CN100343304C - 水解稳定的马来酰亚胺封端的聚合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水解稳定的马来酰亚胺官能化水溶性聚合物和该聚合物及其前体的制备和使用方法。

Description

水解稳定的马来酰亚胺封端的聚合物
技术领域
本发明涉及特殊的马来酰亚胺封端的水溶性聚合物及该聚合物的制备和使用方法。具体地，本发明涉及：(i)有一或多个末端马来酰亚胺基的水解稳定聚合物，(ii)本文所述马来酰亚胺封端的水溶性聚合物试剂连接在另一物质如活性剂或表面上形成的复合体，(iii)这种聚合物试剂的合成方法，和(iv)包含所述聚合物试剂的组合物等。
背景技术
由于近来生物技术的进步，现在可大规模地制备治疗性蛋白质和其它生物分子例如抗体和抗体片段，使这些生物分子可更广泛地应用。不幸的是潜在的治疗性生物分子通常因其迅速解蛋白降解、生物利用率低、生产、储存或服用时的不稳定性、或因其免疫原性而妨碍其临床有用性。由于服用蛋白质和其它生物分子用于治疗不断受到关注，一直在探索克服这些不足的各种途径。
已经广泛研究的途径之一是通过共价连续水溶性聚合物如聚乙二醇或“PEG”使蛋白质和其它潜在的治疗性分子改性(Abuchowski，A.，et al，J.Biol.Chem.252(11)，3579(1977)；Davis，S.，et al.，Clin.Exp Immunol.，46，649-652(1981))。许多病例表明PEG改性蛋白质(也称为PEG复合体或PEG化蛋白质)的生物学性质比其未PEG化对应物明显改进(Herman，et al.，Macromol.Chem.Phys.，195，203-209(1994))。已表明聚乙二醇改性的蛋白质因耐解蛋白降解性提高在体内的循环时间更长而且耐热性提高(Abuchowski，A.，et al.，J.Biol.Chem.，252，3582-3586(1977))。其它生物分子例如抗体和抗体片段也观察到类似的生物效力提高(Chapman，A.，Adv.Drug Del.Rev.54，531-545(2002))。
通常用活化的PEG衍生物即有至少一个适合与生物分子(例如赖氨酸、半胱氨酸和类似的蛋白质残基)的亲核中心反应的活性末端的PEG使聚乙二醇连接在药物或其它表面上。最常用的是基于活化PEG与蛋白质的氨基如蛋白质的赖氨酸侧链中存在的氨基反应的方法。有适合与蛋白质的氨基反应的活性端基的聚乙二醇包括PEG-醛(Harris，J.M.，Herati，R.S.，Polym Prepr.(Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem)，32(1)，154-155(1991))、混合酐、N-羟基琥珀酰亚胺酯、羰基咪唑化物、和氯氰脲酸酯(Herman，S.，et al.，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。虽然已表明很多蛋白质在PEG改性期间保持活性，但某些情况下通过蛋白质的氨基连接聚合物可能不合乎要求，例如特殊赖氨酸残基的衍生作用使蛋白质失活(Suzuki，T.，et al.，Biochimica et Biophysica Acta 788，248-255(1984))。此外，由于大多数蛋白质都有几个可利用/可接近的氨基，所以生成的聚合物复合体通常是单PEG化、二PEG化、和三PEG化物等的混合物，表征和分离可能很难而且耗时。而且通常不能再现地制备该混合物，这可能在放大以获得管理部门批准和后续工业化过程中产生问题。
避免这些问题的方法之一是采用以非胺官能团为目标的位置选择性聚合物试剂。一个特别有吸引力的目标是蛋白质上的硫羟基，存在于氨基酸(半胱氨酸)中。蛋白质中半胱氨酸通常不如赖氨酸多，因此与这些含硫羟基的氨基酸偶合时蛋白质失活的可能性减小。此外，偶合至半胱氨酸部位通常可以确定的方式进行，导致形成单一种聚合物-复合体。
有硫羟基选择性反应端基的聚乙二醇衍生物包括马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺、硫醇、和二硫化物，其中马来酰亚胺是最通用的。这些衍生物都已用于偶联至蛋白质的半胱氨酸侧链上(Zalipsky，S.Bioconjug.Chem.6，150-165(1995)；Greenwald，R.B.et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17，101-161(2000)；Herman，S.，et al.，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。但这些试剂许多因其合成和提纯困难而尚未广泛应用。
如上所述，有末端马来酰亚胺基团的聚乙二醇衍生物是最通用的硫羟基选择性试剂之一，可商购自许多源。虽然未得到广泛的理解或认识，但本申请人认识到许多PEG-马来酰亚胺在储存和偶合至候选药物上期间是水解不稳定的。更具体地，在偶合前后都观察到马来酰亚胺环有明显的水解。此不稳定性可导致药物-复合体组合物内形成多种药物复合体。不同的药物复合体可能有相似的生物活性，但其药物动力学性质可能不同，使这些组合物不适合给患者服用。此外，极难实现开环和闭环形式药物复合体的分离。另外，此水解不稳定性可能导致不同批药物的不一致性。因此，本申请人意识到本领域仍需要开发适合与生物活性分子偶联(理想的是以位置选择性方式)而且在储存和偶联过程中稳定的新型活化的PEG。本发明满足这些需要。
发明内容
本发明提供一族独特的水解稳定的马来酰亚胺封端的聚合物，其中所述聚合物包含介于聚合物链段和马来酰亚胺基团之间的特殊连接基。
本发明基于以下发现：并入与马来酰亚胺封端聚合物的马来酰亚胺环相邻的无环、环状、或脂环族饱和烃连接基使其不稳定性显著降低。本文所提供的是有水解稳定的马来酰亚胺环的聚合物、其聚合物前体、所述水解稳定的马来酰亚胺封端聚合物的复合体、及该聚合物及其复合体的制备和使用方法。
一般地，本发明涉及一种有以下结构的水溶性聚合物：
Figure C20038010801000231
以上通式结构中，POLY为水溶性聚合物链段，L为赋予相邻的马来酰亚胺环水解稳定性的链节。所述连接基通常包括与马来酰亚胺环相邻的无环、环状或脂环族饱和烃链，共含有约3至约20个碳原子，可选地含有其它非干扰原子或官能团。
更具体地，一方面，本发明涉及一种有以下结构的水溶性聚合物：
Figure C20038010801000241
结构II中，POLY为水溶性聚合物链段，b为0或1，X为包含至少3个邻接的饱和碳原子的水解稳定连接基。优选所述聚合物不存在芳基和酯键。一实施方案中，POLY直接与所述酰胺的羰基碳共价键合，可选地通过中间的氧([O]b)形成氨基甲酸酯。另一实施方案中，POLY通过中间间隔基例如亚甲基与所述酰胺的羰基碳连接，可选地通过中间的氧，([O])在b＝1的情况下。
一实施方案中，X为有总共约3至约20个碳原子的无环、环状或脂环族饱和烃链。更具体地，X可有选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的碳原子总数。连接基X中碳原子总数的优选范围是约3至约20、或约4至约12、或约4至约10、或约5至约8个原子。
式II中的连接基X可有许多结构特征之任一。一实施方案中，X是线性的无环饱和烃链。另一实施方案中，X是支化的无环饱和烃链，可含有一或两个取代基，位于该链的任一个或多个碳位上。例如，X可在相对于所述马来酰亚胺基的α碳、相对于所述马来酰亚胺基的β碳、或相对于所述马来酰亚胺基的γ碳上有支链。对于有最多19个碳原子的烃链而言，可使1至19位(1位是最邻近马来酰亚胺环的)之任一支化。例如，对于表示为C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12-C13-C14-C15-C16-C17-C18-C19-的有2至19个碳原子的典型饱和烃链而言，可使C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18或C19之任一个或多个碳支化，取决于链中碳的总数。优选在任何给定的饱和烃链或脂环族连接基中，4或更少的碳原子是支化的，支化位的总数优选等于1、2、3或4。其中“分支”点一起形成饱和环或环系(例如双环、三环等)的实施方案在后面单独描述。
下面提供根据本发明不同实施方案的典型聚合物。
Figure C20038010801000251
例如，结构III中，y为1至约20的整数；R1和R2独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
优选以上结构III中，R1和R2独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团。Y优选选自3、4、5、6、7、8、9和10。结构III的一种特定实施方案中，R1和R2均为H。
结构III的各种实施方案包括以下结构。
Figure C20038010801000252
说明性结构III-A中，Cα上的R1或R2至少之一选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基，y为至少1而且可有上述特定值之任一。
结构III-A的具体实施方案包括以下的那些：
(i)Cα上的R1和R2独立地选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基，和/或
(ii)其它非Cα的R1和R2变量均为H，和/或
(iii)Cα上的R1或R2至少之一为低级烷基或低级环烷基，和/或
(iv)Cα上的R2为H，和/或
(v)Cα上的R1选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、环戊基、己基、和亚甲基环己基。
本发明此方法的另一具体实施方案以如下结构III-B形式提供。
Figure C20038010801000261
其中R1和R2独立地为烷基或环烷基。或者R1为烷基或环烷基而R2为H。结构III-B的其它实施方案是其中(i)R1和R2独立地为甲基或乙基、和/或R1和R2相同的那些。
结构III的再另一实施方案中，本发明聚合物有以下结构：
Figure C20038010801000262
其中R1和R2独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基，但不都为H，y为至少2。
该结构的具体实施方案包括其中(i)R1和R2独立地为H、低级烷基或低级环烷基，和/或(ii)R1和R2独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、环戊基、己基、和环己基，和/或R2为H的那些。
结构III的再另一实施方案中，
Figure C20038010801000271
与Cγ相连的R1和R2至少之一选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基。具体实施方案包括以下的那些：(i)与Cγ相连的R1和R2至少之一为烷基或环烷基，其它R1和R2变量均为H，和/或(ii)与Cα或Cβ相连的R1变量之一为烷基或环烷基，其它R1和R2变量均为H。
如前面所述，X可以是饱和的环或脂环烃链，即连接基X可包含一或多种环烃。
一般地，本文还提供有以下结构的聚合物：
以上结构中，CYCa为有“a”个环碳的亚环烷基，其中“a”的值在3至12的范围内；p和q独立地为0至20，p+q+a≤20。R1和R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
根据本发明，CYCa包括单环、双环、和三环结构等。
以上结构IV的各种实施方案包括以下的那些：
(i)p和q独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7和8，和/或
(ii)R1每次出现时独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团，R2每次出现时独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团，和/或
(iii)a选自5、6、7、8和9，和/或
(iv)a为6，CYCa为1，1-、1，2-、1，3-或1，4-取代的环己基环，和/或
(v)p和q均独立地在0至4的范围内，和/或
(vi)R1和R2均为H。
对于包含亚环烷基及其上的两个取代基的连接基，所述取代基可以是顺式或反式的。
结构IV的具体实施方案包括：
Figure C20038010801000281
其中q和p如上所述。一实施方案中，q和p均独立地在0至6的范围内。另一实施方案中，q在0至6的范围内，p为0。
根据本发明的有亚环烷基环的再另一典型聚合物结构是：
Figure C20038010801000282
其中q和p如前面所定义，更优选均独立地在0至6的范围内。
本发明聚合物包括单官能、双官能和多官能结构。
例如，本发明聚合物一般可用以下结构描述：
Figure C20038010801000291
其中X和b如前面所定义，b’为0或1，X’为包含至少3个邻接的饱和碳原子的水解稳定的连接基。上述实施方案中，b和b’可相同或不同，X和X’可相同或不同。一实施方案中，所述聚合物试剂是同双官能的，即两个活性端基是相同的。在此情况下，b等于b’，X等于X’。
优选其中有马来酰亚胺的任一聚合物中的水溶性聚合物链段是聚环氧烷、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚唑啉、聚丙烯酰吗啉、或聚氧乙烯化多元醇。一优选实施方案中，所述聚合物链段是聚环氧烷，优选聚乙二醇。
根据一种实施方案，所述聚乙二醇链段包含以下结构：Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中n为约10至约4000，Z为包含选自羟基、氨基、酯、碳酸酯、醛、链烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、硫醇、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰肼、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、烷氧基、苄氧基、硅烷、类脂、磷脂、生物素、和荧光素的官能团的部分。该实施方案中，Z包含反应性官能团或封端基团。
再具体的实施方案中，POLY可被封端部分如烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基、取代的芳氧基、或磷脂封端。优选的封端基包括甲氧基、乙氧基、和苄氧基。
POLY一般有落入以下范围之一内的标称平均分子质量：约100至约100 000道尔顿、约1 000至约50 000道尔顿、或约2 000至约30 000道尔顿。POLY的优选分子质量包括250Da(道尔顿)、500Da、750Da、1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、30kDa、40kDa、和50kDa，或者更大。
该聚合物链段可有许多几何图形之任一，例如可为线形、支化或叉状。
本发明聚合物可以是多臂的。根据本发明的典型多臂聚合物有以下结构：
Figure C20038010801000301
上述结构中，d为3至约100的整数，R为有3或更多个羟基、氨基或其组合的中心分子的残基。优选d为3至约12的整数。
另一多臂实施方案中，所述聚合物对应于以下结构：
该结构中，
PEG为-(CH2CH2O)nCH2CH2-，
M为：
Figure C20038010801000311
m选自3、4、5、6、7和8。
再另一方面，本文提供有上述特征和典型结构的聚合物，除上述聚合物中的马来酰亚胺基团被氨基、优选伯氨基(-NH2)代替之外。此类聚合物不仅适合作活性聚合物试剂例如连接至活性剂上，而且是本发明稳定马来酰亚胺聚合物的前体。
例如，本发明包括以下结构的水溶性聚合物：
Figure C20038010801000312
其中变量X和b如前面所述(一般和具体实施方案中所述)。优选所述聚合物不存在芳基和酯键。
再另一方面，本发明提供有以下结构的水溶性聚合物：
Figure C20038010801000313
其中POLY为水溶性聚合物链段，X为水解稳定的连接基，是有总共约3至约20个碳原子的饱和的环或脂环烃链。优选所述聚合物不存在芳基和酯键。
根据本发明此方面的聚合物包括其中X对应于本文所述通用和具体的环和脂环烃结构的那些。
结构XIII的一种具体实施方案中，连接基X有以下结构：
Figure C20038010801000321
其中
CYCa为有“a”个环碳的亚环烷基，其中“a”的值在3至12的范围内；p和q独立地为0至20，p+q+a≤20。结构XIII-A中，R1和R2每次出现时均独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。在CYCa仅有两个取代基的情况下，此取代基可以是顺式或反式的。
结构XIII-A的再另一实施方案中，p和q均独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7和8。
结构XIII-A的再另一实施方案中，R1每次出现时独立地为H或选自低级烷基、低级环烷基、和低级亚烷基环烷基的有机基团，R2每次出现时独立地为H或选自低级烷基、低级环烷基、和低级亚烷基环烷基的有机基团。
结构XIII-A的再另一实施方案中，a选自5、6、7、8和9。
结构XIII-A的一种优选实施方案中，a为6，CYCa为1，1-、1，2-、1，3-或1，4-取代的环己基环。其它实施方案包括其中p和q均独立地在0至4的范围内，和/或其中R1和R2每次出现时均为H的那些。
具体地，结构XIII的一些实施方案包括：
Figure C20038010801000331
其中q和p均独立地在0至6的范围内。
结构XIII的再另一实施方案中，CYCa为双环或三环。
再另一方面，本发明包括用本文所述任一或多种聚合物制备的水凝胶。
再另一方面，提供一种水解稳定的马来酰亚胺封端聚合物的制备方法。该方法包括以下步骤：(a)使有结构POLY-[O]b-C(O)-LG(IX)的聚合物与有结构NH2-X-NH2(XII)的二胺在能形成POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH2(X)的条件下反应，然后(b)使POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH2(X)转化成POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL(II)。
变量POLY、b和X如前面所述(一般和具体地描述的)，LG代表离去基团，MAL为马来酰亚胺。优选所得产物POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL不存在芳基和酯键。
该方法可用于制备本文所述马来酰亚胺封端的聚合物之任一。
优选的离去基团包括卤离子、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、对硝基酚根。
该方法之一实施方案中，所述NH2-X-NH2试剂中的氨基之一处于被保护态。在此情况下，该方法一般包括在所述反应步骤之后使POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2中的氨基脱保护。
所述反应步骤通常在有机溶剂中进行。典型的溶剂包括乙腈、氯代烃、芳烃、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、和二甲亚砜。
该方法的另一实施方案中，所述反应步骤在惰性气氛如氮气或氩气下进行。
进行所述反应步骤的温度在约0至100℃的范围内。
另一实施方案中，所述反应步骤在碱存在下进行。典型的碱包括三乙胺和其它类似的叔胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶、和无机碱如碳酸钠。
一优选实施方案中，该方法还包括在所述转化步骤之前使步骤(a)所得产物纯化的步骤，例如通过柱色谱法、优选通过离子交换色谱法。
再另一具体实施方案中，所述转化步骤包括使POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2与选自N-甲氧羰基马来酰亚胺、外-7-氧杂[2.2.1]双环庚烷-2，3-二甲酸酐、和马来酐的试剂在反应混合物中适合形成POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL的条件下反应。
所述试剂为N-甲氧羰基马来酰亚胺的实施方案中，所述转化步骤优选在水或水与水混溶性溶剂如丙酮或乙腈的混合物中进行。
所述试剂为马来酐的上述方法的实施方案中，所述转化步骤包括使POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2与马来酐在能形成作为中间体的POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH-C(O)CH＝CHCOOH(XI)的条件下反应，然后将POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH-C(O)CH＝CHCOOH在能通过消去水促使环化的条件下加热形成POLY-[O]b-C(O)-NH-X-MAL。
一般地，所述方法还包括从反应混合物中回收产品POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL的步骤。
优选所回收的产品纯度大于约80％，除所要产品之外不存在聚合物杂质。
用于所述方法的典型二胺包括：
Figure C20038010801000351
和
Figure C20038010801000352
其中所述变量包括前面一般和具体地描述的那些。
再另一方面，本文提供制备本发明水解稳定的马来酰亚胺封端聚合物的另一方法。该方法包括使POLY-[O]b-C(O)-LG(IX)与H2N-X-MAL(XIV)在能形成POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL(II)的条件下反应的步骤，其中所述变量POLY、b、X、LG和MAL如前面所定义(一般和具体的，与举例时所用实施方案无关)。
再另一方面，本发明提供生物活性剂与本文所述水解稳定的马来酰亚胺-或氨基-封端聚合物之任一反应形成的复合体。
更具体地，本发明该方面之一实施方案包括包含以下结构的复合体：
其中变量POLY、b和X如前面所定义(一般和具体的，与举例实施方案无关)，“POLY-[O]b-C(O)-HN-X-”不存在芳基和酯键，“-S-生物活性剂”代表包含硫羟基(-SH)的生物活性剂。
一实施方案中，提供包含上述复合体的组合物。一种更具体的实施方案中，所述复合体组合物包含单一种聚合物复合体。
再另一实施方案中，本发明涉及包含以下结构的复合体：
Figure C20038010801000361
其中POLY、b和X如前面所定义(一般和具体的)，“POLY-[O]b-C(O)-NH-X-”不存在芳基和酯键，“-NH-生物活性剂”代表包含氨基的生物活性剂。
再另一相关方面，本发明提供一种聚合物复合体的形成方法，该方法包括使包含活性硫羟基的生物活性剂“HS-生物活性剂”与本发明水解稳定的马来酰亚胺封端的聚合物在能形成有以下结构的聚合物复合体的条件下接触的步骤：
Figure C20038010801000362
结合以下附图和详述阅读时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更显而易见。
附图说明
图1A和1B提供包含水解稳定的环状(包括双环和三环)连接基的本发明典型聚合物马来酰亚胺的结构，和
图2提供适用于制备本发明一些稳定聚合物马来酰亚胺的典型二胺的结构。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的聚合物、合成技术、和活性剂等，因为这些都是可以改变的。还应理解本文所用术语仅用于描述具体实施方案而不是要限制。
本发明的描述和权利要求中，按下述定义使用以下术语。
定义
本文所用以下术语有所指含义。
在说明书和所附权利要求书中使用时，除上下文明确规定之外，所述单数形式“一种”包括复数对象。
本文所用“PEG”或“聚乙二醇”意指包括任何水溶性的聚环氧乙烷。本发明所用PEGs通常包括以下两种结构之一：“-(CH2CH2O)n-”或“-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-”，取决于端氧是否已被置换，例如在合成置换过程中。变量(n)在3至3000的范围内，总PEG的端基和体系结构可以改变。PEG还包含连接基部分(在后面更详细地描述)时，构成连接基的原子(与PEG链段共价连接时)不导致形成(i)氧-氧键(-O-O-，过氧键)或(ii)氮-氧键(N-O、O-N)。“PEG”意指包含占大多数即大于50％的-CH2CH2O-亚单元的聚合物。适用于本发明的PEGs包括有各种分子量、结构或几何形状(例如支化、线形、叉状PEGs和树枝状等)的PEGs，在后面更详细地描述。
“PEG二醇”也称为α，ω-二羟基聚乙二醇，可用简式表示为HO-PEG-OH，其中PEG如前面所定义。
本发明聚合物上下文中的“水溶性”或“水溶性聚合物链段”是在室温下可溶于水的任何链段或聚合物。典型地，水溶性聚合物或链段将透射相同溶液在过滤后所透射光的至少约75％、更优选至少约95％的光。基于重量，水溶性聚合物或其链段优选至少约35％(重)溶于水、更优选至少约50％(重)溶于水、还更优选约70％(重)溶于水、还更优选约85％(重)溶于水。但最优选所述水溶性聚合物或链段约95％(重)溶于水或完全溶于水。
“封端”或“封端的”基团是聚合物如PEG的末端上存在的惰性或非活性基团。封端基是在典型合成反应条件下不易经历化学转变的基团。封端基一般为烷氧基-OR，其中R是由1-20个碳组成的有机基团，优选为低级烷基(例如甲基、乙基)或苄基。“R”可以是饱和或不饱和的，包括芳基、杂芳基、环、杂环、及上述任一的取代形式。例如，封端的PEG通常包含结构“RO-(CH2CH2O)n-”，其中R如前面所定义。或者，封端基可能还利于包含可检测标记。所述聚合物有包含可检测标记的封端基时，可用适合的检测仪测定该聚合物和/或与该聚合物偶联的部分(例如活性剂)的量或位置。此标记包括但不限于荧光剂、化学发光剂、酶标记中所用部分、比色的(例如染料)、金属离子、和放射性部分等。所述封端基可能还利于包括磷脂。聚合物有诸如磷脂等封端基时，使该聚合物具有独特性质(例如能与类似封端的聚合物形成组织结构)。典型的磷脂包括但不限于选自称为磷脂酰胆碱的磷脂类的那些。具体的磷脂包括但不限于选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山俞酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱、和卵磷脂的磷脂酰胆碱。
就本发明聚合物而论的“非天然存在”意指其总体上在自然界中未发现的聚合物。但本发明非天然存在的聚合物可包含一或多种天然存在的亚单元或亚单元链段，只要总聚合物结构在自然界未发现。
本发明水溶性聚合物如PEG上下文中的“分子质量”意指聚合物的标称平均分子质量，通常用粒度排阻色谱法、光散射技术、或在1，2，4-三氯苯中固有速度测定法测定。本发明聚合物通常是多分散性的，有小于约1.20的低多分散性值。
术语“反应性”或“活性”意指在常规有机合成条件下容易或以实用的速率反应的官能团。这与不反应或需要强催化剂或不实用的反应条件使之反应的那些基团(即“非活性”或“惰性”基团)相反。
就反应混合物中分子上存在的官能团而论的“不易反应”或“惰性”表示该基团在所述反应混合物中能产生所要反应的条件下基本上保持完好。
“保护基”是防止或阻止分子中特定的化学反应官能团在一定反应条件下反应的部分。保护基随要被保护的化学反应基团的类型以及所采用的反应条件和分子中其它反应可保护基的存在而改变。可被保护的官能团包括例如羧酸基、氨基、羟基、硫羟基、和羰基等。用于羧酸的典型保护基包括酯(如对甲氧基苄酯)、酰胺和酰肼；用于氨基的典型保护基包括氨基甲酸酯(如叔丁氧羰基)和酰胺；用于羟基的典型保护基包括醚和酯；用于硫羟基的典型保护基包括硫醚和硫酯；用于羰基的典型保护基包括缩醛和缩酮；等等。此保护基为本领域技术人员公知，描述在例如T.W.Greene and G.M.Wuts，Protecting Groupsin Organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999及其中所引参考文献中。
“被保护形式”的官能团意指带保护基的官能团。本文所用术语“官能团”或其任何同义词意指包括其被保护形式。
本文所用术语“连接基”意指可选地用于连接互连部分如聚合物链段和马来酰亚胺的原子或原子集。本发明的连接基一般是水解稳定的。
“生理上可开裂”或“可水解”或“可裂变”的键是在生理条件下与水反应(即水解)的较弱键。键在水中水解的趋势不仅与连接两中心原子的键合类型有关而且与这些中心原子上所连取代基有关。适当的水解不稳定或弱键合包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和低聚核苷酸、硫酯、硫羟酸酯、和碳酸酯。
“可酶解的键”意指通过一或多种酶使之降解的键。
对于本发明特别是本发明聚合物而言，“水解稳定的”键合或连接基意指在正常生理条件下水解稳定的原子或原子集。即水解稳定的键合在生理条件下长期不发生任何明显的水解作用。水解稳定键的例子包括但不限于以下：碳-碳键(例如脂肪链中)、醚、酰胺、氨基甲酸酯、和胺等。典型化学键的水解速率可在大多数标准化学教科书中找到。
关于本发明聚合物的“水解稳定的马来酰亚胺环”是比其无连接基的聚合物马来酰亚胺对应物的开环稳定性更耐马来酰亚胺环水解的。例如，如果水溶性马来酰亚胺有以下结构：CH3O-(CH2CH2O)5k-CH2CH2-C(O)-NH-CH2-1，3-C6H10-CH2-MAL，其中连接基为-C(O)-NH-CH2-1，3-C6H10-CH2-，则构成对比基础的相应无连接基型式为CH3O-(CH2CH2O)5k-CH2CH2-MAL。此水解作用评价通常在室温下在磷酸盐缓冲液中于pH 7.5下进行，通过观测马来酰亚胺环的UV吸收测量。因此，本发明聚合物试剂中所含水解稳定的马来酰亚胺环是水解稳定性比其无连接基的对应物改进的。优选根据本发明的水解稳定的马来酰亚胺环产生在上述条件下水解半衰期为至少约16小时、更优选至少约20小时的稳定聚合物马来酰亚胺。
关于聚合物的几何形状或总结构的“支化”意指聚合物有2或多个聚合物“臂”。支化聚合物可有2、3、4、6、8或更多个聚合物臂。一类高度支化的聚合物是树枝状聚合物或树枝状物，对于本发明而言视为有不同于支化聚合物的结构。
“支化点”意指分歧点，包括聚合物从线形结构中分裂或支化成一或多个附加聚合物臂的一或多个原子。
“树枝状聚合物”是其中所有键都从中心焦点或芯放射状地显露出来有规则的支化图案和均提供支化点的重复单元的球形单分散聚合物。树枝状聚合物表现出某些树枝态性质如芯包封，使之不同于其它类型的聚合物。
“基本上”意指几乎全部或完全，例如某给定量的95％或更大。
“烷基”或“亚烷基”(取决于其在分子中的位置和该基团与氢以外原子连接点的数量)意指烃链或部分，长度通常在约1至20个原子范围内。此烃链优选但不必是饱和的，除非这样指出，可以是支链或直链，但通常优选为直链。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基、己基、和庚基等。
“低级烷基”或“低级亚烷基”意指含有1至6个碳原子的如上所定义的烷基或亚烷基，可以是直链或支链的，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
“环烷基”或“亚环烷基”(取决于其在分子中的位置和与氢以外原子连接点的数量)意指饱和或不饱和的环烃链，包括多环如桥连的、稠合的、或螺环化合物，优选由3至约12个碳原子、更优选3至约8个碳原子组成。
“低级环烷基”或“低级亚环烷基”意指含有1至6个碳原子的环烷基。
“脂环族”意指包含碳原子环的任何脂族化合物。脂环基是包含被一或多个烷基或亚烷基取代的如上所定义的“环烷基”或“亚环烷基”的基团。
“非干扰取代基”是存在于分子中时通常不与该分子中所含其它官能团反应的那些基团。
术语“取代的”例如在“取代的烷基”中意指被一或多个非干扰取代基取代的部分(例如烷基)，所述非干扰取代基的例子包括但不限于：C3-C8环烷基，例如环丙基和环丁基等；卤基，例如氟基、氯基、溴基和碘基；氰基；烷氧基；低级苯基；和取代的苯基等等。对于苯环上的取代，所述取代基可处于任何定位(即邻、间、或对位)。
“烷氧基”意指-O-R基，其中R为烷基或取代的烷基，优选C1-C20烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄基等)，优选C1-C7。
本文所用“链烯基”意指含有至少一个双键的长度为1至15个原子的支化或未支化的烃基，如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、和十四碳烯基等。
本文所用术语“炔基”意指含有至少一个三键的长度为2至15个原子的支化或未支化的烃基，例如乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、正丁炔基、异丁炔基、辛炔基、和癸炔基等等。
“芳基”意指有5或6个中心碳原子的一或多个芳环。芳基包括多芳环，可以是稠合的(如萘基中)或非稠合的(如联苯基中)。芳环还可与一或多个环烃、杂芳基或杂环稠合或未稠合。本文所用“芳基”包括杂芳基。
“杂芳基”是含有一至四个杂原子(优选N、O或S或其组合)的芳基。杂芳基环还可与一或多个环烃、杂环、芳基或杂芳环稠合。
“杂环”或“杂环族”意指一或多个有或没有不饱和或芳香性而且有至少一个非碳环原子的5-12原子、优选5-7原子的环。优选的杂原子包括硫、氧和氮。
“取代的杂芳基”是有一或多个非干扰基作为取代基的杂芳基。
“取代的杂环”是有一或多个由非干扰取代基形成的侧链的杂环。
“亲电体”意指能与亲核体反应的有亲电中心(即寻电子中心)的离子、原子、或原子集(可以是离子的)。
“亲核体”意指能与亲电体反应的有亲核中心(即寻找亲电子中心的中心)的离子、原子、或原子集(可以是离子的)。
本文所用“活性剂”包括具有可经体内或体外证明的某些药理(通常是有益的)效果的任何试剂、药物、化合物、物质组合物或混合物。这包括食品、食品增补剂、营养素、营养物、药物、疫苗、抗体、维生素、和其它有益试剂。本文所用这些术语还包括使患者产生局部或全身效应的任何生理学或药理学活性物质。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”意指可包含在本发明组合物中而且不给患者带来明显毒副作用的赋形剂。
“药理有效量”、“生理有效量”和“治疗有效量”在本文中可互换使用，意指药物制剂中存在的在血液或目标组织内提供所要量的活性剂和/或复合体所需PEG-活性剂复合体的量。确切的量取决于许多因素，例如具体的活性剂、药物制剂的组分和物理特性、目标患者群体、和患者情况等，基于本文所提供的和相关文献中可利用的信息，本领域技术人员可很容易地确定。
本发明聚合物上下文中的“多官能”意指其中含有3或更多官能团的聚合物主链，其中所述官能团可相同或不同，通常存在于聚合物末端。本发明多官能聚合物通常含有约3-100个官能团、或3-50个官能团、或3-25个官能团、或3-15个官能团、或3-10个官能团、或在聚合物主链内含有3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。
“双官能”聚合物意指其中含有两个官能团的聚合物，通常在聚合物末端。所述官能团相同时，称该聚合物是同双官能的。所述官能团不同时，称该聚合物是异双官能的。
本文所述碱性或酸性反应物包括中性的、带电的、及其任何相应盐形式。
“聚烯烃醇”意指包含烯烃聚合物主链如聚乙烯的有多个与聚合物主链相连的侧羟基的聚合物。典型的聚烯烃醇是聚乙烯醇。
本文所用“非肽式”意指基本上不含肽键的聚合物主链。但该聚合物可包括少量沿重复单体亚单元隔开的肽键，例如不多于约1个肽键/约50个单体单元。
术语“患者”意指遭受或倾向于可通过服用本发明聚合物(通常但不必以聚合物-活性剂复合体形式)预防或治疗的状况的生物机体，包括人和动物。
“可选的”或“可选地”意指随后所述情况可出现或不出现，从而该描述包括出现所述情况的例子和不出现所述情况的例子。
“残基”意指分子与一或多种分子反应后剩余的部分。例如，本发明聚合物复合体中的生物活性分子残基是生物活性分子与聚合物主链共价键合后剩余的部分。
术语“复合体”是要意指分子例如生物活性分子或任何反应性表面与反应性聚合物分子(优选反应性聚乙二醇)共价连接形成的实体。
术语“吸电子基团”意指通过中介机理(即通过π键增加或除去局部电子密度)或感应机理(即负电部分沿σ键抽吸电子密度从而使该键极化)使电子密度朝自身方向移动而远离分子的其它区域的化学部分。
术语“位阻”意指两化学基团之间的空间物理干扰。
稳定的聚合物马来酰亚胺-一般特征
本发明提供水溶性非肽式聚合物，其马来酰亚胺环比其无连接基的马来酰亚胺对应物更水解稳定。一般地，通过在聚合物链段和马来酰亚胺之间引入连接基赋予耐水解性(即关于马来酰亚胺环)的特征。所述连接基通常包括与所述马来酰亚胺的氮原子共价连接而且直接相邻的无环、环状、或脂环族饱和烃链。设计该烃链(可包括取代或未取代形式的亚烷基、环烷基或其组合)的结构和尺寸通过以下方式阻止马来酰亚胺开环：i)在马来酰亚胺和连接基或聚合物链段中的任何吸电子基团之间形成足够的距离，从而能使电子释放给马来酰亚胺环，和/或ii)为所述水解过程提供位阻。这样，本文所述连接基使马来酰亚胺环抗水解和所致开环。因此，本发明马来酰亚胺封端的聚合物表现出更大的稳定性，例如在合成、分离和储存时，可在宽pH值范围内与生物活性分子连接而不产生大量开环复合体。本文所提供的水解数据表明此点。实施例I、II、III、IV、V、IX、X、XI和XII中描述典型的稳定聚合物马来酰亚胺的合成。可见，直链无环、支链无环、和脂环连接基都能提高相邻马来酰亚胺环的稳定性。实施例VII、VIII和XIII中给出说明所述聚合物试剂及其相应复合体的此特征的水解数据。
如后面更详细地描述的连接基可还包括一或多种非烃类水解稳定的非反应性原子或原子集，如羟基、硫、和氧等。
本发明马来酰亚胺官能的聚合物优选在宽pH范围如约5至约10内是水解稳定的。最优选本发明反应性聚合物马来酰亚胺在适合与生物活性分子如蛋白质上的硫羟基或氨基连接的pH下是水解稳定的。例如，本发明聚合物优选在约7至约10、更优选约7至约8.5的pH下抗水解所致马来酰亚胺开环的(即如果未连接则不易形成马来酸或如果连接则不易形成琥珀酸)。如本文所定义，水解稳定的马来酰亚胺是其中马来酰亚胺在水介质(例如磷酸盐缓冲液)中25℃和pH 7.5下的半衰期为至少约16小时、更优选至少约20小时、最优选至少约28小时。
聚合物马来酰亚胺的半衰期可通过用HPLC测量马来酰亚胺封端聚合物的浓度随时间的变化或通过观测马来酰亚胺环的UV吸收确定。
与马来酰亚胺基相邻的无环、环状或脂环族饱和烃连接基优选有至少3个碳原子的链长，含有至少3个邻接碳原子。更优选该连接基有至少约4个碳原子、最优选至少约5或6个碳原子。所述链长以构成连接马来酰亚胺的氮原子与聚合物链段的最短原子链的碳原子数度量。所述连接基包括链取代基中碳原子总数通常在4至约20个原子、优选4至约12个原子、更优选4至约10个原子、最优选5至约8个原子的范围内。本发明包括有例如4、5、6、7、8、9、10、11和12个总碳原子的连接基。
聚合物马来酰亚胺的一般结构特征
一般来说，本发明反应性聚合物有通过水解稳定的连接基与马来酰亚胺环相连的水溶性聚合物链段。所述水解稳定的连接基能赋予直接与之共价连接的马来酰亚胺环水解稳定性。更具体地，所述聚合物链段(本文中一般称为POLY)通过中间的-O-、-C(O)-NH-、或O-C(O)-NH-基与水解稳定的连接基X共价连接。X通常含有至少3个邻接的饱和碳原子。优选但不必要，所得聚合物马来酰亚胺不存在芳基和酯键。
本文还提供有针对稳定的聚合物马来酰亚胺描述的一般和具体说明的结构特征的聚合物，除马来酰亚胺环被氨基、优选伯氨基代替之外。因此，所有结构和本文中关于马来酰亚胺封端聚合物试剂的描述都应扩展至如上所述氨基封端的对应物。
连接基X通常含有约1至约20个碳原子。一般地，X为仅有碳和氢原子的烃链，但某些实施方案中，X可含有其它非反应性原子或官能团如羟基、醚、硫醚、或其它非反应性基团。优选此类基团或原子在远离马来酰亚胺环的位置。更优选此类非反应性原子或基团在距马来酰亚胺的氮至少4个碳的位置。甚至更优选X中所含此类附加非反应性原子或基团在距马来酰亚胺的氮至少4个碳、至少5个碳或至少6个碳或更远的位置。此类基团包含在环烷基或脂环族X内的可能性比在其无环对应物中更大，因其存在于很多商购原料中。
本发明聚合物马来酰亚胺一般用下式表征：
Figure C20038010801000451
其中b为0或1。结构I中，羰基和-NH基都不存在(即下标均等于0)时，b等于1。连接基X的特征在以下部分中更详细地描述和举例。
连接基部分
如前面所述，连接基X包含与马来酰亚胺环的氮原子相邻的无环或环状或脂环族饱和烃部分。设计X的尺寸和结构改善马来酰亚胺环的水解稳定性，一般通过增大马来酰亚胺环与分子中存在的吸电子基团的距离或为马来酰亚胺的水解反应提供位阻。X通常包含总共约3至约20个碳原子。更具体地，X可有选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的碳原子总数。连接基X中碳原子总数的优选范围是约3至约20、或约4至约12、或约4至约10、或约5至约8个原子。
典型的烃链包括含至少3个邻接碳原子的直链饱和无环烃，如三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、和六亚甲基等等。即在最简单的形式中，X等于-(CH2)y，其中y在3至约20的范围内。即Y可有以下任一值：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。X还可以是支链的，即可包含一或两个取代基，位于该链的任一个或多个碳位上。即X可在相对于所述马来酰亚胺基的α碳、相对于所述马来酰亚胺基的β碳、或相对于所述马来酰亚胺基的γ碳上有支链。对于有最多19个碳原子的烃链而言，可使1至19位(1位是最邻近马来酰亚胺环的)之任一支化。例如，对于表示为C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12-C13-C14-C15-C16-C17-C18-C19-的有2至19个碳原子的典型饱和烃链而言，可使C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18或C19之任一个或多个碳支化，取决于链中碳的总数，即可有一或两个取代基。支链基通常为烷基、取代的烷基、环烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、或取代的亚烷基环烷基。特别优选的环烷基是环戊基、环己基、和环庚基等，上述环烷基之任一有连接环烷基环与支化碳的一或多个亚烷基(例如亚甲基、二亚甲基、三亚甲基、四亚甲基等)。优选在任何给定的饱和烃链或脂环族连接基中，4或更少的碳原子是支化的，支化位的总数优选等于1、2、3或4。其中“分支”点一起形成饱和环或环系(例如双环、三环等)的实施方案在后面单独描述。最优选X被支化时，支化碳被单支化，即有一个而非两个支化取代基。
例如，该链可有以下结构：-(CR1R2)y-，其中R1和R2独立地为H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基，y为约1至约20、优选约3至约20、更优选4至约12的整数。X被支化时，优选该支化位于C1、C2、C3或C4之一或多个之上，即最邻近马来酰亚胺环的碳原子位，为马来酰亚胺环的水解反应提供最大的位阻。(论述连接X内的碳原子位时，C1指与马来酰亚胺的氮相邻的碳原子)。X被支化时，支链基(例如烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基)通常包含少于8个碳原子。支链基为烷基或环烷基时，优选该烷基是低级烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、环戊基、己基和环己基。
如前面所述，连接基X本身可以是环或脂环的。具体地，X可有以下形式：
Figure C20038010801000471
其中CYCa为有“a”个环碳的亚环烷基，其中“a”的值在3至12的范围内；p和q独立地为0至20，p+q+a≤20，R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团，R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。一优选实施方案中，R1和R2每次出现时均为H。优选p和q独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。甚至更优选p和q独立地在0至6或0至4的范围内。优选用CYCa表示环烷基环含有5至约12个环碳原子、甚至更优选约6至约10个环碳原子。典型的环烷基包括C3-C8亚环烷基，如亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、和亚环庚基、和亚环辛基。CYCa可任选地被一或多个烷基(优选低级烷基)取代，该取代基可位于环内任何位置。在CYCa被两个取代基即以上结构IV中所示(CR1R2)p和(CR1R2)q取代的情况下，所述取代基同样可位于环中任一或多个碳上。例如，对于亚环戊基而言，取代基可位于1，1-、1，2-、或1，3-位。对于亚环己基环，取代基可位于1，1-、1，2-、1，3-、或1，4-位。特别优选的实施方案是其中R1和R2均为H、p和q独立地选自0、1、2和3的那些。举例说明的连接基包括1，2-(CH2)0，1，2，3-C6H4-(CH2)0，1，2，3、1，3-(CH2)0，1，2，3-C6H4-(CH2)0，1，2，3、和1，4-(CH2)0，1，2，3-C6H4-(CH2)0，1，2，3。其中CYCa仅有两个取代基的情况下，取代基可以是顺式或反式的。CYCa含有多于两个取代基时，取代基可处于任何相对定位。
CYCa还包括双环。对应于CYCa的典型双环包括例如双环[1.1.1]戊烷、双环[2.2.1]己烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、双环[3.1.0]己烷、双环[3.1.1]庚烷、双环[3.2.1]辛烷、双环[3.3.1]壬烷、双环[3.3.2]癸烷、和双环[3.3.3]十一烷等环。CYC还包括三环环系如金刚烷。这些双-和三环体系的一些示于下面：
Figure C20038010801000481
这些环可有位于环系内任何可用位置的对应于-[C(R1)(R2)]p和-[C(R1)(R2)]q的亚烷基或取代的亚烷基。此外，所述双环或三环还可有除-[C(R1)(R2)]p和-[C(R1)(R2)]q之外的其它取代基。优选此取代基为低级烷基、羟基、巯基、或卤素。图1A和1B中给出有双环和三环环系的代表性聚合物马来酰亚胺。
结构I中的链节L可还包括与聚合物链段相邻和与上述X互连的非烃部分。与聚合物链段相邻的典型非烃部分包括-O-、-O-C(O)-NH-、-C(O)-NH-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、NH-C(O)-NH-、-NH-、和-S-，优选是水解稳定的。特别优选的非烃部分包括-O-、-O-C(O)-NH-、-C(O)-NH-。一种不优选的实施方案中，所述酰氨或氨基甲酸酯官能团的氮是叔氮，例如有甲基或乙基或类似基团代替所示氢。
根据本发明的包括烃链的典型链节示于下表1中。
表1.马来酰亚胺封端聚合物的典型连接基
Figure C20038010801000501
Figure C20038010801000502
Figure C20038010801000503
L2＝-NH-Q-
L3＝-O-Z
  名称   Z
  L3-ETL3-TMEL3-TEMEL3-PENTL3-HEXA   亚乙基，-(CH2)2-三亚甲基，-(CH2)3-四亚甲基，-(CH2)4-五亚甲基，-(CH2)5-六亚甲基，-(CH2)6-
L4＝-CH2-W-
Figure C20038010801000511
Figure C20038010801000521
Figure C20038010801000522
Figure C20038010801000523
表1中的许多链节有阻止马来酰亚胺环水解，但某些比其它更有效。表1中的几种链节提供位阻防止马来酰亚胺环的氮被水侵袭，使马来酰亚胺抗水解。这些连接基包括含有L4-TMPA、L4-CMEN、L5-TMPE、L1-TEPE、L2-EPEN、L4-ETPA和L4-HEDA的那些。包含L4-TMPA和L5-TMPE(基于易得的相应对称叔二胺)和L4-CMEN(基于商购的天然存在的对甲薄荷烷的二胺衍生物)的连接基是通过在环和吸电子基之间提供位阻和适当间距降低马来酰亚胺环水解速率的典型链节。特别优选的是含有亚环己基环的连接基，如表4中提供的水解数据所示。从水解数据可见，1，3-二亚甲基-亚环己基连接基赋予所得PEG-马来酰亚胺特殊的耐水解稳定性。事实上，其水解半衰期比其无连接基的马来酰亚胺对应物长8倍。1，4-二亚甲基-亚环己基连接基也得到水解半衰期比其无连接基的马来酰亚胺对应物长2.5倍以上的稳定马来酰亚胺聚合物。
聚合物链段
如以上结构中所示，本发明马来酰亚胺封端的聚合物包含水溶性聚合物链段。典型的POLY包括聚烷撑二醇如聚乙二醇、聚丙二醇(“PPG”)、乙二醇-丙二醇共聚物、聚烯烃醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羟烷基甲基丙烯酰胺、聚羟烷基甲基丙烯酸酯、多糖、聚α-羟基酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚唑啉、和聚N-丙烯酰吗啉。POLY可以是以上任意的均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚体、无规三聚体、或嵌段三聚体。所述水溶性聚合物链段优选但不必为聚乙二醇“PEG”或其衍生物。
所述聚合物链段可有许多不同几何形状之任一，例如POLY可以是线形、支化、或叉状。最典型地，POLY为线形或支化的，例如有2个聚合物臂。虽然本文的论述大多集中于PEG作为说明性POLY，但本文所提供的论述和结构可很容易地扩展至包括上述任何水溶性聚合物链段。
任何有至少一个反应性末端的水溶性聚合物都可用于制备本发明聚合物马来酰亚胺，在此方面本发明不受限制。虽然可使用仅有一个反应性末端的水溶性聚合物，但适合转化成本文所述稳定的聚合物马来酰亚胺的有二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多反应性末端的聚合物也可使用。有利地，随着水溶性聚合物链段上羟基或其它反应性部分的数量增加，可用于引入连接马来酰亚胺基的位置数增加。与水溶性聚合物链段相连的羟基和/或反应性部分数量上限的非限制性实例包括约1至约500、约1至约100、约1至约80、约1至约40、约1至约20、和约1至约10。
现转向优选的POLY，PEG包括线形、支化或多臂之任一形式的聚乙二醇，包括封端的PEG、叉状PEG、支化PEG、侧PEG、和不优选的含有一或多个使单体亚单元隔开的可降解链的PEG，后面更详细地描述。本发明一实施方案中，所述聚合物链段不存在酯键。
PEG聚合物链段包括以下：-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中(n)通常在约3至约4000、或约3至约3 000、或更优选约20至约1 000的范围内。
POLY还可以是封端的，例如其中PEG以惰性封端基封端的封端PEG。优选的封端PEG是有诸如烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基、取代的芳氧基等封端部分的那些。优选的封端基是甲氧基、乙氧基和苄氧基。所述封端基还利于包含磷脂，但所述聚合物也可不存在类脂。典型的磷脂包括磷脂酰胆碱如二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山俞酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱、和卵磷脂。
关于包含聚合物链段POLY的任一结构，POLY可对应或包括以下：
“Z-(CH2CH2O)n-”或“Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-”，
其中n在约3至约4000、或约10至约4000的范围内，Z为或包括官能团，可以是活性基团或封端基。Z的例子包括羟基、氨基、酯、碳酸酯、醛、缩醛、醛水合物、酮、缩酮、酮水合物、链烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、硫醇、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰肼、脲、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、烷氧基、苄氧基、硅烷、类脂、磷脂、生物素、和荧光素，适合的情况下包括其活化和保护形式。优选的是诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯、苯并三唑基碳酸酯、胺、乙烯基砜、马来酰亚胺、N-琥珀酰亚胺基碳酸酯、酰肼、琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基酯、缩水甘油醚、氧羰基咪唑、对硝苯基碳酸酯、醛、邻吡啶基二硫化物、和丙烯酰等官能团。
这些和其它官能团Z描述在以下参考文献中(均引入本文供参考)：
N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(参见例如US 5 281 698、5 468 478)、胺(参见例如Buckmann et al.Makromol.Chem.182：1379(1981)、Zalipsky et al.Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(参见例如Andresz et al.Makromol Chem.179：301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(参见例如Olson et al.，Poly(ethyleneglycol)Chemistry & Biological Applications，pp170-181，Harris&Zalipsky Eds.，ACS，Washington，DC，1997；还参见US 5672662)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(参见例如Abuchowski et al.Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)和Joppich et al.，Makromol.Chem.180：1381(1979))、琥珀酰亚胺基酯(参见例如US4670417)、苯并三唑碳酸酯(参见例如US 5650234)、缩水甘油醚(参见例如Pitha et al.Eur.J.Biochem.94：11(1979)、Elling et al.，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧羰基咪唑(参见例如Beauchamp，et al.，Anal.Biochem.131：25(1983)、Tondelli et al.J.ControlledRelease 1：251(1985))、对硝苯基碳酸酯(参见例如Veronese，et al.，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；和Sartore et al.，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛(参见例如Harris et al.J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)、US 5824784、US 5252714)、马来酰亚胺(参见例如Goodson et al.Bio/Technology 8：343(1990)、Romani et al.，Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984)、和Kogan，Synthetic Comm.22：2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(参见例如Woghiren，et al.Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯酰(参见例如Sawhney et al.，Macromolecules，26：581(1993))、乙烯基砜(参见例如US5 900 461)。
而且，如上所示POLY可代表线形聚合物链段，或者可构成支化或叉状聚合物链段的一部分。在聚合物链段是支化的情况下，上述POLY结构可对应于例如构成总POLY结构一部分的聚合物臂。或者，在POLY有叉状结构的情况下，上述POLY可对应于例如支化点之前的聚合物链段的线性部分。
POLY还可对应于有2、3、4、5、6、7、8或更多臂的支化PEG分子。用于制备本发明聚合物马来酰亚胺的支化聚合物可有任何位置的2至300个反应性末端。优选有2或3个聚合物臂的支化聚合物链段。说明性的支化POLY(如US 5932462中所述)对应于以下结构：
该表示中，R”为非反应性部分如H、甲基或PEG，P和Q为非反应性链节。一优选实施方案中，所述支化的PEG聚合物链段是甲氧基聚乙二醇二取代的赖氨酸。
以上支化构型中，支化聚合物链段有从“C”支化点延伸的单一活性部位用于通过本文所述连接基设置反应性马来酰亚胺基。支化PEG如用于本发明的那些通常有少于4个PEG臂、更优选有2或3个PEG臂。此支化PEG提供有单一活性部位的优点，与比其线性PEG对应物更大更密的聚合物云偶联。
一类支化的PEG马来酰亚胺对应于以下结构：(MeO-PEG-)iG-[O]b-C(O)-NH-X-MAL，其中MAL代表马来酰亚胺，i等于2或3，G为赖氨酸或其它适合的氨基酸残基。
说明性的本发明支化聚合物马来酰亚胺有以下所示结构，其中X是本文所述水解稳定连接基之任一。
Figure C20038010801000571
实施例1中提供有上面XVIII所示结构特征的本发明聚合物的合成。适用于制备本发明聚合物马来酰亚胺的支化PEG还包括更一般地用式R(PEG)n表示的那些，其中R为中心或芯分子，从中伸出2或更多PEG臂。变量n代表PEG臂的数量，其中每个聚合物臂可独立地被封端或在其末端有反应性官能团如马来酰亚胺或其它反应性官能团。本发明此多臂实施方案中，每个PEG臂通常在其末端有马来酰亚胺基团。支化PEG如通式R(PEG)d所示的那些有2至约300个聚合物臂(即n在2至约300的范围内)。支化PEG如这些优选有2至约25个聚合物臂、更优选2至约20个聚合物臂、甚至更优选2至约15个聚合物臂或更少。最优选的是有3、4、5、6、7或8个臂的多臂聚合物。
上述支化PEG中优选的中心分子是多元醇。此多元醇包括有1至10个碳原子和1至10个羟基的脂族多元醇，包括乙二醇、链烷二醇、烷基乙二醇、亚烷基烷基二醇、烷基环烷二醇、1，5-萘烷二醇、4，8-双(羟甲基)三环癸烷、亚环烷基二醇、二羟基链烷、和三羟基链烷等。也可使用脂环族多元醇，包括直链或闭环的糖和糖醇，如甘露醇、山梨醇、肌醇、木糖醇、白坚木醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、赤藓醇、福寿糖醇、半乳糖醇、facose、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔洛糖、tagitose、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、和麦芽糖等。其它脂族多元醇包括甘油醛、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖、和相关立体异构体的衍生物。可使用的其它中心多元醇包括冠醚、环糊精、糊精和其它碳水化合物如淀粉和直链淀粉。优选的多元醇包括甘油、季戊四醇、山梨醇、和三羟甲基丙烷。
上述类型的典型多臂聚合物结构是：
Figure C20038010801000581
其中d为3至约100的整数，R为有3或更多羟基、氨基或其组合的中心分子的残基。
用于制备本发明聚合物马来酰亚胺的多臂PEG包括来自Nektar、Huntsville、Alabama的多臂PEG。一优选实施方案中，本发明多臂聚合物马来酰亚胺对应于以下，其中所述分子的连接的马来酰亚胺部分的细节在本文中别处提供。
Figure C20038010801000582
其中
PEG为-(CH2CH2O)nCH2CH2-，
M为：
m选自3、4、5、6、7和8。
或者，所述聚合物马来酰亚胺可有叉状总结构。叉状PEG的例子对应于以下结构：
Figure C20038010801000592
其中PEG是本文所述PEG形式之任一，A为连接基，优选水解稳定的链节如氧、硫或-C(O)-NH-，F和F’为可选地存在的水解稳定间隔基，其它变量对应于水解稳定的连接基X，马来酰亚胺(MAL)部分如前面所定义。针对X的可能值的一般和具体描述均适用于上述实施方案(结构XVIII)。对应于A、F和F’的典型连接基和间隔基描述在PCT/US99/05333中，适用于形成用于本发明的此类聚合物链段。F和F’为间隔基，可相同或不同。以上之一具体实施方案中，PEG为mPEG，A对应于-C(O)-NH-，F和F’均为亚甲基或-CH2-。此类聚合物链段适合与两种活性剂反应，其中两种活性剂位于精确或预定的相隔距离处，取决于F和F’的选择。
有叉形聚合物链段的本发明聚合物试剂的另一种型式对应于：
其中变量如前面所定义。优选该实施方案中的X是有总共3至约20个碳原子的饱和环或脂环烃链。
对应于上式中“PEG”的典型支化PEG是mPEG二取代的赖氨酸，其中“PEG”对应于：
Figure C20038010801000601
或者，用于制备本发明聚合物马来酰亚胺的PEG聚合物链段可以是沿PEG链长而非端部有反应性侧基的PEG分子，以产生有通过连接基X连接在PEG链上的一或多个侧马来酰亚胺基的稳定聚合物马来酰亚胺。
此外，在一种不优选的实施方案中，所述聚合物链段本身可有一或多个易水解的弱或可降解链。所述聚合物链段中可存在的说明性可降解链包括但不限于碳酸酯、亚胺、磷酸酯、和腙。
一般地，水溶性聚合物链段POLY的标称平均分子质量可以改变。POLY的标称平均分子质量通常落入以下范围之一或多个之内：约100至约100 000道尔顿；约500至约80 000道尔顿；约1 000至约50 000道尔顿；约2 000至约25 000道尔顿；约5 000至约20 000道尔顿。水溶性聚合物链段POLY的标称平均分子质量的例子包括约1 000道尔顿、约5 000道尔顿、约10 000道尔顿、约150 00道尔顿、约20 000道尔顿、约25 000道尔顿、约30 000道尔顿、和约40 000道尔顿。低分子量POLY有约250、500、750、1000、2000或5000道尔顿的分子质量。
聚合物胺
本发明还延伸至任一和所有上述结构的胺对应物，除用氨基优选-NH2代替前面所述马来酰亚胺环之外。
更具体地，本发明延伸至有以下结构的水溶性聚合物：
Figure C20038010801000611
其中POLY、b和X如前面所定义。
典型的聚合物胺包括有以下所示通用结构的那些：
其中q和p独立地在0至6的范围内，所述环己烯环上的取代基是顺式或反式的。
Figure C20038010801000613
其中q和p独立地在0至6的范围内，所述环己烯环上的取代基是顺式或反式的。
用VIII表示的胺封端聚合物有许多用途，在后面更详细地描述。例如，可使之转化成本发明相应的马来酰亚胺封端聚合物，或者在不进一步改性的情况下用于共价连接至活性剂或表面上、或用于形成水凝胶。
水解稳定性和制备方法
如前面所述，本文所提供的聚合物马来酰亚胺是耐水解的，如聚合物试剂本身(实施例VII和XIII)及其相应复合体(实施例VIII)所证明。在相同条件下测量时，本发明聚合物马来酰亚胺有比其无连接基的聚合物马来酰亚胺对应物更长的水解半衰期。即，本发明有连接基的聚合物马来酰亚胺有比其相应的无连接基型式更慢的水解速率，意味着在基本上相同的条件下马来酰亚胺环保持完好的时间更长。例如，从实施例7和14、表2和4中的水解数据可以看出，各种典型的连接基都有比无连接基的马来酰亚胺(“3-ET”)延长的水解半衰期。
本发明聚合物马来酰亚胺可通过包括以下的多种可选路线制备。一种途径中，通过连接在聚合物链段(即活化的聚合物链段)上的官能团与连接在双官能连接剂上的官能团反应制备本发明马来酰亚胺封端的聚合物。聚合物链段与双官能连接剂反应导致该连接剂通过水解稳定的键合与聚合物链段共价连接。双官能连接剂上剩余的官能团是马来酰亚胺或可易转化成马来酰亚胺的官能团。
例如，所述连接剂可有结构A-L-B，其中A为可与聚合物链段上的第二官能团反应而形成水解稳定链节L形成POLY-L-B的第一官能团，其中B为马来酰亚胺或可易转化成马来酰亚胺的官能团(例如可通过与甲氧羰基马来酰亚胺反应转化成马来酰亚胺的胺)。上述途径中，A可以是卤基、羟基、活性酯如N-琥珀酰亚胺基酯、活性碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、链烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、硫醇、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、和环氧化物等许多官能团之任一。连接剂的具体实例包括1，4-二溴丁烷、1，5-二溴戊烷、1，6-二溴己烷、N-琥珀酰亚胺基(ε-马来酰亚氨基己酸酯)、N-琥珀酰亚胺基(ε-马来酰亚氨基戊酸酯)、N-(γ-马来酰亚氨基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯、N-(γ-马来酰亚氨基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯、4，7，10-三氧杂-1，3-十三烷二胺、4-(马来酰亚氨甲基)-1-环己烷甲酸-NHS酯、四亚甲基二胺、五亚甲基二胺、六亚甲基二胺、2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷、1，3-环己基双(甲胺)、和1，4-环己基双(甲胺)。此连接剂可商购，例如购自Pierce Chemical Company，或者可用本领域已知技术由商购原料制备。
涉及形成包含连接聚合物链段与连接基X的酰胺或氨酯键的聚合物马来酰亚胺时，此途径更具体地用以下方法1表示。
方法1
Figure C20038010801000631
在与上述类似的方法(称为方法2)中，使反应性聚合物原料POLY-[O]b-C(O)-LG与二胺试剂H2N-X-NH2反应形成相应的聚合物胺中间体POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH2。然后使该中间体转化成相应的稳定马来酰亚胺封端的聚合物。该方法的优点在于适用于形成本文所述稳定聚合物马来酰亚胺的许多二胺试剂可商购。此外，聚合物-胺中间体可比其马来酰亚胺对应物更容易纯化，例如通过柱色谱法，从而提供不显著地存在其它不想要的聚合物衍生副产物如PEG-二醇和PEG-二醇衍生的杂质的聚合物马来酰亚胺产品。方法2如下所示。
方法2
通用反应图式。
步骤a.
Figure C20038010801000632
步骤b.
Figure C20038010801000633
方法1和2中，LG代表离去基团，其它变量如前面所述。反应性聚合物原料POLY-[O]b-C(O)-LG可以是酰基卤、卤甲酸酯、酐、或活性酯。适用于这些方法的离去基团包括卤基(例如氯基、溴基和碘基)、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、和对硝基酚根。形成酰胺或氨酯键的偶联反应一般在无水有机溶剂中进行，优选在惰性气氛如氮气或氩气下进行。适合的溶剂包括乙腈、氯代烃如氯仿和二氯甲烷、芳烃如苯、甲苯和二甲苯、丙酮和四氢呋喃。该反应通常在约0至100℃范围内的温度下进行，取决于所用溶剂的类型和试剂本身的反应性。一般在碱存在下进行偶联。碱包括三烷基胺如三乙胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶、和无机碱如碳酸钠。
图2中给出对应于方法2中H2N-X-NH2的典型双环和三环二胺反应物。方法2中，某些情况下可能必须用例如常规的氨基保护基如t-BOC或FMOC保护H2N-X-NH2中氨基之一。然后通常在进一步提纯或转换之前除去POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH中的保护基。参见例如实施例10和11。在进行中间体聚合物胺提纯的情况下，可采用许多提纯方法之任一，如沉淀或色谱法，但优选的是离子交换色谱法，因为中间体聚合物胺上存在氨基。
继续方法2的途径中，然后使中间体聚合物胺转化成相应的马来酰亚胺。此转化一般通过POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2与N-甲氧羰基马来酰亚胺、外-7-氧杂[2.2.1]双环庚烷-2，3-二甲酸酐、或马来酐等试剂在适合形成POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL的条件下反应实现。
优选的试剂是N-甲氧羰基马来酰亚胺，在此情况下，所述转化在水或水与水混溶性溶剂如乙腈或丙酮的混合物中进行。该转化反应一般在约0至80℃范围内的温度、约6.5至9范围内的pH下进行。
所述试剂为马来酐时，使POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2与马来酐在能形成作为中间体的POLY-[O]b-C(O)-NH-X-NH-C(O)CH＝CHCOOH(XI)的条件下反应。然后将该中间体在能通过消去水促使环化的条件下加热形成POLY-[O]b-C(O)-NH-X-MAL。形成马来酰亚胺环的环化反应的效率通常在约15至约80％的范围内。
一般从反应混合物中回收产品POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL，可选地进一步提纯。通过方法2形成产品的情况下，如果对所述胺前体进行提纯例如通过离子交换色谱法，则可能不必进一步提纯，例如除去聚合物衍生的杂质。优选所述回收产品POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL有大于约80％的聚合物纯度。
实施例1和5说明用包含末端马来酰亚胺基团的连接基形成本发明反应性聚合物的方法。实施例1中，使经改性包含反应性氨基的聚合物链段与包含活化酯和马来酰亚胺基团的双官能连接剂反应。实施例5中用类似方法制备有包含亚环己基连接基的聚合物马来酰亚胺。实施例2、3和4证明聚合物胺中间体的形成，然后转化成相应的马来酰亚胺。实施例9、10、11和12证明通过上述方法2合成含亚环烷基的连接基，其中使反应性聚合物原料POLY-[O]b-C(O)-LG与二胺试剂反应形成POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2，然后使之转化成相应的马来酰亚胺封端产品。
聚合物马来酰亚胺试剂的储存
本发明聚合物马来酰亚胺及其氨基对应物优选储存在惰性气氛如氩气或氮气下。由于该分子的马来酰亚胺部分有可能与水反应(例如暴露于湿气形成相应的开环形式)，还优选减少本发明聚合物马来酰亚胺暴露于湿气。因此，优选的储存条件是在干氩气或其它干惰性气体和低于约-15℃的温度下。优选在低温条件下储存，因为在较低温度下不希望的副反应如马来酰亚胺开环速率变慢。所述聚合物产品的聚合物链段为PEG的情况下，PEG部分可能缓慢地与氧气反应而沿分子的PEG部分形成过氧化物。形成过氧化物最终可能导致链断裂，从而使本文所提供的PEG试剂的多分散性提高。鉴于此，还优选将本发明PEG马来酰亚胺和相关聚合物储存在黑暗中。
生物活性复合体
偶合化学、分离、储存
复合体
本发明还包括本文所述稳定的聚合物马来酰亚胺或其相应的聚合物胺对应物之任一反应形成的复合体。具体地，本文所述聚合物马来酰亚胺适用于与有至少一个可用于反应的硫羟基或氨基的活性剂或表面偶合，而本文所述聚合物胺适用于与有至少一个可用于反应的羧基的活性剂或表面偶合。
例如，本发明复合体可有以下结构：
Figure C20038010801000661
其中“-S-生物活性剂”代表包含硫羟基(-SH)的活性剂、优选生物活性剂，其它变量如前面所定义。所述活性剂为仅含一个反应性硫羟基的生物活性剂或小分子的情况下，所得组合物可有利地仅含一种聚合物复合体，因为蛋白质内通常包含较低量的硫羟基可用于偶合。某些情况下，将蛋白质或小分子或其它活性剂制成在已知位置有硫羟基，同样将得到仅含一种聚合物复合体的组合物。
或者，本发明复合体可有以下结构：
Figure C20038010801000662
结构XV中，“-NH-活性剂”代表包含氨基的活性剂或表面、优选生物活性剂，其它变量如前在所述。
本发明聚合物胺直接使用时可用于提供以下类型的复合体：
Figure C20038010801000663
本文所提供的聚合物复合体特别是由本发明稳定的聚合物马来酰亚胺衍生的那些同样具有改进水解稳定性防止马来酰亚胺开环的特征。此特征在实施例VIII中证实。实施例6、14、15、16和17中描述典型复合体的合成，使用模型化合物2-巯基乙醇和举例说明用的蛋白质。
偶合方法
适合的偶合条件是足以在聚合物试剂和活性剂之间实现偶合的时间、温度、pH、试剂浓度、和溶剂等条件。如本领域所知，具体条件与活性剂、所要偶合类型、和反应混合物中其它物质的存在等有关。本领域普通技术人员参考相关文献阅读本文公开内容和/或通过常规试验可确定在任何具体情况下足以实现偶合的条件。
举例的偶合条件包括在约6至约10的pH、例如在约6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的pH下进行偶合反应。所述反应可进行约5分钟至约72小时、优选约30分钟至约48小时、更优选约4至约24小时或更短。用于偶合反应的温度通常但不必在约0至约40℃的范围内；通常在室温或更低温度下进行偶合。偶合反应通常在缓冲剂如磷酸盐或乙酸盐缓冲剂或类似体系中进行。
关于试剂浓度，通常使过量的聚合物试剂与活性剂混合。但某些情况下，优选有相对于活性剂量化学计量的聚合物试剂上反应基团数量。聚合物试剂与活性剂之比的例子包括约1∶1(聚合物试剂∶活性剂)、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1或10∶1的摩尔比。所述偶合反应可进行至基本上不再发生偶合，一般可通过随时监视反应进度确定。
可在不同时间点从反应混合物中取出等分试样并通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法或其它任何适合的分析方法分析反应混合物监视反应进度。一旦生成复合体的量或剩余未偶合聚合物的量达到平稳状态，则假定反应完全。所述偶合反应通常用几分钟至几小时(例如5分钟至2 4小时或更长时间)。优选从所得产物混合物中分出过量的试剂、未偶合的反应物(例如活性剂)、不想要的多偶合物、和游离或未反应的聚合物，但不必提纯。然后可用MALDI、毛细电泳、凝胶电泳、和/或色谱法等分析方法进一步表征所得复合体。
更优选在约6-9(例如6、6.5、7、7.5、8、8.5、或9)范围内的pH、更优选约7-9的pH、甚至更优选约7至8的pH下使本发明聚合物马来酰亚胺偶合至含硫羟基的活性剂上。一般使用稍微摩尔过量的聚合物马来酰亚胺，例如1.5至15倍摩尔过量、优选2至10倍摩尔过量。室温下反应时间一般在约15分钟至几小时、例如8或更多小时的范围内。对于空间受阻的硫羟基而言，所需反应时间可能明显更长。本发明稳定的马来酰亚胺是硫羟基选择性的，优选在约7的pH下进行硫羟基选择性偶合。
与氨基的反应在更高pH下进行，但相对较慢。蛋白质PEG化反应条件随蛋白质、所要PEG化程度、和具体的聚合物马来酰亚胺试剂而改变。
说明性反应图示
分离
可选地，使本发明PEG马来酰亚胺或PEG胺与生物活性剂反应产生的复合体纯化得到/分离出不同的PEG化物质。或者而且对于低分子量PEG(例如分子量小于约20 000道尔顿、优选小于或等于约10 000道尔顿)更优选使产生混合物纯化得到在一定数量PEG/蛋白质分子周围的分布(适合的情况下)。例如，可使产物混合物纯化得到1至5个PEG/蛋白质的平均值，通常平均约3个PEG/蛋白质。最终复合体反应混合物的纯化策略取决于许多因素-所用聚合物的分子量、具体的蛋白质、所要服用剂量、及各种复合体的剩余活性和体内性质。
需要时，可用凝胶过滤色谱法分离有不同分子量的PEG复合体。虽然该方法可用于分离有不同分子量的PEG复合体，但该方法一般不能分离蛋白质内PEG化部位不同的位置异构体。例如，可用凝胶过滤色谱法分离PEG的1-基体、2-基体、3-基体等，但所回收的PEG-基体组合物可能都包含与蛋白质内不同反应性氨基(例如赖氨酸残基)相连的PEG。
适用于进行此类分离的凝胶过滤柱包括来自AmershamBiosciences的SuperdexTM和SephadexTM。柱的选择取决于所要分馏范围。一般用非胺基缓冲剂如磷酸盐或乙酸盐等进行洗脱。可通过多种不同方法分析收集的馏分，例如(i)在280nm下用于分析蛋白质含量的OD，(ii)BSA蛋白质分析，(iii)用于分析PEG含量的碘试验(SimsG.E.C.，et al.，Anal.Biochem，107，60-63，1980)，或(iv)运行SDS PAGE凝胶，然后用碘化钡着色。
位置异构体的分离通过使用RP-HPLC C18柱(AmershamBiosciences or Vydac)的逆相色谱法或使用离子交换柱(例如来自Amersham Biosciences的SepharoseTM离子交换柱)的离子交换色谱法进行。任一方法都可用于分离有相同分子量的PEG-生物分子异构体(位置异构体)。
取决于所得PEG复合体的预定应用，偶合和可选的附加分离步骤之后，可使复合体混合物浓缩、无菌过滤、而储存在约-20至约-80℃的低温下。或者，可使复合体冻干(有或没有残留缓冲剂)而以冻干的粉末形式储存。某些情况下，优选将偶合所用缓冲剂如乙酸钠换成在冻干过程中易除去的挥发性缓冲剂如碳酸铵或乙酸铵，以使冻干的蛋白质复合体粉剂不含残留缓冲剂。或者，可用配制用缓冲剂进行缓冲剂交换步骤，使冻干的复合体为适用于再组成配制用缓冲剂而最终给哺乳动物服用的形式。
靶分子和表面
可使本发明稳定的聚合物马来酰亚胺(胺)共价或非共价地连接于许多实体之上，包括薄膜、化学分离和提纯表面、固体媒介物、金属/金属氧化物表面如金、钛、钽、铌、铝、钢、及其氧化物、氧化硅、大分子、和小分子。此外，本发明聚合物还可用于生化传感器、生物电子开关和闸门。本发明聚合物马来酰亚胺(胺)还可作为肽合成的媒介物，用于制备聚合物涂布表面和聚合物移植物，制备用于亲和分配的聚合物-配体复合体，制备交联或非交联的水凝胶，及制备用于生物反应器的聚合物-辅因子加合物。
用于与本发明聚合物偶合的生物活性剂可为以下任一或多种。适合的试剂可选自例如安眠药和镇静剂、精神兴奋剂、镇静剂、呼吸用药、抗惊厥剂、肌肉松弛药、抗帕金森药(多巴胺拮抗药)、镇痛药、消炎药、抗焦虑药、食欲抑制剂、抗偏头痛药、肌肉收缩剂、抗感染药(抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗)、抗关节炎药、抗疟药、止吐药、anepileptics、支气管扩张药、细胞活素(cytokines)、生长因素、抗癌药、抗血栓形成药、抗高血压药、心血管药、抗心律失常药、抗氧剂、抗哮喘药、激素制剂包含避孕药、拟交感神经药、利尿剂、脂质调节剂、抗雄激素药、防寄生物剂、抗凝血剂、肿瘤药、抗肿瘤药、低血糖药、营养药和补充剂、生长补充剂、抗肠炎药、疫苗、抗体、诊断剂、和造影剂。
更具体地，所述活性剂可落入许多结构类型之一，包含但不限于小分子(优选不溶性小分子)、肽、多肽、蛋白质、抗体、多糖、类固醇、核苷酸、低聚核苷酸、多核苷酸、脂肪、和电解质等等。优选与本发明聚合物马来酰亚胺偶合的活性剂有天生的氨基或巯基，或者经改性包含至少一个适合与本发明聚合物马来酰亚胺偶合的反应性氨基或巯基。
适合于共价的连接到本发明聚合物的活化剂实施例包含而不局限于适合与本发明聚合物共价连接的活性剂的具体实例包括但不限于天冬酰胺酶(aspariginase)、amdoxovir(DAPD)、抗排卵肽、becaplermin、降血钙素、cyanovirin、denileukin diftitox、促红细胞生成素(EPO)、EPO激动剂(例如来自长度约10-40氨基酸和包含特定核心顺序的肽，如WO 96/40749所述}、dornase alpha、刺激红细胞生成的蛋白质(NESP)、凝血因子例如第五因子、第七因子、VIIa因子、第八因子、第九因子、第十因子、第十二因子、第十三因子、von Willebrand因子；ceredase、cerezyme、α-葡糖苷酶、胶原、环孢子菌素、α-防卫素、β-防卫素、exedin-4、粒细胞菌落刺激因子(GCSF)、促血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、elcatonin、粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子(GMCSF)、纤维蛋白原、filgrastim、生长激素人生长激素(hGH)、生长激素释放激素(GHRH)、GRO-β、GRO-β抗体、骨成形蛋白质例如骨成形蛋白质-2、骨成形蛋白质-6、OP-1；酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、CD-40配体、肝素、人血清白蛋白、低分子量肝素(LMWH)、干扰素例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、干扰素τ、交感干扰素；白细胞间介素和白细胞间介素受体例如白细胞间介素-1受体、白细胞间介素-2、白细胞间介素-2聚变蛋白质、白细胞间介素-1受体拮抗剂、白细胞间介素-3、白细胞间介素-4、白细胞间介素-4受体、白细胞间介素-6、白细胞间介素-8、白细胞间介素-12、白细胞间介素-13受体、白细胞间介素-17受体；乳铁传递蛋白和乳铁传递蛋白片断、促黄体激素释放激素(LHRH)、胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(例如US5922675中所述单酰化胰岛素}、淀粉不溶素、C-肽、生长激素释放抑制激素、包含octreotide的生长激素释放抑制激素类似物、抗利尿激素、促卵泡激素(促卵泡激素)、流感疫苗、胰岛素样生长因子(IGF)，insulintropin、巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)、血纤维蛋白溶解酶原活化剂，例如alteplase、尿激酶、reteplase、链激酶、pamiteplase、lanoteplase、和teneteplase；神经生长因子(神经生长因子)，osteoprotegerin、血小板衍生生长因子、组织生长因素、转变生长因子-1、血管内皮细胞生长因子、白血病抑制因子、角质形成细胞生长因子(KGF)、胶质细胞生长因子(GGF)、T细胞受体、CD分子/抗原、肿瘤坏死因子(肿瘤坏死因子)、单核细胞趋化蛋白-1、内皮的生长因素、甲状旁腺激素(甲状旁腺激素)、胰高血糖素样肽、生长激素、胸腺素α1、胸腺素α1IIb/髂骨抑制剂、胸腺素β10、胸腺素β9胸腺素β4、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4(非常晚期抗原-4)、VLA-4抑制剂、bisphosponates、呼吸道合胞病毒抗体、囊性纤维化跨膜调节剂(CFTR)基因、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、杀菌/渗透性提高的蛋白质(BPI)、和抗CMV抗体。典型的单克隆抗体包含etanercept(由与IgG1的Fc部分连接的人类75kD TNF受体的与细胞外配体结合部分组成的二聚聚变蛋白质)、abciximab、afeliomomab，basiliximab，daclizumab、infliximab，ibritumomab tiuexetan，mitumomab、muromonab-CD3、碘131 tositumomab复合体、olizumab、rituximab、和trastuzumab(herceptin)。
适合与本发明聚合物共价连接的其它试剂的具体实例包括但不限于amifostine、乙胺碘呋酮、氨基己酸、氨基马尿酸钠、氨鲁米特、氨基乙酰丙酸、氨基水杨酸、安吖啶、anagrelide、anastrozole、天冬酰胺酶、anthracyclines、bexarotene、bicalutamide、争光霉素、buserelin、白消安、cabergoline、capecitabine、carboplatin、亚硝脲氮芥、chlorambucin、cilastatin钠、顺氯氨铂、cladribine、clodronate、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、喜树碱、13-顺式视黄酸、所有反式视黄酸；氮烯唑胺、放线菌素、道诺红菌素、去铁敏、地塞米松、diclofenac、己烯雌酚、docetaxel、阿霉素、表柔比星、雌氮芥、鬼臼亚乙苷、exemestane、fexofenadine、fludarabine、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟烃甲基睾丸素、flutamide、gemcitabine、肾上腺素、左旋多巴、羟基脲idarubicin，ifosfamide、imatinib、irinotecan、itraconazole、性激素素阻滞药、letrozole、甲酰四氢叶酸、  左旋四咪唑、lisinopril、lovothyroxine钠、环己亚硝脲、二氯甲二乙胺、6α-甲-17-羟孕酮、甲地孕酮、melphalan，mercaptopurine、重酒石酸间羟胺、氨甲喋呤、灭吐灵、慢心律、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、纳洛酮、nicotine，nilutamide、octreotide、oxaliplatin、pamidronate、pentostatin、pilcamycin，porfimer、强的松、普鲁苄肼、康帕嗪、ondansetron、raltitrexed、sirolimus、链脲霉素、tacrolimus、三苯氧胺、temozolomide、表鬼臼毒噻吩糖苷、睾丸激素、tetrahydrocannabinol、镇静剂、2-氨基嘌呤-6-硫醇、硫替派、topotecan、维甲酸、valrubicin、长春花碱、长春新碱、vindesine，vinorelbine、dolasetron、granisetron；formoterol、fluticasone、leuprolide，midazolam、阿普唑仑、两性霉素B、podophylotoxins、核苷抗病毒的、芳酰腙、sumatriptan；大环内酯例如红霉素、竹桃霉素、三乙酰夹竹桃霉素、roxithromycin、clarithromycin、davercin、azithromycin、flurithromycin、dirithromycin、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、leucomycin，miocamycin、rokitamycin、andazithromycin、和swinolide A；氟喹诺酮例如ciprofloxacin、氧氟沙星、左氟沙星、trovafloxacin，alatrofloxacin、moxifloxicin、norfloxacin、enoxacin、grepafloxacin、gatifloxacin，lomefloxacin、sparfloxacin、temafloxacin、pefloxacin，amifloxacin、氟罗沙星、tosufloxacin、prulifloxacin、irloxacin、pazufloxacin、clinafloxacin、和sitafloxacin；氨基糖苷类例如庆大霉素、netilmicin、草履虫素、托普霉素、氨丁卡霉素、卡那霉素、新霉素、和链霉素、万古霉素、teicoplanin、rampolanin、mideplanin、粘菌素、daptomycin，gramicidin、colistimethate；多粘菌素例如多粘菌素B、缠霉素、杆菌肽、penems；青霉素包含penicllinase-敏感试剂如青霉素G、苯氧甲基青霉素；penicllinase-抵抗的试剂如2，6-二甲氧基苯青霉素、新青霉素、5-甲基-3-邻氯苯基-4-异唑青霉素、双氯青霉素、氟氯青霉素、乙氧萘青霉素；革兰氏阴性微生物活化剂如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、和海他西林、cillin、和galampicillin；antipseudomonal青霉素如羧苄青霉素、羧噻吩青霉素、阿洛西林、美洛西林和piperacillin；头孢菌素如cefpodoxime、cefprozil、ceftbuten、头孢噻肟、ceftriaxone、头孢金素、先锋霉素VIII、先锋霉素IV、cephradrine、头孢噻吩、头孢羟唑、唑啉头孢菌素、头孢利定、氯头孢菌素、头孢羟氨下、先锋霉素III、头孢氨呋肟、ceforanide、氨噻肟头孢菌素、羟胺唑头孢菌素、塞发先令、cefepime、cefixime、cefonicid、氧哌羟苯唑头cefotetan、cefmetazole、ceftazidime、loracarbef、和moxalactam，monobactams如aztreonam；和carbapenems例如imipenem、meropenem，pentamidine isethiouate、舒喘宁硫酸盐、利多卡因、二羟苯基异丙氨基乙醇硫酸盐、倍氯米松diprepionate、氟羟脱氢皮醇乙酰胺、布地缩松丙酮化合物、fluticasone、ipratropiumbromide，flunisolide、色甘酸钠、和酒石酸麦角胺；taxanes如paclitaxel；SN-38，和酪氨酸磷酸化抑制剂。
优选与本发明聚合物马来酰亚胺偶合的肽或蛋白质包括EPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ交感IFN、凝血第七因子、凝血第八因子、凝血第九因子、IL-2，remicade(infliximab)、Rituxan(rituximab)、Enbrel(etanercept)、Synagis(palivizumab)、Reopro(abciximab)、Herceptin(trastuzimab)、tPA、Cerizyme(imiglucerase)、Hepatitus-B疫苗、rDNAse、α-1蛋白酶抑制剂、GCSF、GMCSF、hGH、胰岛素、FSH和PTH。
上述典型的生物活性剂意指包括(适合的情况下)类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、异构体、及其药学可接受的盐形式。关于肽和蛋白质，本发明意包括合成的、重组的、原来的、糖化的、和非糖化的形式、及其生物活性片断。上述生物活性蛋白质还意包括有一或多种氨基酸取代(例如半胱氨酸}、或删除等的变体，只要所得变式蛋白质具有至少一定程度的母(原)蛋白质的活性。
药物组合物
本发明还包括包含与药用赋形剂组合的本文所提供复合体的药物制剂。
一般来说，所述复合体本身是固体形式(例如沉淀物)，可与适合的药用赋形剂组合，赋形剂可以是固体或液体形式的。
典型的赋形剂包括但不限于选自碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱、及其组合的那些。
碳水化合物如糖、衍生糖如糖醇、醛糖酸、和酯化糖、和/或糖聚合物可以赋形剂形式存在。具体的碳水化合物赋形剂包括例如：单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、等等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、等等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉、等等；和糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇、等等。
所述赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，例如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸一钠、磷酸氢二钠、及其组合。
所述制剂可还包括用于防止或阻止微生物生长的抗微生物剂。适用于本发明的抗微生物剂的非限制性实例包括氯化苄烷铵、苯索氯铵、苄醇、氯化十六烷基吡啶翁、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol、及其组合。
所述制剂中还可存在抗氧化剂。抗氧化剂用于防止氧化，从而防止所述复合体或制剂的其它组分变质。适用于本发明的抗氧化剂包括例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、及其组合。
表面活性剂可作为赋形剂存在。典型的表面活性剂包括：聚山梨酸酯如“吐温20”和“吐温80”、和聚乙二醇与环氧乙烷的加聚物如F68和F88(都来自BASF，Mount Olive，New Jersey)；脱水山梨糖醇酯；类脂，如磷脂例如卵磷脂及其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管优选不为脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；类固醇如胆固醇；和螯合剂如EDTA、锌及其它适合的阳离子。
酸或碱可作为赋形剂存在于所述制剂中。可用酸的非限制性实例包括盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸、及其组合。适合的碱的例子包括但不限于氢氧化钠、醋酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾、及其组合。
该药物制剂包括所有类型的制剂，特别是适用于注射的制剂，例如可以悬浮液和溶液形式重组的粉末。所述复合体(即活化剂和本文所述聚合物之间形成的复合体}在组合物中的量随许多因素改变，但所述组合物储存在单位剂量容器(例如小瓶)内时最好为治疗有效量。此外，所述药物制剂可以装在注射器内。治疗有效量可通过重复服用增量的复合体以测定产生临床要求终点的量试验确定。
所述组合物中任何赋形剂的量随该赋形剂的活性和组合物的特定需要而改变。通常，通过常规实验确定任一赋形剂的最佳量，即制备包含不同量赋形剂(从低至高的范围内)的组合物，考察稳定性和其它参数，然后测定在无明显副作用的情况下达到最佳性能的范围。
但赋形剂一般以约1至99％(重)、优选约5至98％(重)、更优选约15-95％(重)赋形剂的量存在于组合物中，最优选浓度低于30％(重)。
以上这些药用赋形剂及其它赋形剂描述在″Remington：TheScience & Practice of Pharmacy″，19thed.，Williams & Williams，(1995)、″Physician′s Desk Reference″，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)、和Kibbe，A.H.，Handbook of PharmaceuticalExcipients，3rd Edition，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000中。
本发明药物制剂通常(但不必须)通过注射给药，因而在要给药之前一般为液态溶液或悬浮液。所述药物制剂还可采用其它形式如糖浆、乳膏、软膏、片剂、和粉剂等。还包括其它给药方式，如肺、直肠、通过皮肤、通过粘膜、口服、鞘内、皮下、和动脉内等。
如前面所述，所述复合体可通过静脉注射、或不优选地通过肌肉或皮下注射而肠胃外注射给药。适合肠胃外给药的制剂类型包括准备用于注射的溶液、使用前与溶剂混合的干粉、准备用于注射的悬浮液、使用前与媒介物混合的不溶性干组合物、及给药前稀释的乳液和液体浓缩物等等。
给药方法
本发明还提供一种给遭受可用本文所提供的复合体治疗的状况的患者服用所述复合体的方法。所述方法包括服用(一般通过注射)治疗有效量的所述复合体(优选作为药物制剂的一部分提供)。所述服用方法可用于治疗可通过服用所述复合体治疗或预防的任何状况。本领域普通技术人员知道具体的复合体可有效地治疗的状态。实际给药剂量随患者的年龄、体重、和全身状态以及被治疗状况的严重程度、保健专家的判断、和所服用的复合体而改变。治疗有效量为本领域技术人员所知和/或描述在相关参考书和文献中。一般来说，治疗有效量在约0.001至100mg的范围内，优选剂量为0.01至75mg/天、更优选0.10至50mg/天。
可以各种剂量日程服用单位剂量的任何给定复合体(优选作为药物制剂的一部分提供)，取决于临床医生的判断、患者的需要等等。具体的剂量日程为本领域普通技术人员已知或者可用常规方法通过实验确定。典型的剂量日程包括但不限于一天服用五次、一天四次、一天三次、一天两次、一天一次、一周三次、一周两次、一周一次、每月两次、每月一次、及其任何组合。一旦达到临床终点，所述组合物的剂量则停止。
服用本发明复合体的优点之一在于各水溶性聚合物部分可开裂。此结果在因聚合物尺寸导致从体内清除可能有问题时是有利的。最好利用可生理分裂和/或酶降解的键如含氨酯、酰胺、碳酸酯或酯的链促使每一水溶性聚合物部分开裂。这样，可通过选择聚合物分子大小和提供所要清除性的官能团类型调节所述复合体的清除(通过各水溶性聚合物部分的分裂)。本领域普通技术人员可确定聚合物的适当分子大小和可分裂的官能团。例如，本领域普通技术人员可采用常规实验先制备有不同聚合物重量和可分裂官能团的多种聚合物衍生物，然后给患者服用聚合物衍生物并周期性地采集血样和/或尿样获得清除曲线(例如通过周期性血样或尿样)，确定适合的分子大小和可分裂官能团。获得每种测试复合体的一系列清除曲线之后，可识别适用的复合体。
本文引用的所有论文、书籍、专利、专利公开和其它公开文献均引入本文供参考。
实施例
应理解虽然已结合某些优选的具体实施方案对本发明进行了描述，但以上描述及后面的实施例仅用于说明而非限制本发明的范围。其它方面、优点和在本发明范围内的修改对所属领域技术人员来说是显而易见的。
缩写
DCM：二氯甲烷
NMR：核磁共振
DI：去离子
r.t.室温
anh.无水
Da道尔顿
GPC凝胶渗透色谱法
原料和方法
除非另有说明，实施例中所提及的化学试剂均可商购。
实施例中所提及的PEG均购自Nektar，Huntsville，AL。所有1HNMR都是用Bruker制造的300或400MHz NMR光谱仪产生的。
实施例1
支化的PEG2-酰氨基五亚甲基-马来酰亚胺(40kDA)(L1-AMPE)合成概述：
Figure C20038010801000781
Figure C20038010801000791
A.支化PEG2(40K)胺
向支化PEG2(40,000)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(20g，0.00050moles)(Nektar，Huntsville Alabama)的二氯甲烷(250ml)溶液中加入乙二胺(0.68ml，0.01017moles)，将反应混合物在室温和氩气氛下搅拌过夜。然后使溶剂蒸发至干。使粗产品溶于少量的二氯甲烷，用异丙醇沉淀。使湿产品减压干燥。产量17.2g。
NMR(d6-DMSO)：2.65ppm(t，-CH2-NH2)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG主链)。
B.支化PEG2-酰氨基五亚甲基-马来酰亚胺-40kDa
经3分钟的时间向N-琥珀酰亚胺基(ε-马来酰亚氨基己酸酯)(0.1g，0.000324moles，Pierce Chemical Company)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入来自步骤A的支化PEG2(40K)胺(12.2g，0.000305moles)的二氯甲烷(20ml)溶液。再加入0.045ml三乙胺，将混合物在室温和氩气氛下搅拌过夜。然后使溶剂蒸馏，使剩余的粗产品溶于30ml二氯甲烷，然后在室温下加入450ml异丙醇使之沉淀。产量11.5g。
质子NMR分析显示主信号在：3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG主链)，7.01ppm(s，CH＝CH，马来酰亚胺)，表示为正确产品。基于NMR，估计取代为约89％。GPC分析显示该主产品为98.3％所要化合物，有1.7％二聚体。该产品还有所要求的紫外线吸收。
实施例2
MPEG(5,000DA)-丁基马来酰亚胺(L3-TEME)
合成概述：
A.mPEG(5,000Da)-丁胺
通过蒸出15ml甲苯使mPEG-5,000Da(2.0g，0.0004moles)(NOFCorporation)的甲苯(30ml)共沸干燥。加入1.0M叔丁醇钾的叔丁醇溶液(2.0ml，0.002moles)和1，4-二溴丁烷(0.43g，0.002moles)，将该混合物在75℃和氩气氛下搅拌过夜。将混合物过滤，在减压下蒸出溶剂。使残留物溶于二氯甲烷(3ml)，加入异丙醇(50ml)。滤出沉淀的产物，并减压干燥。再使之溶于浓氨水(20ml)，所得溶液在室温下搅拌20小时。用二氯甲烷萃取产物。萃取液用无水硫酸镁干燥，在减压下蒸出溶剂，得到1.5g M-PEG(5,000)-丁胺。
NMR(D2O)：1.53ppm(m，-CH2-CH2-CH2-NH2)2.75ppm(t，-CH2-NH2)，3.27ppm(s，-OCH3)，3.53ppm(s，PEG主链)。
B.mPEG(5000Da)-丁基马来酰亚胺
使来自步骤A的mPEG(5,000)-丁胺(1.0g，0.0002moles)溶于饱和NaHCO3水溶液(5ml)，使混合物冷却至℃。在剧烈搅拌下加入N-甲氧羰基马来酰亚胺(0.25g)。搅拌15分钟后，加入水(8ml)，将混合物再搅拌65分钟。加入NaCl(0.5g)，用10％磷酸调至pH 3.0。产物用二氯甲烷萃取。萃取液经无水MgSO4干燥，在减压下蒸出溶剂，得到0.9g白色固体产品。
NMR(d6-DMSO)：1.48ppm(bm，-CH2-CH2-CH2-Mal)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG主链)，7.00ppm(s，-CH＝CH-)。
该产品有82％的马来酰亚胺基取代在PEG部分上。
实施例3
MPEG(5000DA)-己基马来酰亚胺(L3-HEXA)
Figure C20038010801000811
该合成与上面实施例2中所述基本相同，但所用二溴试剂有两个附加的亚甲基，即Br-(CH2)6-Br。
A.mPEG(20,000Da)-己胺
通过蒸出15ml甲苯使mPEG-5,000Da(2.0g，0.0004moles)(N0FCorporation)的甲苯(30ml)溶液共沸干燥。加入1.0M叔丁醇钾的叔丁醇溶液(2.0ml，0.002moles)和1，6-二溴己烷(0.49g，0.002moles)，将该混合物在80℃和氩气氛下搅拌过夜。将混合物过滤，在减压下蒸出溶剂。使残留物溶于二氯甲烷(3ml)，加入异丙醇(50ml)。滤出沉淀的产物，并减压干燥。再使之溶于浓氨水(20ml)，所得溶液在室温下搅拌20小时。用二氯甲烷萃取产物。萃取液用无水硫酸镁干燥，在减压下蒸出溶剂，得到1.6g M-PEG(5,000)-己胺。
NMR(D2O)：1.28ppm(m，-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)，1.47ppm(m，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2)，2.71ppm(t，-CH2-NH2)，3.27ppm(s，-OCH3)，3.53ppm(s，PEG主链)。
B.mPEG(5000Da)-己基马来酰亚胺
使来自步骤A的mPEG(5,000Da)-己胺(1.0g，0.0002moles)溶于饱和NaHCO3水溶液(5ml)，使混合物冷却至℃。在剧烈搅拌下加入N-甲氧羰基马来酰亚胺(0.25g)。搅拌15分钟后，加入水(8ml)，将混合物再搅拌65分钟。加入NaCl(0.5g)，用10％磷酸调至pH 3.0。产物用二氯甲烷萃取。萃取液经无水MgSO4干燥，在减压下蒸出溶剂，得到0.9g白色固体产品。
NMR(d6-DMSO)：1.24ppm(bm，-CH2-CH2-CH2-CH2-Mal)，1.45ppm(bm，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-Mal)，3.24 ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG主链)，7.01ppm(s，-CH＝CH-)。
该产品有80％的马来酰亚胺基取代在PEG部分上。
实施例4
MPEG(5KDA)-丙基马来酰亚胺(L3-TME)
合成概述：
Figure C20038010801000821
A.mPEG(5KDa)-丙胺
在20分钟内向4，7，10-三氧杂-1，1 3-十三烷二胺(4.2g)的无水乙腈(100ml)溶液中加入mPEG-苯并三唑基碳酸酯(5g)(ShearwaterCorp.)的无水乙腈(60ml)溶液，将该混合物在室温和氩气氛下搅拌过夜。然后蒸出溶剂。使产物溶于100ml DIH2O。加入NaCl(5g)，用10％H3PO4调至pH 3.0。产物用CH2Cl2萃取。萃取液用50ml 2％KOH溶液洗涤，然后干燥(MgSO4)，蒸出溶剂。再使产物溶于10ml CH2Cl2，在0-5℃下用200ml异丙醇反沉淀。干燥后产量为4.2g。
NMR：所要产物，取代85.0％，GPC(缓冲剂，25℃)取代97.02％。
B.mPEG(5KDa)-PA-马来酰亚胺
使来自步骤A的mPEG(5KDa)-丙胺(4.0g在20ml去离子水中，pH 8.93)在冰浴上冷却至0-5℃，加入N-甲氧羰基马来酰亚胺溶液(0.5g在3.5ml无水乙腈中)，将该混合物在0-5℃下搅拌15分钟。去掉冰浴，加入DIH2O(16ml)，将混合物在室温下搅拌45分钟。加入NaCl(2g)，用10％H3PO4调至pH 3.0。产物用CH2Cl2萃取。萃取液用MgSO4干燥，蒸出溶剂。使粗产品溶于CH2Cl2(10ml)，在0-5℃下用异丙醇(200ml)沉淀。产量3.7g。
NMR：证明合成所要产物；取代83.5％。
实施例5
MPEG(5KDA)-酰氨基环己基甲基-马来酰亚胺(L1-MCH)
合成概述：
Figure C20038010801000831
向4-(马来酰亚氨甲基)-1-环己烷甲酸NHS酯(0.100g)(PierceChemical Company)的CH2Cl2(10ml)溶液中加入mPEG(5KDa)-胺(1.5g)(Shearwater Corp.)的CH2Cl2(20ml)溶液。加入TEA(0.042ml)，将混合物在室温和氩气氛下搅拌过夜。蒸出溶剂。使粗产品溶于2ml CH2Cl2，在0-5℃下用异丙醇(60ml)沉淀。产量1.35g。
NMR：所要化合物，取代79.7％。GPC(硝酸盐缓冲剂，25℃)：二聚体：3.98％；主化合物：96.02％。
实施例6
MPEG(5KDA)-丙基马来酰亚胺(L3-TME)的复合体
为说明本发明反应性聚合物与有硫羟基的分子的反应，向来自实施例4的MPEG-PA-MAL(1.0g)的磷酸盐缓冲剂溶液中加入25μl 2-巯乙醇。将该混合物在室温和氩气氛下搅拌过夜。产物用CH2Cl2(3×20ml)萃取。使萃取液干燥(MgSO4)，蒸出溶剂。使粗产品溶于2ml CH2Cl2，在0-5℃下用40ml异丙醇沉淀。产量0.78g。
NMR：NMR证明形成所要产物；取代：64.9％
实施例7
反应性聚合物的水解速率研究
用HPLC分析探测几种典型的马来酰亚胺封端的mPEG聚合物(平均分子量5000Da)的马来酰亚胺环的水解速率。
评价马来酰亚胺和PEG聚合物链段之间的以下链节：酰氨基亚乙基(L1-AMDE)，酰氨基五亚甲基(L1-AMPE)，酰氨基环己基甲基(L1-MCH)，氧丁基(L3-TEME)，氧己基(L3-HEXA)，氧乙基(L3-ET)，和氧丙基(L3-TME)。为便于参考下面提供完整结构。
表2.通过297nm的UV吸收测量的mPEG(5k-Da)马来酰亚胺(5mg/ml)在50mM磷酸盐缓冲剂(pH约7.5)中的水解速率
 聚合物     结构(表1)    半衰期(hrs)     相对水解速率
 mPEG-AMDE-MALmPEG-AMPE-MALmPEG-MCH-MALmPEG-TEME-MALmPEG-HEXA-MALmPEG-ET-MALmPEG-TME-MAL     L1-AMDEL1-AMPEL1-MCHL3-TEMEL3-HEXAL3-ETL3-TME    8.819.416.319.632.38.111.5     3.661.661.981.651.004.012.82
如上表2中数据所示，这些举例说明性聚合物马来酰亚胺水解生成其各自马来酸的水解速率随着与马来酰亚胺环相邻的烃部分的结构改变。第三栏的数据显示相对于六亚甲基-马来酰亚胺聚合物的水解速率。可见，对于所考察的聚合物来说，L3-HEXA聚合物是最稳定的，即水解速率最慢，因而半衰期最长。以上数据表明隔开聚合物和马来酰亚胺的烃链长度增加使马来酰亚胺封端聚合物本身的半衰期增加。
实施例8
聚合物复合体的水解速率研究
研究典型蛋白质和小分子模型复合体的水解速率考察聚合物-封端马来酰亚胺本身与其复合体的开环倾向之间的关系。
由于大生物分子组分如蛋白质对复合分子在普通液相色谱柱上的保留有显著的影响，所以测量马来酰亚胺复合体的动力学一般比聚合物本身更难。此分析中，不能清楚地区别开环酸式马来酸与未开环或闭环形式。但成功地用基于粒度排阻色谱法(HPLC-SE)和分析蛋白质电泳(SDS-PAGE)的组合分析评估聚合物马来酰亚胺蛋白质复合体以及用非蛋白质的模型化合物制备的复合体的开环特性。
此研究中，研究以下通式所示两种PEG-球状蛋白质复合体考察其开环特性。
Figure C20038010801000871
上面的结构是球状蛋白质2的PEG-马亚酰亚胺复合体，其中球状蛋白质2是分子量约48kDa的蛋白质。使球状蛋白质2与PEG丙酸衍生的PEG马来酰亚胺(MW 30kDa)偶合，还包括介于该聚合物的丙酸衍生部分和马来酰亚胺末端之间中等长度连接基。上面结构中连接基是-C(O)-NH(CH2)2-NH-C(O)-CH2CH2-。
下面的结构是球状蛋白质1的PEG-马来酰亚胺复合体，其中蛋白质有约11kDa的分子量。该复合体用分子量约20kDa的无连接基的马来酰亚胺(mPEG-ET-MAL)制备。对应的PEG马来酰亚胺结构是L3-ET，在实施例7中描述。
下面的结构(球状蛋白质2)在室温pH 8.5下24小时后完全开环，表明此类不存在隔开聚合物和马来酰亚胺环的稳定连接基的马来酰亚胺基封端聚合物的不稳定性。但相对于无连接基形式，上面结构(球状蛋白质1)中的连接基阻止开环，因为上面复合体中的环结构在pH 9下加热至50℃时直至17小时还未完全开环。类似地，测定与模型化合物2-巯基乙醇偶合的本发明稳定的聚合物马来酰亚胺的水解速率评定该复合体的开环倾向。研究显示本发明稳定的聚合物马来酰亚胺优于用于形成球状蛋白质1和球状蛋白质2的复合体的那些。即在游离和复合形式中，本发明聚合物马来酰亚胺都表现出比无连接基的PEG马来酰亚胺和例如上面所示与球状蛋白质2相连的PEG-马来酰亚胺优异的稳定性和耐开环性。
如前面针对未偶合的马来酰亚胺所述进行8-TRI、8-PEN、和8-MCH(结构示于下表3中)复合体的水解速率研究。所示半衰期是由两种不同pH值下所得数据计算的。与未偶合的马来酰亚胺相似，数据表明pH降低时反应速率变慢，开环增加。有与琥珀酰亚胺环(即8-TRI)相邻的最短烃链的键与所研究的其它复合体相比开环最快。数据表明较长/较大的烃链提供优异的耐水解所致开环性。
表3.mPEG(5k-Da)马来酰亚胺复合体的水解半衰期
Figure C20038010801000881
实施例9
1-(N-马来酰亚氨甲基)-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的合成
步骤1
Figure C20038010801000882
9A.1-氨甲基-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的制备：将甲氧基聚乙二醇丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯MW 5,000(20.0g，4.0mmol，Nektar Therapeutics)的乙腈(200mL)溶液滴加至含三乙胺(20mL)的1，4-环己烷二甲胺(11.34g，79.7mmol)的乙腈(200mL)溶液中。将该混合物在室温下搅拌3天。在真空中除去溶剂留下白色固体。将固体与醚(100mL)一起搅拌，过滤收集并干燥得到20.23g粗产品。使该粗混合物溶于CH2Cl2(30mL)，用IPA(500mL)/醚(250mL)沉淀。过滤收集固体并真空干燥(16.3g)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.76(1H，d，NHC＝O)，3.51(br s，O-CH2CH2-，PEG主链)，2.98和2.88(2H，t，CH2-NH-C＝O)，2.43和2.36(2H，d，CH2-NH2)，2.30(2H，CH2C＝O)，1.78-1.68(1H，m，环CH)，1.45-1.21(6H，m，环亚甲基质子)，0.90-0.73(1H，m，环CH)。
步骤2.
9.B.1-(N-马来酰亚氨甲基)-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的制备：使1-氨甲基-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)(3.68g，0.74mmol)的NaHCO3(饱和的，19mL)溶液在冰/盐/水浴中冷却。向其中加入N-甲氧羰基马来酰亚胺(116mg，0.82mmol)。将该混合物在冰浴中搅拌15分钟，加入H2O(29mL)。在冰浴中搅拌1小时后，从浴中取出反应混合物，在室温下搅拌3小时。将反应混合物用盐水(30mL)稀释。用10％磷酸调至pH 3，用CH2Cl2(3×50mL)萃取。使混合的有机萃取液干燥(Na2SO4)并真空浓缩。使残留物溶于CH2Cl2(10mL)，用IPA(60mL)/醚(100mL)沉淀。过滤收集产品并真空干燥过夜(3.14g)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.79(1H，d，NHC＝O)，7.01(2H，s，CH＝CH)，3.51(brs，O-CH2CH2-，PEG主链)，2.32(2H，CH2C＝O)，1.78-1.45(2H，m，环亚甲基)，1.45-1.21(5H，m，环亚甲基质子和CH)，0.90-0.73(1H，m，环质子)。
实施例10
反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)-N-环己基马来酰亚胺的合成.
步骤1.
Figure C20038010801000901
10.A.反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己基-t-BOC胺的制备：在氩气下向反式-4-氨甲基环己基-t-BOC-胺(1.0g，4.67mmol，Albany Molecular)和甲氧基聚乙二醇丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯MW 5,000(22.9g，4.20mmol，Nektar Therapeutics)的乙腈(200mL)溶液中加入三乙胺(1.2mL，8.6mmol)。将该混合物在室温和氩气氛下搅拌24小时。NMR未显示出任何来自SPA基团的剩余质子。在真空中除去溶剂得到白色残留物，使之溶于CH2Cl2(60mL)用IPA(500mL)/醚(1L)沉淀。过滤收集固体并真空干燥得到白色固体形式的产品(22.2g)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.80(1H，s，CH-NH)，6.70(1H，d，CH-NH)，3.55(brs，O-CH2CH2-，PEG主链)，3.28(3H，s，CH3)，3.15(1H，brs，CH)，2.90(2H，t，CH-CH2-NH)，2.33(3H，t，CH2-C＝O)，1.74-1.65(4H，M，环质子)，1.37(9H，s，C(CH3)3)，1.25(1H，brs，CH)，1.14-0.83(4H，m，环质子)。
步骤2.
Figure C20038010801000911
10.B.反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己胺三氟乙酸酯的制备.向反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己基-t-BOC-胺(1.20g，0.24mmol)的无水CH2Cl2(5.0mL)溶液中加入三氟乙酸(2.5mL，32.5mmol)。将该混合物在25℃下搅拌18小时。在真空中除去溶剂留下油状残留物，使之真空干燥过夜。将残留物与无水醚(20mL)一起搅拌。过滤收集产品然后干燥(0.99g)。
1H NMR(dmso-d6)δ8.13(1H，brs，NH)，7.80(3H，d，NH3)，3.51(brs，O-CH2CH2-，PEG主链和CH)，3.24(3H，s，CH3)，2.97(1H，brs，CH)，2.27(2H，t，CH2C＝O)，1.95-1.35(2H，m，环己烷质子)，1.34-1.25(2H，m，环己烷质子)，1.40-1.25(2H，m，环己烷质子)，1.25-1.13(2H，m，环己烷质子)。
步骤3.
Figure C20038010801000921
10.B.反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)-N-环己基马来酰亚胺的制备.使反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己胺三氟乙酸酯(3.0g，0.60mmol)溶于NaHCO3(饱和水溶液，16mL)，在冰/盐浴中冷却至2℃。向其中加入N-甲氧羰基马来酰亚胺(100mg，0.70mmol)。在2℃下搅拌15分钟后，向反应混合物中加入H2O(24mL)，继续搅拌4小时。加入盐水(50mL)，然后用10％磷酸调至pH 3。将该混合物用CH2Cl2(3×50mL)萃取。使混合的有机萃取液干燥(Na2SO4)，真空浓缩，和真空干燥。1H NMR显示产品为约50％马来酰亚胺/50％开环物质(来自不完全闭环)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.80(1H，d，NH)，6.96(2H，s，马来酰亚胺CH＝CH)，3.51(474，br s，PEG主链和CH)，3.24(3H，s，CH3)，2.89(2H，t，CH2)，2.30(2H，t，CH2C＝O)，1.85-1.73(2H，m，环己烷质子)，1.73-1.63(2H，m，环己烷质子)，1.32(1H，brs，CH)，1.15-1.05(2H，m，环己烷质子)，1.00-0.85(2H，m，环己烷质子)。
实施例11
反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)-N-环己基马来酰亚胺的合成
步骤1.
Figure C20038010801000931
11.A.反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)环己基-t-BOC胺的制备：在氩气下向单-t-BOC-反式-1，4-二氨基环己烷(1.0g，4.38mmol，Albany Molecular)和甲氧基聚乙二醇丙酸N-羟基琥珀酰胺基酯MW 5,000(21.5g，4.30mmol，Nektar Therapeutics)的乙腈(200mL)溶液中加入三乙胺(1.2mL，8.6mmol)。将该混合物在室温和氩气氛下搅拌24小时。1H NMR未显示出任何来自N-羟基琥珀酰亚胺酯基的剩余质子。在真空中除去溶剂得到白色残留物，在醚(50mL)中搅拌30分钟。过滤收集固体并真空干燥得到白色固体产品(1.95g)。1H NMR(dmso-d6)δ7.70(1H，d，CH-NH)，6.69(1H，d，CH-NH)，3.51(br s，O-CH2CH2-，PEG主链和CH)，3.24(3H，s，CH3)，3.15(1H，brs，CH)，2.26(3H，t，CH2-C＝O)，1.74(4H，brd，环质子)，1.37(9H，s，C(CH3)3)，1.17-1.07(4H，m，环质子)。
步骤2.
Figure C20038010801000932
11.B.反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)环己胺三氟乙酸酯的制备.向反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)环己基-t-BOC胺(12.0g，2.4mmol)的无水CH2Cl2(55mL)溶液中加入三氟乙酸(25mL，325mmol)。将该混合物在25℃下搅拌18小时。在真空中除去溶剂留下油状残留物，使之真空干燥过夜。使残留物溶于CH2Cl2(30mL)，用IPA(750mL)/醚(500mL)沉淀。过滤产品，然后干燥得到白色固体产品(10.2g)。
1H NMR(dmso-d6)δ8.13(1H，br s，NH)，7.80(3H，d，NH3)，3.51(br s，O-CH2CH2-，PEG主链和CH)，3.24(3H，s，CH3)，2.97(1H，br s，CH)，2.27(2H，t，CH2C＝O)，1.95-1.35(2H，m，环己烷质子)，1.34-1.25(2H，m，环己烷质子)，1.40-1.25(2H，m，环己烷质子)，1.25-1.13(2H，m，环己烷质子)。
步骤3.
11.C.反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)-N-环己基马来酰亚胺的制备.使反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)环己胺三氟乙酸酯(3.0g，0.60mmol)溶于NaHCO3(饱和水溶液，16mL)，在冰/盐浴中冷却至2℃。向其中加入N-甲氧羰基马来酰亚胺(100mg，0.70mmol)。在2℃下搅拌15分钟后，向反应混合物中加H2O(24mL)，继续搅拌5小时。加入盐水(20mL)，然后用10％磷酸调至pH 3。将该混合物用CH2Cl2(3×50mL)萃取。使混合的有机萃取液干燥(Na2SO4)，真空浓缩，并真空干燥得到白色固体产品(2.75g)。1H NMR显示产品为26％马来酰亚胺/74％开环物(来自不完全闭环)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.77(1H，d，NH)，6.96(2H，s，马来酰亚胺CH＝CH)，3.51(br s，O-CH2CH2-，PEG主链)，3.24(3H，s，CH3)，2.28(2H，t，CH2C＝O)，2.06-1.92(1H，m，环己烷质子)，1.88-1.73(3H，m，环己烷质子)，1.59-1.65(1H，m，环己烷质子)，1.28-1.13(3H，m，环己烷质子)。
实施例12
1-N-马亚酰亚氨甲基-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的合成
步骤1.
Figure C20038010801000951
12.A.1-氨甲基-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的制备：将甲氧基聚乙二醇丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯MW 5,000(10.0g，2.0mmol，Nektar Therapeutics)的乙腈(100mL)溶液滴加至包含三乙胺(10mL)的1，3-环己烷二甲胺(6.0mL，39.9mmol，Albany Molecular)的乙腈(100mL)溶液中。将该混合物在室温下搅拌3天。滤出不溶性固体，使滤液真空浓缩，留下白色固体。使粗混合物溶于CH2Cl2(50mL)，用IPA(375mL)/醚(300mL)沉淀。滤出固体，真空干燥，得到白色固体(9.5g)。1H NMR显示剩余一些1，3-环己烷二甲胺，通过使固体溶于CH2Cl2并通过Amberlyst 15(15g)洗涤除去。除去溶剂得到1-甲氨基-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(8.62g)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.78(1H，d，NHC＝O)，3.51(br s，PEG主链)，3.24(3H，s，OCH3)，2.95和2.89(2H，m，CH2-NH-C＝O)，2.49和2.37(2H，d，CH2-NH2)，2.30(2H，CH2C＝O)，1.75-1.65(4H，m，环质子)，1.63-1.21(2H，m，环质子)，1.21-1.03(2H，m，环质子)，0.80-0.70(1H，m，环质子)，0.50-0.30(1H，m，环质子)。
步骤2.
Figure C20038010801000961
12.B.1-N-马来酰亚氨甲基-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的制备：使1-氨甲基-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)(4.0g，0.8mmol)的NaHCO3(饱和，20mL)溶液在冰/盐/水浴中冷却。向其中加入N-甲氧羰基马来酰亚胺(126mg，0.89mmol)。将该混合物在冰浴中搅拌15分钟，加H2O(32mL)。在冰浴中搅拌1小时后，将反应混合物从浴中取出，在室温下搅拌3小时。将反应混合物用盐水(30mL)稀释。用10％磷酸调至pH 3，用CH2Cl2(3×50mL)萃取。使混合的有机萃取液干燥(Na2SO4)，真空浓缩。使残留物真空干燥得到白色固体产品。
1H NMR(dmso-d6)δ7.79(1H，d，NHC＝O)，7.01(2H，s，CH＝CH)，3.51(br s，PEG主链和CHCH2)，3.24(3H，s，OCH3)3.10-2.63(2H，m，CHCH2)，2.31(2H，dd CH2C＝O)，1.65-1.1.10(8H，m，环质子)，0.83-0.48(2H，m，环质子)。
实施例13
典型聚合物马来酰亚胺的水解速率研究
如前面实施例7中所述对几种典型的稳定PEG-马来酰亚胺进行水解研究。具体的PEG-马来酰亚胺的结构及其相应的半衰期示于下表4中。
表4.所选mPEG马来酰亚胺的稳定性
实施例14
稳定的mPEG-马来酰亚胺1-(N-马来酰亚氨甲基)-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷至模型化合物2-巯基乙醇的偶合
Figure C20038010801000981
1-(3-(2-羟乙巯基)-N-琥珀酰亚胺基甲基)-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的制备向1-(N-马来酰亚氨甲基)-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)(500mg，0.1mmol)的CH3CN(10mL)溶液中加入2-巯基乙醇(15μL，0.21mmol)。将该混合物在室温下搅拌18小时。1H NMR显示剩余马来酰亚胺原料。再加入2-巯基乙醇(15μL，0.21mmol)，将混合物再搅拌24小时。1H NMR显示不存在剩余的马来酰亚胺。在真空中除去溶剂，真空干燥。使固体溶于CH2Cl2(2mL)，用IPA(50mL)沉淀。过滤收集固体并干燥得到白色固体产品(403mg)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.66(1H，br s，NH)，4.83(1H，t，OH)，4.01(1H，dd，CH-S)，3.51(br s，PEG主链)，3.05-2.61(4H，m，2x CHCH2)，2.30(2H，t，CH2C＝O)，1.75-0.75(10H，m，环质子)。
实施例15
稳定的mPEG-马来酰亚胺反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)-N-环己基马来酰亚胺至模型化合物2-巯基乙醇的偶合
反式-1-(3-(2-羟乙巯基)-N-琥珀酰亚胺基)-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷的制备向反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)-N-环己基马来酰亚胺(400mg，0.0.08mmol)的CH3CN(10mL)溶液中加入2-巯基乙醇(15μL，0.21mmol)。将该混合物在室温下搅拌18小时。在真空中除去溶剂，真空干燥。残留物与醚(2×20mL)一起搅拌，过滤收集固体得到白色固体产品(310mg)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.81(1H，br s，NH)，4.87(1H，t，OH)，3.85(1H，dd，CH-SEtOH)，3.51(br s，PEG主链，CH和SCH2CH2OH)，3.24(3H，s，CH3)，2.90(2H，br s，CH2NH)，2.79(2H，t，SCH2CH2)，2.30(2H，t，CH2C＝O)，2.08-1.55(5H，m，环质子)，1.25-0.94(4H，m，环质子)。
实施例16
稳定的MPEG-马来酰亚胺反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)-N-环己基马来酰亚胺至模型化合物2-巯基乙醇的偶合
Figure C20038010801001001
反式-1-(3-(2-羟乙巯基)-N-琥珀酰亚胺基)-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)环己烷的制备向反式-4-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨基)-N-环己基马来酰亚胺(400mg，0.0.08mmol)的CH3CN(10mL)溶液中加入2-巯基乙醇(15μL，0.21mmol)。将该混合物在室温下搅拌18小时。在真空中除去溶剂，真空干燥，得到白色固体产品(240mg)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.75(1H，br s，NH)，4.83(1H，t，OH)，4.01(1H，dd，CH-S)，3.51(br s，PEG 主链和2X CH)，2.75(2H，m，S-CH2)，2.33(2H，t，CH2C＝O)，2.02-1.65(4H，m，环质子)，1.55-0.95(4H，m，环质子)。
实施例17
稳定的MPEG-马来酰亚胺1-N-马来酰亚氨甲基-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷至模型化合物2-巯基乙醇的偶合
Figure C20038010801001011
1-(3-(2-羟乙巯基)-N-琥珀酰亚胺甲基)-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)的制备向1-N-马来酰亚氨甲基-3-(甲氧基聚(乙二醇)丙酰氨甲基)环己烷(顺式和反式异构体的混合物)(450mg，0.0.09mmol)的CH3CN(10mL)溶液中加入2-巯基乙醇(15μL，0.21mmol)。将该混合物在室温下搅拌18小时。在真空中除去溶剂，真空干燥。残留物与醚(20mL)一起搅拌，过滤收集固体得到白色固体产品(230mg)。
1H NMR(dmso-d6)δ7.81(1H，br s，NH)，4.89(1H，t，OH)，4.03(1H，dd，CH-S)，3.51(PEG主链和S-CH2CH2)，3.24(3H，s，CH3)，3.05-2.60(4H，m，2x CHCH2)，2.30(2H，t，CH2C＝O)，1.80-1.05(8H，m，环质子)，0.80-0.51(2H，m，环质子)。
所属领域技术人员得益于以上描述中的教导将想起本发明的许多修改和其它实施方案。因而，应理解为本发明不限于所公开的具体实施方案，这些修改和其它实施方案都包括在所附权利要求书的范围内。虽然本文中采用特殊术语，但它们仅以一般描述性的意义使用而不用于限制。

Claims (129)

1.一种有以下结构的水溶性聚合物：
其中
POLY为水溶性聚合物链段，
b为0或1，
X为包含至少4个邻接的饱和碳原子的水解稳定连接基，而且
所述聚合物不存在芳基和酯键。
2.权利要求1的聚合物，其中X为有总共4至20个碳原子的无环、环状或脂环族饱和烃链。
3.权利要求2的聚合物，其中X为有选自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的碳原子总数的无环、环状或脂环族饱和烃链。
4.权利要求3的聚合物，其中X为有选自4至20、4至12、4至10、和5至8个原子的碳原子总数的无环、环状或脂环族饱和烃链。
5.权利要求2至4之任一的聚合物，其中X是线性的无环饱和烃链。
6.权利要求5的聚合物，其中X是支化的无环饱和烃链。
7.权利要求6的聚合物，其中X在相对于所述马来酰亚胺基的α碳上有支链。
8.权利要求6的聚合物，其中X在相对于所述马来酰亚胺基的β碳上有支链。
9.权利要求6的聚合物，其中X在相对于所述马来酰亚胺基的γ碳上有支链。
10.权利要求5的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100003C1
其中
y为4至20的整数；
R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团，和
R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
11.权利要求10的聚合物，其中R1和R2每次出现时独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团。
12.权利要求10的聚合物，其中R1和R2均为H，Y选自4、5、6、7、8、9和10。
13.权利要求10的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100003C2
其中，Cα上的R1或R2至少之一选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基，y为至少4。
14.权利要求13的聚合物，其中Cα上的R1和R2独立地选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基。
15.权利要求13的聚合物，其中其它非Cα的R1和R2变量均为H。
16.权利要求13的聚合物，其中Cα上的R1或R2至少之一为低级烷基或低级环烷基。
17.权利要求13的聚合物，其中Cα上的R2为H。
18.权利要求17的聚合物，其中Cα上的R1选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、环戊基、己基、和环己基。
19.权利要求13的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100004C1
其中R1和R2独立地为烷基或环烷基。
20.权利要求13的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100004C2
其中R1为烷基或环烷基而R2为H。
21.权利要求19的聚合物，其中R1和R2独立地为甲基或乙基。
22.权利要求19的聚合物，其中R1和R2相同。
23.权利要求1的聚合物，其中所述聚合物有水解稳定的马来酰亚胺环。
24.权利要求8的聚合物，有以下结构：
其中R1和R2独立地选自H、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基，但不都为H，和
y为至少4。
25.权利要求24的聚合物，其中R1和R2独立地为H、低级烷基或低级环烷基。
26.权利要求25的聚合物，其中R1和R2独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、环戊基、己基、和环己基。
27.权利要求24的聚合物，其中R2为H。
28.权利要求10的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100005C2
其中与Cγ相连的R1和R2至少之一选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基。
29.权利要求28的聚合物，其中与Cγ相连的R1和R2至少之一为烷基或环烷基，其它R1和R2变量均为H。
30.权利要求28的聚合物，其中与Cα或Cβ相连的R1变量之一为烷基或环烷基，其它R1和R2变量均为H。
31.权利要求2的聚合物，其中X为饱和的环或脂环烃链。
32.权利要求31的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100006C1
其中
CYCa为有“a”个环碳的亚环烷基，其中“a”的值在4至12的范围内；
p和q独立地为0至20，而且p+q+a≤20，
R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团，和
R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
33.权利要求32的聚合物，其中p和q独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7和8。
34.权利要求32的聚合物，其中R1每次出现时独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团，R2每次出现时独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团。
35.权利要求32的聚合物，其中a选自5、6、7、8和9。
36.权利要求35的聚合物，其中a为6，CYCa为1，1-、1，2-、1，3-或1，4-取代的环己基环。
37.权利要求32的聚合物，其中p和q各自独立地在0至4的范围内。
38.权利要求36的聚合物，其中所述取代的环己基环上的取代基是顺式的。
39.权利要求36的聚合物，其中所述取代的环己基环上的取代基是反式的。
40.权利要求32的聚合物，其中R1和R2每次出现时均为H。
41.权利要求34的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100007C1
其中q和p各自独立地在0至6的范围内。
42.权利要求41的聚合物，其中q在0至6的范围内，p为0。
43.权利要求34的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100007C2
其中q和p各自独立地在0至6的范围内，所述亚环己基环上的取代基是顺式或反式的。
44.权利要求32的聚合物，其中CYCa为双环或三环。
45.权利要求44的聚合物，其中CYCa选自：
Figure C2003801080100008C1
所述环上取代基位于所述双环或三环上任何可用位置。
46.权利要求1的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100008C2
其中X和b如前面所定义，
b’为0或1，和
X’为包含至少3个邻接的饱和碳原子的水解稳定的连接基。
47.权利要求1的聚合物，其中POLY选自聚环氧烷、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚唑啉、聚丙烯酰吗啉、和聚氧乙烯化多元醇。
48.权利要求47的聚合物，其中POLY为聚环氧烷。
49.权利要求48的聚合物，其中POLY为聚乙二醇。
50.权利要求49的聚合物，其中所述聚乙二醇被封端部分封端。
51.权利要求50的聚合物，其中所述封端部分独立地选自烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基、和取代的芳氧基。
52.权利要求51的聚合物，其中所述封端部分选自甲氧基、乙氧基、和苄氧基。
53.权利要求49的聚合物，其中所述聚乙二醇有100至100 000道尔顿的标称平均分子质量。
54.权利要求53的聚合物，其中所述聚乙二醇有1 000至50 000道尔顿的标称平均分子质量。
55.权利要求54的聚合物，其中所述聚乙二醇有2 000至30 000道尔顿的标称平均分子质量。
56.权利要求46的聚合物，其中所述POLY是线形的，所述聚合物是同双官能的。
57.权利要求49的聚合物，其中所述聚乙二醇有选自线形、支化和叉状的结构。
58.权利要求26的聚合物，其中所述聚乙二醇包含以下结构：
Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，
其中n为10至4000，Z包含选自羟基、氨基、酯、醛、醛水合物、缩醛、酮、酮水合物、缩酮、链烯基、丙烯酰胺、砜、硫醇、羧酸、酰肼、脲、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、烷氧基、苄氧基、硅烷、类脂、磷脂、生物素、和荧光素的部分。
59.以下结构的聚合物：
Figure C2003801080100009C1
其中：
d为3至100的整数，和
R为有3或更多个羟基、氨基或其组合的中心分子的残基。
60.权利要求59的聚合物，其中d为3至12的整数。
61.以下结构的聚合物：
Figure C2003801080100010C1
其中
PEG为-(CH2CH2O)nCH2CH2-，
M为：
Figure C2003801080100010C2
m选自3、4、5、6、7和8。
62.一种水溶性聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100010C3
其中
POLY为水溶性聚合物链段，
b为0或1，
X为包含至少3个邻接的饱和碳原子的水解稳定连接基，而且
所述聚合物不存在芳基和酯键。
63.权利要求62的聚合物，其中X为有总共3至20个碳原子的无环、环状或脂环族饱和烃链。
64.权利要求62的聚合物，其中X为有选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的碳原子总数的无环、环状或脂环族饱和烃链。
65.权利要求64的聚合物，其中X为有选自3至20、4至12、4至10、和5至8个原子的碳原子总数的无环、环状或脂环族饱和烃链。
66.权利要求63的聚合物，其中X是线性的无环饱和烃链。
67.权利要求63的聚合物，其中X是支化的无环饱和烃链。
68.权利要求67的聚合物，其中X在相对于氨基的α碳上有支链。
69.权利要求67的聚合物，其中X在相对于氨基的β碳上有支链。
70.权利要求67的聚合物，其中X在相对于氨基的γ碳上有支链。
71.权利要求63的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100011C1
其中
y为3至20的整数；
R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基的有机基团，和
R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
72.权利要求62的聚合物，其中X为饱和的环或脂环烃部分。
73.权利要求72的聚合物，其中X有以下结构：
其中
CYCa为有“a”个环碳的亚环烷基，其中“a”的值在3至12的范围内；
p和q独立地为0至20，而且p+q+a≤20，
R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团，和
R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
74.权利要求73的聚合物，其中p和q独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7和8。
75.权利要求73的聚合物，其中R1每次出现时独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团，R2每次出现时独立地为H或选自低级烷基和低级环烷基的有机基团。
76.权利要求73的聚合物，其中a选自5、6、7、8和9。
77.权利要求76的聚合物，其中a为6，CYCa为1，1-、1，2-、1，3-或1，4-取代的亚环己基环。
78.权利要求77的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100012C1
其中q和p各自独立地在0至6的范围内，所述亚环己基环上的取代基是顺式或反式的。
79.权利要求77的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100012C2
其中q和p各自独立地在0至6的范围内，所述亚环己基环上的取代基是顺式或反式的。
80.权利要求73的聚合物，其中CYCa为双环或三环的。
81.一种马来酰亚胺封端聚合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a.使POLY-[O]b-C(O)-LG(IX)与NH2-X-NH2(XII)在能形成POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH2(X)的条件下反应，和
b.使POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH2(X)转化成POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL(II)
其中：
POLY为水溶性聚合物链段，
b为0或1，
X为包含至少3个邻接的饱和碳原子的水解稳定连接基，
LG为离去基团，
MAL为马来酰亚胺，而且
所述马来酰亚胺封端聚合物不存在芳基和酯键。
82.权利要求81的方法，其中所述LG选自卤离子、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、对硝基酚根。
83.权利要求81的方法，其中所述NH2-X-NH2试剂中的氨基之一处于被保护态。
84.权利要求81的方法，其中所述反应步骤在选自乙腈、氯仿、二氯甲烷、苯、甲苯、二甲苯、丙酮、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、和二甲亚砜的有机溶剂中进行。
85.权利要求81的方法，其中所述反应步骤在惰性气氛下进行。
86.权利要求81的方法，其中所述反应步骤在0至100℃范围内的温度下进行。
87.权利要求81的方法，其中所述反应步骤在选自三乙胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶、和碳酸钠的碱存在下进行。
88.权利要求83的方法，还包括在所述反应步骤之后使POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2中的氨基脱保护。
89.权利要求81的方法，还包括在所述转化步骤之前使步骤(a)所得产物纯化的步骤。
90.权利要求89的方法，其中所述纯化包括通过柱色谱法使产品纯化。
91.权利要求89的方法，其中所述纯化包括通过离子交换色谱法使产品纯化。
92.权利要求81的方法，其中所述转化步骤包括使POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2与选自N-甲氧羰基马来酰亚胺、外-7-氧杂[2.2.1]双环庚烷-2，3-二甲酸酐、和马来酐的试剂在适合在反应混合物中形成POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL的条件下反应。
93.权利要求92的方法，其中所述试剂为N-甲氧羰基马来酰亚胺，所述转化步骤在水或水和与水混溶性溶剂的混合物中进行。
94.权利要求92的方法，其中所述试剂为马来酐，所述转化步骤包括使POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2与马来酐在能形成作为中间体的POLY-[O]b-C(O)-NH-X-NH-C(O)CH＝CHCOOH(XI)的条件下反应，而且所述方法还包括：
将POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH-C(O)CH＝CHCOOH在能促进通过消去水而环化的条件下加热形成POLY-[O]b-C(O)-NH-X-MAL。
95.权利要求92的方法，还包括从反应混合物中回收所述POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL的步骤。
96.权利要求95的方法，其中所回收的POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL纯度大于80％。
97.权利要求81的方法，其中X为有总共3至20个碳原子的无环、环状或脂环族饱和烃链。
98.权利要求81的方法，其中X是线性的无环饱和烃链。
99.权利要求81的方法，其中X是支化的无环饱和烃链。
100.权利要求99的方法，其中X在相对于所述马来酰亚胺基的α碳上有支链。
101.权利要求99的方法，其中X在相对于所述马来酰亚胺基的β碳上有支链。
102.权利要求99的方法，其中X在相对于所述马来酰亚胺基的γ碳上有支链。
103.权利要求81的方法，其中所述NH2-X-NH2对应于以下结构：
Figure C2003801080100015C1
其中
y为3至20的整数；
R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基的有机基团，和
R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基、和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
104.权利要求81的方法，其中所述NH2-X-NH2对应于以下结构：
Figure C2003801080100016C1
其中
CYCa为有“a”个环碳的亚环烷基，其中“a”的值在3至12的范围内；
p和q独立地为0至20，而且p+q+a≤20，
R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团，和
R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
105.一种通过有巯基的生物活性剂与权利要求1的聚合物反应形成的复合体。
106.有以下结构的复合体：
Figure C2003801080100016C2
其中：
POLY为水溶性聚合物链段，
b为0或1，
X为包含至少4个邻接的饱和碳原子的水解稳定连接基，“POLY-[O]b-C(O)-HN-X-”不存在芳基和酯键，和
“-S-生物活性剂”代表包含巯基(-SH)的生物活性剂的残基。
107.一种包含权利要求106所述复合体的组合物，其中所述组合物包含单一种聚合物复合体。
108.一种聚合物复合体的形成方法，所述方法包括使包含反应性硫羟基的生物活性剂“HS-生物活性剂”与权利要求1的聚合物在能促进形成有以下结构的聚合物复合体的条件下接触：
Figure C2003801080100017C1
109.权利要求108的方法，其中所述接触步骤在6.0至8.0范围内的pH进行。
110.权利要求109的方法，其中所述聚合物复合体在反应混合物中形成，所述方法还包括在所述接触步骤之后从所述反应混合物中分离出所述聚合物复合体。
111.用权利要求1所述水溶性聚合物形成的水凝胶。
112.用权利要求59所述水溶性聚合物形成的水凝胶。
113.用权利要求61所述水溶性聚合物形成的水凝胶。
114.一种水溶性聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100017C2
其中
POLY为水溶性聚合物链段，
X为水解稳定连接基，是有总共3至20个碳原子的饱和环或脂环烃链，和
所述聚合物不存在芳基和酯键。
115.权利要求114的聚合物，其中X有以下结构：
其中
CYCa为有“a”个环碳的亚环烷基，其中“a”的值在3至12的范围内；
p和q独立地为0至20，而且p+q+a≤20，
R1每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团，和
R2每次出现时独立地为H或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、亚烷基环烷基和取代的亚烷基环烷基的有机基团。
116.权利要求115的聚合物，其中p和q独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7和8。
117.权利要求115的聚合物，其中R1每次出现时独立地为H或选自低级烷基、低级环烷基、和低级亚烷基环烷基的有机基团，R2每次出现时独立地为H或选自低级烷基、低级环烷基、和低级亚烷基环烷基的有机基团。
118.权利要求115的聚合物，其中a选自5、6、7、8和9。
119.权利要求115的聚合物，其中CYCa是顺式的。
120.权利要求115的聚合物，其中CYCa是反式的。
121.权利要求118的聚合物，其中a为6，CYCa为1，1-、1，2-、1，3-或1，4-取代的环己基环。
122.权利要求115的聚合物，其中q和p各自独立地在0至4的范围内。
123.权利要求115的聚合物，其中R1和R2每次出现时均为H。
124.权利要求115的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100019C1
其中q和p各自独立地在0至6的范围内。
125.权利要求115的聚合物，其中q在0至6的范围内，p为0。
126.权利要求115的聚合物，有以下结构：
Figure C2003801080100019C2
其中q和p各自独立地在0至6的范围内。
127.权利要求115的聚合物，其中CYCa为双环或三环的。
128.权利要求115的聚合物，其中CYCa选自：
Figure C2003801080100019C3
Figure C2003801080100020C1
所述环上取代基位于所述双环或三环上任何可用位置。
129.一种马来酰亚胺封端聚合物的制备方法，所述方法包括：
a.使POLY-[O]b-C(O)-LG  与H2N-X-MAL在能形成POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL的条件下反应，
其中：
POLY为水溶性聚合物链段，
b为0或1，
X为包含至少3个邻接的饱和碳原子的水解稳定连接基，
LG为离去基团，
MAL为马来酰亚胺，而且
所述马来酰亚胺封端聚合物不存在芳基和酯键。
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