JP2002512886A - 分離方法におけるまたはこれに関する改良 - Google Patents
分離方法におけるまたはこれに関する改良Info
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- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03D—FLOTATION; DIFFERENTIAL SEDIMENTATION
- B03D2203/00—Specified materials treated by the flotation agents; specified applications
- B03D2203/003—Biotechnological applications, e.g. separation or purification of enzymes, hormones, vitamins, viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
カプセル化した標的捕捉性のガスマイクロバブルに標的を結合させ、マイクロバブルおよび結合した標的を液体試料の表面に浮遊させて、マイクロバブル/標的の浮遊する層を形成し、そしてこの層を試料から分離することにより液体試料からの標的物質の分離が達せられる。積極的な分離方法では、マイクロバブルは次に例えば破裂によって標的から取り出される。消極的な分離方法では、浮遊する層の分離に続いて標的を含まない試料が回収される。この方法は試料中の疾病マーカーの存在を検出するために診断的にも用いられることができる。新規な分離装置もまた記載されている。
Description
【0001】 本発明は試料からの成分の分離に関し、更に特定すれば、浮遊性のガスマイク
ロバブルを使用する分離方法およびこのような方法に有用な装置に関する。
ロバブルを使用する分離方法およびこのような方法に有用な装置に関する。
【0002】 試料からの標的成分の分離は、水の浄化、工業化学、医学およびバイオ技術を
含めて広範な種類の分野における研究者が日々直面する問題である。試料はしば
しば不均質であり、また試料または成分を更に操作または使用する以前に、特定
の成分がこのような試料から回収または除去される必要があるであろうから、特
別な成分を分離する必要がある。寸法がミクロン程度である成分の単離、精製に
は、いくつかの成分を除去するための濾過または遠心分離の工程と、これに続く
、関心のある成分を濃縮する工程が含まれ、クロマトグラフィー工程もまた含ま
れてよい。その後、所望の成分を十分な純度で得るために、一層洗練された精製
工程がしばしば必要である。しばしば費用が嵩みまた面倒であろうこのような方
法を用いることなく、簡単な1つの工程で成分が分離されるならば有利であるこ
とは明らかであろう。
含めて広範な種類の分野における研究者が日々直面する問題である。試料はしば
しば不均質であり、また試料または成分を更に操作または使用する以前に、特定
の成分がこのような試料から回収または除去される必要があるであろうから、特
別な成分を分離する必要がある。寸法がミクロン程度である成分の単離、精製に
は、いくつかの成分を除去するための濾過または遠心分離の工程と、これに続く
、関心のある成分を濃縮する工程が含まれ、クロマトグラフィー工程もまた含ま
れてよい。その後、所望の成分を十分な純度で得るために、一層洗練された精製
工程がしばしば必要である。しばしば費用が嵩みまた面倒であろうこのような方
法を用いることなく、簡単な1つの工程で成分が分離されるならば有利であるこ
とは明らかであろう。
【0003】 比較的最近、主として、モノクローナル抗体の出現および規定された抗原エピ
トープに関するこの抗体の特別な特異性のため、抗体−抗原反応によって媒介さ
れる分離技術が研究所と臨床実験室との双方で用いられてきた。従って、バイオ
技術のような分野では、時間のかかる濾過/遠心分離技術や濃縮技術の代りに、
関心のある特別な成分に結合させるために標的となる抗体の使用がある。
トープに関するこの抗体の特別な特異性のため、抗体−抗原反応によって媒介さ
れる分離技術が研究所と臨床実験室との双方で用いられてきた。従って、バイオ
技術のような分野では、時間のかかる濾過/遠心分離技術や濃縮技術の代りに、
関心のある特別な成分に結合させるために標的となる抗体の使用がある。
【0004】 このような抗体−抗原結合を活用する1つの技術は、Dymabeads(登録商標)
のような超常磁性のポリマー粒子を使用する、例えば血液の成分または細胞の分
離である。超常磁性粒子は磁場の存在下でのみ磁気特性を示す。分離手続きにこ
の粒子を使用することは多年にわたって知られておりまた現在広くいきわたって
いる。
のような超常磁性のポリマー粒子を使用する、例えば血液の成分または細胞の分
離である。超常磁性粒子は磁場の存在下でのみ磁気特性を示す。分離手続きにこ
の粒子を使用することは多年にわたって知られておりまた現在広くいきわたって
いる。
【0005】 超常磁性ポリマー粒子は特定的なリガンドでコートされそして所望の標的と結
合するために不均質の標的懸濁液に添加される。得られる標的/超常磁性粒子複
合体は、磁石を使用することにより簡単に固定でき、次いで標的を含まない懸濁
液が系から抜き出される。あるいは、標的に対する特異性を有する1次抗体が先
ず懸濁液に添加され、そして過剰な抗体をすべて除去した後、1次抗体に対する
特異性を有する2次抗体を担持する磁性ポリマー粒子が添加されて、1次抗体を
介して標的に結合できる。次いで、上記のように磁気分離が実施される。
合するために不均質の標的懸濁液に添加される。得られる標的/超常磁性粒子複
合体は、磁石を使用することにより簡単に固定でき、次いで標的を含まない懸濁
液が系から抜き出される。あるいは、標的に対する特異性を有する1次抗体が先
ず懸濁液に添加され、そして過剰な抗体をすべて除去した後、1次抗体に対する
特異性を有する2次抗体を担持する磁性ポリマー粒子が添加されて、1次抗体を
介して標的に結合できる。次いで、上記のように磁気分離が実施される。
【0006】 しかしながら、細胞の磁気分離には多くの欠点がある。先ず第一に、試料に磁
場がかけられると、超常磁性粒子および標的/粒子複合体は試料を通過して磁石
に向かって急速に引き寄せられるであろう。ポリマー粒子は硬くまた典型的には
細胞と似た寸法であろうから、この急速な運動によって試料中の標的細胞に著し
い損傷が及ぶ可能性がある。
場がかけられると、超常磁性粒子および標的/粒子複合体は試料を通過して磁石
に向かって急速に引き寄せられるであろう。ポリマー粒子は硬くまた典型的には
細胞と似た寸法であろうから、この急速な運動によって試料中の標的細胞に著し
い損傷が及ぶ可能性がある。
【0007】 さらに、分離された成分のポリマー粒子からの離脱は困難で時間のかかる工程
でありうる。代表的な技術には、抗原−抗体結合の直接的な解離を実施するため
に、モノクローナル抗体のFab−断片と反応するポリクローナル抗体を使用す
ることが関与する。この技術は、ある種のポリマー粒子とある種のモノクローナ
ル抗体とともに用いる場合にのみ好適である。別な離脱方法には、37℃で一晩
培養、酵素分解および、ポリマー粒子と同じ標的と競合する反応体の導入が含ま
れる。
でありうる。代表的な技術には、抗原−抗体結合の直接的な解離を実施するため
に、モノクローナル抗体のFab−断片と反応するポリクローナル抗体を使用す
ることが関与する。この技術は、ある種のポリマー粒子とある種のモノクローナ
ル抗体とともに用いる場合にのみ好適である。別な離脱方法には、37℃で一晩
培養、酵素分解および、ポリマー粒子と同じ標的と競合する反応体の導入が含ま
れる。
【0008】 これらの離脱技術が複雑な性格を帯びているため『消極的な』成分分離、つま
り好ましくない成分を磁気粒子に結合させそして単離し、所望の成分を試料中に
残す方法において、磁性ポリマー粒子が主として使用される。特定の成分が標的
にされそして単離される『積極的な』選択にこの粒子を使用することは比較的制
限されている。
り好ましくない成分を磁気粒子に結合させそして単離し、所望の成分を試料中に
残す方法において、磁性ポリマー粒子が主として使用される。特定の成分が標的
にされそして単離される『積極的な』選択にこの粒子を使用することは比較的制
限されている。
【0009】 上記に論じたような磁気分離方法に対する別な方法として、浮遊性のビーズま
たは低密度の粒子を使用する多くの分離方法が提案されている。Transplantatio
n 46(4)、558〜563ページ、(1988年)には、白血病細胞またはリンパ腫細胞を自
己由来の骨髄から除去するための技術が記載されている。この方法ではモノクロ
ーナル抗体で被覆されている低密度ポリプロピレンビーズが利用される。標的細
胞はポリプロピレンビーズに結合したモノクローナル抗体に結合しそして懸濁液
の表面に浮遊し、そこでデカンテーションによって取り出されることができ、懸
濁液中に残留する通常の骨髄細胞が残される。
たは低密度の粒子を使用する多くの分離方法が提案されている。Transplantatio
n 46(4)、558〜563ページ、(1988年)には、白血病細胞またはリンパ腫細胞を自
己由来の骨髄から除去するための技術が記載されている。この方法ではモノクロ
ーナル抗体で被覆されている低密度ポリプロピレンビーズが利用される。標的細
胞はポリプロピレンビーズに結合したモノクローナル抗体に結合しそして懸濁液
の表面に浮遊し、そこでデカンテーションによって取り出されることができ、懸
濁液中に残留する通常の骨髄細胞が残される。
【0010】 US-A-5116724には、細胞およびビールスを分離するための製品が記載されてい
る。これは『浮遊性』である粒子、つまり粒子が使用されている媒体より小さい
密度を有する粒子からなる。標的細胞に特異的に固定できる巨大分子で被覆され
てよい好適な粒子には、低密度のポリエチレンまたはポリプロピレンのような物
質からなる、形状および寸法の異なる粒子が含まれると言われている。
る。これは『浮遊性』である粒子、つまり粒子が使用されている媒体より小さい
密度を有する粒子からなる。標的細胞に特異的に固定できる巨大分子で被覆され
てよい好適な粒子には、低密度のポリエチレンまたはポリプロピレンのような物
質からなる、形状および寸法の異なる粒子が含まれると言われている。
【0011】 DE-A-2642944には、電気分解によって発生したガスバブルを使用して浮遊によ
って水性の培養液からバクテリア塊状物を回収することが記載されている。
って水性の培養液からバクテリア塊状物を回収することが記載されている。
【0012】 浮遊性ビーズを使用する技術は、積極的な成分分離が関与するので、磁気粒子
を使用する技術と同じ制約を不可避的にこうむることがわかるであろう。また、
典型的な低密度ポリマー粒子と水性培養基との密度の差異が比較的小さいので、
このような浮遊分離の有効性が限定されるであろう。
を使用する技術と同じ制約を不可避的にこうむることがわかるであろう。また、
典型的な低密度ポリマー粒子と水性培養基との密度の差異が比較的小さいので、
このような浮遊分離の有効性が限定されるであろう。
【0013】 従って、分離手続きに際して標的成分が損傷されないでいることを確実にし、
成分の消極的分離および積極的分離の双方にとって有用であり、また標的成分の
効率的かつ高度に選択的な分離を可能にする分離技術に対する必要が依然として
ある。
成分の消極的分離および積極的分離の双方にとって有用であり、また標的成分の
効率的かつ高度に選択的な分離を可能にする分離技術に対する必要が依然として
ある。
【0014】 本発明は、標的成分がカプセル化されたガスマイクロバブルに結合されるよう
になる浮遊方法によって著しく効率的な成分分離が達せられるという発見に基づ
いている。このような分離の効率はガスマイクロバブルと液体試料媒体との間の
かなりの密度差によって増大され、従ってこの方法は感度が高い。浮遊分離は磁
気分離より本来一層穏和に進行し、またガスマイクロバブルは可撓性のカプセル
化用物質を使用して有利に製造でき、分離中に細胞のような敏感な標的成分を損
傷する可能性はこのようにして最小限に抑えられるであろう。カプセル化された
ガスマイクロバブルを使用すると、マイクロバブルを単に破裂させることにより
、分離後に標的成分からマイクロバブルを容易に除去することも可能である。
になる浮遊方法によって著しく効率的な成分分離が達せられるという発見に基づ
いている。このような分離の効率はガスマイクロバブルと液体試料媒体との間の
かなりの密度差によって増大され、従ってこの方法は感度が高い。浮遊分離は磁
気分離より本来一層穏和に進行し、またガスマイクロバブルは可撓性のカプセル
化用物質を使用して有利に製造でき、分離中に細胞のような敏感な標的成分を損
傷する可能性はこのようにして最小限に抑えられるであろう。カプセル化された
ガスマイクロバブルを使用すると、マイクロバブルを単に破裂させることにより
、分離後に標的成分からマイクロバブルを容易に除去することも可能である。
【0015】 このような分離方法は、現存する浮遊分離技術、例えば、鉱物の分離または油
で汚染された水の浄化に使用される技術とは異なる。現在知られている浮遊分離
では、予め製造されたカプセル化ガスマイクロバブルでなくむしろその場で発生
させた遊離のガスバブルまたはマイクロバブルが使用される。細胞の親和性分離
のような方法を実施するのに、遊離のガスバブル/マイクロバブルを使用するこ
とができないことがわかるであろう。
で汚染された水の浄化に使用される技術とは異なる。現在知られている浮遊分離
では、予め製造されたカプセル化ガスマイクロバブルでなくむしろその場で発生
させた遊離のガスバブルまたはマイクロバブルが使用される。細胞の親和性分離
のような方法を実施するのに、遊離のガスバブル/マイクロバブルを使用するこ
とができないことがわかるであろう。
【0016】 本発明の1局面によれば、標的捕捉性のカプセル化されたガスマイクロバブル
に標的を結合させ、マイクロバブルおよび結合した標的を試料の表面に浮遊させ
てマイクロバブル/標的の浮遊層をつくり、液体試料からこの層を分離し、そし
て標的からマイクロバブルを除去する(積極的選択の場合)か、標的を含まない
試料物質を回収する(消極的選択の場合)ことからなる、液体試料から標的物質
を分離する方法が提供される。
に標的を結合させ、マイクロバブルおよび結合した標的を試料の表面に浮遊させ
てマイクロバブル/標的の浮遊層をつくり、液体試料からこの層を分離し、そし
て標的からマイクロバブルを除去する(積極的選択の場合)か、標的を含まない
試料物質を回収する(消極的選択の場合)ことからなる、液体試料から標的物質
を分離する方法が提供される。
【0017】 本発明で有用なカプセル化されたガスマイクロバブルには、標的捕捉性の形に
つくられる安定化された任意のマイクロバブルが含まれる。マイクロバブルの用
途によって、カプセル化用物質および含まれるガスは生体親和性または非生体親
和性であってよく、前者は細胞、生体分子などの関与する分離において当然好ま
しい。マイクロバブルの代表例には、標的捕捉性の造影剤処方物、特に、標的捕
捉性の超音波造影剤処方物中で使用するのに好適なものがあり、また耐コアレッ
センス性の表面膜(例としては、ゼラチン、例えばW0-A-8002365に記載のような
)、フィルム形成性タンパク質(例としては、ヒトの血清アルブミンのようなア
ルブミン、例えば、US-A-4718433、US-A-4774958、US-A-4844882、EP-A-0359246
、W0-A-9112823、W0-A-9205806、W0-A-9217213、W0-A-9406477、W0-A-9501187ま
たはW0-A-9638180に記載のもの)またはW0-A-9501187もしくはW0-A-9746264に記
載のタンパク質、ポリマー物質(例えば、EP-A-0398935に記載の生分解性の合成
ポリマー、US-A-5611344に記載の合成ポリマー、W0-A-9402106に記載の変性され
たポリマー、EP-A-0458745に記載の、弾力性があり、界面にある合成ポリマー膜
、EP-A-0441468に記載の微細粒状の生分解性ポリアルデヒド、EP-A-0458079に記
載のポリアミノ酸−多環式イミドの、微細粒状のN−ジカルボン酸誘導体、また
はW0-A-9317718もしくはW0-A-9607434に記載の生分解性ポリマー)、W0-A-96402
85もしくはW0-A-9748337に記載の脂質、タンパク質またはポリマー物質、非重合
体でありかつ非重合性の壁形成物質(例えばW0-A-9521631に記載のもの)、界面
活性剤(例えば、Pulonicのようなポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
ブロックコポリマー界面活性剤、W0-A-9506518に記載のポリマー界面活性剤、リ
ン脂質のようなフィルム形成性の界面活性剤、例えば、W0-A-9211873、W0-A-921
7212、W0-A-9222247、W0-A-9409829、W0-A-9428780、W0-A-9503835またはW0-A-9
729783に記載のもの、またはEP-A-0727225に含まれる広範囲のリストに記載の界
面活性剤、あるいはW0-A-9416739に記載の界面活性剤、W0-A-9428874またはW0-A
-9428873に記載の脂質、W0-A-9740858に記載の凍結乾燥脂質、WO-A-9640283に記
載の耐圧性バリアーを形成する物質、W0-A-9604018におけるフッ素を含有する両
親媒性物質あるいは1つまたはそれ以上のリポペプチド)によって安定化された
(例えば、少なくとも部分的にカプセル化された)ガスのマイクロバブルがある
。上記に引用した種々の文献の内容は参照によって本記載に加入されている。中
空の無機の微細粒子例えば、炭酸カルシウム、石英、アルミナ、水酸化ニッケル
または水酸化第2鉄を含むものもまた有用である。
つくられる安定化された任意のマイクロバブルが含まれる。マイクロバブルの用
途によって、カプセル化用物質および含まれるガスは生体親和性または非生体親
和性であってよく、前者は細胞、生体分子などの関与する分離において当然好ま
しい。マイクロバブルの代表例には、標的捕捉性の造影剤処方物、特に、標的捕
捉性の超音波造影剤処方物中で使用するのに好適なものがあり、また耐コアレッ
センス性の表面膜(例としては、ゼラチン、例えばW0-A-8002365に記載のような
)、フィルム形成性タンパク質(例としては、ヒトの血清アルブミンのようなア
ルブミン、例えば、US-A-4718433、US-A-4774958、US-A-4844882、EP-A-0359246
、W0-A-9112823、W0-A-9205806、W0-A-9217213、W0-A-9406477、W0-A-9501187ま
たはW0-A-9638180に記載のもの)またはW0-A-9501187もしくはW0-A-9746264に記
載のタンパク質、ポリマー物質(例えば、EP-A-0398935に記載の生分解性の合成
ポリマー、US-A-5611344に記載の合成ポリマー、W0-A-9402106に記載の変性され
たポリマー、EP-A-0458745に記載の、弾力性があり、界面にある合成ポリマー膜
、EP-A-0441468に記載の微細粒状の生分解性ポリアルデヒド、EP-A-0458079に記
載のポリアミノ酸−多環式イミドの、微細粒状のN−ジカルボン酸誘導体、また
はW0-A-9317718もしくはW0-A-9607434に記載の生分解性ポリマー)、W0-A-96402
85もしくはW0-A-9748337に記載の脂質、タンパク質またはポリマー物質、非重合
体でありかつ非重合性の壁形成物質(例えばW0-A-9521631に記載のもの)、界面
活性剤(例えば、Pulonicのようなポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
ブロックコポリマー界面活性剤、W0-A-9506518に記載のポリマー界面活性剤、リ
ン脂質のようなフィルム形成性の界面活性剤、例えば、W0-A-9211873、W0-A-921
7212、W0-A-9222247、W0-A-9409829、W0-A-9428780、W0-A-9503835またはW0-A-9
729783に記載のもの、またはEP-A-0727225に含まれる広範囲のリストに記載の界
面活性剤、あるいはW0-A-9416739に記載の界面活性剤、W0-A-9428874またはW0-A
-9428873に記載の脂質、W0-A-9740858に記載の凍結乾燥脂質、WO-A-9640283に記
載の耐圧性バリアーを形成する物質、W0-A-9604018におけるフッ素を含有する両
親媒性物質あるいは1つまたはそれ以上のリポペプチド)によって安定化された
(例えば、少なくとも部分的にカプセル化された)ガスのマイクロバブルがある
。上記に引用した種々の文献の内容は参照によって本記載に加入されている。中
空の無機の微細粒子例えば、炭酸カルシウム、石英、アルミナ、水酸化ニッケル
または水酸化第2鉄を含むものもまた有用である。
【0018】 本発明の好ましい一態様においては、カプセル化用物質は1つまたはそれ以上
のリン脂質および/またはリポペプチドからなる。従って、このような物質によ
ってカプセル化されるガスマイクロバブルは特に高い安定性を示す傾向があるの
みならず、その分子は通常、抗体または他の親和性リガンドのような標的化ベク
ターが付着している反応性部分を、例えば適切な結合基を介して含む。
のリン脂質および/またはリポペプチドからなる。従って、このような物質によ
ってカプセル化されるガスマイクロバブルは特に高い安定性を示す傾向があるの
みならず、その分子は通常、抗体または他の親和性リガンドのような標的化ベク
ターが付着している反応性部分を、例えば適切な結合基を介して含む。
【0019】 有用なリン脂質の代表例には、レシチン(つまりホスファチジルコリン)、例
えば、卵黄レシチンまたは大豆レシチンのような天然レシチンおよびジミリスト
イルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジステ
アロイルホスファチジルコリンのような合成または半合成のレシチン;ホスファ
チジル酸;ホスファチジルエタノールアミン;飽和した(例えば、水素化された
または合成の)天然のホスファチジルセリンおよび、ジステアロイルホスファチ
ジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンおよびジアラキドイルホスフ
ァチジルセリンのような合成または半合成のジアルカノイルホスファチジルセリ
ンを含むホスファチジルセリン;ホスファチジルグリセロール;ホスファチジル
イノシトール;カルジオリピン;スフィンゴミエリン;上記のいずれかのフッ素
化類縁体;上記のいずれかの混合物そしてコレストロールのような他の脂質との
混合物がある。
えば、卵黄レシチンまたは大豆レシチンのような天然レシチンおよびジミリスト
イルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジステ
アロイルホスファチジルコリンのような合成または半合成のレシチン;ホスファ
チジル酸;ホスファチジルエタノールアミン;飽和した(例えば、水素化された
または合成の)天然のホスファチジルセリンおよび、ジステアロイルホスファチ
ジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンおよびジアラキドイルホスフ
ァチジルセリンのような合成または半合成のジアルカノイルホスファチジルセリ
ンを含むホスファチジルセリン;ホスファチジルグリセロール;ホスファチジル
イノシトール;カルジオリピン;スフィンゴミエリン;上記のいずれかのフッ素
化類縁体;上記のいずれかの混合物そしてコレストロールのような他の脂質との
混合物がある。
【0020】 ガスマイクロバブルを安定化するために有用なリン脂質に関する一層詳細な論
議はW0-A-9729783中に含まれており、その内容は参照によって本記載に加入され
ている。
議はW0-A-9729783中に含まれており、その内容は参照によって本記載に加入され
ている。
【0021】 使用することができるリポペプチドには、両親媒性であり、かつ膜を形成でき
る、脂質で置換されたペプチドがある。このようなリポペプチドは、2〜50個
のアミノ酸残基からそれぞれなり、また5〜約50個の炭素原子を含む1つまた
はそれ以上の親油性炭化水素鎖をそれぞれ有する個々のペプチド単位からつくら
れる。
る、脂質で置換されたペプチドがある。このようなリポペプチドは、2〜50個
のアミノ酸残基からそれぞれなり、また5〜約50個の炭素原子を含む1つまた
はそれ以上の親油性炭化水素鎖をそれぞれ有する個々のペプチド単位からつくら
れる。
【0022】 個々のペプチド単位中のアミノ酸残基の数は、20より少ないのが好ましく、
10より少ないのが一層好ましくまた2〜8であるのが最も好ましい。アミノ酸
残基の数を最小に保つと、費用を低減するとともにリポペプチドの製造を容易に
するであろうことは明らかである。
10より少ないのが一層好ましくまた2〜8であるのが最も好ましい。アミノ酸
残基の数を最小に保つと、費用を低減するとともにリポペプチドの製造を容易に
するであろうことは明らかである。
【0023】 最終生成物のリポペプチドが両親媒性であるかぎり、原則的には個々のペプチ
ド単位の製造に任意のアミノ酸残基が使用できる。しかしながら、好ましい態様
においてペプチド単位は容易に入手できる天然産の20種の必須アミノ酸の残基
を含む。
ド単位の製造に任意のアミノ酸残基が使用できる。しかしながら、好ましい態様
においてペプチド単位は容易に入手できる天然産の20種の必須アミノ酸の残基
を含む。
【0024】 1つの態様においてペプチド単位はアラニルやジアミノプロピオニルのような
、疎水性および親水性が交互になっているアミノ酸残基を含んでよく、また生物
学的受容体に対する親和性を有する1つまたはそれ以上の相補的な配列および/
または標的配列を含んでよい。好ましい態様において、リジンおよびグルタミン
酸のような荷電したアミノ酸の残基は、中性のpHにおいて正および/または負に
荷電した基を含む側鎖官能基を与えるべく選択される。理論によって束縛される
ことは望まないが、これらの荷電した基は、イオン対または塩橋を形成すること
により膜の外方の部分を安定化する助けになるであろうと考えられる。関与する
ペプチド配列が互いに相補的である場合にかぎって、反対に荷電した基を配置し
て膜の安定性につなげることが可能である。リポペプチドの脂質成分はアルキル
鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖、特にアルキル鎖を含むのが望ましい。こ
のような鎖は5〜25個の炭素原子を含むのが好ましくそして容易に入手できる
脂肪酸誘導体から得ることができるのが最も好ましい。好適な脂肪酸には、オレ
イン酸、ステアリン酸、パルミチン酸などがあり、このような脂肪酸は当業者に
とって周知である。個々のリポペプチド単位あたりの炭化水素鎖の数は存在する
残基の数に依存して変化し、当業者が簡単に測定できる。各々のリポペプチド分
子は典型的に1つまたは2つの炭化水素鎖を含むであろう。
、疎水性および親水性が交互になっているアミノ酸残基を含んでよく、また生物
学的受容体に対する親和性を有する1つまたはそれ以上の相補的な配列および/
または標的配列を含んでよい。好ましい態様において、リジンおよびグルタミン
酸のような荷電したアミノ酸の残基は、中性のpHにおいて正および/または負に
荷電した基を含む側鎖官能基を与えるべく選択される。理論によって束縛される
ことは望まないが、これらの荷電した基は、イオン対または塩橋を形成すること
により膜の外方の部分を安定化する助けになるであろうと考えられる。関与する
ペプチド配列が互いに相補的である場合にかぎって、反対に荷電した基を配置し
て膜の安定性につなげることが可能である。リポペプチドの脂質成分はアルキル
鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖、特にアルキル鎖を含むのが望ましい。こ
のような鎖は5〜25個の炭素原子を含むのが好ましくそして容易に入手できる
脂肪酸誘導体から得ることができるのが最も好ましい。好適な脂肪酸には、オレ
イン酸、ステアリン酸、パルミチン酸などがあり、このような脂肪酸は当業者に
とって周知である。個々のリポペプチド単位あたりの炭化水素鎖の数は存在する
残基の数に依存して変化し、当業者が簡単に測定できる。各々のリポペプチド分
子は典型的に1つまたは2つの炭化水素鎖を含むであろう。
【0025】 例えば、適切なリン脂質またはリポペプチドのように荷電した安定化材料が存
在するために、カプセル化用膜が全体として正味の電荷を有するガスマイクロバ
ブルを使用することは、マイクロバブルの安定性および分散性、ならびに耐コア
レッセンス性を増大し、それによって安定化添加剤を使用する必要を避けるとい
う点で有利であろう。
在するために、カプセル化用膜が全体として正味の電荷を有するガスマイクロバ
ブルを使用することは、マイクロバブルの安定性および分散性、ならびに耐コア
レッセンス性を増大し、それによって安定化添加剤を使用する必要を避けるとい
う点で有利であろう。
【0026】 リン脂質およびリポペプチドのような膜形成性の両親媒性カプセル化用物質は
単層、二層または多層(例えば複数の二層を含む)としてマイクロバブル−試料
液体界面に存在しうる。
単層、二層または多層(例えば複数の二層を含む)としてマイクロバブル−試料
液体界面に存在しうる。
【0027】 典型的な処理温度(例えば約20℃)で少なくとも部分的に、例えばほとんど
または完全に、ガス状または蒸気状である、混合物を含めて任意の物質が原則と
してマイクロバブルガスとして使用できる。代表的なガスには従って、空気;窒
素;酸素;二酸化炭素;水素;ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトン
のような不活性ガス;六弗化硫黄、十弗化二硫黄または五弗化トリフルオロメチ
ル硫黄のような弗化硫黄;六弗化セレニウム;メチルシランまたはジメチルシラ
ンのような場合によってハロゲン化されたシラン;低分子量炭化水素(例えば、
7個までの炭素原子を含むもの)、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタンま
たはペンタンのようなアルカン、シクロプロパン、シクロブタンまたはシクロペ
ンタンのようなシクロアルカン、エチレン、プロペン、プロパジエンまたはブテ
ンのようなアルケン、およびアセチレンまたはプロピンのようなアルキン;ジメ
チルエーテルのようなエーテル;ケトン;エステル;低分子量の(例えば、7個
までの炭素を含む)ハロゲン化炭化水素;および上記の任意のものの混合物があ
る。ハロゲン化ガス中のハロゲン原子の少なくともいくつかはフッ素原子である
のが好ましく、従って、生体親和性のハロゲン化炭化水素ガスは例えば、ブロモ
クロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン
、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオ
ロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロトリフルオロエチレン、フル
オロエチレン、エチルフルオライド、1,1−ジフルオロエタンおよびパーフル
オロカーボンから選択されてよい。代表的なパーフルオロカーボンには、パーフ
ルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタ
ン(例えば、場合によってはパーフルオロ−イソ−ブタンのような別な異性体と
混合したパーフルオロ−n−ブタン)、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘ
キサンまたはパーフルオロヘプタンのようなパーフルオロアルカン;パーフルオ
ロプロペン、パーフルオロブテン(例えばパーフルオロブト−2−エン)、パー
フルオロブタジエン、パーフルオロペンテン(例えばパーフルオロペント−1−
エン)、またはパーフルオロ−4−メチルペント−2−エンのようなパーフルオ
ロアルケン;パーフルオロブト−2−インのようなパーフルオロアルキン;およ
びパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロ
ジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロシ
クロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシク
ロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサン
またはパーフルオロシクロヘプタンのようなパーフルオロシクロアルカンがある
。ハロゲン化された他のガスには、メチルクロライド、パーフルオロアセトンの
ようなフッ素化された(例えば過フッ素化された)ケトンおよびパーフルオロジ
エチルエーテルのようなフッ素化された(例えば過フッ素化された)エーテルが
ある。過フッ素化ガス、例えば六弗化硫黄そしてパーフルオロプロパン、パーフ
ルオロブタン、パーフルオロペンタンおよびパーフルオロヘキサンのようなパー
フルオロカーボンの使用は、このようなガスを含有するマイクロバブルに認めら
れる高い安定性からみて特に有利であろう。著しく安定なマイクロバブルの生成
を惹起する物理化学的特性を有する他のガスもまた同様に有用であろう。上記に
列挙したガスで意図する分離処理温度をより高い沸点を有するガスは、単独で使
用されるよりむしろ、揮発性がより大きい別なガスとの混合物の成分として一般
に使用されることが分かるであろう。
または完全に、ガス状または蒸気状である、混合物を含めて任意の物質が原則と
してマイクロバブルガスとして使用できる。代表的なガスには従って、空気;窒
素;酸素;二酸化炭素;水素;ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトン
のような不活性ガス;六弗化硫黄、十弗化二硫黄または五弗化トリフルオロメチ
ル硫黄のような弗化硫黄;六弗化セレニウム;メチルシランまたはジメチルシラ
ンのような場合によってハロゲン化されたシラン;低分子量炭化水素(例えば、
7個までの炭素原子を含むもの)、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタンま
たはペンタンのようなアルカン、シクロプロパン、シクロブタンまたはシクロペ
ンタンのようなシクロアルカン、エチレン、プロペン、プロパジエンまたはブテ
ンのようなアルケン、およびアセチレンまたはプロピンのようなアルキン;ジメ
チルエーテルのようなエーテル;ケトン;エステル;低分子量の(例えば、7個
までの炭素を含む)ハロゲン化炭化水素;および上記の任意のものの混合物があ
る。ハロゲン化ガス中のハロゲン原子の少なくともいくつかはフッ素原子である
のが好ましく、従って、生体親和性のハロゲン化炭化水素ガスは例えば、ブロモ
クロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン
、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオ
ロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロトリフルオロエチレン、フル
オロエチレン、エチルフルオライド、1,1−ジフルオロエタンおよびパーフル
オロカーボンから選択されてよい。代表的なパーフルオロカーボンには、パーフ
ルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタ
ン(例えば、場合によってはパーフルオロ−イソ−ブタンのような別な異性体と
混合したパーフルオロ−n−ブタン)、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘ
キサンまたはパーフルオロヘプタンのようなパーフルオロアルカン;パーフルオ
ロプロペン、パーフルオロブテン(例えばパーフルオロブト−2−エン)、パー
フルオロブタジエン、パーフルオロペンテン(例えばパーフルオロペント−1−
エン)、またはパーフルオロ−4−メチルペント−2−エンのようなパーフルオ
ロアルケン;パーフルオロブト−2−インのようなパーフルオロアルキン;およ
びパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロ
ジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロシ
クロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシク
ロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサン
またはパーフルオロシクロヘプタンのようなパーフルオロシクロアルカンがある
。ハロゲン化された他のガスには、メチルクロライド、パーフルオロアセトンの
ようなフッ素化された(例えば過フッ素化された)ケトンおよびパーフルオロジ
エチルエーテルのようなフッ素化された(例えば過フッ素化された)エーテルが
ある。過フッ素化ガス、例えば六弗化硫黄そしてパーフルオロプロパン、パーフ
ルオロブタン、パーフルオロペンタンおよびパーフルオロヘキサンのようなパー
フルオロカーボンの使用は、このようなガスを含有するマイクロバブルに認めら
れる高い安定性からみて特に有利であろう。著しく安定なマイクロバブルの生成
を惹起する物理化学的特性を有する他のガスもまた同様に有用であろう。上記に
列挙したガスで意図する分離処理温度をより高い沸点を有するガスは、単独で使
用されるよりむしろ、揮発性がより大きい別なガスとの混合物の成分として一般
に使用されることが分かるであろう。
【0028】 本発明の方法で使用されるマイクロバブルの寸法は、単離されるべき標的の性
質および大きさのようなパラメーターに例えば依存して変化してよい。標的に結
合する時に試料の液体媒体より密度が低いマイクロバブルが好適である。インビ
トロで使用するにはマイクロバブルは例えば50nm〜50μm、望ましくは20
0nm〜25μmの直径を有してよい。マイクロバブルは標的成分に似た寸法であ
るのが便利であろう。従って例えば、標的成分が細胞であるなら、マイクロバブ
ルは1〜10μm、望ましくは3〜5μmの直径を有してよい。
質および大きさのようなパラメーターに例えば依存して変化してよい。標的に結
合する時に試料の液体媒体より密度が低いマイクロバブルが好適である。インビ
トロで使用するにはマイクロバブルは例えば50nm〜50μm、望ましくは20
0nm〜25μmの直径を有してよい。マイクロバブルは標的成分に似た寸法であ
るのが便利であろう。従って例えば、標的成分が細胞であるなら、マイクロバブ
ルは1〜10μm、望ましくは3〜5μmの直径を有してよい。
【0029】 特定の標的成分を試料から単離するために必要なマイクロバブルの数は、マイ
クロバブルおよび標的の性質、そして特に試料中に存在する他の成分の数のよう
な要因に応じて変化する。一般に、マイクロバブル/標的成分の複合体の浮遊を
確実にするための、マイクロバブルの数:標的成分の数の最適比を決定するため
に簡単な実験を行なうことができる。より明確には、必要なマイクロバブルの数
は、試料中の標的でない成分に対する標的成分の含有率にも依存するであろう。
従って例えば、標的成分の含有割合の少ない試料は、十分な分離を確保するため
に相対的に多い数のマイクロバブルによる処理を必要とするであろう。
クロバブルおよび標的の性質、そして特に試料中に存在する他の成分の数のよう
な要因に応じて変化する。一般に、マイクロバブル/標的成分の複合体の浮遊を
確実にするための、マイクロバブルの数:標的成分の数の最適比を決定するため
に簡単な実験を行なうことができる。より明確には、必要なマイクロバブルの数
は、試料中の標的でない成分に対する標的成分の含有率にも依存するであろう。
従って例えば、標的成分の含有割合の少ない試料は、十分な分離を確保するため
に相対的に多い数のマイクロバブルによる処理を必要とするであろう。
【0030】 本発明の方法は、原則として、浮遊性のマイクロバブルを使用することにより
分離に好適な任意の標的成分を液体試料から分離するために用いることができる
。標的成分は本発明のマイクロバブルと大きさが同じようなものでよいか、ある
いはより大きいかまたはより小さくてよいが、標的成分の寸法は直径が50μm
より小さいのが好ましい。好適な標的成分には例えば、金属(金属イオンおよび
重金属)、ポリマー、脂質、炭水化物、血液成分、タンパク質、糖タンパク質、
ペプチド(プリオンを含む)、グリコペプチド、ホルモン、固定されたコンビナ
トリアルライブラリー成分、細胞および変性された(例えば、トランスフェクシ
ョンされたおよび/または感染された)細胞、細胞断片、細胞小器官、DNA、
RNA、ファージ、酵素、リボソーム、トキシン、バクテリアおよびビールス(
変性された、例えばトランスフェクションされた、バクテリアおよびビールスを
含む)のような生体などが含まれてよい。
分離に好適な任意の標的成分を液体試料から分離するために用いることができる
。標的成分は本発明のマイクロバブルと大きさが同じようなものでよいか、ある
いはより大きいかまたはより小さくてよいが、標的成分の寸法は直径が50μm
より小さいのが好ましい。好適な標的成分には例えば、金属(金属イオンおよび
重金属)、ポリマー、脂質、炭水化物、血液成分、タンパク質、糖タンパク質、
ペプチド(プリオンを含む)、グリコペプチド、ホルモン、固定されたコンビナ
トリアルライブラリー成分、細胞および変性された(例えば、トランスフェクシ
ョンされたおよび/または感染された)細胞、細胞断片、細胞小器官、DNA、
RNA、ファージ、酵素、リボソーム、トキシン、バクテリアおよびビールス(
変性された、例えばトランスフェクションされた、バクテリアおよびビールスを
含む)のような生体などが含まれてよい。
【0031】 本発明の方法はヒトの患者またはヒト以外の動物の罹患体から得られる細胞お
よび他の生物学的成分を分離するのに特に好適である。代表的な標的細胞には、
あらゆるCD陽性の細胞、例えば抗原提供細胞(例えば、ランゲルハンス細胞、
内皮細胞、トロホブラスト、神経細胞および、別の方法では血液中に見いだされ
ない癌のマーカーである上皮腫瘍細胞を含む上皮細胞)、造血細胞(例えば、リ
ンパ細胞、顆粒球、単核細胞、マクロファージ、網状赤血球およびトランスフェ
リン受容体を発現する他の細胞、赤血球、巨核球および血小板)、NK細胞、造
血前駆細胞、白血球、骨髄細胞、変性された(トランスフェクションされた)細
胞などがある。特に、本発明の方法は造血前駆細胞および/または幹細胞を骨髄
/血液懸濁液から分離するために用いることができ、このような分離は投薬量の
多い化学療法を受けている患者の治療に重要であり、現在ははるかに複雑で厄介
な技術を用いて行なわれている。本発明による細胞分離技術は、試料から癌細胞
を除去しまたは『追い出し』て、癌性の細胞を含まない試料を得るのに特に有効
でもある。
よび他の生物学的成分を分離するのに特に好適である。代表的な標的細胞には、
あらゆるCD陽性の細胞、例えば抗原提供細胞(例えば、ランゲルハンス細胞、
内皮細胞、トロホブラスト、神経細胞および、別の方法では血液中に見いだされ
ない癌のマーカーである上皮腫瘍細胞を含む上皮細胞)、造血細胞(例えば、リ
ンパ細胞、顆粒球、単核細胞、マクロファージ、網状赤血球およびトランスフェ
リン受容体を発現する他の細胞、赤血球、巨核球および血小板)、NK細胞、造
血前駆細胞、白血球、骨髄細胞、変性された(トランスフェクションされた)細
胞などがある。特に、本発明の方法は造血前駆細胞および/または幹細胞を骨髄
/血液懸濁液から分離するために用いることができ、このような分離は投薬量の
多い化学療法を受けている患者の治療に重要であり、現在ははるかに複雑で厄介
な技術を用いて行なわれている。本発明による細胞分離技術は、試料から癌細胞
を除去しまたは『追い出し』て、癌性の細胞を含まない試料を得るのに特に有効
でもある。
【0032】 細胞(癌細胞、ビールス感染細胞およびマイコプラズマ感染細胞を含む)、細
胞培養物、バクテリアまたはビールスのような生物学的標的成分へのマイクロバ
ブルの結合もまた、試料中にこのような成分が存在することを検出するための手
段として用いられてよく、また診断方法で用いられてよい。従って例えば、特定
の疾病マーカー成分に特異的なベクターに結合したマイクロバブルを用いて、試
料中の該成分を検出することが可能である。細胞、バクテリアまたはビールスの
ようなマイクロバブルと結合した標的成分の存在を検鏡またはフロー・サイトメ
トリのような技術によって知ることができ、これによって医師またはその他熟練
した技能者が標的成分の有無に基づいた情報による診断を行うことができるので
、試料からマイクロバブル/標的の浮遊複合体を分離する必要はなかろう。
胞培養物、バクテリアまたはビールスのような生物学的標的成分へのマイクロバ
ブルの結合もまた、試料中にこのような成分が存在することを検出するための手
段として用いられてよく、また診断方法で用いられてよい。従って例えば、特定
の疾病マーカー成分に特異的なベクターに結合したマイクロバブルを用いて、試
料中の該成分を検出することが可能である。細胞、バクテリアまたはビールスの
ようなマイクロバブルと結合した標的成分の存在を検鏡またはフロー・サイトメ
トリのような技術によって知ることができ、これによって医師またはその他熟練
した技能者が標的成分の有無に基づいた情報による診断を行うことができるので
、試料からマイクロバブル/標的の浮遊複合体を分離する必要はなかろう。
【0033】 従って、本発明のこの態様によると、液体試料、例えば血液または他の体液試
料中で疾病マーカー成分を検出するための診断方法が提供される。この方法は、
疾病マーカー成分を標的とすることができるカプセル化されたガスマイクロバブ
ルと混合し、このマイクロバブルおよび結合した任意の疾病マーカー成分を試料
の表面に浮遊させて浮遊性マイクロバブル層を形成させ、そして例えば、検鏡ま
たはフロー・サイトメトリによってこの層を疾病マーカー成分の存在に関して分
析することからなる。
料中で疾病マーカー成分を検出するための診断方法が提供される。この方法は、
疾病マーカー成分を標的とすることができるカプセル化されたガスマイクロバブ
ルと混合し、このマイクロバブルおよび結合した任意の疾病マーカー成分を試料
の表面に浮遊させて浮遊性マイクロバブル層を形成させ、そして例えば、検鏡ま
たはフロー・サイトメトリによってこの層を疾病マーカー成分の存在に関して分
析することからなる。
【0034】 本発明で用いられるマイクロバブルを標的捕捉性にするために、このマイクロ
バブルは、1つまたはそれ以上の好適な標的部位、例えば親和性のリガンドまた
はベクターに直接にあるいは適切な連結基を介して結合させてよい。しかしなが
ら、場合によって、マイクロバブルの膜はそれ自体標的成分に対して親和性を有
し、従って膜と標的部分との複合型とみなすことができよう。これの1例は、チ
オール化されたリポペプチドによってドープされたホスファチジルセリンでカプ
セル化されたガスマイクロバブルを造血前駆細胞の分離に使用する場合である。
従って、このようなマイクロバブルは、分化した細胞を欠くハツカネズミの骨髄
細胞(いわゆる陰性細胞系)の集団に添加されると、陰性細胞系は5%より少な
く含むが、インビトロでコロニーを形成する細胞をほとんど100%含有し、分
離された集団中の細胞の大半が前駆細胞である下位集団に結合し、そしてこれを
浮遊させることが見いだされている。
バブルは、1つまたはそれ以上の好適な標的部位、例えば親和性のリガンドまた
はベクターに直接にあるいは適切な連結基を介して結合させてよい。しかしなが
ら、場合によって、マイクロバブルの膜はそれ自体標的成分に対して親和性を有
し、従って膜と標的部分との複合型とみなすことができよう。これの1例は、チ
オール化されたリポペプチドによってドープされたホスファチジルセリンでカプ
セル化されたガスマイクロバブルを造血前駆細胞の分離に使用する場合である。
従って、このようなマイクロバブルは、分化した細胞を欠くハツカネズミの骨髄
細胞(いわゆる陰性細胞系)の集団に添加されると、陰性細胞系は5%より少な
く含むが、インビトロでコロニーを形成する細胞をほとんど100%含有し、分
離された集団中の細胞の大半が前駆細胞である下位集団に結合し、そしてこれを
浮遊させることが見いだされている。
【0035】 金属イオンのような非生物学的な標的の場合、特定の金属イオンに結合するキ
レート化剤をマイクロバブルに添加してよい。マイクロバブルはまた、それが、
標的成分中の特定的な相補的官能基と反応するようにされた反応性官能基を含む
ように選択されあるいは変性されてよい。例えば、マイクロバブルは標的成分上
でアミノまたはアルコール官能基と容易に反応する無水物またはアシルクロライ
ドの部分を有することができる。浮遊および分離の後、形成されたアミドまたは
エステル結合が、慣用の技術を用いて壊され標的成分が放出される。
レート化剤をマイクロバブルに添加してよい。マイクロバブルはまた、それが、
標的成分中の特定的な相補的官能基と反応するようにされた反応性官能基を含む
ように選択されあるいは変性されてよい。例えば、マイクロバブルは標的成分上
でアミノまたはアルコール官能基と容易に反応する無水物またはアシルクロライ
ドの部分を有することができる。浮遊および分離の後、形成されたアミドまたは
エステル結合が、慣用の技術を用いて壊され標的成分が放出される。
【0036】 生物学的な成分の分離において、マイクロバブルは、特定の標的成分を認識で
きるモノクローナル抗体のようなベクターに例えば直接結合してよい。あるいは
マイクロバブルは、ペプチドにまたは、標的成分に特異性を有する1次抗体に対
して特異性を有する2次抗体に結合あるいは連結してよい。2次抗体をこのよう
に使用することは、2次抗体の適切な選定によって、広範囲な応用に用いること
ができる『汎用的な』マイクロバブルの製造が可能となる点で有利であるが、こ
れは1次抗体を特定の標的成分に適合させることができるからである。
きるモノクローナル抗体のようなベクターに例えば直接結合してよい。あるいは
マイクロバブルは、ペプチドにまたは、標的成分に特異性を有する1次抗体に対
して特異性を有する2次抗体に結合あるいは連結してよい。2次抗体をこのよう
に使用することは、2次抗体の適切な選定によって、広範囲な応用に用いること
ができる『汎用的な』マイクロバブルの製造が可能となる点で有利であるが、こ
れは1次抗体を特定の標的成分に適合させることができるからである。
【0037】 マイクロバブルは、ビオチニル化されたベクターの結合を可能にするように、
ストレプタビジン/アビジンのような物質に結合または連結されてもよく、ある
いは例えば当該技術上知られているように、タンパク質、レクチン、多糖類、ペ
プチド、ヌクレオチド、炭水化物、低分子量の受容体アゴニストまたはアンタゴ
ニストのようなベクターに結合または連結されてよい。標的成分中に存在する官
能基に対して相補的であるベクターの使用は熟達した技能者によって容易に行わ
れよう。
ストレプタビジン/アビジンのような物質に結合または連結されてもよく、ある
いは例えば当該技術上知られているように、タンパク質、レクチン、多糖類、ペ
プチド、ヌクレオチド、炭水化物、低分子量の受容体アゴニストまたはアンタゴ
ニストのようなベクターに結合または連結されてよい。標的成分中に存在する官
能基に対して相補的であるベクターの使用は熟達した技能者によって容易に行わ
れよう。
【0038】 細胞の表面上にある受容体分子と結合するために本発明の方法では、反応性の
基を1つまたはそれ以上有する官能性化されたマイクロバブルを使用してよい。
例えば、チオール部分を含むマイクロバブルはジサルファイド交換反応によって
細胞表面の受容体に結合する。このような反応の可逆的性質は、結合そして引き
続く離脱が酸化還元環境を変更することにより制御され得ることを意味する。同
様に、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性化されたエステルを
含む膜を有する官能性化されたマイクロバブルを使用していろいろな細胞表面分
子上にあるアミノ基と反応させることができる。
基を1つまたはそれ以上有する官能性化されたマイクロバブルを使用してよい。
例えば、チオール部分を含むマイクロバブルはジサルファイド交換反応によって
細胞表面の受容体に結合する。このような反応の可逆的性質は、結合そして引き
続く離脱が酸化還元環境を変更することにより制御され得ることを意味する。同
様に、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性化されたエステルを
含む膜を有する官能性化されたマイクロバブルを使用していろいろな細胞表面分
子上にあるアミノ基と反応させることができる。
【0039】 所望のベクターとのマイクロバブルの結合は、例えば、マイクロバブルおよび
/またはベクター上にある1つまたはそれ以上の官能基との相互作用が関与する
共有結合的または非共有結合的な手段によって達成できる。この目的に使用でき
る化学反応性のある官能基の例には、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、
カルボキシル、およびカルボニル基、ならびに炭水化物基、隣位ジオール、チオ
エーテル、2−アミノアルコール、2−アミノチオール、グアニジル基、イミダ
ゾリル基およびフェノール基がある。ベクターおよびマイクロバブルは連結基を
介して結合されてよく、多くのこのような基が技術上知られている。従って、場
合によっては連結基を介するベクターとマイクロバブルの結合は、例えばW0-A-9
818501に要約されているような常套的な技術を用いることにより容易に実施しう
る。この特許の内容は参照によって本記載に加入されている。
/またはベクター上にある1つまたはそれ以上の官能基との相互作用が関与する
共有結合的または非共有結合的な手段によって達成できる。この目的に使用でき
る化学反応性のある官能基の例には、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、
カルボキシル、およびカルボニル基、ならびに炭水化物基、隣位ジオール、チオ
エーテル、2−アミノアルコール、2−アミノチオール、グアニジル基、イミダ
ゾリル基およびフェノール基がある。ベクターおよびマイクロバブルは連結基を
介して結合されてよく、多くのこのような基が技術上知られている。従って、場
合によっては連結基を介するベクターとマイクロバブルの結合は、例えばW0-A-9
818501に要約されているような常套的な技術を用いることにより容易に実施しう
る。この特許の内容は参照によって本記載に加入されている。
【0040】 マイクロバブルおよび結合した標的が試料の表面に浮遊する速さは、所望によ
り、適当な任意の、例えば慣用の、遠心分離装置を使用して試料を遠心分離にか
けることにより増大することができる。 マイクロバブル/標的成分の浮遊性の層の試料からの分離は、例えば、デカン
テーション、1つの注射器から他の注射器への移し入れ、あるいは浮遊するマイ
クロバブル層の単なるすくい取りによって達せられる。所望ならば、試料に非混
合性の低密度の流体をオーバーレイし、マイクロバブル/標的成分の複合体をこ
の流体中に浮遊させて、この複合体を試料から全体的に分離することにより分離
を強化することができる。密度が異なる非混合性の水性の層を含む2相系、例え
ば2相のデキストラン−ポリエチレングリコール−水系が、Partition of Cell
Particles and Macromolecules (Wiley-Interscience、第2版、1971年)の例え
ば44〜47ページにAlbertsonによって述べられている。
り、適当な任意の、例えば慣用の、遠心分離装置を使用して試料を遠心分離にか
けることにより増大することができる。 マイクロバブル/標的成分の浮遊性の層の試料からの分離は、例えば、デカン
テーション、1つの注射器から他の注射器への移し入れ、あるいは浮遊するマイ
クロバブル層の単なるすくい取りによって達せられる。所望ならば、試料に非混
合性の低密度の流体をオーバーレイし、マイクロバブル/標的成分の複合体をこ
の流体中に浮遊させて、この複合体を試料から全体的に分離することにより分離
を強化することができる。密度が異なる非混合性の水性の層を含む2相系、例え
ば2相のデキストラン−ポリエチレングリコール−水系が、Partition of Cell
Particles and Macromolecules (Wiley-Interscience、第2版、1971年)の例え
ば44〜47ページにAlbertsonによって述べられている。
【0041】 この成分分離方法では、細胞のような標的成分を単離するために時間のかかる
洗浄技術を反復する必要がないことが本発明の利点である。 分離に続いて、マイクロバブルの除去は例としては、例えば過剰圧または減圧
の一時的な適用、超音波処理またはpHの変化によってマイクロバブルを破裂させ
ることにより実施されうる。マイクロバブルの破裂条件は成分の損傷を避けるの
に十分に穏和であるべきことが了解されるであろう。分離された生成物中の細胞
のような標的成分を損傷することなくマイクロバブルを壊すために、2〜4気圧
までの短時間の過剰圧を使用できることが試験によって示されている。破裂によ
るマイクロバブルの除去に続いて、マイクロバブルをカプセル化する物質の一部
が、分離された標的成分に結合したままのこともあろうが、細胞の分離に関して
いうなら、このことは、一般的には細胞の生存可能性に影響をおよぼすほど十分
ではない。マイクロバブルをカプセル化する物質の残部は、所望ならば例えば簡
単な洗浄処理によって除去できる。
洗浄技術を反復する必要がないことが本発明の利点である。 分離に続いて、マイクロバブルの除去は例としては、例えば過剰圧または減圧
の一時的な適用、超音波処理またはpHの変化によってマイクロバブルを破裂させ
ることにより実施されうる。マイクロバブルの破裂条件は成分の損傷を避けるの
に十分に穏和であるべきことが了解されるであろう。分離された生成物中の細胞
のような標的成分を損傷することなくマイクロバブルを壊すために、2〜4気圧
までの短時間の過剰圧を使用できることが試験によって示されている。破裂によ
るマイクロバブルの除去に続いて、マイクロバブルをカプセル化する物質の一部
が、分離された標的成分に結合したままのこともあろうが、細胞の分離に関して
いうなら、このことは、一般的には細胞の生存可能性に影響をおよぼすほど十分
ではない。マイクロバブルをカプセル化する物質の残部は、所望ならば例えば簡
単な洗浄処理によって除去できる。
【0042】 分離されたマイクロバブル/標的成分の画分にA気圧の特定の過剰圧または減
圧を適用するための有用な1つの方法は、この画分を注射器に入れ、次いで体積
Vの空気または他の(例えば、不活性な)ガスを導入することである。次いで注
射器の先端を例えば適当な栓によって閉じ、その後、ガスの体積をV/Aに変化
させるためにプランジャーを少し動かす。一定の温度が維持される限り、この時
点で注射器内にA気圧の過剰圧または減圧があることになる。
圧を適用するための有用な1つの方法は、この画分を注射器に入れ、次いで体積
Vの空気または他の(例えば、不活性な)ガスを導入することである。次いで注
射器の先端を例えば適当な栓によって閉じ、その後、ガスの体積をV/Aに変化
させるためにプランジャーを少し動かす。一定の温度が維持される限り、この時
点で注射器内にA気圧の過剰圧または減圧があることになる。
【0043】 例えば破裂に比較的耐えるガスマイクロバブルを使用する場合に用いられてよ
いマイクロバブル除去法には、例えば加水分解、pHの変化、塩の添加、酸化還元
環境の変更、酵素分解などによりマイクロバブルを結合解除/離脱することが含
まれる。
いマイクロバブル除去法には、例えば加水分解、pHの変化、塩の添加、酸化還元
環境の変更、酵素分解などによりマイクロバブルを結合解除/離脱することが含
まれる。
【0044】 本発明によって得られるある種の標的成分例えば細胞の生存可能性は、結合し
た生体親和性のマイクロバブルの存在によって影響されることは少なく、従って
このような成分はさらに操作を受けてよく、例えば、マイクロバブルの除去工程
に先立って培養されてよいことがわかっている。
た生体親和性のマイクロバブルの存在によって影響されることは少なく、従って
このような成分はさらに操作を受けてよく、例えば、マイクロバブルの除去工程
に先立って培養されてよいことがわかっている。
【0045】 マイクロバブルの除去が容易に達成でき、また生体親和性のガスマイクロバブ
ルが使用できるため、本方法は生物学的分野および生物工学的分野における積極
的な成分選別に特に好適である。 従って例えば、膜にアソシエートされたタンパク質によってトランスフェクシ
ョンあるいはコトランスフェクションされた細胞とは、膜に結び付いたタンパク
質に対する親和性を有するベクターに結合したマイクロバブルを使用して、トラ
ンスフェクションされていない細胞から分離することができる。これを細胞の一
時的なトランスフェクション時に有利に用いてトランスフェクションされた細胞
を高密度で含む細胞培養物とすることができ、これはトランスフェクションされ
た遺伝子の作用を決定するのにしばしば必須である。
ルが使用できるため、本方法は生物学的分野および生物工学的分野における積極
的な成分選別に特に好適である。 従って例えば、膜にアソシエートされたタンパク質によってトランスフェクシ
ョンあるいはコトランスフェクションされた細胞とは、膜に結び付いたタンパク
質に対する親和性を有するベクターに結合したマイクロバブルを使用して、トラ
ンスフェクションされていない細胞から分離することができる。これを細胞の一
時的なトランスフェクション時に有利に用いてトランスフェクションされた細胞
を高密度で含む細胞培養物とすることができ、これはトランスフェクションされ
た遺伝子の作用を決定するのにしばしば必須である。
【0046】 タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、鉄交換物質、金属と
結合する部分または低分子量の受容体アゴニストまたはアンタゴニストのような
親和性リガンドに結合したマイクロバブルを用いて発酵された肉汁のような生物
学的な粗試料から関心のある分子を濃縮しそして精製することができる。これに
より、遠心分離器、フィルターおよび大規模なクロマトグラフィーカラムのよう
な高価で扱いにくい装置を使用せずに単一な工程でこういった濃縮および精製が
達せられるであろう。関心のある分子を、マイクロバブル/親和性リガンドを除
去した後に、残留するマイクロバブルをすべて別な浮遊分離において除去するこ
とにより、抽出により(マイクロバブル成分は関心のある分子より実質的にみて
一層疎水性である)、または適当な慣用の精製方法により残留するマイクロバブ
ルから分離してよい。
結合する部分または低分子量の受容体アゴニストまたはアンタゴニストのような
親和性リガンドに結合したマイクロバブルを用いて発酵された肉汁のような生物
学的な粗試料から関心のある分子を濃縮しそして精製することができる。これに
より、遠心分離器、フィルターおよび大規模なクロマトグラフィーカラムのよう
な高価で扱いにくい装置を使用せずに単一な工程でこういった濃縮および精製が
達せられるであろう。関心のある分子を、マイクロバブル/親和性リガンドを除
去した後に、残留するマイクロバブルをすべて別な浮遊分離において除去するこ
とにより、抽出により(マイクロバブル成分は関心のある分子より実質的にみて
一層疎水性である)、または適当な慣用の精製方法により残留するマイクロバブ
ルから分離してよい。
【0047】 タンパク質に結合したマイクロバブルはファージディスプレイライブラリーの
スクリーニング(「バイオパンニング」)に使用してよい。タンパク質は例えば
、特定タンパク質をコード化するcDNAでトランスフェクトされた細胞を培養
することにより得ることができる。関心のあるタンパク質をコード化するcDN
Aはフレーム中のプラスミドにおいて分泌信号およびタグ(例えば、6つのヒス
チジンまたは、抗体に結合するペプチド、マルトースに結合するもしくはカルモ
デュリンに結合するペプチド)および好適な細胞系をトランスフェクトするため
に使用されるプラスミドによってライゲートされてよい。適切なベクター(例え
ば、Ni2+、抗体、マルトースまたはカルモデュリン)に結合したマイクロバブ
ルは分泌された組み換えタンパク質に結合し、次いでタンパク質との親和性を有
するペプチドを単離するためにバイオパンニング過程に直接に使用されてよい。
同様な方法を用いてコンビナトリアルライブラリーまたは別な任意のペプチドデ
ィスプレイライブラリーのような他のライブラリーに属するリガンドを同定する
ことができる。この方法は、自己免疫障害のような好ましくない免疫学的反応を
低減するために例えば有用な抗体アンタゴニストを見いだすための手立てとして
特に有用であろう。
スクリーニング(「バイオパンニング」)に使用してよい。タンパク質は例えば
、特定タンパク質をコード化するcDNAでトランスフェクトされた細胞を培養
することにより得ることができる。関心のあるタンパク質をコード化するcDN
Aはフレーム中のプラスミドにおいて分泌信号およびタグ(例えば、6つのヒス
チジンまたは、抗体に結合するペプチド、マルトースに結合するもしくはカルモ
デュリンに結合するペプチド)および好適な細胞系をトランスフェクトするため
に使用されるプラスミドによってライゲートされてよい。適切なベクター(例え
ば、Ni2+、抗体、マルトースまたはカルモデュリン)に結合したマイクロバブ
ルは分泌された組み換えタンパク質に結合し、次いでタンパク質との親和性を有
するペプチドを単離するためにバイオパンニング過程に直接に使用されてよい。
同様な方法を用いてコンビナトリアルライブラリーまたは別な任意のペプチドデ
ィスプレイライブラリーのような他のライブラリーに属するリガンドを同定する
ことができる。この方法は、自己免疫障害のような好ましくない免疫学的反応を
低減するために例えば有用な抗体アンタゴニストを見いだすための手立てとして
特に有用であろう。
【0048】 ポリマービーズのような固相の支持体に結合した固定されたコンビナトリアル
ペプチドライブラリーもまた研究されてよい。このような固相ポリマービーズで
支持されたライブラリーは、本発明により使用されるガスマイクロバブルの寸法
とおなじような数百万の多孔性球状ビーズから典型的になる。標的化されたマイ
クロバブルをこのような固定されたコンビナトリアルライブラリーとともに培養
した後、結合用ペプチドを担持する支持ビーズはマイクロバブルとともに表面ま
で浮遊するが、非結合配列を有するビーズは重力の作用下で培養槽の底に沈むで
あろう。マイクロバブルと結合したポリマービーズはデカンテーションによって
分離されてよく、その後マイクロバブルが除去されまた残留するマイクロバブル
物質は洗浄除去されてよい。このようにして得たペプチドを次いで、結合配列を
同定するために、例えばマイクロシークエンシングまたはタンデム質量分析法に
よる分析に付すことができる。
ペプチドライブラリーもまた研究されてよい。このような固相ポリマービーズで
支持されたライブラリーは、本発明により使用されるガスマイクロバブルの寸法
とおなじような数百万の多孔性球状ビーズから典型的になる。標的化されたマイ
クロバブルをこのような固定されたコンビナトリアルライブラリーとともに培養
した後、結合用ペプチドを担持する支持ビーズはマイクロバブルとともに表面ま
で浮遊するが、非結合配列を有するビーズは重力の作用下で培養槽の底に沈むで
あろう。マイクロバブルと結合したポリマービーズはデカンテーションによって
分離されてよく、その後マイクロバブルが除去されまた残留するマイクロバブル
物質は洗浄除去されてよい。このようにして得たペプチドを次いで、結合配列を
同定するために、例えばマイクロシークエンシングまたはタンデム質量分析法に
よる分析に付すことができる。
【0049】 本発明の別な態様によると、マイクロバブルを含む試料が1つのチャンバーに
導入されそしてマイクロバブル/標的成分の複合体が浮遊させられ、次いで別な
チャンバー内に移されるように相互に連結された2つのチャンバーを包含する、
液体試料の成分を浮遊によって分離するのに使用するための装置が提供される。
導入されそしてマイクロバブル/標的成分の複合体が浮遊させられ、次いで別な
チャンバー内に移されるように相互に連結された2つのチャンバーを包含する、
液体試料の成分を浮遊によって分離するのに使用するための装置が提供される。
【0050】 このような装置は、互いに連結可能であり、そして三方弁を通じてマイクロバ
ブル源と試料源とに連結可能である注射器のような容積を変化できる対向する2
つのチャンバーからなるのが好ましい。マイクロバブルおよび試料は最初第1の
注射器に導入され、そこでマイクロバブルがその標的に結合する。マイクロバブ
ル/標的の複合体が針側の末端に浮遊し、一方、結合していない成分は注射器の
底に残留するように、注射器はそのプランジャーを下方に向けて垂直に置かれる
。浮遊が進行する速さは、所望ならば、遠心力を加えるために適当な遠心分離器
の使用によって増大することができる。浮遊するマイクロバブル/標的の複合体
は第2の注射器のプランジャーを引き出すことによりこの注射器に移され、それ
により、結合された成分と結合されていない成分との分離が容易になる。消極的
選別では1つまたはそれ以上の所望の成分は第1の注射器内ありまたさらに操作
することなく単離され得る。積極的選別では、マイクロバブルにつなげられた第
2の注射器内に1つまたはそれ以上の所望の成分があることになる。マイクロバ
ブルを破裂させるために第2の注射器のプランジャーにゆるい圧力を短時間かけ
ることができ、その後所望の成分が第2の注射器から取り出される。
ブル源と試料源とに連結可能である注射器のような容積を変化できる対向する2
つのチャンバーからなるのが好ましい。マイクロバブルおよび試料は最初第1の
注射器に導入され、そこでマイクロバブルがその標的に結合する。マイクロバブ
ル/標的の複合体が針側の末端に浮遊し、一方、結合していない成分は注射器の
底に残留するように、注射器はそのプランジャーを下方に向けて垂直に置かれる
。浮遊が進行する速さは、所望ならば、遠心力を加えるために適当な遠心分離器
の使用によって増大することができる。浮遊するマイクロバブル/標的の複合体
は第2の注射器のプランジャーを引き出すことによりこの注射器に移され、それ
により、結合された成分と結合されていない成分との分離が容易になる。消極的
選別では1つまたはそれ以上の所望の成分は第1の注射器内ありまたさらに操作
することなく単離され得る。積極的選別では、マイクロバブルにつなげられた第
2の注射器内に1つまたはそれ以上の所望の成分があることになる。マイクロバ
ブルを破裂させるために第2の注射器のプランジャーにゆるい圧力を短時間かけ
ることができ、その後所望の成分が第2の注射器から取り出される。
【0051】 本発明のさらに別な態様では、本発明の方法による浮遊によって試料の成分を
連続流で分離するのに使用する装置が提供され、この装置は、下方に向かって狭
小化する側面を1つまたはそれ以上有する(倒立円錐またはピラミッドにおける
ように)分離槽に、標的捕捉された、カプセル化ガスマイクロバブルを含む試料
の連続流を供給するのに適した供給手段を含み、この槽の底部に試料液体および
結合していない試料成分を抜き出す手段が設けられ、そしてこの槽の頂部に試料
液体およびマイクロバブル/標的成分の複合体の溢流を可能にする手段が設けら
れている。さらに処理するために、分離された画分の一方または両方をしかるべ
く収集することができる。
連続流で分離するのに使用する装置が提供され、この装置は、下方に向かって狭
小化する側面を1つまたはそれ以上有する(倒立円錐またはピラミッドにおける
ように)分離槽に、標的捕捉された、カプセル化ガスマイクロバブルを含む試料
の連続流を供給するのに適した供給手段を含み、この槽の底部に試料液体および
結合していない試料成分を抜き出す手段が設けられ、そしてこの槽の頂部に試料
液体およびマイクロバブル/標的成分の複合体の溢流を可能にする手段が設けら
れている。さらに処理するために、分離された画分の一方または両方をしかるべ
く収集することができる。
【0052】 本発明をなんら制約することなく例示するための添付の図面において、 図1は、相互に連絡された2つの注射器を浮遊分離に使用する場合のその概略
図であり、 図2は、本発明の連続流分離方法で有用な装置の側面図である。
図であり、 図2は、本発明の連続流分離方法で有用な装置の側面図である。
【0053】 図1を一層詳細に参照すると、本装置は、相互に連結され、そして三方弁3を
通じてマイクロバブル源および試料源に連結可能な、直径の方向に向かい合う注
射器1および2を包含する。(a)においてマイクロバブルが注射器に導入され
そして(b)において試料が導入される。次いで(c)に示されるように、マイ
クロバブルと試料とを混合するために装置を180°回転させ、そしてマイクロ
バブル/標的の複合体を注射器1の頂部へと浮遊させ、次いで注射器2に移し入
れる。次いで(d)に示されるように、弁を閉じた後にマイクロバブルを破裂さ
せるために注射器2のプランジャーに圧力を加えてよく、その後、分離した試料
成分を(e)で示されるように注射器2から放出する。あるいは、消極的選別手
順においては(f)に示されるように注射器1から所望の試料成分を放出する。
通じてマイクロバブル源および試料源に連結可能な、直径の方向に向かい合う注
射器1および2を包含する。(a)においてマイクロバブルが注射器に導入され
そして(b)において試料が導入される。次いで(c)に示されるように、マイ
クロバブルと試料とを混合するために装置を180°回転させ、そしてマイクロ
バブル/標的の複合体を注射器1の頂部へと浮遊させ、次いで注射器2に移し入
れる。次いで(d)に示されるように、弁を閉じた後にマイクロバブルを破裂さ
せるために注射器2のプランジャーに圧力を加えてよく、その後、分離した試料
成分を(e)で示されるように注射器2から放出する。あるいは、消極的選別手
順においては(f)に示されるように注射器1から所望の試料成分を放出する。
【0054】 図2を参照すると、撹拌機5を備えた供給槽4中でマイクロバブルと試料を混
合し、そして弁6を経てチャンネル7に供給し、次いで円錐状の分離槽8に供給
する。槽8はその底部に残留物を除去する弁9を具備しており、また試料液体お
よび浮遊するマイクロバブル/標的複合体の溢流を可能にする舌状部10を有す
る。 以下の実施例は非限定的であるが本発明を例示するためのものである。
合し、そして弁6を経てチャンネル7に供給し、次いで円錐状の分離槽8に供給
する。槽8はその底部に残留物を除去する弁9を具備しており、また試料液体お
よび浮遊するマイクロバブル/標的複合体の溢流を可能にする舌状部10を有す
る。 以下の実施例は非限定的であるが本発明を例示するためのものである。
【0055】 実施例1 DSPSおよびチオール化した抗−CD34−Mal−PEG2000−DSPEで
カプセル化した、造血幹細胞の分離に有用なガスマイクロバブルの調製 a) Boc−NH−PEG2000−DSPE[t−ブチルカルバメートポリ(エチ
レングリコール)ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン]の合成 ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE−31mg)をクロ
ロフォルム(2ml)中のBoc−NH−PEG2000−SC(150mg)の溶液に
添加し、続いてトリエチルアミン(33μl)を添加した。出発物質が溶解する
まで混合物を41℃で10分間撹拌した。溶媒を回転蒸発しそして残留物をアセ
トニトリル(5ml)中に取り込んだ。得られる分散体を4℃に冷却しそして遠心
分離した後、溶液を濾過しそして蒸発乾固した。得られる生成物の構造はNMR
によって確認した。
カプセル化した、造血幹細胞の分離に有用なガスマイクロバブルの調製 a) Boc−NH−PEG2000−DSPE[t−ブチルカルバメートポリ(エチ
レングリコール)ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン]の合成 ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE−31mg)をクロ
ロフォルム(2ml)中のBoc−NH−PEG2000−SC(150mg)の溶液に
添加し、続いてトリエチルアミン(33μl)を添加した。出発物質が溶解する
まで混合物を41℃で10分間撹拌した。溶媒を回転蒸発しそして残留物をアセ
トニトリル(5ml)中に取り込んだ。得られる分散体を4℃に冷却しそして遠心
分離した後、溶液を濾過しそして蒸発乾固した。得られる生成物の構造はNMR
によって確認した。
【0056】 b) H2N−PEG2000−DSPE[アミノ−ポリ(エチレングリコール)ジス
テアロイルホスファチジルエタノールアミン]の合成 Boc−NH−PEG2000−DSPE(167mg)をジオキサン(5ml)中の
4Mの塩酸中で周囲温度で2.5時間撹拌した。回転蒸発によって溶媒を除去し
そして残留物をクロロホルム(1.5ml)中に取り込みそして水で(1.5mlで2
回)洗浄した。有機相を真空蒸発した。TLC分析(クロロホルム/メタノール
/水が13:5:0.8)によってRf=0.6である単一のニンヒドリンの陽性
のスポットが得られた。構造の確認はNMRによって行った。
テアロイルホスファチジルエタノールアミン]の合成 Boc−NH−PEG2000−DSPE(167mg)をジオキサン(5ml)中の
4Mの塩酸中で周囲温度で2.5時間撹拌した。回転蒸発によって溶媒を除去し
そして残留物をクロロホルム(1.5ml)中に取り込みそして水で(1.5mlで2
回)洗浄した。有機相を真空蒸発した。TLC分析(クロロホルム/メタノール
/水が13:5:0.8)によってRf=0.6である単一のニンヒドリンの陽性
のスポットが得られた。構造の確認はNMRによって行った。
【0057】 c) Mal−PEG2000−DSPE[3−マレイミドプロピオネートポリ(エチ
レングリコール)ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン]の合成 テトラヒドロフラン(0.2ml)中のNースクシンイミジル−3−マレイミド
プロピオネート(5.6mg、0.018ミリモル)の溶液をテトラヒドロフラン(
1ml)およびpHが7.5の0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(2ml)中に溶解し
たH2N−PEG2000−DSPE(65mg、0.012ミリモル)に添加した。混
合物を30℃に温めそして反応を続け、TLC分析によって完結させ、その後溶
媒を真空下で除去した。クロロホルム:メタノールが80:20のものを溶離剤
として使用することによりフラッシュシリカカラム上で標題物質を精製した。N
MRおよび質量分析によって純粋な生成物の構造を確認した。
レングリコール)ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン]の合成 テトラヒドロフラン(0.2ml)中のNースクシンイミジル−3−マレイミド
プロピオネート(5.6mg、0.018ミリモル)の溶液をテトラヒドロフラン(
1ml)およびpHが7.5の0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(2ml)中に溶解し
たH2N−PEG2000−DSPE(65mg、0.012ミリモル)に添加した。混
合物を30℃に温めそして反応を続け、TLC分析によって完結させ、その後溶
媒を真空下で除去した。クロロホルム:メタノールが80:20のものを溶離剤
として使用することによりフラッシュシリカカラム上で標題物質を精製した。N
MRおよび質量分析によって純粋な生成物の構造を確認した。
【0058】 d) Mal−PEG2000−DSPEで『ドープされた』DSPSでカプセル化し
たマイクロバブルの調製 ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS−4.5mg)および上記(c
)からのMal−PEG2000−DSPE(0.5mg)を清浄なバイアル内に秤量
して入れそして1.4%のプロピレングリコール/2.4%のグリセロールの溶液
1mlを添加した。混合物を80℃に5分間温め、次いで4.5μmのフィルターを
通じて濾過した。試料を室温に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタンガスでフ
ラッシュした。バイアルをキャップミキサー内で45秒震盪しそして得られるマ
イクロバブルを蒸留水で3回洗浄した。
たマイクロバブルの調製 ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS−4.5mg)および上記(c
)からのMal−PEG2000−DSPE(0.5mg)を清浄なバイアル内に秤量
して入れそして1.4%のプロピレングリコール/2.4%のグリセロールの溶液
1mlを添加した。混合物を80℃に5分間温め、次いで4.5μmのフィルターを
通じて濾過した。試料を室温に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタンガスでフ
ラッシュした。バイアルをキャップミキサー内で45秒震盪しそして得られるマ
イクロバブルを蒸留水で3回洗浄した。
【0059】 e) 抗−CD34抗体のチオール化 燐酸塩で緩衝された塩水(PBS)(pH7)0.5ml中に溶解した抗−CD34
抗体0.3mgに、Traut試薬を0.3mg添加しそして溶液を室温で1時間撹拌した
。NAP−5カラム上の変性されたタンパク質から過剰の試薬を分離した。
抗体0.3mgに、Traut試薬を0.3mg添加しそして溶液を室温で1時間撹拌した
。NAP−5カラム上の変性されたタンパク質から過剰の試薬を分離した。
【0060】 f) DSPSおよびMal−PEG2000−DSPEでカプセル化したガスマイク
ロバブルへのチオール化した抗−CD34抗体のコンジュゲーション (e)からのチオール化した抗体調製物0.5mlを、(d)からのマイクロバ
ブルのアリコートに添加しそしてローラーテーブル上で30分間コンジュゲーシ
ョン反応を進行させた。2000rpmで5分間遠心分離した後、下層の液体を取
り出した。さらに、マイクロバブルを水で3回洗浄した。
ロバブルへのチオール化した抗−CD34抗体のコンジュゲーション (e)からのチオール化した抗体調製物0.5mlを、(d)からのマイクロバ
ブルのアリコートに添加しそしてローラーテーブル上で30分間コンジュゲーシ
ョン反応を進行させた。2000rpmで5分間遠心分離した後、下層の液体を取
り出した。さらに、マイクロバブルを水で3回洗浄した。
【0061】 g) FITCにコンジュゲートした2次抗体を使用することによるマイクロバブ
ルとコンジュゲートした抗体の検出 FITCにコンジュゲートしたヤギの抗−マウス抗体を0.025ml、(f)
からのマイクロバブル懸濁液に添加した。混合物をローラーテーブル上の暗所内
で30分間室温でインキュベートし、次いで2000rpmで5分間遠心分離した
。次に下層の液体を除去し、さらにマイクロバブルを水で3回洗浄した。マイク
ロバブルの懸濁液をフロー・サイトメトリによって分析すると、個体群の98%
が蛍光性であることが示された。
ルとコンジュゲートした抗体の検出 FITCにコンジュゲートしたヤギの抗−マウス抗体を0.025ml、(f)
からのマイクロバブル懸濁液に添加した。混合物をローラーテーブル上の暗所内
で30分間室温でインキュベートし、次いで2000rpmで5分間遠心分離した
。次に下層の液体を除去し、さらにマイクロバブルを水で3回洗浄した。マイク
ロバブルの懸濁液をフロー・サイトメトリによって分析すると、個体群の98%
が蛍光性であることが示された。
【0062】 h) CD34陽性の細胞の分離 4日間にわたってG−CSFを注射された(10μg/日)患者から、遠心エ
ルトリションによって白血球細胞を収集した。次いで、CD34抗体を伴うマイ
クロバブルを遠心分離管内でこの細胞と10:1の比率で混合しそしてローラー
ミキサー内に30分間入れた。次いでこの管を400×gで30分間遠心分離し
そして頂部に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。収集した懸濁
液に、細胞を損傷することなくバブルを破壊するのに十分な圧力をかけ、次いで
このような細胞を必要とする患者にこの細胞を移植した。
ルトリションによって白血球細胞を収集した。次いで、CD34抗体を伴うマイ
クロバブルを遠心分離管内でこの細胞と10:1の比率で混合しそしてローラー
ミキサー内に30分間入れた。次いでこの管を400×gで30分間遠心分離し
そして頂部に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。収集した懸濁
液に、細胞を損傷することなくバブルを破壊するのに十分な圧力をかけ、次いで
このような細胞を必要とする患者にこの細胞を移植した。
【0063】 実施例2 DSPSおよびチオール化した抗−CD62−Mal−PEG2000−DSPEで
カプセル化したガスマイクロバブルの調製 実施例1と同じ手順を用いて抗−CD62抗体を含むマイクロバブルを調製し
た。 このマイクロバブルを使用してCD62陽性の細胞を、CD62陰性の細胞か
らまたは抗原の発現が少ない細胞から分離した。
カプセル化したガスマイクロバブルの調製 実施例1と同じ手順を用いて抗−CD62抗体を含むマイクロバブルを調製し
た。 このマイクロバブルを使用してCD62陽性の細胞を、CD62陰性の細胞か
らまたは抗原の発現が少ない細胞から分離した。
【0064】 実施例3 DSPSおよびチオール化した抗−ICAM−1−Mal−PEG2000−DSP
Eでカプセル化したガスマイクロバブルの調製 実施例1と同じ手順を用いて抗−ICAM−1抗体を含むマイクロバブルを調
製した。 このマイクロバブルを使用してICAM−1陽性の細胞を、ICAM−1陰性
の細胞からまたは抗原の発現が少ない細胞から分離した。
Eでカプセル化したガスマイクロバブルの調製 実施例1と同じ手順を用いて抗−ICAM−1抗体を含むマイクロバブルを調
製した。 このマイクロバブルを使用してICAM−1陽性の細胞を、ICAM−1陰性
の細胞からまたは抗原の発現が少ない細胞から分離した。
【0065】 実施例4 DSPS、チオール化した抗−CD62−Mal−PEG2000−DSPEおよび
チオール化した抗−ICAM−1−Mal−PEG2000−DSPEでカプセル化
したガスマイクロバブルの調製 本例には、両方の抗原を発現する細胞を、陰性の細胞からまたは抗原をただ1
つしか発現しない細胞から分離するために、複数の抗体ベクターを含むマイクロ
バブルの調製を記載する。
チオール化した抗−ICAM−1−Mal−PEG2000−DSPEでカプセル化
したガスマイクロバブルの調製 本例には、両方の抗原を発現する細胞を、陰性の細胞からまたは抗原をただ1
つしか発現しない細胞から分離するために、複数の抗体ベクターを含むマイクロ
バブルの調製を記載する。
【0066】 a) DSPSおよびMal−PEG2000−DSPEでカプセル化したガスマイク
ロバブルの調製 DSPS(4.5mg)および実施例1からのMal−PEG2000−DSPE(
0.5mg)を清浄なバイアル内に秤量して入れそして1.4%のプロピレングリコ
ール/2.4%のグリセロールの溶液1mlを添加した。混合物を80℃に5分間
温め、次いで4.5μmのフィルターを通じて濾過した。試料を室温に冷却しそし
て頭隙をパーフルオロブタンガスでフラッシュした。バイアルをキャップミキサ
ー内で45秒震盪しそして得られるマイクロバブルを蒸留水で3回洗浄した。
ロバブルの調製 DSPS(4.5mg)および実施例1からのMal−PEG2000−DSPE(
0.5mg)を清浄なバイアル内に秤量して入れそして1.4%のプロピレングリコ
ール/2.4%のグリセロールの溶液1mlを添加した。混合物を80℃に5分間
温め、次いで4.5μmのフィルターを通じて濾過した。試料を室温に冷却しそし
て頭隙をパーフルオロブタンガスでフラッシュした。バイアルをキャップミキサ
ー内で45秒震盪しそして得られるマイクロバブルを蒸留水で3回洗浄した。
【0067】 b) 抗−CD62抗体および抗−ICAM−1抗体のチオール化 PBS緩衝液(pH7、0.5ml)中に溶解した抗−CD62抗体および抗−I
CAM−1抗体のそれぞれ0.3mgに、Traut試薬を添加しそして溶液を室温で1
時間撹拌した。NAP−5カラム上の変性されたタンパク質から過剰の試薬を分
離した。
CAM−1抗体のそれぞれ0.3mgに、Traut試薬を添加しそして溶液を室温で1
時間撹拌した。NAP−5カラム上の変性されたタンパク質から過剰の試薬を分
離した。
【0068】 c) DSPSおよびMal−PEG2000−DSPEでカプセル化したガスマイク
ロバブルへのチオール化した抗−CD62抗体および抗−ICAM−1抗体のコ
ンジュゲーション (b)からのチオール化した抗体調製物の混合物0.5mlを、(a)からのマ
イクロバブルのアリコートに添加しそしてローラーテーブル上で30分間コンジ
ュゲーション反応を進行させた。2000rpmで5分間遠心分離した後、下層の
液体を取り出した。さらに、マイクロバブルを水で3回洗浄した。 PEGスペーサーの長さは、より長い鎖(例えば、PEG3400およびPEG50 00 )またはより短い鎖(例えば、PEG600およびPEG800)を含むように変え
てよい。チオール化した抗−CD34のような第3の抗体を加えることもできる
。
ロバブルへのチオール化した抗−CD62抗体および抗−ICAM−1抗体のコ
ンジュゲーション (b)からのチオール化した抗体調製物の混合物0.5mlを、(a)からのマ
イクロバブルのアリコートに添加しそしてローラーテーブル上で30分間コンジ
ュゲーション反応を進行させた。2000rpmで5分間遠心分離した後、下層の
液体を取り出した。さらに、マイクロバブルを水で3回洗浄した。 PEGスペーサーの長さは、より長い鎖(例えば、PEG3400およびPEG50 00 )またはより短い鎖(例えば、PEG600およびPEG800)を含むように変え
てよい。チオール化した抗−CD34のような第3の抗体を加えることもできる
。
【0069】 実施例5 トランスフェリン受容体を高度に発現する細胞を分離するためのトランスフェリ
ンでコートされたガスマイクロバブルの調製 a) チオール官能性化された脂質分子の合成
ンでコートされたガスマイクロバブルの調製 a) チオール官能性化された脂質分子の合成
【化1】
【0070】 1ミリモルのアミノ酸カートリッジを使用することにより、0.25ミリモル
基準のFmoc−Cys(Trt)−Wang樹脂から出発して上記に示す構造の脂質を
ABI 433A自動ペプチド合成機で合成した。O−ベンゾトリアゾール−1
−イル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェー
ト(HBTU)を使用して、すべてのアミノ酸およびパルミチン酸を結合の前に
予め活性化した。樹脂からのペプチドの除去および側鎖保護基の保護解除とを同
時に、5%の1,2−エタンジチオール(EDT)と5%の水とを含有するトリ
フルオロ酢酸(TFA)中で2時間にわたって実施して、粗生成物の収量250
mgを得た。9ml/分の流速において、50分にわたってのBが90〜100%で
ある勾配(A=0.1%TFA/水またB=メタノール)を用いて、粗製物質の
40mgのアリコートの分取HPLCによる精製を実施した。凍結乾燥の後、純粋
な物質を24mg得た(分析HPLC:B=0.1%TFA/アセトニトリル、A
=0.01%TFA/水であるとして、Bが70〜100%である勾配;検出−
214nmのUV;生成物の保持時間=23分)。MALDI質量分析:M+Hの
予測値は1096、実験値は1099。
基準のFmoc−Cys(Trt)−Wang樹脂から出発して上記に示す構造の脂質を
ABI 433A自動ペプチド合成機で合成した。O−ベンゾトリアゾール−1
−イル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェー
ト(HBTU)を使用して、すべてのアミノ酸およびパルミチン酸を結合の前に
予め活性化した。樹脂からのペプチドの除去および側鎖保護基の保護解除とを同
時に、5%の1,2−エタンジチオール(EDT)と5%の水とを含有するトリ
フルオロ酢酸(TFA)中で2時間にわたって実施して、粗生成物の収量250
mgを得た。9ml/分の流速において、50分にわたってのBが90〜100%で
ある勾配(A=0.1%TFA/水またB=メタノール)を用いて、粗製物質の
40mgのアリコートの分取HPLCによる精製を実施した。凍結乾燥の後、純粋
な物質を24mg得た(分析HPLC:B=0.1%TFA/アセトニトリル、A
=0.01%TFA/水であるとして、Bが70〜100%である勾配;検出−
214nmのUV;生成物の保持時間=23分)。MALDI質量分析:M+Hの
予測値は1096、実験値は1099。
【0071】 b) チオールを含む脂質構造で『ドープされた』DSPSによってカプセル化し
たガスマイクロバブルの調製 DSPS(4.5mg)および上記の(a)からの脂質(0.5mg、0.4ミリモ
ル)を清浄なバイアル内に秤量して入れそして1.4%のプロピレングリコール
/2.4%のグリセロールの溶液0.8mlを添加した。混合物を80℃に5分間温
め(加温に際してバイアルを震盪しつつ)そしてまだ熱いうちに40μmのフィ
ルターを通じて濾過した。試料を室温に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタン
ガスでフラッシュした。バイアルをキャップミキサー内で45秒間震盪し次いで
ローラーテーブル上に一晩置いた。得られるマイクロバブルを脱イオン水で数回
洗浄しそしてEllmans Reagentを使用することにより、チオール基の取り込みに
ついて分析した。
たガスマイクロバブルの調製 DSPS(4.5mg)および上記の(a)からの脂質(0.5mg、0.4ミリモ
ル)を清浄なバイアル内に秤量して入れそして1.4%のプロピレングリコール
/2.4%のグリセロールの溶液0.8mlを添加した。混合物を80℃に5分間温
め(加温に際してバイアルを震盪しつつ)そしてまだ熱いうちに40μmのフィ
ルターを通じて濾過した。試料を室温に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタン
ガスでフラッシュした。バイアルをキャップミキサー内で45秒間震盪し次いで
ローラーテーブル上に一晩置いた。得られるマイクロバブルを脱イオン水で数回
洗浄しそしてEllmans Reagentを使用することにより、チオール基の取り込みに
ついて分析した。
【0072】 c) フルオレセイン−NHSおよびSulpho−SMPBでのトランスフェリンの修
飾 PBS(1ml)中のトランスフェリン(Holo、ヒト)4mgに、1mgのSulpho−
SMPBと0.5mgのフルオレセイン−NHSとを含有するジメチルスルホキシ
ド溶液0.5mlを添加した。混合物を室温で45分撹拌し、次いでPBSを溶離
剤としてSephadex 200カラムに通した。タンパク質の画分を収集しそして使用前
に4℃に保存した。
飾 PBS(1ml)中のトランスフェリン(Holo、ヒト)4mgに、1mgのSulpho−
SMPBと0.5mgのフルオレセイン−NHSとを含有するジメチルスルホキシ
ド溶液0.5mlを添加した。混合物を室温で45分撹拌し、次いでPBSを溶離
剤としてSephadex 200カラムに通した。タンパク質の画分を収集しそして使用前
に4℃に保存した。
【0073】 d) トランスフェリンとコンジュゲートしたマイクロバブル (b)からのチオール含有マイクロバブルに(c)からの変性したトランスフ
ェリンタンパク質溶液1mlを添加した。溶液のpHを9に調整した後、コンジュゲ
ーション反応を室温で2時間進行させた。脱イオン水での十分な洗浄に続いて、
Coulterカウンター(1〜5μmの間で97%)および蛍光顕微鏡法(著しく蛍光
性であるマイクロバブルを検鏡した)によってマイクロバブルを分析した。
ェリンタンパク質溶液1mlを添加した。溶液のpHを9に調整した後、コンジュゲ
ーション反応を室温で2時間進行させた。脱イオン水での十分な洗浄に続いて、
Coulterカウンター(1〜5μmの間で97%)および蛍光顕微鏡法(著しく蛍光
性であるマイクロバブルを検鏡した)によってマイクロバブルを分析した。
【0074】 e) トランスフェリン受容体陽性の細胞の分離 トランスフェリンを伴う(d)からのマイクロバブルを遠心分離管内の増殖細
胞(U937、ATCC)に10:1の比率で添加しそしてこの管を37℃でロ
ーラーミキサー内に30分間入れた。次いでこの管を200×gで5分間遠心分
離しそして頂部に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。トランス
フェリン受容体陽性の細胞の百分率を決定するために、温和な過剰圧によってマ
イクロバブルを崩壊させた後、フロー・サイトメトリによって細胞を分析した。
胞(U937、ATCC)に10:1の比率で添加しそしてこの管を37℃でロ
ーラーミキサー内に30分間入れた。次いでこの管を200×gで5分間遠心分
離しそして頂部に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。トランス
フェリン受容体陽性の細胞の百分率を決定するために、温和な過剰圧によってマ
イクロバブルを崩壊させた後、フロー・サイトメトリによって細胞を分析した。
【0075】 実施例6 発酵後のペプチドを精製するための、熱安定性のエンテロトキシン(ST−ペプ
チド)に対する抗体を担持するガスマイクロバブルの調製 好適な担持体にコンジュゲートしたペプチドでヒツジを免疫した後、ST−ペ
プチドに対する抗体を得た。実施例5(d)でトランスフェリンについて概説し
たのと同じ手順を用いて抗体をガスマイクロバブルに結合した。最適な量のペプ
チドを生成しそして放出するために、ST−ペプチドに関する遺伝子が挿入され
ている E.coliが培養されている培地にこのマイクロバブルを(培地1mlあたり
マイクロバブル懸濁液1μl)添加した。室温で30分インキュベートし、続い
て200×gで5分間遠心分離した後に浮遊するマイクロバブルを収集し、そし
て低いpHでマイクロバブルから離脱させた後、ペプチドの量および機能(受容体
結合)を測定した。
チド)に対する抗体を担持するガスマイクロバブルの調製 好適な担持体にコンジュゲートしたペプチドでヒツジを免疫した後、ST−ペ
プチドに対する抗体を得た。実施例5(d)でトランスフェリンについて概説し
たのと同じ手順を用いて抗体をガスマイクロバブルに結合した。最適な量のペプ
チドを生成しそして放出するために、ST−ペプチドに関する遺伝子が挿入され
ている E.coliが培養されている培地にこのマイクロバブルを(培地1mlあたり
マイクロバブル懸濁液1μl)添加した。室温で30分インキュベートし、続い
て200×gで5分間遠心分離した後に浮遊するマイクロバブルを収集し、そし
て低いpHでマイクロバブルから離脱させた後、ペプチドの量および機能(受容体
結合)を測定した。
【0076】 実施例7 生物活性のある分子を精製するためのガスマイクロバブルの調製 実施例5(d)でトランスフェリンについて述べたように、生物活性分子に対
する抗体例えば、G−CSF、GM−CSFおよびSCFのような造血調整剤を
マイクロバブルと結合させた。最適な量のタンパク質を生成しそして放出するた
めに、適切な遺伝子が挿入されている E.coliが培養されている培地にこのマイ
クロバブルを(培地1mlあたりマイクロバブル懸濁液1μl)添加した。室温で
30分インキュベートし、続いて200×gで5分間遠心分離した後に浮遊する
マイクロバブルを収集し、そして低いpHでマイクロバブルから離脱させた後、タ
ンパク質の量および機能(受容体結合)を測定した。
する抗体例えば、G−CSF、GM−CSFおよびSCFのような造血調整剤を
マイクロバブルと結合させた。最適な量のタンパク質を生成しそして放出するた
めに、適切な遺伝子が挿入されている E.coliが培養されている培地にこのマイ
クロバブルを(培地1mlあたりマイクロバブル懸濁液1μl)添加した。室温で
30分インキュベートし、続いて200×gで5分間遠心分離した後に浮遊する
マイクロバブルを収集し、そして低いpHでマイクロバブルから離脱させた後、タ
ンパク質の量および機能(受容体結合)を測定した。
【0077】 実施例8 細胞表面上のエピトープに対し1次マウス抗体でタグを付けた細胞を分離するた
めの、ヤギの抗−マウス抗体を担持するガスマイクロバブルの調製 実施例5(d)に記載のようにマイクロバブルを調製したが、ただしトランスフ
ェリンをヤギの抗−マウス抗体に換えた。凝固防止されたヒトの末梢血10mlを
遠心分離した後、密度の勾配を通じそして相間の細胞層の収集によって単核細胞
を得た。細胞をFITCとコンジュゲートしたマウスの抗−ヒトCD4抗体と混
合し、そして結合した抗体を有する細胞の洗浄後の画分をフロー・サイトメトリ
によって測定した。次いでヤギの抗−マウス抗体を担持するマイクロバブルを遠
心分離管内に10:1の比率で添加し、そしてこの管を37℃に保持してローラ
ーミキサー内に30分間入れた。次にこの管を400×gで5分間遠心分離しそ
して頂部に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。穏和な過剰圧に
よってマイクロバブルを注射器内で崩壊させた後、フロー・サイトメトリによっ
て細胞を分析すると、87%の細胞がCD4陽性であることが示された。抗体を
担持しないマイクロバブルでは浮遊する細胞はなかった。
めの、ヤギの抗−マウス抗体を担持するガスマイクロバブルの調製 実施例5(d)に記載のようにマイクロバブルを調製したが、ただしトランスフ
ェリンをヤギの抗−マウス抗体に換えた。凝固防止されたヒトの末梢血10mlを
遠心分離した後、密度の勾配を通じそして相間の細胞層の収集によって単核細胞
を得た。細胞をFITCとコンジュゲートしたマウスの抗−ヒトCD4抗体と混
合し、そして結合した抗体を有する細胞の洗浄後の画分をフロー・サイトメトリ
によって測定した。次いでヤギの抗−マウス抗体を担持するマイクロバブルを遠
心分離管内に10:1の比率で添加し、そしてこの管を37℃に保持してローラ
ーミキサー内に30分間入れた。次にこの管を400×gで5分間遠心分離しそ
して頂部に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。穏和な過剰圧に
よってマイクロバブルを注射器内で崩壊させた後、フロー・サイトメトリによっ
て細胞を分析すると、87%の細胞がCD4陽性であることが示された。抗体を
担持しないマイクロバブルでは浮遊する細胞はなかった。
【0078】 実施例9 ヒトの末梢血に移動した造血幹細胞の、2次抗体を担持するマイクロバブルによ
る分離 4日にわたって顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を注射された(10〜
15μg/日)患者から、遠心エルトリションによって収集された白血球細胞を
、造血前駆細胞上のCD34抗原を認識する抗体と混合し、そして氷上で30分
間インキュベートした。次いでCD34抗原に対向する抗体を担持するマイクロ
バブルを遠心分離管内で細胞と10:1の比率で混合しそしてローラーミキサー
内に30分間入れた。次いでこの管を200×gで5分間遠心分離しそして頂部
に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。収集した懸濁液に、細胞
を損傷することなくマイクロバブルを破壊するのに十分な圧力をかけ、次いでこ
のような細胞を必要とする患者にこの細胞を移植した。
る分離 4日にわたって顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を注射された(10〜
15μg/日)患者から、遠心エルトリションによって収集された白血球細胞を
、造血前駆細胞上のCD34抗原を認識する抗体と混合し、そして氷上で30分
間インキュベートした。次いでCD34抗原に対向する抗体を担持するマイクロ
バブルを遠心分離管内で細胞と10:1の比率で混合しそしてローラーミキサー
内に30分間入れた。次いでこの管を200×gで5分間遠心分離しそして頂部
に浮遊するマイクロバブルに結合した細胞を収集した。収集した懸濁液に、細胞
を損傷することなくマイクロバブルを破壊するのに十分な圧力をかけ、次いでこ
のような細胞を必要とする患者にこの細胞を移植した。
【0079】 実施例10 ハツカネズミの骨髄からの造血幹細胞の単離 C57b1/6Jマウスの大腿骨/脛骨からの骨髄細胞(BMC)を、MEM
アルファで培養器をフラッシュすることにより得た。CD2、CD8a、CD4
、Mac−1、B220、Gr−1およびTER−119に対向する、細胞系特
異的抗体のカクテル(ラットのIgGアイソタイプ、PharMingen、カリフォルニ
ア州サンディエゴ)を添加しそして細胞を氷上で30分間インキュベートした。
抗体でタグを付けた細胞を、ヒツジの抗−ラットIgG抗体で被覆したDynabead
sで除去した。残留する陰性系の画分を、Sca 1(Ly 6A/E、クローン
E13−161.7、PharMingen)に対するFITCとコンジュゲーションした
抗体とともにインキュベートし、そしてフロー・サイトメトリ細胞選別によるか
または実施例8におけるように調製されるが、Sca 1抗体に結合するヤギの
抗−ラット抗体で被覆したマイクロバブルとともに30分間インキュベートしそ
して浮遊の後に収集することにより選別した。このようにして得た細胞画分を、
適切な成長因子(SCF、IL−1、IL−3、IL−6、IL−11、G−C
SFおよびGM−CSF)の存在下で1皿あたりの細胞が400個の寒天皿内で
培養することにより、増殖能力が大きいコロニー形成性細胞の含有率について検
べた。マイクロバブルによる浮遊によって単離される細胞画分は、フロー・サイ
トメトリで選別される細胞集団と比べると、大きなコロニー(直径が0.5mmを
越える)を形成する幹細胞の全体の数および濃度が大きい。また、マイクロバブ
ル法によって単離された細胞から、より小さいコロニーが検出されたが、フロー
・サイトメトリで選別される細胞から生ずるコロニーは無かった。
アルファで培養器をフラッシュすることにより得た。CD2、CD8a、CD4
、Mac−1、B220、Gr−1およびTER−119に対向する、細胞系特
異的抗体のカクテル(ラットのIgGアイソタイプ、PharMingen、カリフォルニ
ア州サンディエゴ)を添加しそして細胞を氷上で30分間インキュベートした。
抗体でタグを付けた細胞を、ヒツジの抗−ラットIgG抗体で被覆したDynabead
sで除去した。残留する陰性系の画分を、Sca 1(Ly 6A/E、クローン
E13−161.7、PharMingen)に対するFITCとコンジュゲーションした
抗体とともにインキュベートし、そしてフロー・サイトメトリ細胞選別によるか
または実施例8におけるように調製されるが、Sca 1抗体に結合するヤギの
抗−ラット抗体で被覆したマイクロバブルとともに30分間インキュベートしそ
して浮遊の後に収集することにより選別した。このようにして得た細胞画分を、
適切な成長因子(SCF、IL−1、IL−3、IL−6、IL−11、G−C
SFおよびGM−CSF)の存在下で1皿あたりの細胞が400個の寒天皿内で
培養することにより、増殖能力が大きいコロニー形成性細胞の含有率について検
べた。マイクロバブルによる浮遊によって単離される細胞画分は、フロー・サイ
トメトリで選別される細胞集団と比べると、大きなコロニー(直径が0.5mmを
越える)を形成する幹細胞の全体の数および濃度が大きい。また、マイクロバブ
ル法によって単離された細胞から、より小さいコロニーが検出されたが、フロー
・サイトメトリで選別される細胞から生ずるコロニーは無かった。
【0080】 実施例11 ヘパリンサルフェートと結合するペプチド(KRKR)とフィブロネクチンペプ
チド(WOPPRARI)を含む多重特異的リポペプチドで『ドープされた』D
SPSでカプセル化したガスマイクロバブルの調製 本例には、細胞を分離するために直線的に配列されている複数のペプチド性ベ
クターを含む標的化されたマイクロバブルの調製を記載する。 a) ヘパリンサルフェートと結合するペプチド(KRKR)とフィブロネクチン
ペプチド(WOPPRARI)を含むリポペプチドの合成
チド(WOPPRARI)を含む多重特異的リポペプチドで『ドープされた』D
SPSでカプセル化したガスマイクロバブルの調製 本例には、細胞を分離するために直線的に配列されている複数のペプチド性ベ
クターを含む標的化されたマイクロバブルの調製を記載する。 a) ヘパリンサルフェートと結合するペプチド(KRKR)とフィブロネクチン
ペプチド(WOPPRARI)を含むリポペプチドの合成
【化2】
【0081】 1ミリモルのアミノ酸カートリッジを使用して、0.1ミリモル基準のFmoc-Il
e-Wang樹脂から出発して上記のリポペプチドをABI 433A自動ペプチド合
成機で合成した。HBTUを使用して、すべてのアミノ酸およびパルミチン酸を
結合の前に予め活性化した。樹脂からのペプチドの除去および側鎖保護基の除去
を、5%のフェノール、5%のEDT、5%のアニソールおよび5%の水を含有
するTFA中で2時間にわたって同時に実施して、粗生成物の収量150mgを得
た。9ml/分の流速で、50分にわたってのBが70〜100%である勾配(A
=0.1%TFA/水およびB=メタノール)を用いて、粗製物質の40mgのア
リコートの分取HPLCによる精製を実施した。凍結乾燥の後、純粋な物質を1
6mg得た(分析HPLC:B=メタノール、A=0.01%TFA/水であると
して、Bが70〜100%である勾配;検出−UV260およびフルオレッセン
スEx280,Em350;生成物の保持時間=19.44分)。MALDI質量分析
を用いて生成物の特性把握をさらに実施した:M+Hの予測値は2198、実験
値は2199。
e-Wang樹脂から出発して上記のリポペプチドをABI 433A自動ペプチド合
成機で合成した。HBTUを使用して、すべてのアミノ酸およびパルミチン酸を
結合の前に予め活性化した。樹脂からのペプチドの除去および側鎖保護基の除去
を、5%のフェノール、5%のEDT、5%のアニソールおよび5%の水を含有
するTFA中で2時間にわたって同時に実施して、粗生成物の収量150mgを得
た。9ml/分の流速で、50分にわたってのBが70〜100%である勾配(A
=0.1%TFA/水およびB=メタノール)を用いて、粗製物質の40mgのア
リコートの分取HPLCによる精製を実施した。凍結乾燥の後、純粋な物質を1
6mg得た(分析HPLC:B=メタノール、A=0.01%TFA/水であると
して、Bが70〜100%である勾配;検出−UV260およびフルオレッセン
スEx280,Em350;生成物の保持時間=19.44分)。MALDI質量分析
を用いて生成物の特性把握をさらに実施した:M+Hの予測値は2198、実験
値は2199。
【0082】 b) ヘパリンサルフェートと結合するペプチド(KRKR)とフィブロネクチン
ペプチド(WOPPRARI)を含む多重特異的リポペプチドで『ドープされた
』DSPSでカプセル化したガスマイクロバブルの調製 DSPS(4.5mg)の試料と(a)からのリポペプチド(0.5mg)の試料と
をともに、2つのバイアルのそれぞれに秤量して入れそして1.4%のプロピレ
ングリコール/2.4%のグリセロールの溶液0.8mlを各バイアルに添加した。
混合物を80℃まで5分間加温した(加温に際してバイアルを震盪)。試料を室
温に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタンガスでフラッシュした。バイアルを
キャップミキサー内で45秒間震盪しそして一晩回転させた。得られるマイクロ
バブルを脱イオン水で数回洗浄しそしてCoulterカウンターによって分析し(寸
法:1〜3μm(87%)、3〜5μm(11.5%))、また音響減衰によって分
析した(最大減衰での周波数:3.5MHz)。マイクロバブルは120mmHgで安定
であった。MALDI質量分析を用いて以下のようにDSPSでカプセル化した
マイクロバブルへのリポペプチドの取り込みを確認した。約0.05〜0.1mlの
マイクロバブル懸濁液を清浄なバイアル内に移しそして0.05〜0.1mlのメタ
ノールを添加した。懸濁液を30秒間超音波処理しそしてMALDI MSによ
って分析した。モードで、2200のM+H(リポペプチドについての予想値は
2198)を得た。
ペプチド(WOPPRARI)を含む多重特異的リポペプチドで『ドープされた
』DSPSでカプセル化したガスマイクロバブルの調製 DSPS(4.5mg)の試料と(a)からのリポペプチド(0.5mg)の試料と
をともに、2つのバイアルのそれぞれに秤量して入れそして1.4%のプロピレ
ングリコール/2.4%のグリセロールの溶液0.8mlを各バイアルに添加した。
混合物を80℃まで5分間加温した(加温に際してバイアルを震盪)。試料を室
温に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタンガスでフラッシュした。バイアルを
キャップミキサー内で45秒間震盪しそして一晩回転させた。得られるマイクロ
バブルを脱イオン水で数回洗浄しそしてCoulterカウンターによって分析し(寸
法:1〜3μm(87%)、3〜5μm(11.5%))、また音響減衰によって分
析した(最大減衰での周波数:3.5MHz)。マイクロバブルは120mmHgで安定
であった。MALDI質量分析を用いて以下のようにDSPSでカプセル化した
マイクロバブルへのリポペプチドの取り込みを確認した。約0.05〜0.1mlの
マイクロバブル懸濁液を清浄なバイアル内に移しそして0.05〜0.1mlのメタ
ノールを添加した。懸濁液を30秒間超音波処理しそしてMALDI MSによ
って分析した。モードで、2200のM+H(リポペプチドについての予想値は
2198)を得た。
【0083】 実施例12 細胞膜に対する親和性のある螺旋状ペを含むリポペプチドで『ドープされた』D
SPSによってカプセル化されたガスマイクロバブルの調製 本例には、細胞膜構造物を標的捕捉するためのペプチド性ベクターを含む標的
化されたマイクロバブルの調製を記載する。
SPSによってカプセル化されたガスマイクロバブルの調製 本例には、細胞膜構造物を標的捕捉するためのペプチド性ベクターを含む標的
化されたマイクロバブルの調製を記載する。
【化3】
【0084】 1ミリモルのアミノ酸カートリッジを使用して、0.2ミリモル基準のRinkア
ミド樹脂から出発して上記のリポペプチドをABI 433A自動ペプチド合成
機で合成した。HBTUを使用して、すべてのアミノ酸および2−n−ヘキサデ
シルステアリン酸を結合の前に予め活性化した。樹脂からのリポペプチドの除去
および側鎖保護基の除去を、5%の水を含有するTFA中で2時間にわたって同
時に実施して、粗生成物の収量520mgを得た。9ml/分の流速において、40
分にわたってのBが90〜100%である勾配(A=0.1%TFA/水またB
=メタノール)を用いて、粗製物質の30mgのアリコートの分取HPLCによる
精製を実施した。凍結乾燥の後、純粋な物質を10mg得た(分析HPLC:B=
メタノール、A=0.01%TFA/水であるとして、20分にわたりBが90
〜100%である勾配;検出−214nmのUV;生成物の保持時間=23分)。
MALDI質量分析を用いて生成物の特性把握をさらに実施した:M+Hの予測
値は2369、実験値は2375。
ミド樹脂から出発して上記のリポペプチドをABI 433A自動ペプチド合成
機で合成した。HBTUを使用して、すべてのアミノ酸および2−n−ヘキサデ
シルステアリン酸を結合の前に予め活性化した。樹脂からのリポペプチドの除去
および側鎖保護基の除去を、5%の水を含有するTFA中で2時間にわたって同
時に実施して、粗生成物の収量520mgを得た。9ml/分の流速において、40
分にわたってのBが90〜100%である勾配(A=0.1%TFA/水またB
=メタノール)を用いて、粗製物質の30mgのアリコートの分取HPLCによる
精製を実施した。凍結乾燥の後、純粋な物質を10mg得た(分析HPLC:B=
メタノール、A=0.01%TFA/水であるとして、20分にわたりBが90
〜100%である勾配;検出−214nmのUV;生成物の保持時間=23分)。
MALDI質量分析を用いて生成物の特性把握をさらに実施した:M+Hの予測
値は2369、実験値は2375。
【0085】 b) カプセル化したガスマイクロバブルの調製 DSPS(4.5mg)および(a)からのリポペプチド(0.5mg)を清浄なバ
イアル内に秤量して入れそして1.4%のプロピレングリコール/2.4%のグリ
セロールの溶液1.0mlを添加した。混合物を3〜5分間超音波処理し、80℃
まで5分間加温し次いで4.5μmのフィルターを通じて濾過した。混合物を室温
に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタンガスでフラッシュした。バイアルをキ
ャップミキサー内で45秒間震盪しそして得られるマイクロバブルを1000rp
mで3分間遠心分離した。次いで、洗浄水中にリポペプチドが検出できなくなる
まで(MALDI−MS)、マイクロバブルを水洗した。Coulterカウンター計
測、音響減衰および圧力安定性の検討を実施した。リポペプチドの存在を確認す
るために、洗浄されたバブルのアリコート(約0.2ml)にメタノール(0.5ml
)を添加しそして混合物を超音波処理浴内に2分間入れた。得られる透明な溶液
はMALDI−MSで分析するとリポペプチドを含有することが分かった。
イアル内に秤量して入れそして1.4%のプロピレングリコール/2.4%のグリ
セロールの溶液1.0mlを添加した。混合物を3〜5分間超音波処理し、80℃
まで5分間加温し次いで4.5μmのフィルターを通じて濾過した。混合物を室温
に冷却しそして頭隙をパーフルオロブタンガスでフラッシュした。バイアルをキ
ャップミキサー内で45秒間震盪しそして得られるマイクロバブルを1000rp
mで3分間遠心分離した。次いで、洗浄水中にリポペプチドが検出できなくなる
まで(MALDI−MS)、マイクロバブルを水洗した。Coulterカウンター計
測、音響減衰および圧力安定性の検討を実施した。リポペプチドの存在を確認す
るために、洗浄されたバブルのアリコート(約0.2ml)にメタノール(0.5ml
)を添加しそして混合物を超音波処理浴内に2分間入れた。得られる透明な溶液
はMALDI−MSで分析するとリポペプチドを含有することが分かった。
【0086】 実施例13 ECV 304の細胞系に特異的に結合するベクターを担持するガスマイクロバ
ブルによるこの細胞系の浮遊 もとは、ヒトの内皮細胞系と考えられたが、現在は膀胱癌腫細胞系であること
が知られている、正常な臍の緒から得たECV 304細胞系を、Nunc培養
フラスコ(Chutney 153732)の中で、L−グルタミン酸200mM、ペニシリン/
ストレプトマイシン(10.000U/mlおよび10.00mcg/ml)および10
%のウシ胎仔血清が添加されているRPMI 1640培地中で培養した。トリ
プシン処理の後、集密状態に達した時、分割比を1:5〜1:7にして細胞を継
代培養した。トリプシン処理した集密的培養物からの200万個の細胞を5本の
遠心分離管のそれぞれに入れた。次いで対照用のマイクロバブルまたは内皮細胞
に結合することができるマイクロバブル(実施例11および12に記載のように
して調製)を遠心分離管1本あたりバブルを200万、400万、600万、8
00万または1000万個添加した。400×gで5分間遠心分離した後、管の
底にある細胞をCoulterカウンターで計測した。細胞に結合する4つまたはそれ
以上のマイクロバブルによって、遠心分離管内で細胞が液体の表面に浮遊させら
れることが分かった。実施例12からのマイクロバブルによってすべての細胞が
浮遊したが、実施例11からのマイクロバブルでは約50%の細胞が浮遊した。
デカンテーションによってまたは浮遊するマイクロバブルを試料の表面から単に
すくい取ることによって、浮遊した細胞を分離した。あるいは、内皮細胞をマイ
クロバブルによって浮遊させそして分離するのに図1の装置を使用してもよい。
ブルによるこの細胞系の浮遊 もとは、ヒトの内皮細胞系と考えられたが、現在は膀胱癌腫細胞系であること
が知られている、正常な臍の緒から得たECV 304細胞系を、Nunc培養
フラスコ(Chutney 153732)の中で、L−グルタミン酸200mM、ペニシリン/
ストレプトマイシン(10.000U/mlおよび10.00mcg/ml)および10
%のウシ胎仔血清が添加されているRPMI 1640培地中で培養した。トリ
プシン処理の後、集密状態に達した時、分割比を1:5〜1:7にして細胞を継
代培養した。トリプシン処理した集密的培養物からの200万個の細胞を5本の
遠心分離管のそれぞれに入れた。次いで対照用のマイクロバブルまたは内皮細胞
に結合することができるマイクロバブル(実施例11および12に記載のように
して調製)を遠心分離管1本あたりバブルを200万、400万、600万、8
00万または1000万個添加した。400×gで5分間遠心分離した後、管の
底にある細胞をCoulterカウンターで計測した。細胞に結合する4つまたはそれ
以上のマイクロバブルによって、遠心分離管内で細胞が液体の表面に浮遊させら
れることが分かった。実施例12からのマイクロバブルによってすべての細胞が
浮遊したが、実施例11からのマイクロバブルでは約50%の細胞が浮遊した。
デカンテーションによってまたは浮遊するマイクロバブルを試料の表面から単に
すくい取ることによって、浮遊した細胞を分離した。あるいは、内皮細胞をマイ
クロバブルによって浮遊させそして分離するのに図1の装置を使用してもよい。
【0087】 実施例14 エチリデンビス(16−ヒドロキシヘキサデカノエート)のポリマーでカプセル
化しそしてアジポイルクロライドと、このポリマーに共有結合的に結合したビオ
チン−アミドカプロエート−Alaとを有するガスマイクロバブル a) Z−Ala−ポリマー[3−O−(カルボベンジルオキシ−L−アラニル)
ポリマー]の合成 WO-A-9607434中に記載のようにエチリデンビス(16−ヒドロキシヘキサデカ
ノエート)およびアジポイルクロライドからポリマーをつくり、そして分子量が
10,000であるポリマーの画分をゲル浸透クロマトグラフィーを用いて精製
した。10gのこの物質(1ミリモルのOH基に相当する)、Z−アラニン(5
ミリモル)およびジメチルアミノピリジン(4ミリモル)を乾燥ジメチルホルム
アミド/テトラヒドロキフラン中に溶解し、次いでジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを添加した。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。ジシクロヘキシル尿素
を濾過で除去しまた回転蒸発を用いて溶媒を除去した。生成物をクロマトグラフ
ィーによって精製し、生成物を含有する画分を一緒にしそして回転蒸発を用いて
溶媒を除去した。生成物の構造をNMRで確認した。
化しそしてアジポイルクロライドと、このポリマーに共有結合的に結合したビオ
チン−アミドカプロエート−Alaとを有するガスマイクロバブル a) Z−Ala−ポリマー[3−O−(カルボベンジルオキシ−L−アラニル)
ポリマー]の合成 WO-A-9607434中に記載のようにエチリデンビス(16−ヒドロキシヘキサデカ
ノエート)およびアジポイルクロライドからポリマーをつくり、そして分子量が
10,000であるポリマーの画分をゲル浸透クロマトグラフィーを用いて精製
した。10gのこの物質(1ミリモルのOH基に相当する)、Z−アラニン(5
ミリモル)およびジメチルアミノピリジン(4ミリモル)を乾燥ジメチルホルム
アミド/テトラヒドロキフラン中に溶解し、次いでジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを添加した。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。ジシクロヘキシル尿素
を濾過で除去しまた回転蒸発を用いて溶媒を除去した。生成物をクロマトグラフ
ィーによって精製し、生成物を含有する画分を一緒にしそして回転蒸発を用いて
溶媒を除去した。生成物の構造をNMRで確認した。
【0088】 b) Ala−ポリマー[3−O−(L−アラニル)−ポリマー]の合成 (a)からのZ−Ala−ポリマー(0.1ミリモル)をトルエン/テトラヒ
ドロフランおよび氷酢酸(全容積の15%)中で撹拌しそして木炭上の5%パラ
ジウムの存在下に2時間水素化した。反応混合物を濾過しそして真空濃縮した。
ドロフランおよび氷酢酸(全容積の15%)中で撹拌しそして木炭上の5%パラ
ジウムの存在下に2時間水素化した。反応混合物を濾過しそして真空濃縮した。
【0089】 c) ビオチンアミドカプロエート−Ala−ポリマーの合成 テトラヒドロフラン中のビオチンアミドカプロエートN−ヒドロキシスクシン
イミドエステルの溶液を(b)からのAla−ポリマーに添加し、テトラヒドロ
キフランとジメチルホルムアミドとの混合物および、pHが7.5の0.1Mのリン
酸ナトリウムの中に溶解した。反応混合物を30℃に加熱しそして激しく撹拌し
、TLCによって反応の完結をモニターした。溶媒を蒸発させそして粗生成物を
さらに精製せずに使用した。
イミドエステルの溶液を(b)からのAla−ポリマーに添加し、テトラヒドロ
キフランとジメチルホルムアミドとの混合物および、pHが7.5の0.1Mのリン
酸ナトリウムの中に溶解した。反応混合物を30℃に加熱しそして激しく撹拌し
、TLCによって反応の完結をモニターした。溶媒を蒸発させそして粗生成物を
さらに精製せずに使用した。
【0090】 d) ビオチン−アミドカプロエート−Ala−ポリマーとPEG10000メチルエ
ーテル16−ヘキサデカノイルオキシヘキサデカノエートとを含むガスマイクロ
バブル 60℃に保たれた(−)−カンフェン中の、(c)からのビオチン−アミドカ
プロエート−Ala−ポリマーの5%重量/重量の溶液10mlをPEG10000メ
チルエーテル16−ヘキサデカノイルオキシヘキサデカノエート(W0-A-9607434
中に記載のようにして調製)の1%重量/重量の同じ温度の水溶液30mlに添加
した。低速度の回転子固定子混合機(Ultra Turax(登録商標)T25)を使用するこ
とにより混合物を乳化し、その後ドライアイス/メタノール浴中で凍結しそして
48時間凍結乾燥して、微細粒子状の白い粉末として標題の生成物を得た。
ーテル16−ヘキサデカノイルオキシヘキサデカノエートとを含むガスマイクロ
バブル 60℃に保たれた(−)−カンフェン中の、(c)からのビオチン−アミドカ
プロエート−Ala−ポリマーの5%重量/重量の溶液10mlをPEG10000メ
チルエーテル16−ヘキサデカノイルオキシヘキサデカノエート(W0-A-9607434
中に記載のようにして調製)の1%重量/重量の同じ温度の水溶液30mlに添加
した。低速度の回転子固定子混合機(Ultra Turax(登録商標)T25)を使用するこ
とにより混合物を乳化し、その後ドライアイス/メタノール浴中で凍結しそして
48時間凍結乾燥して、微細粒子状の白い粉末として標題の生成物を得た。
【0091】 e) 生成物の顕微鏡法による特性把握 W0-A-960734に記載の光学顕微鏡法を用いて生成物の微細粒子の性状を確認し
た。3.5MHzの広帯域変換器を用いる超音波透過測定によって、2mg/mlより小
さい微細粒子懸濁液が少なくとも5dB/cmの音響ビーム減衰を与えることが示さ
れた。
た。3.5MHzの広帯域変換器を用いる超音波透過測定によって、2mg/mlより小
さい微細粒子懸濁液が少なくとも5dB/cmの音響ビーム減衰を与えることが示さ
れた。
【0092】 実施例15 アルブミンでカプセル化しそしてビオチンで官能性化したガスマイクロバブル すべての操作を室温で実施して、ガスを充満したアルブミンの微細球の5mg/
mlのアルブミン中の均一な懸濁液(1mlあたり6×108個の微細球)を使用し
た。微細球の浮遊を促進するために10mlの2つのアリコートを遠心分離し(1
70×g、5分間)そして注意深く吸引することにより下層の液体8mlを抜き出
しそして空気で飽和されリン酸塩で緩衝された等容積の塩水で置換された。調製
物を15〜20分間回転させて微細球を再び懸濁させた。この手続きを2回反復
した。その後では微細球に結び付かない遊離のアルブミンは極くわずかな量しか
残留しないと思われた。50μlのNHS−ビオチン(ジメチルスルホキシド中
で10mM)をアリコートの1つに添加した(最終濃度は50μM)。別な(対照
用の)アリコートには50μlのジメチルスルホキシドを入れた。試料の入った
管を1時間回転し、その後、微細球を架橋するために50%の水性グルタルアル
デヒドを各々の管に20μlずつ添加した。さらに1時間回転させた後、微細球
の浮遊を可能にするために管を1晩垂直に位置させた。翌日、1mg/mlのヒト血
清アルブミンを含有するリン酸塩で緩衝された塩水(PBS/HSA)で懸濁液
を2回洗浄しそして最後の遠心分離の後にPBS/HSA中に再度懸濁した。
mlのアルブミン中の均一な懸濁液(1mlあたり6×108個の微細球)を使用し
た。微細球の浮遊を促進するために10mlの2つのアリコートを遠心分離し(1
70×g、5分間)そして注意深く吸引することにより下層の液体8mlを抜き出
しそして空気で飽和されリン酸塩で緩衝された等容積の塩水で置換された。調製
物を15〜20分間回転させて微細球を再び懸濁させた。この手続きを2回反復
した。その後では微細球に結び付かない遊離のアルブミンは極くわずかな量しか
残留しないと思われた。50μlのNHS−ビオチン(ジメチルスルホキシド中
で10mM)をアリコートの1つに添加した(最終濃度は50μM)。別な(対照
用の)アリコートには50μlのジメチルスルホキシドを入れた。試料の入った
管を1時間回転し、その後、微細球を架橋するために50%の水性グルタルアル
デヒドを各々の管に20μlずつ添加した。さらに1時間回転させた後、微細球
の浮遊を可能にするために管を1晩垂直に位置させた。翌日、1mg/mlのヒト血
清アルブミンを含有するリン酸塩で緩衝された塩水(PBS/HSA)で懸濁液
を2回洗浄しそして最後の遠心分離の後にPBS/HSA中に再度懸濁した。
【0093】 微細球に結び付いたビオチンの存在を検べるために、ホースラディッシュパー
オキシダーゼにコンジュゲートしたストレプタビジン(strep-HRP)を両方の懸
濁液に添加しそして反応を可能にするために管を1時間回転した。次いで微細球
を3回洗浄し、0.1mg/mlのフェニレンジアミンジハイドロクロライドと0.0
1%の過酸化水素とを含有する100mMのクエン酸塩−燐酸塩緩衝液(pH5)中
に再度懸濁し、そして10分間回転させた。黄緑色が生じることにより酵素の存
在が示された。以下の結果を得た。 試 料 発色 ビオチニル化された微細球+strp-HRP 2+ 対照用の微細球+strp-HRP + これによって微細球がビオチニル化されたことが確認される。
オキシダーゼにコンジュゲートしたストレプタビジン(strep-HRP)を両方の懸
濁液に添加しそして反応を可能にするために管を1時間回転した。次いで微細球
を3回洗浄し、0.1mg/mlのフェニレンジアミンジハイドロクロライドと0.0
1%の過酸化水素とを含有する100mMのクエン酸塩−燐酸塩緩衝液(pH5)中
に再度懸濁し、そして10分間回転させた。黄緑色が生じることにより酵素の存
在が示された。以下の結果を得た。 試 料 発色 ビオチニル化された微細球+strp-HRP 2+ 対照用の微細球+strp-HRP + これによって微細球がビオチニル化されたことが確認される。
【0094】 実施例16 トランスフェクトしたU937−1細胞のトランスフェクトしない細胞からの分
離 pHook−1プラスミド(オランダのGroningenのInvitrogen)は、ハプテンph
Ox(4−エトキシメチレン−2−フェニル−2−オキサゾリン−5−オン)に
対向する単一鎖の抗体(sFv)をコード化する。sFvはPDSF−受容体の
トランスメンブレイン領域と融合しそしてトランスフェクトした細胞の表面で発
現するであろう。関心のある遺伝子はsFv単位の上流にある複数のクローニン
グの部位でクローン化されるであろう。
離 pHook−1プラスミド(オランダのGroningenのInvitrogen)は、ハプテンph
Ox(4−エトキシメチレン−2−フェニル−2−オキサゾリン−5−オン)に
対向する単一鎖の抗体(sFv)をコード化する。sFvはPDSF−受容体の
トランスメンブレイン領域と融合しそしてトランスフェクトした細胞の表面で発
現するであろう。関心のある遺伝子はsFv単位の上流にある複数のクローニン
グの部位でクローン化されるであろう。
【0095】 a) pHook−1プラスミドでのU937−1細胞のトランスフェクション 対数期の後期にあるU937−1細胞を340×gで5分間遠心分離し、PB
S中で1回洗浄しそして媒体450μlあたりの細胞が20×106である濃度ま
でRPMI1640媒体中に再度懸濁した。50μlのRPMI−1640媒体
中に約50μgあるpHook−1をU937−1細胞に添加しそして溶液を電気穿孔
キュベットに移し入れた。このキュベットを氷上で5分間インキュベートした後
キュベットチャンバーに入れた。電気穿孔法は1000μF、∞Ωおよび300
Vで実施した。キュベットを氷上で10分間インキュベートしそして内容物を、
10%のウシ胎仔血清、2mMのL−グルタミンおよび抗生物質を含有する50ml
のRPMI−1640(37℃で予めインキュベートされている)中に移し入れ
た。トランスフェクトした細胞を37℃およびCO2 5%でインキュベートした
。
S中で1回洗浄しそして媒体450μlあたりの細胞が20×106である濃度ま
でRPMI1640媒体中に再度懸濁した。50μlのRPMI−1640媒体
中に約50μgあるpHook−1をU937−1細胞に添加しそして溶液を電気穿孔
キュベットに移し入れた。このキュベットを氷上で5分間インキュベートした後
キュベットチャンバーに入れた。電気穿孔法は1000μF、∞Ωおよび300
Vで実施した。キュベットを氷上で10分間インキュベートしそして内容物を、
10%のウシ胎仔血清、2mMのL−グルタミンおよび抗生物質を含有する50ml
のRPMI−1640(37℃で予めインキュベートされている)中に移し入れ
た。トランスフェクトした細胞を37℃およびCO2 5%でインキュベートした
。
【0096】 b) [5−オキソ−2−フェニルオキサゾール−4−イリデンメチル)アミノ]
酢酸の調製 窒素雰囲気下にあるアセトン(20ml)中の4−エトキシメチレン−2−フェ
ニル−2−フェニル−2−オキサゾリン−5−オン(4ミリモル)の撹拌された
溶液に、重炭酸ナトリウム溶液(20ml)中でグリシン(4ミリモル)を15分
間撹拌することによりつくられる溶液を添加した。混合物を18時間撹拌し、ジ
クロロメタンで(15ml、2回)洗浄しそして1Nの塩酸で酸性化した。撹拌に
際して生成する結晶を収集しそしてジクロロメタンで完全に洗浄して純粋な生成
物を得た。
酢酸の調製 窒素雰囲気下にあるアセトン(20ml)中の4−エトキシメチレン−2−フェ
ニル−2−フェニル−2−オキサゾリン−5−オン(4ミリモル)の撹拌された
溶液に、重炭酸ナトリウム溶液(20ml)中でグリシン(4ミリモル)を15分
間撹拌することによりつくられる溶液を添加した。混合物を18時間撹拌し、ジ
クロロメタンで(15ml、2回)洗浄しそして1Nの塩酸で酸性化した。撹拌に
際して生成する結晶を収集しそしてジクロロメタンで完全に洗浄して純粋な生成
物を得た。
【0097】 c) [(5−オキソ−2−フェニルオキサゾール−4−イリデンメチル)アミノ
]アセチル−DSPEの調製 (b)からの生成物(0.56ミリモル)をジメチルホルムアミド(5ml)中
に溶解した。N−メチルモルホリン(1.68ミリモル)を添加し、続いてDS
PE(0.84ミリモル)とベンゾトリアゾール−1−イロキシ−トリス(ジメ
チルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(0.73ミリモル)と
を添加した。混合物を16時間撹拌し、その後ジメチルホルムアミドを減圧下で
蒸発させた。残留物をエチルアセテート中に取り込み、得られる溶液を乾燥状態
まで蒸発させ、そして残留物をクロロホルム/メタノール(8:2)を使用して
シリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標題化合物の白い
結晶を得た(収率70%)。
]アセチル−DSPEの調製 (b)からの生成物(0.56ミリモル)をジメチルホルムアミド(5ml)中
に溶解した。N−メチルモルホリン(1.68ミリモル)を添加し、続いてDS
PE(0.84ミリモル)とベンゾトリアゾール−1−イロキシ−トリス(ジメ
チルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(0.73ミリモル)と
を添加した。混合物を16時間撹拌し、その後ジメチルホルムアミドを減圧下で
蒸発させた。残留物をエチルアセテート中に取り込み、得られる溶液を乾燥状態
まで蒸発させ、そして残留物をクロロホルム/メタノール(8:2)を使用して
シリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標題化合物の白い
結晶を得た(収率70%)。
【0098】 d) ハプテンphOxを担持するガスマイクロバブルの調整 (c)からのphOx−DSPEで『ドープされた』DSPSでカプセル化し
たガスマイクロバブルを実施例11(b)の方法に従って調製した。
たガスマイクロバブルを実施例11(b)の方法に従って調製した。
【0099】 e) 陽性にトランスフェクトした細胞の分離 (d)からのphOxを担持するマイクロバブルを、遠心分離管内で増殖する
トランスフェクトしたU937−1細胞に10:1の比率で添加し、そしてこの
管を37℃に保ちそしてローラーミキサー内に30分間入れた。次にこの管を2
00×gで5分間遠心分離した。マイクロバブルに結合した細胞を頂部に浮遊さ
せそしてこれを収集した。穏和な過剰圧によってマイクロバブルを崩壊させそし
てトランスフェクトした細胞を別な分析のために使用した。トランスフェクトし
ていない細胞からトランスフェクトした細胞が首尾よく分離されることを確認す
るために、単一な細胞をフロー・サイトメトリ内で選別することができ、また細
胞の遺伝物質をポリメラーゼ連鎖反応によって分析することができる。
トランスフェクトしたU937−1細胞に10:1の比率で添加し、そしてこの
管を37℃に保ちそしてローラーミキサー内に30分間入れた。次にこの管を2
00×gで5分間遠心分離した。マイクロバブルに結合した細胞を頂部に浮遊さ
せそしてこれを収集した。穏和な過剰圧によってマイクロバブルを崩壊させそし
てトランスフェクトした細胞を別な分析のために使用した。トランスフェクトし
ていない細胞からトランスフェクトした細胞が首尾よく分離されることを確認す
るために、単一な細胞をフロー・サイトメトリ内で選別することができ、また細
胞の遺伝物質をポリメラーゼ連鎖反応によって分析することができる。
【0100】 実施例17 細胞を分離するためのマイクロバブルを製造するために好適な、チオール含有ポ
リエチレングリコール化したリポペプチドである、NH2−Dab[PEG3400
(N−α−アセチル−Cys)]−Lys(Hds)−Lys−Lys(Hds
)−Glu−OH(ここでDabはジアミノ酪酸であり、そしてHdsは2−n
−ヘキサデシルステアリン酸である)の合成
リエチレングリコール化したリポペプチドである、NH2−Dab[PEG3400
(N−α−アセチル−Cys)]−Lys(Hds)−Lys−Lys(Hds
)−Glu−OH(ここでDabはジアミノ酪酸であり、そしてHdsは2−n
−ヘキサデシルステアリン酸である)の合成
【化4】
【0101】 上記のリポペプチドのペプチド成分を、0.2ミリモル基準でFmoc−Gl
u(OtBu)−Wangから出発してABI 433A自動ペプチド合成機で
合成した。HATUで予め活性化させて、Fmoc−Lys(Dde)−OH(
1ミリモル)を結合させた。同様な仕方で、Fmoc−Lys(Boc)−OH
、Fmoc−Lys(Dde)−OHおよびBoc−Dab(Fmoc)−OH
の順序でアミノ酸誘導体を固体の支持体上で自動的にアッセンブリーした。次い
でペプチド−樹脂を手動の窒素バブラーに移しそしてFmoc−PEG3400−N
HS(2g、約0.5ミリモル)をDab残基の側鎖を通じて結合させた。ジメ
チルホルムアミド中の20%ピペリジンによってPEGスペーサー成分から樹脂
に結合したFmoc基を除去した後、HATU活性化を用いてFmoc−Cys
(Trt)を結合させた。Fmocの脱保護サイクルを用いてCysアミノ官能
基を遊離させ、直ちにこれを無水酢酸でキャップした。次いで2−n−ヘキサデ
シルステアリン酸との結合に先立って2%のヒドラジン/ジメチルホルムアミド
溶液中でDde保護基を分裂させた。樹脂からのポリエチレングリコール化した
リポペプチドの除去および側鎖保護基の除去の双方を、5%の水と5%のトリイ
ソプロピルシランとを含有するTFA中で実施し、粗生成物の収量550mgを得
た。MALDI質量分析を用いて生成物の特性把握を実施した:M+H+の予測
値、4500〜5200の複数のピーク、M+H+の実験値、4000〜530
0。
u(OtBu)−Wangから出発してABI 433A自動ペプチド合成機で
合成した。HATUで予め活性化させて、Fmoc−Lys(Dde)−OH(
1ミリモル)を結合させた。同様な仕方で、Fmoc−Lys(Boc)−OH
、Fmoc−Lys(Dde)−OHおよびBoc−Dab(Fmoc)−OH
の順序でアミノ酸誘導体を固体の支持体上で自動的にアッセンブリーした。次い
でペプチド−樹脂を手動の窒素バブラーに移しそしてFmoc−PEG3400−N
HS(2g、約0.5ミリモル)をDab残基の側鎖を通じて結合させた。ジメ
チルホルムアミド中の20%ピペリジンによってPEGスペーサー成分から樹脂
に結合したFmoc基を除去した後、HATU活性化を用いてFmoc−Cys
(Trt)を結合させた。Fmocの脱保護サイクルを用いてCysアミノ官能
基を遊離させ、直ちにこれを無水酢酸でキャップした。次いで2−n−ヘキサデ
シルステアリン酸との結合に先立って2%のヒドラジン/ジメチルホルムアミド
溶液中でDde保護基を分裂させた。樹脂からのポリエチレングリコール化した
リポペプチドの除去および側鎖保護基の除去の双方を、5%の水と5%のトリイ
ソプロピルシランとを含有するTFA中で実施し、粗生成物の収量550mgを得
た。MALDI質量分析を用いて生成物の特性把握を実施した:M+H+の予測
値、4500〜5200の複数のピーク、M+H+の実験値、4000〜530
0。
【0102】 実施例18 水素化された卵のホスファチジルセリンによってカプセル化したガスマイクロバ
ブルによるハツカネズミの骨髄からの造血前駆細胞の単離 NMRIマウスの大腿骨/脛骨からの骨髄細胞をMEMアルファ培養基でのフ
ラッシングによって得た。CD2、CD8a、CD4、Mac−1、B220、
Gr−1およびTER−119に対向する細胞系に特異的な抗体のカルテル(ラ
ットのIgGアイソタイプ、PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)を添
加しそして細胞を氷上で30分間インキュベートした。抗体でタグを付けた細胞
を、ヤギの抗−ラットIgG抗体で被覆されたDynabeadsで除去した。残留する
陰性系の画分を、実施例5(a)中に述べたように調製したチオール化したリポ
ペプチドデ『ドープされた』、水素化した卵のホスファチジルセリン(HEPS
)でカプセル化したマイクロバブルとともに30分間インキュベートした。マイ
クロバブルは、DSPSの代わりに4.0mgのHEPSを使用しまた0.7mgのリ
ポペプチドを使用して実施例5(b)に述べたように調製した。浮遊によって分
別された細胞は陰性系の集団が2.44%を占め、適切な成長因子(SCF、I
L−1、IL−3およびIL−6)の存在下で寒天の皿の中で1皿あたり100
0個の細胞を培養することにより、顆粒球/マクロファージコロニー形成細胞(
GM−CFC)の含有率について上記の細胞を評価した。インキュベーター内で
7日間培養(空気中に窒素を導入した結果、酸素分圧が低下した)した後、倒立
顕微鏡(Zeiss)によってコロニーの数を調べた。半分より多い細胞がコロニー
形成性の細胞であることが分かった(培養された1000の細胞のうち530の
コロニー)。
ブルによるハツカネズミの骨髄からの造血前駆細胞の単離 NMRIマウスの大腿骨/脛骨からの骨髄細胞をMEMアルファ培養基でのフ
ラッシングによって得た。CD2、CD8a、CD4、Mac−1、B220、
Gr−1およびTER−119に対向する細胞系に特異的な抗体のカルテル(ラ
ットのIgGアイソタイプ、PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)を添
加しそして細胞を氷上で30分間インキュベートした。抗体でタグを付けた細胞
を、ヤギの抗−ラットIgG抗体で被覆されたDynabeadsで除去した。残留する
陰性系の画分を、実施例5(a)中に述べたように調製したチオール化したリポ
ペプチドデ『ドープされた』、水素化した卵のホスファチジルセリン(HEPS
)でカプセル化したマイクロバブルとともに30分間インキュベートした。マイ
クロバブルは、DSPSの代わりに4.0mgのHEPSを使用しまた0.7mgのリ
ポペプチドを使用して実施例5(b)に述べたように調製した。浮遊によって分
別された細胞は陰性系の集団が2.44%を占め、適切な成長因子(SCF、I
L−1、IL−3およびIL−6)の存在下で寒天の皿の中で1皿あたり100
0個の細胞を培養することにより、顆粒球/マクロファージコロニー形成細胞(
GM−CFC)の含有率について上記の細胞を評価した。インキュベーター内で
7日間培養(空気中に窒素を導入した結果、酸素分圧が低下した)した後、倒立
顕微鏡(Zeiss)によってコロニーの数を調べた。半分より多い細胞がコロニー
形成性の細胞であることが分かった(培養された1000の細胞のうち530の
コロニー)。
【0103】 実施例19 ニトリロトリ酢酸キレート結合中心を担持するガスマイクロバブルの調製 a) N−[2−{ビス−カルボキシメチルアミノ}−6−(3−カルボキシプロ
ピオニルアミノ)ヘキサン酸]−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3
−ホスホエタノールアミンの合成 ジメチルホルムアミド(5ml)中の化合物1,2−ジステアロイル−sn−グ
リセロ−3−ホスホエタノールアミン−n−スクシニル(米国のAvanti Polar L
ipids Inc.;100mg、0.12ミリモル)にジイソプロピルエチルアミン(6
3μl、0.36ミリモル)を添加し、続いてジメチルホルムアミド(1ml)中の
N,N,N′,N′−テトラメチル(スクシンイミド)ウロニウムテトラフルオロ
ボレート(TSTU)(45mg、0.15ミリモル)の溶液を添加した。混合物を
2時間撹拌し、その後にジメチルホルムアミド(1ml)中の2−(ビス−カルボ
キシメチルアミノ)−6−(3−カルボキシプロピオニルアミノ)ヘキサン酸(
Hochuli,E.;Dobeli,H.;Schacher,A.、Journal of Chromatography 411、17
7ページ、(1987年)で報じられている手順によって合成される。31.47mg、
0.12ミリモル)の溶液を添加した。次いで混合物を周囲温度で24時間撹拌
したが、この時TLCによってモニターすると反応が完結することが示された。
溶媒の蒸発の後、フラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して純粋
で白い標題の化合物を得た(収率65%)。
ピオニルアミノ)ヘキサン酸]−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3
−ホスホエタノールアミンの合成 ジメチルホルムアミド(5ml)中の化合物1,2−ジステアロイル−sn−グ
リセロ−3−ホスホエタノールアミン−n−スクシニル(米国のAvanti Polar L
ipids Inc.;100mg、0.12ミリモル)にジイソプロピルエチルアミン(6
3μl、0.36ミリモル)を添加し、続いてジメチルホルムアミド(1ml)中の
N,N,N′,N′−テトラメチル(スクシンイミド)ウロニウムテトラフルオロ
ボレート(TSTU)(45mg、0.15ミリモル)の溶液を添加した。混合物を
2時間撹拌し、その後にジメチルホルムアミド(1ml)中の2−(ビス−カルボ
キシメチルアミノ)−6−(3−カルボキシプロピオニルアミノ)ヘキサン酸(
Hochuli,E.;Dobeli,H.;Schacher,A.、Journal of Chromatography 411、17
7ページ、(1987年)で報じられている手順によって合成される。31.47mg、
0.12ミリモル)の溶液を添加した。次いで混合物を周囲温度で24時間撹拌
したが、この時TLCによってモニターすると反応が完結することが示された。
溶媒の蒸発の後、フラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して純粋
で白い標題の化合物を得た(収率65%)。
【0104】 b) DSPCおよびキレートでカプセル化したガスマイクロバブルの調製 水(1ml)中の5%のプロピレングリコール/グリセロールを4.5mgのDS
PCと0.5mgの(a)からのキレートとの混合物に添加した。分散体を80℃
以下5分間加熱し、次いで周囲温度まで冷却した。分散体(0.8ml)をバイア
ル(1ml)に移し入れそして頭隙をパーフルオロブタンでフラッシュした。バイ
アルをキャップミキサー内で45秒間震盪し、その後試料をローラーテーブル上
に置いた。遠心分離の後、下層の液を水と交換しそして洗浄を反復した。
PCと0.5mgの(a)からのキレートとの混合物に添加した。分散体を80℃
以下5分間加熱し、次いで周囲温度まで冷却した。分散体(0.8ml)をバイア
ル(1ml)に移し入れそして頭隙をパーフルオロブタンでフラッシュした。バイ
アルをキャップミキサー内で45秒間震盪し、その後試料をローラーテーブル上
に置いた。遠心分離の後、下層の液を水と交換しそして洗浄を反復した。
【0105】 c) キレートを含有するガスマイクロバブル中への金属陽イオンの導入 (b)からのキレート含有マイクロバブルを、キレートのNi2+イオンとの配
位を可能にするようにさらに変性した。マイクロバブルを1mMの水酸化ナトリウ
ム水溶液で洗浄し、続いて1%の水性Ni(SO4)・6H2Oで洗浄し、Ni2+と
配位する化学種を得、これによって、結合したNi2+を含むガスマイクロバブル
を形成した。
位を可能にするようにさらに変性した。マイクロバブルを1mMの水酸化ナトリウ
ム水溶液で洗浄し、続いて1%の水性Ni(SO4)・6H2Oで洗浄し、Ni2+と
配位する化学種を得、これによって、結合したNi2+を含むガスマイクロバブル
を形成した。
【図1】 相互に連絡された2つの注射器を浮遊分離に使用する場合のその概略図である
。
。
【図2】 本発明の連続流分離方法で有用な装置の側面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/487 C12N 5/00 B (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 ポール・ロングヴェド ノールウェー国エン−0401オスロ.ピー・ オー・ボックス4220トルショヴ.ニュコヴ ェイエン2.ニュコメド・イメージング・ アクシエセルカペト (72)発明者 ダグフィン・レーヴハウグ ノールウェー国エン−0401オスロ.ピー・ オー・ボックス4220トルショヴ.ニュコヴ ェイエン2.ニュコメド・イメージング・ アクシエセルカペト (72)発明者 ヘーゲ・フィエールディングスタード ノールウェー国エン−0401オスロ.ピー・ オー・ボックス4220トルショヴ.ニュコヴ ェイエン2.ニュコメド・イメージング・ アクシエセルカペト (72)発明者 マグネ・ソルバッケン ノールウェー国エン−0401オスロ.ピー・ オー・ボックス4220トルショヴ.ニュコヴ ェイエン2.ニュコメド・イメージング・ アクシエセルカペト (72)発明者 アースラク・ゴーダール ノールウェー国エン−0365オスロ.ネドレ シルケストロ
Claims (25)
- 【請求項1】 標的を標的捕捉性のカプセル化したガスマイクロバブルに結
合させ、マイクロバブルおよび結合した標的を液体試料の表面に浮遊させてマイ
クロバブル/標的の浮遊層をつくり、該試料からこの層を分離し、そして標的か
らマイクロバブルを除去するかまたは標的を含まない試料物質を回収することか
らなる、液体試料から標的物質を分離する方法。 - 【請求項2】 ガスマイクロバブルが耐コアレッセンス性の表面膜、フィル
ム形成性のタンパク質、ポリマー物質、脂質物質、非重合体であってかつ非重合
性の壁形成物質または界面活性剤によってカプセル化する請求項1に記載の方法
。 - 【請求項3】 ガスマイクロバブルが1つまたはそれ以上のリン脂質および
/またはリポペプチドによってカプセル化する請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 ガスマイクロバブルが、少なくとも2つの相補的リポペプチ
ドからなる膜によってカプセル化される請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 ガスマイクロバブルが正味の全体的電荷を有する請求項1〜
4のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項6】 ガスマイクロバブルがパーフルオロカーボンまたは弗化硫黄
からなる請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項7】 ガスマイクロバブルが六弗化硫黄、パーフルオロプロパンま
たはパーフルオロブタンからなる請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 標的物質が、金属および金属イオン、ポリマー、脂質、炭水
化物、血液成分、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、グリコペプチド、ホル
モン、固定されたコンビナトリアルライブラリー成分、細胞、変性された細胞、
細胞断片、細胞小器官、DNA、RNA、ファージ、酵素、リボソーム、トキシ
ン、バクテリア、変性バクテリア、ビールスおよび変性ビールスから選択される
請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】 標的物質が造血細胞または抗原提供細胞からなる請求項8記
載の方法。 - 【請求項10】 造血細胞がリンパ細胞、顆粒球、単核細胞、マクロファー
ジ、網状赤血球、赤血球、巨核球および血小板から選択される請求項9に記載の
方法。 - 【請求項11】 抗原提供細胞がランゲルハンス細胞、内皮細胞、上皮細胞
、トロホブラストおよび神経細胞から選択される請求項9に記載の方法。 - 【請求項12】 標的物質が造血前駆細胞および/または幹細胞からなり、
また試料が骨髄/血液懸濁液または、造血前駆細胞および/または幹細胞を含有
する細胞培養物からなる請求項9に記載の方法。 - 【請求項13】 標的物質がガン細胞からなる請求項8に記載の方法。
- 【請求項14】 ガン細胞が上皮腫瘍細胞である請求項13に記載の方法。
- 【請求項15】 標的物質がトランスフェクション細胞またはビールス感染
細胞からなる請求項8に記載の方法。 - 【請求項16】 カプセル化したガスマイクロバブルが、直接または結合基
を介して親和リガンドまたはベクターに結合することにより標的捕捉性化されて
いる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項17】 親和リガンドまたはベクターがモノクローナル抗体である
請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 親和リガンドまたはベクターがペプチドまたは、標的物質
に対し特異性を有する1次抗体に対して親和性を有する2次抗体である請求項1
6に記載の方法。 - 【請求項19】 カプセル化したガスマイクロバブルが、キレート剤の結合
によってあるいは、標的物質中の相補的な官能基と反応性の1つまたはそれ以上
の官能基の存在によって標的捕捉性化される請求項1〜15のいずれか1項に記
載の方法。 - 【請求項20】 マイクロバブルが破裂によって標的から除去される請求項
1〜19のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項21】 マイクロバブルが過剰圧または減圧の一時的適用によって
、超音波処理によってあるいはpHの変化によって破裂させられる請求項20に記
載の方法。 - 【請求項22】 液体試料と、疾病マーカー成分を標的とすることができる
カプセル化したガスマイクロバブルとを混合し、このマイクロバブルと任意の結
合した疾病マーカー成分とを試料の表面に浮遊させてマイクロバブル浮遊層を形
成し、そして上記の疾病マーカー成分の存在についてこの層を分析することから
なる、液体試料中の疾病マーカー成分を検出するための診断方法。 - 【請求項23】 マイクロバブルを含む試料が一方のチャンバーに導入され
そしてマイクロバブル/標的成分の複合体を浮遊させ、次いで他方のチャンバー
内に移されるように相互に連結された2つのチャンバーを包含する、液体試料の
成分を浮遊によって分離するのに使用するための装置。 - 【請求項24】 チャンバーが注射器筒を含む請求項23に記載の方法。
- 【請求項25】 下方に向かって狭小化する側面を1つまたはそれ以上有す
る分離槽に、標的捕捉された、カプセル化ガスマイクロバブルを含む試料の連続
流を供給するのに適した供給手段を含み、この槽の底部に試料液体および結合し
ていない試料成分を抜き出す手段が設けられ、そしてこの槽の頂部に試料液体お
よびマイクロバブル/標的成分の複合体の溢流を可能にする手段が設けられてい
る、請求項1の方法による浮遊による試料成分の連続流分離に使用するための装
置。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9809085.5 | 1998-04-28 | ||
GBGB9809085.5A GB9809085D0 (en) | 1998-04-28 | 1998-04-28 | Improvements in or relating to separation processes |
GB9809083.0 | 1998-04-28 | ||
GBGB9809083.0A GB9809083D0 (en) | 1998-04-28 | 1998-04-28 | Improvements in or relating to separation processes |
PCT/GB1999/001317 WO1999055837A2 (en) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | Improvements in or relating to separation processes |
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Publication Number | Publication Date |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000545981A Withdrawn JP2002512886A (ja) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | 分離方法におけるまたはこれに関する改良 |
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Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP1073716B1 (ja) |
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AU (1) | AU3719799A (ja) |
CA (1) | CA2326386A1 (ja) |
DE (1) | DE69916822T2 (ja) |
IL (1) | IL139034A0 (ja) |
WO (1) | WO1999055837A2 (ja) |
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JP2013180956A (ja) * | 2012-02-29 | 2013-09-12 | Sunstar Engineering Inc | 殺菌剤組成物 |
JP2017522860A (ja) * | 2014-05-10 | 2017-08-17 | ダイアグノロジックス・エルエルシー | 浮力を用いて薬剤を単離または濃縮するためのシステムおよび装置 |
JP2022031708A (ja) * | 2015-12-29 | 2022-02-22 | サーモゲネシス コーポレーション | 細胞分離装置、システム、及び方法 |
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RU2331669C2 (ru) * | 2002-07-25 | 2008-08-20 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Популяция стволовых кроветворных клеток и ее применение |
US7838290B2 (en) * | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
US7314746B2 (en) * | 2002-09-13 | 2008-01-01 | Valentis, Inc. | Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids |
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US7432331B2 (en) | 2002-12-31 | 2008-10-07 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers |
ATE444984T1 (de) | 2002-12-31 | 2009-10-15 | Nektar Therapeutics Al Corp | Hydrolysestabile maleimidendgruppen-enthaltende polymere |
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