは、ベクター特異的プローブ［ＢａｍＨＩにより消化されたｐＧ
ＥＭ−７Ｚｆ（＋）ＤＮＡ］で再混成された同一の肝臓ＤＮＡにも見られるが、
３．２ｋｂバンドは検出できなかった。ＨＢＶゲノム（ａｄｗサブタイプ；３．
２ｋｂ）およびａｄｗＲ９ＨＢＶ構築体（７．２ｋｂ）の双方には、単独Ｅｃｏ
ＲＶ部位（Ｂｌｕｍら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１４：５６，１９９１）を有す
ることから、観測された３．２ｋｂバンドは、消化されたａｄｗＲ９から誘導さ
れなかった。これらのデータは、ＨＢＶＤＮＡが産生され、肝臓に不統合形態
で存在する。さらに、肝臓中のａｄｗＲ９プラスミドＤＮＡは１日目と３日目と
の間で急速に減少したが、ＨＢＶＤＮＡは、１日目、２日目、３日目に同様の
強度で検出された。斯様に、肝臓からのａｄｗＲ９構築体のクリアランス後、３
．２ｋｂＨＢＶＤＮＡの存在は、ＨＢＶ産生がそれ自身の複製により媒介され
た可能性があることを示す。

【００７２】ゲノムサザン分析は、以下のとおり実施された。ＨＢＶ、ａｄｗＲ９の頭−尾
ヘテロダイマーにより形質移入されたラット肝臓は、分析のために用いられた。
ＤＮＡは、肝臓から抽出され、単一部位のＨＢＶゲノムとａｄｗＲ９を切断する
ＥｃｏＲＶで消化され、１％アガロースゲルを介して電気泳動により分離した。
ＤＮＡフラグメントは、サザン混成フィルタに移し、ブロットは最初、ＨＢＶ特
異的制限フラグメント（ｐＨＢＶ−ＨＴＤのＡａｔＩＩフラグメント）により混
成し、ストリップし、次いでサザン分析のためにベクター特異的プローブ［Ｂａ
ｍＨＩにより消化されたｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）ＤＮＡ］で再混成した。

【００７３】形質移入されたラットにおける血清ＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢｅ抗体応答ｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質移入されたラットにおける血清ＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢ
ｅ抗体応答の代表的経時推移を図３に示す。ＨＢｅＡｇは、ｐＨＢＶ−ＨＴＤに
よる肝臓形質移入の３〜７日後にラット血清に見出され、続いて２１日までに抗
ＨＢｅ抗体力価が増加した。ＨＢｅＡｇまたは抗ＨＢｅのいずれも、ｐＧＥＭ−
７Ｚｆ（＋）により形質移入された偽形質移入ラットの血清には見出されなかっ
た。（図１）ＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢｅ抗体は、以下のとおり測定された。血清は、ラット
の尾静脈から採取した。商品として入手できるＥＬＩＳＡキット（アボット）を
用いて、ＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢｅ抗体の存在は、それぞれ「サンドウィッチ」
法および「競合結合」法により決定した。ＨＢｅＡｇの相対濃度は、４９２ｎｍ
（Ａ₄₉₂）における標本の絶対値により表された。抗ＨＢｅの濃度は、次式を用
いることにより計算されたパーセント阻害として表された；パーセント阻害＝［
（ネガティブコントロールの平均Ａ₄₉₂−サンプルのＡ₄₉₂）／（ネガティブコン
トロールの平均Ａ₄₉₂−ポジティブコントロールの平均Ａ₄₉₂）］×１００。

【００７４】グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）濃度ＧＰＴが肝臓に本来見られ、損傷肝細胞から遊離されることから、血清におけ
るＧＰＴ活性は肝臓病の指標として測定された。血清ＧＰＴ値は、ＨＢＶ形質移
入の２〜３週後の大半のラットにおいて上昇した［０日目では６０国際単位（Ｉ
Ｕ）／１″５ＩＵ／１および２１日目では２１０ＩＵ／１″４９ＩＵ／１
；平均″ＳＥＭ、ｎ＝１５］（図２）。偽形質移入ラットにおいては、血清ＧＰ
Ｔ上昇を認めなかった（０日目では３７ＩＵ／１″１８ＩＵ／１および２１
日目では３０ＩＵ／１″１２ＩＵ／１、ｎ＝３）。

【００７５】肝臓組織学ｐＨＢＶ−ＨＴＤ、ａｄｗＲ９、またはｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）構築体による
インビボ形質移入後、３〜２１日後、殺処理した任意に選択したラットから肝組
織を得た。ｐＨＢＶ−ＨＴＤ構築体によるインビボ形質移入２１日後のラットの
１匹は、４８３ＩＵ／ｌのＧＰＴレベルを有し、肝組織学で（図２を参照）門脈
近傍の実質細胞が消失しており、リンパ球の湿潤に置き換えられていた。ｐＨＢ
Ｖ−ＨＴＤまたはａｄｗＲ９による形質移入した他のラットも同様な組織学的変
化を示した。偽形質移入ラットの肝臓では肝細胞の死滅またはリンパ球湿潤は見
られなかった。

【００７６】ｐＨＢＶ−ＨＴＤによる無胸腺ヌードラットのインビボ形質移入ここで記載される実験動物モデルにおいて、Ｔリンパ球が肝細胞損傷の誘発に
とって重要化どうかを見るため、Ｔリンパ球欠損無胸腺ヌードラットに上記のｐ
ＨＢＶ−ＨＴＤで形質移入した。これらの形質移入ラットのいずれにおいても血
清ＧＰＴ上昇は見られず（図２）、それらの肝臓は組織学的に正常であった。こ
れらのヌードラットにおいてＨＢＶビリオンの血清濃度が７〜２１日間で上昇が
見られたことは興味深い。この知見は、形質移入７〜１４日後で急降下する正常
ラットの血清ＨＢＶビリオン濃度と対照的である。

【００７７】モデルの特性化上記の方法に従ったクローンＨＢＶＤＮＡのインビボ形質移入後、３．２ｋ
ｂＨＢＶＤＮＡと同様にＨＢＶＲＮＡも肝臓に存在しており、ＨＢＶビリオン
が血中に検出された。最も重要なことには、活性ウィルス複製の血清学的マーカ
ーであるＨＢｅＡｇ（Ｂｒｅｈｏｔら、Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ：７６５，１９８
１；Ｈａｄｚｉｙａｎｎｉｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３：６５６，１９
９３）が、ラット血清中に見られ、その発現後抗ＨＢｅ抗体応答が生じた。これ
らのデータは、ＨＢＶビリオンが盛んに産生されたこと、そしてＨＢＶ遺伝子産
物に対する免疫応答がＨＢＶ構築体により形質移入されたラットにおいて誘導さ
れたことを示している。さらに、これらの動物における肝臓組織学ではＧＰＴが
上昇した場合、肝細胞の死滅およびリンパ球湿潤により特徴づけられる重度の肝
細胞損傷が示された。このように、これらの形質移入ラットにおけるＨＢＶ誘導
の病因は、ＨＢＶ遺伝子発現、ＨＢＶビリオン産生、結成トランスアミナーゼの
増加および特性的組織学所見によって特徴づけられた。ＨＢＶＤＮＡによって
形質移入されたラットにおけるこれらの病的変化は、ヒトにおいてＨＢＶにより
誘導された急性ウィルス性肝炎に見られるものと同様である。

【００７８】これらの研究では、ＨＢＶ（ｐＨＢＶ−ＨＴＤ）およびａｄｗＲ９の頭−尾ダ
イマー構築体を用いた。これらおよび他の頭−尾ダイマー構築体は、ヒトの肝癌
細胞系において完全ビリオンを産生するのに十分なＨＢＶゲノムと内在性ウィル
スエンハンサー／プロモーター因子を含んでおり（Ｂｌｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．６５：１８３６，１９９１およびＢｌｕｍら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：１００５，１９８７；Ｓｕｒｅａｕら、Ｃｅｌ
ｌ４７：３７，１９８６；Ｙａｇｉｎｕｍａら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２６７８，１９８７；Ｙａｓｉｎｕｍａら
、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２６７８，１９８
９）また、ＨＢＶのインビトロ複製は、以前、ラットの肝臓由来細胞において示
されている（Ｓｈｉｈら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
６：６３２３，１９８９；Ｄｉｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３６：９
３，１９９２）。しかし、これら複製能のある構築体の直接的形質移入後、ラッ
トのインビボ肝臓でＨＢＶ遺伝子が発現されるかどうかを確認する研究は以前に
は無かった。本データは、単一遺伝子のインビボ移入後のラットにおけるＨＢＶ
遺伝子の発現の発現、ＨＢＶ粒子の生成および自発性肝炎の発現を示す。

【００７９】ＨＢＶの無胸腺ヌードマウスモデルにおける

【００８０】

【化２０】

【００８１】のインビボ効果ｐＨＢＶ−ＨＴＤは、アシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジン共役体および
カチオン性リポソームと複合して肝臓特異的形質移入に関して、ウィルス様粒子
を形成する（感染性リポソーム）。感染性リポソーム複合体は、ヌードマウスの
脾臓を経て門脈へ注入された。インビボ形質移入７日後、マウスを任意に選択し
て生理食塩水（ＰＳＳ），

【００８２】

【化２１】

【００８３】（１０，０００ＩＵ／日）または

【００８４】

【化２２】

【００８５】（１０，０００ＩＵ／日）の腹腔内注射を７日間行なった。

【００８６】アシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジン共役体およびカチオン性リポソーム
は、Ｔｒｕｂｅｔｓｋａｙら（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．３：３
２３，１９９２）およびＫａｒｌら（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０７：１
３８，１９９４）により記載されたように調製した。アシアロフェチュインは、
肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体と結合し、カチオン性リポソームは、細
胞膜への融合および肝細胞へのＤＮＡ送達を促進することから、肝臓特異的形質
移入を達成するため、ｐＨＢＶ−ＨＴＤをアシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リ
ジン共役体およびカチオン性リポソームと複合化させた。手短に言えば、５０ｉ
ｌのアシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジン共役体（５００ｉｇ／ｍｌのＢＳ
Ｓ，ｐＨ７．４）および１００ｉｌのカチオン性リポソーム（１，０００ｉｇ／
ｍｌのＢＳＳ，ｐＨ７．７）を微量遠心分離チューブ内で混合した。混合しなが
ら室温で１５分間インキュベーション後、［アシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−
リジン］−［ＤＮＡ］−［カチオン性脂質］複合体を０．２ｉｍポリカーボネー
ト膜フィルタ（カリフォルニア州、ポレティックス社）を通してろ過し、形質移
入した。

【００８７】ヒトのアシアロ−ＩＦＮ−βを生産するために、ビーズ化したアガロース（約
０．２２単位、シグマ）に２０ｍｇの不溶性ノイラミニダーゼを微量遠心分離チ
ューブ内で１ｍｌの蒸留水に懸濁し、簡単に水和化する。次にこのチューブを急
速回転し、１５４ｍＭＮａＣｌおよび９ｍＭ塩化カルシウムを含む酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍｌで３回洗浄した。次にこのゲル（約７２ｉｌ）を
酢酸ナトリウム緩衝液１５０ｉｌに再懸濁させた。次にグリコシル化ヒトＩＦＮ
−β（３×１０⁶ＩＵ／バイアル、約０．１５ｍｇであった）を酢酸ナトリウム
緩衝液１５０ｉｌに懸濁させた。ゲルとＩＦＮ−βを次に混合し、３７ＥＣで３
時間回転台上に温置した。その後この混合物を０．２ｉｍフィルタを有するＺ−
スピンチューブへ移した。次にアシアロＩＦＮ−βを急速回転により、ノイラミ
ニダーゼから分離し、５０ミクロリットルのアリコートを作成し、使用まで８０
ＥＣで貯蔵した。

【００８８】ＨＢＶ粒子は、感染性リポソームを用いて、インビボ形質移入により、全ての
ヌードマウスで産生した。ＰＢＳで処理したヌードマウスにおいて、ＨＢＶウィ
ルス血症がこの処理の終わり（形質移入１４日後）まで継続した。シアル化した
天然の

【００８９】

【化２３】

【００９０】（１０，０００ＩＵ／マウス／日を７日間）は、有意な抗ウィルス効果を示さな
かった。これと対照的に、

【００９１】

【化２４】

【００９２】（１０，０００ＩＵ／マウス／日を７日間）は、大きな抗ウィルス効果を示した
。

【００９３】ＨＢＶ形質移入されたヒト肝癌細胞に関する

【００９４】

【化２５】

【００９５】の効果アシアロ糖タンパク質受容体保持肝癌細胞系は、［¹²¹Ｉ］標識アシアロオル
ソムコイドを用いて同定された（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２５６：８８７８，１９８１）。１つのアシアロ糖タンパク質受容体発現細
胞系ＨｅｐＧ２（アメリカ型培養収集；メリーランド州ベセスダ：ＡＴＣＣＨ
Ｂ８０６５）をＨＢＶによる形質移入のために選ばれた。ＨｅｐＧ２細胞を、上
記のようにｐＨＢＶ−ＨＴＤにより形質移入した。

【００９６】ＨＢＶ形質移入されたＨｅｐＧ２細胞における

【００９７】

【化２６】

【００９８】および天然の

【００９９】

【化２７】

【０１００】の効果を調べるために、２×１０⁵形質移入された細胞を、ヒトの

【０１０１】

【化２８】

【０１０２】（１，０００ＩＵ／ｍｌ）、

【０１０３】

【化２９】

【０１０４】（１，０００ＩＵ／ｍｌ）または生理食塩水のいずれかで４８時間処理した。細
胞毒性をＭｏｓｍａｎｎにより記載されたとおり（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．６５：５５，１９８３）比色ＭＴＴ細胞増殖を用いてモニターした。

【０１０５】

【化３０】

【０１０６】は、

【０１０７】

【化３１】

【０１０８】よりも効果的である。

【０１０９】

【化３２】

【０１１０】および

【０１１１】

【化３３】

【０１１２】は、ＨＢＶ形質移入されたＨｅｐＧ２細胞によりＨＢＶ産生を減少させることが
判った。しかしながら、

【０１１３】

【化３４】

【０１１４】は、

【０１１５】

【化３５】

【０１１６】よりも効果的であることが判った。

【０１１７】

【化３６】

【０１１８】は、対照細胞と比較して５倍以上ＨＢＶ産生を減少させたが、

【０１１９】

【化３７】

【０１２０】は、１．５倍から２倍のＨＢＶ産生を減少させた。さらに、

【０１２１】

【化３８】

【０１２２】は、ＨＢＶ形質移入されたＨｅｐＧ２によるＨＢｓＡｇ産生を２６〜３８％減少
させたが、

【０１２３】

【化３９】

【０１２４】は、ＨＢｓＡｇ産生を３３〜４０％減少させた。

【０１２５】

【表１】

【０１２６】注：形質移入６時間後、生理食塩水、ＩＦＮ−βまたはアシアロＩＦＮ−βを
培地に添加した（０時間）。形質移入したＨｅｐＧ２細胞からのＨＢｓＡｇの産
生は、ＩＦＮ−βおよびＡＳ−ＩＦＮ−βの４８時間処理により有意に阻害され
た（^*：スチューデントｔ検定によりそれぞれＰ＝０．００００４対生理食塩水
、^**：Ｐ＝０．００００４対生理食塩水およびＰ＝０．０１５対ＩＦＮ−β）。

【０１２７】ｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質移入したＳＫ−ＨＥＰ細胞における

【０１２８】

【化４０】

【０１２９】および

【０１３０】

【化４１】

【０１３１】の効果を検討した。これらの細胞は、アシアロ糖タンパク質の受容体を欠いてい
る。これらの細胞では、

【０１３２】

【化４２】

【０１３３】は

【０１３４】

【化４３】

【０１３５】以上に効果的であるということはない。

【０１３６】下記の方法は、この節に記述される実験に用いられた。

【０１３７】これら実験のための

【０１３８】

【化４４】

【０１３９】は、上記の

【０１４０】

【化４５】

【０１４１】から調製された。ＨＢＶ形質移入したＨｅｐＧ２細胞によるＨＢＶビリオン産生
は、上記のとおり測定された。ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は酵素結合イムノ
ソルベントアッセイ（ＡＵＳＺＹＭＥ、アボットラボラトリー）を用いて試験し
た。

【０１４２】全ての細胞系は、５６ＥＣで３０分間不活化した１０％ウシ胎仔血清、１０ｉ
Ｍ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｉｇ／ｍｌのスト
レプトマイシンによって補足されたＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ；米国メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）であった。インビ
トロ試験に使用される細胞は、トリプシンの存在しない０．０４％ＥＤＴＡ／ベ
ルシン緩衝液を用いて３７ＥＣで５分間処理することにより単層培地から得た。

【０１４３】３００ｍｍプレートにつき２×１０⁵細胞および３ｉｇのｐＨＢＶ−ＨＴＤを
用いて、リン酸カルシウム法（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：２７４５，１
９８７）により、細胞にｐＨＢＶ−ＨＴＤで形質移入した。形質移入後、３０ｉ
ｌの

【０１４４】

【化４６】

【０１４５】（１００ＩＵ／ｉｌ）または

【０１４６】

【化４７】

【０１４７】（１００ＩＵ／ｉｌ）を６時間ごとに４８時間培地に塗布し、１０００ＩＵ／ｍ
ｌの最終濃度とした。同じ合計量の生理的食塩水を対照培地に加えた。

【０１４８】アシアロ−インターフェロンＢ型肝炎およびその他の病気の治療に使用されるアシアロインターフェロンは
、インターフェロンから末端シアル残基を除去することにより生産し得る。イン
ターフェロンは、真核細胞内で産生されたためにグリコシル化されており、通常
そのような残基を有する（例えば、米国特許第４，１８４９１７号およびそこに
引用されている参照文献およびＫａｓａｍａら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒ．Ｃｙｔ
ｏ．Ｒｅｓ．１５：４０７−４１５，１９９５を参照）。末端シアル残基は、
例えば、Ｄｒｚｅｎｉｅｃｋら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：
３５，１９７２に記載されているように緩和な酸加水分解または単離精製された
細菌またはウィルスのノイラミニダーゼによる天然のグリコシル化ＩＦＮの処理
により除去し得る。ノイラミニダーゼは、シグマケミカル社よりカタログ番号Ｎ
３６４２、Ｎ５１４６、Ｎ７７７１，Ｎ５２７１，Ｎ６５１４，Ｎ７８８５，Ｎ
２８７６，Ｎ２９０４，Ｎ３００１，Ｎ５６３１，Ｎ２１３３、Ｎ６０２１，Ｎ
５２５４およびＮ４８８３として容易に入手できる。

【０１４９】天然のグリコシル化インターフェロンは、ヒトの細胞から単離できるが、ヒト
の細胞は、それを自然に産生するか、または増殖された真核細胞から産生された
結果、クローン化インターフェロン遺伝子を発現する。インターフェロンの天然
のまたは組換えによる生産法は、一般的に米国特許第４，７５８，５１０号、米
国特許第４，１２４，７０２号、米国特許第５，８２７，６９４号、米国特許第
４，６８０，２６１号、米国特許第５，７９５，７７９号および米国特許第４，
１３０，６４１号に記載されている。他に、単離精製されたヒトインターフェロ
ンは、シグマからカタログ番号Ｉ２３９６、Ｉ２２７１、Ｉ１６４０およびＩ６
５０７として入手し得る。

【０１５０】動物のモデル前述の方法を使用して、他の形態の肝炎のげっ歯類モデルを作製することがで
きる。したがって、Ｂ型肝炎ウイルスの他の変異体および突然変異体形を、前述
の実験において使用されるａｄｗ２変異体の代わりに使用することができる。し
たがって、ａｄｗ、ａｄｒ（１）、ａｄｒ（２）、ａｙｒ、ａｙｗ（１）、ａｙ
ｗ（２）または他の変異体を使用することができる。さらに、前述の方法は当業
者によって使用され、Ｃ型肝炎およびＧ型肝炎のモデルを作製することができる
。

【０１５１】アシアロ（ａｓｉａｌｏ）インターフェロンによる治療前述の方法、および当分野で知られる他の技法を使用して、グリコシル化した
サイトカインのアシアロ形を作製することができる。したがって、

【０１５２】

【化４８】

【０１５３】または他のグリコシル化したヒトのインターフェロンのアシアロ形を作製するこ
とが可能である。アシアロインターフェロンを使用して広範囲の肝臓疾患、また
はインターフェロンをアシアロ糖タンパク質受容体を有する細胞へ投与すること
を必要とする、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、腎臓細胞のガン、およびＧ型肝炎を含めた
他の疾患を治療することができる。

【０１５４】真核細胞中で生成される他の広範囲のタンパク質（生来のものまたは組換え遺
伝子の発現によるもの）を改質するために、末端シアル酸残基を取り除くことが
有用な方法である可能性がある。この改質によって、アシアロ糖タンパク質受容
体を有する細胞によってより容易に取り込むことができるアシアロタンパク質が
生成されるはずであり、したがってこの改質はより効果的である。

【０１５５】アシアロ−ＩＦＮ−βは生体外および生体内のＨＢＶ複製を阻害し、元のＩＦ
Ｎ−βに対して優性である。

【０１５６】完全なＨＢＶゲノム（ｐＨＢＶ−ＨＴＤ、前項を参照のこと）の完全な同質二
量体を保有している複製能力のあるＨＢＶ構築体と共にトランスフェクトされた
ＨｅｐＧ２ヒト肝腫細胞によって、無傷なＨＢＶビリオンの生成を減少させるそ
の能力により、

【０１５７】

【化４９】

【０１５８】の効力を評価した。この肝臓細胞株は、正常なヒト肝細胞と同等なレベルでアシ
アロ糖タンパク質受容体を発現する。（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ他のＪ．Ｈｅｐａｔ
ｏｌ．１３：３０５〜３０９，１９９１；およびＳｃｈｗａｒｔｚ他のＪ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：８８７８〜８８８１，１９８１）。

【０１５９】以下に記載する実験によって、肝細胞中の肝炎ウイルス複製を阻害する際に、
アシアロ−ＩＦＮ−βが元のＩＦＮ−βより効果的であることが証明される。ア
シアロ−ＩＦＮ−βが、ＩＦＮ抗ウイルス性細胞応答の指標である２′−５′オ
リゴアデニルシンセターゼを元のＩＦＮ−βによって誘導されたそれよりも大幅
に高いレベルで誘導した、以下にも記載される発見とこの結果は一致する。

【０１６０】ＨＢＶのＤＮＡを含む無傷なビリオンの定量化のために、放射性ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用した。この方法は、培養上澄みのＤＮａｓｅＩに
よる消化および包被されているウイルス粒子の免疫沈降を含む。この方法を順次
に希釈されたウイルスＤＮＡの調製物に適用することによって、この定量化を正
当化した。図４は、ＰＣＲ産物への

【０１６１】

【化５０】

【０１６２】で標識されたｄＣＴＰの取り込みとコントロールのＨＢＶのＤＮＡのコピーの知
られている数との間の明確な直線関係（直線回帰の相関係数；γ＝０．９９８、
Ｐ＜０．００１）を示す。図４は、トランスフェクションの実験において無傷な
ビリオンを含む、ＨＢＶのＤＮＡのコピー数の計算用の標準曲線も提供する。

【０１６３】このセクションにおいて行った方法は以下のように実施した。ヒトの肝腫細胞
株のＳＫ−ＨＥＰ−１細胞およびＨｅｐＧ２細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、熱
不活性ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、必須でないアミノ酸１００ＦＭ、ペニシリン１００
Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン１００Ｆｇ／ｍｌを補充したＤｕｌｅｂｅ
ｃｃｏの改質型イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎ
ｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）において、５％ＣＯ₂の存在下で３７
ＥＣで培養した。

【０１６４】ヒトのアシアロ−ＩＦＮ−βを前述のように作製した。

【０１６５】肝腫細胞（２×１０⁵個の細胞）を３０ｍｍのプラスチック皿中で培養し、リ
ン酸カルシウムホ乳類細胞トランスフェクションキット（５Ｐｒｉｍｅ６３Ｐｒ
ｉｍｅ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を使用してｐＨＢＶ−ＨＴＤ３Ｆｇ
と共にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をトランスフェクショ
ンの２４時間および４８時間後において、天然の

【０１６６】

【化５１】

【０１６７】、天然の

【０１６８】

【化５２】

【０１６９】、アシアロ−

【０１７０】

【化５３】

【０１７１】、または生理食塩水（コントロール）のいずれかで処理した。トランスフェクシ
ョンの７２時間後において、培養上澄みを回収した。ＩＦＮで処理された肝腫細
胞の生存能力を、臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−ｏｌ］−２，５
−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ
．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による色素還元アッセイによって評価した。

【０１７２】ＨＢＶ生成を測定するために、細胞の培養上澄み（２００Ｆｌ）を３７ＥＣに
おいて１５分間、２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）処理し、任意の
プラスミドを分解、すなわちＨＢＶのＤＮＡを切り離した。次いで１０マイクロ
リットルのＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）を加えて、ＤＮａｓｅＩを不活
性化させた。包被されているウイルス粒子を、ＨＢＶ表面の抗原に特異的な高親
和性モノクローナル抗体と共に吸収させ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他のＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１４７０〜１４７４，１９９５）、こ
れがアズラクト−アクリルアミドコポリマーのビーズに共有結合した（３ＭＥ
ｍｐｈａｚｅＪＢｉｏｓｕｐｐｏｒｔＭｅｄｉｕｍＡＢ１，Ｐｉｅｒｃｅ
，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。さらなる洗浄後、９５ＥＣにおいて１０分間加熱
することによって、５０Ｆｌの蒸留水中でＨＢＶのＤＮＡをビーズから切り離し
た。ＨＢＶのＤＮＡの定量化を、プライマー５′−ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＣ
ＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧ−３′（配列番号５）および５′−ＧＡＡ
ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＧＡＧＡ−３′（配列番号６）を
使用するＰＣＲによって実施した。２０ＦｌのＤＮＡサンプル、２．５ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂および２つのプライマー１ＦＭ、ｄＮＴＰ０．０１ｍＭ、ＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ２．５ユニット（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）、および

【０１７３】

【化５４】

【０１７４】 −ｄＣＴＰ１０ＦＣｉを含む５０Ｆｌの混合物中で、９５ＥＣで３０秒、５０Ｅ
Ｃで１分、７２ＥＣで３分の増幅サイクルで、ＡｍｐｌｉＷａｘＪＰＣＲＧ
ｅｍ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ
，ＣＡ）を使用してホットスタートによってＰＣＲを行った。２５サイクル後、
ＰＣＲ産物それぞれの１０Ｆｌを、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル中の
電気泳動によって分離した。オートラジオグラフィによってＰＣＲ産物のバンド
の位置を特定し、液体用シンチレーション計数管（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によって放射活性を測定した。ＨＢ
Ｖの定量化のために、知られている量の３．２ｋｂ線状ＨＢＶのＤＮＡのＰＣＲ
から標準曲線を構築した。ＤＮＡサンプル中にトランスフェクションされたプラ
スミドが存在しないことを保証するために、ＨＢｃＡｇ配列用のセンスプライマ
ー（配列番号５）で置換されたｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）ベクターのｌａｃＺ配列
内に位置するセンスプライマーによってもＰＣＲは行われた。ＤＮａｓｅ処理に
よって鋳型の汚染を検出することはできなかった。

【０１７５】ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐ
ｏｌｉｓ，ＩＮ）から、生後７から８週のＢａｌｂ／ｃ無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎ
ｕ）マウスを得た。実験を通じて、これらの動物を特異的病原体のない条件下に
維持した。マウスにｐＨＢＶ−ＨＴＤを、［アシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−
リジン］−［ＨＢＶのＤＮＡ］−［陽イオン性リポソーム］の三元複合体からな
る肝臓特異的トランスフェクション試薬を使用して生体内にトランスフェクショ
ンした。ポリ（Ｌ−リジン）の抗体への接合について記載されている条件（Ｔｒ
ｕｂｅｔｓｋｏｙ他のＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１３１：３
１１〜３１３，１９９２）と同等の条件を使用して、Ｎ末端が改質されたポリ（
Ｌ−リジン）をアシアロフェチュインと接合した。ｐＨＢＶ−ＨＴＤ５０マイク
ロリットル（Ｄ−ＭＥＭ中に４００Ｆｇ／ｍｌ）、アシアロフェチュイン−ポリ
−Ｌ−リジン接合体（ハンクス平衡化塩溶液、ｐＨ７．４中に５００Ｆｇ／ｍｌ
）、および

【０１７６】

【化５５】

【０１７７】［Ｎ−（Ｎ＝，Ｎ＝ジメチルアモエタン）カルバミオイル］コレステロール６５
モルパーセントおよびオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ハンクス平
衡化塩溶液、ｐＨ７．７中に１，０００Ｆｇ／ｍｌ）３５モルパーセントを含む
陽イオン性リポソーム１００Ｆｌをミクロ遠心分離用チューブ中で合わせた。混
合しながら室温で１５分培養した後、三元複合体を０．２Ｆｍのポリカーボネー
ト膜フィルタ（ＰｏｒｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）を通じて濾
過し、ヌードマウスの門脈内に脾臓を介して注入した。生体内へのトランスフェ
クションから７日後、マウスをランダムに選択し、眼窩出血によってそれらの血
液をサンプル採取した。次いで膜腔にプラシーボとして生理食塩水、

【０１７８】

【化５６】

【０１７９】または

【０１８０】

【化５７】

【０１８１】を７日連続で注入することによって（１日当たりそれぞれ、生理食塩水２００Ｆ
ｌ中に１，０００または１０，０００ＩＵ）、それらを治療した。

【０１８２】２′−５′オリゴアデニル（２−５Ａ）シンセターゼ活性を測定するために、
２４ウェルのプラスチックプレート中で８、１２または２４時間、ヒトのＩＦＮ
−βまたはアシアロ−ＩＦＮ−β１００ＩＵ／ｍｌでＨｅｐＧ２細胞を処理した
。リン酸緩衝生理食塩水で細胞を２度洗浄し、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ（ｐＨ７．６
）、ＫＣｌ１０ｍＭ、酢酸マグネシウム２ｍＭ、２−メルカプトエタノール７ｍ
Ｍ、および０．５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を含む溶解用緩衝液に溶解させ
た。次いで細胞を２０秒間超音波処理し、１５，０００ｘｇで１５分間遠心分離
した。Ｂｉｏ−Ｒａｄのタンパク質アッセイ用キット（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用するＢｒａｄｆｏｒｄの
色素結合手順によって、細胞の溶解液のタンパク質濃度を測定した。アッセイさ
れるまで、サンプルはすべてＢ８０ＥＣにおいて凍結させた。Ｓｈｉｎｄｏ他の
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ８：３６６〜３７０，１９８８に記載されるラジオイムノ
アッセイ用キット（ＥｉｋｅｎＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ＨｅｐＧ２細胞中の２−５Ａ
シンセターゼ活性のレベルを測定した。

【０１８３】ＨＢＶがトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞を

【０１８４】

【化５８】

【０１８５】で処理し、その抗ウイルス性効果を従来の天然の

【０１８６】

【化５９】

【０１８７】（ＳｕｍｉｔｏｍｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｏｓａｋａ，Ｊ
ａｐａｎ）または

【０１８８】

【化６０】

【０１８９】（ＴｏｒａｙＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のそれと比較
した。図５に示すように、アシアロ−

【０１９０】

【化６１】

【０１９１】によって従来の

【０１９２】

【化６２】

【０１９３】または

【０１９４】

【化６３】

【０１９５】よりも大幅に高い抗ウイルス効果が生み出された（Ｐ＜０．００１；

【０１９６】

【化６４】

【０１９７】対従来の

【０１９８】

【化６５】

【０１９９】または

【０２００】

【化６６】

【０２０１】、大幅なＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉｔテストによって１０、１０
０および１，０００ＩＵ／ｍｌで）。１００ＩＵ／ｍｌの用量においては、アシ
アロ−ＩＦＮ−βで処理されたＨＢＶのコピー数は、元のＩＦＮ−βで処理され
たＨＢＶのコピー数の半分未満であった。したがってアシアロ糖タンパク質は、
ＨＢＶの複製を減少させることにおいて元の片割れの少なくとも２倍の効果があ
った。アシアロ糖タンパク質受容体を非常によく発現する他のヒトの肝腫細胞株
、Ｈｕｈ−７を使用することによっても同様の結果が観察された。

【０２０２】

【化６７】

【０２０３】によってＨＢＶの阻害が増大したことは、細胞毒効果によるものではなっかった
。ＭＴＴ色素還元アッセイ（図６）によって調べたとき、これらの実験で使用さ
れた最高の用量（１０００ＩＵ／ｍｌ、７２時間中２４時間ごと）においても細
胞毒性は観察されなかった。

【０２０４】アシアロ−ＩＦＮ−βの抗ウイルス効果を確認するために、２−５Ａシンセタ
ーゼ活性を測定した。このＩＦＮ誘導型酵素は、ＡＴＰを２＝５＝オリゴアデニ
ルに重合させ、次いでこれが潜在エンドリボヌクレアーゼを活性化してＲＮＡを
分解する。ＨＢＶはＲＮＡの中間体を介して複製するので、２−５Ａシンセター
ゼの誘導は、タンパク質合成の阻害およびウイルス複製によるＩＦＮの抗ウイル
ス作用において重要な役割を果たすと考えられる。図１１に示すように、アシア
ロ−ＩＦＮ−β処理したＨｅｐＧ２細胞中の２−５Ａシンセターゼ活性は、従来
のＩＦＮ−β処理したＨｅｐＧ２細胞のそれよりも大幅に高いレベルに増加した
（Ｐ＝０．０２５および０．００４；アシアロ−ＩＦＮ−β対従来のＩＦＮ−β
、それぞれ１２時間および２４時間におけるｔテストによる）。したがって、２
−５Ａシンセターゼ活性の誘導が増加したことによって、ヒトのアシアロ−ＩＦ
Ｎ−βの抗ウイルス効果が増大したことを確認した。

【０２０５】

【化６８】

【０２０６】の薬剤効果が増大したかどうかの判定が、アシアロ糖タンパク質受容体によって
標的細胞上で媒介され、競合阻止実験を競合ＡＳＧＰ受容体阻害剤としてアシア
ロフェチュインを使用して行った。図８に示すように、

【０２０７】

【化６９】

【０２０８】の抗ウイルス効果は、ＨＢＶがトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞中のアシ
アロフェチュイン（０．０１〜１．０ｉＭ）によって阻害された（大幅なＡＮＯ
ＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉｔテストによる１対毎の比較ですべてＰ＜０
．０１）。

【０２０９】アシアロ糖タンパク質受容体に対してネガティブであるヒトの肝腫細胞株ＳＫ
−ＨＥＰ−１を使用して、ＡＳＧＰ受容体の重要性をさらに調べた。このアシア
ロ糖タンパク質受容体に対してネガティブ細胞株においては、従来の

【０２１０】

【化７０】

【０２１１】または

【０２１２】

【化７１】

【０２１３】と比較して

【０２１４】

【化７２】

【０２１５】は抗ウイルス効果の増大を示さなかったことが分かった。

【０２１６】

【化７３】

【０２１７】の抗ウイルス効果の増大がＩＦＮ受容体への結合にも依存するかどうか調べるた
めに、

【０２１８】

【化７４】

【０２１９】中和抗体を使用して、

【０２２０】

【化７５】

【０２２１】がＩＦＮ受容体に結合するのを妨げた。図９に示すように、

【０２２２】

【化７６】

【０２２３】の抗ウイルス効果は、この中和抗体によって阻害されたが、イソタイプ適合型の
ＩＦＮ特異的ではないマウスのＩｇＧによっては阻害されなかった。（Ｐ＜０．
００１、

【０２２４】

【化７７】

【０２２５】対０個の抗体または無関係なマウスのＩｇＧ；Ｐ＞０．０５、０個の抗体対無関
係なマウスのＩｇＧ、大幅なＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉｔテスト
による）。この結果によって、

【０２２６】

【化７８】

【０２２７】はＩＦＮ受容体シグナルを介して抗ウイルス効果を発揮することを確認した。

【０２２８】ヒトのアシアロ−ＩＦＮ−βの効力を生体内で再び試験した。この実験では、
サザン分析によってＰＣＲ増幅されるＨＢＶのＤＮＡの特異性を確認した。アシ
アロ−ＩＦＮ−β（１０，０００ＩＵ）で処理したマウスのＨＢＶのＤＮＡがト
ランスフェクションされてから１４日後までに、血清ＨＢＶビリオンは急速に減
少し、このことはプラシーボ処理したマウス中のＨＢＶビリオンレベルの増加と
は対照的であった。従来のＩＦＮ−β（１０，０００ＩＵ）は前処理レベル未満
にウイルス血症を抑制することができなかった。それぞれ個々の無胸腺マウス中
の前処理値（トランスフェクション後７日目における）と比較した、処理の終わ
りにおける（トランスフェクション後１４日目における）ＰＣＲ産物のサザン分
析によって検出される血清ＨＢＶビリオンの変化を図１０に要約する。従来のＩ
ＦＮ−β（１，０００または１０，０００ＩＵ）は、プラシーボと比較して統計
的に有意な抗ウイルス効果は示さなかった（Ｐ＞０．０５；プラシーボ対従来の
ＩＦＮ−β、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉｔテストによる）。このネガティブな結果
は、統計的に有意な抗ウイルス効果を生み出したアシアロ−ＩＦＮ−β（１０，
０００ＩＵ）とは対照的である（Ｐ＜０．００５、アシアロ−ＩＦＮ−β対プラ
シーボまたは従来のＩＦＮ−β１，０００ＩＵ、Ｐ＜０．０５、アシアロ−ＩＦ
Ｎ−β対従来のＩＦＮ−β１０，０００ＩＵ、大幅なＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆ
ｅｒｒｏｎｉｔテストによる）。何匹かのマウスでは少しの用量のＩＦＮ−β
で（１，０００ＩＵ）前処理レベル未満にウイルス血症も抑制されたが、この用
量では統計的に有意な抗ウイルス効果は観察されなかった（Ｐ＞０．０５；対プ
ラシーボ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉｔテストによる）。

【０２２９】従来の組み換えマウスの

【０２３０】

【化７９】

【０２３１】（１，０００または１０，０００ＩＵ）は、前処理レベル未満にウイルス血症を
抑制することができず、プラシーボと比較して統計的に有意な抗ウイルス効果は
示さなかった（Ｐ＞０．０５；プラシーボ対従来の

【０２３２】

【化８０】

【０２３３】、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉｔテストによる）。対照的に、

【０２３４】

【化８１】

【０２３５】（１，０００または１０，０００ＩＵ）は、統計的に有意な抗ウイルス効果を生
み出し（Ｐ＜０．００１、

【０２３６】

【化８２】

【０２３７】対プラシーボまたは従来の

【０２３８】

【化８３】

【０２３９】、大幅なＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉｔテストによる）、ウイルス
の数を前処理レベル未満に減少させた（図１０）。注目すべきことに、ウイルス
は完全に根絶され、処理の最後には１，０００ＩＵの

【０２４０】

【化８４】

【０２４１】では３分の１、１０，０００ＩＵの

【０２４２】

【化８５】

【０２４３】では３分の２のマウス中においてそれぞれ検出されなかった。

【０２４４】さらに、ＨＢＶ特異的制限断片を使用してＰＣＲ産物のサザン分析によって、
生体内の従来の

【０２４５】

【化８６】

【０２４６】と比較して、

【０２４７】

【化８７】

【０２４８】のより高い有効性を確認した。

【０２４９】このセクションの実験によって、ＡＳＧＰ受容体が生体外および生体内のＩＦ
Ｎの抗ウイルス効果の増大を媒介していることが証明された。従来の

【０２５０】

【化８８】

【０２５１】または

【０２５２】

【化８９】

【０２５３】と比較して、アシアロ−ＩＦＮによって大幅に増大した抗ウイルス効果が生み出
された（図５）。

【０２５４】細胞当たり１００〜５，０００の結合部位を有する

【０２５５】

【化９０】

【０２５６】の受容体と比較して、ＡＳＧＰ受容体は肝細胞当たり５０，０００から５００，
０００もの受容体を有する豊かな受容体である。この改質されるＩＦＮの効力を
増大させるためには、競合阻害の研究（図８）によって証明されるように、ＡＳ
ＧＰ受容体への結合が必要であることは明らかである。さらに重要なことに、

【０２５７】

【化９１】

【０２５８】のＩＦＮ受容体への結合は、その抗ウイルス効果のために必須である（図９）。

【０２５９】さらに、

【０２６０】

【化９２】

【０２６１】によって従来の

【０２６２】

【化９３】

【０２６３】よりも大幅に高いレベルで２−５Ａシンセターゼが誘導され、ＩＦＮ受容体によ
って媒介された抗ウイルス効果の増大が確認された。これらの観察は、

【０２６４】

【化９４】

【０２６５】のＡＳＧＰ受容体への結合によって

【０２６６】

【化９５】

【０２６７】の受容体によるシグナル伝達およびその抗ウイルス効果の増大が助長されるとい
う仮説と一致する。

【０２６８】使用法本発明の動物肝炎モデルは、肝臓細胞の死の研究を含めて、肝炎の病理プロセ
スの免疫学および分子の研究用に使用することができる。重要なことに、このモ
デルを使用して潜在的な治療論について調べることができる。

【０２６９】ＨＢＶゲノム中の突然変異による変化または欠失が同定されており、肝炎の厳
密な形の進展と関係があると考えられている。しかしながら、適切なモデルシス
テムがないために、この仮説は生体内では試験されていない。さまざまなＨＢＶ
トランス転写促進活性タンパク質の細胞的機能、およびガンのプロセスにおける
これらのタンパク質の関与も正常な成人の肝細胞では調べられていない。本明細
書に記載される動物肝炎モデルを使用して、変異体または突然変異体または他の
ウイルスを宿している動物を作成することによって、現在はこの仮説を実験的評
価に適用することができる。さらに、実験モデルを開発して生体内における治療
養生法の抗ウイルス効果を試験し、Ｃ型肝炎ウイルスを含めた他の肝炎性ウイル
スの病原性を調べることが現在可能である。

【０２７０】ヒトのインターフェロンの生来の形でアシアロインターフェロン

【０２７１】

【化９６】

【０２７２】を使用して、当業者によって使用されるのと同等またはそれ未満の用量で、Ｂ型
肝炎（またはＣ型肝炎またはＧ型肝炎）を治療することができる。特異性が高い
ために、低い毒性でより効果的な用量が可能であるはずである。当業者であれば
、動物モデルの使用によって適切な用量、および用量を段階的に拡大する臨床試
験について決定することができるはずである。当然ながら、一般的に効果的な用
量は生来のインターフェロン未満であるはずであり、このインターフェロンは処
理されて末端のシアル酸が取り除かれているわけではない。他の形のインターフ
ェロンを同様に処理することができる。

【０２７３】他のアシアロ糖タンパク質の生成ＩＦＮに関して前に記載した方法と同様な方法で、ＩＦＮ以外のアシアロ糖タ
ンパク質を生成することができる。たとえばＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、Ｉ
Ｌ−１０、ＩＬ−１２などのグリコシル化されたサイトカイン、繊維芽細胞成長
因子、神経の成長因子、血小板由来の成長因子が、それぞれカタログ番号Ｉ５２
７３、Ｉ３２６８、Ｉ３３９４、Ｉ３５１９、Ｉ１２７０、Ｆ３１３３、Ｎ４２
７３およびＰ８１８４としてＳｉｇｍａから入手可能である。次いでこれらのサ
イトカインをノイラミニダーゼで処理して、前述のアシアロサイトカインを生成
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＨＢＶ−ＨＴＤ（丸）、またはｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（三角）でトランス
フェクトされたラットにおける、血清ＨＢｅＡｇレベル（白抜きの印）、および
抗ＨＢｅ抗体力価（黒抜きの印）の分析結果を示すグラフである。ＨＢｅＡｇ、
および抗ＨＢｅの相対濃度は、本明細書に記載のとおり、それぞれＡ₄₉₂、およ
び阻害％によって示す。カットオフ値０．０６５（陰性コントロールの平均値に
係数０．０６を加えたもの）に等しいか、またはそれを超えるＡ₄₉₂を有する標
本を、ＨＢｅＡｇに関して陽性とみなし、５０％に等しいか、またはそれを超え
る阻害値％を有する標本を、抗ＨＢｅに関して陽性とみなす。

【図２】正常なＣＤラット（＿）、およびｐＨＢＶ−ＨＴＤでトランスフェクトされた
無胸腺ヌードラット（！）における、血清ＧＰＴレベルを例示するグラフである
。

【図３】

【化９７】の構造の模式図である。さらに、ノイラミニダーゼによる、

【化９８】の典型的なバイアンテナリーコンプレックスタイプ糖鎖の開裂部位も例示する。
略語：Ｆｕｃはフコース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎは
マンノース、Ｇａｌはガラクトース、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸。

【図４】［アルファ−³³Ｐ］−ｄＣＴＰを用いる放射性ＰＣＲによるＨＢＶＤＮＡの定
量化に関する標準曲線のグラフである。

【図５】培地中のインターフェロン濃度に対する、ＨＢＶＤＮＡトランスフェクトＨｅ
ｐＧ２細胞の培養物におけるＨＢＶコピー数のグラフである。ＨＢＶトランスフ
ェクトＨｅｐＧ２細胞を、ヒト天然ＩＦＮ−アルファ、ヒト天然ＩＦＮ−β、ま
たはアシアロＩＦＮ−ベータ（１０、１００、または１０００ＩＵ／ｍｌ）で、
２４時間毎に４８時間処理した。トランスフェクトＨｅｐＧ２細胞の培養上澄み
におけるＨＢＶ生成の減少は、培養上澄み１ミリリットルに存在するＨＢＶＤＮ
Ａ含有ビリオンのコピー数の減少によって示される。結果は、３つの実験で得ら
れた値の平均＋または−一標準偏差（ＳＤ）である。

【図６】時間に対する、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−オール］−２，５−
ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を用いる細胞生存能力検定におけ
るＯＤ₅₉₀のグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を、１０００ＩＵ／ｍｌの通常のＩ
ＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−β、またはアシアロＩＦＮ−βで、２４時間毎に７２
時間処理した。結果は、３つの実験で得られた値の平均＋または−ＳＤである。

【図７】未処理ＡＳＧＰ受容体陰性肝細胞、またはＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−β、ま
たはアシアロＩＦＮ−βで処理した同じ細胞におけるＨＢＶコピー数の棒グラフ
である。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、１０００ＩＵ／ｍｌのサイトカインで、２４
時間毎に４８時間処理した。結果は、３つの検定で得られた値の平均＋または−
ＳＤである。

【図８】様々な濃度のアシアロＩＦＮ−β、および／またはＡＳＧＰ受容体に対する競
合物質であるアシアロフェツインで処理した細胞におけるＨＢＶコピー数の棒グ
ラフである。ＨＢＶＤＮＡトランスフェクトＨｅｐＧ２細胞を、様々な濃度のア
シアロフェツイン（０〜１．０マイクロモル）の存在下、１００ＩＵ／ｍｌのア
シアロＩＦＮ−βで、２４時間毎に４８時間処理した。結果は、３つの実験で得
られた値の平均＋または−ＳＤである。

【図９】アシアロＩＦＮ−β、非特異的マウスＩｇＧ１／カッパ、またはヒトＩＦＮ−
βを無力化するマウス抗体で処理した細胞培養物におけるＨＢＶコピー数の棒グ
ラフである（Ｂ−０２、ＩｇＧ１／カッパ、ＪａｐａｎＩｍｍｕｎｏ−Ｍｏｎ
ｉｔｏｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒＩｎｃ．、日本東京）。ＨＢＶＤＮＡトランス
フェクトＨｅｐＧ２細胞を、１マイクログラム／ｍｌのＢ−０２抗体、または非
特異的マウス抗体の存在下、１００ＩＵ／ｍｌのアシアロＩＦＮ−βで、２４時
間毎に４８時間処理した。結果は、３つの実験で得られた値の平均＋または−Ｓ
Ｄである。

【図１０】様々な処理に関するＨＢＶトランスフェクトマウスにおける血清ＨＢＶビリオ
ンレベルの相対変化のプロットである。

【図１１】ＩＮＦ処理の時間数に対する、細胞培養物における２−５Ａシンテターゼ活性
のグラフである。白抜きの丸は、天然ＩＦＮ−β処理中の２−５Ａシンテターゼ
レベルを表す。黒塗りの丸は、アシアロＩＦＮ−β処理中の２−５Ａシンテター
ゼレベルを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 31/12 31/12 Ｃ１２Ｎ 5/02 ＺＮＡＣ１２Ｎ 5/02 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/576 Ｂ // Ｇ０１Ｎ 33/576 ＺＡ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AC20 BB34 CA46 4C076 AA11 BB11 BB13 BB15 BB16 CC16 CC35 DD23A DD26A EE30A EE41A FF12 4C084 AA02 AA03 BA44 DA01 DA12 DA13 DA15 DA16 DA17 DA18 DA19 DA21 DA24 DA25 DB52 DB54 DB55 DB56 DB59 DB60 DB61 MA01 MA17 MA65 MA66 NA14 ZA752 ZB332

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物においてウイルス性肝炎を治療する方法であって、
この方法が、治療用量のアシアロインターフェロンを含む組成物を哺乳動物に投
与する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】糖タンパク質の標的を肝細胞とする方法であって、この方法
が、糖タンパク質からシアル酸残基を除去することによって生成されたアシアロ糖
タンパク質を提供する段階、およびそのアシアロ糖タンパク質を肝細胞と接触させる段階を含み、その糖タンパク質が、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ
−１５、エリトロポイエチン、線維芽細胞増殖因子、顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子、ガンマインターフェロン、腫瘍壊死因子−β、白血病抑制因子、
マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ遊走阻止因子、神経発育因子
、オステオスタチン（ｏｓｔｅｏｓｔａｔｉｎ）Ｍ、血小板由来成長因子、幹細
胞増殖因子、トロンボポイエチン、血管内皮増殖因子、および肝細胞増殖因子か
らなるグループから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】肝細胞が肝臓の内部にあり、その肝臓が哺乳動物の内部にあ
ることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】アシアロ糖タンパク質を、哺乳動物へのアシアロ糖タンパク
質の静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内注射によって肝細胞と接触させること
を特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】糖タンパク質からシアル酸残基を除去することによって生成
されたアシアロ糖タンパク質を含む組成物であって、その糖タンパク質が、ＩＬ
−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−
１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、エリトロポイエチン
、線維芽細胞増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ガンマインタ
ーフェロン、腫瘍壊死因子−β、白血病抑制因子、マクロファージコロニー刺激
因子、マクロファージ遊走阻止因子、神経発育因子、オステオスタチンＭ、血小
板由来成長因子、幹細胞増殖因子、トロンボポイエチン、血管内皮増殖因子、お
よび肝細胞増殖因子からなるグループから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項６】さらに薬剤として許容される賦形剤を含むことを特徴とする
請求項５に記載の組成物。
【請求項７】哺乳動物においてウイルス性肝炎を治療する方法であって、
この方法が、哺乳動物がウイルス性肝炎を有することを確認する段階、および治
療用量のアシアロインターフェロンを含む組成物をその哺乳動物に投与する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】確認段階が、哺乳動物における肝炎ウイルス複製のレベルを
測定する段階を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】肝炎ウイルス複製のレベルが、肝炎ウイルス特異性ポリメラ
ーゼ連鎖反応を用いて測定されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】肝炎ウイルス複製のレベルが、哺乳動物の体液中の肝炎ウ
イルス抗原を検出することによって測定されることを特徴とする請求項８に記載
の方法。
【請求項１１】体液が血液であることを特徴とする請求項１０に記載の方
法。
【請求項１２】肝炎ウイルス抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスのｅ抗原であるこ
とを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】ウイルス性肝炎が、Ｂ型肝炎ウイルス感染によるものであ
ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】ウイルス性肝炎が、Ｃ型肝炎ウイルス感染によるものであ
ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１５】組成物が、皮下、筋肉内、動脈内、または静脈内に投与さ
れることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１６】治療用量が、約０．０２ｉｇから２００ｉｇ／ｋｇ（体重
）／日であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】治療用量が、約３０ｉｇから７５ｉｇ／日であることを特
徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】組成物がさらに、薬剤として許容される賦形剤を含むこと
を特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】賦形剤が、デキストロース、アルブミン、塩化ナトリウム
、リン酸ナトリウム、および水からなるグループから選択されることを特徴とす
る請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】治療用量が、約１００００から２０００００ＩＵ／ｋｇ（
体重）／日であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項７に記載の
方法。
【請求項２２】哺乳動物において貧血を治療する方法であって、この方法
が、治療用量のアシアロ糖タンパク質を含む組成物を提供する段階であって、その
アシアロ糖タンパク質が、糖タンパク質からシアル酸残基を除去することによっ
て生成され、その糖タンパク質が、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびエリ
トロポイエチンからなるグループから選択される段階、およびその組成物を哺乳動物に投与する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】Ｔ細胞の増殖、または分化を促進する方法であって、この
方法が、糖タンパク質からシアル酸残基を除去することによって生成されたアシアロ糖
タンパク質を提供する段階であって、その糖タンパク質が、ＩＬ−７、またはＩ
Ｌ１０である段階、およびＴ細胞をそのアシアロ糖タンパク質と接触させる段階を含むことを特徴とする
方法。
【請求項２４】Ｔ細胞が哺乳動物の内部にあり、接触段階が、アシアロ糖
タンパク質を含む組成物を哺乳動物に投与する段階を含むことを特徴とする請求
項２３に記載の方法。
【請求項２５】マクロファージの増殖、または分化を促進する方法であっ
て、この方法が、糖タンパク質からシアル酸残基を除去することによって生成されたアシアロ糖
タンパク質を提供する段階であって、その糖タンパク質が、ＧＭ−ＣＳＦ、また
はＭ−ＣＳＦである段階、およびマクロファージをそのアシアロ糖タンパク質と接触させる段階を含むことを特
徴とする方法。
【請求項２６】マクロファージが哺乳動物の内部にあり、接触段階が、ア
シアロ糖タンパク質を含む組成物を哺乳動物に投与する段階を含むことを特徴と
する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】哺乳動物において肝炎を治療する方法であって、この方法
が、糖タンパク質からシアル酸残基を除去することによって生成されたアシアロ糖
タンパク質を提供する段階であって、その糖タンパク質が、ＩＬ−１、ＩＬ−６
、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、または肝細胞増殖因子である段階、および治療用量のそのアシアロ糖タンパク質を哺乳動物に投与する段階を含むことを
特徴とする方法。