CN104411324A - 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法 - Google Patents

使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN104411324A
CN104411324A CN201380029337.9A CN201380029337A CN104411324A CN 104411324 A CN104411324 A CN 104411324A CN 201380029337 A CN201380029337 A CN 201380029337A CN 104411324 A CN104411324 A CN 104411324A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hyaluronic acid
combination
hours
cancer
peg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380029337.9A
Other languages
English (en)
Inventor
D·C·马内瓦尔
H·M·谢泼德
C·B·汤普森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Halozyme Inc
Original Assignee
Halozyme Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Halozyme Inc filed Critical Halozyme Inc
Priority to CN201810685607.6A priority Critical patent/CN108686203A/zh
Publication of CN104411324A publication Critical patent/CN104411324A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本文提供的是含有抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷，以及任选地进一步的化疗剂例如核苷类似物的组合疗法。组合疗法可以用于治疗癌症特别是实体瘤癌症的方法中。

Description

使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法
相关申请
本申请要求美国临时申请号61/686,429和美国临时申请号61/714,719的优先权利益，所述美国临时申请61/686,429于2012年4月4日提交，名称为“COMBINATION THERAPY WITH A POLYMER-CONJUGATEDHYALURONAN-DEGRADING ENZYME AND THERAPEUTIC AGENT”，所述美国临时申请61/714,719于2012年10月16日提交，名称为“COMBINATION THERAPY WITH AN ANTI-HYALURONAN AGENTAND THERAPEUTIC AGENT”。
本申请涉及名称为“COMBINATION THERAPY WITH ANANTI-HYALURONAN AGENT AND THERAPEUTIC AGENT”，与此同一天提交的美国专利申请号(代理人案号33320-03108.US02)，其要求美国临时申请号61/686,429和美国临时申请号61/714,719的优先权。
本申请涉及名称为“MODIFIED HYALURONIDASES AND USES INTREATING HYALURONAN-ASSOCIATED DISEASES ANDCONDITIONS”，于2009年4月14日提交的美国专利申请号12/386,222，其以US20100003238公开并且要求美国临时申请号61/124,278、61/130,357和61/195,624的优先权。本申请还涉及于2009年4月14日提交的国际PCT申请号PCT/US2009/002352，其以WO2009/128917公开并且还要求美国临时申请号61/124,278、61/130,357和61/195,624的优先权。
本申请涉及名称为“ADVERSE SIDE-EFFECTS ASSOCIATED WITHADMINISTRATION OF ANTI-HYALURONAN AGENTS AND METHODSFOR AMELIORATING OR PREVENTING THE SIDE-EFFECTS”，于2011年7月15日提交的美国专利申请号13/135,817，其以US20120020951公开并且要求美国临时申请号61/399,993和61/455,260的优先权。本申请还涉及于2011年7月15日提交的国际PCT申请号PCT/US2011/044281，其以WO2012/012300公开并且还要求美国临时申请号61/399,993和61/455,260的优先权。
上述申请各自的主题整体引入作为参考。
引入作为参考的电子提供的序列表
随同提交了电子版本的序列表，其内容整体引入作为参考。电子文件于2013年3月15日创建，大小891千字节，标题为3108SEQPC1.txt。
技术领域
本文提供的是含有抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷，以及任选地含有进一步的化疗剂例如核苷类似物的组合疗法。组合疗法可以用于治疗癌症特别是实体瘤癌症的方法中。
背景技术
抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶例如PH20用于治疗透明质酸相关疾病或状况的方法中，所述疾病或状况包括癌症且特别是透明质酸相关的癌症或肿瘤。透明质酸(透明质酸；HA)是糖胺聚糖，主要存在于哺乳动物结缔组织、皮肤、软骨和滑液中。在结缔组织中，与透明质酸相关的结合水产生组织之间的水合基质。HA在许多细胞的细胞外基质尤其是软结缔组织中发现。某些疾病包括实体瘤与透明质酸的表达和/或产生相关。抗透明质酸剂是调节HA合成或降解，从而改变组织或细胞中HA水平的试剂。具体地，透明质酸酶是降解透明质酸的酶。通过催化HA的分解，透明质酸酶可以用于治疗与HA或其他糖胺聚糖累积相关的疾病或病症，包括癌症和肿瘤。对于癌症且特别是实体瘤癌症的治疗，存在改善或替代治疗处理的需要。
发明内容
本文提供的是包含含有抗透明质酸剂的组合物和含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物的组合。本文还提供的是包含含有抗透明质酸剂的组合物、含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物和含有核苷类似物的组合物的组合。本文提供的组合中的任一种均可进一步包含含有皮质类固醇的组合物。本文提供的是用于治疗癌症的方法，其中施用含有抗透明质酸剂的组合物和含有肿瘤靶向紫杉烷制剂的组合物。在一些例子中，该方法进一步包括施用含有核苷类似物的组合物。在一些例子中，该方法进一步包括施用皮质类固醇。在另外其他例子中，该方法进一步包括施用癌症治疗。在此类组合和方法中，所述试剂以如本文描述的治疗有效量提供。
本文还提供的是组合疗法的医学用途。例如，本文提供的是抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷用于治疗癌症的用途，其中所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷分开或一起配制。本文还提供的是抗透明质酸剂用于治疗癌症的用途，其中所述治疗包括同时、分开或顺次给对象施用肿瘤靶向紫杉烷。本文还提供的是用于治疗癌症的含有抗透明质酸剂的组合物，其中所述治疗包括同时、分开或顺次给对象施用肿瘤靶向紫杉烷。在本文医学用途的例子中，治疗还可以包括与抗透明质酸剂或肿瘤靶向紫杉烷同时、分开或顺次给对象施用核苷类似物。在其他或另外的例子中，治疗可以包括与抗透明质酸剂同时、分开或顺次施用皮质类固醇。
在本文提供的组合、组合物、方法和用途中，抗透明质酸剂是透明质酸降解酶或是抑制透明质酸合成的试剂。在一些例子中，抗透明质酸剂是为透明质酸酶的透明质酸降解酶。在其他例子中，抗透明质酸剂是与聚合物缀合的透明质酸降解酶。在一些例子中，抗透明质酸剂是抑制透明质酸合成的试剂，选自针对HA合酶的有义或反义核酸分子或者是小分子药物。在一些例子中，抗透明质酸剂是选自4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物、或者来氟米特或其衍生物的小分子药物。在其他例子中，抗透明质酸剂是选自6,7-二羟基-4-甲基香豆素或5,7-二羟基-4-甲基香豆素的4-甲基伞形酮(MU)衍生物的小分子药物。
本文提供的是包含含有与聚合物缀合的透明质酸降解酶的组合物和含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物的组合。本文还提供的是包含含有与聚合物缀合的透明质酸降解酶的组合物、含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物和含有核苷类似物的组合物的组合。本文提供的组合中的任何均可进一步包含含有皮质类固醇的组合物。本文提供的是用于治疗癌症的方法，其中施用含有与聚合物缀合的透明质酸降解酶的组合物和含有肿瘤靶向紫杉烷制剂的组合物。在一些例子中，该方法进一步包括施用含有核苷类似物的组合物。在一些例子中，该方法进一步包括施用皮质类固醇。在另外其他例子中，该方法进一步包括施用癌症治疗。
本文提供的是包含含有透明质酸降解酶的组合物和含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物的组合、方法和用途，其中所述透明质酸降解酶与聚合物缀合。在组合的一些例子中，该组合物配制用于直接施用，透明质酸降解酶的浓度足以降解肿瘤相关透明质酸，并且肿瘤靶向紫杉烷的浓度足以实现肿瘤内递送。在一些例子中，与在不存在肿瘤内紫杉烷制剂的情况下的核苷脱氨酶的水平或活性相比较，肿瘤靶向紫杉烷制剂的浓度足以减少肿瘤内核苷脱氨酶蛋白质水平或蛋白质活性。在组合的一些例子中，透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷共配制。在组合的其他例子中，透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷分开提供。
在例子的任一个中，提供的组合进一步包含含有核苷类似物的组合物。在特定例子中，该组合物配制用于直接施用，并且核苷类似物的浓度足以实现肿瘤内递送。在组合的一些例子中，核苷类似物与透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷分开提供。在组合的其他例子中，核苷类似物与透明质酸降解酶共配制或与肿瘤靶向紫杉烷共配制。在组合的另外其他例子中，核苷类似物与透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷共配制。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，含有透明质酸降解酶的组合物、含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物和/或含有核苷类似物的组合物配制用于多重剂量施用。在本文提供的组合的其他例子中，含有透明质酸降解酶的组合物、含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物和/或含有核苷类似物的组合物配制用于单次剂量施用。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，透明质酸降解酶组合物含有或配制为含有在下述之间或大约在下述之间的与聚合物缀合的透明质酸降解酶：0.5μg-50mg、100μg-1mg、1mg-20mg、100μg-5mg、0.5μg-1450μg、1μg-1000μg、5μg-1250μg、10μg-750μg、50μg-500μg、0.5μg-500μg、500μg-1450μg。在本文提供的组合的其他例子中，与聚合物缀合的透明质酸降解酶具有至少或约20,000U/mg、25,000U/mg、30,000U/mg、31,000U/mg、32,000U/mg、33,000U/mg、34,000U/mg、35,000U/mg、36,000U/mg、37,000U/mg、38、000U/mg、39,000U/mg、40,000U/mg、45,000U/mg、50,000U/mg、55,000U/mg、60,000U/mg或更多的比活性。在本文提供的组合的进一步例子中，透明质酸降解酶组合物含有在下述之间或大约在下述之间的与聚合物缀合的透明质酸降解酶：150单位(U)-60,000U、300U-30,000U、500U-25,000U、500U-10,000U、150U-15,000U、150U-5000U、500U-1000U、5000U-45,000U 10,000U-50,000U或20,000U-60,000U。含有透明质酸降解酶的组合物体积可以在下述之间或大约在下述之间：0.5mL-100mL、0.5mL-50mL、0.5mL-10mL、1mL-40mL、1mL-20mL、1mL-10mL或3mL-10mL。在本文提供的组合的一些例子中，含有透明质酸降解酶的组合物含有组氨酸和/或NaCl。在其他例子中，含有透明质酸降解酶的组合物具有在6.0-7.4之间或大约在6.0-7.4之间的pH。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，透明质酸降解酶是透明质酸酶。例如，透明质酸酶可以是PH20或其截短形式，所述截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或GPI附着位点的部分。在一些例子中，透明质酸酶是为人或非人PH20的PH20。在具体例子中，透明质酸降解酶是截短的PH20并且截短的PH20包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列，或包含与含有SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。在一些例子中，透明质酸酶是含有与含有SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列的PH20。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，PH20含有这样的氨基酸序列，其含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短，或是其与含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短的氨基酸序列显示出至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的变体。例如PH20含有这样的氨基酸序列，其与含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，肿瘤靶向紫杉烷是紫杉醇或多西他赛或者是其类似物、衍生物或前药。肿瘤靶向紫杉烷可以与肿瘤靶向部分直接或间接连接。在一些例子中，肿瘤靶向紫杉烷配制为选自胶束、纳米颗粒、微球体、脂质体或水凝胶的递送媒介物。递送媒介物可以与肿瘤靶向部分直接或间接连接。在一些例子中，肿瘤靶向部分选自大分子、蛋白质、肽、单克隆抗体或脂肪酸脂质。在其他例子中，肿瘤靶向部分是选自西妥昔单抗或曲妥珠单抗的单克隆抗体。在另外其他例子中，肿瘤靶向部分是白蛋白。在一些例子中，肿瘤靶向紫杉烷是白蛋白结合的紫杉醇或白蛋白结合的多西他赛。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，肿瘤靶向紫杉烷组合物含有或配制为含有下述之间或大约在下述之间的肿瘤靶向紫杉烷：10mg-1000mg，例如20mg-500mg、10mg-250mg、75mg-400mg、100mg-200mg、150mg-400mg、200mg-800mg、50mg-200mg或50mg-150mg。在其他例子中，含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物体积可以在下述之间或大约在下述之间：0.5mL-100mL、1mL-500mL、0.5mL-50mL、0.5mL-10mL、1mL-40mL、1mL-20mL、1mL-10mL或3mL-10mL。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，核苷类似物是嘌呤或嘧啶类似物或其衍生物。在一些例子中，核苷类似物选自氟嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟-2'-脱氧胞苷、阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、氮杂胞苷、假异胞苷(pseudoisocytidine)、Zebularine、安西他滨、法扎拉滨、6-氮杂胞苷、卡培他滨、N4-十八烷基-阿糖胞苷、反油酸阿糖胞苷、氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨、呋咯地辛(forodesine)和喷司他丁或其衍生物。在一个例子中，核苷类似物是核苷脱氨酶的底物，所述核苷脱氨酶是腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶。在一些例子中，核苷类似物选自氟达拉滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨和氮杂胞苷或其衍生物。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，核苷类似物组合物含有或配制为含有100mg-5000mg、500mg-5000mg、500mg-2500mg、1000mg-2500mg、1500mg-2500mg或2000mg-5000mg核苷类似物。在其他例子中，含有核苷类似物的组合物体积可以在下述之间或大约在下述之间：0.5mL-1000mL，例如0.5mL-100mL、0.5mL-10mL、1mL-500mL、1mL-10mL。
本文提供的组合、方法和用途的任一个均可进一步包含含有皮质类固醇的组合物。在一些例子中，皮质类固醇是选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松的糖皮质激素。在一些例子中，皮质类固醇组合物含有或配制为含有下述之间或大约在下述之间的皮质类固醇：0.1-20mg、0.1-15mg、0.1-10mg、0.1-5mg、0.2-20mg、0.2-15mg、0.2-10mg、0.2-5mg、0.4-20mg、0.4-15mg、0.4-10mg、0.4-5mg、0.4-4mg、1-20mg、1-15mg或1-10mg。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，该组合物配制用于经口、静脉内(IV)、皮下、肌内、肿瘤内、皮内、局部、经皮、经直肠、鞘内或表皮下施用。例如，该组合物配制用于静脉内施用或皮下施用。
在本文提供的组合、方法和用途的例子的任一个中，所述聚合物是聚亚烷基二醇、右旋糖酐、普鲁兰(pullulan)或纤维素。在一个例子中，所述聚合物是选自聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(mPEG)的聚亚烷基二醇。在具体例子中，所述聚合物是PEG，并且PEG是分支或线性PEG。在一些例子中，所述聚合物通过与下述反应而产生：甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚(乙二醇)-对硝基苯基碳酸酯(PEG-对硝基苯基碳酸酯)(30kDa)；或聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。在具体例子中，所述聚合物是具有30或约30千道尔顿分子量的PEG。
本文提供的组合的任何均可包装为试剂盒且任选包括使用说明书。
本文还提供的是用于治疗癌症的方法或用途，其中施用含有透明质酸降解酶的组合物并且施用含有肿瘤靶向紫杉烷制剂的组合物，其中所述透明质酸降解酶与聚合物缀合。在该方法的例子的任一个中，还施用含有核苷类似物的组合物。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，癌症是肿瘤。在一个例子中，肿瘤是实体瘤。在本文方法或用途的例子的任一个中，与相同组织类型的非癌性组织相比较或与相同肿瘤类型的非转移性肿瘤相比较，所述肿瘤具有增加的细胞和/或基质透明质酸表达。在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，所述癌症选自胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫颈癌、头颈癌和乳腺癌。在具体例子中，所述癌症是胰腺癌。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，所述透明质酸降解酶是透明质酸酶。例如，所述透明质酸酶是PH20或其截短形式，所述截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或GPI附着位点的部分。在具体例子中，所述透明质酸酶是为人或非人PH20的PH20。在特定例子中，所述透明质酸降解酶是截短的PH20并且截短的PH20包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列或包含与至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。在一些例子中，PH20含有这样的氨基酸序列，其与至少含有SEQID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性。在其他例子中，PH20含有这样的氨基酸序列，其含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短，或是其与含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短的氨基酸序列显示出至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的变体。在另外其他例子中，PH20含有这样的氨基酸序列，其与含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，所述聚合物是聚亚烷基二醇、右旋糖酐、普鲁兰或纤维素。在一个例子中，该聚合物是选自聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(mPEG)的聚亚烷基二醇。在具体例子中，该聚合物是PEG并且PEG是分支或线性PEG。在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，该聚合物通过与下述反应而产生：甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚(乙二醇)-对硝基苯基碳酸酯(PEG-对硝基苯基碳酸酯)(30kDa)；或聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。在具体例子中，该聚合物是具有30或约30千道尔顿分子量的PEG。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，透明质酸降解酶以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围量施用或者配制用于以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围量施用：0.01μg/kg-25mg/kg(对象)、0.5μg/kg-25mg/kg、0.5μg/kg-10mg/kg、0.02mg/kg-1.5mg/kg、0.01μg/kg-15μg/kg、0.05μg/kg-10μg/kg、0.75μg/kg-7.5μg/kg或1.0μg/kg-3.0μg/kg(对象)。在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，透明质酸降解酶以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围量施用或者配制用于以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围量施用：1单位/kg-800,000单位/kg(对象)，例如10-800,000单位/kg、10-750,000单位/kg、10-700,000单位/kg、10-650,000单位/kg、10-600,000单位/kg、10-550,000单位/kg、10-500,000单位/kg、10-450,000单位/kg、10-400,000单位/kg、10-350,000单位/kg、10-320,000单位/kg、10-300,000单位/kg、10-280,000单位/kg、10-260,000单位/kg、10-240,000单位/kg、10-220,000单位/kg、10-200,000单位/kg、10-180,000单位/kg、10-160,000单位/kg、10-140,000单位/kg、10-120,000单位/kg、10-100,000单位/kg、10-80,000单位/kg、10-70,000单位/kg、10-60,000单位/kg、10-50,000单位/kg、10-40,000单位/kg、10-30,000单位/kg、10-20,000单位/kg、10-15,000单位/kg、10-12,800单位/kg、10-10,000单位/kg、10-9,000单位/kg、10-8,000单位/kg、10-7,000单位/kg、10-6,000单位/kg、10-5,000单位/kg、10-4,000单位/kg、10-3,000单位/kg、10-2,000单位/kg、10-1,000单位/kg、10-900单位/kg、10-800单位/kg、10-700单位/kg、10-500单位/kg、10-400单位/kg、10-300单位/kg、10-200单位/kg、10-100单位/kg、16-600,000单位/kg、16-500,000单位/kg、16-400,000单位/kg、16-350,000单位/kg、16-320,000单位/kg、16-160,000单位/kg、16-80,000单位/kg、16-40,000单位/kg、16-20,000单位/kg、16-16,000单位/kg、16-12,800单位/kg、16-10,000单位/kg、16-5,000单位/kg、16-4,000单位/kg、16-3,000单位/kg、16-2,000单位/kg、16-1,000单位/kg、16-900单位/kg、16-800单位/kg、16-700单位/kg、16-500单位/kg、16-400单位/kg、16-300单位/kg、16-200单位/kg、16-100单位/kg、160-12,800单位/kg、160-8,000单位/kg、160-6,000单位/kg、160-4,000单位/kg、160-2,000单位/kg、160-1,000单位/kg、160-500单位/kg、500-5000单位/kg、1000-100,000单位/kg或1000-10,000单位/kg(对象)。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，肿瘤靶向紫杉烷是紫杉醇或多西他赛或者是其类似物、衍生物或前药。肿瘤靶向紫杉烷可以与肿瘤靶向部分直接或间接连接。在一些例子中，肿瘤靶向紫杉烷配制为选自胶束、纳米颗粒、微球体、脂质体或水凝胶的递送媒介物。递送媒介物可以与肿瘤靶向部分直接或间接连接。在一些例子中，肿瘤靶向部分选自大分子、蛋白质、肽、单克隆抗体或脂肪酸脂质。在其他例子中，肿瘤靶向部分是选自西妥昔单抗或曲妥珠单抗的单克隆抗体。在另外一个例子中，肿瘤靶向部分是白蛋白。在特定例子中，肿瘤靶向紫杉烷是白蛋白结合的紫杉醇或白蛋白结合的多西他赛。在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，肿瘤靶向紫杉烷以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围施用或者配制用于以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围施用：1mg/m2-1000mg/m2(对象的体表面积)、10mg/m2-500mg/m2、50mg/m2-400mg/m2或25mg/m2-300mg/m2。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，核苷类似物是嘌呤或嘧啶类似物或其衍生物。在例子的任一个中，核苷类似物选自氟嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟-2'-脱氧胞苷、阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、氮杂胞苷、假异胞苷、Zebularine、安西他滨、法扎拉滨、6-氮杂胞苷、卡培他滨、N4-十八烷基-阿糖胞苷、反油酸阿糖胞苷、氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨、呋咯地辛和喷司他丁或其衍生物。在特定例子中，核苷类似物是核苷脱氨酶的底物并且核苷脱氨酶是腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶。在例子中，核苷类似物选自氟达拉滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨和氮杂胞苷或其衍生物。在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，核苷类似物以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围施用或者配制用于以在下述之间或大约在下述之间的剂量范围施用：100mg/m2-2500mg/m2、500mg/m2-2000mg/m2、750mg/m2-1500mg/m2、1000mg/m2-1500mg/m2或500mg/m2-1500mg/m2。在本文提供的方法或用途的其他例子中，核苷类似物以这样的量施用或配制用于以这样的量施用，所述量是至少或至少约200mg/m2或500mg/m2，但小于1000mg/m2或1250mg/m2。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，该组合物经口、静脉内(IV)、皮下、肌内、肿瘤内、皮内、局部、经皮、经直肠、鞘内或表皮下施用，或者配制用于经口、静脉内(IV)、皮下、肌内、肿瘤内、皮内、局部、经皮、经直肠、鞘内或表皮下施用。在特定例子中，该组合物静脉内施用或皮下施用。在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，透明质酸降解酶在肿瘤靶向紫杉烷之前、同时或接近同时、顺次或间歇施用或使用。
在本文提供的方法的例子中，透明质酸降解酶在肿瘤靶向紫杉烷施用前施用。在一个例子中，透明质酸降解酶在肿瘤靶向紫杉烷施用前至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时施用。在本文提供的方法的另一个例子中，透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷同时或接近同时施用。
在本文提供的方法的例子的任一个中，透明质酸降解酶的施用频率是每周两次、每周一次、每14天一次、每21天一次或每月一次。在其他例子中，肿瘤靶向紫杉烷的施用频率是每周两次、每周一次、每14天一次、每21天一次或每月一次。在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷在核苷类似物之前、同时或接近同时、顺次或间歇施用，或者配制用于在核苷类似物之前、同时或接近同时、顺次或间歇施用。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷在施用周期中施用预定周数。在一个例子中，预定周数可以是至少两周、至少三周或至少四周。在一些例子中，透明质酸降解酶在核苷类似物施用前至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时施用。在一些例子中，肿瘤靶向紫杉烷在核苷类似物施用前至少或至少约或约或1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时施用。在特定例子中，肿瘤靶向紫杉烷与核苷类似物同时或接近同时施用。在提供的方法中，核苷类似物的施用频率可以是每周两次、每周一次、每14天一次、每21天一次或每月一次。在一些例子中，核苷类似物在施用周期中施用预定周数。例如，预定周数可以是至少两周、至少三周或至少四周。在本文提供的方法的另一个例子中，在核苷类似物施用预定周数后，施用中断第一预定时间段，并且随后重新开始至少一周。
在本文提供的方法或用途的特定例子中，透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷在核苷类似物施用之前施用；同时或接近同时施用；并且以每周两次或两周一次的频率施用预定周数。在一些例子中，预定周数是四周。在此类例子中，核苷类似物在透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷施用之后至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时施用。
在本文提供的方法或用途的例子的任一个中，核苷类似物每周一次施用预定周数。在一个例子中，预定周数是三周。在此类例子中，施用可以中断至少一周。
在本文提供的方法或用途的任一个中，施用周期和/或施用中断可以重复多次。在一些例子中，在第一施用周期中的施用频率与后续施用周期中的施用频率相同或不同。例如，施用频率在第一施用周期中是每周两次，对于后续施用周期是每周一次。
本文提供的方法或用途的任一个均可进一步包括施用皮质类固醇的步骤或包括施用皮质类固醇的治疗。在此类例子的任一个中，皮质类固醇是可以选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松的糖皮质激素。在该方法的一些例子中，皮质类固醇在透明质酸降解酶施用之前、同时、间歇或之后施用。在一个例子中，皮质类固醇与透明质酸降解酶共施用。在另一个例子中，皮质类固醇在透明质酸降解酶施用之前至少或约至少1小时施用。在提供的方法的另一个例子中，皮质类固醇在透明质酸降解酶施用之后至少8小时-12小时施用。在一些例子中，施用或配制用于施用的皮质类固醇量在下述之间或大约在下述之间：0.1-20mg、0.1-15mg、0.1-10mg、0.1-5mg、0.2-20mg、0.2-15mg、0.2-10mg、0.2-5mg、0.4-20mg、0.4-15mg、0.4-10mg、0.4-5mg、0.4-4mg、1-20mg、1-15mg或1-10mg。皮质类固醇可以经口施用。
本文提供的方法或用途的任一个均可进一步包括癌症治疗的施用。在一些例子中，癌症治疗选自手术、放射、化疗剂、生物制剂、多肽、抗体、肽、小分子、基因疗法载体、病毒和DNA。本文提供的方法的任一个均可用于治疗其为人的对象。
本文还提供的是本文提供的组合物组合可以用于治疗癌症的用途。本文提供的组合物组合中的任一均可用于治疗癌症。在一些例子中，癌症是肿瘤。例如，癌症是实体瘤。在一些例子中，与相同组织类型的非癌性组织相比较或与相同肿瘤类型的非转移性肿瘤相比较，所述肿瘤具有增加的细胞和/或基质透明质酸表达。在一些例子中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫颈癌、头颈癌和乳腺癌。在特定例子中，癌症是胰腺癌。本文还提供的是含有与聚合物缀合的透明质酸降解酶的组合和含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物用于增加核苷类似物的肿瘤内活性的用途。
附图说明
图1描述了PEGPH20(P)和/或nab-紫杉醇(NAB，N)对小鼠BxPC-3PDA肿瘤异种移植物模型中的肿瘤生长的作用。
图2描述了施用不同剂量的吉西他滨(GEM)对小鼠BxPC-3PDA肿瘤异种移植物模型中的肿瘤生长的作用。
图3描述了PEGPH20(P)、吉西他滨(GEM)和/或nab-紫杉醇(NAB，N)对小鼠BxPC-3PDA肿瘤异种移植物模型中的肿瘤生长的作用。
图4描述了在小鼠BxPC-3PDA肿瘤异种移植物模型中，用PEGPH20(P)、吉西他滨(GEM)和/或nab-紫杉醇(NAB，N)处理的小鼠的平均存活时间。
图5描述了在小鼠BxPC-3PDA肿瘤异种移植物模型中，来自用PEGPH20(P)、吉西他滨(GEM)和/或nab-紫杉醇(NAB，N)处理的小鼠的血清的CA19-9(图5A)和CEA标记(图5B)水平。
图6描述了在异种移植物模型中，PEGPH20和白蛋白缀合的紫杉醇(Ab-pac)的肿瘤生长抑制。图6A描述了在MDA-MB-468/HAS3肿瘤模型中，用媒介物、与白蛋白缀合的紫杉醇(Ab-pac)、PEGPH20、或Ab-pac和PEGPH20处理的小鼠中的肿瘤生长抑制。图6B描述了在MDA-MB-468/HAS3肿瘤模型中，用媒介物、以1mg/kg的与白蛋白缀合的紫杉醇(Ab-pac)、以3mg/kg的Ab-pac、以1mg/kg的Ab-pac和PEGPH20、或以10mg/kg的Ab-pac处理的小鼠中的肿瘤生长抑制。
具体实施方式
概要
A.定义
B.抗透明质酸剂组合疗法
1.实体瘤和肿瘤靶向疗法
a.肿瘤靶向紫杉烷
b.抗透明质酸剂
2.抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷组合疗法
C.组合疗法试剂
1.抗透明质酸剂
a.抑制透明质酸合成的试剂
b.透明质酸降解酶和聚合物缀合的透明质酸降解酶
i.透明质酸酶
(a)哺乳动物型透明质酸酶
PH20
(b)细菌透明质酸酶
(c)来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶
ii.其他透明质酸降解酶
iii.可溶性透明质酸降解酶
(a)可溶性人PH20
(b)rHuPH20
iv.透明质酸降解酶的糖基化
v.经修饰的(聚合物缀合的)透明质酸降解酶
聚乙二醇化可溶性透明质酸降解酶
2.紫杉烷及其制剂
a.紫杉烷
b.肿瘤或基质靶向紫杉烷
白蛋白结合的紫杉烷
3.进一步的化疗剂(例如核苷类似物)
示例性核苷类似物
i.吉西他滨
ii.阿糖胞苷
ii.地西他滨
iv.氮杂胞苷
D.产生透明质酸降解酶的核酸及编码多肽的方法
1.载体和细胞
2.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化技术
4.透明质酸降解酶多肽的聚乙二醇化
E.药物组合物和制剂
1.制剂
a.注射剂、溶液和乳状液
b.冻干粉末
c.局部施用
d.用于其他施用途径的组合物
2.制剂量
3.包装和制造物品
F.评价活性、生物利用度和药物代谢动力学的方法
1.体外测定法
a.透明质酸降解酶的透明质酸酶活性
b.紫杉烷活性
c.抗癌剂活性
2.体内动物模型
3.药物代谢动力学和耐受性
G.组合疗法的方法和用途
1.癌症
用于治疗的对象选择
2.剂量和施用
3.给药方案：施用频率和周期
4.另外的组合疗法
a.皮质类固醇
b.抗癌剂及其他治疗
H.实施例
A.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。除非另有说明，否则本文整体公开内容自始至终提及的所有专利、专利申请、公开申请和出版物、基因库序列、数据库、网站及其他公开材料整体引入作为参考。在存在用于本文术语的多个定义的情况下，以这个部分中的定义为准。当提及URL或其他此类标识符或地址时，应当理解此类标识符可以改变，并且在因特网上的特定信息可以是不定的，但等价信息可以通过搜索因特网找到。对其的提及证明此类信息的可用性和公开传播。
如本文使用的，“组合疗法”指其中对象给予两种或更多种治疗剂例如至少两种或至少三种治疗剂用于治疗单一疾病的治疗。对于本文目的，组合疗法包括用聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷以及任选地进一步的抗癌剂或化疗剂例如核苷类似物的疗法。
如本文使用的，紫杉烷指抗有丝分裂剂或抗微管剂家族，其由于干扰微管聚合通过停止有丝分裂和细胞分裂而抑制细胞生长。紫杉烷包括由红豆杉属(Taxus)植物(紫杉)产生的天然二萜。紫杉烷还包括显示出抗有丝分裂或抗微管活性的合成产生的紫杉烷。通常，紫杉烷共享含有四个环(六元A和C环、八元B环和四元D环)的共同核心结构。示例性紫杉烷是紫杉醇、紫杉烷或其衍生物或类似物。
如本文使用的，抗有丝分裂活性指抑制、减少或预防有丝分裂。由于此类活性，细胞生长得到抑制、减少或预防。例如，如果与在不存在试剂的情况下的细胞生长相比较，细胞生长被抑制至少或约至少或20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则该试剂显示出抗有丝分裂活性。
如本文使用的，抗微管活性指例如通过降低、减少或预防微管聚合而干扰微管的任何试剂活性。因此，抗微管活性可以指稳定微管的任何活性，所述微管是天然不稳定的并经历动态解聚(缩短)和聚合(延长)过程。例如，抗微管活性通过试剂例如紫杉烷实现，所述紫杉烷与微管末端相互作用，由此冷冻或预防解聚或装配。评价微管聚合的测定法是本领域已知的，并且示例性测定法在本文中描述。如果与在不存在所述试剂的情况下的聚合相比较，所述试剂使微管聚合抑制至少或约至少或20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则存在抗微管活性。
如本文使用的，“肿瘤靶向紫杉烷”指这样的紫杉烷，其与部分直接或间接连接并且与未连接至肿瘤部分的紫杉烷相比较，显示出对于肿瘤表面上的一种或多种分子增加的特异性。例如，所述部分可以是大分子、肽、蛋白质、抗体(例如单克隆抗体)或脂质，其与肿瘤表面上存在的分子例如肿瘤表面上存在的糖、脂质、糖胺聚糖或蛋白质相互作用或结合(例如特异性结合)。一般地，肿瘤表面上存在的分子存在的水平或程度是异常的或不同于非肿瘤组织或正常组织或细胞。
如本文使用的，短语“足以实现肿瘤内递送”意指紫杉烷显示出对肿瘤细胞比对非肿瘤细胞增加或更大的靶向，并且因此显示出在其中增加或更大的细胞内定位。评价肿瘤内递送的测定法可以包括体外或体内测定法，例如结合测定法或亚细胞定位测定法，由此在正常细胞和肿瘤细胞之间比较药物例如紫杉烷的结合或细胞内水平或量。此类测定法包括但不限于免疫测定法，包括放射性免疫测定法或ELISA(例如基于裂解产物的ELISA或红外ELISA；还参见Svojanovsky等人(1999)Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis，20:549-555)；基于微管蛋白的生物测定法(参见例如Suye等人(1997)Anal.Chem.，69:3633-3635)；组织化学或免疫组织化学(Hong等人(2007)Mol.Cancer.Ther.，6:3239)；HPLC；基于荧光的测定法包括流式细胞术及其他方法(参见例如Sheikh等人(2001)Biosensors&Bioelectronics，16:647-652)，以及本领域技术人员已知的其他相似测定法。用于此类方法中的针对紫杉烷的抗体是可获得的(参见例如Grothaus等人(1995)J Nat.Prod.，58:1003-14；Leu等人(1993)Cancer Res.，53:1388-1391；目录号ab26953，Abcam)。还可以使用生物传感器技术(参见例如Braunhut等人(2005)Assay and Drug Dev.Tech.，3:77-88)。测定法还可以包括间接测定法，由此评价紫杉烷对细胞机制的活性，包括对肿瘤细胞凋亡和肿瘤生长包括肿瘤大小或体积的作用。
如本文使用的，抗透明质酸剂指调节透明质酸(HA)合成或降解、从而改变组织或细胞中透明质酸水平的任何试剂。为了本文目的，与不存在所述试剂的情况下相比较，抗透明质酸剂减少组织或细胞中的透明质酸水平。此类试剂包括这样的化合物，其调节编码HA合酶(HAS)以及涉及透明质酸代谢的其他酶或受体的遗传材料的表达，或者调节合成或降解透明质酸包括HAS功能或活性的蛋白质。所述试剂包括小分子、核酸、肽、蛋白质或其他化合物。例如，抗透明质酸剂包括但不限于反义或有义分子、抗体、酶、小分子抑制剂和HAS底物类似物。
如本文使用的，“缀合物”指与一种或多种其他多肽或化学部分直接或间接连接的多肽。此类缀合物包括融合蛋白，通过化学缀合产生的那些和通过任何其他方法产生的那些。例如，缀合物指与一种或多种其他多肽或化学部分直接或间接连接的透明质酸降解酶，例如透明质酸酶或可溶性PH20多肽，由此至少一种可溶性PH20多肽与另一种多肽或化学部分直接或间接连接，只要缀合物保留透明质酸酶活性即可。
如本文使用的，“聚合物缀合的透明质酸降解酶”指与聚合物直接或间接连接的透明质酸降解酶。连接可以是任何类型的连接，包括但不限于离子键和共价键，以及任何其他足够稳定结合的相互作用。提及聚合物缀合的透明质酸降解酶意指缀合物显示出透明质酸酶活性。通常，与未缀合至聚合物的透明质酸降解酶相比较，聚合物缀合物显示出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的透明质酸酶活性。
如本文使用的，透明质酸降解酶指催化透明质酸聚合物(也称为透明质酸或HA)切割成更小分子量的片段的酶。示例性透明质酸降解酶是透明质酸酶，且特别是具有使透明质酸解聚的能力的软骨素酶和裂解酶。其为透明质酸降解酶的示例性软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称为软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称为硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素消除酶(eliminase))和软骨素C裂解酶。软骨素ABC裂解酶包含两种酶，硫酸软骨素ABC内切裂解酶(EC 4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外切裂解酶(EC4.2.2.21)。示例性硫酸软骨素ABC内切裂解酶和硫酸软骨素ABC外切裂解酶包括但不限于来自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的那些(普通变形杆菌硫酸软骨素ABC内切裂解酶在SEQ ID NO:98中显示；Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1):39-46)。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于来自肝素黄杆菌(SEQ ID NO:99中所示)、Victivallis vadensis(SEQ ID NO:100中所示)和金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)的那些(Tkalec等人(2000)Applied andEnvironmental Microbiology 66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews inBiochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)。来自细菌的示例性软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属(Streptococcus)和黄杆菌属(Flavobacterium)的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262:127-133)。
如本文使用的，透明质酸酶指一类透明质酸降解酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)，来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，和哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶包括非人起源的、包括但不限于鼠、犬、猫、兔、禽类、牛、绵羊、猪、马、鱼、蛙、细菌的任何酶以及来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的任何酶。示例性非人透明质酸酶包括来自下述的透明质酸酶：牛(SEQ ID NO:10、11、64和BH55(美国专利号5,747,027和5,827,721))、黄蜂(SEQ ID NO:12和13)、蜜蜂(SEQ ID NO:14)、白脸大黄蜂(SEQ ID NO:15)、胡蜂(SEQ ID NO:16)、小鼠(SEQ ID NO:17-19、32)、猪(SEQ ID NO:20-21)、大鼠(SEQ ID NO:22-24、31)、兔(SEQ ID NO:25)、绵羊(SEQ ID NO:26、27、63和65)、黑猩猩(SEQ ID NO:185)、恒河猴(SEQ ID NO:102)、猩猩(SEQ ID NO:28)、食蟹猴(SEQ ID NO:29)、豚鼠(SEQ ID NO:30)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)(菌株FB24)(SEQ ID NO:67)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)(SEQ IDNO:68)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(SEQ ID NO:69)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)((SEQ ID NO:70)；18RS21(SEQ ID NO:71)；血清型Ia(SEQ ID NO:72)；和血清型III(SEQ ID NO:73))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(菌株COL(SEQ ID NO:74)；菌株MRSA252(SEQ IDNO:75和76)；菌株MSSA476(SEQ ID NO:77)；菌株NCTC 8325(SEQ ID NO:78)；菌株牛RF122(SEQ ID NO:79和80)；和菌株USA300(SEQ ID NO:81))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)((SEQ ID NO:82)；菌株ATCCBAA-255/R6(SEQ ID NO:83)；血清型2、菌株D39/NCTC 7466(SEQ IDNO:84))、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(血清型M1(SEQ ID NO:85)；血清型M2、菌株MGAS10270(SEQ ID NO:86)；血清型M4、菌株MGAS10750(SEQ ID NO:87)；血清型M6(SEQ ID NO:88)；血清型M12、菌株MGAS2096(SEQ ID NO:89和90)；血清型M12、菌株MGAS9429(SEQ IDNO:91)；和血清型M28(SEQ ID NO:92))；猪链球菌(Streptococcus suis)(SEQID NO:93-95)；费氏弧菌(Vibrio fischeri)(菌株ATCC 700601/ES114(SEQ IDNO:96))，和Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对于透明质酸是特异性的并且不切割软骨素或硫酸软骨素(Ohya，T.和Kaneko，Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta 198:607)。透明质酸酶还包括人起源的那些。示例性人透明质酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO:36)、HYAL2(SEQ ID NO:37)、HYAL3(SEQ ID NO:38)、HYAL4(SEQ ID NO:39)和PH20(SEQ ID NO:1)。在透明质酸酶中还包括的是可溶性透明质酸酶，包括绵羊和牛PH20、可溶性人PH20和可溶性rHuPH20。商购可得的牛或绵羊可溶性透明质酸酶的例子包括(绵羊透明质酸酶)、(牛透明质酸酶)和HydaseTM(牛透明质酸酶)。
如本文使用的，“纯化的牛睾丸透明质酸酶”指由牛睾丸提取物纯化的牛透明质酸酶(参见美国专利号2,488,564、2,488,565、2,806,815、2,808,362、2,676,139、2,795,529、5,747,027和5,827,721)。商购可得的纯化的牛睾丸透明质酸酶的例子包括和HydaseTM，以及牛透明质酸酶包括但不限于可得自Sigma Aldrich、Abnova、EMD Chemicals、GenWay Biotech，Inc.、Raybiotech，Inc.和Calzyme的那些。还包括的是重组产生的牛透明质酸酶，例如但不限于通过表达SEQ ID NO:190-192中任一所示的核酸分子生成的那些。
如本文使用的，“纯化的绵羊睾丸透明质酸酶”指由绵羊睾丸提取物纯化的绵羊透明质酸酶(参见美国专利号2,488,564，2,488,565和2,806,815以及国际PCT申请号WO2005/118799)。商购可得的纯化的绵羊睾丸透明质酸酶的例子包括以及绵羊透明质酸酶包括但不限于可得自SigmaAldrich、Cell Sciences、EMD Chemicals、GenWay Biotech，Inc.、Mybiosource.com和Raybiotech，Inc的那些。还包括的是重组产生的绵羊透明质酸酶，例如但不限于通过表达SEQ ID NO:66和193-194中任一所示的核酸分子生成的那些。
如本文使用的，“PH20”指在精子中出现并且是中性活性的一类透明质酸酶。PH20在精子表面上和在溶酶体衍生的顶体中出现，在其中它与顶体内膜结合。PH20包括任何起源包括但不限于人、黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、鼠、牛、绵羊、豚鼠、兔和大鼠起源的那些。示例性PH20多肽包括来自人(SEQ ID NO:1)、黑猩猩(SEQ ID NO:101)、恒河猴(SEQ ID NO:102)、食蟹猴(SEQ ID NO:29)、牛(例如SEQ ID NO:11和64)、小鼠(SEQ ID NO:32)、大鼠(SEQ ID NO:31)、兔(SEQ ID NO:25)、绵羊(SEQ ID NO:27、63和65)和豚鼠(SEQ ID NO:30)的那些。
提及透明质酸降解酶包括前体透明质酸降解酶多肽和成熟透明质酸降解酶多肽(例如其中信号序列已去除的那些)、其具有活性的截短形式，并且包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体、及其他变体，包括与SEQ ID NO：1和10-48、63-65、67-102中所示的前体多肽具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的多肽，或其成熟形式。例如，提及透明质酸降解酶还包括SEQ ID NO:50-51中所示的人PH20前体多肽变体。透明质酸降解酶还包括含有化学或翻译后修饰的那些以及不含化学或翻译后修饰的那些。此类修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其他多肽修饰。截短的PH20透明质酸酶是其任何C末端缩短形式，特别是截短的并且当N-糖基化时是中性活性的形式。
如本文使用的，“可溶性PH20”指在生理条件下可溶的任何形式的PH20。可溶性PH20可以例如通过其在37℃下分配到X-114溶液的水相内进行鉴定(Bordier等人，(1981)J.Biol.Chem.，256:1604-7)。膜锚定PH20例如脂质锚定的PH20包括GPI锚定的PH20将分配到富含去污剂的相内，但在用磷脂酶-C处理后将分配到去污剂很少的相或水相内。在可溶性PH20中包括的是其中与PH20锚定至膜相关的一个或多个区域已被去除或修饰的膜锚定的PH20，其中可溶形式保留透明质酸酶活性。可溶性PH20还包括重组可溶性PH20和在天然来源中含有或由天然来源纯化的那些，例如来自绵羊或牛的睾丸提取物。示例性此类可溶性PH20是可溶性人PH20。
如本文使用的，可溶性人PH20或sHuPH20包括缺乏在C末端处的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚序列的全部或部分的PH20多肽，从而使得在表达后，多肽在生理条件下是可溶的。可溶性可以通过证实在生理条件下的可溶性的任何合适方法进行评价。示例性此类方法是X-114测定法，其评价进入水相内的分配并且在上文和实施例中描述。另外，如果在CHO细胞例如CHO-S细胞中产生，则可溶性人PH20多肽是被表达且被分泌到细胞培养基内的多肽。然而，可溶性人PH20多肽并不限于在CHO细胞中产生的那些，而是可以在任何细胞中或通过任何方法包括重组表达和多肽合成产生。提及通过CHO细胞分泌是明确的。因此，如果多肽可以通过CHO细胞表达并分泌并且是可溶的，即当用X-114提取时分配到水相内，则无论它是否如此产生，它都是可溶性PH20多肽。sHuPH20多肽的前体多肽可以包括信号序列，例如异源或非异源(即天然)信号序列。示例性前体是包括信号序列例如在氨基酸位置1-35(参见例如SEQ ID NO:1的氨基酸1-35)处的天然35氨基酸信号序列的那些。
如本文使用的，“延长的可溶性PH20”或“esPH20”包括可溶性PH20多肽，其含有直到GPI锚附着信号序列的残基和来自GPI锚附着信号序列的一个或多个连续残基，从而使得esPH20在生理条件下是可溶的。在生理条件下的可溶性可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行测定。例如，它可以通过上文和实施例中所述的X-114测定法进行评价。另外，如上所述，如果在CHO细胞例如CHO-S细胞中产生，则可溶性PH20是被表达且被分泌到细胞培养基内的多肽。然而，可溶性人PH20多肽并不限于在CHO细胞中产生的那些，而是可以在任何细胞中或通过任何方法包括重组表达和多肽合成产生。提及通过CHO细胞分泌是明确的。因此，如果多肽可以通过CHO细胞表达并分泌并且是可溶的，即当用X-114提取时分配到水相内，则无论它是否如此产生，它都是可溶性PH20多肽。除残基36-490之外，人可溶性esPH20多肽还包括自SEQ ID NO:1的氨基酸残基位置491的一个或多个连续氨基酸(包括端点)，从而使得所得到的多肽是可溶的。示例性人esPH20可溶性多肽是具有对应于SEQ ID NO:1的氨基酸36-491、36-492、36-493、36-494、36-495、36-496和36-497的氨基酸残基的那些。示例性多肽是具有SEQ ID NO:151-154和185-187中任一所示的氨基酸序列的那些。还包括的是等位基因变体及其他变体，例如与SEQ IDNO:151-154和185-187的对应多肽具有40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的任一，其保留中性活性且是可溶的。提及序列相同性指具有氨基酸取代的变体。
如本文使用的，提及“esPH20”包括前体esPH20多肽和成熟esPH20多肽(例如其中信号序列已去除的那些)，其具有酶促活性(保留至少1％、10％、20％、30％、40％、50％或更多的全长形式)且是可溶的截短形式，并且包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体、及其他变体，包括与SEQID NO:1和3中所示的前体多肽具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的多肽，或其成熟形式。
如本文使用的，提及“esPH20”还包括含有化学或翻译后修饰的那些以及不含化学或翻译后修饰的那些。此类修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其他多肽修饰。
如本文使用的，“可溶性重组人PH20(rHuPH20)”指含有如在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达并分泌的可溶形式的人PH20的组合物。可溶性rHuPH20由核酸分子编码，所述核酸分子包括信号序列并且显示于SEQ IDNO:49中。编码可溶性rHuPH20的核酸在分泌成熟多肽的CHO细胞中表达。当在培养基中产生时，在C末端处存在异质性，从而使得产物包括种的混合物，所述种可以包括不同丰度的SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:9中的任何一个或多个。
类似地，对于其他形式的PH20，例如esPH20，重组表达的多肽及其组合物可以包括其C末端显示出异质性的多个种类。例如，通过表达SEQ IDNO:151(其编码具有36-497氨基酸的esPH20)多肽产生的重组表达esPH20的组合物可以包括具有更少氨基酸例如36-496或36-495的形式。
如本文使用的，“N联部分”指多肽的天冬酰胺(N)氨基酸残基，其能够通过多肽的翻译后修饰被糖基化。人PH20的示例性N联部分包括SEQ IDNO:1中所示的人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393。
如本文使用的，“N糖基化多肽”指含有至少三个N联氨基酸残基的寡糖连接例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基N235、N368和N393的N联部分的PH20多肽或其截短形式。N糖基化多肽可以包括其中三个、四个、五个和直至所有N联部分与寡糖连接的多肽。N联寡糖可以包括寡聚甘露糖、复合物、杂交物或硫酸化寡糖、或其他寡糖和单糖。
如本文使用的，“N部分糖基化多肽”指最低限度含有与至少三个N联部分连接的N-乙酰葡糖胺聚糖的多肽。部分糖基化多肽可以包括多种聚糖形式，包括单糖、寡糖和分支糖形式，包括通过用EndoH、EndoF1、EndoF2和/或EndoF3处理多肽形成的那些。
如本文使用的，“去糖基化PH20多肽”指其中少于所有可能的糖基化位点是糖基化的PH20多肽。去糖基化可以例如通过去除糖基化，通过预防糖基化，或通过修饰多肽以消除糖基化位点来实现。特定N糖基化位点不是活性所需的，而其他的则是。
如本文使用的，“聚合物”指由重复单位构成的任何高分子量天然或合成部分。聚合物包括但不限于聚乙二醇部分、右旋糖酐、纤维素和唾液酸。这些及其他示例性聚合物在本文中描述，并且许多是本领域已知的。为了本文目的，聚合物可以与多肽缀合，即直接或经由接头间接地与多肽稳定连接。此类聚合物缀合物通常增加血清半衰期，并且包括但不限于唾液酸部分、聚乙二醇化部分、右旋糖酐、以及糖和其他部分例如糖基化。例如，透明质酸酶例如可溶性PH20或rHuPH20可以与聚合物缀合。
如本文使用的，“聚乙二醇化”指聚合分子例如聚乙二醇(聚乙二醇化部分PEG)与蛋白质的共价或其他稳定附着，所述蛋白质包括透明质酸降解酶，例如透明质酸酶，通常用于增加透明质酸降解酶的半衰期。
如本文使用的，抗癌剂或化疗剂指能够杀死快速分裂的细胞例如癌细胞的试剂。本领域技术人员熟悉抗癌剂，包括化疗剂。示例性试剂在本文中描述。
如本文使用的，核苷类似物(或相似体)指在DNA复制过程中替换或模拟核酸构件块之一例如嘌呤或嘧啶核苷的试剂。该过程可以停滞肿瘤生长，因为另外的核苷不能附着。示例性核苷类似物是吉西他滨，其是脱氧胞苷类似物，并且在代谢活化后，形成模拟或替换核苷胞苷的三磷酸盐以掺入DNA内并竞争性抑制DNA合成。
如本文使用的，核苷脱氨酶指实现核苷脱氨基的酶。例如，胞苷脱氨酶(CDA)使胞苷和脱氧胞苷分别脱氨基为尿苷和脱氧尿苷。腺苷脱氨酶(ADA)使腺苷脱氨基，通过以氨基取代羟基，将其转换为相关核苷肌苷。
如本文使用的，核苷脱氨酶的底物是这样的分子，在核苷脱氨酶存在下，其可以脱氨基为无活性代谢产物，并且因此失活。评价脱氨基的测定法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于用于代谢产物和脱氨基代谢产物的高效液相色谱法(HPLC)或质谱法，脱氨基测定法例如使用过量尿嘧啶-DNA转葡糖基酶基于UDG的脱氨基测定法(参见例如Morgan等人(2004)J.Biol.Chem.，279:52353-52360)或通过评价已知表达核苷脱氨酶的细胞中的细胞毒性。
如本文使用的，短语“足以减少核苷脱氨酶蛋白质水平或蛋白质活性”指为了抑制核苷脱氨酶活性所需的紫杉烷的量。例如，抑制可以通过使用如上所述用于脱氨基的测定法评价脱氨酶(例如胞苷脱氨酶)的脱氨基活性进行评价。抑制还可以通过测定细胞内脱氨酶蛋白质水平进行评价。评价亚细胞蛋白质的测定法是本领域技术人员众所周知的，并且包括例如基于细胞的ELISA、流式细胞术或蛋白质检测方法例如蛋白质印迹。一般地，此类测定法可以对细胞裂解产物或渗透化细胞进行。例如，用于胞苷脱氨酶的蛋白质印迹可以通过下述进行：使总细胞裂解产物溶解，分离蛋白质，并且使用针对CDA的抗体(例如目录号ab82346，Abcam)就脱氨酶免疫印迹，随后与次级辣根过氧化物酶抗体一起温育，并检测。一般地，如果蛋白质水平或活性减少至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则量足以减少核苷脱氨酶蛋白质水平或蛋白质活性。
如本文使用的，前药是在生物转化后显示出药理学活性的化合物。例如，核苷类似物例如吉西他滨是前药，由此活性由于通过脱氧胞苷激酶细胞内转换为两种活性代谢产物，吉西他滨二磷酸盐和吉西他滨三磷酸盐而发生。三磷酸盐(二氟脱氧胞苷三磷酸)与内源脱氧核苷三磷酸竞争掺入DNA内。
如本文使用的，衍生物指这样的药物形式，与参考药物或试剂相比较，其已经历来自参考药物或试剂的变化或修饰，但仍保留活性(例如显示出增加或降低的活性)。通常，化合物的衍生物形式意指化合物的侧链已被修饰或改变。
如本文使用的，药物或试剂的相似体或类似物是与参考药物相关，但其化学和生物活性可以不同的药物或试剂。通常，相似体显示出与参考药物或试剂相似的活性，但活性可以是增加的或降低的或在其他方面改善的。通常，化合物或药物的相似体形式意指与参考药物相比较，结构的主链核心是修饰的或改变的。
如本文使用的，“活性”指与全长(完全)蛋白质相关的多肽或其部分的一种或多种功能活性。例如，多肽的活性片段可以显示出全长蛋白质的活性。功能活性包括但不限于生物学活性、催化或酶促活性、抗原性(与多肽结合或竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力、和与多肽的受体或配体特异性结合的能力。
如本文使用的，“透明质酸酶活性”指酶促催化透明质酸切割的能力。用于透明质酸酶的美国药典(USP)XXII测定法通过测量在允许该酶在37℃下与HA反应30分钟后剩余的高分子量透明质酸或透明质酸(HA)底物的量，间接测定透明质酸酶活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645美国药典公约，Inc，Rockville，MD)。参考标准溶液可以在测定法中用于确定以单位表示的任何透明质酸酶的相对活性。测定透明质酸酶例如PH20包括可溶性PH20和esPH20的透明质酸酶活性的体外测定法是本领域已知且在本文中描述的。示例性测定法包括微浊度测定法和生物素化的透明质酸测定法，所述微浊度测定法通过检测在未切割的透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀物，间接测量通过透明质酸酶的透明质酸切割，所述生物素化的透明质酸测定法通过用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物和生色底物检测与微量滴定板孔非共价结合的剩余生物素化的透明质酸，间接测量透明质酸的切割。参考标准可以例如用于生成标准曲线，以测定以单位表示的待测试的透明质酸酶活性。
如本文使用的，比活性指活性单位/mg蛋白质。透明质酸酶的毫克通过溶液在280nm下的吸收进行限定，假定大约1.7的摩尔消光系数，以M-1cm-1为单位。
如本文使用的，“中性活性”指PH20多肽在中性pH下(例如在pH 7.0下或约pH 7.0)酶促催化透明质酸切割的能力。
如本文使用的，“GPI锚附着信号序列”是指导将预形成的GPI锚添加至ER腔内多肽的C末端氨基酸序列。GPI锚附着信号序列存在于GPI锚定多肽的前体多肽例如GPI锚定的PH20多肽内。C末端GPI锚附着信号序列通常含有8-20个氨基酸的主要疏水区，在8-12个氨基酸的亲水间隔区后，ω-位点或GPI锚附着位点立即下游。GPI锚附着信号序列可以使用本领域众所周知的方法进行鉴定。这些包括但不限于计算机芯片(in silico)方法和算法(参见例如Udenfriend等人(1995)Methods Enzymol.250:571-582，Eisenhaber等人，(1999)J.Biol.Chem.292:741-758，Fankhauser等人，(2005)Bioinformatics 21:1846-1852，Omaetxebarria等人，(2007)Proteomics7:1951-1960，Pierleoni等人，(2008)BMC Bioinformatics 9:392)，包括在生物信息学网站例如ExPASy Proteomics工具网站(例如万维网网站expasy.ch/tools/)上可容易获得的那些。
如本文使用的，“核酸”包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当提及例如由可检测标记例如荧光或放射性标记任选标记的探针或引物时，考虑单链分子。此类分子一般具有这样的长度，从而使得它们的靶是统计上独特的或具有低拷贝数(一般小于5，一般小于3)用于探测或引发文库。一般地，探针或引物含有与目的基因互补或相同的至少14、16或30个连续核苷酸的序列。探针和引物可以长10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文使用的，肽指长度大于或等于2个氨基酸并且长度小于或等于40个氨基酸的多肽。
如本文使用的，在本文提供的多种氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知的三字母或单字母缩写进行鉴定(表1)。在多种核酸片段中出现的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母命名进行指定。
如本文使用的，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两个或更多个氨基酸。为了本文目的，氨基酸包括二十种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即，其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文使用的，“氨基酸残基”指多肽在其肽键处的化学消化(水解)后形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基假定为“L”异构形式。如此指定的以“D”异构形式的残基可以置换任何L-氨基酸残基，只要所需功能性质由多肽保留。NH2指在多肽的氨基末端处存在的游离氨基。COOH指在多肽的羧基末端处存在的游离羧基。与J.Biol.Chem.，243：3557-3559(1968)中所述且采用37C.F.R.§§1.821-1.822的标准多肽命名法一致，关于氨基酸残基的缩写显示于表1中：
表1–对应表
本文通过式表示的所有氨基酸残基序列具有以氨基末端到羧基末端的常规方向的左到右定向。此外，短语“氨基酸残基”定义为包括对应表(表1)中列出的氨基酸以及经修饰的和罕见的氨基酸，例如37C.F.R.§§1.821-1.822中提及且引入本文作为参考的那些。此外，应当指出在氨基酸残基序列开始或结束时的破折号指示与一个或多个进一步的氨基酸残基序列、氨基末端基团例如NH2或羧基末端基团例如COOH的肽键。
如本文使用的，“天然存在的α-氨基酸”是在自然界中发现的20种α-氨基酸的残基，其通过荷电tRNA分子由其在人中的同源mRNA密码子的特异性识别而掺入蛋白质内。非天然存在的氨基酸因此包括例如除了20种天然存在的氨基酸外的氨基酸或氨基酸类似物，并且包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸在本文中描述且是本领域技术人员已知的。
如本文使用的，DNA构建体是单链或双链、线性或环状DNA分子，其含有以在自然界中未发现的方式组合且并列的DNA区段。DNA构建体由于人为操作而出现，并且包括操作分子的克隆及其他拷贝。
如本文使用的，DNA区段是具有指定属性的较大DNA分子的部分。例如，编码指定多肽的DNA区段是较长DNA分子例如质粒或质粒片段的部分，当从5'到3'方向阅读时，其编码指定多肽的氨基酸序列。
如本文使用的，术语多核苷酸意指从5'到3'末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源中分离，在体外合成，或由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文中以核苷酸(缩写“nt”)或碱基对(缩写“bp”)的方式给出。上下文允许时，术语核苷酸用于单链和双链分子。当该术语应用于双链分子时，它用于指示总长度，并且应理解为等价于术语碱基对。本领域技术人员应认识到，双链多核苷酸的两条链可以在长度中轻微不同，并且其末端可以是交错的；因此在双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以不都是成对的。此类不成对末端长度一般不超过20个核苷酸。
如本文使用的，两种蛋白质或核酸之间的“相似性”指在蛋白质的氨基酸序列或核酸的核苷酸序列之间的关联性。相似性可以基于其中含有的残基序列和残基的相同性和/或同源性程度。用于评估蛋白质或核酸之间的相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在评估序列相似性的一种方法中，两个氨基酸或核苷酸序列以获得序列间的最大相同性水平的方式进行比对。“相同性”指氨基酸或核苷酸序列对于其不变的程度。氨基酸序列和一定程度的核苷酸序列的比对还可以考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或频繁取代。保守差异是保存所涉及残基的理化性质的那些。比对可以是总体的(在序列整个长度上且包括所有残基的比较序列的比对)或局部的(仅包括最相似的一个或多个区域的序列部分的比对)。
“相同性”本身具有领域公认的含义，并且可以使用公开技术进行计算。(参见例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York，1991)。虽然存在测量两种多核苷酸或多肽之间的相同性的许多方法，但术语“相同性”是技术人员众所周知的(Carrillo，H.&Lipman，D.，SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
如本文使用的，同源(就核酸和/或氨基酸序列而言)意指约大于或等于25％序列同源性，一般大于或等于25％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同源性；如果需要，则可以指定精确百分比。为了本文目的，除非另有说明，否则术语“同源性”和“相同性”通常可互换使用。一般而言，对于同源性或相同性百分比的测定，序列如此比对，从而使得获得最高级别的匹配(参见例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York，1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。通过序列同源性，通过标准比对算法程序测定保守氨基酸数目，并且可以与由每个供应商确定的缺省缺口罚分一起使用。基本上同源的核酸分子一般在目的核酸长度自始至终以中等严格性或高严格性杂交。还考虑的是含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子的核酸分子。
任何两个分子是否具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或“同源”的核苷酸序列或氨基酸序列，可以使用已知计算机算法例如“FASTA”程序进行测定，使用例如如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中的缺省参数(其他程序包括GCG程序包(Devereux，J.,等人，Nucleic Acids Research 12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul，S.F.,等人，J Mol Biol 215:403(1990))；Guide toHuge Computers，Martin J.Bishop，编辑，Academic Press，San Diego，1994和Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库的BLAST函数可以用于测定相同性。其他商购可得或可公开获得的程序包括DNAStar"MegAlign"程序(Madison，WI)和University of Wisconsin Genetics ComputerGroup(UWG)"Gap"程序(Madison WI)。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序比较序列信息进行测定(例如Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443，如由Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482修改的)。简言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)数目除以两个序列中较短的中的总符号数目。GAP程序的缺省参数可以包括：(1)一元比较矩阵(含有值1用于相同性和0用于非相同性)和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如由Schwartz和Dayhoff，编辑，ATLAS OF PROTEINSEQUENCE AND STRUCTURE，National Biomedical Research Foundation，第353-358页(1979)描述的；(2)关于每个缺口的罚分3.0和关于每个缺口中的每个符号的另外0.10罚分；和(3)对于末端缺口无罚分。
因此，如本文使用的，术语“相同性”或“同源性”表示测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较。如本文使用的，术语至少“90％相同”指相对于参考核酸或多肽的氨基酸序列，90-99.99的相同性百分比。以90％或更多水平的相同性指示下述事实：为了例子目的假定比较100个氨基酸的测试和参考多肽长度。测试多肽中的不超过10％(即，100个中的10个)氨基酸不同于参考多肽的那个。相似比较可以在测试和参考多核苷酸之间作出。此类差异可以表示为在多肽整个长度上随机分布的点突变，或它们可以在不同长度的一个或多个位置上中聚类一直到可允许的最大值，例如10/100个氨基酸差异(约90％相同性)。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在超过约85-90％的同源性或相同性水平上，结果应不依赖于程序和缺口参数设置；此类高水平的相同性可以通常通过手动比对而不依赖软件容易地进行评估。
如本文使用的，比对的序列指使用同源性(相似性和/或相同性)以比对核苷酸或氨基酸序列中的相应位置。一般地，比对通过50％或更多相同性相关的两个或更多个序列。比对的序列组指在相应位置处比对的2个或更多个序列，并且可以包括衍生自RNA的比对序列，例如EST和与基因组DNA序列比对的其他cDNA。
如本文使用的，“引物”指在适当条件下(例如在四种不同的核苷三磷酸和聚合剂例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的存在下)在适当缓冲液中以及在合适的温度下，可以充当模板指导的DNA合成的起始点的核酸分子。应当理解某些核酸分子可以充当“探针”和“引物”。然而，引物具有3’羟基用于延伸。引物可以用于多种方法中，包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多路PCR、锅柄PCR、捕获PCR、表达PCR、3'和5'RACE、原位PCR、连接介导的PCR及其他扩增方案。
如本文使用的，“引物对”指包括与待扩增(例如通过PCR)序列的5'末端杂交的5'(上游)引物和与待扩增序列的3'末端的互补体杂交的3'(下游)引物的一组引物。
如本文使用的，“特异性杂交”指通过核酸分子(例如寡核苷酸)与靶核酸分子的互补碱基配对的退火。技术人员熟悉影响特异性杂交的体外和体内参数，例如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。在高严格性下用于去除非特异性结合的核酸分子的示例性洗涤条件是0.1x SSPE、0.1％SDS、65℃，在中等严格性下是0.2x SSPE、0.1％SDS、50℃。等价严格条件是本领域已知的。技术人员可以容易地调整这些参数，以实现对于特定应用适当的核酸分子与靶核酸分子的特异性杂交。当提及两种核苷酸序列时，互补意指两种核苷酸序列能够杂交，通常在相对核苷酸之间具有小于25％、15％或5％错配。需要时，将指定互补性百分比。通常，两种分子这样选择，从而使得它们将在高严格性条件下杂交。
如本文使用的，与产物基本上相同意指足够相似的，从而使得目的性质是足够未改变的，从而使得基本上相同的产物可以用于代替所述产物。
如本文使用的，还应当理解术语“基本上相同”或“相似”随着上下文而改变，如相关领域技术人员理解的。
如本文使用的，等位基因变体或等位基因变异提及占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种交替形式中的任一种。等位基因变异通过突变天然出现，并且可以导致在群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文中也用于指示由基因的等位基因变体编码的蛋白质。一般地，参考形式的基因编码来自物种的群体或单个参考成员的野生型和/或主要形式的多肽。一般地，包括物种间和物种中的变体的等位基因变体一般与来自相同物种的野生型和/或主要形式具有至少80％、90％或更多的氨基酸相同性；相同性程度取决于基因和比较是种间还是种内的。一般地，种内等位基因变体与野生型和/或主要形式具有至少约80％、85％、90％、95％或更大的相同性，包括与野生型和/或主要形式的多肽96％、97％、98％、99％或更大的相同性。本文提及等位基因变体通常指在相同物种的成员中的蛋白质中的变异。
如本文使用的，在本文中可与“等位基因变体”互换使用的“等位基因”指基因或其部分的交替形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当对象具有基因的两个相同的等位基因时，对象被说成对于该基因或等位基因是纯合的。当对象具有基因的两个不同的等位基因时，对象被说成对于该基因是杂合的。特定基因的等位基因可以在单个核苷酸或几个核苷酸中彼此不同，并且可以包括核苷酸的修饰例如取代、缺失和插入。基因的等位基因还可以是含有突变的基因形式。
如本文使用的，种变体指在不同物种中的多肽中的变体，所述不同物种包括不同哺乳动物物种例如小鼠和人。例如对于PH20，本文提供的示例性种变体是灵长类PH20，例如但不限于人、黑猩猩、猕猴和食蟹猴。一般地，种变体具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更多序列相同性。在种变体之间和之中的对应残基可以通过下述进行测定：比较并比对序列，以使匹配核苷酸或残基数目达到最大，例如，从而使得序列间的相同性等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％或等于或大于99％。目的位置随后给出在参考核酸分子中指定的数目。特别当序列相同性大于80％时，比对可以手动或通过肉眼实现。
如本文使用的，人蛋白质是由人基因组中存在的核酸分子例如DNA编码的蛋白质，包括其所有等位基因变体和保守变化。如果修饰基于人蛋白质的野生型或显著序列，则蛋白质的变体或修饰是人蛋白质。
如本文使用的，剪接变体指通过基因组DNA的初级转录物的差异加工产生的变体，所述差异加工导致一种类型以上的mRNA。
如本文使用的，修饰指多肽的氨基酸序列或核酸分子的核苷酸序列的修饰，并且分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换(例如取代)。示例性修饰是氨基酸取代。氨基酸取代的多肽可以与不含所述氨基酸取代的多肽显示出65％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更多序列相同性。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。一般地，对多肽的任何修饰保留多肽的活性。修饰多肽的方法对于技术人员是常规的，例如通过使用重组DNA方法。
如本文使用的，氨基酸的合适保守取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以制备而不改变所得到的分子的生物学活性。技术人员认识到，一般而言，在多肽的非必需区中的单一氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等人Molecular Biology of the Gene，第4版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.co.，第224页)。此类取代可以如下依照表2中所示的那些进行制备：
表2
其他取代也是许可的，并且可以凭经验或依照已知保守取代进行测定。
如本文使用的，术语启动子意指含有DNA序列的基因部分，其提供RNA聚合酶的结合和转录起始。启动子序列通常但不总是在基因的5’非编码区中发现。
如本文使用的，分离或纯化的多肽或蛋白质或其生物学活性部分基本上不含来自蛋白质衍生自其的细胞或组织的细胞材料或其他污染蛋白质，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学制品。制剂可以测定为基本上不含，如果它们看起来不含可容易检测的杂质，如通过由本领域技术人员用于评估此类纯度的标准分析方法测定的，所述标准分析方法例如薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC)，或足够纯的，从而使得进一步的纯化将不可检测地改变物质的物理和化学性质，例如酶促和生物学活性。用于化合物纯化以产生基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在此类情况下，进一步的纯化可能增加化合物的比活性。
因此，提及基本上纯化的多肽例如基本上纯化的可溶性PH20，指基本上不含细胞材料的蛋白质制剂，包括其中蛋白质与它由其分离或重组产生的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。在一个实施方案中，术语基本上不含细胞材料包括这样的酶蛋白质制剂，其具有小于约30％(按干重计)非酶蛋白质(在本文中也称为污染蛋白质)、一般小于约20％非酶蛋白质或10％非酶蛋白质或小于约5％非酶蛋白质。当酶蛋白质重组产生时，它还基本上不含培养基，即培养基代表小于约或以20％、10％或5％的酶蛋白质制剂体积。
如本文使用的，术语基本上不含化学前体或其他化学制品包括这样的酶蛋白质制剂，其中蛋白质与涉及蛋白质合成的化学前体或其他化学制品分离。该术语包括具有小于约30％(按干重计)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非酶化学制品或组分的酶蛋白质制剂。
如本文使用的，就例如合成核酸分子或合成基因或合成肽而言的合成指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文使用的，通过重组方法或使用重组DNA法的产生意指使用众所周知的分子生物学方法用于表达由克隆DNA编码的蛋白质。
如本文使用的，载体(或质粒)指用于将异源核酸引入细胞内用于其表达或复制的不连续元件。载体一般保持游离，但可以设计为实现基因或其部分整合到基因组的染色体内。还考虑的是其为人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。此类媒介物的选择和使用是本领域技术人员众所周知的。
如本文使用的，表达载体包括能够表达与调节序列例如启动子区可操作地连接的DNA的载体，所述调节序列能够实现此类DNA片段的表达。此类另外的区段可以包括启动子和终止子序列，并且任选可以包括一个或多个复制起点、一或多个可选择标记、增强子、多腺苷酸化信号。表达载体一般衍生自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，其在引入合适的宿主细胞内之后，导致克隆DNA的表达。合适的表达载体是本领域技术人员众所周知的，并且包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些，和保持游离的那些或整合到宿主细胞基因组内的那些。
如本文使用的，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是经工程化的病毒，其与外源基因可操作地连接，以将外源基因(如媒介物或穿梭物)转移到细胞内。
如本文使用的，当提及DNA区段时，“可操作地”或“可操作地连接”意指区段如此排列，从而使得它们为了其预期目的协同作用，例如启动子下游和任何转录序列的上游的转录起始。启动子通常为转录机制与之结合以起始转录且通过编码区段进行到终止子的结构域。
如本文使用的，术语“评估”预期包括以获得关于样品中存在的蛋白质例如酶或其结构域活性的绝对值，以及获得指示活性水平的指数、比例、百分比、视觉或其他值的定量和定性测定。评估可以是直接或间接的。例如，实际检测的化学种类当然无需是酶促切割产物自身，还可以例如是其衍生物或一些进一步的物质。例如，切割产物的检测可以是可检测部分例如荧光部分。
如本文使用的，生物学活性指在化合物、组合物或其他混合物体内施用后产生的化合物的体内活性或生理学应答。因此，生物学活性包含此类化合物、组合物和混合物的疗效和药学活性。生物学活性可以在设计为测试或使用此类活性的体外系统中观察到。因此，为了本文目的，透明质酸酶的生物学活性是其降解透明质酸。
如本文使用的，当提及两个核酸序列时，等价意指所讨论的两个序列编码相同氨基酸序列或等价蛋白质。当等价在提及两个蛋白质或肽中使用时，它意指两个蛋白质或肽具有基本上相同的氨基酸序列，仅具有基本上不改变蛋白质或肽的活性或功能的氨基酸取代。当等价指性质时，该性质无需存在至相同程度(例如，两个肽可以显示出不同速率的相同类型酶促活性)，但活性通常基本上是相同的。
如本文使用的，“调节”或“改变”指分子例如蛋白质活性的改变。示例性活性包括但不限于生物学活性例如信号转导。调节可以包括活性增加(即上调或激动剂活性)，活性降低(即下调或抑制)或活性中的任何其他变化(例如周期性、频率、持续时间、动力学或其他参数的变化)。调节可以是背景依赖性的，并且通常调节与指定状态例如野生型蛋白质、处于组成性状态的蛋白质、或在指定细胞类型或状况下表达的蛋白质相比较。
如本文使用的，直接施用指无需稀释而施用的组合物。
如本文使用的，单一剂量制剂指仅使用一次的制剂。通常，单一剂量制剂用于直接施用。
如本文使用的，多重剂量制型指用于重复施用的制剂。
如本文使用的，组合物指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文使用的，组合指两个或更多个项目之间或之中的任何结合。组合可以是两个或更多个分离项目，例如两个组合物或两个集合，可以是其混合物，例如两个或更多个项目的单一混合物，或其任何变化。组合的元件一般是功能上结合或相关的。
如本文使用的，“疾病或病症”指生物体中起因于病因或状况的病理学状况，所述病因或状况包括但不限于感染、获得状况、遗传状况，并且特征在于可鉴别的症状。本文感兴趣的疾病和病症是透明质酸相关疾病和病症。
如本文使用的，“静脉内施用”指治疗剂直接输送入静脉。
如本文使用的，“透明质酸相关癌症”或“富含透明质酸的癌症”包括其中透明质酸水平作为疾病或状况的原因、结果或观察到的其他方式而升高的癌症。透明质酸相关癌症或肿瘤与组织或细胞中升高的透明质酸水平、增加的组织间隙液压、降低的血管容积和/或组织中增加的含水量相关。此类癌症包括例如肿瘤包括实体瘤例如晚期癌症、转移性癌症、未分化癌、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌及其他癌症。
如本文使用的，升高的透明质酸水平指在特定组织、体液或细胞中的透明质酸量，取决于疾病或状况，在疾病中观察到的后果或其他。例如，由于富含透明质酸的肿瘤的存在，透明质酸(HA)水平在体液例如血液、尿、唾液和血清和/或肿瘤组织或细胞中可以是升高的。水平可以与标准或其他合适对照例如来自对象的可比较样品相比较，所述对象不具有HA相关疾病。
如本文使用的，“治疗”具有疾病或状况的对象意指对象的症状是部分或完全缓和的，或在治疗后保持静止。因此，治疗包含预防、治疗和/或治愈。预防指潜在疾病的阻止和/或疾病症状的恶化或进展的阻止。
如本文使用的，药学有效剂包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如化疗剂、麻醉药、血管收缩剂、分散剂、常规治疗性药物包括小分子药物和治疗蛋白质。
如本文使用的，治疗意指其中状况、病症或疾病或其他适应症的症状得到改善或另外有利地改变的任何方式。
如本文使用的，疗效意指起因于对象治疗的效果，所述治疗改变、一般改善或改进疾病或状况的症状或者治愈疾病或状况。治疗有效量指在施用于对象后，导致疗效的组合物、分子或化合物的量。
如本文使用的，术语“对象”指动物，包括哺乳动物，例如人类。
如本文使用的，患者指显示出疾病或病症症状的人对象。
如本文使用的，大约相同意指在本领域技术人员视为相同或在可接受的误差范围内的量。例如，通常，对于药物组合物，在至少1％、2％、3％、4％、5％或10％内视为大约相同。此类量可以取决于通过对象对特定组合物变化的耐受而改变。
如本文使用的，给药方案指施用的试剂量和施用频率，所述试剂例如含有抗透明质酸剂例如可溶性透明质酸酶或其他药物的组合物。给药方案是待治疗疾病或状况的函数，并且因此可以改变。
如本文使用的，施用频率指在相继治疗施用之间的时间。例如，频率可以是天、周或月。例如，频率可以是每周超过一次，例如每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次。频率还可以是一、二、三或四周。特定频率是待治疗的特定疾病或状况的函数。一般地，频率是每周超过一次，并且一般是每周两次。
如本文使用的，“施用周期”指经过相继施用重复的酶和/或第二种试剂施用的给药方案的重复时间表。例如，示例性施用周期是28天周期，其中每周施用两次共三周，随后为一周中断给药。
如本文使用的，当提及基于mg/kg对象的剂量时，平均人对象视为具有约70kg-75kg例如70kg的质量和体表面积(BSA)1.73。
如本文使用的，特定疾病或病症的症状通过治疗例如通过施用药物组合物或其他治疗剂的改善，指症状或状况的不利效应的任何减轻，无论是永久的还是暂时的、持久的还是瞬时的，例如与抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用相关或在抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用后发生的不利效应的减少。
如本文使用的，阻止或预防指发展疾病或状况的危险减少。
如本文使用的，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指至少足以产生疗效的试剂、化合物、材料或含有化合物的组合物的数量。因此，它是阻止、治愈、改善、抑制或部分抑制疾病或病症症状所需的数量。
如本文使用的，单位剂型指如本领域已知的，适合于人和动物对象且个别包装的物理上不连续的单位。
如本文使用的，单一剂量制剂指作为单一剂量的制剂。
如本文使用的，用于直接施用的制剂意指该组合物无需进一步稀释用于施用。
如本文使用的，“制造物品”是制造且销售的产品。如本申请自始至终使用的，该术语意欲包含在包装物品中含有的抗透明质酸剂，例如透明质酸降解酶，例如透明质酸酶和第二种试剂组合物。例如，第二种试剂是皮质类固醇、肿瘤靶向紫杉烷或化疗剂。
如本文使用的，流体指可以流动的任何组合物。流体因此包含以半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳膏及其他此类组合物形式的组合物。
如本文使用的，组合例如本文提供的组合物组合指组合元件的结合。
如本文使用的，试剂盒指组分的组合例如本文组合物和用于下述目的的另一个项目的组合：包括但不限于重构、活化、和用于递送的器械/设备、施用、诊断和生物学活性或性质的评估。试剂盒任选包括使用说明书。
如本文使用的，细胞提取物或裂解产物指由裂解或破裂的细胞制成的制剂或级分。
如本文使用的，动物包括任何动物例如但不限于灵长类动物包括人、大猩猩和猴；啮齿类动物例如小鼠和大鼠；家禽例如鸡；反刍动物例如山羊、牛、鹿、绵羊；猪及其他动物。非人动物排除人作为考虑的动物。本文提供的透明质酸酶来自任何来源，动物、植物、原核和真菌。大多数透明质酸酶是动物来源的，包括哺乳动物来源。一般地，透明质酸酶是人来源的。
如本文使用的，抗癌治疗包括用于治疗癌症的药物及其他试剂的施用，以及治疗方案例如手术和放射。抗癌治疗包括抗癌剂的施用。
如本文使用的，抗癌剂指抗癌治疗中使用的任何试剂或化合物。这些包括任何试剂，当单独或与其他化合物组合使用时，所述试剂可以减轻、减少、改善、阻止或置于或维持与肿瘤和癌症相关的临床症状或诊断标记的缓解状态，并且可以用于本文提供的组合和组合物中。示例性抗癌剂包括但不限于单独或与其他抗癌剂组合使用的透明质酸降解酶，例如本文提供的聚乙二醇化的透明质酸降解酶，所述其他抗癌剂例如化疗剂、多肽、抗体、肽、小分子或基因疗法载体、病毒或DNA。
如本文使用的，对照指基本上与测试样品相同的样品，除了它不用测试参数进行处理外，或如果它是血浆样品，则它可以来自未受目的状况影响的正常志愿者。对照还可以是内部对照。
如本文使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考。因此，例如，提及包含或含有“一个细胞外结构域”的化合物包括具有一个或多个细胞外结构域的化合物。
如本文使用的，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。约还包括确切量。因此，“约5个碱基”意指“约5个碱基”以及“5个碱基”。
如本文使用的，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形的确发生或不发生，并且该描述包括其中所述事件或情形发生的情况和其中它不发生的情况。例如，任选地取代的基团意指所述基团是未被取代的或被取代的。
如本文使用的，除非另有说明，否则关于任何保护基、氨基酸及其他化合物的缩写依照其常见用法、公认缩写、或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Commission on Biochemical Nomenclature)(参见(1972)Biochem11:1726)。
B.抗透明质酸剂组合疗法
本文提供的是用于治疗癌症的抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉醇的组合疗法。例如，本文提供的是用于治疗癌症的聚合物缀合的透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PEGPH20和肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉醇的组合疗法。特别地，本文提供的组合疗法用于治疗特征在于实体瘤的任何癌症，所述实体瘤由于基质层而是无法穿透的。示例性此类癌症包括实体瘤癌症，例如但不限于胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、头颈部癌及其他。组合疗法可以进一步包括进一步的细胞毒性化疗药物，例如其活性通过抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷之一或两者增加(例如由于增加的递送和/或增加的半衰期)的任何药物。例如，进一步的化疗剂可以是显示出直接抗肿瘤活性的核苷类似物，例如吉西他滨或其衍生物。
1.实体瘤和肿瘤靶向疗法
实体瘤由癌细胞和基质细胞(例如成纤维细胞和炎症细胞)构成，所述癌细胞和基质细胞由细胞外基质和血管网络包围。与正常组织中存在的那些相比较，基质细胞、细胞外基质组分和/或脉管系统一般是异常的。例如，与正常组织相比较，许多实体瘤具有增加数目的成纤维细胞。此外，与正常脉管系统相比较，实体瘤中的脉管系统可以显示出分支或卷曲的结构，并且显示出特征在于膨胀血管，内皮衬里的减少和/或压缩血管的结构畸变。最后，肿瘤和基质细胞产生并装配细胞外基质组分例如形成致密团块并可以促成高肿瘤组织间隙压的胶原、蛋白聚糖、糖胺聚糖(例如透明质酸)及其他分子的复杂网络。超过终末小动脉和毛细血管中的血管内压的高组织间隙液压可以损害流体和溶质进入间质内的灌注。因此，高组织间隙压可以阻碍治疗剂摄取到肿瘤组织内，并且还可以影响肿瘤细胞的生长特性以支持肿瘤细胞增殖。
为了肿瘤疗法有效，药物必须有效离开肿瘤血管并穿透肿瘤组织以到达癌细胞。高组织间隙液压以及细胞外基质的致密组成和组构以及相关细胞影响药物穿透。结果是基质障碍通常阻止抗肿瘤药物穿透到肿瘤内，这致使许多常规癌症治疗无效。
例如，胰腺癌是所有实体瘤癌症中最无法穿透的。因此，胰腺癌包括胰腺导管腺癌特征在于对常规化疗剂的固有抗性，从而使得5年存活率小于5％。胰腺癌的标准疗法是用吉西他滨治疗。吉西他滨对增加患者存活具有有限作用。例如，仅约四分之一用吉西他滨单一疗法治疗的患者显示出临床益处，具有仅超过5个月的生存中值，这仅比用化疗剂氟尿嘧啶(5-FU)的治疗长一个月(Burris等人(1997)J Clin Oncol，15:2403-2413)。在其中治疗也伴随胰腺癌手术或其他非化疗辅助疗法的辅助背景下，与单独进行手术的患者相比较，吉西他滨使存活增加两个月(Neuhaus等人(2008)J.Clin.Oncol.26:May 20suppl；摘要)。
近来，已开发了包括可以穿透基质层和相关脉管系统的治疗剂的疗法。可以耗尽基质，在基质中穿孔或以其他方式穿透基质的治疗剂视为用于特征在于无法穿透的基质层的许多癌症的有希望治疗剂。此类试剂包括例如白蛋白缀合的紫杉烷(Von Hoff等人(2011)J.Clin.Oncol.，29:4548-54；Frese等人(2012)Cancer Discovery，2:260-269)、hedgehog抑制剂(Olive等人(2009)Science，324:1457-61)和聚合物缀合的透明质酸酶(Provenzano等人(2012)Cancer Cell，21:418-429)。这些治疗各自还与非基质靶向化疗剂的递送增加相关，导致与化疗剂(例如吉西他滨)单一疗法相比较增强的抗肿瘤效应和存活时间的倍增。
a.肿瘤靶向紫杉烷
紫杉烷例如紫杉醇(例如)和多西他赛(例如)是用于治疗多种肿瘤类型的有力化疗剂。紫杉烷通过以高亲和力与微管结合充当有丝分裂抑制剂，从而干扰细胞分裂。结果是紫杉烷阻止肿瘤细胞生长和转移，并且可以引起细胞死亡。由于可溶性和相关毒性、长期全身可用性和无法接近肿瘤基质的问题，紫杉烷的治疗用途已受限制。
为了克服与紫杉烷的治疗用途相关的问题，已开发了由白蛋白结合的颗粒形式的紫杉烷构成的gp60受体靶向纳米颗粒药物制剂。这些包括例如纳米颗粒白蛋白结合的(nab)紫杉醇(ABI-007，例如)和纳米颗粒白蛋白结合的多西他赛(ABI-008)。Gp60是在血管内皮上的白蛋白受体。白蛋白受体介导的经由gp60的摄取导致与细胞内小窝蛋白-1的结合，导致细胞膜凹入以形成含有来自细胞外间隙的结合的血浆组成成分的胞转小泡(称为小窝)、胞转作用和小窝内容物的血管外沉积。此外，白蛋白还与SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白)结合，所述SPARC是在多种癌症中过表达且与预后不良相关的细胞外基质糖蛋白。结果是绕开对药物递送的基质障碍，并且实现更高的肿瘤内药物浓度。与基于常规溶剂的紫杉醇相比较，Nab-紫杉醇可以实现更高的肿瘤内浓度和增加的生物利用度(Foote(2007)Biotechnology Annual Review，13:345)。
因为肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白缀合的紫杉烷能够穿透并耗尽或坍塌基质，所以这些试剂可以与其他非基质靶向化疗剂组合使用，以便增强其他试剂对肿瘤的递送。增强递送的机制归于基质体系结构的破坏和反应性血管生成的诱导，其导致化疗剂的灌注和递送增加(参见例如Frese等人(2012)Cancer Discovery，2:260-269)。例如，研究已显示与用单独的吉西他滨的治疗相比较，与吉西他滨组合的nab-紫杉醇，白蛋白缀合的紫杉烷，使在肿瘤中的吉西他滨量增强几乎2.8倍(Von Hoff等人(2011)J.Clin.Oncol.，29:4548-4554)。结果还显示组合疗法使患有胰腺癌的患者的存活时间加倍(Von Hoff等人(2011))。
增强与nab-紫杉醇疗法组合的吉西他滨的肿瘤内量的机制最近以来已归于与nab-紫杉醇治疗组中的胞苷脱氨酶(Cda)减少相关的独立机制(Frese等人(2012)Cancer Discovery 2:260-269)。Cda在细胞中遍在表达，并且可以通过使吉西他滨脱氨基成其代谢产物二氟脱氧尿苷(dFdU)而使吉西他滨失活。nab-紫杉醇治疗增加活性氧(ROS)，其导致Cda的降解而不伴随mRNA水平的任何调节。因此，与nab-紫杉醇的共治疗导致吉西他滨脱氨基减少，从而稳定吉西他滨，导致肿瘤内吉西他滨水平升高。
b.抗透明质酸剂
抗透明质酸剂通过干扰透明质酸的合成或增加透明质酸的降解而减少透明质酸(HA；本文也称为透明质酸)水平。例如，透明质酸降解酶例如透明质酸酶是干扰并降解透明质酸的酶。透明质酸是实体瘤的细胞外基质的主要组分。HA是高分子量线性糖胺聚糖，其含有重复二糖单位，与D-葡糖醛酸β-1,4连接的β-1,3N-乙酰-D-葡糖胺。HA天然存在于体内并且在一些癌细胞包括胰腺癌细胞中以极高水平分泌。HA代谢的局部异常已在许多实体瘤恶性肿瘤中报道，其中升高水平的HA通常与肿瘤的预后不良关联，所述肿瘤例如乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌。
HA涉及疾病组织例如肿瘤中增加的水摄取和组织间隙液压(IFP)，从而导致压缩的肿瘤脉管系统。例如，在炎症部位处或在肿瘤病灶中，存在透明质酸、其他基质组分和水的快速累积。因为这种快速累积，疾病部位不能与其环境达成平衡，因此具有比正常组织更高的组织间隙液压。如上所述，大多数实体瘤以及与累积HA相关的其他患病组织的IFP是升高的，充当有效药物递送的障碍(Heldin等人(2004)Nat Rev Cancer 4(10):806-813)。HA累积还减少肿瘤细胞之间和之中的接触抑制(参见例如Itano等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:3609-3614)。
抑制HA合成或降解透明质酸的抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶例如透明质酸酶(例如PH20)可以减少透明质酸，从而使得组织缩小，血管扩张，更多血液可以流经该部位。这导致在组织部位处的组织间隙液压减小和血管灌注中的相关增加。例如，透明质酸酶已显示去除来自肿瘤的HA，导致肿瘤体积减少、肿瘤内组织间隙压减少、肿瘤细胞增殖减慢以及通过允许增加的肿瘤穿透来增强共施用的化疗药物和生物药物的功效(参见例如美国公开申请号20100003238和国际公开PCT申请号WO 2009/128917)。
透明质酸酶例如PH20酶用于全身治疗的用途具有与酶的短半衰期相关的问题。例如，未经修饰的透明质酸酶通常具有数分钟、一般小于5分钟的在血液中的酶促活性短半衰期。这意指此类酶一般不适用于静脉内施用，以及其中其作用持续时间是短命的其他施用。这是因为在降解后，HA底物替换为大约5小时的半衰期。相比之下，增加透明质酸酶递送和/或延长透明质酸酶与细胞相关的透明质酸(例如肿瘤相关的细胞外周透明质酸)的结合的方法允许治疗富含HA的肿瘤。此类方法可以包括但不限于酶与聚合物的缀合，使用无糖基化的或修饰为具有减少的糖基化的酶，酶的连续输注和/或酶的局部递送。例如，透明质酸酶例如通过聚乙二醇化的聚合物修饰使酶的半衰期增加至大约48-72小时，并且允许全身治疗富含HA的肿瘤(参见例如美国公开申请号20100003238和国际公开PCT申请号WO2009/128917)。相对于未经修饰的透明质酸酶增加的半衰期允许连续去除HA，从而减少或降低患病组织例如肿瘤内HA再生的程度。因此，血浆酶水平通过聚合物缀合的维持可以去除HA，例如肿瘤HA，并且还对抗HA再合成。
另外，聚合物缀合的透明质酸降解酶例如聚合物缀合的透明质酸酶或PH20例如PEGPH20可以通过降解HA而耗尽围绕癌细胞的基质。此类试剂可以用于单一试剂疗法中用于治疗肿瘤或用于组合疗法中以增强非基质靶向化疗剂例如吉西他滨的递送。来自患有胰腺癌的患者的临床试验的结果也显示与用单独的吉西他滨治疗相比较，与吉西他滨组合的PEGPH20治疗导致总体存活接近倍增(Provenzano等人(2012)Cancer Cell，21:418-429)。
2.抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷组合疗法
在本文中发现含有至少两种不同基质或肿瘤靶向疗法的组合疗法显示出远远大于单一基质靶向试剂的功效。例如，在本文中发现与单独的任一试剂的单一治疗相比较，足以减少HA水平的时间的具有肿瘤靶向紫杉烷和抗透明质酸剂(特别是能够到达肿瘤的细胞外周HA的抗透明质酸剂)的组合疗法显示出增加的功效。例如，与单一试剂治疗相比较，具有肿瘤靶向紫杉烷和聚合物缀合的透明质酸酶的组合疗法导致大于25％的功效增加。在与非基质靶向化疗药物吉西他滨的进一步组合中，与仅用吉西他滨的治疗相比较，示例性癌症的生存中值在胰腺癌小鼠模型中增加79％，并且与仅含有单一基质靶向试剂的现有疗法相比较，增加超过30％。这种功效的增加可以转变为与现有治疗相比较，具有胰腺癌和特征在于无法穿透的基质的其他癌症的患者存活的实质改善。
因此，本文提供的是使用含有抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶或聚合物缀合的透明质酸降解酶(例如透明质酸酶或PH20)和肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷的组合疗法用于治疗实体瘤基质癌症的方法。例如，组合疗法可以用于治疗胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌和其他。含有抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶(例如透明质酸酶或PH20)和肿瘤靶向紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉烷)的组合物可以在组合中分开提供或在单一组合物中提供。如果分开提供并施用，则试剂可以同时或接近同时、以任何次序序贯或间歇地施用。例如，抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶(例如透明质酸酶或PH20)和肿瘤靶向紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉烷)可以分开施用，由此它们接近同时施用或相隔数小时或数天施用。注射部位可以是相同的或不同的。如果是不同的，则注射部位可以接近于第一种施用试剂的注射部位。
肿瘤靶向剂的组合可以一起用于治疗实体瘤基质癌症，或可以与其他化疗剂或治疗进一步组合使用。在特定例子中，抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶(例如透明质酸酶或PH20)和肿瘤靶向紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉烷)的组合用于与化疗剂进一步组合。其他试剂可以是基质或非基质靶向试剂。通常，其他试剂是显示出直接抗肿瘤活性的非基质细胞毒性剂。例如，进一步的化疗剂可以是细胞毒性剂例如铂(顺铂或卡铂)、紫杉醇、吉西他滨、多西他赛、长春瑞滨、伊立替康和培美曲塞。通常，进一步的化疗剂是核苷类似物例如吉西他滨。进一步治疗或试剂可以与抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)和/或肿瘤靶向紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉烷)组合疗法分开或一起施用。进一步试剂可以在组合中分开施用或在单一组合物中提供。如果分开提供并施用，则进一步试剂可以与抗透明质酸剂和/或白蛋白结合的紫杉烷组合疗法同时或接近同时、以任何次序序贯或间歇地施用。通常，为了实现进一步试剂的增强递送，进一步试剂在抗透明质酸剂和/或白蛋白结合的紫杉烷组合疗法施用后施用。由于进一步化疗剂的增强递送和半衰期，与现有剂量方案相比较，施用的进一步试剂的剂量可以是减少的和/或施用频率可以是减少的。结果是本文提供的组合疗法可以导致与其单独施用或其与单独的抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶或肿瘤靶向紫杉烷中任一的施用相比较，共施用的进一步治疗剂(例如核苷类似物例如吉西他滨)的副作用减少。
下文部分描述了用于本文提供的组合疗法中的示例性抗透明质酸剂，包括聚合物缀合的透明质酸降解酶、肿瘤靶向紫杉烷及其他示例性非限制性化疗剂。还描述了治疗基质实体瘤癌症的示例性剂量方案和方法。
C.组合疗法试剂
本文提供的是用于治疗癌症的抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉醇的组合疗法。特别地，本文提供的是用于治疗癌症的聚合物缀合的透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PEGPH20和肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉醇的组合疗法。特别地，本文提供的组合疗法用于治疗特征在于实体瘤的任何癌症，所述实体瘤由于细胞外基质中的HA而是无法穿透的。示例性此类癌症包括实体瘤癌症，例如但不限于胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、头颈部癌及其他。组合疗法可以进一步包括进一步的细胞毒性化疗药物，例如其活性通过抗透明质酸剂包括聚合物缀合的透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷之一或两者增加(例如由于增加的递送和/或增加的半衰期)的任何药物。例如，进一步的化疗剂可以是显示出直接抗肿瘤活性的核苷类似物，例如吉西他滨或其衍生物。
1.抗透明质酸剂
本文提供的组合疗法包括组合和方法和其用途包含抗透明质酸剂，例如透明质酸降解酶例如聚合物缀合的透明质酸降解酶。抗透明质酸剂是这样的，其可以施用从而使得它到达其靶，且特别到达含有升高的细胞外周HA的肿瘤细胞。例如，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶可以通过连续输注或局部注射施用，可以由聚合物修饰，或是无糖基化的或被修饰从而使得它是无糖基化的或具有降低的糖基化。在一个例子中，提供的组合物和组合含有透明质酸降解酶，特别是透明质酸酶，例如可溶性透明质酸酶(例如PH20或截短的PH20)，其已通过与一或多个聚合分子(聚合物)缀合进行修饰，通常为了增加透明质酸降解酶的半衰期，例如以促进在对象中延长/持续的治疗效应。
透明质酸是细胞外基质的组分和间质障碍的主要组成成分。通过催化透明质酸水解，透明质酸降解酶降低透明质酸的粘度，从而增加组织穿透性且增加肠胃外施用的流体的吸收率。如此，抗透明质酸剂包括透明质酸降解酶例如透明质酸酶已例如与其他试剂、药物和蛋白质结合用作铺展剂或分散剂，以增强其分散和递送。
抗透明质酸剂通过干扰透明质酸的合成或增加透明质酸的降解而减少透明质酸(HA；本文也称为透明质酸)水平。例如，透明质酸降解酶例如透明质酸酶干扰并降解透明质酸(HA)。用降解或抑制透明质酸合成的试剂例如透明质酸降解酶处理减少透明质酸，从而使得组织缩小，血管扩张，更多血液可以流经该部位。示例性此类抗透明质酸剂是抑制透明质酸合成或降解透明质酸的试剂。
a.抑制透明质酸合成的试剂
抗透明质酸剂包括抑制透明质酸合成的试剂，例如抑制、减少或下调HA合酶表达的试剂，HA合成抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
HA可以通过三种酶合成，所述三种酶是鉴定为HA合酶的三种相关哺乳动物基因(指定为has-1、has-2和has-3)的产物。不同的细胞类型表达不同的HAS酶并且HAS mRNA的表达与HA生物合成相关。已知使肿瘤细胞中的HAS基因沉默抑制肿瘤生长和转移。抗透明质酸剂包括抑制、减少或下调HA合酶的表达或水平的任何试剂。此类试剂是本领域技术人员已知的或可以鉴定的。
例如，HAS的下调可以通过提供寡核苷酸来完成，所述寡核苷酸与编码HAS的一种或多种核酸分子特异性杂交或以其他方式相互作用。例如，抑制透明质酸合成的抗透明质酸剂包括针对has基因的反义或有义分子。此类反义或有义抑制通常基于以氢键合为基础的寡核苷酸链或区段杂交，从而使得至少一个链或区段被切割、降解或以其他方式致使无法操作。在其他例子中，可以采用转录后基因沉默(PTGS)、RNAi、核酶和DNA酶。基于HAS1(SEQ ID NO:195中所示)、HAS2(SEQ ID NO:196中所示)或HAS3(SEQ ID NO:197或198中所示)的序列生成此类构建体在本领域技术水平内。本领域应当理解反义或有义化合物的序列无需与其可特异性杂交的靶核酸的序列100％互补。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，从而使得间插或邻近区段不涉及杂交事件(例如环结构或发夹结构)。一般地，反义或有义化合物与靶核酸内的靶区域具有至少70％序列互补性，例如75％-100％互补性，例如75％、80％、85％、90％、95％或100％。示例性有义或反义分子是本领域已知的(参见例如Chao等人(2005)J.Biol.Chem.，280:27513-27522；Simpson等人(2002)J.Biol.Chem.，277:10050-10057；Simpson等人(2002)Am.J Path.，161:849；Nishida等人(1999)J.Biol.Chem.，274:21893-21899；Edward等人(2010)British J Dermatology，162:1224-1232；Udabage等人(2005)Cancer Res.，65:6139；以及公开的美国专利申请号US20070286856)。
其为HA合成抑制剂的另一种示例性抗透明质酸剂是4-甲基伞形酮(4-MU；7-羟基-4-甲基香豆素)或其衍生物。4-MU通过减少HA合成所需的UDP-GlcUA前体库起作用。例如，在哺乳动物细胞中，HA使用UDP-葡糖醛酸(UGA)和UDP-N-乙酰-D-葡糖胺前体通过HAS合成。4-MU干扰生成UGA的过程，从而耗尽细胞内UGA库并且导致HA合成的抑制。4-MU已知具有抗肿瘤活性(参见例如Lokeshwar等人(2010)Cancer Res.，70:2613-23；Nakazawa等人(2006)Cancer Chemother.Pharmacol.，57:165-170；Morohashi等人(2006)Biochem.Biophys.Res.Comm.，345-1454-1459)。4-MU以600mg/kg/d)的经口施用使B16黑素瘤模型中的转移减少64％(Yoshihara等人(2005)FEBS Lett.，579:2722-6)。4-MU的结构在下文示出。另外，4-MU的衍生物，特别是6,7-二羟基(dihydrozy)-4-甲基香豆和5,7-二羟基-4-甲基香豆素，显示出抗癌活性(参见例如Morohashi等人(2006)Biochem.Biophys.Res.Comm.，345-1454-1459)。
4-甲基伞形酮(4-MU；C10H8O3)
进一步的示例性抗透明质酸剂是酪氨酸激酶抑制剂，例如来氟米特(Arava)、染料木黄酮或erbstatin。来氟米特还是嘧啶合成抑制剂。来氟米特是用于治疗类风湿性关节炎(RA)的已知药物，并且还有效治疗同种异体移植物以及异种移植物的排斥。HA已知直接或间接促成RA(参见例如Stuhlmeier(2005)J Immunol.，174:7376-7382)。酪氨酸激酶抑制剂抑制HAS1基因表达(Stuhlmeier 2005)。
b.透明质酸降解酶和聚合物缀合的透明质酸降解酶
抗透明质酸剂包括透明质酸降解酶。透明质酸降解酶例如透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族，所述透明质酸是细胞外基质的主要组分和间质障碍的主要组成部分。透明质酸降解酶通过切割透明质酸聚合物降解透明质酸，所述透明质酸聚合物由重复二糖单位组成，所述重复二糖单位是经由交替的β-1→4和β-1→3糖苷键连接在一起的D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)。透明质酸链可以达到长度约25,000个二糖重复或更多并且透明质酸聚合物大小范围在体内可以为约5,000-20,000,000Da。通过催化透明质酸(间质障碍的主要组成部分)的水解，透明质酸降解酶降低透明质酸的粘度，从而增加组织穿透性。
相应地，用于提供的组合、用途和方法的透明质酸降解酶包括具有催化透明质酸二糖链或聚合物切割的能力的任何酶。在一些例子中，透明质酸降解酶切割透明质酸链或聚合物中的β-1→4糖苷键。在其他例子中，透明质酸降解酶催化透明质酸链或聚合物中的β-1→3糖苷键的切割。
透明质酸降解酶包括透明质酸酶以及具有切割透明质酸的能力的其他酶，例如软骨素酶(chondrotinases)和裂解酶。进一步地，透明质酸降解酶还包括可以由细胞表达并分泌的其可溶形式。如下所述，透明质酸降解酶以膜结合形式或由细胞分泌的可溶形式存在。为了本文目的，可溶性透明质酸降解酶提供用于本文组合、方法和用途中。因此，当透明质酸降解酶包括糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚和/或以其他方式膜锚定或不可溶时，此类透明质酸降解酶可以通过GPI锚的截短或缺失以可溶形式提供，以使酶分泌并可溶。因此，透明质酸降解酶包括截短变体，例如截短以去除GPI锚的全部或部分。示例性此类可溶性透明质酸酶是可溶性PH20透明质酸酶，例如(美国专利号7,767,429；美国公开号US20040268425或US20100143457中所述的任何。
本文提供的透明质酸降解酶还包括任何透明质酸降解酶例如任何透明质酸酶或可溶性透明质酸酶例如PH20的变体，其是本领域技术人员已知的或本文描述的。例如，透明质酸降解酶可以含有在其一级序列中的一个或多个变异，例如氨基酸取代、添加和/或缺失。与不含该变异的透明质酸降解酶相比较，透明质酸降解酶的变体一般显示出至少或约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。任何变异都可以包括在透明质酸降解酶中用于本文目的，条件是酶保留透明质酸酶活性，例如至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的不含该变异的透明质酸降解酶的活性(如通过本领域众所周知和本文描述的体外和/或体内测定法测量的)。例如，示例性透明质酸降解酶包括可以与聚合物缀合的那些是SEQ ID NO:2、4-9、47、48、150-170、183-189和199-210中任一所示的任何酶，或与SEQ ID NO:2、4-9、47、48、150-170、183-189和199-210中任一显示出至少或约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的任何酶。
多种形式的透明质酸降解酶包括透明质酸酶已进行制备且批准用于对象包括人中的治疗用途。例如，动物衍生的透明质酸酶制剂包括(ISTA Pharmaceuticals)，纯化的绵羊睾丸透明质酸酶，(Amphastar Pharmaceuticals)，牛睾丸透明质酸酶和HydaseTM(Prima PharmInc.)，牛睾丸透明质酸酶。(Halozyme Therapeutics)是通过遗传改造的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的人重组透明质酸酶，所述CHO细胞含有编码可溶形式的PH20(指名rHuPH20)的核酸(参见例如美国公开号US20040268425；美国专利号7,767,429)。应当理解任何透明质酸酶制剂均可用于本文提供的组合、方法和用途中，参见例如美国专利号2,488,564、2,488,565、2,676,139、2,795,529、2,806,815、2,808,362、5,747,027和5,827,721和国际PCT公开号WO2005/118799；美国公开号US20040268425；美国专利号7,767,429或本文提供的任何。
用于本文提供的组合和方法中的示例性透明质酸降解酶例如透明质酸酶或可溶性透明质酸酶例如PH20的非限制性描述在下文描述。一般地，此类透明质酸降解酶包括与聚合物缀合的那些。
i.透明质酸酶
透明质酸酶是透明质酸降解酶大家族的成员。一般存在三类透明质酸酶：哺乳动物型透明质酸酶，细菌透明质酸酶以及来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶。其他透明质酸酶是已知的，例如黄蜂(SEQ IDNO:12和13)、蜜蜂(SEQ ID NO:14)、白脸大黄蜂(SEQ ID NO:15)和胡蜂(SEQID NO:16)。此类酶中的任一种均可用于本文提供的组合物、组合和方法中。
(a)哺乳动物型透明质酸酶
哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)是内切-β-N-乙酰-己糖胺酶，其将透明质酸的β-1→4糖苷键水解成多个寡糖长度例如四糖和六糖。这些酶具有水解和转糖苷酶活性，并且可以降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，一般为C4-S和C6-S。这类透明质酸酶包括但不限于来自下述的透明质酸酶：母牛(牛)(SEQ ID NO:10、11、64、203和204以及SEQ ID NO:190-192中所示的核酸分子)、绵羊(绵羊(Ovis aries))(SEQ ID NO：26、27、63和65，SEQ IDNO:66和193-194中所示的核酸分子)、猪(SEQ ID NO:20-21)、小鼠(SEQ IDNO:17-19、32、205)、大鼠(SEQ ID NO:22-24、31、206)、兔(SEQ ID NO:25、207)、猩猩(SEQ ID NO:28)、食蟹猴(SEQ ID NO:29、202)、豚鼠(SEQ IDNO:30、208)、黑猩猩(SEQ ID NO:101、199、200)、恒河猴(SEQ ID NO:102、201)、狐狸(SEQ ID NO:209和210)和人透明质酸酶(SEQ ID NO:1-2、36-39)。上述透明质酸酶包括PH20透明质酸酶。此外，如美国专利号5,747,027和5,827,721中所述的BH55透明质酸酶也是这个类型。本文提供的组合物、组合和方法中的示例性透明质酸酶是可溶性透明质酸酶。
哺乳动物透明质酸酶可以进一步再分成主要在睾丸提取物中发现的中性活性、和主要在器官例如肝中发现的酸性活性的那些。示例性中性活性透明质酸酶包括PH20，包括但不限于衍生自不同物种例如绵羊(SEQ ID NO:27、63和65)、牛(SEQ ID NO:11和64)和人(SEQ ID NO:1)的PH20。人PH20(也称为SPAM1或精子表面蛋白质PH20)一般经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着至质膜。它天然涉及精-卵附着且通过消化透明质酸帮助精子穿透卵丘细胞层。
除了人PH20(也称为SPAM1)外，在人基因组中已鉴定五种透明质酸酶样基因，HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。HYALP1是假基因，并且HYALP3(SEQ ID NO:38)仍未显示具有针对任何已知底物的酶活性。HYALP4(SEQ ID NO:39中所示的前体多肽)是软骨素酶并且显示出针对透明质酸的很少活性。HYALP1(SEQ ID NO:36中所示的前体多肽)是典型的酸性活性酶，并且PH20(SEQ ID NO:1中所示的前体多肽)是典型的中性活性酶。酸性活性透明质酸酶例如HYAL1和HYAL2(SEQ ID NO:37中所示的前体多肽)一般在中性pH(即pH 7)下缺乏催化活性。例如，HYAL1超过pH4.5具有很少的体外催化活性(Frost等人(1997)Anal.Biochem.251:263-269)。HYAL2是在体外具有极低比活性的酸性活性酶。透明质酸酶样酶还可以特征在于一般经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着至质膜的那些，例如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova,等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-4585)，以及一般可溶的那些，例如人HYAL1(Frost等人(1997)BiochemBiophys Res Commun.236(1):10-15)。
PH20
PH20，如同其他哺乳动物透明质酸酶，是内切-β-N-乙酰-己糖胺酶，其将透明质酸的β-1→4糖苷键水解成多个寡糖长度例如四糖和六糖。它具有水解和转糖苷酶活性并且可以降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，例如C4-S和C6-S。PH20天然涉及精-卵附着且通过消化透明质酸帮助精子穿透卵丘细胞层。PH20位于精子表面上和溶酶体衍生的顶体中，在其中它与顶体内膜结合。质膜PH20具有仅在中性pH下的透明质酸酶活性，而顶体内膜PH20具有在中性和酸性pH下的活性。除了是透明质酸酶外，PH20还看起来是HA诱导的细胞信号传导的受体，和围绕卵母细胞的透明带的受体。
示例性PH20蛋白质包括前体和成熟形式包括但不限于人(SEQ IDNO:1中所示的前体多肽、SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽)、黑猩猩(SEQ IDNO:101、199、200)、恒河猴(SEQ ID NO:102、201)、牛(SEQ ID NO：11和64、203、204)、兔(SEQ ID NO：25、207)、绵羊PH20(SEQ ID NO：27、63和65)、食蟹猴(SEQ ID NO：29、202)、豚鼠(SEQ ID NO：30、208)、大鼠(SEQ ID NO：31、206)、小鼠(SEQ ID NO：32、205)和狐狸(SEQ ID NO:209和210)PH20多肽。
牛PH20是553氨基酸前体多肽(SEQ ID NO:11)。牛PH20与人PH20的比对仅显示弱同源性，其中由于牛多肽中GPI锚的不存在，存在从氨基酸470直到各自羧基末端的多个缺口(参见例如Frost(2007)Expert Opin.Drug.Deliv.4：427-440)。事实上，明确的GPI锚在除了人外的许多其他PH20物种中未预测到。因此，由绵羊和牛产生的PH20多肽作为可溶形式天然存在。尽管牛PH20非常松散地附着至质膜存在，但它不经由磷脂酶敏感性锚附着(Lalancette等人(2001)Biol Reprod.65(2):628-636)。牛透明质酸酶的这个独特特征已允许使用可溶性牛睾丸透明质酸酶作为临床使用的提取物()。
人PH20mRNA转录物通常翻译生成509氨基酸前体多肽(SEQ IDNO:1)，其含有在N末端的35氨基酸信号序列(氨基酸残基位置1-35)和在C末端的19氨基酸糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着信号序列(氨基酸残基位置491-509)。因此，成熟PH20是SEQ ID NO:2中所示的474氨基酸多肽。在前体多肽转运至ER和信号肽去除后，切割C末端GPI附着信号肽以促进在对应于SEQ ID NO:1中所示的前体多肽的第490位的氨基酸位置处GPI锚与新近形成的C末端氨基酸的共价附着。因此，产生具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的474氨基酸GPI锚定的成熟多肽。
人PH20显示出在中性和酸性pH下的透明质酸酶活性。在一个方面，人PH20是一般经由GPI锚锁定至质膜的典型中性活性透明质酸酶。在另一个方面，PH20在顶体内膜上表达，其中其在中性和酸性pH下具有透明质酸酶活性。看起来PH20含有在多肽的不同区域处的两个催化位点：肽1和肽3区(Cherr等人，(2001)Matrix Biology 20:515-525)。证据指示对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的氨基酸位置107-137和SEQ ID NO:1中所示的前体多肽的位置142-172的PH20的肽1区是在中性pH下的酶活性所需的。在这个区域内的第111和113位处的氨基酸(对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟PH20多肽)看起来对于活性是重要的，因为与野生型PH20相比较，通过氨基酸替换的诱变导致分别具有3％透明质酸酶活性或无法检测的透明质酸酶活性的PH20多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。
对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的氨基酸位置242-262和SEQID NO:1中所示的前体多肽的位置277-297的肽3区看起来对于酸性pH下的酶活性是重要的。在这个区域内，在成熟PH20多肽的第249和252位处的氨基酸看起来对于活性是必需的，并且任一个的诱变导致基本上缺乏活性的多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。
除了催化位点外，PH20还含有透明质酸结合位点。实验数据指示这个位点位于肽2区中，对应于SEQ ID NO:1中所示的前体多肽的氨基酸位置205-235和SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的位置170-200。这个区域在透明质酸酶中是高度保守的，并且类似于肝素结合基序。在第176位处(对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟PH20多肽)的精氨酸残基至甘氨酸的突变导致仅具有野生型多肽的约1％透明质酸酶活性的多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。
在SEQ ID NO:1中例示的多肽的N82、N166、N235、N254、N368、N393和S490处，在人PH20中存在七个潜在糖基化位点，包括N和O联糖基化位点。因为SEQ ID NO:1的氨基酸36-464看起来含有最低限度活性人PH20透明质酸酶结构域，所以在S-490的糖基化位点不是适当透明质酸酶活性所需的。在人PH20中存在六个二硫键。在SEQ ID NO:1中例示的多肽的半胱氨酸残基C60和C351之间以及C224和C238之间的两个二硫键(分别对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的残基C25和C316以及C189和C203)。进一步的四个二硫键在SEQ ID NO:1中例示的多肽的半胱氨酸残基C376和C387之间；C381和C435之间；C437和C443之间；以及C458和C464之间(分别对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的残基C341和C352；C346和C400之间；C402和C408之间；以及C423和C429之间)形成。
(b)细菌透明质酸酶
细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)降解透明质酸和不同程度的硫酸软骨素和硫酸皮肤素。从细菌中分离的透明质酸裂解酶的作用方式不同于透明质酸酶(来自其他来源例如透明质酸葡糖胺酶，EC 3.2.1.35)。它们是内切-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，其催化透明质酸中的N-乙酰-β-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸残基之间的β1→4-糖苷键的消除反应，而不是水解，获得3-(4-脱氧-β-D-葡-4-糖醛酸基(enuronosyl))-N-乙酰-D-葡糖胺四糖和六糖，以及二糖终产物。该反应导致在其非还原端处具有不饱和已糖醛酸残基的寡糖形成。
用于提供的组合物、组合和方法的来自细菌的示例性透明质酸酶包括但不限于微生物中的透明质酸降解酶，所述微生物包括节杆菌属(Arthrobacter)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、梭菌属(Clostridium)、微球菌属(Micrococcus)、链球菌属(Streptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)和链霉菌属(Streptomyces)菌株。此类菌株和酶的特定例子包括但不限于节杆菌属物种(菌株FB24)(SEQ ID NO:67)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)(SEQ ID NO:68)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(SEQ ID NO:69)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)((SEQ ID NO:70)；18RS21(SEQ ID NO:71)；血清型Ia(SEQ ID NO:72)；和血清型III(SEQ ID NO:73))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(菌株COL)(SEQ ID NO:74)；菌株MRSA252(SEQ IDNO:75和76)；菌株MSSA476(SEQ ID NO:77)；菌株NCTC 8325(SEQ IDNO:78)；菌株牛RF122(SEQ ID NO:79和80)；和菌株USA300(SEQ IDNO:81))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)((SEQ ID NO:82)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ ID NO:83)；和血清型2、菌株D39/NCTC 7466(SEQ ID NO:84))、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(血清型M1(SEQID NO:85)；血清型M2、菌株MGAS10270(SEQ ID NO:86)；血清型M4、菌株MGAS10750(SEQ ID NO:87)；血清型M6(SEQ ID NO:88)；血清型M12、菌株MGAS2096(SEQ ID NO:89和90)；血清型M12、菌株MGAS9429(SEQID NO:91)；和血清型M28(SEQ ID NO:92))；猪链球菌(Streptococcussuis)(SEQ ID NO:93-95)；费氏弧菌(Vibrio fischeri)(菌株ATCC 700601/ES114(SEQ ID NO:96))，和Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对于透明质酸是特异性的并且不切割软骨素或硫酸软骨素(Ohya，T.和Kaneko，Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta 198:607)。
(c)来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶
来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)是内切-β-葡糖醛酸糖苷酶，其生成四糖和六糖终产物。这些酶催化透明质酸中的β-D-葡糖醛酸盐和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1→3-键的水解。来自水蛭的示例性透明质酸酶包括但不限于来自下述的透明质酸酶：水蛭科(Hirudinidae)(例如医用水蛭(Hirudo medicinalis))、石蛭科(Erpobdellidae)(例如Nephelopsis obscura和Erpobdella punctata)、舌蛭科(Glossiphoniidae)(例如Desserobdella picta、静泽蛭(Helobdella stagnalis)、扁舌蛭(Glossiphoniacomplanata)、润饰盾蛭(Placobdella ornata)和晶蛭属物种(Theromyzon sp.))和黄蛭科(Haemopidae)(马蛭(Haemopis marmorata))(Hovingh等人(1999)Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.124(3):319-26)。具有与水蛭透明质酸酶相同作用机制的来自细菌的示例性透明质酸酶是来自蓝细菌聚球藻属物种(Synechococcus sp.)(菌株RCC307，SEQ ID NO:97)的那种。
ii.其他透明质酸降解酶
除了透明质酸酶家族外，其他透明质酸降解酶也可以用于提供的组合物、组合和方法中。例如，可以采用具有切割透明质酸能力的酶，包括特定软骨素酶和裂解酶。可以降解透明质酸的示例性软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称为软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称为硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素消除酶)和软骨素C裂解酶。用于在提供的组合物、组合和方法中使用的此类酶的生产和纯化方法是本领域已知的(例如，美国专利号6,054,569；Yamagata,等人(1968)J.Biol.Chem.243(7):1523-1535；Yang等人(1985)J.Biol.Chem.160(30):1849-1857)。
软骨素ABC裂解酶包含两种酶，硫酸软骨素ABC内切裂解酶(EC4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外切裂解酶(EC 4.2.2.21)(Hamai等人(1997)JBiol Chem.272(14):9123-30)，其降解多种硫酸软骨素和硫酸皮肤素类型的葡糖氨基聚糖。硫酸软骨素、硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸皮肤素是用于硫酸软骨素ABC内切裂解酶的优选底物，但该酶还可以以较低速率作用于透明质酸。硫酸软骨素ABC内切裂解酶降解多种硫酸软骨素和硫酸皮肤素类型的葡糖氨基聚糖，产生不同大小的Δ4-不饱和寡糖的混合物，其最终降解为Δ4-不饱和四糖和二糖。硫酸软骨素ABC外切裂解酶具有相同的底物特异性，但从聚合硫酸软骨素及其通过硫酸软骨素ABC内切裂解酶产生的寡糖片段的非还原端去除二糖残基(Hamai，A.等人(1997)J.Biol.Chem.272:9123-9130)。示例性硫酸软骨素ABC内切裂解酶和硫酸软骨素ABC外切裂解酶包括但不限于来自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的那些(普通变形杆菌硫酸软骨素ABC内切裂解酶在SEQ ID NO:98中显示(Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1):39-46)。
软骨素AC裂解酶(EC 4.2.2.5)对硫酸软骨素A和C、软骨素和透明质酸具有活性，但对硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)不具有活性。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于来自肝素黄杆菌和Victivallis vadensis(分别在SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100中所示)、和金黄色节杆菌(Arthrobacteraurescens)的那些(Tkalec等人(2000)Applied and Environmental Microbiology66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews in Biochemistry and MolecularBiology 30(5):387-444)。
软骨素酶C切割硫酸软骨素C，产生四糖加上不饱和6-硫酸化二糖(delta Di-6S)。它还切割透明质酸，产生不饱和的非硫酸化二糖(delta Di-OS)。来自细菌的示例性软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属和黄杆菌属的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262:127-133)。
iii.可溶性透明质酸降解酶
本文的组合物、组合、用途和方法中提供的是可溶性透明质酸降解酶，包括可溶性透明质酸酶。可溶性透明质酸降解酶包括在表达后由细胞(例如CHO细胞)分泌并以可溶形式存在的任何透明质酸降解酶。此类酶包括但不限于可溶性透明质酸酶，包括非人可溶性透明质酸酶，包括非人动物可溶性透明质酸酶、细菌可溶性透明质酸酶和人透明质酸酶、Hyal1、牛PH20和绵羊PH20、其等位基因变体及其其他变体。例如，在可溶性透明质酸降解酶中包括的是已经修饰为可溶的任何透明质酸降解酶。例如，通过GPI锚的全部或部分的截短和去除，可以将含有GPI锚的透明质酸降解酶制备为可溶的。在一个例子中，通过在C末端处的GPI锚的全部或部分的截短和去除，可以使得通常经由GPI锚膜锚定的人透明质酸酶PH20可溶。
可溶性透明质酸降解酶还包括中性活性和酸性活性透明质酸酶。取决于因素例如但不限于在施用后的所需酶活性水平和/或施用部位，可以选择中性活性和酸性活性透明质酸酶。在特定例子中，用于本文组合物、组合和方法中的透明质酸降解酶是可溶性中性活性透明质酸酶。
示例性透明质酸酶包括来自任何物种的可溶形式的PH20，例如SEQ IDNO:1、2、11、25、27、29-32、63-65、101-102和199-210中任一的可溶形式的PH20。此类可溶形式包括其缺乏C末端GPI锚的全部或部分的截短形式，只要透明质酸酶是可溶的(在表达后分泌的)且保留透明质酸酶活性。此类形式通常还是当在细胞中表达时，缺乏信号肽的成熟形式。在可溶性透明质酸酶中还包括的是来自SEQ ID NO:1、2、11、25、27、29-32、63-65、101-102和199-210中所示的任何种类的PH20的任何的变体的可溶形式，或其截短形式，其显示出透明质酸酶活性。变体包括与SEQ ID NO:1、2、11、25、27、29-32、63-65、101-102和199-210中任一具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的多肽，或其成熟(例如缺乏信号序列)或截短形式。氨基酸变体包括保守和非保守突变。应当理解，重要的或透明质酸酶活性另外需要的残基，例如上文描述的或本领域技术人员已知的任何残基，一般是不变的且不能被改变。这些包括例如活性位点残基。因此，例如，人PH20多肽或其可溶形式的氨基酸残基111、113和176(对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟PH20多肽中的残基)一般是不变的且不改变的。赋予糖基化和正确折叠所需的二硫键形成的其他残基也可以不变。
在一些情况下，可溶性透明质酸降解酶通常是GPI锚定的(例如人PH20)，并且通过在C末端处的截短而致使可溶。此类截短可以去除GPI锚附着信号序列的全部，或可以仅去除GPI锚附着信号序列的一些。然而，所得到的多肽是可溶的。在其中可溶性透明质酸降解酶保留GPI锚附着信号序列的部分的情况下，可以保留GPI锚附着信号序列的中的1、2、3、4、5、6、7个或更多个氨基酸残基，条件是该多肽是可溶的。含有GPI锚的一个或多个氨基酸的多肽被称为延长的可溶性透明质酸降解酶。本领域技术人员可以使用本领域众所周知的方法确定多肽是否是GPI锚定的。此类方法包括但不限于使用已知算法预测GPI锚附着信号序列和ω-位点的存在和定位，并且在用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或D(PI-PLD)消化前后进行可溶性分析。
延长的可溶性透明质酸降解酶可以通过对任何天然GPI锚定的透明质酸降解酶制备C末端截短而产生，从而使得所得到的多肽是可溶的并且含有来自GPI锚附着信号序列的一个或多个氨基酸残基(参见例如美国公开专利申请号US20100143457)。其为C末端截短的但保留GPI锚附着信号序列的部分的示例性延长的可溶性透明质酸降解酶包括但不限于灵长类动物起源的延长的可溶性PH20(esPH20)多肽，例如人和黑猩猩esPH20多肽。例如，可以通过SEQ ID NO:1、2、50、51或101中所示的成熟或前体多肽中的任何、或其他变体包括其活性片段的C末端截短，制备esPH20多肽，其中所得到的多肽是可溶的并且保留来自GPI锚附着信号序列的一个或多个氨基酸残基。变体包括与SEQ ID NO:1、2、50、51或101中任一具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多序列相同性的多肽，其保留透明质酸酶活性。与野生型多肽例如具有SEQ ID NO:1、2、50、51或101中所示序列的多肽相比较，本文提供的esPH20多肽可以是C末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的，条件是所得到的esPH20多肽是可溶的并且保留来自GPI锚附着信号序列的1个或多个氨基酸残基。
通常，对于在本文组合物、组合和方法中的使用，使用可溶性人透明质酸降解酶例如可溶性人PH20。尽管可以利用来自其他动物的透明质酸降解酶例如PH20，但此类制剂是潜在免疫原性的，因为它们是动物蛋白质。例如，显著比例的患者证实对摄入的食物继发性的先前致敏，并且因为这些是动物蛋白质，所以所有患者均具有后续致敏的危险。因此，非人制剂可能不适合于长期使用。如果需要非人制剂，则本文考虑此类多肽可以制备为具有减少的免疫原性。此类修饰在本领域技术人员的水平内并且可以包括例如分子上的一个或多个抗原性表位的去除和/或替换。
本文方法中使用的透明质酸降解酶包括透明质酸酶(例如PH20)可以重组产生或可以由天然来源例如由睾丸提取物纯化或部分纯化。产生重组蛋白质包括重组透明质酸降解酶的方法在本文其他地方提供并且是本领域众所周知的。
(a)可溶性人PH20
示例性可溶性透明质酸酶是可溶性人PH20。可溶形式的重组人PH20已被产生并且可以用于本文描述的组合物、组合和方法中。此类可溶形式的PH20的产生在美国公开专利申请号US20040268425；US20050260186、US20060104968、US20100143457以及国际PCT公开号WO2009111066中描述。例如，可溶性PH20多肽包括C末端截短的变体多肽，其包括SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1或2中包括的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列相同性，保留透明质酸酶活性并且是可溶的。在这些多肽内包括的是可溶性PH20多肽，其完全缺乏GPI锚附着信号序列的全部或部分。
还包括的是延长的可溶性PH20(esPH20)多肽，其含有GPI锚的至少一个氨基酸。因此，代替在ER中具有共价附着至蛋白质C末端的GPI锚且锚定至质膜的细胞外片，这些多肽是分泌的且是可溶的。与全长野生型多肽例如具有SEQ ID NO:1或2中所示序列的全长野生型多肽，或其等位基因或种变体或其他变体相比较，C末端截短的PH20多肽可以是C末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60个或更多个氨基酸的。
例如，可溶形式包括但不限于SEQ ID NO:1中所示的人PH20的C末端截短的多肽，其具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的C末端氨基酸残基467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482和483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500，或显示出与之至少85％相同性的多肽。可溶形式的人PH20一般包括含有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸36-464的那些。例如，当在哺乳动物细胞中表达时，35氨基酸N末端信号序列在加工过程中被切割，并且分泌成熟形式的蛋白质。因此，成熟可溶性多肽含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482和483。表3提供了示例性C末端截短的PH20多肽包括C末端截短的可溶性PH20多肽的非限制性例子。在下表3中，提供了前体和成熟多肽的长度(以氨基酸表示)，和其中显示C末端截短的PH20蛋白质的前体和成熟多肽的示例性氨基酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。野生型PH20多肽也包括在表3中用于比较。特别地，示例性可溶性透明质酸酶是可溶性人PH20多肽，其长度为442、443、444、445、446或447个氨基酸，例如SEQ ID NO:4-9中任一所示，或其等位基因或种变体或其他变体。
例如，可溶形式的PH20包括例如这样的多肽，其具有SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列显示出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。
一般地，可溶形式的PH20使用蛋白质表达系统产生，所述蛋白质表达系统促进正确的N-糖基化以确保多肽保留活性，因为糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性是重要的。此类细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44CHO细胞)。
(b)rHuPH20
重组可溶形式的人PH20已被产生并且可以用于本文提供的组合物、组合和方法中。此类可溶形式的重组人PH20的生成例如在美国公开专利申请号US20040268425；US 20050260186；US20060104968；US20100143457；以及国际PCT申请号WO2009111066中描述。示例性此类多肽是通过表达编码氨基酸1-482(SEQ ID NO:3中所示)的核酸分子生成的那些。此类示例性核酸分子在SEQ ID NO:49中显示。翻译后加工去除35氨基酸信号序列，留下447氨基酸可溶性重组人PH20(SEQ ID NO:4)。当在培养基中产生时，在C末端处存在异质性，从而使得指名rHuPH20的产物包括种类的混合物，所述种类可以包括不同丰度的SEQ ID NO.4-9中的任何一个或多个。一般地，rHuPH20在促进正确N-糖基化以保留活性的细胞例如CHO细胞(例如DG44CHO细胞)中产生。
iv.透明质酸降解酶的糖基化
一些透明质酸降解酶包括透明质酸酶的糖基化(包括N和O联糖基化)对于其催化活性和稳定性可以是重要的。虽然改变聚糖类型修饰糖蛋白可以对蛋白质的抗原性、结构折叠、可溶性和稳定性具有显著影响，但大多数酶不认为需要糖基化用于最佳酶活性。对于一些透明质酸酶，N联糖基化的去除可以导致透明质酸酶活性的几乎完全失活。因此，对于此类透明质酸酶，N联聚糖的存在对于生成活性酶是关键的。
N联寡糖分成几个主要类型(寡聚甘露糖，复杂、混合、硫酸化)，所有这些都具有经由Asn残基的酰胺氮附着的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核，所述Asn残基属于-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)。对于凝固蛋白C，已报道在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化。在一些情况下，透明质酸降解酶例如透明质酸酶可以含有N-糖苷键和O-糖苷键。例如，PH20具有O联寡糖以及N联寡糖。在SEQ ID NO：1中例示的人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393存在六个潜在N联糖基化位点。氨基酸残基N82、N166和N254由复杂型聚糖占据，而氨基酸残基N368和N393由高甘露糖型聚糖占据。氨基酸残基N235由约80％高甘露糖型聚糖和20％复杂型聚糖占据。如上所述，在S490处的O联糖基化不是透明质酸酶活性所需的。
在一些例子中，用于提供的组合物、组合和/或方法中的透明质酸降解酶在糖基化位点中的一个或全部处是糖基化的。例如，对于人PH20或其可溶形式，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点中的2、3、4、5或6个是糖基化的。在一些例子中，透明质酸降解酶在一个或多个天然糖基化位点处是糖基化的。在其他例子中，透明质酸降解酶在一个或多个非天然糖基化位点处进行修饰，以在一个或多个另外位点处赋予多肽的糖基化。在此类例子中，另外的糖部分的附着可以增强分子的药物代谢动力学性质，例如改善的半衰期和/或改善的活性。
在其他例子中，用于本文提供的组合物、组合和/或方法中的透明质酸降解酶是部分去糖基化的(或N部分糖基化多肽)。例如，保留完全糖基化透明质酸酶的全部或部分透明质酸酶活性的部分去糖基化可溶性PH20多肽可以用于本文提供的组合物、组合和/或方法中。示例性部分去糖基化的透明质酸酶包括来自任何物种的部分去糖基化PH20多肽的可溶形式，例如SEQ ID NO:1、2、11、25、27、29-32、63、65、101-102和199-210中任一所示的，或其等位基因变体、截短变体或其他变体。此类变体是本领域技术人员已知的，并且包括与SEQ ID NO:1、2、11、25、27、29-32、63、65、101-102和199-210中任一或其截短形式具有60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多序列相同性的多肽。本文提供的部分去糖基化的透明质酸酶还包括杂交、融合和嵌合部分去糖基化的透明质酸酶以及部分去糖基化的透明质酸酶缀合物。
糖苷酶或糖苷水解酶是催化糖苷键水解的酶，以生成两个更小的糖。脊椎动物中主要类型的N-聚糖包括高甘露糖聚糖、混合聚糖和复杂聚糖。存在仅导致部分蛋白质去糖基化的几个糖苷酶，包括：EndoF1，其切割高甘露糖和混合型聚糖；EndoF2，其切割双触角复杂型聚糖；EndoF3，其切割双触角和更多支链的复杂聚糖；和EndoH，其切割高甘露糖和混合型聚糖。用这些糖苷酶中的一种或全部处理透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶例如可溶性PH20可以导致仅部分糖基化，并且因此保留透明质酸酶活性。
部分去糖基化的透明质酸降解酶例如部分去糖基化的可溶性透明质酸酶可以通过用一种或多种糖苷酶消化产生，所述糖苷酶一般为不去除全部N聚糖而仅使蛋白质部分去糖基化的糖苷酶。例如，用上述糖苷酶(例如EndoF1、EndoF2和/或EndoF3)中的一种或全部处理PH20(例如指定为rHuPH20的重组PH20)导致部分去糖基化。这些部分去糖基化的PH20多糖可以显示出与完全糖基化的多肽可比较的透明质酸酶酶促活性。相比之下，用PNG酶F(切割所有N-聚糖的糖苷酶)处理PH20导致所有N-聚糖的完全去除，从而使PH20变得酶促失活。因此，尽管所有N联糖基化位点(例如在SEQ ID NO:1中例示的人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393处的那些)可以是糖基化的，但与不用一种或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比较，用一种或多种糖苷酶处理可以使糖基化程度减少。
部分去糖基化的透明质酸降解酶包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽，可以具有完全糖基化多肽的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％糖基化水平。在一个例子中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点中的1、2、3、4、5或6个是部分去糖基化的，从而使得它们不再含有高甘露糖或复杂型聚糖，而是含有至少N-乙酰葡糖胺部分。在一些例子中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166和N254的N-糖基化位点中的1、2或3个是去糖基化的，即，它们不含糖部分。在其他例子中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点中的3、4、5或6个是糖基化的。糖基化的氨基酸残基最低限度含有N-乙酰葡糖胺部分。一般地，部分去糖基化的透明质酸降解酶包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽显示出这样的透明质酸酶活性，其是由完全糖基化的多肽显示出的透明质酸酶活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多。
v.经修饰的(聚合物缀合的)透明质酸降解酶
聚合分子例如聚乙二醇部分(聚乙二醇化部分(PEG))与透明质酸降解酶例如透明质酸酶的共价或其他稳定附着(缀合)因此可以对所得到的透明质酸降解酶-聚合物组合物赋予有利性质。此类性质包括改善的生物相容性、在对象内的血液、细胞和/或其他组织中的蛋白质(和酶促活性)半衰期的延长、蛋白质不受蛋白酶和水解的有效屏蔽、改善的生物分布、增强的药物代谢动力学和/或药效学、和增加的水溶性。
可以缀合至透明质酸降解酶例如透明质酸酶的示例性聚合物包括天然和合成同聚物例如多元醇(即聚OH)、聚胺(即聚NH2)和聚羧酸(即聚COOH)，和进一步的杂聚物即包含一个或多个不同偶联基团例如羟基和氨基的聚合物。合适聚合分子的例子包括选自下述中的聚合分子：聚烷撑氧化物(PAO)例如聚烷撑二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)，PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支链聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚(乙烯亚胺)(PEI)，线性聚酰胺胺，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基丙烯酰胺(PDAAm)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚-D,L-氨基酸，聚乙烯共马来酸酐，聚苯乙烯共马来酸酐，右旋糖酐包括羧甲基-壳聚糖，糊精，右旋糖酐，肝素，同源白蛋白，纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羧丙基纤维素，壳聚糖水解产物，淀粉例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜尔胶，普鲁兰，菊粉，黄原胶，角叉菜胶，果胶，海藻酸水解产物和生物聚合物。
一般地，聚合物为聚烷撑氧化物(PAO)，例如聚氧化乙烯，例如PEG，一般为mPEG，其与多糖例如右旋糖酐和普鲁兰相比较，具有能够交联的少数反应基团。一般地，聚合物是无毒聚合分子例如(m)聚乙二醇(mPEG)，其可以使用相对简单的化学作用共价缀合至透明质酸降解酶例如透明质酸酶(例如蛋白质表面上的附着基团)。
治疗剂的聚乙二醇化已报道增加对蛋白酶解的抗性、增加血浆半衰期且降低抗原性和免疫原性。示例性聚乙二醇化方法是本领域已知的(参见例如Lu和Felix，Int.J.Peptide Protein Res.，43:127-138，1994；Lu和Felix，Peptide Res.，6:140-6，1993；Felix等人，Int.J.Peptide Res.，46:253-64，1995；Benhar等人，J.Biol.Chem.，269:13398-404，1994；Brumeanu等人，J Immunol.，154:3088-95，1995；还参见，Caliceti等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10):1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8Pt 2):3S-8S)。聚乙二醇化还可以用于在体内的核酸分子递送。例如，腺病毒的聚乙二醇化可以增加稳定性和基因转移(参见例如Cheng等人(2003)Pharm.Res.20(9):1444-51)。
用于附着至透明质酸降解酶包括透明质酸酶的合适聚合分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物，例如甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支链PEG和聚氧化乙烯(PEO)(参见例如Roberts等人，Advanced Drug Delivery Review(2002)，54：459-476；Harris和Zalipsky，S(编辑)"Poly(ethylene glycol)，Chemistry andBiological Applications"ACS Symposium Series 680，1997；Mehvar等人，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，3(1):125-136，2000；Harris，(2003)Nature ReviewsDrug Discovery 2:214-221；和Tsubery，(2004)J Biol.Chem 279(37):38118-24)。聚合分子可以具有一般范围为约3kDa-约60kDa的分子量。在一些实施方案中，缀合至蛋白质例如透明质酸酶例如PH20的聚合分子具有在5-60kDa之间或大约在5-60kDa之间例如至少或约至少或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或超过60kDa的分子量。
聚乙二醇化的可溶性透明质酸降解酶
在本文组合物和方法中使用的透明质酸降解酶可以是聚乙二醇化的透明质酸降解酶，例如聚乙二醇化的可溶性透明质酸降解酶。在一个例子中，它是聚乙二醇化的可溶性透明质酸酶例如聚乙二醇化的PH20。通过共价附着(缀合)PEG或PEG衍生物(即，“聚乙二醇化”)修饰多肽的多种方法是本领域已知的(参见例如U.S.2006/0104968；U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；和U.S.2004/0235734)。用于聚乙二醇化的技术包括但不限于专门接头和偶联化学(参见例如Roberts等人，Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476，2002)、多个PEG部分与单个缀合位点的附着(例如经由支链PEG的使用；参见例如Guiotto等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180，2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见例如Chapman等人，Nature Biotech.17:780-783，1999)、和定点酶促聚乙二醇化(参见例如Sato，Adv.Drug Deliv.Rev.，54:487-504，2002)。本领域描述的方法和技术可以产生具有附着至单个蛋白质分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个PEG或PEG衍生物的蛋白质(参见例如U.S.2006/0104968)。
用于聚乙二醇化的众多试剂已在本领域中得到描述。此类试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活化PEG、琥珀酰亚胺基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚胺基α-丁酸甲酯、mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚胺酯、同双功能PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、同双功能PEG丙醛、同双功能PEG丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、对硝基苯基碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支链mPEG2丁醛、mPEG乙酰基、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG“无接头”马来酰亚胺、mPEG乙烯基砜、mPEG硫醇、mPEG邻吡啶基硫酯、mPEG邻二硫吡啶、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯基砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS、和生物素PEG-NHS(参见例如Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6:62-69，1995；Veronese等人，J.Bioactive CompatiblePolymers 12:197-207，1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324，844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795，569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990，237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；WO0500360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO 01076640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；和WO 0187925)。
2.紫杉烷及其制剂
本文提供的组合疗法包括其组合物、组合以及方法和用途包含紫杉烷。紫杉烷一般是弱水溶性的，这限制其治疗用途。在本文提供的组合物和组合中，紫杉烷作为显示出水溶性的制剂提供。在本文提供的特定例子中，紫杉烷作为靶向和/或穿透肿瘤基质或细胞的制剂提供。示例性此类紫杉烷制剂是白蛋白结合的紫杉烷。
a.紫杉烷
紫杉烷是由红豆杉属植物(紫杉)产生的二萜。紫杉烷是抗有丝分裂剂，其与微管蛋白结合并用于稳定微管聚合，从而破坏涉及微管装配和解构的正常平衡并延缓微管功能。虽然紫杉烷促进微管的形成，但它们阻止形成有丝分裂纺锤体微管的微管蛋白解聚。微管是细胞分裂必需的，并且暴露于紫杉烷的细胞被阻滞在有丝分裂前G2期且未能分裂。这些药物因此干扰细胞分裂过程，因为用这些药物处理的细胞保持在有丝分裂。这可以最终导致由于不成功的有丝分裂的细胞死亡。
紫杉烷还在经处理的细胞中产生活性氧(ROS)，包括O2和H2O2累积。ROS的累积与紫杉烷包括紫杉醇的直接细胞毒性活性以及对邻近细胞的旁观者作用相关(参见例如Alexandre等人(2007)Cancer Res.，67:3512)。
用于本文提供的组合物、组合和方法中的紫杉烷包括抑制微管蛋白解聚的任何二萜化合物。特别地，此类紫杉烷还包括导致经处理的细胞中ROS累积的任何物质。紫杉烷包括其为天然产生的二萜的纯化形式的那些或人工合成的那些。紫杉烷包括非结晶和/或无定形的那些。紫杉烷还可以包括无水形式的紫杉烷。
紫杉醇(泰素)是天然存在的二萜类化合物。它具有化学名称5β,20-环氧-1,2α4,7β,10β,13α-六羟基紫杉(hexahydroxytax)-11-烯-9-酮4,10-二乙酸-2-苯甲酸酯。泰素在西部紫杉(短叶红豆杉(Taxus brevifolia))以及(欧洲红豆杉(T.baccata)和东北红豆杉(T.cuspidata))的茎树皮中发现。它首先从太平洋紫杉树，短叶红豆杉的树皮中分离(Wani等人(1971)J.Am.Chem.Soc.，93:2325)。紫杉醇的核心结构含有四个环(六元A和C环、八元B环和四元D环)。紫杉醇的结构在下文显示，其中显示的编号使用这类药物的常规编号系统。
紫杉醇可以通过来自称为浆果赤霉素(baccatins)的前体化学品的半合成方法进行制备，所述浆果赤霉素衍生自欧洲或喜马拉雅紫杉树的针叶和小枝。例如，紫杉醇可以通过下述由浆果赤霉素进行制备：对待成为紫杉醇羟基的浆果赤霉素羟基附着保护基团，将前体浆果赤霉素转换为紫杉醇，并且随后从羟基处去除保护基团，以获得紫杉醇。此外，紫杉醇近期已由简单前体合成。(参见例如国际PCT公开号WO93/10076，WO93/16059；美国专利号5,200,534美国专利号5,015,744；美国专利号4,960,790；Nicolaou(1993)Nature 364:464-466；Nicolaou，K.C.等人(1994)Nature，367:630-634；和Holton等人(1994)J.Am.Chem.Soc.，116:1597-1600)。
多西他赛(泰索帝)是用于本文提供的组合和组合物中的另一种示例性紫杉烷。多西他赛具有化学名称1,7β,10β-三羟基-9-氧代-5β,20-环氧紫衫-11-烯-2α,4,13α-三基4-乙酸酯2-苯甲酸酯13-{(2R,3S)-3-[(叔丁氧羰基)氨基]-2-羟基-3-苯基丙酸酯并且具有下文显示的结构，其中显示的编号使用这类药物的常规编号系统。
多西他赛是衍生自欧洲紫杉树(欧洲红豆杉)中发现的化合物的半合成第二代紫杉烷。多西他赛是由欧洲紫杉树提取的10-脱乙酰浆果赤霉素III的酯化产物。它在其化学结构中的两个位置处不同于紫杉醇：它缺乏乙酸酯，并且在苯基丙酸酯侧链上存在叔丁基氨基甲酸酯代替紫杉醇中的苄基酰胺。多西他赛，紫杉醇的类似物，由从欧洲红豆杉的针叶中提取的非细胞毒性前体的10-脱乙酰浆果赤霉素III并且由化学合成的侧链酯化半合成产生(Cortes和Pazdur，1995，J.Clin.Oncol.13(10):2643-55)。
用于本文提供的组合物、组合和方法中的紫杉烷包括紫杉醇或多西他赛的类似物、衍生物和前药形式。此类紫杉烷衍生物包括与紫杉醇或多西他赛相比较显示出改善的水溶性的那些。例如，紫杉烷衍生物、类似物和前药形式包括其中环位置进行修饰或衍生的那些，并且特别是其中2’-和7或10-位置由合适基团衍生的那些(参见例如Fu等人(2009)CurrentMedicinal Chemistry，16:1-13)。
例如，紫杉烷衍生物、类似物或前药形式包括但不限于在2’-O-位置处具有多个取代酰基的水溶性泰素(参见例如美国专利号4,942,184)；水溶性泰素，由此2’和/或7’羟基由所选氨基酸或氨基酸模拟化合物衍生(参见例如美国专利号4,960,790)；磺酸化2’-丙烯酰，磺酸化2’-O-酰基酸泰素和取代的2’-苯甲酰和2’7-二苯甲酰泰素(参见例如美国专利号5,352,805和5,411,984)；泰素的2’和/或7-O-酯以及2’和/或7-O-碳酸酯衍生物(参见例如美国专利号5,817,840)；通过与聚合物例如聚乙二醇、聚(L-谷氨酸)、聚(L-天冬氨酸)缀合形成的紫杉烷衍生物(参见例如美国专利号5,977,163)；在紫杉烷侧链的C-7、C-10和/或2’位置处具有膦酰氧基的紫杉烷的前药形式(参见例如WO9414787)；2’-琥珀酰紫杉醇和2’戊二酰紫杉醇的盐(Deutch等人(1989)J.Med.Chem.，32:788-792)；紫杉醇的2’和7-氨基酸衍生物及其盐(Matthew等人(1992)J.Med.Chem.，35:145-151；磺酸酯衍生物(Zhao等人(1991)J.Nat.Prod.，54:1607-1611；7-磷酸酯紫杉醇相似体(Vyas等人(1993)Bioorg.Med.Chem.，Lett.，3:1357-1360)；紫杉醇的2’和7-聚乙二醇酯(Greenwald等人(1995)J.Org.Chem.，60:331-336；Greenwald等人(1996)J.Med.Chem.，39:424-431)；2’和7-膦酰氧基苯基-丙酸酯紫杉醇(Ueda等人(1993)Bioorg.Med.Chem.Lett.，3:1761-1766)；紫杉醇的2’和7-甲基吡啶鎓乙酸酯相似体(Nicolaou等人(1994)Angew Chemie，106:1672-1675)；Paloma等人(1994)Chem.Biol.，1:107-112)；在2’位置处具有苹果酸的紫杉醇前药(Damen等人(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.，8:427-432)；紫杉烷且特别是泰素的磺酸盐(美国专利号5,059,699)；其中附着酰基链以增强紫杉烷的脂溶性的衍生物(参见例如美国专利号6,482,850)；显示出比无水产物更大的稳定性的三水合物形式的多西他赛(参见例如美国专利号6,022,985和6,838,569)；C-10紫杉烷衍生物包括在C-10位置处含有氨基甲酸酯部分的那些(美国专利号8,138,361)；疏水紫杉烷衍生物(美国专利公开号US20090263483)；和紫杉烷的含酰肼羧酸酯衍生物(参见例如美国专利号8,133,888)。
b.肿瘤或基质靶向的紫杉烷
在本文组合物和组合中提供的紫杉烷化合物一般制备为靶向肿瘤或肿瘤周围的基质。本文提供的组合物和组合中的紫杉烷也作为显示出改善可溶性的增溶或纳米分散的制剂提供。
天然或半合成产生的紫杉醇(泰素)具有例如低水溶性和非特异性靶向或定位的问题。例如，紫杉烷包括紫杉醇和多西他赛是非常难溶于水的(小于10μg/mL)，并且因此实际上不能用水性介质配制用于静脉内施用。为了对抗水溶性问题，目前的紫杉醇制剂在具有聚氧乙烯化蓖麻油(聚氧乙烯35或)作为主要溶剂/表面活性剂的溶液中配制用于静脉内施用于具有癌症的患者，在所述溶液中采用高浓度的乙醇作为共溶剂。如同紫杉醇，多西他赛是非常难溶于水的。目前，用于溶解多西他赛的溶剂/表面活性剂是聚山梨醇酯80(Tween 80)(Bissery等人1991Cancer Res.51(18):4845-52；Tomiak等人1992)。现有制剂中的乙醇、克列莫佛(Cremophor)和/或Tween与超敏反应的发生相关，所述超敏反应可以包括严重皮疹、荨麻疹、潮红、呼吸困难、心动过速及其他。
进一步地，通过增加针对癌症组织的特异性，由于减少的全身效应或暴露，紫杉烷分子显示出更少的毒性。通常，肿瘤靶向紫杉烷是直接或经由接头与肿瘤识别部分缀合或连接的紫杉烷、其衍生物、类似物或前药。肿瘤识别部分可以是单克隆抗体、蛋白质、肽、脂质或大分子复合物，其识别与正常细胞相比较在癌细胞上差异表达的肿瘤特异性标记或部分。癌细胞过表达可以靶向递送紫杉烷的许多肿瘤特异性标记或受体。
肿瘤靶向紫杉烷可以作为胶束、纳米颗粒、微球体、脂质体或水凝胶制剂提供。可以使用此类制剂以便在水性介质中封装可以显示出低可溶性的活性成分，例如紫杉烷。此类制剂是本领域技术人员众所周知的。在一些例子中，递送媒介物由肿瘤靶向部分例如大分子复合物、单克隆抗体、蛋白质、肽或脂质包被或缀合。因此，在一些例子中，药物递送平台封装紫杉烷，并且自身在表面上展示靶向配体或其他聚合包衣以实现肿瘤靶向。
示例性肿瘤靶向紫杉烷及其制剂含有肿瘤靶向部分，其为大分子例如聚-L-谷氨酸盐(PGA-TXL，Xyotax；Li等人(1998)Cancer Res.，58:2404-2409)；特异性针对肿瘤标记例如p140TrkA或p75受体(Guillemard和Saragovi(2001)Cancer Res.，61:694)或抗表皮生长因子受体(即抗EGFR单克隆抗体，例如西妥昔单抗；Safavy等人(2003)Bioconjug.，14:302-10；Ojima等人(2002)J.Med.Chem.，45:5620-3)的单克隆抗体，抗HER2(赫赛汀，曲妥珠单抗，Cirstoiu-Hapca等人(2010)J.Control Release，144:324-31)；多不饱和脂肪酸例如二十二碳六烯酸(DHA；Bradley等人(2001)Clin.CancerResearch，7:3229-38)，亚麻酸或亚油酸(Kuznetsova等人(2006)Bioorg.Med.Chem.Lett.，15:974-7)；肽例如指定为BBN[7-13]的7-氨基酸合成肽，其与细胞表面铃蟾肽/胃泌素释放肽(BBN/GRP)结合(Safavy等人(1999)J.Med.Chem.，42:4919-4924)，LRP-1靶向19氨基酸肽angiopep-2(Wen等人(2011)Molecular Cancer Therapeutics，10(11Suppl):Abstract B49)，通过基质金属蛋白酶2(MMP2；Yamada等人(2010)Cancer Biology and Therapy，9:192-203)切割的八肽，RGD肽(参见例如Zhao等人(2009)J.Drug Target，17:10-8)；靶向肿瘤特异性受体例如维生素受体包括生物素(维生素H或B-7，叶酸盐或叶酸，维生素B12或核黄素)的蛋白质(参见例如Chen等人(2010)Biconjug.Chem.，21:979-987，Li等人(2011)International Journal of Nanomedicine，6:1167-1184)；透明质酸(HA)(Auzenne等人(2007)Neoplasia，9:479-486)；运铁蛋白(Sahoo等人(2004)Int.J.Cancer，112:335-40)；和白蛋白。
白蛋白结合的紫杉烷
示例性可溶性聚合物-药物复合物是白蛋白缀合的紫杉烷。白蛋白是内源疏水分子例如维生素或激素的天然载体。除充当载体之外，白蛋白还通过与内皮细胞表面上的gp60结合来促进蛋白质结合的血浆组成成分的内皮胞转作用，其实现小窝(caveolae)介导的胞转作用。白蛋白还能够结合富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(SPARC，也称为骨接合素)，其存在于许多肿瘤细胞上。因此，白蛋白促进白蛋白结合药物的肿瘤细胞累积。
白蛋白包括人血清白蛋白(HSA)以及非人白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)。HSA是Mr 65K的高度可溶性球状蛋白质，含有585个氨基酸(SEQID NO:211)。HSA是血浆中最丰富的蛋白质，负责70-80％的人血浆胶体渗透压。HSA的氨基酸序列含有总共17个二硫桥，一个游离硫醇(Cys 34)和单个色氨酸(Trp 214)。
人血清白蛋白(HSA)具有多个疏水结合位点(总共八个用于脂肪酸，HSA的内源配体)，并且已显示结合不同组的药物试剂，尤其是中性和带负电的疏水化合物(Goodman等人，The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill New York(1996))。两个高亲和力结合位点已在HSA的亚结构域IIA和IIIA中提出，其是高度拉长的疏水口袋，具有接近表面的荷电赖氨酸和精氨酸残基，其充当极性配体特征的附着点(参见例如Fehske等人，Biochem.Pharmcol.，30，687-92(1981)，Vorum，Dan.Med.Bull.，46，379-99(1999)，Kragh-Hansen，Dan.Med.Bull.，37:57-84(1990)，Curry等人，Nat.Struct.Biol.，5，827-35(1998)，Sugio等人，Protein.Eng.，12，439-46(1999)，He等人，Nature，358，209-15(1992)，和Carter等人，Adv.Protein.Chem.，45，153-203(1994))。紫杉醇和多西他赛已显示结合HSA(参见例如Paal等人，Eur.J.Biochem.，268(7)，2187-91(2001)，Purcell等人，Biochim.Biophys.Acta，1478(1)，61-8(2000)，Altmayer等人，Arzneimittelforschung，45，1053-6(1995)，Garrido等人，Rev.Esp.Anestestiol.Reanim.，41，308-12(1994)；和Urien等人，Invyvest.New Drugs，14(2)，147-51(1996))。
组合物中白蛋白与紫杉烷的重量比是约或小于20:1或更少，例如19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1或更少，并且一般是至少或约至少或是9:1。所得到的产物可以生成为不含溶剂和/或表面活性剂的。紫杉烷由白蛋白包被。紫杉烷/白蛋白纳米颗粒一般具有不超过200nm并且一般为100nm-200nm的平均直径，例如130nm的平均直径。
例如，白蛋白结合的紫杉烷包括白蛋白结合的(nab-)紫杉醇(例如Abraxane，American Bioscience，Inc.(Santa Monica，CA)；也在美国专利号5,439,686和6,749,868中描述)或白蛋白结合的多西他赛(例如在例如美国专利申请公开号20080161382、20070117744和20070082838中描述)。人白蛋白充当表面活性聚合物，对紫杉醇纳米颗粒提供电荷和立体稳定，以预防聚集。稳定通过下述事实来实现：白蛋白吸附在紫杉醇纳米颗粒的表面上，因此产生充当表面活性聚合物的片层，阻止紫杉醇颗粒的聚集。在紫杉醇和人白蛋白之间的相互作用很弱，并且两种物质在重构后自由解离。因此，当重构并注射到血流内时，紫杉醇浓度快速降低，白蛋白颗粒被认为解离成个别白蛋白分子并且随后与仍附着的紫杉醇一起循环。特别地，白蛋白结合的紫杉醇(例如nab-紫杉醇或Abraxane)可以用作衍生自在盐水溶液(0.9％NaCl)中稀释的紫杉醇和人白蛋白的冻干制剂的胶体悬浮液。所得到的药物颗粒复合物以130nm的平均大小被稳定。还可以生成并使用含有其他紫杉烷例如本文上文描述的任何的纳米颗粒，并且可以含有与上文描述相同的特征。
3.进一步的化疗剂(例如核苷类似物)
任选地，其活性通过与聚合物缀合的透明质酸降解酶和/或紫杉烷制剂之一或两者共施用得到改善或增加的另外的化疗剂可以包括在本文提供的组合疗法中。例如，一种或多种核苷类似物特别是抗代谢物可以包括在本文提供的组合疗法中。在它们进入细胞后，核苷类似物成功磷酸化为核苷5’-单磷酸盐、二磷酸盐和三磷酸盐。例如，一般地，核苷类似物通过核苷磷酸化为其三磷酸盐(例如通过二磷酸盐激酶)转换为活性化合物，其随后能够与作为底物的生理学核苷(例如dCTP)竞争掺入DNA。因此，核苷类似物模拟生理学核苷。一旦掺入，类似物就是无效底物，从而停顿复制和/或引起链终止。关于核苷类似物的综述参见Sampath等人(2003)，Oncogene，22:9063-9074。因为核苷类似物需要转换成活性形式，所以它们一般是必须磷酸化为活性形式的前药。
用于本文组合物和组合中的核苷类似物包括嘌呤和嘧啶核苷类似物，以及其衍生物和前药形式。嘧啶核苷类似物包括但不限于氟嘧啶5-氟尿嘧啶(5-FU；氟尿嘧啶)，5-氟-2'-脱氧胞苷(FCdR)，阿糖胞嘧啶(氮杂-C；也称为胞嘧啶阿糖核苷或阿糖胞苷)，吉西他滨(2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷)，曲沙他滨(β-L-二氧戊环胞苷，BCH-4556)，地西他滨(5-氮杂-2'-脱氧胞苷)，氮杂胞苷(4-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-1,3,5-三嗪-2(1H)-酮)，假异胞苷(psi ICR)，5-氮杂-2'-脱氧-2′,2′-二氟胞苷；5-氮杂-2'-脱氧-2'-氟胞苷；1-β-D-呋喃核糖基-2(1H)-嘧啶酮(Zebularine)；2′,3′-二脱氧-5-氟-3'-硫代胞苷(恩曲他滨)；2'-环胞苷(安西他滨)；1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-氮杂胞嘧啶(法扎拉滨或氮杂-AC)；6-氮杂胞苷(6-氮杂-CR)；5,6-二氢-5-氮杂胞苷(dH-氮杂-CR)；N4-戊氧基羰基-5'-脱氧-5-氟胞苷(卡培他滨)；N4-十八烷基-阿糖胞苷；和反油酸阿糖胞苷，及其衍生物和前药形式。嘌呤核苷类似物包括例如氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨、呋咯地辛、喷司他丁和替扎他滨以及衍生物和前药形式。
核苷类似物的其他前药形式是已知的或可以生成的。例如，其他前药形式包括修饰为改变细胞摄取的特性和/或对通过脱氨酶失活的抗性的那些(下文讨论)。例如，此类前药形式可以允许改善的经口吸收和/或增加的或特异性组织靶向(Li等人(2008)Journal Pharm.Science，97:1109-1134)。
一些核苷类似物的抗肿瘤活性已受限于可以实现的低细胞毒性水平。这在很大程度上是由于在许多组织中可以存在的酶的失活。例如，一些核苷类似物的代谢失活可以通过脱氨基引起。脱氨基可以通过核苷酸特异性脱氨酶例如腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶(cdA)进行催化。因此，一些癌症药物通过生物体的天然存在的酶例如腺苷脱氨酶(ADA，EC 3.5.4.4)和胞苷脱氨酶(CDA，也称为胞嘧啶核苷脱氨酶、胞苷氨基水解酶或EC 3.5.4.5)进行代谢。这些酶作用于分别使人及其他生物体中的天然氨基嘌呤和氨基嘧啶核苷脱氨基。这些酶还将基于活性核苷的癌症药物转换成失活代谢产物。例如，CDA是嘧啶补救途径的组分。它通过水解脱氨基将胞苷和脱氧胞苷分别转换为尿苷和脱氧尿苷(Cacciamani等人(1991)Arch.Biochem.Biophys.290:285-292；Wentworth和Wolfenden(1978)Methods Enzymol.57:401-407；Wisdom和Orsi(1967)Biochem.J.104:7P)。它还使许多合成胞嘧啶类似物脱氨基，所述合成胞嘧啶类似物是临床上有用的药物，例如氮杂-C以及下文讨论的其他(Eliopoulos等人(1998)Cancer Chemother.Pharmacol.42:373-378；Kees等人(1989)Cancer Res.49:3015-3019；Antiviral Chem.Chemother.(1990)1:255-262)。例如，由于通过内源酶脱氧胞苷脱氨酶快速脱氨基为相应的尿嘧啶衍生物(dFdU)，吉西他滨在血浆中的半衰期是大约10分钟(P.G.Johnston等人，Cancer Chromatography and Biological ResponseModifiers，Annual 16，1996，第1章，编辑Pinedo H.M.等人)。
例如，嘌呤核苷药物阿糖腺嘌呤(氟达拉滨，氮杂-A)通过ADA脱氨基；与亲本化合物相比较，其中亲本氨基替换为羟基的所得到的化合物作为抗肿瘤剂是失活的。类似地，药物阿糖胞嘧啶(也称为阿糖胞苷Ara-C(或AraC)；4-氨基-l-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-2(lH)-嘧啶酮；胞嘧啶阿糖核苷；或l-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶)通过CDA代谢降解成失活的阿糖尿嘧啶。吉西他滨、地西他滨、氮杂胞苷及其他也是类似失活的。核苷类似物例如胞嘧啶核苷及其类似物(例如阿糖胞苷和吉西他滨)的脱氨基阻止其充当活性代谢产物的毒性细胞内三磷酸盐衍生物的累积。
胞嘧啶化合物转换为尿苷衍生物通常导致丧失治疗活性或增加副作用。还已显示获得针对胞嘧啶类似物药物的抗性的癌症通常过表达CDA(Leuk.Res.1990，14，751-754)。表达高水平CDA的白血病细胞和实体瘤可以表现对胞嘧啶抗代谢物的抗性，从而限制此类治疗剂的抗肿瘤活性(Biochem.Pharmacol.1993，45:1857-1861)。对核苷类似物的抗性可以需要增加剂量，继续输注或重复施用。这些效应可以导致严重不利作用，尤其涉及骨髓抑制和免疫抑制。
活性氧(ROS)与酶包括核苷脱氨酶失活相关。紫杉烷已知诱导肿瘤内ROS，并且因此可以失活核苷脱氨酶的活性(参见例如Frese等人(2012)Cancer Discovery，2:260-269)。
因此，为了本文目的，用于本文提供的组合和组合物中的示例性核苷类似物是其为脱氨酶的底物的并且从而被失活的那些。例如，脱氨酶可以是胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶。此类类似物的肿瘤内水平和活性在具有聚合物缀合的透明质酸降解酶和紫杉烷制剂的组合疗法中可以得到极大增加。示例性此类核苷类似物包括但不限于氟达拉滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨和氮杂胞苷或其衍生物。在特定例子中，核苷类似物是可以治疗实体瘤例如膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌及其他癌症的核苷类似物。
本文提供的核苷类似物中的任何均可配制为脂质体、微粒、纳米颗粒或聚合物缀合物。例如，制剂可以制备用于控制施用药物的递送和/或增加施用药物的半衰期。例如，示例性脂质体制剂是已知的(参见例如美国专利号5,736,155和8,022,279)。
示例性核苷类似物
i)吉西他滨
吉西他滨(2',2'-二氟脱氧胞苷，dFdC)是脱氧胞苷的二氟化类似物，并且因此是核苷类似物或抗代谢物。在它进入细胞后，通过核苷单磷酸盐和二磷酸盐激酶的细胞内磷酸化分别产生5'-二磷酸盐(dFdCDP)和5'-三磷酸盐(dFdCTP)衍生物。三磷酸吉西他滨充当欺诈碱基，与dCTP竞争掺入DNA。如果掺入DNA内，则在DNA链延长停止前仅可以再掺入一个核苷酸。DNA聚合酶ε因此不能去除吉西他滨核苷酸并且修复增长中的DNA链(掩蔽链终止)。
吉西他滨作为销售，其是冻干粉末制剂。注射用吉西他滨，USP，含有其为2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷单盐酸盐(β-异构体)的吉西他滨HCl。作为含有200mg或1g吉西他滨HCl(作为游离碱表达)的静脉内制剂供应，用甘露醇(分别为200mg或1g)和乙酸钠(分别为12.5mg或62.5mg)配制为无菌冻干粉末。制剂的pH可以通过添加盐酸和/或氢氧化钠进行调整。用于制备其的过程和使用其的方法在美国专利号5,464,826和美国专利号4,808,614中描述。目前被批准用于治疗胰腺癌、乳腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，并且正就卵巢癌进行评估。此外，可以用于治疗HCV以及免疫功能的调节剂(参见美国专利号6,555,518)。可以通过以在30分钟内大约1000-1250mg/m2剂量的静脉内输注进行施用，每周一次直至7周，随后为从治疗的一周休息。
吉西他滨的合成衍生物包括几种前药形式是已知的(参见例如Ishitsuka等人，国际公开号WO03/043631；Alexander等人(2003)J.Med.Chem.，46:4205-4208；美国专利号6,303,569；Guo等人(2001)Cancer Chemother.Pharmacol.,48:169-176；国际公开号WO01/21135；Di Stefano等人(1999)Biochem.Pharmacol.，57:793-799；Guo等人(1999)J.Org.Chem.，64:8319-8322；国际公开号WO99/33483；国际公开号WO98/32762；国际公开号WO98/00173；美国专利号5,606,048；美国专利号5,594,124；欧洲专利申请号EP712860；美国专利号5,521,294；美国专利号5,426,183；美国专利号5,401,838；欧洲专利号EP0376518；欧洲专利申请号EP577303；欧洲专利申请号EP576230；Chou等人(1992)Synthesis，565-570；Richardson等人(1992)Nucleic Acid Res.，20:1763-1768；Baker等人(1991)J.Med.Chem.，34:1879-1884；国际公开号WO91/15498；欧洲专利申请号EP329348；欧洲专利申请号EP272891)。
示例性改善的前药包括但不限于吉西他滨反油酸酯(也称为9(E)-十八碳烯酸2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷-5'-基酯；2'-脱氧-2',2'-二氟-5'-O-[9(E)-十八烯酰]胞苷；CP-4126；或CAS登记号210829-30-4)；壬二酸吉西他滨酯葡甲胺盐(也称为1-[5-O-(9-羧基壬酰基)-β-D-阿拉伯呋喃糖基]胞嘧啶葡甲胺盐)；壬二酸吉西他滨酯的其他盐；和1-[4-(2-丙基胆酰胺)-2-氧代-1H-嘧啶-1-基]-2-脱氧-2,2-二氟-β-D-呋喃核糖(也称为LY-2334737)。例如，CP-4126是吉西他滨的亲脂、不饱和脂肪酸酯衍生物。由于其亲脂性，它显示出增加的细胞摄取和累积，从而导致对活性代谢产物的转换增加。
与其他核苷类似物相比较，吉西他滨及其衍生物或前药显示出特别是针对实体瘤更大的抗肿瘤活性。吉西他滨针对胰腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌以及膀胱癌的抗肿瘤活性已得到证实。
相对亲水的化合物，吉西他滨具有有限的经由被动扩散穿透质膜的能力。因此，需要增加的剂量或输注。吉西他滨施用已与一些副作用相关。维持细胞毒性水平而施用的剂量或更长的输注时间可以与骨髓毒性以及其他不利效应例如升高的肝转氨酶、恶心和呕吐以及皮疹相关。
ii)阿糖胞苷
阿糖胞苷是最初从海绵隐南瓜海绵(Cryptotethya crypta)中分离的核苷类似物。阿糖胞苷磷酸化为氮杂-CTP，其可以与dCTP竞争。氮杂-CTP也可以掺入DNA并且干扰链聚合和DNA修复。阿糖胞苷可以通过胞苷脱氨酶失活。
阿糖胞苷已主要用于血液癌症中。阿糖胞苷的合成衍生物已得到开发并且显示为展示针对实体瘤的功效。这些包括例如吉西他滨(参见上文)。例如，阿糖胞苷的酯衍生物是已知的。示例性此类衍生物是CP-4055，其为阿糖胞苷的5’-反油酸酯(参见例如Breistol等人(1999)Cancer Res.，59:2944)。
由于维持足够水平的细胞毒性效应的问题，施用的剂量或增加的输注时间可以引起副作用例如骨髓抑制及其他特异性组织损伤。
iii)地西他滨
地西他滨(5-氮杂-2′-脱氧胞苷，5-氮杂-CdR)是胞苷的嘧啶核苷类似物。地西他滨最初通过全酰基糖基异氰酸酯的环化进行制备(Pliml和Sorm(1964)Collect.Czech.Chem.Commun.29:2576-2577)。地西他滨的两种异构形式可以被区分。β-异头物是活性形式。地西他滨是以用于注射的无菌冻干粉末形式的商业销售的DACOGENTM产品的活性成分。
在细胞内，地西他滨首先通过脱氧胞苷激酶转换成其活性形式，磷酸化的5-氮杂-脱氧胞苷，所述脱氧胞苷激酶主要在细胞周期的S期过程中合成。地西他滨对于脱氧胞苷激酶的催化位点的亲和力类似于天然底物，脱氧胞苷(Momparler等人(1985)Pharmacol Ther 30:287-299)。在通过脱氧胞苷激酶转换为其活性三磷酸盐形式后，地西他滨以类似于天然底物dCTP那种的速率掺入正在复制的DNA(Bouchard和Momparler(1983)Mol.Pharmacol.24:109-114)。
地西他滨的功能之一是其特异性并有力抑制DNA甲基化的能力。胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶在DNA水平上发生。地西他滨掺入DNA链内具有低甲基化效应。每类分化细胞具有其自身独特的甲基化模式。在染色体复制后，为了转换这种甲基化模式，在亲本链上的5-甲基胞嘧啶用于指导互补子代DNA链上的甲基化。用在胞嘧啶5位置处的碳替代氮干扰DNA甲基化的这个正常过程。在甲基化的特异性位点处5-甲基胞嘧啶替换为地西他滨产生DNA甲基转移酶的不可逆失活，可能是由于在酶和地西他滨之间形成共价键(Juttermann等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11797-11801)。通过特异性抑制DNA甲基转移酶，甲基化所需的酶，可以阻止肿瘤抑制基因的异常甲基化。
制备地西他滨且特别是β-异头物的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号3,350,388；美国专利号3,817,980；美国专利号4,209,613；美国公开申请号US20120046457；国际申请公开号WO2008/101448；Winkley等人(1970)J Org Chem，35:491-495；Piskala等人(1978)Nucleic Acids Research，1:s109-s114；Ben-Hattar等人(1986)J Org Chem，51:3211-3213.)。地西他滨可以通过本领域已知的标准方法进行配制。制剂可以是液体或冻干制剂。例如，地西他滨通常作为用于注射的无菌冻干粉末，连同缓冲盐例如磷酸二氢钾和pH改性剂例如氢氧化钠一起供应。例如，地西他滨由SuperGen，Inc.作为在20mL玻璃小瓶中包装的冻干粉末供应，所述玻璃小瓶含有50mg地西他滨、单碱式磷酸二氢钾和氢氧化钠。当用10mL无菌注射用水重构时，每mL含有5mg地西他滨、6.8mg KH2PO4和大约1.1mg NaOH。所得到的溶液的pH是6.5-7.5。重构的溶液可以在冷输注流体(即0.9％氯化钠；或5％右旋糖；或5％葡萄糖；或乳酸林格液)中进一步稀释至1.0或0.1mg/mL的浓度。未打开的小瓶通常在原始包装中冷藏(2-8℃；36-46°F.)贮存。液体制剂也是已知的(参见例如美国专利号6,982,253)。
由于地西他滨通过胞苷脱氨酶催化脱氨基为5-氮杂-2'-脱氧尿苷，地西他滨在体内显示出短半衰期(Chabot等人(1983)Biochemical Pharmacology22:1327-1328)。与关于天然底物脱氧胞苷的Km 12μM相比较，估计的地西他滨Km对于从人肝脏中纯化的酶为250μM。脱氧胞苷的脱氨基速率是相同浓度的地西他滨通过胞苷脱氨酶的约6倍。由于短半衰期，地西他滨最通常通过注射，例如通过弹丸I.V.注射，连续I.V.输注或I.V.输注施用于患者。
I.V.输注的长度可以受限于地西他滨在水溶液中的分解。存在在水溶液中更稳定的地西他滨衍生物(参见例如美国专利号7,250,416)。
iv)氮杂胞苷
5-氮杂胞苷(国家服务中心命名(National Service Center designation)NSC-102816；CAS登记号320-67-2)也称为阿扎胞苷、AZA或4-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-1,3,5-三嗪-2(IH)-酮，是地西他滨的类似物(参见例如Hanna等人(1998)Collect.Czech.Chem.Commun.，63:222-230)。它目前作为药品销售。氮杂胞苷是核苷类似物，更具体而言是胞苷类似物。它是其天然核苷的拮抗剂。例如，在氮杂胞嘧啶和胞嘧啶之间的唯一结构差异是与胞嘧啶在该位置处的碳相比较，在氮杂胞嘧啶中的胞嘧啶环的位置5处的氮原子的存在。
制备氮杂胞苷的方法且特别是避免使用水的方法是本领域已知的(美国专利号3,350,388；美国专利号8,058,424；Winkley和Robins(1970)J.Org.Chem.，35:491；Piskala和Sorm(1978)Nucl.Acid.Chem.，1:435；和Vorbrueggen等人(1981)Chemische Berichte，114:1234-1255。
氮杂胞苷是胞苷脱氨酶的底物(参见例如Voytek等人(1977)CancerRes.，37:1956-61)。为了在体内显示出细胞毒性效应，需要高浓度或连续输注。副作用尤其包括降低的白细胞和红细胞以及血小板计数、恶心、呕吐、疲乏、腹泻。
D.产生透明质酸降解酶的核酸和编码多肽的方法
本文所示的透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶的多肽可以通过本领域众所周知的用于蛋白质纯化和重组蛋白质表达的方法获得。可以使用本领域技术人员已知的用于鉴定编码所需基因的核酸的任何方法。本领域可获得的任何方法都可以用于例如从细胞或组织来源获得编码透明质酸酶的全长(即包含整个编码区)cDNA或基因组DNA克隆。经修饰的或变体可溶性透明质酸酶可以例如通过定点诱变由野生型多肽进行改造。
多肽可以使用本领域已知的用于克隆和分离核酸分子的任何可用方法进行克隆或分离。此类方法包括核酸的PCR扩增和文库筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。
用于核酸扩增的方法可以用于分离编码所需多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含核酸材料可以用作所需多肽编码核酸分子可以由其分离的初始材料。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、流体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品可以用于扩增方法中。核酸文库也可以用作初始材料来源。引物可以设计为扩增所需多肽。例如，引物可以基于由其生成所需多肽的表达序列进行设计。引物可以基于多肽氨基酸序列的回译进行设计。通过扩增生成的核酸分子可以进行测序，证实编码所需多肽。
另外的核苷酸序列可以连接至多肽编码核酸分子，包括含有用于将合成基因克隆到载体的限制性核酸内切酶位点的接头序列，例如蛋白质表达载体或设计用于扩增核心蛋白质编码DNA序列的载体。此外，指定功能DNA元件的另外核苷酸序列可以可操作地连接至多肽编码核酸分子。此类序列的例子包括但不限于设计为促进细胞内蛋白质表达的启动子序列、和设计为促进蛋白质分泌的分泌序列例如异源信号序列。此类序列是本领域技术人员已知的。另外的核苷酸残基序列例如指定蛋白质结合区的碱基序列也可以连接至酶编码核酸分子。此类区域包括但不限于促进或编码蛋白质的残基序列，所述蛋白质促进酶摄取到特定靶细胞内，或另外改变合成基因产物的药物代谢动力学。例如，酶可以连接至PEG部分。
此外，可以加入标签或其他部分，例如以帮助多肽的检测或亲和纯化。例如，另外的核苷酸残基序列例如指定表位标签或其他可检测标记的碱基序列也可以连接至酶编码核酸分子。示例性此类序列包括编码His标签(例如，6xHis，HHHHHH；SEQ ID NO:54)或Flag标签(DYKDDDDK；SEQ IDNO:55)的核酸序列。
随后将鉴定且分离的核酸插入合适的克隆载体。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能载体包括但不限于质粒或经修饰的病毒，但载体系统必须与使用的宿主细胞相容。此类载体包括但不限于细菌噬菌体例如λ衍生物，或质粒例如pCMV4、pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。其他表达载体包括本文例示的HZ24表达载体。插入克隆载体可以例如通过将DNA片段连接到克隆载体完成，所述克隆载体具有互补粘性末端。插入可以使用TOPO克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)实现。如果用于片段化DNA的互补限制位点不存在于克隆载体中，则DNA分子的末端可以进行酶促修饰。可替代地，任何所需位点都可以通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端上产生；这些连接的接头可以含有编码限制性核酸内切酶识别序列的特定化学合成的寡核苷酸。在可替代方法中，切割的载体和蛋白质基因可以通过同聚物加尾进行修饰。重组分子可以经由例如转化、转染、感染、电穿孔和声孔效应引入宿主细胞内，从而生成基因序列的多个拷贝。
在特定实施方案中，用重组DNA分子转化宿主细胞使得能够产生基因的多个拷贝，所述重组DNA分子掺入分离的蛋白质基因、cDNA或合成的DNA序列。因此，基因可以通过下述大量获得：生长转化体，从转化体中分离重组DNA分子，和需要时，从分离的重组DNA中取回插入的基因。
1.载体和细胞
对于一种或多种所需蛋白质例如本文描述的任何透明质酸降解酶的重组表达，可以将含有编码蛋白质的全部或部分核苷酸序列的核酸插入合适的表达载体内，即，含有用于插入的蛋白质编码序列的转录和翻译必需的元件的载体。必需转录和翻译信号也可以通过用于酶基因和/或其侧翼区的天然启动子供应。
还提供的是含有编码酶的核酸的载体。还提供了含有载体的细胞。细胞包括真核和原核细胞，并且载体是适合于在其中使用的任何。
提供了含有载体的原核和真核细胞包括内皮细胞。此类细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌(Archea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过在编码的蛋白质由细胞表达的条件下生长上述细胞，且回收表达的蛋白质，细胞用于产生其蛋白质。为了本文目的，例如，酶可以分泌到培养基内。
提供的是含有核苷酸序列以及其多个拷贝的载体，所述核苷酸序列编码与天然或异源信号序列偶联的透明质酸降解酶多肽，在一些例子中是可溶性透明质酸酶多肽。载体可以就酶蛋白质在细胞中的表达进行选择，或从而使得酶蛋白质作为分泌蛋白质表达。
多种宿主-载体系统可以用于表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于由病毒(例如痘病毒、腺病毒及其他病毒)感染的哺乳动物细胞系统；由病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物例如含酵母载体的酵母；或由细菌噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在其强度和特异性方面不同。取决于使用的宿主-载体系统，可以使用多种合适的转录和翻译元件中的任何一种。
本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体内的任何方法都可以用于构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(基因重组)。编码蛋白质、或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸序列的表达可以通过第二种核酸序列进行调节，从而使得基因或其片段在用一种或多种重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以受本领域已知的任何启动子/增强子控制。在特定实施方案中，启动子对于所需蛋白质的基因不是天然的。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist和Chambon，Nature 290:304-310(1981))、在劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等人Cell 22:787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441-1445(1981)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，Nature296:39-42(1982))；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Jay等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5543)或tac启动子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983)；还参见“Useful Proteins from RecombinantBacteria”：in Scientific American 242:79-94(1980)；含有胭脂碱合成酶启动子(Herrera-Estrella等人，Nature 303:209-213(1983))或花椰菜花叶病毒35SRNA启动子(Gardner等人，Nucleic Acids Res.9:2871(1981))、和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶(Herrera-Estrella等人，Nature 310:115-120(1984))的启动子的植物表达载体；来自酵母和及其他真菌的启动子元件，例如Gal4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子，和显示出组织特异性且已用于转基因动物中的下述动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中是活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，Cell 38:639-646(1984)；Ornitz等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonald，Hepatology 7:425-515(1987))；在胰腺β细胞中是活性的胰岛素基因控制区(Hanahan等人，Nature 315:115-122(1985))，在淋巴样细胞中是活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，Cell 38:647-658(1984)；Adams等人，Nature 318:533-538(1985)；Alexander等人，Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987))，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中是活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等人，Cell 45:485-495(1986))，在肝中是活性的白蛋白基因控制区(Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer等人，Science 235:53-58 1987))，在肝中是活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer等人，Science235:53-58 1987))，在肝中是活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，Genes and Devel.1:161-171(1987))，在髓样细胞中是活性的β珠蛋白基因控制区(Magram等人，Nature 315:338-340(1985)；Kollias等人，Cell 46:89-94(1986))，在脑的少突胶质细胞中是活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等人，Cell 48:703-712(1987))，在骨骼肌中是活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，Nature 314:283-286(1985))，和在下丘脑的促性腺细胞中是活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人，Science 234:1372-1378(1986))。
在特定实施方案中，使用这样的载体，其含有可操作地连接至编码核酸(所述核酸编码所需蛋白质、或其结构域、片段、衍生物或同源物)的启动子、一或多个复制起点和任选地含有一或多个可选择标记(例如抗生素抗性基因)。用于转化大肠杆菌细胞的示例性质粒载体包括例如pQE表达载体(可得自Qiagen，Valencia，CA；还参见由Qiagen公开的描述该系统的文献)。pQE载体具有提供重组蛋白质在大肠杆菌中的紧密调节的高水平表达的噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)和双重lac操纵基因阻遏模块、用于有效翻译的合成核糖体结合位点(RBS II)、6XHis标签编码序列、t0和T1转录终止子、ColE1复制起点、和用于赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。pQE载体使6xHis标签能够置于重组蛋白质的N或C末端处。此类质粒包括pQE 32、pQE 30和pQE 31，其提供用于所有三个读框的多克隆位点且提供N末端加上6xHis标签的蛋白质的表达。用于转化大肠杆菌细胞的其他示例性质粒载体包括例如pET表达载体(参见美国专利4,952,496；可得自Novagen，Madison，WI；还参见由Novagen公开的描述该系统的文献)。此类质粒包括pET 11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、诱导型大肠杆菌lac操纵基因和lac阻遏基因；pET 12a-c，其含有T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b(Novagen，Madison，WI)，其含有在用His柱纯化中使用的His-TagTM前导序列和在经过柱纯化后允许切割的凝血酶切割位点、T7-lac启动子区和T7终止子。
用于哺乳动物细胞表达的示例性载体是HZ24表达载体。HZ24表达载体衍生自pCI载体主链(Promega)。它含有编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、F1复制起点、巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区(CMV)和SV40晚期多腺苷酸化信号(SV40)。表达载体还具有来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
2.表达
透明质酸降解酶多肽包括可溶性透明质酸酶多肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法(包括体内和体外方法)产生。所需蛋白质可以在适合于产生例如施用和治疗所需的蛋白质的所需量和形式的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体例如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞包括人细胞系和转基因动物。表达宿主可以在其蛋白质生产水平以及在表达蛋白质上存在的翻译后修饰类型方面不同。可以基于这些及其他因素例如管理和安全考虑、生产成本以及纯化需要和方法，作出表达宿主的选择。
许多表达载体是可获得的且是本领域技术人员已知的，并且可以用于蛋白质表达。表达载体的选择将受选择的宿主表达系统影响。一般而言，表达载体可以包括转录启动子和任选地包括增强子、翻译信号、以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体一般具有允许选择和维持转化细胞的可选择标记。在一些情况下，复制起点可以用于扩增载体拷贝数。
透明质酸降解酶多肽例如可溶性透明质酸酶多肽还可作为蛋白质融合物使用或表达。例如，可生成酶融合物，以对酶添加另外功能性。酶融合蛋白的例子包括但不限于信号序列、例如用于定位的标签如his6标签或myc标签、或用于纯化的标签例如GST融合物、和用于指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合物。
a.原核细胞
原核生物尤其是大肠杆菌提供了用于生产大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员众所周知的简单快速技术。用于大肠杆菌的表达载体可以含有诱导型启动子，此类启动子用于诱导高水平的蛋白质表达和用于表达对宿主细胞显示出一些毒性的蛋白质。诱导型启动子的例子包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子和温度调节型λPL启动子。
蛋白质例如本文提供的任何都可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是还原环境，并且对于一些分子，这可以导致不溶性包含体的形成。还原剂例如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇和变性剂例如HCl胍和尿素可以用于再溶解蛋白质。可替代方法是在细菌的周质空间中表达蛋白质，所述周质空间提供氧化环境和伴侣蛋白样和二硫键异构酶并且可以导致可溶蛋白质的产生。一般地，前导序列融合至待表达的蛋白质，这将蛋白质导向周质。前导区随后通过周质内的信号肽酶去除。周质靶向前导序列的例子包括来自果胶酸裂解酶基因的pelB前导区和衍生自碱性磷酸酶基因的前导区。在一些情况下，周质表达允许表达蛋白质渗漏到培养基内。蛋白质的分泌允许自培养上清液快速简单纯化。不分泌的蛋白质可以通过渗透性裂解得自周质。类似于细胞质表达，在一些情况下，蛋白质可以变得不可溶，并且变性剂和还原剂可以用于促进增溶和重折叠。诱导和生长的温度还可以影响表达水平和溶解度，一般使用25℃-37℃的温度。一般地，细菌产生去糖基化蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化用于功能，则糖基化可以在由宿主细胞纯化后在体外添加。
b.酵母细胞
酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是众所周知的酵母表达宿主，可以用于生产蛋白质例如本文描述的任何。酵母可以用附加型复制载体或通过经由同源重组的稳定染色体整合进行转化。一般地，诱导型启动子用于调节基因表达。此类启动子的例子包括GAL1、GAL7和GAL5，和金属硫蛋白启动子例如CUP1、AOX1或其他毕赤酵母属或其他酵母启动子。表达载体通常包括用于选择和维持转化DNA的可选择标记，例如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。在酵母中表达的蛋白质通常是可溶的。与伴侣蛋白例如Bip和蛋白质二硫化物异构酶的共表达可以改善表达水平和溶解度。另外，使用分泌信号肽融合物，例如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号、和与酵母细胞表面蛋白质例如Aga2p交配粘着受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合物，可以指导在酵母中表达的蛋白质用于分泌。蛋白酶切割位点例如Kex-2蛋白酶的可以进行改造，以在表达多肽离开分泌途径时，去除来自其的融合序列。酵母还能够在Asn-X-Ser/Thr基序处糖基化。
c.昆虫细胞
特别使用杆状病毒表达的昆虫细胞用于表达多肽例如透明质酸酶多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白质且能够具有由高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，其改善真核表达的安全且减少管理关注。一般的表达载体使用启动子例如杆状病毒的多角体蛋白启动子用于高水平表达。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)和昆虫细胞系例如衍生自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf9、粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和大斑蝶(Danausplexippus)(DpN1)。对于高水平表达，待表达分子的核苷酸序列立即融合至病毒的多角体蛋白起始密码子的下游。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确地加工并且可以用于将表达的蛋白质分泌到培养基内。此外，细胞系粘虫(A7S)和大斑蝶(DpN1)产生具有类似于哺乳动物细胞系统的糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中的可替代表达系统是稳定转化细胞的使用。细胞系例如Schneider 2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))和C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可以用于表达。果蝇属(Drosophila)金属硫蛋白启动子可以在用镉或铜的重金属诱导的存在下用于诱导高水平表达。表达载体一般通过使用可选择标记例如新霉素和潮霉素进行维持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可以用于表达蛋白质包括透明质酸降解酶多肽例如可溶性透明质酸酶多肽。通过病毒感染例如腺病毒或通过直接DNA转移例如脂质体、磷酸钙、DEAE-右旋糖酐和通过物理方法例如电穿孔和显微注射，可以将表达构建体转移到哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞的表达载体一般包括mRNA加帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多腺苷酸化元件。还可以加入IRES元件，以允许与另一种基因例如可选择标记的双顺反子表达。此类载体通常包括转录启动子-增强子用于高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自下述基因的那些：弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳房肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素基因控制。可选择标记可以用于选择且维持具有表达构建体的细胞。可选择标记基因的例子包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，表达可以在氨甲蝶呤的存在下进行，以仅选择表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号传导分子例如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导蛋白质以活性状态在细胞表面上表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌性)及其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异源杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和HKB细胞。适合于无血清培养基的细胞系也是可获得的，所述无血清培养基促进从细胞培养基中纯化分泌的蛋白质。例子包括CHO-S细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，目录#11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Pham等人，(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-342.)。适合于在对于最大表达最佳化的专门培养基中生长的细胞系也是可获得的。例如，DG44CHO细胞适合于在化学成分限定的无动物产品培养基中的悬浮培养中生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可以用于表达蛋白质例如本文描述的任何。一般使用直接DNA转移例如微粒轰击和PEG介导的转移到原生质体内和使用土壤杆菌介导的转化，将表达构建体转移到植物。表达载体可以包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶植物宿主例如拟南芥属(Arabidopsis)和烟草与单子叶植物宿主例如玉米和稻之间分开。用于表达的植物启动子的例子包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子和遍在蛋白和UBQ3启动子。可选择标记例如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进转化细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以在培养中维持为细胞，聚集(愈伤组织)或再生成全植物。转基因植物细胞也可以包括改造为产生透明质酸酶多肽的藻类。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，所以这可以影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
3.纯化技术
用于从宿主细胞中纯化多肽包括透明质酸降解酶多肽(例如可溶性透明质酸酶多肽)或其他蛋白质的方法将取决于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质一般在去除细胞后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以将细胞裂解，并且从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体例如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可以用作初始材料以制备裂解的细胞提取物。另外，转基因动物生产可以包括在可以收集的乳或蛋中生产多肽，并且需要时，可以使用本领域的标准方法提取蛋白质且进一步纯化。
蛋白质例如可溶性透明质酸酶多肽可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术进行纯化，所述纯化技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级和尺寸排阻色谱法、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法例如阴离子交换色谱法。亲和纯化技术也可以用于改善制剂的效率和纯度。例如，结合透明质酸酶的抗体、受体及其他分子可以用于亲和纯化中。表达构建体还可以进行改造以将亲和标签例如myc表位、GST融合物或His6加入蛋白质中并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和纯化。纯度可以通过本领域已知的任何方法进行评估，所述方法包括凝胶电泳以及染色和分光光度计测量技术。如本文提供的纯化的rHuPH20组合物通常具有至少70,000-100,000单位/mg，例如约120,000单位/mg的比活性。比活性可以在例如用聚合物修饰后改变。
4.透明质酸降解酶多肽的聚乙二醇化
聚乙二醇(PEG)已广泛用于生物材料、生物技术和医学中，主要是因为PEG是通常为非免疫原性的生物相容的、无毒、水溶性聚合物(Zhao和Harris，ACS Symposium Series 680:458-72，1997)。在药物递送领域中，PEG衍生物已广泛用于共价附着(即“聚乙二醇化”)至蛋白质以减少免疫原性、蛋白酶解和肾清除并增强可溶性(Zalipsky，Adv.Drug Del.Rev.16:157-82，1995)。类似地，PEG已附着至低分子量、相对疏水的药物以增强可溶性，减少毒性并改变生物分布。通常，聚乙二醇化的药物作为溶液注射。
紧密相关的应用是用于药物递送的交联可降解PEG网络或制剂的合成，因为在可降解的可溶性药学载体设计中使用的许多相同化学也可以用于设计可降解的凝胶(Sawhney等人，Macromolecules 26:581-87，1993)。还已知大分子间复合物可以通过混合两种互补聚合物的溶液形成。此类复合物一般通过涉及的聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子-聚阳离子)和/或氢键(聚酸-聚碱)，和/或通过水性环境中的聚合物之间的疏水相互作用(Krupers等人，Eur.Polym J.32:785-790，1996)得到稳定。例如，在适当条件下混合聚丙烯酸(PAAc)和聚氧化乙烯(PEO)溶液导致形成主要基于氢键合的复合物。这些复合物在生理条件下的解离已用于递送游离药物(即，非聚乙二醇化的)。此外，互补聚合物的复合物已由均聚物和共聚物形成。
用于聚乙二醇化的众多试剂已在本领域中描述。此类试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活化PEG、琥珀酰亚胺基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚胺基α-丁酸甲酯、mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚胺酯、同双功能PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、同双功能PEG丙醛、同双功能PEG丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、对硝基苯基碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支链mPEG2丁醛、mPEG乙酰基、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG“无接头”马来酰亚胺、mPEG乙烯基砜、mPEG硫醇、mPEG邻吡啶基硫酯、mPEG邻二硫吡啶、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯基砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS、和生物素PEG-NHS(参见例如Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6:62-69，1995；Veronese等人，J.Bioactive CompatiblePolymers 12:197-207，1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324，844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795，569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990，237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US 2004/0235734；WO0500360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO 01076640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；和WO 0187925)。
在一个例子中，聚乙二醇具有范围为约3kD-约50kD，且通常为约5kD-约30kD的分子量。PEG与药物的共价附着(称为“聚乙二醇化”)可以通过已知化学合成技术实现。例如，蛋白质的聚乙二醇化可以通过在适当的反应条件下使NHS活化的PEG与蛋白质反应来实现。
虽然对于聚乙二醇化已描述了众多反应，但最一般可应用的这些反应赋予方向性，利用温和的反应条件，并且不需要广泛下游加工以去除毒性催化剂或副产物。例如，单甲氧基PEG(mPEG)仅具有一个反应末端羟基，因此它的使用限制所得到的PEG-蛋白质产物混合物的一些异质性。一般需要活化在与末端甲氧基相对的聚合物末端处的羟基来实现有效蛋白质聚乙二醇化，目的是使得衍生的PEG对亲核攻击更敏感。攻击亲核体通常是赖氨酰残基的ε-氨基，但如果局部条件是有利的，则其他胺也可以反应(例如组氨酸的N末端α-胺或环胺)。在含有单个赖氨酸或半胱氨酸的蛋白质中，更直接的附着是可能的。后面一种残基可以通过PEG-马来酰亚胺靶向用于硫醇特异性修饰。可替代地，PEG酰肼可以与高碘酸盐氧化的透明质酸降解酶反应，并且在NaCNBH3的存在下还原。更具体而言，聚乙二醇化的CMP糖可以在适当的糖基转移酶的存在下与透明质酸降解酶反应。一种技术是“聚乙二醇化”技术，其中许多聚合物分子与所讨论的多肽偶联。当使用这种技术时，免疫系统具有识别多肽表面上负责抗体形成的表位的困难，从而减少免疫应答。对于直接引入人体的循环系统内以获得特定生理效应的多肽(即药剂)，通常的潜在免疫应答是IgG和/或IgM应答，而通过呼吸系统吸入的多肽(即工业多肽)潜在地可以引起IgE应答(即变应性应答)。解释免疫应答减少的理论之一是聚合物分子屏蔽多肽表面上负责免疫应答导致抗体形成的表位。另一种理论或至少部分因素是缀合物越重，获得越多的免疫应答减少。
通常，为了制备本文提供的聚乙二醇化的透明质酸降解酶，包括聚乙二醇化的透明质酸酶，PEG部分经由共价附着与多肽缀合。用于聚乙二醇化的技术包括但不限于专门接头和偶联化学(参见例如Roberts等人，Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476，2002)、多个PEG部分与单个缀合位点的附着(例如经由支链PEG的使用；参见例如Guiotto等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180，2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见例如Chapman等人，Nature Biotech.17:780-783，1999)、和定点酶促聚乙二醇化(参见例如Sato，Adv.Drug Deliv.Rev.，54:487-504，2002)。本领域描述的方法和技术可以产生具有附着至单个蛋白质分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个PEG或PEG衍生物的蛋白质(参见例如U.S.2006/0104968)。
作为用于制备聚乙二醇化的透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶的示例性方法的聚乙二醇化的示例性举例说明，PEG醛、琥珀酰亚胺和碳酸酯已各自应用于使PEG部分通常为琥珀酰亚胺PEG与rHuPH20缀合。例如，rHuPH20已由示例性琥珀酰亚胺单PEG(mPEG)试剂缀合，所述琥珀酰亚胺单PEG试剂包括mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)以及(用于附着“分支”PEG)mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺。这些聚乙二醇化的琥珀酰亚胺酯在PEG基团和活化的交联剂以及单一或分支PEG基团之间含有不同长度的碳主链。这些差异可以例如用于提供不同反应动力学和潜在限制在缀合过程期间可用于PEG与rHuPH20附着的位点。
包含线性或分支PEG的琥珀酰亚胺PEG(如上)可以与rHuPH20缀合。PEG可以用于生成重现性含有分子的rHuPH20，平均起来具有约三至六个或三至六个PEG分子/透明质酸酶。此类聚乙二醇化的rHuPH20组合物可以容易地纯化以获得具有大约25,000-30,000单位/mg蛋白质透明质酸酶活性的比活性，并且基本上不含非聚乙二醇化的rHuPH20(小于5％非聚乙二醇化的)。
使用多种PEG试剂，例如使用mPEG-SBA(30kD)、mPEG-SMB(30kD)以及基于mPEG2-NHS(40kD)和mPEG2-NHS(60kD)的分支形式，可以制备示例性形式的透明质酸降解酶，特别是可溶性人重组透明质酸酶(例如rHuPH20)。聚乙二醇化形式的rHuPH20已使用NHS化学以及碳酸酯和醛生成，使用下述试剂中的每一种：分支的mPEG2-NHS-40K，分支的mPEG-NHS-10K，分支的mPEG-NHS-20K，分支的mPEG2-NHS-60K；mPEG-SBA-5K，mPEG-SBA-20K，mPEG-SBA-30K；mPEG-SMB-20K，mPEG-SMB-30K；mPEG-丁醛；mPEG-SPA-20K，mPEG-SPA-30K；和PEG-NHS-5K-生物素。聚乙二醇化的透明质酸酶也已使用可得自Dowpharma(Dow Chemical Corporation的部门)的PEG试剂进行制备；包括用Dowpharma的对硝基苯基碳酸酯PEG(30kDa)和丙醛PEG(30kDa)聚乙二醇化的透明质酸酶。
在一个例子中，聚乙二醇化包括mPEG-SBA例如mPEG-SBA-30K(具有约30kDa的分子量)或PEG丁酸衍生物的另一种琥珀酰亚胺酯与可溶性透明质酸酶的缀合。PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚胺酯例如mPEG-SBA-30K容易与蛋白质的氨基偶联。例如，m-PEG-SBA-30K和rHuPH20(其大小为大约60KDa)的共价缀合提供在rHuPH20和mPEG之间的稳定酰胺键，如下文方案1中所示。
通常，以10:1的PEG:多肽摩尔比将mPEG-SBA-30K或其他PEG加入在合适缓冲液(例如以pH 6.8的130mM NaCl/10mM HEPES或70mM磷酸盐缓冲液，pH 7)中的透明质酸降解酶，在一些情况下是透明质酸酶，随后灭菌例如无菌过滤，以及例如伴随在4℃下在冷室中搅拌过夜的连续缀合。在一个例子中，缀合的PEG-透明质酸降解酶是浓缩和缓冲液交换的。
偶联PEG丁酸衍生物的琥珀酰亚胺酯例如mPEG-SBA-30K的其他方法是本领域已知的(参见例如U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；和U.S.2004/0235734)。例如，通过在硼酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)中在4℃下反应一小时，多肽例如透明质酸降解酶(例如透明质酸酶)可以与NHS活化的PEG衍生物偶联。所得到的聚乙二醇化的蛋白质可以通过超滤进行纯化。可替代地，可以通过在4℃下在含有0.2M磷酸钠和0.5M NaCl的缓冲液中(pH 7.5)混合磷酸酶与mPEG-SBA共30分钟来实现牛碱性磷酸酶的聚乙二醇化。未反应的PEG可以通过超滤去除。另一种方法使多肽与mPEG-SBA在去离子水中反应，向所述去离子水中加入三乙胺以将pH升高至7.2-9。将所得到的混合物在室温下搅拌几小时以完成聚乙二醇化。
用于透明质酸降解酶多肽包括例如动物衍生的透明质酸酶和细菌透明质酸降解酶的聚乙二醇化的方法是本领域技术人员已知的。参见例如欧洲专利号EP 0400472，其描述了牛睾丸透明质酸酶和软骨素ABC裂解酶的聚乙二醇化。此外，美国公开号2006014968描述了衍生自人PH20的人透明质酸酶的聚乙二醇化。例如，聚乙二醇化的透明质酸降解酶一般含有至少3个PEG部分/分子。例如，透明质酸降解酶可以具有在5:1-9:1之间例如7:1的PEG与蛋白质摩尔比。
E.药物组合物和制剂
本文提供的是抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷制剂的组合物或组合。例如，本文提供的是聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷制剂的组合物或组合。紫杉烷制剂可以与含有抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶的组合物共配制或共施用。例如，此类组合和组合物可以用于治疗如本文描述的癌症包括实体瘤。在一些例子中，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶可以作为分开施用的分开组合物的组合提供。在其他例子中，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和紫杉烷在相同组合物中提供并且可以一起施用。组合物或组合物的组合可以配制用于肠胃外递送(即用于全身递送)。例如，组合物或组合物的组合配制用于皮下递送或静脉内递送。
本文还提供的是含有第三种试剂的组合和组合物，所述第三种试剂是用于治疗癌症的进一步化疗剂，例如核苷类似物或其他抗代谢物(例如吉西他滨或衍生物或其他核苷类似物)。示例性此类试剂在上文和本文其他地方描述。进一步的化疗剂例如核苷类似物可以与含有抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶的组合物，和/或含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物共配制或共施用。例如，进一步的化疗剂例如核苷类似物可以作为与抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和紫杉烷的组合或组合物分开的组合物提供。在其他例子中，核苷类似物与抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和紫杉烷之一或两者共配制。例如，核苷类似物与抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶共配制，并且肿瘤靶向紫杉烷作为分开组合物提供。在另一个例子中，核苷类似物与肿瘤靶向紫杉烷共配制，并且抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶作为分开组合物提供。作为进一步例子，核苷类似物、抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷在相同组合物中一起共配制。组合物或组合物的组合可以配制用于肠胃外递送(即用于全身递送)。例如，组合物或组合物的组合配制用于皮下递送或静脉内递送。
组合物可以配制用于单一剂量施用或多重剂量施用。试剂可以配制用于直接施用。组合物可以作为液体或冻干制剂提供。
化合物可以配制成合适的药物制剂例如溶液、悬浮液、片剂、分散片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂或酏剂、用于经口施用、以及经皮贴剂制剂和干粉吸入器。通常，使用本领域众所周知的技术和操作(参见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第四版，1985，126)，将化合物配制成药物组合物。一般地，配制方法是施用途径的函数。组合物可以共配制或作为分开组合物提供。
一般地，组合物以冻干或液体形式配制。当组合物以冻干形式提供时，它们可以就在使用前通过适当缓冲液例如无菌盐水溶液重构。组合物可以一起或分开提供。为了本文目的，此类组合物一般分开提供。抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶、肿瘤靶向紫杉烷和/或进一步的化疗剂可以作为分开组合物包装用于一起、顺次或间歇地施用。组合可以包装为试剂盒。
组合物可以配制用于通过本领域技术人员已知的任何途径施用，所述途径包括肌内、静脉内、真皮内、病灶内、腹膜内注射、皮下、肿瘤内、硬膜外、鼻、经口、阴道、直肠、表面、局部、耳、吸入、颊(例如舌下)和经皮施用或任何途径。还考虑了其他施用方式。施用可以是局部、表面或全身的，取决于治疗部位。局部施用于需要治疗的区域可以通过例如但不限于下述来实现：在手术过程中的局部输注、例如与在手术后的伤口敷料结合的表面施加、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于埋植剂。组合物还可以与其他生物学活性剂顺次、间歇地或在相同组合物中施用。施用还可以包括控制释放系统，包括控制释放制剂和控制释放装置，例如借助于泵。
在任何给定情况下的最合适途径取决于多种因素，例如疾病的性质、疾病的进程、疾病的严重性和使用的特定组合物。为了本文目的，希望抗透明质酸剂通常为透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶、肿瘤靶向紫杉烷和/或进一步的化疗剂这样施用，使得药学可获得的量或水平存在于血浆中。例如，组合物例如经由静脉内施用而全身施用。还可以采用皮下方法，尽管可能需要增加的吸收时间以确保与静脉内方法等价的生物利用度。试剂例如透明质酸降解酶、肿瘤靶向紫杉烷和/或进一步的化疗剂(例如核苷类似物)可以通过不同施用途径进行施用。药物组合物可以以适合于每种施用途径的剂型配制。
施用方法可以用于降低透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶及其他分子对降解过程例如蛋白酶解降解以及经由抗原性和免疫原性应答的免疫干预的暴露。此类方法的例子包括抗透明质酸剂在治疗部位处的局部施用或连续输注。
1.制剂
药学可接受的组合物考虑到管理机构或其他机构的批准制备，依照用于动物和人中的一般公认的药典制备。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末和持续释放制剂的形式。组合物可以配制为栓剂，具有常规粘合剂和载体例如甘油三酯。经口制剂可以包括标准载体例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁及其他此类试剂。制剂应适合施用方式。
药物组合物可以包括酶或活化剂与之一起施用的载体例如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适药学载体的例子通过E.W.Martin在"Remington'sPharmaceutical Sciences"中描述。此类组合物将含有一般纯化形式的治疗有效量的化合物连同合适量的载体，以便对患者提供适当施用的形式。此类药学载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当药物组合物静脉内施用时，水是通常载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别用于可注射溶液。组合物可以含有下述活性成分：稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；以及粘合剂例如淀粉、天然树胶例如阿拉伯树胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和本领域技术人员已知的其他此类粘合剂。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。需要时，组合物还可以含有少量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺、及其他此类试剂。
在一个例子中，药物组合物可以采取液体形式例如溶液、糖浆剂或悬浮液。此类液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂进行制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、油酯或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。在另一个例子中，药物组合物可以以冻干形式呈现用于在使用前用水或其他合适媒介物重构。
药学和治疗上活性的化合物及其衍生物通常以单位剂型或多重剂型配制并施用。每个剂量单位含有与所需药学载体、媒介物或稀释剂结合，足以产生所需疗效的预定数量的治疗活性化合物。单位剂型包括但不限于片剂、胶囊、丸剂、粉末、粒剂、无菌肠胃外溶液或悬浮液、和经口溶液或悬浮液、和含有合适数量的化合物或其药学可接受的衍生物的油水乳状液。单位剂量形式可以含有安瓿和注射器或个别包装的片剂或胶囊。单位剂量形式可以以其部分或多倍施用。多重剂量形式是在单一容器中包装的多个相同单位剂型或以隔离的单位剂量形式施用。多重剂量形式的例子包括小瓶、片剂或胶囊的瓶或者品脱或加仑的瓶。因此，多重剂量形式是在包装中不隔离的多个单位剂量。一般地，可以制备含有在0.005％-100％范围内的活性成分的剂型或组合物，其中余量由无毒载体补足。
药物组合物可以以适合于每种施用途径的剂型配制。
a.注射剂、溶液和乳状液
本文考虑了一般特征在于皮下注射、肌内注射、肿瘤内注射、静脉内注射或皮内注射的肠胃外施用。注射剂可以以常规形式制备为液体溶液或悬浮液，适合于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或乳状液。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，需要时，待施用的药物组合物还可以含有溶剂形式的活化剂，例如pH缓冲剂、金属离子盐或其他此类缓冲剂。药物组合物还可以含有其他少量无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、可溶性增强剂及其他此类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。本文还考虑了缓慢释放或持续释放系统的植入，从而使得维持恒定水平的剂量(参见例如美国专利号3,710,795)。在此类肠胃外组合物中含有的活性化合物百分比高度取决于其特定性质，以及化合物的活性和对象的需要。
例如，如本文提供的聚合物缀合物的透明质酸降解酶例如聚合物缀合的可溶性透明质酸酶的标准稳定制剂用EDTA、NaCl、CaCl2、组氨酸、乳糖、白蛋白、和/或其他去污剂或其他相似试剂的一或多种配制。例如，本文提供的组合物可以含有一或多种pH缓冲剂(例如组氨酸、磷酸盐或其他缓冲剂)，或酸性缓冲剂(例如乙酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、Gly-HCl、琥珀酸盐、乳酸盐、马来酸盐或其他缓冲剂)，张力调节剂(例如氨基酸、多元醇、NaCl、海藻糖、其他盐和/或糖)，稳定剂，螯合剂例如乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐或钙EDTA，除氧剂例如甲硫氨酸、抗坏血酸/抗坏血酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐或白蛋白，和/或防腐剂例如含有芳环的防腐剂(例如苯酚或甲酚)。用于含有透明质酸降解酶的组合物的示例性稳定剂包括去污剂，例如聚山梨醇酯和蛋白质例如人血清白蛋白。用于本文组合物中的血清白蛋白的示例性浓度包括0.1mg/mL-1mg/mL，例如至少或至少约或约或0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL，但可以是更多或更少。聚山梨醇酯也可以以例如在或大约在0.001％-0.1％之间的浓度存在于组合物中，例如至少约或至少或约或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、00.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。金属螯合剂例如钙EDTA(CaEDTA)也可以例如以在大约0.02mM-20mM之间的浓度存在，例如至少约或至少或约或0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或更多。组合物的pH和摩尔渗透压浓度可以通过本领域技术人员进行调整以优化组合物的所需活性和稳定性的条件。在一些例子中，本文提供的组合物具有在100mOsm/kg-500mOsm/kg之间的摩尔渗透压浓度，例如至少或至少约或是或约100mOsm/kg、120mOsm/kg、140mOsm/kg、160mOsm/kg、180mOsm/kg、200mOsm/kg、220mOsm/kg、240mOsm/kg、260mOsm/kg、280mOsm/kg、300mOsm/kg、320mOsm/kg、340mOsm/kg、360mOsm/kg、380mOsm/kg、400mOsm/kg、420mOsm/kg、440mOsm/kg、460mOsm/kg、500或更多mOsm/kg，以及在6-8之间或在约6-8之间的pH，例如6-7.4，例如是或约6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8。
一般地，NaCl在本文含有透明质酸降解酶的制剂中提供，例如其量是或是约100mM-150mM或更多。例如，示例性制剂可以含有以或约10mM组氨酸和/或以或约130mM NaCl。其他制剂可以另外或可替代地含有例如以或约13mg/ml的乳糖。另外，抗细菌剂或抗真菌剂包括但不限于硫柳汞可以存在于制剂中。制剂可以进一步含有白蛋白、F68、和/或其他去污剂。制剂以这样的pH提供，所述pH是或是约6.0-7.4，例如6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4，一般是或是约pH 6.5。用于本文的经修饰的可溶性透明质酸酶的浓缩制剂一般在施用前在盐水溶液或其他盐缓冲溶液中稀释以维持适当的盐浓度。
注射剂设计用于局部和全身施用。为了本文目的，需要局部施用以直接施用于与累积或过量透明质酸相关的受累间隙。用于肠胃外施用的制剂包括准备用于注射的无菌溶液，在使用前准备与溶剂组合的无菌干燥可溶产品，例如冻干粉末，包括皮下注射用片剂，准备用于注射的无菌悬浮液，在使用前准备与媒介物组合的无菌干燥不溶性产品和无菌乳状液。溶液可以是水性的或非水性的。如果静脉内施用，则合适载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
在肠胃外制剂中使用的药学可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、多价螯合剂或螯合剂以及其他药学可接受的物质。水性媒介物的例子包括氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格氏注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物起源的不挥发性油，棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。以抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂可以加入在多重剂量容器中包装的肠胃外制剂，其包括苯酚或甲酚、汞制剂、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(TWEEN 80)。金属离子的多价螯合剂或螯合剂包括EDTA。药学载体还包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇用于水混溶的媒介物以及氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸用于pH调整。
如果静脉内施用，则合适载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
药学活性化合物的浓度这样调整，从而使得注射剂提供产生所需药理学效应的有效量。确切剂量取决于如本领域已知的患者或动物的年龄、重量和状况。单位剂量肠胃外制剂包装在安瓿、小瓶或具有针的注射器中。含有药学活性化合物的液体溶液或重构粉末制剂的体积是待治疗疾病和选择用于包装的特定制造物品的函数。所有肠胃外施用的制剂必须是无菌的，如本领域已知和实践的。
b.冻干粉末
本文感兴趣的是冻干粉末，其可以重构用于作为溶液、乳状液及其他混合物施用。它们还可以重构并配制为固体或凝胶。冻干粉末还可以由上文描述的溶液中的任何进行制备。
无菌、冻干粉末通过将抗透明质酸剂(其为透明质酸降解酶，例如可溶性透明质酸酶)和/或第二种试剂的化合物溶解于缓冲溶液中进行制备。缓冲溶液可以含有改善稳定性的赋形剂或粉末或由粉末制备的重构溶液的其他药理学组分。溶液的后续无菌过滤随后为在本领域技术人员已知的标准条件下冻干提供所需制剂。简言之，冻干粉末通过将赋形剂例如右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适试剂溶解于合适缓冲液例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲液中进行制备。随后，将所选酶加入所得到的混合物中，并且搅拌直至它溶解。将所得到的混合物无菌过滤或处理以去除颗粒并确保无菌性，并分配到小瓶内用于冻干。每个小瓶将含有单一剂量(1mg-1g，一般为1-100mg，例如1-5mg)或多重剂量的化合物。冻干粉末可以贮存于适当条件下，例如在约4℃至室温下。
这种冻干粉末用缓冲溶液重构提供了用于肠胃外施用的制剂。精确量取决于治疗的适应症和所选化合物。此类量可以凭经验确定。
c.表面施用
表面混合物如对于局部和全身施用所述的进行制备。所得到的混合物可以是溶液、悬浮液、乳状液等等，并且配制为乳膏、凝胶、软膏、乳状液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或适合于表面施用的任何其他制剂。
化合物或其药学可接受的衍生物可以配制为气溶胶用于例如通过吸入的表面施加(参见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了用于递送用于治疗炎性疾病特别是哮喘的类固醇的气溶胶)。施用于呼吸道的这些制剂可以采用用于喷雾器的气溶胶或溶液的形式，或作为用于吹入的超细粉，单独或与惰性载体例如乳糖组合。在此类情况下，制剂的颗粒通常具有小于50微米优选小于10微米的直径。
化合物可以配制用于局部或表面施加，例如表面施加于皮肤和粘膜，例如在眼中，以凝胶、乳膏和洗剂的形式，并且施加于眼或用于脑池内或脊柱内施加。表面施用考虑用于经皮递送以及施用于眼或粘膜，或用于吸入疗法。还可以施用单独或与其他药学可接受的赋形剂组合的活性化合物的鼻溶液。
提供了适合于经皮施用的制剂。它们可以以任何合适形式提供，例如适合于与接受者的表皮保持紧密接触延长时间段的离散贴剂。此类贴剂含有例如就活性化合物而言0.1-0.2M浓度的在任选缓冲的水溶液中的活性化合物。适合于经皮施用的制剂还可以通过离子电渗疗法递送(参见例如Pharmaceutical Research 3(6)，318(1986))并且一般采取活性化合物的任选缓冲的水溶液的形式。
d.用于其他施用途径的组合物
取决于治疗的状况，本文还考虑了其他施用途径例如表面施加、经皮贴剂、经口和直肠施用。例如，用于直肠施用的药物剂型是直肠栓剂、用于全身效应的胶囊和片剂。直肠栓剂包括插入直肠内的固体，其在体温下融化或软化，释放一或多种药理学或治疗活性成分。用于直肠栓剂中的药学可接受的物质是基质或媒介物和提高熔点的试剂。基质的例子包括可可脂(可可油)、甘油-明胶，碳蜡(聚氧乙二醇)以及脂肪酸的甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯的适当混合物。可以使用多种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过模塑来制备。直肠栓剂的典型重量为约2至3克。用于直肠施用的片剂和胶囊使用相同药学可接受的物质并且通过与经口施用制剂相同的方法进行制造。
适合于直肠施用的制剂可以作为单位剂量栓剂提供。这些可以通过下述进行制备：将活性化合物与一或多种常规固体载体例如可可脂混合，并且随后使所得到的混合物成形。
对于经口施用，药物组合物可以采取例如通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，所述赋形剂例如粘合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或湿润剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。
适合于经颊(舌下)施用的制剂包括例如在调味基质中含有活性化合物的锭剂，所述调味基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；以及在惰性基质中含有化合物的软锭剂，所述惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶。
药物组合物还可以通过控制释放制剂和/或递送装置进行施用(参见例如美国专利号3,536,809；3,598,123；3,630,200；3,845,770；3,847,770；3,916,899；4,008,719；4,687,660；4,769,027；5,059,595；5,073,543；5,120,548；5,354,556；5,591,767；5,639,476；5,674,533和5,733,566)。
多种递送系统是已知的并且可以用于施用所选组合物，例如但不限于封装在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用、以及编码可溶性透明质酸酶或其他试剂的核酸分子的递送例如逆转录病毒递送系统。
因此，在某些实施方案中，脂质体和/或纳米颗粒也可以用于施用本文的组合物。脂质体由磷脂形成，所述磷脂在水介质中分散并且自发形成多层同心双层小泡(也称为多层小泡(MLV))。MLV一般具有25nm-4μm的直径。MLV的超声处理导致形成在核心中含有水溶液，直径在200-500埃范围的小单层小泡(SUV)。
当在水中分散时，取决于脂质与水的摩尔比，磷脂可以形成除脂质体外的多种结构。在低比例时，形成脂质体。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可以显示对离子和极性物质的低渗透性，但在高温下经历显著改变其渗透性的相变。相变涉及从称为凝胶状态的紧密填充的有序结构变化到称为流体状态的松散填充的较不有序的结构。这在特征性相变温度下发生并导致对离子、糖和药物的渗透性的增加。
脂质体经由不同机制与细胞相互作用：通过网状内皮系统的吞噬细胞例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的内吞作用；通过非特异性弱疏水或静电力，或通过与细胞表面组分的特异性相互作用吸附至细胞表面；通过脂质体的脂质双层插入质膜内与浆细胞膜融合，伴随脂质体内容物同时释放到细胞质内；并且通过脂质体脂质转移至细胞或亚细胞膜，或反之亦然，而无脂质体内容物的任何结合。改变脂质体制剂可以改变起作用的机制，尽管超过一种机制可以同时起作用。纳米胶囊一般可以以稳定和重现性方式诱陷化合物。为了避免由于细胞内聚合物超负荷的副作用，此类超细颗粒(大小约0.1μm)应使用能够在体内降解的聚合物进行设计。符合这些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷酯纳米颗粒考虑用于本文，并且此类颗粒可以容易地制备。
2.制剂量
组合物可以配制用于单一剂量施用或多重剂量施用。试剂可以配制用于直接施用。
在其中抗透明质酸剂是透明质酸降解酶例如聚合物缀合的透明质酸降解酶的本文提供的组合物或组合物的组合中，聚合物缀合的透明质酸降解酶以在下述之间或大约在下述之间的量配制用于直接施用：0.5μg-50mg，例如100μg-1mg、1mg-20mg、100μg-5mg、0.5μg-1450μg、1μg-1000μg、5μg-1250μg、10μg-750μg、50μg-500μg、0.5μg-500μg或500μg-1450μg。例如，聚合物缀合的透明质酸降解酶以在下述之间或大约在下述之间的量配制用于直接施用：15单位(U)或150单位(U)-60,000单位/剂，300U-30,0000U、500U-25,000U、500U-10,000U、150U-15,000U、150U-5000U、500U-1000U、5000U-45,000U、10,000U-50,000U或20,000U-60,000U，例如至少或约至少或约或15U、50U、100U、200U、300U；400U；500U；600U；700U；800U；900U；1,000U；1250U；1500U；2000U；3000U；4000U；5,000U；6,000U；7,000U；8,000U；9,000U；10,000U；20,000U；30,000U；40,000U；或50,000U。聚合物缀合的透明质酸降解酶可以作为以或约50U/mL-15,000U/mL的原液提供，例如10U/mL-500U/mL、1000U/mL-15,000U/mL、100U/mL-5,000U/mL、500U/mL-5,000U/mL或100U/mL-400U/mL，例如至少或至少约或约或50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、400U/mL、500U/mL、1000U/mL、2000单位/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、6000U/mL、7000U/mL、8000U/mL、9000U/mL、10,000U/mL、11,000U/mL、12,000U/mL或12,800U/mL。组合物的体积可以是0.5mL-1000mL，例如0.5mL-100mL、0.5mL-10mL、1mL-500mL、1mL-10mL，例如至少或约至少或约或0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。组合物一般这样配制，从而使得聚合物缀合的透明质酸降解酶不以大于约50mL的体积施用，并且通常以5-30mL的体积施用，一般为不大于约10mL的体积。对于更大体积，输注时间可以适合促进更大体积的递送。例如，输注时间可以是至少1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时或更久。
在本文提供的组合物或组合物的组合中，肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉醇以范围在下述之间或大约在下述之间的量配制用于紫杉烷的直接施用：10mg-1000mg，例如20mg-500mg、10mg-250mg、75mg-400mg、100mg-200mg、150mg-400mg、200mg-800mg、50mg-200mg或50mg-150mg。组合物可以作为用于以后重构的冻干形式提供或作为液体制剂提供。例如，液体制剂的重构可以使用水或0.9％氯化钠或其他生理溶液。当重构或提供为液体制剂时，组合物可以提供含有在作为原液的肿瘤靶向紫杉烷制剂中的在下述之间或大约在下述之间的紫杉烷：0.01mg/mL-100mg/mL，例如1mg/mL-50mg/ml、2.5mg/mL-25mg/mL、5mg/mL-15mg/mL或10mg/mL-100mg/mL，例如至少或约至少5mg/mL。组合物的体积可以是0.5mL-1000mL，例如0.5mL-100mL、0.5mL-10mL、1mL-500mL、1mL-10mL，例如至少或约至少或约或0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL、100mL、200mL或更多。整个小瓶内容物可以抽取用于施用，或可以分成多个剂量用于多重施用。对于更大体积，输注时间可以适合促进更大体积的递送。例如，输注时间可以是至少1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时或更久。应当理解紫杉烷的制剂可以含有其他组分，包括载体、聚合物、脂质及其他赋形剂。上文提供的剂量就其为活性成分的紫杉烷组分而言。
例如，白蛋白结合的紫杉醇，配制为紫杉醇的无溶剂制剂，其中紫杉醇仅与白蛋白复合，形成大小约130nm的稳定颗粒。每50mL小瓶含有作为无菌、冻干团块的100mg紫杉醇和大约900mg人白蛋白。每个小瓶提供用于由20mL 0.9％氯化钠注射液，USP重构以产生含有5mg/mL紫杉醇的悬浮液。重构的Abraxane悬浮液以260mg/m2的推荐剂量在30分钟内静脉内输注。
在本文提供的组合物或组合物的组合中，核苷类似物例如吉西他滨或其衍生物以在下述之间或大约在下述之间的量配制用于直接施用：100mg-5000mg，例如500mg-5000mg、500mg-2500mg、1000mg-2500mg、2000mg-5000mg或1500mg-2500mg，一般为至少或约至少或约100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg。组合物可以作为用于以后重构的冻干形式提供或作为液体制剂提供。例如，液体制剂的重构可以使用水或0.9％氯化钠或其他生理溶液。当重构或提供为液体制剂时，组合物可以作为含有在下述之间或大约在下述之间的核苷类似物的原液提供：1mg/mL-500mg/mL，例如5mg/mL-100mg/ml、10mg/mL-50mg/mL、25mg/mL-200mg/mL或20mg/mL-100mg/mL，例如至少或约至少5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL或40mg/mL，并且一般不大于40mg/mL，以便使不完全溶解降到最低。组合物的体积可以是0.5mL-1000mL，例如0.5mL-100mL、0.5mL-10mL、1mL-500mL、1mL-10mL，例如至少或约至少或约或0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL、100mL、200mL或更多。整个小瓶内容物可以抽取用于施用，或可以分成多个剂量用于多重施用。对于更大体积，输注时间可以适合促进更大体积的递送。例如，输注时间可以是至少1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时或更久。在抽取一定量的药物用于施用后，需要时，制剂可以例如在水、盐水(例如0.9％)或其他生理溶液中进一步稀释。应当理解核苷类似物(例如吉西他滨或衍生物)的制剂可以含有其他组分，包括载体、聚合物、脂质及其他赋形剂。上文提供的剂量就其为活性成分的核苷类似物组分而言。
例如，注射用吉西他滨，作为含有200mg或1000mg活性剂/小瓶的冻干制剂提供。每个小瓶提供用于分别用5mL或25mL 0.9％氯化钠注射液，USP重构以产生含有40mg/mL吉西他滨的悬浮液(对于冻干粉末的置换体积计算，重构的浓度可以是约或38mg/mL)。在施用前，适当量的药物可以用0.9％氯化钠或其他生理溶液进一步稀释。
3.包装和制造物品
还提供的是制造物品，其含有包装材料、本文提供的任何药物组合物或组合、以及指示该组合物和组合用于治疗癌症例如基质肿瘤癌症或实体瘤癌症的标签。示例性制造物品是容器，包括单室和双室容器。容器包括但不限于管、瓶和注射器。容器可以进一步包括用于皮下施用的针。
在一个例子中，制造物品含有药物组合物，其含有抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷且不含进一步试剂或治疗。在另一个例子中，制造物品含有药物组合物，其含有抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶、肿瘤靶向紫杉烷和进一步的化疗剂(例如核苷类似物)。在这个例子中，试剂可以一起或分开提供，用于作为制造物品包装。
本文提供的制造物品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料是本领域技术人员众所周知的。参见例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，所述专利各自整体引入本文。药物包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合于所选制剂以及预期施用模式和治疗的任何包装材料。
包装的选择取决于试剂，以及此类组合物是一起包装还是分开包装。一般而言，包装与其中含有的组合物是不反应的。在其他例子中，一些组分可以作为混合物包装。在其他例子中，所有组分均分开包装。因此，例如，组分可以作为分开的组合物包装，在施用前混合后，所述组合物可以直接一起施用。可替代地，组分可以作为分开组合物包装用于分开施用。
组分可以在容器中包装。组分可以在相同容器中分开包装。一般地，此类容器的例子包括这样的容器，其具有含有聚合物缀合的透明质酸降解酶的封闭的限定空间，以及含有其他一或多种组分的分开的封闭的限定空间，从而使得后续区域通过可容易去除的膜分开，所述膜在去除后允许组分混合，或所述膜允许组分分开施用。考虑了任何容器或其他制造物品，只要试剂在施用前与其他组分分开。对于合适实施方案，参见例如美国专利号3,539,794和5,171,081中描述的容器。
所选组合物包括其制造物品也可以作为试剂盒提供。试剂盒可以包括本文描述的药物组合物和作为制造物品提供的用于施用的物品。试剂盒可以任选地包括施加说明书，包括剂量、给药方案和施用模式说明书。试剂盒还可以包括本文描述的药物组合物和用于诊断的物品。
F.评价活性、生物利用度和药物代谢动力学的方法
本文组合物中的试剂可以就特性和活性进行评价。特性和活性可以涉及生物学活性和/或肿瘤活性。测定法可以在体外或在体内进行。此类测定法可以包括但不限于测量组织或肿瘤活组织检查中的透明质酸量或血浆中的可溶性透明质酸量，测量在血液或尿中的透明质酸分解代谢产物，测量在血浆中的透明质酸酶活性，或测量在肿瘤中的组织间隙液压、血管容量或含水量。测定法可以用于评价试剂的效应，包括施用剂量和途径的效应。
1.体外测定法
a.透明质酸降解酶的透明质酸酶活性
透明质酸降解酶的活性可以使用本领域众所周知的方法进行评价。例如，通过测量在允许该酶在37℃下与HA反应30分钟后剩余的未降解的透明质酸或透明质酸(HA)底物的量，用于透明质酸酶的USP XXII测定法间接测定活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645美国药典公约，Inc，Rockville，MD)。透明质酸酶参考标准(USP)或国家处方集(NF)标准透明质酸酶溶液可以用于测定法中，以确定以单位表示的任何透明质酸酶的活性。在一个例子中，使用微浊度测定法测量活性。这基于当透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀物。通过使透明质酸酶与透明质酸(透明质酸)钠一起温育设定时间段(例如10分钟)并且随后通过添加酸化血清白蛋白使未消化的透明质酸钠沉淀来测量活性。在另外的显色时间后，在640nm测量所得样品的浊度。起因于对透明质酸钠底物的透明质酸酶活性的浊度降低是透明质酸酶酶促活性的量度。在另一个例子中，使用微量滴定测定法测量透明质酸酶活性，其中在与透明质酸酶一起温育后测量残留生物素化的透明质酸(参见例如Frost和Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269，美国专利公开号20050260186)。在透明质酸的葡糖醛酸残基上的游离羧基是生物素化的，并且生物素化的透明质酸底物与微量滴定板共价偶联。在与透明质酸酶一起温育后，使用抗生物素蛋白-过氧化物酶反应检测残留生物素化的透明质酸底物，并且与在与已知活性的透明质酸酶标准反应后获得的相比较。测量透明质酸酶活性的其他测定法是本领域已知的并且可以用于本文的方法中(参见例如Delpech等人，(1995)Anal.Biochem.229:35-41；Takahashi等人，(2003)Anal.Biochem.322:257-263)。
还可以评价透明质酸降解酶例如经修饰的可溶性透明质酸酶(例如聚乙二醇化的rHuPH20)充当铺展剂或分散剂的能力。例如，锥虫蓝染料可以连同或不连同透明质酸降解酶一起例如皮下或皮内注射到裸鼠每侧的侧面皮肤内。随后例如用测微计测量染料面积，以测定透明质酸降解酶充当铺展剂的能力(参见例如美国公开专利号20060104968)。透明质酸降解酶例如透明质酸酶与另一种试剂例如化疗剂的共施用对该试剂的药物代谢动力学和药效特性的作用还可以使用动物模型和/或人对象在体内进行评价，例如在临床试验的背景下，如上文讨论和下文实施例1中证实的。其并非透明质酸酶的透明质酸降解酶的功能活性可以使用这些测定法中的任何与透明质酸酶相比较。可以完成这点以测定透明质酸降解酶的功能等价量是多少。例如，透明质酸降解酶充当铺展剂或扩散剂的能力可以通过将其与锥虫蓝一起注射(例如皮下或皮内)到小鼠的侧面皮肤内进行评估，并且可以测定达到与例如100单位的透明质酸降解酶参考标准相同量的扩散所需的量。因此，所需的透明质酸降解酶的量在功能上等于100透明质酸酶单位。还可以测量在用经修饰的透明质酸降解酶例如经修饰的透明质酸酶处理前后，例如在肿瘤中的导水率(K)，以评价经修饰的透明质酸降解酶制剂的活性。
可以使用上文描述的测定法中的任何一种或多种，评价经修饰的透明质酸降解酶例如经修饰的透明质酸酶包括聚乙二醇化透明质酸酶影响与上文描述的透明质酸相关疾病和病症相关的标记中的任何一种或多种，或任何其他相关标记或表型的能力。例如，可以使用上文体外、离体和/或体内测定法中的任何一种或多种，评价经修饰的透明质酸降解酶例如经修饰的透明质酸酶减少透明质酸水平或含量、晕圈形成或大小、组织间隙液压、含水量和/或血管容量的能力。在一个例子中，经修饰的透明质酸酶可以施用于具有肿瘤的对象或适当的动物模型，并评价对透明质酸水平、晕圈形成或大小、组织间隙液压、含水量和/或血管容量的作用并且与未施用经修饰的透明质酸酶的对象或动物模型相比较。在一些例子中，经修饰的透明质酸酶可以与另一种试剂例如化疗剂一起施用。
评价透明质酸酶活性包括对HA合成和降解的作用的其他多种测定法是本领域技术人员已知的，包括但不限于本文描述或本领域已知的任何，例如测量透明质酸降解的体外测定法(参见例如Frost和Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269)，例如通过使用HA结合蛋白或其他抗HA试剂就HA染色组织或其他样品(参见例如Nishida等人(1999)J.Biol.Chem.，274:21893-21899)，颗粒排除测定法(Nishida等人1999；Morohashi等人(2006)Biochem Biophys.Res.Comm.，345:1454-1459)；测量或评价关于has基因的HAS mRNA表达(Nishida等人1999)。
b.紫杉烷活性
标准生理学、药理学和生物化学操作可用于测试化合物以鉴定具有用于抑制微管蛋白结合的所需生物学活性的那些。体外和体内测定法可以用于评估生物学活性，例如细胞毒性和微管蛋白聚合(参见例如Hidaka等人(2012)Biosci.Biotechnol.Biochem.，76:349-352)。
例如，本文提供的紫杉烷化合物可以在微管稳定测定法中进行测试(Barron等人，(2003)Anal.Biochem.，315:49-56)。微管蛋白装配或其抑制可以在微管蛋白聚合测定法中以吸光度或荧光形式进行监控。例如，可以使用基于光密度的微管蛋白聚合测定法，因为微管聚合物的浓度与通过微管散射的光程度成比例。示例性此类测定法是微管蛋白聚合HTS测定法(目录号BK004P或BK006P；Cytoskeleton，Denver，CO)。还可以使用基于荧光的测定法，由此由于荧光报道分子掺入微管内，聚合随后为荧光增强(目录号BK011P，Cytoskeleton，Denver)。在此类测定法中，微管蛋白可以与紫杉烷化合物例如紫杉醇、长春花碱或多西他赛一起温育，并且可以测量随时间的聚合。例如，在荧光测定法中，聚合可以通过监控在360nm处的激发和在420nm处的发射的荧光变化进行测量。微管蛋白装配还可以通过光散射进行监控，所述光散射接近于在350nm处的表观吸收。在该测定法中，牛血清白蛋白(BSA)一般用于阻止聚集。此外，省略其为微管蛋白聚合增强剂的甘油，以增加信噪比。作为对照，可以使用微管去稳定药物长春花碱，其稳定微管蛋白并且不影响解聚。
c.抗癌活性
本文描述的化合物和试剂包括透明质酸降解酶、肿瘤靶向紫杉烷和/或其他化疗剂(例如核苷类似物)及其制剂的抗癌活性可以在体外进行检查，例如通过使癌细胞培养物与衍生物一起温育，并且随后评估培养物中的细胞生长抑制。用于此类测试的合适细胞包括鼠P388白血病、B16黑素瘤和Lewis肺癌细胞，以及人乳房MCF7、卵巢OVCAR-3、A549肺癌细胞、MX-1(人乳腺肿瘤细胞)、HT29(结肠癌细胞系)、HepG2(肝癌细胞系)和HCT116(结肠癌细胞系)。
2.体内动物模型
动物模型可以用于评价本文提供的组合物或组合对透明质酸水平或含量、组织间隙液压、含水量、血管容量的作用，以及对肿瘤大小、体积或生长的作用。此外，动物模型可以用于评价组合物或组合的药物代谢动力学或耐受性。
动物模型可以包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、豚鼠和非人灵长类动物模型例如食蟹猴和恒河猴。动物模型包括遗传模型以及异种移植物模型。例如，异种移植物模型包括这样的模型，其中在测试试剂前，肿瘤可以在合适的测试动物例如裸鼠中建立。在一些例子中，用例如来自透明质酸相关癌症的肿瘤细胞系移植免疫缺陷小鼠例如裸鼠或SCID小鼠，以建立该癌症的动物模型。示例性细胞系包括来自透明质酸相关癌症的细胞系包括但不限于PC3前列腺癌细胞、BxPC-3胰腺腺癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞、MCF-7乳腺肿瘤细胞、BT474乳腺肿瘤细胞、Tramp C2前列腺肿瘤细胞和Mat-LyLu前列腺癌细胞，以及其为透明质酸相关例如含有升高水平的透明质酸的本文描述的其他细胞系。胰腺癌的示例性动物肿瘤模型涉及使用BxPC-3胰腺腺癌细胞在动物中生成肿瘤(参见例如Von Hoff等人(2011)J.Clin.Oncol.，29:4548-54)。
还可以使用遗传模型，其中使动物在一种或多种基因中是缺陷的，这导致肿瘤生成或形成。此类遗传改造的小鼠模型(GEMM)可以再现疾病的分子和临床特点。例如，示例性胰腺癌遗传学模型涉及内源突变型Kras和Trp53等位基因的胰腺特异性表达，其导致显示出缺陷表型的突变型小鼠(被称为KPC小鼠；LSL-KrasG12D，LSL-Trp53R172H，Pdx-1-Cre)。KPC小鼠发展原发性胰腺肿瘤，其显示出类似于人疾病的特点，包括对核苷类似物吉西他滨的抗性(参见例如Frese等人(2012)Cancer Discovery，2:260-269)。
本文提供的组合物或组合可以施用于小鼠以评价对疾病的作用。例如，可以评价或测量透明质酸水平。在另一个例子中，可以评价对肿瘤生长或肿瘤细胞抑制的作用。例如，可以测定ED50值，其是实现动物中的肿瘤生长的50％抑制所需的试剂量。还可以测定存活率。
3.药物代谢动力学和耐受性
药物代谢动力学和耐受性研究可以使用动物模型进行或可以在患者的临床研究过程中进行，以评价本文提供的组合和组合物的效应。动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、豚鼠和非人灵长类动物模型例如食蟹猴或恒河猴。在一些情况下，药物代谢动力学和耐受性研究使用健康动物进行。在其他例子中，使用对于其考虑本文组合或组合物的治疗的疾病动物模型例如癌症动物模型进行研究。
本文提供的组合或组合物的药物代谢动力学特性可以通过在施用后测量下述参数进行评价：最大(峰)化疗剂浓度(Cmax)、峰时间(即，出现最大化疗剂浓度的时间；Tmax)、最小化疗剂浓度(即，在化疗剂剂量之间的最小浓度；Cmin)、清除半衰期(T1/2)和曲线下面积(即，通过标绘时间相对于浓度生成的曲线下面积；AUC)。在其中化疗剂皮下施用的情况下，通过比较在皮下递送后的化疗剂曲线下面积(AUCsc)与在静脉内递送后的化疗剂的AUC(AUCiv)，测定试剂的绝对生物利用度。绝对生物利用度(F)可以使用下式进行计算：F＝([AUC]sc×剂量sc)/([AUC]iv×剂量iv)。可以使用适合于评价血液样品中化疗剂浓度的本领域已知的任何方法，测量在皮下施用后在血浆中的化疗剂浓度。
可以在药物代谢动力学研究中进行施用一系列剂量和不同给药频率，以评价增加或降低共施用试剂(例如核苷类似物)的浓度。皮下施用的化治疗剂的药物代谢动力学特性例如生物利用度还可以连同或不连同聚合物缀合的透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷的共施用进行评价。例如，使用一种或多种施用途径，可以给犬例如小猎犬施用与聚合物缀合的透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷组合的化疗剂(例如核苷类似物例如吉西他滨)。可以进行此类研究以评价与抗透明质酸剂例如透明质酸酶的共施用对化疗剂的药物代谢动力学特性例如生物利用度的作用。
评价安全和耐受性的研究也是本领域已知的并且可以在本文中使用。在本文的组合和组合物施用后，可以监控任何不良反应的发展。不良反应可以包括但不限于注射部位反应，例如水肿或肿胀、头痛、发热、疲乏、畏寒、面色潮红、头晕、荨麻疹、喘息或胸闷、恶心、呕吐、寒战、腰痛、胸痛、肌肉痉挛、抽搐或惊厥、血压变化和过敏性或严重超敏反应。通常，在安全和耐受性研究中施用一系列剂量和不同给药频率以评价增加或降低剂量中的化疗剂和/或抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷的浓度的效应。
G.组合疗法的方法和用途
本文提供的组合和组合物可以用于治疗癌症且特别是实体瘤癌症的治疗方法中。在该方法中，抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶(例如透明质酸酶，例如PH20，例如PEGPH20)和紫杉烷制剂(例如白蛋白结合的紫杉烷制剂)的组合疗法施用于患有实体瘤的对象。在一些例子中，还可以施用进一步的核苷类似物试剂，并且特别是其为用于治疗实体瘤和/或对通过脱氨基抑制敏感(例如吉西他滨或其衍生物)的核苷类似物试剂。如本文发现的，在与聚合物缀合的透明质酸降解酶和紫杉烷制剂的组合方案中，核苷类似物的肿瘤内量和因此其细胞毒性效应远远超过当核苷类似物仅与一种试剂(聚合物缀合的透明质酸降解酶或紫杉烷制剂)一起施用时的效应。例如，该效应可以是协同的。在本文提供的组合疗法中观察到的核苷类似物肿瘤内活性的程度和水平实现迄今用现有疗法未实现的结果，包括优于现有治疗方案的增加的功效和存活。
1.癌症
抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶、紫杉烷制剂和/或核苷类似物的组合疗法可以用于治疗癌性细胞、赘生物、肿瘤和转移灶。本文提供的组合疗法显示出抗肿瘤功效并且导致肿瘤生长的减慢或减少，肿瘤体积的降低以及在一些情况下肿瘤的消除或根除。组合疗法导致与用与单一或双重组合疗法相同的试剂处理的对象相比较增加的对象存活。对于难以治疗的癌症如胰腺癌，组合疗法与现有方法相比较提供显著益处。
例如，组合疗法可以用于治疗实体瘤，例如肺和支气管肿瘤、乳腺肿瘤、结肠和直肠肿瘤、肾肿瘤、胃肿瘤、食管肿瘤、肝和肝内胆管肿瘤、膀胱肿瘤、脑和其他神经系统肿瘤、头和颈肿瘤、口腔和咽肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫体肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤、睾丸肿瘤、前列腺肿瘤、恶性黑色素瘤、胆管癌、胸腺瘤、非黑色素瘤皮肤癌，以及血液系统肿瘤和/或恶性肿瘤，例如儿童白血病和淋巴瘤，多发性骨髓瘤，霍奇金病，淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤，急性和慢性白血病例如急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性或慢性髓细胞性白血病，浆细胞赘生物，淋巴样赘生物和与AIDS有关的癌症。通常，组合疗法用于治疗实体瘤例如实体瘤基质癌症。示例性肿瘤包括例如胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、前列腺肿瘤、子宫颈肿瘤和乳腺肿瘤。
特别地，癌症可以是富含透明质酸的癌症，其适合于通过抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶靶向。几种富含透明质酸的癌症已得到鉴定。富含透明质酸的癌症包括但不限于前列腺、乳腺、结肠、卵巢、胃、头和颈及其他肿瘤和癌症。在一些情况下，透明质酸水平与预后不良关联，例如降低的存活率和/或无复发存活率、转移灶、血管生成、癌细胞侵入其他组织/区域内、以及预后不良的其他指示。此类关联已例如在富含透明质酸的癌症中观察到，所述富含透明质酸的癌症包括卵巢癌、SCC、ISC、前列腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌(参见例如Anttila等人，(2000)Cancer Research，60:150-155；Karvinen等人，(2003)BritishJournal of Dermatology，148:86-94；Lipponen等人，(2001)Eur.Journal ofCancer，849-856；Pirinen等人，(2001)Int.J.Cancer:95:12-17；Auvinen等人，(2000)American Journal of Pathology，156(2):529-536；Ropponen等人，(1998)Cancer Research，58:342-347)。因此，富含透明质酸的癌症可以通过施用抗透明质酸剂例如透明质酸酶治疗，以治疗一种或多种癌症症状。
在治疗富含透明质酸的癌症的例子中，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶可以单独充当治疗剂和/或它可以增强其他共施用疗法或组合疗法的活性。例如，当注射到肿瘤内时，透明质酸降解酶例如透明质酸酶具有直接抗癌效应。透明质酸酶阻止移植到小鼠内的肿瘤生长(De Maeyer等人，(1992)Int.J.Cancer 51:657-660)并且抑制暴露于致癌物后的肿瘤形成(Pawlowski等人(1979)Int.J.Cancer 23:105-109)。透明质酸酶作为单独的治疗剂在脑癌(神经胶质瘤)治疗中是有效的(参见国际专利公开号WO198802261)。
抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶包括透明质酸酶还可以用于增加化疗剂对肿瘤的递送。透明质酸降解酶可以与一种或多种其他化疗剂或其他抗癌剂或治疗(例如使用紫杉烷制剂的治疗和/或使用核苷类似物的治疗)组合、例如同时或之前施用。在一些情况下，酶可以增加对常规化疗抗性的肿瘤的敏感性。例如，透明质酸降解酶包括透明质酸酶例如rHuPH20可以施用于患者，其量有效增加在肿瘤部位周围的扩散(例如以促进在肿瘤部位中和周围的化疗剂的循环和/或浓度)，例如通过透明质酸降解来抑制肿瘤细胞能动性和/或降低肿瘤细胞凋亡阈值。这可以使肿瘤细胞达到失巢凋亡状态，这致使肿瘤细胞对化疗剂的作用更敏感。透明质酸降解酶例如透明质酸酶的施用可以诱导先前化疗抗性的胰腺肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤和乳腺肿瘤的应答性(Baumgartner等人(1988)Reg.Cancer Treat.1:55-58；Zanker等人(1986)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27:390)。透明质酸降解酶例如透明质酸酶通常增强化疗剂或其他抗癌剂进入实体瘤内的渗透，从而治疗该疾病。
选择用于治疗的对象
该方法包括选择患有透明质酸相关肿瘤或癌症的对象用于治疗的步骤。此类方法包括用于检测透明质酸相关疾病标记的方法，其包括下述的任何指示：对象患有透明质酸相关疾病，对象可能响应通过抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶的治疗，和/或来自对象的样品例如组织、细胞或流体含有升高的透明质酸表达。用于检测标记的示例性测定法在下文描述，并且包括用于测量来自对象的样品中的HA水平和/或相对HA水平的测定法，用于分析透明质酸降解酶对来自对象的样品的作用的测定法，以及用于测量通常与某些透明质酸相关疾病/状况相关的读出的测定法，例如低透明质酸酶表达或活性、高组织间隙液压、血管容量和含水量。一般而言，可以使用用于检测来自对象的样品中的蛋白质或核酸或用于评价处理在体外对细胞/组织的作用的任何已知测定法。
选择用于在本文提供的方法中治疗的对象包括与未患有疾病或状况的对象相比较或者与不具有升高、异常或累积的HA表达的正常组织或样品相比较，具有升高、异常或累积的透明质酸水平的对象。可以测试来自对象的任何样品或组织并且与正常样品或组织相比较。透明质酸水平可以由任何来源例如组织(例如通过活组织检查)、肿瘤、细胞或者由血液、血清、尿或其他体液进行测量。例如，如本文其他地方描述的，在实体瘤中的HA沉积谱一般已分类为细胞外周的或基质的。升高的HA血浆水平已最显著地在具有Wilm’s瘤、间皮瘤和肝转移灶的患者中观察到。因此，取决于疾病或状况，不同样品可以就透明质酸水平进行测量。样品的选择在本领域技术人员的水平内。
用于测量透明质酸酶底物水平的测定法是疾病或状况的函数并且可以基于特定疾病或状况进行选择。本领域技术人员熟悉检测透明质酸的方法，其包括但不限于免疫组织化学方法或ELISA方法。
在一个例子中，在治疗对象前进行用于检测标记的步骤，例如以测定对象是否患有将顺应用透明质酸降解酶的治疗的透明质酸相关状况或疾病。在这个例子中，如果检测到标记(例如如果测定来自患者的细胞、组织或流体含有升高的透明质酸表达或响应透明质酸降解酶)，则进行其中将透明质酸降解酶施用于对象的治疗步骤。在一个例子中，当未检测到标记时(例如，如果测定来自患者的细胞、组织或流体含有正常或非升高的透明质酸表达或者不响应透明质酸降解酶)，可以选择另一个治疗选项。
在另一个例子中，在治疗对象后或在对象的治疗过程期间(例如使用抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶(例如可溶性经修饰的透明质酸酶)(连同或不连同共施用的试剂)的治疗)进行检测标记的步骤，例如，以测定用抗透明质酸剂的治疗是否对治疗疾病或状况具有作用。在一个此类例子中，标记未检测到或在与治疗前的量/水平相比较或与另一个样品相比较是降低的量或相对水平检测到，治疗继续，进行另一轮治疗，或起始另一种治疗例如组合疗法。在另一个此类例子中，如果标记以与治疗前或另一个样品相同的水平检测到，则可以选择另一个治疗选项。
检测透明质酸相关疾病和状况的标记的测定法包括测量对象的组织、细胞和/或体液例如肿瘤中透明质酸和/或透明质酸酶表达的量(例如相对量)。在此类测定法中包括的是可以检测例如在来自对象的样品中的HA表达、透明质酸合酶1(HAS1)表达、透明质酸合酶2(HAS2)表达、透明质酸合酶3(HAS3)表达、HALO(富含蛋白聚糖包括透明质酸的细胞外周基质区域)的存在和透明质酸降解酶例如透明质酸酶的存在的那些。
检测蛋白质和核酸水平的测定法是本领域众所周知的并且可以用于本文方法中以测量透明质酸、透明质酸合酶或其他蛋白质和/或核酸表达。此类测定法包括但不限于ELISA、SDS-PAGE、蛋白质印迹、PCR、RT-PCR、免疫组织化学、组织学和流式细胞术。例如，来自对象的样品例如组织样品(例如来自患者或动物模型的肿瘤的活组织检查、基质样品)、流体(例如血液、尿、血浆、唾液或其他样品)、细胞或细胞样品、或提取物或其他样品，可以用抗HA抗体或HA结合蛋白染色，例如使用组织学染色例如固定或冷冻组织切片的免疫组织化学(IHC)，以测定组织或样品中透明质酸的存在和程度，或免疫荧光细胞染色、下拉测定法(pull-down assay)和流式细胞术。在另一个例子中，样品例如活组织检查可以通过RT-PCR进行测定以评价HA mRNA的量。
用于检测癌症中的透明质酸表达的已知方法包括但不限于Lokeshwar等人，(1997)Cancer Res.57:773-777中所述的ELISA样测定法，用于测量患有膀胱癌的对象的尿或膀胱组织提取物中的HA水平。对于该测定法，将尿或提取物包被在微孔板上(还包被用作标准的脐带HA)，随后与标记的(例如生物素化的)HA结合蛋白例如本文描述的那些一起温育(例如16小时，室温)，洗涤并且使用抗生物素蛋白-生物素检测试剂底物定量与孔结合的HA结合蛋白。此类方法是本领域众所周知的。在一个例子中，来自具有HA相关膀胱癌的对象的尿含有HA水平，其与来自正常患者(健康对象或者具有其他泌尿生殖疾病或状况的对象)的尿/提取物相比较升高2-9倍；因此，如果尿中的HA水平与正常对象相比较升高，例如升高在或约2倍至或约9倍之间，例如与正常对象相比较，以或约2、3、4、5、6、7、8或9倍升高，则将检测到标记。
在进一步的例子中，在体外肿瘤细胞中的透明质酸表达和产生可以使用上文描述的方法中的任一种进行评价。类似地，在体外、离体或体内细胞的透明质酸合酶产生(例如HAS1、HAS2或HAS3)和/或表达也可以通过例如ELISA、SDS-PAGE、蛋白质印迹、PCR、RT-PCR、免疫组织化学、组织学或流式细胞术进行测定。
在另一个例子中，例如使用浊度测定法，测定来自对象的样品中例如在血液或血浆中的透明质酸酶活性的量。
在另一个例子中，分离来自患者的细胞或其他组织例如肿瘤细胞，并且用于研究中以测定细胞或组织是否在体外响应用透明质酸降解酶的处理，例如使用克隆生成测定法或用于测量细胞或组织例如肿瘤细胞响应处理的生长、增殖和/或存活的任何其他测定法。例如，来自对象的癌细胞可以种植到表面上，例如细胞外基质或蛋白质混合物，例如以商品名称(BD Biosciences)出售的混合物。在这个例子中，透明质酸相关的标记是细胞或组织对透明质酸降解酶施用的敏感性。在这个例子中，如果细胞的任何特性例如增殖、生长或存活通过添加透明质酸降解酶被抑制或阻断，则确定对象可以顺应用包含透明质酸降解酶的组合物的治疗。
除测定透明质酸表达水平的测定法之外，其他测定法可以用于选择对象用于治疗和/或评价治疗功效和/或持续时间。组织间隙液压(IFP)可以使用适当探针或仪器进行测量。例如，顶端带有换能器的导管(transducer-tippedcatheter)可以用于测量癌症组织或其他目的组织中的IFP。使导管经过手术针的内孔，随后将所述手术针插入肿瘤的中心。将针抽出同时使导管保留在原位。随后可以使用适当的数据采集单元测量IFP(mmHg)(Ozerdem等人(2005)Microvasc.Res.70:116-120)。测量IFP的其他方法包括针芯方法(wick-in-needle method)(Fadnes等人(1977)Microvasc.Res.14:27-36)。
血管容量可以通过例如使用超声成像进行测量。这种方法采用高回声微泡来提供检测到的强超声波反射。当例如静脉内注射到对象或动物模型内时，微泡由于其大小而移动通过血管空间。评价组织含水量例如肿瘤组织含水量的测定法也是本领域已知的。例如，可以将来自肿瘤的样品收获，印迹、称重并在冻干前速冻。水重量随后报告为组织湿重与干(即冻干)重比。
肿瘤细胞在体外形成细胞外周基质(晕圈)的能力可以使用颗粒排除测定法进行评价。在例如聚集蛋白聚糖的存在下，小颗粒(福尔马林固定的红细胞)可以加入肿瘤细胞的低密度培养物中，所述聚集蛋白聚糖是大量聚集的硫酸软骨素蛋白聚糖。在颗粒沉降后，培养物可以在400x放大率下察看，以测定是否通过肿瘤细胞形成任何晕圈。这可以显现为在颗粒从其中排除的细胞周围的区域。
对于任何所述检测方法，标记(例如HA表达、对透明质酸降解酶的应答性、HA合酶表达或透明质酸酶活性)通常与对照样品相比较，从而使得标记的检测通常包括测定读出与对照样品相比较是升高或减少的。
例如，对照样品可以是另一种组织、细胞或体液，例如正常组织、细胞或体液，例如类似于待测试的样品但从不同对象中分离的组织、细胞或体液，所述不同对象例如其为正常的对象(即不患有疾病或状况，或不患有待测试对象患有的疾病或状况类型)，例如不患有透明质酸相关疾病或状况的对象，或来自另一个对象的类似组织，所述另一个对象具有相似疾病或状况，但其疾病不那么严重和/或不是透明质酸相关的或表达相对更少的透明质酸并且因此是透明质酸较少程度相关的。例如，当待测试的细胞、组织或流体是患有癌症的对象时，它可以与来自患有较不严重的癌症例如早期、分化或其他类型的癌症的对象的组织、细胞或流体相比较。在另一个例子中，对照样品是流体、组织、提取物(例如细胞或核提取物)、核酸或肽制剂、细胞系、活组织检查、具有已知量或相对量HA的标准或其他样品，例如样品，例如已知表达相对低水平HA的肿瘤细胞系，例如本文描述的示例性肿瘤细胞系，其表达低水平的HA，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCI H460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系和来自使用此类细胞系生成的肿瘤模型的肿瘤。
应当理解HA中的特定变化例如增加或降低取决于使用的测定法。例如，在ELISA中，在特定波长处的吸光度或蛋白质数量的倍数增加或降低(例如，如通过使用标准曲线测定的)可以相对于对照表示。在PCR测定法例如RT-PCR中，可以使用本领域技术人员已知的方法例如使用标准与对照表达水平相比较(例如表示为倍数变化)。
例如，当待测试来自对象的样品中的透明质酸量时，标记的检测可以测定与对照样品例如在先前段落中描述的对照样品相比较，来自对象的样品(例如癌性细胞、组织或流体)中的HA量是升高的。在一个例子中，如果与对照样品相比较，组织、细胞或流体中的HA量升高为或约为0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍或更多，则癌症测定为富含透明质酸的癌症，所述对照样品可以是例如但不限于具有已知量或相对量的HA的流体、组织、提取物(例如细胞或核提取物)、核酸或肽制剂、细胞系、活组织检查、标准或其他样品，例如样品，例如已知表达相对低水平的HA的肿瘤细胞系，例如本文描述的示例性肿瘤细胞系，其表达低水平的HA，例如HCT 116细胞系、HT29细胞系、NCI H460细胞系、DU145细胞系、Capan-1细胞系和来自使用此类细胞系生成的肿瘤模型的肿瘤。
此外，在此类方法中，细胞相关的透明质酸水平可以评分为低、中等或高。例如，如果30％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的肿瘤区域显示持续HA信号，则HA表达视为高或中等的。通常，本文考虑了具有至少中等至高HA的对象的治疗。
2.剂量和施用
含有抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶、和肿瘤靶向紫杉烷以及任选地与核苷类似物进一步组合的本文提供的组合疗法以足以发挥治疗上有用的效应的量施用。通常，活性剂施用的量不导致待治疗患者不希望的副作用，或与使用上述试剂之一的单一治疗所需的剂量和量相比较，使观察到的副作用降到最低或减少。例如，如本文其他地方描述的，本文发现具有聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法导致共施用的核苷类似物例如吉西他滨增加的肿瘤内递送和增加的肿瘤内半衰期。因此，与使用现有技术方法(例如吉西他滨单一疗法或与一种其他试剂结合的双重疗法)施用的核苷类似物的量相比较，可以在本文提供的组合疗法中施用的核苷类似物(例如吉西他滨)的量是减少的，同时实现基本上相同或改善的治疗效果。由于施用的剂量降低，与核苷类似物(例如吉西他滨)施用相关的副作用例如免疫抑制或骨髓抑制是减少、降到最低或避免的。
测定待施用于对象的活性剂包括抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶、肿瘤靶向紫杉烷和任选地核苷类似物的精确量在本领域技术人员的水平内。例如，用于治疗疾病和状况例如癌症和实体瘤的此类试剂和用途是本领域众所周知的。因此，在组合物或组合疗法中的此类试剂的剂量可以基于在给定施用途径下关于该试剂的标准给药方案进行选择。
应当理解治疗的精确剂量和持续时间是待治疗的组织或肿瘤的函数，并且可以使用已知测试方案或者通过由体内或体外测试数据外推凭经验进行测定，和/或可以由特定试剂的已知给药方案进行测定。应当指出浓度和剂量值还可以随待治疗个体的年龄、个体的重量、施用途径和/或疾病的程度或严重性以及在熟练的医学从业者考虑水平内的其他因素。一般地，选择剂量方案以限制毒性。应当指出由于毒性或者骨髓、肝或肾或其他组织功能障碍，主治医生将知道如何和何时终止、中断或调整疗法至较低剂量。相反，如果临床应答不足够(排除毒性副作用)，则主治医生也将知道如何和何时调整治疗至更高水平。应进一步理解对于任何特定对象，特定剂量方案应根据个体需要和施用或监督制剂施用的个人的职业判断在一段时间内调整，并且本文所示的浓度范围仅是示例性的并且不意图限制其范围。
例如，聚合物缀合的透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如PEGPH20)以治疗有效量施用以降解或切割肿瘤相关的透明质酸。待施用用于治疗疾病或状况(例如癌症或实体瘤例如富含HA的肿瘤)的透明质酸降解酶例如可溶性透明质酸酶的量可以通过标准临床技术进行测定。此外，体外测定法和动物模型可以用于帮助鉴定最佳剂量范围。可以凭经验测定的精确剂量可以取决于特定酶、施用途径、待治疗疾病的类型和疾病的严重性。示例性剂量范围是或约50单位-50,000,000单位与聚合物缀合的透明质酸降解酶，或功能等价量的另一种与聚合物缀合的透明质酸降解酶。本文应当理解活性单位针对标准活性例如如在测定透明质酸酶活性的微浊度测定法中测量的活性进行标准化。
因此，例如，与聚合物例如PEG缀合的透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20可以以或约10-50,000,000单位、10-40,000,000单位、10-36,000,000单位、10-12,000,000单位、10-1,200,000单位、10-1,000,000单位、10-500,000单位、100-100,000单位、500-50,000单位、1000-10,000单位、5000-7500单位、5000单位-50,000单位或1,000-10,000单位施用。一般地，聚合物缀合的透明质酸降解酶施用于对象的量在下述之间或大约在下述之间：0.01μg/kg-25mg/kg，例如0.0005mg/kg(0.5μg/kg)-25mg/kg、0.5μg/kg-10mg/kg、0.02mg/kg-1.5mg/kg、0.01μg/kg-15μg/kg、0.05μg/kg-10μg/kg、0.75μg/kg-7.5μg/kg或1.0μg/kg-3.0μg/kg。聚合物缀合的透明质酸降解酶可以例如以下述剂量施用：至少或约至少0.0005mg/kg(对象)、0.0006mg/kg、0.0007mg/kg、0.0008mg/kg、0.0009mg/kg、0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg.kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg或更多施用于一般重量约70kg-75kg的平均成年人对象。
本文提供的聚合物缀合的透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶(例如PEGPH20)可以在下述之间或大约在下述之间施用：1单位/kg-800,000单位/kg，例如10-800,000单位/kg、10-750,000单位/kg、10-700,000单位/kg、10-650,000单位/kg、10-600,000单位/kg、10-550,000单位/kg、10-500,000单位/kg、10-450,000单位/kg、10-400,000单位/kg、10-350,000单位/kg、10-320,000单位/kg、10-300,000单位/kg、10-280,000单位/kg、10-260,000单位/kg、10-240,000单位/kg、10-220,000单位/kg、10-200,000单位/kg、10-180,000单位/kg、10-160,000单位/kg、10-140,000单位/kg、10-120,000单位/kg、10-100,000单位/kg、10-80,000单位/kg、10-70,000单位/kg、10-60,000单位/kg、10-50,000单位/kg、10-40,000单位/kg、10-30,000单位/kg、10-20,000单位/kg、10-15,000单位/kg、10-12,800单位/kg、10-10,000单位/kg、10-9,000单位/kg、10-8,000单位/kg、10-7,000单位/kg、10-6,000单位/kg、10-5,000单位/kg、10-4,000单位/kg、10-3,000单位/kg、10-2,000单位/kg、10-1,000单位/kg、10-900单位/kg、10-800单位/kg、10-700单位/kg、10-500单位/kg、10-400单位/kg、10-300单位/kg、10-200单位/kg、10-100单位/kg、16-600,000单位/kg、16-500,000单位/kg、16-400,000单位/kg、16-350,000单位/kg、16-320,000单位/kg、16-160,000单位/kg、16-80,000单位/kg、16-40,000单位/kg、16-20,000单位/kg、16-16,000单位/kg、16-12,800单位/kg、16-10,000单位/kg、16-5,000单位/kg、16-4,000单位/kg、16-3,000单位/kg、16-2,000单位/kg、16-1,000单位/kg、16-900单位/kg、16-800单位/kg、16-700单位/kg、16-500单位/kg、16-400单位/kg、16-300单位/kg、16-200单位/kg、16-100单位/kg、160-12,800单位/kg、160-8,000单位/kg、160-6,000单位/kg、160-4,000单位/kg、160-2,000单位/kg、160-1,000单位/kg、160-500单位/kg、500-5000单位/kg、1000-100,000单位/kg或1000-10,000单位/kg它施用于其的对象质量。在一些例子中，透明质酸降解酶例如聚合物缀合的透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶(例如PEGPH20)可以以或约以1单位/kg-1000单位/kg、1单位/kg-500单位/kg或10单位/kg-50单位/kg施用。
一般地，当聚乙二醇化的透明质酸酶的比活性是或是约10,000U/mg-80,000U/mg，例如20,000U/mg-60,000U/mg或18,000U/mg-45,000U/mg时，一般施用或约1单位/kg(U/kg)、2U/kg、3U/kg、4U/kg、5U/kg、6U/kg、7U/kg、8U/kg、8U/kg 10U/kg、16U/kg、32U/kg、64U/kg、100U/kg、200U/kg、300U/kg、400U/kg、500U/kg、600U/kg、700U/kg、800U/kg、900U/kg、1,000U/kg、2,000U/kg、3,000U/kg、4,000U/kg、5,000U/kg、6,000U/kg、7,000U/kg、8,000U/kg、9,000U/kg、10,000U/kg、12,800U/kg、20,000U/kg、32,000U/kg、40,000U/kg、50,000U/kg、60,000U/kg、70,000U/kg、80,000U/kg、90,000U/kg、100,000U/kg、120,000U/kg、140,000U/kg、160,000U/kg、180,000U/kg、200,000U/kg、220,000U/kg、240,000U/kg、260,000U/kg、280,000U/kg、300,000U/kg、320,000U/kg、350,000U/kg、400,000U/kg、450,000U/kg、500,000U/kg、550,000U/kg、600,000U/kg、650,000U/kg、700,000U/kg、750,000U/kg、800,000U/kg或更多/对象的质量。例如，施用60,000U；70,000U；80,000U；90,000U；100,000U；200,000U；300,000U；400,000U；500,000U；600,000U；700,000U；800,000U；900,000U；1,000,000U；1,500,000U；2,000,000U；2,500,000U；3,000,000U；3,500,000U；4,000,000U或更多。
在本文例子中，肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)以足以实现肿瘤内递送的治疗有效量施用。在一些例子中，肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)以治疗有效量施用，与不存在治疗相比较减少肿瘤内脱氨酶(例如胞苷脱氨酶)蛋白质水平，例如使水平减少或降低至少或约至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在特定例子中，肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)以治疗有效量施用，与不存在治疗相比较增加共施用的核苷类似物(例如吉西他滨或衍生物)的肿瘤内水平。例如，肿瘤内吉西他滨增加至少或约至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。待施用用于治疗疾病或状况(例如癌症或实体瘤例如富含HA的肿瘤)的肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)的量可以通过标准临床技术进行测定。此外，体外测定法和动物模型可以用于帮助鉴定最佳剂量范围。可以凭经验测定的精确剂量可以取决于特定紫杉烷、特定制剂(例如纳米颗粒或脂质体制剂)、施用途径、待治疗疾病的类型和疾病的严重性。
通常，肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)相对于对象的体表面积(BSA；m2)在1mg/m2-1000mg/m2之间或大约在1mg/m2-1000mg/m2之间施用于对象，例如在下述之间或大约在下述之间：10mg/m2-500mg/m2、50mg/m2-400mg/m2、25mg/m2-300mg/m2，并且一般为至少或约至少或约或20mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、70mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2。在一些情况下，与现有制剂或剂量方案相比较，更低剂量的肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)可以施用于对象。例如，肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)施用于对象的量是至少或约至少50mg/m2或100mg/m2，但小于260mg/m2、200mg/m2或150mg/m2。在其他例子中，每次施用所施用的剂量与现有剂量和剂量方案相同，但剂量时间表减少，从而使得每个施用周期施用更低量的核苷类似物。在其他情况下，与现有制剂和给药方案相比较，更高剂量的肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)可以施用于对象。例如，肿瘤靶向紫杉烷例如白蛋白结合的紫杉烷(例如白蛋白结合的紫杉醇)施用于对象的量是至少或约至少300mg/m2，例如在300mg/m2-1000mg/m2之间或大约在300mg/m2-1000mg/m2之间。基于对象的高度和重量转换或测定以mg/kg表示的相应剂量在本领域技术人员的水平内。例如，BSA通过式(高度(cm)x重量(kg)/3600)1/2进行测定。平均成人的BSA为1.73m2。
在本文例子中，组合疗法任选含有核苷类似物(例如吉西他滨或衍生物或其他类似物)的进一步施用。吉西他滨以足以实现肿瘤内递送的治疗有效量施用。在特定例子中，与当单独施用时的肿瘤内水平相比较，核苷类似物(例如吉西他滨或衍生物或其他类似物)在本文组合疗法中共施用的量实现至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多增加的肿瘤内水平。待施用用于治疗疾病或状况(例如癌症或实体瘤例如富含HA的肿瘤)的核苷类似物(例如吉西他滨、其衍生物或本文描述的其他类似物)的量可以通过标准临床技术进行测定。此外，体外测定法和动物模型可以用于帮助鉴定最佳剂量范围。可以凭经验测定的精确剂量可以取决于特定核苷类似物、特定制剂、施用途径、待治疗疾病的类型和疾病的严重性。
通常，核苷类似物(例如吉西他滨或其衍生物或其他类似物)相对于对象的体表面积(BSA；m2)在100mg/m2-2500mg/m2之间或大约在100mg/m2-2500mg/m2之间施用于对象，例如在下述之间或大约在下述之间：500mg/m2-2000mg/m2、750mg/m2-1500mg/m2、1000mg/m2-1500mg/m2或500mg/m2-1500mg/m2，并且一般为至少或约至少或约或500mg/m2、600mg/m2、700mg/m2、800mg/m2、900mg/m2、1000mg/m2、1250mg/m2、1500mg/m2、1750mg/m2、2000mg/m2或更多。在一些情况下，与现有制剂或剂量方案相比较，更低剂量的核苷类似物(例如吉西他滨或其衍生物或其他紫衫烷)可以施用于对象。例如，核苷类似物(例如吉西他滨或其衍生物或其他紫衫烷)施用于对象的量是至少或约至少200mg/m2或500mg/m2，但小于1000mg/m2或1250mg/m2。在其他情况下，每次施用所施用的剂量与现有剂量和给药方案相同，但剂量时间表减少，从而使得每个施用周期施用更低量的核苷类似物。测定以mg/kg表示的相应剂量在本领域技术人员的水平内。
本文提供的试剂可以静脉内、皮下、肿瘤内、皮内、经口或通过其他施用途径进行施用。特定途径可以在施用试剂之间不同或可以是相同的。例如，一种或多种或全部试剂可以皮下施用。在特定例子中，本文考虑聚合物缀合的透明质酸降解酶可以皮下施用。在此类例子中，聚合物缀合的透明质酸降解酶在这样的剂量方案中施用，所述剂量方案允许1-8小时例如1-2小时吸收以实现血流中生物可用的酶，以便导致与同时静脉内剂量方案相似的肿瘤活性。在本文例子中，肿瘤靶向紫杉烷和/或核苷类似物还可以皮下施用。提供一种或多种试剂的特定皮下制剂或共制剂以便实现试剂的足够生物利用度并使注射部位反应降到最低。
在另一个例子中，一种或多种或全部试剂可以静脉内施用。在此类例子中，一种或多种或全部试剂通过推压或输注施用。推压或输注时间可以是1分钟至60分钟，一般为约10分钟至40分钟，不超过60分钟。试剂可以通过同时输注或后续输注施用。在一个例子中，本文提供的组合疗法中的试剂中的两种或所有三种施用的试剂同时输注。在此类例子中，施用的试剂在相同组合物中提供用于在相同袋中一起输注。在其他情况下，施用的试剂在分开组合物中提供，但在输注前组合到单一袋内作为一种输液。在进一步的例子中，施用的试剂同时或接近同时输注或随后输注，并且悬挂在分开袋中用于分开输注。
3.给药方案：施用频率和周期
抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶可以在肿瘤靶向紫杉烷之前、同时或接近同时、顺次或间歇地施用。例如，抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷可以一起或分开共施用。如果分开施用，则试剂可以彼此立即相隔施用，例如在彼此30秒至15分钟内施用，例如彼此相隔小于15分钟、14分钟、12分钟、10分钟、5分钟、2分钟、1分钟或30秒。在其他情况下，抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷顺次和/或间歇地施用。在此类例子中，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶可以首先施用，或肿瘤靶向紫杉烷可以首先施用。一般地，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶在肿瘤靶向紫杉烷之前施用。例如，在肿瘤靶向紫杉烷施用之前至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶。
在本文的组合疗法的例子中，核苷类似物可以在抗透明质酸剂(例如透明质酸降解酶)和/或肿瘤靶向紫杉烷之前、同时或接近同时、顺次或间歇地施用。核苷类似物可以与抗透明质酸剂(例如透明质酸降解酶)和/或肿瘤靶向紫杉烷之一或两者一起或分开共施用。如果分开施用，则核苷类似物可以在抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷施用之前或之后立即施用，例如在彼此30秒至15分钟内施用，例如与抗透明质酸剂(例如透明质酸降解酶)和/或肿瘤靶向紫杉烷相隔小于15分钟、14分钟、12分钟、10分钟、5分钟、2分钟、1分钟或30秒。一般地，核苷类似物在抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶之后施用。在一些情况下，核苷类似物在抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷之后施用。例如，在抗透明质酸剂(例如透明质酸降解酶)和/或肿瘤靶向紫杉烷施用之后至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用核苷类似物。
在本文的一个例子中，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶与其他试剂分开施用，并且在肿瘤靶向紫杉烷之前或之后立即施用。例如，在肿瘤靶向紫杉烷之前或之后小于15分钟、14分钟、12分钟、10分钟、5分钟、2分钟、1分钟或30秒施用透明质酸降解酶。在此类例子中，核苷类似物在抗透明质酸剂(例如透明质酸降解酶)和肿瘤靶向紫杉烷之后施用。例如，在透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷施用之后至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用核苷类似物。
在另一个例子中，抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶在肿瘤靶向紫杉烷之前施用，所述肿瘤靶向紫杉烷在核苷类似物之前施用。例如，在肿瘤靶向紫杉烷施用之前至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用抗透明质酸剂(例如透明质酸降解酶)。在此类例子中，在肿瘤靶向紫杉烷施用之后至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用核苷类似物。
施用频率和时机以及给药量可以在施用周期内定期施用，以维持活性剂的连续和/或长期效应所需时间长度。组合或组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年施用一次或施用一次。施用周期的时间长度可以凭经验测定，并且取决于待治疗的疾病、疾病的严重性、特定患者和在治疗医生技术水平内的其他考虑。用本文提供的组合疗法的治疗时间长度可以是一周、两周、一个月、几个月、一年、几年或更久。剂量可以分成疗程期间的多个施用周期。例如，经修饰的透明质酸酶可以在一年或更久的时期内每周施用两次。如果在不存在中断治疗的情况下疾病症状持续，则治疗可以继续另外的时间长度。在疗程内，可以监控疾病和/或治疗相关毒性或副作用的证据。
此外，施用周期可以定制，以添加中断治疗时期，以便提供不暴露于试剂的休息期。治疗中断的时间长度可以是预定时间或可以凭经验测定，取决于患者如何响应或取决于观察到的副作用。例如，治疗可以中断一周、两周、一个月或几个月。一般地，将中断治疗时期构建到患者的给药方案周期内。
例如，示例性给药方案是28天的治疗周期或施用周期。试剂例如抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶、肿瘤靶向紫杉烷和/或核苷类似物可以每周施用一次或每周施用两次。例如，试剂可以施用前3周，每周一次或每周两次，随后为不给药的一周。因此，例如，在28天周期内，患者可以在第1、4、8、11、15和18天(或第0、3、6、9、12和15天)时用试剂每周给药两次，随后为一周中断治疗。在另一个例子中，在28天周期内，患者可以在第1、8和16天时用试剂每周给药一次，随后为一周中断治疗。在另一个例子中，对于整个28天，试剂可以每周施用一次或每周施用两次。因此，例如，对于整个28天周期，患者可以在第1、4、8、11、15、18、21和24天(或第0、4、7、11、14、18、21或25天)时用试剂每周给药两次。在其他例子中，对于整个28天周期，患者可以在第1、8、16或24天时用试剂每周给药一次。应当理解上述描述仅用于例证目的，并且可以采用上文的变化。进一步地，相似的施用周期可以应用于所有施用的试剂，或每种施用的试剂可以采用其在本文提供的组合疗法中的自身给药方案。
测定精确的施用周期和给药时间表在本领域技术人员的水平内。如上所述，施用周期可以用于任何所需时间长度。因此，28天施用周期可以重复任何时间长度。取决于对于待治疗的患者和疾病特异性的个人考虑，采取符合患者需要的施用周期和给药方案在治疗医生的技术水平内。
一般地，核苷类似物例如吉西他滨或衍生物的施用时机通常是抗透明质酸剂例如聚合物缀合的透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷的施用周期的函数。例如，核苷类似物可以在施用周期中抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶、和/或肿瘤靶向紫杉烷的第一次施用之前施用，和/或在周期中的任何一次或多次后续施用之后施用。在其他例子中，核苷类似物在周期中的抗透明质酸剂(例如透明质酸降解酶)和/或肿瘤靶向紫杉烷的每次后续施用之后施用，在周期中的透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷的每一次其他后续施用之后施用，或在抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷的施用周期过程中每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次或每个月施用一次。在一些例子中，每个抗透明质酸剂例如透明质酸降解酶和/或肿瘤靶向紫杉烷的施用周期仅施用一次核苷类似物。在另外的例子中，核苷类似物在施用周期之间间歇地施用。例如，核苷类似物在第一个施用周期过程中不施用，而是在第二个周期过程中施用，随后跳过第三个周期并且再次在第四个周期过程中施用等等或其任何变化。
在本文的组合疗法的特定例子中，该方法包括同时或接近同时例如伴随地施用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷。抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷可以以每周两次或每周一次的施用频率施用预定周数。特别地，抗透明质酸剂每周施用两次并且肿瘤靶向紫杉烷每周施用一次。任选地，核苷类似物还可以在组合疗法中施用。例如，核苷类似物每周施用一次共预定周数，并且通常核苷类似物在抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷施用之后一周施用。该方法还可以包括在抗透明质酸剂施用之前、同时、间歇地或之后施用皮质类固醇。施用周期可以是任何时间段，并且在治疗医生或临床医生的水平内。通常，预定周数是3周或4周，但可以是更久。取决于疾病状态和对象的应答，施用周期可以重复多次。
4.另外的组合治疗
本文提供的组合疗法可以单独或者与其他疗法或治疗进一步组合使用。本文提供的组合或组合物可以与其他治疗剂或药理试剂或治疗例如操作一起、之前、间歇地或之后进一步共配制或共施用。例如，此类试剂包括但不限于其他生物制品、抗癌剂、小分子化合物、分散剂、麻醉药、血管收缩剂和手术及其组合。此类试剂还可以包括改善、减少或阻止副作用的一种或多种试剂。在一些情况下，组合疗法可以与一种或多种癌症治疗组合施用，所述癌症治疗去除原发性肿瘤或在治疗前使对象免疫抑制。例如，另外的化疗或放射疗法可以加上本文提供的组合疗法一起使用。此类另外的疗法可以具有使对象免疫系统减弱的效应。在其他例子中，可能不需要手术摘除和/或免疫系统减弱疗法。可以在其中组合的示例性其他方法包括施用降低肿瘤或赘生性细胞的增殖率的化合物，而不使免疫系统减弱(例如通过施用肿瘤抑制剂化合物或通过施用肿瘤细胞特异性化合物)或施用血管生成抑制化合物。
第二种的一种或多种试剂或者一种或多种治疗的制剂可以一次施用，或可以分成多个更小剂量以时间间隔施用。所选试剂/治疗制剂可以在治疗时间过程内以一个或多个剂量施用，例如经过几小时、几天、几周或几个月。在一些情况下，连续施用是有用的。应当理解施用的精确剂量和过程取决于适应症和患者的耐受性。一般地，本文第二种试剂/治疗的给药方案是本领域技术人员已知的。
a.皮质类固醇
本文提供的组合疗法可以单独或者与一种或多种皮质类固醇进一步组合使用。皮质类固醇施用的量在治疗上有效改善或减少聚合物缀合的透明质酸降解酶或其他试剂施用的一种或多种不利效应，特别是不利的肌肉骨骼效应。治疗有效量是足以改善、阻止、消除或减少一种或多种症状或不利效应的剂量。改善或成功预治疗的指示包括在CTCAE量表上未能体现有关得分或者在CTCAE量表上的分级或严重性变化的测定。
皮质类固醇是在肾上腺皮质中产生的一类类固醇激素。皮质类固醇涉及广泛多样的生理系统例如应激反应、免疫应答和炎症调节、碳水化合物代谢、蛋白质分解代谢、血液电解质水平和行为。这些包括其为具有大量其他功能的抗炎剂的糖皮质激素，以及主要通过对肾的作用控制盐和水平衡的盐皮质激素。
糖皮质激素是一类类固醇激素，例如与糖皮质激素受体结合的皮质类固醇。糖皮质激素通过与糖皮质激素受体结合引起其效应。在其他活性中，活化的糖皮质激素复合物依次通过阻止其他转录因子从细胞溶质易位到核内，上调核中的抗炎蛋白质表达并且阻遏细胞溶质中的促炎蛋白质表达。
一般地，任何皮质类固醇例如糖皮质激素可以用于本文提供的方法或组合中。糖皮质激素包括合成和半合成糖皮质激素。示例性糖皮质激素包括但不限于：阿氯米松、阿尔孕酮、倍氯米松(例如二丙酸倍氯米松)、倍他米松(例如倍他米松17-戊酸酯、倍他米松乙酸钠、倍他米松磷酸钠、戊酸倍他米松)、布地奈德、氯倍他索(例如丙酸氯倍他索)、氯倍他松、氯可托龙(例如特戊酸氯可托龙)、氯泼尼醇、皮质酮、可的松和氢化可的松(例如乙酸氢化可的松)、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松(例如地塞米松21-磷酸酯、乙酸地塞米松、地塞米松磷酸钠)、二氟拉松(例如二乙酸二氟拉松)、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟氢可的松(例如乙酸氟氢可的松)、氟米松(例如特戊酸氟米松)、氟尼缩松、氟轻松(例如乙酸氟轻松)、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙(例如乙酸氟米龙)、氟培龙(例如乙酸氟培龙)、氟泼尼定、氟泼尼龙、氟氢缩松、氟替卡松(例如丙酸氟替卡松)、福莫可他、哈西奈德(halcinonides)、halobetasols、卤米松、卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松(例如氢化可的松21-丁酸酯、乙丙氢化可的松、乙酸氢化可的松、氢化可的松丙酸酯、丁酸氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯、氢化可的松半琥珀酸酯、氢化可的松丙丁酸酯(probutate)、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松戊酸酯)、依碳酸氯替泼诺、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙(乙丙甲泼尼龙、乙酸甲泼尼龙、甲泼尼龙半琥珀酸酯、甲泼尼龙琥珀酸钠)、莫米松(例如糠酸莫米松)、帕拉米松(例如乙酸帕拉米松)、泼尼卡酯、泼尼松龙(例如泼尼松龙25-二乙氨基乙酸酯、强的松龙磷酸钠、泼尼松龙21-半琥珀酸酯、乙酸泼尼松龙；法尼泼尼松龙、泼尼松龙半琥珀酸酯、泼尼松龙-21(β-D-葡糖苷酸)、泼尼松龙间间磺苯酸、司替泼尼松龙、丁乙酸泼尼松龙、四氢酞酸泼尼松龙)、泼尼松、强的松龙戊酸酯(prednivals)、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安西龙(例如曲安奈德、苯曲安奈德、己曲安奈德、曲安奈德21-棕榈酸酯、曲安西龙二乙酸酯)。这些糖皮质激素及其盐例如在Remington's Pharmaceutical Sciences，A.Osol，编辑Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(第16版1980)中详细讨论。
在一些例子中，糖皮质激素选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松。在特定例子中，糖皮质激素是地塞米松。
皮质类固醇以治疗有效剂量提供。治疗有效浓度可以通过在已知体外或体内(例如动物模型)系统中测试凭经验进行测定。例如，待施用以改善不利效应的所选皮质类固醇的量可以通过标准临床技术进行测定。此外，动物模型可以用于帮助鉴定最佳剂量范围。可以凭经验测定的精确剂量可以取决于特定治疗制剂、方案和给药时间表、施用途径和疾病的严重性。
在组合物中的所选治疗剂浓度取决于吸收、失活和排泄率、理化特征、剂量时间表和施用的量以及本领域技术人员已知的其他因素。例如，应当理解精确剂量和治疗持续时间是疾病或状况，待治疗的组织、患者或对象以及抗透明质酸剂包括量和剂量方案的函数。皮质类固醇的剂量还可以根据患者的年龄和健康、聚合物缀合的透明质酸降解酶给药(聚乙二醇化的透明质酸降解酶给药)、皮质类固醇的效力和施用途径而改变。例如，应当指出浓度和剂量值将随透明质酸降解酶的治疗剂量和剂量方案而改变。另外，皮质类固醇可以每天、每周或每月或在更长时间段内施用，以便实现所需结果。特定剂量体积可以改变并且取决于剂量方案、施用频率和所需施用速率。应当指出浓度和剂量值还可以随治疗个体的年龄而改变。
精确剂量和治疗持续时间可以使用已知测试方案或者通过由体内或体外测试数据外推凭经验进行测定。应进一步理解对于任何特定对象，特定剂量方案应根据个体需要和施用或监督制剂施用的个人的职业判断在一段时间内调整，并且本文所示的浓度范围仅是示例性的并不意图限制其范围。一般地，选择剂量方案以限制毒性，并且本文选择剂量方案以改善不利副作用。应当指出由于毒性或者骨髓、肝或肾或其他组织功能障碍，主治医生将知道如何和何时终止、中断或调整疗法至较低剂量。相反，如果临床应答不足够(排除毒性副作用)，则主治医生也将知道如何和何时调整治疗至更高水平。治疗剂的施用不应超过通过美国食品与药物管理局确定或医师案头参考(Physician’s Desk Reference)公布的最大剂量水平。
一般地，施用的皮质类固醇剂量取决于特定皮质类固醇，因为在不同皮质类固醇之间存在效力差异(参见下表4)。皮质类固醇或糖皮质激素例如地塞米松可以经口(片剂、液体或液体浓缩物)PO、静脉内(IV)或肌内给予。皮质类固醇通常作为推注施用，但许多可以在一段时间内施用，只要剂量有效改善与抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用相关的一种或多种副作用。
皮质类固醇可以以有效改善与透明质酸降解酶施用相关的一种或多种副作用的任何量施用。因此，皮质类固醇例如糖皮质激素可以以例如在或在约0.1-100mg/剂量，例如0.1-80mg、0.1-60mg、0.1-40mg、0.1-30mg、0.1-20mg、0.1-15mg、0.1-10mg、0.1-5mg、0.2-40mg、0.2-30mg、0.2-20mg、0.2-15mg、0.2-10mg、0.2-5mg、0.4-40mg、0.4-30mg、0.4-20mg、0.4-15mg、0.4-10mg、0.4-5mg、0.4-4mg、1-20mg、1-15mg或1-10mg之间的量施用于70kg成年人对象。通常，皮质类固醇例如糖皮质激素以在或在约0.4-20mg之间的量施用于平均成年人对象，例如以或约0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg或20mg/剂量。
皮质类固醇可以例如以或约下述剂量施用于一般重量约70kg-75kg的平均成年人对象：0.001mg/kg(对象)、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.01mg/kg、0.015mg/kg、0.02mg/kg、0.025mg/kg、0.03mg/kg、0.035mg/kg、0.04mg/kg、0.045mg/kg、0.05mg/kg、0.055mg/kg、0.06mg/kg、0.065mg/kg、0.07mg/kg、0.075mg/kg、0.08mg/kg、0.085mg/kg、0.09mg/kg、0.095mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.50mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.65mg/kg、0.70mg/kg、0.75mg/kg、0.80mg/kg、0.85mg/kg、0.90mg/kg、0.95mg/kg、1mg/kg、1.05mg/kg、1.1mg/kg、1.15mg/kg、1.20mg/kg、1.25mg/kg、1.3mg/kg、1.35mg/kg或1.4mg/kg。
施用的剂量可以改变，只要皮质类固醇的施用改善与透明质酸降解酶施用相关的一种或多种不利副作用。在一个例子中，糖皮质激素例如地塞米松的剂量以相继降低的剂量/治疗周期施用。因此，在此类治疗方案中，皮质类固醇的剂量逐渐减少。例如，地塞米松在透明质酸降解酶施用之前以4mg的初始剂量施用，在透明质酸降解酶的每次相继施用后，地塞米松剂量降低，从而使得剂量对于透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶的下一次施用为3mg，并且随后为2mg/抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用，并且随后为1mg/抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用。考虑了任何剂量，只要皮质类固醇的剂量有效减少与透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用相关的一种或多种副作用。
施用时间可以改变，只要皮质类固醇的施用改善与透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用相关的一种或多种不利副作用。皮质类固醇可以与透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶顺次、间歇地、同时或在相同组合物中施用。例如，皮质类固醇可以在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用之前、过程中、同时或之后施用。在另一个例子中，皮质类固醇和透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶间歇地施用。一般地，皮质类固醇在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用之前施用。例如，可以在抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用之前或约0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时或更久，施用皮质类固醇例如糖皮质激素例如地塞米松。
在一些例子中，皮质类固醇与透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用同时施用。在这个例子中，皮质类固醇可以与透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶一起或分开施用。通常，皮质类固醇与透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶分开施用。在其他例子中，在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用之后或约0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时或更久，施用皮质类固醇。
在一个例子中，皮质类固醇在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用之前施用。例如，在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用之前1小时，施用皮质类固醇例如糖皮质激素例如地塞米松。在另一个例子中，在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用之前5分钟施用皮质类固醇。在另一个例子中，在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用之前和之后都施用皮质类固醇。在这个例子中，在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用之前一至五分钟立即以及在抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用之后八小时施用皮质类固醇例如地塞米松。在另一个例子中，在透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用之前一小时以及在抗透明质酸剂例如聚乙二醇化的透明质酸降解酶施用之后八至十二小时施用皮质类固醇例如地塞米松。
考虑了任何给药方案，只要皮质类固醇的给药时间改善与透明质酸降解酶例如聚乙二醇化的透明质酸酶施用相关的一种或多种副作用。此外，皮质类固醇的剂量或给药方案不干扰或减少在本文提供的组合物和组合中的透明质酸降解酶或其他试剂的疗效，包括治疗癌症或实体瘤。
b.抗癌剂及其他治疗
本文提供的组合疗法可以单独或与其他抗癌剂进一步组合使用。抗癌剂和治疗可以是手术、放射、药物、化疗剂、多肽、抗体、肽、小分子或基因疗法载体、病毒或DNA。
可以在本文组合疗法施用之后、同时或之前施用的示例性抗癌剂包括但不限于阿西维辛；Avicin；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维甲酸(9-顺式视黄酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；阿伏西地；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；安曲霉素；阿帕齐醌；精美司那；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴诺蒽醌；巴他布林；巴马司他；活卡介苗(BCG Live)；贝那昔滨；苯达莫司汀；苯佐替哌；贝沙罗汀；贝伐珠单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；双奈法德；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡纽替尼；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀与聚苯丙生(Carmustines with Polifeprosans)；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；达依泊汀α；柔红霉素脂质体；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；地尼白介素-毒素连接物(DenileukinDiftitoxes)；右尼古地平；右奥马铂(Dexormaplatin)；右雷佐生；地扎呱宁；地吖醌；二溴螺氯铵(Dibrospidium)；地诺孕素；地那林(Dinalin)；地舍莫来；多西他赛；多非喹达；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射液；多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；艾特咔林；依氟鸟氨酸；依拉克达；依利奈法德；埃利奥溶液(Elliott's B Solution)；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；恩扎妥林；依匹哌啶；表柔比星；阿法依泊汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌氮芥；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；加柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/奥佐米星；吉罗酚；吉马替康；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；乙酸戈舍瑞林；羟基脲；替伊莫单抗免疫球蛋白(Ibritumomabs)/替伊莫单抗；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；吲地磺胺；英丙醌；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素-2及其他白介素(包括重组白介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；异丙铂；伊立替康；伊索拉定；伊沙匹隆；酮曲沙；L-阿拉诺新；兰瑞肽；拉帕替尼；来多蒽琼；来曲唑；甲酰四氢叶酸；亮丙立德；亮丙瑞林(Leuprorelides)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNU；洛莫司汀；氯那法尼；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美登素；氮芥(Mechlorethamine)；氮芥(Mechlorethamines)/氮芥(Nitrogen mustard)；乙酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；MelphalanslL-PAM；美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6-巯嘌呤；美司钠；美替辛德；氨甲蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨啶；美妥替哌；米铂；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；莫立替尼；麦考酚酸；苯丙酸诺龙；奈达铂；奈拉滨；奈莫柔比星；尼曲吖啶；诺考达唑；诺莫单抗；诺拉霉素；诺拉曲塞；诺托生琼；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；奥他赛；奥替拉西；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；帕米膦酸二钠(Pamidronate)；帕土匹龙(Patubilone)；培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；吡利曲索；培美曲塞；奈莫司汀(Pentamustines)；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；吡铂；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；匹蒽醌；普来曲塞；普卡霉素(Plicamycid)光神霉素；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟吩姆(Porfimer)；泊非霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴胼；普罗帕脒；螺丙醇(Prospidium)；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡唑呋林；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素；沙柔比星；沙芬戈；沙格司亭；沙铂；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；磷乙酰天冬氨酸(Sparfosate)；膦门冬酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；角鲨胺；链黑霉素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；硫鸟嘌呤(6-TG)；他地那兰；滑石；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；他立喹达；牛磺莫司汀；替可加兰(Tecogalan)；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；噻唑呋林；噻氯咪索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；托匹生琼；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743)；曲妥珠单抗；曲托龙；维甲酸/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；四硝酸三铂；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达；伐普肽；维替泊芬；长春花碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗辛；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；链黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；Zilascorb[2-H]；净司他丁；唑来膦酸盐；佐柔比星；和佐舒喹达，例如
阿地白介素(例如)；阿仑珠单抗(例如)；阿利维甲酸(例如)；别嘌呤醇(例如)；六甲蜜胺(例如)；氨磷汀(例如)；阿那曲唑(例如)；三氧化砷(例如)；天冬酰胺酶(例如)；活卡介苗(例如)；贝沙罗汀(例如)；贝伐单抗()；博来霉素(例如)；静脉注射白消安(例如)；口服白消安(例如)；卡普睾酮(例如)；卡培他滨(例如)；卡铂(例如)；卡莫司汀(例如 )；卡莫司汀与聚苯丙生(例如Wafer)；塞来考昔(例如)；苯丁酸氮芥(例如)；顺铂(例如)；克拉屈滨(例如)；环磷酰胺(例如 )；阿糖胞苷(例如)；阿糖胞苷脂质体(例如)；达卡巴嗪(例如DTIC-Dome)；更生霉素(例如)；达依泊汀α(例如)；柔红霉素脂质体(例如)；柔红霉素/道诺霉素(例如)；地尼白介素-毒素连接物(例如)；右雷佐生(例如)；多西他赛(例如)；多柔比星(例如)；多柔比星脂质体，包括盐酸多柔比星脂质体注射液(例如)；丙酸屈他雄酮(例如和注射液)；埃利奥溶液(例如Elliott's B)；表柔比星(例如)；阿法依泊汀(例如)；雌氮芥(例如)；磷酸依托泊苷(例如)；依托泊苷VP-16(例如)；依西美坦(例如)；非格司亭(例如)；氟尿苷(例如)；氟达拉滨(例如)；氟尿嘧啶包括5-FU(例如)；氟维司群(例如)；吉西他滨(例如)；吉妥珠单抗/奥佐米星(例如)；乙酸戈舍瑞林(例如)；羟基脲(例如)；替伊莫单抗免疫球蛋白/替伊莫单抗(例如)；伊达比星(例如)；异环磷酰胺(例如)；甲磺酸伊马替尼(例如)干扰素α-2a(例如)；干扰素α-2b(例如)；伊立替康(例如)；来曲唑(例如)；甲酰四氢叶酸(例如)；左旋咪唑(例如)；洛莫司汀/CCNU(例如)；氮芥/氮芥(例如)；乙酸甲地孕酮(例如)；美法仑/L-PAM(例如)；巯嘌呤，其中包括6-巯嘌呤(6-MPS；例如)；美司钠(例如)；氨甲喋呤；甲氧沙林(例如)；丝裂霉素C(例如)；米托坦(例如)；米托蒽醌(例如)；苯丙酸诺龙(例如)；诺莫单抗(例如)；奥普瑞白介素(例如)；奥沙利铂(例如)；紫杉醇(例如)；帕米膦酸二钠(例如)；培加酶(例如)；培门冬酶(例如)；培非司亭(例如)；喷司他丁(例如)；哌泊溴烷(例如)；普卡霉素/光神霉素(例如)；卟吩姆钠(例如)；丙卡巴肼(例如)；奎纳克林(例如)；拉布立酶(例如)；利妥昔单抗(例如)；沙格司亭(例如)；链佐星(例如)；苹果酸舒尼替尼(例如)；滑石(例如)；他莫西芬(例如)；替莫唑胺(例如)；替尼泊苷/VM-26(例如)；睾内酯(例如)；硫鸟嘌呤包括6-硫鸟嘌呤(6-TG)；噻替派(例如)；托泊替康(例如)；托瑞米芬(例如)；托西莫单抗(例如)；曲妥珠单抗(例如)；维甲酸/ATRA(例如)；尿嘧啶氮芥；戊柔比星(例如)；长春花碱(例如)；长春新碱(例如)；长春瑞滨(例如)；和唑来膦酸盐(例如)。
H.实施例
下述实施例仅为了举例说明性目的而包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1
PEGPH20和nab-紫杉醇组合治疗在人胰腺肿瘤异种移植物模型中的抗肿瘤效应
人胰腺癌异种移植物模型就PEGPH20组合纳米颗粒白蛋白结合的(nab)紫杉醇的抗肿瘤效应进行评估。
来自BxPC3胰腺癌细胞系(美国典型培养物中心(ATCC)CRL-1687)的肿瘤细胞生长至大约80％汇合，胰蛋白酶消化，收集，在HBSS(汉克氏平衡盐溶液，Mediatech Inc.)中洗涤一次。在温育前，细胞用无菌HBSS洗涤两次，使用经由台盼蓝排除测定细胞浓度和活力的Nexcelom Cellometer(Nexcelom Bioscience；Lawrence，MA)自动化计数装置进行计数，并且在接种动物之前在冰上用HBSS稀释至1x 108细胞/mL的浓度。大约6周龄的雄性裸鼠(无胸腺NCr nu/nu小鼠，Taconic Laboratories，Inc.)在左后肢中胫骨周(邻近胫骨骨膜)用0.05mL细胞悬浮液肌内(IM)接种。动物中的肿瘤每周评价两次，并且允许生长至大约350-400mm3的平均肿瘤体积。使用VisualSonics Vevo 770高分辨率超声(VisulaSonics Inc.；Toronto，Ontario，加拿大)测定实际肿瘤体积。
将荷瘤动物分组成8只动物/组的8个处理组，并且用下述静脉内处理：1)媒介物(API缓冲液；2)PEGPH20(4.5mg/kg)；3)nab-紫杉醇(3mg/kg；低剂量)；4)nab-紫杉醇(10mg/kg；中等剂量)；5)nab-紫杉醇(30mg/kg；高剂量)；6)PEGPH20(4.5mg/kg)+nab-紫杉醇(3mg/kg)；7)PEGPH20(4.5mg/kg)+nab-紫杉醇(10mg/kg)；或8)PEGPH20(4.5mg/kg)+nab-紫杉醇(30mg/kg)。PEGPH20和nab-紫杉醇分开施用。首先施用PEGPH20，随后立即施用nab-紫杉醇。处理的剂量和频率为每3天，总共6次注射，在第0天时开始使用0.1mL/25g小鼠的剂量体积，或4.0mL/kg(即第0、3、6、9、12、15天)。
所有小鼠的肿瘤体积均通过使用VisualSonics超声系统捕获图像每周测量2次。使用3D模型成像软件程序(v 3.0.0)计算肿瘤体积。肿瘤生长抑制百分比(％TGI)通过下式进行计算：
[1-(Tn-T0)/(Cn-C0)]x 100％
在上式中，Tn是在处理后的所示时间点的各自天数“n”时，在处理组中的平均肿瘤体积；T0是在处理前的第0天时，在处理组中的平均肿瘤体积；Cn是在用媒介物处理后的所示时间点的各自天数“n”时，在对照组中的平均肿瘤体积；并且C0是在处理前的第0天时在对照组中的平均肿瘤体积。
结果在图1中描述。结果显示高和中等剂量的nab-紫杉醇抑制肿瘤生长，这在PEGPH20的存在下得到增强。例如，在其中测量肿瘤体积的最后一个时间点，与媒介物对照相比较，中等至高剂量的nab-紫杉醇(10mg/kg和30mg/kg)分别使肿瘤生长抑制62％(p<0.01)和74％(p<0.01)。在PEGPH20的存在下，关于nab-紫杉醇的10mg/kg剂量处理组的肿瘤生长抑制增加至72％(p<0.01)，并且对于nab-紫杉醇的30mg/kg剂量处理组增加至91％(p<0.01)。对于中等nab-紫杉醇剂量，PEGPH20介导功效19％增加，对于高nab-紫杉醇剂量为26％。在PEGPH20的存在或不存在下，在用4.5mg/mgPEGPH20处理的组中或在用3mg/kg低剂量nab-紫杉醇处理的组中，未观察到实质肿瘤生长抑制。
实施例2
PEGPH20、nab-紫杉醇和吉西他滨组合治疗在人胰腺肿瘤异种移植物模型中的抗肿瘤效应
A.肿瘤生长抑制
实施例1中所述的人胰腺癌异种移植物模型用于评估与吉西他滨处理进一步组合的PEGPH20和nab-紫杉醇组合疗法的抗肿瘤效应。在进行研究之前，基于选择吉西他滨的途径和剂量水平。为此，将荷瘤小鼠用不同剂量的吉西他滨(60mg/kg、120mg/kg、180mg/kg和240mg/kg)每周处理一次，共21天(第0、7、14和21天)并且如上所述监控肿瘤体积。结果在图2中描述。结果显示与仅媒介物相比较，吉西他滨在测试的所有剂量均抑制肿瘤生长。选择亚最佳剂量180mg/kg用于后续PEGPH20组合化疗研究中。选择吉西他滨和nab-紫杉醇的亚最佳剂量以评估组合下述三种抗癌剂的潜在益处：PEGPH20、吉西他滨和nab-紫杉醇。
将荷瘤动物分组成12只动物/组的8个处理组并且用下述处理：1)媒介物(API缓冲液)；2)PEGPH20(4.5mg/kg)；3)nab-紫杉醇(10mg/kg)；4)吉西他滨(180mg/kg)；5)PEGPH20(4.5mg/kg)+nab-紫杉醇(10mg/kg)；6)PEGPH20(4.5mg/kg)+吉西他滨(180mg/kg)；7)nab-紫杉醇(10mg/kg)+吉西他滨(180mg/kg)；或8)PEGPH20(4.5mg/kg)+nab-紫杉醇(10mg/kg)+吉西他滨(180mg/kg)。PEGPH20和nab-紫杉醇静脉内施用并且剂量和处理频率为每周2次(2x/wk)，共四周剂量周期。吉西他滨在PEGPH20和/或nab-紫杉醇之后24小时腹膜内施用，每7天，共三周剂量周期。根据测试组，在四周周期中试剂施用的给药时间表在表5中示出。
如实施例1中所述测定肿瘤体积和肿瘤生长抑制。结果在图3中描述。结果显示单独的吉西他滨、单独的PEGPH20和PEGPH20+吉西他滨显示出一些抗肿瘤活性，但抗肿瘤效应在含有nab-紫杉醇的疗法中大得多，其中最大的抗肿瘤效应在用PEGPH20、nab-紫杉醇和吉西他滨处理的动物中显示出。表6描述了相对于如由在第26天时的肿瘤体积测量测定的，作为相对于媒介物的生长抑制百分比的结果。结果显示用PEGPH20处理动物加上用nab-紫杉醇和吉西他滨处理导致相对于媒介物的81％肿瘤生长抑制，而不含PEGPH20的nab-紫杉醇和吉西他滨处理仅导致66％肿瘤生长抑制。因此，结果显示PEGPH20加上nab-紫杉醇和吉西他滨组合疗法导致功效增加23％。
B.中值存活时间
在如部分A中所示的前四周给药周期后，将给药周期重复两次，并且在一段时间内跟踪存活终点时间。简言之，在每个给药周期中，将动物用媒介物或PEGPH20(4.5mg/mL)连同或不连同nab-紫杉醇(10mg/kg)静脉内每周处理两次，共四周。在每个周期中，接受吉西他滨的组在PEGPH20和/或nab-紫杉醇之后24小时施用吉西他滨(180mg/kg)，每7天，共剂量周期的三周。存活终点时间，动物存活的替代物，定义为(a)肿瘤体积大于2000mm3的时间，(b)大于20％体重丧失的时间，或(c)动物胁迫或死亡的时间。
结果在图4和表7中示出。结果显示仅用吉西他滨处理的动物的中值存活终点时间为38天，用nab-紫杉醇和吉西他滨处理的动物为52天，用PEGPH20、nab-紫杉醇和吉西他滨处理的动物为68天。因此，结果显示与任何其他处理相比较，用nab-紫杉醇和吉西他滨处理添加PEGPH20增加中值存活时间，其中与用不含PEGPH20的nab-紫杉醇和吉西他滨处理相比较，功效增加31％，与仅用吉西他滨处理相比较功效增加79％。
*相对于媒介物(p＜0.0001)
≠相对于nab-紫杉醇+吉西他滨(p＝0.0008)
C.肿瘤生物标记的测量
测试与胰腺癌相关的生物标记碳水化合物抗原(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)以测量治疗应答。动物如部分A中所述进行处理。在第一个给药周期的第0、6、13和20天，从每组的卫星动物(satellite animal)(n≤3)中收集血清。使用CA 19-9ELISA试剂盒(目录号CA199T，Calbiotech，Spring Valley，CA)测量人CA19-9并使用CEA ELISA试剂盒(目录号CE062T，Calbiotech，Spring Valley，CA)测量CEA肿瘤抗原。
结果在图5中示出。结果显示PEGPH20处理的存在导致所有处理组中测量标记的减少。例如，在第20天，检测到的CA19-9标记水平在用PEGPH20处理的所有组中是相似的，范围为大约40-60U/mL。相比之下，在用nab-紫杉醇或nab-紫杉醇+吉西他滨处理的动物中的CA19-9标记水平是还用PEGPH20处理的动物的大约两倍，为大约110U/mL。仅用吉西他滨处理的动物显示出大约类似于仅媒介物对照的CA19-9水平。因此，结果显示与仅用nab-紫杉醇处理的动物相比较，用PEGPH20+nab-紫杉醇处理的动物具有减少的CA19-9水平；与仅用吉西他滨处理的动物相比较，用PEGPH20+吉西他滨处理的动物具有减少的CA19-9水平；与仅用nab-紫杉醇+吉西他滨处理的动物相比较，用PEGPH20+nab-紫杉醇+吉西他滨处理的动物具有减少的CA19-9水平。对于用PEGPH20+nab-紫杉醇+吉西他滨处理的动物，与在不存在PEGPH20的情况下，与用nab-紫杉醇+吉西他滨处理的动物相比较，CA19-9减少49％。
当测量CEA标记时，结果是相似的。使用这种标记，结果显示与媒介物对照相比较，CEA水平在仅用nab-紫杉醇处理的动物中在第20天时基本上不改变，因为CEA在这些组中测量为大约20-25ng/mL。在用吉西他滨或nab-紫杉醇+吉西他滨处理的动物中，在第20天时测量的CEA标记中存在至大约15ng/mL的一些减少。在PEGPH20存在下，与不含PEGPH20的处理组相比较，测量的标记水平相当大地减少。例如，在仅用PEGPH20处理的动物中，在第20天时测量的CEA为大约7-8ng/mL。在用PEGPH20+吉西他滨、PEGPH20+nab-紫杉醇、或PEGPH20+nab-紫杉醇+吉西他滨处理的动物中，在第20天时的CEA水平太低而无法通过ELISA定量。
实施例3
rHuPH20表达细胞系
A.初始可溶性rHuPH20表达细胞系的生成
用HZ24质粒(SEQ ID NO：52所示)转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体含有pCI载体主链(Promega)、编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482的DNA(SEQ ID NO:49)、来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体主链还包括编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区(CMV)、嵌合内含子和SV40晚期多腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA含有在编码人PH20的天然35氨基酸信号序列的氨基酸位置1处的甲硫氨酸的DNA之前的NheI位点和Kozak共有序列和在编码对应于SEQ ID NO:1)所示的人PH20透明质酸酶的氨基酸位置482的酪氨酸的DNA后的终止密码子，随后为BamHI限制位点。因此，构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)导致由CMV启动子驱动的单一mRNA种类，其编码由内部核糖体进入位点(IRES)分开的人PH20的氨基酸1-482(SEQ ID NO:3所示)和小鼠二氢叶酸还原酶的氨基酸1-186(SEQ ID NO:53所示)。
在补充有4mM谷氨酰胺和18ml/L Pluronic F68/L(Gibco)，用于DHFR(-)细胞的GIBCO Modified CD-CHO培养基中生长的未经转染的CHO细胞以0.5x 106细胞/ml种植到摇瓶中制备用于转染。细胞在37℃下在5％CO2中在加湿培养箱中生长，以120rpm振荡。指数生长的未经转染的CHO细胞在转染前就活力进行测试。
将未经转染的CHO细胞培养的60,000,000活细胞形成团块并且在0.7mL 2x转染缓冲液(2x HeBS：40mM Hepes，pH 7.0、274mM NaCl、10mMKCl、1.4mM Na2HPO4、12mM右旋糖)中重悬浮至2×107细胞的密度。向重悬浮细胞的每个等分试样中加入0.09mL(250μg)线性HZ24质粒(通过用Cla I(New England Biolabs)过夜消化线性化)，并且在室温下将细胞/DNA溶液转移到0.4cm间隙BTX(Gentronics)电穿孔小杯内。用不与细胞混合的质粒DNA进行阴性对照电穿孔。细胞/质粒混合物用330V和960μF或350V和960μF的电容放电进行电穿孔。
在电穿孔后从小杯中取出细胞且转移到补充有4mM谷氨酰胺和18ml/L Pluronic F68/L(Gibco)，用于DHFR(-)细胞的5mL Modified CD-CHO培养基内，允许在6孔组织培养板的孔中生长，无需在37℃下在5％CO2中在加湿培养箱中选择2天。
电穿孔后两天，从每个孔中取出0.5mL组织培养基并且使用实施例6中所述的微浊度测定法测试透明质酸酶活性的存在。从组织培养孔中收集表达最高水平的透明质酸活性的细胞，计数且稀释至1×104-2×104活细胞/mL。将0.1mL细胞悬液等分试样转移到五块96孔圆底组织培养板的每个孔内。将含有4mM GlutaMAXTM-1补充物(GIBCOTM，Invitrogen Corporation)且不含次黄嘌呤和胸苷补充物的一百微升CD-CHO培养基(GIBCO)加入含有细胞的孔中(终体积0.2mL)。
由不含氨甲蝶呤生长的5块平板鉴定十个克隆。这些HZ24克隆中的六个在培养中扩增且作为单细胞悬液转移到摇瓶内。使用二维无限稀释策略，将克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10铺平板到96孔圆底组织培养板内，其中细胞沿着平板1:2稀释，跨越平板1:3稀释，以在左上角孔中的5000个细胞开始。稀释的克隆在500个未经转染的DG44CHO细胞/孔的背景下生长，以提供培养中的最初日子的必需生长因子。每个亚克隆制备十块平板，其中5块平板含有50nM氨甲蝶呤，5块平板不含氨甲蝶呤。
克隆3D3产生24个可见亚克隆(13个来自无氨甲蝶呤处理，11个来自50nM氨甲蝶呤处理)。在来自24个亚克隆的8个的上清液中测量显著透明质酸酶活性(>50单位/mL)，这8个亚克隆扩增到T-25组织培养瓶内。从氨甲蝶呤处理方案分离的克隆在50nM氨甲蝶呤的存在下扩增。克隆3D35M在摇瓶中的500nM氨甲蝶呤中进一步扩增，并且产生多于1,000单位/ml透明质酸酶活性的克隆(克隆3D35M；或Gen13D35M)。随后制备3D35M细胞的主细胞库(MCB)。
B.表达可溶性rHuPH20的第二代细胞系的生成
使实施例3A中所述的Gen13D35M细胞系适应更高的氨甲蝶呤水平，以产生2代(Gen2)克隆。3D35M细胞由建立的含氨甲蝶呤培养物种植到含有4mM GlutaMAX-1TM和1.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基内。通过使细胞在37℃、7％CO2加湿培养基中经过46天的时期生长且传代9次，使细胞适应更高的氨甲蝶呤水平。扩增的细胞群通过在96孔组织培养板中的有限稀释克隆出来，所述组织培养板具有含2.0μM氨甲蝶呤的培养基。在约4周后，鉴定克隆并且选择克隆3E10B用于扩增。3E10B细胞在含有4mMGlutaMAX-1TM和2.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基中生长20代。制备3E10B细胞系的主细胞库(MCB)并且冷冻用于后续研究。
通过在含有4mM GlutaMAX-1TM和4.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基中培养3E10B细胞，继续细胞系的扩增。在第12次传代后，将细胞在小瓶中冷冻作为研究细胞库(RCB)。将一个RCB小瓶解冻且在含有8.0μM氨甲蝶呤的培养基中培养。在5天后，将培养基中的氨甲蝶呤浓度增至16.0μM，随后18天后增至20.0μM。来自在含有20.0μM氨甲蝶呤的培养基中的第8次传代的细胞通过在96孔组织培养板中的有限稀释克隆出来，所述组织培养板具有含4mM GlutaMAX-1TM和20.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基。5-6周后鉴定克隆，并且选择克隆2B2用于在含有20.0μM氨甲蝶呤的培养基中扩增。第11次传代后，将2B2细胞在小瓶中冷冻作为研究细胞库(RCB)。
所得到的2B2细胞是二氢叶酸还原酶缺陷型(dhfr-)DG44CHO细胞，其表达可溶性重组人PH20(rHuPH20)。可溶性PH20以约206个拷贝/细胞的拷贝数存在于2B2细胞中。使用rHuPH20特异性探针的Spe I-、Xba I-和BamH I/Hind III消化的基因组2B2细胞DNA的DNA印迹分析揭示下述限制性消化谱：～7.7kb的一个主要杂交条带和四个次要杂交条带(～13.9、～6.6、～5.7和～4.6kb)，其中DNA用Spe I消化；～5.0kb的一个主要杂交条带和两个次要杂交条带(～13.9和～6.5kb)，其中DNA用Xba I消化；和使用由BamH I/Hind III消化的2B2DNA观察到的～1.4kb的一个单一杂交条带。mRNA转录物的序列分析指出衍生的cDNA(SEQ ID NO:56)等同于参考序列(SEQ ID NO:49)，除了在第1131处的一个碱基对差异外，这观察为胸苷(T)而不是预期的胞嘧啶(C)。这是沉默突变，对氨基酸序列没有作用。
实施例4
rHuPH20的产生和纯化
A.在300L生物反应器细胞培养中生产Gen2可溶性rHuPH20
将HZ24-2B2细胞(实施例3B)小瓶解冻并且在补充有20μM氨甲蝶呤和GlutaMAX-1TM(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中通过36L旋转瓶进行摇瓶扩增。简言之，将细胞小瓶在37℃水浴中解冻，加入培养基且将细胞离心。将细胞重悬浮于具有20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中，置于37℃、7％CO2培养箱中。细胞在125mL摇瓶中扩增直到40mL。当细胞密度达到大于1.5x 106细胞/mL时，将培养物扩增到以100mL培养体积的125mL旋转瓶内。烧瓶在37℃、7％CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x 106细胞/mL时，将培养物扩增到以200mL培养体积的250mL旋转瓶内，并且将烧瓶在37℃、7％CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增到以800mL培养体积的1L旋转瓶内，并且在37℃、7％CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x 106细胞/mL时，将培养物扩增到以5000mL培养体积的6L旋转瓶内，并且在37℃、7％CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x 106细胞/mL时，将培养物扩增到以32L培养体积的36L旋转瓶内，并且在37℃、7％CO2下温育。
将400L反应器灭菌，并且加入230mL CD-CHO培养基。在使用前，就污染检查反应器。以4.0×105活细胞/ml的接种密度和260L的总体积，将约30L细胞从36L旋转瓶转移到400L生物反应器(Braun)。参数为温度设定点：37℃；叶轮速度40-55RPM；器皿压力：3psi；空气喷洒0.5-1.5L/分钟；空气覆盖：3L/分钟。反应器每天取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质生产和保留。此外，在运行过程中加入营养素补料。在120小时(第5天)，加入10.4L补料#1培养基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L Glutamax-1TM+83mL/L酵母自溶液+33mg/L rHuInsulin)。在168小时(第7天)，加入10.8L补料#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L Glutamax-1TM+167mL/L酵母自溶液+0.92g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为36.5℃。在216小时(第9天)，加入10.8L补料#3(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母自溶液+1.80g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为36℃。在264小时(第11天)，加入10.8L补料#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母自溶液+0.92g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为35.5℃。观察到补料培养基的添加显著增强生产终末期中的可溶性rHuPH20生产。在14或15天时，或当细胞生存下降低于40％时，收获反应器。该过程导致17,000单位/ml的最终生产力，具有12,000,000细胞/mL的最大细胞密度。在收获时，将培养物取样用于支原体、生物负荷量、内毒素和体外和体内病毒、透射电子显微镜(TEM)和酶活性。
培养物通过蠕动泵抽泵通过四个平行的Millistak过滤系统模块(Millipore)，其各自含有分级至4-8μm的硅藻土层和分级至1.4-1.1μm的硅藻土层，随后为纤维素膜，随后通过第二个单一Millistak过滤系统(Millipore)，其含有分级至0.4-0.11μm的硅藻土层和分级至<0.1μm的硅藻土层，随后为纤维素膜，并且随后通过0.22μm最终滤器进入具有350L容量的无菌单次使用的弹性袋。收获的细胞培养流体补充有10mM EDTA和10mM Tris至pH 7.5。将培养物用切向流过滤(TFF)仪器浓缩10×，使用四个Sartoslice TFF 30kDa分子量截断(MWCO)聚醚砜(PES)滤器(Sartorius)，随后通过用10mM Tris、20mM Na2SO4，pH 7.5的10×缓冲液交换到0.22μm最终滤器内进入50L无菌贮存袋。
浓缩的渗滤收获物就病毒进行灭活。在病毒灭活前，制备10％TritonX-100、3％三(正丁基)磷酸盐(TNBP)溶液。在Q柱上纯化前立即使浓缩的渗滤收获物暴露于在36L玻璃反应器中的1％Triton X-100、0.3％TNBP共1小时。
B.Gen2可溶性rHuPH20的纯化
制备Q琼脂糖(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂、H＝29cm、D＝20cm)。收集洗涤样品用于测定pH、传导性和内毒素(LAL)测定法。将柱用5柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4，pH 7.5平衡。在病毒灭活后，将浓缩的渗滤收获物(实施例4A)以100cm/小时的流速装载到Q柱上。将柱用5柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4，pH 7.5和10mM Hepes、50mM NaCl，pH 7.0.洗涤。蛋白质用10mM Hepes、400mM NaCl，pH 7.0洗脱到0.22μm最终滤器内进入无菌袋。洗脱物样品就生物负荷、蛋白质浓度和透明质酸酶活性进行测试。在更换开始和结束时获得A280吸光度读数。
接下来进行苯基-琼脂糖(Pharmacia)疏水作用色谱法。制备苯基-琼脂糖(PS)柱(19-21L树脂，H＝29cm，D＝30cm)。收集洗涤液且取样用于pH、传导性和内毒素(LAL测定法)。将柱用5柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2，pH 7.0平衡。来自Q琼脂糖柱的蛋白质洗脱物补充有2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl2原液以分别获得5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。将蛋白质以100cm/小时的流速装载到PS柱上，并且收集柱流通物。将柱用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2pH 7.0以100cm/小时洗涤并且将洗涤液加入收集的流通物。与柱洗涤液合并，使流通物流经0.22μm最终滤器进入无菌袋内。将流通物取样用于生物负荷、蛋白质浓度和酶活性。
制备氨基苯基硼酸盐柱(ProMedics)。收集洗涤液且取样用于pH、传导性和内毒素(LAL测定法)。将柱用5柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡。将含有纯化蛋白质的PS流通物以100cm/小时的流速装载到氨基苯基硼酸盐柱上。将柱用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤。将柱用20mM N-二羟乙基甘氨酸、0.5M硫酸铵，pH 9.0洗涤。将柱用20mM N-二羟乙基甘氨酸、100mM氯化钠，pH 9.0洗涤。将蛋白质用50mM Hepes、100mM NaCl，pH 6.9洗脱并且流经无菌滤器进入无菌袋内。洗脱样品就生物负荷、蛋白质浓度和酶活性进行测试。
制备羟磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液且测试pH、传导性和内毒素(LAL测定法)。将柱用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl2，pH7.0平衡。将氨基苯基硼酸盐纯化的蛋白质补充至5mM磷酸钾和0.1mMCaCl2的终浓度，并且以100cm/小时的流速装载到HAP柱上。将柱用5mM磷酸钾，pH 7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗涤。接下来将柱用10mM磷酸钾，pH 7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗涤。将蛋白质用70mM磷酸钾，pH 7.0洗脱且流经0.22μm无菌滤器进入无菌袋。洗脱样品就生物负荷量、蛋白质浓度和酶活性进行测试。
HAP纯化的蛋白质随后流经病毒去除滤器。首先通过用2L 70mM磷酸钾，pH 7.0洗涤制备无菌Viosart滤器(Sartorius)。在使用前，将过滤的缓冲液取样用于pH和传导性。HAP纯化的蛋白质随后经由蠕动泵抽泵通过20nM病毒去除滤器。在70mM磷酸钾，pH 7.0中的过滤蛋白质流经0.22μm最终滤器进入无菌袋。病毒过滤的样品就蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸谱进行测试。样品还就过程相关杂质进行测试。
实施例5
聚乙二醇化的rHuPH20的制备
在这个实施例中，rHuPH20通过使该酶与甲氧基聚(乙二醇)丁酸的线性N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-SBA-30K)反应进行聚乙二醇化。
A.mPEG-SBA-30K的制备
为了生成PEGPH20，使rHuPH20(其大小为大约60KDa)与具有30kDa近似分子量的甲氧基聚(乙二醇)丁酸的线性N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-SBA-30K)共价缀合。mPEG-SBA的结构在下文显示，其中n≈681。
用于制备用于使rHuPH20聚乙二醇化的mPEG-SBA-30K的方法例如在美国专利号5,672,662中描述。简言之，根据下述操作制备mPEG-SBA-30K：
使溶解于二噁烷中的丙二酸乙酯(2当量)溶液在氮气下逐滴地加入氢化钠(2当量)和甲苯中。使mPEG甲烷磺酸酯(1当量，MW 30kDa，Shearwater)溶解于甲苯中并加入上述混合物中。使所得到的混合物回流大约18小时。使反应混合物浓缩至其原始体积的一半，用10％NaCl水溶液提取，用1％含水盐酸提取，并且组合水性提取物。用二氯甲烷(3x)提取收集的水层并且用硫酸镁干燥有机层，过滤并蒸发至干燥。使所得到的残渣溶解于含有氯化钠的1N氢氧化钠中并且将混合物搅拌1小时。通过添加6N盐酸使混合物的pH调整至大约3。用二氯甲烷(2x)提取混合物。
使有机层在硫酸镁上干燥，过滤，浓缩，并且倾入冷二乙醚内。通过过滤收集沉淀物并在真空下干燥。使所得到的化合物溶解于二噁烷中并回流8小时并且随后浓缩至干燥。使所得到的残渣溶解于水中并且用二氯甲烷(2x)提取，在硫酸镁上干燥，并且溶液通过旋转蒸发进行浓缩并随后倾入冷二乙醚内。通过过滤收集沉淀物并在真空下干燥。使所得到的化合物(1当量)溶解于二氯甲烷中并且加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.1当量)。使溶液冷却至0℃并且逐滴加入溶于二氯甲烷的二环己基碳二亚胺(2.1当量)溶液。将溶液在室温下搅拌大约18小时。将反应混合物过滤，浓缩并在二乙醚中沉淀。将沉淀物通过过滤收集并在真空下干燥以提供随后在≤-15℃下冷冻的粉末mPEG-SBA-30K。
B.mPEG-SBA-30K与rHuPH20的缀合
为了制备PEGPH20，通过共价缀合使mPEG-SBA-30K与rHuPH20的氨基偶联，提供在rHuPH20和mPEG之间稳定的酰胺键，如下所示，其中n≈681。
在缀合前，使用具有0.2m2过滤面积的10kDa聚醚砜(PES)切向流过滤(TFF)药筒(Sartorius)，使实施例4B中制备的rHuPH20纯化的大量蛋白质浓缩至10mg/mL，并且针对以pH 7.2的70mM磷酸钾缓冲液交换。随后将浓缩的蛋白质贮存于2-8℃下直至使用。
为了缀合rHuPH20，使mPEG-SBA-30K(Nektar)在室温下在黑暗中解冻不长于2小时。取决于批次大小，将无菌3”搅拌棒置于1或3升锥形瓶内，并且加入缓冲液交换的rHuPH20蛋白质。在真空罩下将五克mPEG-SBA-30K干粉/克rHuPH20(mPEG-SBA-30K:rHuPH20的10:1摩尔比)加入烧瓶中并且将混合物混合10分钟或直至mPEG-SBA-30K完全溶解。搅拌速率这样设置，从而使得发生涡旋而不发沫。
随后通过经由蠕动泵使溶液抽泵经过0.22μm聚苯乙烯、乙酸纤维素过滤胶囊(Corning 50mL Tubetop滤器)，在100级罩中使溶液过滤到新的含有无菌3”搅拌棒的1或3升锥形瓶内。通过质量(1g/mL密度)测定PEGPH20反应混合物的体积并且在使用后完整性测试中检查用于过滤的0.22μm滤器。
随后将混合物置于在2-8℃下的搅拌板上并且在黑暗中混合20±1小时。再次设置搅拌速率，从而使得发生涡旋而不发沫。将整个锥形瓶容器包裹在箔中以使溶液避光。在混合后，通过添加1M甘氨酸至25mM终浓度猝灭反应。从容器中取出样品以测试pH和电导率。随后通过加入5mM Tris碱(5.65L/L)和5mM Tris，10mM NaCl，pH 8.0(13.35L/L)溶液调整pH和电导率以进行至Q Sepharose纯化。
通过用5柱体积(36L)的5mM Tris，10mM NaCl，pH 8.0平衡来制备QFF Sepharose(GE Healthcare)离子交换柱(高度＝21.5-24.0cm，直径＝20cm)。将缀合的产物以95cm/小时的流速装载到QFF柱上。随后用11L平衡缓冲液(5mM Tris，10mM NaCl，pH 8.0)以95cm/小时的流速洗涤柱，随后为用25L平衡缓冲液以268cm/小时的流速洗涤。随后用5mM Tris，130mMNaCl，pH 8.0以268cm/小时的流速洗脱蛋白质产物。使用具有0.2m2过滤面积的30kDa聚醚砜(PES)切向流过滤(TFF)药筒(Sartorius)，使所得到的纯化的PEGPH20浓缩至3.5mg/mL，并且针对pH6.5的10mM组氨酸、130mMNaCl进行缓冲液交换。所得到的材料如下文实施例6中所述就酶活性进行测试。使3mL体积的浓度为3.5mg/mL(最终酶活性140,000U/mL)的聚乙二醇化的rHuPH20材料填充到具有硅化处理的溴化丁基橡胶塞和铝翻转密封的5mL玻璃小瓶内，并且冷冻(在-80℃冰箱中冷冻过夜，随后置于-20℃冰箱用于更长期贮存)。聚乙二醇化的rHuHP20含有大约4.5摩尔PEG/摩尔rHuHP20。
实施例6
可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的测定
使用微浊度测定法或生物素化的透明质酸底物测定法，测定在样品例如细胞培养物、血浆、纯化级分和纯化溶液中的可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性，所述微浊度测定法基于当透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀物，所述生物素化的透明质酸底物测定法通过消化与塑料多孔微量滴定板非共价结合的生物素化的透明质酸(b-HA)底物来测量酶促活性的rHuPH20或PEGPH20的量。
A.微浊度测定法
通过使可溶性rHuPH20与透明质酸钠(透明质酸)一起温育设定时间段(10分钟)且随后通过添加酸化血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠，测量可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性。在30分钟发展期后，在640nm处测量所得到的样品的浊度。起因于对透明质酸钠底物的酶活性的浊度降低是可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的量度。该方法使用由可溶性rHuPH20测定法工作参考标准的稀释生成的校准曲线执行，并且相对于这个校准曲线作出样品活性测量。
样品的稀释在酶稀释溶液中制备。酶稀释溶液通过下述进行制备：将33.0±0.05mg水解明胶溶解于25.0mL 50mM PIPES反应缓冲液(140mMNaCl、50mM PIPES，pH 5.5)和25.0mL无菌注射用水(SWFI)，并且将0.2mL25％正常人血清蛋白(Buminate)溶液稀释到混合物内且涡旋30秒。这在使用2小时内执行且贮存在冰上直至需要时。将样品稀释至估计的1-2U/mL。一般地，每个步骤最大稀释度不超过1:100，并且第一个稀释度的最初样品大小不小于20μL。执行测定法所需的最小样品体积如下：过程中样品，FPLC馏分：80μL；组织培养上清液：1mL；浓缩材料80μL；纯化或最终步骤材料：80μL。稀释在低蛋白质结合96孔板中一式三份进行，并且将30μL每个稀释度转移到Optilux黑色/透明底部平板(BD BioSciences)。
在酶稀释溶液中制备具有2.5U/mL浓度的已知可溶性rHuPH20稀释度以生成标准曲线，且一式三份加入Optilux平板。稀释度包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL和2.5U/mL。在平板中包括含有60μL酶稀释溶液的“试剂空白”孔作为阴性对照。随后将平板覆盖且在加热块上在37℃下加温5分钟。去除覆盖且将平板振荡10秒。在振荡后，将平板送回加热块，并且用加温的0.25mg/mL透明质酸钠溶液(通过将100mg透明质酸钠(LifeCore Biomedical)溶解于20.0mL SWFI中制备。通过在2-8℃下轻轻转动和/或振动2-4小时或直至完全溶解将这混合)引发MULTIDROP 384液体处理设备。将反应板转移到MULTIDROP 384并且通过按压起始键将30μL透明质酸钠分配到每个孔内来开始反应。随后从MULTIDROP 384中取出平板且在转移到加热块前振荡10秒，其中置换平板覆盖。将平板在37℃下温育10分钟。
通过用血清工作溶液引发机器并且将体积设置变为240μL，制备MULTIDROP 384以停止反应。(在75mL 500mM乙酸盐缓冲溶液中的25mL血清原液[1体积马血清(Sigma)用9体积500mM乙酸盐缓冲溶液稀释，并且用盐酸将pH调整至3.1])。从加热块中取出平板并且置于MULTIDROP 384上，并且将240μL血清工作溶液分配到孔内。将平板取出且在板阅读器上振荡10秒。在进一步的15分钟后，在640nm处测量样品的浊度，并且通过与标准曲线拟合测定每种样品的透明质酸酶活性(以U/mL表示)。
通过将透明质酸酶活性(U/mL)除以蛋白质浓度(mg/mL)计算比活性(单位/mg)。
B.生物素化的透明质酸测定法
通过消化与塑料多孔微量滴定板非共价结合的大分子量(～1.2兆道尔顿)生物素化的透明质酸(b-HA)底物，生物素化的透明质酸测定法测量生物学样品中酶促活性的rHuPH20或PEGPH20的量。允许标准和样品中的rHuPH20或PEGPH20在37℃下在由b-HA包被的板中温育。在一系列洗涤后，用链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物酶缀合物(SA-HRP)处理剩余未切割的/结合的b-HA(SA-HRP)。在固定的SA-HRP和生色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)之间的反应产生蓝色溶液。在用酸停止反应后，通过使用微量滴定板分光光度计阅读在450nm处的吸光度，测定可溶性黄色反应产物的形成。起因于对生物素化的透明质酸(b-HA)底物的酶活性，在450nm处吸光度的降低是可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的量度。该方法使用由可溶性rHuPH20或PEGPH20参考标准的稀释生成的校准曲线进行，并且相对于这个校准曲线进行样品活性测量。
样品和校准物的稀释在测定法稀释液中进行制备。通过将1％v/v混合血浆(来自适当种类)加入在HEPES，pH 7.4中的0.1％(w/v)BSA制备测定法稀释液。这每天制备并贮存于2-8℃下。取决于物种类型以及预期的透明质酸酶水平，制备单一或多个稀释度以确保至少一个样品稀释度将落入校准曲线的范围内。为了指导测试样品稀释度的选择，关于施用的透明质酸酶剂量、施用途径、物种的大约血浆体积和时间点已知的信息用于估计透明质酸酶活性水平。每个样品稀释度在其制备时通过短暂脉冲涡旋进行混合并且在每次稀释之间更换吸管尖端。一般而言，稀释以最初50或100倍稀释开始，随后为另外的系列稀释。制备rHuPH20或PEGPH20的七点校准曲线(取决于施用的处理)，对于rHuPH20浓度范围为0.004-3.0U/mL，对于PEGPH20浓度范围为0.037-27U/mL。将一百微升(100μL)每个测试样品稀释度和校准曲线点施加于96孔微量滴定板(Immulon 4HBX，Thermo)的一式三份孔，所述96孔微量滴定板先前已用100μL/孔的b-HA以0.1mg/mL包被并且用在PBS中的250μL 1.0％(w/v)牛血清白蛋白封闭。平板用粘性平板密封覆盖并在37℃下温育大约90分钟。在温育期结束时，从平板去除粘性密封，抽吸样品并且使用自动化平板洗涤器(BioTek ELx405Select CW，程序‘4HBX1’)将平板用300μL/孔洗涤缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液、2.7mM氯化钾、137mM氯化钠，pH 7.4，具有0.05％(v/v)Tween 20，PBST)洗涤五(5)次。每孔加入一百微升链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物工作溶液[在20mM Tris-HCl、137mM氯化钠、0.025％(v/v)Tween 20、0.1％(w/v)牛血清白蛋白中的链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物(1:5,000v/v)]。使平板密封并允许在环境温度下温育大约60分钟，不伴随振荡并避光。在温育期结束时，从平板去除粘性密封，抽吸样品并且如上所述将平板用300μL/孔洗涤缓冲液洗涤五(5)次。将TMB溶液(在环境温度下)加入每个孔中并且允许在室温下避光温育大约五(5)分钟。TMB停止溶液(KPL，目录#50-85-06)随后以100μL/孔加入。使用微量滴定板分光光度计测定每个孔在450nm处的吸光度。使用4参数逻辑曲线拟合建模在每块平板上的校准曲线应答。通过由校准曲线内插计算每个未知的透明质酸酶活性，就样品稀释倍数校准并且以U/mL报告。
实施例7
PEGPH20处理在高瘤周透明质酸(HA)肿瘤模型中的效应
为了评价PEGPH20对高水平的瘤周HA的作用，生成BXPC3-Has3肿瘤细胞系以建立HAhigh小鼠异种移植物肿瘤模型。使用完全RPMI培养基在标准培养条件下培养BxPC3细胞(ATCC目录号CRL-1687)。生成慢病毒系统以表达人透明质酸合酶3cDNA转录物(SEQ ID NO:212所示)。生成的表达hHAS3cDNA的慢病毒载体指定为pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg并且在SEQ ID NO:213中示出。通过用pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg的病毒感染，随后通过潮霉素选择，生成BX-PC3-Has3稳定细胞系。受感染以过表达hHAS3的细胞用于所有实验中。
为了证实HA水平，用Aperio光谱程序测量肿瘤切片中的颜色密度。肿瘤在超过25％肿瘤切片上的强HA染色时分级为HAhigh；在10-25％之间的肿瘤切片上的强HA染色时分级为HAModerate；在10％肿瘤切片下的强HA染色时分级为HALow。
5-6周龄并称重在20-25g之间的NCr(nu/nu)小鼠用BxPC-3-Has3细胞(5x 106/50μL)邻近右胫骨骨膜接种，生成高压肿瘤。通过测径器测量实体瘤团块的长度(L)和宽度(W)，肿瘤体积(TV)计算为：(L x W2)/2。当肿瘤的体积达到直径大约1500-2000mm3时，将小鼠分级成两个处理组：(1)BxPC3HAhigh，媒介物对照或(2)BxPC3HAhigh，PEGPH20。
在0小时和再次在42小时，给动物施用媒介物(10mM组氨酸，pH 6.5，130mM NaCl)或PEGPH20(4.5mg/kg)。对于第一次PEGPH20或媒介物对照处理(在处死前48小时，即在t＝0小时)，动物还用240mg/kg吉西他滨腹膜内处理和10mg/kg紫杉醇()静脉内处理。在处死前两小时(46小时，动物用以60mg/kg的HYPOXYPROBETM(盐酸哌莫硝唑；ChemiconInternational，Temecula，CA)以及用0.5mL BrdU腹膜内处理。在处死前五分钟(48小时)，用溶解于75％DMSO 1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)中的75μL 0.6mg/mL荧光羰花青静脉内处理动物。
在48小时处死动物。收集整个肿瘤，使组织在铝块上冷却至-20℃，在包埋OCT介质(Sakura Finetek，Torrance，CA)中覆盖并贮存于-80℃下直至切片。将肿瘤冷冻切片切割成10μm切片并且处理用于免疫组织化学或显微镜成像。评价对血管灌注和肿瘤缺氧的作用。
A.血管灌注
用荧光显微镜成像系统(BD CARV II Confocal Imager，Sparks，MD；Quentem 512sc照相机(Photometrics，Tucson，AZ)；MIV2000电动x-y平台和MetaMorph System，Sunnyvale，CA)扫描非染色的新鲜冷冻切片。整个肿瘤切片在10x下就荧光羰花青(DiI)信号(激发562nm/发射624nm)进行扫描以测定肿瘤灌注。使用Image-Pro Analyzer 7.0(Media Cybermetrics，Bethesda，MD)分析图像。测定完整肿瘤面积和阳性染色面积。每个肿瘤中的血管灌注计算为在整个肿瘤切片上的阳性百分比(信号)。
结果在表8中示出。结果显示PEG-PH20处理介导BxPC3-HAS3肿瘤中的染料灌注，其中相对于对照处理的肿瘤，在来自用PEGPH20处理的小鼠的肿瘤中血管灌注显著增加。如表8中概括的，用PEGPH20处理的动物显示血管灌注增加，具有7.24±1.78的平均面积，这是相对于对照动物增加116.9％。
B.缺氧
来自经处理的动物的肿瘤切片通过显现盐酸哌莫硝唑(HYPOXYPROBETM)比较缺氧区域。具体地，在处死后，已用山羊血清封闭非特异性染色的冷冻切片在室温下探测1小时，使用1:50稀释的抗哌莫硝唑抗体(HypoxyprobeTM-1Mab-1，小鼠IgG1；Chemicon International，Temecula，CA)检测哌莫硝唑加合物或使用1:100稀释的抗CD31抗体(大鼠，BD Pharmingen，San Diego，CA)检测内皮细胞。在洗涤去除初级试剂后，FITC山羊抗小鼠二抗(为了显现HypoxyprobeTM-1Mab-1，1:100稀释；VectorLabs Burlingame，CA，USA)或德克萨斯红山羊抗大鼠二抗(为了显现CD31内皮细胞；1:100稀释；Vector Labs Burlingame，CA USA)用作次级试剂在室温下30分钟。使用Image-Pro Analyzer 7.0(Media Cybermetrics，Bethesda，MD)成像系统使切片成像。对于CD31成像，激发波长为562nm，发射波长为624nm。对于盐酸哌莫硝唑(HYPOXYPROBETM)的成像，激发波长为490nm，发射波长为520nm。
结果在表9中示出。结果显示介导HA去除的PEGPH20导致BxPC3-Has3肿瘤中的缺氧减少。对照动物具有完整肿瘤切片中3.98±2.70％的平均缺氧面积百分比。用PEGPH20处理的动物具有肿瘤中减少的缺氧面积，具有0.86±1.07的平均面积，相对于对照动物降低78％。
实施例8
组合PEGPH20和nab-紫杉醇处理在高瘤周透明质酸(HA)三重阴性乳腺癌肿瘤模型中的效应
生成MDA-MB-468三重阴性乳腺癌(TNBC)细胞系以过表达hHAS3AcDNA转录物(SEQ ID NO:212)并从而建立HAhigh TNBC模型。用上文描述的hHAS3cDNA表达慢病毒载体pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg(SEQ ID NO:213)感染MDA-MB-468细胞(ATCC目录号HTB-132)(使用完全RPMI培养基在标准培养条件下培养)，随后通过潮霉素选择以生成稳定的hHAS3表达细胞系MDA-MB-468/HAS3。
将悬浮于RPMI中的MDA-MB-468/HAS3细胞注射到裸鼠内。如上所述测量肿瘤体积。在第17天，当肿瘤达到大约300mm3的体积时，将动物分成6个处理组，其静脉内施用1)媒介物；2)1mg/kg的nab-紫杉醇；3)3mg/kg的nab-紫杉醇；4)10mg/kg的nab-紫杉醇；5)4.5mg/kg PEGPH20；或6)1mg/kg的nab-紫杉醇和4.5mg/kg PEG20。每3-4天测量肿瘤体积，共45天。
结果在图6中示出。仅接受媒介物的处理组1中的动物在研究过程自始至终显示出渐进性肿瘤生长。在研究的最后一天(第62天)时，平均肿瘤大小在体积中刚刚超过一倍。接受1或3mg/kg的nab-紫杉醇的处理组2和3中的动物的肿瘤在细胞植入后的第17-27天(处理后0-10天)时显示出肿瘤体积的初始(大约30％)降低，但随后肿瘤生长以与媒介物对照动物相比较减少的速率重新开始。在研究的最后一天，平均肿瘤体积正好在起始体积两倍下。
关于PEGPH20处理的动物(组5)的肿瘤生长模式类似于组2和3的，但在最后一天，组5的平均肿瘤大小略微小于组2和3的。接受10mg/kg的nab-紫杉醇的组4中的动物的平均肿瘤大小，在处理后的前10天(研究日17-27)遵循与组2、3和5相同的趋势，但在随后另外11天保持在减少的体积，随后在研究的剩余部分内渐进性降低另外30％，在研究结束时获得为平均起始肿瘤体积三分之一的平均肿瘤体积。
1mg/kg的nab-紫杉醇和PEGPH20的组合(组6)导致平均肿瘤体积的实质降低。这些结果显示在用nab-紫杉醇和PEGPH20的组合处理后具有协同效应，导致与以相同剂量的个别处理相比较，对肿瘤生长抑制显著改善的功效。组合疗法导致肿瘤体积与接受作为单一疗法的10倍nab-紫杉醇(10mg/kg nab-紫杉醇(组5))的动物观察到的相似的降低，这还获得大约为平均起始肿瘤体积三分之一的最终平均肿瘤体积。
因为修饰对于本领域技术人员将是显而易见的，所以本发明仅受附加的权利要求书的范围限制。

Claims (161)

1.一种组合，其包含：
含有抗透明质酸剂的组合物；和
含有肿瘤靶向紫杉烷的组合物。
2.权利要求1的组合，其中：
所述组合物配制用于直接施用；
所述抗透明质酸剂的浓度足以降解肿瘤相关透明质酸；和
所述肿瘤靶向紫杉烷的浓度足以实现肿瘤内递送。
3.权利要求1或2的组合，其中与在不存在所述肿瘤内紫杉烷制剂的情况下的核苷脱氨酶的水平或活性相比较，所述肿瘤靶向紫杉烷制剂的浓度足以减少肿瘤内核苷脱氨酶蛋白质水平或蛋白质活性。
4.权利要求1-3中任一项的组合，其中所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷共配制或分开提供。
5.权利要求1-4中任一项的组合，其进一步包含含有核苷类似物的组合物。
6.权利要求5的组合，其中：
所述组合物配制用于直接施用；和
所述核苷类似物的浓度足以实现肿瘤内递送。
7.权利要求5或6的组合，其中所述核苷类似物与所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷分开提供。
8.权利要求5或6的组合，其中所述核苷类似物与所述抗透明质酸剂共配制或与所述肿瘤靶向紫杉烷共配制。
9.权利要求5或6的组合，其中所述核苷类似物与所述抗透明质酸剂和所述肿瘤靶向紫杉烷共配制。
10.权利要求1-9中任一项的组合，其中所述组合物配制用于多重剂量施用。
11.权利要求1-9中任一项的组合，其中所述组合物配制用于单次剂量施用。
12.权利要求1-11中任一项的组合，其中所述抗透明质酸剂是透明质酸降解酶或是抑制透明质酸合成的试剂。
13.权利要求1-12中任一项的组合，其中所述抗透明质酸剂是透明质酸降解酶。
14.权利要求13的组合，其中所述透明质酸降解酶与聚合物缀合。
15.权利要求13-14中任一项的组合，其中所述透明质酸降解酶组合物含有在0.5μg-50mg之间或大约在0.5μg-50mg之间的与聚合物缀合的透明质酸降解酶。
16.权利要求15的组合，其中所述与聚合物缀合的透明质酸降解酶具有至少或约20,000U/mg的比活性。
17.权利要求13-16中任一项的组合，其中所述透明质酸降解酶组合物含有在150单位(U)-60,000U之间或大约在150单位(U)-60,000U之间的与聚合物缀合的透明质酸降解酶。
18.权利要求13-17中任一项的组合，其中含有所述透明质酸降解酶的所述组合物的体积在0.5mL-100mL之间或大约在0.5mL-100mL之间。
19.权利要求13-18中任一项的组合，其中含有透明质酸降解酶的所述组合物包含组氨酸和/或NaCl。
20.权利要求19的组合，其中含有透明质酸降解酶的所述组合物具有在6.0-7.4之间或大约在6.0-7.4之间的pH。
21.权利要求13-20中任一项的组合，其中所述透明质酸降解酶是透明质酸酶。
22.权利要求21的组合，其中所述透明质酸酶是PH20或其截短形式，所述截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或所述GPI附着位点的部分。
23.权利要求21或22的组合，其中所述透明质酸酶是PH20，其为人或非人PH20。
24.权利要求13-23中任一项的组合，其中：
所述透明质酸降解酶是截短的PH20；
所述透明质酸降解酶是中性活性和可溶的；和
所述截短的PH20包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列，或包含与至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。
25.权利要求24的组合，其中所述PH20包含这样的氨基酸序列，其与至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性。
26.权利要求24或25的组合，其中所述PH20包含SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列显示出至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。
27.权利要求26的组合，其中所述PH20包含与SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。
28.权利要求1-12中任一项的组合，其中所述抗透明质酸剂是抑制透明质酸合成的试剂且选自针对HA合酶的有义或反义核酸分子或者是小分子药物。
29.权利要求28的方法，其中所述抗透明质酸剂是选自4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物、或者来氟米特或其衍生物的小分子药物。
30.权利要求29的方法，其中所述小分子药物是选自6,7-二羟基-4-甲基香豆素或5,7-二羟基-4-甲基香豆素的4-甲基伞形酮(MU)衍生物。
31.权利要求1-30中任一项的组合，其中所述肿瘤靶向紫杉烷包含紫杉醇或多西他赛或者是它们的类似物、衍生物或前药。
32.权利要求1-31中任一项的组合，其中所述肿瘤靶向紫杉烷与肿瘤靶向部分直接或间接连接。
33.权利要求1-32中任一项的组合，其中所述肿瘤靶向紫杉烷配制为选自胶束、纳米颗粒、微球体、脂质体或水凝胶的递送媒介物。
34.权利要求33的组合，其中所述递送媒介物与肿瘤靶向部分直接或间接连接。
35.权利要求32-34中任一项的组合，其中所述肿瘤靶向部分选自大分子、蛋白质、肽、单克隆抗体或脂肪酸脂质。
36.权利要求32-35中任一项的组合，其中所述肿瘤靶向部分是选自西妥昔单抗或曲妥珠单抗的单克隆抗体。
37.权利要求32-35中任一项的组合，其中所述肿瘤靶向部分是白蛋白。
38.权利要求37的组合，其中所述肿瘤靶向紫杉烷是白蛋白结合的紫杉醇或白蛋白结合的多西他赛。
39.权利要求1-38中任一项的组合，其中所述肿瘤靶向紫杉烷组合物含有在10mg-1000mg之间或大约在10mg-1000mg之间的肿瘤靶向紫杉烷。
40.权利要求1-39中任一项的组合，其中包含肿瘤靶向紫杉烷的所述组合物的体积在0.5mL-100mL之间或大约在0.5mL-100mL之间。
41.权利要求5-40中任一项的组合，其中所述核苷类似物是嘌呤或嘧啶类似物或它们的衍生物。
42.权利要求5-41中任一项的组合，其中所述核苷类似物选自氟嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟-2'-脱氧胞苷、阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、氮杂胞苷、假异胞苷、Zebularine、安西他滨、法扎拉滨、6-氮杂胞苷、卡培他滨、N4-十八烷基-阿糖胞苷、反油酸阿糖胞苷、氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨、呋咯地辛和喷司他丁，或它们的衍生物。
43.权利要求5-42中任一项的组合，其中所述核苷类似物是核苷脱氨酶的底物。
44.权利要求43的组合，其中所述核苷脱氨酶是腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶。
45.权利要求5-44中任一项的组合，其中所述核苷类似物选自氟达拉滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨和氮杂胞苷或它们的衍生物。
46.权利要求5-45中任一项的组合，其中所述核苷类似物组合物包含100mg-5000mg、500mg-5000mg、500mg-2500mg、1000mg-2500mg、1500mg-2500mg或2000mg-5000mg核苷类似物。
47.权利要求5-46中任一项的组合，其中包含核苷类似物的所述组合物的体积在0.5mL-1000mL之间或大约在0.5mL-1000mL之间。
48.权利要求1-47中任一项的组合，其进一步包含含有皮质类固醇的组合物。
49.权利要求48的组合，其中所述皮质类固醇是糖皮质激素。
50.权利要求49的组合，其中所述糖皮质激素选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松。
51.权利要求48-50中任一项的组合，其中所述皮质类固醇组合物包含0.1-20mg或约0.1-20mg皮质类固醇。
52.权利要求1-51中任一项的组合，其中所述组合物配制用于经口、静脉内(IV)、皮下、肌内、肿瘤内、皮内、表面、经皮、经直肠、鞘内或表皮下施用。
53.权利要求1-52中任一项的组合，其中所述组合物配制用于静脉内施用或皮下施用。
54.权利要求14的组合，其中所述聚合物是聚亚烷基二醇、右旋糖酐、普鲁兰或纤维素。
55.权利要求54的组合，其中所述聚亚烷基二醇选自聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
56.权利要求54-55中任一项的组合，其中所述聚合物是PEG，并且所述PEG是分支或线性PEG。
57.权利要求54-55中任一项的组合，其中所述聚合物通过和下述反应而产生：甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚(乙二醇)-对硝基苯基碳酸酯(PEG-对硝基苯基碳酸酯)(30kDa)；或聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。
58.权利要求54-57中任一项的组合，其中所述聚合物是具有30或约30千道尔顿分子量的PEG。
59.权利要求1-58中任一项的组合，其包装为试剂盒且任选包括使用说明书。
60.一种用于治疗癌症的方法，其包括：
施用包含抗透明质酸剂的组合物；和
施用包含肿瘤靶向紫杉烷制剂的组合物。
61.权利要求60的方法，其进一步包括施用包含核苷类似物的组合物。
62.权利要求61的方法，其中所述癌症是肿瘤。
63.权利要求62的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
64.权利要求62或63的方法，其中与相同组织类型的非癌性组织相比较或与相同肿瘤类型的非转移性肿瘤相比较，所述肿瘤具有增加的细胞和/或基质透明质酸表达。
65.权利要求60-64中任一项的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫颈癌、头颈癌和乳腺癌。
66.权利要求60-65中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
67.权利要求60-66中任一项的方法，其中所述抗透明质酸剂是透明质酸降解酶。
68.权利要求67的方法，其中所述透明质酸降解酶与聚合物缀合。
69.权利要求67-68中任一项的方法，其中所述透明质酸降解酶是透明质酸酶。
70.权利要求69的方法，其中所述透明质酸酶是PH20或其截短形式，所述截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或所述GPI附着位点的部分。
71.权利要求69或70的方法，其中所述透明质酸酶是PH20，其为人或非人PH20。
72.权利要求67-71中任一项的方法，其中：
所述透明质酸降解酶是截短的PH20；和
所述截短的PH20包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列，或包含与至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。
73.权利要求72的方法，其中所述PH20包含这样的氨基酸序列，其与至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性。
74.权利要求72或73的方法，其中所述PH20包含SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列显示出至少85％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。
75.权利要求74的方法，其中所述PH20包含与SEQ ID NO:4-9、47、48、150-170、183-189中任一所示的氨基酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且保留透明质酸酶活性的氨基酸序列。
76.权利要求68-75中任一项的方法，其中所述聚合物是聚亚烷基二醇、右旋糖酐、普鲁兰或纤维素。
77.权利要求76的方法，其中所述聚亚烷基二醇选自聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
78.权利要求76或77的方法，其中所述聚合物是PEG，并且所述PEG是分支或线性PEG。
79.权利要求76-78中任一项的方法，其中所述聚合物通过和下述反应而产生：甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(5kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)(30kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)-丁醛(mPEG-丁醛)(30kDa)，甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(20kDa)；甲氧基-聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)(30kDa)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(10kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(20kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa分支的)；(甲氧基-聚(乙二醇))2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(60kDa分支的)；生物素-聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-PEG-NHS)(5kDa生物素化的)；聚(乙二醇)-对硝基苯基碳酸酯(PEG-对硝基苯基碳酸酯)(30kDa)；或聚(乙二醇)-丙醛(PEG-丙醛)(30kDa)。
80.权利要求76-79中任一项的方法，其中所述聚合物是具有30或约30千道尔顿分子量的PEG。
81.权利要求67-80中任一项的方法，其中：
所述透明质酸降解酶以在0.01μg/kg-15μg/kg之间或大约在0.01μg/kg-15μg/kg之间的剂量范围量施用；或
所述透明质酸降解酶以在10-10,000单位/kg(对象)之间或大约在10-10,000单位/kg(对象)之间的剂量范围量施用。
82.权利要求60-66中任一项的方法，其中所述抗透明质酸剂是抑制透明质酸合成的试剂。
83.权利要求82的方法，其中所述抗透明质酸剂是抑制透明质酸合成的试剂且选自针对HA合酶的有义或反义核酸分子或者是小分子药物。
84.权利要求83的方法，其中所述抗透明质酸剂是选自4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物、或者来氟米特或其衍生物的小分子药物。
85.权利要求84的方法，其中所述小分子药物是选自6,7-二羟基-4-甲基香豆素或5,7-二羟基-4-甲基香豆素的4-甲基伞形酮(MU)衍生物。
86.权利要求60-85中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向紫杉烷包含紫杉醇或多西他赛或者是它们的类似物、衍生物或前药。
87.权利要求60-86中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向紫杉烷与肿瘤靶向部分直接或间接连接。
88.权利要求60-87中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向紫杉烷配制为选自胶束、纳米颗粒、微球体、脂质体或水凝胶的递送媒介物。
89.权利要求88的方法，其中所述递送媒介物与肿瘤靶向部分直接或间接连接。
90.权利要求87-89中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向部分选自大分子、蛋白质、肽、单克隆抗体或脂肪酸脂质。
91.权利要求87-89中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向部分是选自西妥昔单抗或曲妥珠单抗的单克隆抗体。
92.权利要求87-89中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向部分是白蛋白。
93.权利要求92的方法，其中所述肿瘤靶向紫杉烷是白蛋白结合的紫杉醇或白蛋白结合的多西他赛。
94.权利要求60-93中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向紫杉烷以在1mg/m2-1000mg/m2(对象的体表面积)之间或大约在1mg/m2-1000mg/m2(对象的体表面积)之间的剂量范围施用。
95.权利要求61-94中任一项的方法，其中所述核苷类似物是嘌呤或嘧啶类似物或它们的衍生物。
96.权利要求61-95中任一项的方法，其中所述核苷类似物选自氟嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟-2'-脱氧胞苷、阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、氮杂胞苷、假异胞苷、Zebularine、安西他滨、法扎拉滨、6-氮杂胞苷、卡培他滨、N4-十八烷基-阿糖胞苷、反油酸阿糖胞苷、氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨、呋咯地辛和喷司他丁，或它们的衍生物。
97.权利要求61-96中任一项的方法，其中所述核苷类似物是核苷脱氨酶的底物。
98.权利要求97的方法，其中所述核苷脱氨酶是腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶。
99.权利要求61-98中任一项的方法，其中所述核苷类似物选自氟达拉滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨和氮杂胞苷或它们的衍生物。
100.权利要求61-99中任一项的方法，其中所述核苷类似物是吉西他滨或其衍生物。
101.权利要求61-100中任一项的方法，其中所述核苷类似物以在100mg/m2-2500mg/m2之间或大约在100mg/m2-2500mg/m2之间的剂量范围量施用。
102.权利要求61-100中任一项的方法，其中所述核苷类似物施用的量是至少或至少约200mg/m2或500mg/m2，但小于1000mg/m2或1250mg/m2。
103.权利要求61-102中任一项的方法，其中所述组合物经口、静脉内(IV)、皮下、肌内、肿瘤内、皮内、表面、经皮、经直肠、鞘内或表皮下施用。
104.权利要求61-103中任一项的方法，其中所述组合物静脉内施用或皮下施用。
105.权利要求60-104中任一项的方法，其中所述抗透明质酸剂在所述肿瘤靶向紫杉烷之前、同时或接近同时、顺次或间歇施用。
106.权利要求105的方法，其中所述抗透明质酸剂在所述肿瘤靶向紫杉烷施用前施用。
107.权利要求105或106的方法，其中在所述肿瘤靶向紫杉烷施用前至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用所述抗透明质酸剂。
108.权利要求105的方法，其中所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷同时或接近同时施用。
109.权利要求60-108中任一项的方法，其中：
所述抗透明质酸剂的施用频率是每周两次、每周一次、每14天一次、每21天一次或每月一次；和/或
所述肿瘤靶向紫杉烷的施用频率是每周两次、每周一次、每14天一次、每21天一次或每月一次。
110.权利要求61-109中任一项的方法，其中所述抗透明质酸剂和/或肿瘤靶向紫杉烷在所述核苷类似物之前、同时或接近同时、顺次或间歇施用。
111.权利要求60-110中任一项的方法，其中所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷在施用周期中施用预定周数。
112.权利要求111的方法，其中所述预定周数是至少两周、至少三周或至少四周。
113.权利要求61-112中任一项的方法，其中在所述核苷类似物施用前至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用所述抗透明质酸剂。
114.权利要求61-113中任一项的方法，其中在所述核苷类似物施用前至少或至少约或约或1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，施用所述肿瘤靶向紫杉烷。
115.权利要求61-114中任一项的方法，其中所述肿瘤靶向紫杉烷与所述核苷类似物同时或接近同时施用。
116.权利要求61-115中任一项的方法，其中所述核苷类似物的施用频率是每周两次、每周一次、每14天一次、每21天一次或每月一次。
117.权利要求61-116中任一项的方法，其中所述核苷类似物在施用周期中施用预定周数。
118.权利要求117的方法，其中所述预定周数是至少两周、至少三周或至少四周。
119.权利要求117或118的方法，其中在预定周数后，施用中断第一预定时间段，并且随后重新开始至少一周。
120.权利要求60-119中任一项的方法，其中所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷同时或接近同时施用，并且以每周两次或每周一次的施用频率施用预定周数。
121.权利要求61-120中任一项的方法，其中所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷：
在所述核苷类似物施用之前施用；
同时或接近同时施用；和
以每周两次或每周一次的施用频率施用预定周数。
122.权利要求120或121的方法，其中所述预定周数是四周。
123.权利要求121或122的方法，其中在所述透明质酸降解酶和肿瘤靶向紫杉烷施用后至少或至少约或约或5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、30小时、36小时、40小时或48小时，施用所述核苷类似物。
124.权利要求116的方法，其中所述核苷类似物每周一次施用预定周数。
125.权利要求124的方法，其中所述预定周数是三周。
126.权利要求125的方法，其中施用中断至少一周。
127.权利要求111-126中任一项的方法，其中所述施用周期和/或施用中断重复多次。
128.权利要求127的方法，其中在所述第一施用周期中的施用频率与后续施用周期中的施用频率相同或不同。
129.权利要求127的方法，其中所述施用频率在所述第一施用周期中是每周两次，并且对于后续施用周期是每周一次。
130.权利要求60-129中任一项的方法，其进一步包括施用皮质类固醇。
131.权利要求130的方法，其中所述所述皮质类固醇是糖皮质激素。
132.权利要求131的方法，其中所述糖皮质激素选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松。
133.权利要求130-132中任一项的方法，其中所述皮质类固醇在所述抗透明质酸剂施用之前、同时、间歇或之后施用。
134.权利要求130-132中任一项的方法，其中所述皮质类固醇在所述抗透明质酸剂施用之前和在所述抗透明质酸剂施用之后施用。
135.权利要求133的方法，其中所述皮质类固醇与所述抗透明质酸剂共施用。
136.权利要求133或134的方法，其中所述皮质类固醇在所述抗透明质酸剂施用之前至少或约至少1小时施用。
137.权利要求133或134的方法，其中所述皮质类固醇在所述抗透明质酸剂施用之后至少8小时-12小时施用。
138.权利要求130-137中任一项的方法，其中施用的皮质类固醇量在下述之间或大约在下述之间：0.1-20mg、0.1-15mg、0.1-10mg、0.1-5mg、0.2-20mg、0.2-15mg、0.2-10mg、0.2-5mg、0.4-20mg、0.4-15mg、0.4-10mg、0.4-5mg、0.4-4mg、1-20mg、1-15mg和1-10mg。
139.权利要求130-138中任一项的方法，其中所述皮质类固醇经口施用。
140.权利要求60-139中任一项的方法，其包括：
施用包含抗透明质酸剂的组合物；
施用包含肿瘤靶向紫杉烷制剂的组合物，其中所述肿瘤靶向紫杉烷与所述抗透明质酸剂同时或接近同时施用；
任选地，在施用所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷之后，施用核苷类似物；和
在所述抗透明质酸剂施用之前、同时、间歇或之后施用皮质类固醇。
141.权利要求140的方法，其中：
所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷以每周两次或每周一次的施用频率施用预定周数；和
所述核苷类似物每周一次施用预定周数。
142.权利要求141的方法，其中所述抗透明质酸剂每周施用两次，并且所述肿瘤靶向紫杉烷每周施用一次。
143.权利要求140-142中任一项的方法，其中所述核苷类似物在所述抗透明质酸剂和所述肿瘤靶向紫杉烷施用之后一周施用。
144.权利要求140-142中任一项的方法，其中所述预定周数是4周。
145.权利要求60-144中任一项的方法，其进一步包括癌症治疗的施用。
146.权利要求145的方法，其中所述癌症治疗选自手术、放射、化疗剂、生物制剂、多肽、抗体、肽、小分子、基因疗法载体、病毒和DNA。
147.权利要求60-146中任一项的方法，其中所述对象是人。
148.权利要求1-59中任一项的组合物组合用于治疗癌症的用途。
149.用于治疗癌症的权利要求1-59中任一项的组合物组合。
150.抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷用于治疗癌症的用途，其中所述抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷分开或一起配制。
151.抗透明质酸剂在制备用于治疗癌症的药剂中的用途，其中所述治疗包括同时、接近同时、分开或顺次给对象施用肿瘤靶向紫杉烷。
152.一种用于治疗癌症的包含抗透明质酸剂的组合物，其中所述治疗包括同时、接近同时、分开或顺次给对象施用肿瘤靶向紫杉烷。
153.权利要求151的用途或权利要求152的组合物，其中所述治疗包括接近同时施用肿瘤靶向紫杉烷。
154.权利要求148-153中任一项的用途或组合，其中所述癌症是肿瘤。
155.权利要求148-154中任一项的用途或组合，其中所述肿瘤是实体瘤。
156.权利要求154或155的用途或组合，其中与相同组织类型的非癌性组织相比较或与相同肿瘤类型的非转移性肿瘤相比较，所述肿瘤具有增加的细胞和/或基质透明质酸表达。
157.权利要求148-156中任一项的用途或组合，其中所述癌症选自胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫颈癌、头颈癌和乳腺癌。
158.权利要求148-157中任一项的用途或组合，其中所述癌症是胰腺癌。
159.权利要求151-158中任一项的用途或组合，其中所述治疗进一步包括与所述抗透明质酸剂或肿瘤靶向紫杉烷同时、接近同时、分开或顺次施用核苷类似物。
160.包含与聚合物缀合的透明质酸降解酶的组合和包含肿瘤靶向紫杉烷的组合物用于增加核苷类似物的肿瘤内活性的用途。
161.包含抗透明质酸剂的组合和包含肿瘤靶向紫杉烷的组合物用于增加核苷类似物的肿瘤内活性的用途。
CN201380029337.9A 2012-04-04 2013-03-15 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法 Pending CN104411324A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810685607.6A CN108686203A (zh) 2012-04-04 2013-03-15 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261686429P 2012-04-04 2012-04-04
US61/686,429 2012-04-04
US201261714719P 2012-10-16 2012-10-16
US61/714,719 2012-10-16
PCT/US2013/032684 WO2013151774A1 (en) 2012-04-04 2013-03-15 Combination therapy with an anti - hyaluronan agent and a tumor - targeted taxane

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810685607.6A Division CN108686203A (zh) 2012-04-04 2013-03-15 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104411324A true CN104411324A (zh) 2015-03-11

Family

ID=48050937

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810685607.6A Pending CN108686203A (zh) 2012-04-04 2013-03-15 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法
CN201380029337.9A Pending CN104411324A (zh) 2012-04-04 2013-03-15 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810685607.6A Pending CN108686203A (zh) 2012-04-04 2013-03-15 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法

Country Status (28)

Country Link
US (3) US9913822B2 (zh)
EP (1) EP2833905B1 (zh)
JP (4) JP6042527B2 (zh)
KR (2) KR101626703B1 (zh)
CN (2) CN108686203A (zh)
AU (1) AU2013243873B2 (zh)
BR (1) BR112014024848A2 (zh)
CA (3) CA3152081A1 (zh)
CY (1) CY1120523T1 (zh)
DK (1) DK2833905T3 (zh)
EA (1) EA031986B1 (zh)
ES (1) ES2673093T3 (zh)
HK (1) HK1203844A1 (zh)
HR (1) HRP20181187T1 (zh)
HU (1) HUE038744T2 (zh)
IL (2) IL234703B (zh)
LT (1) LT2833905T (zh)
MX (2) MX360092B (zh)
NZ (1) NZ700073A (zh)
PL (1) PL2833905T3 (zh)
PT (1) PT2833905T (zh)
RS (1) RS57449B1 (zh)
SG (1) SG11201406340QA (zh)
SI (1) SI2833905T1 (zh)
SM (1) SMT201800366T1 (zh)
TR (1) TR201809231T4 (zh)
WO (1) WO2013151774A1 (zh)
ZA (1) ZA201406969B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109641009A (zh) * 2016-08-31 2019-04-16 富士胶片株式会社 抗肿瘤剂、抗肿瘤效果增强剂及抗肿瘤用试剂盒
CN110960506A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 中山大学 用于治疗由线粒体功能失调引起的疾病的纳米制剂
CN111437259A (zh) * 2015-11-02 2020-07-24 富士胶片株式会社 包含吉西他滨或其盐的脂质体组合物
CN112165949A (zh) * 2018-03-16 2021-01-01 Dfb索里亚有限责任公司 使用紫杉烷纳米颗粒治疗宫颈上皮内瘤变(cin)和宫颈癌的局部疗法
CN114377139A (zh) * 2022-03-11 2022-04-22 四川省医学科学院·四川省人民医院 载体、药物递送系统及其应用
US11684575B2 (en) 2014-04-30 2023-06-27 Fujifilm Corporation Liposome composition and method for producing same
US12201723B2 (en) 2018-06-20 2025-01-21 Fujifilm Corporation Combined pharmaceutical formulation comprising gemcitabine-containing liposome composition and immune checkpoint inhibitor

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1583562E (pt) 2003-01-06 2011-09-19 Angiochem Inc Angiopep-1, compostos relacionados, e suas utilizações
ES2532399T3 (es) 2003-03-05 2015-03-26 Halozyme, Inc. Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
NZ588638A (en) 2008-04-14 2012-09-28 Halozyme Inc Screening method for identifying a subject for treatment with a modified hyaluronidase polypeptides
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
AU2009304505A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 Angiochem Inc. Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery
US8921314B2 (en) 2008-10-15 2014-12-30 Angiochem, Inc. Conjugates of GLP-1 agonists and uses thereof
CN102307904A (zh) 2008-12-05 2012-01-04 安吉奥开米公司 神经降压素或神经降压素类似物的缀合物及其用途
WO2010077297A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
US8853353B2 (en) 2008-12-17 2014-10-07 Angiochem, Inc. Membrane type-1 matrix metalloprotein inhibitors and uses thereof
ES2729261T3 (es) 2009-04-20 2019-10-31 Angiochem Inc Tratamiento del cáncer de ovario utilizando un agente anticancerígeno conjugado con un análogo de Angiopep-2
RU2012103240A (ru) 2009-07-02 2013-08-10 Ангиокем Инк. Мультимерные пептидные конъюгаты и их применение
DK2477603T3 (en) 2009-09-17 2016-06-13 Baxalta Inc STABLE CO-DEVELOPMENT OF hyaluronidase and Immunoglobulin, AND METHODS OF USE THEREOF
ES2661089T3 (es) 2010-07-20 2018-03-27 Halozyme Inc. Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano
SG11201401797TA (en) 2011-10-24 2014-09-26 Halozyme Inc Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
US9447401B2 (en) 2011-12-30 2016-09-20 Halozyme, Inc. PH20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
SMT201800366T1 (it) 2012-04-04 2018-09-13 Halozyme Inc Combinazione terapia con ialuronidasi e taxano mirato al tumore
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
WO2015023691A2 (en) * 2013-08-12 2015-02-19 Benaroya Research Institute At Virginia Mason 4-methylumbelliferone treatment for immune modulation
EP3074047A2 (en) * 2013-11-26 2016-10-05 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Receptor-targeted nanoparticles for enhanced transcytosis mediated drug delivery
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US10117886B2 (en) 2014-05-30 2018-11-06 Hao Cheng Hyaluronidase and a low density second PEG layer on the surface of therapeutic-encapsulated nanoparticles to enhance nanoparticle diffusion and circulation
DK3186281T3 (da) 2014-08-28 2019-06-11 Halozyme Inc Kombinationsterapi med et hyaluronan-nedbrydende enzym og en immun-checkpoint-inhibitor
CN104237500B (zh) * 2014-09-30 2016-09-28 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种透明质酸固相包被方法
CA2969717A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Janssen Biotech, Inc. Anti-cd38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
WO2016118538A1 (en) * 2015-01-19 2016-07-28 The Texas A&M University System Functionalized protein-based materials and their uses
KR102649222B1 (ko) 2015-05-20 2024-03-18 얀센 바이오테크 인코포레이티드 경쇄 아밀로이드증 및 다른 cd38-양성 혈액학적 악성종양을 치료하기 위한 항-cd38 항체
CN107921143B (zh) 2015-06-15 2021-11-19 安吉奥开米公司 用于治疗软脑膜癌病的方法
JP6816038B2 (ja) 2015-06-22 2021-01-20 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３８抗体及びサバイビン阻害剤による血液悪性疾患の併用療法
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
EP4085929A1 (en) 2015-11-03 2022-11-09 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-cd38 antibodies and their uses
EP3187190A1 (en) * 2015-12-31 2017-07-05 Erytech Pharma Method of treating a mammal, including human, against cancer using methionine and asparagine depletion
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
JPWO2017195792A1 (ja) * 2016-05-13 2019-03-14 国立大学法人 熊本大学 新規なｐｅｇ修飾酵素及びそれを用いた抗がん剤デリバリー
CA3079242A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
CN112996501A (zh) * 2017-12-20 2021-06-18 塔佳吉尼克斯公司 癌症中紫杉类纳米乳剂与免疫疗法的联合
WO2019222435A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
CA3139852A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Polymer-based implant for retinal therapy and methods of making and using the same
CN110302395B (zh) * 2019-07-18 2023-02-17 暨南大学 一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子及其制备方法与应用
RU2706341C1 (ru) * 2019-07-24 2019-11-18 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАДИОЛОГИИ И ХИРУРГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ИМЕНИ АКАДЕМИКА А.М. ГРАНОВА" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ / ФГБУ "РНЦРХТ им. ак. А.М. Гранова" Минздрава России Способ лечения неоперабельной аденокарциномы головки поджелудочной железы
US12178852B2 (en) 2020-09-30 2024-12-31 Willow Laboratories, Inc. Insulin formulations and uses in infusion devices
CN112245580A (zh) * 2020-10-26 2021-01-22 深圳先进技术研究院 一种靶向载氧纳米酶制剂及其制备方法
TW202440064A (zh) 2022-12-22 2024-10-16 美商哈洛賽恩公司 用於高容量施予之玻尿酸酶調製劑
WO2024177927A1 (en) * 2023-02-20 2024-08-29 Lindy Biosciences, Inc. Hyaluronidase particles, compositions comprising the same and methods of making and using the same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009128917A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2488564A (en) 1947-06-03 1949-11-22 Orthe Pharmaecutlcal Corp Preparation of hyaluronidase
US2488565A (en) 1947-06-04 1949-11-22 Ortho Pharma Corp Preparation of hyaluronidase
US2676139A (en) 1950-09-01 1954-04-20 American Home Prod Hyaluronidase
US2808362A (en) 1952-05-02 1957-10-01 Armour & Co Preparation of hyaluronidase
US2795529A (en) 1954-06-17 1957-06-11 American Home Prod Stabilized hyaluronidase solution containing calcium chloride
US2806815A (en) 1955-04-12 1957-09-17 Ortho Pharma Corp Stabilized hyaluronidase
GB1050899A (zh) 1963-12-22
US3539794A (en) 1967-09-12 1970-11-10 American Cyanamid Co Self-contained chemiluminescent lighting device
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
DE2012888C3 (de) 1970-03-14 1981-04-02 Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen Verfahren zur Herstellung von 5-Azapyrimidinnucleosiden
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
DE2757365A1 (de) 1977-12-20 1979-06-21 Schering Ag Neues verfahren zur herstellung von nucleosiden
US4526988A (en) 1983-03-10 1985-07-02 Eli Lilly And Company Difluoro antivirals and intermediate therefor
GB8322007D0 (en) 1983-08-16 1983-09-21 Wellcome Found Pharmaceutical delivery system
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5736155A (en) 1984-08-08 1998-04-07 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes
US4769027A (en) 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
IL77133A (en) 1984-12-04 1991-01-31 Lilly Co Eli Antineoplastic pharmaceutical compositions containing pentofuranoside derivatives,some new such compounds and their preparation
WO1988002261A1 (en) 1986-09-30 1988-04-07 Biochemie Gesellschaft M.B.H. Use of hyaluronidase
RU1787160C (ru) 1986-12-24 1993-01-07 Эли Лилли Энд Компани Способ получени иммуноглобулинового конъюгата
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
CA1312599C (en) 1988-02-16 1993-01-12 Larry Wayne Hertel 2',3'dideoxy-2',2'difluoronucleosides
US4942184A (en) 1988-03-07 1990-07-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Water soluble, antineoplastic derivatives of taxol
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
CA2004695C (en) 1988-12-12 1999-08-10 Rosanne Bonjouklian Phospholipid nucleosides
US4960790A (en) 1989-03-09 1990-10-02 University Of Kansas Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
EP0400472B1 (en) 1989-05-27 1996-04-03 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Process for preparing polyethylene glycol derivatives and modified protein.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5015744A (en) 1989-11-14 1991-05-14 Florida State University Method for preparation of taxol using an oxazinone
EP0523110A1 (en) 1990-04-04 1993-01-20 Nycomed Imaging As Nucleoside derivatives
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5059699A (en) 1990-08-28 1991-10-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Water soluble derivatives of taxol
WO1993010076A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 The University Of Mississippi Synthesis and optical resolution of the taxol side chain and related compounds
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
FR2687150B1 (fr) 1992-02-07 1995-04-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de derives du taxane.
US5200534A (en) 1992-03-13 1993-04-06 University Of Florida Process for the preparation of taxol and 10-deacetyltaxol
US5171081A (en) 1992-05-29 1992-12-15 Pita Joe W Chemiluminescent reactive vessel
UA41261C2 (uk) 1992-06-22 2001-09-17 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб одержання збагачених бета-аномером нуклеозидів
US5594124A (en) 1992-06-22 1997-01-14 Eli Lilly And Company Stereoselective glycosylation process for preparing 2'-Deoxy-2',2'-difluoropyrimidine nucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoropyrimidine nucleosides and intermediates thereof
US5606048A (en) 1992-06-22 1997-02-25 Eli Lilly And Company Stereoselective glycosylation process for preparing 2'-Deoxy-2', 2'-difluoronucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides
US5401838A (en) 1992-06-22 1995-03-28 Eli Lilly And Company Stereoselective fusion glycosylation process for preparing 2'-deoxy-2',2'-difluoronucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides
YU43193A (sh) 1992-06-22 1997-01-08 Eli Lilly And Company 2'-deoksi-2',2'-difluoro(4-supstituisani)pirimidinski nukleozidi antivirusnog i antikancerogenog dejstva i međuproizvodi
US5426183A (en) 1992-06-22 1995-06-20 Eli Lilly And Company Catalytic stereoselective glycosylation process for preparing 2'-deoxy-2',2'-difluoronucleosides and 2'-deoxy-2'-fluoronucleosides
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
WO1994005282A1 (en) 1992-09-04 1994-03-17 The Scripps Research Institute Water soluble taxol derivatives
US5411984A (en) 1992-10-16 1995-05-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Water soluble analogs and prodrugs of taxol
HU225294B1 (en) 1992-12-23 2006-09-28 Bristol Myers Squibb Co Oxazoline derivatives for synthesis of sidechain-bearing taxanes and preparation thereof
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US5439686A (en) 1993-02-22 1995-08-08 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for in vivo delivery of substantially water insoluble pharmacologically active agents and compositions useful therefor
US6749868B1 (en) 1993-02-22 2004-06-15 American Bioscience, Inc. Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5795569A (en) 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
EP0675201A1 (en) 1994-03-31 1995-10-04 Amgen Inc. Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US6093563A (en) 1994-07-08 2000-07-25 Ibex Technologies R And D, Inc. Chondroitin lyase enzymes
FR2722191B1 (fr) 1994-07-08 1996-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation du trihydrate du (2r,3s)-3-tertbutoxycarbonylamino-2-hydroxy-3-phenylpropionate de 4-acetoxy2alpha-benzoyloxy-5beta,20epoxy-1,7beta,10beta trihydroxy-9-oxo-tax-11-en-13alpha-yle
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5521294A (en) 1995-01-18 1996-05-28 Eli Lilly And Company 2,2-difluoro-3-carbamoyl ribose sulfonate compounds and process for the preparation of beta nucleosides
US5747027A (en) 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6107332A (en) 1995-09-12 2000-08-22 The Liposome Company, Inc. Hydrolysis-promoting hydrophobic taxane derivatives
SI0932399T1 (sl) 1996-03-12 2006-10-31 Pg Txl Co Lp Vodotopna paklitakselna predzdravila
ATE249842T1 (de) 1996-07-03 2003-10-15 Upjohn Co Zielgerichte arzneimittel abgabe für zulphonamide-derivate
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6193963B1 (en) 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6103525A (en) 1996-10-17 2000-08-15 The Regents Of The University Of California Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies that bind to human plasma hyaluronidase
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
US6384019B1 (en) 1997-01-24 2002-05-07 Norsk Hydro Asa Gemcitabine derivatives
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
NZ525580A (en) 1997-06-27 2004-08-27 Vivorx Pharmaceuticals Inc Vehicles for intravenous administration of paclitaxel having reduced toxicity
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
CA2323048C (en) 1998-03-12 2006-10-10 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
TW466112B (en) 1998-04-14 2001-12-01 Lilly Co Eli Novel use of 2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine for immunosuppressive therapy and pharmaceutical composition comprising the same
CA2336399A1 (en) 1998-07-03 2000-01-13 Neles Field Controls Oy Method and arrangement for measuring fluid
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
EP1144011B1 (en) 1998-12-11 2010-03-10 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
CA2362937C (en) 1999-02-24 2011-03-22 The Uab Research Foundation Taxane derivatives for targeted therapy of cancer
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
US6376470B1 (en) 1999-09-23 2002-04-23 Enzon, Inc. Polymer conjugates of ara-C and ara-C derivatives
AU781839B2 (en) 1999-12-22 2005-06-16 Nektar Therapeutics Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
EP1284987B1 (en) 2000-05-16 2007-07-18 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
EP1345628B1 (en) 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
WO2003040211A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
AU2002352048A1 (en) 2001-11-23 2003-06-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for identification of tumor targeting enzymes
US6982253B2 (en) 2002-06-05 2006-01-03 Supergen, Inc. Liquid formulation of decitabine and use of the same
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
US20050004002A1 (en) 2002-12-09 2005-01-06 American Bioscience, Inc. Compositions and methods of delivery of pharmacological agents
EP2298874A1 (en) 2002-12-16 2011-03-23 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (CHASEGP), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
US6838569B2 (en) 2002-12-16 2005-01-04 Dabur India Limited Process for preparation of paclitaxel trihydrate and docetaxel trihydrate
CA2788505C (en) 2003-02-26 2018-09-04 Nektar Therapeutics Polymer-factor viii moiety conjugates
ES2532399T3 (es) 2003-03-05 2015-03-26 Halozyme, Inc. Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20090123367A1 (en) 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US7038038B2 (en) 2003-03-17 2006-05-02 Pharmion Corporation Synthesis of 5-azacytidine
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
EP3593820A1 (en) 2003-05-23 2020-01-15 Nektar Therapeutics Peg derivatives containing two peg chains
PL1678194T3 (pl) 2003-10-10 2014-01-31 Alchemia Oncology Pty Ltd Modulowanie syntezy i degradacji hialuronianu w leczeniu choroby
WO2005118799A1 (en) 2004-04-15 2005-12-15 Ista Pharmaceuticals, Inc. Ovine hyaluronidase
JP4972545B2 (ja) 2004-04-22 2012-07-11 セレーター ファーマスーティカルズ、インク． アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログのリポソーム製剤
AU2006249235B2 (en) 2004-05-14 2010-11-11 Abraxis Bioscience, Llc Sparc and methods of use thereof
US7112687B2 (en) 2004-07-15 2006-09-26 Indena, S.P.A. Methods for obtaining paclitaxel from taxus plants
LT3248600T (lt) 2005-02-18 2020-07-27 Abraxis Bioscience, Llc Terapinių agentų deriniai bei įvedimo būdai ir kombinuotas gydymas
US7250416B2 (en) 2005-03-11 2007-07-31 Supergen, Inc. Azacytosine analogs and derivatives
JP2006265117A (ja) 2005-03-22 2006-10-05 Noribumi Sawamukai Ａｋｔシグナル経路の活性化阻害を目的として使用するレフルノミド
JP2006298892A (ja) 2005-04-18 2006-11-02 Glyco Japan Co Ltd 抗癌剤
US8034765B2 (en) 2005-08-31 2011-10-11 Abraxis Bioscience, Llc Compositions and methods for preparation of poorly water soluble drugs with increased stability
EP1931321B1 (en) 2005-08-31 2018-12-26 Abraxis BioScience, LLC Compositions comprising poorly water soluble pharmaceutical agents and antimicrobial agents
WO2007076160A2 (en) 2005-12-28 2007-07-05 Acidophil Llc C-10 carbamates of taxanes
US20100112077A1 (en) 2006-11-06 2010-05-06 Abraxis Bioscience, Llc Nanoparticles of paclitaxel and albumin in combination with bevacizumab against cancer
CZ2007136A3 (cs) 2007-02-20 2008-08-27 Ústav organické chemie a biochemie AV CR, v.v.i. Zpusob výroby 1-(2-deoxy-alfa-D-erythro-pentofuranosyl)-5-azacytosinu
CA2683973A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Abraxis Bioscience, Inc. Sparc and methods of use thereof
BRPI0908845A2 (pt) 2008-02-21 2016-05-24 Sun Pharma Advanced Res Co Ltd nova hidrazida contendo taxano conjugados
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
EP4421168A3 (en) 2008-03-06 2024-11-13 Halozyme, Inc. Large-scale production of soluble hyaluronidase
WO2009126401A1 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Abraxis Bioscience, Llc Compositions of hydrophobic taxane derivatives and uses thereof
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
CN104829718A (zh) 2008-07-08 2015-08-12 艾伯维公司 前列腺素e2结合蛋白及其用途
WO2010077297A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
WO2010129211A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Preparation of decitabine
US20100305500A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Hyaluronidase as an adjuvant for increasing the injection volume and dispersion of large diameter synthetic membrane vesicles containing a therapeutic agent
WO2011057034A2 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Catenae: serosal cancer stem cells
TWI502004B (zh) * 2009-11-09 2015-10-01 Dow Corning 群集官能性聚有機矽氧烷之製法及其使用方法
KR20130028727A (ko) 2010-03-29 2013-03-19 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 치료제의 약물 전달 및 유효성 향상 방법
MX357674B (es) 2010-05-21 2018-07-18 Xl Protein Gmbh Polipeptidos biosinteticos de espira aleatoria de prolina/alanina y sus usos.
KR20130088116A (ko) 2010-06-04 2013-08-07 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨 췌장암의 치료 방법
ES2661089T3 (es) 2010-07-20 2018-03-27 Halozyme Inc. Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano
EP2672958A1 (en) 2011-02-08 2013-12-18 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
SG11201401797TA (en) 2011-10-24 2014-09-26 Halozyme Inc Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
US9447401B2 (en) 2011-12-30 2016-09-20 Halozyme, Inc. PH20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
SMT201800366T1 (it) 2012-04-04 2018-09-13 Halozyme Inc Combinazione terapia con ialuronidasi e taxano mirato al tumore
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009128917A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
CN102065886A (zh) * 2008-04-14 2011-05-18 哈洛齐梅公司 修饰的透明质酸酶及其在治疗透明质酸相关疾病和病症中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DESAI NEIL P等: "Improved effectiveness of nanoparticle albumin-bound (nab) paclitaxel versus polysorbate-based docetaxel in multiple xenografts as a function of HER2 and SPARC status", 《ANTI-CANCER DRUGS》, vol. 19, no. 6, 31 October 2008 (2008-10-31), pages 899 - 909, XP002698728, DOI: doi:10.1097/CAD.0b013e32830f9046 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11684575B2 (en) 2014-04-30 2023-06-27 Fujifilm Corporation Liposome composition and method for producing same
CN111437259A (zh) * 2015-11-02 2020-07-24 富士胶片株式会社 包含吉西他滨或其盐的脂质体组合物
US11166913B2 (en) 2015-11-02 2021-11-09 Fujifilm Corporation Tumor therapeutic agent and kit containing gemcitabine liposome composition
US11166914B2 (en) 2015-11-02 2021-11-09 Fujifilm Corporation Tumor therapeutic agent and kit containing gemcitabine liposome composition
CN109641009A (zh) * 2016-08-31 2019-04-16 富士胶片株式会社 抗肿瘤剂、抗肿瘤效果增强剂及抗肿瘤用试剂盒
CN109641009B (zh) * 2016-08-31 2021-12-31 富士胶片株式会社 抗肿瘤剂、抗肿瘤效果增强剂及抗肿瘤用试剂盒
CN112165949A (zh) * 2018-03-16 2021-01-01 Dfb索里亚有限责任公司 使用紫杉烷纳米颗粒治疗宫颈上皮内瘤变(cin)和宫颈癌的局部疗法
US12201723B2 (en) 2018-06-20 2025-01-21 Fujifilm Corporation Combined pharmaceutical formulation comprising gemcitabine-containing liposome composition and immune checkpoint inhibitor
CN110960506A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 中山大学 用于治疗由线粒体功能失调引起的疾病的纳米制剂
CN114377139A (zh) * 2022-03-11 2022-04-22 四川省医学科学院·四川省人民医院 载体、药物递送系统及其应用
CN114377139B (zh) * 2022-03-11 2023-07-04 四川省医学科学院·四川省人民医院 载体、药物递送系统及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013151774A1 (en) 2013-10-10
PL2833905T3 (pl) 2019-01-31
US20190083449A1 (en) 2019-03-21
BR112014024848A2 (pt) 2017-07-11
CA2869460A1 (en) 2013-10-10
TR201809231T4 (tr) 2018-07-23
CY1120523T1 (el) 2019-07-10
ZA201406969B (en) 2020-01-29
MX360092B (es) 2018-10-19
JP2018138613A (ja) 2018-09-06
JP6422920B2 (ja) 2018-11-14
IL259977A (en) 2018-12-02
HK1203844A1 (zh) 2015-11-06
SI2833905T1 (en) 2018-08-31
JP2015514109A (ja) 2015-05-18
ES2673093T3 (es) 2018-06-19
SMT201800366T1 (it) 2018-09-13
US10137104B2 (en) 2018-11-27
IL234703A0 (en) 2014-11-30
CA2986512C (en) 2022-05-17
HRP20181187T1 (hr) 2018-09-21
NZ700073A (en) 2016-08-26
RS57449B1 (sr) 2018-09-28
MX2014011965A (es) 2015-04-08
DK2833905T3 (en) 2018-07-30
LT2833905T (lt) 2018-07-10
AU2013243873B2 (en) 2016-08-25
CN108686203A (zh) 2018-10-23
US20170290796A1 (en) 2017-10-12
CA3152081A1 (en) 2013-10-10
EA031986B1 (ru) 2019-03-29
HUE038744T2 (hu) 2018-11-28
CA2869460C (en) 2018-05-15
KR20160033249A (ko) 2016-03-25
CA2986512A1 (en) 2013-10-10
EP2833905A1 (en) 2015-02-11
JP6042527B2 (ja) 2016-12-14
PT2833905T (pt) 2018-08-06
SG11201406340QA (en) 2014-11-27
KR101809858B1 (ko) 2017-12-15
EP2833905B1 (en) 2018-05-02
US20130302400A1 (en) 2013-11-14
KR101626703B1 (ko) 2016-06-02
EA201401096A1 (ru) 2015-09-30
AU2013243873A1 (en) 2014-10-09
JP2016188250A (ja) 2016-11-04
US9913822B2 (en) 2018-03-13
JP2019199479A (ja) 2019-11-21
MX2022013713A (es) 2022-12-13
IL234703B (en) 2019-12-31
IL259977B (en) 2019-09-26
KR20150002752A (ko) 2015-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10137104B2 (en) Combination therapy with an anti-hyaluronan agent and therapeutic agent
JP6262700B2 (ja) 修飾されたヒアルロニダーゼおよびヒアルロナン関連疾患および状態の治療における使用
JP6113262B2 (ja) 抗ヒアルロナン剤の投与に関連する有害副作用の処置
US20190351031A1 (en) Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150311

RJ01 Rejection of invention patent application after publication