ES2673093T3 - Terapia combinada con hialuronidasa y un taxano dirigido a un tumor - Google Patents

Terapia combinada con hialuronidasa y un taxano dirigido a un tumor Download PDF

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Daniel C. Maneval
H. Michael Shepard
Curtis B. Thompson
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Abstract

Una combinación de composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas, en donde la combinación comprende: una primera composición que comprende una hialuronidasa conjugada con un polímero; y una segunda composición que comprende un taxano dirigido al tumor, en donde el taxano dirigido a un tumor comprende nab-paclitaxel o nab-docetaxel.

Description

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DESCRIPCIÓN
Terapia combinada con hialuronidasa y un taxano dirigido a un tumor
5 Campo de la invención
En la presente memoria se proporciona una terapia combinada que contiene un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, y un taxano dirigido a un tumor, y opcionalmente un agente quimioterapéutico adicional tal como un análogo de nucleósido. La terapia combinada se
10 puede utilizar en métodos para tratar cánceres, y en particular cánceres de tumores sólidos.
Antecedentes
Los agentes anti-hialuronano, tales como las enzimas de degradación de hialuronano, p.ej., PH20, se utilizan en
15 métodos para tratar enfermedades o afecciones asociadas a hialuronano, incluyendo cánceres y en particular cánceres o tumores asociados a hialuronano. El hialuronano (ácido hialurónico, HA) es un glicosaminoglicano que existe predominantemente en tejidos conjuntivos, piel, cartílago y en líquido sinovial en mamíferos. En el tejido conectivo, el agua de hidratación asociada con el hialuronano crea matrices hidratadas entre los tejidos. El HA se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en tejidos conectivos blandos. Ciertas
20 enfermedades están asociadas con la expresión y/o producción de hialuronano, incluyendo los tumores sólidos. Los agentes antihialuronano son agentes que modulan la síntesis o degradación de HA, alterando así los niveles de HA en un tejido o célula. Específicamente, las hialuronidasas son enzimas que degradan el hialuronano. Al catalizar la descomposición de HA, las hialuronidasas se pueden utilizar para tratar enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de HA u otros glicosaminoglicanos, incluyendo cánceres y tumores. Para el tratamiento de cánceres, y
25 en particular cánceres de tumores sólidos, existe la necesidad de tratamientos terapéuticos mejorados o alternativos.
Compendio
La presente invención proporciona una combinación de composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer de
30 páncreas, en donde la combinación comprende: una primera composición que comprende una hialuronidasa conjugada con un polímero; y una segunda composición que comprende un taxano dirigido a un tumor, en el que el taxano dirigido a un tumor comprende nab-paclitaxel o nab-docetaxel.
La invención proporciona adicionalmente una composición que comprende una hialuronidasa conjugada con un
35 polímero para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas, en donde: la hialuronidasa se utiliza con un taxano dirigido a un tumor y se administra simultáneamente, casi simultáneamente, por separado o sucesivamente a un sujeto con el taxano dirigido a un tumor; y el taxano dirigido a un tumor comprende nab-paclitaxel o nab-docetaxel.
En la presente memoria se proporcionan combinaciones que contienen una composición que contiene un agente
40 antihialuronano y una composición que contiene un taxano dirigido a un tumor. También se proporcionan en la presente memoria combinaciones que contienen una composición que contiene un agente antihialuronano, una composición que contiene un taxano dirigido a un tumor y una composición que contiene un análogo de nucleósido. Cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria puede contener adicionalmente una composición que contiene un corticosteroide. Se proporcionan en la presente memoria combinaciones o
45 composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en donde se administran una composición que contiene un agente antihialuronano y una composición que contiene una formulación de taxano dirigido a un tumor. En algunos ejemplos, los métodos incluyen adicionalmente la administración de una composición que contiene un análogo de nucleósido. En algunos ejemplos, los métodos incluyen adicionalmente la administración de un corticosteroide. En otros ejemplos más, los métodos incluyen adicionalmente la administración de un tratamiento
50 contra el cáncer. En tales combinaciones y métodos, los agentes se proporcionan en cantidades terapéuticamente eficaces como se describe en la presente memoria.
También se describen en la presente memoria los usos médicos de la terapia combinada. Por ejemplo, se describen en la presente memoria los usos de un agente antihialuronano y un taxano dirigido a un tumor para tratar el cáncer 55 de páncreas, en donde el agente antihialuronano y el taxano dirigido a un tumor se formulan por separado o juntos. También se proporcionan en la presente memoria los usos de un agente antihialuronano para tratar el cáncer de páncreas, en donde dicho tratamiento incluye la administración simultánea, separada o sucesiva a un sujeto de un taxano dirigido a un tumor. También se proporcionan en la presente memoria composiciones que contienen un agente antihialuronano para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas, en donde dicho tratamiento incluye la
60 administración simultánea, separada o sucesiva a un sujeto de un taxano dirigido a un tumor. En los ejemplos de los usos médicos en la presente memoria, el tratamiento también puede incluir la administración a un sujeto un análogo de nucleósido simultáneamente, por separado o sucesivamente con el agente antihialuronano o taxano dirigido a un tumor. En otros ejemplos o en ejemplos adicionales, el tratamiento puede incluir administrar un corticosteroide simultáneamente, por separado o sucesivamente con el agente antihialuronano.
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En las combinaciones, composiciones y usos proporcionados en la presente memoria, el agente antihialuronano es una enzima de degradación de hialuronano o es un agente que inhibe la síntesis de hialuronano. En algunos ejemplos, el agente antihialuronano es una enzima de degradación de hialuronano que es una hialuronidasa. En otros ejemplos, el agente antihialuronano es una enzima de degradación de hialuronano que está conjugada con un 5 polímero. En algunos ejemplos, el agente antihialuronano es un agente que inhibe la síntesis de hialuronano que se selecciona entre una molécula de ácido nucleico efectora o antisentido contra una HA sintasa o es un fármaco de molécula pequeña. En algunos ejemplos, el agente antihialuronano es un fármaco de molécula pequeña seleccionado entre 4-metilumbeliferona (MU) o un derivado de la misma, o leflunomida o un derivado de la misma. En otros ejemplos, el agente antihialuronano es un fármaco de molécula pequeña que es un derivado de 4
10 metilumbeliferona (MU) seleccionado entre 6,7-dihidroxi-4-metil cumarina o 5,7-dihidroxi-4-metil cumarina.
En la presente memoria se proporcionan combinaciones que contienen una composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano que está conjugada con un polímero y una composición que contiene un taxano dirigido a un tumor. También se proporcionan en la presente memoria combinaciones que contienen una 15 composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano que está conjugada con un polímero, una composición que contiene un taxano dirigido a un tumor y una composición que contiene un análogo de nucleósido. Cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria puede contener adicionalmente una composición que contiene un corticosteroide. Se proporcionan en la presente memoria combinaciones o composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas en donde se administran una composición que
20 contiene una enzima de degradación de hialuronano que está conjugada con un polímero y una composición que contiene una formulación de taxano dirigido a un tumor. En algunos ejemplos, los métodos incluyen adicionalmente la administración de una composición que contiene un análogo de nucleósido. En algunos ejemplos, los métodos incluyen adicionalmente la administración de un corticosteroide. En otros ejemplos más, los métodos incluyen adicionalmente la administración de un tratamiento contra el cáncer.
25 En la presente memoria se proporcionan combinaciones y usos que contienen una composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano, en donde la enzima de degradación de hialuronano está conjugada con un polímero; y una composición que contiene un taxano dirigido a un tumor. En algunos ejemplos de la combinación, las composiciones se formulan para administración directa, la concentración de enzima de degradación de
30 hialuronano es suficiente para degradar hialuronano asociado a tumor, y la concentración de taxano dirigido a un tumor es suficiente para lograr el suministro intratumoral. En algunos ejemplos, la concentración de formulación de taxano dirigido a un tumor es suficiente para reducir los niveles de proteína de nucleósido desaminasa intratumoral o la actividad de proteína en comparación con los niveles o actividad de la nucleósido desaminasa en ausencia de la formulación de taxano intratumoral. En algunos ejemplos de las combinaciones, la enzima de degradación de
35 hialuronano y el taxano dirigido a un tumor se co-formulan. En otros ejemplos de las combinaciones, la enzima de degradación de hialuronano y el taxano dirigido a un tumor se proporcionan por separado.
En cualquiera de los ejemplos, las combinaciones proporcionadas contienen adicionalmente una composición que contiene un análogo de nucleósido. En ejemplos particulares, la composición se formula para administración directa 40 y la concentración de análogo de nucleósido es suficiente para lograr el suministro intratumoral. En algunos ejemplos de la combinación, el análogo de nucleósido se proporciona por separado de la enzima de degradación de hialuronano y del taxano dirigido a un tumor. En otros ejemplos de la combinación, el análogo de nucleósido se coformula con la enzima de degradación de hialuronano o se co-formula con el taxano dirigido a un tumor. En otros ejemplos más de la combinación, el análogo de nucleósido se co-formula con la enzima de degradación de
45 hialuronano y el taxano dirigido a un tumor.
En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, las composiciones que contienen una enzima de degradación de hialuronano, composiciones que contienen un taxano dirigido a un tumor y/o composiciones que contienen un análogo de nucleósido se formulan para administración de
50 dosificación múltiple. En otros ejemplos de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, las composiciones que contienen una enzima de degradación de hialuronano, composiciones que contienen un taxano dirigido a un tumor y/o composiciones que contienen un análogo de nucleósido se formulan para administración de una sola dosis.
55 En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, la composición enzimática de degradación de hialuronano contiene o está formulada para contener entre o aproximadamente entre 0,5 μg a 50 mg, 100 μg a 1 mg, 1 mg a 20 mg, 100 μg a 5 mg, 0,5 μg a 1.450 μg, 1 μg a
1.000 μg, 5 μg a 1.250 μg, 10 μg a 750 μg, 50 μg a 500 μg, 0,5 μg a 500 μg, 500 μg a 1.450 μg de enzima de degradación de hialuronano conjugado con un polímero. En otros ejemplos de las combinaciones proporcionadas en
60 la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero tiene una actividad específica de al menos o aproximadamente 20.000 U/mg, 25.000 U/mg, 30.000 U/mg, 31.000 U/mg, 32.000 U/mg,
33.000 U/mg, 34.000 U/mg, 35.000 U/mg, 36.000 U/mg, 37.000 U/mg, 38.000 U/mg, 39.000 U/mg, 40.000 U/mg,
45.000 U/mg, 50.000 U/mg, 55.000 U/mg, 60.000 U/mg o más. En otros ejemplos de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, la composición enzimática de degradación de hialuronano contiene entre o aproximadamente entre 150 unidades (U) a 60.000 U, 300 U a 30.000 U, 500 U a 25.000 U, 500 U a 10.000 U, 150 U a 15.000 U, 150 U a 5.000 U, 500 U a 1.000 U, 5.000 U a 45.000 U 10.000 U a 50.000 U o 20.000 U a 60.000 U de enzima de degradación de hialuronano conjugada con unpolímero. El volumen de la composición que contiene la enzima de degradación de hialuronano puede estar entre o puede estar aproximadamente entre 0,5 mL a 100 mL,
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5 0,5mLa50mL,0,5mLa10mL,1mLa40mL,1mLa20mL,1mLa10mLo3mLa10mL.Enalgunosejemplos de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, la composición que contiene una enzima degradación de hialuronano contiene histidina y/o NaCl. En otros ejemplos, la composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano tiene un pH que está entre o aproximadamente entre 6,0 y 7,4.
10 En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano es una hialuronidasa. Por ejemplo, la hialuronidasa puede ser una PH20 o una forma truncada de la misma que carece de un sitio de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porción del sitio de anclaje de GPI. En algunos ejemplos, la hialuronidasa es una PH20 que es una PH20 humana o no humana. En un ejemplo específico, la enzima de degradación de hialuronano es una PH20 truncada y la PH20 truncada
15 contiene una secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 36-464 de SEC ID NO: 1, o contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36 -464 de SEC ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa. En algunos ejemplos, la hialuronidasa es PH20 que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia
20 de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de SEC ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa.
En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, la PH20 contiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de 25 aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o es una variante de la misma que exhibe al menos un 85% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 30 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa. Por ejemplo, la PH20 contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476 , 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484,
35 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa.
En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, el taxano dirigido a un tumor es paclitaxel o docetaxel. El taxano dirigido a un tumor se puede conectar directa o 40 indirectamente a un radical de direccionamiento tumoral. En algunos ejemplos, el taxano dirigido a un tumor se formula como un vehículo de suministro seleccionado entre una micela, nanopartícula, microesfera, liposomas o hidrogel. El vehículo de suministro se puede conectar unir directa o indirectamente a un radical de direccionamiento tumoral. En algunos ejemplos, el radical de direccionamiento tumoral se selecciona entre una macromolécula, una proteína, un péptido, un anticuerpo monoclonal o un lípido de ácido graso. En otros ejemplos, el radical de
45 direccionamiento tumoral es un anticuerpo monoclonal seleccionado entre cetuximab o trastuzumab. En otros ejemplos más, el radical de direccionamiento tumoral es albúmina. De acuerdo con las presentes reivindicaciones, el taxano dirigido a un tumor es paclitaxel unido a albúmina o docetaxel unido a albúmina.
En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, la
50 composición de taxano dirigido a un tumor contiene o está formulada para contener entre o aproximadamente entre 10 mg y 1.000 mg, tal como 20 mg y 500 mg, 10 mg y 250 mg, 75 mg y 400 mg, 100 mg y 200 mg, 150 mg y 400 mg, 200 mg y 800 mg, 50 mg y 200 mg o 50 mg y 150 mg de taxano dirigido a un tumor. En otros ejemplos, el volumen de la composición que contiene un taxano dirigido a un tumor está entre o aproximadamente entre 0,5 mL y 100 mL, 1 mL y 500 mL, 0,5 mL y 50 mL, 0,5 mL y 10 mL, 1 mL y 40 mL, 1 mL y 20 mL, 1 mL y 10 mL o 3 mL y 10
55 mL.
En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, el análogo de nucleósido es un análogo de purina o pirimidina o sus derivados. En algunos ejemplos, el análogo de nucleósido se selecciona entre fluoropirimidina, 5-fluorouracilo, 5-fluoro-2'-desoxicitidina, citarabina, gemcitabina, troxacitabina,
60 decitabina, Azacitidina, pseudoisocianidina, Zebularina, Ancitabina, Fazarabina, 6-azacitidina, capecitabina, N4octadecil-citarabina, ácido elaídico citarabina, fludarabina, cladribina, clofarabina, nelarabina, forodesina y pentostatina, o sus derivados. En un ejemplo, el análogo de nucleósido es un sustrato para una nucleósido desaminasa que es adenosina desaminasa o citidina desaminasa. En algunos ejemplos, el análogo de nucleósido se selecciona entre fludarabina, citarabina, gemcitabina, decitabina y azacitidina o sus derivados.
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En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, la composición del análogo de nucleósido contiene o está formulada para contener de 100 mg a 5.000 mg, de 500 mg a 5.000 mg, de 500 mg a 2.500 mg, de 1.000 mg a 2.500 mg, 1.500 mg a 2.500 mg o 2.000 mg a 5.000 mg de un análogo de nucleósido. En otros ejemplos, el volumen de la composición que contiene un análogo de nucleósido
5 está entre o aproximadamente entre 0,5 mL y 1.000 mL, tal como 0,5 mL y 100 mL, 0,5 mL y 10 mL, 1 mL y 500 mL, 1 mL y 10mL.
Cualquiera de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria puede contener adicionalmente una composición que contiene un corticosteroide. En algunos ejemplos, el corticosteroide es un glucocorticoide que
10 se selecciona entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas. En algunos ejemplos, la composición de corticosteroides contiene o está formulada para contener entre o aproximadamente entre 0,1 y 20 mg, 0,1 y 15 mg, 0,1 y 10 mg, 0,1 y 5 mg, 0,2 y 20 mg, 0,2 y 15 mg, 0,2 y 10 mg, 0,2 y 5 mg, 0,4 y 20 mg, 0,4 y 15 mg, 0,4 y 10 mg, 0,4 y 5 mg, 0,4 y 4 mg, 1 y 20 mg, 1 y 15 mg o 1 y 10 mg de corticosteroide.
15 En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, las composiciones se formulan para administración oral, intravenosa (IV), subcutánea, intramuscular, intratumoral, intradérmica, tópica, transdérmica, rectal, intratecal o subepidérmica. Por ejemplo, las composiciones se formulan para administración intravenosa o administración subcutánea.
20 En cualquiera de los ejemplos de las combinaciones, métodos y usos descritos en la presente memoria, el polímero es un polialquilenglicol, dextrano, pululano o celulosa. En un ejemplo, el polímero es un polialquilenglicol que se selecciona entre polietilenglicoles (PEG) o metoxipolietilenglicoles (mPEG). En un ejemplo específico, el polímero es un PEG, y el PEG es un PEG ramificado o lineal. En algunos ejemplos, el polímero se produce por reacción con
25 metoxi-poli(etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (5 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (20 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (30 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-α-metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) (20 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-αmetilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) (30 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-butiraldehído (mPEG-butiraldehído) (30 kDa), metoxi-poli(etilenglicol)-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA) (20 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)
30 propionato de succinimidilo (mPEG-SPA) (30 kDa); (metoxi-poli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (10 kDa ramificado); (metoxi-poli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (20 kDa ramificado); (metoxi-poli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (40 kDa ramificado); (metoxipoli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (60 kDa ramificado); biotina-poli(etilenglicol)-éster de N-hidroxisuccinimida (biotina-PEG-NHS) (5 kDa biotinilado); poli(etilenglicol)-carbonato de p-nitrofenilo (PEG
35 carbonato de p-nitrofenilo) (30 kDa); o poli(etilenglicol)-propionaldehído (PEG-propionaldehído) (30 kDa). En ejemplos específicos, el polímero es un PEG que tiene un peso molecular de 30 o aproximadamente 30 kilodaltons.
Cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria se puede empaquetar como un kit y opcionalmente incluir instrucciones de uso.
40 También se proporcionan en la presente memoria combinaciones o composiciones para utilizar en el tratamiento de cáncer de páncreas en donde se administra una composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano, en donde la enzima de degradación de hialuronano se conjuga con un polímero y se administra una composición que contiene una formulación de taxano dirigido a un tumor. En cualquiera de los ejemplos del método,
45 también se administra una composición que contiene un análogo de nucleósido.
En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, el cáncer es un tumor. En un ejemplo, el tumor es un tumor sólido. En cualquiera de los ejemplos del método o usos de la presente memoria, el tumor presenta un aumento de expresión celular y/o estromal de un hialuronano, en comparación con un tejido no
50 canceroso del mismo tipo de tejido o en comparación con un tumor no metastásico del mismo tipo de tumor. En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, el cáncer se selecciona entre cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama. De acuerdo con las presentes reivindicaciones, el cáncer es cáncer de páncreas.
55 En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano es una hialuronidasa. Por ejemplo, la hialuronidasa es una PH20 o forma truncada de la misma que carece de un sitio de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porción del sitio de unión de GPI. En un ejemplo específico, la hialuronidasa es una PH20 que es una PH20 humana o no humana. En un ejemplo particular,
60 la enzima de degradación de hialuronano es una PH20 truncada y la PH20 truncada contiene una secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 36-464 de SEC ID NO: 1, o contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36 -464 de SEC ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa. En algunos ejemplos, la PH20 contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
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95%, 96%, 97 %, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de SEC ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa. En otros ejemplos, la PH20 contiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478. , 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 5 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o es una variante de la misma que exhibe al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470 , 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495 , 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 1 y 10 conserva la actividad hialuronidasa. En otros ejemplos más, la PH20 contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475 , 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos
15 expuesta en SEC ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa.
En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, el polímero es un polialquilenglicol, dextrano, pululano o celulosa. En un ejemplo, el polímero es un polialquilenglicol que se selecciona entre polietilenglicoles (PEG) o metoxipolietilenglicoles (mPEG). En un ejemplo específico, el polímero es un PEG, y 20 el PEG es un PEG ramificado o lineal. En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos proporcionados en la presente memoria, el polímero se produce por reacción con metoxi-poli(etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (5 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (20 kDa); metoxipoli(etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (30 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-α-metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) (20 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-α-metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) (30 25 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-butiraldehído (mPEG-butiraldehído) (30 kDa), metoxi-poli(etilenglicol)-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA) (20 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA) (30 kDa); (metoxi-poli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (10 kDa ramificado); (metoxipoli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (20 kDa ramificado); (metoxi-poli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (40 kDa ramificado); (metoxi-poli(etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida
30 (mPEG2-NHS) (60 kDa ramificado); biotina-poli(etilenglicol)-éster de N-hidroxisuccinimida (biotina-PEG-NHS) (5 kDa biotinilado);poli(etilenglicol)-carbonato dep-nitrofenilo(PEG-carbonato dep-nitrofenilo)(30kDa);opoli(etilenglicol)propionaldehído (PEG-propionaldehído) (30 kDa). En un ejemplo específico, el polímero es un PEG que tiene un peso molecular de 30 o aproximadamente 30 kilodaltons.
35 En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano se administra o se formula para su administración en una cantidad de intervalo de dosificación de entre o aproximadamente entre aproximadamente 0,01 μg/kg a 25 mg/kg (del sujeto), 0,5 μg/kg y 25 mg/kg, 0,5 μg/kg y 10 mg/kg, 0,02 mg/kg y 1,5 mg/kg, 0,01 μg/kg y 15 μg/kg, 0,05 μg/kg y 10 μg/kg , 0,75 μg/kg y 7,5 μg/kg o 1,0 μg/kg y 3,0 μg/kg (del sujeto). En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos proporcionados en la
40 presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano se administra o se formula para administración en una cantidad de intervalo de dosificación de entre aproximadamente 1 Unidad/kg y 800.000 Unidades/kg (del sujeto), tal como entre 10 y 800,000 Unidades/kg, 10 y 750.000 Unidades/kg, 10 y 700.000 Unidades/kg, 10 y 650.000 Unidades/kg, 10 y 600.000 Unidades/kg, 10 y 550.000 Unidades/kg, 10 y 500.000 Unidades/kg, 10 y 450.000 Unidades/kg, 10 y 400.000 Unidades/kg, 10 y 350.000 Unidades/kg, 10 y 320.000 Unidades/kg, 10 y 300.000
45 Unidades/kg, 10 y 280.000 Unidades/kg, 10 y 260.000 Unidades/kg, 10 y 240.000 Unidades/kg, 10 y 220.000 Unidades/kg, 10 y 200.000 Unidades/kg, 10 y 180.000 Unidades/kg, 10 y 160.000 Unidades/kg, 10 y 140.000 Unidades/kg, 10 y 120.000 Unidades/kg, 10 y 100.000 Unidades/kg, 10 y 80.000 Unidades/kg, 10 y 70.000 Unidades/kg, 10 y 60.000 Unidades/kg, 10 y 50.000 Unidades/kg, 10 y 40.000 Unidades/kg, 10 y 30.000 Unidades/kg, 10 y 20.000 Unidades/kg, 10 y 15.000 Unidades/kg, 10 y 12.800 Unidades/kg, 10 y 10.000
50 Unidades/kg, 10 y 9.000 Unidades/kg, 10 y 8.000 Unidades/kg, 10 y 7.000 Unidades/kg, 10 y 6.000 Unidades/kg, 10 y 5.000 Unidades/kg, 10 y 4.000 Unidades/kg, 10 y 3.000 Unidades/kg, 10 y 2.000 Unidades/kg, 10 y 1.000 Unidades/kg, de 10 y 900 Unidades/kg, 10 y 800 Unidades/kg, 10 y 700 Unidades/kg, 10 y 500 Unidades/kg, 10 y 400 Unidades/kg, 10 y 300 Unidades/kg, 10 y 200 Unidades/kg, 10 y 100 Unidades/kg, 16 y 600.000 Unidades/kg, 16 y 500.000 Unidades/kg, 16 y 400.000 Unidades/kg, 16 y 350.000 Unidades/kg, 16 y 320.000 Unidades/kg, 16 y
55 160.000 Unidades/kg, 16 y 80.000 Unidades/kg, 16 y 40.000 Unidades/kg, 16 y 20.000 Unidades/kg, 16 y 16.000 Unidades/kg, 16 y 12.800 Unidades/kg , 16 y 10.000 Unidades/kg, 16 y 5.000 Unidades/kg, 16 y 4.000 Unidades/kg, 16 y 3.000 Unidades/kg, 16 y 2.000 Unidades/kg, 16 y 1.000 Unidades/kg, 16 y 900 Unidades/kg, 16 y 800 Unidades/kg, 16 y 700 Unidades/kg, 16 y 500 Unidades/kg, 16 y 400 Unidades/kg, 16 y 300 Unidades/kg, 16 y 200 Unidades/kg, 16 y 100 Unidades/kg, 160 y 12.800 Unidades/kg, 160 y 8.000 Unidades/kg, 160 y 6.000 Unidades/kg,
60 160 y 4.000 Unidades/kg, 160 y 2.000 Unidades/kg, 160 y 1.000 Unidades/kg, 160 y 500 Unidades/kg, 500 y 5.000 Unidades/kg, 1.000 y 100.000 Unidades/kg o 1.000 y 10.000Unidades/kg (del sujeto).
En cualquiera de los ejemplos delos métodos o usos descritos en la presentememoria, el taxano dirigido a un tumor es paclitaxel o docetaxel. El taxano dirigido a un tumor se puede unir directa o indirectamente a un radical de
imagen6
direccionamiento tumoral. En algunos ejemplos, el taxano dirigido a un tumor se formula como un vehículo de suministro seleccionado de entre una micela, nanopartícula, microesfera, liposomas o hidrogel. El vehículo de suministro se puede unir directa o indirectamente a un radical de direccionamiento tumoral. En algunos ejemplos, el radical de direccionamiento tumoral se selecciona entre una macromolécula, una proteína, un péptido, un anticuerpo 5 monoclonal o un lípido de ácido graso. En otros ejemplos, el radical de direccionamiento tumoral es un anticuerpo monoclonal seleccionado entre cetuximab o trastuzumab. De acuerdo con las presentes reivindicaciones, el radical de direccionamiento tumoral es albúmina. El taxano dirigido a un tumor es paclitaxel unido a albúmina o docetaxel unido a albúmina. En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos proporcionados en la presente memoria, el taxano dirigido a un tumor se administra o se formulado para la administración en un intervalo de dosificación que
10 está entre o aproximadamente entre 1 mg/m2 y 1.000 mg/m2 (área de superficie corporal del sujeto), 10 mg/m2 y 500 mg/m2, 50 mg/m2 y 400 mg/m2, o 25 mg/m2 y 300 mg/m2.
En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, el análogo de nucleósido es un análogo de purina o pirimidina o sus derivados. En cualquiera de los ejemplos, el análogo de nucleósido se 15 selecciona entre fluoropirimidina 5-fluorouracilo, 5-fluoro-2'-desoxicitidina, citarabina, gemcitabina, troxacitabina, decitabina, Azacitidina, pseudoisocianidina, Zebularina, Ancitabina, Fazarabina, 6-azacitidina, capecitabina, N4octadecil-citarabina, ácido elaídico citarabina, fludarabina, cladribina, clofarabina, nelarabina, forodesina y pentostatina, o sus derivados. En un ejemplo concreto, el análogo de nucleósido es un sustrato para una nucleósido desaminasa y la nucleósido desaminasa es adenosina desaminasa o citidina desaminasa. En los ejemplos, el 20 análogo de nucleósido se selecciona entre fludarabina, citarabina, gemcitabina, decitabina y azacitidina o derivados de las mismas. En otros ejemplos más, el análogo de nucleósido es gemcitabina o un derivado de la misma. En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos proporcionados en la presentememoria, el análogo de nucleósido se administra o se formula para administración en un intervalo de dosificación que está entre o entre aproximadamente 100 mg/m2 y 2.500 mg/m2, 500 mg/m2 y 2.000 mg/m2, 750 mg/m2 y 1.500 mg/m2, 1.000 mg/m2 y 25 1500 mg/m2, o 500 mg/m2 y 1.500 mg/m2. En otros ejemplos de los métodos o usos proporcionados en la presente memoria, el análogo de nucleósido se administra o se formula para administración en una cantidad que es al menos
o al menos aproximadamente 200mg/m2 o 500 mg/m2 peroque es menos de 1.000mg/m2 o 1.250 mg/m2.
En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, las composiciones se
30 administran o se formulan para administración oral, intravenosa (IV), subcutánea, intramuscular, intratumoral, intradérmica, tópica, transdérmica, rectal, intratecal o sub-epidérmica. En un ejemplo concreto, las composiciones se administran por vía intravenosa o subcutánea. En cualquiera de los métodos o usos en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano se administra o se utiliza antes, simultáneamente o casi simultáneamente, sucesiva o intermitentemente con el taxano dirigido a un tumor.
35 En ejemplos de los métodos descritos en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano se administra antes de la administración del taxano dirigido a un tumor. En un ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano se administra al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24
40 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas antes de la administración del taxano dirigido a un tumor. En otro ejemplo de los métodos proporcionados en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano y el taxano dirigido a un tumor se administran simultáneamente o casi simultáneamente.
En cualquiera de los ejemplos de los métodos descritos en la presente memoria, la frecuencia de administración de
45 la enzima de degradación de hialuronano es dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada 14 días, una vez cada 21 días o una vez al mes. En otros ejemplos, la frecuencia de administración del taxano dirigido a un tumor es dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada 14 días, una vez cada 21 días o una vez al mes. En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos proporcionados en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano y/o el taxano dirigido a un tumor se administran o se formulan para administración
50 antes, simultáneamente o casi simultáneamente, sucesivamente o intermitentemente con el análogo de nucleósido.
En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano y el taxano dirigido a un tumor se administran durante un número predeterminado de semanas en un ciclo de administración. En un ejemplo, el número predeterminado de semanas puede ser de al menos dos 55 semanas, al menos tres semanas o al menos cuatro semanas. En algunos ejemplos, la enzima de degradación de hialuronano se administra al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas antes de la administración del análogo de nucleósido. En algunos ejemplos, el taxano dirigido a un tumor se administra al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 1 60 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas o 24 horas antes de la administración del análogo de nucleósido. En un ejemplo concreto, el taxano dirigido a un tumor se administra simultáneamente o casi simultáneamente con el análogo de nucleósido. En los métodos proporcionados, la frecuencia de administración del análogo de nucleósido puede ser dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada 14 días, una vez cada 21 días o una vez al mes. En algunos ejemplos, el análogo de nucleósido se
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administra durante un número predeterminado de semanas en un ciclo de administración. Por ejemplo, el número predeterminado de semanas puede ser de al menos dos semanas, al menos tres semanas o al menos cuatro semanas. En otro ejemplo de los métodos proporcionados en la presente memoria, después del número predeterminado de semanas de administración del análogo de nucleósido, la administración se interrumpe durante
5 un primer período de tiempo predeterminado, y a continuación se reanuda durante al menos una semana.
En ejemplos concretos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano y el taxano dirigido a un tumor se administran antes de la administración del análogo de nucleósido; se administran simultáneamente o casi simultáneamente; y se administran a una frecuencia de administración de dos 10 veces por semana o una vez por semana durante un número predeterminado de semanas. En algunos ejemplos, el número predeterminado de semanas es de cuatro semanas. En tales ejemplos, el análogo de nucleósido se administra al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano y del taxano
15 dirigido a un tumor.
En cualquiera de los ejemplos de los métodos o usos descritos en la presente memoria, el análogo de nucleósido se administra una vez a la semana durante un número predeterminado de semanas. En un ejemplo, el número predeterminado de semanas es de tres semanas. En tales ejemplos, la administración puede suspenderse durante
20 al menos una semana.
En cualquiera de los métodos o usos descritos en la presente memoria, el ciclo de administración y/o interrupción de la administración puede repetirse una pluralidad de veces. En algunos ejemplos, la frecuencia de administración en el primer ciclo de administración es la misma que la frecuencia de administración en ciclos de administración
25 posteriores. Por ejemplo, la frecuencia de administración es dos veces a la semana en el primer ciclo de administración y una vez a la semana en ciclos posteriores de administración.
Cualquiera de los métodos o usos descritos en la presente memoria puede incluir adicionalmente una etapa de administración de un corticosteroide o un tratamiento que incluye la administración de un corticosteroide. En 30 cualquiera de estos ejemplos, el corticosteroide es un glucocorticoide que puede seleccionarse entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas. En algunos ejemplos del método, el corticosteroide se administra antes, junto con, intermitentemente o después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En un ejemplo, el corticosteroide se co-administra con la enzima de degradación de hialuronano. En otro ejemplo, el corticosteroide se administra al menos o aproximadamente al menos 1 hora antes 35 de la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En otro ejemplo de los métodos proporcionados, el corticosteroide se administra al menos de 8 horas a 12 horas después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En algunos ejemplos, la cantidad de corticosteroide administrada es o está formulada para la administración entre 0,1 y 20 mg, 0,1 a 15 mg, 0,1 y 10 mg, 0,1 y 5 mg, 0,2 y 20 mg, 0,2 y 15 mg., 0,2 y 10 mg, 0,2 y 5 mg, 0,4 y 20 mg, 0,4 y 15 mg, 0,4 y 10 mg, 0,4 y 5 mg, 0,4 y 4 mg, 1 y 20 mg, 1 y 15 mg o 1 y 10 mg. El
40 corticosteroide se puede administrar por vía oral.
Cualquiera de los métodos o usos descritos en la presente memoria puede incluir adicionalmente la administración de un tratamiento contra el cáncer. En algunos ejemplos, el tratamiento contra el cáncer se selecciona entre cirugía, radiación, un agente quimioterapéutico, un agente biológico, un polipéptido, un anticuerpo, un péptido, una molécula
45 pequeña, un vector de terapia génica, un virus y ADN. Cualquiera de las combinaciones y composiciones proporcionadas en la presentememoria se puede utilizar para tratar a un sujeto que es un ser humano.
También se proporcionan en la presente memoria combinaciones de composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas. Cualquiera de las combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente memoria 50 se puede utilizar para tratar el cáncer. En algunos ejemplos, el cáncer es un tumor. Por ejemplo, el cáncer es un tumor sólido. En algunos ejemplos, el tumor presenta un aumento de la expresión celular y/o estromal de un hialuronano, en comparación con un tejido no canceroso del mismo tipo de tejido o en comparación con un tumor no metastásico del mismo tipo de tumor. En algunos ejemplos, el cáncer se selecciona entre cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino, cáncer de
55 cabezaycuelloycáncerdemama.Deacuerdoconlaspresentesreivindicaciones,elcáncerescáncerdepáncreas. También se describe en la presente memoria el uso de una combinación que contiene una enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero y una composición que contiene un taxano dirigido a un tumor para aumentar la actividad intratumoral de un análogo de nucleósido.
60 Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa el efecto de PEGPH20 (P) y/o nab-paclitaxel (NAB, N) sobre el crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto de tumor PDA en BxPC-3 de ratón. La Figura 2 describe los efectos de la administración de dosis variables de gemcitabina (GEM) sobre el
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crecimiento del tumor en unmodelo de xenoinjerto de tumor PDA en BxPC-3 de ratón. La Figura 3 representa el efecto de PEGPH20 (P), gemcitabina (GEM, G) y/o nab-paclitaxel (NAB, N) sobre el crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto de tumor PDA en BxPC-3 de ratón. La Figura 4 representa la mediana del tiempo de supervivencia de los ratones tratados con PEGPH20 (P),
5 gemcitabina (GEM, G) y/o nab-paclitaxel (NAB, N) en un modelo de xenoinjerto de tumor PDA en BxPC-3 de ratón. La Figura 5 representa los niveles de CA19-9 (Figura 5A) y marcador CEA (Figura 5B) del suero de ratones tratados con PEGPH20 (P), gemcitabina (GEM, G) y/o nab-paclitaxel (NAB, N) en un modelo de xenoinjerto de tumor ratón PDA en BxPC-3.
10 La Figura 6 representa la inhibición del crecimiento tumoral de PEGPH20 y paclitaxel conjugado con albúmina (Ab-pac) en un modelo de xenoinjerto. La Figura 6A representa la inhibición del crecimiento tumoral en ratones tratados con vehículo, paclitaxel conjugado con albúmina (Ab-pac), PEGPH20, o Ab-pac y PEGPH20 en el modelo tumoral MDA-MB-468/HAS3. La Figura 6B representa la inhibición del crecimiento tumoral en ratones tratados con vehículo, paclitaxel conjugado con albúmina (Ab-pac) a 1 mg/kg, Ab-pac a 3
15 mg/kg,Ab-paca1mg/kgyPEGPH20,oAb-paca10mg/kgenelmodelodetumorMDA-MB-468/HAS3.
Descripción detallada
Esquema
20 A. Definiciones
B. Terapia combinada con agente anti-hialuronano
1. Tumores sólidos y terapias dirigidas contra tumores 25
a.
Taxano dirigido a un tumor
b.
Agente anti-hialuronano
2. Terapia combinada con agente anti-hialuronano y taxano dirigido a un tumor 30
C. Agentes deterapia combinada
1. Agentes anti-hialuronano
35 a. Agentes que inhiben la síntesis de hialuronano
b. Enzimas de degradación de hialuronano y enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero
i. Hialuronidasas 40
(a)
Hialuronidasas PH20 detipo mamífero
(b)
Hialuronidasa bacteriana
(c)
Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos
45 ii. Otras enzimas de degradación de hialuronano
iii. Enzimas de degradación de hialuronano solubles
(a) PH20 humana soluble
(b) rHuPH20 50
iv.
Glicosilación de enzimas de degradación de hialuronano
v.
Enzimas de degradación de hialuronanomodificadas (conjugadas con polímero)
enzimas de degradación de hialuronano solubles PEGiladas 55
2. Taxanos yformulaciones delosmismos
a. Taxanos
b. Taxanos dirigidos a un tumor o al estroma. Taxano unido a albúmina 60
3. Agente quimioterapéutico adicional (p.ej., análogo de nucleósido) Análogos de nucleósidos ilustrativos
i. Gemcitabina
ii. Citarabina
ii. Decitabina
iv. Azacitidina
D. Métodos de producción de ácidos nucleicos y polipéptidos codificados de enzimas de degradación de 5 hialuronano
1.
Vectores y Células
2.
Expresión
10 a. Células procariotas
b.
Células de levadura
c.
Células deinsecto
d.
Células demamíferos
e.
Plantas 15
3.
Técnicas de purificación
4.
PEGilación de polipéptidos de enzimas de degradación dehialuronano
E.
Composiciones y formulaciones farmacéuticas 20
1. Formulaciones
a. Inyectables, soluciones y emulsiones
b.
Polvos liofilizados 25 c. Administración tópica
d. Composiciones para otras vías de administración
2. Cantidades deformulación
3. Envasado y artículos de fabricación 30
F. Métodos para evaluar la actividad, la biodisponibilidad y lafarmacocinética
1. Ensayos in vitro
35 a.Actividaddehialuronidasadeunaenzimadedegradacióndehialuronano
b.
Actividad de taxano
c.
Actividad anticancerosa
2. Modelos animales in vivo
40 3. Farmacocinética y tolerabilidad
G. Métodos y usos dela terapia combinada
1. Cánceres
45 Selección de sujetos para el tratamiento
2.
Dosificación y administración
3.
Régimen de dosificación: frecuencia y ciclo de administración
50 4. Terapia combinada adicional
a.
Corticosteroide
b.
Agentes anticancerosos y otros tratamientos
55 H. Ejemplos
A. Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizadosen la presente memoria tienen
60 el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenecen la invención o invenciones. En el caso en el que haya una pluralidad de definiciones para los términos en la presente memoria, prevalecerán las de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección de este tipo, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y que la información particular en Internet puede aparecer y desaparecer, pero se puede encontrar información equivalente buscando en Internet. La referencia a esto evidencia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
la disponibilidad y difusión pública de dicha información.
Según se utiliza en la presente memoria, "terapia combinada" se refiere a un tratamiento en el que un sujeto recibe dos o más agentes terapéuticos, tales como al menos dos o al menos tres agentes terapéuticos, para tratar una sola enfermedad. Para los fines de la presente memoria, la terapia combinada incluye terapia con una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y un taxano dirigido a un tumor y opcionalmente un agente anticanceroso o agente quimioterapéutico adicionales tales como un análogo de nucleósido.
Según se utiliza en la presente memoria, un taxano se refiere a una familia de agentes antimitóticos o antimicrotúbulos que inhiben el crecimiento celular al detener la mitosis y la división celular debido a la interferencia en la polimerización de microtúbulos. Los taxanos incluyen diterpenos producidos naturalmente a partir de las plantas del género Taxus (tejos). Los taxanos también incluyen taxanos que se producen sintéticamente que exhiben actividad antimitótica o antimicrotúbulos. Típicamente, los taxanos comparten una estructura central común que contiene cuatro anillos (anillos A y C de seis miembros, anillo B de ocho miembros y anillo D de cuatro miembros). Un ejemplo de un taxano es paclitaxel, taxano o un derivado o análogo de losmismos.
Según se utiliza en la presente memoria, la actividad antimitótica se refiere a inhibir, reducir o prevenir la mitosis. En virtud de tal actividad, el crecimiento celular se inhibe, se reduce o se previene. Por ejemplo, un agente exhibe actividad antimitótica si el crecimiento celular se inhibe en al menos o aproximadamente al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% omás en comparación con el crecimiento celular en ausencia del agente.
Según se utiliza en la presente memoria, la actividad antimicrotúbulos se refiere a la actividad de cualquier agente que interfiera con los microtúbulos, por ejemplo disminuyendo, reduciendo o previniendo la polimerización de microtúbulos. Por lo tanto, la actividad antimicrotúbulos puede referirse a cualquier actividad que estabilice los microtúbulos, que son naturalmente inestables y que se someten a procesos dinámicos de despolimerización (acortamiento) y polimerización (alargamiento). Por ejemplo, la actividad antimicrotúbulos se efectúa mediante agentes, tales como taxanos, que interaccionan con los extremos de los microtúbulos, congelando de ese modo o previniendo el desensamblaje o el ensamblaje. Los ensayos para evaluar la polimerización de microtúbulos son conocidos en la técnica, y los ensayos ilustrativos se describen en la presente memoria. Existe actividad antimicrotúbulos si un agente inhibe la polimerización de microtúbulos en al menos o aproximadamente al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con la polimerización en ausencia del agente.
Según se utiliza en la presente memoria, un "taxano dirigido a un tumor" se refiere a taxano que está vinculado, directa o indirectamente, a un radical y que exhibe aumento de especificidad con una o más moléculas en la superficie de un tumor en comparación con el taxano que no está relacionado con el radical tumoral. Por ejemplo, el radical puede ser una macromolécula, péptido, proteína, anticuerpo (p.ej. anticuerpo monoclonal) o lípido que interactúa o se une (p.ej. se une específicamente) a una molécula presente en la superficie de un tumor tal como un azúcar, lípido, glicosaminoglicano o proteína presente en la superficie del tumor. Generalmente, la molécula que está presente en la superficie del tumor está presente a un nivel o en una medida que es aberrante o distinta de los tejidos notumorales o tejidos o células normales.
Según se utiliza en la presente memoria, la frase "suficiente para lograr el suministro intratumoral" significa que el taxano exhibe un aumento de direccionamiento o un direccionamiento mayor a una célula tumoral que a una célula no tumoral, y por lo tanto exhibe un aumento de localización intracelular o mayor localización intracelular en la misma. Los ensayos para evaluar el suministro intratumoral pueden incluir ensayos in vitro o en vivo, tales como ensayos de unión o ensayos de localización subcelular por medio de los cuales se compara el nivel o la cantidad unida o intracelular de un fármaco, tal como un taxano, entre células normales y células tumorales. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayos, incluyendo radioinmunoensayos o ELISA (p.ej. ELISA basados en productos lisados y ELISA de infrarrojos; véase también Svojanovsky et al. (1999) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 20:549-555); bioensayo basado en tubulina (véase p.ej. Suye et al. (1997) Anal. Chem., 69:3633-3635); histoquímica o inmunohistoquímica (Hong et al. (2007) Mol. Cáncer. Ther., 6:3239); HPLC; ensayos basados en fluorescencia, que incluyen citometría de flujo y otros métodos (véase p.ej. Sheikh et al. (2001) Biosensors & Bioelectronics, 16:647-652), y otros ensayos similares conocidos por un experto en la técnica. Están disponibles anticuerpos contra taxano para su uso en tales métodos (véanse p.ej. Grothaus et al. (1995) J Nat. Prod., 58:1003-14; Leu et al. (1993) Cancer Res., 53:1388-1391; Núm. de catálogo ab26953, Abcam). También se puede utilizar la tecnología con biosensores (véase p.ej. Braunhut et al. (2005) Assay and Drug Dev. Tech., 3:77-88). Los ensayos también pueden incluir ensayos indirectos, mediante los cuales se evalúa la actividad del taxano en la maquinaria celular, incluyendo los efectos sobre la apoptosis de las células tumorales y el crecimiento tumoral, incluyendo el tamaño o volumen del tumor.
Según se utiliza en la presente memoria, un agente antihialuronano se refiere a cualquier agente que modula la síntesis o degradación de hialuronano (HA), alterando de este modo los niveles de hialuronano en un tejido o célula. Para los fines de la presente memoria, los agentes antihialuronano reducen los niveles de hialuronano en un tejido o célula en comparación con la ausencia del agente. Tales agentes incluyen compuestos que modulan la expresión del material genético que codifica la HA sintasa (HAS) y otras enzimas o receptores implicados en el metabolismo del hialuronano, o que modulan las proteínas que sintetizan o degradan el hialuronano, incluyendo la función o actividad de HAS. Los agentes incluyen moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas u otros compuestos. Por ejemplo, los agentes anti-hialuronano incluyen, pero no se limitan a, moléculas antisentido o
imagen9
5 efectoras,anticuerpos,enzimas,inhibidoresdemoléculaspequeñasyanálogosdesustratodeHAS.
Según se utiliza en la presente memoria, un "producto conjugado" se refiere a un polipéptido unido directa o indirectamente a uno o más polipéptidos o radicales químicos diferentes. Tales productos conjugados incluyen proteínas de fusión, los producidos por productos conjugados químicos y los producidos por cualquier otro método.
10 Por ejemplo, un producto conjugado se refiere a una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa o polipéptido de PH20 soluble, unido directa o indirectamente a uno o más polipéptidos o radicales químicos diferentes, por lo que al menos un polipéptido de PH20 soluble está unido, directa o indirectamente a otro polipéptido o radical químico con tal que el producto conjugado conserve la actividad hialuronidasa.
15 Según se utiliza en la presente memoria, una "enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero" se refiere a una enzima de degradación de hialuronano que está unida directa o indirectamente a un polímero. El enlace puede ser cualquier tipo de enlace, incluyen, pero sin limitarse a, enlaces iónicos y covalentes, y cualquier otra interacción asociada suficientemente estable. La referencia a una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero significa que el producto conjugado exhibe actividad de hialuronidasa. Típicamente, el
20 polímero conjugado exhibe al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más actividad hialuronidasa en comparación conla enzima de degradación de hialuronano que no está conjugada con un polímero.
Según se utiliza en la presente memoria, una enzima de degradación de hialuronano se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un polímero de hialuronano (también denominado ácido hialurónico o HA) en fragmentos de 25 menor peso molecular. Los ejemplos de enzimas de degradación de hialuronano son hialuronidasas, y condroitinasas y liasas concretas que tienen la capacidad de despolimerizar hialuronano. Las condroitinasas ilustrativas que son enzimas de degradación de hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa (también conocida como condroitín sulfato liasa o condroitín sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. La condroitina ABC liasa comprende dos enzimas, condroitin30 sulfato-ABC-endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitin-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Las condroitin-sulfato-ABC endoliasas y condroitin-sulfato-ABC exoliasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, las de Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 98; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46). Las enzimas condroitinasa AC ilustrativas de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, las de Flavobacterium heparinum, expuestas en SEQ ID NO: 99, Victivallis
35 vadensis, expuesta en SEQ ID NO: 100, y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444). Las enzimas condroitinasa C ilustrativas de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, las de Estreptococcus y Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
40 Según se utiliza en la presente memoria, hialuronidasa se refiere a una clase de enzimas de degradación de hialuronano. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano que incluye, pero sin limitarse a, murino, canino, felino,
45 leporino, aviar, bovino, ovino, porcino, equino, de peces, de ranas, bacteriano y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas no humanas ilustrativas incluyen, hialuronidasas de vacas (SEQ ID NO: 10, 11, 64 y BH55 (Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.747.027 y 5.827.721)), avispa chaqueta amarilla (SEC ID NO: 12 y 13), abeja melífera (SEC ID NO: 14), avispón cara blanca (SEC ID NO: 15), avispa de papel (SEC ID NO: 16), ratón ( SEQ ID NO: 17-19, 32), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), rata (SEQ ID NO: 22-24, 31), conejo (SEQ ID NO:
50 25), oveja (SEQ ID NO: 26, 27, 63 y 65), chimpancé (SEQ ID NO: 101), mono Rhesus (SEQ ID NO: 102), orangután (SEQ ID NO: 28), mono cinomolgo (SEQ ID NO: 29), cobaya ( SEQ ID NO: 30), Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO: 70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71); serotipo Ia (SEQ ID NO: 72); y serotipo III (SEQ ID NO: 73)), Staphylococcus aureus (cepa COL (SEQ ID NO: 74); cepa MRSA252 (SEQ ID NO: 75 y 76); cepa MSSA476
55 (SEQ ID NO: 77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78); cepa bovina RF122 (SEQ ID NO: 79 y 80) y cepa USA300 (SEQ ID NO: 81)), Streptococcus neumoniae ((SEQ ID NO: 82); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO: 83); y serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO: 84)), Streptococcus pyogenes (serotipo M1 (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 86); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 87); serotipo M6 (SEQ ID NO: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEC ID NO: 89 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEC ID
60 NO: 91) y serotipo M28 (SEC ID NO: 92)); Streptococcus suis (SEQ ID NO: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 96)), y la enzima hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es específica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina o el condroitin sulfato (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Las hialuronidasas también incluyen las de origen humano. Las hialuronidasas humanas ilustrativas incluyen HYAL1 (SEQ ID NO: 36), HYAL2 (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO: 38), HYAL4 (SEQ ID
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NO: 39) y PH20 (SEQ ID NO: 1). También se incluyen entre las hialuronidasas hialuronidasas solubles, incluyendo PH20 ovina y bovina, PH20 humana soluble y rHuPH20 soluble. Los ejemplos de hialuronidasas solubles bovinas u ovinas comercialmente disponibles incluyen Vitrase® (hialuronidasa ovina), Amphadase® (hialuronidasa bovina) e Hydase™ (hialuronidasa bovina).
Según se utiliza en la presente memoria, "hialuronidasa testicular bovina purificada" se refiere a una hialuronidasa bovina purificada a partir de extractos testiculares bovinos (véanse las Patentes de los Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565, 2.806.815, 2.808.362, 2.676.139, 2.795.529, 5.747.027 y 5.827.721). Los ejemplos de hialuronidasas testiculares bovinas purificadas disponibles comercialmente incluyen Amphadase® e Hydase™, e hialuronidasas bovinas, que incluyen, pero no se limitan a, las disponibles de Sigma Aldrich, Abnova, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Raybiotech, Inc. y Calzyme. También se incluyen hialuronidasas bovinas producidas recombinantemente, tales como, pero sin limitación, aquellas generadas por la expresión de una molécula de ácido nucleico expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 190-192.
Según se utiliza en la presente memoria, "hialuronidasa testicular ovina purificada" se refiere a una hialuronidasa ovina purificada a partir de extractos testiculares ovinos (véanse las Patentes de los Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565 y 2.806.815 y la Publicación PCT internacional Núm. WO1005/118799). Los ejemplos de extracto testicular ovino purificado disponible comercialmente incluyen Vitrase® e hialuronidasas ovinas, incluyendo, pero limitadas a, las disponibles de Sigma Aldrich, Cell Sciences, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Mybiosource.com y Raybiotech, Inc. También se incluyen hialuronidasas ovinas producidas recombinantemente, tales como, pero sin limitación, las generadas por la expresión de una molécula de ácido nucleico expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 66 y 193-194.
Según se utiliza en la presente memoria, "PH20" se refiere a un tipo de hialuronidasa que se produce en los espermatozoides y es activa en condiciones neutras. La PH-20 aparece en la superficie de los espermatozoides y en el acrosoma derivado de los lisosomas, donde está unida a la membrana acrosómica interna. La PH20 incluye las de cualquier origen incluyendo, pero sin limitarse a, las de origen humano, de chimpancé, mono Cynomolgus, mono Rhesus, murino, bovino, ovino, de cobaya, de conejo y de rata. Los polipéptidos de PH20 ilustrativos los de ser humano (SEQ ID NO: 1), chimpancé (SEQ ID NO: 101), mono Rhesus (SEQ ID NO: 102), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29), vaca (p.ej., SEQ ID NO: 11 y 64), ratón (SEQ ID NO: 32), rata (SEQ ID NO: 31), conejo (SEQ ID NO: 25), oveja (SEQ ID NO: 27, 63 y 65) y cobaya (SEQ ID NO: 30).
La referencia a enzimas de degradación de hialuronano incluye polipéptidos enzimáticos de degradación de hialuronano precursores y polipéptidos enzimáticos de degradación de hialuronano maduros (tales como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad e incluyen variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% omás deidentidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en SEC ID NO: 1 y 1048, 63-65, 67-102, o las formas maduras de los mismos. Por ejemplo, la referencia a la enzima de degradación de hialuronano también incluye las variantes del polipéptido precursor de PH20 humana expuestas en SEC ID NO: 50
51. Las enzimas de degradación de hialuronano también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, PEGilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones polipeptídicas conocidas en la técnica. Una hialuronidasa PH20 truncada es cualquier forma abreviada C-terminal de la misma, particularmente formas que están truncadas y activas en condiciones neutras cuando se N-glicosilan.
Según se utiliza en la presente memoria, una "PH20 soluble" se refiere a cualquier forma de PH20 que sea soluble en condiciones fisiológicas. Se puede identificar una PH20 soluble, por ejemplo, mediante su reparto en la fase acuosa de una solución de Triton® X-114 a 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). La PH20 anclada a la membrana, tal como la PH20 anclada a lípidos, incluyendo la PH20 anclada a GPI, se repatirá en la fase rica en detergente, pero se repartirá en la fase pobre en detergente o acuosa después del tratamiento con fosfolipasa-C. Entrelas PH20 solubles se incluyen las PH20 ancladas a la membrana en las que una o más regiones asociadas con el anclaje de la PH20 a la membrana se han eliminado o modificado, dondela forma soluble conserva la actividad hialuronidasa. La PH20 soluble también incluye la PH20 soluble recombinante y las contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. Un ejemplo de dicha PH20 soluble es la PH20 humana soluble.
Según se utiliza en la presente memoria, PH20 humana soluble o sHuPH20 incluye polipéptidos de PH20 que carecen de la totalidad o de una porción de la secuencia de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) en el extremo C de manera que tras la expresión, los polipéptidos son solubles bajo condiciones fisiológicas. La solubilidad puede evaluarsemediante cualquier método adecuado que demuestre solubilidad bajo condiciones fisiológicas. Un ejemplo de tales métodos es el ensayo Triton® X-114, que evalúa el reparto en la fase acuosa y que se describe anteriormente y en los ejemplos. Además, un polipéptido de PH20 humana soluble, si se produce en células CHO,
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tales como células CHO-S, es un polipéptido que se expresa y se secreta al medio de cultivo celular. Los polipéptidos de PH20 humana soluble, sin embargo, no se limitan a los producidos en células CHO, sino que se pueden producir en cualquier célula omediante cualquier método, incluyendo la expresión recombinante y la síntesis de polipéptidos. La referencia a la secreción por células CHO es definitoria. Por lo tanto, si un polipéptido puede ser 5 expresado y secretado por células CHO y es soluble, es decir se reparte en la fase acuosa cuando se extrae con Triton® X-114, es un polipéptido de PH20 soluble, se produzca o no de esa manera. Los polipéptidos precursores para los polipéptidos de sHuPH20 pueden incluir una secuencia señal, tal como una secuencia señal heteróloga o no heteróloga (es decir nativa). Los ejemplos de los precursores son aquellos que incluyen una secuencia señal, tal como la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa en las posiciones de aminoácidos 1-35 (véase, p.ej.,
10 aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 1).
Según se utiliza en la presente memoria, una "PH20 soluble extendida" o "esPH20" incluye polipéptidos de PH20 solubles que contienen residuos hasta la secuencia de señal de unión al ancla de GPI y uno o más residuos contiguos de la secuencia señal de unión al ancla de GPI de manera que la esPH20 sea soluble bajo condiciones 15 fisiológicas. La solubilidad en condiciones fisiológicas se puede determinar mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede evaluarse mediante el ensayo Triton® X-114 descrito anteriormente y en los ejemplos. Además, como se comentó anteriormente, una PH20 soluble es, si se produce en células CHO, tales como células CHO-S, un polipéptido que se expresa y se secreta al medio de cultivo celular. Los polipéptidos de PH20 humana soluble, sin embargo, no se limitan a los producidos en células CHO, sino que se pueden producir 20 en cualquier célula o mediante cualquier método, incluyendo la expresión recombinante y la síntesis de polipéptidos. La referencia a la secreción por células CHO es definitoria. Por lo tanto, si un polipéptido puede ser expresado y secretado por células CHO y es soluble, es decir se reparte en la fase acuosa cuando se extrae con Triton® X-114, es un polipéptido de PH20 soluble, se produzca o no de esa manera. Los polipéptidos de esPH20 soluble de seres humanos incluyen, además de los residuos 36-490, uno o más aminoácidos contiguos desde la posición de residuo 25 de aminoácido 491 de SEC ID NO: 1, inclusive, de manera que el polipéptido resultante es soluble. Los polipéptidos solubles de esPH20 humana ilustrativos son aquellos que tienen residuos de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 y 36-497 de SEQ ID NO: 1. Son ejemplos de estos aquellos con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 151-154 y 185-187. También se incluyen variantes alélicas y otras variantes, tal como cualquiera con 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%,
30 85%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con los correspondientes polipéptidos de SEC ID NO: 151-154 y 185-187 que conservan actividad en condiciones neutras y son solubles. La referencia a la identidad de secuencia se refiere a variantes con sustituciones de aminoácidos.
Según se utiliza en la presente memoria, la referencia a las "esPH20" incluye polipéptidos de esPH20 precursores y
35 polipéptidos de esPH20 maduros (tales como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad enzimática (conservación de al menos 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más de la forma completa) y son solubles, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos 40%, 45 %, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad
40 desecuenciaconlospolipéptidosprecursoresexpuestosenSECIDNO:1y3,olasformasmadurasdelosmismos.
Según se utiliza en la presente memoria, la referencia a las "esPH20" también incluye aquellas que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellos que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero sin limitación, PEGilación, albuminación, glicosilación,
45 farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones polipeptídicas conocidas en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, "PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20)" se refiere a una composición que contiene una forma soluble de PH20 humana expresada de forma recombinante y secretada en células de ovario de hámster chino (CHO). La rHuPH20 soluble está codificada por una molécula de ácido nucleico
50 que incluye la secuencia señal y se expone en SEC ID NO: 49. El ácido nucleico que codifica rHuPH20 soluble se expresa en células CHO que secretan el polipéptido maduro. Puesto que se produce en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en el extremo C de manera que el producto incluye una mezcla de especies que puede incluir una o más de SEC ID NO: 4 a SEQ ID NO: 9 en diversa abundancia.
55 De forma similar, para otras formas de PH20, tales como las esPH20, los polipéptidos expresados recombinantemente y las composiciones de los mismos pueden incluir una pluralidad de especies cuyo extremo C exhibe heterogeneidad. Por ejemplo, las composiciones de esPH20 expresadas de forma recombinante producidas por la expresión del polipéptido de SEC ID NO: 151, que codifica una esPH20 que tiene los aminoácidos 36-497, pueden incluir formas con menos aminoácidos, tales como 36-496 o 36-495.
60 Según se utiliza en la presentememoria, un "radical unido a N" se refiere a un residuo de aminoácido deasparragina
(N) de un polipéptido que es capaz de glicosilarse por modificación postraduccional de un polipéptido. Los radicales unidos a N ilustrativos de PH20 humana incluyen los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de PH20 humana expuestos en SEC ID NO: 1.
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Según se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido N-glicosilado" se refiere a un polipéptido de PH20 o forma truncada que contiene un enlace oligosacárido de al menos tres residuos de aminoácidos unidos a N, por ejemplo, radicales unidos a N correspondientes a los residuos de aminoácidos N235, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1. Un polipéptido N-glicosilado puede incluir un polipéptido en el que tres, cuatro, cinco y hasta todos los restos unidos a N
5 están unidos a un oligosacárido. Los oligosacáridos unidos a N pueden incluir oligomanosa, oligosacáridos complejos, híbridos o sulfatados u otros oligosacáridos ymonosacáridos.
Según se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido parcialmente N-glicosilado" se refiere a un polipéptido que contiene mínimamente un N-acetilglucosaminoglicano unido a al menos tres radicales unidos a N. Un polipéptido
10 parcialmente glicosilado puede incluir diversas formas de glicano, incluyendo monosacáridos, oligosacáridos y formas de azúcar ramificadas, que incluyen las formadas por el tratamiento de un polipéptido con EndoH, EndoF1, EndoF2 y/o EndoF3.
Según se utiliza en la presente memoria, un "polipéptido de PH20 desglicosilado" se refiere a un polipéptido de
15 PH20 en el que menos de todos los sitios de glicosilación posibles están glicosilados. La desglicosilación se puede efectuar, por ejemplo, eliminando la glicosilación, previniéndola o modificando el polipéptido para eliminar un sitio de glicosilación. Los sitios concretos de N-glicosilación no son necesarios para la actividad, mientras que otros sí lo son.
Según se utiliza en la presente memoria, un "polímero" se refiere a cualquier radical natural o sintético de alto peso
20 molecular que se compone de unidades repetitivas. Los polímeros incluyen, pero sin limitación, radicales de polietilenglicol, dextrano, celulosa y ácido siálico. Estos y otros polímeros ilustrativos se describen en la presente memoria, y muchos son conocidos en la técnica. Para los fines de la presente memoria, el polímero se puede conjugar con, es decir unir de manera estable directa o indirectamente a través de un conector, a un polipéptido. Tales productos conjugados poliméricos, típicamente aumentan la semivida en suero, e incluyen, pero sin limitación,
25 radicales siálicos, radicales de PEGilación, dextrano y azúcares y otros radicales, por ejemplo de glicosilación. Por ejemplo, las hialuronidasas, tales como una PH20 soluble o rHuPH20, pueden conjugarse con un polímero.
Según se utiliza en la presente memoria, "PEGilado" se refiere al anclaje covalente u otro anclaje estable de moléculas poliméricas, tales como polietilenglicol (radical de PEGilación PEG) a proteínas, incluyendo enzimas de
30 degradación de hialuronano, tales como hialuronidasas, típicamente para aumentar la semivida de la enzima de degradación de hialuronano.
Según se utiliza en la presente memoria, un agente anticanceroso o agente quimioterapéutico se refiere a un agente que es capaz de destruir células que se dividen rápidamente, tales como células cancerosas. Un experto en la
35 técnica está familiarizado con agentes anticancerosos, incluyen agentes quimioterapéuticos. Los agentes ilustrativos se describen en la presente memoria.
Según se utiliza en la presente memoria, un análogo de nucleósido (o análogo) se refiere a un agente que reemplaza o imita uno de las unidades estructurales de los ácidos nucleicos, tal como un nucleósido de purina o
40 pirimidina, durante la replicación del ADN. El proceso puede detener el crecimiento del tumor, ya que no se pueden anclar nucleósidos adicionales. Un ejemplo de un análogo de nucleósido es gemcitabina, que, es un análogo de desoxicitidina y, tras la activación metabólica, forma un trifosfato que imita o reemplaza al nucleósido de citidina para incorporarlo al ADN einhibir competitivamente la síntesis deADN.
45 Según se utiliza en la presente memoria, una nucleósido desaminasa se refiere a una enzima que efectúa la desaminación de un nucleósido. Por ejemplo, la citidina desaminasa (CDA) desamina citidina y desoxicitidina a uridina y desoxiuridina, respectivamente. La adenosina desaminasa (ADA) desamina la adenosina, convirtiéndola en el nucleósido relacionado inosina mediante la sustitución del grupo amino por un grupo hidroxilo.
50 Según se utiliza en la presente memoria, un sustrato de una nucleósido desaminasa es una molécula que puede desaminarse a un metabolito inactivo y, por lo tanto, inactivarse, en presencia de una nucleósido desaminasa. Los ensayos para evaluar la desaminación son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o espectrometría de masas para metabolitos y metabolitos desaminados, ensayos de desaminación tales como un ensayo de desaminasa basado en UDG utilizando exceso de
55 uracilo-ADN glicosilasa (véase p.ej. Morgan et al. (2004) J. Biol. Chem., 279:52353-52360) o evaluando la citotoxicidad en células conocidas por expresar una nucleósido desaminasa.
Según se utiliza en la presente memoria, la frase "suficiente para reducir los niveles de proteína o la actividad de proteína nucleósido desaminasa" se refiere a la cantidad de taxano que se requiere para inhibir la actividad de una 60 nucleósido desaminasa. Por ejemplo, la inhibición puede evaluarse analizando la actividad de desaminación de una desaminasa (p.ej. citidina desaminasa) utilizando ensayos para la desaminación como se describió anteriormente. La inhibición también puede evaluarse analizando los niveles de proteína desaminasa intracelular. Los ensayos para evaluar proteínas subcelulares son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA basado en células, citometría de flujo o métodos de detección de proteínas tales como transferencia Western.
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Generalmente, tales ensayos se pueden realizar en productos lisados celulares o células permeabilizadas. Por ejemplo, la transferencia Western para la citidina desaminasa se puede realizar solubilizando productos lisados celulares totales, separando proteínas, e inmunotransferencia para desaminasa utilizando un anticuerpo contra CDA (p.ej. Núm. de Cat. ab82346, Abcam) seguido de incubación con un anticuerpo secundario de peroxidasa de rábano picante y detección. Generalmente, una cantidad es suficiente para reducir los niveles de proteína o la actividad de proteína nucleósido desaminasa si el nivel o actividad de proteína se reduce al menos o al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más.
Según se utiliza en la presente memoria, un profármaco es un compuesto que exhibe actividad farmacológica después de la biotransformación. Por ejemplo, los análogos de nucleósidos tales como gemcitabina son profármacos, por lo que la actividad se produce como resultado de la conversión intracelular en dos metabolitos activos, gemcitabina difosfato y gemcitabinatrifosfato por la desoxicitidina quinasa. El trifosfato (difluorodesoxicitidina trifosfato) compite con desoxinucleósidostrifosfato endógenos para su incorporación al ADN.
Según se utiliza en la presente memoria, un derivado se refiere a una forma de un fármaco que ha sufrido un cambio
o modificación a partir de un fármaco o agente de referencia, pero que aún conserva la actividad (p.ej. exhibe aumento o disminución de actividad) en comparación con el fármaco o agente de referencia. Típicamente, una forma derivada de un compuesto significa que una cadena lateral del compuesto se ha modificado o cambiado.
Según se utiliza en la presente memoria, un análogo o análogo de un fármaco o agente es un fármaco o agente que están relacionados con un fármaco de referencia, pero cuyas actividades químicas y biológicas pueden ser diferentes. Típicamente, los análogos exhiben actividades similares a un fármaco o agente de referencia, pero la actividad puede aumentarse o reducirse o mejorarse de otro modo. Típicamente, una forma análoga de un compuesto o fármaco significa que el núcleo de la estructura se modifica o cambia en comparación con un fármaco de referencia.
Según se utiliza en la presente memoria, "actividad" se refiere a una actividad o actividades funcionales de un polipéptido o parte del mismo asociadas con una proteína íntegra (completa). Por ejemplo, los fragmentos activos de un polipéptido pueden exhibir una actividad de una proteína completa. Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad de unirse o competir con un polipéptido por la unión a un anticuerpo anti-polipéptido), inmunogenicidad, capacidad de formar multímeros y capacidad de unirse específicamente a un receptor oligandopara el polipéptido.
Según se utiliza en la presente memoria, "actividad hialuronidasa" se refiere a la capacidad de catalizar enzimáticamente la escisión del ácido hialurónico. El ensayo de hialuronidasa de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) XXII determina la actividad hialuronidasa indirectamente al medir la cantidad de sustrato de ácido hialurónico o hialuronano (HA) de mayor peso molecular que queda después de que la enzima reaccione con el HA durante 30 minutos a 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Se puede utilizar una solución Patrón de Referencia en un ensayo para determinar la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Los ensayos in vitro para determinar la actividad hialuronidasa de las hialuronidasas, tales como PH20, incluyendo PH20 soluble y esPH20, son conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. Los ensayos ilustrativos incluyen el ensayo de microturbidez que mide la escisión del ácido hialurónico por hialuronidasa indirectamente detectando el producto precipitado insoluble formado cuando el ácido hialurónico no escindido se une a la albúmina sérica y el ensayo de ácido hialurónico biotinilado que mide la escisión del ácido hialurónico indirectamente al detectar el ácido hialurónico biotinilado restante unido de forma no covalente a los pocillos de la placa de microtitulación con un producto conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y un sustrato cromogénico. Los Patrones de Referencia se pueden utilizar, por ejemplo, para generar una curva patrón para determinar la actividad en unidades dela hialuronidasa que se está sometiendo a ensayo.
Según se utiliza en la presente memoria, la actividad específica se refiere a las unidades de actividad por mg de proteína. Los miligramos de hialuronidasa se definen por la absorción de una solución a 280 nm suponiendo un coeficiente de extinciónmolar de aproximadamente 1,7, en unidades de M-1 cm-1 .
Según se utiliza en la presente memoria, "activo en condiciones neutras" se refiere a la capacidad de un polipéptido de PH20 para catalizar enzimáticamente la escisión del ácido hialurónico a pH neutro (p.ej. a o aproximadamente a pH 7,0).
Según se utiliza en la presente memoria, una secuencia señal de unión al ancla de GPI es una secuencia de aminoácidos C-terminal que dirige la adición de un ancla de GPI preformada al polipéptido dentro del lumen del RE. Las secuencias señal de unión al ancla de GPI están presentes en los polipéptidos precursores de los polipéptidos anclados a GPI, tales como los polipéptidos de PH20 anclados a GPI. La secuencia señal de unión al ancla de GPI C-terminal contiene típicamente una región predominantemente hidrófoba de 8-20 aminoácidos, precedida por una región espaciadora hidrófila de 8-12 aminoácidos, inmediatamente aguas abajo del sitio ω, o sitio de unión al ancla de GPI. Las secuencias señal de unión al ancla de GPI se pueden identificar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a, métodos in silico y algoritmos (véase, p.ej. Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292:741-758, Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392), incluyendo los que están disponibles en sitios web bioinformáticos, tales como el sitio de
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5 herramientas ExPASy Proteomics (p.ej., el sitio dela red en el ámbito mundial expasy.ch/tools/).
Según se utiliza en la presente memoria, los "ácidos nucleicos" incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra sencilla y de doble hebra. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están opcionalmentemarcados, tal 10 como con una marca detectable, por ejemplo con un marcador fluorescente o una radiomarca, se contemplan las moléculas de hebra sencilla. Tales moléculas tienen típicamente una longitud tal que su diana es estadísticamente única o de bajo número de copias (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para sondear o cebar una biblioteca. Generalmente, una sonda o cebador contienen al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden tener 10, 20, 30, 50, 100 o más
15 ácidos nucleicos de longitud.
Según se utiliza en la presente memoria, un péptido se refiere a un polipéptido que tiene una longitud mayor que o igual a 2 aminoácidos, y una longitud inferior o igual a 40 aminoácidos.
20 Según se utiliza en la presente memoria, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente memoria se identifican de acuerdo con sus abreviaturas conocidas de tres letras o una letra (Tabla 1). Los nucleótidos que se producen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones convencionales de una sola letra utilizadas rutinariamente en la técnica.
25 Según se utiliza en la presente memoria, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los fines de la presente memoria, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos(es decir., aminoácidos en los que el carbono α tiene una cadena lateral).
30 Según se utiliza en la presente memoria, "residuo de aminoácido" se refiere a un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Se supone que los residuos de aminoácidos descritos en la presente memoria están en forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D", que se designan así, pueden sustituirse por cualquier residuo de L-aminoácido siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido.
35 COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura polipeptídica convencional descrita en J. Biol. Chem., 243:3557-3559 (1968)), y adoptó 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para los residuos de aminoácido semuestran en la Tabla 1:
Tabla 1 -Tabla de correspondencia
SÍMBOLO
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1 Letra 3 Letras
AMINOÁCIDOS
Y Tyr
Tirosina
G Gly
Glicina
F Phe
Fenilalanina
M Met
Metionina
A Ala
Alanina
S Ser
Serina
I Ile
Isoleucina
L Leu
Leucina
T Thr
Treonina
V Val
Valina
P Pro
Prolina
K Lys
Lisina
H His
Histidina
Q
Gln Glutamina
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SÍMBOLO
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1 Letra 3 Letras
AMINOÁCIDOS
E Glu
Ácido glutamico
Z Glx
Glu y/o Gln
W Trp
Triptófano
R Arg
Arginina
D Áspid
Ácido aspártico
N Asn
Asparragina
B Asx
Asn y/o Asp
C Cys
Cisteína
X
Xaa Desconocido u otro
Todas las secuencias de residuos de aminoácidos representadas en la presente memoria por las fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxilo.
5 Además, la frase "residuo de aminoácido" se define para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, tales como los mencionados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822. Además, se debe observar que un guión al comienzo o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos, a un grupo amino-terminal tal como NH2 o a un grupo carboxilo terminal tal como COOH.
10 Según se utiliza en la presente memoria, los "α-aminoácidos naturales" son los residuos de aquellos 20 αaminoácidos encontrados en la naturaleza que se incorporan a la proteína mediante el reconocimiento específico de la molécula de ARNt cargada con su codón de ARNm cognado en seres humanos. Los aminoácidos no naturales incluyen así, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos naturales e
15 incluyen,peronoselimitana,losestereoisómerosDdelosaminoácidos.Losejemplosdeaminoácidosnonaturales se describen en la presente memoria y son conocidos por los expertos en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, una construcción de ADN es una molécula de ADN lineal o circular de hebra sencilla o doble hebra que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera que no se
20 encuentra en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana e incluyen clones y otras copias demoléculas manipuladas.
Según se utiliza en la presente memoria, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una
25 porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, que, cuando se lee desde la dirección 5' a 3', codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.
Según se utiliza en la presente memoria, el término polinucleótido significa un polímero de hebra sencilla o doble hebra de desoxirribonucleótidos o bases ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen 30 ARN y ADN, y se pueden aislar a partir de fuentes naturales, sintetizar in vitro, o preparar a partir de una combinación demoléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se proporciona en la presente memoria en términos de nucleótidos (abreviado "nt") o pares de bases (abreviado "pb"). El término nucleótidos se utiliza para moléculas de hebra sencilla y de doble hebra cuando el contexto lo permite. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se utiliza para denotar la longitud total y se entenderá que es
35 equivalente al término pares de bases. Los expertos en la técnica reconocerán que la longitud de las dos cadenas de un polinucleótido de doble hebra puede diferir ligeramente y que sus extremos pueden escalonarse; por lo tanto, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra pueden no estar emparejados. Tales extremos no emparejados, en general, no superarán los 20 nucleótidos de longitud.
40 Según se utiliza en la presente memoria, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de residuos y los residuos contenidos en ellas. Los expertos en la técnica conocen métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, dos secuencias de aminoácidos
45 o nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. "Identidad" se refiere al grado en que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariables. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos, y en cierta medida de las secuencias de nucleótidos, también puede tener en cuenta las diferencias conservativas y/o las sustituciones frecuentes de aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son aquellas que conservan las propiedades fisicoquímicas de los residuos involucrados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas a lo largo de toda la longitud de las
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5 secuencias e incluir todos los residuos) o locales (alineamiento de una parte de las secuencias que incluye solo la región o regiones más similares).
"Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando mecanismos publicados. (Véanse, p.ej. Biología Molecular Computacional, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 10 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existe una serie de métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los expertos
15 enlatécnica(Carrillo,H.yLipman,D.,SIAMJAppliedMath48:1073(1988)).
Según se utiliza en la presente memoria, homólogo (con respecto a secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos) significa aproximadamente una homología de secuencia superior o igual a 25%, típicamente mayor o igual a 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de homologíade secuencia; el porcentaje exacto se puede especificar 20 si es necesario. Para los fines de la presente memoria, los términos "homología" e "identidad" a menudo se utilizan indistintamente, a menos que se indique lo contrario. En general, para la determinación del porcentaje de homología
o identidad, las secuencias se alinean de modo que se obtiene el emparejamiento de mayor orden (véase, p.ej.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of 25 Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Mediante la homología de secuencia, el número de aminoácidos conservados se determina mediante programas de algoritmos de alineamiento convencionales, y se puede utilizar con penalizaciones de espacio por defecto predeterminadas
30 establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas se hibridarían típicamente a rigurosidad moderada o a alta rigurosidad a lo largo de la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplan las moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico hibridante.
35 Si dos moléculas cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas" u "homólogas" se puede determinar utilizando algoritmos informáticos conocidos como el programa "FASTA", utilizando, por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:2444 (otros programas incluyen el paquete del programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA
40 (Altschul, S.F., et al., J Mol Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 y Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos de información del Centro Nacional de Biotecnología se puede utilizar para determinar la identidad. Otros programas comercial o públicamente disponibles incluyen el programa "MegAlign" de DNAStar (Madison, WI) y el programa "Gap" del Genetics Computer Group (UWG) de la Universidad de Wisconsin (Madison WI). El porcentaje
45 de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico se puede determinar, por ejemplo, comparando información de secuencia utilizando un programa informático GAP (p.ej., Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, revisado por Smith y Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos), que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el
50 programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación única (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, como describen Schwartz y Dayhoff, eds., en ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, Fundación Nacional de Investigación Biomédica, pág. 353-358 (1979)); (2) una penalización de 3.0 por cada espacio y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada espacio; y (3) no hay penalización por los espacios
55 finales.
Por lo tanto, según se utiliza en la presente memoria, el término "identidad" u "homología" representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. Según se utiliza en la presente memoria, el término al menos "idéntico en 90% a" se refiere a porcentajes de identidades de 90 a 99,99 con 60 respecto a la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de referencia del polipéptido. La identidad a un nivel de 90% o más es indicativa del hecho de que, suponiendo fines ilustrativos, se compara una longitud de polipéptido de ensayo y de referencia de 100 aminoácidos. No más de 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de ensayo difiere del polipéptido de referencia. Comparaciones similares se pueden realizar entre polinucleótidos de ensayo y de referencia. Tales diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales
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distribuidas aleatoriamente en toda la longitud de un polipéptido o pueden agruparse en una o más ubicaciones de longitud variable hasta el máximo permisible, p.ej. una diferencia de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90% de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos. En el nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente 85-90%, el resultado debe
5 ser independiente del programa y del ajuste de los parámetros de espacio; tales altos niveles de identidad se pueden evaluar fácilmente, a menudo mediante alineamientomanual sin depender de soporte lógico.
Según se utiliza en la presente memoria, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente,
10 dos o más secuencias que están relacionadas con 50% o más de identidad están alineadas. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y pueden incluir secuencias alineadas derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineados con la secuencia de ADN genómico.
15 Según se utiliza en la presente memoria, "cebador" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida por molde en condiciones apropiadas (p.ej., en presencia de cuatro nucleósido trifosfatos diferentes y un agente de polimerización, tal como ADN polimerasa, ARN polimerasa
o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que ciertas moléculas de ácido nucleico pueden servir como una "sonda" y como un "cebador". Sin embargo, un cebador tiene un grupo 3'
20 hidroxilo para la extensión. Un cebador se puede utilizar en una variedad de métodos, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de transcriptasa inversa (RT)-PCR, PCR de ARN, LCR, PCR múltiple, PCR angosta, PCR de captura, PCR de expresión, 3' y 5' RACE, PCR in situ, PCR mediada por ligación y otros protocolos de amplificación.
25 Según se utiliza en la presente memoria, "par de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador 5' (aguas arriba) que hibrida con el extremo 5' de una secuencia que se debe amplificar (p.ej. mediante PCR) y un cebador 3' (aguas abajo) que hibrida con el complemento del extremo 3' de la secuencia que se debe amplificar.
30 Según se utiliza en la presente memoria, "hibrida específicamente" se refiere a reasociación, mediante emparejamiento de bases complementarias, de una molécula de ácido nucleico (p.ej. un oligonucleótido) a una molécula de ácido nucleico diana. Los expertos en la técnica están familiarizados con parámetros in vitro e in vivo que afectan a la hibridación específica, tales como la longitud y la composición de la molécula concreta. Los parámetros particularmente relevantes para la hibridación in vitro incluyen adicionalmente la temperatura de
35 reasociación y lavado, la composición del tampón y la concentración de sal. Las condiciones de lavado ilustrativas para eliminar moléculas de ácido nucleico no específicamente unidas con alta rigurosidad son 0,1 x SSPE, SDS al 0,1%, 65°C, y a rigurosidad media son 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, 50°C. Se conocen condiciones de rigurosidad equivalentes en la técnica. El experto en la técnica puede ajustar fácilmente estos parámetros para lograr la hibridación específica de una molécula de ácido nucleico con una molécula de ácido nucleico diana apropiada para
40 una aplicación concreta. Complementarias, cuando se refiere a dos secuencias de nucleótidos, significa que las dos secuencias de nucleótidos son capaces de hibridarse, típicamente con menos de 25%, 15% o 5% de emparejamientos erróneos entre nucleótidos opuestos. Si es necesario, se especificará el porcentaje de complementariedad. Típicamente, las dos moléculas se seleccionan de manera que se hibriden en condiciones de alta rigurosidad.
45 Según se utiliza en la presente memoria, sustancialmente idéntico a un producto significa suficientemente similar para que la propiedad de interés no se modifique lo suficiente, de forma que el producto sustancialmente idéntico se puede utilizar en lugar del producto.
50 Según se utiliza en la presente memoria, también se entiende que los términos "sustancialmente idéntico" o "similar" varían con el contexto tal como lo entienden los expertos en la técnica relevante.
Según se utiliza en la presente memoria, una variante alélica o variación alélica se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica se produce naturalmente 55 a través de la mutación, y puede dar lugar a un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término "variante alélica" también se utiliza en la presente memoria para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente, la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo salvaje y/o forma predominante de un polipéptido de una población o miembro de 60 referencia único de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre especies, típicamente tienen al menos 80%, 90% o más de identidad de aminoácidos con un tipo salvaje y/o una forma predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y de si la comparación es interespecie o intraespecie. Generalmente, las variantes alélicas intraespecie tienen al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o más identidad con un tipo salvaje y/o forma predominante, incluyendo 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad
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con un tipo salvaje y/o forma predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en la presente memoria generalmente serefiere a variaciones en las proteínas entremiembros dela misma especie.
Según se utiliza en la presente memoria, "alelo", que se utiliza indistintamente en la presente memoria con "variante alélica" se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en los cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigótico para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un solo nucleótido o en varios nucleótidos, y pueden incluir modificaciones tales como sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Según se utiliza en la presente memoria, las variantes de especie se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies demamíferos, tales como ratón y ser humano. Por ejemplo, para PH20, los ejemplos de variantes de especies proporcionadas en la presente memoria son PH20 de primate, tales como, pero sin limitarse a, ser humano, chimpancé, macaco y mono cinomolgo. Generalmente, las variantes de especie tienen una identidad de secuencia de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más. Los residuos correspondientes entre las variantes de especie pueden determinarse comparando y alineando secuencias para maximizar el número de nucleótidos o residuos coincidentes, por ejemplo, de modo que la identidad entre las secuencias sea igual o mayor que 95%, igual o mayor que 96%, igual o mayor que 97%, igual
o mayor que 98%, o igual omayor que 99%. A la posición de interés se le asigna a continuación el número asignado en la molécula de ácido nucleico de referencia. El alineamiento se puede efectuar manualmente o visualmente, en particular, cuando laidentidad de secuencia es superior a 80%.
Según se utiliza en la presente memoria, una proteína humana es una codificada por una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, presente en el genoma de un ser humano, incluyendo todas las variantes alélicas y variaciones conservativas de las mismas. Una variante o modificación de una proteína es una proteína humana si la modificación se basa en el tipo salvaje o secuencia prominente de una proteína humana.
Según se utiliza en la presente memoria, una variante de empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.
Según se utiliza en la presente memoria, la modificación se refiere a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones y reemplazos (p.ej. sustituciones) de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Los ejemplos de modificaciones son sustituciones de aminoácidos. Un polipéptido sustituido con un aminoácido puede exhibir una identidad de secuencia de 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más con un polipéptido que no contiene las sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas. Generalmente, cualquier modificación de un polipéptido conserva una actividad del polipéptido. Los métodos para modificar un polipéptido son rutinarios para los expertos en la técnica, por ejemplomediante el uso demetodologías de ADN recombinante.
Según se utiliza en la presente memoria, los expertos en la técnica conocen las sustituciones conservativas de aminoácidos adecuadas y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en la técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un único aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, p.ej., Watson et al. Molecular Biology of the Gen, 4ª Edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224). Tales sustituciones se pueden realizar de acuerdo con las establecidas en la Tabla 2 dela siguientemanera:
Tabla 2
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Otras sustituciones también son permisibles y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.
5 Según se utiliza en la presente memoria, el término promotor significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en la región 5' no codificante delos genes.
Según se utiliza en la presente memoria, el polipéptido o proteína aislados o purificados o porción biológicamente
10 activa de los mismos están sustancialmente libres de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido del que deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Se puede determinar que las preparaciones están sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables según se determina mediante métodos de análisis convencionales, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC),
15 utilizados por los expertos en la técnica para evaluar tal pureza, o suficientemente puros como para que una purificación adicional no altere de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la técnica conocen métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos químicamente puros sustancialmente. Sin embargo, un compuesto químicamente puro sustancialmente puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, la purificación
20 adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
Por lo tanto, la referencia a un polipéptido sustancialmente purificado, tal como una PH20 soluble sustancialmente purificada, se refiere a preparaciones de proteínas que están sustancialmente libres de material celular incluyendo preparaciones de proteínas en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que 25 se aísla o se produce recombinantemente. En una realización, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también referidas en la presente memoria como proteínas contaminantes), generalmente menos de aproximadamente 20% de proteínas no enzimáticas o 10% de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente 5% de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce de forma
30 recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína enzimática.
Según se utiliza en la presente memoria, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína se separa de precursores químicos
35 u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5% o menos de precursores químicos o productos químicos o componentes no enzimáticos.
Según se utiliza en la presente memoria, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico
40 sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se producemediantemétodos recombinantes y/o mediantemétodos de síntesis química.
Según se utiliza en la presente memoria, la producción por medios recombinantes o el uso de métodos de ADN recombinante significa el uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas
45 codificadas por ADN clonado.
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Según se utiliza en la presente memoria, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se utilizan para introducir un ácido nucleico heterólogo en las células para su expresión o replicación. Los vectores típicamente permanecen episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar la integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan los vectores que son cromosomas artificiales, tales como los cromosomas artificiales de levadura y los cromosomas artificiales de mamífero. La selección y el uso de tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está unido operativamente a secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación. Los vectores de expresión generalmente derivan de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula anfitriona apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen aquellos que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y aquellos que permanecen episómicos o aquellos que se integran en el genoma de la célula anfitriona.
Según se utiliza en la presente memoria, el vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Los vectores virales son virus modificados genéticamente que están conectados operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos olanzaderas) los genes exógenos a las células.
Según se utiliza en la presente memoria, "operablemente" o "conectado operativamente" cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos de modo que funcionen en concierto para los fines previstos, p.ej., la transcripción se inicia aguas abajo del promotor y aguas arriba de cualquier secuencia transcrita. El promotor es usualmente el dominio al que se une la maquinaria transcripcional para iniciar la transcripción y avanza a través del segmento codificante hacia el terminador.
Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "evaluar" incluya una determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteína, tal como una enzima, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también para obtener un índice, proporción, porcentaje, valor visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, no es necesario en absoluto que la especie química realmente detectada sea el propio producto escindido enzimáticamente, sino que puede ser, por ejemplo, un derivado del mismo o alguna otra sustancia adicional. Por ejemplo, la detección de un producto de escisión puede ser un radical detectable tal como un radical fluorescente.
Según se utiliza en la presente memoria, la actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o la respuestas fisiológicas que se producen después de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. La actividad biológica, por lo tanto, abarca los efectos terapéuticos y la actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones y mezclas. Se pueden observar actividades biológicas en sistemas in vitro diseñados para someter a ensayo o utilizar tales actividades. Por lo tanto, para los fines de la presente memoria, una actividad biológica de una enzima hialuronidasa es su degradación deácido hialurónico.
Según se utiliza en la presente memoria, equivalente, cuando se hace referencia a dos secuencias de ácidos nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestión codifican la misma secuencia de aminoácidos o proteínas equivalentes. Cuando se utiliza equivalente para referirse a dos proteínas o péptidos, significa que las dos proteínas
o péptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos con solo sustituciones de aminoácidos que no alteran sustancialmente la actividad o función de la proteína o el péptido. Cuando equivalente se refiere a una propiedad, no es necesario que la propiedad esté presente en la misma medida (p.ej., dos péptidos pueden exhibir diferentes tasas del mismo tipo de actividad enzimática), pero las actividades son generalmente sustancialmente las mismas.
Según se utiliza en la presente memoria, "modular" y "modulación" o "alterar" se refieren a un cambio de una actividad de una molécula, tal como una proteína. Las actividades ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, actividades biológicas, tales como la transducción de señales. La modulación puede incluir un aumento de la actividad (es decir, regulación al alza o actividad agonística), una disminución de la actividad (es decir, regulación a la baja o inhibición) o cualquier otra alteración de una actividad (tal como un cambio en la periodicidad, frecuencia, duración, cinética u otro parámetro). La modulación puede depender del contexto y típicamente la modulación se compara con un estado designado, por ejemplo, la proteína de tipo salvaje, la proteína en un estado constitutivo o la proteína expresada en un tipo o condición de célula designada.
Según se utiliza en la presentememoria, la administración directa serefierea una composición queseadministra sin dilución.
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Según se utiliza en la presentememoria, una formulación dedosificación única se refiere a una formulación para uso una sola vez. Típicamente, una formulación de dosificación única es para administración directa.
5 Según se utiliza en la presente memoria, una formulación de dosificación múltiple se refiere a una formulación para su uso en administraciones repetidas.
Según se utiliza en la presente memoria, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuosos, no acuosos o cualquier combinación delos mismos.
10 Según se utiliza en la presente memoria, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más elementos. La combinación puede ser de dos o más elementos separados, tales como dos composiciones o dos colecciones, puede ser una mezcla de los mismos, tal como una mezcla única de los dos o más elementos, o cualquier variación de los mismos. Los elementos de una combinación generalmente están asociados o
15 relacionadosfuncionalmente.
Según se utiliza en la presente memoria, "enfermedad o trastorno" se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta de una causa o afección incluyendo, pero sin limitarse a, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas y que se caracteriza por síntomas identificables. Las enfermedades y trastornos de interés en
20 lapresentememoriasonenfermedadesytrastornosasociadosconhialuronano.
Según se utiliza en la presente memoria, "administración intravenosa" se refiere a la administración de un agente terapéutico directamente en una vena.
25 Según se utiliza en la presente memoria, un "cáncer asociado a hialuronano" o "cánceres ricos en hialuronano" incluyen cánceres en los que los niveles de hialuronano se elevan como causa, consecuencia o como se observa de otro modo en la enfermedad o afección. Los cánceres o tumores asociados a hialuronano se asocian a niveles elevados de hialuronano en un tejido o célula, aumento de la presión del líquido intersticial, disminución del volumen vascular y/o aumento del contenido de agua en un tejido. Tales cánceres incluyen, por ejemplo, tumores, incluyendo
30 tumores sólidos tales como cánceres en fase tardía, cánceres metastásicos, cánceres indiferenciados, cáncer de ovario, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer demama, cáncer de colon y otros cánceres.
Según se utiliza en la presente memoria, los niveles elevados de hialuronano se refieren a las cantidades de
35 hialuronano en un tejido, fluido corporal o célula en particular, dependiendo de la enfermedad o condición, consecuencia u observada de otro modo en la enfermedad. Por ejemplo, como consecuencia de la presencia de un tumor rico en hialuronano, los niveles de hialuronano (HA) pueden elevarse en fluidos corporales, tales como sangre, orina, saliva y suero, y/o en el tejido o célula tumoral. El nivel se puede comparar con un patrón u otro control adecuado, como una muestra comparable de un sujeto que no tiene la enfermedad asociada a HA.
40 Según se utiliza en la presente memoria, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o afección significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o totalmente, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o la prevención del empeoramiento de los síntomas o la progresión de una enfermedad.
45 Según se utiliza en la presente memoria, un agente farmacéuticamente eficaz incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, anestésicos, vasoconstrictores, dispersantes, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos demolécula pequeña y proteínas terapéuticas.
50 Según se utiliza en la presente memoria, tratamiento significa cualquier manera en la que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad u otraindicación, mejoran o se alteran beneficiosamente de otromodo.
Según se utiliza en la presente memoria, efecto terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento de un 55 sujeto que altera, típicamente mejora o alivia los síntomas de una enfermedad o afección o que cura una enfermedad o afección. Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de una composición, molécula
o compuesto que da como resultado un efecto terapéutico después de la administración a un sujeto.
Según se utiliza en la presentememoria, el término "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo unmamífero, tal como 60 un ser humano.
Según se utiliza en la presente memoria, un paciente se refiere a un sujeto humano que presenta síntomas de una enfermedad o trastorno.
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Según se utiliza en la presente memoria, aproximadamente lo mismo significa dentro de una cantidad que un experto en la técnica consideraría como lo mismo o dentro de un intervalo aceptable de error. Por ejemplo, típicamente, para composiciones farmacéuticas, dentro de al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5% o 10% se considera aproximadamente lo mismo. Tal cantidad puede variar dependiendo de la tolerancia a la variación en la composición
5 concreta por parte de los sujetos.
Según se utiliza en la presente memoria, el régimen de dosificación se refiere a la cantidad de agente, por ejemplo, la composición que contiene un agente antihialuronano, por ejemplo una hialuronidasa soluble u otro agente, administrada, y la frecuencia de administración. El régimen de dosificación es una función de la enfermedad o
10 afecciónquesevayaatratar,yporlotantopuedevariar.
Según se utiliza en la presente memoria, la frecuencia de administración se refiere al tiempo entre las administraciones de tratamiento sucesivas. Por ejemplo, la frecuencia puede ser de días, semanas o meses. Por ejemplo, la frecuencia puede ser más de una vez por semana, por ejemplo, dos veces por semana, tres veces por
15 semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana o diariamente. La frecuencia también puede ser de una, dos, tres o cuatro semanas. La frecuencia concreta está en función de la enfermedad o afección concretas tratadas. Generalmente, la frecuencia es más de una vez por semana, y generalmente es dos veces por semana.
20 Según se utiliza en la presente memoria, un "ciclo de administración" se refiere al programa repetido del régimen de dosificación de administración de la enzima y/o un segundo agente que se repite a lo largo de administraciones sucesivas. Por ejemplo, un ciclo de administración ilustrativo es un ciclo de 28 días con administración dos veces a la semana durantetres semanas, seguido de una semana de dosificación interrumpida.
25 Según se utiliza en la presente memoria, cuando se hace referencia a la dosificación basada en mg/kg del sujeto, se considera que un sujeto humano medio tiene una masa de aproximadamente 70 kg-75 kg, tal como 70 kg y un área de superficie corporal (ASC) de 1,73.
Según se utiliza en la presente memoria, el alivio de los síntomas de una enfermedad o trastorno concretos
30 mediante un tratamiento, tal como mediante la administración de una composición farmacéutica u otro agente terapéutico, se refiere a cualquier disminución, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria, de los síntomas o, efectos adversos de una afección, tal como, por ejemplo, la reducción de los efectos adversos asociados con o que se producen tras la administración de un agente antihialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada.
35 Según se utiliza en la presente memoria, la prevención o profilaxis se refiere a la reducción del riesgo de desarrollar una enfermedad o afección.
Según se utiliza en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "dosis terapéuticamente
40 eficaz" se refieren a la cantidad de un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por lo tanto, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.
Según se utiliza en la presente memoria, la forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente discretas 45 adecuadasparasujetoshumanosyanimalesyenvasadasindividualmentecomoseconoceenlatécnica.
Según se utiliza en la presente memoria, una formulación de dosificación única se refiere a una formulación en forma de una dosis única.
50 Según se utiliza en la presente memoria, la formulación para administración directa significa que la composición no requiere una dilución adicional para su administración.
Según se utiliza en la presentememoria, un "artículo defabricación" es un producto quese fabrica y secomercializa. Según se utiliza en esta solicitud, se pretende que el término abarque agentes antihialuronano, por ejemplo enzima
55 de degradación de hialuronano, tal como hialuronidasa, y composiciones de segundo agente contenidas en artículos de envasado. Por ejemplo, un segundo agente es un corticosteroide, un taxano dirigido a un tumor o un agente quimioterapéutico.
Según se utiliza en la presente memoria, fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Por lo tanto, los
60 fluidos abarcan de ese modo composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones similares.
Según se utiliza en la presente memoria, una combinación, tal como una combinación de composiciones proporcionadas en la presentememoria, se refiere a una asociación de elementos dela combinación.
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Según se utiliza en la presente memoria, un kit se refiere a una combinación de componentes, tal como una combinación de las composiciones de la presente memoria y otro elemento para un fin que incluye, pero no se limita a, reconstitución, activación e instrumentos/dispositivos para suministro, diagnóstico y evaluación de una actividad o propiedad biológicas. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones de uso.
5 Según se utiliza en la presente memoria, un extracto o producto lisado celular se refiere a una preparación o fracción que se prepara a partir de una célula lisada o rota.
Según se utiliza en la presente memoria, el animal incluye cualquier animal, tal como, pero no limitado a primates
10 incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves de corral, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los seres humanos como animal contemplado. Las hialuronidasas proporcionadas en la presente memoria son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariota y fúngica. La mayoría de las hialuronidasas son de origen animal, incluyendo de origen mamífero. Generalmente las hialuronidasas son de origen humano.
15 Según se utiliza en la presente memoria, los tratamientos anticancerosos incluyen la administración de fármacos y otros agentes para tratar el cáncer, y también protocolos de tratamiento, tales como cirugía y radiación. Los tratamientos contra el cáncer incluyen la administración de agentes contra el cáncer.
20 Según se utiliza en la presente memoria, un agente anticanceroso se refiere a cualquier agente o compuesto utilizado en el tratamiento contra el cáncer. Estos incluyen cualquier agente, cuando se utiliza solo o combinado con otros compuestos, que puede aliviar, reducir, mejorar, prevenir o colocar o mantener en un estado de remisión de síntomas clínicos o marcadores de diagnóstico asociados con tumores y cáncer, y se puede utilizar en combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria. Los agentes anticancerosos ilustrativos
25 incluyen, pero no se limitan a, enzimas de degradación de hialuronano, tales como las enzimas de degradación de hialuronano PEGilado proporcionadas en la presente memoria utilizadas individualmente o combinadas con otros agentes anticancerosos, tales como agentes quimioterapéuticos, polipéptidos, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas o vectores de terapia génica, virus o ADN.
30 Según se utiliza en la presente memoria, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de ensayo, excepto que no se trata con un parámetro de ensayo, o, si se trata de una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado con la afección de interés. Un control también puede ser un control interno.
35 Según se utiliza en la presente memoria, las formas singulares "un", "una", "uno" y "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a un compuesto que comprende o contiene "un dominio extracelular" incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.
40 Según se utiliza en la presente memoria, los intervalos y las cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo concretos. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente de 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases".
Según se utiliza en la presente memoria, "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia
45 descritas posteriormente tiene lugar o no, y que la descripción incluye casos en los que se produce dicho evento o circunstancia y casos en los que no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo no está sustituido o está sustituido.
Según se utiliza en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácido y otros
50 compuestos están, a menos que se indique lo contrario, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión IUPAC-IUB de Nomenclatura Bioquímica (véase, (1972) Biochem. 11:1726).
B. Terapia combinada con el agente antihialuronano
55 Se proporcionan en la presente memoria terapias combinadas de un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, y un taxano dirigido a un tumor, tal como paclitaxel unido a albúmina, para su uso en el tratamiento de cánceres. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan terapias combinadas de enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero, por ejemplo una hialuronidasa, tal como PEGPH20, y un taxano dirigido a un tumor, tal como paclitaxel unido a albúmina, para su uso en el tratamiento de cánceres. En
60 particular, la terapia combinada proporcionada en la presente memoria se utiliza en el tratamiento de cualquier cáncer caracterizado por tumores sólidos que son impenetrables debido a la capa estromal. Los ejemplos de tales cánceres incluyen cánceres de tumores sólidos, tales como, pero sin limitarse a, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello y otros. La terapia combinada puede incluir adicionalmente un fármaco quimioterapéutico citotóxico adicional, por ejemplo cualquiera cuya actividad se incremente (p.ej. debido a un aumento del suministro y/o un incremento de la semivida) por uno o ambos agentes antihialuronano, por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y/o el taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico adicional puede ser un análogo de nucleósido, tal como gemcitabina o un derivado del mismo, que exhiba actividades antitumorales directas.
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1. Tumores sólidos y terapias dirigidas contra tumores
Los tumores sólidos están formados por células cancerosas y células del estroma (p.ej. fibroblastos y células inflamatorias) que están rodeadas por una matriz extracelular y una red vascular. Las células estromales, los 10 componentes de la matriz extracelular y/o la vasculatura generalmente son anormales en comparación con los presentes en los tejidos normales. Por ejemplo, muchos tumores sólidos tienen un mayor número de fibroblastos en comparación con los tejidos normales. Además, la vasculatura en los tumores sólidos puede mostrar una estructura ramificada o convolucionada en comparación con la vasculatura normal, y mostrar aberraciones estructurales caracterizadas por vasos dilatados, reducción del recubrimiento endotelial y/o vasos comprimidos. Finalmente, el 15 tumor y las células del estroma producen y ensamblan una red compleja de componentes de la matriz extracelular, tales como colágenos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos (p.ej., hialuronano) y otras moléculas que forman una masa densa y pueden contribuir a la alta presión intersticial del tumor. La alta presión del fluido intersticial por encima de la presión intravascular en las arteriolas y capilares terminales puede perjudicar la perfusión de líquidos y solutos al intersticio. Por lo tanto, la alta presión intersticial puede dificultar la absorción de productos terapéuticos en
20 los tejidos tumorales, y también puede afectar a las propiedades de crecimiento de las células tumorales para apoyar la proliferación de células tumorales.
Para que las terapias tumorales sean eficaces, los medicamentos deben salir de forma eficaz de los vasos sanguíneos del tumor y penetrar en los tejidos del tumor para llegar a las células cancerosas. La alta presión del
25 fluido intersticial, así como la composición densa y la organización de la matriz extracelular y las células asociadas afectan a la penetración del fármaco. El resultado es que la barrera estromal a menudo impide la penetración de fármacos antitumorales a los tumores, lo que hace que muchos tratamientos convencionales contra el cáncer sean ineficaces.
30 Por ejemplo, el cáncer de páncreas se encuentra entre los cánceres de tumores sólidos más impenetrables. Como resultado, los cánceres de páncreas, incluyendo el adenocarcinoma ductal pancreático, se caracterizan por una resistencia innata a los agentes quimioterapéuticos convencionales, de modo que la tasa de supervivencia a 5 años es inferior a 5%. La terapia convencional para el cáncer de páncreas es el tratamiento con gemcitabina. La gemcitabina tiene efectos limitados sobre el aumento de la supervivencia del paciente. Por ejemplo, solo
35 aproximadamente una cuarta parte de los pacientes tratados con gemcitabina en monoterapia exhibe un beneficio clínico con una mediana de supervivencia de pocomás de 5 meses, que fue solo un mes más que el tratamiento con el agente quimioterapéutico fluorouracilo (5-FU) (Burris et al. (1997) J Clin Oncol, 15:2403-2413). En un entorno coadyuvante donde el tratamiento también se acompaña de cirugía de cáncer de páncreas u otra terapia coadyuvante no quimioterapéutica, la gemcitabina aumentó la supervivencia en dos meses en comparación con los
40 pacientesquesesometieronsoloacirugía(Neuhausetal.(2008)J.Clin.Oncol.26:supl.de20demayo;resumen).
Recientemente, se han desarrollado terapias que incluyen un agente terapéutico que puede penetrar la capa estromal y la vasculatura asociada. Los agentes terapéuticos que pueden reducir el estroma, perforar orificios o penetrar de otro modo el estroma se consideran agentes terapéuticos prometedores para muchos cánceres 45 caracterizados por una capa estromal impenetrable. Tales agentes incluyen, por ejemplo, taxanos conjugados con albúmina (Von Hoff et al. (2011) J. Clin. Oncol., 29:4548-54; Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269), un inhibidor de erizo (Olive et al. (2009) Science, 324:1457-61) e hialuronidasa conjugada con polímero (Provenzano et al. (2012) Cancer Cell, 21:418-429). Cada uno de estos tratamientos también está asociado con un aumento de suministro de agentes quimioterapéuticos no dirigidos al estroma, dando como resultado una potenciación de los
50 efectos antitumorales y una duplicación del tiempo de supervivencia en comparación con el agente quimioterapéutico (p.ej., gemcitabina) en monoterapia.
a. Taxano dirigido a tumores
55 Los taxanos, tales como paclitaxel (p.ej. Taxol®) y docetaxel (p.ej. Taxotere®) son potentes agentes quimioterapéuticos para su uso en el tratamiento de múltiples tipos de tumores. Los taxanos actúan como inhibidores mitóticos al unirse con alta afinidad a los microtúbulos, interfiriendo de ese modo en la división celular. El resultado es que los taxanos previenen el crecimiento de células tumorales y la metástasis, y pueden causar la muerte celular. El uso terapéutico de taxanos ha sidolimitado debido a problemas con la solubilidad ylas toxicidades
60 asociadas, la disponibilidad sistémica a largo plazo y la inaccesibilidad al estroma tumoral.
Para superar los problemas asociados con el uso terapéutico de taxanos, se ha desarrollado una formulación de fármaco en nanopartículas dirigida al receptor gp60 constituida por formas de taxanos en partículas unidas a albúmina. Estas incluyen, por ejemplo, paclitaxel unido a albúmina en nanopartículas (nab) (ABI-007, p.ej.,
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Abraxane®) y docetaxel unido a albúmina en nanopartículas (ABI-008). Gp60 es el receptor de albúmina en el endotelio vascular. La captación mediada por el receptor de albúmina a través de gp60 da como resultado la asociación con caveolina-1 intracelular que conduce a la invaginación de la membrana celular para formar vesículas transcitóticas (denominadas caveolas) que contienen los constituyentes del plasma unidos del espacio extracelular, 5 transcitosis y deposito extravascular del contenido de las caveolas. Además, la albúmina también se une a SPARC (ácido proteico secretado y rico en cisteína), que es una glicoproteína de le matriz extracelular que se expresa en exceso y se asocia con un mal pronóstico en una variedad de cánceres. El resultado es que se evitan las barreras estromales al suministro de fármacos y se logra una mayor concentración intratumoral del fármaco. El nab-paclitaxel puede alcanzar concentraciones intratumorales más altas y una mayor biodisponibilidad en comparación con el
10 paclitaxelconvencionalconunabasededisolvente(Foote(2007)BiotechnologyAnnualReview,13:345).
Dado que los taxanos dirigidos a tumores, tales como los taxanos conjugados con albúmina, pueden penetrar y reducir o hundir el estroma, estos agentes se pueden utilizar combinados con otros agentes quimioterapéuticos no dirigidos al estroma para mejorar el suministro de los otros agentes al tumor. El mecanismo para la mejora del
15 suministro se atribuye a la alteración de la arquitectura del estroma y la inducción de la angiogénesis reactiva que conduce a un aumento de la perfusión y suministro del agente quimioterapéutico (véase, p. Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269). Por ejemplo, los estudios han demostrado que el nab-paclitaxel, un taxano conjugado con albúmina, combinado con gemcitabina aumentó casi 2,8 veces la cantidad de gemcitabina en el tumor en comparación con el tratamiento con gemcitabina sola (Von Hoff et al. (2011) J. Clin. Oncol., 29:4548-4554). Los
20 resultados también mostraron que la terapia combinada duplicó el tiempo de supervivencia de los pacientes con cáncer de páncreas (Von Hoff et al. (2011).
El mecanismo para aumentar las cantidades intratumorales de gemcitabina combinada con terapia con nabpaclitaxel se ha atribuido más recientemente a un mecanismo independiente relacionado con una reducción de la
25 citidina desaminasa (Cda) en grupos tratados con nab-paclitaxel (Frese et al. (2012) Cancer Discovery 2:260-269). La Cda se expresa de forma ubicua en las células y puede inactivar la gemcitabina por desaminación a su metabolito difluorodesoxiuridina (dFdU). El tratamiento con nab-paclitaxel aumentó las especies reactivas del oxígeno (ROS), lo que condujo a la degradación de Cda sin ninguna modulación de los niveles de ARNm. Por lo tanto, el tratamiento conjunto con nab-paclitaxel da como resultado una reducción de la desaminación de la
30 gemcitabina y, por lo tanto, estabiliza la gemcitabina, lo que conduce a una elevación de los niveles de gemcitabina intratumoral.
b. Agente anti-hialuronano
35 Los agentes antihialuronano reducen los niveles de ácido hialurónico (HA, también referido en la presente memoria como hialuronano) al interferir con su síntesis o aumentar su degradación. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano, tales como las enzimas hialuronidasas, son enzimas que menoscaban el ácido hialurónico y lo degradan. El hialuronano es un componente principal de la matriz extracelular de tumores sólidos. El HA es un glicosaminoglicano lineal de alto peso molecular que contiene unidades repetitivas de disacáridos, beta-1,3-N-acetil
40 D-glucosamina-unida mediante beta-1,4 a ácido D-glucurónico. El HA se produce naturalmente en el organismo y se secreta a niveles extremadamente altos en algunas células cancerosas, incluyendo las células de cáncer de páncreas. Se han notificado aberraciones locales del metabolismo del HA en muchas neoplasias tumorales sólidas, donde los niveles elevados de HA frecuentemente se correlacionan con un mal pronóstico en tumores tales como el carcinoma demama, gástrico, colorrectal, ovárico, de próstata y de pulmón.
45 El HA está implicado en un aumento de la captación de agua y presión del líquido intersticial (PLI) en los tejidos enfermos, tales como tumores, lo que da como resultado una vasculatura tumoral comprimida. Por ejemplo, en sitios de inflamación o en un foco tumoral, hay una acumulación rápida de hialuronano, otros componentes de la matriz y agua. Debido a esta rápida acumulación, el sitio enfermo no puede llegar a un equilibrio con su entorno y, por lo
50 tanto, tiene una presión de fluido intersticial más alta que los tejidos normales. Como se discutió anteriormente, la PLI de la mayoría de los tumores sólidos y otros tejidos enfermos asociados con el HA acumulado es elevada, actuando como una barrera para el suministro eficaz de fármacos (Heldin et al. (2004) Nat Rev Cancer 4 (10): 806813). La acumulación de HA también reduce la inhibición de contacto entre las células tumorales (véase, p.ej., Itano et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:3609-3614).
55 Los agentes anti-hialuronano que inhiben la síntesis de HA o degradan hialuronano, tales como enzimas de degradación de hialuronano, p.ej., hialuronidasas (p.ej. PH20), pueden reducir el hialuronano de manera que el tejido se deshincha, los vasos sanguíneos se expanden y puede circular más sangre a través del sitio. Esto da como resultado una disminución de la presión del líquido intersticial en el sitio del tejido y un aumento asociado en la
60 perfusión vascular. Por ejemplo, se ha demostrado que la hialuronidasa elimina el HA de los tumores, lo que reduce el volumen tumoral, reduce la presión intersticial intratumoral, disminuye la proliferación de las células tumorales y mejora la eficacia de los fármacos quimioterapéuticos y los agentes biológicos administrados conjuntamente, al permitir el aumento de la penetración del tumor (véase p.ej. la Solicitud Publicada de los Estados Unidos Núm. 20100003238 yla Solicitud Internacional PCT publicada Núm. WO 2009/128917).
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El uso de hialuronidasa, tal como una enzima PH20, para el tratamiento sistémico adolece de problemas asociados con la corta semivida de la enzima. Por ejemplo, la hialuronidasa nomodificada típicamente tiene una semivida corta de actividad enzimática en la sangre de minutos, generalmente menos de 5 minutos. Esto significa que tales enzimas generalmente no son adecuadas para su uso en administraciones intravenosas, y otras administraciones, 5 donde su duración de acción es de corta duración. Esto es porque después de la degradación, el sustrato de HA es reemplazado con una semivida de aproximadamente 5 h. Por el contrario, los métodos que aumentan el suministro y/o prolongan la asociación de una hialuronidasa con hialurounano asociado a células (p.ej., hialuronano pericelular asociado a tumor) permiten el tratamiento de tumores ricos en HA. Tales métodos pueden incluir, entre otros, la conjugación de la enzima con un polímero, el uso de una enzima que está aglicosilada o que está modificada para 10 tener una glucosilación reducida, infusión continua de la enzima y/o suministro localizado de la enzima. Por ejemplo, la modificación con polímero de la hialuronidasa, por ejemplo mediante por PEGilación, aumenta la semivida de la enzima a aproximadamente 48 a 72 horas y permite el tratamiento sistémico de tumores ricos en HA (véase p.ej. la Solicitud Publicada de los Estados Unidos Núm. 20100003238 y la Solicitud Internacional PCT publicada Núm. WO 2009/128917). El aumento de la semivida con respecto a la hialuronidasa no modificada permite la eliminación
15 continua de HA, y por lo tanto reduce o disminuye el grado de regeneración de HA en tejidos enfermos, tales como el tumor. Por lo tanto, el mantenimiento de niveles de enzimas plasmáticas mediante conjugación de polímeros puede eliminar el HA, tal como HA tumoral, y también contrarrestar la resíntesis de HA.
Además, las enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero, tales como una hialuronidasa
20 conjugada con polímero o PH20, por ejemplo PEGPH20, pueden reducir el estroma que rodea las células cancerosas degradando el HA. Tales agentes se pueden utilizar en terapia de agente único para el tratamiento de tumores o en terapia combinada para potenciar el suministro de agentes quimioterapéuticos no dirigidos al estroma tales como gemcitabina. Los resultados de los ensayos clínicos de pacientes con cáncer de páncreas también muestran que el tratamiento con PEGPH20 combinado con gemcitabina produce una duplicación casi total de la
25 supervivencia global en comparación con el tratamiento con gemcitabina sola (Provenzano et al. (2012) Cancer Cell, 21:418-429).
2. Terapia combinada con agente anti-hialuronano y taxano dirigido a un tumor
30 En la presente memoria se ha encontrado que las terapias combinadas que contienen al menos dos terapias dirigidas contra estroma o tumor diferentes exhiben una eficacia que es mucho mayor que un único agente de direccionamiento al estroma. Por ejemplo, se ha encontrado en la presente memoria que la terapia combinada con taxanos dirigidos a tumores y un agente antihialuronano, en particular un agente antihialuronano capaz de alcanzar el HA pericelular en un tumor durante un tiempo suficiente para reducir los niveles de HA, muestra una mayor
35 eficacia en comparación con el tratamiento individual de cualquiera de los agentes solo. Por ejemplo, la terapia combinada con un taxano dirigido a un tumor y una hialuronidasa conjugada con polímero da como resultado un aumento de la eficacia de más del 25% en comparación con el tratamiento con un solo agente. En una combinación adicional con el fármaco quimioterapéutico no dirigido al estroma gemcitabina, la mediana de supervivencia de un cáncer ilustrativo aumentó en 79% en un modelo de ratón de cáncer de páncreas en comparación con el tratamiento
40 solo con gemcitabina y aumentó en más de 30% en comparación con las terapias existentes que contenían solo un único agente de direccionamiento al estroma. Este aumento de la eficacia se puede traducir en una mejora sustancial en la supervivencia de los pacientes con cáncer de páncreas y otros cánceres caracterizados por un estroma impenetrable en comparación conlos tratamientos existentes.
45 Por lo tanto, en la presente memoria se proporcionan métodos que utilizan una terapia combinada que contiene un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano o una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p.ej. hialuronidasa o PH20), y un taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina, para tratar cánceres de estroma tumoral sólido. Por ejemplo, la terapia combinada se puede utilizar para el tratamiento de cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico,
50 cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y otros. Las composiciones que contienen el agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p.ej. hialuronidasa o PH20) y un taxano dirigido a un tumor (p.ej. taxano unido a albúmina) se pueden proporcionar por separado en la combinación o se pueden proporcionar en una única composición. Si se proporcionan y se administran por separado, los agentes se pueden administrar de forma simultánea o casi simultánea, sucesiva o
55 intermitente en cualquier orden. Por ejemplo, un agente antihialuronano, p.ej., enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p.ej. hialuronidasa o PH20) y un taxano dirigido a un tumor (p.ej. taxano unido a albúmina) se puede administrar por separado, por lo que se administran casi simultáneamente o se administran con un intervalo de horas o días. El sitio de inyección puede ser el mismo o diferente. Si es diferente, el sitio de inyección puede estar cerca del sitio deinyección del primer agente administrado.
60 La combinación de los agentes dirigidos al tumor se puede utilizar en conjunto para tratar cánceres de estroma tumoral sólido, o se puede utilizar combinada adicionalmente con otros agentes o tratamientos quimioterapéuticos. En ejemplos concretos, la combinación de un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p.ej. hialuronidasa o PH20) y un taxano dirigido a un tumor (p.ej. taxano unido
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a albúmina) se utiliza en una combinación adicional con un agente quimioterapéutico. El otro agente puede ser un agente de direccionamiento estromal o no estromal. Típicamente, el otro agente es un agente citotóxico no estromal que exhibe actividad antitumoral directa. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico adicional puede ser un agente citotóxico tal como platino (cisplatino o carboplatino), paclitaxel, gemcitabina, docetaxel, vinorelbina, irinotecán y 5 pemetrexed. Típicamente, el agente quimioterapéutico adicional es un análogo de nucleósido, tal como gemcitabina. El tratamiento o agente adicional se pueden administrar por separado o junto con el agente anti-hialuronano, tal como la terapia combinada de la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p.ej. hialuronidasa) y/o un taxano dirigido a un tumor (p.ej. taxano unido a albúmina). El agente adicional se puede administrar por separado en la combinación o proporcionarse en una única composición. Si se proporciona y se 10 administra por separado, el agente adicional se puede administrar simultáneamente o casi simultáneamente, sucesivamente o intermitentemente en cualquier orden con la terapia combinada de agente antihialuronano y/o taxano unido a albúmina. Típicamente, con el fin de efectuar una mejora del suministro del agente adicional, el agente adicional se administra después de la administración de la terapia combinada del agente antihialuronano y/o un taxano unido a albúmina. Debido a la mejora del suministro y la semivida del agente quimioterapéutico adicional, 15 la dosificación del agente adicional para su administración se puede reducir y/o la frecuencia de administración se puede reducir en comparación con los regímenes de dosificación existentes. El resultado es que la terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede dar como resultado una reducción de los efectos secundarios del agente terapéutico adicional co-administrado (p.ej., análogo de nucleósido tal como gemcitabina) en comparación con su administración solo o su administración con cualquiera de un agente antihialuronano, p.ej., una
20 enzima de degradación de hialuronano, o taxano dirigido a un tumor solo.
Las siguientes secciones describen agentes antihialuronano ilustrativos, incluyendo enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero, taxanos dirigidos a tumores y otros agentes quimioterapéuticos no limitantes ilustrativos para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria. También se describen
25 regímenesdedosificaciónymétodosilustrativosparaeltratamientodecánceresdetumoressólidosestromales.
C. Agentes de terapia combinada
En la presente memoria se proporcionan terapias combinadas de agentes antihialuronano, tales como enzimas de
30 degradación de hialuronano, y un taxano dirigido a un tumor, tal como paclitaxel unido a albúmina, para su uso en el tratamiento de cánceres. En particular, en la presente memoria se proporcionan terapias combinadas de una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, por ejemplo una hialuronidasa, tal como PEGPH20, y un taxano dirigido a un tumor, tal como paclitaxel unido a albúmina, para su uso en el tratamiento de cánceres. En particular, la terapia combinada proporcionada en la presente memoria se utiliza en el tratamiento de cualquier
35 cáncer caracterizado por tumores sólidos que son impenetrables debido al HA en la matriz extracelular. Ejemplos de tales cánceres incluyen cánceres de tumores sólidos, tales como, pero sin limitación, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello y otros. La terapia combinada puede incluir adicionalmente un fármaco quimioterapéutico citotóxico adicional, por ejemplo cualquiera cuya actividad se incremente (p.ej. debido al aumento del suministro y/o al aumento de la semivida) por
40 uno o ambos agentes antihialuronano, incluyendo la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, y/o taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico adicional puede ser un análogo de nucleósido, tal como gemcitabina o un derivado del mismo, que exhibe actividades antitumorales directas.
1. Agentes anti-hialuronano
45 La terapia combinada, que incluye combinaciones y métodos y su uso, proporcionada en la presente memoria contiene un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, p.ej., una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero. El agente antihialuronano es uno que se puede administrar de forma que alcance su diana y, en particular, alcance una célula tumoral que contiene un HA pericelular elevado. Por
50 ejemplo, el agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, se puede administrar por infusión continua o inyectarse localmente, puede modificarse con un polímero, o es uno que está aglicosilado o se modifica de forma que está aglicosilado o tenga una disminución de la glicosilación. En un ejemplo, las composiciones y combinaciones proporcionadas contienen una enzima de degradación de hialuronano, en particular una hialuronidasa, tal como una hialuronidasa soluble (p.ej. una PH20 o PH20 truncada), que ha sido modificada por
55 conjugación con una o más moléculas poliméricas (polímero), típicamente para aumentar la semivida de la enzima de degradación de hialuronano, por ejemplo, para promover efectos de tratamiento prolongados/sostenidos en un sujeto.
El hialuronano es un componente de la matriz extracelular y un componente principal de la barrera intersticial. Al
60 catalizar la hidrólisis de hialuronano, las enzimas de degradación de hialuronano reducen la viscosidad del hialuronano, aumentando así la permeabilidad del tejido y aumentando la velocidad de absorción de los fluidos administrados por vía parenteral. Como tales, los agentes anti-hialuronano, incluyen enzimas de degradación de hialuronano, tales como hialuronidasas, se han utilizado, por ejemplo, como agentes de diseminación o dispersión junto con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y suministro.
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Los agentes antihialuronano reducen los niveles de ácido hialurónico (HA, también referido en la presente memoria como hialuronano) al menoscabar su síntesis o aumentar su degradación. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano, tal como la hialuronidasa, menoscaban el ácido hialurónico (AH) y lo degradan. El tratamiento con agentes que degradan o inhiben la síntesis de hialuronano, tales como las enzimas de degradación de hialuronano,
5 reduce el hialuronano de manera que el tejido se deshincha, los vasos sanguíneos se expanden y puede circular más sangre a través del sitio. Los ejemplos de tales agentes antihialuronano son agentes que inhiben la síntesis de hialuronano o degradan el hialuronano.
a. Agentes que inhiben la síntesis de hialuronano
10 Los agentes antihialuronano incluyen agentes que inhiben la síntesis de hialuronano, tales como agentes que inhiben, reducen o regulan ala baja la expresión de una HA sintasa, inhibidores de la síntesis de HA e inhibidores de tirosina quinasa.
15 El HA puede sintetizarse mediante tres enzimas que son productos de tres genes de mamíferos relacionados identificados como HA sintasas, denominados has-1, has-2 y has-3. Diferentes tipos de células expresan diferentes enzimas HAS y la expresión de los ARNm de HAS se correlaciona con la biosíntesis de HA. Se sabe que el silenciamiento de los genes HAS en las células tumorales inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis. Un agente antihialuronano incluye cualquier agente que inhibe, reduce o regula a la baja la expresión o el nivel de una HA
20 sintasa. Tales agentes son conocidos por los expertos en la técnica o pueden identificarse.
Por ejemplo, la regulación a la baja de una HAS se puede lograr proporcionando oligonucleótidos que hibridan específicamente o interaccionan de otro modo con una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una HAS. Por ejemplo, los agentes anti-hialuronano que inhiben la síntesis de hialuronano incluyen moléculas antisentido o 25 efectoras contra un gene has. Tal inhibición antisentido o efectora se basa típicamente en la hibridación basada en enlaces de hidrógeno de hebras o segmentos de oligonucleótidos de forma que al menos una hebra o segmento se escinda, se degrade o se haga de otro modo inoperable. En otros ejemplos, se pueden emplear silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), ARNi, ribozimas y ADNzimas. Está en el nivel de un experto en la técnica generar tales construcciones basadas en la secuencia de HAS1 (expuesta en SEQ ID NO: 195), HAS2 (expuesta en SEQ ID 30 NO: 196) o HAS3 (expuesta en SEQ ID NO: 197 o 198). Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido o efector no tiene que ser 100% complementaria de la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Además, un oligonucleótido puede hibridarse en uno o más segmentos de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no están implicados en el evento de hibridación (p.ej. una estructura de bucle o estructura en horquilla). Generalmente, los compuestos antisentido o efectores tienen al menos 70% de 35 complementariedad de secuencia con una región diana dentro del ácido nucleico diana, por ejemplo, 75% a 100% de complementariedad, tal como 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%. Las moléculas efectoras o antisentido ilustrativas son conocidas en la técnica (véanse p.ej. Chao et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:27513-27522; Simpson et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am. J Path., 161:849; Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899; Edward et al. (2010) British J Dermatology, 162:1224-1232; Udabage et al. (2005)
40 Cancer Res., 65:6139; y Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada Núm. US20070286856).
Otro agente anti-hialuronano ilustrativo que es un inhibidor de la síntesis de HA es la 4-metilumbeliferona (4-MU; 7hidroxi-4-metilcumarina) o un derivado de la misma. La 4-MU actúa reduciendo el grupo de precursores de UDP-GlcUA que se requiere para la síntesis de HA. Por ejemplo, en células de mamífero, el HA se sintetiza mediante 45 HAS utilizando UDP-ácido glucurónico (UGA) y precursores de UDP-N-acetil-D-glucosamina. La 4-MU interfiere en el procedimiento mediante el cual se genera UGA, agotando así el grupo intracelular de UGA y dando como resultado la inhibición de la síntesis de HA. Se sabe que la 4-MU tiene actividad antitumoral (véanse p.ej. Lokeshwar et al. (2010) Cancer Res., 70:2613-23; Nakazawa et al. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol., 57:165-170; Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459). La administración oral de 4-MU a 600
50 mg/kg/d) reduce las metástasis en 64% en el modelo de melanoma B16 (Yoshihara et al. (2005) FEBS Lett., 579:2722-6). La estructura de 4-MU se muestra a continuación. Asimismo, los derivados de 4-MU exhiben actividad anticancerosa, en particular la 6,7-dihidroz-4-metil cumarina y 5,7-dihidroxi-4-metil cumarina (véase p.ej. Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459).
55 4-Metilumbeliferona (4-MU; C10H8O3)
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Otros agentes antihialuronano ilustrativos son los inhibidores de tirosina quinasa, tales como Leflunomida (Arava), 60 genisteína o erbstatina. La leflunomida también es un inhibidor de la síntesis de pirimidina. La leflunomida es un medicamento conocido para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) y también es eficaz en el tratamiento del rechazo de aloinjertos y xenoinjertos. Se sabe que el HA contribuye directa o indirectamente a la AR (véase p.ej. Stuhlmeier (2005) J Immunol., 174:7376-7382). Los inhibidores de la tirosina quinasa inhiben la expresión del gen HAS1 (Stuhlmeier 2005).
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5
b. Enzimas de degradación de hialuronano y enzimas de degradación de hialuronano conjugadas conpolímero
Los agentes antihialuronano incluyen enzimas de degradación de hialuronano. Las enzimas de degradación de
10 hialuronano, tales como las hialuronidasas, son una familia de enzimas que degradan el hialuronano, que es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Las enzimas de degradación de hialuronano actúan degradando hialuronano mediante la escisión de polímeros de hialuronano, que están compuestos por unidades de disacáridos repetitivas, ácido D-glucurónico (GlcA) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc), unidos mediante la alternancia de enlaces glicosídicos β-1→4 y β-1→3. Las cadenas de hialuronano
15 pueden alcanzar repeticiones de aproximadamente 25.000 disacáridos o más de longitud y el tamaño de los polímeros de hialuronano puede variar de aproximadamente 5.000 a 20.000.000 Da. in vivo. Al catalizar la hidrólisis del hialuronano, un componente principal de la barrera intersticial, las enzimas de degradación del hialuronano reducen la viscosidad del hialuronano, aumentando así la permeabilidad del tejido.
20 Por consiguiente, las enzimas de degradación de hialuronano para las combinaciones, usos y métodos proporcionados incluyen cualquier enzima que tenga la capacidad de catalizar la escisión de una cadena o polímero de disacárido de hialuronano. En algunos ejemplos, la enzima de degradación de hialuronano escinde el enlace glicosídico β-1→4 en la cadena o polímero de hialuronano. En otros ejemplos, la enzima de degradación de hialuronano cataliza la escisión del enlace glicosídico β-1→3 en la cadena o polímero de hialuronano.
25 Las enzimas de degradación de hialuronano incluyen hialuronidasas, así como otras enzimas tales como condroitinasas y liasas que tienen la capacidad de escindir hialuronano. Adicionalmente, las enzimas de degradación de hialuronano también incluyen formas solubles de las mismas que se pueden expresar y secretar a partir de las células. Como se describe a continuación, las enzimas de degradación de hialuronano existen en formas unidas a la
30 membrana o solubles que se secretan desde las células. Para los fines de la presente memoria, se proporcionan enzimas de degradación de hialuronano solubles para su uso en las combinaciones, métodos y usos en la presente memoria. Por lo tanto, cuando las enzimas de degradación de hialuronano incluyen un anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) y/o están ancladas a la membrana de otra manera o son insolubles, tales enzimas de degradación de hialuronano se pueden proporcionar en forma solublemediante truncamiento o deleción del ancla de
35 GPI para producir la enzima secretada y soluble. Por lo tanto, las enzimas de degradación de hialuronano incluyen variantes truncadas, p.ej. truncadas para eliminar todo o una parte de un ancla de GPI. Son ilustrativas de tales hialuronidasas solubles la hialuronidasa PH20 soluble, tales como las expuestas en (Patente de Estados Unidos Núm. 7.767.429; Publicaciones de los Estados Unidos Núm. US20040268425 o US20100143457.
40 Las enzimas de degradación de hialuronano proporcionadas en la presente memoria también incluyen variantes de cualquier enzima de degradación de hialuronano, tal como cualquier hialuronidasa o hialuronidasa soluble, por ejemplo una PH20, que es conocida por un experto en la técnica o que se describe en la presente memoria. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano pueden contener una o más variaciones en su secuencia primaria, tales como sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos. Una variante de una enzima de
45 degradación de hialuronano generalmente muestra al menos o aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en comparación con la enzima de degradación de hialuronano que no contiene la variación. Se puede incluir cualquier variación en la enzima de degradación de hialuronano para los fines en la presente memoria siempre que la enzima conserve actividad hialuronidasa, tal como al menos o aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%,
50 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o más de la actividad de una enzima de degradación de hialuronano que no contiene la variación (medida por ensayos in vitro y/o in vivo bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria). Por ejemplo, son ilustrativas de las enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo aquellas que pueden conjugarse con un polímero, cualquiera expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 2, 4-9, 47, 48, 150-170, 183189 y 199-210, o cualquiera que muestre al menos o aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%,
55 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4-9, 47, 48, 150170, 183-189 y 199-210.
Se han preparado y aprobado varias formas de enzimas de degradación de hialuronano, que incluyen hialuronidasas, para uso terapéutico en sujetos, incluyendo seres humanos. Por ejemplo, las preparaciones de 60 hialuronidasa derivadas de animales incluyen Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), una hialuronidasa testicular ovina purificada, Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals), hialuronidasa testicular bovina e Hydase™ (Prima Pharm Inc.), una hialuronidasa testicular bovina. Hylenex® (Halozyme Therapeutics) es una hialuronidasa recombinante humana producida por células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas genéticamente que contienen ácido nucleico que codifica formas solubles de PH20, denominada rHuPH20 (véanse p.ej., la Publicación de Estados
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Unidos Núm. US20040268425; la Patente de Estados Unidos Núm. 7.767.429). Se entiende que cualquier preparación de hialuronidasa se puede utilizar en las combinaciones, métodos y usos proporcionados en la presente memoria, véanse, p.ej., las Patentes de los Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565, 2.676.139, 2.795,529, 2.806.815, 2.808.362, 5.747.027 y 5.827.721 e la Publicación Internacional PCT Núm. WO2005/118799; la
5 Publicación de los Estados Unidos Núm. US20040268425; la Patente de Estados Unidos Núm. 7.767.429; o cualquiera proporcionada en la presentememoria.
Una descripción no limitante de enzimas de degradación de hialuronano ilustrativas, tales como enzimas hialuronidasa o enzimas hialuronidasas solubles, por ejemplo PH20, para su uso en las combinaciones y métodos
10 proporcionados en la presente memoria se describen a continuación. En general, tales enzimas de degradación de hialuronano incluyen aquellas que están conjugadas con un polímero.
i. Hialuronidasas
15 Las hialuronidasas son miembros de una gran familia de enzimas de degradación de hialuronano. Hay tres clases generales de hialuronidasas: hialuronidasas de tipo mamífero, hialuronidasas bacterianas e hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Se conocen otras hialuronidasas tales como de avispa de chaqueta amarilla (SEC ID NO: 12 y 13), abeja melífera (SEC ID NO: 14), avispón de cara blanca (SEC ID NO: 15) y avispa de papel (SEC ID NO: 16). Cualquiera de tales enzimas se puede utilizar en las composiciones, combinaciones y
20 métodos proporcionados en la presente memoria.
(a) Hialuronidasas de tipo mamífero
Las hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35) son endo-β-N-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan el enlace
25 glicosídico β-1→4 del hialuronano a diversas longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Estas enzimas tienen actividades tanto hidrolíticas como transglicosidasa, y pueden degradar hialuronano y condroitín sulfatos (CS), generalmente C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen, pero no se limitan a, las hialuronidasas de vaca (bovina) (SEC ID NO: 10, 11, 64, 203 y 204 y moléculas de ácido nucleico expuestas en SEC ID NO: 190-192), oveja (Ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 y 65, moléculas de ácido nucleico
30 expuestas en SEQ ID NO: 66 y 193-194), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), ratón (SEQ ID NO: 17-19, 32, 205), rata (SEQ ID NO: 22-24, 31, 206), conejo (SEQ ID NO: 25, 207), orangután (SEQ ID NO: 28), mono cinomolgo (SEQ ID NO: 29, 202), cobaya (SEQ ID NO: 30, 208), chimpancé (SEQ ID NO: 101, 199, 200), mono rhesus (SEQ ID NO: 102, 201), zorro (SEQ ID NO: 209 y 210) y humanas (SEQ ID NO: 1-2, 36-39). Las hialuronidasas anteriores incluyen hialuronidasas PH20. Además, la hialuronidasa BH55 es de este tipo como se describe en las Patentes de los
35 Estados Unidos Núm. 5.747.027 y 5.827.721. Son ilustrativas de hialuronidasas en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados en la presentememoria las hialuronidasas solubles.
Las hialuronidasas de mamífero se pueden subdividir adicionalmente en aquellas que son activas en condiciones neutras, que se encuentran predominantemente en extractos de testículos y activas en condiciones ácidas, que se 40 encuentran predominantemente en órganos tales como el hígado. Las hialuronidasas activas en condiciones neutras ilustrativas incluyen PH20, incluyendo pero sin limitarse a, PH20 derivada de diferentes especies tales como ovina (SEC ID NO: 27, 63 y 65), bovina (SEC ID NO: 11 y 64) y humana (SEC ID NO: 1). La PH20 humana (también conocida como SPAM1 o proteína de superficie del espermatozoide PH20), generalmente está anclada a la membrana plasmática a través de un ancla de glucosilfosfatidil inositol (GPI). Está naturalmente involucrada en la
45 adhesión espermatozoide-óvulo y ayuda a la penetración por los espermatozoides de la capa de células del cumulus al digerir el ácido hialurónico.
Además de la PH20 humana (también denominada SPAM1), se han identificado cinco genes similares a la hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 e HYALP1. HYALP1 es un pseudogen y no se 50 ha demostrado que HYAL3 (SEQ ID NO: 38) posea actividad enzimática frente a sustratos conocidos. HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 39) es una condroitinasa y exhibe poca actividad frente a hialuronano. HYAL1 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 36) es la enzima prototípica activa en condiciones ácidas y PH20 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1) es la enzima prototípica activa en condiciones neutras. Las hialuronidasas activas en condiciones ácidas, tales como HYAL1 y HYAL2 (polipéptido 55 precursor expuesto en SEQ ID NO: 37) generalmente carecen de actividad catalítica a pH neutro (es decir pH 7). Por ejemplo, HYAL1 tiene poca actividad catalítica in vitro por encima de un pH de 4,5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 es una enzima activas en condiciones ácidas con una actividad específica muy baja in vitro. Las enzimas de tipo hialuronidasa también se pueden caracterizar por las que generalmente están unidas a la membrana plasmática a través de un ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) tal como HYAL2 humana y PH20
60 humana (Danilkovitch-Miagkova et al., (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-4585), y aquellas que son generalmente solubles tales como HYAL1 humana (Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):1015).
PH20
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La PH20, como otras hialuronidasas de mamíferos, es una endo-β-N-acetil-hexosaminidasa que hidroliza el enlace glicosídico β1→4 del ácido hialurónico a diversas longitudes de oligosacáridos tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Tiene actividades tanto hidrolíticas como transglicosidasa y puede degradar el ácido hialurónico y los sulfatos de condroitina, tales como C4-S y C6-S. La PH20 participa de forma natural en la adhesión del 5 espermatozoide-óvulo y ayuda a la penetración por el espermatozoide de la capa de células del cumulus al digerir el ácido hialurónico. La PH20 está ubicada en la superficie de los espermatozoides y en el acrosoma derivado de los lisosomas, donde está unido a la membrana acrosómica interna. La PH20 de la membrana plasmática tiene actividad de hialuronidasa solo a pH neutro, mientras que la PH20 de la membrana acrosómica interna tiene actividad a pH neutro y ácido. Además de ser una hialuronidasa, PH20 también parece ser un receptor para la
10 señalización celular inducida por HA y un receptor para la zona pelúcida que rodea al ovocito.
Las proteínas PH20 ilustrativas, incluyendo las formas precursoras y maduras, incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de PH20 humanos (polipéptido precursor expuesto en SEC ID NO: 1, polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2), chimpancé (SEQ ID NO: 101, 199, 200), mono Rhesus (SEC ID NO: 102, 201) bovino (SEC ID NO:
15 11 y 64, 203, 204), conejo (SEC ID NO: 25, 207), PH20 ovina (SEC ID NO: 27, 63 y 65), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29, 202), cobaya (SEQ ID NO: 30, 208), rata (SEQ ID NO: 31, 206), ratón (SEQ ID NO: 32, 205) y zorro (SEQ ID NO: 209 y 210).
La PH20 bovina es un polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID NO: 11). El alineamiento de PH20 bovina
20 con PH20 humana muestra solo una débil homología, con múltiples espacios existentes desde el aminoácido 470 hasta los respectivos extremos carboxi debido a la ausencia de un ancla de GPI en el polipéptido bovino (véase p.ej., Frost (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440). De hecho, no se pronostican anclas claras de GPI en muchas otras especies de PH20 además de las humanas. Por lo tanto, los polipéptidos de PH20 producidos a partir óvidos y bóvidos existen naturalmente como formas solubles. Aunque la PH20 bovina existe unida muy laxamente a
25 la membrana plasmática, no está anclada a través de un ancla sensible a fosfolipasa (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-636). Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa soluble de testículos bovinos como un extractopara uso clínico (Wydase®, Hyalase®).
El transcrito de ARNm de PH20 humana se traduce normalmente para generar un polipéptido precursor de 509
30 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en el extremo N (posiciones de residuos de aminoácidos 1-35) y una secuencia señal de unión al ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 19 aminoácidos en el extremo C (posiciones de residuos de aminoácidos 491-509). La PH20 madura, por lo tanto, es un polipéptido de 474 aminoácidos expuesto en SEC ID NO: 2. Después del transporte del polipéptido precursor al RE y la eliminación del péptido señal, el péptido señal de unión a GPI C-terminal se escinde para facilitar la unión
35 covalente de un ancla de GPI al aminoácido C-terminal recién formado en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 490 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1. De este modo, se produce un polipéptido maduro anclado a GPI de 474 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.
40 La PH20 humana exhibe actividad hialuronidasa a pH neutro y ácido. En un aspecto, la PH20 humana es la hialuronidasa activa en condiciones neutras prototípica que generalmente se bloquea en la membrana plasmática a través de un ancla de GPI. En otro aspecto, PH20 se expresa en la membrana acrosómica interna donde tiene actividad hialuronidasa a pH neutro y ácido. Parece que PH20 contiene dos sitios catalíticos en distintas regiones del polipéptido: las regiones del Péptido 1 y del Péptido 3 (Cherr et al., (2001) Matrix Biology 20:515-525). La evidencia
45 indica que la región del péptido 1 de PH20, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 107-137 del polipéptido maduro expuesto en SEC ID NO: 2 y las posiciones 142-172 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, es requerida para la actividad de la enzima a pH neutro. Los aminoácidos en las posiciones 111 y 113 (correspondientes al polipéptido de PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 2) dentro de esta región parecen ser importantes para la actividad, ya que la mutagénesis por sustitución de aminoácidos da como resultado polipéptidos
50 de PH20 con actividad hialuronidasa de 3% o actividad hialuronidasa indetectable, respectivamente, en comparación con la PH20 detipo salvaje(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
La región del Péptido 3, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 242-262 del polipéptido maduro expuesto en SEC ID NO: 2, y las posiciones 277-297 del polipéptido precursor expuesto en SEC ID NO: 1, parece ser
55 importante para actividad enzimática a pH ácido. Dentro de esta región, los aminoácidos en las posiciones 249 y 252 del polipéptido de PH20 maduro parecen ser esenciales para la actividad, y la mutagénesis de cualquiera de los dos da como resultado un polipéptido esencialmente desprovisto de actividad (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
60 Además de los sitios catalíticos, PH20 también contiene un sitio de unión a hialuronano. La evidencia experimental indica que este sitio está ubicado en la región del Péptido 2, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 205235 del polipéptido precursor expuesto en SEC ID NO: 1 y las posiciones 170-200 del polipéptido maduro expuesto en SEC ID NO: 2. Esta región está altamente conservada entre hialuronidasas y es similar al motivo de unión a heparina. La mutación del residuo de arginina en la posición 176 (correspondiente al polipéptido de PH20 maduro expuesto en SEC ID NO: 2) a una glicina da como resultado un polipéptido con solo aproximadamente 1% de la actividad hialuronidasa del polipéptido de tipo salvaje (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
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Existen siete sitios de glicosilación potenciales, que incluyen los sitios de glicosilación unidos a N y O, en la PH20
5 humana en N82, N166, N235, N254, N368, N393 y S490 del polipéptido ilustrado en SEC ID NO: 1. Debido a que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1 parecen contener el dominio hialuronidasa de PH20 humana mínimamente activo, el sitio de glicosilación en S490 no se requiere para la actividad de hialuronidasa apropiada. Existen seis enlaces disulfuro en PH20 humana. Dos enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína C60 y C351 y entre C224 y C238 del polipéptido ilustrado en SEC ID NO: 1 (correspondiente a los residuos C25 y C316, y C189 y
10 C203delpolipéptidomaduroexpuestoenSEQIDNO:2,respectivamente).Seformanotroscuatroenlacesdisulfuro entre los residuos de cisteína C376 y C387; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y C464 del polipéptido ilustrado en SEC ID NO: 1 (correspondiente a los residuos C341 y C352; entre C346 y C400; entre C402 y C408; y entre C423 y C429 del polipéptidomaduro expuesto en SEQ ID NO: 2, respectivamente).
15 (b) Hialuronidasas bacterianas
Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1) degradan el hialuronano y, en diversos grados, los sulfatos de condroitina y los sulfatos de dermatán. Las hialuronano liasas aisladas de bacterias difieren de las hialuronidasas (de otras fuentes, p.ej., hialuronoglucosaminidasas, EC 3.2.1.35) en su modo de acción. Son endo-β
20 N-acetilhexosaminidasas que catalizan una reacción de eliminación, en lugar de hidrólisis, del enlace β1→4 glicosídico entre N-acetil-beta-D-glucosamina y residuos de ácido D-glucurónico en el hialuronano, produciendo tetra-y hexa-sacáridos de 3-(4-desoxi-β-D-gluc-4-enuronosil)-N-acetil-D-glucosamina y productos finales disacáridos. La reacción da como resultado la formación de oligosacáridos con residuos de ácido hexurónico insaturado en sus extremos no reductores.
25 Las hialuronidasas ilustrativas de bacterias para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados incluyen, pero no se limitan a, enzimas de degradación de hialuronano en microorganismos, incluyendo cepas de Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus, Propionibacterium, Bacteroides, y Streptomyces. Los ejemplos concretos de tales cepas y enzimas incluyen, pero no
30 se limitan a Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO: 70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71); serotipo Ia (SEQ ID NO: 72); y serotipo III (SEQ ID NO: 73)), Staphylococcus aureus (cepa COL (SEQ ID NO: 74); cepa MRSA252 (SEQ ID NO: 75 y 76); cepa MSSA476 (SEQ ID NO: 77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78); cepa bovina RF122 (SEQ ID NO: 79 y 80) y cepa USA300 (SEQ ID NO: 81)), Streptococcus neumoniae ((SEQ ID NO:
35 82); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO: 83); y serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO: 84)), Streptococcus pyogenes (serotipo M1 (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 86); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 87); serotipo M6 (SEQ ID NO: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEC ID NO: 89 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEC ID NO: 91) y serotipo M28 (SEC ID NO: 92)); Streptococcus suis (SEQ ID NO: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 96)), y la enzima hialuronidasa de Streptomyces
40 hyaluronolyticus, que es específica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina o el condroitin sulfato (Ohya,
T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607).
(c) Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos
45 Las hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) son endo-β-glucuronidasas que generan productos finales tetra y hexasacáridos. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de enlaces 1→3 entre β-Dglucuronato y residuos de N-acetil-D-glucosamina en hialuronato. Las hialuronidasas ilustrativas de sanguijuelas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasa de Hirudinidae (p.ej., Hirudo medicinalis), Erpobdellidae (p.ej., Nephelopsis obscura y Erpobdella punctata,), Glossiphoniidae (p.ej., Desserobdella picta, Helobdella stagnalis,
50 Glossiphonia complanata, Placobdella ornata y Theromyzon sp.) y Haemopidae (Haemopis marmorata) (Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). Una hialuronidasa ilustrativa de bacterias que tiene el mismo mecanismo de acción que la hialuronidasa de sanguijuela es la de cianobacterias, Synechococcus sp. (cepa RCC307, SEQ ID NO: 97).
55 ii. Otras enzimas de degradación de hialuronano
Además de la familia de hialuronidasa, se pueden utilizar otras enzimas de degradación de hialuronano en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados. Por ejemplo, se pueden emplear enzimas, que incluyen condroitinasas y liasas concretas, que tienen la capacidad de escindir hialuronano. Las condroitinasas ilustrativas 60 que pueden degradar hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa (también conocida como condroitín sulfato liasa o condroitín sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. Los métodos para la producción y purificación de tales enzimas para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados son conocidos en la técnica (p.ej., Patente de Estados Unidos Núm. 6.054.569; Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang et al. (1985) J. Biol. Chem.
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160(30):1849-1857).
La condroitina ABC liasa contiene dos enzimas, condroitin-sulfato-ABC-endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitin-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30), que degradan una variedad de 5 glicosaminoglicanos de tipo condroitin sulfato y dermatán sulfato. El condroitin sulfato, el condroitin sulfatoproteoglicano y el dermatán sulfato son los sustratos preferidos para la condroitin-sulfato-ABC-endoliasa, pero la enzima también puede actuar sobre el hialuronano a una velocidad menor. La condroitin-sulfato-ABC endoliasa degrada una variedad de glicosaminoglicanos del tipo condroitin sulfato y dermatán sulfato, produciendo una mezcla de oligosacáridos Δ4 insaturados de diferentes tamaños que finalmente se degradan a tetra y disacáridos 10 insaturados. La condroitin-sulfato-ABC exoliasa tiene la misma especificidad de sustrato pero elimina los residuos disacáridos de los extremos no reductores tanto de condroitín sulfatos poliméricos como de sus fragmentos oligosacáridos producidos por la condroitin-sulfato-ABC endoliasa (Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:91239130). Las condroitin-sulfato-ABC-endoliasas y condroitin-sulfato-ABC-exoliasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, las de Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus
15 vulgaris se expone en SEQ ID NO: 98 (Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46).
La condroitina AC liasa (EC 4.2.2.5) es activa sobre los condroitinsulfatos A y C, la condroitina y el ácido hialurónico, pero no es activa en el dermatán sulfato (condroitin sulfato B). Las enzimas condroitinasa AC ilustrativas de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, las de Flavobacterium heparinum y Victivallis vadensis, expuestas en SEQ
20 ID NO: 99 y 100, respectivamente, y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
La condroitinasa C escinde el condroitin sulfato C produciendo tetrasacárido más un disacárido 6 sulfatado insaturado (delta Di-6S). También escinde el ácido hialurónico que produce el disacárido no sulfatado insaturado
25 (delta Di-OS). Las enzimas condroitinasa C ilustrativas de la bacteria incluyen, pero no se limitan a, las de Estreptococcus y Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
iii. Enzimas de degradación de hialuronano solubles
30 En las composiciones, combinaciones, usos y métodos de la presente invención se encuentran enzimas de degradación de hialuronano solubles, que incluyen hialuronidasas solubles. Las enzimas de degradación de hialuronano solubles incluyen cualquier enzima de degradación de hialuronano secretada por las células (p.ej. células CHO) después de la expresión y existen en forma soluble. Tales enzimas incluyen, pero no se limitan a,
35 hialuronidasas solubles, incluyendo hialuronidasas solubles no humanas, incluyendo hialuronidasas solubles animales no humanas, hialuronidasas solubles bacterianas e hialuronidasas humanas, Hyal1, PH20 bovina y PH20 ovina, variantes alélicas de las mismas y otras variantes de las mismas. Por ejemplo, entre las enzimas de degradación de hialuronano solubles se incluyen enzimas de degradación de hialuronano que se han modificado para que sean solubles. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano que contienen un ancla de GPI se
40 pueden hacer solubles mediante el truncamiento y la eliminación de la totalidad o una parte del ancla de GPI. En un ejemplo, la hialuronidasa humana PH20, que normalmente está anclada a lamembrana a través de un ancla deGPI, puede hacerse solublemediante el truncamiento y la eliminación de todo o una parte del ancla de GPI en el extremo C-terminal.
45 Las enzimas de degradación de hialuronano solubles también incluyen hialuronidasas activas en condiciones neutras y activas en condiciones ácidas. Dependiendo de factores, tales como, pero no limitados a, el nivel deseado de actividad de la enzima después de la administración y/o el sitio de administración, se pueden seleccionar hialuronidasas activas en condiciones neutras y activas en condiciones ácidas. En un ejemplo concreto, la enzima de degradación de hialuronano para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos de la presente
50 memoriaesunahialuronidasaactivaencondicionesneutrassoluble.
Los ejemplos de hialuronidasas incluyen una forma soluble de una PH20 de cualquier especie, tal como una forma soluble de una PH20 de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65, 101-102 y 199-210. Tales formas solubles incluyen formas truncadas de las mismas que carecen de toda o una parte del ancla deGPI C-terminal, con 55 tal que la hialuronidasa sea soluble (secretada tras la expresión) y retenga la actividad hialuronidasa. Tales formas también son típicamente formas maduras que, cuando se expresan en una célula, carecen del péptido señal. También se incluyen entre las hialuronidasas solubles las formas solubles de variantes de cualquiera de las PH20 de cualquier especie expuesta en SEC ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65, 101-102 y 199-210, o formas truncadas de las mismas, que muestran actividad hialuronidasa. Las variantes incluyen polipéptidos que tienen 60%, 70%, 80%, 60 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65, 101-102 y 199-210, maduros (p.ej. que carece de la secuencia señal) o formas truncadas de los mismos. Las variantes de aminoácidos incluyen mutaciones conservativas y no conservativas. Se entiende que los residuos que son importantes o que se requieren de otro modo para la actividad de una hialuronidasa, tal como cualquiera de las descritas anteriormente o conocidas por los expertos en la técnica, son
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generalmente invariables y no pueden modificarse. Estos incluyen, por ejemplo, residuos de sitios activos. Por lo tanto, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 111, 113 y 176 (correspondientes a residuos en el polipéptido de PH20 maduro expuesto en SEC ID NO: 2) de un polipéptido de PH20 humana, o una forma soluble del mismo, son generalmente invariantes y no están alterados. Otros residuos que confieren glicosilación y formación de enlaces
5 disulfuro requeridos para el plegamiento adecuado también pueden ser invariantes.
En algunos casos, la enzima de degradación de hialuronano soluble normalmente está anclada a GPI (tal como, por ejemplo, PH20 humana) y se vuelve soluble mediante truncamiento en el extremo C-terminal. Tal truncamiento puede eliminar toda la secuencia señal de unión al ancla de GPI, o puede eliminar solo parte de la secuencia señal 10 de unión al ancla de GPI. El polipéptido resultante, sin embargo, es soluble. En casos donde la enzima de degradación de hialuronano soluble conserva una porción de la secuencia señal de unión al ancla de GPI, se pueden conservar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más residuos de aminoácidos en la secuencia señal de unión al ancla de GPI, siempre que el polipéptido sea soluble. Los polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos del ancla de GPI se denominan enzimas de degradación de hialuronano soluble extendidas. Un experto en la técnica puede determinar
15 si un polipéptido está anclado a GPI utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, utilización de algoritmos conocidos para predecir la presencia y ubicación de la secuencia de señal de unión al ancla de GPI y el sitio ω, y realización de análisis de solubilidad antes y después de la digestión con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) o D (PI-PLD).
20 Se pueden producir enzimas de degradación de hialuronano solubles extendidas realizando truncamientos Cterminales en cualquier enzima de degradación de hialuronano anclada naturalmente a GPI de modo que el polipéptido resultante sea soluble y contenga uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia señal de unión al ancla de GPI (véase, p.ej., la Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada US20100143457). Las enzimas de degradación de hialuronano solubles extendidas ilustrativas que están truncadas en el extremo C-terminal pero que
25 conservan una porción de la secuencia señal de unión al ancla de de GPI incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de PH20 (esPH20) extendidos de origen de primate, tales como, por ejemplo, polipéptidos de esPH20 humanos y de chimpancé. Por ejemplo, los polipéptidos de esPH20 se pueden preparar por truncamiento C-terminal de cualquiera de los polipéptidos maduros o precursores expuestos en SEC ID NO: 1, 2, 50, 51 o 101, u otras variantes de los mismos, incluyendo el fragmento activo del mismo, en donde el polipéptido resultante es soluble y conserva uno o
30 más residuos de aminoácidos de la secuencia señal de unión al ancla de de GPI. Las variantes incluyen polipéptidos que tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o más identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 50, 51 o 101 que conservan la actividad hialuronidasa. Los polipéptidos de esPH20 proporcionados en la presente memoria pueden truncarse en el extremo C-terminal en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos en comparación con el polipéptido de tipo salvaje, tal como un polipéptido con una secuencia expuesta en SEC ID NO:
35 1, 2, 50, 51 o 101, con la condición de que el polipéptido esPH20 resultante sea soluble y conserve 1 o más residuos de aminoácidos dela secuencia señal de unión al ancla deGPI.
Típicamente, para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos de la presente memoria, se utiliza una enzima de degradación de hialuronano humana soluble, tal como una PH20 humana soluble. Aunque pueden 40 utilizarse enzimas de degradación de hialuronano, tales como PH20, de otros animales, tales preparaciones son potencialmente inmunogénicas, ya que son proteínas animales. Por ejemplo, una proporción significativa de pacientes demuestra una sensibilización previa secundaria a los alimentos ingeridos, y dado que se trata de proteínas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilización posterior. Por lo tanto, las preparaciones no humanas pueden no ser adecuadas para uso crónico. Si se desean preparaciones no humanas, se contempla en
45 la presente memoria que tales polipéptidos se puedan preparar para tener una menor inmunogenicidad. Tales modificaciones están dentro del nivel de un experto en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, la eliminación y/o la sustitución de uno omás epítopos antigénicos en lamolécula.
Las enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo las hialuronidasas (p.ej., PH20), utilizada en los métodos de
50 la presente memoria, se pueden producir recombinantemente o se pueden purificar o purificar parcialmente a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículos. Los métodos para la producción de proteínas recombinantes, que incluyen enzimas de degradación de hialuronano recombinantes, se proporcionan en cualquier parte dela presentememoria y son bien conocidos en la técnica.
55 (a) PH20 humana soluble
Una hialuronidasa soluble ilustrativa es PH20 humana soluble. Se han producido formas solubles de PH20 humana recombinante y se pueden utilizar en las composiciones, combinaciones y métodos descritos en la presente memoria. La producción de tales formas solubles de PH20 se describe en las Solicitudes de Patente Publicadas de 60 los Estados Unidos. US20040268425; US20050260186, US20060104968, US20100143457 y la Publicación Internacional PCT Núm. WO2009111066. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 soluble, incluyen polipéptidos variantes truncados en el extremo C que incluyen una secuencia de aminoácidos en SEC ID NO: 1 o 2, o tienen al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, o 98% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos incluida en SEC ID NO: 1 o 2, conservan la actividad de hialuronidasa y son solubles. Entre estos
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polipéptidos están incluidos los polipéptidos de PH20 solubles que carecen completamente de toda o una porción de la secuencia señal de unión al ancla deGPI.
También se incluyen polipéptidos de PH20 (esPH20) solubles extendidos que contienen al menos un aminoácido del
5 ancladeGPI.Porlotanto,enlugardetenerunancladeGPIunidacovalentementealextremoCdelaproteínaenel RE y estar anclada a la capa extracelular de la membrana plasmática, estos polipéptidos se secretan y son solubles. Los polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C-terminal pueden truncarse en el extremo C-terminal en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más aminoácidos en comparación con el polipéptido de tipo salvaje completo, tal como un polipéptido de tipo salvaje completo con una
10 secuenciaexpuestaenSEQIDNO:1o2,ovariantesalélicasodeespecieuotrasvariantesdelosmismos.
Por ejemplo, las formas solubles incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos truncados en el extremo C de PH20 humana expuestos en SEC ID NO: 1 que tienen un residuo de aminoácido C-terminal 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 15 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, o polipéptidos que exhiben al menos 85% de identidad con los mismos. Las formas solubles de PH20 humana generalmente incluyen aquellas que contienen los aminoácidos 36-464 expuestos en SEC ID NO: 1. Por ejemplo, cuando se expresa en células de mamífero, la secuencia señal N-terminal de 35 aminoácidos se escinde durante el procesamiento, y la forma madura de la proteína se secreta. Por lo tanto, los polipéptidos solubles maduros contienen los aminoácidos 36 a 467, 468, 20 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483 de SEQ ID NO: 1. La Tabla 3 proporciona ejemplos no limitantes de polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C-terminal ilustrativos, que incluyen polipéptidos de PH20 solubles truncados en el extremo C-terminal. En la Tabla 3 siguiente, se proporcionan las longitudes (en aminoácidos) de los polipéptidos precursores y maduros, y se expone el identificador de secuencia (SEC ID NO) en el que se establecen las secuencias de aminoácidos ilustrativas de los polipéptidos
25 precursores y maduros de las proteínas PH20 truncadas en el extremo C-terminal. El polipéptido de PH20 de tipo salvaje también se incluye en la Tabla 3 como comparación. En particular, son ejemplos de hialuronidasas solubles son polipéptidos de PH20 humana soluble que tienen 442, 443, 444, 445, 446 o 447 aminoácidos de longitud, tal como se expone en cualquiera de SEC ID NO: 4-9, o variantes alélicas o de especie u otras variantes de los mismos.
30 Por ejemplo, las formas solubles de PH20 incluyen, por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189, o una secuencia de amino ácidos que presenta al menos el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o
Tabla 3. Polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C-terminal ilustrativos
Polipéptido Precursor Precursor Maduro Maduro
(aminoácidos) SEQ ID NO (aminoácidos) SEQ ID NO
tipo salvaje 509 1 474 2
SPAM1-SILF 500 139 465 183
SPAM-VSIL 499 106 464 150
SPAM1-IVSI 498 140 463 184
SPAM1-FIVS 497 107 462 151
SPAM1-MFIV 496 141 461 185
SPAM1-TMFI 495 108 460 152
SPAM1-ATMF 494 142 459 186
SPAM1-SATM 493 109 458 153
SPAM1-LSAT 492 143 457 187
SPAM1-TLSA 491 110 456 154
SPAM1-STLS 490 112 455 156
SPAM1-PSTL 489 111 454 155
SPAM1-SPST 488 144 453 188
SPAM1-ASPS 487 113 452 157
SPAM1-NASP 486 145 451 189
SPAM1-YNAS 485 114 450 158
SPAM1-FYNA
484 115 449 159
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Tabla 3. Polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C-terminal ilustrativos
Polipéptido Precursor Precursor Maduro Maduro
(aminoácidos) SEQ ID NO (aminoácidos) SEQ ID NO
SPAM1-IFYN 483 46 448 48
SPAM1-QIFY 482 3 447 4
SPAM1-PQIF 481 45 446 5
SPAM1-EPQI 480 44 445 6
SPAM1-EEPQ 479 43 444 7
SPAM1-TEEP 478 42 443 8
SPAM1-ETEE 477 41 442 9
SPAM1-METE 476 116 441 160
SPAM1-PMET 475 117 440 161
SPAM1-PPME 474 118 439 162
SPAM1-KPPM 473 119 438 163
SPAM1-LKPP 472 120 437 164
SPAM1-FLKP 471 121 436 165
SPAM1-AFLK 470 122 435 166
SPAM1-DAFL 469 123 434 167
SPAM1-IDAF 468 124 433 168
SPAM1-CIDA 467 40 432 47
SPAM1-VCID 466 125 431 169
SPAM1-GVCI
465 126 430 170
5 99% de secuencia identidad con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189 y conserva actividad hialuronidasa.
Las formas generalmente solubles de PH20 se producen utilizando sistemas de expresión de proteínas que facilitan la N-glicosilación correcta para asegurar que el polipéptido conserva la actividad, ya que la glicosilación es
10 importante para la actividad catalítica y la estabilidad de las hialuronidasas. Tales células incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) (p.ej. Células CHO DG44).
(b) rHuPH20
15 Se han generado formas solubles recombinantes de PH20 humana y se pueden utilizar en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados en la presente memoria. La generación de tales formas solubles de PH20 humana recombinante se describe, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Publicadas de los Estados Unidos US20040268425; US 20050260186; US20060104968; US20100143457; y la Solicitud PCT Internacional Núm. WO2009111066. Los ejemplos de dichos polipéptidos son los generados por la expresión de una molécula de ácido
20 nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 (expuesta en SEC ID NO: 3). Tal molécula de ácido nucleico ilustrativa se expone en SEQ ID NO: 49. El procesamiento postraduccional elimina la secuencia señal de 35 aminoácidos, dejando una PH20 humana recombinante soluble de 447 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). Puesto que se produce en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en el extremo C de manera que el producto, designado rHuPH20, incluye una mezcla de especies que puede incluir una o más de SEQ ID NOS. 4-9 en diversa abundancia. Típicamente,
25 rHuPH20 se produce en células que facilitan la N-glicosilación correcta para conservar la actividad, tales como las células CHO (p.ej. Células CHO DG44).
iv. Glicosilación de enzimas de degradación de hialuronano
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La glicosilación, incluyendo la glucosilación ligada a N y O, de algunas enzimas de degradación de hialuronano, incluidas las hialuronidasas, puede ser importante para su actividad catalítica y estabilidad. Aunque la alteración del tipo de glicano que modifica una glicoproteína puede tener efectos drásticos sobre la antigenicidad, el plegamiento estructural, la solubilidad y la estabilidad de una proteína, no se cree que la mayoría de las enzimas requieran la
5 glicosilación para una actividad enzimática óptima. Para algunas hialuronidasas, la eliminación de la glicosilación ligada a N puede dar como resultado una inactivación casi completa de la actividad hialuronidasa. Por lo tanto, para tales hialuronidasas, la presencia de glicanos unidos a N es crítica para generar una enzima activa.
Los oligosacáridos unidos a N pertenecen a varios tipos principales (oligomanosa, complejo, híbrido, sulfatado),
10 todos los cuales tienen núcleos (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-unidos por medio del nitrógeno amídico de residuos de Asn que se encuentran dentro de secuencias -Asn-Xaa-Thr/Ser-(en donde Xaa no es Pro). Se ha informado sobre glicosilación en un sitio -Asn-Xaa-Cys-para la proteína C de coagulación. En algunos casos, una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa, puede contener enlaces N-glicosídicos y O-glicosídicos. Por ejemplo, PH20 tiene oligosacáridos ligados a O así como oligosacáridos ligados a N. Existen seis posibles sitios
15 de glicosilación unidos a N en N82, N166, N235, N254, N368, N393 de PH20 humana ilustrados en SEC ID NO 1. Los residuos de aminoácidos N82, N166 y N254 están ocupados por glicanos de tipo complejo, mientras que los residuos de aminoácidos N368 y N393 están ocupados por glicanos de tipo alto contenido demanosa. El residuo de aminoácido N235 está ocupado por aproximadamente 80% de glicanos de tipo alto contenido de manosa y 20% de glicanos de tipo complejo. Como se indicó anteriormente, la glicosilación ligada a O en S490 no es necesaria para la
20 actividad de hialuronidasa.
En algunos ejemplos, las enzimas de degradación de hialuronano para utilizar en las composiciones, combinaciones y/o métodos proporcionados están glicosiladas en uno o en todos los sitios de glicosilación. Por ejemplo, para PH20 humana, o una forma soluble de la misma, 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilación correspondientes a los 25 aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1 están glicosilados. En algunos ejemplos, las enzimas de degradación de hialuronano están glicosiladas en uno o más sitios de glicosilación nativos. En otros ejemplos, las enzimas de degradación de hialuronano se modifican en uno o más sitios de glicosilación no nativos para conferir glicosilación del polipéptido en uno o más sitios adicionales. En dichos ejemplos, el anclaje de radicales de azúcar adicionales puede potenciar las propiedades farmacocinéticas de la molécula, tales como un aumento de
30 lasemividay/ounamejoractividad.
En otros ejemplos, las enzimas de degradación de hialuronano para su uso en las composiciones, combinaciones y/o métodos proporcionados en la presente memoria son parcialmente desglicosilados (o polipéptidos parcialmente N-glicosilados). Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 solubles parcialmente desglicosilados que conservan la 35 totalidad o una parte de la actividad hialuronidasa de una hialuronidasa completamente glicosilada se pueden utilizar en las composiciones, combinaciones y/o métodos proporcionados en la presente memoria. Las hialurodinasas parcialmente desglicosiladas ilustrativas incluyen formas solubles de polipéptidos de PH20 parcialmente desglicosilados de cualquier especie, tales como cualquiera de los expuestos en cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, 101-102 y 199-210, o variantes alélicas, variantes truncadas u otras variantes de los mismos. 40 Tales variantes son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o más con cualquiera de SEQ. ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, 101-102 y 199-210, o formas truncadas de los mismos. Las hialuronidasas parcialmente desglicosiladas proporcionadas en la presente memoria también incluyen hialuronidasas parcialmente desglicosiladas híbridas, de fusión y quiméricas, y productos conjugados de hialuronidasa parcialmente
45 desglicosilados.
Las glicosidasas, o glicósido hidrolasas, son enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace glicosídico para generar dos azúcares más pequeños. Los principales tipos de N-glicanos en vertebrados incluyen glicanos con alto contenido demanosa, glicanos híbridos y glicanos complejos. Existen diversas glicosidasas que dan como resultado 50 solo una desglicosilación parcial de la proteína, incluyendo: EndoF1, que escinde glicanos de tipo alto contenido de manosa y de tipo híbrido; EndoF2, que escinde glicanos de tipo complejo biantenario; EndoF3, que escinde glicanos complejos biantenarios ymás ramificados; y EndoH, que escinde glicanos de tipo alto contenido demanosa y de tipo híbrido. El tratamiento de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, tal como una PH20 soluble, con una o todas estas glicosidasas puede dar como resultado una desglicosilación solo parcial y,
55 por lo tanto, la conservación de la actividad hialuronidasa.
Las enzimas de degradación de hialuronano parcialmente desglicosiladas, tales como las hialuronidasas solubles parcialmente desglicosiladas, pueden producirse por digestión con una o más glicosidasas, generalmente una glicosidasa que no elimina todos los N-glicanos, sino que solo desglicosila parcialmente la proteína. Por ejemplo, el 60 tratamiento de PH20 (p.ej. una PH20 recombinante denominada rHuPH20) con una o todas las glicosidasas anteriores (p.ej. EndoF1, EndoF2 y/o EndoF3) da como resultado una desglicosilación parcial. Estos polipéptidos de PH20 parcialmente desglicosilados pueden exhibir actividad enzimática de hialuronidasa que es comparable a la de los polipéptidos completamente glicosilados. Por el contrario, el tratamiento de PH20 con PNGaseF, una glicosidasa que escinde todos los N-glicanos, da como resultado la eliminación completa de todos los N-glicanos y por lo tanto
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hace que PH20 sea enzimáticamente inactiva. Por lo tanto, aunque todos los sitios de glicosilación unidos a N (tales como, por ejemplo, los de los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de PH20 humana, ilustrados en SEC ID NO: 1) pueden glicosilarse, el tratamiento con una omás glicosidasas puede reducir el grado de glicosilación en comparación con una hialuronidasa que no se digiere conuna omás glicosidasas.
5 Las enzimas de degradación de hialuronano parcialmente desglicosiladas, incluyendo polipéptidos de PH20 solubles parcialmente desglicosilados, pueden tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% del nivel de glicosilación de un polipéptido completamente glicosilado. En un ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilación correspondientes a los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1 están parcialmente
10 desglicosilados,detalformaqueyanocontienenglicanosdealtocontenidodemanosaodetipocomplejo,sinoque contienen al menos un radical N-acetilglicosamina. En algunos ejemplos, 1, 2 o 3 de los sitios de N-glicosilación correspondientes a los aminoácidos N82, N166 y N254 de SEQ ID NO: 1 están desglicosilados, es decir, no contienen un radical azúcar. En otros ejemplos, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de SEQ ID NO: 1 están glicosilados. Los residuos de
15 aminoácidos glicosilados contienen mínimamente un radical N-acetilglicosamina. Típicamente, las enzimas de degradación de hialuronano parcialmente desglicosiladas, incluyendo polipéptidos de PH20 solubles parcialmente desglicosilados, exhiben actividad de hialuronidasa que es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1.000% o más de la actividad hialuronidasa exhibida por el polipéptido completamente glicosilado.
20
v. Enzimas de degradación de hialuronano modificadas (conjugadas con polímero)
La unión covalente u otra unión estable (conjugación) de moléculas poliméricas, tales como polietilenglicol (radical de PEGilación (PEG)), a las enzimas de degradación de hialuronano, tales como hialuronidasas, confiere
25 propiedades beneficiosas a la composición de enzima-polímero de degradación de hialuronano resultante. Tales propiedades incluyen mejora de la biocompatibilidad, extensión de la semivida de proteínas (y actividad enzimática) en la sangre, células y/o en otros tejidos dentro de un sujeto, protección eficaz de la proteína frente a proteasas e hidrólisis, mejora de la biodistribución, mejora de la farmacocinética y/o farmacodinamia y una mayor solubilidad en agua.
30 Los polímeros ilustrativos que pueden conjugarse con la enzima de degradación de hialuronano, tales como hialuronidasa, incluyen homopolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir, poli-OH), poliaminas (es decir, poli-NH2) y ácidos policarboxílicos (es decir, poli-COOH), y otros heteropolímeros, es decir, polímeros que comprenden uno o más grupos de acoplamiento diferentes p.ej. un grupo hidroxilo y grupos amina. Los ejemplos de
35 moléculas poliméricas adecuadas incluyen moléculas poliméricas seleccionadas entre poli(óxidos de alquileno) (POA), tales como polialquilenglicoles (PAG), incluyendo polietilenglicoles (PEG), metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, PEG-glicidiléteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), polietilenglicoles ramificados (PEG), poli(alcohol vinílico) (PAV), poli(etilenimina) (PEI), poliamidoaminas lineales, poliacrilamida (PAAm), polidimetilacrilamida (PDAAm), poli(alcohol vinílico) (PAV), policarboxilatos, polivinilpirrolidona (PVP), poli
40 D,L-aminoácidos, poli(etileno-co-anhídrido maleico), poli(estireno-co-anhídrido maleico), dextranos que incluyen carboximetil-quitosano, dextrina, dextranos, heparina, albúmina homóloga, celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, productos hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietil-almidones e hidroxipropil-almidones, glicógeno, agarosas y sus derivados, goma guar, pululano, inulina, goma de xantano, carragenano, pectina, productos hidrolizados de
45 ácido algínico y biopolímeros.
Típicamente, los polímeros son poli(óxidos de alquileno) (POA), tales como poli(óxido de etileno), tales como PEG, típicamente mPEG, que, en comparación con polisacáridos tales como dextrano y pululano, tienen pocos grupos reactivos susceptibles de entrecruzamiento. Típicamente, los polímeros son moléculas poliméricas no tóxicas tales
50 como (m)polietilenglicol (mPEG) que pueden conjugarse covalentemente con la enzima de degradación de hialuronano, tal como hialuronidasa (p.ej., grupos de anclaje en la superficie de la proteína) utilizando una química relativamente simple.
Se ha informado de que la PEGilación de agentes terapéuticos aumenta la resistencia a la proteólisis, aumenta la
55 semivida en plasma y disminuye la antigenicidad y la inmunogenicidad. Se conocen en la técnica ejemplos de metodologías de PEGilación (véanse, por ejemplo, Lu y Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138, 1994; Lu y Felix, Peptide Res., 6:140-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46:253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269:13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154:3088-95, 1995; véanse también, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). La PEGilación también se
60 puede utilizar en el suministro de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por ejemplo, la PEGilación de adenovirus puede aumentar la estabilidad y la transferencia de genes (véase, p.ej., Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9):144451).
Las moléculas poliméricas adecuadas para la unión a las enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo
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hialuronidasas, incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxipolietilenglicoles (mPEG), PEG-glicidiléteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEG ramificados y poli(óxido de etileno) (POE) (véanse p.ej. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review (2002) 54:459-476; Harris y Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethylenglycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium 5 Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, (2003) Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221; y Tsubery, (2004) J Biol. Chem 279(37):38118-24). La molécula polimérica puede ser de un peso molecular que típicamente varía de aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 60 kDa. En algunas realizaciones, la molécula polimérica que está conjugada con una proteína, tal como una hialuronidasa, por ejemplo una PH20, tiene un peso molecular entre o aproximadamente entre 5 a 60 kDa, tal como al menos o
10 aproximadamentealmenos5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60omásde60kDa.
Enzimas de degradación de hialuronano solubles PEGiladas
La enzima de degradación de hialuronano utilizada en las combinaciones y métodos de la presente invención puede
15 ser una enzima de degradación de hialuronano PEGilada, tal como una enzima de degradación de hialuronano soluble PEGilada. En un ejemplo, es una hialuronidasa soluble pegilada, p.ej. PH20 PEGilada. Se conocen en la técnica varios métodos para modificar polipéptidos uniendo (conjugando) de manera covalente un PEG o derivado de PEG (es decir, "PEGilación") (véanse p.ej., los documentos U.S. 2006/0104968; U.S. 5.672.662; U.S. 6.737.505; y U.S. 2004/0235734). Las técnicas para la PEGilación incluyen, pero no se limitan a, conectores especializados y
20 químicas de acoplamiento (véase p.ej., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), anclaje de múltiples radicales de PEG a un único sitio de conjugación (tal como mediante el uso de PEG ramificados; véase, p.ej., Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGilación y/o mono-PEGilación específicas de sitio (véase, p.ej., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase p.ej., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Los métodos y mecanismos descritos en la técnica pueden
25 producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG unidos a una sola molécula de proteína (véase p.ej., el documento U.S. 2006/0104968).
Se han descrito en la técnica numerosos reactivos para la PEGilación. Tales reactivos incluyen, pero no se limitan a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, alfa30 metilbutanoato de succinimidilo con mPEG, propionato de succinimidilo con mPEG, butanoato de succinimidilo con mPEG, éster de succinimidilo de ácido carboximetil 3-hidroxibutanoico con mPEG, PEG-propionato de succinimidilo homobifuncional, propionaldehído con PEG homobifuncional, butiraldehído con PEG homobifuncional, maleimida con PEG, hidrazida con PEG, carbonato de p-nitrofenilo-PEG, mPEG-carbonato de benzotriazol, propionaldehído con PEG, butiraldehído con mPEG, butiraldehído con mPEG2 ramificado, acetilo con mPEG, piperidona con mPEG, 35 metilcetona con mPEG, maleimida con mPEG "sin conector", vinil sulfona con mPEG, tiol con mPEG, ortopiridiltioéster con mPEG, ortopiridil disulfuro con mPEG, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona con PEG-NHS, acrilato de PEG-NHS, fluoresceína con PEG-NHS y biotina con PEG-NHS (véanse p.ej., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; documentos U.S. 5.672.662; U.S. 5.932.462; U.S. 6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S. 4.179.337; U.S. 40 5.122.614; U.S. 5.324. 844; U.S. 5.446.090; U.S. 5.612.460; U.S. 5.643.575; U.S. 5.766.581; U.S. 5.795. 569; U.S. 5.808.096; U.S. 5.900.461; U.S. 5.919.455; U.S. 5.985.263; U.S. 5.990. 237; U.S. 6.113.906; U.S. 6.214.966; U.S. 6.258.351; U.S. 6.340.742; U.S. 6.413.507; U.S. 6.420.339; U.S. 6.437.025; U.S. 6.448.369; U.S. 6.461.802; U.S. 6.828.401; U.S. 6.858.736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S.
45 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WO0500360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; y WO 0187925).
2. Taxanos y formulaciones de losmismos
50 La terapia combinada, incluyendo composiciones, combinaciones y métodos y su uso, proporcionada en la presente memoria contiene un taxano. Los taxanos son generalmente poco solubles en agua, lo que ha limitado su uso terapéutico. En las composiciones y combinaciones proporcionadas en la presente memoria, los taxanos se proporcionan como formulaciones que muestran solubilidad en agua. En ejemplos concretos proporcionados en la
55 presente memoria, los taxanos se proporcionan como formulaciones que se dirigen y/o penetran en el estroma o las células de un tumor. Un ejemplo de dicha formulación de taxano es un taxano unido a albúmina.
a. Taxanos
60 Los taxanos son diterpenos que se producen a partir de plantas del género Taxus (tejos). Los taxanos son agentes antimitóticos que se unen a la tubulina y actúan estabilizando la polimerización de microtúbulos, alterando así el equilibrio normal implicado en el ensamblaje y el desmantelamiento de microtúbulos y retardando el funcionamiento de los microtúbulos. Si bien los taxanos promueven la formación de microtúbulos, evitan la despolimerización de la tubulina que forma los microtúbulos del huso mitótico. Los microtúbulos son esenciales para la división celular y las células expuestas a los taxanos se detienen en la fase premitótica G2 y no se dividen. Estos fármacos interfieren por lo tanto en el proceso de división celular ya que las células tratadas con estos fármacos se mantienen en mitosis. Esto finalmente puede dar como resultado lamuerte celular debido a lamitosis no satisfactoria.
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5 Los taxanos también generan especies reactivas del oxígeno (ROS), incluyendo acumulación O2 y H2O2, en células tratadas. La acumulación de ROS se asocia con la actividad citotóxica directa de los taxanos, incluyendo el paclitaxel, así como los efectos de vecindad en las células contiguas (véase p.ej. Alexandre et al. (2007) Cancer Res., 67:3512).
10 Los taxanos para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados en la presente memoria incluyen cualquier compuesto de diterpeno que inhiba la despolimerización de tubulina. En particular, tales taxanos también incluyen cualquiera que dé como resultado la acumulación de ROS en las células tratadas. Los taxanos incluyen aquellos que son formas purificadas de un diterpeno producido naturalmente o aquellos que se sintetizan artificialmente. Los taxanos incluyen aquellos que son no cristalinos y/o amorfos. Los taxanos también pueden incluir
15 formas anhidras de un taxano.
El paclitaxel (taxol) es un diterpenoide natural. Tiene el nombre químico 5β,20-epoxi-1,2α,4,7β,10β,13αhexahidroxitax-11-en-9-ona 4,10-diacetato 2-benzoato. El Taxol se encuentra en la corteza del tallo del tejo occidental, Taxus brevifolia, así como en T. baccata y T. cuspidata. Primero fue aislado de la corteza del tejo del
20 Pacífico, Taxus brevifolia (Wani et al. (1971) J. Am. Chem. Soc., 93:2325) A. La estructura del núcleo del paclitaxel contiene cuatro anillos (anillos A y C de seis miembros, anillo B de ocho miembros y anillo D de cuatro miembros). La estructura de paclitaxel se expone a continuación, mostrando la numeración utilizando el sistema de numeración convencional para esta clase de fármacos.
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25 El paclitaxel se puede preparar mediante métodos semisintéticos a partir de sustancias químicas precursoras llamadas bacatinas, que se obtienen de las agujas y ramas del tejo europeo o del Himalaya. Por ejemplo, el Paclitaxel se puede preparar a partir de bacatina mediante anclaje de grupos protectores a los grupos hidroxilo de la bacatina que se convertirán en los grupos hidroxilo del paclitaxel, convirtiendo la bacatina precursora en paclitaxel, y
30 a continuación eliminando los grupos protectores de los grupos hidroxilo para obtener paclitaxel. Además, el paclitaxel se ha sintetizado recientemente a partir de precursores simples. (Véanse, p.ej., Publicación Internacional PCT Núm. WO93/10076, WO93/16059; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.200.534 Patente de los Estados Unidos Núm. 5.015.744; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.960.790; Nicolaou (1993) Nature 364:464-466; Nicolaou, K.C. y col. (1994) Nature, 367:630-634; y Holton et al. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116:1597-1600).
35 El docetaxel (taxotere) es otro taxano ilustrativo para su uso en las combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria. Docetaxel tiene el nombre químico 4-acetato 2-benzoato 13-{(2R,3S)-3-[(tercbutoxicarbonil)amino]-2-hidroxi-3-fenilpropanoato de 1,7β,10β-trihidroxi-9-oxo-5β,20-epoxitax-11-eno-2α,4,13α-triilo y tiene la estructura que se expone a continuación con la numeración mostrada utilizando el sistema de numeración
40 convencional para esta clase de fármacos.
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Docetaxel es un taxano semisintético de segunda generación derivado de un compuesto encontrado en el tejo europeo Taxus baccata. El docetaxel es un producto esterificado de la 10-desacetil bacatina III, que se extrae del
5 tejo europeo. Difiere del paclitaxel en dos posiciones en su estructura química: carece de un éster acetato, y existe un éster carbamato de terc-butilo en la cadena lateral de fenilpropionato en lugar de la bencilamida del paclitaxel. Docetaxel, un análogo de paclitaxel, se produce semisintéticamente a partir de 10-desacetil bacatina III, un precursor no citotóxico extraído de las agujas de Taxus baccata y esterificado con una cadena lateral sintetizada químicamente(Cortes y Pazdur, 1995, J. Clin. Oncol. 13(10):2643-55).
10 Los taxanos para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados en la presente memoria incluyen análogos, derivados y formas de profármacos de paclitaxel o docetaxel. Tales derivados de taxano incluyen aquellos que exhiben una mejor solubilidad en agua en comparación con paclitaxel o el docetaxel. Por ejemplo, los derivados, los análogos y las formas de profármaco del taxano incluyen aquellos en los que las posiciones de los
15 anillos se modifican o se transforman, y en particular cuando la posición 2'-y 7 o 10-se transforma con un grupo adecuado (véase p.ej. Fu et al. (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:1-13).
Por ejemplo, los derivados, análogos o formas de profármaco del taxano incluyen, pero no se limitan a, taxoles solubles en agua que tienen varios grupos acilo sustituidos en posición 2'-O (véase p.ej. Patente de Estados Unidos 20 Núm. 4.942.184); taxoles solubles en agua, en los cuales el hidroxi 2' y/o 7' se transforman con un aminoácido o un compuesto mimético de aminoácido seleccionados (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 4.960.790); 2'acriloil taxol sulfonado, ácido 2'-O-acil taxol sulfonado y 2'-benzoil-y 2'7-dibenzoil taxol sustituido (véanse p.ej. las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.352.805 y 5.411.984); derivados 2' y/o 7-O-éster y 2'-y/o 7-O-carbonato de taxol (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 5.817.840); derivados de taxano formados por conjugación 25 con polímeros tales como polietilenglicol, poli(ácido L-glutámico), poli(ácido L-aspártico) (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 5.977.163); formas de profármaco de taxano que poseen un grupo fosfonooxi en la posición C-7, C-10 y/o 2' de la cadena lateral de un taxano (véase p.ej. el documento WO9414787); sales de 2'succinilpaclitaxel y 2'-glutarilpaclitaxel (Deutch et al. (1989) J. Med. Chem., 32:788-792); derivados de 2' y 7 aminoácidos de paclitaxel y sus sales (Matthew et al. (1992) J. Med. Chem., 35:145-151; derivados sulfonato (Zhao 30 et al. (1991) J. Nat. Prod., 54:1607-1611; análogos 7-fosfato de paclitaxel (Vyas et al. (1993) Bioorg. Med. Chem., Lett., 3:1357-1360); ésteres de 2' y 7-polietilenglicol de paclitaxel (Greenwald et al. (1995) J. Org. Chem., 60:331336; Greenwald et al. (1996) J. Med. Chem., 39:424-431); 2' y 7-Fosfonoxifenil-propionato de paclitaxel (Ueda et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett., 3:1761-1766); análogos de acetato de 2' y 7-metilpiridinio de paclitaxel (Nicolaou et al. (1994) Angew Chemie, 106:1672-1675); Paloma et al. (1994) Chem. Biol., 1:107-112); profármaco de paclitaxel 35 con ácido málico en la posición 2' (Damen et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 427-432); sales de sulfonato de taxanos y, en particular, de taxol (Patente de Estados Unidos Núm. 5.059.699); derivados en los que se une una cadena de acilo para mejorar la solubilidad en lípidos del taxano (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 6,482,850); formas trihidratadas de docetaxel que exhiben una mayor estabilidad que el producto anhidro (véanse p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 6.022.985 y 6.838.569); derivados del taxano C-10, incluyendo los que
40 contienen un radical carbamato en la posición C-10 (Patente de Estados Unidos Núm. 8.138.361); derivados de taxano hidrófobos (publicación de patente de Estados Unidos Núm. US20090263483); y derivados carboxilato que contienen hidrazida de taxanos (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 8,133,888).
b. Taxanos dirigidostumores o estroma
45 Los compuestos de taxano proporcionados en las composiciones y combinaciones de la presente memoria se preparan generalmente para dirigirse al tumor o estroma que rodea un tumor. El taxano en las composiciones y combinaciones proporcionadas en la presente memoria también se proporcionan como formulaciones solubilizadas
o nanodispersas que exhiben una mejor solubilidad.
50 El paclitaxel producido naturalmente o semi-sintéticamente (taxol) adolece de problemas tales como baja solubilidad en agua y direccionamiento o localización no específicos. Por ejemplo, los taxanos, incluyendo paclitaxel y docetaxel, son muy poco solubles en agua (menos de 10 μg/ml), y como resultado, no se pueden formular prácticamente con un medio acuoso para administración intravenosa. Para combatir los problemas de solubilidad en agua, las formulaciones actuales de paclitaxel se formulan para administración intravenosa a pacientes con cáncer en una solución con aceite de ricino polioxietilado (Polyoxyl 35 o Cremophor®) como principal disolvente/tensioactivo, empleando altas concentraciones de etanol empleadas como co-disolvente. Al igual que el
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5 paclitaxel, el docetaxel es muy poco soluble en agua. Actualmente, el disolvente/tensioactivo utilizado para disolver docetaxel es polisorbato 80 (Tween 80) (Bissery et al. 1991 Cancer Res. 51(18):4845-52; Tomiak et al. 1992). El etanol, Cremophor y/o Tween en las formulaciones existentes se asocian con la aparición de reacciones de hipersensibilidad, que pueden incluir erupciones severas en la piel, urticaria, enrojecimiento, disnea, taquicardia y otras.
10 Adicionalmente, al aumentar la especificidad hacia un tejido canceroso, las moléculas de taxano exhiben menos toxicidad debido a una reducción de los efectos sistémicos o de la exposición. Típicamente, un taxano dirigido a un tumor es un taxano, derivado, análogo o profármaco del mismo que está conjugado o unido directa o indirectamente a través de un conector a un radical de reconocimiento de tumor. El radical de reconocimiento del tumor puede ser
15 un anticuerpo monoclonal, proteína, péptido, lípido o complejo macromolecular que reconoce un marcador o radical específicos del tumor expresados diferencialmente en células cancerosas en comparación con células normales. Las células cancerosas expresan en exceso muchos marcadores o receptores específicos de tumores que se pueden elegir como diana para administrar un taxano.
20 El taxano dirigido a un tumor se puede proporcionar como micelas, nanopartículas, microesferas, liposomas o formulaciones de hidrogel. Tales formulaciones se pueden utilizar para encapsular ingredientes activos tales como taxanos que pueden exhibir baja solubilidad en medio acuoso. Tales formulaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica. En algunos ejemplos, el vehículo de suministro está recubierto o conjugado con el radical de direccionamiento al tumor, tal como un complejo macromolecular, anticuerpo monoclonal, proteína, péptido o lípido.
25 Por lo tanto, en algunos ejemplos, la plataforma de suministro de fármaco encapsula el taxano, y muestra un ligando de direccionamiento u otro recubrimiento polimérico en la superficie para efectuar el direccionamiento al tumor.
Los ejemplos de taxanos dirigidos a tumores y formulaciones de los mismos, contienen un radical de direccionamiento a tumores que es una macromolécula tal como poli-L-glutamato (PGA-TXL, Xyotax; Li et al. (1998) 30 Cancer Res., 58:2404-2409); un anticuerpo monoclonal específico contra un marcador tumoral, tal como los receptores p140 TrkA o p75 (Guillemard y Saragovi (2001) Cancer Res., 61:694) o un anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (es decir, anticuerpo monoclonal anti-EGFR, tal como cetuximab; Safavy et al. (2003) Bioconjug., 14:302-10; Ojima et al. (2002) J. Med. Chem., 45:5620-3), anti-HER2 (Herceptin, trastuzumab, Cirstoiu-Hapca et al. (2010) J. Control Release, 144:324-31); un ácido graso poliinsaturado tal como ácido docosahexaenoico 35 (DHA; Bradley et al. (2001) Clin. Cancer Research, 7:3229-38), ácido linolénico o ácido linoleico (Kuznetsova et al. (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett., 15:974-7); un péptido tal como un péptido sintético de 7 aminoácidos denominado BBN[7-13] que se une a bombesina/péptido liberador de gastrina (BBN/GRP) de la superficie celular (Safavy et al. (1999) J. Med. Chem., 42:4919-4924), un péptido de 19 aminoácidos dirigido a LRP-1 angiopep-2 (Wen et al. (2011) Molecular Cancer Therapeutics, 10 (Sup. 11): Resumen B49), un octapéptido que es escindido por la 40 metaloproteasa de la matriz 2 (MMP2; Yamada et al. (2010) Cancer Biology and Therapy, 9:192-203), un péptido RGD (véase p.ej. Zhao et al. (2009) J. Drug Target, 17:10-8); proteínas que se dirigen a receptores específicos de tumores tales como receptores de vitaminas, incluyendo la biotina (vitamina H o B-7, folato o ácido fólico, vitamina B12 o riboflavina (véanse p.ej. Chen et al. (2010) Biconjug. Chem., 21:979-987, Li et al. (2011) International revue of Nanomedicine, 6:1167-1184); ácido hialurónico (HA) (Auzenne et al. (2007) Neoplasia, 9:479-486); transferrina
45 (Sahoo et al. (2004) Int. J. Cancer, 112:335-40); y albúmina.
Taxano unido a albúmina
Un ejemplo de un complejo polímero-fármaco soluble es un taxano conjugado con albúmina. La albúmina es un
50 portador natural de moléculas hidrófobas endógenas, tales como vitaminas u hormonas. Además de actuar como portador, la albúmina también facilita la transcitosis endotelial de los constituyentes plasmáticos unidos a la proteína al unirse a gp60 en la superficie de las células endoteliales, lo que afecta la transcitosis mediada por caveolas. La albúmina también puede unirse al ácido proteico secretado rico en cisteína (SPARC, también conocido como osteonectina), que está presente en muchas células tumorales. Por lo tanto, la albúmina promueve la acumulación
55 en células tumorales de fármacos unidos a la albúmina.
La albúmina incluye albúmina de suero humano (HSA) así como albúmina no humana tal como albúmina de suero bovino (BSA). La HSA es una proteína globular altamente soluble de Mr65K y contiene 585 aminoácidos (SEQ ID NO: 211). La HSA es la proteína más abundante en el plasma y representa 70-80% de la presión osmótica coloidal
60 del plasma humano. La secuencia de aminoácidos de HSA contiene un total de 17 puentes disulfuro, un tiol libre (Cys 34) y un solo triptófano (Trp 214).
La albúmina sérica humana (HSA) tiene múltiples sitios de unión hidrófobos (un total de ocho para ácidos grasos, un ligando endógeno de HSA) y se ha demostrado que se une a un conjunto diverso de agentes farmacéuticos,
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especialmente compuestos hidrófobos neutros y con carga negativa (Goodman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, novena edición, McGraw-Hill New York (1996)). Se han propuesto dos sitios de unión de alta afinidad en los subdominios IIA y IIIA de HSA, que son bolsas hidrófobas muy alargadas con residuos de lisina y arginina cargados cerca de la superficie que funcionan como puntos de unión para las características del ligando polar 5 (véase, p.ej., Fehske et al., Biochem. Pharmacol., 30, 687-92 (1981), Vorum, Dan. Med. Bull., 46, 379-99 (1999), Kragh-Hansen, Dan. Med. Bull., 37:57-84 (1990), Curry et al., Nat. Struct. Biol., 5, 827-35 (1998), Sugio et al., Protein. Eng., 12, 439-46 (1999), He et al., Nature, 358, 209-15 (1992), y Carter et al., Adv. Protein. Chem., 45, 153203 (1994)). Se ha demostrado que paclitaxel y docetaxel se unen a la HSA (véanse, p.ej., Paal et al., Eur. J. Biochem., 268(7), 2187-91 (2001), Purcell et al., Biochim. Biophys. Acta, 1478(1), 61-8 (2000), Altmayer et al.,
10 Arzneimittelforschung, 45, 1053-6 (1995), Garrido et al., Rev. Esp. Anestestiol. Reanim., 41, 308-12 (1994); y Urien et al., Invyvest. New Drugs, 14(2), 147-51 (1996)).
La razón en peso de albúmina con respecto a taxano en la composición es aproximadamente o inferior a 20: 1 o menor, como 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 o menos, y generalmente
15 es al menos o aproximadamente al menos 9:1. El producto resultante puede generarse para estar libre de disolvente y/o tensioactivo. El taxano está cubierto con la albúmina. Las nanopartículas de taxano/albúmina generalmente tienen un diámetro promedio de no más de 200 nm, y generalmente de 100 nm a 200 nm, tal como un diámetro promedio de 130 nm.
20 Por ejemplo, los taxanos unidos a albúmina incluyen paclitaxel unido a albúmina (nab) p.ej. Abraxane, American Bioscience, Inc. (Santa Mónica, CA); también descrito en las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.439.686 y 6.749.868) o docetaxel unido a albúmina (p.ej. descrito, por ejemplo, en las Publicaciones de las Solicitudes de Patente de Estados Unidos Núm. 20080161382, 20070117744 y 20070082838). La albúmina humana funciona como un polímero tensioactivo que proporciona carga y estabilización estérica a las nanopartículas de paclitaxel
25 para evitar la agregación. La estabilización se logra por el hecho de que la albúmina se adsorbe sobre la superficie de las nanopartículas de paclitaxel, creando así una lámina que funciona como un polímero tensioactivo que evita la agregación de partículas de paclitaxel. La interacción entre el paclitaxel y la albúmina humana es débil y ambas sustancias se disocian libremente después de la reconstitución. Por lo tanto, cuando se reconstituye y se inyecta en el torrente sanguíneo, la concentración de paclitaxel disminuye rápidamente y se cree que las partículas de albúmina
30 se disocian en moléculas de albúmina individuales y a continuación circulan con el paclitaxel aún unido. En particular, se pueden utilizar paclitaxel unido a albúmina (p.ej. nab-paclitaxel o Abraxane) como una suspensión coloidal derivada de una formulación liofilizada de paclitaxel y albúmina de suero humano diluida en solución salina (NaCl al 0,9%). El complejo de partículas de fármaco resultante se estabiliza a un tamaño medio de 130 nm. También se pueden generar y utilizar nanopartículas que contienen otros taxanos, tales como las descritas
35 anteriormente en la presente memoria, y pueden contener las mismas características que las descritas anteriormente.
3. Agente quimioterapéutico adicional (p.ej. análogo de nucleósido)
40 Opcionalmente, se puede incluir un agente quimioterapéutico adicional cuya actividad se mejora o aumenta mediante la administración conjunta con una o ambas enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero y/o una formulación de taxano en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, se pueden incluir uno o más análogos de nucleósidos, en particular antimetabolitos, en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria. Después de que entran en la célula, los análogos de nucleósidos
45 se fosforilan sucesivamente a los nucleósidos 5'-mono-fosfato, di-fosfato y tri-fosfato. Por ejemplo, generalmente, los análogos de nucleósidos se convierten en un compuesto activo por fosforilación del nucleósido en su trifosfato (p.ej. por difosfato quinasas), que a continuación es capaz de competir con un nucleósido fisiológico (p.ej. dCTP) como sustrato para la incorporación al ADN. Por lo tanto, los análogos de nucleósidos imitan los nucleósidos fisiológicos. Una vez incorporado, el análogo es un sustrato ineficaz, lo que detiene la replicación y/o provoca la terminación de
50 la cadena. Véase Sampath et al. (2003), Oncogene, 22:9063-9074 para una revisión de análogos de nucleósidos. Dado que los análogos de nucleósidos requieren conversión a una forma activa, generalmente son profármacos que deben ser fosforilados a una forma activa.
Los análogos de nucleósidos para su uso en las composiciones y combinaciones de la presente memoria incluyen
55 análogos de nucleósidos de purina y pirimidina, así como derivados y formas de profármacos de los mismos. Los análogos de nucleósidos de pirimidina incluyen, pero no están limitados a, fluoropirimidina, 5-fluorouracilo (5-FU; fluorouracilo), 5-fluoro-2'-desoxicitidina (FCdR), arabinosilcitosina (ara-C, también denominada citosin arabinosido o citarabina), gemcitabina (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), troxacitabina (beta-L-dioxolano citidina, BCH-4556), decitabina (5-aza-2'-desoxicitidina), azacitidina (4-amino-1-β-D-ribofuranosil-1,3,5-triazin-2(1H)-ona),
60 pseudoisocitidina (psi ICR), 5-aza-2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina; 5-aza-2'-desoxi-2'-fluorocitidina; 1-β-D-ribofuranosil2(1H)-pirimidinona (Zebularina); 2',3'-didesoxi-5-fluoro-3'-tiacitidina (Emtriva); 2'-ciclocitidina (Ancitabina); 1-β-Darabinofuranosil-5-azacitosina (Fazarabina o ara-AC); 6-azacitidina (6-aza-CR); 5,6-dihidro-5-azacitidina (dH-aza-CR); N4-pentiloxicarbonil-5'-desoxi-5-fluorocitidina (Capecitabina); N4-octadecil-citarabina; y ácido elaídico citarabina, y derivados y formas profármaco de los mismos. Los análogos de nucleósidos de purina incluyen, por ejemplo, fludarabina, cladribina, clofarabina, nelarabina, forodesina, pentostatina y tezacitabina, y derivados y formas profármaco.
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Se conocen o pueden generarse otras formas profármaco de análogos de nucleósidos. Por ejemplo, otras formas
5 profármaco incluyen aquellas que se modifican para alterar las propiedades de captación celular y/o resistencia a la desactivación por desaminasa (comentado a continuación). Por ejemplo, tales formas profármaco pueden permitir una mejor absorción oral y/o un direccionamiento tisular aumentado o específico (Li et al. (2008) Journal Pharm. Science, 97:1109-1134).
10 La actividad antitumoral de algunos análogos de nucleósidos ha estado limitada por los bajos niveles citotóxicos que se pueden lograr. Esto se debe principalmente a la inactivación de las enzimas que puede ocurrir en muchos tejidos. Por ejemplo, la inactivación metabólica de algunos análogos de nucleósidos puede ser causada por la desaminación. La desaminación puede ser catalizada por una desaminasa específica de nucleótido, tal como la adenosina desaminasa o la citidina desaminasa (cdA). Por lo tanto, algunos fármacos contra el cáncer son
15 metabolizados por enzimas naturales del organismo tales como la adenosina desaminasa (ADA, EC 3.5.4.4) y la citidina desaminasa (CDA, también denominada citosina nucleósido desaminasa, citidina aminohidrolasa, o EC 3.5.4.5). Estas enzimas funcionan para desaminando nucleósidos de aminopurina y aminopirimidina naturales, respectivamente, en seres humanos y otros organismos. Estas enzimas también convierten los medicamentos contra el cáncer basados en nucleósidos activos en metabolitos inactivos. Por ejemplo, CDA es un componente de
20 la ruta de rescate de pirimidina. Convierte la citidina y la desoxicitidina en uridina y desoxiuridina, respectivamente, mediante desaminación hidrolítica (Cacciamani et al. (1991) Arch. Biochem. Biophys. 290:285-292; Wentworth y Wolfenden (1978) Methods Enzymol. 57:401-407; Wisdom y Orsi (1967) Biochem. J. 104:7P). También desamina una cantidad de análogos sintéticos de citosina que son fármacos clínicamente útiles, tales como ara-C y otros, como se analiza a continuación (Eliopoulos et al. (1998) Cancer Chemother. Pharmacol. 42:373-378; Kees et al.
25 (1989) Cancer Res. 49:3015-3019; Antiviral Chem. Chemother. (1990) 1:255-262). Por ejemplo, la semivida de gemcitabina en plasma es de aproximadamente 10 minutos, debido a la rápida desaminación por la enzima desoxicitidina desaminasa endógena al correspondiente derivado de uracilo (dFdU) (P. G. Johnston et al., Cancer Chromatography and Biological Response Modifiers, Annual 16, 1996, Cap. 1, ed. Pinedo H. M. et al.).
30 Por ejemplo, el fármaco nucleósido de purina arabinosiladenina (fludarabina, ara-A) es desaminado mediante ADA; el compuesto resultante, con el grupo amino original sustituido por hidroxilo, es inactivo como agente antitumoral en comparación con el compuesto original. Del mismo modo, el fármaco arabinosilcitosina (también llamada citarabina Ara-C (o AraC), 4-Amino-1-(β-D-arabinofuranosil)-2(1H)-pirimidinona, citosin arabinósido, o 1-(β-DArabinofuranosil)citosina) es degradado metabólicamente por CDA a arabinosiluracilo inactivo. La gemcitabina,
35 decitabina, azacitidina y otros también son inactivados de manera similar. La desaminación de análogos de nucleósidos, tales como los nucleósidos de citosina y sus análogos (p.ej. citarabina y gemcitabina), previene la acumulación de sus derivados tóxicos trifosfatointracelulares que actúan comometabolitos activos.
La conversión de los compuestos de citosina en derivados de uridina generalmente confiere pérdida de actividad
40 terapéutica o adición de efectos secundarios. También se ha demostrado que los cánceres que adquieren resistencia a los fármacos análogos a la citosina a menudo expresan en exceso CDA (Leuk. Res. 1990, 14, 751754). Las células leucémicas y los tumores sólidos que expresan un alto nivel de CDA pueden manifestar resistencia a los antimetabolitos de citosina y de ese modo limitar la actividad antineoplásica de tales agentes terapéuticos (Biochem. Pharmacol. 1993, 45:1857-1861). La resistencia a análogos de nucleósidos puede requerir mayores
45 dosis, infusiones continuas o administraciones repetidas. Estos efectos pueden conducir a efectos adversos graves, especialmente relacionados conla mielosupresión y lainmunosupresión.
Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian con la inactivación de enzimas, incluyendo las nucleósido desaminasas. Se sabe que los taxanos inducen ROS intratumorales y, por lo tanto, pueden inactivar la actividad de
50 las nucleósido desaminasas (véase p.ej. Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269).
Por lo tanto, para los fines de la presente memoria, los análogos de nucleósidos ilustrativos para su uso en las combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria son aquellos que son sustratos para una desaminasa, y que por lo tanto están inactivados. Por ejemplo, la desaminasa puede ser una citidina desaminasa o 55 una adenosina desaminasa. El nivel intratumoral y la actividad de tales análogos pueden aumentarse enormemente en la terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y una formulación de taxano. Los ejemplos de dichos análogos de nucleósidos incluyen, pero sin limitación, fludarabina, citarabina, gemcitabina, decitabina y azacitidina o derivados de las mismas. En ejemplos concretos, el análogo de nucleósido es uno que puede tratar tumores sólidos, tales como cáncer de vejiga, mama, pulmón, ovario, páncreas y otros tipos
60 de cáncer.
Cualquiera de los análogos de nucleósidos proporcionados en la presente memoria puede formularse en forma de liposomas, micropartículas, nanopartículas o en forma de productos conjugados de polímeros. Por ejemplo, las formulaciones se pueden preparar para controlar el suministro y/o aumentar las vidas medias de los fármacos administrados. Por ejemplo, se conocen formulaciones liposómicas ilustrativas (véanse p.ej. las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.736.155 y 8.022.279).
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Análogos de nucleósidos ilustrativos
5
i) Gemcitabina
La gemcitabina (2',2'-difluorodesoxicitidina, dFdC) es un análogo difluorado de la desoxicitidina y, por lo tanto, es un análogo de nucleósido o un antimetabolito. Después de que entra en las células, la fosforilación intracelular por
10 nucleósido monofosfato y difosfato quinasas produce derivados 5'-difosfato (dFdCDP) y 5'-trifosfato (dFdCTP), respectivamente. El trifosfato de gemcitabina actúa como una base fraudulenta, que compite con dCTP para su incorporación al ADN. Si se incorpora al ADN, solo se puede incorporar un nucleótido más antes de que se detenga la elongación de la cadena de ADN. La ADN polimerasa épsilon es incapaz en ese caso de eliminar el nucleótido de gemcitabina y reparar las hebras de ADN en crecimiento (terminación de cadena enmascarada).
15 La gemcitabina se comercializa como Gemzar®, que es una formulación en polvo liofilizada. Gemzar®, gemcitabina inyectable, USP, contiene Gemcitabina HCl que es monohidrocloruro de 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina (isómero β). Gemzar® se suministra como una formulación intravenosa que contiene 200 mg o 1 g de gemcitabina HCl (expresada como base libre) formulada con manitol (200 mg o 1 g, respectivamente) y acetato de sodio (12,5 mg o
20 62,5 mg, respectivamente) en forma de polvo liofilizado estéril. El pH de la formulación se puede ajustar mediante la adición de ácido clorhídrico y/o hidróxido de sodio. Gemzar®, un proceso para elaborarlo y los métodos para su uso se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.464.826 y en la Patente de los Estados Unidos Núm.
4.808.614. Actualmente, Gemzar® está aprobado para el tratamiento del cáncer de páncreas, cáncer de mama y cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y está siendo evaluado para el cáncer de ovario. Además,
25 Gemzar® se puede utilizar en el tratamiento del VHC así como en un modulador de la función inmunitaria (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.555.518). Gemzar® se puede administrar por infusión intravenosa a una dosis de aproximadamente 1.000 a 1.250 mg/m2 a lo largo de 30 minutos, una vez a la semana durante hasta 7 semanas seguidas de una semana de descanso del tratamiento.
30 Los derivados sintéticos de la gemcitabina, incluyendo varias formas profármaco, son conocidos (véase, por ejemplo, Ishitsuka et al, Publicación Internacional Núm. WO03/043631; Alexander et al. (2003) J. Med. Chem., 46:4205-4208; Patente de los Estados Unidos Núm. 6.303.569; Guo et al. (2001) Cancer Chemother. Pharmacol., 48:169-176; Publicación Internacional Núm. WO01/21135; Di Stefano et al. (1999) Biochem. Pharmacol., 57:793799; Guo et al. (1999) J. Org. Chem., 64:8319-8322; Publicación internacional Núm. WO99/33483; Publicación
35 InternacionalNúm.WO98/32762;PublicacióninternacionalNúm. WO98/00173;PatentedelosEstadosUnidosNúm. 5.606.048; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.594.124; Solicitud de Patente Europea Núm. EP712860; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.521.294; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.426.183; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.401.838; Patente Europea Núm. EP0376518; Solicitud de Patente Europea Núm. EP577303; Solicitud de Patente Europea Núm. EP576230; Chou et al. (1992) Synthesis, 565-570; Richardson et al. (1992)
40 Nucleic Acid Res., 20:1763-1768; Baker et al. (1991) J. Med. Chem., 34:1879-1884; Publicación internacional Núm. WO91/15498; Solicitud de Patente Europea Núm. EP329348; Solicitud de Patente Europea Núm. EP272891).
Los profármacos mejorados ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, elaidato de gemcitabina (también denominado éster 2'-desoxi-2',2'-difluorocidin-5'-ílico de ácido 9(E)-octadecenoico; 2'-desoxi-2',2'-difluoro-5'-O-[9(E)45 octadecenoil]citidina; CP-4126; o Núm. Registro CAS 210829-30-4); Sal de meglumina de éster de gemcitabina de ácido azelaico (también denominada sal de meglumina de 1-[5-O-(9-carboxinonanoil)-β-D-arabinofuranosil]citosina); otras sales deéster de gemcitabina deácido azelaico; y 1-[4-(2-Propilpentanamido)-2-oxo-1H-pirimidin-1-il]-2-desoxi2,2-difluoro-β-D-ribofuranosa (también denominada LY-2334737). Por ejemplo, CP-4126 es un derivado éster de ácido graso insaturado lipófilo de gemcitabina. Debido a su carácter lipófilo, exhibe un aumento de la captación y
50 acumulacióncelular,loquedacomoresultadounamayorconversiónenmetabolitosactivos.
En comparación con otros análogos de nucleósidos, la gemcitabina y derivados o profármacos de la misma, exhiben una mayor actividad antitumoral, particularmente hacia tumores sólidos. Se ha demostrado la actividad antitumoral de la gemcitabina contra cánceres, en el cáncer de páncreas, el cáncer de pulmón de células pequeñas y no
55 pequeñas, y el cáncer de vejiga.
Un compuesto relativamente hidrofílico, la gemcitabina tiene una capacidad limitada de penetrar las membranas plasmáticas a través de la difusión pasiva. Por lo tanto, se requieren mayores dosis o infusiones. La administración de gemcitabina se ha asociado con algunos efectos secundarios. Las dosificaciones administradas o los tiempos de
60 infusión más largos para mantener los niveles citotóxicos pueden asociarse con mielotoxicidad y otros efectos adversos tales como elevación de la enzima transaminasa hepática, náuseas y vómitos y erupción cutánea.
ii) Citarabina
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La citarabina es un análogo de nucleósido que se aisló originalmente de la esponja Cryptotethya crypta. La citarabina se fosforila a ara-CTP, que puede competir con dCTP. La ara-CTP también se puede incorporar al ADN e interferir en la polimerización de la cadena y la reparación del ADN. La citabitina puede ser inactivada por la citidina desaminasa.
5 La citarabina se ha utilizado principalmente en cánceres hematológicos. Se han desarrollado derivados sintéticos de citarabina y se ha demostrado que muestran eficacia contra tumores sólidos. Estos incluyen, por ejemplo, gemcitabina (véase más arriba). Por ejemplo, se conocen derivados éster de citarabina. Un ejemplo de dicho derivado es CP-4055, que es el éster de ácido 5'-elaídico de citarabina (véase p.ej. Breistol et al. (1999) Cancer
10 Res., 59:2944).
Debido a los problemas para mantener niveles suficientes de efectos citotóxicos, las dosis administradas o los aumentos de los tiempos de infusión pueden causar efectos secundarios tales como mielosupresión y otras lesiones tisulares específicas.
15
iii) Decitabina
La decitabina (5-aza-2'-desoxicitidina, 5-aza-CdR) es un análogo de nucleósido de pirimidina de la citidina. La decitabina se preparó inicialmente por ciclación de isocianatos de peracilglicosilo (PlimL y Sorm (1964) Collect.
20 Czech. Chem. Commun. 29:2576-2577). Se pueden distinguir dos formas isoméricas de decitabina. El anómero β es la forma activa. La decitabina es el ingrediente activo en el producto comercializado DACOGEN™, en forma de un polvoliofilizado estéril para inyectables.
Dentro de la célula, la decitabina se convierte primero en su forma activa, la 5-aza-desoxicitidina fosforilada, por la
25 desoxicitidina quinasa que se sintetiza principalmente durante la fase S del ciclo celular. La afinidad de la decitabina por el sitio catalítico de la desoxicitidina quinasa es similar al sustrato natural, la desoxicitidina (Momparler et al. (1985) Pharmacol Ther 30:287-299). Después de la conversión a su forma de trifosfato por la desoxicitidina quinasa, la decitabina se incorpora al ADN replicante a una velocidad similar a la del sustrato natural, dCTP (Bouchard y Momparler (1983) Mol. Pharmacol. 24:109-114).
30 Una de las funciones de la decitabina es su capacidad para inhibir específica y potentemente la metilación del ADN. La metilación de la citosina a 5-metilcitosina se produce a nivel de ADN. La incorporación de decitabina a la hebra de ADN tiene un efecto de hipometilación. Cada clase de células diferenciadas tiene su propio patrón de metilación distintivo. Después de la duplicación cromosómica, para conservar este patrón de metilación, la 5-metilcitosina de la
35 hebra parental sirve para dirigir la metilación en la hebra de ADN hija complementaria. La sustitución del carbono en la posición 5 de la citosina por un nitrógeno interfiere en este proceso normal de metilación del ADN. La sustitución de 5-metilcitosina por decitabina en un sitio específico de metilación produce una inactivación irreversible de ADN metiltransferasa, presumiblemente debido a la formación de un enlace covalente entre la enzima y la decitabina (Juttermann et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11797-11801). Al inhibir específicamente la ADN
40 metiltransferasa, la enzima requerida para la metilación, se puede prevenir la metilación aberrante de los genes supresores detumores.
Los métodos para preparar decitabina, y particularmente el anómero β, son conocidos en la técnica (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 3.350.388; la Patente de Estados Unidos Núm. 3.817.980; la Patente de Estados
45 Unidos Núm. 4.209.613; la Solicitud Publicada de Estados Unidos Núm. US20120046457; la Publicación de la Solicitud Internacional Núm. WO2008/101448; Winkley et al. (1970) J Org Chem, 35:491-495; Piskala et al. (1978) Nucleic Acids Research, 1:s109-s114; Ben-Hattar et al. (1986) J Org Chem, 51:3211-3213). La decitabina se puede formular mediante métodos convencionales conocidos en la técnica. Las formulaciones pueden ser formulaciones líquidas o liofilizadas. Por ejemplo, la decitabina se suministra comúnmente como un polvo liofilizado estéril para
50 inyectables, junto con una sal tamponadora, tal como dihidrogenofosfato de potasio y un modificador de pH, tal como hidróxido de sodio. Por ejemplo, la decitabina es suministrada por SuperGen, Inc., en forma de polvo liofilizado envasado en viales de vidrio de 20 mL, que contienen 50 mg de decitabina, dihidrogenofosfato de potasio monobásico e hidróxido de sodio. Cuando se reconstituye con 10 mL de agua estéril para inyectables, cada mL contiene 5 mg de decitabina, 6,8 mg de KH2PO4 y aproximadamente 1,1 mg de NaOH. El pH de la solución
55 resultante es 6,5-7,5. La solución reconstituida se puede diluir adicionalmente a una concentración de 1,0 o 0,1 mg/mL en fluidos de infusión en frío, es decir, Cloruro de Sodio al 0,9%; o Dextrosa al 5%; o glucosa al 5%; o Solución de Ringer con Lactato añadido. Los viales sin abrir normalmente se almacenan en refrigeración (2-8°C, 3646°F), en el envase original. Las formulaciones líquidas también son conocidas (véase p.ej. Patente de Estados Unidos Núm. 6.982.253).
60 La decitabina exhibe una corta semivida in vivo debido a la desaminación dedecitabina a 5-aza-2'-desoxiuridina, que es catalizada por la citidina desaminasa (Chabot et al. (1983) Biochemical Pharmacology 22:1327-1328) La Km estimada de la decitabina fue de 250 μM para la enzima purificada de hígado humano en comparación con la Km 12 μM para el sustrato natural, desoxicitidina. La velocidad de desaminación de la desoxicitidina fue aproximadamente 6 veces mayor que la de decitabina por la citidina desaminasa a concentraciones iguales. Debido a la corta semivida, la decitabina se administra muy típicamente a los pacientes mediante inyección, tal como una inyección
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I.V. en embolada, infusiónI.V. continua, o infusión I.V.
5 La duración de la infusión I.V. puede estar limitada por la descomposición de decitabina en soluciones acuosas. Existen derivados de decitabina que son más estables en soluciones acuosas (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 7.250.416).
iv) Azacitidina
10 La 5-azacitidina (designación del Centro de Servicio Nacional NSC-102816; Número de registro CAS 320-67-2), también conocida como azacitidina, AZA o 4-amino-1-β-D-ribofuranosil-1,3,5-triazin-2(1H)-ona, es un análogo de decitabina (véase p.ej. Hanna et al. (1998) Cellect. Czech. Chem. Commun., 63:222-230). Actualmente se comercializa como medicamento VIDAZA®. La azacitidina es un análogo de nucleósido, más específicamente un
15 análogo de citidina. Es un antagonista de su nucleósido natural. Por ejemplo, la única diferencia estructural entre la azacitosina y la citosina es la presencia de un átomo de nitrógeno en la posición 5 del anillo de citosina en la azacitosina en comparación con un carbono en esta posición para la citosina.
Los métodos para preparar azacitidina, y particularmente los métodos que evitan el uso de agua, son conocidos en
20 la técnica (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.350.388; Patente de los Estados Unidos Núm. 8.058.424; Winkley y Robins (1970) J. Org. Chem., 35:491; Piskala y Sorm (1978) Nucl. Ácid. Chem., 1:435; y Vorbrueggen et al. (1981) Chemische Berichte, 114:1234-1255.
La azacitidina es un sustrato para la citidina desaminasa (véase p.ej. Voytek et al. (1977) Cancer Res., 37:1956-61).
25 Para mostrar efectos citotóxicos in vivo se requieren altas concentraciones o infusiones continuas. Los efectos secundarios incluyen la disminución del recuento de glóbulos blancos y glóbulos rojos y plaquetas, náuseas, vómitos, fatiga, diarrea, entre otros efectos.
D. Métodos de producción de ácidos nucleicos y polipéptidos codificados por enzimas de degradación de30 hialuronano
Los polipéptidos de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, expuestos en la presente memoria, se pueden obtener por métodos bien conocidos en la técnica para la purificación de proteínas y la expresión de proteínas recombinantes. Se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica
35 para la identificación de ácidos nucleicos que codifican genes deseados. Se puede utilizar cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc completo (es decir, que abarca toda la región codificante), o clon de ADN genómico que codifica una hialuronidasa, tal como de una fuente celular o tisular. Las hialuronidasas solubles modificadas o variantes se pueden diseñar a partir de un polipéptido de tipo salvaje, tal como mediantemutagénesis dirigida al sitio.
40 Los polipéptidos se pueden clonar o aislar utilizando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Tales métodos incluyen la amplificación por PCR de ácidos nucleicos y el escrutinio de bibliotecas, incluyendo el escrutinio de hibridación de ácidos nucleicos, el escrutinio basado en anticuerpos y el escrutinio basado en la actividad.
45 Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos se pueden utilizar para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido deseado, incluyendo, por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede utilizar un material que contiene ácido nucleico como material de partida a partir del cual se puede aislar una molécula deseada de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Por ejemplo, se pueden utilizar preparaciones
50 de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos de tejidos, muestras de fluidos (p.ej. sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos en métodos de amplificación. Las bibliotecas de ácidos nucleicos también se pueden utilizar como fuente de material de partida. Se pueden diseñar cebadores para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar basándose en secuencias expresadas a partir de las cuales se genera un polipéptido deseado. Los cebadores se pueden diseñar basándose en la retrotraducción de una
55 secuencia de aminoácidos polipeptídicos. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación se pueden secuenciar y se puede confirmar que codifican un polipéptido deseado.
Se pueden unir secuencias nucleotídicas adicionales a una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, incluyendo secuencias conectoras que contienen sitios de endonucleasas de restricción con el fin de clonar el gen
60 sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteína o un vector diseñado para la amplificación de la secuencias de ADN que codifican la proteína central. Además, las secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales se pueden unir operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Los ejemplos de tales secuencias incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares, y secuencias de secreción, por ejemplo secuencias señal heterólogas, diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Tales secuencias son conocidas por los expertos en la técnica. También se pueden unir secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican regiones de unión a proteínas a moléculas de ácidos nucleicos que codifican enzimas. Tales regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias de residuos que facilitan o codifican proteínas
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5 que facilitan la absorción de una enzima a células diana específicas, o alteran de otro modo la farmacocinética de un producto de un gen sintético. Por ejemplo, las enzimas se pueden unir a radicales de PEG.
Además, se pueden añadir etiquetas u otros radicales, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, también se pueden unir secuencias de residuos de nucleótidos adicionales
10 tales como las secuencias de bases que especifican una etiqueta epitópica u otro marcador detectable a moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Los ejemplos de tales secuencias incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican una etiqueta de His (p.ej., 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO: 54) o Etiqueta Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 55).
15 Los ácidos nucleicos identificados y aislados se pueden insertar a continuación en un vector de clonación apropiado. Se puede utilizar una gran cantidad de sistemas vector-anfitrión conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vectores debe ser compatible con la célula anfitriona utilizada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como pCMV4, pBR322 o derivados del plásmido pUC o el vector Bluescript (Stratagene,
20 La Jolla, CA). Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ilustrado en la presente memoria. La inserción en un vector de clonación se puede realizar, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN a un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. La inserción se puede efectuar utilizando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Si los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse
25 enzimáticamente. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (conectores) en los extremos del ADN; estos conectores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de la proteína se pueden modificar mediante colas homopoliméricas. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en células anfitrionas, por ejemplo, mediante transformación,
30 transfección,infección,electroporaciónysonoporación,demodoquesegeneranmuchascopiasdelasecuenciadel gen.
En realizaciones específicas, la transformación de células anfitrionas con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen aislado de proteína, ADNc o la secuencia de ADN sintetizada permite la generación de copias
35 múltiples del gen. Por lo tanto, el gen se puede obtener en grandes cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado.
1. Vectores y células
40 Para la expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, tales como cualquier polipéptido de enzima de degradación de hialuronano descrito en la presente memoria, el ácido nucleico que contiene toda o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede insertarse en un vector de expresión apropiado. es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la
45 secuencia codificante de la proteína insertada. Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias también pueden ser suministradas por el promotor nativo para genes de enzimas y/o sus regiones flanqueantes.
También se proporcionan vectores que contienen un ácido nucleico que codifica la enzima. También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucariotas y procariotas, y los vectores
50 son adecuados para su uso en las mismas.
Se proporcionan células procariotas y eucariotas, que incluyen células endoteliales, que contienen los vectores. Tales células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células vegetales, células de insectos y células animales. Las células se utilizan para producir una proteína de las mismas cultivando las
55 células descritas anteriormente en condiciones en las que la proteína codificada es expresada por la célula, y recuperando la proteína expresada. Para los fines de la presente memoria, por ejemplo, la enzima puede secretarse al medio.
Se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la enzima de
60 degradación de hialuronano, en algunos ejemplos un polipéptido de hialuronidasa soluble, acoplado a la secuencia señal nativa o heteróloga, así como múltiples copias de los mismos. Los vectores se pueden seleccionar para la expresión de la proteína enzimática en la célula o de manera que la proteína enzimática se exprese como una proteína secretada.
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Se puede utilizar una variedad de sistemas de anfitrión-vector para expresar la secuencia codificante de la proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, sistemas de células de mamíferos infectados con virus (p.ej. virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insectos infectados con virus (p.ej. baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN
5 plasmídico o ADN cósmido. Las fortalezas y especificidades de los elementos de expresión de los vectores varían. Dependiendo del sistema de anfitrión-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de una serie de elementos de transcripción y traducción adecuados.
Se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN
10 en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales de control de la transcripción/traducción apropiados y secuencias codificantes de proteínas. Estos métodos pueden incluir técnicas ADN recombinante y sintéticas in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican proteína, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de la misma, puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los
15 mismos se expresen en un anfitrión transformado con la molécula o moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse mediante cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En una realización específica, el promotor no es nativo para los genes para una proteína deseada. Los promotores que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous
20 (Yamamoto et al. Cell 22:787 -797 (1980)), el promotor de la timidina quinasa de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de β-lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 78:5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983); véase también "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": en Scientific American 242:79-94
25 (1980); vectores de expresión de plantas que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1983)) o el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de la alcohol deshidrogenasa, el promotor de la fosfoglicerol quinasa, el promotor de la fosfatasa alcalina
30 y las siguientes regiones de control transcripcional animales que exhiben especificidad tisular y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639 -646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); la región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), la región de control del gen de inmunoglobulina que es
35 activa en células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436 -1444 (1987)), la región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), la región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., Genes y Devel. 1:268-276 (1987)), la región de control del gen de la alfafetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648
40 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58, 1987)), la región de control del gen de alfa-1 antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., Genes y Devel. 1:161-171 (1987)), la región de control del gen de la beta globina que es activa en células mieloides (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en las células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), la región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina que es
45 activa en el músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), y la región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrófica, que es activa en los gonadotrofos del hipotálamo (Mason et al., Science 234: 1372 -1378 (1986)).
En una realización específica, se utiliza un vector que contiene un promotor unido operablemente a ácidos nucleicos
50 que codifican una proteína deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo de la misma, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (p.ej., un gen de resistencia a antibióticos). Los vectores plasmídicos ilustrativos para la transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA, véase también la bibliografía publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor de fago T5 (reconocido por ARN polimerasa
55 de E. coli) y un módulo de represión de operador lac doble para proporcionar una expresión altamente regulada y de alto nivel de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de unión al ribosoma sintético (RBS II) para la traducción eficaz, una secuencia codificante de la etiqueta 6XHis, terminadores transcripcionales t0 y T1, origen de replicación ColE1 y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de una etiqueta 6xHis en el extremo N o C de la proteína recombinante. Tales plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30 y
60 pQE 31 que proporcionan múltiples sitios de clonación para los tres marcos de lectura y proporcionan la expresión delas proteínasmarcadas N-terminalmentecon 6xHis. Otrosvectores plasmídicosilustrativos parala transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, la Patente de Estados Unidos Núm. 4.952.496; disponible de Novagen, Madison, WI; véase, también la bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Tales plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T71ac, el terminador T7, el operador lac inducible de E. coli, y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7 y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET15b y pET19b (Novagen, Madison, WI), que contienen una secuencia líder His-Tag™ para su uso en la purificación con una columna His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de la purificación sobrela columna, la región promotora T7-lac y el terminador T7.
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5 Un ejemplo de un vector para la expresión en células de mamífero es el vector de expresión HZ24. El vector de expresión HZ24 se obtuvo de la cadena principal del vector pCI (Promega). Contiene ADN que codifica el gen de resistencia a betalactamasa (AmpR), un origen de replicación F1, una región potenciadora temprana inmediata/promotora de citomegalovirus (CMV), y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El vector de
10 expresión también tiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón.
2. Expresión
15 Los polipéptidos de enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo polipéptidos de hialuronidasa solubles, se pueden producir mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de las proteínas, tales como, por ejemplo, las necesarias para la administración y el tratamiento. Los anfitriones de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tales como E. coli, levadura, plantas,
20 células de insectos, células de mamíferos, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los anfitriones de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas así como en los tipos de modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del anfitrión de expresión se puede realizar en base a estos y otros factores, tales como las consideraciones reglamentarias y de seguridad, los costes de producción y la necesidad y losmétodos de purificación.
25 Muchos vectores de expresión están disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden utilizar para la expresión de proteínas. La elección del vector de expresión estará influenciada por la elección del sistema de expresión del anfitrión. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente potenciadores, señales de traducción y señales de terminación de la transcripción y la traducción.
30 Los vectores de expresión que se utilizan para la transformación estable típicamente tienen un marcador seleccionable que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, se puede utilizar un origen de replicación para amplificar el número decopias del vector.
Los polipéptidos de enzimas de degradación de hialuronano, tales como los polipéptidos de hialuronidasa solubles,
35 también se pueden utilizar o expresar como fusiones de proteínas. Por ejemplo, se puede generar una fusión enzimática para agregar funcionalidad adicional a una enzima. Los ejemplos de proteínas de fusión enzimática incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia señal, una etiqueta tal como para localización, p.ej. una etiqueta his6 o una etiqueta myc, o una etiqueta para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de proteína y/o la asociación con membrana.
40
a. Células procariotas
Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es un mecanismo técnica simple y rápido bien conocido por los expertos en la técnica. Los
45 vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles, tales promotores son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que exhiben cierta toxicidad para las células anfitrionas. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor λPLregulado por temperatura.
50 Las proteínas, tales como las proporcionadas en la presente memoria, pueden expresarse en el entorno citoplásmico de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas, esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Se pueden utilizar agentes reductores tales como ditiotreitol y β-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCl y urea, para volver a solubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de bacterias que
55 proporciona un entorno oxidante e isomerasas de tipo chaperonina y disulfuro y puede conducir a la producción de proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona con la proteína que se va a expresar que dirige la proteína al periplasma. El líder es a continuación eliminado por peptidasas señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder de direccionamiento periplásmico incluyen el líder pelB del gen de la pectato liasa y el líder derivado del gen de la fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la filtración de la
60 proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y simple del sobrenadante de cultivo. Las proteínas que no se secretan se pueden obtener a partir del periplasma mediante lisis osmótica. De una manera similar a la expresión citoplásmica, en algunos casos las proteínas pueden volverse insolubles y se pueden utilizar desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y la solubilidad, típicamente se utilizan temperaturas entre 25°C y 37°C. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas. Por lo tanto, si las proteínas requieren glicosilación para su función, se puede agregar glicosilación in vitro después de la purificación de las células anfitrionas.
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5 b. Células de levadura
Levaduras tales como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son anfitriones de expresión de levaduras bien conocidos que se pueden utilizar para la producción de proteínas, tales como las descritas en la presente memoria. La levadura se puede transformar con 10 vectores replicantes episomales o mediante integración cromosómica estable por recombinación homóloga. Típicamente, los promotores inducibles se utilizan para regular la expresión génica. Los ejemplos de tales promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneína, tales como CUP1, AOX1 u otro promotor de Pichia u otra levadura. Los vectores de expresión a menudo incluyen un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para la selección y el mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en 15 levadura a menudo son solubles. La coexpresión con chaperoninas tales como Bip y la proteína disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Además, las proteínas expresadas en levadura pueden dirigirse a la secreción utilizando fusiones de péptidos señal de secreción tales como la señal de secreción del factor alfa de apareamiento de levaduras de Saccharomyces cerevisae y fusiones con proteínas de la superficie celular de levadura tales como el receptor de adhesión de apareamiento Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Se
20 puede modificar genéticamente un sitio de escisión de proteasa tal como para la proteasa Kex-2, para eliminar las secuencias fusionadas de los polipéptidos expresados a medida que salen de la ruta de secreción. La levadura también es susceptible de glicosilación en losmotivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Células de insecto
25 Las células de insecto, que se utilizan particularmente para la expresión de baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos tales como polipéptidos de hialuronidasa. Las células de insecto expresan altos niveles de proteína y son susceptibles de la mayoría de las modificaciones postraduccionales utilizadas por los eucariotas superiores. Los baculovirus tienen una gama de anfitrión restrictiva que mejora la seguridad y reduce las consideraciones
30 regulatorias de la expresión eucariótica. Los vectores de expresión típicos utilizan un promotor para expresión de alto nivel tal como el promotor de polihedrina de baculovirus. Los sistemas de baculovirus utilizados comúnmente incluyen los baculovirus tales como el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), y el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una línea celular deinsecto tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para la expresión de alto nivel, la secuencia de
35 nucleótidos de la molécula que se va a expresar se fusiona inmediatamente aguas abajo del codón de iniciación de la polihedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en células de insectos y se pueden utilizar para secretar la proteína expresada al medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a los sistemas de células demamíferos.
40 Un sistema de expresión alternativo en células de insecto es el uso de células transformadas establemente. Se pueden utilizar líneas celulares tales como las células Schneider 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus) para la expresión. Se puede utilizar el promotor de metalotioneína de Drosophila para inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción de metales pesados con cadmio o cobre. Los vectores de
45 expresión se mantienen típicamente mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.
d. Células de mamífero
50 Los sistemas de expresión de mamíferos se pueden utilizar para expresar proteínas que incluyen polipéptidos enzimáticos de degradación de hialuronano, tales como polipéptidos de hialuronidasa solubles. Las construcciones de expresión pueden transferirse a células de mamífero mediante infección viral tal como adenovirus o mediante transferencia directa de ADN tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamífero incluyen típicamente un sitio
55 cap de ARNm, una caja TATA, una secuencia de iniciación de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. También se pueden añadir elementos IRES para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, tal como un marcador seleccionable. Tales vectores a menudo incluyen promotor-potenciadores transcripcionales para la expresión de alto nivel, por ejemplo, el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV) y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (RSV). Estos
60 promotores-potenciadores están activos en muchos tipos de células. Se pueden utilizar regiones promotoras y potenciadoras de tipo tisular y celular también para la expresión. Las regiones promotoras/potenciadoras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus de tumor mamario de ratón, albúmina, alfafetoproteína, alfa 1 antitripsina, beta globina, proteína básica de mielina, cadena ligera de miosina 2 y el control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica. Los marcadores seleccionables se pueden utilizar para seleccionar y mantener células con la construcción de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, entre otros, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantinaguanina fosforribosil transferasa, aminoglicósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Por ejemplo, la expresión se puede realizar en presencia de metotrexato para seleccionar únicamente aquellas
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5 células que expresan el gen DHFR. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular como TCR-ζ y FcεRI-γ puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo sobre la superficie celular.
Están disponibles muchas líneas celulares para la expresión en mamíferos que incluyen células de ratón, de rata, humanas, de mono, de pollo y de hámster. Las líneas celulares ilustrativas incluyen, pero no se limitan a células 10 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretora) y otras líneas celulares de mieloma, hibridoma y líneas celulares de heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 y HKB. También están disponibles líneas celulares adaptadas a medios libres de suero que facilitan la purificación de proteínas secretadas de los medios de cultivo celular. Los ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, Núm. de Cat. 11619-012) y la línea celular EBNA-1 libre de suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-342).
15 También se encuentran disponibles líneas celulares que están adaptadas para crecer en medios especiales optimizados para unamáxima expresión. Por ejemplo, las células CHO DG44 están adaptadas para crecer en cultivo en suspensión en unmedio químicamente definido, libre de productos de origen animal.
e. Plantas
20 Se pueden utilizar células vegetales y plantas transgénicas para expresar proteínas tales como las descritas en la presente memoria. Las construcciones de expresión se transfieren típicamente a plantas utilizando transferencia directa de ADN tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG en protoplastos, y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y
25 potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y las técnicas de transformación generalmente se dividen entre anfitriones dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco, y anfitriones monocotiledóneos, tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores vegetales utilizados para la expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintetasa, el promotor de la ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Los
30 marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa se utilizan a menudo para facilitar la selección y el mantenimiento de las células transformadas. Las células vegetales transformadas se pueden mantener en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse a plantas completas. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas modificadas genéticamente para producir polipéptidos de hialuronidasa. Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación que las
35 célulasdemamíferos,estopuedeinfluirenlaeleccióndelaproteínaproducidaenestosanfitriones.
3. Técnicas de purificación
El método para la purificación de polipéptidos, incluyendo polipéptidos de enzimas de degradación de hialuronano
40 (p.ej. polipéptidos de hialuronidasa soluble) u otras proteínas, a partir de células anfitrionas dependerán de las células anfitrionas y los sistemas de expresión elegidos. Para las moléculas secretadas, las proteínas se purifican generalmente a partir de los medios de cultivo después de eliminar las células. Para la expresión intracelular, las células se pueden lisar y las proteínas purificar del extracto. Cuando se utilizan organismos transgénicos tales como plantas y animales transgénicos para la expresión, se pueden utilizar tejidos u órganos como material de partida
45 para preparar un extracto de células lisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en la leche o en los huevos, que se pueden recoger y, si fuera necesario, las proteínas se pueden extraer y purificar adicionalmente utilizando métodos convencionales en la técnica.
Las proteínas, tales como los polipéptidos de hialuronidasa solubles, se pueden purificar utilizando mecanismos de
50 purificación de proteínas conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, SDS-PAGE, cromatografía de fraccionamiento por tamaño y exclusión por tamaño, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico, tal como cromatografía de intercambio aniónico. Las técnicas de purificación por afinidad también se pueden utilizar para mejorar la eficacia y la pureza de las preparaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar en la purificación por afinidad anticuerpos, receptores y otras moléculas que se unen a las enzimas hialuronidasa.
55 También se pueden diseñar construcciones de expresión para agregar una etiqueta de afinidad a una proteína tal como un epítopomyc, fusión GST o His6 y purificar por afinidad con anticuerpo para myc, resina de glutatión y resina de Ni, respectivamente. La pureza se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica que incluya electroforesis en gel y técnicas de tinción y espectrofotometría. Las composiciones de rHuPH20 purificadas, proporcionadas en la presente memoria, tienen típicamente una actividad específica de al menos 70.000 a 100.000
60 Unidades/mg, por ejemplo, aproximadamente 120.000 Unidades/mg. La actividad específica puede variar con la modificación, tal como con un polímero.
4. PEGilación de polipéptidos de enzimas de degradación de hialuronano
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El polietilenglicol (PEG) se ha utilizado ampliamente en biomateriales, biotecnología y medicina principalmente porque el PEG es un polímero biocompatible, no tóxico, soluble en agua que generalmente no es inmunogénico (Zhao y Harris, ACS Symposium Series 680:458-72, 1997). En el área del suministro de fármacos, los derivados de PEG se han utilizado ampliamente en la unión covalente (es decir, "PEGilación") a proteínas para reducir la
5 inmunogenicidad, la proteólisis y la depuración renal y para mejorar la solubilidad (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). De forma similar, el PEG se ha unido a fármacos relativamente hidrófobos de bajo peso molecular para mejorar la solubilidad, reducir la toxicidad y alterar la biodistribución. Típicamente, losmedicamentos PEGilados se inyectan en forma de soluciones.
10 Una aplicación estrechamente relacionada es la síntesis de redes de PEG degradable entrecruzadas o formulaciones para su uso en el suministro de fármacos, ya que gran parte de la misma química utilizada en el diseño de portadores de fármacos solubles y degradables también se puede utilizar en el diseño de geles degradables (Sawhney et al., Macromolecules 26:581-87, 1993). También se sabe que se pueden formar complejos intermacromoleculares mezclando soluciones de dos polímeros complementarios. Tales complejos generalmente se
15 estabilizan mediante interacciones electrostáticas (polianiones-policationes) y/o enlaces de hidrógeno (poliacidospolibásicos) entre los polímeros implicados, y/o mediante interacciones hidrófobas entre los polímeros en un entorno acuoso (Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). Por ejemplo, mezclar soluciones de poli(ácido acrílico) (PAAc) y poli(óxido de etileno) (POE) en las condiciones adecuadas da como resultado la formación de complejos basados principalmente en enlaces de hidrógeno. La disociación de estos complejos en condiciones fisiológicas se
20 ha utilizado para el suministro de fármacos libres (es decir, no PEGilados). Además, se han formado complejos de polímeros complementarios tanto de homopolímeros como de copolímeros.
Se han descrito en la técnica numerosos reactivos para PEGilación. Tales reactivos incluyen, pero no se limitan a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS), succinimidil mPEG, mPEG -N-hidroxisuccinimida, alfa25 metilbutanoato de succinimidilo con mPEG, propionato de succinimidilo con mPEG, butanoato de succinimidilo con mPEG, éster de succinimidilo de ácido carboximetil 3-hidroxibutanoico con mPEG, PEG-propionato de succinimidilo, homobifuncional, propionaldehído con PEG homobifuncional, butiraldehído con PEG homobifuncional, maleimida con PEG, hidrazida con PEG, carbonato de p-nitrofenilo-PEG, carbonato de mPEG-benzotriazol, propionaldehído con PEG, butiraldehído con mPEG, butiraldehído con mPEG2 ramificado, acetilo con mPEG, piperidona con mPEG, 30 metilcetona con mPEG, maleimida con mPEG "sin conector", vinil sulfona con mPEG, tiol con mPEG, ortopiridiltioéster con, ortopiridil disulfuro con mPEG, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona con PEG-NHS, acrilato con PEG-NHS, fluoresceína con PEG-NHS y biotina con PEG-NHS (véase p.ej., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; documentos U.S. 5.672.662; U.S. 5.932.462; U.S. 6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S. 4.179.337; U.S. 35 5.122.614; U.S. 5.324. 844; U.S. 5.446.090; U.S. 5.612.460; U.S. 5.643.575; U.S. 5.766.581; U.S. 5.795. 569; U.S. 5.808.096; U.S. 5.900.461; U.S. 5.919.455; U.S. 5.985.263; U.S. 5.990. 237; U.S. 6.113.906; U.S. 6.214.966; U.S. 6.258.351; U.S. 6.340.742; U.S. 6.413.507; U.S. 6.420.339; U.S. 6.437.025; U.S. 6.448.369; U.S. 6.461.802; U.S. 6.828.401; U.S. 6.858.736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S.
40 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WO0500360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; y WO 0187925).
En un ejemplo, el polietilenglicol tiene un peso molecular que varía de aproximadamente 3 kD a aproximadamente
45 50 kD, y típicamente de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 30 kD. La unión covalente del PEG al fármaco (conocida como "PEGilación") se puede lograr mediante técnicas conocidas de síntesis química. Por ejemplo, la PEGilación de la proteína se puede lograr haciendo reaccionar PEG activado con NHS con la proteína en condiciones de reacción adecuadas.
50 Aunque se han descrito numerosas reacciones para la PEGilación, las que son más aplicables en general confieren direccionalidad, utilizan condiciones de reacción suaves y no requieren un procesamiento posterior exhaustivo para eliminar catalizadores o productos biológicos tóxicos. Por ejemplo, el monometoxi PEG (mPEG) tiene solo un hidroxilo terminal reactivo, y por lo tanto su uso limita parte de la heterogeneidad de la mezcla de productos de PEGproteína resultante. La activación del grupo hidroxilo en el extremo del polímero opuesto al grupo metoxi terminal es
55 generalmente necesaria para lograr una PEGilación de proteína eficaz, con el objetivo de hacer que el PEG transformado sea más susceptible al ataque nucleofílico. El nucleófilo de ataque suele ser el grupo épsilon-amino de un residuo de lisilo, pero también pueden reaccionar otras aminas (p.ej. la alfa-amina N-terminal o las aminas anulares de la histidina) si las condiciones locales son favorables. Es posible una unión más dirigida en proteínas que contienen una sola lisina o cisteína. El último residuo puede ser dirigido por PEG-maleimida para la modificación
60 específica de tiol. Alternativamente, la hidrazida con PEG puede reaccionar con una enzima de degradación de hialuronano oxidada con peryodato y reducirse en presencia de NaCNBH3. Más específicamente, los azúcares CMP PEGilados se pueden hacer reaccionar con una enzima de degradación de hialuronano en presencia de glicosiltransferasas apropiadas. Una técnica es la técnica de "PEGilación" en la que varias moléculas poliméricas se acoplan al polipéptido en cuestión. Cuando se utiliza esta técnica, el sistema inmunitario tiene dificultades para reconocer los epítopos sobre la superficie del polipéptido responsables de la formación de anticuerpos, lo que reduce la respuesta inmunitaria. Para los polipéptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del cuerpo humano para proporcionar un efecto fisiológico concreto (es decir, fármacos) la respuesta inmunitaria potencial típica es una respuesta de IgG y/o IgM, mientras que los polipéptidos que se inhalan a través del sistema respiratorio (es
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5 decir, polipéptido industrial) potencialmente puede causar una respuesta de IgE (es decir, respuesta alérgica). Una de las teorías que explican la respuesta inmunitaria reducida es que las moléculas poliméricas protegen los epítopos sobre la superficie del polipéptido responsable de la respuesta inmunitaria que conduce a la formación de anticuerpos. Otra teoría o al menos un factor parcial es que cuanto más pesado es el producto conjugado, más reducida es la respuesta inmunitaria obtenida.
10 Típicamente, para preparar las enzimas de degradación de hialuronano PEGiladas proporcionadas en la presente memoria, incluyendo las hialuronidasas PEGiladas, los radicales de PEG se conjugan, mediante unión covalente, a los polipéptidos. Las técnicas de PEGilación incluyen, pero no se limitan a, conectores especializados y químicas de acoplamiento (véase p.ej., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), anclaje de múltiples radicales de
15 PEGaunúnicositiodeconjugación(talcomomedianteelusodePEGramificados;p.ej., Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGilación y/o mono-PEGilación específicas de sitio (véase p.ej., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase p.ej., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Los métodos y mecanismos descritos en la técnica pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG unidos a una sola molécula de proteína (véase p.ej.,
20 documento U.S. 2006/0104968).
Como ejemplo ilustrativo de la PEGilación de un método ilustrativo para preparar enzimas de degradación de hialuronano PEGiladas, tales como hialuronidasas PEGiladas, se han aplicado aldehídos, succinimidas y carbonatos con PEG para conjugar radicales de PEG, típicamente succinimidil PEG, a rHuPH20. Por ejemplo, se ha conjugado 25 rHuPH20 con reactivos de succinimidil monoPEG (mPEG) ilustrativos incluyendo mPEG-propionatos de succinimidilo (mPEG-SPA), mPEG-butanoatos de succinimidilo (mPEG-SBA) y (para unir PEG "ramificados") mPEG2-N-hidroxilsuccinimida. Estos ésteres de succinimidilo PEGilados contienen cadenas principales de carbono de longitud diferente entre el grupo PEG y el agente de entrecruzamiento activado, y un grupo PEG único o ramificado. Estas diferencias se pueden utilizar, por ejemplo, para proporcionar diferentes cinéticas de reacción y
30 para restringir potencialmente los sitios disponibles para la unión de PEG a rHuPH20 durante el procedimiento de conjugación.
Los succinimidil PEG (como anteriormente) que comprenden PEG lineales o ramificados se pueden conjugar con rHuPH20. Los PEG se pueden utilizar para generar rHuPH20 que contienen de manera reproducible moléculas que
35 tienen, de promedio, entre aproximadamente tres y seis o de tres a seis moléculas de PEG por hialuronidasa. Tales composiciones de rHuPH20 PEGiladas se pueden purificar fácilmente para producir composiciones que tienen actividades específicas de aproximadamente 25.000 o 30.000 unidades/mg de proteína de actividad hialuronidasa, y que están sustancialmente libres de rHuPH20 no PEGilada (menos de 5% no PEGilada).
40 Utilizando diversos reactivos de PEG, se puede preparar versiones ilustrativas de enzimas de degradación de hialuronano, en particular hialuronidasas recombinantes humanas solubles (p.ej. rHuPH20), por ejemplo, utilizando mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD) y versiones ramificadas basadas en mPEG2-NHS (40 kD) y mPEG2-NHS (60 kD). Las versiones PEGiladas de rHuPH20 se han generado utilizando químicas de NHS, así como carbonatos y aldehídos, utilizando cada uno de los siguientes reactivos: mPEG2-NHS-40K ramificado, mPEG-NHS-10K
45 ramificado, mPEG-NHS-20K ramificado, mPEG2-NHS-60K ramificado; mPEG-SBA-5K, mPEG-SBA-20K, mPEGSBA-30K; mPEG-SMB-20K, mPEG-SMB-30K; mPEG-butiraldehído; mPEG-SPA-20K, mPEG-SPA-30K; y PEGNHS-5K-biotina. Las hialuronidasas PEGiladas también se han preparado utilizando reactivos de PEG disponibles de Dowpharma, una división de Dow Chemical Corporation; incluyendo hialuronidasas PEGiladas con PEG con carbonato de p-nitrofenilo de Dowpharma (30 kDa) y con propionaldehído con PEG (30 kDa).
50 En un ejemplo, la PEGilación incluye la conjugación de mPEG-SBA, por ejemplo, mPEG-SBA-30K (que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa) u otros ésteres de succinimidilo de derivados de ácido butanoico con PEG, a una hialuronidasa soluble. Los ésteres de succinimidilo de los derivados de ácido butanoico con PEG, tales como mPEG-SBA-30K, se acoplan fácilmente a grupos amino de proteínas. Por ejemplo, la conjugación covalente
55 de m-PEG-SBA-30K y rHuPH20 (que tiene un tamaño de aproximadamente 60 KDa) proporciona enlaces amida estables entrerHuPH20 y mPEG, como semuestra en el Esquema 1, a continuación.
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Típicamente, el mPEG-SBA-30K u otro PEG se agregan a la enzima de degradación de hialuronano, en algunos casos una hialuronidasa, a una razón molar de PEG:polipéptido de 10:1 en un tampón adecuado, p.ej. NaCl 130
5 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8 o tampón de fosfato 70 mM, pH 7, seguido de esterilización, p.ej. filtración en condiciones estériles, y conjugación continua, por ejemplo, con agitación, durantela nochea 4ºC en una sala fría. En un ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con PEG se concentra y se intercambia el tampón.
Se conocen en la técnica otros métodos para acoplar ésteres de succinimidilo de derivados de ácido butanoico con
10 PEG, tales como mPEG-SBA-30K (véanse p.ej., los documentos U.S. 5.672.662; U.S. 6.737.505; y U.S. 2004/0235734). Por ejemplo, un polipéptido, tal como una enzima de degradación de hialuronano (p.ej. una hialuronidasa), se puede acoplar a un derivado de PEG activado por NHS mediante reacción en un tampón de borato (0,1 M, pH 8,0) durante una hora a 4°C. La proteína PEGilada resultante se puede purificar mediante ultrafiltración. Alternativamente, la PEGilación de una fosfatasa alcalina bovina se puede realizar mezclando la
15 fosfatasa con mPEG-SBA en un tampón que contiene fosfato de sodio 0,2 M y NaCl 0,5 M (pH 7,5) a 4°C durante 30 minutos. El PEG que no ha reaccionado se puede eliminar por ultrafiltración. Otro método hace reaccionar el polipéptido con mPEG-SBA en agua desionizada a la que se añade trietilamina para elevar el pH a 7,2-9. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias horas para completar la PEGilación.
20 Los expertos en la técnica conocen los métodos para la PEGilación de polipéptidos que degradan hialuronano, incluyen, por ejemplo, hialuronidasas derivadas de animales y enzimas de degradación de hialuronano bacterianas. Véase, por ejemplo, la Patente Europea Núm. EP 0400472, que describe la PEGilación de hialuronidasa de testículos bovinos y condroitina ABC liasa. También, la Publicación de los Estados Unidos Núm. 2006014968 describe la PEGilación de una hialuronidasa humana derivada de PH20 humana. Por ejemplo, la enzima de
25 degradación de hialuronano PEGilada contiene generalmente al menos 3 radicales de PEG por molécula. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano puede tener una razón molar de PEG con respecto a proteína entre 5:1 y 9:1, por ejemplo, 7:1.
E. Composiciones y formulaciones farmacéuticas
30 En la presente memoria se proporcionan composiciones o combinaciones de un agente antihialuronano y una formulación de taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan composiciones o combinaciones de una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y una formulación de taxano dirigido a un tumor. La formulación de taxano se puede co-formular o co-administrar con composiciones que
35 contienen un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano. Por ejemplo, tales combinaciones y composiciones se pueden utilizar en el tratamiento de cánceres, incluyendo tumores sólidos, como se describe en la presente memoria. En algunos ejemplos, el agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, se puede proporcionar como una combinación de composiciones separadas que se administran por separado. En otros ejemplos, el agente antihialuronano, por ejemplo, la enzima de degradación de
40 hialuronano, y el taxano se proporcionan en la misma composición y se pueden administrar juntos. Las composiciones o combinación de composiciones se pueden formular para el suministro parenteral (es decir para el suministro sistémico). Por ejemplo, las composiciones o combinación de composiciones se formulan para suministro subcutáneo o para suministro intravenoso.
45 También se proporcionan en la presente memoria combinaciones y composiciones que contienen un tercer agente que es un agente quimioterapéutico adicional para tratar el cáncer, tal como un análogo de nucleósido u otro antimetabolito (p.ej. gemcitabina o derivado u otro análogo de nucleósido). Los ejemplos de tales agentes se han descrito anteriormente y en otra parte de la presentememoria. El agente quimioterapéutico adicional, por ejemplo un
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análogo de nucleósido, se puede co-formular o co-administrar con composiciones que contienen un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, y/o composiciones que contienen un taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico adicional, por ejemplo un análogo de nucleósido, se puede proporcionar como una composición separada de las combinaciones o composiciones de un agente 5 antihialuronano, por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano y taxano. En otros ejemplos, el análogo de nucleósido se coformula con uno o ambos agentes antihialuronano, por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano y taxano. Por ejemplo, el análogo de nucleósido se coformula con un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, y se proporciona un taxano dirigido a un tumor como una composición separada. En otro ejemplo, el análogo de nucleósido se coformula con un taxano dirigido a un tumor y se
10 proporciona un agente antihialuronano, por ejemplo, enzima de degradación de hialuronano, como una composición separada. Como ejemplo adicional, el análogo de nucleósido, el agente antihialuronano y el taxano dirigido a un tumor se coformulan juntos en la misma composición. Las composiciones o combinación de composiciones se pueden formular para suministro parenteral (es decir para suministro sistémico). Por ejemplo, las composiciones o combinación de composiciones se formulan para suministro subcutáneo o para suministro intravenoso.
15 Las composiciones se pueden formular para administración de dosificación única o para administración de dosificación múltiple. Los agentes se pueden formular para administración directa. Las composiciones se pueden proporcionar como unaformulación líquida o liofilizada.
20 Los compuestos se pueden formular en preparaciones farmacéuticas adecuadas tales como soluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida o elixires, para administración oral, así como preparación de parches transdérmicos e inhaladores de polvo seco. Típicamente, los compuestos se formulan en composiciones farmacéuticas utilizando mecanismos y procedimientos bien conocidos en la técnica (véase p.ej., Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,
25 cuarta edición, 1985, 126). En general, el modo de formulación es una función de la vía de administración. Las composiciones se pueden formular conjuntamente o proporcionarse como composiciones separadas.
En general, las composiciones se formulan en forma liofilizada o líquida. Cuando las composiciones se proporcionan en forma liofilizada, se pueden reconstituir inmediatamente antes de su uso mediante un tampón apropiado, por
30 ejemplo, una solución salina estéril. Las composiciones se pueden proporcionar juntas o por separado. Para los fines de la presente memoria, tales composiciones típicamente se proporcionan por separado. El agente antihialuronano, por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano, tal como la hialuronidasa soluble, el taxano dirigido a un tumor y/o un agente quimioterapéutico adicional pueden envasarse como composiciones separadas para la administración conjunta, sucesiva o intermitente. Lascombinaciones se pueden envasar en forma de un kit.
35 Las composiciones se pueden formular para administración por cualquier ruta conocida por los expertos en la técnica, incluyendo inyección intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, intraperitoneal, subcutánea, intratumoral, epidural, nasal, oral, vaginal, rectal, tópica, local, ótica, inhalatoria, bucal (p.ej., sublingual), y la administración transdérmica o cualquier ruta. También se contemplan otros modos de administración. La
40 administración puede ser local, tópica o sistémica dependiendo del lugar de tratamiento. La administración local a una zona que necesita tratamiento se puede lograr, por ejemplo, pero sin limitarse a, infusión local durantela cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante. Las composiciones también se pueden administrar con otros agentes biológicamente activos, ya sea de forma sucesiva, intermitente o en la misma
45 composición. La administración también puede incluir sistemas de liberación controlada incluyendo formulaciones de liberación controlada y dispositivos deliberación controlada, tal como por medio de una bomba.
La ruta más adecuada en cualquier caso dado depende de una variedad de factores, tales como la naturaleza de la enfermedad, el progreso de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la composición particular que se utiliza.
50 Para los fines de la presente memoria, se desea que un agente antihialuronano, típicamente una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, una taxano dirigido a un tumor y/o un agente quimioterapéutico adicional se administren de manera tal que exista una cantidad o nivel disponible farmacéuticamente en el plasma. Por ejemplo, las composiciones se administran sistémicamente, por ejemplo, mediante administración intravenosa. También se pueden emplear métodos subcutáneos, aunque pueden ser
55 necesarios tiempos de absorción más prolongados para garantizar una biodisponibilidad equivalente en comparación con los métodos intravenosos. Los agentes, tales como una enzima de degradación de hialuronano, un taxano dirigido a un tumor y/o un agente quimioterapéutico adicional (p.ej. análogo de nucleósido) se pueden administrar por diferentes vías de administración. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
60 Se pueden emplear métodos de administración para disminuir la exposición de las enzimas de degradación de hialuronano, p.ej. hialuronidasas solubles y otras moléculas a procesos degradativos, tales como degradación proteolítica e intervención inmunológica a través de respuestas antigénicas e inmunogénicas. Los ejemplos de tales métodos incluyen administración local en el sitio detratamiento oinfusión continua del agente antihialuronano.
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1. Formulaciones
Se preparan composiciones farmacéuticamente aceptables a la vista de las aprobaciones para una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea generalmente reconocida para su uso en 5 animales y en seres humanos. Las composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Una composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y otros agentes similares. La
10 formulación debe adecuarse al modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores tales como un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra una enzima o activador. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una 15 cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de una administración adecuada al paciente. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceitemineral y aceite de sésamo. El agua es un portador típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las 20 soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un ingrediente activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melazas, polivinilpirrolidina, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros 25 aglutinantes de este tipo conocidos por los expertos en la técnica. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades mínimas de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH, por ejemplo, acetato, citrato sódico, derivados de ciclodextrina,
30 monolaurato de sorbitán, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes similares.
En un ejemplo, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (p.ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o
35 grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p.ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p.ej., aceite de almendras, ésteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p.ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo ácido sórbico). En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas se pueden presentar en forma liofilizada para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
40 Los compuestos farmacéuticamente y terapéuticamente activos y sus derivados se formulan y administran típicamente en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiples. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo, o diluyente farmacéutico requerido. Las formas de dosificación unitaria incluyen, pero no se limitan a, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones
45 parenterales estériles y soluciones o suspensiones orales y emulsiones de agua y aceite que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las formas de dosis unitaria pueden estar contenidas en ampollas y jeringas o en comprimidos o cápsulas envasados individualmente. Las formas de dosis unitaria se pueden administrar en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente para
50 administrarse en forma de dosis unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o botellas de pintas o galones. Por lo tanto, la forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no se segregan en el envase. Generalmente, se pueden preparar formas de dosificación o composiciones que contienen ingrediente activo en el intervalo de 0,005% a 100% con el resto constituido por un portador no tóxico.
55 La composición farmacéutica se puede formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
a. Inyectables, soluciones y emulsiones
60 En la presente memoria se contempla administración parenteral, caracterizada generalmente por inyección, ya sea por vía subcutánea, intramuscular, intratumoral, intravenosa o intradérmica. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua,
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solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar también pueden contener un activador en forma de un disolvente tal como agentes tamponadores del pH, sales de iones metálicos u otros tampones de este tipo. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otras cantidades mínimas de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o 5 emulsionantes, agentes tamponadores del pH, estabilizadores, potenciadores de la solubilidad y otros agentes tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas. También se contempla en la presente memoria la Implantación de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida, de modo que se mantenga un nivel constante de dosificación (véase, p.ej. la Patente de los Estados Unidos Núm. 3.710.795). El porcentaje de compuesto activo contenido en tales composiciones parenterales depende en gran
10 medida de la naturaleza específica de las mismas, así como de la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto.
Por ejemplo, una formulación estabilizada convencional de una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como una hialuronidasa soluble conjugada con polímero como se proporciona en la presente 15 memoria, se formula con uno o más de EDTA, NaCl, CaCl2, histidina, lactosa, albúmina, Pluronic® F68, TWEEN® y/u otro detergente u otros agentes similares. Por ejemplo, las composiciones proporcionadas en la presente memoria pueden contener uno o más tampones de pH (tales como, por ejemplo, histidina, fosfato u otros tampones),
o tampón ácido (tal como acetato, citrato, piruvato, Gly-HCl, succinato, lactato, maleato u otros tampones), modificador de la tonicidad (tal como, por ejemplo, un aminoácido, polialcohol, NaCl, trehalosa, otras sales y/o 20 azúcares), estabilizador, agente quelante, tal como ácido etilendiaminotetraacético, etilendiaminotetraacetato o EDTA de calcio, captador de oxígeno, tal como metionina, ácido ascórbico/ascorbato, ácido cítrico/citrato o albúmina y/o un conservante, tal como un conservante que contiene un anillo aromático (p.ej. fenol o cresol). Los estabilizadores ilustrativos que son útiles para las composiciones que contienen una enzima de degradación de hialuronano incluyen detergentes, tales como polisorbatos y proteínas tales como albúmina de suero humano. Las
25 concentraciones ilustrativas de albúmina de suero que son útiles en las composiciones de la presente memoria incluyen 0,1 mg/mL a 1 mg/ml, tal como al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6mg/ml, 0,7mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/mL o 1 mg/ml, pero puede ser más
o menos. Los polisorbatos también pueden estar presentes en las composiciones a, por ejemplo, concentraciones de o aproximadamente entre 0,001% y 0,1%, tal como al menos aproximadamente o al menos o aproximadamente 30 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% o 0,1%. También puede estar presente un agente quelante de metales, tal como EDTA de calcio (CaEDTA), tal como, por ejemplo, a concentraciones de entre aproximadamente 0,02 mM y 20 mM, tal como al menos aproximadamente o al menos o aproximadamente 0,02 mM, 0,04 mM., 0y06 mM, 0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM 35 o más. El pH y la osmolaridad de las composiciones pueden ser ajustadas por un experto en la técnica para optimizar las condiciones para la actividad y la estabilidad deseadas de la composición. En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas en la presente memoria tienen una osmolaridad de entre 100 mOsm/kg y 500 mOsm/kg, tal como al menos o al menos aproximadamente o de o aproximadamente 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280
40 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 o más mOsm/kg, y un pH de entre o aproximadamente entre 6 y 8, tales como 6 y 7,4, por ejemplo de o aproximadamente de 6, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 u 8.
Generalmente, el NaCl se proporciona en formulaciones que contienen una enzima de degradación de hialuronano
45 de la presente memoria, por ejemplo, en una cantidad que es o es de aproximadamente 100 mM a 150 mM o más. Por ejemplo, una formulación ilustrativa puede contener, o contener aproximadamente, histidina 10mM y/o contener, o contener aproximadamente NaCl 130 mM. Otras formulaciones pueden contener adicionalmente o alternativamente lactosa, por ejemplo, a o aproximadamente a 13 mg/mL o aproximadamente 13 mg/ml. Adicionalmente, puede estar presente en la formulación un agente antibacteriano o antifúngico, incluyendo, pero no
50 limitadoatimerosal.LasformulacionespuedenconteneradicionalmenteAlbúmina,Pluronic®F68,TWEEN®y/uotro detergente. Las formulaciones se proporcionan a un pH que es o es de aproximadamente 6,0 a 7,4, tal como 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 o 7,4, generalmente el pH es o es aproximadamente 6,5. Las formulaciones concentradas de una hialuronidasa soluble modificada para su uso en la presente invención generalmente se diluyen en una solución salina u otra solución salina tamponada antes de la administración para
55 mantener la concentración de sal apropiada.
Los inyectables están diseñados para administración local y sistémica. Para los fines de la presente memoria, se desea la administración local para la administración directa al intersticio afectado asociado con hialuronano acumulado o en exceso. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para 60 inyección, productos estériles solubles en seco, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un disolvente inmediatamente antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser combinados con un vehículo inmediatamente antes del uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas. Si se administran por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato
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(PBS), y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas delosmismos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables utilizados en las preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen Inyectable de Cloruro de Sodio, Inyectable de Ringer, Inyectable de Dextrosa Isotónica, Inyectable de Agua Estéril, Dextrosa e Inyectable de Ringer con Lactato añadido. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijados de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Los agentes antimicrobianos a concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas se pueden añadir a preparaciones parenterales envasadas en recipientes de dosis múltiples, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil-y propil-p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen hidrocloruro de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen polisorbato 80 (TWEEN 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles con agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.
Si se administran por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas delosmismos.
La concentración del compuesto farmacéuticamente activo se ajusta de modo que una inyección proporciona una cantidad eficaz para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso y el estado del paciente o animal como se conoce en la técnica. Las preparaciones parenterales de dosis unitarias se envasan en una ampolla, un vial o una jeringa con una aguja. El volumen de la solución líquida o preparación de polvo reconstituido, que contiene el compuesto farmacéuticamente activo, está en función de la enfermedad que se vaya a tratar y del artículo de fabricación concreto elegido para el envase. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles, como se conoce y practica en la técnica.
b. Polvos liofilizados
Tienen interés en la presente invención los polvos liofilizados, que pueden reconstituirse para su administración en forma de soluciones, emulsiones y otras mezclas. También se pueden reconstituir y formular en forma de sólidos o geles. Los polvosliofilizados se pueden preparar a partir de cualquiera delas soluciones descritas anteriormente.
El polvo estéril liofilizado se prepara disolviendo un compuesto de un agente antihialuronano que es una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, y/o un segundo agente en una solución tampón. La solución tampón puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo
o solución reconstituida, preparada a partir del polvo. La posterior filtración en condiciones estériles de la solución seguida de liofilización en condiciones convencionales conocidas por los expertos en la técnica proporciona la formulación deseada. Brevemente, el polvo liofilizado se prepara disolviendo un excipiente, tal como dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado, en un tampón adecuado, tal como citrato, fosfato de sodio o potasio u otro tampón semejante conocido por los expertos en la técnica. A continuación, se añade una enzima seleccionada a la mezcla resultante, y se agita hasta que se disuelva. La mezcla resultante se filtra en condiciones estériles o se trata para eliminar los productos particulados y para asegurar la esterilidad, y se distribuye en viales para la liofilización. Cada vial contendrá una dosis única (1 mg -1 g, generalmente 1-100 mg, tal como 1-5 mg) o múltiples dosis del compuesto. El polvo liofilizado se puede almacenar en condiciones apropiadas, tal como de aproximadamente 4°C a temperatura ambiente.
La reconstitución de este polvo liofilizado con una solución tampón proporciona una formulación para su uso en administración parenteral. La cantidad precisa depende de la indicación tratada y el compuesto seleccionado. Tal cantidad puede ser determinada empíricamente.
c. Administración tópica
Las mezclas tópicas se preparan como se describe para la administración local y sistémica. Las mezclas resultantes pueden ser una solución, suspensión, emulsión o similar y se formulan como cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendajes, parches dérmicos o cualquier otraformulación adecuada para administración tópica.
Los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden formular en forma de aerosoles para aplicación tópica, tal como mediante inhalación (véanse, p.ej., las Patentes de los Estados Unidos Núm. 4.044.126, 4.414.209 y 4.364.923, que describen aerosoles para el suministro de un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmenteasma). Estas formulaciones para administración al tracto respiratorio pueden estar en forma de un aerosol o solución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solo o combinado con un portador inerte tal como lactosa. En tal caso, las partículas de la formulación típicamente tendrán diámetros demenos de 50micras, preferiblementemenos de 10 micras.
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Los compuestos se pueden formular para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica en la piel y las membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones y para su aplicación al ojo o para la aplicación intracisternal o intraespinal. Se contempla la administración tópica para el suministro transdérmico y también para la administración a los ojos o a la mucosa, o para terapias de inhalación. También se pueden administrar soluciones nasales del compuesto activo solo o combinado con otros excipientes farmacéuticamente aceptables.
Se proporcionan formulaciones adecuadas para administración transdérmica. Se pueden proporcionar en cualquier formato adecuado, tal como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período prolongado de tiempo. Tales parches contienen el compuesto activo en una solución acuosa opcionalmente tamponada de, por ejemplo, una concentración de 0,1 a 0,2 M con respecto al compuesto activo. Las formulaciones adecuadas para la administración transdérmica también se pueden suministrar mediante iontoforesis (véase, p.ej., Pharmaceutical Research 3(6), 318 (1986)) y típicamente adoptan la forma de una solución acuosa opcionalmente tamponada del compuesto activo.
d. Composiciones para otras vías de administración
Dependiendo de la afección tratada, también se contemplan en la presente memoria otras vías de administración, tales como la aplicación tópica, los parches transdérmicos, la administración oral y rectal. Por ejemplo, las formas de dosificación farmacéutica para administración rectal son supositorios rectales, cápsulas y comprimidos para efecto sistémico. Los supositorios rectales incluyen cuerpos sólidos para inserción en el recto que se funden o ablandan a temperatura corporal liberando uno o más ingredientes farmacológicamente o terapéuticamente activos. Las sustancias farmacéuticamente aceptables utilizadas en supositorios rectales son bases o vehículos y agentes para elevar el punto de fusión. Los ejemplos de bases incluyen manteca de cacao (aceite de theobroma), glicerinagelatina, carbowax (polioxietilenglicol) y mezclas apropiadas de mono-, di-y triglicéridos de ácidos grasos. Se pueden utilizar combinaciones de las diversas bases. Los agentes para elevar el punto de fusión de los supositorios incluyen espermaceti y cera. Los supositorios rectales se pueden preparar mediante el método comprimido o mediante moldeo. El peso típico de un supositorio rectal es de aproximadamente 2 a 3 g. Los comprimidos y las cápsulas para administración rectal se fabrican utilizando la misma sustancia farmacéuticamente aceptable y mediante losmismos métodos que para las formulaciones para administración oral.
Las formulaciones adecuadas para administración rectal se pueden proporcionar como supositorios de dosis unitaria. Estos se pueden preparar mezclando el compuesto activo con uno o más portadores sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y a continuación dando forma a la mezcla resultante.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos
o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (p.ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (p.ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (p.ej., estearato de magnesio, talco
o sílice); disgregantes (p.ej., almidón de patata o sal sódica de glicolato de almidón); o agentes humectantes (p.ej., laurilsulfato de sodio). Los comprimidos se pueden recubrir por medio demétodos bien conocidos en la técnica.
Las formulaciones adecuadas para la administración bucal (sublingual) incluyen, por ejemplo, grageas que contienen el compuesto activo en una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; y pastillas que contienen el compuesto en una base inerte tal como gelatinay glicerina o sacarosa y acacia.
Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar mediante formulaciones de liberación controlada y/o dispositivos de suministro (véanse, p.ej., las Patentes de los Estados Unidos Núm. 3.536.809; 3.598.123; 3.630.200; 3.845.770; 3.847.770; 3.916.899; 4.008.719; 4.687.660; 4.769.027; 5.059.595; 5.073.543; 5.120.548; 5.354.556; 5.591.767; 5.639.476; 5.674.533 y 5.733.566).
Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden utilizar para administrar composiciones seleccionadas, tales como, pero no limitados a, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor y suministro de moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína soluble hialuronidasa u otro agente tal como sistemas de suministro de retrovirus.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los liposomas y/o nanopartículas también pueden emplearse con la administración de las composiciones de la presente invención. Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de dos capas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 μm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 angstroms que contienen una solución acuosa en el núcleo.
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Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras distintas a los liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la razón molar de lípido a agua. A bajas razones, se forman los liposomas. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que altera marcadamente su permeabilidad. La transición de fase implica un cambio de una estructura ordenada estrechamente empaquetada, conocida como estado de gel, a una estructura menos empaquetada, menos apretada, conocida como estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fase característica y da como resultado un aumento en la permeabilidad aiones, azúcares y fármacos.
Los liposomas interactúan con las células a través de diferentes mecanismos: endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea por fuerzas hidrófobas o electrostáticas débiles no específicas, o por interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con la membrana de la célula plasmáticamediante la inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con la liberación simultánea de contenidos liposómicos al citoplasma; y por transferencia de lípidos liposómicos a membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin ninguna asociación del contenido de los liposomas. La variación de la formulación del liposoma puede alterar el mecanismo que es operativo, aunque puede operar más de uno al mismo tiempo. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (con un tamaño de alrededor de 0,1 μm) deben ser diseñadas utilizando polímeros susceptibles de ser degradados in vivo. Las nanopartículas de poli(cianoacrilato) de alquilo biodegradables que cumplen estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invención, y tales partículas se pueden fabricar fácilmente.
2. Cantidades de formulación
Las composiciones se pueden formular para administración de dosificación única o para administración de dosificaciónmúltiple. Los agentes se pueden formular para administración directa.
En las composiciones o combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente memoria en donde el agente antihialuronano es una enzima de degradación de hialuronano tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se formula en una cantidad para administración directa en un intervalo entre o aproximadamente entre 0,5 μg y 50mg, tal como 100 μg y 1 mg, 1 mg y 20 mg, 100 μg y 5 mg, 0,5 μg y 1.450 μg, 1 μg y 1.000 μg, 5 μg y 1.250 μg, 10 μg y 750 μg, 50 μg y 500 μg, 0,5 μg y 500 μg o 500 μg y 1450 μg. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se formula en una cantidad para administración directa en un intervalo entre o aproximadamente entre 15 Unidades (U) o 150 Unidades (U) y 60.000 Unidades por dosis, 300 U y 30.000 U, 500 U y 25.000 U, 500 U y 10.000 U, 150 U y 15.000 U, 150 U y 5.000 U, 500 U y 1.000 U, 5.000 U y 45.000 U, 10.000 U y
50.000 U o 20.000 U y 60.000 U, por ejemplo al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 15 U, 50 U, 100 U, 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1.000 U; 1.250 U; 1.500 U; 2.000 U; 3.000 U;
4.000 U; 5.000 U; 6.000 U; 7.000 U; 8.000 U; 9.000 U; 10.000 U; 20.000 U; 30.000 U; 40.000 U; o 50.000 U. La enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se puede proporcionar en forma de una solución de partida de o aproximadamente de 50 U/mL a 15.000 U/ml, tal como 10 U/mL a 500 U/ml, 1.000 U/mL a 15.000. U/mL, 100 U/mL a 5.000 U/mL, 500 U/mL a 5.000 U/mL o 100 U/mL a 400 U/mL, por ejemplo al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 50 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 1.000 U/mL,
2.000 Unidades/mL, 3.000 U/mL, 4.000 U/mL, 5.000 U/mL, 6.000 U/mL, 7.000 U/mL, 8.000 U/mL, 9.000 U/mL,
10.000 U/mL, 11.000 U/mL, 12.000 U/mL, o 12.800 U/mL. El volumen de la composición puede ser de 0,5 mL a
1.000mL, tal como de0,5 mL a 100 mL, de0,5mL a 10mL, de1 mL a 500mL, de1 mL a 10mL, tal como al menos
o aproximadamente al menos o aproximadamente 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10mL, 15mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL omás. La composición generalmenteseformula demodo quela enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero no se administre a volúmenes superiores a aproximadamente 50 mL, y típicamente se administre a un volumen de 5-30 mL, generalmente en un volumen que no sea superior a aproximadamente 10 mL. Para volúmenes más grandes, el tiempo de infusión se puede adaptar para facilitar el suministro del mayor volumen. Por ejemplo, el tiempo de infusión puede ser de al menos 1 minuto, 5 minutos, 10minutos, 20minutos, 30 minutos, 40minutos, 50minutos, 1 hora omás.
En las composiciones o combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente memoria, el taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina, por ejemplo, paclitaxel unido a albúmina, se formula en una cantidad para administración directa del taxano en un intervalo entre o aproximadamente entre 10 mg a 1000 mg, tal como 20mg y 500 mg, 10 mg y 250 mg, 75mg y 400mg, 100 mg y 200mg, 150 mg y 400 mg, 200 mg y 800 mg, 50 mg y 200 mg o 50 mg y 150 mg. La composición se puede proporcionar como una forma liofilizada para una posterior reconstitución o como una formulación líquida. Por ejemplo, la reconstitución de una formulación líquida puede ser con agua o cloruro sódico al 0,9% u otra solución fisiológica. Cuando se reconstituye o proporciona como una formulación líquida, se puede proporcionar la composición que contiene taxano en la formulación de taxano dirigido a un tumor como una solución de partida de entre o aproximadamente entre 0,01 mg/mL y 100 mg/ml, tal como 1 mg/mL y 50 mg/ml, 2,5 mg/mL y 25 mg/ml, de 5 mg/mL y 15 mg/mL o de 10 mg/mL y 100 mg/ml, por ejemplo al menos o aproximadamente al menos 5 mg/ml. El volumen de la composición puede ser de 0,5 mL a
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1.000mL, tal como de0,5 mL a 100 mL, de0,5mL a 10mL, de1 mL a 500mL, de1 mL a 10mL, tal como al menos
o aproximadamente al menos o aproximadamente 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL o más. El contenido del vial completo se puede retirar para su administración, o se puede dividir en una pluralidad de dosificaciones para una administración múltiple. Para volúmenes más grandes, el tiempo de infusión se puede adaptar para facilitar el suministro del mayor volumen. Por ejemplo, el tiempo de infusión puede ser de al menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora o más. Se entiende que las formulaciones de un taxano pueden contener otros componentes, que incluyen portadores, polímeros, lípidos y otros excipientes. Las dosificaciones proporcionadas anteriormente son con respecto al componente taxano, que es el ingrediente activo.
Por ejemplo, Abraxane®, un paclitaxel unido a albúmina, se formula como una formulación libre de solvente de paclitaxel en la que el paclitaxel se compleja solo con albúmina para formar partículas estables o de aproximadamente 130 nm de tamaño. Cada vial de 50 mL de Abraxane® contiene 100 mg de paclitaxel y aproximadamente 900 mg de albúmina humana en forma de una torta estéril liofilizada. Cada vial se proporciona para ser reconstituido con 20 mL de Inyección de Cloruro de Sodio al 0,9% USP para producir una suspensión que contiene 5 mg/mL de paclitaxel. La suspensión reconstituida de Abraxane se infunde a una dosis recomendada de 260 mg/m2 por víaintravenosa durante 30minutos.
En las composiciones o combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente memoria, el análogo de nucleósido, tal como gemcitabina o un derivado del mismo, se formula en una cantidad para administración directa en un intervalo entre o aproximadamente entre 100 mg y 5.000 mg, tal como 500 mg y 5.000 mg, 500 mg y 2.500 mg, 1.000mg y 2.500 mg, 2.000 mg y 5.000mg o 1.500mgy 2.500 mg, generalmente al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg o 1.000 mg. La composición se puede proporcionar como una forma liofilizada para una posterior reconstitución o como una formulación líquida. Por ejemplo, la reconstitución de una formulación líquida puede ser con agua o cloruro sódico al 0,9% u otra solución fisiológica. Cuando se reconstituye o se proporciona como una formulación líquida, la composición se puede proporcionar como una solución de partida que contiene un análogo de nucleósido de entre o aproximadamente entre 1 mg/mL y 500 mg/ml, tal como 5 mg/mL y 100 mg/ml, 10 mg/mL y 50 mg/ml, 25 mg/mL y 200 mg/mL o 20 mg/mL y 100 mg/ml, por ejemplo al menos o aproximadamente al menos 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/mL, 30 mg/mL o 40 mg/mL, y generalmente no más de 40 mg/mL para minimizar la disolución incompleta. El volumen de la composición puede ser de 0,5 mL a 1.000 mL, tal como de 0,5 mL a 100 mL, de 0,5 mL a 10 mL, de 1 mL a 500 mL, de 1 mL a 10 mL, tal como al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL 200 mL o más. El contenido del vial completo se puede retirar para su administración, o se puede dividir en una pluralidad de dosificaciones para una administración múltiple. Para volúmenes más grandes, el tiempo de infusión se puede adaptar para facilitar el suministro del mayor volumen. Por ejemplo, el tiempo de infusión puede ser de al menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora o más. Tras la retirada de una cantidad de fármaco para su administración, la formulación se puede diluir adicionalmente si se desea, por ejemplo diluir en agua, solución salina (p.ej. 0,9%) u otra solución fisiológica. Se entiende que las formulaciones de un análogo de nucleósido (p.ej. gemcitabina o un derivado) pueden contener otros componentes, incluyendo portadores, polímeros, lípidos y otros excipientes. Las dosificaciones proporcionadas anteriormente son con respecto al componente análogo de nucleósido, que es el ingrediente activo.
Por ejemplo, Gemzar®, gemictabina para inyectables, se proporciona como una formulación liofilizada que contiene 200 mg o 1.000 mg de agente activo por vial. Cada vial se proporciona para ser reconstituido con 5 mL o 25 mL, respectivamente, de Cloruro de Sodio al 0,9% para inyectables USP para producir una suspensión que contiene 40 mg/mL de gemcitabina (lo que representa el volumen de desplazamiento del polvo liofilizado, la concentración reconstituida puede ser o ser de aproximadamente 38 mg/ml). Antes de la administración, la cantidad apropiada de fármaco se puede diluir adicionalmente con cloruro sódico al 0,9% u otra solución fisiológica.
3. Envasado y artículos de fabricación
También se proporcionan artículos de fabricación que contienen materiales de envasado, cualquier composición farmacéutica o la combinación proporcionada en la presente memoria, y una etiqueta que indica que las composiciones y combinaciones se van a utilizar para el tratamiento de cánceres, tales como cánceres de tumores estromales o cánceres de tumores sólidos. Los ejemplos de artículos de fabricación son recipientes que incluyen recipientes de cámara única y de cámara doble.
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Los recipientes incluyen, pero no están limitados a, tubos, frascos y jeringas. Los recipientes pueden incluir adicionalmente una aguja para administración subcutánea.
En un ejemplo, el artículo de fabricación contiene una composición farmacéutica que contiene el agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, y taxano dirigido a un tumor y ningún agente o tratamiento adicional. En otro ejemplo, el artículo de fabricación contiene composiciones farmacéuticas que contienen el agente antihialuronano, por ejemplo, enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, el taxano dirigido a un tumor y un agente quimioterapéutico adicional (p.ej. análogo de nucleósido). En este ejemplo, los agentes se pueden proporcionar juntos o por separado, para su envasado en forma de artículos de fabricación.
Los artículos de fabricación proporcionados en la presente memoria contienen materiales de envasado. Los materiales de envasado para su uso en el envasado de productos farmacéuticos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.323.907, 5.052.558 y
5.033.252. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéuticos incluyen, pero no se limitan a, envase de tipo burbuja, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, botellas y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada ymodo de administración y tratamiento previstos.
La elección del envase depende de los agentes, y de si dichas composiciones se envasarán juntas o por separado. En general, el envase no es reactivo con las composiciones contenidas en el mismo. En otros ejemplos, algunos de los componentes se pueden envasar como una mezcla. En otros ejemplos, todos los componentes se envasan por separado. Por lo tanto, por ejemplo, los componentes se pueden envasar como composiciones separadas que, al mezclarse inmediatamente antes de su administración, se pueden administrar directamente juntas. Alternativamente, los componentes pueden envasarse como composiciones separadas para administración por separado.
Los componentes se pueden envasar en un recipiente. Los componentes se envasan por separado en el mismo recipiente. Generalmente, los ejemplos de tales recipientes incluyen aquellos que tienen un espacio cerrado, definido que contiene la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, y un espacio cerrado, definido y separado que contiene el otros componente o los otros componentes de manera que las zonas posteriores están separadas por una membrana fácilmente extraíble que, después de la eliminación, permite que los componentes se mezclen, o que permite que los componentes se administren por separado. Se contempla cualquier recipiente u otro artículo de fabricación, siempre que los agentes estén separados de los otros componentes antes de la administración. Para realizaciones adecuadas, véanse, por ejemplo, los recipientes descritos en la Patentes de los Estados Unidos Núm. 3.539.794 y 5.171.081.
Las composiciones seleccionadas incluyendo artículos de fabricación de las mismas también se pueden proporcionar en forma de kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente memoria y un elemento para administración proporcionado como artículo de fabricación. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para la aplicación incluyendo dosis, regímenes de dosificación e instrucciones para los modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en la presente memoria y un artículo para diagnóstico.
F. Métodos de evaluación de la actividad, biodisponibilidad y farmacocinética
Los agentes en las composiciones de la presente memoria se pueden evaluar para determinar sus propiedades y actividades. Las propiedades y actividades pueden estar relacionadas con actividades biológicas y/o actividades tumogénicas. Los ensayos se pueden realizar in vitro o in vivo. Tales ensayos pueden incluir, entre otros, la medición de las cantidades de hialuronano en biopsias de tejido o de tumor o de hialuronano soluble en plasma, mediciones de catabolitos de hialuronano en sangre u orina, mediciones de actividad hialuronidasa en plasma o mediciones de presión de líquido intersticial, volumen vascular o contenido de agua en tumores. Los ensayos se pueden utilizar para evaluar los efectos delos agentes, incluyendo los efectos de la dosis y la vía de administración.
1. Ensayos In Vitro a. Actividad hialuronidasa de una enzima de degradación de hialuronano
La actividad de una enzima de degradación de hialuronano puede evaluarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo USP XXII para hialuronidasa determina la actividad indirectamente al medir la cantidad de sustrato, ácido hialurónico, o de hialuronano (HA) no degradada que queda después de que se haya dejado reacciona la enzima con él HA durante 30 minutos a 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Se puede utilizar una Solución Patrón de Referencia de Hialuronidasa (USP) o Hialuronidasa Patrón del Formulario Nacional (NF) en un ensayo para determinar la actividad, en unidades, de cualquier hialuronidasa. En un ejemplo, la actividad se mide utilizando un ensayo demicroturbidez. Éste se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con la albúmina sérica. La actividad semide incubando hialuronidasa con hialuronato sódico (ácido hialurónico) durante un período de tiempo determinado (p.ej., 10 minutos) y a continuación precipitando el hialuronato sódico no digerido con la adición de albúmina sérica acidulada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un período de desarrollo adicional. La disminución de la turbidez resultante de la actividad de la hialuronidasa en el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad enzimática de la hialuronidasa. En otro ejemplo, la actividad hialuronidasa se mide utilizando un ensayo de microtitulación en el que se mide el ácido hialurónico biotinilado residual después de la incubación con hialuronidasa (véase p.ej. Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicación de la Patente de Estados Unidos Núm. 20050260186). Los grupos carboxilo libres en los residuos de ácido glucurónico del ácido hialurónico se biotinilan, y el sustrato de ácido hialurónico biotinilado se acopla covalentemente a una placa de microtitulación. Después de la incubación con hialuronidasa, se detecta el sustrato de ácido hialurónico biotinilado residual utilizando una reacción de avidina-peroxidasa, y se compara con la reacción siguiente obtenida con patrones de hialuronidasa de actividad conocida. También se conocen en la técnica otros ensayos para medir la actividad hialuronidasa y se pueden utilizar en los métodos de la presente memoria (véase p.ej. Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
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También se puede evaluar la capacidad de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble modificada (p.ej., rHuPH20 PEGilada) para actuar como un agente de diseminación o difusión. Por ejemplo, se puede inyectar colorante azul tripán, tal como subcutáneamente o intradérmicamente, con o sin una enzima de degradación de hialuronano en la piel lateral de cada flanco de ratones carentes de sistema inmunitario. A continuación se mide el área teñida, por ejemplo, con un microcalibrador, para determinar la capacidad de la enzima de degradación de hialuronano para actuar como un agente dispersante (véase p.ej. la Patente Publicada de los Estados Unidos Núm. 20060104968). El efecto de la co-administración de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa, con otro agente, tal como un agente quimioterapéutico, sobre las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de ese agente también se puede evaluar in vivo utilizando modelos animales y/o sujetos humanos, tal como en el contexto de un ensayo clínico, como se comentó anteriormente y se demuestra en el Ejemplo 1, a continuación. La actividad funcional de una enzima de degradación de hialuronano que no es una hialuronidasa se puede comparar con una hialuronidasa utilizando cualquiera de estos ensayos. Esto se puede realizar para determinar la cantidad funcionalmente equivalente de una enzima de degradación de hialuronano. Por ejemplo, la capacidad de una enzima de degradación de hialuronano para actuar como un agente de diseminación o difusión se puede evaluar inyectándola (p.ej. por vía subcutánea o intradérmica) en la piel lateral de ratones con azul tripán, y se puede determinar la cantidad requerida para alcanzar la misma cantidad de difusión que, por ejemplo, 100 unidades de un Patrón de Referencia de Hialuronidasa. La cantidad de enzima de degradación de hialuronano requerida es, por lo tanto, funcionalmente equivalente a 100 unidades de hialuronidasa. También se puede medir la conductividad hidráulica (K), por ejemplo en un tumor, antes y después del tratamiento con una enzima de degradación de hialuronano modificada, tal como una hialuronidasa modificada, para evaluar la actividad de una preparación enzimática de degradación de hialuronanomodificada.
Se puede evaluar la capacidad de una enzima de degradación de hialuronano modificada, tal como hialuronidasa modificada, incluyendo hialuronidasa pegilada, para afectar a uno o más de los marcadores asociados con enfermedades y trastornos asociados con hialuronano descritos anteriormente, o cualquier otro marcador o fenotipo asociado, utilizando cualquiera de los uno o más de los ensayos descritos anteriormente. Por ejemplo, se puede evaluar la capacidad de una enzima de degradación de hialuronano modificada, tal como hialuronidasa modificada, para reducir los niveles o contenido de hialuronano, la formación o el tamaño de halos, la presión de líquido intersticial, el contenido de agua y/o el volumen vascular utilizando uno o más de los ensayos anteriores in vitro, ex vivo y/o in vivo. En un ejemplo, se puede administrar una hialuronidasa modificada a un sujeto con un tumor o un modelo animal apropiado y evaluar el efecto sobre los niveles de hialuronano, la formación o el tamaño de los halos, la presión del líquido intersticial, el contenido de agua y/o el volumen vascular y compararlos con sujetos o modelos animales a los que no se ha administrado hialuronidasa modificada. En algunos ejemplos, la hialuronidasa modificada se puede administrar con otro agente, tal como un agente quimioterapéutico.
El experto en la técnica conoce otros ensayos para evaluar la actividad hialuronidasa, incluyendo efectos sobre la síntesis o degradación de HA, que incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los descritos en la presentememoria
o conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayos in vitro que miden la degradación de hialuronano (véase, p.ej. Frost y Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269), tiñendo tejido u otras muestras para HA tal como utilizando una proteína de unión a HA u otro reactivo anti-HA (véase, p.ej. Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899), ensayo de exclusión de partículas (Nishida) et al. 1999; Morohashi et al. (2006) Biochem Biophys. Res. Comm., 345: 1454-1459); midiendo o evaluandola expresión de ARNm de HAS para un gene has (Nishida) et al. 1999).
b.
Actividad de taxano
Se encuentran disponibles procedimientos fisiológicos, farmacológicos y bioquímicos convencionales para someter a ensayo los compuestos para identificar aquellos que poseen una actividad biológica deseada para inhibir la asociación de tubulina. Se pueden utilizar ensayos in vitro e in vivo para evaluar la actividad biológica, tal como la citotoxicidad y la polimerización de tubulina (véase, p.ej. Hidaka et al. (2012) Biosci. Biotechnol. Biochem., 76:349352).
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Por ejemplo, los compuestos de taxano proporcionados en la presente memoria se pueden someter a ensayo en un análisis de estabilización de microtúbulos (Barron et al., (2003) Anal. Biochem., 315:49-56). El ensamblaje de tubulina o su inhibición se pueden controlar en un ensayo de polimerización de tubulina en un formato de absorbancia o fluorescencia. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de polimerización de tubulina basado en densidad óptica, ya que la concentración de un polímero de microtúbulos es proporcional a la medida de la luz dispersada por los microtúbulos. Un ejemplo de tal ensayo es el Ensayo HTS de polimerización de Tubulina (Núm. de catálogo BK004P o BK006P; Cytoskeleton, Denver, CO). También se puede utilizar un ensayo basado en fluorescencia, mediante el cual la polimerización es seguida por una potenciación de la fluorescencia debida a la incorporación de un indicador fluorescente a los microtúbulos (Núm. de catálogo BK011P, Cytoskeleton, Denver). En tales ensayos, la tubulina puede incubarse con un compuesto de taxano, tal como paclitaxel, vinblastina o docetaxel, y la polimerización se puede medir a lo largo del tiempo. Por ejemplo, en un ensayo de fluorescencia, la polimerización puede medirse controlando los cambios de la fluorescencia a una excitación a 360 nm y emisión a 420 nm. El ensamblaje de tubulina también se puede controlar mediante dispersión de la luz, que se aproxima mediante la absorción aparente a 350 nm. En el ensayo, generalmente se emplea albúmina de suero bovino (BSA) para prevenir la agregación. Además, el glicerol, que es un potenciador de la polimerización de tubulina, se omite para aumentar la razón señal/ruido. Como control, se puede utilizar el fármaco desestabilizante de microtúbulos, vinblastina, que estabiliza la tubulina y no afecta la despolimerización.
c. Actividad anticancerosa
La actividad anticancerosa de los compuestos y agentes descritos en la presente memoria, incluyendo la enzima de degradación de hialuronano, el taxano dirigido al tumor y/u otro agente quimioterapéutico (p.ej. análogo de nucleósido) y sus formulaciones puede examinar in vitro, por ejemplo, incubando un cultivo de células cancerosas con el derivado, y a continuación evaluando la inhibición del crecimiento celular en el cultivo. Las células adecuadas para tales pruebas incluyen células de leucemia P388 murina, de melanoma B16 y de cáncer de pulmón de Lewis, así como células de cáncer MCF7 mamarios humano, OVCAR-3 de ovario y A549 de pulmón, MX-1 (células de tumor de mama humano), HT29 (línea celular de cáncer de colon), HepG2 (líneas celulares de cáncer de hígado) y HCT116 (líneas celulares de cáncer de colon).
2. Modelos animales in vivo
Se pueden utilizar modelos animales para evaluar los efectos de las composiciones o combinaciones proporcionadas en la presente memoria sobre los niveles o contenido de hialuronano, la presión del líquido intersticial, el contenido de agua, el volumen vascular y el tamaño, volumen o crecimiento del tumor. Además, los modelos animales se pueden utilizar para evaluar la farmacocinética o la tolerabilidad de las composiciones o combinaciones.
Los modelos animales pueden incluir, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, perros, cobayas y modelos de primates no humanos, tales como monos cinomolgos o macacos rhesus. Los modelos animales incluyen modelos genéticos y modelos de xenoinjerto. Por ejemplo, los modelos de xenoinjerto incluyen aquellos en los que, antes de someter a ensayo los agentes, se pueden establecer tumores en animales de ensayo adecuados, p.ej., ratones carentes de sistema inmunitario. En algunos ejemplos, a los ratones inmunodeficientes, tales como ratones carentes de sistema inmunitario o ratones SCID, se les trasplanta una línea celular tumoral, tal como un cáncer asociado a hialuronano, para establecer un modelo animal de ese cáncer. Líneas celulares ilustrativas, que incluyen cánceres asociados a hialuronano, incluyen, pero no se limitan a, células de carcinoma de próstata PC3, células de adenocarcinoma de páncreas BxPC-3, células de carcinoma de mama MDA-MB-231, células de tumor de mama MCF-7, células de tumor de mama BT474, células de tumor de próstata Tramp C2 y células de cáncer de próstata Mat-LyLu, y otras líneas celulares descritas en la presente memoria que están asociadas con hialuronano, p.ej. contienen niveles elevados de hialuronano. Un ejemplo de un modelo de tumor animal de cáncer de páncreas implica la generación de tumores en animales utilizando células de adenocarcinoma de páncreas BxPC-3 (véase p.ej. Von Hoff et al. (2011) J. Clin. Oncol., 29:4548-54).
También se pueden utilizar modelos genéticos en los que los animales se han vuelto deficientes en uno o más genes que dan como resultado la generación o formación de tumores. Tales modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) pueden recapitular las características moleculares y clínicas de la enfermedad. Por ejemplo, un modelo genético ilustrativo de cáncer de páncreas implica la expresión pancreática específica de mutantes endógenos de los alelos Kras y Trp53, lo que da como resultado ratones mutantes que exhiben un fenotipo deficiente (denominado ratones KPC; LSL-KrasG12D, LSL-Trp53R172H, Pdx-1-Cre). Los ratones KPC desarrollan tumores pancreáticos primarios que exhiben características similares a la enfermedad humana, incluyendo la resistencia al análogo de nucleósido gemcitabina (véase p.ej. Frese et al. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269).
Las composiciones o combinaciones proporcionadas en la presente memoria se pueden administrar a los ratones para evaluar los efectos sobre la enfermedad. Por ejemplo, se pueden evaluar o medir los niveles de hialuronano. En otro ejemplo, se pueden evaluar los efectos sobre el crecimiento tumoral o la inhibición de células tumorales. Por ejemplo, se pueden determinar los valores de DE50, es decir, la cantidad de agente o agentes requeridos para lograr una inhibición de 50% del crecimiento tumoral en el animal. También se pueden determinar las tasas de supervivencia.
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3. Farmacocinética y tolerabilidad
Los estudios farmacocinéticos y de tolerabilidad se pueden realizar utilizando modelos animales o se pueden realizar durante los estudios clínicos con pacientes para evaluar el efecto de las combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria. Los modelos animales incluyen, pero no se limitan a, modelos de ratones, ratas, conejos, perros, cobayas y primates no humanos, tales como monos cinomolgos o macacos rhesus. En algunos casos, los estudios farmacocinéticos y de tolerabilidad se realizan con animales sanos. En otros ejemplos, los estudios se realizan utilizando modelos animales de una enfermedad para la cual se considera la terapia con una combinación o composición dela presente memoria, tal como modelos animales de cáncer.
Las propiedades farmacocinéticas de las combinaciones o composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden evaluar midiendo parámetros tales como la concentración máxima (pico) del agente quimioterapéutico (Cmáx), el tiempo pico (es decir, cuando se produce la concentración máxima del agente quimioterapéutico; Tmax), la concentración mínima del agente quimioterapéutico (es decir, la concentración mínima entre dosis de agente quimioterapéutico; Cmin), la semivida de eliminación (T1/2) y el área bajo la curva (es decir, el área bajo la curva generada al representar el tiempo frente a la concentración; AUC), después dela administración. En los casos en los que el agente quimioterapéutico se administra por vía subcutánea, la biodisponibilidad absoluta del agente se determina comparando el área bajo la curva del agente quimioterapéutico después del suministro subcutáneo (AUCsc) con el AUC del agente quimioterapéutico después del suministro intravenoso (AUCiv). La biodisponibilidad absoluta (F) se puede calcular con la fórmula: F = ([AUC]sc ×dosissc) / ([AUC]iv × dosisiv) La concentración de agente quimioterapéutico en el plasma después de la administración subcutánea se puede medir utilizando cualquier método conocido en la técnica adecuado para evaluar concentraciones de agente quimioterapéutico en muestras de sangre.
Se puede administrar un intervalo de dosis y una frecuencia de dosificación diferente en los estudios de farmacocinética para evaluar el efecto del aumento o disminución de las concentraciones del agente coadministrado (p.ej., análogo de nucleósido). Las propiedades farmacocinéticas de los agentes quimioterapéuticos administrados por vía subcutánea, tales como la biodisponibilidad, también se pueden evaluar con o sin co-administración de enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y/o taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, se puede administrar a perros, tales como Beagles, un tratamiento quimioterapéutico (p.ej. análogo de nucleósido tal como gemcitabina) combinado con enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y/o taxano dirigido a un tumor, o solo, utilizando una o más vías de administración. Tales estudios se pueden realizar para evaluar el efecto de la co-administración con un agente antihialuronano, como una hialuronidasa, sobre propiedades farmacocinéticas, tales como la biodisponibilidad, de agentes quimioterapéuticos.
Los estudios para evaluar la seguridad y la tolerabilidad también se conocen en la técnica y se pueden utilizar en la presente memoria. Después de la administración de la combinación y las composiciones de la presente invención, se puede controlar el desarrollo de cualquier reacción adversa. Las reacciones adversas pueden incluir, pero no se limitan a, reacciones en el sitio de inyección, tales como edema o hinchazón, dolor de cabeza, fiebre, fatiga, escalofríos, sofocos, mareos, urticaria, sibilancias u opresión en el pecho, náuseas, vómitos, temblores, dolor de espalda, dolor de pecho, calambres musculares, ataques o convulsiones, cambios en la presión sanguínea y respuestas anafilácticas o de hipersensibilidad severa. Típicamente, se debe administrar un intervalo de dosis y diferentes frecuencias de dosificación en los estudios de seguridad y tolerabilidad para evaluar el efecto de concentraciones crecientes o decrecientes de agente quimioterapéutico y/o agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, y/o taxano dirigido a un tumor en la dosis.
G. Métodos y usos dela terapia combinada
Las combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden utilizar en métodos de terapia para tratar cánceres, y en particular cánceres de tumores sólidos. En los métodos, se administra una terapia combinada de un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p.ej., una hialuronidasa, tal como una PH20, por ejemplo PEGPH20) y una formulación de taxano (p.ej., una formulación de taxano unida a albúmina) a un sujeto que tiene un tumor sólido. En algunos ejemplos, también se puede administrar otro agente análogo de nucleósido, y en particular un agente análogo de nucleósido que es un tratamiento para tumores sólidos y/o es susceptible de inhibición por desaminación (p.ej., gemcitabina o derivado de la misma). Según se encuentra en la presente memoria, la cantidad intratumoral de un análogo de nucleósido, y por lo tanto los efectos citotóxicos del mismo, en un régimen combinado con una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y una formulación de taxano excede ampliamente los efectos obtenidos cuando el análogo de nucleósido se administra con solo uno de los agentes (es decir, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero o la formulación de taxano). Por ejemplo, los efectos pueden ser sinérgicos. La extensión y el nivel de la actividad intratumoral del análogo de nucleósido observada en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria logran resultados que hasta ahora no se han logrado con las terapias existentes, incluyen aumento de la eficacia y la supervivencia que superan los regímenes de tratamiento existentes.
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1. Cánceres
La terapia combinada de un agente antihialuronano, p.ej. la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, la formulación de taxano y/o un análogo de nucleósido se puede utilizar para el tratamiento de células cancerosas, neoplasias, tumores y metástasis. La terapia combinada proporcionada en la presente memoria exhibe eficacia antitumoral y da como resultado una ralentización o reducción del crecimiento tumoral, una disminución del volumen tumoral y, en algunos casos, la eliminación o erradicación del tumor. La terapia combinada da como resultado una mayor supervivencia de los sujetos en comparación con los sujetos tratados con los mismos agentes que una terapia combinada simple o doble. Para cánceres como el cáncer de páncreas que son difíciles de tratar, la terapia combinada proporciona beneficios significativos en comparación con los métodos existentes.
Por ejemplo, la terapia combinada se puede utilizar para tratar un tumor sólido, tal como el de pulmón y bronquio, mama, colon y recto, riñón, estómago, esófago, hígado y conducto biliar intrahepático, vejiga urinaria, cerebro y otros cánceres del sistema nervioso, cabeza y cuello, cavidad oral y faringe, cuello uterino, cuerpo uterino, tiroides, ovario, testículos, próstata, melanoma maligno, colangiocarcinoma, timoma, de piel no melanoma, así como tumores hematológicos y/o tumores malignos, tales como la leucemia infantil y linfomas, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfomas de origen linfocítico y cutáneo, leucemia aguda y crónica, tal como leucemia linfoblástica aguda, mielocítica aguda o mielocítica crónica, neoplasia de células plasmáticas, neoplasia linfoide y cánceres asociados con el SIDA. Típicamente, la terapia combinada se utiliza para el tratamiento de tumores sólidos, por ejemplo, cánceres estromales de tumores sólidos. Los ejemplos de tumores incluyen, por ejemplo, tumores pancreáticos, tumores ováricos, tumores pulmonares, tumores de colon, tumores de próstata, tumores cervicales y tumores de mama.
En particular, los cánceres pueden ser cánceres ricos en hialuronano que son adecuados para el direccionamiento por un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano. Se han identificado diversos cánceres ricos en hialuronano. Los tumores ricos en hialuronano incluyen, pero no se limitan a, cáncer de próstata, mama, colon, ovario, estómago, cabeza y cuello y otros tumores y cánceres. En algunos casos, los niveles de hialuronano se correlacionan con un mal pronóstico, por ejemplo, disminución de la tasa de supervivencia y/o tasa de supervivencia libre de recurrencia, metástasis, angiogénesis, invasión de células cancerosas en otros tejidos/zonas y otros indicadores de mal pronóstico. Tal correlación ha sido observada, por ejemplo, en tumores ricos en hialuronano incluyendo cáncer de ovario, SCC, ISC, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de páncreas (véanse, por ejemplo, Anttila et al., (2000) Cancer Research, 60:150-155; Karvinen et al., (2003) British Journal of Dermatology, 148:86-94; Lipponen et al., (2001) Eur. Journal of Cáncer, 849-856; Pirinen et al., (2001) Int. J. Cancer: 95:12-17; Auvinen et al., (2000) American Journal of Pathology, 156(2):529-536; Ropponen et al., (1998) Cancer Research, 58:342-347). Por lo tanto, los cánceres ricos en hialuronano se pueden tratar mediante la administración de un agente antihialuronano, tal como una hialuronidasa, para tratar uno omás síntomas del cáncer.
En ejemplos de tratamiento de cánceres ricos en hialuronano, el agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, puede actuar como un agente terapéutico por sí mismo y/o puede potenciar la actividad de otras terapias combinadas o coadministradas. Por ejemplo, las enzimas que degradan el hialuronano, tales como la hialuronidasa, tienen efectos anticarcinogénicos directos cuando se inyectan en los tumores. La hialuronidasa previene el crecimiento de tumores trasplantados a ratones (De Maeyer et al., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660) e inhibe la formación de tumores tras la exposición a carcinógenos (Pawlowski et al. (1979) Int. J. Cancer 23:105-109. La hialuronidasa es efectiva como único agente terapéutico en el tratamiento del cáncer de cerebro (gliomas) (véase, la Publicación de PatenteInternacional Núm.WO198802261).
Los agentes antihialuronano, tales como las enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo las hialuronidasas, también se pueden utilizar para aumentar el suministro de agentes quimioterapéuticos a los tumores. La enzima de degradación de hialuronano se puede administrar combinada con, por ejemplo, simultáneamente o antes de, uno o más agentes quimioterapéuticos u otros agentes o tratamientos anticancerosos (p.ej., tratamiento con una formulación de taxano y/o tratamiento con un análogo de nucleósido). En algunos casos, las enzimas pueden aumentar la sensibilidad de los tumores que son resistentes a la quimioterapia convencional. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo hialuronidasas, como rHuPH20, se pueden administrar a un paciente en una cantidad eficaz para aumentar la difusión alrededor del sitio del tumor (p.ej., para facilitar la circulación y/o concentraciones de agentes quimioterapéuticos en y alrededor del sitio del tumor), inhibir la motilidad de las células tumorales, tal como mediante la degradación del ácido hialurónico, y/o disminuir el umbral de apoptosis de las células tumorales. Esto puede llevar a las tumorales a un estado de anoikis, lo que hace que la célula tumoral sea más susceptible a la acción de agentes quimioterapéuticos. La administración de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa, puede inducir la capacidad de respuesta de tumores del páncreas, estómago, colon, ovarios y mama previamente resistentes a la quimioterapia (Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390). La enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa, típicamente mejora la penetración de agentes quimioterapéuticos u otros agentes anticancerosos en tumores sólidos, tratando así la enfermedad.
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Selección de sujetos para el tratamiento
Los métodos incluyen etapas para seleccionar sujetos para el tratamiento que tienen un tumor o cáncer asociados a hialuronano. Tales métodos incluyen métodos para detectar marcadores de enfermedad asociados a hialuronano, que incluyen cualquier indicación de que un sujeto tiene una enfermedad asociada a hialuronano, que es probable que el sujeto responda al tratamiento por un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, y/o que una muestra del sujeto, tal como un tejido, célula o fluido, contiene una expresión de hialuronano elevada. Los ensayos ilustrativos para detectar marcadores se describen a continuación e incluyen ensayos para medir el nivel de HA y/o niveles de HA relativos en una muestra de un sujeto, ensayos para analizar los efectos de enzimas de degradación de hialuronano en una muestra del sujeto y ensayos para medir lecturas típicamente asociada con ciertas enfermedades/afecciones asociadas con hialuronano, tales como baja expresión o actividad de hialuronidasa, alta presión de líquido intersticial, volumen vascular y contenido de agua. En general, se puede utilizar cualquier ensayo conocido para la detección de proteínas o ácidos nucleicos en muestras de sujetos,
o para evaluar los efectos del tratamiento en células/tejidos in vitro.
Los sujetos seleccionados para el tratamiento en los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen sujetos que tienen niveles elevados, aberrantes o acumulados de hialuronano en comparación con sujetos que no tienen la enfermedad o afección o en comparación con tejidos o muestras normales que no tienen expresión elevada, aberrante o acumulada de HA. Se puede someter a ensayo cualquier muestra o tejido de un sujeto y comparar con una muestra o tejido normal. Los niveles de hialuronano se pueden medir a partir de cualquier fuente tal como a partir de un tejido (p.ej., mediante biopsia), tumor, células, o a partir de sangre, suero, orina u otros fluidos corporales. Por ejemplo, como se describe en otra parte en la presente memoria, los perfiles de depósito de HA en tumores sólidos se han categorizado generalmente como pericelulares o estromales. Se han observado niveles elevados de HA en plasma, sobre todo en pacientes con tumor de Wilms, mesotelioma y metástasis hepáticas. Por lo tanto, dependiendo de la enfermedad o afección, se puede medir una muestra diferente para determinar los niveles de hialuronano. La elección de la muestra está dentro del nivel de un experto en la técnica.
El ensayo utilizado para medir los niveles de sustrato de hialuronidasa está en función de la enfermedad o afección y se puede seleccionar basándose en la enfermedad o afección concretas. Un experto en la técnica está familiarizado con los métodos de detección de hialuronano, que incluyen, pero no se limitan a, métodos de inmunohistoquímica o métodos de ELISA.
En un ejemplo, la etapa para detectar marcadores se realiza antes de tratar a un sujeto, por ejemplo, para determinar si el sujeto tiene una afección o enfermedad asociada con hialuronano que será susceptible de tratamiento con una enzima de degradación de hialuronano. En este ejemplo, si el marcador es detectado (p.ej. si se determina que una célula, tejido o fluido del paciente contiene una expresión elevada de hialuronano o responde a la enzima de degradación de hialuronano), se realiza una etapa de tratamiento, donde se administra al sujeto una enzima de degradación de hialuronano. En un ejemplo, cuando el marcador no se detecta (p.ej. si se determina que una célula, tejido o fluido del paciente contiene expresión de hialuronano normal o no elevada o no responde a la enzima de degradación de hialuronano), se puede seleccionar otra opción detratamiento.
En otro ejemplo, la etapa para detectar marcadores se realiza después de tratar a un sujeto, o durante el curso del tratamiento del sujeto, (p.ej. tratamiento con el agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano (p.ej. hialuronidasa modificada soluble) (con o sin un agente coadministrado)), por ejemplo, para determinar si el tratamiento con el agente antihialuronano está teniendo un efecto en el tratamiento de la enfermedad o afección. En uno de esos ejemplos, el marcador no se detecta o se detecta en una cantidad o nivel relativo que disminuye en comparación con la cantidad/nivel antes del tratamiento, o en comparación con otra muestra, el tratamiento continúa, se realiza otra ronda de tratamiento, o se inicia otro tratamiento, tal como una terapia combinada. En otro ejemplo similar, si el marcador se detecta al mismo nivel que antes del tratamiento u otra muestra, se puede seleccionar otra opción de tratamiento.
Los ensayos para detectar marcadores de enfermedades y afecciones asociadas a hialuronano incluyen ensayos para medir la cantidad (p.ej. cantidad relativa) de expresión de hialuronano y/o hialuronidasa en un tejido, célula y/o fluido corporal de un sujeto, por ejemplo, un tumor. Entre estos ensayos están incluidos aquellos que pueden detectar la expresión de HA, la expresión de Hialuronano sintasa 1 (HAS1), expresión de Hialuronano sintasa 2 (HAS2), expresión de Hialuronano sintasa 3 (HAS3), la presencia de HALO (regiones de matriz pericelular que son ricas en proteoglicanos, incluyendo hialuronano) y la presencia de enzimas de degradación de hialuronano, tales como hialuronidasas, por ejemplo, en muestras del sujeto.
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Los ensayos para detectar niveles de proteína y ácido nucleico son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar en los métodos de la presente memoria para medir la expresión de hialuronano, hialuronano sintasa u otra proteína y/o ácido nucleico. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, ELISA, SDS-PAGE, transferencia Western, PCR, RT-PCR, inmunohistoquímica, histología y citometría de flujo. Por ejemplo, una muestra de un sujeto, tal como una muestra de tejido (p.ej. una biopsia de un tumor de un paciente o modelo animal, una muestra estromal), un fluido (p.ej. sangre, orina, plasma, saliva u otra muestra), una célula o muestra celular, o extracto, u otra muestra, se pueden teñir con anticuerpos anti-HA o proteínas de unión a HA, por ejemplo, utilizando tinción histológica, tal como inmunohistoquímica (IHC) de secciones de tejido fijas o congeladas, para determinar la presencia y extensión de hialuronano en el tejido o muestra, o tinción celular inmunofluorescente, ensayos de interacción y precipitación y citometría de flujo. En otro ejemplo, la muestra, p.ej. biopsia, se puede analizar mediante RT-PCR para evaluar la cantidad de ARNm de HA.
Los métodos conocidos para la detección de la expresión de hialuronano en el cáncer incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de tipo ELISA descrito por Lokeshwar et al., (1997) en Cancer Res. 57:773-777, para medir los niveles de HA en orina o extractos de tejido de vejiga de sujetos que tienen cáncer de vejiga. Para el ensayo, la orina o los extractos se aplican como recubrimiento sobre placas de micropocillos (también se aplica como recubrimiento el HA de cordón umbilical utilizado como patrón), seguido de incubación (p.ej. 16 horas, temperatura ambiente) con una proteína de unión a HA marcada (p.ej. biotinilada), tal como las descritas en la presente memoria, se lava y se cuantifica la proteína de unión a HA unida a los pocillos utilizando un sustrato de agente de detección de avidinabiotina. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. En un ejemplo, la orina de un sujeto con un cáncer de vejiga asociado a HA contenía niveles de HA que se elevaron 2-9 veces en comparación con la orina/extractos de pacientes normales (sujetos sanos o sujetos con otras enfermedades o afecciones gastrourinarias); por lo tanto, el marcador se detectaría si los niveles de HA en la orina fueran elevados en comparación con los sujetos normales, p.ej. una elevación entre o aproximadamente 2 veces y 9 veces o aproximadamente 9 veces, p.ej. una elevación de
o aproximadamente de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces en comparación con el sujeto normal.
En un ejemplo adicional, la expresión y producción de hialuronano en células tumorales in vitro se puede evaluar utilizando cualquiera de los métodos descritos anteriormente. De forma similar, la producción de hialuronano sintasa (p.ej., HAS1, HAS2 o HAS3) y/o la expresión por células in vitro, ex vivo o in vivo también se pueden someter a ensayo, por ejemplo, mediante ELISA, SDS-PAGE, transferencia Western, PCR, RT-PCR, inmunohistoquímica, histología o citometría de flujo.
En otro ejemplo, se determina la cantidad de actividad hialuronidasa en una muestra del sujeto, por ejemplo en sangre o plasma por ejemplo con un ensayo de turbidez.
En otro ejemplo, se aísla una célula u otro tejido de un paciente, p.ej. una célula tumoral, y se utiliza en un estudio para determinar si la célula o el tejido responden al tratamiento con la enzima de degradación de hialuronano in vitro, por ejemplo, utilizando un ensayo clonogénico o cualquier otro ensayo para medir el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de células o tejidos, tales como células tumorales, en respuesta al tratamiento. Por ejemplo, las células cancerosas de un sujeto pueden sembrarse en la superficie, tal como una matriz extracelular o una mezcla de proteínas, tal como la mezcla comercializada con el nombre comercial Matrigel® (BD Biosciences). En este ejemplo, el marcador asociado a hialuronano es la sensibilidad de la célula o tejido a la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En este ejemplo, si se inhibe o bloquea cualquier propiedad, tal como proliferación, crecimiento o supervivencia de las células mediante la adición de enzima de degradación de hialuronano, se determina que el sujeto puede ser susceptible de tratamiento con composiciones que contienen enzimas de degradación de hialuronano.
Además de los ensayos para determinar los niveles de expresión del hialuronano, se pueden utilizar otros ensayos para seleccionar un sujeto para el tratamiento y/o para evaluar la eficacia y/o la duración del tratamiento. La presión del líquido intersticial (PLI) se puede medir utilizando una sonda o aparato apropiado. Por ejemplo, se puede utilizar un catéter con punta transductora para medir la PLI en tejidos cancerosos u otros tejidos de interés. El catéter pasa a través del orificio interno de una aguja quirúrgica, que a continuación se inserta en el centro del tumor. La aguja se retira mientras el catéter se mantiene en posición. La PLI (mmHg) se puede medir a continuación utilizando una unidad de adquisición de datos apropiada (Ozerdem et al. (2005) Microvasc. Res. 70:116-120). Otros métodos para medir la PLI incluyen el método demecha en aguja "wick-in-needle" (Fadnes et al. (1977) Microvasc. Res. 14:27-36).
El volumen vascular se puede medir, por ejemplo, utilizando imágenes de ultrasonido. Este método emplea microburbujas hiper-ecoicas para proporcionar las fuertes reflexiones de ondas de ultrasonido que se detectan. Las microburbujas, cuando se inyectan, por ejemplo intravenosamente, a un sujeto o modelo animal, semueven a través del espacio vascular debido a su tamaño. Los ensayos para evaluar el contenido de agua en el tejido, tal como el contenido de agua del tejido tumoral, también son conocidosen la técnica. Por ejemplo, las muestras de un tumor se pueden cosechar, transferir, pesar y congelar rápidamente antes de ser liofilizadas. El peso de agua es referido a
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continuación comola razón de peso detejido húmedo con respecto a peso seco (es decir, liofilizado).
La capacidad de una célula tumoral para formar matrices pericelulares (halos) in vitro se puede evaluar utilizando un ensayo de exclusión de partículas. Se pueden añadir pequeñas partículas (glóbulos rojos fijados con formalina) a cultivos de células tumorales de baja densidad en presencia, por ejemplo, de agrecano, que es un gran proteoglicano de condroitín sulfato de agregación. Después de que las partículas se sedimentan, los cultivos se pueden observar a 400 aumentos para determinar si las células tumorales formaron halos. Esto se puede visualizar como zonas alrededor de las células delas cuales se excluyen las partículas.
Para cualquiera de los métodos de detección, el marcador (p.ej. expresión de HA, sensibilidad a la enzima de degradación de hialuronano, expresión de HA-sintasa o actividad hialuronidasa) típicamente se compara con una muestra de control, de manera que la detección del marcador incluye típicamente la determinación de que la lectura es elevada o reducida en comparación con lamuestra de control.
Por ejemplo, la muestra de control puede ser otro tejido, célula o fluido corporal, tal como un tejido normal, célula o fluido corporal, por ejemplo, un tejido, célula o fluido corporal que es análogo a la muestra que se somete a ensayo, pero aislada de un sujeto diferente, tal como un sujeto que es normal (es decir, no tiene una enfermedad o afección,
o no tiene el tipo de enfermedad o afección que tiene el sujeto que se está sometiendo a ensayo), por ejemplo, un sujeto que no tiene un enfermedad o afección asociada hialuronano, o un tejido análogo de otro sujeto que tiene una enfermedad o afección similar, pero cuya enfermedad no es tan grave y/o no está asociada con hialuronano o expresa relativamente menos hialuronano y, por lo tanto, está asociada a hialuronano en menor grado. Por ejemplo, cuando la célula, tejido o fluido que se están evaluando son un sujeto que tiene cáncer, se pueden comparar con un tejido, célula o fluido de un sujeto que tiene un cáncer menos grave, tal como un cáncer en fase temprana, diferenciado u otro tipo de cáncer. En otro ejemplo, la muestra de control es un fluido, tejido, extracto (p.ej. extracto celular o nuclear), ácido nucleico o preparación de péptidos, línea celular, biopsia, patrón u otra muestra, con una cantidad conocida o cantidad relativa de HA, tal como una muestra, por ejemplo una línea celular tumoral, que se sabe que expresa niveles relativamente bajos de HA, tales como líneas celulares tumorales ilustrativas descritas en la presentememoria que expresan bajos niveles de HA, por ejemplo, la línea celular HCT 116, la línea celular HT29, la línea celular NCI H460, la línea celular DU145, la línea celular Capan-1, y tumores de modelos tumorales generados utilizando tales líneas celulares.
Se entiende que el cambio particular, p.ej. aumentar o disminuir HA, depende del ensayo utilizado. Por ejemplo, en un ELISA, la multiplicidad de aumento o disminución de la absorbancia a una longitud de onda concreta o de la cantidad de proteína (p.ej. según se determina al utilizar una curva patrón) se puede expresarse con respecto a un control. En un ensayo de PCR, como la RT-PCR, se puede comparar con los niveles de expresión de control (p.ej. expresados como multplicidad de cambio) utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como el uso de patrones.
Por ejemplo, cuando se somete a ensayo la cantidad de hialuronano en una muestra de un sujeto, la detección del marcador puede determinar que la cantidad de HA en la muestra (p.ej. célula, tejido o fluido cancerosos) del sujeto es elevada en comparación con una muestra de control, tal como una muestra de control descrita en el párrafo anterior. En un ejemplo, se determina que el cáncer es un cáncer rico en hialuronano si la cantidad de HA en el tejido, la célula o el líquido está elevada en aproximadamente 0,5 veces, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 20 veces, o más, en comparación con la muestra de control, que puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, un fluido, tejido, extracto (p.ej. extracto celular o nuclear), ácido nucleico o preparación de péptidos, línea celular, biopsia, patrón u otra muestra, con una cantidad conocida o cantidad relativa de HA, tal como una muestra, por ejemplo una línea celular tumoral, que se sabe que expresa niveles relativamente bajos de HA, tales como líneas celulares tumorales ilustrativas descritas en la presente memoria que expresan bajos niveles de HA, por ejemplo, la línea celular HCT 116, la línea celular HT29, la línea celular NCI H460, la línea celular DU145, la línea celular Capan-1, y tumores de modelos tumorales generados utilizando tales líneas celulares.
Además, en tales métodos, el nivel de hialuronano asociado a células puede calificarse como bajo, moderado o alto. Por ejemplo, la expresión de HA se considera alta omoderada si 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o más del área tumoral muestra señal de HA persistente. Típicamente, el tratamiento de sujetos con HA al menos demoderado a alto se contempla en la presentememoria.
2. Dosificación y administración
La terapia combinada proporcionada en la presente memoria que contiene un agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano y un taxano dirigido a un tumor, y opcionalmente un análogo de nucleósido combinado adicionalmente, se administra en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil. Típicamente, los agentes activos se administran en una cantidad que no da como resultado efectos secundarios indeseables del paciente que se está tratando, o que minimiza o reduce los efectos secundarios observados en comparación con las dosificaciones y cantidades requeridas para un único tratamiento con uno de los agentes anteriores. Por ejemplo, como se describe en otra parte de la presente memoria, se encuentra en la presente memoria que la terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y un taxano dirigido a un tumor da como resultado un aumento del suministro intratumoral y un aumento de la semivida intratumoral de un análogo de nucleósido coadministrado, p.ej. una gemcitabina. Por lo tanto, la cantidad de un análogo de nucleósido (p.ej. gemcitabina) que se puede administrar en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria, en comparación con las cantidades de un análogo de nucleósido administrado utilizando métodos de la técnica anterior (p.ej. gemcitabina en monoterapia o doble terapia junto con otro agente) se reduce, mientras se logra sustancialmente una eficacia terapéutica igual o mejorada. En virtud de la disminución de la dosis que se administra, los efectos secundarios asociados con la administración del análogo de nucleósido (p.ej. gemcitabina), tal como inmunosupresión o mielosupresión, se reducen, minimizan o evitan.
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Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar las cantidades precisas de agentes activos, incluyendo el agente antihialuronano, por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, taxano dirigido a un tumor y, opcionalmente, un análogo de nucleósido, que se va a administrar a un sujeto. Por ejemplo, tales agentes y usos para el tratamiento de enfermedades y afecciones, tales como cánceres y tumores sólidos, son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, las dosis de tales agentes en una composición o terapia combinada se pueden seleccionar basándose en regímenes de dosificación convencionales para ese agente bajo una ruta de administración dada.
Se entiende que la dosificación y la duración del tratamiento precisas son una función del tejido o tumor que se están tratando y se pueden determinar empíricamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o mediante extrapolación a partir de datos de ensayo in vivo o in vitro y/o se pueden determinar a partir de los regímenes de dosificación conocidos del agente concreto. Cabe señalar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la edad del individuo tratado, el peso del individuo, la vía de administración y/o la extensión o gravedad de la enfermedad y otros factores a considerar que están dentro del nivel de un facultativo cualificado. En general, los regímenes de dosificación se eligen para limitar la toxicidad. Cabe señalar que el médico a cargo sabría cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la terapia a una dosis menor debido a la toxicidad, o disfunciones de la médula ósea, el hígado o el riñón u otros tejidos. Por el contrario, el médico a cargo también sabría cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica no fuera la adecuada (lo que excluye los efectos secundarios tóxicos). Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto concreto, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las formulaciones, y que los intervalos de concentración establecidos en la presente memoria son meramente ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de lamisma.
Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como una hialuronidasa, por ejemplo, una PH20 (p.ej. PEGPH20), se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz para degradar o escindir el hialuronano asociado al tumor. La cantidad de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, que se va a administrar para el tratamiento de una enfermedad o afección, por ejemplo un cáncer o tumor sólido tal como un tumor rico en HA, se puede determinar mediantetécnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosificación precisa, que se puede determinar empíricamente, puede depender de la enzima concreta, la vía de administración, el tipo de enfermedad que se vaya a tratar y la gravedad de la enfermedad. El intervalo de dosificación ilustrativo es de aproximadamente 50 unidades a 50.000.000 de unidades de una enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero, o una cantidad funcionalmente equivalente de otra enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero. En la presente memoria se entiende que una unidad de actividad se normaliza a una actividad convencional, por ejemplo, una actividad medida en un ensayo de microturbidez que analiza la actividad hialuronidasa.
Así, por ejemplo, una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo, una PH20, conjugada con un polímero, por ejemplo, un PEG, se puede administrar a una cantidad de o de aproximadamente 10 a 50.000.000 de Unidades, 10 a 40.000.000 de Unidades, 10 a 36.000.000 de Unidades, 10 a 12.000.000 de Unidades, 10 a 1.200.000 Unidades, 10 a 1.000.000 de Unidades, 10 a 500.000 Unidades, 100 a 100.000 Unidades, 500 a 50.000 Unidades, 1000 a 10.000 Unidades, 5.000 a 7.500 Unidades, 5.000 Unidades a 50.000 Unidades, o
1.000 a 10.000 Unidades. Generalmente, se administra a un sujeto una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero en una cantidad que está entre o aproximadamente entre 0,01 μg/kg y 25 mg/kg, tal como 0,0005 mg/kg (0,5 μg/kg) a 25 mg/kg, 0,5 μg/kg a 10 mg/kg, 0,02 mg/kg a 1,5 mg/kg, 0,01 μg/kg a 15 μg/kg, 0,05 μg/kg a 10 μg/kg, 0,75 μg/kg a 7,5 μg/kg o 1,0 μg/kg a 3,0 μg/kg. La enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se puede administrar, por ejemplo, a una dosificación de al menos o aproximadamente al menos 0,0005 mg/kg (del sujeto), 0,0006 mg/kg, 0,0007 mg/kg, 0,0008 mg/kg, 0.0009 mg/kg, 0,001 mg/kg, 0,0016 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,016 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg o más a un sujeto humano adulto promedio, que típicamente pesa aproximadamente de 70 kg a 75 kg.
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Una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como una hialuronidasa PEGilada (p.ej., PEGPH20), proporcionada en la presente memoria se puede administrar entre o aproximadamente entre 1 Unidad/kg y 800.000 Unidades/kg, tal como de 10 a 800.000 Unidades/kg, de 10 a 750.000 Unidades/kg, de 10 a
700.000 Unidades/kg, de 10 a 650.000 Unidades/kg, de 10 a 600.000 Unidades/kg, de 10 a 550.000 Unidades/kg, de 10 a 500.000 Unidades/kg, de 10 a 450.000 Unidades/kg, de 10 a 400.000 Unidades/kg, de 10 a 350.000 Unidades/kg, de 10 a 320.000 Unidades/kg, de 10 a 300.000 Unidades/kg, de 10 a 280.000 Unidades/kg, de 10 a
260.000 Unidades/kg, de 10 a 240.000 Unidades/kg, de 10 a 220.000 Unidades/kg, de 10 a 200.000 Unidades/kg, de 10 a 180.000 Unidades/kg, de 10 a 160.000 Unidades/kg, de 10 a 140.000 Unidades/kg, de 10 a 120.000 Unidades/kg, de 10 a 100.000 Unidades/kg, de 10 a 80.000 Unidades/kg, de 10 a 70.000 Unidades/kg, de 10 a
60.000 Unidades/kg, de 10 a 50.000 Unidades/kg, de 10 a 40.000 Unidades/kg, de 10 a 30.000 Unidades/kg, de 10 a 20.000 Unidades/kg, de 10 a 15.000 Unidades/kg, de 10 a 12,800 Unidades/kg, de 10 a 10.000 Unidades/kg, de 10 a 9.000 Unidades/kg, de 10 a 8.000 Unidades/kg, de 10 a 7.000 Unidades/kg, de 10 a 6.000 Unidades/kg, de 10 a 5.000 Unidades/kg, de 10 a 4.000 Unidades/kg, de 10 a 3.000 Unidades/kg, de 10 a 2.000 Unidades/kg, de 10 a
1.000 Unidades/kg, de 10 a 900 Unidades/kg, de 10 a 800 Unidades/kg, de 10 a 700 Unidades/kg, de 10 a 500 Unidades/kg, de 10 a 400 Unidades/kg, de 10 a 300 Unidades/kg, de 10 a 200 Unidades/kg, de 10 a 100 Unidades/kg, de 16 a 600.000 Unidades/kg, de 16 a 500.000 Unidades/kg, de 16 a 400.000 Unidades/kg, de 16 a
350.000 Unidades/kg, de 16 a 320.000 Unidades/kg, de 16 a 160.000 Unidades/kg, de 16 a 80.000 Unidades/kg, de 16 a 40.000 Unidades/kg, de 16 a 20.000 Unidades/kg, de 16 a 16,000 Unidades/kg, de 16 a 12.800 Unidades/kg, de 16 a 10.000 Unidades/kg, de 16 a 5.000 Unidades/kg, de 16 a 4.000 Unidades/kg, de 16 a 3.000 Unidades/kg, de 16 a 2.000 Unidades/kg, de 16 a 1.000 Unidades/kg, de 16 a 900 Unidades/kg, de 16 a 800 Unidades/kg, de 16 a 700 Unidades/kg, de 16 a 500 Unidades/kg, de 16 a 400 Unidades/kg, de 16 a 300 Unidades/kg, de 16 a 200 Unidades/kg, de 16 a 100 Unidades/kg, de 160 a 12.800 Unidades/kg, de 160 a 8.000 Unidades/kg, de 160 a 6.000 Unidades/kg, de 160 a 4.000 Unidades/kg, de 160 a 2.000 Unidades/kg, de 160 a 1.000 Unidades/kg, de 160 a 500 Unidades/kg, de 500 a 5.000 Unidades/kg, de 1000 a 100.000 Unidades/kg o de 1.000 a 10.000 Unidades/kg, de la masa del sujeto al que se administra. En algunos ejemplos, una enzima de degradación de hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como una hialuronidasa PEGilada (p.ej. PEGPH20) se puede administrar en una cantidad de o de aproximadamente 1 Unidad/kg a 1.000 Unidades/kg, 1 Unidad/kg a 500 Unidades/kg o 10 Unidades/kg a 50 Unidades/kg.
Generalmente, cuando la actividad específica de la hialuronidasa PEGilada es o es aproximadamente de 10.000 U/mg a 80.000 U/mg, tal como de 20.000 U/mg a 60.000 U/mg o de 18.000 U/mg a 45.000 U/mg, se administra generalmente una cantidad de o aproximadamente de 1 Unidad/kg (U/kg), 2 U/kg, 3 U/kg, 4 U/kg, 5 U/kg, 6 U/kg, 7 U/kg, 8 U/kg, 8 U/kg 10 U/kg, 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/kg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1.000 U/kg, 2.000 U/kg, 3.000 U/kg, 4.000 U/kg, 5.000 U/kg, 6.000 U/kg, 7.000 U/kg, 8.000 U/kg, 9,000 U/kg, 10.000 U/kg, 12.800 U/kg, 20.000 U/kg, 32.000 U/kg, 40.000 U/kg, 50.000 U/kg,
60.000 U/kg, 70.000 U/kg, 80.000 U/kg, 90.000 U/kg, 100.000 U/kg, 120.000 U/kg, 140.000 U/kg, 160.000 U/kg,
180.000 U/kg, 200.000 U/kg, 220.000 U/kg, 240.000 U/kg, 260.000 U/kg, 280.000 U/kg, 300.000 U/kg, 320.000 U/kg,
350.000 U/kg, 400.000 U/kg, 450.000 U/kg, 500.000 U/kg, 550.000 U/kg, 600.000 U/kg, 650.000 U/kg, 700.000 U/kg,
750.000 U/kg, 800.000 U/kg o más, por masa del sujeto. Por ejemplo, se administran 60.000 U; 70.000 U; 80.000 U;
90.000 U; 100.000 U; 200.000 U; 300.000 U; 400.000 U; 500.000 U; 600.000 U; 700.000 U; 800.000 U; 900.000 U;
1.000.000 de U; 1.500.000 U; 2.000.000 de U; 2.500.000 U; 3.000.000 de U; 3.500.000 U; 4.000.000 de U omás.
En los ejemplos de la presente memoria, el taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina), se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para lograr el suministro intratumoral. En algunos ejemplos, un taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina) se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz para reducir los niveles de proteína desaminasa intratumoral (p.ej. citidina desaminasa) en comparación con la ausencia de tratamiento, por ejemplo para reducir o disminuir los niveles en al menos o aproximadamente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más. En ejemplos concretos, un taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina) se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz para aumentar el nivel intratumoral de un análogo de nucleósido coadministrado (p.ej. gemcitabina o derivado) en comparación con la ausencia de tratamiento. Por ejemplo, la gemcitabina intratumoral se aumenta en al menos o aproximadamente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más. La cantidad de un taxano dirigido a un tumor, como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina) que se va a administrar para el tratamiento de una enfermedad o afección, por ejemplo, un cáncer o tumor sólido tal como un tumor rico en HA, se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosificación precisa, que se puede determinar empíricamente, puede depender del taxano concreto, la formulación concreta (p.ej. formulación de nanopartículas o liposomas), la vía de administración, el tipo de enfermedad que se vaya a tratar y la gravedad de la enfermedad.
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Típicamente, un taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina) se administra a un sujeto con respecto el área de superficie corporal (ASC; m2) del sujeto de entre o aproximadamenteentre1 mg/m2 y 1.000mg/m2, tal como entreo aproximadamente entre10 mg/m2 a 500mg/m2, 50 mg/m2 y 400 mg/m2, 25 mg/m2 y 300 mg/m2, y generalmente al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 20 mg/m2, 30 mg/m2, 40 mg/m2, 50mg/m2, 60mg/m2, 70mg/m2, 80 mg/m2, 90 mg/m2, 100mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2. En algunos casos, se pueden administrar dosificaciones más bajas de un taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina), a sujetos en comparación con formulaciones o regímenes de dosificación existentes. Por ejemplo, un taxano dirigido a un tumor, como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina), se administra a un sujeto en una cantidad que es al menos o aproximadamente al menos 50 mg/m2 o 100 mg/m2, pero que es menos de 260 mg/m2, 200 mg/m2 o 150 mg/m2. En otros ejemplos, la dosificación que se administra por administración es lamisma que las dosificaciones y regímenes de dosificación existentes, pero el programa de dosificación se reduce de modo que se administra una menor cantidad de análogo de nucleósido por ciclo de administración. En otros casos, se pueden administrar dosificaciones más altas de un taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina), a sujetos en comparación con formulaciones o regímenes de dosificación existentes. Por ejemplo, un taxano dirigido a un tumor, tal como un taxano unido a albúmina (p.ej. paclitaxel unido a albúmina), se administra a un sujeto en una cantidad que es al menos o aproximadamente al menos 300 mg/m2, tal como entre o aproximadamente entre 300 mg/m2 y 1.000 mg/m2. Está dentro del nivel de un experto en la técnica convertir o determinar las dosificaciones correspondientes en mg/kg basándose en la altura y el peso de un sujeto. Por ejemplo, el ASC se determina por la fórmula(altura (cm) x peso (kg)/3600)1/2. El ASC de un adulto promedio es de 1,73m2.
En los ejemplos de la presente memoria, la terapia combinada contiene opcionalmente una administración adicional de un análogo de nucleósido (p.ej. una gemcitabina o derivado u otro análogo). La gemictabina se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para lograr el suministro intratumoral. En ejemplos concretos, el análogo de nucleósido (p.ej. una gemcitabina o derivado u otro análogo) se coadministra en la terapia combinada de la presente invención en una cantidad para alcanzar un nivel intratumoral que aumente al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más en comparación con el nivel intratumoral cuando se administra solo. La cantidad de un análogo de nucleósido (p.ej. gemcitabina, derivado del mismo u otro análogo descrito en la presente memoria) que se va a administrar para el tratamiento de una enfermedad o afección, por ejemplo, un cáncer o tumor sólido tal como un tumor rico en HA, se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosificación precisa, que se puede determinar empíricamente, puede depender del análogo de nucleósido concreto, la formulación concreta, la vía de administración, el tipo de enfermedad que se vaya a tratar y la gravedad de la enfermedad.
Típicamente, un análogo de nucleósido (p.ej. gemcitabina o derivado de la misma u otro análogo) se administra a un sujeto con respecto al área de superficie corporal (ASC; m2) del sujeto de entre o aproximadamente entre 100 mg/m2 y 2.500mg/m2, tal como entreo aproximadamenteentre500 mg/m2 y 2.000mg/m2, 750mg/m2 y 1.500 mg/m2, 1.000 mg/m2 y 1.500 mg/m2, o 500 mg/m2 y 1.500 mg/m2, y generalmente al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 500 mg/m2, 600 mg/m2, 700 mg/m2, 800 mg/m2, 900 mg/m2, 1.000 mg/m2, 1.250 mg/m2, 1.500 mg/m2, 1.750 mg/m2, 2.000 mg/m2 o más. En algunos casos, se pueden administrar dosificaciones más bajas de un análogo de nucleósido (p.ej. gemcitabina o derivado de la misma u otro taxano), a los sujetos en comparación con las formulaciones o regímenes de dosificación existentes. Por ejemplo, un análogo de nucleósido (p.ej. gemcitabina
o su derivado u otro taxano), se administra a un sujeto en una cantidad que es al menos o aproximadamente al menos 200 mg/m2 o 500 mg/m2, pero que es menor de 1.000 mg/m2 o 1.250 mg/m2. En otros casos, la dosificación que se administra por administración es la misma que las dosis y los regímenes de dosificación existentes, pero el programa de dosificación se reduce de modo que se administra una menor cantidad de análogo de nucleósido por ciclo de administración. Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar la dosificación correspondiente en mg/kg.
Los agentes proporcionados en la presente memoria se pueden administrar por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral, intradérmica, oral o por otras vías de administración. La vía particular puede diferir entre los agentes administrados o puede ser la misma. Por ejemplo, se pueden administrar por vía subcutánea uno o más, o todos los agentes. En ejemplos concretos, en la presente memoria se contempla que una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se puede administrar por vía subcutánea. En tales ejemplos, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se administra en un régimen de dosificación que permite 1-8 horas, tal como 1-2 horas, de absorción para que la enzima biodisponible alcance el torrente sanguíneo con el fin de producir una actividad tumoral similar a la un régimen de dosificación intravenoso simultáneo. En los ejemplos de la presente memoria, el taxano dirigido al tumor y/o análogo de nucleósido también se pueden administrar por vía subcutánea. La formulación o coformulación subcutánea concreta de los uno o más agentes se proporciona para lograr una biodisponibilidad suficiente del agente y para minimizar las reacciones en el sitio deinyección.
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En otro ejemplo, se pueden administrar por vía intravenosa uno o más, o todos los agentes. En tal ejemplo, se pueden administrar uno o más, o todos los agentes mediante embolada o infusión. El tiempo de embolada o infusión puede ser de 1 minuto a 60 minutos, y generalmente de aproximadamente 10 minutos a 40 minutos y no más de 60 minutos. Los agentes se pueden administrar mediante infusión concurrente o por infusión subsiguiente. En un ejemplo, dos de los agentes o los tres agentes administrados en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria se infunden simultáneamente. En tal ejemplo, los agentes administrados se proporcionan en la misma composición para infusión juntos en la misma bolsa. En otros casos, los agentes administrados se proporcionan en composiciones separadas, pero se combinan en una única bolsa como producto de infusión inmediatamente antes de la infusión. En un ejemplo adicional, los agentes administrados se infunden simultánea o casi simultáneamente o se infunden posteriormente, y se cuelgan en bolsas separadas para infusiones separadas.
3. Régimen de dosificación: frecuencia y ciclo de administración
El agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, se puede administrar antes, demanera simultánea o casi simultánea, sucesiva o intermitentecon el taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el agente antihialuronano, p.ej., la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y el taxano dirigido a un tumor se pueden coadministrar juntos o por separado. Si se administran por separado, los agentes se pueden administrar inmediatamente con una separación entre sí, tal como entre 30 segundos y 15 minutos el uno del otro, tal como menos de 15 minutos, 14 minutos, 12 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 2 minutos, 1 minuto o 30 segundos el uno del otro. En otros casos, el agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, y el taxano dirigido a un tumor se administran sucesivamente y/o intermitentemente. En dichos ejemplos, el agente antihialuronano, p.ej., la enzima de degradación de hialuronano, se puede administrar primero o el taxano dirigido a un tumor se puede administrar primero. Generalmente, el agente antihialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, se administra antes del taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el agente antihialuronano o enzima de degradación de hialuronano se administran al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas antes de la administración del taxano dirigido a un tumor.
En ejemplos de la terapia combinada de la presente memoria, el análogo de nucleósido se puede administrar antes, de forma simultánea o casi simultánea, sucesiva o intermitente con el agente antihialuronano (p.ej., enzima de degradación de hialuronano) y/o taxano dirigido a un tumor. El análogo de nucleósido se puede coadministrar conjuntamente o por separado con uno o ambos del agente antihialuronano (p.ej., enzima de degradación de hialuronano) y/o taxano dirigido a un tumor. Si se administran por separado, el análogo de nucleósido se puede administrar inmediatamente antes o después de la administración del agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano y/o el taxano dirigido a un tumor, por ejemplo administrado entre 30 segundos y 15 minutos el uno del otro, tal como menos de 15 minutos, 14 minutos, 12 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 2 minutos, 1 minuto o 30 segundos de diferencia del agente antihialuronano (p. ej., enzima de degradación de hialuronano) y/o taxano dirigido a un tumor. Generalmente, el análogo de nucleósido se administra después del agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano. En algunos casos, el análogo de nucleósido se administra después del agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano y el taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el análogo de nucleósido se administra al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas después de la administración del agente antihialuronano (p.ej., enzima de degradación de hialuronano) y/o taxano dirigido a un tumor.
En un ejemplo de la presente memoria, el agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano, se administra por separado de los otros agentes y se administra inmediatamente antes o después del taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano se administra menos de 15 minutos, 14 minutos, 12 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 2 minutos, 1 minuto o 30 segundos antes o después del taxano dirigido a un tumor. En dichos ejemplos, el análogo de nucleósido se administra después del agente antihialuronano (p.ej., enzima de degradación de hialuronano) y el taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el análogo de nucleósido se administra al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano y del taxano dirigido a un tumor.
En otro ejemplo, el agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano, se administra antes del taxano dirigido a un tumor, que se administra antes del análogo de nucleósido. Por ejemplo, el agente antihialuronano (p.ej., enzima de degradación de hialuronano) se administra al menos o al menos aproximadamente
o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas., 8 horas, 12 La frecuencia y el momento de la administración, y las cantidades de dosificación, se pueden administrar periódicamente durante un ciclo de administración paramantener un efecto continuo y/o a largo plazo delos agentes activos durante un período de tiempo deseado. Las combinaciones o composiciones se pueden administrar por hora, día, semana, mes, año o una vez. La duración del ciclo de administración se puede determinar empíricamente, y depende de la enfermedad que se vaya a tratar, la gravedad de la enfermedad, el paciente concreto y otras consideraciones dentro del nivel del conocimiento práctico del médico a cargo. El tiempo de tratamiento con una terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede ser de una semana, dos semanas, un mes, varios meses, un año, varios años o más. Las dosificaciones se pueden dividir en una pluralidad de ciclos de administración durante el curso del tratamiento. Por ejemplo, una enzima hialuronidasa modificada se puede administrar dos veces a la semana durante un período de un año o más. Si los síntomas de la enfermedad persisten en ausencia de tratamiento interrumpido, el tratamiento puede continuarse durante un período de tiempo adicional. Durante el transcurso del tratamiento, se pueden controlar las pruebas de toxicidad o efectos secundarios relacionados con la enfermedad o el tratamiento.
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Además, el ciclo de administración se puede adaptar para agregar períodos de tratamiento interrumpido a fin de proporcionar un período de descanso de la exposición a los agentes. El tiempo deinterrupción del tratamiento puede ser por un tiempo predeterminado o se puede determinar empíricamente según cómo responda el paciente o según los efectos secundarios observados. Por ejemplo, el tratamiento puede interrumpirse durante una semana, dos semanas, un mes o varios meses. En general, el período de tratamiento interrumpido se integra en un ciclo de régimen de dosificación para un paciente.
Por ejemplo, un régimen de dosificación ilustrativo es un ciclo de tratamiento o ciclo de administración de 28 días. El agente, tal como el agente antihialuronano, por ejemplo, enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, taxano dirigido a un tumor y/o análogo de nucleósido, se pueden administrar una vez a la semana o dos veces a la semana. Por ejemplo, el agente se puede administrar durante las primeras 3 semanas, una vez a la semana o dos veces a la semana, seguido de una semana sin dosificación. Así, por ejemplo, a un paciente se le pueden administrar dosis del agente dos veces a la semana los días 1, 4, 8, 11, 15 y 18 (o los días 0, 3, 6, 9, 12 y 15), seguido de una semana de interrupción del tratamiento, en el transcurso del ciclo de 28 días. En otro ejemplo, a un paciente se le pueden administrar dosis del agente una vez a la semana los días 1, 8 y 16, seguido de una semana de tratamiento interrumpido en el transcurso del ciclo de 28 días. En otro ejemplo, el agente se puede administrar durante los 28 días completos una vez a la semana o dos veces a la semana. Así, por ejemplo, a un paciente se le pueden administrar dosis del agente dos veces a la semana los días 1, 4, 8, 11, 15, 18, 21 y 24 (o los días 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21 o 25) durante el ciclo completo de 28 días. En otros ejemplos, a un paciente se le pueden administrar dosis del agente una vez a la semana los días 1, 8, 16 o 24 durante el ciclo completo de 28 días. Se entiende que la descripción anterior es únicamente para fines de ilustración y que pueden emplearse variaciones de lo anterior. Además, se pueden aplicar ciclos de administración similares a todos los agentes administrados, o cada agente administrado se puede emplear en su propio régimen de dosificación en la terapia combinada proporcionada en la presentememoria.
Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar el ciclo preciso de administración y el programa de dosificación. Como se indicó anteriormente, el ciclo de administración puede ser durante cualquier período detiempo deseado. Por lo tanto, el ciclo de administración de 28 días se puede repetir durante cualquier período de tiempo. Está dentro del nivel de conocimiento práctico del médico a cargo adoptar un ciclo de administración y régimen de dosificación que satisfaga las necesidades del paciente dependiendo de las consideraciones personales específicas del paciente y la enfermedad que se vaya a tratar.
Generalmente, el momento de administración del análogo de nucleósido, por ejemplo gemcitabina o derivado, es típicamente una función del ciclo de administración del agente antihialuronano, p.ej., enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y/o taxano dirigido a un tumor. Por ejemplo, el análogo de nucleósido se puede administrar después de la primera administración del agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano y/o taxano dirigido a un tumor en un ciclo de administración, y/o después de uno o más de las siguientes administraciones en el ciclo. En otros ejemplos, el análogo de nucleósido se administra después de cada administración posterior del agente antihialuronano (p.ej., enzima de degradación de hialuronano) y/o taxano dirigido a un tumor en el ciclo, después de cada administración posterior de la enzima de degradación de hialuronano y/o taxano dirigido a un tumor en el ciclo, o se administra una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes durante el ciclo de administración del agente antihialuronano, p. ej. enzima de degradación de hialuronano y/o taxano dirigido a un tumor. En algunos ejemplos, el análogo de nucleósido solo se administra una vez por ciclo de administración del agente antihialuronano, p.ej. enzima de degradación de hialuronano y/o taxano dirigido a un tumor. En un ejemplo adicional, el análogo de nucleósido se administra intermitentemente entre ciclos de administración. Por ejemplo, el análogo de nucleósido no se administra durante el primer ciclo de administración, pero se administra durante un segundo ciclo, seguido de omisión del tercer ciclo y se administra de nuevo durante un cuarto ciclo, etc. o cualquier variación de losmismos.
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En ejemplos concretos de la terapia combinada de la presente invención, los métodos incluyen administrar un agente antihialuronano y un taxano dirigido a un tumor simultáneamente o casi simultáneamente, por ejemplo de forma concomitante. El agente antihialuronano y el taxano dirigido a un tumor se pueden administrar con una frecuencia de administración de dos veces a la semana o una vez a la semana durante un número predeterminado de semanas. En particular, el agente antihialuronano se administra dos veces por semana y el taxano dirigido a un tumor se administra una vez a la semana. Opcionalmente, también se puede administrar un análogo de nucleósido en la terapia combinada. Por ejemplo, el análogo de nucleósido se administra una vez a la semana durante un número predeterminado de semanas, y típicamente el análogo de nucleósido se administra una semana después de la administración del agente antihialuronano y del taxano dirigido a un tumor. El método también puede incluir la administración de un corticosteroide antes, simultáneamente a, intermitentemente o después de la administración del agente antihialuronano. El ciclo de administración puede ser durante cualquier período de tiempo, y está dentro del nivel del médico o facultativo a cargo. Por lo general, el número predeterminado de semanas es de 3 semanas o 4 semanas, pero puede ser más prolongado. El ciclo de administración puede repetirse una pluralidad de veces dependiendo del estado dela enfermedad yla respuesta del sujeto.
4. Tratamientos combinados adicionales
La terapia combinada proporcionada en la presente memoria se puede utilizar sola o combinada adicionalmente con otras terapias o tratamientos. Las combinaciones o composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden coformular o coadministrar junto con, antes de, intermitentemente con, o después de, otros agentes o tratamientos terapéuticos o farmacológicos, tales como procedimientos. Por ejemplo, tales agentes incluyen, pero sin limitación, otros agentes biológicos, agentes anticancerosos, compuestos de molécula pequeña, agentes dispersantes, anestésicos, vasoconstrictores y cirugía, y combinaciones de los mismos. Tales agentes también pueden incluir uno o más agentes para mejorar, reducir o prevenir los efectos secundarios. En algunos casos, la terapia combinada se puede utilizar combinada con uno o más tratamientos contra el cáncer que eliminan el tumor primario o que inmunosuprimen al sujeto antes del tratamiento. Por ejemplo, se puede utilizar quimioterapia o radioterapia adicional además de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria. Tal terapia adicional puede tener el efecto de debilitar el sistema inmunitario de un sujeto. En otros ejemplos, pueden no ser necesarias la eliminación quirúrgica y/o la terapia de debilitamiento del sistema inmunitario. Otros métodos ilustrativos que se pueden combinar incluyen la administración de un compuesto que disminuye la tasa de proliferación del tumor o células neoplásicas sin debilitar el sistema inmunitario (p.ej., administrando compuestos supresores de tumores o administrando compuestos específicos de células tumorales) o administrando un compuesto inhibidor de la angiogénesis.
Se pueden administrar a la vez una preparación de un segundo agente o agentes o tratamiento o tratamientos, o se puede dividir en varias dosis más pequeñas que se deben administrar a intervalos de tiempo. Las preparaciones de agente/tratamiento seleccionadas se pueden administrar en una o más dosis en el curso de un tiempo de tratamiento, por ejemplo, durante varias horas, días, semanas o meses. En algunos casos, la administración continua es útil. Se entiende que la dosificación precisa y el curso de la administración dependen de la indicación y la tolerabilidad del paciente. En general, los expertos en la técnica conocen los regímenes de dosificación para los segundos agentes/tratamientos de la presente invención.
a. Corticosteroides
La terapia combinada proporcionada en la presente memoria se puede utilizar sola o combinada adicionalmente con uno o más corticosteroides. Se administra un corticosteroide en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para mejorar o reducir uno o más efectos adversos de la administración de enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero u otro agente, en particular, efectos musculoesqueléticos adversos. Una cantidad terapéuticamente eficaz es la dosificación suficiente para mejorar, prevenir, eliminar o reducir uno o más síntomas o efectos adversos. Los indicadores de mejora o pretratamiento satisfactorio incluyen la determinación del fracaso para manifestar una puntuación relevante en la escala CTCAE o un cambio en la clasificación o gravedad en la escala CTCAE.
Los corticosteroides son una clase de hormonas esteroides que se producen en la corteza suprarrenal. Los corticosteroides están involucrados en una amplia gama de sistemas fisiológicos, tales como la respuesta al estrés, la respuesta inmunitaria y la regulación de la inflamación, el metabolismo de carbohidratos, el catabolismo de proteínas, los niveles de electrolitos en sangre y el comportamiento. Estos incluyen glucocorticoides, que son agentes antiinflamatorios con un gran número de otras funciones y mineralocorticoides, que controlan el equilibrio de la sal y el agua principalmente através de la acción sobre los riñones.
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Los glucocorticoides son una clase de hormonas esteroides, por ejemplo, corticosteroides, que se unen al receptor de glucocorticoides. Los glucocorticoides causan sus efectos uniéndose al receptor de glucocorticoides. Entre otras actividades, el complejo glucocorticoide activado a su vez regula la expresión de proteínas antiinflamatorias en el núcleo y reprimela expresión deproteínas proinflamatorias en el citosol al evitar la translocación deotros factores de transcripción del citosol al núcleo.
En general, se puede utilizar cualquier corticosteroide, p.ej., glucocorticoide, en los métodos o combinaciones proporcionados en la presente memoria. Los glucocorticoides incluyen glucocorticoides sintéticos y no sintéticos. Los glucocorticoides ilustativos incluyen, pero no se limitan a: alclometasonas, algestonas, beclometasonas (p.ej. dipropionato de beclometasona), betametasona (p.ej. 17-valerato de betametasona, acetato sódico de betametasona, fosfato sódico de betametasona, valerato de betametasona), budesonidas, clobetasoles (p.ej. propionato de clobetasol), clobetasonas, clocortolonas (p.ej. pivalato de clocortolona), cloprednoles, corticosteronas, cortisonas e hidrocortisonas (p.ej. acetato de hidrocortisona), cortivazoles, deflazacorts, desonidas, desoximetasonas, dexametasonas (p.ej. dexametasona 21-fosfato, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona), diflorasonas (p.ej. diacetato de diflorasona), diflucortolonas, difluprednatos, enoxolonas, fluazacorts, flucloronidas, fludrocortisonas (p.ej., acetato de fludrocortisona), flumetasonas (p.ej. pivalato de flumetasona), flunisolida, fluocinolonas (p.ej. acetónido de fluocinolona), fluocinonidas, fluocortinas, fluocortolonas, fluorometolonas (p.ej. acetato de fluorometolona), fluperolonas (p.ej., acetato de fluperolona), fluprednidenos, fluprednisolonas, flurandrenolidas, fluticasonas (p.ej. propionato de fluticasona), formocortales, halcinonidas, halobetasoles, halometasonas, halopredonas, hidrocortamatos, hidrocortisonas (p.ej. hidrocortisona 21-butirato, aceponato de hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, buteprato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, hemisuccinato de hidrocortisona, probutato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona), etabonato de loteprednol, mazipredonas, medrisonas, meprednisonas, metilprednisolonas (aceponato de metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, hemisuccinato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona), mometasonas (p.ej., furoato de mometasona), parametasonas (p.ej., acetato de parametasona), prednicarbatos, prednisolonas (p.ej. 25dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, 21-hemisuccinato de prednisolona, acetato de prednisolona; farnesilato de prednisolona, hemisuccinato de prednisolona, prednisolona-21 (beta-D-glicurónido), metasulfobenzoato de prednisolona, esteaglato de prednisolona, tebutato de prednisolona, tetrahidroftalato de prednisolona), prednisonas, prednivales, predinlidenos, rimexolonas, tixocorticos, triamcinolonas (p.ej. acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, hexacetónido de triamcinolona, 21-palmitato de acetónido de triamcinolona, diacetato de triamcinolona). Estos glucocorticoides y las sales de los mismos se comentan en detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (16ª ed. 1980).
En algunos ejemplos, el glucocorticoide se selecciona entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas. En un ejemplo concreto, el glucocorticoide es dexametasona.
El corticosteroide se proporciona en una dosis terapéuticamente eficaz. La concentración terapéuticamente eficaz se puede determinar empíricamente mediante pruebas en sistemas in vitro o in vivo conocidos (p.ej. modelos animales). Por ejemplo, la cantidad de un corticosteroide seleccionado que se va a administrar para mejorar los efectos adversos se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear modelos animales para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosificación precisa, que se puede determinar empíricamente, puede depender de la preparación terapéutica, el régimen y el programa de dosificación, la vía de administración y la gravedad de la enfermedad concretos.
La concentración de un agente terapéutico seleccionado en la composición depende de las velocidades de absorción, inactivación y excreción, las características fisicoquímicas, el programa de dosificación y la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento está en función de la enfermedad o afección, el tejido que se esté tratando, el paciente o sujeto y el agente antihialuronano, incluyendo la cantidad y el régimen de dosificación. La dosis del corticosteroide también puede variar dependiendo de la edad y la salud del paciente, la dosificación de la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p.ej. dosificación de la enzima de degradación de hialuronano PEGilada), la potencia del corticosteroide y la vía de administración. Por ejemplo, se debe observar que las concentraciones y los valores de dosificación variarán con la dosis terapéutica y el régimen de dosificación de la enzima de degradación de hialuronano. Además, el corticosteroide se puede administrar diariamente, semanalmente
o mensualmente o durante períodos de tiempo más largos para lograr los resultados deseados. El volumen de dosificación concreto puede variar y depende del régimen de dosificación, la frecuencia de administración y la velocidad de administración deseada. Cabe señalar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la edad del individuo tratado.
La dosificación precisa y la duración del tratamiento se pueden determinar empíricamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o mediante extrapolación de datos de ensayo in vivo o in vitro. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto concreto, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la
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administración de las formulaciones, y que los intervalos de concentración establecidos en la presente memoria son meramente ilustrativos y no se pretende que limiten su alcance. En general, los regímenes de dosificación se seleccionan para limitar la toxicidad, y en la presente memoria se seleccionan para mejorar los efectos secundarios adversos. Cabe señalar que el médico a cargo sabría cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la terapia a una dosis menor debido a la toxicidad, o disfunciones en la médula ósea, el hígado o el riñón u otro tejido. Por el contrario, el médico a cargo también sabría cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica no fuera la adecuada (excluyendo los efectos secundarios tóxicos). La administración de un agente terapéutico no debe exceder los niveles de dosificación máximos establecidos por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos o publicados en Physician's Desk Reference.
Generalmente, la dosis de corticosteroide administrada depende del corticosteroide específico, ya que existe una diferencia de potencia entre diferentes corticosteroides (véase la Tabla 4 a continuación). El corticosteroide, o glucocorticoide, por ejemplo dexametasona, se puede administrar por vía oral (comprimidos, líquido o concentrado líquido) PO, por vía intravenosa (IV) o intramuscular. El corticosteroide se administra típicamente en forma de bolo, pero muchos se administran durante un período de tiempo, siempre que la dosis sea eficaz para mejorar uno o más efectos secundarios asociados con la administración del agente antihialuronano, por ejemplo, una hialuronidasa PEGilada.
Tabla 4. Administración de glucocorticoides
Glucocorticoide (vía) Potencia equivalente (mg)
Hidrocortisona (IV o PO) 20
Prednisona 5
Prednisolona (IV o PO) 5
Succinato sódico de metilprednisolona (IV) 4
Dexametasona (IV o PO)
0,5-0,75
El corticosteroide se puede administrar en cualquier cantidad que sea eficaz para mejorar uno o más efectos secundarios asociados con la administración de la enzima de degradación de hialuronano. Por lo tanto, el corticosteroide, p.ej., glucocorticoide, se puede administrar, por ejemplo, a una cantidad entre o aproximadamente 0,1 y 100 mg, por dosis, de 0,1 y 80 mg, de 0,1 y 60 mg, de 0,1 y 40 mg, de 0,1 y 30 mg, de 0,1 y 20 mg, 0,1 y 15 mg, 0,1 y 10 mg, 0,1 y 5 mg, 0,2 y 40 mg, 0,2 y 30 mg, 0,2 y 20 mg, 0,2 y 15 mg, 0,2 y 10 mg, 0,2 y 5 mg, 0,4 y 40 mg, 0,4 y 30 mg, 0,4 y 20mg, 0,4 y 15 mg, 0,4 y 10 mg, 0,4 y 5 mg, 0,4 y 4 mg, 1 y 20 mg, 1 y 15 mg o 1 y 10 mg, a un sujeto humano adulto de 70 kg. Típicamente, el corticosteroide, tal como un glucocorticoide se administra en una cantidad entre aproximadamente 0,4 y 20 mg, por ejemplo, a o a aproximadamente 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,75 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16mg, 17mg, 18mg, 19mg o 20mg por dosis, a un sujeto humano adulto promedio.
El corticosteroide se puede administrar, por ejemplo, a una dosificación de o de aproximadamente 0,001 mg/kg (del sujeto), 0,002 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,035 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,045 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,055 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,065 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,085 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,095 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,50 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,60 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,70 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,80 mg/kg, 0,85 mg/kg, 0,90 mg/kg, 0,95 mg/kg, 1 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,20 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,35 mg/kg o 1,4 mg/kg, a un sujeto humano adulto promedio, típicamente con un peso de aproximadamente 70 kg a 75 kg.
La administración de la dosificación administrada puede variar siempre que la administración del corticosteroide mejore uno o más efectos secundarios adversos asociados con la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En un ejemplo, la dosificación de glucocorticoide, por ejemplo, dexametasona, se administra a dosis sucesivamente más bajas por ciclo de tratamiento. Por lo tanto, en tales regímenes de tratamiento, la dosis de corticosteroide se reduce. Por ejemplo, la dexametasona se administra antes de la administración de una enzima de degradación de hialuronano, a una dosis inicial de 4mg, y después de cada administración sucesiva de la enzima de degradación de hialuronano, la dosis de dexametasona disminuye, de modo que la dosis sea de 3 mg para la próxima administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. hialuronidasa PEGilada, a continuación 2 mg por administración de agente antihialuronano, p.ej. hialuronidasa PEGilada, y a continuación 1 mg por administración de agente antihialuronano, p.ej. hialuronidasa pegilada. Se contempla cualquier dosis siempre que la dosis del corticosteroide sea eficaz para reducir uno o más efectos secundarios asociados con la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada.
El tiempo de administración puede variar siempre que la administración del corticosteroidemejore uno o más efectos secundarios adversos asociados con la administración de la enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada. El corticosteroide se puede administrar de forma sucesiva, de forma intermitente, al mismo tiempo o en la misma composición que la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. enzima de degradación de hialuronano PEGilada. Por ejemplo, el corticosteroide se puede administrar antes, durante, simultáneamente o después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. hialuronidasa PEGilada. En otro ejemplo, el corticosteroide y la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. la hialuronidasa PEGilada se administran de forma intermitente. En general, el corticosteroide se administra antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. hialuronidasa PEGilada Por ejemplo, el corticosteroide, p.ej., el glucocorticoide, tal como la dexametasona, se puede administrar o se puede administrar aproximadamente 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o más antes de la administración del agente antihialuronano, por ejemplo, una enzima de degradación de hialuronano PEGilada.
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En algunos ejemplos, el corticosteroide se administra al mismo tiempo que la administración de la enzima de degradación de hialuronano, por ejemplo, una enzima de degradación de hialuronano PEGilada. En este ejemplo, el corticosteroide se puede administrar junto con, o por separado de, la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada. Típicamente, el corticosteroide se administra por separado de la enzima de degradación de hialuronano, por ejemplo, una enzima de degradación de hialuronano PEGilada. En otros ejemplos, el corticosteroide se administra o se administra aproximadamente 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o más después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, por ejemplo una enzima de degradación de hialuronano PEGilada.
En un ejemplo, el corticosteroide se administra antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, por ejemplo, una hialuronidasa PEGilada. Por ejemplo, el corticosteroide, p.ej., el glucocorticoide, por ejemplo, dexametasona, se administra 1 hora antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada. En otro ejemplo, el corticosteroide se administra 5 minutos antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. una enzima de degradación de hialuronano PEGilada. En otro ejemplo, el corticosteroide se administra antes y después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. una hialuronidasa PEGilada. En este ejemplo, el corticosteroide, tal como la dexametasona, se administra de uno a cinco minutos inmediatamente antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. una enzima de degradación de hialuronano PEGilado y ocho horas después de la administración del agente antihialuronano, p.ej. una enzima de degradación de hialuronano PEGilada. En otro ejemplo, se administra un corticosteroide, tal como dexametasona, una hora antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, p.ej. una enzima de degradación de hialuronano PEGilada y de ocho a doce horas después de la administración del agente antihialuronano, p.ej. una enzima de degradación de hialuronano PEGilada.
Se contempla cualquier régimen de dosificación siempre que el tiempo de dosificación del corticosteroide mejore los uno o más efectos secundarios asociados con la administración de la enzima de degradación de hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa PEGilada. Además, la dosis o el régimen de dosificación de corticosteroide es uno que no interfiere ni reduce el efecto terapéutico de la enzima de degradación de hialuronano u otro agente en las composiciones y combinaciones proporcionadas en la presente memoria, incluyendo en el tratamiento de un cáncer
o tumor sólido.
b.
Agentes contra el cáncer y otros tratamientos
La terapia combinada proporcionada en la presente memoria se puede utilizar sola o combinada adicionalmente con otros agentes anticancerosos. El o los agentes o el tratamiento o los tratamientos anticancerosos pueden ser cirugía, radiación, fármacos, agentes quimioterapéuticos, polipéptidos, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas o vectores de terapia génica, virus o ADN.
Los ejemplos de agentes anticancerosos que se pueden administrar después, coincidentes con o antes de la administración de la combinación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a Acivicinas; Avicina;Aclarrubicinas; Acodazoles; Acroninas; Adozelesinas; Aldesleuquinas; Alemtuzumab; Alitretinoinas (Ácido 9-Cis-Retinoico); Alopurinoles; Altretaminas; Alvocidib; Ambazonas; Ambomininas; Ametantronas; Amifostinas; Aminoglutetimidas; Amsacrinas; Anastrozoles; Anaxironas; Ancitabinas; Antramicinas; Apazicuonas; Argimesnas; Trióxidos de arsénico; Asparraginasas; Asperlinas; Atrimustinas; Azacitidinas; Azetepas; Azotomicinas; Banoxantronas; Batabulinas; Batimastat; BCG Vivo; Benaxibinas; Bendamustinas; Benzodepas; Bexarotenos; Bevacizumab; Bicalutamidas; Bietaserpinas; Biricodar; Bisantrenos; Dimesilato de Bisnafida; Bizelesinas; Bleomicinas; Bortezomib; Brequinar; Bropiriminas; Budotitanos; Busulfanos; Cactinomicinas; Calusteronas; Canertinib; Capecitabinas; Caracemidas; Carbetímeros; Carboplatinos; Carbocuonas; Carmofur; Carmustinas con Polifeprosan; Carmustinas; Carrubicinas; Carzelesinas; Cedefingoles; Celecoxib; Cemadotinas; Clorambucilos; Cioteronel; Cirolemicinas; Cisplatinos; Cladribinas; Clanfenur; Clofarabinas; Crisnatol; Ciclofosfamidas; Citarabinas Liposomales; Citarabinas; Dacarbazinas; Dactinomicinas; Darbepoetinas Alfa; Daunorrubicinas Liposomales; Daunorrubicinas/Daunomicinas; Daunorrubicinas; Decitabinas; Denileucina Diftitox; Dexniguldipinas; Dexonaplatinos; Dexrrazoxanos; Dezaguaninas; Diaziquonas; Dibrospidium; Dienogest; Dinalinas; Disermolida; Docetaxel; Dofequidar; Doxifluridinas; Doxorrubicinas Liposomales; Doxorrubicina HCL; inyección de Doxorrubicina HCL liposomal; Doxorrubicinas; Droloxifenos; Propionatos de Dromostanolona; Duazomicinas; Ecomustinas; Edatrexatos; Edotecarinas; Eflornitinas; Elacridar; Elinafidas; Soluciones B de Elliott; Elsamitrucinas; Emitefur; Enloplatinos; Enpromatos; Enzastaurinas; Epipropidinas; Epirrubicinas; Epoetinas alfa; Eptaloprost; Erbulozoles; Esorrubicinas; Estramustinas; Etanidazoles; Etoglucidos; Fosfatos de Etopósido; Etoposidos VP-16; Etopósidos; Etoprinas; Exemestanos; Exisulind; Fadrozoles; Fazarabines; Fenretinidas; Filgrastim; Floxuridinas; Fludarabinas; Fluorouracilos; 5-fluorouracilos; Fluoximesteronas; Flurocitabinas; Fosquidones; Fostriecinas; Fostriecinas; Fotretaminas; Fulvestrant; Galarrubicinas; Galocitabinas; Gemcitabinas; Gemtuzumab/Ozogamicinas; Geroquinoles; Gimatecanos; Gimeracilos; Gloxazonas; Glufosfamidas; Acetatos de goserelina; Hidroxiureas; Ibritumomab/Tiuxetano; Idarrubicinas; Ifosfamidas; Ilmofosinas; Ilomastat; Mesilatos de imatinib; Imexonas; Improsulfanos; Indisulam; Inprocuonas; Interferones alfa-2; Interferones alfa-2b; Interferones Alfa; Interferones Beta; Interferones Gamma; Interferones; Interleucina-2 y otras interleucinas (incluyendo las interleucinas recombinantes); Intoplicinas; Iobenguanos [131-1]; Iproplatinos; Irinotecán; Irsogladinas; Ixabepilonas; Cetotrexatos; L-alanosinas; Lanreotidas; Lapatinib; Ledoxantronas; Letrozoles; Leucovorinas; Leuprolidas; Leuprorelinas (Leuprorelides); Levamisoles; Lexacalcitoles; Liarozoles; Lobaplatinos; Lometrexoles; Lomustinas/CCNU; Lomustinas; Lonafarnib; Losoxantronas; Lurtotecán; Mafosfamidas; Manosulfanos; Marimastat; Masoprocoles; Maytansinas; Mecloretaminas; Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas; Acetatos de Megestrol; Megestroles; Melengestroles; Melfalán; Melfalan lL-PAM; Menogarilos; Mepitiostanos; Mercaptopurinas; 6-Mercaptopurina; Mesna; Metesind; Metotrexatos; Metoxsalenos; Metomidatos; Metoprinas; Meturedepas; Miboplatinas; Miproxifenos; Misonidazoles; Mitindomidas; Mitocarcinas; Mitocrominas; Mitoflaxonas; Mitogilinas; Mitoguazonas; Mitomalcinas; Mitomicina C; Mitomicinas; Mitonafidas; Mitoquidonas; Mitosper; Mitotanos; Mitoxantronas; Mitozolomidas; Mivobulinas; Mizoribinas;Mofarotenos; Mopidamoles; Mubritinib; Ácidos micofenólicos; Fenpropionatos de Nandrolona; Nedaplatinos; Nelzarabinas; Nemorrrubicinas; Nitracrinas; Nocodazoles; Nofetumomab; Nogalamicinas; Nolatrexed; Nortopixantronas; Octreótidos; Oprelvequinas; Ormaplatinos; Ortataxel; Oteracilos; Oxaliplatinos; Oxisuranos; Oxofenarsinas; Paclitaxel; Pamidronatos; Patubilonas; Pegademasas; Pegaspargasas; Pegfilgrastim; Peldesinas; Peliomicinas; Pelitrexoles; Pemetrexed; Pentamustinas; Pentostatinas; Peplomicinas; Perfosfamidas; Perifosinas; Picoplatinos; Pinafidas; Pipobromanos; Piposulfanos; Pirfenidonas; Piroxantronas; Pixantronas; Plevitrexed; Plicamicida mitramicinas; Plicamicinas; Plomestanos; Plomestanos; Porfímero sódico; Porfímeros; Porfiromicinas; Prednimustinas; Procarbazinas; Propamidinas; Prospidios; Pumitepas; Puromicinas; Pirazofurinas; Quinacrinas; Ranimustinas; Rasburicasas; Riboprinas; Ritrosulfanos; Rituximab; Rogletimidas; Roquinimex; Rufocromomicinas; Sabarubicinas; Safingoles; Sargramostim; Satraplatinos; Sebriplatinos; Semustinas; Simtrazenos; Sizofiranos;Sobuzoxanos; Sorafenib; Esparfosatos; Ácidos esparfósicos; Esparsomicinas; Espirogermanios; Espiromustinas; Espiroplatinas; Espiroplatinas; Escualaminas; Estreptonigrinas; Estreptovaricinas; Estreptozocinas; Sufosfamidas; Sulofenur; Malato de Sunitinib; 6-tioguanina (6-TG); Tacedinalinas; Talcos; Talisomicinas; Talimustinas; Tamoxifenos; Tariquidar; Tauromustinas; Tecogalanos; Tegafur; Teloxantronas; Temoporfinas; Temozolomidas; Teniposidos/VM-26; Teniposidos; Teroxironas; Testolactonas; Tiamiprinas; Tioguaninas; Tiotepas; Tiamiprinas; Tiazofurinas; Tilomisoles; Tiloronas; Timcodar; Timonacic; Tirapazaminas; Topixantronas; Topotecán; Toremifenos; Tositumomab; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); Trastuzumab; Trestolonas; Tretinoínas/ATRA; Triciribinas; Trilostanos; Trimetrexatos; Tetranitratos de Triplatino; Triptorelinas; Trofosfamidas; Tubulozoles; Ubenimex; Mostazas de Uracilo; Uredepas; Valrubicinas; Valspodar; Vapreotidas; Verteporfinas; Vinblastinas; Vincristinas; Vindesinas; Vinepidinas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos; Vinleucinoles; Vinleurosinas; Vinorelbinas; Vinrosidinas; Vintriptoles; Vinzolidinas; Vorozoles; Xantomicinas A (Guameciclinas); Zeniplatinos; Zilascorb [2-H]; Zinostatinas; Zoledronato; Zorrubicinas; y Zosuquidar, por ejemplo:
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Aldesleuquinas (p.ej. PROLEUKIN®); Alemtuzumab (p.ej. CAMPATH®); Alitretinoínas (p.ej. PANRETIN®); Alopurinoles (p.ej. ZYLOPRIM®); Altretaminas (p.ej. HEXALEN®); Amifostinas (p.ej. ETHYOL®); Anastrozoles (p.ej. ARIMIDEX®); Trióxidos de arsénico (p.ej. TRISENOX®); Asparraginasas (p.ej. ELSPAR®); BCG Vivo (p.ej. TICE® BCG); Bexarotenos (p.ej. TARGRETIN®); Bevacizumab (AVASTIN®); Bleomicinas (p.ej. BLENOXANE®); Busulfán intravenoso (p.ej. BUSULFEX®); Busulfán oral (p.ej. MYLERAN®); Calusteronas (p.ej. METHOSARB®); Capecitabinas (p.ej. XELODA®); Carboplatinos (p.ej. PARAPLATIN®); Carmustinas (p.ej. BCNU®, BiCNU®); Carmustinas con Polifeprosanos (p.ej. Oblea de GLIADEL®); Celecoxib (p.ej. CELEBREX®); Clorambucilos (p.ej. LEUKERAN®); Cisplatinos (p.ej. PLATINOL®); Cladribinas (p.ej. LEUSTATIN®, 2-CdA®); Ciclofosfamidas (p.ej. CYTOXAN®, NEOSAR®); Citarabinas (p.ej. CYTOSAR-U®); Citarabinas Liposomales (p.ej. DepoCyt®); Dacarbazinas (p.ej. DTIC-Dome): Dactinomicinas (p.ej. COSMEGEN®); Darbepoetinad Alfa (p.ej. ARANESP®); Daunorrubicinas liposomales (p.ej., DANUOXOME®); Daunorrubicinas/Daunomicinas (p.ej. CERUBIDINE®); Denileucina Diftitox (p.ej. ONTAK®); Dexrazoxanos (p.ej. ZINECARD®); Docetaxel (p.ej. TAXOTERE®); Doxorrubicinas (p.ej. ADRIAMYCIN®, RUBEX®); Doxorrubicina Liposomal, incluyendo inyección de Doxorubicina HCL liposomal (p.ej. DOXIL®); Propionatos de Dromostanolona (p.ej. DROMOSTANOLONE® y MASTERONE® Injectable); Soluciones B de Elliott (p.ej. Elliott's B Solution®); Epirrubicinas (p.ej. ELLENCE®); Epoetinas alfa (p.ej. EPOGEN®); Estramustinas (p.ej. EMCYT®); Fosfatos de Etopósido (p.ej. ETOPOPHOS®); Etoposidos VP-16 (p.ej. VEPESID®); Exemestanos (p.ej. AROMASIN®); Filgrastim (p.ej. NEUPOGEN®); Floxuridinas (p.ej. FUDR®); Fludarabinas (p.ej. FLUDARA®); Fluorouracilo incl. 5-FU (p.ej.ADRUCIL®); Fulvestrant (p.ej. FASLODEX®); Gemcitabinas (p.ej. GEMZAR®); Gemtuzumab/Ozogamicina (p.ej. MYLOTARG®); Acetatos de goserelina (p.ej. ZOLADEX®); Hidroxiureas (p.ej. HYDREA®); Ibritumomab/Tiuxetan (p.ej. ZEVALIN®); Idarrubicinas (p.ej. IDAMYCIN®); Ifosfamidas (p.ej. IFEX®); Mesilatos de imatinib (p.ej. GLEEVEC®); Interferones alfa-2a (p.ej. ROFERON-A®); Interferones alfa-2b (p.ej. INTRON A®); Irinotecán (p.ej. CAMPTOSAR®); Letrozoles (p.ej.FEMARA®); Leucovorinas (p.ej. WELLCOVORIN®, LEUCOVORIN®); Levamisoles (p.ej. ERGAMISOL®); Lomustinas/CCNU (p.ej. CeeBU®); Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas (p.ej. MUSTARGEN®); Acetatos de Megestrol (p.ej. MEGACE®); Melfalán/L-PAM (p.ej. ALKERAN®); Mercaptopurina, incluyendo 6-mercaptopurinas (6-MP; p.ej. PURINETHOL®); Mesna (p.ej. MESNEX®); Metotrexatos; Metoxsalenos (p.ej. UVADEX®); Mitomicinas C (p.ej. MUTAMYCIN®, MITOZYTREX®); Mitotanos (p.ej. LYSODREN®); Mitoxantronas (p.ej. NOVANTRONE®); Fenpropionatos de Nandrolona (p.ej. DURABOLIN-50®); Nofetumomab (p.ej. VERLUMA®); Oprelvequinas (p.ej. NEUMEGA®); Oxaliplatinos (p.ej. ELOXATIN®); Paclitaxel (p.ej. PAXENE®, TAXOL®); Pamidronatos (p.ej. AREDIA®); Pegademasas (p.ej. ADAGEN®); Pegaspargasas (p.ej. ONCASPAR®); Pegfilgrastim (p.ej. NEULASTA®); Pentostatinas (p.ej. NIPENT®); Pipobromanos (p.ej. VERCYTE®); Plicamicina/mitramicinas (p.ej. MITHRACIN®); Porfímeros sódicos (p.ej. PHOTOFRIN®); Procarbazinas (p.ej. MATULANE®); Quinacrinas (p.ej. ATABRINE®); Rasburicasas (p.ej. ELITEK®); Rituximab (p.ej. RITUXAN®); Sargramostim (p.ej. PROKINE®); Estreptozocinas (p.ej. ZANOSAR®); Malatos de Sunitinib (p.ej. SUTENT®); Talcos (p.ej. SCLEROSOL®); Tamoxifenos (p.ej. NOLVADEX®); Temozolomidas (p.ej. TEMODAR®); Teniposidos/VM-26 (p.ej. VUMON®); Testolactonas (p.ej. TESLAC®); Tioguaninas incluyendo, 6-tioguanina (6-TG); Tiotepas (p.ej. THIOPLEX®); Topotecón (p.ej. HYCAMTIN®); Toremifenos (p.ej. FARESTON®); Tositumomab (p.ej. BEXXAR®); Trastuzumab (p.ej. HERCEPTIN®); Tretinoínas/ATRA (p.ej. VESANOID®); Mostazas de Uracilo; Valrubicinas (p.ej. VALSTAR®); Vinblastinas (p.ej. VELBAN®); Vincristinas (p.ej. ONCOVIN®); Vinorelbinas (p.ej. NAVELBINE®); y Zoledronatos (p.ej. ZOMETA®).
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H. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen solo con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Ejemplo 1
Efecto antitumoral del tratamiento combinado con PEGPH20 y Nab-paclitaxel en un modelo de xenoinjertode tumor de páncreas humano
Se evaluó un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano para determinar los efectos antitumorales de PEGPH20 combinada con paclitaxel unido a albúmina en nanopartículas (nab).
Se cultivaron células tumorales de la línea celular de cáncer de páncreas BxPC3 (American Tissue Culture Collection (ATCC) CRL-1687) hasta aproximadamente 80% de confluencia, se tripsinizaron, se recogieron y se lavaron una vez en HBSS (solución salina equilibrada de Hank, Mediatech Inc.). Antes de la inoculación, las células se lavaron dos veces con HBSS estéril, se contaron utilizando un dispositivo de recuento automatizado Nexcelom Cellometer (Nexcelom Bioscience; Lawrence, MA) que determina la concentración celular y la viabilidad mediante exclusión con Azul Tripán y se diluyeron con HBSS a una concentración de 1 x 108 células/mL en hielo antes de la inoculación a los animales. A ratones macho carentes de sistema inmunitario (ratones Atímicos NCr nu/nu Taconic Laboratories, Inc.) de aproximadamente 6 semanas de edad, se les inocularon por vía intramuscular (IM) 0,05mL de suspensión celular, peritibialmente, en la pata trasera izquierda (adyacente al periostio tibial). Los tumores en los animales se evaluaron dos veces por semana y se dejaron crecer hasta un volumen tumoral medio de aproximadamente 350 -400 mm3. Los volúmenes tumorales reales se determinaron utilizando el ultrasonido de alta resolución VisualSonics Vevo 770 (VisualSonics Inc., Toronto, Ontario, Canadá).
Los animales portadores de tumores se agruparon en 8 grupos de tratamiento de 8 animales por grupo y se trataron por vía intravenosa con: 1) vehículo (tampón API; 2) PEGPH20 (4,5 mg/kg); 3) nab-paclitaxel (3 mg/kg, dosis baja); 4) nab-paclitaxel (10 mg/kg, dosis moderada); 5) nab-paclitaxel (30 mg/kg; dosis alta); 6) PEGPH20 (4,5 mg/kg) + nab-paclitaxel (3 mg/kg); 7) PEGPH20 (4,5 mg/kg) + nab-paclitaxel (10 mg/kg); u 8) PEGPH20 (4,5 mg/kg) + nabpaclitaxel (30 mg/kg). La PEGPH20 y nab-paclitaxel se administraron por separado. Primero se administró PEGPH20 inmediatamente seguido de nab-paclitaxel. La dosis y frecuencia de los tratamientos fue cada 3 días para un total de 6 inyecciones a partir del Día 0 con un volumen de dosis de 0,1 mL/25 g de ratón, o 4,0 mL/kg (es decir, Días 0, 3, 6, 9, 12, 15).
Los volúmenes tumorales de todos los ratones semidieron capturando imágenes utilizando el sistema de ultrasonido VisualSonics 2 veces por semana. El volumen del tumor se calculó utilizando un programa de soporta lógico de
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imágenes en modo 3D (VisualSonics® Vevo 770®, v 3.0.0). El porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (% TGI) se calculó mediante la siguiente ecuación:
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En la ecuación anterior, Tn es el volumen tumoral promedio en el grupo de tratamiento el día "n" respectivo en el punto temporal indicado después del tratamiento; T0 es el volumen tumoral promedio en el grupo de tratamiento el Día 0 antes del tratamiento; Cn es el volumen tumoral promedio en el grupo de control el día "n" respectivo en el punto temporal indicado después del tratamiento con el vehículo; y C0 es el volumen tumoral promedio en el grupo de control el día 0 antes del tratamiento.
Los resultados semuestran en la Figura 1. Los resultados muestran que el nab-paclitaxel a dosis altas y moderadas inhibió el crecimiento tumoral, quemejoró en presencia de PEGPH20. Por ejemplo, en el último punto temporal en el que se midió el volumen tumoral, las dosis moderadas a altas de nab-paclitaxel (10 mg/kg y 30 mg/kg) inhibieron el crecimiento tumoral en 62% (p <0,01) y 74% (p < 0,01), respectivamente, en comparación con el control de vehículo. En presencia de PEGPH20, la inhibición del crecimiento tumoral para los grupos de tratamiento con dosis de 10 mg/kg de nab-palitaxel aumentó a 72% (p <0,01) y para los grupos de tratamiento con la dosis de 30 mg/kg de nabpalitaxel aumentó a 91% (p <0,01). Este es un aumento mediado por PEGPH20 de la eficacia de 19% para la dosis moderada de nab-palitaxel, y de 26% para la dosis alta de nab-palitaxel. No se observó una inhibición sustancial del crecimiento tumoral en los grupos tratados con 4,5 mg/mg de PEGPH20 o en grupos tratados con 3 mg/kg de baja dosis de Nab-paclitaxel en presencia o ausencia de PEGPH20.
Ejemplo 2
Efecto antitumoral de tratamiento de combinación con PEGPH20, Nab-paclitaxel y gemcitabina en un modelo de xenoinjerto de tumor de páncreas humano
A. Inhibición del crecimiento tumoral
El modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano descrito en el Ejemplo 1 se utilizó para evaluar los efectos antitumorales de la terapia combinada de PEGPH20 y nab-paclitaxel combinada adicionalmente con el tratamiento con gemcitabina. Antes de realizar el estudio, se seleccionó una vía y un nivel de dosis para la gemcitabina. Para esto, los ratones portadores de tumores fueron tratados con dosis variables de gemcitabina (60 mg/kg, 120 mg/kg, 180 mg/kg y 240 mg/kg) una vez a la semana durante 21 días (día 0, 7, 14 y 21) y se controló el volumen tumoral como se describió anteriormente. Los resultados se representan en la Figura 2. Los resultados muestran que la gemcitabina inhibió el crecimiento tumoral a todas las dosis sometidas a ensayo en comparación con el vehículo solo. Se seleccionó una dosis subóptima de 180 mg/kg para su uso en estudios quimioterapéuticos combinados con PEGPH20 posteriores. Se seleccionaron dosis subóptimas tanto de gemcitabina como de nab-paclitaxel para evaluar los beneficios potenciales de combinar los tres agentes anticancerosos: PEGPH20, gemcitabina y nabpaclitaxel.
Los ratones portadores de tumores se agruparon en 8 grupos de tratamiento de 12 animales por grupo y se trataron con: 1) vehículo (tampón API); 2) PEGPH20 (4,5 mg/kg); 3) nab-paclitaxel (10 mg/kg); 4) gemcitabina (180 mg/kg); 5) PEGPH20 (4,5 mg/kg) + nab-paclitaxel (10 mg/kg); 6) PEGPH20 (4,5 mg/kg) + gemcitabina (180 mg/kg); 7) nabpaclitaxel (10 mg/kg) + gemcitabina (180 mg/kg); u 8) PEGPH20 (4,5 mg/kg) + nab-paclitaxel (10 mg/kg) + gemcitabina (180 mg/kg). La PEGPH20 y el nab-paclitaxel se administraron por vía intravenosa y la dosis y frecuencia de los tratamientos fueron 2 veces por semana (2 x sem.) durante un ciclo de dosis de cuatro semanas. La gemcitabina se administró por vía intraperitoneal 24 horas después de PEGPH20 y/o nab-paclitaxel cada 7 días durante tres semanas del ciclo de dosis. Dependiendo del grupo sometido a ensayo, el programa de dosificación para la administración de los agentes en un ciclo de cuatro semanas se establece en la Tabla 5.
Tabla 5: Horario de dosificación
Programa
Tratamiento
Día 0
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
Día 1 (24 horas después de la administración del día 0)
gemcitabina (intraperitoneal)
Día 4
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
Día 7
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
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Tabla 5: Horario de dosificación
Programa
Tratamiento
Día 8 (24 horas después de la administración del día 7)
gemcitabina (intraperitoneal)
Día 11
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
Día 14
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
Día 15 (24 horas después de la administración del día 14)
gemcitabina (intraperitoneal)
Día 18
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
Día 21
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
Día 25
vehículo o PEGPH20 ± nab-paclitaxel intravenoso) (cada uno
El volumen tumoral y la inhibición del crecimiento tumoral se determinaron como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados semuestran en la Figura 3. Los resultadosmuestran que gemcitabina sola, PEGPH20 sola y PEGPH20 + gemcitabina exhibieron cierta actividad antitumoral, pero que el efecto antitumoral fue mucho mayor en terapias que 5 contenían nab-paclitaxel mostrando el mayor efecto antitumoral en animales tratados con PEGPH20, nab-paclitaxel y gemcitabina. La Tabla 6 representa los resultados como el porcentaje de inhibición del crecimiento con respecto al vehículo determinado a partir de las mediciones de volumen tumoral el día 26. Los resultados muestran que el tratamiento de animales con PEGPH20 además del tratamiento con nab-paclitaxel y gemcitabina dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral de 81% con respecto al vehículo, mientras que el tratamiento con nab
10 paclitaxel y gemcitabina sin PEGPH20 solo dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral de 66%. Por lo tanto, los resultados muestran que la adición de PEGPH20 a la terapia combinada de nab-paclitaxel y gemcitabina dio como resultado un aumento de eficacia de 23%.
Tabla 6: Efecto antitumoral de PEGPH20 combinada con gemcitabina y/o nab-paclitaxel
Tratamiento Inhibición del crecimiento tumoral (% de control de vehículo) valor p (con respecto al control de vehículo)
gemcitabina 25 0,0110
PEGPH20 + gemcitabina 38 <0,0001
PEGPH20 39 <0,0028
nab-paclitaxel 63 <0,0001
nab-paclitaxel + gemcitabina 66 <0,0001
PEGPH20 + nab-paclitaxel 71 <0,0001
PEGPH20 + nab-paclitaxel + gemcitabina
81 <0,0001
15 B. Tiempo medio de supervivencia
Después del primer ciclo de dosificación de cuatro semanas como se establece en la parte A, el ciclo de dosificación se repitió dos veces y se siguió el tiempo hasta el punto final de supervivencia a lo largo del tiempo. Brevemente, en cada ciclo de dosificación, los animales se trataron con vehículo o PEGPH20 (4,5 mg/ml) con o sin nab-paclitaxel (10
20 mg/kg) por vía intravenosa dos veces por semana durante cuatro semanas. En cada ciclo, a los grupos que recibieron gemcitabina se les administró gemcitabina (180 mg/kg) 24 horas después de PEGPH20 y/o nab-paclitaxel cada 7 días durante tres semanas del ciclo de dosis. El tiempo hasta el punto final de supervivencia, un sustituto de la supervivencia animal, se definió como (a) el tiempo hasta el volumen tumoral de más de 2000 mm3, (b) tiempo hasta una pérdida de peso superior a 20%, o (c) tiempo hasta la represión de los animales o lamuerte.
25 Los resultados se muestran en la Figura 4 y la Tabla 7. Los resultados muestran que la mediana del tiempo de supervivencia hasta el punto final de los animales tratados solo con gemcitabina fue de 38 días, los animales
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tratados con Nab-paclitaxel y gemcitabina fueron 52 días y los animales tratados con PEGPH20, nab-paclitaxel y gemcitabina fueron 68 días. Por lo tanto, los resultados muestran que la adición de PEGPH20 al tratamiento con nab-paclitaxel y gemcitabina aumentó el tiempo medio de supervivencia en comparación con cualquier otro tratamiento con un aumento de eficacia de 31% en comparación con el tratamiento con nab-paclitaxel y gemcitabina sin PEGPH20 y una mayor eficacia de 79% comparado con el tratamiento solo con gemcitabina.
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C. Medición de biomarcadores tumorales
Los biomarcadores del antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9) y el antígeno carcinoembrionario (CEA) asociados con el cáncer de páncreas se analizaron para medir la respuesta terapéutica. Los animales se trataron como se describe en la parte A. Se recogió suero de animales satélite (n≤3) de cada grupo los días 0, 6, 13 y 20 del primer ciclo de dosificación. El CA19-9 humano se midió utilizando un kit ELISA para CA 19-9 (Núm. de catálogo CA199T, Calbiotech, Spring Valley, CA) y se midió el antígeno tumoral CEA utilizando un kit ELISA para CEA (Núm. de catálogo CE062T, Calbiotech, Spring Valley, CA )
Los resultados se muestran en la Figura 5. Los resultados muestran que la presencia del tratamiento con PEGPH20 dio como resultado una reducción de los marcadores medidos en todos los grupos de tratamiento. Por ejemplo, el día 20, el nivel de marcador CA19-9 detectado fue similar en todos los grupos tratados con PEGPH20 que oscilaba de aproximadamente 40 a 60 U/ml. Por el contrario, el nivel de marcador CA19-9 en animales tratados con nabpacilitaxel o nab-paclitaxel + gemcitabina fue aproximadamente el doble que el de los animales también tratados con PEGPH20 y fue de aproximadamente 110 U/ml. Los animales tratados solo con gemcitabina mostraron niveles de CA19-9 que eran aproximadamente similares al control solo de vehículo. Por lo tanto, los resultados muestran que los animales tratados con PEGPH20 + nab-paclitaxel presentaban una reducción de los niveles de CA19-9 en comparación con los animales tratados solo con Nab-paclitaxel; los animales tratados con PEGPH20 + gemcitabina presentaron una reducción de los niveles de CA19-9 en comparación con los animales tratados solo con gemcitabina; y los animales tratados con PEGPH20 + nab-paclitaxel + gemcitabina presentaron una reducción de los niveles de CA19-9 en comparación con los animales tratados solo con nab-paclitaxel + gemcitabina. Para los animales tratados con PEGPH20 + nab-paclitaxel + gemcitabina, el CA19-9 se redujo en 49% en comparación con los animales tratados con nab-paclitaxel + gemcitabina en ausencia de PEGPH20.
Los resultados fueron similares cuando se midió el marcador CEA. Utilizando este marcador, los resultados muestran que los niveles de CEA no se modificaron sustancialmente el día 20 en animales tratados solo con Nabpaclitaxel en comparación con el control de vehículo ya que el CEA se midió a aproximadamente 20 -25 ng/mL en estos grupos. En los animales tratados con gemcitabina o nab-paclitaxel + gemcitabina hubo alguna reducción en el marcador CEA medido el día 20 a aproximadamente 15 ng/ml. En presencia de PEGPH20, el nivel de marcador que se midió se redujo considerablemente en comparación con los grupos de tratamiento sin PEGPH20. Por ejemplo, en animales tratados solo con PEGPH20, el CEA medido el día 20 fue aproximadamente 7-8 ng/ml. En los animales tratados con PEGPH20 + gemcitabina, PEGPH20 + nab-paclitaxel o PEGPH20 + nab-paclitaxel + gemcitabina, los niveles de CEA el día 20fueron demasiado bajos para ser cuantificados mediante ELISA.
Ejemplo 3
Líneas celulares que expresan rHuPH20
A. Generación de una línea celular soluble inicial que expresa rHuPH20
Se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) con el plásmido HZ24 (expuesto en SEQ ID NO: 52). El vector plasmídico HZ24 para la expresión de rHuPH20 soluble contiene una cadena principal del vector pCI (Promega), ADN que codifica los aminoácidos 1-482 de hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO: 49), un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón. La cadena principal del vector pCI también incluye ADN que codifica el gen de resistencia a betalactamasa (AmpR), un origen de replicación f1, una región potenciadora temprana inmediata/promotora de citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico y una señal de poliadenilación tardía SV40 (SV40). El ADN que codifica la construcción rHuPH20 soluble contiene un sitio NheI y una secuencia consenso Kozak antes del ADN que codifica la metionina en la posición 1 de la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa de PH20 humana, y un codón de parada después del ADN que codifica la tirosina que corresponde a la posición de aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana expuesta en SEC ID NO: 1), seguido de un sitio de restricción BamHI. La construcción pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24), por lo tanto, da comoresultado una única especiedeARNm impulsada por el promotor deCMV que codifica los aminoácidos 1-482 de PH20 humana (expuesta en SEQ ID NO: 3) y los aminoácidos 1-186 de dihidrofolato reductasa de ratón (expuesta en SEQ ID NO: 53), separadas por el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
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Las células CHO no transfectadas que crecen en medios CD-CHO modificado de GIBCO para células DHFR(-), complementados con Glutamina 4 mM y Pluronic F68/L 18 mL/L (Gibco), se sembraron a 0,5 x 106 células/mL en un matraz oscilante para preparar la transfección. Las células se cultivaron a 37°C en CO2 al 5% en una incubadora humidificada, con movimiento oscilante a 120 rpm. Las células CHO no transfectadas en crecimiento exponencial se sometieron a ensayo para determinar la viabilidad antes de la transfección.
Se sedimentaron 60 millones de células viables del cultivo de células CHO no transfectadas y se resuspendieron a una densidad de 2 × 107 células en 0,7 mL de 2x tampón de transfección (2x HeBS: Hepes 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,4 mMm, dextrosa 12 mM). A cada alícuota de células resuspendidas, se le añadieron 0,09 mL (250 μg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado mediante digestión durante la noche con Cla I (New England Biolabs), y las soluciones de células/ADN se transfirieron a cubetas de electroporación BTX (Gentronics) con espacios de 0,4 cm a temperatura ambiente. Se realizó una electroporación de control negativo sin ADN plasmídico mezclado con las células. Las mezclas de célula/plásmido se sometieron a electroporación con una descarga de condensador de 330 V y 960 μF o a 350 V y 960 μF.
Las células se retiraron de las cubetas después de la electroporación y se transfirieron a 5 mL de medios CD-CHO modificados para células DHFR (-), complementados con Glutamina 4 mM y 18 ml/L de Pluronic F68/L (Gibco), y se dejaron crecer en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos sin selección durante 2 días a 37°C en CO2 al 5% en una incubadora humidificada.
Dos días después de la electroporación, se retiraron 0,5 mL de los medio de cultivo tisulares de cada pocillo y se sometieron a ensayo para determinar la presencia de actividad de hialuronidasa utilizando el ensayo de microturbidez descrito en el Ejemplo 6. Las células que expresaban los niveles más altos de actividad hialuronidasa se recogieron del pocillo de cultivo tisular, se sometieron a recuento y se diluyeron de 1 × 104 a 2 × 104 células viables por mL. Se transfirió una alícuota de 0,1mL de la suspensión celular a cada pocillo de cinco placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron cien microlitros de medios CD-CHO (GIBCO) que contenían suplemento GlutaMAX™ -1 4 mM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) y sin suplementos de hipoxantina y timidina a los pocillos que contenían las células (volumenfinal 0,2 mL).
Se identificaron diez clones de las 5 placas cultivadas sin metotrexato. Seis de estos clones HZ24 se expandieron en cultivo y se transfirieron a matraces de agitación como suspensiones de células individuales. Los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 y 4D10 se cultivaron en placa en placas de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos utilizando una estrategia de dilución infinita bidimensional en la que las células se diluyeron 1:2 a lo largo de la placa y 1:3 a lo ancho de la placa, comenzando en 5.000 células en el pocillo de la parte superior izquierda. Los clones diluidos se hicieron crecer en un fondo de 500 células CHO DG44 no transfectadas por pocillo, para proporcionar los factores de crecimiento necesarios para los días iniciales en cultivo. Se prepararon diez placas por subclon, conteniendo 5 placas metotrexato 50 nM y 5 placas sinmetotrexato.
El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexato y 11 del tratamiento con metotrexato 50 nM). Se midió la actividad de hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (> 50 unidades/ml), y estos 8 subclones se expandieron en matraces de cultivo de tejidos T-25. Los clones aislados del protocolo de tratamiento con metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato 50 nM. El clon 3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM en matraces oscilantes y dio lugar a clones que producían más de
1.000 Unidades/mL de actividad hialuronidasa (clon 3D35M o Gen1 3D35M). A continuación se preparó un banco celular maestro (BCM) de las células 3D35M
B. Generación de una línea celular de segunda generación que expresa rHuPH20 soluble
La línea celular Gen1 3D35M descrita en el Ejemplo 3A se adaptó a niveles más altos de metotrexato para producir clones de la generación 2 (Gen2). Se sembraron células 3D35M a partir de cultivos establecidos que contenían metotrexato en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 1,0 μM. Las células se adaptaron a un nivel más alto de metotrexato, cultivándolas y pasándolas 9 veces durante un período de 46 días a 37°C, incubadora humidificada CO2 al 7%. La población amplificada de células se clonó mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio con metotrexato 2,0 μM. Después de aproximadamente 4 semanas, se identificaron los clones y se seleccionó el clon 3E10B para la expansión. Se hicieron crecer células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 2,0 μM durante 20 pases. Se creó y congeló un banco de células maestro (BCM) de lalínea celular 3E10B y se utilizó para estudios posteriores.
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La amplificación de la línea celular continuó cultivando células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX1™ 4 mM y metotrexato 4,0 μM. Después del 12º pase, las células se congelaron en viales como banco de células de investigación (BCI). Un vial del BCI se descongeló y cultivó en un medio que contenía metotrexato 8,0 μM. Después de 5 días, la concentración demetotrexato en el medio se incrementó a 16,0 μM, a continuación a 20,0 μM 18 días después. Las células del 8º pase en un medio que contenía metotrexato 20,0 μM se clonaron mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio CD CHO que contenía GlutaMAX1™ 4 mM y metotrexato 20,0 μM. Los clones se identificaron 5-6 semanas después y el clon 2B2 se seleccionó para la expansión en medio que contenía metotrexato 20,0 μM. Después del 11º pase, las células 2B2 se congelaron en viales como banco de células de investigación (BCI).
Las células 2B2 resultantes son células CHO DG44 deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-) que expresan PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20). La PH20 soluble está presente en células 2B2 con un número de copias de aproximadamente 206 copias/célula. El análisis de transferencia Southern de ADN de células 2B2 genómico digerido con Spe I, Xba I y BamH I/Hind III utilizando una sonda específica de rHuPH20 reveló el siguiente perfil de digestión de restricción: una banda de hibridación principal de ~ 7,7 kb y cuatro bandas de hibridación menores ( ~ 13,9, ~ 6,6, ~ 5,7 y ~ 4,6 kb) con ADN digerido con Spe I; una banda de hibridación principal de ~ 5,0 kb y dos bandas de hibridación menores (~13,9 y ~6,5 kb) con ADN digerido con Xba I; y se observó una única banda de hibridación de ~ 1,4 kb utilizando ADN 2B2 digerido con BamH I/Hind III. El análisis de secuencia del transcrito de ARNm indicó que el ADNc derivado (SEQ ID NO: 56) era idéntico a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 49) excepto por una diferencia de un par de bases en la posición 1131, que se observó que era una timidina (T) en lugar de la citosina esperada (C). Esta es unamutación silenciosa, sin efecto en la secuencia de aminoácidos.
Ejemplo 4
Producción y purificación de rHuPH20
A. Producción de rHuPH20 soluble de Gen2 en cultivo celular en un biorreactor de 300 L
Un vial de células HZ24-2B2 (Ejemplo 3B) se descongeló y se expandió desde matraces oscilantes a través de matraces rotativos de 36 L en medios CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) con un suplemento de metotrexato 20 μM y GlutaMAX-1™ (Invitrogen). Brevemente, se descongeló un vial de células en un baño de agua a 37°C, se añadieron medios y las células se centrifugaron. Las células se resuspendieron en un matraz oscilante de 125 mL con 20 mL de medio de nueva aportación y se colocaron en una incubadora a 37°C, 7% de CO2. Las células se expandieron hasta 40 mL en el matraz oscilante de 125 mL. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, el cultivo se expandió en un matraz rotativo de 125 mL en un volumen de cultivo de 100 mL. El matraz se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz rotativo de 250 mL en un volumen de cultivo de 200 mL, y el matraz se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, el cultivo se expandió en un matraz rotativo de 1 L en un volumen de cultivo de 800 mL y seincubó a 37°C, 7% de CO2. Cuandola densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz rotativo de 6 L en 5000 mL de volumen de cultivo y se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, el cultivo se expandió en un matrazrotativo de 36 L en un volumen de cultivo de 32 L y seincubó a 37ºC, 7% de CO2.
Un reactor de 400 L se esterilizó y se añadieron 230 mL de medios CD-CHO. Antes de su uso, el reactor se verificó para determinar la contaminación. Se transfirieron aproximadamente 30 L de células desde los matraces rotativos de 36 L al biorreactor de 400 L (Braun) a una densidad de inoculación de 4,0 x 105 células viables por mL y un volumen total de 260L. Los parámetros fueron el punto de ajuste de la temperatura, 37°C; Velocidad del Impulsor 40-55 RPM; Presión del Recipiente: 0,2 atm; Inyección de Aire 0,5-1,5 L/Min.; Superposición de aire: 3 L/min. El reactor se muestreó diariamente para realizar recuentos de células, verificación de pH, análisis de medios, producción y retención de proteínas. Además, durante el ciclo se agregaron alimentaciones nutrientes. A las 120 h (día 5), se añadieron 10,4 L de medio de Alimentación Núm. 1 (4 × CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 160 mL/L de Glutamax-1™
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83 mL/L de Yeastolato + 33 mg/L de rHuInsulina). A las 168 horas (día 7), se añadieron 10,8 L de la Alimentación Núm. 2 (2 × CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 80 mL/L de Glutamax-1™ + 167 mL/L de Yeastolato + 0,92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura de cultivo se cambió a 36,5°C. A las 216 horas (día 9), se añadieron 10,8 L de la Alimentación Núm. 3 (1 × CD-CHO + 50 g/L de Glucosa + 50 mL/L de Glutamax-1™ + 250 mL/L de Yeastolato + 1,80 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura de cultivo se cambió a 36°C. A las 264 horas (día 11), se añadieron 10,8 L de la Alimentación Núm. 4 (1 × CD-CHO + 33 g/L deGlucosa + 33mL/LGlutamax-1™ + 250 mL/L Yeastolato
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0,92 g/L de Butirato de Sodio) y la temperatura de cultivo se cambió a 35,5°C. Se observó que la adición de los medios de alimentación aumentaba drásticamente la producción de rHuPH20 soluble en las etapas finales de producción. El reactor se cosechó a los 14 o 15 días o cuando la viabilidad de las células cayó por debajo de 40%.
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El procedimiento dio como resultado una productividad final de 17.000 Unidades por mL con una densidad celular máxima de 12 millones de células/ml. En la cosecha, se tomaron muestras del cultivo de micoplasma, carga biológica, endotoxinas y virus in vitro e in vivo, Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y actividad enzimática.
El cultivo se bombeó mediante una bomba peristáltica a través de cuatro módulos del sistema de filtración Millistak (Millipore) en paralelo, cada uno con una capa de tierra de diatomeas graduada a 4-8 μm y una capa de tierra de diatomeas graduada de 1,4-1,1 μm, seguido de una membrana celulosa, a continuación a través de un segundo sistema de filtración Millistak (Millipore) único que contenía una capa de tierra de diatomeas graduada a 0,4-0,11 μm y una capa de tierra de diatomeas medida a <0,1 μm, seguido de una membrana de celulosa, y a continuación a través de un filtro final de 0,22 μm a una bolsa flexible estéril de un solo uso con una capacidad de 350 L. El fluido de cultivo celular cosechado se complementó con EDTA 10 mM y Tris 10mM a un pH de 7,5. El cultivo se concentró 10 veces con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) utilizando cuatro filtros de poliéter sulfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa Sartoslice TFF (Sartorius), seguido de un intercambio de tampón 10X con Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5 a un filtro final de 0,22 μm en una bolsa de almacenamiento estéril de 50 L.
Se inactivaron los virus de la cosecha concentrada y sometida a diafiltración. Antes de la inactivación viral, se preparó una solución de Triton X-100 al 10%, fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) al 3%. La cosecha concentrada, sometida a diafiltración se expuso a Triton X-100 al 1%, TNBP al 0,3% durante 1 hora en un recipiente de reacción de vidrio de 36 L inmediatamente antes dela purificación en la columna Q.
B. Purificación de rhuPH20 soluble de Gen2
Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (9 L de resina, H = 29 cm, D = 20 cm). Se tomaron muestras de lavado para la determinación del pH, la conductividad y el análisis de endotoxina (LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5. Después de la inactivación viral, la cosecha concentrada, sometida a diafiltración (Ejemplo 4A) se cargó en la columna Q a un caudal de 100 cm/h. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. La proteína se eluyó con Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 en un filtro final de 0,22 μm a una bolsa estéril. La muestra de eluato se sometió a ensayo para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad hialuronidasa. Las lecturas de absorbancia a A280 se tomaron al comienzo y al final del intercambio.
La cromatografía de interacción hidrófoba en Fenil-Sefarosa (Pharmacia) se realizó a continuación. Se preparó una columna de Fenil-Sefarosa (PS) (19-21 L de resina, H = 29 cm, D = 30 cm). El lavado se recogió y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. El eluato de proteína de la columna deQ sepharose se complementó con soluciones de partida de sulfato de amonio 2 M, fosfato de potasio 1 M y CaCl2 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. La proteína se cargó en la columna PS a un caudal de 100 cm/h y se recogió el flujo continuo de la columna. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCl2 0,1 mM. pH 7,0 a 100 cm/h y el lavado se añadió al flujo continuo recogido. Combinado con el lavado de la columna, el flujo continuo se pasó a través de un filtro final de 0,22 μm a una bolsa estéril. El flujo continuo fue muestreado para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Se preparó una columna de aminofenilboronato (ProMedics). El lavado se recogió y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. El flujo continuo de PS que contenía la proteína purificada se cargó en la columna de aminofenilboronato a un caudal de 100 cm/h. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. La columna se lavó con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0. La columna se lavó con bicina 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 9,0. La proteína se eluyó con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 y se pasó a través de un filtro estéril a una bolsa estéril. La muestra eluida se analizó para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad de la enzima.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Biorad). El lavado se recolectó y se sometió a ensayo para determinar el pH, la conductividad y la endotoxina (ensayo LAL). La columna se equilibró con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. La proteína purificada con aminofenil-boronato se complementó con concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCl2 0,1 mM y se cargaron en la columna HAP a un caudal de 100 cm/h. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. La columna se lavó seguidamente con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. La proteína se eluyó con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se pasó a través de un filtro estéril de 0,22 μm a una bolsa estéril. La muestra eluida se analizó para determinar la carga biológica, la concentración de proteína yla actividad de la enzima.
La proteína purificada en HAP se pasó a continuación a través de un filtro de eliminación de virus. Primero se preparó el filtro Viosart (Sartorius) esterilizado lavando con 2 L de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0. Antes del uso,
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el tampón filtrado semuestreó para determinar el pH y la conductividad. La proteína purificada en HAP se bombeó a través de una bomba peristáltica a través del filtro de eliminación de virus 20 nM. La proteína filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 se pasó a través de un filtro final de 0,22 μm a una bolsa estéril. La muestra filtrada para eliminar los virus se sometió a ensayo para determinar el perfil de concentración de proteína, actividad enzimática, oligosacáridos, monosacáridos y ácido siálico. La muestra también se sometió a ensayo para determinar las impurezas relacionadas con el procedimiento.
Ejemplo 5
Preparación de rHuPH20 PEGilada
En este ejemplo, la rHuPH20 se PEGiló mediante reacción de la enzima con éster de N-hidroxisuccinimidilo lineal de ácidometoxi-poli(etilenglicol)-butanoico (mPEG-SBA-30K).
A. Preparación demPEG-SBA-30K
Para generar PEGPH20, se conjugó covalentemente rHuPH20 (que tiene un tamaño de aproximadamente 60 KDa) a un éster N-hidroxisuccinimidílico lineal de ácido metoxi-poli(etilenglicol)-butanoico (mPEG-SBA-30K), que tiene un
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Los métodos utilizados para preparar el mPEG-SBA-30K que se utilizó para PEGilar la rHuPH20 se describen, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos Núm. 5.672.662. En resumen, el mPEG-SBA-30K se fabrica de acuerdo con el siguiente procedimiento:
Se añade gota a gota una solución de malonato de etilo (2 equivalentes) disuelto en dioxano a hidruro de sodio (2 equivalentes) y tolueno bajo una atmósfera de nitrógeno. Se disuelve mPEG metano sulfonato (1 equivalente, MW 30 kDa, Shearwater) en tolueno y se añade a la mezcla anterior. La mezcla resultante se deja a reflujo durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción se concentra a la mitad de su volumen original, se extrae con una solución acuosa de NaCl al 10%, se extrae con ácido clorhídrico acuoso al 1% y los extractos acuosos se combinan. Las capas acuosas recogidas se extraen con diclorometano (3x) y la capa orgánica se seca con sulfato de magnesio, se filtra y se evapora hasta sequedad. El residuo resultante se disuelve en hidróxido de sodio 1 N que contiene cloruro de sodio y la mezcla se agita durante 1 hora. El pH de la mezcla se ajusta a aproximadamente 3 mediante adición de ácido clorhídrico 6N. La mezcla se extrae con diclorometano (2x).
La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra, se concentra y se vierte en éter dietílico frío. El precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío. El compuesto resultante se disuelve en dioxano y se somete a reflujo durante 8 horas y a continuación se concentra hasta sequedad. El residuo resultante se disuelve en agua y se extrae con diclorometano (2x), se seca sobre sulfato de magnesio y la solución se concentra por evaporación rotativa y a continuación se vierte en éter dietílico frío. El precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío. El compuesto resultante (1 equivalente) se disuelve en diclorometano y se añade N-hidroxisuccinimida (2,1 equivalentes). La solución se enfría a 0°C y se añade gota a gota una solución de diciclohexilcarbodiimida (2,1 equivalentes) en diclorometano. La solución se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción se filtra, concentra y precipita en éter dietílico. El precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío para proporcionar mPEG-SBA-30K en polvo que a continuación se congela a ≤ -15°C.
B. Conjugación de mPEG-SBA-30K a rHuPH20
Para preparar la PEGPH20, se acopló mPEG-SBA-30K al grupo o los grupos amino de rHuPH20 mediante conjugación covalente, proporcionando enlaces amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra a continuación, donde n ≈681.
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Antes de la conjugación, la proteína en masa rHuPH20 purificada preparada en el Ejemplo 4B se concentró a 10 mg/ml, utilizando casetes de filtración de flujo tangencial (TFF) de polietersulfona (PES) de 10 kDa (Sartorius) con un área de filtración de 0,2 m2 y se cambió el tampón contra fosfato de potasio 70 mM a pH 7,2. La proteína concentrada se almacenó a continuación a 2-8°C hasta su uso.
Para conjugar la rHuPH20, se descongeló mPEG-SBA-30K (Nektar) a temperatura ambiente en la oscuridad durante no más de 2 horas. Dependiendo del tamaño del lote, se colocó una barra de agitación estéril de 7,62 cm en un matraz Erlenmeyer de 1 o 3 litros y se añadió proteína rHuPH20 con el tampón intercambiado. Se añadieron 5 g de polvo de mPEG-SBA-30K seco por gramo de rHuPH20 (razón molar 10:1 de mPEG-SBA-30K:rHuPH20) al matraz bajo una campana de vacío y la mezcla se mezcló durante 10 minutos o hasta que se disolvió por completo el mPEG-SBA-30K. La velocidad de agitación se ajustó demanera que se produjera agitación vorticial sin formación de espuma.
La solución se filtró a continuación bajo una campana de clase 100 bombeando la solución, a través de una bomba peristáltica, a través de una cápsula de filtro de acetato de celulosa con poliestireno de 0,22 μm (filtro Tubetop Corning de 50 mL) a un nuevo matraz Erlenmeyer de 1 o 3 litros que contenía una barra de agitación de 7,62 cm estéril. El volumen de la mezcla de reacción de PEGPH20 se determinó en masa (densidad de 1 g/ml) y el filtro de 0,22 μm utilizado parala filtración se examinó en una prueba de integridad posterior al uso.
La mezcla se colocó a continuación en una placa de agitación a 2-8°C y se mezcló durante 20 ± 1 horas en la oscuridad. La velocidad de agitación se ajustó de nuevo de manera que se produjera agitación vorticial sin formación de espuma. Todo el recipiente Erlenmeyer se envolvió en papel de aluminio para proteger la solución de la luz. Después de mezclar, la reacción se inactivó mediante la adición de glicina 1 M a una concentración final 25 mM. Las muestras seretiraron del recipientepara someter a ensayo el pH y la conductividad. Después, seajustaron el pH y la conductividad mediante la adición a una solución de Tris Base 5 mM (5,65 L/L) y Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0 (13,35 L/L) para proceder a la purificación con Q Sepharose.
Se preparó una columna de intercambio iónico QFF Sepharose (GE Healthcare) (Altura = 21,5-24,0 cm, Diámetro = 20 cm) equilibrando con 5 volúmenes de columna (36 L) de Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0. El producto conjugado se cargó en la columna QFF a un caudal de 95 cm/h. La columna se lavó a continuación con 11 L de tampón de equilibrado (Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0) a un caudal de 95 cm/h seguido de un lavado con 25 L de tampón de equilibrado a un caudal de 268 cm/hora. El producto proteico se eluyó a continuación con Tris 5 mM, NaCl 130 mM, pH 8,0 a un caudal de 268 cm/h. La PEGPH20 purificada resultante se concentró a 3,5 mg/ml, utilizando un casete de filtración de flujo tangencial (TFF) de polietersulfona (PES) de 30 kDa (Sartorius) con un área de filtración de 0,2 m2, y el tampón se cambió contra Histidina 10 mM, NaCl 130 mM a pH 6,5. El material resultante se sometió a ensayo para determinar la actividad enzimática como se describe en el Ejemplo 6 a continuación. Se cargó el material rHuPH20 PEGilado a una concentración de 3,5 mg/mL (actividad enzimática final 140.000 U/ml), en volúmenes de 3 mL, en viales de vidrio de 5 mL con un tapón de caucho de bromobutilo siliconado y precinto de aluminio desprendible, y se congelaron (congelar durante la noche en un congelador a -80°C, a continuación colocar en un congelador a -20°C para un almacenamiento más prolongado). La rHuHP20 PEGilada contenía aproximadamente 4,5moles de PEG por mol derHuPH20.
Ejemplo 6
Determinación dela actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble
La actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble en muestras tales como cultivos celulares, plasma, fracciones de purificación y soluciones purificadas se determinó utilizando un ensayo turbidimétrico, que se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une a albúmina sérica, o un ensayo con sustrato de ácido hialurónico biotinilado, que mide la cantidad de rHuPH20 o PEGPH20 enzimáticamente activa mediante la digestión del sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) unido no covalentemente a placas de microtitulación de múltiples pocillos de plástico.
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A. Ensayo de microturbidez
La actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble se mide incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un período de tiempo determinado (10 minutos) y a continuación precipitando el hialuronato de sodio no digerido con la adición de albúmina de suero acidulada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un período de desarrollo de 30 minutos. La disminución de la turbidez resultante de la actividad enzimática en el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se realiza utilizando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo para ensayo con rHuPH20 soluble, y las mediciones de la actividad de la muestra se realizan con respecto a esta curva de calibración.
Las diluciones de la muestra se prepararon en Soluciones de Diluyente Enzimático. La Solución de Diluyente Enzimático se preparó disolviendo 33,0 ± 0,05 mg de gelatina hidrolizada en 25,0 mL del tampón de reacción PIPES 50 mM (NaCl 140 mM, PIPES 50mM, pH 5,5) y 25,0 mL de agua estéril parainyectables (SWFI), y diluyendo 0,2 mL de solución de Buminate al 25% en la mezcla y sometiendo a agitación vorticial durante 30 segundos. Esto se realizó en el plazo de las 2 horas posteriores al uso y se almacenó en hielo hasta que fue necesario. Las muestras se diluyeron a 1-2 U/mL estimadas. Generalmente, la dilución máxima por etapa no excedió de 1:100 y el tamaño de muestra inicial para la primera dilución no fue inferior a 20 μL. Los volúmenes de muestra mínimos necesarios para realizar el ensayo fueron los siguientes: Muestras En Proceso, Fracciones de FPLC: 80 μL; Sobrenadantes de Cultivo Tisular: 1 mL; Material Concentrado: 80 μL; Material de la Etapa Purificado o Final: 80 μL. Las diluciones se realizaron por triplicado en una placa de 96 pocillos de Baja Unión de Proteína, y 30 μL de cada dilución se transfirieron a placas de fondo negro/transparenteOptilux (BD BioSciences).
Se prepararon diluciones de rHuPH20 soluble conocida con una concentración de 2,5 U/mL en Solución de Diluyente Enzimático para generar una curva patrón y se añadieron a la placa Optilux por triplicado. Las diluciones incluyeron 0 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL, 1,0 U/mL, 1,5 U/mL, 2,0 U/mL y 2,5 U/mL. Los pocillos de "Blanco reactivo" que contenían 60 μl de solución de Diluyente Enzimático se incluyeron en la placa como control negativo. La placa se cubrió a continuación y se calentó en un bloque térmico durante 5 minutos a 37°C. La cubierta se retiró y la placa se sacudió durante 10 segundos. Después de sacudir, la placa se devolvió al bloque térmico y se cebó el Dispositivo de Manejo de Líquidos MULTIDROP 384 con la solución de hialuronato de sodio caliente de 0,25 mg/mL (preparada disolviendo 100 mg de hialuronato de sodio (LifeCore Biomedical) en 20,0 mL de SWFI. Esto se mezcló girando suavemente y/o balanceando a 2-8°C durante 2-4 horas, o hasta que se disolvió completamente). La placa de reacción se transfirió a MULTIDROP 384 y la reacción se inició presionando la tecla de inicio para dispensar 30 μL de hialuronato sódico a cada pocillo. A continuación la placa se retiró del MULTIDROP 384 y se sacudió durante 10 segundos antes de ser transferida a un bloque térmico con la cubierta de la placa reemplazada. La placa se incubó a 37°C durante 10 minutos.
El MULTIDROP 384 se preparó para detener la reacción cebando la máquina con Solución de Trabajo de Suero y cambiando la configuración de volumen a 240 μL (25 mL de Solución de Partida de Suero [1 volumen de suero de caballo (Sigma) se diluyó con 9 volúmenes de Solución Tampón de Acetato 500 mM] y el pH se ajustó a 3,1 con ácido clorhídrico] en 75 mL de Solución Tampón de Acetato 500 mM). La placa se retiró del bloque térmico y se colocó en el MULTIDROP 384, y se dispensaron 240 μL de Soluciones de Trabajo en suero a los pocillos. La placa se retiró y se sacudió en un lector de placas durante 10 segundos. Después de otros 15minutos, semidió la turbidez de las muestras a 640 nm y se determinó la actividad hialuronidasa (en U/ml) de cada muestra mediante el ajuste a la curva patrón.
La actividad específica (unidades/mg) se calculó dividiendo la actividad de hialuronidasa (U/ml) por la concentración de proteína (mg/ml).
B. Ensayo de hialuronano biotinilado
El ensayo de ácido hialurónico biotinilado mide la cantidad de rHuPH20 o PEGPH20 enzimáticamente activas en muestras biológicas mediante la digestión de un sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) de gran peso molecular (~ 1,2 megadaltons) unido no covalentemente a placas de microtitulación de múltiples pocillos de plástico. Se deja que la rHuPH20 o PEGPH20 de los patrones y las muestras se incuben en una placa recubierta con b-HA a 37°C. Después de una serie de lavados, la b-HA no escindida/unida se trata con producto conjugado de estreptavidina -peroxidasa de rábano picante (SA-HRP). La reacción entre SA-HRP inmovilizada y el sustrato cromogénico, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), produce una solución de color azul. Después de detener la reacción con ácido, se determina la formación del producto de reacción amarillo soluble leyendo la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La disminución de la absorbancia a 450 nm que resulta de la actividad enzimática en el sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) es una medida de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se realiza utilizando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de rHuPH20 o PEGPH20 soluble, y las mediciones de la actividad de la muestra se realizan con respecto a esta curva de calibración.
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Las diluciones de la muestra y el calibrador se prepararon en Diluyente de Ensayo. El diluyente de ensayo se preparó añadiendo plasma reunido al 1% v/v (de la especie apropiada) a BSA en HEPES al 0,1% (p/v), pH 7,4. Esto se preparó diariamente y se almacenó a 2-8°C. Dependiendo del tipo de especie y del nivel de hialuronidasa previsto, se prepararon diluciones únicas o múltiples para asegurar que al menos una dilución de muestra cayera dentro del intervalo de la curva de calibración. Para guiar la selección de las diluciones de la muestra de ensayo, se utilizaron la información conocida sobre la dosis de hialuronidasa administrada, la vía de administración, el volumen plasmático aproximado de la especie y el punto temporal para estimar los niveles de actividad hialuronidasa. Cada dilución de muestra se mezcló a medida que se preparaba mediante agitación vorticial de pulso breve y las puntas de pipeta se cambiaron entre cada dilución. En general, las diluciones comenzaron con una dilución inicial de 50 o 100 veces seguida de diluciones seriadas adicionales. Se preparó una curva de calibración de siete puntos de rHuPH20 o PEGPH20 (dependiendo del tratamiento administrado) que variaba de una concentración de 0,004 a 3,0 U/mL para rHuPH20 y de 0,037 a 27 U/mL para PEGPH20. Se aplicaron cien microlitros (100 μL) de cada dilución de muestra de ensayo y un punto de curva de calibración a pocillos por triplicado de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Immulon 4HBX, Thermo) que se había recubierto previamente con 100 μL por pocillo de b-HA a 0,1 mg/mL y bloqueado con 250 μL de albúmina de suero bovino al 1,0% (p/v) en PBS. Las placas se cubrieron con un sello de placa adhesiva y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 90 minutos. Al final del período de incubación, el sello adhesivo se retiró de la placa, las muestras se aspiraron y la placa se lavó cinco (5) veces con 300 μL por pocillo Tampón de Lavado (Tampón de Fosfato 10 mM, Cloruro de Potasio 2,7 mM, Cloruro Sodio 137 mM, pH 7,4, con Tween 20 al 0,05% (v/v), PBST) utilizando un lavador de placas automatizado (BioTek ELx405 Select CW, Programa '4HBX1'). Se añadieron 100 microlitros de Solución de Trabajo de Producto Conjugado de Estreptavidina-HRP [producto conjugado de estreptavidina-HRP (1:5.000 v/v) en Tris-HCl 20 mM, Cloruro de Sodio 137 mM, 0,025% (v/v) Tween 20, Albúmina de Suero Bovino al 0,1% (p/v) por pocillo. La placa se selló y se dejó incubando a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos sin sacudimiento y protegida de la luz. Al final del período de incubación, el sello adhesivo se retiró de la placa, las muestras se aspiraron y la placa se lavó cinco (5) veces con 300 μL por pocillo de Tampón de Lavado como se describió anteriormente. Se añadió solución de TMB (a temperatura ambiente) a cada pocillo y se dejó incubando protegida de la luz durante aproximadamente cinco (5) minutos a temperatura ambiente. La Solución de Parada de TMB (KPL, Núm. de Catálogo 50-85-06) se añadió a continuación a 100 μL por pocillo. La absorbancia de cada pocillo a 450 nm se determinó utilizando un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La respuesta de la Curva de Calibración de cada placa se modeló utilizando un ajuste de curva logística de 4 parámetros. La actividad hialuronidasa de cada incógnita se calculó mediante la interpolación de la curva de calibración, se corrigió el factor de dilución de la muestra y se refirió en U/ml.
Ejemplo 7
Efecto del tratamiento con PEGPH20 en unmodelo tumoral con hialuronano (AH) peritumoral alto
Para evaluar el efecto de PEGPH20 sobre niveles elevados de HA peritumoral, se generó una línea celular tumoral BXPC3-Has3 para establecer un modelo de tumor de xenoinjerto de ratón HAalto. Las células BxPC3 (ATCC Núm de Cat.. CRL-1687) se cultivaron en condiciones de cultivo convencionales utilizando medios RPMI completos. Se generó un sistema lentiviral para expresar el transcrito de ADNc de hialuronano sintasa 3 humana (expuesto en SEQ ID NO: 212). El vector lentiviral generado que expresaba el ADNc de hHAS3 se denominó pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg y se expone en SEQ ID NO: 213. La línea celular estable BX-PC3-Has3 se generó por infección viral con pLVEF1a-hHAS3-IRES-Hyg, seguido de la selección con higromicina. Las células infectadas para expresar en exceso hHAS3 se utilizaron en todoslos experimentos.
Para confirmar los niveles de HA, se midió la intensidad del color en la sección del tumor con el programa de espectro de Aperio. El tumor fue calificado como HAAlto a fuerte tinción de HA sobre 25% de la sección del tumor; como HAModerado a fuerte tinción de HA entre el 10 y 25% de la sección del tumor; como HABajo a fuerte tinción de HA por debajo de 10% de la sección del tumor.
A los ratones NCr (nu/nu) que tenían de 5 a 6 semanas de edad y pesaban entre 20 y 25 g se les inocularon células BxPC-3-Has3 (5 x 106/50 μL) adyacente al periostio tibial derecho, generando tumores de alta presión. La longitud
(L) y el ancho (W) de la masa tumoral sólida se midieron mediante calibre y el volumen del tumor (VT) se calculó como: (L x W)2)/2. Cuando el volumen de tumores alcanzó aproximadamente 1.500 a 2.000 mm3 de diámetro, los ratones se estadificaron en dos grupos de tratamiento: (1) BxPC3 HAalto, control de vehículo o (2) BxPC3 HAalto, PEGPH20.
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A los animales se les administró vehículo (Histidina 10 mM, pH 6,5, NaCl 130 mM) o PEGPH20 (4,5 mg/kg) a las 0 horas y nuevamente a las 42 horas. Con el primer tratamiento de PEGPH20 o control de vehículo (48 horas antes del sacrificio, es decir, a t = 0 horas), los animales también se trataron con 240 mg/kg de gemcitabina, intraperitonealmente, y 10 mg/kg de paclitaxel (Abraxane®), por vía intravenosa. Dos horas antes del sacrificio (46 horas), los animales se trataron por vía intraperitoneal con HYPOXYPROBE™ (hidrocloruro de pimonidazol, Chemicon International, Temecula, CA) a 60 mg/kg y también con 0,5mL de BrdU. Cinco minutos antes del sacrificio (48 horas), los animales se trataron por vía intravenosa con 75 μL de carbocianina fluorescente de 0,6 mg/mL disuelta en DMSO 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI).
Los animales fueron sacrificados a las 48 horas. Los tumores completos se recogieron, los tejidos se enfriaron a 20°C en bloques de aluminio, se cubrieron en un medio OCT incluyente (Sakura Finetek, Torrance, CA) y se almacenaron a -80°C hasta el corte. Las criosecciones tumorales se cortaron en secciones de 10 μm y se procesaron para la inmunohistoquímica o se obtuvieron imágenes microscópicas. Se evaluaron los efectos sobre la perfusión vascular y la hipoxia tumoral.
A. Perfusión vascular
Las criosecciones frescas no teñidas se escanearon con un sistema de obtención de imágenes de microscopía de fluorescencia (BD CARV II Confocal Imager, Sparks, MD; cámara Quentem 512sc (Photometrics, Tucson, AZ); fase x-y motorizada MIV2000, y MetaMorph System, Sunnyvale, CA). Las secciones tumorales enteras se escanearon a 10x para determinar la señal de carbocianina fluorescente (DiI) (Excitación a 562 nm/emisión a 624 nm) para determinar la perfusión tumoral. Las imágenes se analizaron utilizando un Image-Pro Analyzer 7.0 (Media Cybermetrics, Bethesda, MD). Se determinaron el área tumoral completa y el área de tinción positiva. La perfusión vascular en cada tumor se calculó como porcentaje(señal) positivo en toda la sección del tumor.
Los resultados se muestran en la Tabla 8. Los resultados muestran que el tratamiento con PEG-PH20 mediaba la perfusión de colorante en tumores BxPC3-HAS3, con un aumento significativo en la perfusión de vasos sanguíneos en tumores de ratones tratados con PEGPH20 frente a tumores tratados con control. Como se resume en la Tabla 8, los animales tratados con PEGPH20mostraron un aumento de la perfusión vascular con un área promedio de 7,24 ± 1,78, que es un aumento de 116,9% sobrelos animales de control.
Tabla 8: Aumento mediado por PEGPH20 en la perfusión vascular en tumores con HAalto
% Promedio del área vascular en la sección completa del tumor P
% incremento
control (n = 7) 3,42 ± 0,53 -
-
PEGPH20 (n = 6)
7,24 ± 1,78 <0,0001 116,9
B. Hipoxia
Las secciones tumorales delos animales tratados secompararon para determinar las regiones hipóxicasmediantela visualización de hidrocloruro de pimonidazol (HYPOXYPROBE™). Específicamente, después del sacrificio, se sondearon criosecciones que se habían bloqueado con suero de cabra para su tinción inespecífica durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1:50 de anticuerpo anti-pimonidazol (Hypoxyprobe™-1 Mab-1, IgG de ratón1; Chemicon International, Temecula, CA) para detectar aductos de pimonidazol o con un anticuerpo anti-CD31 de dilución 1:100 (rata, BD Pharmingen, San Diego, CA) para detectar células endoteliales. Después del lavado para eliminar el reactivo primario, se utilizó un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra con FITC (para visualizar Hypoxyprobe™-1 Mab-1, dilución 1: 100; Vector Labs Burlingame, CA, EE. UU.) o un anticuerpo secundario anti-rata de cabra con Rojo Texas (para visualizar las células endoteliales CD31; dilución 1:100; Vector Labs Burlingame, CA EE.UU.) como reactivo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se tomaron imágenes de las secciones utilizando el sistema de obtención de imágenes Image-Pro Analyzer 7.0 (Media Cybermetrics, Bethesda, MD). Para la formación de imágenes de CD31, la longitud de onda de excitación fue de 562 nm y la longitud de onda de emisión fue de 624 nm. Para obtener imágenes para el hidrocloruro de pimonidazol (HYPOXYPROBE™), la longitud de onda de excitaciónfue de 490 nm y la longitud de onda de emisiónfue de 520 nm.
Los resultados semuestran en la Tabla 9. Los resultadosmostraron que PEGPH20, quemedia la eliminación de HA, da como resultado una reducción de la hipoxia en los tumores BxPC3-Has3. Los animales de control tenían un porcentaje medio de área hipóxica en la sección tumoral completa de 3,98 ± 2,70%. Los animales tratados con PEGPH20 tenían una reducción del área de hipoxia en los tumores con un área media de 0,86 ± 1,07, que es una disminución de 78% con respecto a los animales control.
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Tabla 9: Disminución mediada por PEGPH20 en áreas hipóxicas en tumores con HAalto
% del área de hipoxia en la sección completa del tumor P % de disminución
control (n = 7) 3,98 ± 2,70 --
PEGPH20 (n = 6)
0,86 ± 1,07 0,035 78
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Ejemplo 8
Efecto del tratamiento combinatorio con PEGPH20 y nab-paclitaxel en un modelo de tumor de cáncer demama triple negativo con hialuronano (HA) peritumoral alto
La línea celular de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-468 (TNBC) se generó para expresar en exceso el transcrito de ADNc de hHAS3A (SEC ID NO: 212) y establecer así un Modelo de TNBC de HAalto. Las células MDAMB-468 (ATCC Núm. de Cat.HTB-132), cultivadas en condiciones de cultivo convencionales utilizando medio RPMI completo, se infectaron con el vector lentiviral que expresaba ADNc de hHAS3 pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg (SEQ ID NO: 213), descrito anteriormente, seguido de selección con higromicina para generar la línea celular estable que expresa hHAS3 MDA-MB-468/HAS3.
Las células MDA-MB-468/HAS3, suspendidas en RPMI, seinyectaron en ratones carentes de sistema inmunitario. El volumen tumoral semidió como sedescribió anteriormente. El día 17, cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 300 mm3, los animales se dividieron en 6 grupos de tratamiento, a los que se les administró 1) vehículo; 2) 1 mg/kg de Nab-paclitaxel; 3) 3 mg/kg de nab-paclitaxel; 4) 10 mg/kg de nab-paclitaxel; 5) 4,5 mg/kg de PEGPH20; o 6) 1 mg/kg de Nab-paclitaxel y 4,5 mg/kg de PEG20 por vía intravenosa. Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días durante 45 días.
Los resultados se muestran en la Figura 6. Los animales del grupo de tratamiento 1, que reciben solo vehículo, exhibieron un crecimiento tumoral progresivo a lo largo del curso del estudio. El último día del estudio (día 62), el tamaño promedio del tumor había duplicado el volumen. Los tumores de animales en los grupos de tratamiento 2 y 3 que recibieron nab-paclitaxel a 1 o 3 mg/kg exhibieron una disminución inicial (aproximadamente 30%) del volumen tumoral en los días 17-27 después de la implantación celular (0-10 días después del tratamiento), pero a continuación el crecimiento tumoral se reanudó a un ritmo reducido en comparación con los animales de control de vehículo. El último día del estudio, el volumen tumoral promedio fue casi el doble del volumen inicial.
El patrón de crecimiento tumoral observado para los animales tratados con PEGPH20 (grupo 5) fue similar al de los grupos 2 y 3, pero el tamaño promedio del tumor para el grupo 5 fue ligeramentemenor que el de los grupos 2 y 3 el último día. El tamaño tumoral promedio de los animales del grupo 4, que recibió 10mg/kg de nab-paclitaxel, siguió la misma tendencia que los grupos 2, 3 y 5 durante los primeros 10 días después del tratamiento (días de estudio 1727), pero a continuación semantuvo en el volumen reducido durante 11 días adicionales y a continuación disminuyó progresivamente durante el resto del estudio 30% adicional para producir un volumen tumoral promedio al final del estudio que fue untercio del volumen tumoral inicial promedio.
La combinación de 1 mg/kg de nab-paclitaxel y PEGPH20 (grupo 6) dio como resultado una disminución sustancial del volumen tumoral promedio. Estos resultados muestran que hay efectos sinérgicos sobre el tratamiento con la combinación de nab-paclitaxel y PEGPH20, que da como resultado una eficacia significativamente mejorada en la inhibición del crecimiento tumoral en comparación con los tratamientos individuales a la misma dosis. La terapia combinada dio como resultado una disminución similar del volumen tumoral a la observada para animales que recibieron 10 veces más nab-paclitaxel como terapia única (10 mg/kg nab-paclitaxel (grupo 5)), que también produjo un volumen tumoral promedio final que fue aproximadamente un tercio del volumen tumoral inicial promedio.
Dado que las modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica, se pretende que esta invención esté limitada únicamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (23)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1.
    Una combinación de composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas, en donde la combinación comprende:
    una primera composición que comprende una hialuronidasa conjugada con un polímero; y una segunda composición que comprende un taxano dirigido al tumor, en donde el taxano dirigido a un tumor comprende nab-paclitaxel o nab-docetaxel.
  2. 2.
    Una composición que comprende una hialuronidasa conjugada con un polímero para uso en el tratamiento de cáncer de páncreas, en donde:
    la hialuronidasa se utiliza con un taxano dirigido a un tumor y se administra simultáneamente, casi simultáneamente, por separado o secuencialmente a un sujeto con el taxano dirigido a un tumor; y el taxano dirigido a un tumor comprende nab-paclitaxel o nab-docetaxel.
  3. 3.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el taxano dirigido a un tumor es nab-paclitaxel.
  4. 4.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera delas reivindicaciones 1-3, en donde:
    la composición o composiciones se formula o seformulan para administración directa; la concentración de hialuronidasa es suficiente para degradar el hialuronano asociado al tumor; y la concentración del taxano dirigido a un tumor es suficiente para lograr el suministro intratumoral del taxano.
  5. 5.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera delas reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente una composición que comprende un análogode nucleósido que es un agente quimioterapéutico.
  6. 6.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el análogo de nucleósido se selecciona de entre un análogo de nucleósido de purina o pirimidina, o profármaco del mismo, que es un agente quimioterapéutico.
  7. 7.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde:
    la composición o composiciones se formula o seformulan para administración directa; y la concentración del análogo de nucleósido es suficiente para lograr el suministro intratumoral.
  8. 8.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera delas reivindicaciones 5-7, en donde:
    el análogo de nucleósido o profármaco del mismo, se proporcionan por separado de la hialuronidasa y del taxano dirigido a un tumor; o el análogo de nucleósido o profármaco del mismo se coformulan con la hialuronidasa; o el análogo de nucleósido o profármaco del mismo se coformulan con el taxano dirigido a un tumor; o el análogo de nucleósido o profármaco del mismo se coformulan con la hialuronidasa y el taxano dirigido a un tumor.
  9. 9.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la composición o composiciones se formula o se formulan paraadministración de dosificación única omúltiple.
  10. 10.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la composición de hialuronidasa contiene entre 50 unidades de actividad hialuronidasa (U)/ml y 15.000 U/ml, 10 U/ml y 500 U/ml, 1.000 U/ml y 15.000 U/mL, 100 U/mL y 5.000 U/mL, 500 U/mL y 5.000 U/mL o 100 U/mL y 400 U/mL.
  11. 11.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la hialuronidasa es una PH20 o forma truncada de la misma que carece de un sitio de unión a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porción del sitio de unión aGPI.
  12. 12.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde:
    la hialuronidasa es una PH20 truncada; la hialuronidasa es activa en condiciones neutras y soluble; y la PH20 truncado comprende una secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1, o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de
    -344
    imagen2
    aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de SEC ID NO: 1 y conserva la actividad hialuronidasa.
  13. 13.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la hialuronidasa es una PH20 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID NO: 49, 47, 48, 150-170, y 183-189, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NO: 4-9, 47, 48, 150-170 y 183-189 y conserva la actividad de hialuronidasa.
  14. 14.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la composición de taxano dirigido a un tumor contiene una concentración de taxano dirigido a un tumor que está entre 0,01 mg de taxano/ml y 100 mg/ml, tal como 1 mg/ml y 50 mg/ml, 2,5 mg/ml y 25 mg/ml, 5 mg/ml y 15 mg/ml o 10 mg/ml y 100 mg/ml.
  15. 15.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-14, en donde el análogo de nucleósido se selecciona entre fluoropirimidina 5-fluorouracilo, 5-fluoro-2'-desoxicitidina, citarabina, gemcitabina, troxacitabina, decitabina, Azacitidina, pseudoisocitidina, Zebularina, Ancitabina, Fazarabina, 6azacitidina, capecitabina, N4-octadecil-citarabina, ácido elaídico, citarabina, fludarabina, cladribina, clofarabina, nelarabina, forodesina y pentostatina, o sus derivados.
  16. 16.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-14, en donde el análogo de nucleósido es gemcitabina.
  17. 17.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-15, en donde el análogo de nucleósido es un sustrato para una nucleósido desaminasa, y la nucleósido desaminasa es adenosina desaminasa o citidina desaminasa.
  18. 18.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-17, en donde la composición del análogo de nucleósido comprende una concentración de análogo de nucleósido que está entre 1 mg de análogo de nucleósido/ml y 500 mg/ml, 5 mg/ml y 100 mg/ml, 10 mg/ml y 50 mg/ml, 25 mg/ml y 200 mg/ml o 20 mg/ml y 100 mg/ml.
  19. 19.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, que comprende adicionalmente una composición que comprendeun glucocorticoide.
  20. 20.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde el polímero es un polialquilenglicol, dextrano, pululano o celulosa.
  21. 21.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el polialquilenglicol se selecciona de entre polietilenglicoles (PEG) y metoxipolietilenglicoles (mPEG).
  22. 22.
    La combinación o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21 que está envasada como un kit e incluye opcionalmenteinstrucciones de uso.
  23. 23.
    La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la hialuronidasa y el taxano dirigido a un tumor se coformulan para la administración en una única composición.
    -345
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